JPS63230083A - 糖鎖に関する変異ｔＰＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規な糖鎖変異ｔＰＡとその医薬組成物並びに
該変異ｔＰＡの生産に係る遺伝子組換技術に関する。さ
らに詳しくはｔＰＡのアミノ酸配列においてアミノ酸の
新規な置換をおこない、該置換によってアスパラギン結
合型糖鎖に変異をもたらし。

該変異によってｔＰＡの医薬用途における特性を改善す
ることを内容とする。従って本発明は医療用医薬品の分
野において利用することができる。

（以下余白） （２）従来技術 組織プラスミノーゲン活性化因子（本発明においてｔＰ
Ａと略記される）が医薬品分野において特に血栓症治療
剤として有用な物質であり、その利用をいっそう容易に
する目的で遺伝子組換技術が応用されることは一般に公
知であり、下記文献１）〜３）に示されるとおりである
。またｔＰＡの生体内利用を高める目的でｔＰＡのアミ
ノ酸配列に各種の構造的変異を加える試みがなされてお
り、この目的のために同様に遺伝子組換技術が応用され
ていることも一般に公知であり９例えば下記文献４）〜
９）に示されるとおりである。

１）欧州特許出願公開Ｎａ００４１７６６　Ａ２２）欧
州特許出願公開Ｎ１１Ｏ０９３６１９Ａ１３）ペニカ　
エタール０．ネイチャー３０１（Ｐｅｎｎｉｃａ　ｅｔ
ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３０１２１４−２２１　（１
９８３））４）エッチ、カギタニ、エタール０．フエブ
スレット、１８９巻、１号（１９８５）　１４５−１４
９（Ｈ，Ｋａｇｉｔａｎｉ、　ｅｔａｌ、、　ＦＥＢＳ
　Ｌｅｔｔ、　Ｖｏｌ、　１８９゜Ｎα１　（１９８５
）　１４５−１４９）５）ニー、ジュー。ブイ、ゾンネ
ベルト。

エタールニブロッジ、ナショル、アカド。

サイ６ユーエスエー８３．４６７０−４６７４　（１９
８６）（Ａ、　Ｊ、　Ｖ、　５ｏｎｎｅｖｅｌｄ、　ｅ
ｔ　ａｌ　：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３．４６７０−４６７４　（１９
８６））６）国際特許出願公開比８６０１５３８７）欧
州特許出願公開魚０１５５３８７　Ａ２８）欧州特許出
願公開魚０１７８１０５　Ａ２９）欧州特許出願公開魚
０１９９５７４　ＡｔＰＡのアミノ酸配列における構造
的変異の中に糖鎖変異を目的としたものがある。すなわ
ちｔＰＡは他の多くの生理活性物質と同様に糖蛋白質で
あり９通常は分子内に３本あるいは２本のアスパラギン
結合型糖鎖を持っている。従ってこれら糖鎖の増減変異
がｔＰＡの生体内利用に関連する諸々の物理化学的特性
に重要な影響を及ぼすであろうことは容易に推考するこ
とができる。例えばアスパラギン結合型糖鎖を増加して
水溶性を高めるとか。

糖鎖の結合位置を変化せしめて溶解度と血中消失時間の
双方を同時に満足する最適値を求めるとか。

目的に応じた各種の改良を意図することができる。

前記文献８）は子宮由来のｔＰＡの３本のアスパラギン
結合型糖鎖をすべて消失せしめるための技術を開示して
いる。

他方、糖蛋白質において糖鎖が蛋白質に結合する部位に
ついてはある種の規則性の存在することが知られている
。すなわち糖鎖は一般に蛋白質中のアスパラギン残基に
結合し、しかも当該アスパラギンを含むアミノ酸配列は
いわゆるＡｓｐａｒａｇｉｎθＳθｑｕｏｎと呼ばれる
規則的な配列をしており、これは例えば下記文献１０）
〜１６）によれば三つのアミノ酸から構成される配列、
すなわちトリプレットであって、具体的にはＡｓｎ−Ｘ
−Ｔｈｒ、　Ａｓｎ−Ｘ−８ｅｒあるいはＡｓｎ−Ｘ−
Ｃｙｓによって示され、Ｘはプロリン以外のいずれのア
ミノ酸でもよいことが知られている。

１０）　　イー、　　ハウゼ、エ　タール：フエブスレ
ターズ、１０８巻２号　３４１〜３４４　（１９７９）
（Ｅ、　Ｂａｕｓｅ、　ｅｔ　ａｌ　：　ＦＥＢＳ　Ｌ
ＥＴＴＥＲ８Ｖｏｌ、　１０８゜Ｎα２３４１〜３４４
　（１９７９））１１）イー、バウゼ、エ　タール：バ
イオケム。

ジエー、　（１９８２）　２０３．７６１〜７６８（Ｅ
、　Ｂａｕｓｅ、　ｅｔａｌ　：　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｊ、　（１９８２）　２０３゜７６１〜７６８） 】２）イー、バウゼ：バイオケム、ジエー。

（１９８３）　２０９．３３１〜３３６（Ｅ、　Ｂａｕ
ｓｅ　：　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　（１９８３）　２
０９．３３１〜１３）７−ル、ティー、マーシャル：バ
イオケミカル　ソサイエティー　トランスアクションズ
（１９８４）　１２巻　５１３〜５１４（Ｒ，Ｄ、　Ｍ
ａｒｓｈａｌｌ　：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃ
ｉｅｔｙ　Ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｏｎｓ（１９８４）　
Ｖｏｌ、１２．５１３〜５１４）１４）イー、バウゼ：
同誌（１９８４）　１２巻　５１４〜５１７（Ｅ、　Ｂ
ａｕｓｅ　：　１ｂｉｄ、　（１９８４）　Ｖｏｌ、１
２．５１４〜５１７）１５）ディー、グー。ストラック
　アンド　ダブル、ジェー、レンナルツ　イン　ダブル
。

ジェー、レンナルツ編　ザ　バイオケミストリー　オブ
　グリコプロティン　アンドプロテオグリカンス、プレ
ナムプレス。

１９８０、　　ニューヨーク、３５〜８３頁（Ｗ、　Ｋ
、　５ｔｒｕｃｋ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｊ、　Ｌｅｎｎａｒ
ｚ　ｉｎ　Ｗ、　Ｊ。

Ｌｅｎｎａｒｚ　ａｄ、　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　ｏｆ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ　Ｐｒ
ｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ
、　１９８０゜Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ３５〜８３）
１６）　　シー、　　ロニン、エタール１．フエブス　
し、ット、、　９６．１７９　（１９７８） （Ｃ，Ｒｏｎｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅ
ｔｔ、、　９６．１７９　（１９７８））（３）発明が
解決しようとする問題点 ｔＰＡにおける糖鎖の問題については、これまでに前記
文献８）による以外には特別な開示はなされていない。

しかしながら糖鎖の問題に対してはより多（の考慮がは
られれる必要がある。例えば前記したＡｓｐａｒａｇｉ
ｎｅ　５ｅｑｕｏｎを構成するトリプレ・ントを分子内
に有しながら、ある種のトリプレ・ントでは当該部位に
糖鎖が結合する分子と結合しない分子とが混在し、その
結果生産物のロットごとに結合糖鎖数が変動してしまう
ことが知られている。

このような結合糖鎖数の不均一性はプラスミノーゲン、
セル口プラスミン、プロラクチン、マウスＩｇＭ、　ウ
シα−ラクトアルブミン等においてすでに観察されてい
るが、　ｔＰＡにおいても同様であり。

下記文献１７）によれば天然ｔＰＡのアミノ酸位置番号
１８４〜１８６のトリプレットであるＡｓｎ−Ｇｌｙ−
８ｅｒに対する糖鎖の結合は特に不確実であり、その結
果、結合糖鎖数の不均一を招いている。

１７）グンナー　ボール、エタール１．バイオケミスト
リー、　２３．３７０１−３７０７　（１９８４）（Ｇ
ｕｎｎａｒ　Ｐｏｈｌ、　ｅｔａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、　２３＋　３７０１−特定部位に糖鎖の
結合している蛋白質と結合していない蛋白質とを分離す
ることはきわめて困難であるので、実際には不均一のま
ま使用されることになるが、その結果は好ましくない。

例えば溶解度等の物性が糖鎖の結合していない蛋白質の
存在に応じて変化し、また非経口投与でしばしば観察さ
れる免疫原性が変化して品質が一定しない。

すなわち天然ｔＰＡには医療用医薬品として利用する上
で重要な要件である品質についてこれが一定しないとい
う欠点がある。従って特定部位への糖鎖の結合を均一に
するための特別の技術が提供される必要がある。またｔ
ＰＡの糖鎖には別の角度からも考慮がはられれなければ
ならない。すなわちｔＰＡの実用化にあたってはこれを
医療用医薬品として使用する目的や程度に応じてその血
栓溶解活性を変化させあるいは溶解度や血中半減期を調
整することが必要であり、これを糖鎖の変異で達成する
ことが望まれる。本発明はこの目的のためにおこなうべ
き変異ｔＰＡの提供を問題点とした。

（４）問題点を解決するための手段 本発明者は前記問題点に対し種々め検討を行い。

その結果、天然ｔＰＡのアミノ酸位置番号１８３番のＧ
ｌｙおよび１８６番のＳｅｒをそれぞれＳｅｒおよびＴ
ｈｒに置換するか、１１９番のＳｅｒをＭｅｔに置換す
るか。

９６番のＧｉｎ、　９８番のＨｅ、　１１９番（７）　
ＳｅｒをそれぞれＡｓｎ、　Ｔｈｒ、　Ｍｅｔに置換す
ることによって解決されることを知り２本発明を完成す
るに至った。すなわち本発明は上記によって示されると
おりのアミノ酸置換を特徴する糖鎖に関する変異ｔＰＡ
、その医薬組成物並びに該ｔＰＡの生産に係る遺伝子組
換技術を要旨とするものである。

以下に本発明を定義、構成、方法の項に分けて説明する
。

定義 本発明において天然ｔＰＡとはヒトメラノーマ細胞のｍ
ＲＮＡから転写して得られるｃＤＮＡ　（原ｃＤＮＡと
呼ぶことにする）並びに該ｃＤＮＡに該ｃＤＮＡがコー
ドするアミノ酸配列に変異が起らない範囲内の人工的変
異が加えられたｃＤＮＡ　（類似ｃＤＮＡと呼ぶことに
する）がコードするアミノ酸配列を有するｔＰＡ活性ペ
プチドを言う。このアミノ酸配列および該配列における
各アミノ酸のアミノ酸位置番号はペニカらによってすで
に文献３）に詳細に開示されており９本発明における天
然ｔＰＡのアミノ酸配列および各アミノ酸のアミノ酸位
置番号は同文献のＦｉｇ　３に記載される配列および位
置番号によって特定される。

変！ＡｔＰＡとは原ｃＤＮＡまたは類似ｃＤＮＡにこれ
らｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列に変異が起る程度
に特別の人工的変異が加えられたｃＤＮＡ　（変異ｃＤ
ＮＡと呼ぶことにする）がコードするアミノ酸配列を有
するｔＰＡ活性ペプチドであると定義される。ここで特
別な人工的変異とは遺伝子組換操作２例えばＺｏｕｅｒ
　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈの部位特異的変異誘発を利用して
ｃＤＮＡの核酸塩基配列に部分的な欠落、附加、変換が
加えられることを言う。従って変異ｔＰＡのアミノ酸配
列は天然ｔＰＡのアミノ酸配列が部分的に欠落、附加、
変換したものであると言うことができる。本発明におい
て変異の語が各種の局面において各種の意味で使用され
るが、混乱を避けるために議論される局面に応じて区別
して使用される必要があり２例えば核酸塩基配列に部分
的な欠落、附加、変換があった場合にはｃＤＮＡの核酸
塩基配列の配列変異であり、アミノ酸配列に部分的な欠
落、附加、変換があった場合にはアミノ酸配列の配列変
異であり、結合糖鎖に欠落、附加、変換があった場合に
は糖鎖の結合変異であるとそれぞれ区別される。本発明
に係る変異ｔＰＡは当該変異の結果として二次的に糖鎖
変異を伴なっている。従って単にアミノ酸配列における
変異のみを問題として議論する場合に該ｔＰＡを変異ｔ
ＰＡと呼び、糖鎖変異にまで着目し、糖鎖変異を特に強
調する必要のある変異ｔＰＡを指称する場合には別に糖
鎖変異ｔＰＡの語をもって区別することにする。

構成 本発明の構成上の特徴は糖鎖変異を目的とした所定のア
ミノ酸位置番号のアミノ酸の他のアミノ酸への置換であ
る。第一種はアミノ酸位置番号１８３番のＧｌｙおよび
１８６番のＳｅｒをそれぞれＳｅｒおよびＴｈｒに置換
することであり、これによりアミノ酸位置番号１８４番
のＡｓｎに対する糖鎖結合を均一化することができる。

すなわち前記したごとく天然ｔＰＡの該Ａｓｎに対する
糖鎖の結合が不均一であるために品質を損ねているので
あるが２本発明により一定品質の生産物の提供が可能と
なる。第二種はアミノ酸位置番号１１９番のＳｅｒをＭ
ｅｔに置換することであり、これにより１１７番のＡｓ
ｎに結合する糖鎖が消失し、血中半減期が長くなる。第
三種はアミノ酸位置番号９６番のＧｉｎ、　９８番のＩ
ｌｅおよび１１９番のＳｅｒをそれぞれＡｓｎ、　Ｔｈ
ｒおよびＭｅｔに置換することであり、これによりアミ
ノ酸位置番号１１７　ａのＡｓｎに結合する糖鎖が消失
し、アミノ酸位置番号９６番に新たに糖鎖が結合する。

次に本発明の最終目的物質は遺伝子組換技術によって生
産することができる。従って本発明変異ｔＰＡをコード
するｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡを外来遺伝子として含み、か
つ選択した宿主内で制禦および発現が可能となるように
連結して得られた発現プラスミドは本発明最終目的物質
の生産のために必要な中間物質であり、同一の問題点を
解決する意味において発明としては共に一体となるべき
ものである。発現プラスミドの具体例としてＺｅｍ　９
９−（以下余白） ６０００　、同一６３００　、同一６４００　、によっ
て識別表示されるプラスミドをあげることができ、これ
らはいずれもそれぞれ後記実施例において示される。ま
た発現プラスミドによって形質転換された宿主もｃＤＮ
Ａおよび発現プラスミドと同様に発明としては共に一体
となるべきものであり、宿主としては大腸菌や動物細胞
、とりわけＢＨＫ細胞が使用される。形質転換した大腸
菌の例としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＲＲＩ
−Ｚｅｍ９９−６０００．同一６３００　、同一６４０
０によって識別表示される大腸菌をあげることができ。

これらはいずれもそれぞれ後記実施例において示され、
かつそれぞれの表示をもって微工研に寄託されている。

最終目的物質である本発明糖鎖変異ｔＰＡは天然ｔＰＡ
が変異したものであるにもかかわらず、後記実験例によ
って示されるごとく天然ｔＰＡの活性。

すなわち血栓溶解活性を天然ｔＰＡと同程度に有してい
る。従って天然ｔＰＡが医薬組成物の必須の有効成分と
なって、その活性を利用する医療目的に提供されるのと
同様に９本発明糖鎖変異ｔＰＡもその活性を利用する治
療目的のための医薬組成物の必須の有効成分となること
ができる。とりわけ各種の血栓症治療剤となることがで
きるのは後記実験例より明らかである。ところで後記実
験例によって示されるとと（９本発明糖鎖ｔＰＡの血中
消失半減期は天然ｔＰＡのそれに比べて２〜１０倍大き
い。この点を考慮すると本発明糖鎖変異ｔＰＡは天然ｔ
ＰＡよりも優れた血栓症治療剤となることが知られる。

すなわち、天然ｔＰＡの一日当りの用量はその急速な血
中消失を配慮して３０ｙａｙ−１５０ｔｎｙ１人である
とみられるのに対し２本発明糖鎖変異ｔＰＡのそれは０
．３　ｍｙ　−７５■／人で十分であることが知られる
。もちろん本発明は当該範囲に限定されるものではなく
、−日用量は症状に応じて適宜に増減すればよいが２本
発明によってはるかに改良された医薬組成物、とりわけ
血栓症治療剤が提供されることは明らかである。

この場合に該医薬組成物は主として注射剤であり、動静
派内投与される。注射剤として製造するためには、微量
生理活性物質を注射剤とするときの常法に従っておこな
えばよい。従って例えば本発明糖鎖変異ｔＰＡを単独あ
るいは適当な賦形剤。

溶解剤と共に水溶液とし、無菌濾過して充填し。

凍結乾燥し、他方溶解用水溶液を添付して用時溶解型注
射剤とすればよい。

方法 本発明物質の製造方法および評価方法について説明する
。

まず本発明物質を製造するために必要な天然ｔＰＡをコ
ードするｃＤＮＡ　（原ｃＤＮＡまたは類似ｃＤＮＡ）
を含むクローンはボウズメラノーマ細胞ラインのｍＲＮ
Ａを出発物質としてすでに数種のもの力暉４成されてい
るので、該ｃＤＮＡを外来遺伝子として含むプラスミド
で形質転換した適当な株を入手し、プラスミドを単離し
て使用すればよい。例えばｐＤＲ１４９６（ＡＴＣＣ２
０７２Ｂ）、　ｐＤＲ１２９６（ＡＴＣＣ５３３４７）
等である。あるいはさらにこれらのプラスミドからｔＰ
Ａのコード部分をとり出し、適当なプロモータおよびタ
ーミネータを連結して得られる発現プラスミドを用意し
、これを使用してもよい。

例えば下記文献１８）によって示されるＭＴ　ｈＧＨ１
１１およびＭＴ　ｈＧＨ１１２からメタロチオネインプ
ロモータ（ＭＴ−１プロモータと略記する）およびヒト
成長ホルモンターミネータ（ｈＧＨターミネータと略記
する）を得て、これらにｔＰＡコード部分を連結して発
現プラスミドを用意し、使用すればよい。

１８）　　パルミター、エタール８．サイエンスμ狙８
０９−８１４．１９８３ （Ｐａｌｍｉｔｅｒ、　ｅｔａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ
　２２２８０９８１４１９８３）−例を示せば次のごと
くである。まずＭＴ　ｈＧＨｌｌｌよりＭＴ−１プ０−
１１−一夕を含むＫｐｎ　ニー　Ｂａｍ　Ｈ■断片を単
離し、プラスミドｐＵ０１８に挿入した後。

ＭＴ−１プ０−１１−一夕を含むＢａｍ　ＨＩ　−Ｓａ
ｌ　Ｉ断片を用意する。他方ＭＴ　ｈＧ）Ｉ　１１２よ
りＭＴ−１プロモータおよびｈＧＨターミネータを含む
Ｅｃｏ　ＲＩ断片を単離し、プラスミドｐＵｃ１３に挿
入した後、ｈＧＨターミネータを含むＢｇｌ　ｆｌ　−
Ｓａｌ　Ｉ断片を用意する。

以上の二つの断片とｔＰＡのｐｒθ−ｐｒｏ部分をコー
ドするＢａｎ　Ｈｉ　−Ｘｈｏ　ｆｌ断片とを結合し、
その結果得られるプラスミドを精選し、さらにＢｇｌ　
［で切断し、ここにｐＤＲ１２９６から得てきたｔＰＡ
をコードするｘ）１０■断片を挿入すれば、目的とする
発現プラスミドが得られる。Ｚｅｍ９９はこのようにし
て得られる発現プラスミドの一例であり１図１にその制
限酵素マツプを示す。

本発明変異ｔＰＡは公知の遺伝子組換操作を適宜組合わ
せることによって製造することができるが。

本発明ではもっばら特定位置のアミノ酸の置換が行なわ
れる関係で本発明変異ｔＰＡをコードするｃＤＮＡの調
製のためには特にＺｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ（
７）部位特異的変異誘発（５ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を好便に利用することがで
きる。すなわち天然ｔＰＡのアミノ酸配列をコードする
ｃＤＮＡ　（原ｃＤＮＡおよび類似ｃＤＮＡ）をＭ１３
のごときファージベクターに組込み、その結果得られる
二本２１１　Ｍ１３　ＤＮＡで形質転換した大腸菌の培
養液から一本鎖Ｍ１３ＤＮＡを用意し、これに所定の合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてアニーリング
して変異を誘発させればよい。例えばプラスミドｐＤＲ
１４９６からｔＰＡをコードするｃＤＮＡを含む断片を
Ｍ１３ｔｇ１３０ＲＦベクターに組込み、その結果得ら
れる二本鎖Ｍ１３ＤＮＡから一本鎖Ｍ１３ＤＮＡを用意
し、目的とするアミノ酸の置換に応じて所定の合成オリ
ゴヌクレオチドをアニーリングすればよい。アミノ酸位
置番号１８６番の３ｅｒをＴｈｒｌζ置換し、さらに糖
鎖結合を容易にする目的で同１８３番のＧｌｙをＳｅｒ
に置換するためには下記合成ヌクレオチドＰＭ５を使用
すればよい。

ＰＭ５　：　５’　ＡＣＧ　ＧＴＡ　ＧＧＣＴＧＴ　Ｃ
ＣＣＡＴＴ　ＧＣＴＡＡＡ　ＧＴＡ　ＧＣＡ　３’ アミノ酸位置番号１１９番のＳｏｒをＭｅｔに置換する
ためには下記合成ヌクレオチドＰＭ６を使用すればよい
。

ＰＭ６　：　５’　ＧＧＣＣＡＡ　ＣＧＣＣＡＴ　ＧＧ
Ａ　ＧＴＴ　ＣＣＡＧＴＴ　３’ アミノ酸位置番号９６番のＧｉｎおよび同９８番のＩｌ
ｅをそれぞれＡｓｎおよびＴｈｒに置換するためには下
記合成ヌクレオチドＰＭ７を使用すればよい。

ＰＭ７　：　５’　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　
ＡＣＣＧＴＴ　ＧＴＣＣＴＣＧＴＡ３′ アミノ酸位置番号９６のＧｉｎ、　９８番のＩｌｅ、　
１１９番のＳｅｒをそれぞれＡａｎ、　Ｔｈｒ、　Ｍｅ
ｔに置換するためにはＰＭ６およびＰＭ７によって逐次
的に一本鎖Ｍ１３ＤＮＡに変異を導入すればよい。また
ＰＭ６およびＰＭ７によってそれぞれ別の一本鎖Ｍ　１
３　ＤＮＡに変異を導入し、別々に発現プラスミドを調
製し、それぞれにおける所定の消化断片を連結してもよ
い。

部位特異的変異誘発を行った後は、得られた反応液で大
腸菌を形質転換し、これを培養して得られるプラークに
ついて放射標識した合成オリゴヌ（以下余白） クレオチドをハイブリッドしてスクリーニングすれば９
本発明に係る変異ｔＰＡをコードするｃＤＮＡを外来遺
伝子として含む二本鎖Ｍ１３ファージＤＮＡを得ること
ができる。必要により該ＤＮＡから当該ｃＤＮＡを切り
出し、これを宿主に応じて使用される適当な発現ベクタ
ーに連結することは常法に従って適宜おこなえばよい。

以上の製造プロセスの中間段階で利用される個々の遺伝
子組換操作はほとんどが公知であるので。

文献あるいは簡単な記述によって以下に説明する。

制限酵素によるプラスミドの切断、および切断して得ら
れるＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動またはポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分離と回収と結合（こ
ついては下記文献１９）の記述が参照される。

１９）　　マニアティス、ティー、エタール、。

モレキュラークローニング、アラポラトリーマニュアル
、コールドスフリング ハーバ−ラボラトリ−１９８２ （Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔａｌ、、　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　
１９８２） 例えば天然ｔＰＡをコードするｃＤＮＡを含むプラスミ
ドおよびＭ１３ファージベクターを各々切断し。

断片を結合してｃＤＮＡの組込まれた二本鎖Ｍ１３ＤＮ
Ａを得る場合に応用される。

プラスミドの大腸菌への形質転換は下記文献２０）に従
えばよい。

２０）　ＤＮＡクローニング第１巻第６章ディー。

エム、クロパー編、アイアールエル プレス１９８５ （ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌ、１．　ｃｈａｐ、
６．　ｅｄ、　Ｄ、　Ｍ。

Ｇｌｏｖｅｒ　ＩＲＬ　ｐｒｅｓｓ　１９８５）例えば
天然ｔＰＡをコードするｃＤＮＡの組込まれた二本鎖Ｍ
１３ＤＮＡあるいはｔＰＡをコードするｃＤＮＡの組込
まれた発現プラスミドを大腸菌への形質転換に供すると
きに応用される。

変異誘発用およびスクリーニング用のオリゴヌクレオチ
ドのＰｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ法による合成および
５′末端の標識はそれぞれ下記文献２１）および２２）
によればよい。

２１）ニス、エル、ビューケージ、エタール４．：テト
ラヘドロン　レッド、、　２２．１８５９（１９８１）
（Ｓ、　Ｌ＋Ｂｅａｕｃａｇｅ、　ｅｔａｌ、、　Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、。

２２）ニー、マキサムアンドダブリュ。

ギルバード、メソッズインエンチモロ ジー、６５巻４９９−５６０頁　アカデミツクプレス１
９８０ （Ａ、　Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｇ１１ｂｅｒｔ、
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏ
ｌ、６５．　ｐ４９９−５６０．　ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｅｓｓ　１９８０） ＤＮＡ塩基配列の決定は下記文献２３）に従いｄｉｄｅ
ｏｘｙ法によりおこなえばよい。

２３）エフ、サンガーエタール０．ピー、エヌ。

ニー、ニス、　７４５４６３．１９７７（Ｆ、　Ｓａｎ
ｇｅｒ　ｅｔａｌ、、　Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ　７４．
５４６３．１９７７）例えば変異誘発し、スクリーニン
グした一本鎖Ｍ１３ＤＮＡについて塩基配列を決定し、
目的とする変異が誘発されているか否かを確認する場合
に応用される。

二本鎖および一本鎖のＭ１３ファージＤＮＡは以下のよ
うに調製される。すなわち形質転換した大腸菌を下記文
献２４）により培養し、さらに振盪培養し、遠心分離す
る。沈澱部の大腸菌からは前記文献１９）に記載の方法
により二本鎖Ｍ１３ＤＮＡを得る。また上澄液からは、
その１．３ｉＬに２６０μｌの２．５　Ｍ　ＮａＣ１と
２０％ＰＥＧ　６０００を加え、混合物をエッペンドル
フミクロチューブで遠心分離し、得られるペレットを１
２０μｔの１０　ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７−９
，０，１ｍＭ　ＦＪ）ＴＡ）に懸濁し、フェノール抽出
し、エタノールで沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し
、乾燥後３０μｔの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，９，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に再び懸濁して一本鎖Ｍ
１３ＤＮＡを得る。

部位特異的変異誘発反応は下記文献２５）に従っておこ
なわれる。

２５）シラーアンドスミス、メソッズインエンチモロジ
−１００，４６８−５００，１９８３（Ｚｏｌｌｅｒ　
ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍｅｔｈｏｄｅ　ｉｎ　Ｆｍｙ
ｍｏｌｏｇ）ｒ。

１００、４６８−５００．１９８３） すなわち非放射性リン酸で末端標識した変異誘発用合成
オリゴヌクレオチド（プライマー）２０ｐｍｏｌに一本
鎖Ｍ１３ＤＮＡ１μｇ、アニーリング用緩衝液（５０ｍ
Ｍトリス塩酸、　ｐＨ８，０，０，２５ｍＭ　ＭｇＣｌ
、）２μＬ、　Ｂ緩衝液（０，２Ｍ　トリス塩酸、　ｐ
Ｈ７，５゜０゜Ｉ　Ｍ　ＭｇＣｌ２，０．１　Ｍジチオ
スレイトール）８μＬ。

ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄｃＴＰ、　ｄＴＴＰ各２．
５劇ずつの混合物４　μＥ　、　５　ｍＭ　ｒＡＴＰ　
２１ｂｔ　、蒸溜水１μｍ、　Ｔ、ＤＮＡリガーゼ５単
位、　ＤＮＡポリメラーゼＩＫｌｅｎｏｗ　７ラグメン
ト５単位を加え、最終全液量を２０μｔとして１４℃３
時間反応させる。

次に反応混合液を用いて変異誘発を受けたＤＮＡで大腸
菌を形質転換するためには下記文献２６）に従って行な
い、さらに下記文献２７）に従って形質転換した大腸菌
を大腸菌ＪＭ　１０３とまぜて寒天培地上に拡げ、３７
°Ｃで一夜培養し、形成するプラークをニトロセルロー
スフィルター上に写しとる。

２６）クレーマー二タール、、セル３８８７９−８８７
゜（Ｋｒａｍｅｒ　ｅｔａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　３８．８
７９−８８７．１９８４）２７）グルンスタインアンド
ホグネス、ピー。

エラ。ニー、ニス、ニーニスニー７２ ３９６１、１９７５ （Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｈｏｇｎｅｓｓ、　Ｐ
、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　ＵＳＡ　７２３９６１、１９７
５） ニトロセルロースフィルター上に写しとっタフラークに
ついてのスクリーニングは以下のように行なう。

二トロセルロースフィルターヲ６倍ノ５ＳＣ（１倍）Ｓ
ＳＣは１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸ナトリ
ウム）、　１０倍のＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　（１倍（Ｄ
　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓは０．０２％ポリビニルピロリ
ドン、　０．０２％フィコール。

０．０２％ウシ血清アルブミン）、５０μｇ／ｍｌ超音
波処理サケ精子ＤＮＡの中に加えて６５°Ｃ３時間処理
し。

予備ハイブリッドを形成させる。次いでフィルターを放
射標識した変異誘発用合成オリゴヌクレオチドと同一緩
衝液条件下で混合し６５°Ｃで一夜放置してハイブリッ
ドを形成させる。フィルターを６倍のＳＳＣで洗浄し、
水分をきった後、増感スクリーンを重ね、Ｘ線フィルム
に露出して目的のプラークを選出する。　・ 変異ｔＰＡをコードするｃＤＮＡを二本鎖Ｍ１３ＤＮＡ
から切り出し、これを発現ベクターに連結して得られる
発現プラスミドは宿主に応じてそれぞれ形質転換に使用
すればよいが９例えばＢＨＫ細胞の形質転換のためには
下記文献２８）に従ってＬｏｙｔｅｒらの方法によりお
こなえばよい。すなわち得られた発現プラスミドを例え
ばｐｓＶ２−ｄｈｆｒと共にＢＨＫｍ細胞株（ｔｓ、　
ｔｈ−）に形質転換する。なおｐｓＶ２−ｄＭｒについ
ては下記文献２９）が参照される。

２８）ロイターエタール０．ビー、エラ。ニー。

ニス、ニーニスニー、　７９４２２．１９８２（Ｌｏｙ
ｔｅｒ　ｅｔａｌ、、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　ＵＳＡ、　
７９４２２゜２９）　　サブラマニ、エタール：モル、
セル。

バイオ口、　１８５４−８６４．　（ｔｃ：ｓｇ（Ｓａ
ｂｒａｍａｎｉ、　ｅｔａｌ　：　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１
．　Ｂｉｏｌ、　１８５．１−８６４．　　（１９８１
）　）クローニングは限界希釈法（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　
ｄｉｌｕｔｉｏｎ法）を利用して以下のとと（行なうこ
とができる。

形質転換の数日後より２００　殆ＭＡｍｅｔｈｏｐｔｅ
ｒｉｎ含有ダルベコ変法イーグル培地（ダルベコ変法イ
ーグル培地、ブドウ糖３．５９１）、炭酸水素ナトリウ
ム７．５９６．牛胎児血清（Ｆｅ２）　５％、トラネキ
サム酸３ｍＭ、　　グルタミ７２ｍＭ、　（−＋−１−
Ａｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎ２００ｎＭ）で２〜３日毎に
１〜２週培地交換しながら限界希釈して産生株を得る。

次に産生株をローラーボトルに用意した２００　ｎＭ　
Ａｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎ含有ダルベコ変法イーグル培
地３００　ｍＬに接種し、３７℃で培養し、培養開始よ
り３〜４日後より毎日３〜４週間同量の培地で培地交換
し、培養上清を集めればよい。

変異ｔＰＡの精製のためには抗ｔＰＡ抗体を担体に結合
した抗体カラムによるアフィニティークロマトグラフィ
ーを好便に利用することができる。すなわちあらかじめ
トリス緩衝液（１００ｍＭ　トＩＪス塩酸、　Ｉ）Ｈ７
，５，０，５Ｍ　ＮａＣ１）　テ緩衝化シタ抗体カラム
に前記培養上清をチャージし、同上トリス緩衝液で洗浄
後、５ＭＫＳＣＮ溶液（同上トリス緩衝液に溶解）で活
性成分を溶出する。溶出した活性画分は濃縮し２例えば
セファクリルＳ−２００にチャージし。

トリス緩衝液（５０ｍＭ　）リス塩酸、　ｐＨ７，５，
０，５ＭＮａＣ１，１，５Ｍ　ＫＳＣＮ）でゲル濾過す
る。再び活性画分は濃縮し、脱塩し２例えばマニトール
を添加して凍結乾燥すれば最終物質を得ることができる
。

以上の工程操作によって得られた本発明糖鎖変異ｔＰＡ
においては、糖鎖の結合位置を特定する必要があり、こ
の目的のためには以下の分析を行なえばよい。

まず糖鎖変異ｔＰＡについて、下記文献３０）に示すＷ
ａｘｄａｌｌらの方法に従い、ジス少フィト結合を還元
アルキル化後９反応液をＰＤ−１０カラム■（ファルマ
シアジャパン社）により脱塩し、ついで凍結乾燥物を１
１１ＬＬの４Ｍ尿素含有５０　ｍＭ　トリス緩衝液ｐＨ
９，０に溶解し、リジルエンドペプチダーゼを酵素対基
質モル比が１対１００となるよう加え。

３７°Ｃで１６時間酵素消化を行う。酵素消化終了後。

反応液に７０９６ギ酸を加え、ｐＨ２に調整して反応を
止め２反応液は下記の条件下での高速液体りａマドグラ
フィーによるペプチドマツピングに供する。

３０）　　ワックスダール、エム、ジェー、Ｉエタール
、：バイオケミストリー、　　７．１９５９．　（１９
６８）（Ｗａｘｄａｕ、　Ｍ、　Ｊ、、　ｅｔａｌ、　
：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　７゜１９５９、　（
１９６Ｂ）） カ　ラ　ムＵｌｔｒａｐｏｒｅ　ＲＰＳＣ（ベックマフ
ジャパン社）溶出液　０．１９６トリフルオロ酢酸水溶
液及び０．０８％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリ ル 溶出条件　アセトニトリル含量を６０分で０％から６０
９６に上昇させるリニアグラジェント流　　速　毎分１
寞り 検　　出　２０６　ｎｍの紫外吸収 ペプチドマツピングでは、あらかじめ天然ｔＰＡについ
て上記と同一の酵素消化を行い、糖含有ペプチドを含め
、すべての断片ペプチドについての溶出位置を決定して
おく。この結果を基にして。

各糖鎖変異ｔＰＡについての糖含有ペプチドの溶出位置
を推定し、さらにレクチン−パーオキシダーゼを用いた
ドツトブロッティング法により、糖鎖の有無の確認を行
う。

こうして得られた各糖鎖変異ｔＰＡの糖鎖含有フラグメ
ントは０．１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶Ｈに溶解し、ト
リジン７　（Ｗａｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｕ、　Ｓ、人
）を加え。

３７°Ｃ，６時間の酵素消化を行い、上記の高速液体ク
ロマトグラフィーの条件でさらに分離精製する。

各溶出ピークについてアミノ酸配列を分析し、糖鎖の結
合したアミノ酸を決定する。

（５）　　実施例 以下に記載する実施例によって本発明をさらに具体的に
説明する。

実施例１ ｔａｌ　　１８３番ｃｔｙをＳｏｒに、１８６番Ｓｅｒ
をＴｈｒに置換するためのＤＮＡプラスミドの調製 図２に示したようにＺｅｍ　９９よりＭ　１３　ｍｐ　
１Ｂ／Ｂａｍ　Ｚｅｍ　９９を作製した。すなわち、　
Ｚｅｍ９９をシ、ｍＨ１にて切断し、Ｂｇｌ［制限酵素
切断部位を含む約２．４　ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収す
る。このＤＮＡ断片とＭ　１３　ｍｐ　１Ｂ　（ファル
マシア■）のＢａｍＨ１切断断片とを結合させ、二本鎖
Ｍ１３ＤＮＡとし。

大腸菌へ形質転換しＭ　１３　ｍｐ　１Ｂ／Ｂａｍ　Ｚ
ｅｍ　９９　ＲＦおよび一本鎖Ｍ　１３　ｍｐ　１Ｂ／
Ｂａｍ　Ｚｅｍ　９９を得た。

次に、　ｔＰＡの１１１３　ＧＩＹをＳｅｒに、　”Ｓ
ｅｒをＴｈｒに置換する目的で式：　５’　ＡＣＧＧＴ
ＡＧＧＣＴＧＴＣＣＣＡＴＴＧＣＴＡＡＡＧＴＡＧＣＡ
　３’のオリゴヌクレオチドを合成し。

これを変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーとしＭ
　１３　ｍｐ　１Ｂ／Ｂａｍ　Ｚｅｍ　９９とにより部
位特異的な変異誘発を行ない、スフ１ｙ−ニングし１部
位特異的な変異の生じたファージを得た。このファージ
より一本鎖Ｍ１３ＤＮＡを得、　ＤＮＡ塩基配列決定に
より塩基配列を確認し、　Ｍ１３−６０００とした。

サラニ二本ｆｉＭ１３ＤＮＡを得、　Ｍ１３−６０００
ＲＦとした。

次に図３に示したようにＭ　１３−６０００　ＲＦより
Ｚｅｍ　９９−６０００を調製した。すなわち、　Ｍ１
３−６０００ＲＦをＢｇｌＩＩ、　Ａｐａｌ　にて切断
し１．４　Ｋｂｐ　１７）　ＤＮＡ断片を回収し、この
断片とＺｅｍ　９９をＢｇｌ　ＩＩ　、　Ａｐａｌにて
切断した断片を結合させ、大腸菌に形質転換し、プラス
ミドを回収しＺｅｍ　９９−６０００を得た。

なお、　Ｚｅｍ　９９−６００００）変異ｔＰＡ　：７
−ディング領域のＤＮＡ配列およびそのアミノ酸配列を
図７−１゜図７−２９図７−３に示す。またこれで形質
転換した大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｒ
Ｒｌ−Ｚｅｍ９９６０００は微工研寄託番号ＦＥＲＭ　
Ｐ−９１２６である。

ｂ）糖鎖変異ｔＰＡ 得られたＺｅｍ　９９−６０００とｐｓＶ２−ｄｈｆｒ
とテＢＨＫ″Ｑ細胞株（ｔｓ、　ｔｋ”）をＬｏｙｔｅ
ｒの方法により形質転換し、限界希釈法でクローニング
し、培養上清を抗体カラムにチャージし、最終物質Ｎｌ
１６０００を得た。

Ｎα６０００について糖鎖の結合位置を分析したところ
。

天然ｔＰＡのアミノ酸配列におけるアミノ酸位置番号１
１７番、１８４番、４４８番のＡｓｎに糖鎖が結合して
おり、特に１８４番の糖鎖結合が不均一になりやすいと
考えられる問題が解決されていることが判明した。

実施例２ ａ）　１１９番ＳθｒをＭｅｔに置換するためのＤＮＡ
プラスミドの調製 図４に示したようにｐＤＲ１４９６よりＭ１３ｔｇ１３
０−ＷＲＦを作製した。

すなわちｐＤＲ１４９６をＳｐｈ　Ｉ　、　Ｘｂａ　Ｉ
にて切断し。

Ｂｇｌ　ＩＩ制限酵素切断部位を含む約２．Ｉ　Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片とＭ　１３　
ｔｇ　１３０ＲＦのＳｐｈ　ｌ　、　Ｘｂａ　■切断断
片とを結合させ、二本鎖Ｍ　１３　ＤＮＡとし、大腸菌
へ形質転換しＭ１３ｔｇ１３０−Ｗ　ＲＦ及び一本鎖Ｍ
　１３　ｔｇ　１３０−Ｗを得た。

次に、　ｔＰＡの１１９ＳｅｒをＭｅｔに置換させる目
的で式：　５’　ＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＴ
ＴＣＣＡＧＴＴ３’のオリゴヌクレオチドを合成し、こ
れを変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーとじ一本
鎖Ｍ１３ｔｇ１３０−Ｗとにより部位特異的な変異誘発
を行ない。

スクリーニングし９部位特異的な変異の生じたファージ
を得た。このファージより一本鎖Ｍ１３ＤＮＡを得、Ｄ
ＮＡ塩基配列決定により塩基配列を確認し、更に二本鎖
Ｍ１３ＤＮＡを得、　Ｍ　１３　ｔｇ　１３０−Ｗ１６
　　ＲＦとした。

次に図５に示した様にＭ１３ｔｇ１３０−Ｗ１６　　Ｒ
ＦよりＺｅｍ　９９−６３００を調製した。

すなわちＭ　１３　ｔｇ　１３０−Ｗ　１６　　ＲＦを
Ｂｇｌ［、Ａｐａｌにて切断し１．４ＫｂｐのＤＮＡ断
片を回収しこの断片と、　Ｚｅｍ９９をＢｇｌ　ＩＩ　
、　Ａｐａｌ　ｉＣテ切断り、り断片ｔ−Ｍ合させ、大
腸菌に形質転換し、プラスミドを回収しＺｅｍ　９９−
６３００を得た。

なおＺｅｍ　９９−６３００の変異ｔＰＡ　：Ｉ−ディ
ング領域のＤＮＡ配列およびそのアミノ酸配列を図８−
１゜図８−２２図８−３に示す。またこれで形質転換し
た大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏＬｉ　ＲＲｌ−
Ｚｅｍ９９６３００は微工研寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−９
１２７である。

ｂ）糖鎖変異ｔＰＡ Ｚｅｍ　９９−６３００を使用し、実施例１　ノｂ）　
項（７）記載と同様にして最終物質Ｎα６３００を得た
。Ｎα６３００について糖鎖の結合位置を分析したとこ
ろ、天然ｔＰＡのアミノ酸配列におけるアミノ酸位置番
号１８４番と４４８番のＡｓｎにのみ糖鎖が結合してお
り、１１７番のＡｓｎには糖鎖が結合していないことが
判明した。

実施例３ ａ）　１１９番ＳｅｒをＭｅｔに置換し、かつ９６番Ｇ
ｉｎをＡｓｎに、９８番１１ｅをＴｈｒに置換するため
のＤＮＡプラスミドの調製 実施例工のａ）で作製したＭ　１３　ｍｐ　１８／Ｂａ
ｍ　Ｚｅｍ９９を用意した。

次に、　ｔＰＡの”ＧｉｎをＡｓｎに”ＩｌｅをＴｈｒ
に置換させる目的で式：　５’　ＣＣＴＧＴＡＧＣＴＧ
ＧＴＡＣＣＧＴＴＧＴＣＣＴＣＧＴＡ　３’のオリゴヌ
クレオチドを合成し、これを変異誘発性オリゴヌクレオ
チドプライマーとしＭ　１３　ｍｐ　１８／Ｂａｍ　Ｚ
ｅｍ　９９とにより部位特異的す変異誘発を行ない、ス
クリーニングし２部位特異的な変異の生じたファージを
得る。このファージより一本鎖Ｍ１３ＤＮＡを得、　Ｄ
ＮＡ塩基配列決定により塩基配列を確認し、さらに、二
本鎖Ｍ１３ＤＮＡを得、　Ｍ　１３　ｍ６２．５　　Ｒ
Ｆとした。（図６）Ｍ　１３　ｍ　６２．５　　ＲＦを
Ｂｇｌ　ｆｌ　、　Ｎａｒ　ｌにて、また実施例２（７
）ａ）テ作製したＭ　１３　ｔｇ　１３０−Ｗ　１６　
　ＲＦをＮａｒ　■、　Ａｐａ　Ｉにて切断し、それぞ
れ３３１ｂｐ。

１０６８　ｂｐのＤＮＡ断片を回収する。これらのＤＮ
ＡとＺｅｍ９９のＢｇｌ　■、　Ａｐａ　Ｉ切断断片を
結合させ。

大腸菌に形質転換し、プラスミドを回収しＺｅｍ９９−
６４００を得た。（図６） なおＺｅｍ　９９−６４００の変異ｔＰＡ　：Ｉ−ディ
ング領域のＤＮＡ配列およびそのアミノ酸配列を図９−
１゜図９−２１図９−３に示す。またこれで形質転換し
た大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＲＲＩ−
Ｚｅｍ９９６４００は微工研寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−９
１２８である。

ｂ）糖鎖変異ｔＰＡ Ｚｅｍ　９９−６４００を使用し、実施例１ノｂ）項１
７）記載と同様にして最終物質Ｎα６４００を得た。Ｎ
α６４００について糖鎖の結合位置を分析したところ、
天然ｔＰＡのアミノ酸配列におけるアミノ酸位置番号９
８番、１８４番、４４８番のＡｓｎに糖鎖が結合してお
り。

１１７番のＡｓｎには糖鎖が結合していないことが判明
した。

（６）発明の効果 以下の実験例によって本発明の効果を示す。

実験例１ 試料と方法 実施例１〜３で得られたＮα６０００．　Ｎα６３００
　。

Ｎα６４００を検体試料とし、また天然ｔＰＡを対照試
料トシタ。３９６マニトール、３９６アスパラギン酸オ
よび３９６アルギニンを含むｐＨ６，０の水溶液に各試
料を溶解し、　ＳｐｒａｔＤａｗｌｅｙ系雄性ラット（
体重２３０〜２７０　ｙ　）に各々０．４■７に、ずつ
を大腿部静脈内に投与し、経時的に頚静脈から０．５　
ｍＬずつ採血し。

少量の３．８９６クエン酸を添加して遠心分離し、血漿
を得た。血漿中の各ｔＰＡ濃度はサンドイツチ法による
酵素免疫測定法で測定した。

結果 結果を図１０に示す。図１０は各試料についての血漿中
濃度の経時的推移を示すグラフであり１図中・印線、○
印線、Δ印線、ム印線は、それぞれ天然ｔＰＡ、　ＮＧ
、６０００．　Ｎα６３００．　Ｎα６４００における
結果を示す。図１０において各試料濃度の経時的推移は
ｔｗｏ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ　ｍｏｄｅｌで解析さ
れる。消失半減期Ｔｌ／２（α）およびＴｌ／２（β）
を求めた。その結果を表１に示す。表中の数値は３例の
平均値であり。

単位はｍｉｎである。

表１ 試料　Ｔｌ／２（α）　　Ｔｌ／２（β）天然ｔＰＡ　
　　　　１．６０　　　　　３１．７４Ｎα６０００　
　　２．０９　　　　２８．６７Ｎα６３００　　　６
．６７　　　１２６．５　ＯＮα６４００　　　５．３
２　　　　５８．９３図１０および表１より本発明糖鎖
変異ｔＰＡが血中濃度消失において天然ｔＰＡを格段に
改善したものとなっていることが判明する。

実験例２ 実施例１〜３で得られた魔６０００．　Ｎα６３００　
。

Ｎα６４００を検体試料とし、また天然ｔＰＡを対照試
料とした。各試料約５００μｇにｐＨ７，１２緩衝液（
イオン強度０．０５）を溶解液として加え、２６°Ｃで
５分間撹拌し、８時間振とうしてから遠心分離し、上澄
液にライてＩ（ＰＬＯ（ＵＶ　２２０　ｎｍ）により蛋
白量を求め溶解度を定めた。結果を表２に示す。表中の
数値はｍｙ／ｍＬによって示される。

表２ 試料　　　溶解度 天然ｔＰＡ　　　　　０．１０６ Ｎへ６０００　　　０．２５ Ｎα６３００　　　０．０４２ ｋ　６４００　　　０．１０５ 表２より本発明糖鎖変異ｔＰＡは医療目的に応じて溶解
度を適宜に調節できるものとなっていることが判明する
。

実験例３ 試料と方法 実施例１〜３で得られたＮα６０００．　Ｎα６３００
　。

Ｎα６４００を検体試料とし、また天然ｔＰＡを対照試
料とした。アトム静脈カテーテル（４Ｆｒ、　３．５　
ｃｒａ　）に３ｃｍ長の絹糸を入れ、注入用シリンジに
結合させておく。別に血液と３．８９６クエン酸ナトリ
ウムを９：１に混合してヒトクエン酸血液を用意し、こ
の液０．５ｓＬにＩ″Ｉでラベルしたフィブリノーゲン
（２５μＣ１１５０μＬ生理食塩水）、　０．２５Ｍ塩
化カルシウム５０μｔ、　　トロンビン５Ｕ／１０ｔＬ
Ｌを加える。得られる溶液１６μｔを前記注入用シリン
ジに吸いとってカテーテル内に注ぎ、室温６０分間放置
する。絹糸をカテーテルからとり出し、生理食塩水で洗
浄してから放射活性を測定し、スタート時のフィブリン
血栓値とした。次にこの絹糸をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗ
ｌｅｙ系雄ラット（２００−３００ｙ　）の頚動静脈（
ＡＶシャント）内に入れ、続いて計算量の試料を１ｒＬ
Ｌの溶解液に希釈したものを同ラットの大腿静脈より投
与し、２時間経過後に絹糸をとりだし、放射活性を測定
して残存ブイプリン血栓値とした。下式により血栓残存
率（９６）を求めた。

×１００ 結果 結果を図１１に示す。図１１は試料の投与量と血栓残存
率との関係を示すグラフであり９図中、実線（−）１点
線（・・・・・・）、一点鎖線（−・−）、二点鎖線（
−・・−）はそれぞれ天然ｔＰＡ、　Ｎα６０００　。

Ｎα６３００．　Ｎα６４００についての二側の平均値
の結果を示す。

図１１より本発明糖鎖変異ｔＰＡは天然ｔＰＡと同程度
に血栓溶解活性を有することが判明する。

【図面の簡単な説明】

図１はＺｅｍ　９９の制限酵素マツプである。 図２はＭ　１３　ｍｐ　１Ｂ／Ｂａｎ　Ｚｅｍ　９９　
ｃ７）構築図テアル。 図３はＺｅｍ　９９−５ＱＱＱの構築図である。 図４はＭ　１３　ｔｇ　１３０−Ｗ　　ＲＦの横築図で
ある。 図５はＺｅｎｎ９９−６３００の構築図である。 図６はＺｅｍ　９９−６４００の構築図である。 図７−１１図７−２９図７−３はＺｅｍ　９９−６００
０の変異ｔＰＡコーディング領域のＤＮＡ配列およびそ
のアミノ酸配列である。 図８−１２図８−２１図８−３はＺｅｍ　９９−６３０
０の変異ｔＰＡコーディング領域のＤＮＡ配列およびそ
のアミノ酸配列である。 図９−１９図９−２２図９−３はＺｅｍ　９９−６４０
０の変異ｔＰＡコーディング領域のＤＮＡ配列およびそ
のアミノ酸配列である。 図１０は血漿中濃度の経時的推移を示すグラフである。 図１１は投与量と血栓残存率の関係を示すグラフである
。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）天然ｔＰＡのアミノ酸位置番号１８３番のＧｌｙ
   および１８６番のＳｅｒをそれぞれＳｅｒおよびＴｈｒ
   に置換した変異ｔＰＡ
2. （２）天然ｔＰＡのアミノ酸位置番号１１９番のＳｅｒ
   をＭｅｔに置換した変異ｔＰＡ
3. （３）天然ｔＰＡのアミノ酸位置番号９６番のＧｌｎ、
   ９８番のＩｌｅおよび１１９番のＳｅｒをそれぞれＡｓ
   ｎ、ＴｈｒおよびＭｅｔに置換した変異ｔＰＡ
4. （４）天然ｔＰＡのアミノ酸位置番号１８３番のＧｌｙ
   および１８６番のＳｅｒをそれぞれＳｅｒおよびＴｈｒ
   に置換した変異ｔＰＡをコードするｃＤＮＡ
5. （５）天然ｔＰＡのアミノ酸位置番号１１９番のＳｅｒ
   をＭｅｔに置換した変異ｔＰＡをコードするｃＤＮＡ
6. （６）天然ｔＰＡのアミノ酸位置番号９６番のＧｌｎ、
   ９８番のＩｌｅおよび１１９番のＳｅｒをそれぞれＡｓ
   ｎ、ＴｈｒおよびＭｅｔに置換した変異ｔＰＡをコード
   するｃＤＮＡ
7. （７）下記によって識別表示されるいずれかの発現プラ
   スミド Ｚｅｍ９９−６０００、Ｚｅｍ９９−６３００、Ｚｅｍ
   ９９−６４００
8. （８）下記によって識別表示されるいずれかの発現プラ
   スミドにより形質転換された宿主転換体 Ｚｅｍ９９−６０００、Ｚｅｍ９９−６３００、Ｚｅｍ
   ９９−６４００
9. （９）宿主が大腸菌である特許請求の範囲第８項記載の
   宿主転換体
10. （１０）宿主が動物細胞である特許請求の範囲第８項記
    載の宿主転換体
11. （１１）動物細胞がＢＨＫ細胞である特許請求の範囲第
    １０項記載の宿主転換体
12. （１２）天然ｔＰＡのアミノ酸位置番号１８３番のＧｌ
    ｙおよび１８６番のＳｅｒをそれぞれＳｅｒおよびＴｈ
    ｒに置換した変異ｔＰＡを有効成分として含有する医薬
    組成物
13. （１３）天然ｔＰＡのアミノ酸位置番号１１９番のＳｅ
    ｒをＭｅｔに置換した変異ｔＰＡを有効成分として含有
    する医薬組成物
14. （１４）天然ｔＰＡのアミノ酸位置番号９６番のＧｌｎ
    、９８番のＩｌｅおよび１１９番のＳｅｒをそれぞれＡ
    ｓｎ、ＴｈｒおよびＭｅｔに置換した変異ｔＰＡを有効
    成分として含有する医薬組成物
15. （１５）医薬組成物が血栓症治療剤である特許請求の範
    囲第１２項ないし第１４項記載の医薬組成物