KR20130099027A - 혈전용해 및 응고억제 특성을 갖는 단백질 융합 구조물 - Google Patents
혈전용해 및 응고억제 특성을 갖는 단백질 융합 구조물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규의 하이브리드 단백질에 관한 것이고, 상기 하이브리드 단백질은 플라스미노겐 활성화제 및 혈전억제 성질, 예를 들어 심근 경색, 발작 등에 이르게 되는 근원적인 혈관 조직 손상에 기인하는 피브린 덩어리 형성을 수반하는 순환 장애의 치료에 대해 상기 단백질을 매우 유리하게 하는 덩어리 특이적 작용을 모두 갖는다. 또한 플라스민 또는 트롬빈 의존적인 방식으로 플라스미노겐을 활성화함으로써 혈전을 용해시키고 또한 본래의 혈액 응고 경로를 통한 트롬빈의 활성 및 생성을 모두 억제하는데 일조하는 신규의 단백질 및 상기 단백질의 수득 방법을 개시한다.
Description
본 발명은 혈전용해 단백질 및 트롬보모듈린의 4, 5, 6 상피 성장 인자-유사 도메인(EGF 4,5,6)을 포함하는 키메릭 융합 단백질을 포함하는 혈전용해 약물에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질은 플라스미노겐 활성화, 트롬빈 억제, 및 응고억제 단백질 C 경로 활성화 활성을 갖는다. 본 발명의 융합 단백질은 혈전을 파괴하고 혈전 부위의 재폐쇄를 방지하는 치료 능력을 갖는다.
혈관계 내에서 혈병 또는 혈전이 형성되고 발달하는 혈전증은 출혈 중에 발생할 때는 구명 과정이지만, 다른 어떤 때에 발생하는 경우는 생명을 위협할 수 있다. 상기 혈전은 혈관을 막아 기관 또는 다른 신체 부분으로의 혈액 공급을 중지시킬 수 있다. 떨어지는 경우, 상기 혈전은 색전이 되어 원래의 부위로부터 먼 혈관을 폐쇄할 수 있다. 혈전성 질환은 현재 세계적으로 개발 도상국가 및 선진국 모두에서 주된 사망 원인 중 하나를 구성한다. 혈전성 순환 질환에 대한 가장 바람직한 응급조치("SOS") 약물 치료는 여전히 플라스미노겐 활성화제 단백질 약물, 예를 들어 스트렙토키나제(SK), 스타필로키나제(SAK) 및 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)이지만, 상기 약물 치료는 이의 사용과 관련된 출혈 위험성, 및 또한 종종 마주치게 되는 트롬빈 활성 및/또는 트롬빈의 새로운 생성에 기인한 동일한 혈병 손상 부위에서의 혈전 재형성 문제로 인해, 부유한 국가들에서의 스텐트 시술 및 우회 수술과 같은 응급 심장 중재술에 대한 우위를 서서히 상실하고 있다. 따라서, 혈병 특이성 및 혈전방지 성질과 같은 추가적인 특징들을 갖는 더 빠르고 더 유효한 혈전용해 약물을 개발할 필요가 시급하다.
혈병 형성은 여러 생화학적 사건들이 손상 부위에서 밀폐 또는 수복을 유발하는 복잡한 캐스케이드 반응 세트의 최종-결과이다(문헌[Butenas and Mann 2002]). 혈액 응고 캐스케이드의 개시를 기초로 하여, 경로를 외부 및 내재 경로로 나누었으며, 이때 상기 외부 경로는 조직 인자(TF)의 노출에 의해 개시되는 반면, 상기 내재 경로는 인자 XII(하게만 인자), 고 분자량 키니노젠(HK) 또는 프리칼리크레인에 의해 개시된다. 그러나, 상기 두 캐스케이드 경로는 모두 최종적으로 인자 Xa 생성 지점에서 합류하고, 후속으로 공통의 트롬빈 매개된 피브린 생성을 따라간다(문헌[Cannon and Tracy 1995]).
트롬빈 생성은 척추동물에서 혈액 응고 과정의 중심 단계이다. 상기 트롬빈 생성 과정 동안 소량의 트롬빈이 피브린 덩어리/네트워크(확대 시)에 통합되게 되며, 유리된 상기 프로테아제의 촉매 부위(흡수된 트롬빈 중에는 없다)는 상기 덩어리 성장을 증폭시킬 수 있다(문헌[Liu, Nossel et al. 1979]; [Vali and Scheraga 1988]). 트롬빈은 다양한 기질들과 상호작용하며 여러 가지 덩어리 촉진 인자들을 활성화한다, 예를 들어 (a) 상기 트롬빈은 동족 수용체의 절단에 의해 혈소판의 활성화를 일으키고, (b) 인자 V, VIII 및 XI의 피드백 활성화를 일으키며, (c) 트랜스글루타미나제, 인자 XIII의 활성화를 일으키고, (d) 피브리노겐을 피브린으로 전환시킨다. 일단 상기 덩어리가 형성되고 병적인 상태 하에서 가닥-간 가교결합에 의해 안정화되면, 상기 덩어리는 혈관 중의 정상 혈류를 방해하여 동맥과 정맥의 봉쇄에 이르게 한다.
동물/인간에서 병적인 혈전 형성으로부터 나오는 순환 질환에 대한 가장 통상적이고 바람직한 약물 치료 중 하나는 혈전용해제의 정맥 내 주입이다(문헌[Lijnen and Collen 1988]; [Collen and Lijnen 1990];[Francis and Marder 1991]). 입수할 수 있는 혈전용해제, 예를 들어 스트렙토키나제(SK), 유로키나제(UK) 및 조직 유형 플라스미노겐 활성화제(tPA)는 필수적으로 동일한 플라스민-의존성 기전을 통해 작용하며(이들 용해제가 플라스미노겐 활성화제들이므로), 이때 이들 용해제는 플라스미노겐의 잔기 561과 562 사이의 끊어지기 쉬운 펩타이드를 절단하고 이를 이의 단백질 분해에 의해 활성화된 형태인 플라스민으로 전환시킨다. 조직 유형 플라스미노겐 활성화제 및 유로키나제는 인간 플라스미노겐 중의 끊어지기 쉬운 펩타이드 결합을 특이적으로 인식하는 프로테아제(직접 활성화제)인 반면, 스트렙토키나제 및 스타필로키나제(이들은 프로테아제라기보다는 단백질 "보조-인자"이며 따라서 "간접적인" 활성화제이다)(문헌[De Renzo, Boggiano et al. 1967]; [Buck, Hummel et al. 1968]; [McClintock and Bell 1971]을 참조하시오)는 먼저 플라스민 또는 플라스미노겐과 탄탄한 1:1 복합체를 만들고, 생성된 단백질 분해적으로 활성인 복합체(들)는 다른, "유리" 플라스미노겐 분자의 끊어지기 쉬운 펩타이드 결합을 절단하고 플라스민을 기하급수적으로 생성시킨다(문헌[Wohl, Summaria et al. 1978]; [Castellino and Powell 1981]; [Wohl, Sinio et al. 1983]; [Davidson, Higgins et al. 1990]에 의해 재고찰되었다). 현재 입수할 수 있는 모든 혈전용해제들, 즉 플라스미노겐 활성화제 단백질 약물들 중에서, 스트렙토키나제가 가장 높은 혈전용해력을 나타내지만, (SAK와 같이)세균 기원의 것인 상기 스트렙토키나제는 소수의 환자들에게서 면역반응을 야기한다는 한계를 갖는다. 그럼에도 불구하고, tPA 및 UK에 비해 상기 스트렙토키나제의 비교적 저렴한 값으로 인해 값이 적당한 혈전용해제로서 널리 사용되고 있다.
성공적인 혈전용해 요법은 정상 혈류의 유지를 도우며 상당 수의 환자들에게서 생존을 개선시키지만(문헌[Verstraete 1990]), 종종 동일한 부위에서의 조기 재-폐쇄 또는 재혈전증은 상기 혈전용해 약물의 성공적인 적용을 계속해서 제한하여 왔다. 여러 연구들이 혈전용해 요법 후 환자의 30% 이하에서 조기 재폐쇄가 일어남을 입증한다(문헌[Ohman, Califf et al. 1990]). 상기 재혈전증 또는 조기 재폐쇄의 원인은 혈액의 응고항진을 증가시키는 플라스민 활성에 의해 설명되며(문헌[Eisenberg, Miletich et al. 1988]); 플라스민이 접촉 인자들(문헌[Ewald and Eisenberg 1995]), 인자 V(문헌[Lee and Mann 1989]) 및 추정 상 또한 프로트롬빈(문헌[Seitz et al., 1993])을 활성화함이 제안되고 있다. 또 다른 제시된 이유는 상기 프로트롬빈의 용해에 이은 덩어리-결합된 트롬빈의 노출이며, 이는 차례로 보다 많은 트롬빈을 생성시키고, 이때 피브린-결합된 트롬빈은 항-트롬빈 억제제/들에 비교적 내성이며(문헌[Hogg and Jackson 1989; Weitz, Hudoba et al. 1990]); 상기 "유리된" 트롬빈은 다시 상기 응고촉진제 활성을 국소적으로 활성화하여 혈소판을 활성화하기 시작하고(문헌[Kumar, Beguin et al. 1994]; [Puri, Kumar et al. 1995]), 이에 의해 생화학적 사건들의 주기를 촉진하여 재혈전증에 이르게 된다. 따라서, 손상 부위에서 직접 및 응고촉진 활성의 "부차적인" 수준에서 상기 트롬빈의 억제는 모두, 상술한 불필요한 연쇄 사건들을 크게 좌절시킬 것이다. 상기와 같은 성질이 상기 혈전용해 약물과 동일한 분자 중에 성공적으로 통합되는 경우, 구명에 관한 이점은 명백하다.
플라스미노겐 활성화제는 플라스미노겐의 플라스민으로의 효소적 전환을 특징적으로 촉매화하는 프로테아제 과이다. TPA는 단일의 아르기닌-발린 결합의 가수분해를 통해 플라스미노겐을 플라스민으로 효소적 전환시킨다.
조직 플라스미노겐 활성화제(또한 피브리노키나제, 외부 플라스미노겐 활성화제, t-PA 또는 TPA로서 또한 공지됨)는 당단백질이며 약 70,000 달톤(68,000 달톤)의 대략적인 분자량(MW)을 갖는다. 상기 활성화제는 단일의 아르기닌-발린 결합의 가수분해를 통해 전구-효소 플라스미노겐의 활성 효소 플라스민으로의 효소적 전환을 촉매화하는 세린 프로테아제이다. 상기 t-PA의 촉매 부위는 아미노산 His-322, Asp-371 및 Ser-478로 구성된다. t-PA는 피브린의 부재 하에서는 불충분한 플라스미노겐 활성화제이다. 상기 아미노-말단 영역은 여러 도메인들로 구성되며, 이들 도메인은 다른 단백질들에 대해 상동성이다. 이들 별개의 도메인들은 상기 효소의 여러 작용들, 예를 들어 피브린에의 결합, 피브린-특이성 플라스미노겐 활성화, 내피 세포 수용체에의 결합 및 생체 내에서 빠른 제거에 관련된다. 아미노산 잔기 50 내지 87을 포함하는 하나의 상기와 같은 도메인(E 도메인)은 인간 상피 성장 인자와 상동이며 피브린 결합, 피브린 친화성 및 생체 내 제거에 관련되는 것처럼 보인다. 상기 t-PA cDNA는 클로닝되고 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 후속 발현되었다.
조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA)는 피브린 덩어리와 회합된 플라스미노겐의 특이적인 활성화를 맡고 있는 포유동물 피브린용해 시스템의 성분이다(즉 상기 활성화제는 혈병을 용해시킬 수 있다). 조직 플라스미노겐 활성화제-매개된 덩어리 용해는 혈장에서 증가된 수준의 피브리노펩타이드-A(이는 덩어리-결합된 트롬빈의 직접적인 마커이다)를 보인다(문헌[Weitz, Leslie et al. 1998]). 조직 플라스미노겐 활성화제와 현재 공지된 항-트롬빈 약물, 예를 들어 헤파린 및 히루딘과의 조합이 종종 약물 치료에 사용되었지만, 상기 항-트롬빈은 유리 트롬빈에만 작용하며, 상기 덩어리-결합된 트롬빈은 이의 낮은 친화성으로 인해 헤파린 및 다른 억제제들에 대해 내성이다. 게다가, 상기 약물은 추가적인 트롬빈 생성의 간접적인 프로모터(예를 들어 인자 V 및 인자 VIII)에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 덩어리 결합된 트롬빈뿐만 아니라 트롬빈의 간접적인 프로모터, 예를 들어 인자 V 및 인자 VIII의 억제와 함께 플라스미노겐을 활성화하는 신규의 키메릭 단백질을 설계할 필요가 있다.
혈전용해-후 플라스민 활성 및 결과적인 트롬빈 생성에 대한 연구는 병적인 덩어리가 혈전용해 약물에 의해 제거된 경우에조차 응고 경로의 재-활성화를 이끄는 효능 있는 인자들이 존재함을 명백히 암시한다. 또한, 상기 생성된 트롬빈은 자체가 효능 있는 응고 경로 활성화제이다. 트롬빈이 또한 응고 억제 작용을 수행함은 주목할만하며, 이는 맥관구조 전체를 통해 "폭주" 응고가 존재하지 않도록 하는 지혈 시스템의 "자기-제한" 조절 기전의 훌륭한 예이다. 유리 트롬빈은 세포 표면 단백질인 트롬보모듈린과 1:1의 고-친화성, 비-공유 복합체를 만든다(문헌[Kurosawa, Galvin et al. 1987]). 일단 상기 트롬빈-트롬보모듈린 복합체가 형성되었으면, 이의 기질 특이성은 응고-촉진 방식에서 응고-억제 방식으로 방향을 바꾸며, 이에 의해 단백질 C 응고억제 경로가 활성화된다. 따라서, 트롬빈이 단독으로 단백질 C를 활성화한다지만, 일단 트롬보모듈린과 복합체를 형성하면 단백질 C 활성화를 거의 1000 배까지 가속화한다(문헌[Esmon and Owen 1981]; [Owen and Esmon 1981]).
성숙한 트롬보모듈린은 상이한 작용들, 즉 트롬빈 억제 및 단백질 C 활성화를 맡고 있는 상이한 도메인들을 함유하며, 이들 도메인은 상기 큰 단백질의 상피 성장 인자-유사 도메인들 중에 존재한다. 상피 성장 인자-유사(EGF) 도메인 5 및 6은 주로 트롬빈 친화성에 기여하고 EGF 4, 5 및 6 도메인은 함께 단백질 C를 활성화한다(문헌[Kurosawa, Stearns et al. 1988]; [Stearns, Kurosawa et al. 1989]). 트롬보모듈린, 또는 이의 단리된 EGF 도메인 4, 5 및 6은 단백질 C-중심 응고억제 경로를 활성화하고 트롬빈의 활성을 직접적으로 억제하는 것으로 공지되어 있으나, 혼자서 상기 피브린 덩어리를 용해시킬 수는 없다. 이 때문에, 혈전용해제가 필요하다. 상기 2 가지 유형의 작용제는 모두 서로 독립적으로 심장 혈전병 동안 사용될 수 있지만, 상기 2 가지 유형의 특징을 모두 갖는 단일 약물(지금까지 입증되지 않았다)의 이점은 명백하다.
"지혈"이란 용어는 혈관/맥관계에서 응고억제와 응고촉진 활성 간의 균형을 지칭하며, 이때 통상적으로 혈액 성분, 특히 혈소판은 혈관 내층과 병적으로 상호작용하지 않는다. 손상 또는 질병 상태의 경우에, 혈소판은 부착하는 경향이 있으며, 그 결과 혈액 응고 인자들이 상기 손상 부위에서 축적되고 활성화되기 시작하며, 이는 상기 손상 부위에서의 수복을 개시하기 위한 반응이지만, 혈액 폐쇄를 생성시키고, 이에 의해 종종 혈전증 위기에 빠지게 된다.
혈관 내 혈액 응고 및 덩어리의 용해는 모두 정상적인 지혈에 필요한 생리적 과정이다. 상기 혈관 내부의 덩어리 형성 및 용해 기전은 문헌에 널리 공지되어 있으며, 상이한 응고 촉진 단백질(덩어리 촉진) 및 응고 억제 단백질의 역할 또한 현재 꽤 잘-연구되어 있다. 덩어리 형성은 트롬빈이 응고 캐스케이드 촉진뿐만 아니라 개시에 중심 역할을 하는 일련의 복잡한 반응들의 결과이며, 이때 최종-결과는 안정한 피브린 망의 형태로 나타난다.
모든 현대적인 혈전용해/피브린용해 요법은 대개 덩어리 용해 중 응고-촉진과 응고-억제 간의 정상적인 평형 유지에 필요한 혈전억제 약물 치료(예를 들어 아스피린, 헤파린 등)를 또한 병행한다. 용해 중에, 일시적으로 유리된 트롬빈은 자기-생성 고리를 개시하여 덩어리 성장을 증폭시키며; 때때로 이는 상기 평형을 덩어리의 재형성, 또는 응고-촉진/덩어리 프로모터의 활성화 쪽으로 이동시킨다.
혈전용해제는 병적인 덩어리를 순환계 중에 내재하는 플라스미노겐을 활성화시킴으로써 용해한다. 상기 입수 가능하고 치료학적으로 유용한 혈전용해제들 중에서, 스트렙토키나제는 최고의 혈전용해 능력을 나타내지만 때때로 덩어리 특이성의 결여로 인해 상기 약물 치료 중 출혈을 유도한다. 이러한 문제는 다른 혈전용해제들(tPA 및 SAK)과 비교적 덜 관련되는데, 그 이유는 이들의 비교적 증가된 피브린 덩어리 특이성 때문이다. 그러나 이들 혈전용해제의 다른 단점은 보다 적은 피브린용해 능력 및 보다 짧은 생체 내 반감기이다. 상기 모든 혈전용해제들은 본질적으로 동일한 혈전용해(플라스미노겐 활성화) 기전을 갖지만, 혈전용해 후 생성되는 트롬빈이 종종 혈액 응고 인자 Va 및 인자 VIIIa에 의해 조절되는 피드백 기전에 의해 트롬빈 생성을 더욱 증폭시킨다는 공통의 문제를 공유한다. 상기 혈전용해 과정에서, 형성되어 있는(in-built) 항-트롬빈 및 다른 외부에서 제공된 트롬빈 억제 약물에 대해 비교적 내성인 상기 덩어리-결합된 트롬빈은 또한 순환계 내로 방출된다. "원래" 손상에 근접하여 존재하는 상기 덩어리-결합된 트롬빈은 또한 상기 덩어리/손상 부위의 부근에, 특히 덩어리의 불완전한 제거 후에 훨씬 더 많은 트롬빈을 생성시키는데 일조하며, 이는 임상적으로 중대한, 조기 재-폐쇄 문제를 도출한다.
다른 내재하는 응고-촉진제의 용해 및 활성화 중 트롬빈 생성은 지혈 평형의 통상적인 부분이다. 헤파린, 히루딘 및 화학적으로 합성된 약물과 같은 트롬빈 억제제는 트롬빈을 억제하고, 과민성 혈소판 형성 과정의 억제, 피브리노겐에서 피브린으로의 전환의 억제, 및 혈중 응고항진을 유도하는 다른 덩어리 촉진 활성과 같은, 이의 후속의 일시적인 효과들을 방지할 수 있다. 그러나, 현저하게도, 이들 직접적인 억제제는 모두 일시적으로 생성된 트롬빈에 대해서 작용하지만, 트롬빈 생성을 실제로 가속화하고 응고촉진 경로에 핵심 역할을 하는 인자들에 대해서는 작용하지 않는다. 따라서, 이들 약물 중 어느 것도 트롬빈 생성 및 조기 재-폐쇄에서 중대한 역할을 하는 혈액 응고 인자 V 및 VIII에 대해 목적하는 만큼 유효하게 작용하지 않는다.
널리 공지된 세포 표면 분자 트롬보모듈린은 트롬빈과 1:1 복합체를 형성하고 이의 응고-촉진 작용을, 효능 있는 응고-억제제, 즉 단백질 C 활성화제로 향하게 한다. 활성화된 단백질 C와 단백질 S는 모두 활성화된 인자 V 및 인자 VIII을 퇴화시킨다(문헌[Esmon 1989]).
모든 입수 가능한 혈전용해제들이 덩어리 용해 능력을 가지며 이들의 기전이 문헌에 매우 분명하더라도, 덩어리 용해 중에, 잔여 덩어리 및 플라스민은 트롬빈 생성을 유도하며; 동시에 이들 작용제는 상기 덩어리의 용해 중에 일시적으로 나타나는 트롬빈을 불활성화할 수 없고, 그 결과 혈전용해 요법에 따른 통상적인 문제인 재폐쇄가 발생한다. 지금까지, 재혈전증에 주된 책임이 있는 "실제 장본인"을 불활성화하기 위한, 혈전용해와 트롬빈 억제 성질, 특히 응고-촉진 활성이 겸비된 항-트롬빈 약물을 입수할 수 없었다.
본 발명은 플라스미노겐을 활성화할 수 있음과 별개로, 트롬빈 생성을 억제하는 능력을 또한 나타내는 개선된 혈전용해 약물의 설계에 관한 것이다. 동일한 분자 중의 이러한 이중 성질의 존재는 혈전용해 요법 후 조기 재-폐쇄 문제를 최소화하는데 일조하므로 잠재적으로는 임상적으로 대단히 이롭다. 본 발명은 전략적으로 설계된 키메릭 폴리펩타이드를 개시하며, 이때 트롬보모듈린으로부터 유도된, 항트롬빈-성질을 갖는 도메인/구획을, 생성되는 융합/키메릭 폴리펩타이드가 덩어리 용해(혈전용해)뿐만 아니라 동시에 항-트롬빈 성질을 나타내도록 다양한 혈전용해성 단백질들과 융합시킨다. 이러한 신규의 융합 구조물들은 플라스민 및/또는 트롬빈 의존적인 방식(상기 방식은 피브린 덩어리가 플라스민-뿐만 아니라 트롬빈-풍부이므로 상기 구조물을 덩어리-특이적으로 만드는 반면, 유리 플라스민 및 트롬빈은 순환계에서 오래가지 못하고, 세르핀, 예를 들어 알파-2 항플라스민, 항-트롬빈 등에 의해 급속히 불활성화된다)으로 혈전용해 시스템을 활성화하는 능력을 갖는다. 상기 구조물은 또한 덩어리 용해 중에 유리된 일시적으로 생성된 트롬빈을 억제하는 동시에, 혈전성 질환, 예를 들어 발작, 심근 경색, 심부정맥 혈전증 등의 사건에서 상기 작용제로 약물 치료하는 동안 이미 형성되어 있는(내재하는) 응고억제 단백질 C 경로를 또한 개시시킨다.
현재 입수할 수 있는 혈전용해제들과 달리, 본 발명은 응고 캐스케이드(상기 플라스민-의존성 혈전용해 경로를 활성화하는 능력 이외에)의 인자 Va 및 VIIIa 및 또한 본래 형성되어 있는 응고억제 단백질 C 경로를 표적화할 수 있는 신규의 혈전용해 구조물을 개시하며; 동일한 약물 분자 중의 이러한 여러 가지 바람직한 능력들의 조합적인 존재는 이들의 전체 효능을 개선시키고, 따라서 이들은 가장 잠재적으로 생명-위협적인 혈전용해 후 사건들 중 하나, 즉 응고 과정의 재발을 최소화하면서 병적인 혈병을 용해시킬 수 있다.
상기 접근법은 항-트롬빈 및 혈전용해 성질을 모두 갖는 융합 단백질의 생성을 설계하고, 시험하고 확인하는 것이다. EGF 4, 5, 6의 혈전용해 분자 내로의 성공적인 "작용성" 융합은 상기 EGF 4, 5, 6의 내재하는 트롬빈 친화성으로 인해 상기 혈전용해 분자를 트롬빈-풍부 덩어리 쪽으로 잠재적으로 표적화할 수 있다. 동시에, 상기 융합물이, 상기 2 개의 원래 "독립적인" 모 생물 활성들(즉 항-트롬빈 및 플라스미노겐 활성화제 활성)을 유지하는 것과 별개로, 전신적으로는 아니고 상기 덩어리의 부근에서 우선적으로 활성화된다는 점에서 상기 하이브리드 분자에 전구-약물 성질을 부여하며, 이는 상기 융합물의 표적화된 작용 성질로 인해 또 다른 매우 유용하고 유리한 특징일 수 있다.
본 발명에서, 단백질 C 활성화 능력뿐만 아니라 트롬빈 억제와 혈전용해 성질의 조합을 갖는 여러 하이브리드 단백질 분자들이, 현재 입수할 수 있는 혈전용해 약물의 효능을 대단히 개선시키고 상기 재혈전증 현상의 방지를 돕기 위해서 동일한 분자/들 중에 유효한 통합에 의해 성공적으로 작용화되었으며, 따라서 상기 동일한 작용제/분자에 통합된 이러한 모든 성질들의 존재는 다양한 혈전성 병리학적 증후군에서 폐쇄성 피브린 혈병에 실시간으로(일시적으로) 및 공간적으로(동일 반응계) 이로운 작용을 부여할 것이다.
본 발명에서, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제 및 스타필로키나제를 EGF 4, 5, 6과 융합시켜 플라스민 의존성 혈전용해 시스템의 개시 및 트롬빈 매개된 단백질 C 응고억제 경로의 성질을 모두 갖는 키메릭 분자를 생성시켰다. 더욱이, 본 발명의 일부 실시태양에서, 지금까지 보고되지 않았던, 혈전용해, 덩어리 특이성, 및 항트롬빈 활성의 성공적인 통합이 또한 성취된다.
상이한 융합 구조물에서, 상기 혈전용해제와 EGF 도메인 간의 융합 연접을 링커 중의 다양한 바람직한 아미노산 잔기들을 사용하여 조심스럽게 설계하였으며, 상기 키메라로부터의 EGF 4, 5, 6의 단백질 분해적 방출 및 결과적인 혈전 용해 성분의 활성화로 인해 시험관 내에서 상이한 시간-의존적인 플라스미노겐 활성화를 제공하는 상이한 트롬빈 및/또는 플라스민 절단성 부위를 도입시켰다. 상기 혈전용해제와 EGF 4, 5, 6의 연접부에서 상이한 트롬빈 절단성 부위/들의 존재는 이들 둘을 국소적으로 존재하는 효소(트롬빈 또는 플라스민)에 의해 트롬빈 풍부 덩어리의 부근에서 서로로부터 분리되게 하며; 따라서 절단 후에, 각각의 도메인은 이들의 작용을 독립적으로 수행한다. 더욱이, 일부 융합 구조물에서 트랜스글루타미나제-인식 가능한 가교결합 서열을, 상기 활성화된 도메인이 혈액 트랜스글루타미나제의 작용으로 인해 상피 조직(이의 손상은 첫째로 덩어리 생성을 도출하였다) 중의 또는 그 주변의 나머지 덩어리에 공유 결합되고 초기 덩어리 용해 후 오래 계속해서 플라스미노겐 활성화 및 트롬빈 억제 모두에 관해 국소화된 효과를 제공하도록 상기 키메릭 폴리펩타이드 중의 전략적인 위치에 도입시켰다. 이는 현재 사용되고 있는 어떠한 혈전용해 단백질 약물에서도 얻을 수 없는 특성인, 상기 약물의 "치유" 효과를 명백히 도출시킬 것이다.
도 1은 상이한 인-프레임 유전자 융합 구조물의 도식적 표현이며, 이때 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인이, 삼중-글리신(GGG), 또는 다른 조직 또는 피브린 덩어리와의 하이브리드 단백질의 응고 인자 XIII-촉매화된 공유 가교결합을 촉진하기 위한 트랜스글루타미나제-인식 신호(TG)뿐만 아니라 트롬빈-절단 가능한 서열(TCS)을 갖는 것들을 포함한 도메인-간 링커를 암호화하는 인-프레임 융합된 서열과 함께, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제 또는 스타필로키나제를 암호화하는 DNA와 융합되었다.
도 1A는 SK(스트렙토키나제)의 N-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 융합을 암호화하는 DNA 서열을 나타내는 개략적인 도안 A이다.
도 1B는 유연성 촉진 잔기(예를 들어 삼중-글리신 신장부, GGG)를 함유하는 적합한 링커를 통한 SK의 C-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 융합을 나타내는 개략적인 도안 B이다.
도 1C는 트랜스글루타미나제 인식 부위/잔기들의 신장부와 함께 SK의 N 및 C-말단에서의 동시적인 EGF 융합을 나타내는 개략적인 도안 C이다.
도 1D는 SK의 5 아미노산이 결실된, SK의 C-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 D이다.
도 1E는 트롬빈 인식 및 절단 가능 서열(TCS)이 EGF 및 SK의 연접부에 존재하는, SK의 N 및 C-말단에서의 EGF 4,5,6의 동시 융합을 나타내는 개략적인 도안 E이다.
도 1F는 트롬빈 인식 서열이 EGF 및 SK의 연접부에 존재하고 트랜스글루타미나제 인식 서열이 EGF의 개시 부분(N-말단 단부)에 존재하는, SK의 N 및 C-말단에서의 EGF 4,5,6의 동시 융합을 나타내는 개략적인 도안 F이다.
도 1G는 SK의 α 및 β 도메인의 연접부에서의 EGF 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 G이다.
도 1H는 SK의 β 및 γ 도메인의 연접부에서의 지정된 바와 같은 EGF 도메인들의 융합을 나타내는 개략적인 도안 H이다.
도 1I는 tPA(조직 플라스미노겐 활성화제)의 N 및 C 말단에서의 동시적인 EGF 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 I이다 모든 도면 및 상기와 같은 용어들이 명세서 중에 존재하는 어디에서나, "egf"는 tPA의 EGF-유사 도메인을 지칭하는 반면, "EGF456"은 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인을 지칭한다.
도 1J는 tPA의 C-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 J이다.
도 1K는 tPA의 N-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 K이다.
도 1L은 tPA(조직 플라스미노겐 활성화제)의 고유 egf가 결실된, tPA의 N 및 C-말단 모두에서의 EGF 4,5,6 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 L이다.
도 1M은 tPA의 고유 egf가 결실된, tPA의 N-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 융합을 나타내는 개략적인 도안 M이다.
도 1N은 tPA의 고유 egf 및 크링글(kringle) 1이 결실된, tPA의 N-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 융합을 나타내는 개략적인 도안 N이다.
도 1O는 tPA의 고유 egf가 결실된, tPA의 C-말단 단부에서의 EGF 융합을 나타내는 개략적인 도안 O이다.
도 1P는 tPA의 고유 egf 및 크링글 1이 결실된, tPA의 C-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 융합을 나타내는 개략적인 도안 P이다.
도 1Q는 tPA의 고유 egf가 EGF 4,5,6 도메인에 의해 교체된, tPA와의 EGF 4,5,6 도메인 융합을 나타내는 개략적인 도안 Q이다.
도 1R은 tPA의 고유 egf 및 크링글 1이 EGF 4,5,6 도메인에 의해 교체된, tPA와의 EGF 융합을 나타내는 개략적인 도안 R이다.
도 1S는 SAK의 C-말단 단부에서의 EGF 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 S이다.
도 1T는 SAK의 N-말단 단부에서의 EGF 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 T이다.
도 2는 상이한 융합 구조물의 제조에 사용되는 PCR 방법 및 클로닝 설계의 개략적인 표현이다.
도 2a는 N_EGF_SK 융합 유전자 블록의 제작에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2b는 SK_EGF 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2c는 N_EGF_SK_EGF 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2d는 도메인-간 SK_EGF(SK의 α와 β 도메인 사이에 EGF 4,5,6이 융합되었다) 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2e는 도메인-간 SK_EGF(즉 SK의 β와 γ 도메인 사이에 EGF 4,5,6이 융합되었다) 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2f는 tPA 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2g는 N_EGF_tPA 및 tPA_EGF 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2h는 tPA의 고유 egf 및 크링글 1 도메인이 선택적으로 결실된, tPA_EGF 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2i는 tPA의 고유 egf 및 크링글 1 도메인이 결실된, N_EGF_tPA 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2j는 tPA의 고유 egf 도메인이 EGF 4,5,6 도메인으로 교체된, tPA_EGF 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2k는 tPA의 고유 egf 및 크링글 1 도메인이 EGF 4,5,6 도메인으로 교체된, tPA_EGF 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 3은 N-말단 융합된 EGF 4,5,6 및 SK 구조물에 의한 지연된 플라스미노겐 활성화 및 미량의 플라스민의 존재 하에서의 상기 지체의 감소를 나타내는 플라스미노겐 활성화의 분광 광도 측정에 의한 스캔(흡광도 405 ㎚)이다(상세한 내용은 "실시예에 사용된 일반적인 방법"을 참조하시오). 천연 SK는 플라스미노겐 활성화의 어떠한 현저한 지체도 나타내지 않음에 주목한다.
도 4는 나타낸 바와 같은 상이한 융합 구조물들 및 대조군의 양의 변화(60 내지 180 ㎚)에 의한 증가된 트롬빈 응고 시간 분석을 나타낸다.
도 5는 나타낸 바와 같은 상이한 SK 및 EGF 융합 구조물들 및 적합한 대조군의 존재 하에서의 단백질 C 활성화 프로파일을 나타낸다(상세한 내용은 "일반적인 방법"을 참조하시오).
도 6은 나타낸 바와 같은 상이한 tPA 융합 구조물들(동몰; 2 ㎚) 및 대조군을 사용한 응고 시간 분석을 나타낸다.
도 7은 나타낸 바와 같은 대조군과 함께 다양한 tPA 융합 구조물들에 의한, 용해성 피브린의 존재 및 부재 하에서의 플라스미노겐 활성화를 나타낸다.
도 1A는 SK(스트렙토키나제)의 N-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 융합을 암호화하는 DNA 서열을 나타내는 개략적인 도안 A이다.
도 1B는 유연성 촉진 잔기(예를 들어 삼중-글리신 신장부, GGG)를 함유하는 적합한 링커를 통한 SK의 C-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 융합을 나타내는 개략적인 도안 B이다.
도 1C는 트랜스글루타미나제 인식 부위/잔기들의 신장부와 함께 SK의 N 및 C-말단에서의 동시적인 EGF 융합을 나타내는 개략적인 도안 C이다.
도 1D는 SK의 5 아미노산이 결실된, SK의 C-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 D이다.
도 1E는 트롬빈 인식 및 절단 가능 서열(TCS)이 EGF 및 SK의 연접부에 존재하는, SK의 N 및 C-말단에서의 EGF 4,5,6의 동시 융합을 나타내는 개략적인 도안 E이다.
도 1F는 트롬빈 인식 서열이 EGF 및 SK의 연접부에 존재하고 트랜스글루타미나제 인식 서열이 EGF의 개시 부분(N-말단 단부)에 존재하는, SK의 N 및 C-말단에서의 EGF 4,5,6의 동시 융합을 나타내는 개략적인 도안 F이다.
도 1G는 SK의 α 및 β 도메인의 연접부에서의 EGF 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 G이다.
도 1H는 SK의 β 및 γ 도메인의 연접부에서의 지정된 바와 같은 EGF 도메인들의 융합을 나타내는 개략적인 도안 H이다.
도 1I는 tPA(조직 플라스미노겐 활성화제)의 N 및 C 말단에서의 동시적인 EGF 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 I이다 모든 도면 및 상기와 같은 용어들이 명세서 중에 존재하는 어디에서나, "egf"는 tPA의 EGF-유사 도메인을 지칭하는 반면, "EGF456"은 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인을 지칭한다.
도 1J는 tPA의 C-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 J이다.
도 1K는 tPA의 N-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 K이다.
도 1L은 tPA(조직 플라스미노겐 활성화제)의 고유 egf가 결실된, tPA의 N 및 C-말단 모두에서의 EGF 4,5,6 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 L이다.
도 1M은 tPA의 고유 egf가 결실된, tPA의 N-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 융합을 나타내는 개략적인 도안 M이다.
도 1N은 tPA의 고유 egf 및 크링글(kringle) 1이 결실된, tPA의 N-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 융합을 나타내는 개략적인 도안 N이다.
도 1O는 tPA의 고유 egf가 결실된, tPA의 C-말단 단부에서의 EGF 융합을 나타내는 개략적인 도안 O이다.
도 1P는 tPA의 고유 egf 및 크링글 1이 결실된, tPA의 C-말단 단부에서의 EGF 4,5,6 융합을 나타내는 개략적인 도안 P이다.
도 1Q는 tPA의 고유 egf가 EGF 4,5,6 도메인에 의해 교체된, tPA와의 EGF 4,5,6 도메인 융합을 나타내는 개략적인 도안 Q이다.
도 1R은 tPA의 고유 egf 및 크링글 1이 EGF 4,5,6 도메인에 의해 교체된, tPA와의 EGF 융합을 나타내는 개략적인 도안 R이다.
도 1S는 SAK의 C-말단 단부에서의 EGF 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 S이다.
도 1T는 SAK의 N-말단 단부에서의 EGF 도메인의 융합을 나타내는 개략적인 도안 T이다.
도 2는 상이한 융합 구조물의 제조에 사용되는 PCR 방법 및 클로닝 설계의 개략적인 표현이다.
도 2a는 N_EGF_SK 융합 유전자 블록의 제작에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2b는 SK_EGF 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2c는 N_EGF_SK_EGF 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2d는 도메인-간 SK_EGF(SK의 α와 β 도메인 사이에 EGF 4,5,6이 융합되었다) 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2e는 도메인-간 SK_EGF(즉 SK의 β와 γ 도메인 사이에 EGF 4,5,6이 융합되었다) 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2f는 tPA 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2g는 N_EGF_tPA 및 tPA_EGF 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2h는 tPA의 고유 egf 및 크링글 1 도메인이 선택적으로 결실된, tPA_EGF 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2i는 tPA의 고유 egf 및 크링글 1 도메인이 결실된, N_EGF_tPA 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2j는 tPA의 고유 egf 도메인이 EGF 4,5,6 도메인으로 교체된, tPA_EGF 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 2k는 tPA의 고유 egf 및 크링글 1 도메인이 EGF 4,5,6 도메인으로 교체된, tPA_EGF 융합 유전자 블록의 제조에 사용된 PCR, 제한 절단 및 클로닝 전략을 나타내는 개략적인 도안이다.
도 3은 N-말단 융합된 EGF 4,5,6 및 SK 구조물에 의한 지연된 플라스미노겐 활성화 및 미량의 플라스민의 존재 하에서의 상기 지체의 감소를 나타내는 플라스미노겐 활성화의 분광 광도 측정에 의한 스캔(흡광도 405 ㎚)이다(상세한 내용은 "실시예에 사용된 일반적인 방법"을 참조하시오). 천연 SK는 플라스미노겐 활성화의 어떠한 현저한 지체도 나타내지 않음에 주목한다.
도 4는 나타낸 바와 같은 상이한 융합 구조물들 및 대조군의 양의 변화(60 내지 180 ㎚)에 의한 증가된 트롬빈 응고 시간 분석을 나타낸다.
도 5는 나타낸 바와 같은 상이한 SK 및 EGF 융합 구조물들 및 적합한 대조군의 존재 하에서의 단백질 C 활성화 프로파일을 나타낸다(상세한 내용은 "일반적인 방법"을 참조하시오).
도 6은 나타낸 바와 같은 상이한 tPA 융합 구조물들(동몰; 2 ㎚) 및 대조군을 사용한 응고 시간 분석을 나타낸다.
도 7은 나타낸 바와 같은 대조군과 함께 다양한 tPA 융합 구조물들에 의한, 용해성 피브린의 존재 및 부재 하에서의 플라스미노겐 활성화를 나타낸다.
본 발명은, 현재 입수할 수 있는 형태들은 피브린 덩어리를 플라스미노겐 활성화를 통해 단지 용해시킬 뿐이고 혈전용해 후 결과를 방지할 수 없어, 본질적으로 트롬빈 생성으로 인한 혈전용해 요법 중 조기 재폐쇄 문제를 도출하므로, 현재 입수할 수 있는 형태, 즉 조직 플라스미노겐 활성화제, SK 및 SAK 또는 이들의 유도체/변형된 형태들보다 독특한 작용상 이점들을 나타내는 신규의 혈전용해성 융합 폴리펩타이드의 설계 및 제조에 관한 것이다.
본 발명은 플라스미노겐 조각을 활성화시키고 트롬빈을 직접 억제하는 능력을 유지할 뿐만 아니라 트롬빈에 의해 매개된 응고억제 경로를 통해 단백질 C 활성화 능력을 유지하는 트롬보모듈린의 4 번째, 5 번째 및 6 번째 EGF 도메인과 융합된 직접 및 간접적인 플라스미노겐 활성화제와의 융합 구조물의 제조 방법을 개시한다.
단백질의 아미노산 서열에 관하여 "변이체", "동족체", "유도체", "단편" 또는 "유사체"란 용어들은 상기 서열로부터 또는 상기 서열에 대한 하나(이상)의 아미노산의 임의의 치환, 변형, 변경, 교체, 결실 또는 첨가를 포함하며, 생성되는 단백질 또는 (폴리)펩타이드는 변형되지 않은 단백질의 경우와 동등한 작용을 갖는다. 특히, "동족체"란 용어는 구조 및/또는 작용에 관하여 상동성을 포괄한다. 서열 상동성에 관하여, 바람직하게는 변형되지 않은 단백질의 서열에 대해 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 85% 이상의 상동성이 존재한다. 바람직하게는 상기 변형되지 않은 단백질의 서열에 대해 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성이 존재한다.
전형적으로, 본 발명의 변이체, 동족체, 유도체, 단편 또는 유사체의 경우, 수행될 수 있는 아미노산 치환의 유형들은 상기 아미노산 서열의 소수성/친수성을 유지할 것이다. 변형된 서열이 본 발명에 따라 작용하는 능력을 유지하는 한, 아미노산 치환, 예를 들어 1, 2 또는 3 내지 10, 20 또는 30 개의 치환이 수행된다. 아미노산 치환은 예를 들어 치료학적으로 투여된 폴리펩타이드의 혈장 반감기를 증가시키기 위한 비-천연 유사체의 사용을 포함할 수도 있다.
보존 치환은 예를 들어 하기 나타낸 바와 같이 이루어질 수 있다. 같은 줄의 아미노산들은 서로 치환될 수 있다:
지방족 비-극성 G A P I L V
극성 - 하전되지 않은 C S T M N Q
극성 - 하전된 D E K R AROMATIC H F W Y
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단백질들은 전형적으로는 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같은 재조합 수단에 의해서, 및/또는 숙련가에게 널리 공지된 기법을 사용하는 합성 수단, 예를 들어 고상 합성을 사용함으로써 제조된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "결실"은 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 존재하지 않는 각각의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 변화로서 정의된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "삽입" 또는 "첨가"는 천연 단백질에 비해, 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 첨가되어 생성된 각각의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 변화이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "치환"은 상이한 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의한 하나 이상의 각각의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교체로부터 생성된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "4, 5, 및 6 상피 성장 인자-유사 도메인" 또는 "EGF 4,5,6"이란 용어는 트롬보모듈린의 EGF 4, 5 및 6 도메인 중 어느 하나이거나, 펩타이드 또는 펩타이드 단편으로서 함께 공유 결합된 트롬보모듈린의 3 개의 EGF 4, 5 및 6 도메인 모두를 지칭할 수 있다. 상기 4, 5 및 6 상피 성장 인자-유사 도메인들은 각각 상기 상피 성장 인자(EGF) 단백질의 하나 이상의 도메인에 대해 상동성을 갖는다.
본 발명은 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 스타필로키나제, 유로키나제, 및 이들의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈전용해성 단백질에 융합된 트롬보모듈린의 4, 5 및 6 상피 성장 인자-유사 도메인(EGF 4,5,6)을 포함하는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 트롬보모듈린 EGF 4,5,6 도메인이 상기 혈전용해성 단백질 또는 이의 유도체 또는 유사체에, 상기 혈전용해성 단백질 또는 이의 유도체 또는 유사체의 N-말단, C-말단, 또는 N- 및 C-말단 모두에서 융합된 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명은 또한 혈전용해성 단백질(SK, tPA 또는 SAK)의 N-말단 단부를 암호화하는 부분에서 상기 혈전용해성 단백질과 융합된 EGF의 최소 필수 혈전억제 부분을 갖는 유전자 구조물의 설계를 개시하며, 이때 번역(생성된 "키메릭" ORF에서)은 EGF의 4 번째 도메인에 이어서 혈전용해성 폴리펩타이드 합성을 암호화하는 부분에서 시작한다. 따라서, 성숙한 폴리펩타이드 또는 폴딩된 단백질은 2 가지 상이한 유형의 단백질뿐만 아니라 또한 상기 둘의 작용성을 모두 함유한다. 상기 혈전용해성 단백질을 갖는 상기 구조물을 EGF N-말단 융합 구조물이라 칭한다.
또 다른 실시태양에서, 우리는 먼저 상기 번역이 상기 혈전용해성 단백질로 시작하고 EGF의 6 번째 도메인에서 종결되도록 관련된 부분들을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 블록들을 융합시키고(혈전용해제-EGF 4,5,6), 이어서 상기 올리고뉴클레오타이드 하이브리드 블록을 발현 시스템에서 발현시키고, 상기 하이브리드를 정제하고, 이를 플라스미노겐 활성화뿐만 아니라 트롬빈 억제 등에 대해서 시험함으로써, 상기 혈전용해성 단백질의 C-말단 부분에서 융합된 EGF 도메인들의 설계 원리 및 제작 방법을 정의하였다. 이때, 상기 번역된 폴리펩타이드는 작용상 활성인 혈전용해성 단백질로 시작하고 C-말단 단부에 EGF 도메인을 가지며, 따라서 또한 항트롬빈 및 단백질 C 활성화 능력을 갖는다. 작용성 폴리펩타이드의 제조를 도출하는 설계를 또한 개시하였으며, 이때 상기 키메릭 폴리펩타이드는 처음에 불활성이지만 플라스민이나 트롬빈에 의해 단백질 분해적 절두 시 이의 플라스미노겐 활성화 능력을 획득한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 절두를 갖는 스트렙토키나제를 포함하는 혈전용해성 단백질을 개시하며, 이때 상기 구조물은 플라스미노겐 활성화, 트롬빈 억제, 및 응고 억제성 단백질 C 경로 활성화 활성을 갖는다.
또 다른 실시태양은 N 및 C-말단 융합 구조물의 제조 방법을 함유하며, 이때 상기 혈전용해성 단백질은 상기 혈전용해성 단백질의 N- 및 C-말단에 3 개의 EGF 도메인을 동시에 함유한다. 상기 구조물을, 공통의 제한 부위를 통해 결합된 N-말단 및 C-말단 EGF 4,5,6 융합 구조물을 갖는 올리고뉴클레오타이드 블록 및 유전자 클로닝 등의 확립된 방법을 사용하는 이의 발현의 도움으로 설계하였다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 스트렙토키나제 및 조직 플라스미노겐 활성화제와 같은 혈전용해제 내에 EGF 도메인을 수반하는 단백질-내 융합물의 설계를 개시한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 하이브리드/융합 구조물은 EGF 4,5,6 도메인이 tPA의 크링글 1 도메인으로 교체된 조직 플라스미노겐 활성화제를 가졌다. 상기 구조물은 양호한 플라스미노겐 활성뿐만 아니라 항트롬빈 성질을 나타내었다.
또 다른 실시태양은 EGF 4,5,6의 메티오닌/들이 상기 섹션들에서 개시된, 혈전용해제(SK, tPA 및 SAK)와의 N-말단, C-말단 및 N 및 C-말단(동시) 융합 구조물들 중 어느 하나에서, 위치 선택적 돌연변이의 확립된 방법을 통해 발린, 알라닌 또는 글루타민 아미노산 잔기로 교체된 EGF 도메인의 내산화성 형태를 개시한다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서 상기 스트렙토키나제의 알파와 베타 또는 베타와 감마 도메인 사이 또는 스트렙토키나제 유도체 또는 유사체의 알파와 베타 또는 베타와 감마 도메인 사이에서 융합된 트롬보모듈린 EGF 4,5,6 도메인을 개시하며, 이때 상기 스트렙토키나제 유도체 또는 유사체는 하나 이상의 돌연변이, 첨가, 삽입 또는 절두를 포함하며, 상기 구조물은 플라스미노겐을 활성화하고, 트롬빈을 억제하고, 응고억제성 단백질 C 경로를 활성화한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서 EGF 4,5,6 도메인이 스트렙토키나제 N-말단, 스트렙토키나제 C-말단, N- 및 C-스트렙토키나제 말단 모두 중에서 선택된 하나 이상의 위치, 또는 스트렙토키나제의 도메인 사이의 위치에서, 상기 스트렙토키나제, 또는 스트렙토키나제 유도체 또는 유사체에 인-프레임 융합된 구조물을 개시한다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서 상기 스트렙토키나제 유도체가 잔기 5 내지 383 또는 5 내지 414에 걸쳐 있는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서 상기 스트렙토키나제 유도체가 잔기 16 내지 383에 걸쳐 있는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서 EGF 4,5,6 도메인이 스트렙토키나제 N-말단, 스트렙토키나제 C-말단, 및 N- 및 C-스트렙토키나제 말단 모두 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 인-프레임 융합된 키메릭 단백질 구조물을 개시하며, 이때 상기 EGF 4,5,6 도메인의 Met 41은 발린, 알라닌 또는 글루타민에 의해 교체되거나; C-말단 Met 435는 발린, 알라닌, 또는 글루타민에 의해 교체되거나; 동시에 N- 및 C-말단 융합 구조물에서, Met 41 및 Met 435가 발린, 알라닌, 또는 글루타민에 의해 독립적으로 교체된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 트랜스글루타미나제 인식 서열을 추가로 포함하는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서 상기 EGF 4,5,6 도메인과 혈전용해성 단백질 또는 이의 유도체 또는 유사체의 연접부에 하나 이상의 트롬빈 절단성 서열을 추가로 포함하는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 하이브리드/융합 구조물은 EGF 4,5,6의 연접부에 트롬빈 절단성 부위 및 이의 내산화성 형태들을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 EGF 4,5,6 도메인을 함유하는 하이브리드/융합 구조물은 제조 중 메티오닌 산화에 기인한 내산화성 및 결과적인 활성 상실을 갖도록 돌연변이된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA) 유도체, 유사체, 또는 단편의 N-말단에서, 상기 tPA 유도체, 유사체 또는 단편의 C-말단에서, 또는 상기 tPA 유도체, 유사체 또는 단편의 2 개 말단 모두에서, 또는 상기 tPA 유도체, 유사체 또는 단편의 내부에서 상기 tPA 유도체, 유사체 또는 단편에 융합된 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인을 포함하는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서 상기 EGF 4,5,6 도메인과 tPA 유도체, 유사체 또는 단편 간의 융합이 하나 이상의 링커 단편을 추가로 포함하는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 상기 하나 이상의 링커 단편이, 상기 구조물의 유연성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 하나 이상의 아미노산이 Gly, Asn, Pro, Ser, Gln, Arg 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 tPA 유도체, 유사체 또는 단편이 하나 이상의 돌연변이, 첨가, 삽입, 또는 절두를 포함하고 상기 tPA 유도체, 유사체 또는 단편이 플라스미노겐을 활성화하고, 트롬빈을 억제하고, 응고억제성 단백질 C를 활성화하는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)의 EGF 도메인이 하나 이상의 트롬보모듈린 EGF 4,5,6 도메인에 의해 교체되도록 상기 하나 이상의 트롬보모듈린 EGF 4,5,6 도메인에 융합된 상기 tPA의 단편 또는 이의 절두되거나 변형된 형태를 포함하는 키메릭 단백질 구조물을 개시하며, 이때 상기 구조물은 항트롬빈 및 플라스미노겐 활성화 활성을 모두 갖는다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)의 크링글(kringle) 1 및 EGF 도메인이 하나 이상의 트롬보모듈린 EGF 4,5,6 도메인에 의해 교체되도록 상기 하나 이상의 트롬보모듈린 EGF 4,5,6 도메인에 융합된 상기 tPA의 단편 또는 이의 절두되거나 변형된 형태를 포함하는 키메릭 단백질 구조물을 개시하며, 이때 상기 구조물은 항트롬빈 및 플라스미노겐 활성화 활성을 모두 갖는다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 tPA EGF 도메인 및 크링글 1 도메인이 상기 tPA 단편의 N-말단 또는 C-말단에서 하나 이상의 트롬보모듈린 EGF 4,5,6 도메인에 의해 교체된 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 tPA 단편 또는 이의 절두되거나 변형된 형태와 상기 트롬보모듈린 EGF 4,5,6 도메인 사이에 하나 이상의 링커 단편을 추가로 포함하고, 상기 링커 단편이, 구조물이 트롬빈 억제, 단백질 C 활성화 및 플라스미노겐 활성화 능력을 갖도록 상기 구조물의 유연성을 촉진하는 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 EGF 4,5,6 성분의 메티오닌 41이 알라닌, 발린 또는 글루타민에 의해 교체된 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 스타필로키나제(SAK)의 N-말단 또는 C-말단에 인-프레임 융합된 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인을 포함하는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 트롬보모듈린 EGF 4,5,6 도메인의 메티오닌 41이 알라닌, 발린 또는 글루타민에 의해 교체된 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 SAK와 EGF 4,5,6 도메인 영역들 사이에 트롬빈 절단성 서열을 추가로 포함하는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 트랜스글루타미나제 가교결합 서열을 추가로 포함하는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 수용액 또는 염수 용액에 용해성인 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
본 발명에서, 또 다른 실시태양에서, 상기 재조합 키메릭 단백질은 엄격하게 조절된 프로모터의 조절 하에서 플라스미드에 의해 발현된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 다양한 키메릭 구조물을 적합한 숙주, 예를 들어 세균, 진균, 효모 또는 동물 세포 중에서 재조합 DNA 기술을 통해 발현시켰다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서 세포외 배지 내로 분비되는 키메릭 단백질 구조물을 개시한다.
또 다른 실시태양에서, 조직 플라스미노겐 활성화제 및 EGF 4,5,6 융합 구조물을 폴리펩타이드가 수확되는 원핵생물 및 진핵생물 숙주에서 발현시켜 순수한 형태/들의 활성 하이브리드 구조물을 수득하였다.
또 다른 실시태양에서, EGF 구조물과의 다양한 조직 플라스미노겐 활성화제 융합물을 또한, 발현 카세트가 에피솜체로서 숙주 게놈 내로 통합되거나 세포질 중에 남아있는 동물 세포주, 효모 발현 시스템 및 식물 세포와 같은 진핵생물 시스템에서 발현시켰다. 상기 발현된 하이브리드 단백질을 발현에 사용되는 숙주에 따라 글리코실화하거나 글리코실화하지 않을 수도 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서 혈전증의 치료가 필요한 포유동물에게 치료 유효량의 키메릭 단백질 구조물을 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 혈전증을 치료하는 방법을 개시한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 키메릭 단백질 구조물의 사용을 포함하는, 트롬빈의 억제 방법을 개시한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 키메릭 단백질 구조물의 사용을 포함하는, 단백질 C의 활성화 방법을 개시한다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서 키메릭 단백질 구조물의 사용을 포함하는, 항트롬빈 및 플라스미노겐 활성화 모두를 제공하는 방법을 개시한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 약학적 유효량의 키메릭 단백질 구조물을 포함하는 약학 제형을 개시한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 혈전용해가 필요한 포유동물에게 치료 유효량의 키메릭 단백질 구조물을 투여함을 포함하는, 상기 포유동물의 혈전용해 방법을 개시한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 하이브리드 구조물의 암호화 DNA 서열을 적합한 발현 숙주에 최적화시켰다.
또 다른 실시태양에서, 상기 언급된 키메릭 단백질 구조물을 암호화하는 핵산 서열.
또 다른 실시태양에서, 핵산 서열을 포함하는 벡터가 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 키메릭 단백질 구조물을, 숙주 세포 발현 시스템에서 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 발현에 의해 제조한다.
또 다른 실시태양에서, 숙주 세포 발현 시스템에서 키메릭 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 발현에 의한 상기 단백질 구조물의 제조 방법이 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 숙주 세포 발현 시스템이 진핵생물 발현 시스템인 방법이 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 숙주 세포 발현 시스템이 세균 발현 시스템인 방법이 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 세균이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인 방법이 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 진핵생물 발현 시스템이 동물 세포, 또는 효모 세포인 방법이 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 효모가 피스키아 파스토리스(Pischia pastoris)인 방법이 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 키메릭 단백질 구조물이 상기 숙주 세포로부터 세포외 배지 내로 분비되는 방법이 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 정제된 구조물은 치료제로서 및 다양한 혈전증 상태를 갖는 포유동물 치료용 약학 조성물에 유용하다. 포유동물은 인간, 설치류, 또는 가축일 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 정제된 구조물을 추가적인 안정제 및 부형제의 존재 또는 부재 하에서 다양한 순환 장애를 경감시키기 위한 치료제로서 사용하였다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 따라, 상기 정제된 구조물을 하나 이상의 약학 조성물로 제형화한다. 하나든 그 이상이든, 정제된 구조물을 갖는 상기 약학 조성물을 고체 형태(즉 바이알 중에서 동결-건조되어 나중에 적합한 용액 중에서 재조성된다) 또는 액체 형태 모두로 제형화할 수 있다.
하나의 특정 실시태양에서, 상기 정제된 구조물을 갖는 상기 조성물은 다른 구성성분들, 예를 들어 활성 성분을 재조성하기 위한 용액을 갖는 용기, 캐뉼러, 정맥 내 적용을 위한 생리학적 혈청이 있는 점적 주머니 및 사용 설명서 등을 임의로 포함할 수도 있는 혈전용해 요법 또는 치료용 키트를 구성한다.
상기 약제 조합들을 경구 투여용 정제, 캡슐 또는 엘릭서; 직장 투여용 좌약; 주사 투여용 멸균 용액, 현탁액 등으로서 제형화하고 병용 형태(즉 활성 성분들을 모두 하나의 제형으로 합한다) 또는 개별적인 형태(즉 활성 성분들을 하나의 제형으로 합하지 않는다(또는 모두 합하지는 않는다))로 사용할 수도 있다. 상기 투여 용량 및 투여 방법을 최적의 효능을 성취하도록 맞출 수 있지만, 이는 환자 체중, 식이요법, 동반된 약물 치료와 같은 인자 및 의료 분야의 숙련가들이 인지하는 다른 인자들에 따라 변할 것이다.
일반적으로, 본 발명의 정제된 구조물(용도, 방법, 약학 조성물 및 제품 포함)에 관하여, 사용되는 정제된 구조물의 효능에 따라 0.1 내지 1000 ㎎의 양을 투여한다(필요에 따라 단일 용량으로서 또는 수회-용량으로).
바람직한 실시태양은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제 중의, 치료 유효량의 본 발명에 개시된 바와 같은 정제된 구조물 또는 상기 정제된 구조물의 농축 조성물을 포함하는 보관 및 후속 투여를 위해 제조된 약학 조성물을 포함한다. 치료학적 용도에 허용 가능한 담체 또는 희석제는 약학 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)]에 개시되어 있다.
보존제, 안정제, 염료 및 심지어 풍미제를 상기 약학 조성물 중에 제공할 수도 있다. 예를 들어, 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스터를 보존제로서 첨가할 수도 있다. 또한, 산화방지제 및 현탁제를 사용할 수도 있다.
생체 내 복합 요법에서 상기 정제된 구조물 또는 이의 약학 조성물 또는 제품의 사용에 있어서, 상기 조성물/제품을 다양한 투여형을 사용하여, 다양한 방식으로, 예를 들어 비경구(예를 들어 정맥 내, 피하, 근육 내, 결장, 직장, 코, 구강, 경피, 질 또는 복강 내)로 포유동물에게 투여할 수 있다.
당해 분야의 숙련가에게 쉽게 자명한 바와 같이, 상기 투여되는 유용한 생체 내 투여량 및 특정한 투여 방식은 치료되는 포유동물 종, 사용되는 특정 조성물, 및 상기 조성물을 사용하는 특정한 용도에 따라 변할 것이다. 유효 투여량 수준, 즉 목적하는 결과를 성취하기 위해 필요한 투여량 수준의 측정은 당해 분야의 숙련가의 영역 내에 있을 것이다. 전형적으로, 조성물의 적용을 보다 낮은 투여량 수준에서 개시하며, 목적하는 효과가 성취될 때까지 투여량 수준을 증가시킨다.
일반적으로, 본 발명의 방법을 수행함에 있어서, 상기 정제된 구조물 또는 약학 조성물의 투여량은 목적하는 효과 및 치료 적응증에 따라 광범위할 수 있다. 전형적으로, 상기 정제된 구조물의 적합한 투여량은 약 0.1 내지 1000 ㎎, 바람직하게는 약 10 내지 500 ㎎, 보다 바람직하게는 약 10 내지 150 ㎎, 가장 바람직하게는 약 10 내지 120 ㎎일 것이다. 투여는 바람직하게는 정맥 내 투여와 같이 비경구 투여이다. 투여는 또한 바람직하게는 필요에 따라 단일 용량으로서 또는 수회-용량 기준이다. 투여는 바람직하게는 정맥 내 투여와 같이 비경구 투여이다. 투여는 또한 바람직하게는 필요에 따라 단일 용량으로서 또는 수회-용량 기준이다.
주사제를 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체 중에 용해 또는 현탁하기에 적합한 고체 형태, 또는 유화액으로서 통상적인 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어 물/염수, 덱스트로스, 만니톨, 락토오스, 레시틴, 알부민, 나트륨 글루타메이트, 시스테인 하이드로클로라이드 등이다. 또한, 경우에 따라, 상기 주사 가능한 약학 조성물은 소량의 무독성 보조 물질, 예를 들어 습윤제, pH 완충제 등을 함유할 수도 있다. 경우에 따라, 흡수 촉진 제제(예를 들어 리포솜)를 사용할 수도 있다.
비경구 투여를 위해서, 참깨 오일 또는 땅콩 오일 중의 또는 수성 프로필렌 글리콜 중의, 본 발명에 따라 사용되는 약학적으로 활성인 작용제의 용액을 사용할 수도 있다. 상기 수용액을 필요한 경우 적합하게 완충시킬 수도 있으며(바람직하게는 pH 4 내지 pH 9) 상기 액체 희석제를 먼저 등장성으로 만들 수도 있다. 예를 들어, NIF는 약 pH 7의 수용액 중에서 사용된다. 그러나, NIF는 약 pH 4까지의 수용액 중에서 안정하다. 바람직한 "상대 화합물"인 t-PA(또는 이의 변이체)를 일반적으로는 약 pH 5의 수용액 중에서 사용한다. 상기 수용액은 정맥 주사용으로 적합하다. 상기 유성 용액은 관절-내, 근육-내 및 피하 주사용으로 적합하다. 멸균 조건 하에서 상기 모든 용액들의 제조는 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 표준 제약 기법에 의해 쉽게 수행된다.
본 발명의 약학 조성물 및 제품을 재조성 전 및 투여 후에 보관을 위해, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법을 사용하여 동결건조시킬 수도 있다. 동결건조물(들)로서 보관하든지 달리 보관하든지 간에, 본 발명의 복합물 중 활성 성분들을 동결건조 전 또는 재조성 후(나중에 함께 투여하는 경우)에 함께 혼합하거나 개별적으로 보관할 수도 있다(나중에 동시, 별도 또는 연속 투여의 경우).
하나의 특정 실시태양에서, 투여는 예를 들어 정맥내 주사에 의한 비경구 투여이거나, 덩어리 부근에서 원위치 투여를 위한 카테터 설치에 의해 국소적으로 투여된다.
본 발명에 의해 제공된 약제 조합의 조성물 중에 존재할 수도 있는 정제된 구조물의 양은 광범위하지만, 항상 치료 유효량으로 다양할 수 있다.
본 발명의 약제 조합의 조성물의 각 혈전용해 치료 프로토콜에 대한 투여량은 다양한 인자들, 예를 들어 환자의 연령, 상태, 치료하려는 임상 상태의 중증도, 투여 경로 및 회수, 및 각 경우에 투여하려고 하는 정제된 구조물에 따라 변할 것이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 혈전용해 요법에 대해 이미 개시한 바와 같은 본 발명의 약제 복합물 또는 키트에 관한 것이다.
또 다른 추가의 태양에서, 본 발명은 또한 환자에게 치료 유효량의 하나 이상의 정제된 구조물을 투여함으로 이루어진 치료 방법 및 혈전용해 요법에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 조성물은 허혈성 심장병 및 이의 합병증뿐만 아니라 허혈성 대뇌 발작, 류마티스성 질병, 및 혈전증으로 인한 염증 반응, 조직의 허혈, 혈류학의 장애 및 혈관 미세순환의 병인을 갖는 다른 병리상태들의 치료에 특히 바람직하다.
본 발명은 6 개 아미노산 함유 링커 서열을 갖는 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인과 조직 플라스미노겐 활성화제와의 융합 구조물을 개시한다. 상기 링커 서열 길이 및 아미노산 서열 순서를 상기 두 성질 모두의 작용을 더욱 최적화하기 위해 변화시키거나 변경시킬 수 있다. 링커-설계된 구조물에 비해 링커 서열 없이 초기에 설계된 구조물은 최적화된 링커를 함유하는 상이한 구조물 중의 단백질 C 활성의 단지 작은 분획, 대략 20 내지 25%만을 나타내었다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 유전 공학의 표준 방법을 통한 비천연 융합 단백질 암호화 유전자 블록 및 이의 변이체의 제조를 개시한다.
더욱이, 상기 단백질-간 융합 링커 서열은 단백질 C 결합 및 활성화에서 핵심 역할을 하는 EGF의 4 번째 도메인에 필요한 유연성을 제공하기 위해서 상기 EGF 4,5,6 도메인과 상기 플라스미노겐 활성화제 성분의 연접 부위에 3 개 이상의 글리신 아미노산 잔기를 우선적으로 함유하였다. 유사하게, 트롬빈 결합을 촉진할 수 있도록 tPA의 N-말단 영역에 링커들을 융합시키는 경우 EGF의 6 번째 도메인 바로 뒤에 상기 링커들을 놓았다. 이는 EGF 4,5,6을 상기 조직 플라스미노겐 활성화제의 정렬된 구조/도메인 사이에 도입시키는 경우에 특히 그렇다. 따라서, 상기 링커의 역할은 2 개의 상대 단백질 모두의 작용성을 보존하기 위해서 상기 두 상대를 융합시키는 경우 자명하였다.
상기 링커 서열은, 하나의 양으로 하전된 아미노산(리신 또는 아르기닌)을 Val 잔기와 나란히, 그러나 상기 아미노산이, 일시적인 트롬빈 형성 기회가 용해 중 매우 높은 상기 덩어리의 가까운 부근에서 플라스민에 의해 절단될 수 있고 상기 두 도메인이 모두 손상 부위에서 독립적으로 이들의 작용을 수행할 수 있도록 2 또는 3 개의 글리신 잔기 앞에 배치하는 바와 같은 방식으로 선택되었다.
상기 링커는 또한 EGF 4,5,6 도메인이 트롬빈 및 활성화 단백질 C에 결합하는 동안 최적으로 작용할 수 있도록 상기 도메인의 배향 변화를 실제로 돕는 하나의 프롤린 아미노산을 함유한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 설계된 구조물 링커 길이를 증가시키거나 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 아미노산의 서열을 활성화 속도를 완수하기 위해서 천연 및 비천연 아미노산으로 변경시킬 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 트롬빈 절단성 서열, 트랜스글루타미나제 인식 서열 및 다른 혈액 프로테아제 민감성 부위를, 피브린용해 및 혈전억제 작용에 영향을 미치지 않으면서 상기 링커에 도입시킬 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 다양한 융합 폴리펩타이드들 및 이들의 보다 양호한 변이체들의 발현 및 정제 방법을 개시한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 혈전용해 및 항트롬빈의 결합된 성질뿐만 아니라 단백질 C 응고억제 성질을 나타내는 다양한 비천연 폴리펩타이드를 개시한다.
또 다른 실시태양에서, EGF 4,5,6의 내산화성 형태를 고유 tPA(예를 들어 DNA 서열번호 20)에 비해 돌연변이 변화를 갖는 조직 플라스미노겐 활성제의 작용상 개선된 변이체와 융합시켰다.
또 다른 실시태양에서, EGF 4,5,6의 내산화성 형태를 스트렙토키나제의 플라스민 내성 형태와 융합시켰다.
또 다른 실시태양에서, EGF 4,5,6의 내산화성 형태를 하나 이상의 시스테인 잔기가 없는 혈전용해성 단백질과 융합시켰다.
또 다른 실시태양에서, 발현된 융합 폴리펩타이드를 심혈관 질병의 치료에 사용한다.
또 다른 실시태양에서, 적합한 약학 조성물은 만니톨, 인간 혈청 알부민(HSA) 등과 같은 FDA 승인된 화학 안정제 및 용해제와 함께 발현된 융합 폴리펩타이드/들을 갖는다.
발현된 융합 구조물을 인간에 정맥 내 투여하기 위해 제형화할 수도 있으며 FDA 승인된 안정제를 함유한다.
또 다른 실시태양에서, EGF 4,5,6 및 이의 변이체를 유로키나제 유형의 플라스미노겐 활성화제와 융합시킬 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상이한 EGF 융합 구조물을 SK, tPA 및 SAK와 75 내지 100% 상동성을 보이고 천연 단백질/들에 비해 50 내지 100% 플라스미노겐 활성화 능력을 보이는 단백질로 제조할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 SK, tPA 및 SAK와 융합된 EGF 4,5,6의 변이체에서 상기 EGF 4,5,6 변이체는 독립적으로 발현된 고유 EGF 4,5,6 도메인에 비해 75 내지 100% 상동성/유사성 및 50 내지 100% 항트롬빈 및 단백질 C 활성을 보인다.
시약
유전자 구조물:
EGF 4,5,6 도메인 서열은 효모, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 최적의 발현을 위해 상업적으로 주문-합성된(진스크립트 인코포레이티드(GeneScript Inc.), 미국 소재) 인간 트롬보모듈린 DNA의 서열이었다. 상기 합성 유전자 구획을 정확한 순서로 연결하고 세균 플라스미드에 클로닝하였다. 한편으로 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인과 혈전용해제, 예를 들어 SAK, SK 또는 tPA(또는 이들의 유도체/돌연변이체) 간의 융합 구조물을 필수적으로 (a) 화학적 수단을 사용한 주문-유전자 합성, 및 (b) 적합한 플라스미드로부터 특수 설계된 프라이머를 사용하여 선택된 유전자 구획을 수득하기 위해 잘 확립된 PCR 기술을 사용한 다음(하기 실시예에 사용된 방법을 참조하시오), 상기 PCR-생성된 유전자-구획 블록을 단리하고 이들을 특수 PCR 방법, 예를 들어 중복 연장 PCR 등을 사용하여 인-프레임 "융합"시키는 조합에 의해 수행하였다. 일반적으로, 정규 PCR을 적합한 높은 진행도의 열안정성 DNA 폴리머라제(페르맨타스 인코포레이티드(Fermantas Inc.) 또는 스트라타진 인코포레이티드(Stratagene Inc.)로부터의 Pfu DNA 폴리머라제), 또는 고 충실도 pfu 터보(스트라타진 인코포레이티드) 효소를 사용하여 수행하였다. 상기 하이브리드 DNA 구조물을 부수적인 단백질 발현 없이 통상적인 플라스미드 서브-클로닝에 적합한 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주--XL-블루, 및 노바겐 인코포레이티드(Novagen Inc.)(미국 와이오밍주 매디슨 소재)로부터 획득된, T7 RNA Pol 프로모터 하에서 단백질 발현을 위한 균주 BL21(DE3) 내로의 형질전환에 의해 상기 T7 RNA 폴리머라제 프로모터-기재 발현 벡터에 클로닝/발현시키고, 또한 벡터, pPIC-9K 중에 인-프레임 α-짝짓기 인자 신호 서열을 갖는 메탄올 유도성 프로모터 하에서 효모(피키아 파스토리스)에서 발현시켰으며, GS115 세포(인비트로젠 라이프 테크놀로지스(Invitrogen Life Technologies, 미국 캘리포니아주 소재)를 발현에 사용하였다. 다양한 제한 엔도뉴클레아제, T4 DNA 리가제 및 다른 DNA 변형 효소를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)(미국 매사추세츠주 베벌리 소재)로부터 획득하였다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 캐나다 소재 바이오베이직 인코포레이티드(Biobasic, Inc.)에 의해 공급되었다. DNA의 정제 및 아가로스 젤로부터 PCR 증폭된 산물의 추출을 퀴아겐 게엠베하(Qiagen GmbH)(독일 소재)로부터 입수할 수 있는 키트를 사용하여 수행하였다. 형광 염료를 사용하는 자동화된 DNA 서열화를 16-모세관 장치가 구비된 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 3130xl 유전자 분석기상에서 수행하였다. Glu-플라스미노겐을 롯슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH)(독일 펜즈베르크 소재)로부터 구입하거나 친화성 크로마토그래피에 의해 인간 혈장으로부터 정제하였다(문헌[Deutsch and Mertz, 1970]). 인간 단백질 C, 트롬빈, 히루딘을 미국 소재 칼바이오켐(Calbiochem)으로부터 구입하였으며, 토끼의 표준 트롬보모듈린 및 재조합 트롬보모듈린은 모두 미국 소재의 아메리칸 다이아그노스티카 인코포레이티드(American Diagnostica Inc.)로부터 구입하였다. N-말단 기상 아미노산 서열화를 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 서열화기, 모델 491로 수행하였다. 유로키나제, EACA, 나트륨 시아노보로하이드라이드, 및 L-리신을 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)(미국 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다. 페닐 아가로스 6XL 및 DEAE 세파로스(패스트-플로우(Fast-Flow))를 GE-애머샴(Amersham)(스웨덴 웁살라 소재)으로부터 획득한 반면, Ni-NTA 비즈는 퀴아겐으로부터 획득하였다. 모든 다른 시약들은 입수할 수 있는 최고의 분석 등급을 가졌다.
실시예들에
사용된 일반적인 방법:
1. 재조합 DNA 융합 방법:
재조합 DNA 기술로서 집합적으로 지칭된 다양한 방법들은 현재 분자 생물학 분야에 널리 공지되어 있다. 여러 가지 기법, 표준 프로토콜 및 이들의 변형된 형태들은 여러 참고서적들, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual (IInd edition, Cold Spring Harbor Press, New York., 1989]; [McPherson, M. J., Quirke, P., and Taylor, G. R., [Ed.] PCR : A practical approach., IRL Press, Oxford., 1991]에 매우 잘 개시되었다. 그러나 공개된 문헌들로부터의 상이한 발표들이 특정 용도에 대해 인용되는 경우 융합 구조물의 설계에 여러 가지 변형들이 요구되었다. 본 발명에서, 우리가 2 개의 유전자를 융합시키는 경우, 우리는 호(Ho) 등(문헌[Ho, Hunt et al. 1989]) 및 메타 및 싱(Mehta and Singh)(문헌[Mehta and Singh 1999])의 중복 연장 PCR로서 공지된 방법을 사용하였다. 2Kb 이하의 작은 구조물 증폭의 경우, pfu DNA 폴리머라제(페르멘타스 인코포레이티드, 미국 소재)를 사용하였고, 점 돌연변이 구조에 높은 충실도의 폴리머라제 작용이 요구되는 보다 긴 PCR의 경우 pfu 터보(스트라타진)를 6 내지 7 Kb 길이 단편 증폭의 증폭 및 위치 선택적 돌연변이를 위해 사용하였다(문헌[Wang and Malcolm 1999]).
2. 제한 절단 및 연결:
제한 절단 및 연결 효소를 미국 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터 획득하고 페르맨타스 인코포레이티드의 "고속 절단제" 제한 효소를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다. 거의 모든 키메릭 융합물 제작 실시예에 관하여 언급된 경우, 연결을 Xho I(4 염기 절단제) 및 Not I(6 염기 절단제) 절단된 벡터와 삽입물/들 사이에서 수행하여, 방향성 클로닝의 기회를 극대화하였다.
3. 에스케리키아 콜라이 XL 1B 수용 세포에서 연결 혼합물의 일렉트로포레이션 및 pPIC-9K에서 선형화된 삽입물 함유 벡터의 형질전환:
반응의 연결 혼합물을 XL 1B 수용 세포(문헌[Sharma and Schimke 1996]) 내로 일렉트로포레이션시켰다. 다량의 DNA를 사용 설명서에 따라 퀴아겐의 미디 프렙(Midi prep) 키트로부터 제조하였다. 미디 제조의 최종 단계에서 DNA가 높은 염 농도로 용출되었으며, 이때 pH 5의 0.3M 나트륨 아세테이트를 최종 농도로 사용하였고 70% 에탄올을, 절단 반응을 방해할 수도 있는 과잉 염의 제거를 위해 사용하였다(문헌[Sambrook et al., 1989]). 상기 과정에 의해 우리는 50 내지 60 ㎍의 DNA를 수득하였으며 여기에 Bgl II 효소의 도움으로 선형화 단계를 가하였고 절단 후에 다시 나트륨 아세테이트 및 에탄올 침전 단계를 가하였으며, 최종적으로 건조된 펠릿을 7 내지 8 ㎕의 오토클레이브 처리된 무염 수에 용해시키고, 이때 1 내지 3 ㎍/㎕의 DNA를 수득하였다. 이때 7 내지 10 ㎍의 DNA를 피키아 파스토리스의 His- GS 115 세포의 전기수용 세포에서의 형질전환에 사용하였으며, 최종적으로 오직 His+ 형질전환체만이 플레이트 상에서 증식하는 최소 덱스트로스 상에 최종 도말하였다. 상기 플라스미드 pPIC-9k는 목적하는 유전자의 다중사본 삽입이 AOX1 프로모터에 의한 상동 재조합을 통해 가능하도록 하는 방식으로 설계된다(문헌[Ramchuran, Mateus et al., 2005]). 다중사본 표적 유전자 삽입을, 증가하는 항생제 농도를 갖는 젠티신 내성 집단을 모니터함으로써 세균 카나마이신 내성 유전자(Tn903)를 통해 모니터할 수 있다. 피키아는 그 자체로서 0.25 ㎎/㎖의 젠티신 내성을 허용할 수 있지만, 0.5 ㎎/㎖ 및 4 ㎎/㎖은 각각 1 내지 2 사본 및 7 내지 12 사본 삽입을 나타낸다. 젠티신 내성은 목적하는 유전자의 다중 삽입과 직접적으로 상관된다. 유전자 투여 효과로 인해, 목적하는 유전자 산물의 보다 많은 분비는 보다 높은 삽입수에 상응함을 추론할 수 있다(문헌[Norden, Agemark et al. 2011]).
4. 융합 구조물의 봉입체의 발현, 단리 및 리폴딩.
일부 구조물, 예를 들어 EGF-SAK 및 SAK-EGF를, 키메릭 단백질들이 숙주 에스케리키아 콜라이 Bl 21 - DE 3 세포 중에 봉입체의 형태로 축적된 pET 23-d 하에서 발현시켰다. 봉입체가 형성된 경우 최대량의 과발현된 단백질이 수득되었다(문헌[Misawa and Kumagai 1999]; [Zhang, Xu et al. 2009]). 에스케리키아 콜라이 BL21 DE3 세포를 키메릭 융합 단백질의 IB의 생산에 사용하였으며, 이때 밤새 증식된 BL21 DE3 세포 배양물로부터 25 ㎖의 LB(루리아 베르타니(Luria Bertani))를 1차 접종물로서 사용하였고, 이를 500 ㎖ LB(2차 배양) 배지로 옮겼다. 일단 OD600가 0.6 내지 0.8에 도달하였으면 1mM IPTG의 도움으로 단백질 생산을 유도하였다. 유도 후. 세포를 40 ℃에서 6 시간 동안 진탕 조건 하에서 유지시켰다. 6 시간 배양 후. 세포를 4 ℃에서 10 분간 6000 rpm에서 원심분리에 의해 수확하였다. 최종적으로, 수확된 세포를 50 mM 트리스, 100 mM NaCl 및 1 mM EDTA 용액으로 세척하여 세포 덩어리로부터 상기 배지 성분들을 제거하였다. 세척 후에, 세포를 세척 용액에 35 내지 40의 최종 OD600로 현탁하였으며; 상기 희석 시 세포에 45 분간 30 초 온/오프 주기를 사용하는 탐침-기재 초음파 발생 장치로 초음파 처리를 가하였다. 용해 주기의 완료 후에, 세포 펠릿을 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리에 의해 수확하였다. 수득된 펠릿을 100 mM NaCl, 50 mM 트리스 HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100 및 2M 유레아-함유 용액으로 2 회 세척하였다. 다시 상기 IB를 상기 용액에 재현탁하고 12000 rpm에서 15 분간 원심분리에 의해 수확하였다. 수확된 펠릿을 트리톤 X-100이 제거되도록 100 mM NaCl, 50 mM 트리스 Cl pH 7.4 및 1 mM EDTA 용액으로 2 회 세척하였다. 최종적으로 펠릿을 8M 유레아(20 mM 트리스 Cl pH 7.4 중에서 제조됨) 및 1 mM DTT 중에 2 시간 동안 재현탁하였다. 상기 용액 중의 상기 용해된 봉입체의 대부분이 12000 rpm에서 20 분 동안 원심분리에 의해 펠릿으로부터 분리되었으며, 최종 상등액은 상기 키메릭 융합 단백질의 가장 많은 부분을 함유하였다. 현재 상기 단백질 분획에 리폴딩을 수행했으며, 이때 상기 분획을 0.2 ㎎/㎖ 까지 희석하고 하기의 조건, 즉 2 M 유레아, 50 mM NaCl 중의 몰비 1.5:0.5의 산화 및 환원된 글루타치온, 50 mM 트리스·Cl, 2% 글리세롤 하에서 매우 서서히 교반하면서 4 ℃에서 36 시간 동안 리폴딩시켰다. 상기 리폴딩 단계의 완료 후에, 상기 혼합물을 20 mM 트리스 Cl pH 7.6 및 50 mM 유레아에 대해 48 시간 동안 투석시키고 투석된 반응 혼합물을 소수성 및 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 탠덤 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 다이설파이드 결합 형성을, 다이설파이드 결합 형성 및 리폴딩의 직접적인 지표인 DTNB 반응(문헌[Riener, Kada et al. 2002])에 의해 모니터하였다. 최종적으로, 상기 정제된 단백질에 상이한 활성 분석을 수행하였다.
5. 플라스미노겐 활성화의 검출을 위한 카제인-플라스미노겐 오버레이:
융합 구조물에서, 예비 수준으로, 플라스미노겐 활성화를 상기 방법에 의해 선별하였으며, 이때 5%(w/v) 탈지유를 1% 아가로스와 함께 15 mM NaCl 및 50 mM 트리스를 함유하는 물 중에서 비등시킨다. 냉각 후에, 약 200 내지 400 ㎍의 플라스미노겐을 상기 혼합물에 가하고, 선별하려는 콜로니/클론이 있는 LB 암피실린 함유 플레이트 상에 덧발랐다(문헌[Malke and Ferreti 1984)]. 플라스미노겐 활성화 능력을 갖는 상기 융합된 재조합 단백질은 모두, 상기 카제인을 분해시켜 백색 배경에 대해 쉽게 가시화되는 제거 대역을 생성시키는 플라스민의 형성으로 인해, 1-2 시간 내지 18 시간의 다양한 기간 동안 배양 후 가수분해 대역에 의해 쉽게 검출되었다.
6. 플라스미노겐 활성화 프로파일의 검사에 의한 최대 생산자 클론의 선별:
젠티신 내성 마커의 사용에 의해 보다 많은 사본 수 함유 형질전환체를 선택한 후에 최대 생산자 클론의 실제 선별을 수행하였다. 상기 방법에서 1차 배양물을 2.5 ㎖의 BMGY 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1X 글리세롤, 아미노산 비함유 1X 효모 질소 염기 및 100 mM의 칼륨 포스페이트 완충제 pH 5.5) 중에서 30 ℃에서 16 내지 18 시간 동안 증식시켰다. 일단 광학 밀도(OD600)가 3 내지 4 단위까지 도달하면, 우리는 7.5 ㎖의 BMMY 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1X 메탄올, 아미노산 비함유 1X 효모 질소 염기 및 100 mM의 칼륨 포스페이트 완충제, pH 5.5)를 가하여 상기 배양을 유도하였다. 상기 배양을 5일간 최종 0.5 v/v% 메탄올로 재조합 생성물의 생산을 위해 추가로 유도하였으며, 따라서 재조합 융합 단백질이 강한 메탄올 유도된 프로모터의 영향 하에서 생산되었다.
7. 자이모그래피:
세포외 분비된 생성물 및 플라스미노겐 활성화 능력을 갖는 관심의 목적하는 밴드를 상기 방법에 의해 검출하였으며, 이때 10 내지 12.5% SDS-page 젤을 비환원 샘플 완충제에서 실행시켰다. 완료 후에, 과잉의 나트륨 도데실 설페이트를 2.5% 트리톤 X-100 용액 중에서 세척에 의해 제거하였다. 이어서 상기 젤을 50 mM 트리스, pH 7.4로 2 내지 3 회까지 세정하였다. 상기 세척된 젤을 탈지유 아가로스 및 플라스미노겐 함유 고체 표면(아가 젤) 상에 놓았다. 5 내지 7 시간 동안 배양 후 가수분해 대역의 전개가 가시화되었으며 이는 상기 분석된 단백질 중의 플라스미노겐 활성화 능력을 표시한다.
8. 웨스턴 블럿팅 기법:
목적하는 단백질의 검출을 웨스턴 블럿팅의 도움으로 수행하였다. 피키아 파스토이스로부터 세포외 배지 내로 분비된 모든 융합 구조물들을 6000 rpm에서 원심분리의 도움으로 분리시켰으며 상등액을 목적하는 생성물 확인을 위해 취하였다. 상등액을 그 자체로서 웨스턴 블럿팅을 위해 직접 취하거나 먼저 5 kDa 또는 10 kDa 컷 오프 범위 농축기(아미콘(Amicon))에 의해 농축시키거나 트라이-클로로 아세트산 침전을 수행하고, 아세톤으로 세척하고 10 내지 12.5% SDS 폴리아크릴아미드 젤 상에 로딩하였다. 단백질을 25 mM 트리스, 175 mM 글리신 및 20% 메탄올을 함유하는 운반 완충제의 도움으로 나이트로셀룰로스 멤브레인 상으로 운반하였다. 멤브레인 상의 젤 블럿팅을 35 분간 250 mA에서 수행하였다. 블럿팅된 멤브레인을 4 ℃에서 밤새 10% 탈지유 상에서 침액시키거나 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 상기 블럿을 0.1% 트윈-20을 함유하는 포스페이트 완충 염수로 3 시간 동안 추가 세척하였으며, 이는 과잉의 탈지유를 제거한다. 그 후에 상기 블럿을 권장된 희석으로 1 시간 동안 1차 항체 또는 다중혈청 중에 담그고 트윈-20 함유 PBS로 3 회 세척하였다. 추가로 상기 블럿을 HRP 접합된 2차 항체와 함께 배양한 다음 PBS로 3 회 세척하였다. 최종적으로, 블럿을 DAB(다이-아미노 벤지딘) 용액의 첨가에 의해 전개시켰다.
9. 리신-아가로스 크로마토그래피:
EGF 4,5,6을 갖는 다양한 조직 플라스미노겐 활성화제 융합물은 리신 잔기에 대한 친화성으로 알려진 크링글 도메인을 함유한다(문헌[McCance, Menhart et al. 1994]; [Ye, Rahman et al. 2001]). 이 방법에서, 조직 플라스미노겐 활성화제 융합 폴리펩타이드를 갖는, 피키아 파스토리스 발효로부터 수득된 상등액을 포스페이트 완충제 pH 7.5에 대해 3 내지 4 시간 동안 투석시키고, 대략 0.5 ㎖/분의 느린 유속으로 포스페이트 완충제(애머샴 바이오사이언스(스웨덴 웁살라 소재)로부터 구입하였다)로 예비-평형화시킨 리신-세파로스 컬럼 상에 로딩하였다. 로딩의 완료 후에, 컬럼을 다시 4 내지 5 충전 부피(bed volume)의 포스페이트 완충제로 세척하였으며 단백질이 최종적으로 0.3 M 엡실론 아미노 카프로산 및 100 mM NaCl 용액(문헌[Qiu, Swartz et al. 1998]) 중에서 용출되었다.
10. 트롬빈 친화성 크로마토그래피:
트롬빈 결합을 앞서 개시된 과정에 의해 시아노겐 브로마이드 활성화된 비드 상에서 수행하였다(문헌[Salem, Maruyama et al. 1984]). 이때, 상이한 정제 단계들로부터 수득된 단백질에 최종적으로 트롬빈 친화성(이때 컬럼은 50 mM 트리스 Cl pH 7.4로 평형화되었다)을 가하고 대략 0.5 ㎖/분의 느린 유속으로 상기 로딩에 사용된 50 mM 트리스 Cl, pH 7.4에 대해 투석시켰으며; 로딩의 완료 후에, 상기 컬럼을 동일한 완충제로 세척하였다. 최종적으로 단백질이 증가하는 구배의 NaCl에 의해 용출되었다(문헌[Salem, Maruyama et al. 1984]). 이어서 상이한 단백질 분획들을 단백질 C 활성화 능력에 대해 시험하였다.
11. 소수성 상호작용 크로마토그래피:
EGF-SK, EGF-tPA 및 EGF-SAK의 상이한 융합 유전자 구조물의 정제를 상이한 크로마토그래피 방법에 의해 수행하였으며, 이때 소수성 및 이온 교환 크로마토그래피를 상이한 융합 폴리펩타이드들의 빈번한 정제에 사용하였다(문헌[Goyal, Sahoo et al. 2007]).
소수성 크로마토그래피에서, 100 내지 300 μM 직경 크기의 평균 입자 크기를 갖는 페닐 세파로스(애머샴 바이오사이언스, 스웨덴 웁살라 소재) 6% 가교결합된 비드를 컬럼 제조에 사용하였다. 단순한 XK16/20 컬럼(애머샴 바이오사이언스, 스웨덴 웁살라 소재)을 연동 펌프의 도움으로 충전하고, 대략 25 ㎖ 페닐 세파로스 층을 제조하고 4 내지 5 충전 부피의 0.3 M NaCl 및 50 mM 트리스로 평형화하고, 상기 피키아 파스토리스 발효 동안 수득된, 목적하는 융합 구조물을 함유하는 나란한 상등액들을 투석에 의해 상기 평형 완충제와 동일한 완충제 농도 및 염 조성물 중에서 유지시켰다. 평형화된 상등액을 충전된 컬럼 상에 40 ㎖/시간의 유속으로 로딩하고, 상등액 로딩의 완료 후에 4 내지 5 충전 부피의 평형 완충제를 배지 성분 및 비특이적으로 결합된 불순물의 제거를 위해 통과시키고 최종적으로 목적하는 융합 폴리펩타이드를 수 중에서 용출시켰다. 용출된 단백질에 두 번째 라운드의 정제를 수행하고(하기 참조), 플라스미노겐 활성화, 트롬빈 억제 및 단백질 C 활성화 분석에 대해 시험하였다.
12. DEAE(다이에틸아미노에틸) 이온-교환 크로마토그래피:
본 크로마토그래피 과정에서, DEAE 세파로스(상표) 패스트 플로우를 XK 16/20 컬럼(에머샴 바이오사이언스, 스웨덴 웁살라 소재)에 충전하고 일반적으로 제조사의 설명서에 따르며, 이때 대개는 20 ㎖의 팽창된 기질이 상기 충전에 사용되었다. 상기 컬럼을 20 mM 트리스 Cl 완충제 pH 7.4로 평형화하고, 피키아 파스토리스로부터 수득한 상등액을 상기 20 mM 트리스 Cl 완충제 pH 7.4에 대해 광범위하게 투석시킨 후 평형화된 컬럼 상에 로딩하거나(별도의 실행), 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(상기)에 의해 정제시킨 후에 상기 평형 완충제의 경우와 동일하게 유지된 이의 이온 강도로 각각의 컬럼 상에 로딩하였다. 로딩의 완료 후에, 각 컬럼을 4 내지 5 충전 부피의 평형 완충제로 세척하였으며, 이는 비특이적으로 결합되거나 느슨하게 결합된 불순물 및 폴리펩타이드의 제거를 돕는다. 단백질의 용출을 5 충전 부피의 기질 상에 증가하는 구배의 1M NaCl을 적용시킴으로써 수행하였다. 단백질 정량 분석을 브래드포드(Bradford) 방법(문헌[Bradford 1976])의 도움으로 수행하였으며 BSA의 표준 곡선과 비교하였다. 최종적으로 정제된 단백질을 20 K Da 컷-오프 농축기(아미콘)에 의해 농축시키고 다양한 분석 및 작용 분석에 사용하였다.
13. EGF-혈전용해제 융합 구조물에 대한 플라스미노겐 활성화 분석:
모든 키메릭 융합 폴리펩타이드 구조물은 혈전용해 성분(SK, SAK 및 tPA)을 함유하였으며, 따라서 플라스미노겐을 활성화하는 이들 구조물의 능력을 플라스민에 대한 색원성 펩타이드 기질로부터의 색상 방출에 의해 측정하였다. 스트렙토키나제 및 모든 융합 구조물들의 1-단계 분석을 2 μM 인간 플라스미노겐, 50 mM 트리스, 0.05% BSA 및 5 mM의 색원성 기질이 사용되는 조건 하에서 수행하였으며, 색원성 기질의 방출을 시간의 함수로서 분광 광도 측정에 의해 모니터한다. 비선형 회귀를 따랐으며, 따라서 흡광도와 시간2 간의 플롯은 직선 방정식을 따랐다. 스트렙토키나제는 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환을 바로 시작하며 활성화에 있어서 실질적으로 지연을 보이지 않지만 상기 융합 구조물들 중 일부의 경우에, 상기 플라스미노겐이 플라스민으로 활성화하는데 시간이 오래 걸린다. 이는 미량의 플라스민이 상기 활성 복합체를 상기 플라스미노겐의 플라스민으로의 자이모겐 활성화(경로 I)가 활성이지 않게 만듦을 가리켰다. 이는, 미량(나노몰)의 외부 플라스민의 점진적인 첨가가 상기 지체 시간을 점진적으로 감소시킬 때 확인되었다. 조직 플라스미노겐 활성화제에 의한 플라스미노겐 활성화의 경우에, 빠르고 간단한 분광 광도 측정 방법이 이어졌으며, 이때 간단한 색원성 펩타이드(H-D-Val-Leu-Lys-pNA; S-2251; 크로모제닉스 인코포레이티드(Chromogenix Inc.)로부터 구입하였다)를 조직 플라스미노겐 활성화제의 작용에 의해 형성된 플라스민의 검출에 사용하였다(문헌[Verheijen, Mullaart et al. 1982]). 상기 방법을 또한 피브린 존재 하에서 증대된 플라스미노겐 활성화 및 조직 플라스미노겐 활성화의 확인에 사용하였다(문헌[van Zonneveld, Veerman et al. 1986]). 이 활성화 분석에서, 2 μM 플라스미노겐, 0.05 M 트리스 Cl ph 7.2, 100 mM NaCl, 0.05% 및 0.5 mM의 S-2251과 함께 배양된 상이한 정제된 양의 단백질을 용해성 피브린(아메리칸 다이아그노스틱스(미국 소재)로부터 구입하였다)의 존재 및 부재 하에서 및 피브린 없이 사용하였다. 405에서의 흡광도를 1 분 시간 간격으로 2 시간까지 모니터하였다.
14. 상이한 융합 구조물을 사용한 응고 시간 실험:
상이한 키메릭 구조물의 존재 하에서 트롬빈-유발된 덩어리 형성에 대한 영향을 알아보기 위해서, 상이한 트롬빈 농도의 표준 곡선을 작성하였으며 이로부터 6.6 IU의 트롬빈으로 20 초 응고 시간이 획득되었다. 이어서 동일한 양의 트롬빈을 증가하는 농도의 구조물과 함께 배양하여, 응고 시간이 대조군에 비해 두 배로 되는 농도를 측정하였다(문헌[Lougheed, Bowman et al. 1995]).
15. 상이한 융합/키메릭 구조물에 의한 단백질 C 활성화:
조직 플라스미노겐 활성화제, 스타필로키나제 및 스트렙토키나제의 상이한 융합 구조물들에 용량-의존적인 방식으로 트롬빈 매개된 단백질 C 활성화 분석을 수행하였다. 이 분석에서 상이한 양의 단백질(nM 범위)을 37 ℃에서 20 분 동안 50 mM 트리스-Cl, 5 mM CaCl2 및 0.05% BSA의 존재 하에서 10 nM의 트롬빈과 함께 배양하였다. 이 후에 0.5 μM의 단백질 C를 상기 웰에 가하고 25 ℃에서 20 분 동안 배양하였다. 그 후에 0.5 mM의 히루딘을 가하여 트롬빈을 억제하고 배양을 25 ℃에서 5 분간 계속하고 이어서 색원성 기질을 0.5 mM 최종 농도로 가하고, 착색된 pNA의 방출을 405 ㎚에서 앞서 상세히 설명한 바와 같이 시간에 관하여 모니터하였다(문헌[Eisenberg, Miletich et al. 1988]; [Ewald and Eisenberg 1995]; [Lougheed, Bowman et al. 1995]; [Meininger, Hunter et al. 1995]; [Dahlback and Villoutreix 2005]).
실시예
하기의 실시예들은 본 발명의 예시를 목적으로 제공되며 따라서 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.
실시예
1
스트렙토키나제와
EGF
4,5,6 도메인 간의 다양한 융합 유전자의 제조:
(i) SK 암호화 개방-판독-프레임(ORF)에 대해 상류로 인-프레임 융합된 EGF 도메인의 발현을 위한 하이브리드 유전자 구조물:
EGF-SK 단백질 융합(이때 상기 EGF 4,5,6 암호화 서열이 상기 SK ORF의 N-말단 암호화 쪽에서 인-프레임 융합되었다)을 암호화하는 이중 가닥(ds) DNA 블록을 프라이머 N_EGF_SKFp 1 및 N_EGF_SK Rp 2(프라이머의 서열에 대해서 표 1을 참조하시오)를 사용하여 제작하였다. 세균 발현 벡터 pET 23-d_SK의 설계 및 제작은 문헌[Nihalani et al., 1998]에 개시되었다. 상기 설계 및 제작은 pBR 322에서 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis) H46A로부터의 상기 SK 유전자의 클로닝(문헌[Pratapet al ., 1996])에 이어서, 파지 T7 주요 캡시드 단백질로부터의 매우 효율적인 리보솜 결합 부위를 함유하는 발현 벡터인 pET-23d 내로의 서브클로닝(문헌[Studier and Moffatt, 1986]), 및 추가로 2차 구조의 형성 경향을 최소화하기 위한 상기 유전자의 5' 단부의 변형을 수반하였다. pET-23-d_SK 구조물로부터 발현된 스트렙토키나제는 Met-SK이다. 추가의 상세한 내용은 미국 특허 제 7,163,817 호에 개시되어 있다. 상기 구조물을 상기 SK 유전자(DNA 서열번호 1, 및 상응하는 단백질 서열번호 113)의 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다.
EGF 4,5,6 도메인(서열번호 2 및 상응하는 단백질 서열번호 11)에 상응하는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 블록을, 주형으로서 맞춤 DNA 합성에 의해 제조되고 서열 번호 2로의 자동화된 DNA 서열화에 의해 확인된 서열번호 2에 상응하는 합성 유전자(DNA 폴리뉴클레오타이드)를 사용하여 선택적으로 증폭시키고, 그 후에 pET 23-d(노바겐(Novagen)) 벡터에 클로닝시켰다. 프라이머 N_EGF_SK Fp1은 또한, PCR 후에 수득된 생성된 유전자 블록이 효모 발현 플라스미드 내로 도킹(docking)될 수 있도록 이의 5' 단부에 Xho I 제한 부위를 함유하였다(프라이머의 상세한 설명에 대해서 표 1을 참조하시오). 프라이머 N_EGF_SK Rp2는 5' 단부에 서열(EGF 4,5,6의 6 번째 도메인의 단부와 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 외에) 및 또한 SK 유전자 ORF의 5 쪽과 어닐링하는 추가적인 뉴클레오타이드를 함유하였다. PCR 주기 조건은 하기와 같았다: 고온 출발, 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성; 95 ℃에서 45 초간 변성에 이어서 45 ℃에서 45 초간 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장의 총 28 회의 주기, 및 임의의 불완전 PCR 산물의 증폭의 완료를 위해서 10 분간 72 ℃의 최종 연장. 상기 SK 유전자 블록의 증폭을 위해서, 프라이머 N_EGF_SK Fp 3(상류) 및 프라이머 N_EGF_SK_Rp 4(하류 프라이머)(프라이머의 상세한 설명에 대해서 표 1을 참조하시오)를 사용하였다. PCR 조건은 하기와 같았다: PCR 조건: 고온 출발, 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 95 ℃에서 45 초간 변성, 45 ℃에서 45 초간 어닐링, 72 ℃에서 3 분간 연장의 총 28 회의 주기, 및 임의의 불완전 PCR 산물의 완전한 증폭을 위해서 10 분간 72 ℃의 최종 연장. 상기 두 PCR 산물을 모두 젤 추출 정제 키트(퀴아겐)에 의해 아가로스 젤로부터 젤 정제하였다. 이들 2 개의 정제된 PCR 산물에 대해, EGF 4,5,6 암호화 서열이 종결자 코돈으로 끝나는 SK 유전자 암호화 서열과 인-프레임 융합된 연속적인 EGF 4,5,6-SK 하이브리드 유전자 구조물을 제작하기 위해서 접합 중복 연장(SOE) PCR(상세한 내용에 대해서 상기 "실시예에 사용된 일반적인 방법" 섹션을 참조하시오)을 수행하였다. 상기 유전자 블록을 정제된 형태로 아가로스 젤로부터 단리하고 Xho I 및 Not I 제한 효소(R.E. 효소)로 절단하고 유사하게 절단된 pET 23-d 플라스미드 벡터 내로 연결하고(도 1A 및 도 2a를 참조하시오), 이어서 이를 플라스미드 DNA는 증식되지만 폴리펩타이드는 발현되지 않는 에스케리키아 콜라이 XL1B(rec A- 및 end A-) 세포 내로 형질전환시켰다. 상기 플라스미드에 대해, 정확하게 융합된 상기 EGF 및 SK 성분들의 DNA 서열(서열번호 4 및 상응하는 단백질 서열번호 112)을 확인하기 위해서 상거(Sanger)의 다이-데옥시 서열화 방법을 수행하였다. 이 구조물에서, Xho I 및 NotI 절단된 카세트를 아가로스 젤로부터 단리하고 pPIC-9K 내로 "도킹"시켰다. 상기 생성된 구조물에서, 상류 EGF 4,5,6 서열을 α-분비 신호 서열뿐만 아니라 Kex2 가공 부위와 함께 인-프레임 배치하며, 따라서 상기 하이브리드 유전자 구조물, EGF-4,5,6-SK가 숙주 게놈(문헌[Norden , Agemark et al . 2011]) 내로의 통합 후 상기 벡터 내에 위치한 알콜 옥시다제 프로모터로부터 피키아 파스토리스(균주 GS115)에서 발현된다. 상기 발현 벡터로부터 발현된 하이브리드 폴리펩타이드는 또한 막을 가로질러 효율적으로 운반되며(하기 실시예 참조) 순수한 형태로 상기로부터 단리될 수 있다.
(ii) EGF 4,5,6 암호화 도메인이 SK 암호화 유전자의 하류/C-말단 암호화 단부에서 인-프레임 융합된, SK-EGF4,5,6 암호화 유전자 구조물의 제작:
SK_EGF Fp1(상류) 및 SK_EGF Rp2(하류) 프라이머(프라이머 서열에 대해 표 1을 참조하시오)의 세트를 사용함으로써, SK에 상응하는 뉴클레오타이드 서열(DNA 서열번호 1, 및 상응하는 단백질 서열번호 114)을 주형으로서 pET23-d-SK 플라스미드를 사용하여 증폭시켰다("실시예에 사용된 일반적인 방법"을 참조하시오). 프라이머 SK_EGF Fp1은 이의 5' 단부에 Xho I 제한 부위를 함유하는 반면, SK_EGF Rp2는 이의 5' 단부에 1149 bp 이하의 SK 서열에 이어서 삼중 글리신(Gly-Gly-Gly) 암호화 구획뿐만 아니라 트랜스글루타미나제 인식 암호화 서열을 함유하고, 최종적으로 EGF4,5,6의 4 번째 도메인을 암호화하는 상기 5' 단부와 중복되는 서열로 끝난다. 생성되는 유전자 블록은 이의 5' 단부에 동일한 Xho I 제한 부위를 함유하고 하류(3'-단부)는 상기 4 번째 도메인에 대해 중복되는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 두 번째 PCR에서, SK_EGF Fp3 및 SK_EGF Rp4(프라이머 서열에 대해 표 1을 참조하시오) 프라이머 세트를 주형으로서 pET23-d_EGF4,5,6(EGF4,5,6에 대한 합성 주문-제조된 유전자를 함유한다)으로부터의 EGF4,5,6 도메인의 증폭에 사용하였다. 프라이머 SK_EGF_Fp3은 1149 bp 이하의 SK의 하류 서열에 이어서 이의 5' 단부를 향해 삼중 글리신 코돈 구획, 및 트랜스글루타미나제 인식 부위 암호화 서열을 함유하고; 다른 프라이머, 즉 SK_EGF_Rp4는 이의 5' 단부에 EGF4,5,6의 6 번째 도메인의 단부의 부분 서열 및 Not I 제한 부위를 함유하였다. PCR 후에, 상기 프라이머 세트의 사용에 의해 수득된, 생성된 유전자 블록 2는 이의 5' 단부(상류)에 1149 bp의 SK, 이어서 삼중 글리신-암호화 및 트랜스글루타미나제 인식 암호화 서열을 함유하고, 다른 한편으로 이의 3' 단부에 상기 pET-23-d 벡터 내로의 클로닝을 용이하게 하기 위해서 Not I 제한 부위를 함유한다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 95 ℃에서 45 초간, 45 ℃에서 45 초간 프라이머들의 어닐링, 및 72 ℃에서 1 분간의 28 주기; 최종적으로 임의의 부분 길이 PCR 산물을 완성하기 위한 72 ℃에서 10 분간의 연장.
상기 두 PCR 블록들(SK의 PCR 블록, 및 부분적으로 중복되는 서열을 갖는, EGF4,5,6을 암호화하는 PCR 블록)을 퀴아겐 젤 추출 키트를 사용하여 젤로부터 정제하였다. 상기 정제된 PCR 산물에 대해, 연속적인 SK_GGG_트랜스글루타미나제_EGF4,5,6 하이브리드 유전자 구조물을 제작하기 위해 접합 중복 연장 PCR을 수행하고, 최종적으로 SK_EGF Fp1 및 SK_EGF Rp4(프라이머 서열에 대해 표 1을 참조하시오)의 "단부" 프라이머 세트의 도움으로 증폭시켰다. 이어서 최종 PCR 산물을 Xho I 및 Not I 제한 효소(도 1B 및 도 2b를 참조하시오)로 절단하였다. 젤로부터 정제 후에, 최종의 절단되고 정제된 PCR 블록을 pET23-d(Xho I 및 Not I로 앞에서와 유사하게 절단되고, 젤 정제됨) 내로 연결하였다. 생성된 플라스미드를 pET23-d_SK_GGG_TG_EGF라 칭하며, 이를 에스케리키아 콜라이 XL1B(recA-, end A-) 세포에서 증식시켰다. 상기 플라스미드에 상거의 다이-데옥시 쇄 종결 방법을 수행하고 완성된 클로닝된 삽입 서열을 확인하였다(DNA 서열번호 6, 및 상응하는 단백질 서열번호 114). 상기 플라스미드 구조물로부터, Xho 1 및 Not1 효소를 사용함으로써, 상기 하이브리드 유전자 구조물을 단리하고 pPIC-9K(이때 상류 XhoI 부위는 상기 발현 플라스미드에서 상기 하이브리드 유전자의 상류의 α-분비 신호 서열 내로의 SK-GGG-TG-EGF4,5,6 블록의 인-프레임 도킹을 도왔다) 내로 연결시켰다. 상기 하이브리드 유전자-구조물을 알콜 옥시다제 프로모터의 조절 하에서 피키아 파스토리스(GS 115)에서 발현시켰으며, 그 후에 숙주 게놈 내로의 이의 통합 및 작용성 선별에 의한 플라스미노겐 활성화제-양성 클론의 선택을 수행하였다.
(iii) 스트렙토키나제 암호화 유전자 구획 내로의 EGF 4,5,6 도메인의 인-프레임 삽입을 위한 DNA 하이브리드 유전자의 제작:
EGF4,5,6에 대한 서열이 번역에 의한 인-프레임 방식으로 SK의 서열 내에 산재되어 하이브리드 유전자 구조물/들을 생성시킨 "도메인-간 SK"-EGF 구조물의 제작을 또한 설계하였으며, 이어서 적합한 프라이머(프라이머의 서열에 대해서 표 1을 참조하시오)를 사용하여 제조하였다. 상기 EGF 서열을 상기 도메인-간 유연성 구획(문헌[Wang et al., 1998]; [Yadav & Sahni, 2009])을 암호화하는 SK 유전자의 영역 내로, 즉 한편으로는 α와 β 도메인 사이, 또는 다른 한편으로 β와 γ 도메인 사이에 삽입하였다. 이를 위해서, SK의 α-도메인을 암호화하는 DNA의 증폭을, 먼저 프라이머 세트 IDα.Fp1 및 IDα Rp2(서열 세부사항에 대해, 표 1을 참조하시오)를 사용하여 수행하였다. 프라이머 IDα.Fp1은 이의 5' 단부에 Xho I 제한 부위를 함유하고; 다른 한편으로 프라이머 IDα Rp2는 이의 5' 단부에 EGF의 4 번째 도메인에 대한 중복 서열을 함유한다. 상기 반응을 위해서, 하기의 PCR 조건들을 사용하였다: 고온 출발, 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 95 ℃에서 45 초간 변성, 45 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1.5 분간 연장의 28 주기; 및 최종적으로 임의의 불완전 PCR 산물을 완성하기 위한 72 ℃에서 10 분간의 "연장 구획". EGF 4,5,6을 암호화하는 DNA 블록을 또한 프라이머 세트 ID EGF Fp3 및 IDEGF Rp4(이들 프라이머의 서열에 대해서 표 1을 참조하시오)를 별도로 사용하여 증폭시켰다. 상기 프라이머 세트를 사용하여, 5' 단부를 향한 상류 서열이 SK의 α-도메인의 하류 서열과 부분적으로 중복되었고; 마찬가지로 상기 블록의 3' 단부가 상기 SK β-도메인의 상류 서열과 중복하는 서열을 함유하는 EGF 4,5,6 서열을 암호화하는 DNA 블록을 수득하였다. SK의 β와 γ 도메인을 모두 암호화하는 세 번째 PCR 블록을 프라이머 세트 ID β Fp5 및 ID γ Rp6(이들 프라이머의 서열에 대해 표 1을 참조하시오)를 사용하는 PCR에 의해 수득하였다. 상기 반응을 위해서, 하기의 PCR 조건들을 사용하였다: 고온 출발, 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 95 ℃에서 45 초간 변성, 45 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1.5 분간의 연장의 총 28 주기; 및 임의의 불완전 PCR 산물의 완전한 증폭을 위한 72 ℃에서 10 분간의 연장. ID β Fp5 프라이머를, 상기의 5' 단부가 EGF의 6 번째 도메인의 하류 서열과 일치하도록 설계한 반면, 하류 프라이머 ID γRp6은 종결자 코돈에 이어서 NotI 제한 부위를 함유하였다. 3 개의 유전자-블록을 모두 젤 정제 키트(퀴아겐)의 도움으로 아가로스 젤로부터 정제하고, 유전자 구획들의 순서가 하기와 같도록 된 단일의 연속적인 유전자 산물을 수득하기 위해서 단일-용기 접합 중복 연장 반응을 수행하였다: SKα-EGF 4,5,6-SKβ-SKγ. 3 개의 구획을 모두, 상기 3 개-단편 SOE 중간체를 추가로 증폭시키기 위해서, 간단한 PCR 반응(이때 초기 10 회 주기를 프라이머 없이 수행하였으며 다음 18 회 주기는 0.6 μ의 최종 농도로 IDαFp1 및 IDγRp6을 각각 첨가함으로써 수행하였다)으로 1:1:1 몰비로 가하였다. 상기 반응을 위해서, 하기의 PCR 조건들을 사용하였다: 고온 출발, 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 95 ℃에서 45 초간 변성(각각의 주기에서), 45 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 3 분간 연장, 및 임의의 불완전 PCR 산물을 완성하기 위한 72 ℃에서 10 분간의 최종 연장. 최종 PCR 산물을 젤 정제하고, Xho I 및 Not I 제한 효소(도 1G 및 도 2d 참조)로 절단하였다. 이어서 상기 하이브리드 유전자 구조물을 pET 23-d 벡터 내로 연결하고, 소위 다이-데옥시 쇄 종결 방법으로 상거의 자동화된 서열화가 수행된(DNA 서열번호 3, 및 상응하는 단백질 서열번호 116) 에스케리키아 콜라이 XL1B(rec A- 및 end A-) 수용 세포 내로 형질전환시켰으며, 이때 상기 DNA를 단백질 발현 없이(숙주가 필요한 파지-암호화된 RNA 폴리머라제를 제공하지 않았기 때문에) 증식시킬 수 있었다. 이 결과는 하이브리드 유전자 구조물을 완벽하게 확인시켰다. 이 후에, 상기 하이브리드 유전자 카세트를 Xho I 및 Not I 효소로 절단함으로써 pET-23-d 도메인-간 SK_EGF 플라스미드로부터 단리하였다. 이어서 상기 카세트를 α-분비 신호 서열의 상류에서 상기 서열과 인-프레임으로 pPIC-9K 내에 연결시키고, 피키아파스토리스(GS115) 내로 형질전환시키고, 클로닝하고, 이전과 같이 플라스미노겐 활성화에 대한 작용성 선별에 의해 선택하였으며, 상기 발현은 방법 섹션에 상세히 설명한 바와 같이 메탄올 유도 후에 숙주 게놈 내로 통합 후 상기 벡터의 알콜 옥시다제 프로모터의 영향 하에 있었다.
(iv) SK 성분이 EGF 4,5,6 암호화 도메인들과 양쪽에서 인접하고 있는 하이브리드 SK-EGF 유전자의 제작:
SK 암호화 서열이 인-프레임 융합된 EGF 4,5,6 도메인들과 양쪽에서 인접하고 있는 또 다른 구조물을 또한, pET23-d N_EGF_SK 플라스미드 구조물(상기, 섹션 i 및 ii 참조)을 취하고 Xho I 및 AflII(상기 pET23-d N_EGF_SK 구조물 중의 독특한 부위들) 절단을 가하여 제작하였으며, 동일한 처리를 또한 pET-23-d-SK_EGF 구조물에 대해 제공하고 상기 두 절단 산물들을 모두 아가로스 젤 상에서 분석하였다. N_EGF_SK 구조물로부터 수득한 Xho I 및 Afl-II 구획을 SK_EGF 절단의 보다 큰 단편과 연결하고, 그 결과 pET23-d 벡터 중에 N_EGF_SK_EGF(DNA 서열번호 7, 및 상응하는 단백질 서열번호 115)를 제공하였다(도 1C 및 도 2c 참조). 상기 플라스미드로부터의 발현 카세트를 Xho I 및 Not I 절단에 의해 단리하고(상기 구조물을 먼저, 이전과 같이 DNA 서열화에 의해 확인하였다), pPIC-9K에 상기 EGF-SK-EGF 하이브리드 카세트의 상류 α-분비 신호 서열을 인-프레임으로 연결하고, 작용성 선별 후에 이전과 같이 숙주 게놈에서 통합 후 알콜 옥시다제 프로모터의 조절 하에서 피키아 파스토리스에서 발현시켰다(하기 참조).
(v) EGF 4,5,6에 상응하는 내산화성 폴리펩타이드 구획을 암호화하는 서열을 함유하는 N_EGF_SK, SK_EGF 및 N_EGF_SK_EGF 암호화 유전자 구획의 제작:
N_EGF_SK, SK_EGF 및 N_EGF_SK_EGF 폴리펩타이드에서, EGF4,5,6 도메인의 부분으로서, EGF 4,5,6 도메인의 41 번째 아미노산 잔기, 또는 SK-EGF의 434 번째 아미노산 잔기, 및 N_EGF_SK_EGF의 각각 41 번째 및 434 번째 아미노산 위치에 존재하는 메티오닌 잔기는 이의 산화 성향으로 유명하며, 상기 성향은 항트롬빈 활성, 특히 이들 도메인의 단백질 C 활성화 작용을 방해한다. 따라서, 이를 명심하면서, 우리의 상기 다양한 SK-EGF 융합/유전자 융합 구획들의 설계에서, 우리는 상기 메티오닌을 유전자 수준에서 발린/알라닌/글루타민 아미노산 잔기로 교체하였다. 이러한 목표는 이전과 같이, 고 충실성 효소 pfu 터보 DNA 폴리머라제(스트라타진)의 사용, 및 적합한 프라이머를 사용하는 상이한 주형 중의 부위 특이적 돌연변이의 도입에 의해 성취되었다(문헌[Wang and Malcolm 1999]). 이러한 구조물을 제조하기 위해서, 상기 유전자 구조물의 EGF 4,5,6 도메인/구획 중의 원래 Met 잔기의 위치에 상이한 구조물 중의 발린, 알라닌, 또는 글루타민의 별도의 통합을 허용하는 3 개의 프라이머 세트를 설계하였다. 상기 프라이머 세트를 하기와 같이 명명하였다:
i. M rep V Fp, 및 M rep V Rp(프라이머의 서열에 대해 표 1을 참조하시오)
ii. M rep A Fp, 및 M rep A Rp(프라이머의 서열에 대해 표 1을 참조하시오)
iii. M rep Q Fp, 및 M rep Q Rp(프라이머의 서열에 대해 표 1을 참조하시오).
다음 단계에서, pET 23-d_N_EGF_SK 및 pET 23-d_SK_EGF를 주형으로서 상기 언급한 프라이머 세트와 함께 사용하였다. 각 세트의 프라이머에 대해 PCR 주기 계획은 하기와 같았다: 95 ℃에서 완전한 변성, 이어서 28 주기 동안 95 ℃에서 45 초간 변성, 45 ℃에서 45 초간의 어닐링, 68 ℃에서 7 분간 연장, 및 72 ℃에서 추가로 10 분간의 연장. 상기 반응에 의해 수득된 최종 PCR 블록들을, 메틸화된 DNA를 절단하고 형질전환 후 양성 클론으로 될 확률을 증대시키는 Dpn I 제한 효소로 절단하였다. 상기 PCR 산물을 에스케리키아 콜라이 XL1블루 세포 내로 형질전환시키고 암피실린 함유 LB 아가 플레이트 상에 도말하고 37 ℃에서 16 내지 18 시간 동안 배양하였다. 몇 개의 클론을 무작위로 집어 암피실린-함유 LB 배지에서 7 내지 10 ㎖ 배양물로 증식시켰다. 플라스미드를 단리하고, 서열화하여, 목적하는 돌연변이/들의 존재를 확인하였다. 상기 과정을 채용함으로써, 메티오닌을 상기 두 구조물 모두에서 유전자 수준으로 발린, 알라닌 또는 글루타민 아미노산으로 교체하였다. 이들 구조물을 사용하여 표준 서브-클로닝 과정에 의해 N_EGF_SK_EGF 유전자에 발린, 알라닌 및 글루타민 돌연변이를 유발시켰다. 최종적으로, 이들 돌연변이체를 pPIC-9K로 운반하고 이들의 발현을 피키아 파스토리스의 GS115 균주("실시예에 사용된 일반적인 방법"을 참조하시오)에서 검사하였다.
(vi) 5 개 아미노산 결실을 갖는 SK의 N-말단을 갖는 ΔSK_EGF 구조물의 제작:
상기 구조물에서, 관련된 최종 목표는 SK의 N-말단 영역에서 5 개 아미노산의 제거였다. 이들 5 개 아미노산-암호화 뉴클레오타이드를, 주형으로서 pET 23-d_SK_GGG_TG_EGF(내산화성, EGF 4,5,6 구획 중 met 41 번째가 발린으로 교체되었다; 상기 참조)를 사용하여 PCR 프라이머 ΔSK_EGF Fp 1 및 ΔSK_EGF Rp 2(이들 프라이머의 서열에 대해 표 1을 참조하시오)의 도움으로 제거하였다. 상기 프라이머 ΔSK_EGF Fp1은 이의 5' 단부에 Xho I 제한 부위 및 16 번째 염기쌍으로부터 출발하는 SK의 중복 서열을 함유한다. ΔSK_EGF Rp 2는 이의 5' 단부에 EGF 4,5,6의 6 번째 도메인의 서열 및 Not I 부위를 함유한다. PCR 주기를 하기와 같이 상기 반응에 사용하였다: 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 28 주기: 95 ℃에서 45 초간 변성, 55 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 3 분간 연장, 및 불완전 PCR 산물의 완전한 증폭을 위해 72 ℃에서 10 분간 수행된 최종 연장. 최종 PCR 산물을 젤 용출시키고 Xho I 및 Not I 효소로 절단하고 pET 23-d 벡터 내로 연결하고, 완전하고 정확한 개방 판독 프레임의 확인을 위해 서열화하였다. 최종적으로 ΔSK_EGF(도 1D 참조) 카세트를 pPIC-9K에서 연결하고 앞서 개시한 바와 같이 표준화된 과정에 의해 이의 발현에 대해 검사하였다.
(vii) 내산화성 N_EGF_SK 및 N_EGF_SK_EGF 암호화 유전자 블록의 연접부에 트롬빈 절단성 부위를 암호화하는 DNA 서열의 인-프레임 도입:
N_EGF_SK의 발현, 플라스미노겐 활성화의 정제 및 동역학적 분석(플라스미노겐 활성화의 지연된 성질을 확립시켰다)으로부터, 고유/변형되지 않은 SK와 달리, 상기 구조물은 인간 플라스미노겐을 직접 활성화시킬 수 있는 것이 아니라, 예비-형성된 플라스민의 존재를 필요로 함이 자명하였다. 이는 생체 내에서 덩어리가 플라스민 풍부한 반면 상기 플라스민은 일반적인 순환 시 빠르게 불활성화되므로 상기와 같은 구조물에 덩어리-특이적인 활성화의 이점을 자동적으로 부여한다. 유사하게, 피브린 덩어리가 또한 트롬빈-풍부하며; 따라서 우리는 상기 구조물 중의 적합한 부위를 돌연변이시켜 상기 부위를 또한 트롬빈 활성화 가능하게 하였다. 이렇게 하기 위해서, 우리는 트롬빈 절단성 부위에 의해 EGF 및 SK의 도메인-간 결합 부위를 돌연변이시켰고, 그 결과 플라스미노겐 활성화에 트롬빈 절단성 활성화 스위치를 제공할 것이다. 이를, 소량의 트롬빈을 증분적으로 가하고 (앞서 개시한 유사한 플라스민-풍부 실험의 경우에서와 같이) N-말단 EGF4,5,6 융합된 SK 구조물에서의 플라스미노겐 활성화의 지체의 점진적인 감소를 관찰함으로써 1-단계 분석으로 모니터할 수 있다. 인자 XI의 트롬빈 절단성 서열을 EGF 및 SK 유전자 구조물의 연접부에 도입시켰다. 이는 중복 연장 PCR에 의해 성취되었으며, 이때 중복 서열 및 트롬빈 절단성 아미노산 암호화 뉴클레오타이드를 함유하는 연접 프라이머를 사용하였다. 첫 번째 PCR 반응에서, 프라이머 N_EGF_TCS Fp 1 및 N_EGF_TCS Rp 2(이들 프라이머의 서열에 대해 표 1을 참조하시오)를 EGF 4,5,6 도메인의 증폭에 사용하였다. 상기 프라이머 N_EGF_TCS Fp1은 이의 5' 단부에 Xho I 제한 부위 및 EGF의 4 번째 도메인의 서열을 함유하고; 다른 한편으로 N_EGF_TCS Rp2는 EGF의 6 번째 도메인 서열에 이어서 트롬빈 절단성 부위 암호화 서열에 이어서 SK의 상류 부분을 함유한다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 변성, 다음 28 주기에서, 95 ℃에서 45 초간 변성, 50 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 불완전 PCR 단편을 완성하기 위한 72 ℃에서 10 분간 수행된 최종 연장. 상기 반응에 의해 수득된 PCR 블록은 이의 5' 단부에 Xho I 제한 부위를 함유하고 이의 3' 단부에 트롬빈 절단성 암호화 뉴클레오타이드 서열 및 SK의 중복 부분을 함유한다. 다음 PCR 반응에서 TCS_SK Fp 3 및 SK Rp 4(이들 프라이머의 서열에 대해 표 1을 참조하시오)를 사용하였으며, 이때 상류 프라이머(TCS_SK Fp 3)는 5'에서 3' 순서로 6 번째 도메인의 서열, EGF 4,5,6의 중복 부분, 트롬빈 절단성 암호화 뉴클레오타이드 서열, 및 SK 암호화 뉴클레오타이드 서열을 함유하고; 다른 한편으로, SK Rp 4는 이의 5' 단부에 Not I 절단성 부위를 함유한다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 변성, 다음 28 주기에서, 95 ℃에서 45 초간 변성, 50 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 임의의 부분-길이 딸 단편의 합성을 완료하기 위한 72 ℃에서 10 분간 최종 연장. 상기 수득된 PCR 블록은 상류에 6 번째 도메인의 중복 서열 및 트롬빈 절단성 암호화 뉴클레오타이드를 함유할 것인 반면, 하류에는 Not I 제한 부위를 함유할 것이다. 상기 두 PCR 블록을 모두 젤 정제하고 단일 용기 반응으로 1:1 몰비로 혼합하고, 단부-프라이머 TCS Fp1 및 SK Rp6에 의해 증폭시켜, 필요한 N_EGF_TCS_SK PCR 블록(도 1E 참조)(TCS: 트롬빈 절단성 서열)을 제공하였으며, 이를 젤 정제하고 Xho I 및 Not I 효소로 절단하고, 최종적으로 표준 과정에 의해 유사하게 절단된 pET23-d 내로 연결시켰다. 상기 구조물 서열을, 에스케리키아 콜라이 XL 블루에서 서브 클로닝 후에, 이의 개방 판독 프레임에 관하여 확인하였다. 이는 EGF4,5,6과 SK의 연접부에 하기의 아미노산 서열을 갖는 인자 XI 트롬빈 절단성 부위가 상기 유전자 중에 생성되었음을 확립시켰다: Ile-Lys-Pro-Arg-Ile-Val-Gly. 이 서열에서, 트롬빈 특이성은, 트롬빈의 작용 후에 하나의 아미노산이 SK의 N-말단 단부로부터 제거되고, 또한 제 2 아미노산이 발린으로 교환될 수 있도록(고유 SK에서, 상기 N-말단 잔기는 Ile-Ala-Gly-이다) 아르기닌과 아이소류신의 연접부에서 절단을 생성시킨다. 이 후에, 상기 N_EGF_TCS_SK 카세트를 pPIC-9K 내로 연결시키고 이의 발현을 피키아 파스토리스에서 수행하였다. 상기 트롬빈 절단은 실제로, 트롬빈으로 처리 후에, 상기 정제된 구조물의 경우에 진정인 것으로 밝혀졌으며, N-말단 단백질 서열화에 의해 입증되었다.
(viii) SK의 β 및 γ 도메인의 연접부에서 번역에 의해 인-프레임 융합된 EGF4,5,6 도메인:
이를 위해서, β-도메인의 증폭을 주형으로서 pET23-d_SK를 사용함으로써 프라이머 ID αβ Fp1 및 ID αβ Rp2(이들 프라이머의 서열에 대해 표 1을 참조하시오)를 사용하여 수행하였다. 프라이머 ID αβ Fp1은 이의 5' 단부에서 Xho I 제한 부위를 함유하고, 다른 한편으로 ID αβ Rp2는 SK의 β 도메인의 하류 서열뿐만 아니라 EGF4,5,6의 4 번째 도메인의 부분 중복 서열을 함유한다. 이들 프라이머 세트에 의해 수득된 PCR 블록은 상류 서열에 Xho I 제한 부위를 함유하고, 하류는 β-도메인의 말단 서열 및 EGF의 4 번째 도메인의 중복 서열을 함유한다. 다음 단계에서 EGF4,5,6을 암호화하는 pcr 블록 2를 IDE4Fp3 및 IDE6Rp4(이들 프라이머의 서열에 대해서 표 1을 참조하시오) 프라이머 세트를 사용하여 단리하였다. 프라이머 IDE4Fp3은 이의 5' 단부에 SK의 β-도메인의 하류 서열을 함유하고 IDE6Rp4는 이의 5' 단부에 γ 도메인 상류 중복 서열을 함유한다. 상기 프라이머 세트에 의해 수득된 PCR 블록 2는 5' 단부에 하류 β-도메인의 중복 서열을 함유하고 다른 단부는 γ 도메인의 상류 서열을 함유한다. 상기 증폭을 위한 PCR 조건은 하기와 같다. 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 다음 27 주기에서, 95 ℃에서 45 초간, 45 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 72 ℃에서 10 분간 수행된 최종 연장. 다음 단계에서 SK의 γ 도메인을 IDγFp5 및 IDγRp6(이들 프라이머의 서열에 대해 표 1을 참조하시오) 프라이머 세트를 사용하여 단리하였다. 프라이머 ID γ Fp5는 상기와 같은 방식으로 설계되었으며, 이때 IDγFp5'의 5' 단부는 EGF4,5,6의 6 번째 도메인의 상동성 하류 서열을 함유하는 반면, IDγRp6은 종결 코돈에 이어서 Not I 제한 부위를 함유한다. 하기의 pcr 계획을 블록 3의 증폭에 사용하였다: 고온 출발 95 ℃에서 5 분간, 95 ℃에서 45 초간 변성, 47 ℃에서 45 초간의 어닐링, 및 72 ℃에서 1.5 분간 수행된 연장. 총 28 회의 주기가 수행되었으며 임의의 불완전 증폭된 산물의 완성을 위해 72 ℃에서 10 분의 최종 연장을 수행하였다. 상기 수득된 모든 PCR 산물을 젤 추출 키트(퀴아겐)에 의해 젤 정제하고 A260 분광광도 측정에 의해 정량분석하였다. 최종 pct 반응에서, 생성된 구조물의 순서가 하기와 같은 단일의 연속적인 유전자 블록을 획득하기 위해서, 상기 3 개의 유전자 블록을 모두 접합 중복 연장 반응을 위해 단일 용기에 주입하였고: SKα-SKβ-EGF4,5,6-SKγ, 상기 3 개의 pcr 산물을 모두 폴리머라제 쇄 반응에서 1:1:1 몰비로 혼합하였으며, 이때 초기 10 회의 주기를 어떠한 프라이머도 없이 수행하였으며 다음 18 회의 주기를, 상기 3 개 단편 중간 완전 유전자 블록을 증폭시키기 위해서 0.6 μM 최종 농도의 IDαβFp1 및 IDγRp6 프라이머를 첨가하여 수행하였다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 고온 출발, 95 ℃에서 45 초간 변성, 45 ℃에서 45 초간의 어닐링, 및 72 ℃에서 3 분간 연장, 총 28 회의 주기를 수행하였다(이때 초기 10 회의 주기는 프라이머 없이 수행하였고 최종 증폭을 72 ℃에서 10 분간 수행하였다). 최종적으로 수득된 유전자 블록은 이의 5' 단부에 Xho I 부위를 함유하고 이의 3' 단부에는 Not I 부위를 함유한다. 상기 유전자 블록은 Xho I 및 Not I 효소로 절단되고 pET 23-d 및 pPIC 9K로 클로닝되었다. 이의 발현, 정제 및 특성화를 피키아 파스토리스에서 검사하였다. 상기 유전자 블록은 SK의 β와 γ 도메인(DNA 서열번호 5, 및 상응하는 단백질 서열번호 129; 도 1H 및 도 2e를 참조하시오) 사이에 EGF 4,5,6 도메인을 함유한다.
(ix) N_EGF_TCS_SK 하이브리드-유전자 블록(메티오닌 내산화성 돌연변이를 함유한다)의 N-말단 암호화 단부에 트랜스글루타미나제 인식 서열의 통합:
상기 EGF-SK 구조물에서 EGF 4,5,6 도메인의 시작 또는 4 번째 도메인 앞에 트랜스글루타미나제 인식 서열을 통합하기 위해서, 프라이머 TG_N_EGF_Fp 1 및 Afl II Rp 2(프라이머의 상세한 서열에 대해서 표 1을 참조하시오)를 설계하였으며, 이때 TG Fp1은 Xho I 제한 부위, 및 이의 상류 영역에 혈액 인자 XIII 트랜스글루타미나제 인식 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 반면, 프라이머 Afl II Rp 2는 Afl II 제한 절단 부위를 함유하는 상기 영역의 뉴클레오타이드 서열을 함유한다(SK의 165 내지 170 번째 뉴클레오타이드는 상기 프라이머의 중심에 위치한 Afl II 제한 부위를 함유한다). 이들 프라이머로부터, 우리는 PCR에 의해 Xho I 제한 부위, 트랜스글루타미나제 인식 암호화 뉴클레오타이드, 및 EGF4,5,6의 4 번째 도메인의 서열을 함유하는 유전자 블록을 수득하였으며, 이때 상기 블록의 하류 부분은 Afl II 제한 부위를 함유한다. 상기 유전자 블록(내산화성 및 트롬빈 절단성 서열 함유)을 젤로부터 추출하였다. 플라스미드 pET 23-d N_EGF_TCS_SK 및 pET 23-d N_EGF_TCS_SK_EGF를 Xho I 및 Afl II로 절단하였다. 그 결과 상기 두 플라스미드 구조물 모두로부터 Xho I 및 Afl II 유전자 블록 및 보다 크고 보다 작은 부분들이 제공되었다. 상기 절단된 유전자 블록을 상기 구조물의 보다 큰 부분과 연결하고, 에스케리키아 콜라이 XL 블루 내로 형질전환시켜 TG_N_EGF_TCS_SK 및 TG_N_EGF_TCS_SK_EGF(도 1F를 참조하시오) 함유 플라스미드를 수득하였다. 이들을 서열화하고 정확한 개방 판독 프레임, 즉 앞서 개시한 EGF-SK 구조물과 관련하여 트랜스글루타미나제 암호화 서열의 존재를 확인하였다. 이어서 상기 두 카세트를 모두 피키아 파스토리스에 연결하고 이들 구조물의 발현을 검사하였다("실시예에 사용된 방법"을 참조하시오).
실시예
2
다양한
EGF
-
SK
하이브리드
폴리펩타이드의
발현 및 작용 특성화:
실시예 1에 개시된 상이한 유전자 블록들, 예를 들어 트랜스글루타미나제 및 트롬빈 절단 부위 등이 통합되었고, 모두 발현 벡터 pPIC-9K에 클로닝되었으며, 또한 각각의 유전자-융합의 서열로부터 예상되는 작용상 활성인 하이브리드 유전자 산물을 발현하는 것에 관하여 확인된, N-EGF-SK, SK-EGF 및 N_EGF-SK_EGF, 및 또 다른 부류의 도메인-간 융합 구조물, 예를 들어 도메인간 EGF_αβ SK, 도메인간 EGF_βγSK, 절두된 ΔSK_EGF, 및 N_EGF_SK, SK_EGF 및 N_EGF_SK_EGF의 내산화성 형태를 이의 추가적인 특성화 전에 비교적 더 큰-부피의 배양물로부터 단리하였다. 실시예 1에 개시된 바와 같이, 피키아 클론을 처음에 플라스미노겐 활성화 능력에 대해 카제인 오버레이 방법에 의해 통상적으로 시험하고, 이어서 여러 개(각각 10 내지 20 개)의 양성 클론들을 BMGY 및 BMMY 배지(BMGY = 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1X 글리세롤, 아미노산이 없는 1X 효모 질소 염기 및 100 mM의 칼륨 포스페이트 완충제 pH 5.5, 및 BMMY = 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1X 메탄올, 아미노산이 없는 1X 효모 질소 염기 및 100 mM의 칼륨 포스페이트 완충제, pH 5.5)에서 증식시키고 이어서 앞서 "방법" 하에 개시한 바와 같이 메탄올로 유도하고, 무-세포 상등액을 펩타이드 색원성 기질의 존재 하에서 플라스미노겐 활성화(분광광도 측정) 분석뿐만 아니라 카제인 오버레이 분석(재확인을 위해)에 사용하였다. 이어서 비교적 높은 생산자인 것으로 밝혀진 것들을 1-리터 수준으로 증식시키고 단백질을 소수성 상호작용(예를 들어 페닐-아가로스) 및 이온-교환(DEAE-아가로스) 크로마토그래피에 의해 나란히 정제하였다(상세한 설명은 "실시예에 사용된 일반적인 방법" 섹션 하에 개시되어 있다). 이들 2 개의 정제 방법에 의해 수득된 하이브리드 SK-EGF 폴리펩타이드는 SDS-PAGE에 의해 일반적으로 90 내지 95% 순수하였다. 모든 상기 정제된 구조물들을 플라스미노겐 활성화 능력(인간 플라스미노겐을 사용하는 단일-단계 분석)에 대해 시험할 뿐만 아니라 응고 시간을 측정하기 위한 트롬빈 억제 분석, 뿐만 아니라 단백질 C 활성화를 위한 색원성 분석("실시예에 사용된 방법" 참조)을 수행하였다. SK_EGF 및 내산화성 SK_EGF는 SK와 밀접하게 유사하지만, N_EGF_SK의 경우에 활성화 동역학에서 2 내지 3 분의 추가적인 지체가 있는 PG 활성화의 동역학을 나타내며, 상기 활성화에 있어서 내산화성 N_EGF_SK, N_EGF_TCS_SK 및 TG_N_EGF_SK 지체는 매우 현저하였고(20 내지 25 분) 그 후에 상기 플라스미노겐 활성화 동역학은 고유-SK와 같았다. 이는 상기 구조물에 의해 상기 PG의 초기 활성화가 지연된 반면 변형되지 않은 SK의 경우에 실질적으로 순간적임을 암시하였다. 그러나, 일단 상기 SK 구조물이 활성화되었으면, 상기 지체 후라 하더라도, 충분한 플라스미노겐 활성화 특성을 나타내었다. 양극성 EGF 융합 단백질, 즉 N_EGF_SK_EGF, 내산화성 N_EGF_SK_EGF, N_EGF_TCS_SK_EGF 및 이의 변이체 TG_N_EGF_TCS_SK_EGF에서 약간 더 큰 지체(30 내지 25 분)가 발견되었다. 그러나 이전에 서술한 바와 같이, 지체의 제거 후에, 단백질 밀리그램당 플라스미노겐 활성화율(비활성)은 변형되지 않은 SK의 경우와 유사하였다. N_EGF_SK, N_EGF_SK_EGF 및 유사한 종류의 구조물에서 상기 지체의 이유는 자이모겐의 자기 활성화 기전의 제거인 것으로 밝혀졌다(문헌[Bajaj and Castellino 1977]; [Boxrud, Verhamme et al . 2004];[Aneja , Datt et al . 2009]). 이는 소량(나노몰 량)의 플라스민의 상기 반응 분석 내로의 약간의 첨가에 의한 점진적인 지체의 상실이 존재한다는 관찰에 의해 확립되었다. 또한, 이들 구조물의 예비-형성된 플라스민 복합체가 분석에 사용된 경우 지체가 없으며, 이는 SK에 대해 관찰된 즉석 플라스미노겐 활성화 기전 대신에, 상기 지체를 갖는 융합 구조물이 오직 플라스민과 착화된 경우에만 이제 플라스미노겐 활성화가 가능함을 분명히 암시한다. 유사한 플라스민 의존성 활성화가 또한 도메인-간 αβ EGF_SK 구조물에서 발견되었으나; 활성화 후 이의 전체 비활성은 변형되지 않은 스트렙토키나제의 경우의 단지 40 내지 50%인 것으로 밝혀졌다. 현저하게도, EGF 4,5,6 구획이 SK의 β와 γ 도메인의 연접부에 놓인 다른 도메인-간 구조물의 경우에, 상기 정제된 단백질은 변형되지 않은 SK에 비해 5% 미만의 플라스미노겐 활성을 보였다. 이는 명백히 EGF와 SK의 임의의 융합물이 자동적으로 작용성인 것이 아니라, 오직 정확하게 설계된 것들만 그렇다는 것을 나타낸다. 이들을, 고속 대량 선별 시스템에 쉽게 적용시킬 수 있는 플라스미노겐 활성화, 트롬빈 억제 등에 대한 플레이트/분광광도 측정 분석을 사용하여 선별함으로써 선택할 수 있다(상기 설계를 실험적으로 또는 구조 추정에 의해 수행한 경우). 따라서, SK, 또는 스트렙토키나제의 천연 변이체의 임의의 설계된 부위-특이적 치환, 결실 또는 도메인-첨가 돌연변이체를 사용하여, 이때 채용된 접근법에 의해 유사한 SK-EGF 단백질을 획득할 수 있다.
상기 정제된 구조물을 또한 인간 혈액 인자를 사용하는 응고 시간 분석에 의해 트롬빈의 억제 측정을 위해 시험하였다(앞서 개시된, 실시예에 사용된 방법을 참조하시오). 현저하게도 상기 구조물들은 모두 어떠한 구조물도 갖지 않거나, 또 다른 대조군으로서 고유 SK를 갖는 대조용 분석들의 경우보다 상기 분석에서 응고 시간의 현저한 증가(대략 2.5 내지 3배)를 보였다. 더욱이, 상기 응고 시간의 증가는 낮은 나노-몰 농도 범위에 걸쳐 선형의 용량-의존적인 양상을 따르는 것으로 밝혀졌으며, 이는 양성 대조군으로서 사용된, 피키아에서의 발현에 의해 획득된 EGF4,5,6 도메인에 대해 관찰된 경우와 밀접하게 유사하다. 이러한 결과는 플라스미노겐 할성화 능력을 갖는 EGF 융합 구조물(또한 매우 낮은 활성을 갖는 것으로서)이 또한 강한 트롬빈 억제 능력을 발휘함을 확립시켰다.
실시예
3
다양한
EGF4
,5,6 및
TPA
하이브리드
유전자를 암호화하는
DNA
의 제작:
암호화 tpA(서열번호 9, 및 상응하는 단백질 서열번호 120)와 인 프레임 융합된 EGF4,5,6 서열을 암호화하는 DNA 구획(서열번호 2, 및 상응하는 단백질 서열번호 111) 및 EGF4,5,6을 암호화하는 인 프레임 융합된 DNA의 또 다른 구획(서열번호 8, 및 상응하는 단백질 서열번호 111)을 화학적으로 합성하고 정제하고 pUC19에 클로닝하였다. 이를 서열화하여 이의 타당성(서열번호 8, 및 상응하는 단백질 서열번호 111)을 확립시켰다. 상기 구조물을 EGF-tpA-EGF(서열번호 10, 및 상응하는 단백질 서열번호 121)라 칭한다. 상기 유전자 구조물 외에, 상기 구조물에서 EGF4,5,6 도메인 유전자 암호화 구획은 tPA(서열번호 11, 및 상응하는 단백질 서열번호 122)의 N-말단 부위에서 융합되거나 tPA(서열번호 12, 및 상응하는 단백질 서열번호 123)의 C-말단에서 융합되었다. 상기 tPA 암호화 서열들을 먼저 프라이머 tPAFp 1 및 tPA Rp2(프라이머 서열에 대해 표 2를 참조하시오) 프라이머들에 의해 증폭시켰다. 상기 반응을 위해 사용된 PCR 조건은 하기와 같다: 고온 출발, 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 95 ℃에서 45 초간 변성, 55 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 4 분간 연장의 총 28 회의 주기, 및 불완전한 PCR 산물의 완전한 증폭을 위해 72 ℃에서 10 분간 최종 연장. 따라서 상기 반응에 사용된 프라이머 tPAFp 1은 이의 5' 단부에 Xho I 제한 부위를 함유하고 tPARp 2는 Not I 제한 부위를 함유한다. 수득된 PCR 산물을 Xho I 및 Not I 제한 효소로 절단하고 pET 23-d 내로 연결시켰다. 상기 과정에 의해 형성된 최종 구조물을 pET 23-d tPA(도 2f 참조)라 명명하였으며, 서열화하여 상기 tPA 개방 판독 프레임을 확인하였다. N-말단(N_EGF_tPA) 및 C-말단(tPA_EGF) 융합물의 제조를 위해서, 간단한 제한 절단 및 연결 계획을 수행하였다. 상기 두 구조물을 모두 단일 단계로 제조하기 위해서, pET23-d tPA 및 pUC-19_N_EGF_tPA_EGF를 Xho I 및 BSrG I(이 둘은 모두 독특한 절단제이다)로 절단하였으며; 이는 보다 작고 보다 큰 단편을 제공하였다. pUC-19_N_EGF_tPA_EGF 절단의 보다 작은 단편은 N_EGF_tPA 서열을 함유하며, 상기 서열을 pET23-d_tPA의 보다 큰 단편과 연결하였고, 상기 단계는 N_EGF_tPA(DNA 서열번호 11, 및 상응하는 단백질 서열번호 122) 구조물을 제공하였다. tPA_EGF(DNA 서열번호 12, 및 상응하는 단백질 서열번호 123) 구조물을, pUC-19_N_EGF_tPA_EGF의 보다 큰 단편과 pET 23-d_tPA의 보다 작은 단편과의 연결에 의해 제조하였으며, 이는 상기 제작의 경우 tPA_EGF(도 1J 참조)를 제공하였다. N_EGF_tPA(도 1K 참조) 및 tPA_EGF(도 2g 참조)를 Xho I 및 Not I 제한 효소로 절단하고 단리된 삽입 단편을 pPIC-9K 내에 연결하였으며, 이때 상기 구조물은 α-분비 신호 서열에 인-프레임으로 놓였다. 이들 구조물은 모두 숙주 게놈에의 통합 후에 상기 벡터에 위치한 메탄올 유도 프로모터의 영향 하에서 피키아 파스토리스(GS115)에서 발현되었다.
실시예
4
조직
플라스미노겐
활성화제와 인간
트롬보모듈린의
EGF
4,5,6 도메인 간의 다양한
하이브리드
유전자의 제작:
(i) 도메인-간 EGF 4,5,6-tPA 구조물의 제작:
조직 플라스미노겐 활성화제는 하기의 순서로 상이한 도메인들을 함유한다: N-말단 펩타이드-핑거 도메인-EGF 유사 도메인-크링글 1-크링글 2-촉매 도메인. 신규의 비-천연 하이브리드 설계를 유전자 수준에서 제작하였으며, 이때 tPA의 고유 EGF 도메인/들을 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인에 의해 교체하였다. 이들 구조물을 다른 하이브리드 유전자의 생성에 대해 앞서 사용된 중복 연장 PCR 전략에 의해 제조하였다.
(a) tPA의 고유 egf 도메인이 인간 트롬보모듈린의 EGF4,5,6 도메인으로 교체된 하이브리드 유전자 블록의 제작:
상기 구조물을 제조하기 위해서, pET 23-d_tPA(서열번호 9, 및 상응하는 단백질 서열번호 120)를 기준으로서 취하였으며 이때 고유 egf 암호화 영역은 187 bp에서 297 bp로 출발하였다. 첫 번째 단계에서, 상기 핑거 도메인 암호화 DNA를 하기의 프라이머 Fin Fp 1 및 Fin Rp2(이들 프라이머의 서열에 대해서 표 2를 참조하시오)의 사용에 의해 단리하였으며, 이때 상류 프라이머는 이의 5' 말단에 Xho I 제한 부위를 함유하는 반면, 다른 한편으로 두 번째 프라이머는 EGF4,5,6 도메인의 4 번째 도메인에 대한 중복 서열과 함께 핑거 도메인을 암호화하는 하류 서열을 함유한다. 상기 PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 다음 28 주기: 95 ℃에서 45 초간, 48 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 72 ℃에서 10 분간 수행된 최종 연장. 두 번째 PCR에서, EGF 4,5,6 도메인 구획을, EGF Fp 3 및 EGF Rp 4(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오) 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다. 프라이머 EGF Fp3은 핑거 도메인 및 EGF의 4 번째 도메인의 하류 서열을 함유하고; 다른 한편으로 상기 하류 프라이머 EGF Rp 4는 이의 5' 말단 단부에 크링글 1의 중복 서열을 함유한다. 상기 PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 다음 28 주기: 95 ℃에서 45 초간, 48 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 최종적으로 72 ℃에서 10 분간 연장 구획으로 끝난다. 상기 프라이머 세트에 의해 획득된 유전자 블록은 5' 말단에 핑거 도메인 서열 및 이의 3' 단부에 크링글 1의 중복 서열을 함유한다. 세 번째 PCR에서, 상기 촉매 도메인의 단부에 대한 크링글 1을 암호화하는 서열을 K1 Fp 5 및 CD Rp 6(이들 프라이머의 서열에 대해서 표 2를 참조하시오) 프라이머 세트를 사용하여 선택적으로 증폭시켰다. 프라이머 K1 Fp1은 이의 5' 말단에 EGF4,5,6의 6 번째 도메인에 대한 중복 서열을 함유하고 프라이머 CD Rp 6은 5' 단부에 종결 코돈 및 Not I 제한 부위를 함유한다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 다음 28 주기를 수행하였다: 95 ℃에서 45 초간, 48 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 3 분간 연장, 및 모든 부분-길이 단편의 합성 완료를 위해 72 ℃에서 10 분간 수행된 최종 연장. 상기 반응에서 획득된 유전자 블록은 5' 말단에 EGF 6 번째 도메인 중복 서열, 및 또한 이의 3' 단부에 촉매 도메인 암호화 서열, 종결 코돈 및 Not I 부위를 함유한다. 상기 3 개의 PCR 산물을 모두 젤-정제하고 완전한 하이브리드 유전자 구조물의 증폭을 위해 단일-용기 SOE를 수행하였으며, 이때 조립체의 순서는 하기와 같았다: 핑거 도메인-EGF4,5,6 도메인-크링글 1-크링글 2 및 tPA(도 1Q 및 도 2j 참조) 촉매 도메인. 이를 Fin Fp 1 및 CD Rp 6(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오) 프라이머 세트의 도움으로 수행하였다. 최종 PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 다음 28 주기: 95 ℃에서 45 초간, 48 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 4 분간 연장, 및 72 ℃에서 10 분간 최종 연장(단일 구획). 상기 유전자 블록을 젤 추출에 의해 정제하고 Xho I 및 Not I 효소로 절단하고, 유사하게 절단되고 정제된 pET 23-d 벡터와 연결하고, 앞서 개시한 바와 같이 에스케리키아 콜라이 XL 블루 내로 클로닝하였다. 몇몇 랜덤한 클론들에 대해 완전한 삽입/유전자 블록에 대한 상거의 서열화를 수행하고, tPA(DNA 서열번호 13, 및 상응하는 단백질 서열번호 124) 내로의 EGF 4,5,6 도메인의 정확한 인-프레임 통합을 함유함을 확인하였다. 이어서 상기 유전자 블록을 pPIC-9K 벡터로 운반하고, 이전과 같이 피키아 파스토리스 내로 클로닝하고, "실시예에 사용된 일반적인 방법" 하에 개시된 바와 같이 플라스미노겐 활성화제 활성의 높은 수준을 선별하였다.
(b) 고유 egf 및 tPA의 크링글 1 도메인이 인간 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인으로 교체된 도메인-간 tPA 및 EGF 하이브리드 유전자 구조물의 제작:
상기 구조물을 제조하기 위해서, 3 개의 상이한 PCR을 별도로 수행하였으며, 이때 생성된 유전자 블록은 각각의 유전자 블록의 말단에 중복 서열을 함유하고, 이어서 이들 블록을 하기의 하이브리드 구조물의 제조를 위해 단일-용기 SOE 반응으로 증폭시켰다: tPA 핑거 도메인-EGF4,5,6-tPA 크링글2-tPA 촉매(세린 프로테이제) 도메인(도 1R 및 도 2h 참조). 상기 구조물의 제조를 위해서, pET 23-d_tPA(서열번호 9, 및 상응하는 단백질 서열번호 120)를 주형으로서 취하였으며, 이때 고유 egf- 및 크링글 1-암호화 뉴클레오타이드 영역은 187 bp에서 564 bp로 시작한다. 첫 번째 단계에서, 핑거 도메인 암호화 구획을 하기의 프라이머들을 사용하여 단리하였다: FgFp 1 및 Fg Rp2(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오), 이때 상기 상류 프라이머는 5' 말단에서 Xho I 제한 부위를 함유하는 반면, 다른 한편으로 두 번째 프라이머는 핑거 도메인의 하류 서열 및 EGF4,5,6 도메인의 4 번째 도메인의 중복 서열을 함유한다. 상기 PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 다음 28 주기: 95 ℃에서 45 초간, 48 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 72 ℃에서 10 분간 수행된 최종 연장. 두 번째 PCR에서, EGF 4,5,6 도메인을 프라이머 EFI Fp 3 및 EFI Rp 4(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오)로 증폭시켰다. 프라이머 EFI Fp 3은 핑거 도메인 및 EGF의 4 번째 도메인의 하류 서열을 함유하는 반면, 다른 한편으로 하류 프라이머는 이의 5' 말단 단부에서 크링글 2의 중복 서열을 함유하였다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 다음 28 주기: 95 ℃에서 45 초간, 48 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 72 ℃에서 10 분간 수행된 최종 연장. 상기 프라이머 세트에 의해 수득된 유전자 블록은 5' 말단에서 핑거 도메인 서열을 함유하고, 이의 3' 단부에서 크링글 2의 중복 유전자를 함유하였다. 세 번째 PCR 반응에서, 크링글 2에서 tPA 촉매 도메인으로 출발하는 서열을 2 개의 프라이머 세트 K2 Fp 5 및 K2 CD Rp 6(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오)의 사용에 의해 증폭시켰다. 프라이머 K2 Fp5는 이의 5' 말단에 EGF 4,5,6의 6 번째 도메인의 중복 서열을 함유하고 프라이머 K2 CD Rp6은 5' 단부에 종결 코돈 및 Not I 제한 부위를 함유한다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성으로 "고온 출발", 다음 28 주기: 95 ℃에서 45 초간, 48 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 3 분간 연장, 및 72 ℃에서 10 분간 수행된 최종 연장. 상기 반응에서 수득된 유전자 블록은 이의 5' 말단에 6 번째 도메인 중복 서열을 함유하고, 이의 3' 단부에 촉매 도메인 암호화 서열에 이어서 종결 코돈 및 Not I 부위를 함유하였다. 상기 3 개의 PCR 산물을 모두 젤-정제하고 완전한 하이브리드 유전자 구조물을 수득하기 위한 증폭을 위해 Fg Fp 1 및 K2CD Rp 6 프라이머 세트(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오)와 함께 단일-용기 SOE 반응을 수행하였으며, 이때 상기 다양한 단백질 암호화 구획들의 조립체의 순서는 하기와 같다(클로닝 후 DNA 서열화에 의해 최종적으로 확인되었다): 핑거 도메인-EGF4,5,6 도메인-크링글 2 및 촉매 도메인(DNA 서열번호 14, 및 상응하는 단백질 서열번호 126). 최종 PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 다음 28 주기: 95 ℃에서 45 초간, 48 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 4 분간 연장, 및 72 ℃에서 10 분간 수행된 최종 연장. 상기 유전자 블록을 젤 추출에 의해 정제하고 Xho I 및 Not I 효소로 절단하고 pET 23-d 벡터와 연결하고, 에스케리키아 콜라이 XL 블루에 클로닝하였으며, 이때 완전한 유전자 블록을 서열화하고 부분적으로 절두된 tPA 유전자 내로의 EGF 4,5,6 도메인의 정확한 인-프레임 통합을 확인하였다. 상기 최종의 하이브리드 유전자-블록을 pPIC-9K 벡터로 운반하고 앞서 개시한 바와 같은 표준화된 과정을 사용하여 피키아파스토리스에서 이의 ORF 발현에 대해 검사하였다.
(c) EGF 4,5,6 암호화 구획이 tPA의 N-말단 및 C-말단 암호화 단부에 인-프레임 융합된 상기 tPA의 절두된 버전을 암호화하는 하이브리드 유전자 블록의 제작:
상기 구조물들을 주형으로서 앞서 제조된 pET-23-d N_EGF_tPA(서열번호 11, 및 상응하는 단백질 서열 121) 및 pET 23-d_tPA_EGF(서열번호 12, 및 상응하는 단백질 서열번호 123)의 도움으로 제조하였다. 상기 두 구조물 모두에서, 고유 egf 및 크링글 1 도메인을 중복 PCR 설계의 도움으로 제거하였다. N_EGF_tPA(도 1N 참조) 구조물로부터 tPA의 고유 egf 및 크링글 1 도메인을 제거하기 위해서, 2 개의 프라이머 세트를 설계하였다. 첫 번째 프라이머 세트, N_EtPAFp 1 및 N_EtPA Rp 2(이들 프라이머 서열에 대해 표 2를 참조하시오)를 EGF4,5,6 도메인 및 tPA 핑거 도메인의 연속적인 뉴클레오타이드 서열의 증폭에 사용하였다. 이 경우에, 상류 프라이머는 이의 5' 단부에 EGF의 4 번째 도메인 서열 및 Xho I 제한 부위를 함유하였으며, 프라이머 N_EtPA Rp2는 tPA 크링글 2의 중복 서열을 함유하였다. 두 번째 프라이머 세트, 즉 EK2 CD Fp3 및 K2CD Rp 4(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오)를 tPA의 크링글 2 및 촉매 도메인의 증폭에 사용하였다. 프라이머 EK2 CD Fp 3은 5' 단부에 핑거 도메인의 하류 중복 서열을 함유하고 다른 프라이머는 tPA 촉매 도메인의 하류 서열 및 Not I 제한 부위를 함유한다(PCR 조건: 고온 출발, 95 ℃에서 5 분간, 28 주기의 95 ℃에서 45 초간, 52 ℃에서 45 초간, 72 ℃에서 2 분간, 및 72 ℃에서 10 분간 최종 연장). 상기 반응에서 수득된 생성된 유전자 블록은 이의 5' 단부에 tPA 핑거 도메인 중복 서열 및 이의 3' 단부에 Not I 제한 부위를 함유하였다. 상기 두 PCR 산물을 모두 젤-정제하고, 프라이머 N_EtPA Fp1 및 K2 CD Rp4(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오) 세트의 도움으로 고유 egf 및 크링글 1이 결실된 완전한 유전자 블록을 제작하였다. 상기 생성된 유전자 블록을 정제하고 Xho I 및 Not I 제한 효소로 절단하고 pET 23-d 벡터 내로 연결하고, 에스케리키아 콜라이에 서브-클로닝하고, 상기 tPA(DNA 서열번호 15, 및 상응하는 단백질 서열번호 126; 도 2i) 암호화 유전자-블록으로부터 egf 및 크링글 1의 제거 후 정확한 인-프레임 결합을 위해 DNA-서열화하였다. 유전자 블록의 정확한 개방 판독 프레임을 서열화함으로써 확인 후에, 상기 카세트를 pPIC-9K 내로 연결하고, 이전과 같이 피키아 내로 형질전환시키고, 활성에 대해 선별하고, 세포외 발현을 검사하였다. 유사한 방식으로, 고유 egf 및 크링글 1을 구조물, tPA_EGF 중의 tPA 암호화 유전자 블록으로부터 결실시켰다(도 1P 및 도 2h 참조). 이때, pET 23-d-tPA_EGF 플라스미드 DNA를 절두된 tPA 뉴클레오타이드 서열의 증폭을 위해 주형으로서 사용하였다. 핑거 도메인의 증폭을 위해 프라이머 세트, 핑거 Fp1 및 핑거 Rp2(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오)를 사용하였으며, 이때 핑거 Fp1 프라이머는 이의 5' 단부에 Xho I 제한 부위를 함유하였고, 다른 프라이머, 핑거 Rp2는 tPA의 핑거 도메인의 하류 서열 및 크링글 2의 중복 서열을 함유하였다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 30 주기의 95 ℃에서 45 초간의 변성, 44 ℃에서 45 초간의 어닐링 및 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 72 ℃에서 10 분간 최종 연장으로 끝난다. 이는 이의 5' 단부에 tPA 핑거 도메인 중복 서열에 이어서 Xho I 제한 부위를 함유하고 이의 3' 단부에 크링글 2 중복 서열을 함유하는 유전자 블록을 제공하였다. 두 번째 프라이머 세트를 크링글2-촉매 암호화 도메인 및 EGF 4,5,6 도메인의 증폭에 사용하였다. 첫 번째 프라이머, K2 CD Fp3(상기 프라이머 서열에 대해 표 2를 참조하시오)은 tPA 핑거 도메인의 하류 단부에 대한 중복 서열 및 크링글 2의 작은 부분을 함유하였으며; 다른 한편으로, 두 번째 프라이머 EGF Rp 4(상기 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오)는 EGF의 하류 서열 및 Not I 제한 부위를 함유하였다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 및 30 주기의 95 ℃에서 45 초간 변성, 44 ℃에서 45 초간의 어닐링 및 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 72 ℃에서 10 분간 최종 연장. 상기 두 유전자 블록들을 젤로부터 정제하고 프라이머 핑거 Fp1 및 EGF Rp4(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오)의 존재 하에서 중복 연장 반응을 수행하였으며, 상기로부터 수득한 PCR 산물을 젤 정제하고 이 전과 같이 (DNA 서열번호 16, 및 상응하는 단백질 서열번호 127) 에스케리키아 콜라이에서 pet 23-d 내로 연결하고, 서열화하여 완전한 유전자 블록을 확인하였다. 최종적으로 상기 유전자 블록을 pPIC-9K에 연결하고 이전에 개시한 바와 같이 발현 및 작용 성질의 선별을 위해 피키아 파스토리스로 형질전환시켰다.
(d) 조직 플라스미노겐 활성화제 유전자 구조물을 함유하는 다양한 EGF 중의 상이한 돌연변이의 통합:
상술한 EGF 4,5,6 및 tPA의 상이한 융합 구조물에서, 하기의 아미노산 변화가 이루어졌다: 아스파라진에 의해 교환된 쓰레오닌 115 번째 아미노산(T 115 N), 글루타민에 의해 교환된 아스파라진 129 번째 아미노산(N 129 Q) 및 tPA 308 - 311의 KHRR 암호화 영역이 돌연변이의 4중 알라닌 신장부에 의해 교체된다(KHRR(308 - 311) AAAA)(DNA 서열번호 20, 및 상응하는 단백질 서열번호 128). 이들 돌연변이는 생성된 분자에 대해 추가적인 피브린 특이성을 부여할 뿐만 아니라 상기 tPA의 생체 내 반감기를 증가시키는 것으로 공지되어 있다(문헌[Keytt et al., 1994]). 이들 돌연변이의 도입을 위해서, 우리는 위치 선택적 돌연변이 접근법("실시예에 사용된 방법"을 참조하시오)을 사용하였으며 이러한 변화를 내산화성(이때 EGF 4,5,6 도메인의 129 번째 메티오닌이 발린/알라닌/글루타민으로 교체되었다) 유전자 주형에 또한 통합시켰다. 하기의 프라이머들을 위치 선택적 돌연변이에 사용하였다: 1. T 115 N Fp 및 T115 N Rp(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오). 2. N129 Q Fp 및 N129 Q Rp(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오).
tPA 돌연변의 경우에 단부-프라이머로서 KHFp 1 및 KHRp 2(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오)를 사용하는 KHRR(이때 tPA의 잔기 308-311이 4 중 알라닌 아미노산 잔기에 의해 교체되었다) 중복 연장 PCR(실시예에 사용된 방법을 참조하시오)을 폴리뉴클레오타이드의 1 내지 933 bp 길이 신장부의 증폭에 사용하였으며, 이때 KHFp 1 프라이머는 Xho I 제한 부위 및 tPA의 상류 서열을 함유하고; 다른 한편으로 프라이머 KHRp2는 이의 5' 단부에 4개-알라닌 돌연변이를 함유한다. 하기의 PCR 조건을 사용하였다: 고온 출발, 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 총 28 주기의, 95 ℃에서 45 초간 변성, 45 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1.5 분간 연장, 및 임의의 불완전 PCR 산물의 완전한 증폭을 위한 72 ℃에서 10 분간의 최종 연장. 최종적으로, 상기 방법에 의해 수득된 유전자 블록은 5' 단부에 Xho I 제한 부위를 함유하고, 이의 3' 단부에 4중-알라닌 돌연변이를 함유하였다. 또 다른 PCR 반응 세트에서, KHFp3 및 KHRp 4(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오)를 tPA의 918 번째 bp 내지 1617 번째 bp의 DNA의 증폭에 사용하였다. 프라이머 KHFp 3은 이의 5' 단부에 4 중 알라닌 돌연변이를 함유하는 반면, 두 번째 프라이머, KHRp 4는 Xho I 제한 부위를 함유한다. 하기의 PCR 조건을 상기 반응에 사용하였다: 고온 출발, 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 총 28 주기의, 95 ℃에서 45 초간 변성, 45 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1.5 분간 연장, 및 임의의 불완전 PCR 산물의 완전한 증폭을 위한 72 ℃에서 10 분간의 최종 연장. 생성된 유전자 블록은 이의 5' 단부에 4중-알라닌 돌연변이를 함유하고 이의 3' 단부에 Not I 제한 부위를 함유한다. 상기 두 PCR 산물을 모두 젤 정제하고 공통의 "중복" PCR 반응 단일 용기 내로 혼합하였으며, 이때 KHFp1 및 KHRp 4(이들 프라이머의 서열에 대해 표 2를 참조하시오)를 전체 유전자 블록의 증폭에 사용하였다. 최종적으로, 상기 수득된 유전자 블록을 pET 23-d로 운반하고 DNA 서열 및 정확한 개방 판독 프레임의 확인 후에, pPIC9K로 운반하고, 이때 상기 하이브리드 폴리펩타이드를 피키아에서 발현시키고 표준 조건에 의해 검사하였다("실시예에 사용된 방법"을 참조하시오).
실시예
5
스타필로키나제와
트롬보모듈린
도메인
EGF
4,5,6 간의
하이브리드
유전자의 제작:
SAK_EGF 및 EGF_SAK 암호화 하이브리드 유전자 블록의 제작:
EGF-SAK 융합물의 제작을 위해서, EGF 4,5,6 PCR 블록을 N_EGF_SAK Fp1 및 N_EGF_SAK Rp 2 프라이머 세트(이들 프라이머의 서열에 대해 표 3을 참조하시오)의 도움으로 단리하였으며, 이때 pET 23-d_EGF4,5,6(서열번호 2, 및 상응하는 단백질 서열번호 111)을 주형으로서 사용하였다. 이때, N_EGF_SAK Fp1은 이의 5' 단부에 Xho I 제한 부위를 함유한 반면, N_EGF_SAK Rp 2는 5' 단부에 SAK 뉴클레오타이드의 중복 서열을 함유하였다. 하기의 PCR 조건을 사용하였다: 첫 번째(고온 출발) 주기에서 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 28 주기의 95 ℃에서 45 초간 변성, 50 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 임의의 불완전 PCR 산물의 완성을 위한 72 ℃에서 10 분간의 최종 단계. 상기 PCR 산물은 이의 5' 단부에 Xho I 제한 부위를 함유하였고 3' 단부는 SAK의 중복 서열을 함유하였다. 두 번째 단계에서, SAK PCR 블록을 N_EGF_SAK Fp3 및 N_EGF_SAK Rp 4 프라이머 세트의 도움으로 증폭시켰고, pGMEX_SAK(서열번호 17, 및 상응하는 단백질 서열번호 130) 구조물을 주형으로서 사용하였다. 이 반응에서, 프라이머 N_EGF_SAK Fp 3은 EGF 4,5,6의 6 번째 도메인의 하류 중복 서열을 함유하였고; N_EGF_SAK Rp 4는 종결 코돈에 이어서 Not I 제한 부위를 함유하였다. 하기의 PCR 조건을 사용하였다: 첫 번째 주기에서 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 다음 28 주기의, 95 ℃에서 45 초간 변성, 50 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 불완전 PCR 산물의 완성을 위한 72 ℃에서 10 분간의 최종 단계. 이는 5' 단부에 6 번째 EGF 도메인 중복 서열을 갖고 3' 단부에 종결 코돈에 이어서 Not I 제한 부위를 함유하는 유전자 블록을 제공하였다. 상기 두 PCR 산물을 젤-추출하고 젤 정제 키트의 도움으로 정제하고 단일 SOE PCR 반응에, 상기 하이브리드 유전자 중간체(중복 연장에 의해 수득됨) 증폭을 위해 사용되는 N_EGF_SAK 상류 Fp 1 및 N-EGF-SAK Rp 4 하류 프라이머와 1:1 몰비로 혼합하였다. 그 결과, 우리는 N_EGF_SAK(DNA 서열번호 18, 및 상응하는 단백질 서열번호 118) 서열을 함유하는 연속적인 유전자 단편을 획득하였다. 이어서 상기 유전자 블록을 Xho I 및 Not I로 절단하고 pPIC-9K 벡터 내로 운반하였다. DNA 서열화는 상기 EGF_SAK(도 1T 참조) 구조물에서 예상되는 인-프레임 융합 및 임의의 다른 돌연변이의 부재를 입증하였다. 상기 구조물을 피키아 파스토리스의 GS 115 균주 내로 운반하고 이전에서와 같이, 숙주 게놈 내로의 통합 후에 알콜 옥시다제 프로모터의 영향 하에서 발현에 대해 검사하였다.
SAK_EGF(도 1S 참조) 구조물의 제작을 유사한 방식으로 수행하였으며, 이때 EGF4,5,6 도메인 구획을 SAK의 C-말단 단부에서 융합시켰다. 첫 번째 단계에서, SAK 유전자 블록을 SAK_EGF Fp 1 및 SAK_EGF Rp 2 프라이머 세트의 도움으로 단리하였다. 프라이머 SAK_EGF Fp1은 5' 단부에 Xho I 제한 부위를 함유하고; 다른 한편으로 SAK_EGF Rp 2는 EGF 4,5,6의 4 번째 도메인의 중복 서열을 함유한다. 생성된 유전자 블록은 이의 상류 서열들 가운데 Xho I 부위를, 이의 하류 서열에 중복하는 4 번째 도메인 EGF 서열을 함유한다. 두 번째 단계에서, SAK 유전자 블록을 SAK_EGF Fp 3 및 SAK_EGF Rp 4 프라이머의 사용에 의해 단리하고, 이때 SAK_EGF Fp3은 SAK의 중복 서열을 함유하고, SAK_EGF Rp 4는 종결 코돈 및 Not I 제한 부위를 함유한다. 이들 프라이머 세트를 사용하여 PCR로부터 단리한 유전자 블록은 상류에 SAK 중복 서열을 함유하고, 이의 하류 단부에 종결 코돈 및 Not I 부위를 함유하였다. 상기 두 유전자 블록을 모두 아가로스 젤로부터 정제하고, 완전한 SAK_EGF(DNA 서열번호 19 및 상응하는 단백질 서열번호 119) 유전자 블록을 수득하기 위해서 SAK_EGF Fp 1 및 SAK_EGF Rp 4와 단일 SOE 반응 내로 혼합하였다. 따라서, 상기 최종 PCR 산물은 상기 SAK_EGF 서열을 함유하는 하이브리드 유전자 블록을 제공하였으며 이를 젤로부터 정제하고 Xho I 및 Not I 제한 효소로 절단하고 pPIC-9K 내로 운반하고, 서열화 후에 정확한 인-프레임 확인을 수행하였다. 상기 구조물을 피키아 파스토리스의 GS 115 균주 내로 형질전환시키고, 이때 표준화된 과정에 의한 게놈 통합 후에, 상기 알콜 옥시다제 프로모터의 영향 하에서 이의 발현(SDS-PAGE뿐만 아니라 카제인-오버레이 플라스미노겐 활성화제 분석에 의해 검사되었다)은 발현 플라스미드 pPIC-9K 중에 위치하였다. 전체 SAK_EGF 구조물을 α-분비 신호 서열의 상류에 인-프레임 통합시켰으며 이는 막을 가로질러 배지 내로의 하이브리드 유전자 산물의 운반을 돕는다.
N_EGF_SAK 및 SAK_EGF의 세균 발현:
상술한 N_EGF_SAK 및 SAK_EGF DNA 구조물을 또한 IPTG 유도성 lac 프로모터의 영향 하에서 발현시켰다. 이러한 구조물을 제조하기 위해서, 상기 pPIC-9K_N_EGF_SAK 및 pPIC-9K_SAK_EGF 플라스미드를 주형으로서 사용하였다.
(i) N_EGF_SAK 유전자 블록의 세균 발현 카세트의 제작:
N_EGF_SAK 유전자 블록을 먼저 주형으로서 pPIC-9K_N_EGF_SAK를 사용하여 BacFp 1 및 BacRp 2 프라이머의 도움으로 증폭시켰다. Bac Fp1 프라이머는 이의 5' 단부에 Nco I 부위를 함유하여, 상기 유전자 블록의 처음에 필요한 AUG 코돈을 제공하는 것으로 돕고, mRNA 중에 개시제 Met 잔기 암호화 코돈을 제공하였다. 프라이머 BacRp 2는 유전자 산물의 검출 및 이의 정제를 돕는 ter 코돈 앞의 전사된 mRMA의 단부에 6 히스티딘 아미노산-암호화 뉴클레오타이드의 인-프레임 도입을 용이하게 하기 위해서 Xho I 제한 부위를 함유하였다. 상기 유전자 블록을 상기 젤로부터 단리하고 Nco I 및 Xho I 제한 효소로 절단하고, 최종적으로 T7 프로모터 기재 pET 23-d 벡터와 연결시키고 에스케리키아 콜라이 내로 형질전환시켰다. 이들 2 개의 독특한 부위는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 영향 하에서 상기 하이브리드 유전자 구조물의 삽입을 돕는다(문헌[Studier and Moffatt, 1986]). 상기 구조물 pET 23-d_N_EGF_SAK를 XL 1B 세포(rec A- 및 end A-) 내로 형질전환시켰으며, 이때 플라스미드가 증식되고 서열화되었다. 이제 상기 플라스미드를 BL21 (DE3) 세포(발현 숙주)로 운반하고 이때 T7 RNA 폴리머라제의 유도가 IPTG에 의해 수행되었으며 발현이 봉입체로서 세포-내 형태로 수행되었다(발현 조건, 봉입체 단리 및 리폴딩 프로토콜에 대해서 "실시예에 사용된 방법"을 참조하시오). 최종적으로, 상기 리폴딩된 단백질을 크로마토그래피를 통해 매우 정제된 형태로 수득하고 활성 분석을 수행하였다.
(ii) 세균 발현을 위한 SAK_EGF 유전자 블록의 제작:
SAK_EGF 구조물을, SAK_EGF Fp1 및 SAK_EGF Rp 2 프라이머의 도움으로 제조하였으며, 이때 pPIC-9K_SAK_EGF를 증폭을 위한 주형으로서 취하였다. 상기 프라이머 SAK_bac Fp1은 5' 단부에 Nco I 제한 부위를 함유하여 AUG 코돈의 도입을 도왔으며; 다른 한편으로 SAK_bac Rp2는 Xho I 제한 부위를 함유하여 목적하는 SAK_EGF 유전자-구조물의 하류 단부에 종결 코돈 전에 6 히스티딘 아미노산-암호화 뉴클레오타이드의 도입을 촉진하였다. 하기의 PCR 조건을 사용하였다: 첫 번째 주기에서 95 ℃에서 5 분간 완전한 변성, 이어서 다음 28 주기의, 95 ℃에서 45 초간 변성, 50 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1.5 분간 연장, 및 부분-길이 PCR 산물의 완성을 위한 72 ℃에서 10 분간의 최종 단계. 생성된 유전자 블록은 이의 상류 단부에 Nco I 부위를 함유하였고, Xho I 부위가 이의 하류 단부에 존재하였으며, 상기 블록을 젤 추출에 의해 정제하고 pET 23-d 벡터 내로 연결하였다. 상기 연결 산물을 일렉트로포레이션에 의해 에스케리키아 콜라이 XL1B(rec A- 및 end A-) 세포 내로 형질전환시키고 생성된 플라스미드를 정확한 개방 판독 프레임의 확인을 위해 서열화하였다. 플라스미드의 증식을 XL1B 세포에서 수행하였지만 하이브리드 유전자 산물의 발현을 위해서 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 BL 21(DE 3) 세포(노바겐 인코포레이티드) 내로 형질전환시켰다. 최종적으로, 단백질을 IPTG의 존재 하에서 발현시켰으며, 이는 봉입체를 형성시켰고, 이를 단리하고 "실시예에 사용된 방법" 하에 상세히 설명된 바와 같이 산화 및 환원된 글루타치온의 존재 하에서 리폴딩하고, 상기 EGF_SAK 구조물에 대해서와 같이 플라스미노겐 활성화제 및 트롬빈 억제 활성 분석을 수행하였다.
(iii) EGF 및 SAK의 연접부에서 트롬빈 절단성 서열의 도입:
트롬빈 절단성 서열을 N-말단 융합 구조물 중의 EGF 및 SAK의 연접부에 도입시켰다. 상기 구조물의 경우, 플라스미드 pET-23-d 중의 EGF_SAK DNA를 EGF 및 SAK 증폭을 위한 주형으로서 취하였다. 트롬빈 절단성 프라이머를 설계하였다. EGF 증폭의 경우에, E 4 Fp 1 및 E6 Rp 2(이들 프라이머의 서열에 대해 표 3, 일련번호 13 및 14를 참조하시오)라 명명된 프라이머들을 사용하였다. E4 Fp 1 프라이머는 이의 5' 단부에 Xho I 제한 부위 및 EGF4,5,6 도메인의 상류 서열을 함유하고; 다른 한편으로 E6 Rp2는 이의 5' 단부에 EGF 4,5,6의 하류 서열 및 트롬빈 절단성 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 하기의 PCR 조건을 증폭을 위해 사용하였다: 95 ℃에서 완전한 변성, 이어서 다음 28 주기의, 95 ℃에서 45 초간, 45 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 최종적으로, 72 ℃에서 추가로 10 분간의 연장. 상기 PCR 반응에 의해 수득된 유전자 블록은 이의 5' 단부에 EGF의 4 번째 도메인을 인-프레임 암호화하는 서열을 함유하고, 이의 3' 단부에 EGF4,5,6의 하류 서열 및 트롬빈 절단성 서열을 함유한다. 두 번째 PCR 반응에서, 상기 SAK 유전자 블록을 TCS SAK Fp 3 및 TCS SAK Rp4(이들 프라이머의 서열에 대해 표 3, 즉 일련 번호 15,16을 참조하시오)의 도움으로 증폭시켰다. TCS SAK Fp3은 트롬빈 절단성 서열 및 SAK 뉴클레오타이드의 상류 서열을 함유하고; 유사하게 다른 프라이머 TCS SAK Rp4는 SAK의 하류 서열 및 종결 코돈에 이어서 Not I 제한 부위를 함유한다. 생성된, 증폭된 유전자 블록은 이의 5' 단부에 트롬빈 절단성 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 이의 3' 단부에 종결 코돈 및 Not I 부위가 놓였다. 하기의 PCR 조건을 상기 SAK 유전자 블록의 증폭을 위해 사용하였다: 95 ℃에서 완전한 변성, 이어서 다음 28 주기는 하기와 같다: 95 ℃에서 45 초간 변성, 45 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장, 및 72 ℃에서 추가로 10 분간의 최종 연장. 상기 두 PCR 산물을 모두 젤-용출하고, EGF_TCS_SAK 유전자 블록의 증폭을 위해 하기의 조건 하에서 E4 Fp 1 및 TCS_SAK Rp 4(이들 프라이머의 서열에 대해 표 3, 즉 상기 표의 일련번호 13 및 16을 참조하시오)의 도움으로 통상적인 중복 연장 PCR 반응을 수행하였다: 95 ℃에서 완전한 변성, 이어서 28 주기 동안 95 ℃에서 45 초간 변성, 45 ℃에서 45 초간의 어닐링, 72 ℃에서 2 분간 연장, 및 72 ℃에서 추가로 10 분간의 최종 연장. 상기 수득된 유전자 블록은 이의 5' 단부에 Xho I 제한 부위 및 이의 3' 단부에 Not I 부위를 함유하였다. 상기 PCR 산물을 Xho I 및 Not I 효소로 절단하고, pET 23-d에서 클로닝에 후속으로 트롬빈 절단성 서열의 정확한 인-프레임 삽입을 위해 서열화한 후에 pPIC-9K 내로 연결하였다.
실시예
6
TPA
-
EGF
및
SAK
-
EGF
융합 구조물의 생물학적 활성:
화학적으로 합성된, EGF와 tPA의 상이한 하이브리드 유전자 구조물(N_EGF_tPA_EGF), 하이브리드 tPA 융합 구조물(이때 EGF 4,5,6이 삽입되어 tPA의 고유 도메인, 즉 egf 및 크링글 1을 교체하였다), tPA 및 EGF 융합물의 내부적으로 결실된 형태(이때 고유 egf 및 크링글 1이 결실되고 EGF 4,5,6이 N 및 C 말단 중 어느 하나에 융합되었다), 및 상기 언급된 구조물들의 내산화성 변이체를 필수적으로 이전에 개시한 바와 같이 pPIC-9K 벡터의 α-분비 신호 서열의 상류에 인-프레임 클로닝하였다. 각각의 구조물을 제한 엔도뉴클레아제에 의해 별도로 검사하고 DNA 서열화에 의해 확인하였다. 이들 구조물을 모두 개별적으로 일렉트로포레이션에 의해 피키아 파스토리스(GS 115)로 운반하였다("실시예에 사용된 일반적인 방법" 섹션을 참조하시오). 개별적인 클론들을 BMGY 및 BMMY 배지(BMGY = 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1X 글리세롤, 아미노산이 없는 1X 효모 질소 염기 및 100 mM의 칼륨 포스페이트 완충제 pH 5.5, 및 BMMY = 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1X 메탄올, 아미노산이 없는 1X 효모 질소 염기 및 100 mM의 칼륨 포스페이트 완충제, pH 5.5) 상에서 5일간 함께 메탄올로 유도함으로써 증식시키고 상등액을 플라스미노겐 활성화 능력에 대해 카제인 오버레이 방법에 의해 시험하였으며("실시예에 사용된 방법" 섹션을 참조하시오); 이와 별개로, 각각의 양성 클론의 상등액을 1-단계 분석으로 플라스미노겐 활성화에 대해 시험하였다. 이어서 각각의 과잉-활성 클론을 1-리터 수준으로 증식시켰으며, 이때 각 단백질 중의 tPA 폴리펩타이드의 존재를 웨스턴 블럿팅에 이어서 리신 친화성 및 이온-교환 크로마토그래피에 의해 확인하였다(상세한 프로토콜에 대해서 "실시예에 사용된 방법"을 참조하시오). 크로마토그래피에 의해 수득된 상이한 융합 구조물은 SDS-PAGE에 의해 92 내지 95% 순수하였다. 이들 정제된 단백질에 플라스미노겐 활성화 분석을 가하였다. 각각의 정제된 단백질의 비활성은 피키아 유래된 천연 조직 플라스미노겐 활성화제와 아주 유사하였다. 그러나, 핑거, egf, 및 크링글 1 및 크링글 2 도메인이 결실되고 EGF 4,5,6 도메인에 의해 교체된 구조물들은 카제인 오버레이 방법에 의해 비교적 더 약한 가수분해 대역을 보였고, 또한 일반적으로는 플라스미노겐 및 색원성 기질을 사용하는 정량적인 미세적정 플레이트-기재 분석에 의해 비교적 감소된 플라스미노겐 활성화제 활성을 나타내었다. 더욱이, 상기 내부적으로 결실된 구조물 중 용해성 피브린의 존재 하에서 나타난 활성의 자극 정도는 EGF의 융합물이 말단에 있는 tPA/tPA 돌연변이체에 비해 훨씬 더 낮았다. 상기 tPA 돌연변이체(아스파라진으로 교환된 쓰레오닌 115 번째 아미노산(T 115 N), 글루타민으로 교환된 아스파라진 129 번째 아미노산(N 129 Q), 및 tPA의 KHRR 암호화 영역, 즉 잔기 308 내지 311이 돌연변이의 4중-알라닌 신장부에 의해 교체된 것(KHRR(308 - 311 → AAAA; 상기 실시예 참조))을 함유한다)의 경우에, 상기 플라스미노겐 활성화제 활성은 "기본" 활성뿐만 아니라 용해성 피브린 존재 하에서의 이의 자극 모두에 관하여 천연과 같다. 동시에, 상기 구조물은 트롬빈 억제 및 단백질 C 활성화의 잘 정의된 분석("실시예에 사용된 방법"을 참조하시오)을 사용하여 최고의 트롬빈 억제 성질을 나타내었다. 대조적으로, 응고 시간 분석에 의해 검사된 바와 같은 트롬빈 억제(이때 천연 tPA의 존재 또는 부재 하에서 높은 마이크로 몰 농도까지의 피브린 망 형성은 완충제 대조군에 비해 본질적으로 변경되지 않았다), 상기 "4중-ala" 돌연변이체를 포함한 상이한 정제된 키메릭 구조물의 나노몰 농도의 첨가, 또는 EGF 4,5,6을 내부적으로 상이한 장소에 또는 tPA 중의 단부에 통합한 경우, 용량-의존적인 방식으로 현저하게 증가된 응고 시간을 제공하였다. 상기 관찰된 응고의 증가는 어느 한 단부에 융합된 EGF 도메인에 비해 N_EGF_tPA_EGF 구조물에서 보다 현저하였다. 이러한 유형의 효과는 트롬빈 매개된 단백질 C 활성화 분석에서 또한 관찰되었으며, 상기 분석에서 N_EGF_tPA_EG에 의해 생성된 단백질 C의 양은 일반적으로 tPA 융합 구조물 및 내부적으로 융합된 EGF-tPA 구조물을 함유하는 단일 EGF 4,5,6 도메인보다 2 내지 4 배 더 높았다. 상기 EGF-tPA 융합물의 EGF 부분에서 메티오닌 치환된 내산화성 형태들을 이들의 트롬빈 매개된 단백질 C 활성화 능력에 대해 비교한 경우의 또 다른 세트의 결과에서, 메티오닌이 발린으로 일정하게 교체된 내산화성 형태들은 15 내지 20% 더 높은 단백질 C 활성화를 나타내었다.
유사한 방식으로 스트필로키나제 및 EGF 융합 구조물을 제조하고 피키아 파스토리스 뿐만 아니라 Bl21 DE3 세포에서 발현시켰다. 피키아 파스토리스에서의 스트렙토키나제 발현 및 이의 26 번째 아미노산의 글리코실화가 문헌에 보고되었으며, 이때 상기 글리코실화는 상기 플라스미노겐 활성화 작용을 방해하는 것처럼 보이지만, 배양물을 튜니카마이신 함유 배지의 존재하에서 증식시키는 경우, 천연 세균 정제된 SAK와 같은 동일한 플라스미노겐 활성화 프로파일이 획득된다. 이러한 사실을 고려하면서, 동일한 유전자 블록들을 세균 및 피키아 발현 모두에 대해 제조하고 설계하였다. N-말단 및 C-말단 단부에서 SAK-EGF 융합물에 대한 SAK 및 EGF 융합 유전자 블록을 사용하여, 초기 발현을 에스케리키아 콜라이 BL 21 DE 세포에서 수행하였으며 이때 상기 폴리펩타이드 합성을 1 mM 농도의 IPTG에 의해 유도하였다("실시예에 사용된 방법"을 참조하시오). 최종적으로, EGF_SAK 및 SAK_EGF를 봉입체의 형태로 수득하였으며, 이때 이들 폴리펩타이드의 리폴딩 조건을 산화 및 환원된 글루타치온의 상이한 비뿐만 아니라 다른 용해 조건들로 최적화하였으며("실시예에 사용된 방법"을 참조하시오); 나란히, 상기 두 구조물을 모두 튜니카마이신의 존재 하에서 피키아 파스토리스에서 발현시켰다. 최종적으로, 상기 두 방법 모두를 통해 수득된 융합 폴리펩타이드를 정제하고 이에 대해 플라스미노겐 활성화, 트롬빈 억제 및 단백질 C 활성화 분석을 수행하였다. 한편으로 피키아-유도된 플라스미노겐 활성화, 및 다른 한편으로 에스케리키아 콜라이 IB로부터 수득된 리폴딩된 융합 구조물은 본질적으로 동일하였지만, 트롬빈 억제 및 단백질 C 활성화의 경우에, 상기 피키아 유도된 EGF_SAK 및 SAK_EGF 폴리펩타이드는 상기 에스케리키아 콜라이 유도된 단백질에 비해 단지 약 2 배 더 활성이었다. 근원적인 이유, 즉 특히 리폴딩 중 산화 조건의 존재 하에서 EGF의 메티오닌 산화를 정량적인 아미노산 분석에 의해 확인하였다. 상기 산화 및 활성 감소 문제는 상기에 선행 실시예에 개시된 바와 같이, 상기 하이브리드의 EGF 부분에서 위치 선택적인 돌연변이에 의해 메티오닌 대신에 발린을 놓음으로써 해결되었다.
본 발명의 이점
본 발명은 당해 분야에 사용된 항-트롬빈 혈전용해제보다 이점을 갖는다. 과거에, 조직 플라스미노겐 활성화제의 크링글, 아르기닌(R), 글리신(G) 및 아스파트산(D)을 함유하는 펩타이드 서열, 및 히루딘의 항-트롬빈 부분이 스트필로키나제의 C-말단에서 도입된 항-트롬빈 혈전용해제를 제조하고자 시도하였으나, 상기 형태의 스타필로키나제가 "RGD 펩타이드"에 의한 혈소판 억제, tPA 유도된 크링글에 의한 증가된 피브린 친화성, 및 초기 단계에 일시적으로 형성된 트롬빈의 억제를 통해 항-트롬빈 성질을 부여하는 트롬빈 불활성화 히루딘 부분을 도울 것이라는 전제가 있었다(문헌[Szemraj, Walkowiak et al. 2005]). 또한 재조합 지방단백질 회합된 응고 억제제(LACI)를 통해 혈전용해 후 재-폐쇄 문제와 대항하여 조직 인자 및 인자 VII의 억제를 수행하기 위한 노력이 수행되었다(문헌[Haskel, Torr et al. 1991]). 이는 조직 인자와 불활성 복합체를 제조하는 것을 돕지만, 일시적이며 덩어리-결합된 트롬빈을 방해할 수는 없다.
그러나, 본 발명에서, 두 종류(초기 단계의 일시적인 트롬빈뿐만 아니라 응고촉진제 발생된 단백질 C 경로) 모두의 플라스미노겐 활성화뿐만 아니라 트롬빈 억제 성질을 함유하는 전략적으로 설계된 신세대 혈전용해제가 설계되고 확인되었다.
심근 경색/순환 질병에 대해 현재 이용 가능한 약물 치료는 헤파린, 히루딘 및 다른 트롬빈 억제제의 동시 투여를 필요로 하지만, 입수 가능하고/시판되는 억제제는 일시적으로 생성된 트롬빈을 표적화하며, 트롬빈의 피드백 생성은 억제하지 못한다.
현재 이용 가능한 약물 치료와 대조적으로, 우리는 상기 트롬빈 억제 작용들을 모두 수행하고 동시에 이들의 플라스미노겐 활성화 성질 특이성과 별개로, 피브린 증대(tPA의 경우에서와 같이)와 같은 이들의 원래 성질뿐만 아니라 추가적인 성질들(예를 들어 플라스민- 및 트롬빈 의존성 활성화 중 어느 것도 "모" 분자 중에 존재하지 않는 경우)을 훼손하지 않으면서 덩어리 용해 중에 불필요한 부작용들을 방지하는데 일조하는 새로운 부류의 개선된 혈전용해제를 전략적으로 설계하였다. 원래 분자(스트렙토키나제의 경우와 같이) 중에 비-특이적인 플라스미노겐 활성화가 존재하는 경우에 우리는 상기 항트롬빈 성질들과 별개로 덩어리 특이성을 나타내는 하이브리드 구조물을 설계하였다.
본 발명에서, 우리는 피브린 용해 및 항-트롬빈 능력을 모두 함유하는 스트렙토키나제, 스타필로키나제 및 조직 플라스미노겐 활성화제와 같은 혈전용해제의 비-천연 키메릭 버전을 개시하였다. 제 2- 및 제 3-세대 가공된 것들을 포함하여, 상기 구조물들의 이미 공지된 "모" 분자는 덩어리를 용해할 수 있지만, 재-혈전증에 주된 원인이 되는 트롬빈의 활성을 억제할 수는 없다. 본 발명의 구조물은 상기 피브린 덩어리를 용해할 뿐만 아니라 트롬빈을 직접 억제하고 또한 트롬빈이 고유 트롬보모듈린-촉매화된 응고억제 경로를 통해 평형을 이동시키는 경우 단백질 C를 활성화한다.
본 발명에 따라, 하나의 실시태양에서, EGF 4,5,6 도메인을 적합한 링커의 배치 후에 또는 천연 도메인-간 링커 대신에 상기 스트렙토키나제 분자 내의 상이한 도메인 연접부에 도입시켰다. 이어서 상이한 활성 구조물을 플라스미노겐 활성화 프로파일뿐만 아니라 트롬빈 억제 성질을 근거로 선택하였다. 유사하게, EGF 도메인과 다양한 조합/동기로 융합된 SK의 다양한 돌연변이 단백질들을 생성시키고, 발현시켰으며, 이어서 목적하는 성질을 갖는 작용적으로 생존하는 키메라를 선택해내는 간단한 분석 시스템을 사용하여 선별하였다.
EGF 4,5,6이 N-말단 단부에 융합될 때 스트렙토키나제(가장 큰 혈전용해 능력을 갖는 약물 분자)에서 관찰된 흥미롭고 유용한 현상은 상기 키메릭 구조물이 지연된 플라스미노겐 활성화 동역학을 나타내고 상기 지연된 활성화는 소량의 플라스민이 상기 반응 혼합물 중에 존재하는 경우 현저하게 감소한다는 것이었다. 이들 키메릭 구조물이 플라스민-의존성 활성화를 나타낸다는 유리한 관찰(변형되지 않은 천연 스트렙토키나제에 의한 플라스미노겐의 "자발적인" 자이모겐 활성화와 상반되게)은 또한 상기 생성되는 분자를, 상기 덩어리가 처음에는 불활성 상태로 순환할 것이나(대개는 혈중에 유리 플라스민이 존재하지 않기 때문에, 항-플라스민 세르핀에 의해 급속하게 불활성화되므로), 덩어리-결합된 플라스민과 만나게 되면 이의 플라스민 의존성 작용 기전으로 인해 활성화될 것이라는 점에서 덩어리 특이성으로 만든다. 이는 SK의 출혈 위험을 크게 최소화할 것이며 상기 EGF 도메인의 작용성 융합에 의해 부여된 것 이외에, 광범위하게 사용되는 약물에 대해 추가적인 이점을 부여할 것이다.
본 발명에 따른 다른 흥미로운 구조물을 한편으로 스트렙토키나제의 알파(α) 및 베타(β) 도메인, 및 다른 한편으로 베타(β) 및 감마(γ) 도메인의 도메인-간 연접부에서 EGF 4,5,6 도메인들의 융합에 의해 수득하였다. 이들 구조물들 중에서 우리는 오직 EGF를 상기 알파와 베타 도메인 사이에 융합시켰을 때만 플라스미노겐 활성화뿐만 아니라 항-트롬빈 활성을 발견하였다. 흥미롭게도, EGF 도메인을 상기 베타와 감마 도메인 사이에 도입시킨 융합 구조물은 어떠한 플라스민 활성도 보이지 못했다. 이러한 결과는 주어진 도메인 융합 설계가 실험에 의해 실제로 시험되지 않는 한 "모" 성질들을 공존할 수 있게 할 것인지의 여부를 선험적으로 예견할 수 없음을 암시한다.
상기 N-말단 EGF-SK 융합 구조물, 및 EGF 도메인과 절두된 SK(잔기 5 내지 383) 구조물과의 N-말단 융합에서 관찰된 이점은, 트롬빈 불활성화와 별개로 이들의 명백한 플라스민 의존성 활성화 성질이었으며, 이러한 성질은 덩어리 특이적인 혈전용해 및 트롬빈 불활성화에 대해 잠재적으로 큰 이점을 갖는다.
EGF 4,5,6 도메인을 스타필로키나제의 N-말단 및 C-말단 영역들과 융합시킨 경우, 상기 N-말단 부분이 1:1 플라스민 복합체 형성 중에 제거되는 것으로 관찰되었으며, 이는 또한 높은 수준의 덩어리 특이성 생성에서와 같이 상기 용해 중 EGF 도메인의 독립적인 작용에 도움이 되는 듯하다. C-말단 EGF 융합의 경우에, 상기 융합은 SAK에 부착된 채로 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서 상기 두 경우 모두에서, 플라스미노겐 활성화 및 혈전억제 성질이 상기 키메릭 폴리펩타이드에 성공적으로 통합되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 전구약물 형태를 가질 수 있다. 본 발명 화합물의 전구약물은 본 발명의 방법에 유용하다. 생체 내에서 전환되어 생물학적으로, 약학적으로 또는 치료학적으로 활성인 형태의 본 발명의 화합물을 제공하는 임의의 화합물이 전구 약물이다. 전구약물의 다양한 예 및 형태들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 단백질 전구체 또는 핵산 전구체와 같은 생물분자가 전구약물일 수 있다. 전구약물의 예들이 특히 문헌[Design of Prodrugs, edited by H. Bundgaard, (Elsevier, 1985), Methods in Enzymology, Vol. 42, at pp. 309-396, edited by K. Widder, et. al. (Academic Press, 1985)]; [A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krosgaard-Larsen and H. Bundgaard, Chapter 5, "Design and Application of Prodrugs," by H. Bundgaard, at pp. 113-191, 1991]; [H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 8, p. 1-38 (1992)]; [H. Bundgaard, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 77, p. 285 (1988)]; 및 [Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392]에서 발견된다.
본 발명을 다양한 구체적이고 바람직한 실시태양 및 기법들을 참고로 개시하였다. 그러나, 다수의 변화 및 변경들을 본 발명의 진의 및 범위 내에 있으면서 수행할 수 있음은 물론이다. 본 발명에 구체적으로 개시된 것들 이외의 조성물, 방법, 장치, 장치 요소, 물질, 과정 및 기법들을 과도한 실험에 의지하지 않고 본 발명에 광범위하게 개시된 바와 같은 본 발명의 실시에 적용할 수 있음은 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 자명할 것이다. 본 발명에 개시된 조성물, 방법, 장치, 장치 요소, 물질, 과정 및 기법의 모든 당해 분야 공지된 등가물들을 본 발명에 포함하고자 한다. 범위를 개시할 때마다, 모든 하위 범위 및 개별적인 값들을 포함하고자 한다. 본 발명은, 예로서 또는 예시로서 제공되고 제한이 아닌, 도면에 나타내거나 명세서에 예시된 임의의 것들을 포함하여, 개시된 실시태양들에 의해 제한되지 않는다. 본 발명의 범위는 단지 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이다.
참고문헌
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<212> DNA
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<223> Streptococcus equisimilis
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<400> 8
gttgaccctt gctttagagc caactgtgaa taccaatgcc agcctttgaa ccagacctca 60
tacttgtgtg tttgtgccga gggttttgca ccaattcctc atgaaccaca cagatgtcaa 120
atgttctgca accagactgc ctgtccagca gactgcgatc ctaatacaca agcttcttgt 180
gagtgccctg aaggatacat cttggatgac ggttttattt gtactgacat cgatgagtgc 240
gaaaacggtg gattttgtag tggtgtttgc cataatcttc caggaacctt cgaatgtatt 300
tgcggtcctg actctgcctt ggcaagacac atcggaactg actgtgattc cgga 354
<210> 9
<211> 1617
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARTIFICIALLY SYNTHESIZED TPA
<400> 9
caagagattc atgctagatt cagaagaggt gctagatcct accaggtcat ttgtagagat 60
gaaaagacac aaatgatcta tcaacagcac cagtcatggc ttagacctgt tttgagaagt 120
aacagagtcg agtactgttg gtgcaattct ggtagagccc aatgtcatag tgttccagtc 180
aaatcatgta gtgaacctag atgctttaac ggtggaactt gtcaacaggc tttgtacttc 240
tctgatttcg tttgtcaatg cccagaggga ttcgctggta aatgttgcga aattgacacc 300
agagctactt gttacgaaga tcagggaatc tcatatagag gtacatggtc taccgctgag 360
tccggagccg aatgtactaa ctggaattct tccgctttgg cccaaaaacc atactctggt 420
agaagacctg atgctattag acttggtttg ggaaaccaca attattgcag aaatccagac 480
agagattcta agccttggtg ttacgttttt aaggccggaa aatattcaag tgaattctgt 540
tccacccctg catgctcaga gggtaacagt gattgttact ttggtaatgg atctgcttat 600
agaggaaccc attccttgac tgagtcaggt gccagttgtc ttccatggaa ctcaatgatt 660
ttgatcggaa aagtttacac tgcacaaaat cctagtgcac aggctcttgg tttgggaaag 720
cataactact gtagaaatcc agacggagat gccaaacctt ggtgtcacgt tcttaagaac 780
agaagattga catgggaata ctgtgacgtc ccatcttgtt ccacctgcgg tttgagacaa 840
tactcacaac ctcagtttag aattaaaggt ggattgttcg ctgatatcgc ctctcatcca 900
tggcaggctg ccatttttgc taagcacaga agatcccctg gagagagatt cctttgtggt 960
ggaattttga tctcttcctg ctggattttg tccgcagctc actgttttca agaaagattc 1020
ccacctcatc accttacagt tatcttggga agaacctaca gagttgtccc aggtgaagag 1080
gaacagaagt ttgaggttga aaaatacatt gtccataagg agttcgatga cgatacttat 1140
gacaatgata tcgcactttt gcaattgaag tctgattcaa gtagatgtgc tcaggaatct 1200
tccgttgtca gaactgtttg tttgccacct gctgaccttc aattgcctga ttggacagag 1260
tgtgaacttt ctggttacgg aaaacacgaa gccttgtctc cattttattc cgagagactt 1320
aaggaagcac atgttagatt gtatccttca agtagatgta catcccaaca ccttttgaac 1380
agaactgtca cagacaatat gttgtgtgct ggagatacca gatcaggtgg accacaagcc 1440
aacttgcatg acgcatgcca gggagatagt ggtggacctc ttgtttgttt gaatgacggt 1500
agaatgactc ttgtcggaat tatctcttgg ggtttgggat gtggtcaaaa agatgttcca 1560
ggtgtctaca ctaaggttac aaactatttg gactggatca gagataacat gagacca 1617
<210> 10
<211> 2325
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N_EGF_TPA_EGF, Fusion at the N and C terminal of TPA
<400> 10
gtcgatccat gttttagagc taattgcgag tatcaatgcc agcctcttaa ccaaacttct 60
tatttgtgtg tttgcgcaga gggttttgct cctatcccac acgagcctca tagatgccag 120
atgttttgca accagaccgc atgtccagct gactgcgatc ctaatactca agcttcctgt 180
gagtgccctg aaggttacat tttggacgat ggattcattt gcaccgatat tgacgaatgt 240
gagaacggtg gattttgttc aggagtttgc cacaatttgc caggtacatt cgaatgtatt 300
tgtggacctg atagtgctct tgccagacat attggaacag attgtgactc cggtcaagag 360
attcatgcta gattcagaag aggtgctaga tcctaccagg tcatttgtag agatgaaaag 420
acacaaatga tctatcaaca gcaccagtca tggcttagac ctgttttgag aagtaacaga 480
gtcgagtact gttggtgcaa ttctggtaga gcccaatgtc atagtgttcc agtcaaatca 540
tgtagtgaac ctagatgctt taacggtgga acttgtcaac aggctttgta cttctctgat 600
ttcgtttgtc aatgcccaga gggattcgct ggtaaatgtt gcgaaattga caccagagct 660
acttgttacg aagatcaggg aatctcatat agaggtacat ggtctaccgc tgagtccgga 720
gccgaatgta ctaactggaa ttcttccgct ttggcccaaa aaccatactc tggtagaaga 780
cctgatgcta ttagacttgg tttgggaaac cacaattatt gcagaaatcc agacagagat 840
tctaagcctt ggtgttacgt ttttaaggcc ggaaaatatt caagtgaatt ctgttccacc 900
cctgcatgct cagagggtaa cagtgattgt tactttggta atggatctgc ttatagagga 960
acccattcct tgactgagtc aggtgccagt tgtcttccat ggaactcaat gattttgatc 1020
ggaaaagttt acactgcaca aaatcctagt gcacaggctc ttggtttggg aaagcataac 1080
tactgtagaa atccagacgg agatgccaaa ccttggtgtc acgttcttaa gaacagaaga 1140
ttgacatggg aatactgtga cgtcccatct tgttccacct gcggtttgag acaatactca 1200
caacctcagt ttagaattaa aggtggattg ttcgctgata tcgcctctca tccatggcag 1260
gctgccattt ttgctaagca cagaagatcc cctggagaga gattcctttg tggtggaatt 1320
ttgatctctt cctgctggat tttgtccgca gctcactgtt ttcaagaaag attcccacct 1380
catcacctta cagttatctt gggaagaacc tacagagttg tcccaggtga agaggaacag 1440
aagtttgagg ttgaaaaata cattgtccat aaggagttcg atgacgatac ttatgacaat 1500
gatatcgcac ttttgcaatt gaagtctgat tcaagtagat gtgctcagga atcttccgtt 1560
gtcagaactg tttgtttgcc acctgctgac cttcaattgc ctgattggac agagtgtgaa 1620
ctttctggtt acggaaaaca cgaagccttg tctccatttt attccgagag acttaaggaa 1680
gcacatgtta gattgtatcc ttcaagtaga tgtacatccc aacacctttt gaacagaact 1740
gtcacagaca atatgttgtg tgctggagat accagatcag gtggaccaca agccaacttg 1800
catgacgcat gccagggaga tagtggtgga cctcttgttt gtttgaatga cggtagaatg 1860
actcttgtcg gaattatctc ttggggtttg ggatgtggtc aaaaagatgt tccaggtgtc 1920
tacactaagg ttacaaacta tttggactgg atcagagata acatgagacc agtcgatcca 1980
tgttttagag ctaattgcga gtatcaatgc cagcctctta accaaacttc ttatttgtgt 2040
gtttgcgcag agggttttgc tcctatccca cacgagcctc atagatgcca gatgttttgc 2100
aaccagaccg catgtccagc tgactgcgat cctaatactc aagcttcctg tgagtgccct 2160
gaaggttaca ttttggacga tggattcatt tgcaccgata ttgacgaatg tgagaacggt 2220
ggattttgtt caggagtttg ccacaatttg ccaggtacat tcgaatgtat ttgtggacct 2280
gatagtgctc ttgccagaca tattggaaca gattgtgact ccggt 2325
<210> 11
<211> 1971
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N_EGF_TPA, fusion at the N-teminal of TPA
<400> 11
gtcgatccat gttttagagc taattgcgag tatcaatgcc agcctcttaa ccaaacttct 60
tatttgtgtg tttgcgcaga gggttttgct cctatcccac acgagcctca tagatgccag 120
atgttttgca accagaccgc atgtccagct gactgcgatc ctaatactca agcttcctgt 180
gagtgccctg aaggttacat tttggacgat ggattcattt gcaccgatat tgacgaatgt 240
gagaacggtg gattttgttc aggagtttgc cacaatttgc caggtacatt cgaatgtatt 300
tgtggacctg atagtgctct tgccagacat attggaacag attgtgactc cggtcaagag 360
attcatgcta gattcagaag aggtgctaga tcctaccagg tcatttgtag agatgaaaag 420
acacaaatga tctatcaaca gcaccagtca tggcttagac ctgttttgag aagtaacaga 480
gtcgagtact gttggtgcaa ttctggtaga gcccaatgtc atagtgttcc agtcaaatca 540
tgtagtgaac ctagatgctt taacggtgga acttgtcaac aggctttgta cttctctgat 600
ttcgtttgtc aatgcccaga gggattcgct ggtaaatgtt gcgaaattga caccagagct 660
acttgttacg aagatcaggg aatctcatat agaggtacat ggtctaccgc tgagtccgga 720
gccgaatgta ctaactggaa ttcttccgct ttggcccaaa aaccatactc tggtagaaga 780
cctgatgcta ttagacttgg tttgggaaac cacaattatt gcagaaatcc agacagagat 840
tctaagcctt ggtgttacgt ttttaaggcc ggaaaatatt caagtgaatt ctgttccacc 900
cctgcatgct cagagggtaa cagtgattgt tactttggta atggatctgc ttatagagga 960
acccattcct tgactgagtc aggtgccagt tgtcttccat ggaactcaat gattttgatc 1020
ggaaaagttt acactgcaca aaatcctagt gcacaggctc ttggtttggg aaagcataac 1080
tactgtagaa atccagacgg agatgccaaa ccttggtgtc acgttcttaa gaacagaaga 1140
ttgacatggg aatactgtga cgtcccatct tgttccacct gcggtttgag acaatactca 1200
caacctcagt ttagaattaa aggtggattg ttcgctgata tcgcctctca tccatggcag 1260
gctgccattt ttgctaagca cagaagatcc cctggagaga gattcctttg tggtggaatt 1320
ttgatctctt cctgctggat tttgtccgca gctcactgtt ttcaagaaag attcccacct 1380
catcacctta cagttatctt gggaagaacc tacagagttg tcccaggtga agaggaacag 1440
aagtttgagg ttgaaaaata cattgtccat aaggagttcg atgacgatac ttatgacaat 1500
gatatcgcac ttttgcaatt gaagtctgat tcaagtagat gtgctcagga atcttccgtt 1560
gtcagaactg tttgtttgcc acctgctgac cttcaattgc ctgattggac agagtgtgaa 1620
ctttctggtt acggaaaaca cgaagccttg tctccatttt attccgagag acttaaggaa 1680
gcacatgtta gattgtatcc ttcaagtaga tgtacatccc aacacctttt gaacagaact 1740
gtcacagaca atatgttgtg tgctggagat accagatcag gtggaccaca agccaacttg 1800
catgacgcat gccagggaga tagtggtgga cctcttgttt gtttgaatga cggtagaatg 1860
actcttgtcg gaattatctc ttggggtttg ggatgtggtc aaaaagatgt tccaggtgtc 1920
tacactaagg ttacaaacta tttggactgg atcagagata acatgagacc a 1971
<210> 12
<211> 1971
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TPA_EGF, fusion at the C-terminal of TPA
<400> 12
caagagattc atgctagatt cagaagaggt gctagatcct accaggtcat ttgtagagat 60
gaaaagacac aaatgatcta tcaacagcac cagtcatggc ttagacctgt tttgagaagt 120
aacagagtcg agtactgttg gtgcaattct ggtagagccc aatgtcatag tgttccagtc 180
aaatcatgta gtgaacctag atgctttaac ggtggaactt gtcaacaggc tttgtacttc 240
tctgatttcg tttgtcaatg cccagaggga ttcgctggta aatgttgcga aattgacacc 300
agagctactt gttacgaaga tcagggaatc tcatatagag gtacatggtc taccgctgag 360
tccggagccg aatgtactaa ctggaattct tccgctttgg cccaaaaacc atactctggt 420
agaagacctg atgctattag acttggtttg ggaaaccaca attattgcag aaatccagac 480
agagattcta agccttggtg ttacgttttt aaggccggaa aatattcaag tgaattctgt 540
tccacccctg catgctcaga gggtaacagt gattgttact ttggtaatgg atctgcttat 600
agaggaaccc attccttgac tgagtcaggt gccagttgtc ttccatggaa ctcaatgatt 660
ttgatcggaa aagtttacac tgcacaaaat cctagtgcac aggctcttgg tttgggaaag 720
cataactact gtagaaatcc agacggagat gccaaacctt ggtgtcacgt tcttaagaac 780
agaagattga catgggaata ctgtgacgtc ccatcttgtt ccacctgcgg tttgagacaa 840
tactcacaac ctcagtttag aattaaaggt ggattgttcg ctgatatcgc ctctcatcca 900
tggcaggctg ccatttttgc taagcacaga agatcccctg gagagagatt cctttgtggt 960
ggaattttga tctcttcctg ctggattttg tccgcagctc actgttttca agaaagattc 1020
ccacctcatc accttacagt tatcttggga agaacctaca gagttgtccc aggtgaagag 1080
gaacagaagt ttgaggttga aaaatacatt gtccataagg agttcgatga cgatacttat 1140
gacaatgata tcgcactttt gcaattgaag tctgattcaa gtagatgtgc tcaggaatct 1200
tccgttgtca gaactgtttg tttgccacct gctgaccttc aattgcctga ttggacagag 1260
tgtgaacttt ctggttacgg aaaacacgaa gccttgtctc cattttattc cgagagactt 1320
aaggaagcac atgttagatt gtatccttca agtagatgta catcccaaca ccttttgaac 1380
agaactgtca cagacaatat gttgtgtgct ggagatacca gatcaggtgg accacaagcc 1440
aacttgcatg acgcatgcca gggagatagt ggtggacctc ttgtttgttt gaatgacggt 1500
agaatgactc ttgtcggaat tatctcttgg ggtttgggat gtggtcaaaa agatgttcca 1560
ggtgtctaca ctaaggttac aaactatttg gactggatca gagataacat gagaccagtc 1620
gatccatgtt ttagagctaa ttgcgagtat caatgccagc ctcttaacca aacttcttat 1680
ttgtgtgttt gcgcagaggg ttttgctcct atcccacacg agcctcatag atgccagatg 1740
ttttgcaacc agaccgcatg tccagctgac tgcgatccta atactcaagc ttcctgtgag 1800
tgccctgaag gttacatttt ggacgatgga ttcatttgca ccgatattga cgaatgtgag 1860
aacggtggat tttgttcagg agtttgccac aatttgccag gtacattcga atgtatttgt 1920
ggacctgata gtgctcttgc cagacatatt ggaacagatt gtgactccgg t 1971
<210> 13
<211> 1860
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ID EGF TPA DEL EGF
<400> 13
caagagattc atgctagatt cagaagaggt gctagatcct accaggtcat ttgtagagat 60
gaaaagacac aaatgatcta tcaacagcac cagtcatggc ttagacctgt tttgagaagt 120
aacagagtcg agtactgttg gtgcaattct ggtagagccc aatgtcatag tgttccagtt 180
aaatcagttg acccttgctt tagagccaac tgtgaatacc aatgccagcc tttgaaccag 240
acctcatact tgtgtgtttg tgccgagggt tttgcaccaa ttcctcatga accacacaga 300
tgtcaaatgt tctgcaacca gactgcctgt ccagcagact gcgatcctaa tacacaagct 360
tcttgtgagt gccctgaagg atacatcttg gatgacggtt ttatttgtac tgacatcgat 420
gagtgcgaaa acggtggatt ttgtagtggt gtttgccata atcttccagg aaccttcgaa 480
tgtatttgcg gtcctgactc tgccttggca agacatatag gtactgactg tgattccgga 540
accagagcta cttgttacga agatcaggga atctcatata gaggtacatg gtctaccgct 600
gagtccggag ccgaatgtac taactggaat tcttccgctt tggcccaaaa accatactct 660
ggtagaagac ctgatgctat tagacttggt ttgggaaacc acaattattg cagaaatcca 720
gacagagatt ctaagccttg gtgttacgtt tttaaggccg gaaaatattc aagtgaattc 780
tgttccaccc ctgcatgctc agagggtaac agtgattgtt actttggtaa tggatctgct 840
tatagaggaa cccattcctt gactgagtca ggtgccagtt gtcttccatg gaactcaatg 900
attttgatcg gaaaagttta cactgcacaa aatcctagtg cacaggctct tggtttggga 960
aagcataact actgtagaaa tccagacgga gatgccaaac cttggtgtca cgttcttaag 1020
aacagaagat tgacatggga atactgtgac gtcccatctt gttccacctg cggtttgaga 1080
caatactcac aacctcagtt tagaattaaa ggtggattgt tcgctgatat cgcctctcat 1140
ccatggcagg ctgccatttt tgctaagcac agaagatccc ctggagagag attcctttgt 1200
ggtggaattt tgatctcttc ctgctggatt ttgtccgcag ctcactgttt tcaagaaaga 1260
ttcccacctc atcaccttac agttatcttg ggaagaacct acagagttgt cccaggtgaa 1320
gaggaacaga agtttgaggt tgaaaaatac attgtccata aggagttcga tgacgatact 1380
tatgacaatg atatcgcact tttgcaattg aagtctgatt caagtagatg tgctcaggaa 1440
tcttccgttg tcagaactgt ttgtttgcca cctgctgacc ttcaattgcc tgattggaca 1500
gagtgtgaac tttctggtta cggaaaacac gaagccttgt ctccatttta ttccgagaga 1560
cttaaggaag cacatgttag attgtatcct tcaagtagat gtacatccca acaccttttg 1620
aacagaactg tcacagacaa tatgttgtgt gctggagata ccagatcagg tggaccacaa 1680
gccaacttgc atgacgcatg ccagggagat agtggtggac ctcttgtttg tttgaatgac 1740
ggtagaatga ctcttgtcgg aattatctct tggggtttgg gatgtggtca aaaagatgtt 1800
ccaggtgtct acactaaggt tacaaactat ttggactgga tcagagataa catgagacca 1860
<210> 14
<211> 1593
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ID EGF TPA DEL EGF K1
<400> 14
caagagattc atgctagatt cagaagaggt gctagatcct accaggtcat ttgtagagat 60
gaaaagacac aaatgatcta tcaacagcac cagtcatggc ttagacctgt tttgagaagt 120
aacagagtcg agtactgttg gtgcaattct ggtagagccc aatgtcatag tgttccagtt 180
aaatcagttg acccttgctt tagagccaac tgtgaatacc aatgccagcc tttgaaccag 240
acctcatact tgtgtgtttg tgccgagggt tttgcaccaa ttcctcatga accacacaga 300
tgtcaaatgt tctgcaacca gactgcctgt ccagcagact gcgatcctaa tacacaagct 360
tcttgtgagt gccctgaagg atacatcttg gatgacggtt ttatttgtac tgacatcgat 420
gagtgcgaaa acggtggatt ttgtagtggt gtttgccata atcttccagg aaccttcgaa 480
tgtatttgcg gtcctgactc tgccttggca agacatattg gtactgattg tgattccgga 540
aacagtgatt gttactttgg taatggatct gcttatagag gaacccattc cttgactgag 600
tcaggtgcca gttgtcttcc atggaactca atgattttga tcggaaaagt ttacactgca 660
caaaatccta gtgcacaggc tcttggtttg ggaaagcata actactgtag aaatccagac 720
ggagatgcca aaccttggtg tcacgttctt aagaacagaa gattgacatg ggaatactgt 780
gacgtcccat cttgttccac ctgcggtttg agacaatact cacaacctca gtttagaatt 840
aaaggtggat tgttcgctga tatcgcctct catccatggc aggctgccat ttttgctaag 900
cacagaagat cccctggaga gagattcctt tgtggtggaa ttttgatctc ttcctgctgg 960
attttgtccg cagctcactg ttttcaagaa agattcccac ctcatcacct tacagttatc 1020
ttgggaagaa cctacagagt tgtcccaggt gaagaggaac agaagtttga ggttgaaaaa 1080
tacattgtcc ataaggagtt cgatgacgat acttatgaca atgatatcgc acttttgcaa 1140
ttgaagtctg attcaagtag atgtgctcag gaatcttccg ttgtcagaac tgtttgtttg 1200
ccacctgctg accttcaatt gcctgattgg acagagtgtg aactttctgg ttacggaaaa 1260
cacgaagcct tgtctccatt ttattccgag agacttaagg aagcacatgt tagattgtat 1320
ccttcaagta gatgtacatc ccaacacctt ttgaacagaa ctgtcacaga caatatgttg 1380
tgtgctggag ataccagatc aggtggacca caagccaact tgcatgacgc atgccaggga 1440
gatagtggtg gacctcttgt ttgtttgaat gacggtagaa tgactcttgt cggaattatc 1500
tcttggggtt tgggatgtgg tcaaaaagat gttccaggtg tctacactaa ggttacaaac 1560
tatttggact ggatcagaga taacatgaga cca 1593
<210> 15
<211> 1593
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N_EGF DEL EGF K1
<400> 15
gttgaccctt gcttcagagc caactgtgaa taccaatgcc agcctttgaa ccagacctca 60
tacttgtgtg tttgtgccga gggttttgca ccaattcctc atgaaccaca cagatgtcaa 120
atgttctgca accagactgc ctgtccagca gactgcgatc ctaatacaca agcttcttgt 180
gagtgccctg aaggatacat cttggatgac ggttttattt gtactgacat cgatgagtgc 240
gaaaacggtg gattttgtag tggtgtttgc cataatcttc caggaacctt cgaatgtatt 300
tgcggtcctg actctgcctt ggcaagacac atcggaactg actgtgattc cggacaagag 360
attcatgcta gattcagaag aggtgctaga tcctaccagg tcatttgtag agatgaaaag 420
acacaaatga tctatcaaca gcaccagtca tggcttagac ctgttttgag aagtaacaga 480
gtcgagtact gttggtgcaa ttctggtaga gcccaatgtc atagtgttcc agtcaagtca 540
aatagtgatt gttactttgg taatggatct gcttatagag gaacccattc cttgactgag 600
tcaggtgcca gttgtcttcc atggaactca atgattttga tcggaaaagt ttacactgca 660
caaaatccta gtgcacaggc tcttggtttg ggaaagcata actactgtag aaatccagac 720
ggagatgcca aaccttggtg tcacgttctt aagaacagaa gattgacatg ggaatactgt 780
gacgtcccat cttgttccac ctgcggtttg agacaatact cacaacctca gtttagaatt 840
aaaggtggat tgttcgctga tatcgcctct catccatggc aggctgccat ttttgctaag 900
cacagaagat cccctggaga gagattcctt tgtggtggaa ttttgatctc ttcctgctgg 960
attttgtccg cagctcactg ttttcaagaa agattcccac ctcatcacct tacagttatc 1020
ttgggaagaa cctacagagt tgtcccaggt gaagaggaac agaagtttga ggttgaaaaa 1080
tacattgtcc ataaggagtt cgatgacgat acttatgaca atgatatcgc acttttgcaa 1140
ttgaagtctg attcaagtag atgtgctcag gaatcttccg ttgtcagaac tgtttgtttg 1200
ccacctgctg accttcaatt gcctgattgg acagagtgtg aactttctgg ttacggaaaa 1260
cacgaagcct tgtctccatt ttattccgag agacttaagg aagcacatgt tagattgtat 1320
ccttcaagta gatgtacatc ccaacacctt ttgaacagaa ctgtcacaga caatatgttg 1380
tgtgctggag ataccagatc aggtggacca caagccaact tgcatgacgc atgccaggga 1440
gatagtggtg gacctcttgt ttgtttgaat gacggtagaa tgactcttgt cggaattatc 1500
tcttggggtt tgggatgtgg tcaaaaagat gttccaggtg tctacactaa ggttacaaac 1560
tatttggact ggatcagaga taacatgaga cca 1593
<210> 16
<211> 1593
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TPA _EGF DEL EGF AND K1
<400> 16
caagagattc atgctagatt cagaagaggt gctagatcct accaggtcat ttgtagagat 60
gaaaagacac aaatgatcta tcaacagcac cagtcatggc ttagacctgt tttgagaagt 120
aacagagtcg agtactgttg gtgcaattct ggtagagccc aatgtcatag tgttccagtc 180
aagtcaaata gtgattgtta ctttggtaat ggatctgctt atagaggaac ccattccttg 240
actgagtcag gtgccagttg tcttccatgg aactcaatga ttttgatcgg aaaagtttac 300
actgcacaaa atcctagtgc acaggctctt ggtttgggaa agcataacta ctgtagaaat 360
ccagacggag atgccaaacc ttggtgtcac gttcttaaga acagaagatt gacatgggaa 420
tactgtgacg tcccatcttg ttccacctgc ggtttgagac aatactcaca acctcagttt 480
agaattaaag gtggattgtt cgctgatatc gcctctcatc catggcaggc tgccattttt 540
gctaagcaca gaagatcccc tggagagaga ttcctttgtg gtggaatttt gatctcttcc 600
tgctggattt tgtccgcagc tcactgtttt caagaaagat tcccacctca tcaccttaca 660
gttatcttgg gaagaaccta cagagttgtc ccaggtgaag aggaacagaa gtttgaggtt 720
gaaaaataca ttgtccataa ggagttcgat gacgatactt atgacaatga tatcgcactt 780
ttgcaattga agtctgattc aagtagatgt gctcaggaat cttccgttgt cagaactgtt 840
tgtttgccac ctgctgacct tcaattgcct gattggacag agtgtgaact ttctggttac 900
ggaaaacacg aagccttgtc tccattttat tccgagagac ttaaggaagc acatgttaga 960
ttgtatcctt caagtagatg tacatcccaa caccttttga acagaactgt cacagacaat 1020
atgttgtgtg ctggagatac cagatcaggt ggaccacaag ccaacttgca tgacgcatgc 1080
cagggagata gtggtggacc tcttgtttgt ttgaatgacg gtagaatgac tcttgtcgga 1140
attatctctt ggggtttggg atgtggtcaa aaagatgttc caggtgtcta cactaaggtt 1200
acaaactatt tggactggat cagagataac atgagaccag tcgatccatg ttttagagct 1260
aattgcgagt atcaatgcca gcctcttaac caaacttctt atttgtgtgt ttgcgcagag 1320
ggttttgctc ctatcccaca cgagcctcat agatgccaga tgttttgcaa ccagaccgca 1380
tgtccagctg actgcgatcc taatactcaa gcttcctgtg agtgccctga aggttacatt 1440
ttggacgatg gattcatttg caccgatatt gacgaatgtg agaacggtgg attttgttca 1500
ggagtttgcc acaatttgcc aggtacattc gaatgtattt gtggacctga tagtgctctt 1560
gccagacata ttggaacaga ttgtgactca ggt 1593
<210> 17
<211> 414
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SAK
<400> 17
atgtcaagtt cattcgacaa aggaaaatat aaaaaaggcg atgacgcgag ttattttgaa 60
ccaacaggcc cgtatttgat ggtaaatgtg actggagttg atagtaaagg aaatgaattg 120
ctatcccctc attatgtcga gtttcctatt aaacctggga ctacacttac aaaagaaaaa 180
attgaatact atgtcgaatg ggcattagat gcgacagcat ataaagagtt tagagtagtt 240
gaattagatc caagcgcaaa gatcgaagtc acttattatg ataagaataa gaaaaaagaa 300
gaaacgaagt ctttccctat aacagaaaaa ggttttgttg tcccagattt atcagagcat 360
attaaaaacc ctggattcaa cttaattaca aaggttgtta tagaaaagaa ataa 414
<210> 18
<211> 762
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N_EGF_SAK, fusion at the N-terminal of SAK
<400> 18
gtggacccgt gcttcagagc caactgcgag taccagtgcc agcccctgaa ccaaactagc 60
tacctctgcg tctgcgccga gggcttcgcg cccattcccc acgagccgca caggtgccag 120
atgttttgca accagactgc ctgtccagcc gactgcgacc ccaacaccca ggctagctgt 180
gagtgccctg aaggctacat cctggacgac ggtttcatct gcacggacat cgacgagtgc 240
gaaaacggcg gcttctgctc cggggtgtgc cacaacctcc ccggtacctt cgagtgcatc 300
tgcgggcccg actcggccct tgcccgccac attggcaccg actgtgactc cggctcaagt 360
tcattcgaca aaggaaaata taaaaaaggc gatgacgcga gttattttga accaacaggc 420
ccgtatttga tggtaaatgt gactggagtt gatagtaaag gaaatgaatt gctatcccct 480
cattatgtcg agtttcctat taaacctggg actacactta caaaagaaaa aattgaatac 540
tatgtcgaat gggcattaga tgcgacagca tataaagagt ttagagtagt tgaattagat 600
ccaagcgcaa agatcgaagt cacttattat gataagaata agaaaaaaga agaaacgaag 660
tctttcccta taacagaaaa aggttttgtt gtcccagatt tatcagagca tattaaaaac 720
cctggattca acttaattac aaaggttgtt atagaaaaga aa 762
<210> 19
<211> 768
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SAK_EGF, fusion at the C-terminal of SAK
<400> 19
tcaagttcat tcgacaaagg aaaatataaa aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca 60
acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact ggagttgata gtaaaggaaa tgaattgcta 120
tcccctcatt atgtcgagtt tcctattaaa cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt 180
gaatactatg tcgaatgggc attagatgcg acagcatata aagagtttag agtagttgaa 240
ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact tattatgata agaataagaa aaaagaagaa 300
acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt 360
aaaaaccctg gattcaactt aattacaaag gttgttatag aaaagaaaga gcccgtggac 420
ccgtgcttca gagccaactg cgagtaccag tgccagcccc tgaaccaaac tagctacctc 480
tgcgtctgcg ccgagggctt cgcgcccatt ccccacgagc cgcacaggtg ccagatgttt 540
tgcaaccaga ctgcctgtcc agccgactgc gaccccaaca cccaggctag ctgtgagtgc 600
cctgaaggct acatcctgga cgacggtttc atctgcacgg acatcgacga gtgcgaaaac 660
ggcggcttct gctccggggt gtgccacaac ctccccggta ccttcgagtg catctgcggg 720
cccgactcgg cccttgcccg ccacattggc accgactgtg actccggc 768
<210> 20
<211> 1617
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant of tPA (tenecteplase)
<400> 20
caagagattc atgctagatt cagaagaggt gctagatcct accaggtcat ttgtagagat 60
gaaaagacac aaatgatcta tcaacagcac cagtcatggc ttagacctgt tttgagaagt 120
aacagagtcg agtactgttg gtgcaattct ggtagagccc aatgtcatag tgttccagtc 180
aaatcatgta gtgaacctag atgctttaac ggtggaactt gtcaacaggc tttgtacttc 240
tctgatttcg tttgtcaatg cccagaggga ttcgctggta aatgttgcga aattgacacc 300
agagctactt gttacgaaga tcagggaatc tcatatagag gtaattggtc tacagctgag 360
tccggagccg aatgtactca atggaattct tccgctttgg cccaaaaacc atactctggt 420
agaagacctg atgctattag acttggtttg ggaaaccaca attattgcag aaatccagac 480
agagattcta agccttggtg ttacgttttt aaggccggaa aatattcaag tgaattctgt 540
tccacccctg catgctcaga gggtaacagt gattgttact ttggtaatgg atctgcttat 600
agaggaaccc attccttgac tgagtcaggt gccagttgtc ttccatggaa ctcaatgatt 660
ttgatcggaa aagtttacac tgcacaaaat cctagtgcac aggctcttgg tttgggaaag 720
cataactact gtagaaatcc agacggagat gccaaacctt ggtgtcacgt tcttaagaac 780
agaagattga catgggaata ctgtgacgtc ccatcttgtt ccacctgcgg tttgagacaa 840
tactcacaac ctcagtttag aattaaaggt ggattgttcg ctgatatcgc ctctcatcca 900
tggcaggctg ccatttttgc tgctgccgct gcttcccctg gagagagatt cctttgtggt 960
ggaattttga tctcttcctg ctggattttg tccgcagctc actgttttca agaaagattc 1020
ccacctcatc accttacagt tatcttggga agaacctaca gagttgtccc aggtgaagag 1080
gaacagaagt ttgaggttga aaaatacatt gtccataagg agttcgatga cgatacttat 1140
gacaatgata tcgcactttt gcaattgaag tctgattcaa gtagatgtgc tcaggaatct 1200
tccgttgtca gaactgtttg tttgccacct gctgaccttc aattgcctga ttggacagag 1260
tgtgaacttt ctggttacgg aaaacacgaa gccttgtctc cattttattc cgagagactt 1320
aaggaagcac atgttagatt gtatccttca agtagatgta catcccaaca ccttttgaac 1380
agaactgtca cagacaatat gttgtgtgct ggagatacca gatcaggtgg accacaagcc 1440
aacttgcatg acgcatgcca gggagatagt ggtggacctc ttgtttgttt gaatgacggt 1500
agaatgactc ttgtcggaat tatctcttgg ggtttgggat gtggtcaaaa agatgttcca 1560
ggtgtctaca ctaaggttac aaactatttg gactggatca gagataacat gagacca 1617
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind N_EGF_SK Fp 1
<400> 21
gaatatctcg agaaaagagt ggacccgtgc ttcagagcca 40
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind N_EGF_SK Rp 2
<400> 22
gtctagcagc cactcaggtc cagcaatgcc ggagtcacag tcggtgcc 48
<210> 23
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind N_EGF_SK Fp3
<400> 23
ggcaccgact gtgactccgg cattgctgga cctgagtggc tgctagac 48
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind N_EGF_SK Rp 4
<400> 24
cctatacgcg gccgcttatt tgtcgttagg gttatcaggt at 42
<210> 25
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind SK_EGF Fp 1
<400> 25
gcatatctcg agaaaagaat tgctggacct gagtggctgc ta 42
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind SK_EGF Rp 2
<400> 26
gaagcacggg tccaccacaa tttgttgagc ttgtccgcca ccggctaaat gatagctagc 60
<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind SK_EGF Fp 3
<400> 27
gctagctatc atttagccgg tggcggacaa gctcaacaaa ttgtggtgga cccgtgcttc 60
<210> 28
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind SK_EGF Rp 4
<400> 28
ccatatcgcg gccgcgccgg agtcacagtc ggtgccaat 39
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind ID a Fp 1
<400> 29
ggatatctcg agaaaagaat tgctggacct gagtggctgc ta 42
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind ID a Rp 2
<400> 30
aagcacgggt ccacgggctc agatttcgct tggttttgta tt 42
<210> 31
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind ID EGF Fp 3
<400> 31
aatacaaaac caagcgaaat ctgagcccgt ggacccgtgc tt 42
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind ID EGF Rp 4
<400> 32
tacagtatat tccacatcaa cgccggagtc acagtcagtg ccaa 44
<210> 33
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind ID ß Fp 5
<400> 33
attggcactg actgtgactc cggcgttgat gtggaatata ctgt 44
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind ID γRp 6
<400> 34
aaatatcgcg gccgctttgt cgttagggtt atcaggtata 40
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind M repV Fp
<400> 35
cacaggtgtc aggtgttttg caatcagact g 31
<210> 36
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind M rep V Rp
<400> 36
cagtctgatt gcaaaacacc tgacacctgt g 31
<210> 37
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind M rep A Fp
<400> 37
ccgcacaggt gccaggcttt ttgcaaccag actgcttgtc ca 42
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind M rep A Rp
<400> 38
tggacaagca gtctggttgc aaaaagcctg gcacctgtgc gg 42
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind M rep Q Fp
<400> 39
cacaggtgtc agcaattttg caaccagaca gcctgt 36
<210> 40
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind M rep Q Rp
<400> 40
acaggctgtc tggttgcaaa attgctgaca cctgtg 36
<210> 41
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind δSK_EGF Fp 1
<400> 41
gcataactcg agaaaagaga ggcttggctg ctagaccgtc ca 42
<210> 42
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind δSK_EGF Rp 2
<400> 42
ccatatcgcg gccgcgccgg agtcacagtc ggtgccaat 39
<210> 43
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind N_EGF_TCS Fp 1
<400> 43
gcctaactcg agaaaagaga gcccgtggac ccgtgcttca ga 42
<210> 44
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind N_EGF_TCS_Rp2
<400> 44
gacaattcta ggtttaatgc cagagtcaca gtcggtgcca at 42
<210> 45
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind TCS_SK Fp 3
<400> 45
ggcattaaac ctagaattgt cggacctgag tggctgctag a 41
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind SK Rp 4
<400> 46
cctatacgcg gccgcttatt tgtcgttagg gttatcaggt at 42
<210> 47
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind ID αß Fp1
<400> 47
ggatatctcg agaaaagaat tgctggacct gagtggctgc ta 42
<210> 48
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind ID αß Rp
<400> 48
ctctgaagca cgggtccacg ggctccaagt gactgcgatc aaa 43
<210> 49
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind IDE4Fp3
<400> 49
tttgatcgca gtcacttgga gcccgtggac ccgtgcttca gag 43
<210> 50
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind IDE6Rp4
<400> 50
aacgtatttg atggtgaaca gtttgccgga gtcacagtcg 40
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind IDγFp5
<400> 51
cgactgtgac tccggcaaac tgttcaccat caaatacgtt 40
<210> 52
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind ID γRp6
<400> 52
aaatatcgcg gccgctttgt cgttagggtt atcaggtata 40
<210> 53
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind TG_ N_EGF_ Fp 1
<400> 53
ggtatcctcg agaaaagagt tcaagcgcaa cagatcgtgg aacccgtgga cccgtgcttc 60
aga 63
<210> 54
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind Afl-II Rp2
<400> 54
ggttttgatt ttggacttaa gccttgctct gtct 34
<210> 55
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind N_EGF_SAK Fp 1
<400> 55
atggatctcg agaaaagagt ggacccgtgc ttcaga 36
<210> 56
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind N_EGF_SAK Rp 2
<400> 56
atattttctt tgtcgaatga acttgacatg ccggagtcac agtc 44
<210> 57
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind N_EGF_SAK Fp3
<400> 57
gactgtgact ccggcatgtc aagttcattc gacaaaggaa aatat 45
<210> 58
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind N_EGF_SAK Rp 4
<400> 58
ttatatcgcg gccgcttatt tcttttctat aacaaccttt 40
<210> 59
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind SAK_EGF Fp 1
<400> 59
atccctctcg agaaaagatc aagttcattc gacaaaggaa 40
<210> 60
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind SAK_EGF Rp 2
<400> 60
agttggctct gaagcacggg tccacgggct ctttcttttc tataacaacc tt 52
<210> 61
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind SAK_EGF Fp 3
<400> 61
aaggttgtta tagaaaagaa agagcccgtg gacccgtgct tcagagccaa ct 52
<210> 62
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind SAK_EGF Rp 4
<400> 62
ttttacgcgg ccgctcctga gtcacagtct gtgccaatgt 40
<210> 63
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind BacFp 1
<400> 63
atataggcca tgggtggacc cgtgcttcag agccaact 38
<210> 64
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind BacRp 2
<400> 64
cctatatctc gagtttcttt tctataacaa ccttt 35
<210> 65
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind SAK_bac Fp1
<400> 65
atggatccat ggtcaagttc attcgacaaa ggaaaatata 40
<210> 66
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind SAK_bac Rp2
<400> 66
tatattctcg agtcctgagt cacagtctgt gccaatgt 38
<210> 67
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind E 4 Fp 1
<400> 67
atggatctcg agaaaagagt ggacccgtgc ttcaga 36
<210> 68
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind E6 Rp 2
<400> 68
ccgacaattc taggtttaat gccggagtca cagtcagtgc caa 43
<210> 69
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind TCS SAK Fp 3
<400> 69
ggcattaaac ctagaattgt cggatcaagt tcattcgata aaggaaaat 49
<210> 70
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind TCS SAK Rp4
<400> 70
ttatatcgcg gccgcttatt tcttttctat aacaaccttt 40
<210> 71
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind tPA_Fp 1
<400> 71
ggataactcg agaaaagaga ggctcaagag attcatgcta gattcaga 48
<210> 72
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind tPA Rp 2
<400> 72
tcatatcgcg gccgctggtc tcatgttatc tctgatccag tcca 44
<210> 73
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind Fin Fp 1
<400> 73
ggataactcg agaaaagaga ggctcaagag attcatgcta gattcaga 48
<210> 74
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind Fin Rp2
<400> 74
ggctctaaag caagggtcaa ctgatttaac tggaacacta tg 42
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tctaaagcaa gggtcaactg atttaactgg aacactatga ca 42
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atcactgttt ccggaatcac aatcagtacc aatatgtctt gccaa 45
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aaagtaacaa tcactatttg acttgactgg aacactatga ca 42
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tgtcatagtg ttccagtcaa gtcaaatagt gattgttact tt 42
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aaagtaacaa tcactatttg acttgactgg aacactatga ca 42
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tgtcatagtg ttccagtcaa gtcaaatagt gattgttact tt 42
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gttgaccctt gctttagagc caactgtgaa taccaatgcc ag 42
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ctggcattgg tattcacagt tggctctaaa gcaagggtca ac 42
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gttgaccctt gctttagagc caactgtgaa taccaatgcc ag 42
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tttatacgcg gccgctggtc tcatgttatc tctgatccag t 41
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cagtctggtt gcagaatact tgacatctat gtggttcatg 40
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<400> 99
catgaaccac atagatgtca agcattctgc aaccagactg 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cagtctggtt gcagaatgct tgacatctat gtggttcatg 40
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<212> DNA
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catgaaccac atagatgtca acaattctgc aaccagactg 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 102
cagtctggtt gcagaattgt tgacatctat gtggttcatg 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 103
cagggaatct catatagagg taattggtct acagctgagt 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 104
actcagctgt agaccaatta cctctatatg agattccctg 40
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 105
aatgtactaa ctggcaatct tccgctttgg c 31
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 106
gccaaagcgg aagattgcca gttagtacat t 31
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<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 107
ggataactcg agaaaagaga ggctcaagag attcatgcta gattcaga 48
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<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 108
agcagcggca gcagcaaaaa tggcagcctg cca 33
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 109
gctgctgccg ctgcttcccc tggagagaga ttccttt 37
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_bind KH Rp4
<400> 110
tcatatcgcg gccgctggtc tcatgttatc tctgatccag tcca 44
<210> 111
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu
1 5 10 15
Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile
20 25 30
Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys
35 40 45
Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu
50 55 60
Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys
65 70 75 80
Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr
85 90 95
Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly
100 105 110
Thr Asp Cys Asp Ser Gly
115
<210> 112
<211> 414
<212> PRT
<213> Streptococcus equisimilis
<400> 112
Ile Ala Gly Pro Glu Trp Leu Leu Asp Arg Pro Ser Val Asn Asn Ser
1 5 10 15
Gln Leu Val Val Ser Val Ala Gly Thr Val Glu Gly Thr Asn Gln Asp
20 25 30
Ile Ser Leu Lys Phe Phe Glu Ile Asp Leu Thr Ser Arg Pro Ala His
35 40 45
Gly Gly Lys Thr Glu Gln Gly Leu Ser Pro Lys Ser Lys Pro Phe Ala
50 55 60
Thr Asp Ser Gly Ala Met Ser His Lys Leu Glu Lys Ala Asp Leu Leu
65 70 75 80
Lys Ala Ile Gln Glu Gln Leu Ile Ala Asn Val His Ser Asn Asp Asp
85 90 95
Tyr Phe Glu Val Ile Asp Phe Ala Ser Asp Ala Thr Ile Thr Asp Arg
100 105 110
Asn Gly Lys Val Tyr Phe Ala Asp Lys Asp Gly Ser Val Thr Leu Pro
115 120 125
Thr Gln Pro Val Gln Glu Phe Leu Leu Ser Gly His Val Arg Val Arg
130 135 140
Pro Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Gln Asn Gln Ala Lys Ser Val Asp Val
145 150 155 160
Glu Tyr Thr Val Gln Phe Thr Pro Leu Asn Pro Asp Asp Asp Phe Arg
165 170 175
Pro Gly Leu Lys Asp Thr Lys Leu Leu Lys Thr Leu Ala Ile Gly Asp
180 185 190
Thr Ile Thr Ser Gln Glu Leu Leu Ala Gln Ala Gln Ser Ile Leu Asn
195 200 205
Lys Asn His Pro Gly Tyr Thr Ile Tyr Glu Arg Asp Ser Ser Ile Val
210 215 220
Thr His Asp Asn Asp Ile Phe Arg Thr Ile Leu Pro Met Asp Gln Glu
225 230 235 240
Phe Thr Tyr Arg Val Lys Asn Arg Glu Gln Ala Tyr Arg Ile Asn Lys
245 250 255
Lys Ser Gly Leu Asn Glu Glu Ile Asn Asn Thr Asp Leu Ile Ser Glu
260 265 270
Lys Tyr Tyr Val Leu Lys Lys Gly Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Phe Asp
275 280 285
Arg Ser His Leu Lys Leu Phe Thr Ile Lys Tyr Val Asp Val Asp Thr
290 295 300
Asn Glu Leu Leu Lys Ser Glu Gln Leu Leu Thr Ala Ser Glu Arg Asn
305 310 315 320
Leu Asp Phe Arg Asp Leu Tyr Asp Pro Arg Asp Lys Ala Lys Leu Leu
325 330 335
Tyr Asn Asn Leu Asp Ala Phe Gly Ile Met Asp Tyr Thr Leu Thr Gly
340 345 350
Lys Val Glu Asp Asn His Asp Asp Thr Asn Arg Ile Ile Thr Val Tyr
355 360 365
Met Gly Lys Arg Pro Glu Gly Glu Asn Ala Ser Tyr His Leu Ala Tyr
370 375 380
Asp Lys Asp Arg Tyr Thr Glu Glu Glu Arg Glu Val Tyr Ser Tyr Leu
385 390 395 400
Arg Tyr Thr Gly Thr Pro Ile Pro Asp Asn Pro Asn Asp Lys
405 410
<210> 113
<211> 532
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTIEN - N_EGF _SK
<400> 113
Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu
1 5 10 15
Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile
20 25 30
Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys
35 40 45
Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu
50 55 60
Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys
65 70 75 80
Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr
85 90 95
Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly
100 105 110
Thr Asp Cys Asp Ser Gly Ile Ala Gly Pro Glu Trp Leu Leu Asp Arg
115 120 125
Pro Ser Val Asn Asn Ser Gln Leu Val Val Ser Val Ala Gly Thr Val
130 135 140
Glu Gly Thr Asn Gln Asp Ile Ser Leu Lys Phe Phe Glu Ile Asp Leu
145 150 155 160
Thr Ser Arg Pro Ala His Gly Gly Lys Thr Glu Gln Gly Leu Ser Pro
165 170 175
Lys Ser Lys Pro Phe Ala Thr Asp Ser Gly Ala Met Ser His Lys Leu
180 185 190
Glu Lys Ala Asp Leu Leu Lys Ala Ile Gln Glu Gln Leu Ile Ala Asn
195 200 205
Val His Ser Asn Asp Asp Tyr Phe Glu Val Ile Asp Phe Ala Ser Asp
210 215 220
Ala Thr Ile Thr Asp Arg Asn Gly Lys Val Tyr Phe Ala Asp Lys Asp
225 230 235 240
Gly Ser Val Thr Leu Pro Thr Gln Pro Val Gln Glu Phe Leu Leu Ser
245 250 255
Gly His Val Arg Val Arg Pro Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Gln Asn Gln
260 265 270
Ala Lys Ser Val Asp Val Glu Tyr Thr Val Gln Phe Thr Pro Leu Asn
275 280 285
Pro Asp Asp Asp Phe Arg Pro Gly Leu Lys Asp Thr Lys Leu Leu Lys
290 295 300
Thr Leu Ala Ile Gly Asp Thr Ile Thr Ser Gln Glu Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Ala Gln Ser Ile Leu Asn Lys Asn His Pro Gly Tyr Thr Ile Tyr Glu
325 330 335
Arg Asp Ser Ser Ile Val Thr His Asp Asn Asp Ile Phe Arg Thr Ile
340 345 350
Leu Pro Met Asp Gln Glu Phe Thr Tyr Arg Val Lys Asn Arg Glu Gln
355 360 365
Ala Tyr Arg Ile Asn Lys Lys Ser Gly Leu Asn Glu Glu Ile Asn Asn
370 375 380
Thr Asp Leu Ile Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Leu Lys Lys Gly Glu Lys
385 390 395 400
Pro Tyr Asp Pro Phe Asp Arg Ser His Leu Lys Leu Phe Thr Ile Lys
405 410 415
Tyr Val Asp Val Asp Thr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Glu Gln Leu Leu
420 425 430
Thr Ala Ser Glu Arg Asn Leu Asp Phe Arg Asp Leu Tyr Asp Pro Arg
435 440 445
Asp Lys Ala Lys Leu Leu Tyr Asn Asn Leu Asp Ala Phe Gly Ile Met
450 455 460
Asp Tyr Thr Leu Thr Gly Lys Val Glu Asp Asn His Asp Asp Thr Asn
465 470 475 480
Arg Ile Ile Thr Val Tyr Met Gly Lys Arg Pro Glu Gly Glu Asn Ala
485 490 495
Ser Tyr His Leu Ala Tyr Asp Lys Asp Arg Tyr Thr Glu Glu Glu Arg
500 505 510
Glu Val Tyr Ser Tyr Leu Arg Tyr Thr Gly Thr Pro Ile Pro Asp Asn
515 520 525
Pro Asn Asp Lys
530
<210> 114
<211> 511
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTEIN - SK_EGF
<400> 114
Ile Ala Gly Pro Glu Trp Leu Leu Asp Arg Pro Ser Val Asn Asn Ser
1 5 10 15
Gln Leu Val Val Ser Val Ala Gly Thr Val Glu Gly Thr Asn Gln Asp
20 25 30
Ile Ser Leu Lys Phe Phe Glu Ile Asp Leu Thr Ser Arg Pro Ala His
35 40 45
Gly Gly Lys Thr Glu Gln Gly Leu Ser Pro Lys Ser Lys Pro Phe Ala
50 55 60
Thr Asp Ser Gly Ala Met Ser His Lys Leu Glu Lys Ala Asp Leu Leu
65 70 75 80
Lys Ala Ile Gln Glu Gln Leu Ile Ala Asn Val His Ser Asn Asp Asp
85 90 95
Tyr Phe Glu Val Ile Asp Phe Ala Ser Asp Ala Thr Ile Thr Asp Arg
100 105 110
Asn Gly Lys Val Tyr Phe Ala Asp Lys Asp Gly Ser Val Thr Leu Pro
115 120 125
Thr Gln Pro Val Gln Glu Phe Leu Leu Ser Gly His Val Arg Val Arg
130 135 140
Pro Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Gln Asn Gln Ala Lys Ser Val Asp Val
145 150 155 160
Glu Tyr Thr Val Gln Phe Thr Pro Leu Asn Pro Asp Asp Asp Phe Arg
165 170 175
Pro Gly Leu Lys Asp Thr Lys Leu Leu Lys Thr Leu Ala Ile Gly Asp
180 185 190
Thr Ile Thr Ser Gln Glu Leu Leu Ala Gln Ala Gln Ser Ile Leu Asn
195 200 205
Lys Asn His Pro Gly Tyr Thr Ile Tyr Glu Arg Asp Ser Ser Ile Val
210 215 220
Thr His Asp Asn Asp Ile Phe Arg Thr Ile Leu Pro Met Asp Gln Glu
225 230 235 240
Phe Thr Tyr Arg Val Lys Asn Arg Glu Gln Ala Tyr Arg Ile Asn Lys
245 250 255
Lys Ser Gly Leu Asn Glu Glu Ile Asn Asn Thr Asp Leu Ile Ser Glu
260 265 270
Lys Tyr Tyr Val Leu Lys Lys Gly Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Phe Asp
275 280 285
Arg Ser His Leu Lys Leu Phe Thr Ile Lys Tyr Val Asp Val Asp Thr
290 295 300
Asn Glu Leu Leu Lys Ser Glu Gln Leu Leu Thr Ala Ser Glu Arg Asn
305 310 315 320
Leu Asp Phe Arg Asp Leu Tyr Asp Pro Arg Asp Lys Ala Lys Leu Leu
325 330 335
Tyr Asn Asn Leu Asp Ala Phe Gly Ile Met Asp Tyr Thr Leu Thr Gly
340 345 350
Lys Val Glu Asp Asn His Asp Asp Thr Asn Arg Ile Ile Thr Val Tyr
355 360 365
Met Gly Lys Arg Pro Glu Gly Glu Asn Ala Ser Tyr His Leu Ala Gly
370 375 380
Gly Gly Val Gln Ala Gln Gln Ile Val Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala
385 390 395 400
Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys
405 410 415
Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys
420 425 430
Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn
435 440 445
Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly
450 455 460
Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser
465 470 475 480
Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro
485 490 495
Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly
500 505 510
<210> 115
<211> 629
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTEIN - N_EGF_SK_EGF
<400> 115
Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu
1 5 10 15
Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile
20 25 30
Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys
35 40 45
Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu
50 55 60
Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys
65 70 75 80
Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr
85 90 95
Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly
100 105 110
Thr Asp Cys Asp Ser Gly Ile Ala Gly Pro Glu Trp Leu Leu Asp Arg
115 120 125
Pro Ser Val Asn Asn Ser Gln Leu Val Val Ser Val Ala Gly Thr Val
130 135 140
Glu Gly Thr Asn Gln Asp Ile Ser Leu Lys Phe Phe Glu Ile Asp Leu
145 150 155 160
Thr Ser Arg Pro Ala His Gly Gly Lys Thr Glu Gln Gly Leu Ser Pro
165 170 175
Lys Ser Lys Pro Phe Ala Thr Asp Ser Gly Ala Met Ser His Lys Leu
180 185 190
Glu Lys Ala Asp Leu Leu Lys Ala Ile Gln Glu Gln Leu Ile Ala Asn
195 200 205
Val His Ser Asn Asp Asp Tyr Phe Glu Val Ile Asp Phe Ala Ser Asp
210 215 220
Ala Thr Ile Thr Asp Arg Asn Gly Lys Val Tyr Phe Ala Asp Lys Asp
225 230 235 240
Gly Ser Val Thr Leu Pro Thr Gln Pro Val Gln Glu Phe Leu Leu Ser
245 250 255
Gly His Val Arg Val Arg Pro Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Gln Asn Gln
260 265 270
Ala Lys Ser Val Asp Val Glu Tyr Thr Val Gln Phe Thr Pro Leu Asn
275 280 285
Pro Asp Asp Asp Phe Arg Pro Gly Leu Lys Asp Thr Lys Leu Leu Lys
290 295 300
Thr Leu Ala Ile Gly Asp Thr Ile Thr Ser Gln Glu Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Ala Gln Ser Ile Leu Asn Lys Asn His Pro Gly Tyr Thr Ile Tyr Glu
325 330 335
Arg Asp Ser Ser Ile Val Thr His Asp Asn Asp Ile Phe Arg Thr Ile
340 345 350
Leu Pro Met Asp Gln Glu Phe Thr Tyr Arg Val Lys Asn Arg Glu Gln
355 360 365
Ala Tyr Arg Ile Asn Lys Lys Ser Gly Leu Asn Glu Glu Ile Asn Asn
370 375 380
Thr Asp Leu Ile Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Leu Lys Lys Gly Glu Lys
385 390 395 400
Pro Tyr Asp Pro Phe Asp Arg Ser His Leu Lys Leu Phe Thr Ile Lys
405 410 415
Tyr Val Asp Val Asp Thr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Glu Gln Leu Leu
420 425 430
Thr Ala Ser Glu Arg Asn Leu Asp Phe Arg Asp Leu Tyr Asp Pro Arg
435 440 445
Asp Lys Ala Lys Leu Leu Tyr Asn Asn Leu Asp Ala Phe Gly Ile Met
450 455 460
Asp Tyr Thr Leu Thr Gly Lys Val Glu Asp Asn His Asp Asp Thr Asn
465 470 475 480
Arg Ile Ile Thr Val Tyr Met Gly Lys Arg Pro Glu Gly Glu Asn Ala
485 490 495
Ser Tyr His Leu Ala Gly Gly Gly Val Gln Ala Gln Gln Ile Val Val
500 505 510
Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn
515 520 525
Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro
530 535 540
His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro
545 550 555 560
Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly
565 570 575
Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu
580 585 590
Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe
595 600 605
Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr
610 615 620
Asp Cys Asp Ser Gly
625
<210> 116
<211> 534
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTEIN - INTERDOMAIN SK_EGF ALPHA AND BETA
<400> 116
Ile Ala Gly Pro Glu Trp Leu Leu Asp Arg Pro Ser Val Asn Asn Ser
1 5 10 15
Gln Leu Val Val Ser Val Ala Gly Thr Val Glu Gly Thr Asn Gln Asp
20 25 30
Ile Ser Leu Lys Phe Phe Glu Ile Asp Leu Thr Ser Arg Pro Ala His
35 40 45
Gly Gly Lys Thr Glu Gln Gly Leu Ser Pro Lys Ser Lys Pro Phe Ala
50 55 60
Thr Asp Ser Gly Ala Met Ser His Lys Leu Glu Lys Ala Asp Leu Leu
65 70 75 80
Lys Ala Ile Gln Glu Gln Leu Ile Ala Asn Val His Ser Asn Asp Asp
85 90 95
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100 105 110
Asn Gly Lys Val Tyr Phe Ala Asp Lys Asp Gly Ser Val Thr Leu Pro
115 120 125
Thr Gln Pro Val Gln Glu Phe Leu Leu Ser Gly His Val Arg Val Arg
130 135 140
Pro Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Gln Asn Gln Ala Lys Ser Glu Pro Val
145 150 155 160
Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn
165 170 175
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Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu
225 230 235 240
Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe
245 250 255
Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr
260 265 270
Asp Cys Asp Ser Gly Val Asp Val Glu Tyr Thr Val Gln Phe Thr Pro
275 280 285
Leu Asn Pro Asp Asp Asp Phe Arg Pro Gly Leu Lys Asp Thr Lys Leu
290 295 300
Leu Lys Thr Leu Ala Ile Gly Asp Thr Ile Thr Ser Gln Glu Leu Leu
305 310 315 320
Ala Gln Ala Gln Ser Ile Leu Asn Lys Asn His Pro Gly Tyr Thr Ile
325 330 335
Tyr Glu Arg Asp Ser Ser Ile Val Thr His Asp Asn Asp Ile Phe Arg
340 345 350
Thr Ile Leu Pro Met Asp Gln Glu Phe Thr Tyr Arg Val Lys Asn Arg
355 360 365
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370 375 380
Asn Asn Thr Asp Leu Ile Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Leu Lys Lys Gly
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Pro Arg Asp Lys Ala Lys Leu Leu Tyr Asn Asn Leu Asp Ala Phe Gly
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Asn Ala Ser Tyr His Leu Ala Tyr Asp Lys Asp Arg Tyr Thr Glu Glu
500 505 510
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515 520 525
Asp Asn Pro Asn Asp Lys
530
<210> 117
<211> 643
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTEIN - TG_N_EGF _TCS_SK_EGF
<400> 117
Val Gln Ala Gln Gln Ile Val Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Thr Asn Gln Asp Ile Ser Leu Lys Phe Phe Glu Ile Asp Leu Thr Ser
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ser Asn Asp Asp Tyr Phe Glu Val Ile Asp Phe Ala Ser Asp Ala Thr
225 230 235 240
Ile Thr Asp Arg Asn Gly Lys Val Tyr Phe Ala Asp Lys Asp Gly Ser
245 250 255
Val Thr Leu Pro Thr Gln Pro Val Gln Glu Phe Leu Leu Ser Gly His
260 265 270
Val Arg Val Arg Pro Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Gln Asn Gln Ala Lys
275 280 285
Ser Val Asp Val Glu Tyr Thr Val Gln Phe Thr Pro Leu Asn Pro Asp
290 295 300
Asp Asp Phe Arg Pro Gly Leu Lys Asp Thr Lys Leu Leu Lys Thr Leu
305 310 315 320
Ala Ile Gly Asp Thr Ile Thr Ser Gln Glu Leu Leu Ala Gln Ala Gln
325 330 335
Ser Ile Leu Asn Lys Asn His Pro Gly Tyr Thr Ile Tyr Glu Arg Asp
340 345 350
Ser Ser Ile Val Thr His Asp Asn Asp Ile Phe Arg Thr Ile Leu Pro
355 360 365
Met Asp Gln Glu Phe Thr Tyr Arg Val Lys Asn Arg Glu Gln Ala Tyr
370 375 380
Arg Ile Asn Lys Lys Ser Gly Leu Asn Glu Glu Ile Asn Asn Thr Asp
385 390 395 400
Leu Ile Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Leu Lys Lys Gly Glu Lys Pro Tyr
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Asp Pro Phe Asp Arg Ser His Leu Lys Leu Phe Thr Ile Lys Tyr Val
420 425 430
Asp Val Asp Thr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Glu Gln Leu Leu Thr Ala
435 440 445
Ser Glu Arg Asn Leu Asp Phe Arg Asp Leu Tyr Asp Pro Arg Asp Lys
450 455 460
Ala Lys Leu Leu Tyr Asn Asn Leu Asp Ala Phe Gly Ile Met Asp Tyr
465 470 475 480
Thr Leu Thr Gly Lys Val Glu Asp Asn His Asp Asp Thr Asn Arg Ile
485 490 495
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Asp Ser Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTEIN - EGF _SAK
<400> 118
Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu
1 5 10 15
Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile
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Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu
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Thr Asp Cys Asp Ser Gly Gly Gly Pro Gln Val Lys
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<210> 119
<211> 256
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTEIN - SAK _EGF
<400> 119
Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser
1 5 10 15
Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val
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Asp Ser Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro
35 40 45
Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys
85 90 95
Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val
100 105 110
Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile
115 120 125
Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg
130 135 140
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195 200 205
Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys
210 215 220
Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly
225 230 235 240
Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly
245 250 255
<210> 120
<211> 539
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FROM CUSTOME SYNTHESIZED DNA - TPA =SEQ
<400> 120
Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val
1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe
65 70 75 80
Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys
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Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr
100 105 110
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Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp
130 135 140
Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp
145 150 155 160
Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser
165 170 175
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Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys
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245 250 255
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260 265 270
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305 310 315 320
Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe
325 330 335
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340 345 350
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385 390 395 400
Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro
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Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr
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Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
530 535
<210> 121
<211> 775
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTEIN - N_EGF_TPA_EGF
<400> 121
Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu
1 5 10 15
Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile
20 25 30
Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys
35 40 45
Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu
50 55 60
Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys
65 70 75 80
Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr
85 90 95
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100 105 110
Thr Asp Cys Asp Ser Gly Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg Gly
115 120 125
Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile
130 135 140
Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg
145 150 155 160
Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val
165 170 175
Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys
180 185 190
Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly
195 200 205
Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu
210 215 220
Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly
225 230 235 240
Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr
245 250 255
Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn
260 265 270
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe
275 280 285
Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser
290 295 300
Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly
305 310 315 320
Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser
325 330 335
Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln
340 345 350
Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp
355 360 365
Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu
370 375 380
Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser
385 390 395 400
Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser
405 410 415
His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly
420 425 430
Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu
435 440 445
Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr
450 455 460
Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln
465 470 475 480
Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp
485 490 495
Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser
500 505 510
Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro
515 520 525
Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr
530 535 540
Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu
545 550 555 560
Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu
565 570 575
Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg
580 585 590
Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser
595 600 605
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610 615 620
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Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg
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Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro
675 680 685
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Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu
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Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly
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<210> 122
<211> 657
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTEIN - N_EGF_TPA
<400> 122
Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu
1 5 10 15
Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile
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Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr
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Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val
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Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys
180 185 190
Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly
195 200 205
Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu
210 215 220
Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly
225 230 235 240
Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr
245 250 255
Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn
260 265 270
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe
275 280 285
Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser
290 295 300
Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly
305 310 315 320
Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser
325 330 335
Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln
340 345 350
Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp
355 360 365
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Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser
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Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser
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420 425 430
Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu
435 440 445
Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr
450 455 460
Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln
465 470 475 480
Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp
485 490 495
Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser
500 505 510
Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro
515 520 525
Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr
530 535 540
Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu
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Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu
565 570 575
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580 585 590
Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser
595 600 605
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Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg
645 650 655
Pro
<210> 123
<211> 657
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTEIN - TPA _EGF
<400> 123
Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val
1 5 10 15
Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser
20 25 30
Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys
85 90 95
Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser
165 170 175
Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys
180 185 190
Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu
195 200 205
Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys
210 215 220
Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys
225 230 235 240
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Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser
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Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile
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Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala
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Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly
305 310 315 320
Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe
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Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile
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420 425 430
Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr
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450 455 460
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485 490 495
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530 535 540
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545 550 555 560
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645 650 655
Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTEIN - ID EGF TPA EGF DEL
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225 230 235 240
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Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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340 345 350
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370 375 380
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Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys
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580 585 590
Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr
595 600 605
Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
610 615 620
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTEIN - ID EGF TPA EGF k1 DEL
<400> 125
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Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys
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225 230 235 240
Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr
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260 265 270
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION ROTEIN - N_EGF_TPA EGF k1 DEL
<400> 126
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225 230 235 240
Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser
405 410 415
Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro
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515 520 525
Met Arg Pro
530
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<211> 531
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUSION PROTEIN - TPA _EGF egf AND K1 DEL
<400> 127
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65 70 75 80
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val
385 390 395 400
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405 410 415
Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr
420 425 430
Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu
435 440 445
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450 455 460
Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile
465 470 475 480
Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly
485 490 495
Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys
500 505 510
Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr Asp Cys
515 520 525
Asp Ser Gly
530
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tPA variant
<400> 128
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Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser
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Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu
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210 215 220
Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys
225 230 235 240
His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His
245 250 255
Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser
260 265 270
Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile
275 280 285
Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala
290 295 300
Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly
305 310 315 320
Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe
325 330 335
Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys
355 360 365
Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile
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Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro
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Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu
420 425 430
Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr
435 440 445
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450 455 460
Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala
465 470 475 480
Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys
485 490 495
Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu
500 505 510
Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn
515 520 525
Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
530 535
<210> 129
<211> 532
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Interdomain SK_EGFpolypeptide where EGF fused between beta and
gamma domain of SK
<400> 129
Ile Ala Gly Pro Glu Trp Leu Leu Asp Arg Pro Ser Val Asn Asn Ser
1 5 10 15
Gln Leu Val Val Ser Val Ala Gly Thr Val Glu Gly Thr Asn Gln Asp
20 25 30
Ile Ser Leu Lys Phe Phe Glu Ile Asp Leu Thr Ser Arg Pro Ala His
35 40 45
Gly Gly Lys Thr Glu Gln Gly Leu Ser Pro Lys Ser Lys Pro Phe Ala
50 55 60
Thr Asp Ser Gly Ala Met Ser His Lys Leu Glu Lys Ala Asp Leu Leu
65 70 75 80
Lys Ala Ile Gln Glu Gln Leu Ile Ala Asn Val His Ser Asn Asp Asp
85 90 95
Tyr Phe Glu Val Ile Asp Phe Ala Ser Asp Ala Thr Ile Thr Asp Arg
100 105 110
Asn Gly Lys Val Tyr Phe Ala Asp Lys Asp Gly Ser Val Thr Leu Pro
115 120 125
Thr Gln Pro Val Gln Glu Phe Leu Leu Ser Gly His Val Arg Val Arg
130 135 140
Pro Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Gln Asn Gln Ala Lys Ser Val Asp Val
145 150 155 160
Glu Tyr Thr Val Gln Phe Thr Pro Leu Asn Pro Asp Asp Asp Phe Arg
165 170 175
Pro Gly Leu Lys Asp Thr Lys Leu Leu Lys Thr Leu Ala Ile Gly Asp
180 185 190
Thr Ile Thr Ser Gln Glu Leu Leu Ala Gln Ala Gln Ser Ile Leu Asn
195 200 205
Lys Asn His Pro Gly Tyr Thr Ile Tyr Glu Arg Asp Ser Ser Ile Val
210 215 220
Thr His Asp Asn Asp Ile Phe Arg Thr Ile Leu Pro Met Asp Gln Glu
225 230 235 240
Phe Thr Tyr Arg Val Lys Asn Arg Glu Gln Ala Tyr Arg Ile Asn Lys
245 250 255
Lys Ser Gly Leu Asn Glu Glu Ile Asn Asn Thr Asp Leu Ile Ser Glu
260 265 270
Lys Tyr Tyr Val Leu Lys Lys Gly Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Phe Asp
275 280 285
Arg Ser His Leu Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln
290 295 300
Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly
305 310 315 320
Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn
325 330 335
Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys
340 345 350
Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp
355 360 365
Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn
370 375 380
Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala
385 390 395 400
Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly Lys Leu Phe Thr Ile Lys
405 410 415
Tyr Val Asp Val Asp Thr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Glu Gln Leu Leu
420 425 430
Thr Ala Ser Glu Arg Asn Leu Asp Phe Arg Asp Leu Tyr Asp Pro Arg
435 440 445
Asp Lys Ala Lys Leu Leu Tyr Asn Asn Leu Asp Ala Phe Gly Ile Met
450 455 460
Asp Tyr Thr Leu Thr Gly Lys Val Glu Asp Asn His Asp Asp Thr Asn
465 470 475 480
Arg Ile Ile Thr Val Tyr Met Gly Lys Arg Pro Glu Gly Glu Asn Ala
485 490 495
Ser Tyr His Leu Ala Tyr Asp Lys Asp Arg Tyr Thr Glu Glu Glu Arg
500 505 510
Glu Val Tyr Ser Tyr Leu Arg Tyr Thr Gly Thr Pro Ile Pro Asp Asn
515 520 525
Pro Asn Asp Lys
530
<210> 130
<211> 136
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 130
Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser
1 5 10 15
Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val
20 25 30
Asp Ser Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro
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Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val
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Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu
65 70 75 80
Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys
85 90 95
Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val
100 105 110
Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile
115 120 125
Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys
130 135
Claims (46)
- 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 스타필로키나제, 유로키나제, 및 이들의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈전용해성 단백질에 융합된 트롬보모듈린의 4, 5 및 6 상피 성장 인자-유사 도메인(EGF 4,5,6 도메인)을 포함하는 키메릭 단백질 구조물.
- 제 1 항에 있어서,
트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인이 혈전용해성 단백질 또는 이의 유도체 또는 유사체에, 상기 혈전용해성 단백질 또는 이의 유도체 또는 유사체의 N-말단, C-말단, 또는 N- 및 C-말단 모두에서 융합된 키메릭 단백질 구조물. - 제 1 항에 있어서,
혈전용해성 단백질이 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 절두(truncation)를 포함하는 스트렙토키나제를 포함하는, 플라스미노겐 활성화, 트롬빈 억제 및 응고 억제성 단백질 C 경로 활성화 활성을 갖는 키메릭 단백질 구조물. - 제 1 항에 있어서,
트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인이 스트렙토키나제의 알파와 베타 또는 베타와 감마 도메인 사이 또는 스트렙토키나제 유도체 또는 유사체의 알파와 베타 또는 베타와 감마 도메인 사이에서 융합되고, 상기 스트렙토키나제 유도체 또는 유사체가 하나 이상의 돌연변이, 첨가, 삽입 또는 절두를 포함하는, 플라스미노겐을 활성화하고, 트롬빈을 억제하고, 응고억제성 단백질 C 경로를 활성화하는 키메릭 단백질 구조물. - 제 2 항에 있어서,
EGF 4,5,6 도메인이 스트렙토키나제 N-말단, 스트렙토키나제 C-말단, N- 및 C-스트렙토키나제 말단 모두로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서, 또는 스트렙토키나제의 도메인 사이의 위치에서, 상기 스트렙토키나제, 또는 스트렙토키나제 유도체 또는 유사체에 인-프레임 융합된 키메릭 단백질 구조물. - 제 5 항에 있어서,
스트렙토키나제 유도체가 잔기 5 내지 383 또는 5 내지 414에 걸쳐 있는 키메릭 단백질 구조물. - 제 6 항에 있어서,
스트렙토키나제 유도체가 잔기 16 내지 383에 걸쳐 있는 키메릭 단백질 구조물. - 제 2 항에 있어서,
EGF 4,5,6 도메인이 스트렙토키나제 N-말단, 스트렙토키나제 C-말단, 및 N- 및 C-스트렙토키나제 말단 모두로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 인-프레임 융합되고, 상기 EGF 4,5,6 도메인의 메티오닌(Met) 41이 발린, 알라닌 또는 글루타민에 의해 교체되거나; C-말단 Met 435가 발린, 알라닌 또는 글루타민에 의해 교체되거나; 동시에 N- 및 C-말단 융합 구조물에서, Met 41 및 Met 435가 발린, 알라닌 또는 글루타민에 의해 독립적으로 교체된 키메릭 단백질 구조물. - 제 1 항에 있어서,
트랜스글루타미나제 인식 서열을 추가로 포함하는 키메릭 단백질 구조물. - 제 1 항에 있어서,
EGF 4,5,6 도메인과 혈전용해성 단백질 또는 이의 유도체 또는 유사체의 연접부에서 하나 이상의 트롬빈 절단성 서열을 추가로 포함하는 키메릭 단백질 구조물. - 치료 유효량의 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 단백질 구조물을 혈전증의 치료가 필요한 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 혈전증을 치료하는 방법.
- 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA) 유도체, 유사체, 또는 단편의 N-말단에서, 상기 tPA 유도체, 유사체 또는 단편의 C-말단에서, 또는 상기 tPA 유도체, 유사체 또는 단편의 2 개 말단 모두에서, 또는 상기 tPA 유도체, 유사체 또는 단편의 내부에서 상기 tPA 유도체, 유사체 또는 단편에 융합된 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인을 포함하는 키메릭 단백질 구조물.
- 제 12 항에 있어서,
EGF 4,5,6 도메인과 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA) 유도체, 유사체 또는 단편 사이의 융합이 하나 이상의 링커 단편을 추가로 포함하는 키메릭 단백질 구조물. - 제 13 항에 있어서,
하나 이상의 링커 단편이, 구조물의 유연성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 키메릭 단백질 구조물. - 제 12 항에 있어서,
조직 플라스미노겐 활성화제(tPA) 유도체, 유사체 또는 단편이 하나 이상의 돌연변이, 첨가, 삽입 또는 절두를 포함하고, 상기 tPA 유도체, 유사체 또는 단편이 플라스미노겐을 활성화하고, 트롬빈을 억제하고, 응고억제성 단백질 C를 활성화하는 키메릭 단백질 구조물. - 제 12 항에 있어서,
조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)의 EGF 도메인이 하나 이상의 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인에 의해 교체되도록 상기 하나 이상의 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인에 융합된 상기 tPA의 단편 또는 이의 절두되거나 변형된 형태를 포함하고, 항트롬빈 및 플라스미노겐 활성화 활성을 모두 갖는 키메릭 단백질 구조물. - 제 12 항에 있어서,
조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)의 크링글(kringle) 1 및 EGF 도메인이 하나 이상의 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인에 의해 교체되도록 상기 하나 이상의 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인에 융합된 상기 tPA의 단편 또는 이의 절두되거나 변형된 형태를 포함하고, 항트롬빈 및 플라스미노겐 활성화 활성을 모두 갖는 키메릭 단백질 구조물. - 제 17 항에 있어서,
조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)의 EGF 도메인 및 크링글 1 도메인이 tPA 단편의 N-말단 또는 C-말단에서 하나 이상의 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인에 의해 교체된 키메릭 단백질 구조물. - 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
조직 플라스미노겐 활성화제(tPA) 단편 또는 이의 절두되거나 변형된 형태와 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인 사이에 하나 이상의 링커 단편을 추가로 포함하고, 상기 링커 단편이, 구조물이 트롬빈 억제, 단백질 C 활성화 및 플라스미노겐 활성화 능력을 갖도록 상기 구조물의 유연성을 촉진하는 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 단백질 구조물. - 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
EGF 4,5,6 도메인의 Met 41이 알라닌, 발린 또는 글루타민에 의해 교체된 키메릭 단백질 구조물. - 스타필로키나제의 N-말단 또는 C-말단에 인-프레임 융합된 트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인을 포함하는 키메릭 단백질 구조물.
- 제 21 항에 있어서,
트롬보모듈린의 EGF 4,5,6 도메인의 Met 41이 알라닌, 발린 또는 글루타민에 의해 교체된 키메릭 단백질 구조물. - 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,
스타필로키나제와 EGF 4,5,6 도메인 영역 사이에 트롬빈 절단성 서열을 추가로 포함하는 키메릭 단백질 구조물. - 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,
트랜스글루타미나제 가교결합 서열을 추가로 포함하는 키메릭 단백질 구조물. - 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
수용액 또는 염수 용액에 용해성인 키메릭 단백질 구조물. - 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 단백질 구조물의 사용을 포함하는 트롬빈의 억제 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 단백질 구조물의 사용을 포함하는 단백질 C의 활성화 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 단백질 구조물의 사용을 포함하는 항트롬빈 및 플라스미노겐 활성화 모두를 제공하는 방법.
- 약학적 유효량의 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 단백질 구조물을 포함하는 약학 제형.
- 치료 유효량의 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 단백질 구조물을 혈전용해가 필요한 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서의 혈전용해 방법.
- 세균 시스템 내의 발현에 의해 제조된 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 단백질 구조물.
- 진핵생물 시스템 내의 발현에 의해 제조된 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 단백질 구조물.
- 제 32 항에 있어서,
진핵생물 발현 시스템이 동물 세포, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키메릭 단백질 구조물. - 제 33 항에 있어서,
세포외 배지 내로 분비되는 키메릭 단백질 구조물. - 제 13 항에 있어서,
하나 이상의 아미노산이 Gly, Asn, Pro, Ser, Gln, Arg 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 키메릭 단백질 구조물. - 제 1 항 내지 제 10 항, 제 12 항 내지 제 25 항 및 제 31 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 단백질 구조물을 암호화하는 핵산 서열.
- 제 36 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 제 37 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 숙주 세포 발현 시스템에서 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 발현에 의해 제조되는, 제 1 항 내지 제 10 항, 제 12 항 내지 제 25 항 및 제 31 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 단백질 구조물.
- 숙주 세포 발현 시스템에서 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 발현에 의해 제 1 항 내지 제 10 항, 제 12 항 내지 제 25 항 및 제 31 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 단백질 구조물을 제조하는 방법.
- 제 40 항에 있어서,
숙주 세포 발현 시스템이 진핵생물 발현 시스템인 방법. - 제 41 항에 있어서,
숙주 세포 발현 시스템이 세균 발현 시스템인 방법. - 제 42 항에 있어서,
세균이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인 방법. - 제 43 항에 있어서,
진핵생물 발현 시스템이 동물 세포 또는 효모 세포인 방법. - 제 44 항에 있어서,
효모가 피스키아 파스토리스인 방법. - 제 40 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
키메릭 단백질 구조물이 숙주 세포로부터 세포외 배지 내로 분비되는 방법.
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