ES2342055T3 - Nuevos activadores del plasminogeno quimericos y sus usos farmaceuticos. - Google Patents
Nuevos activadores del plasminogeno quimericos y sus usos farmaceuticos. Download PDFInfo
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Abstract
Una proteína de fusión que comprende: (a) un precursor de proteína surfactante hidrófoba pulmonar de mamífero que carece de su polipéptido C-terminal, y (b) un activador del plasminógeno de mamífero, en la que el precursor de proteína surfactante está fusionado en su extremo C al extremo N del activador del plasminógeno.
Description
Nuevos activadores del plasminógeno quiméricos y
sus usos farmacéuticos.
La presente invención se refiere a proteínas
quiméricas recombinantes que comprenden un precursor de proteína
surfactante fusionado en el extremo N-terminal a un
activador del plasminógeno o que comprenden una proteína
surfactante madura fusionada en el extremo
N-terminal o C-terminal a un
activador del plasminógeno.
Numerosas enfermedades pulmonares intersticiales
inflamatorias agudas y crónicas, tales como el síndrome de
dificultad respiratoria aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda (ALI),
enfermedad pulmonar intersticial (ILD) o fibrosis pulmonar
idiopática (IPF), se caracterizan por anormalidades surfactantes
sustanciales, por ejemplo alteraciones en la composición de
surfactantes, filtración de proteínas del plasma al espacio
alveolar, o acumulación intra-alveolar de fibrina
(revisada en [1, 2]).
En estas condiciones patológicas, el equilibrio
hemostático alveolar se desplaza hacia un predominio de actividades
pro-coagulantes y
anti-fibrinolíticas, mientras que la actividad
fibrinolítica del espacio alveolar se reduce marcadamente, con
niveles reducidos de activador del plasminógeno de tipo uroquinasa
(u-PA; también denominado uroquinasa), el activador
del plasminógeno predominante en este compartimento, pero
concentraciones elevadas de inhibidor del activador del
plasminógeno 1 (PAI-1) y
\alpha_{2}-antiplasmina [3-5].
En dicho entorno, el fibrinógeno que se filtra al espacio alveolar
debido a una función alterada de la barrera alveolocapilar
(constituida por el endotelio capilar, el espacio intersticial, y el
epitelio alveolar) se convierte rápidamente en fibrina, y se observa
acumulación de fibrina
alveolar.
alveolar.
La función de la formación de fibrina en el
espacio alveolar es en gran medida desconocida. Ésta puede tener
efectos beneficiosos en la prevención de la hemorragia pulmonar y
servir como matriz primaria en la reparación de heridas. Por otro
lado, la fibrina alveolar puede contribuir a la alteración del
intercambio gaseoso en la lesión pulmonar aguda, y una eliminación
con retraso de la fibrina alveolar puede proporcionar una matriz
provisional para la posterior invasión de fibroblastos así como la
producción de proteínas de la matriz extracelular y, de este modo,
promover la respuesta fibroproliferativa que caracteriza una
evolución prolongada de ARDS y fibrosis pulmonar (revisado en
[6-8]).
[6-8]).
El surfactante pulmonar es un complejo de
lipoproteínas que cubre la superficie alveolar de todos los pulmones
de mamíferos (revisado en [9, 10]). Al reducir la tensión
superficial en el interfaz de aire/líquido a niveles muy bajos,
hace a la ventilación alveolar y el intercambio gaseoso factibles a
presiones pulmonares fisiológicas bajas y evita que los alvéolos se
replieguen sobre sí mismos. El surfactante pulmonar está compuesto
por aproximadamente el 90% de lípidos y el 10% de proteínas. De los
lípidos, el 80-90% son fosfolípidos, con
fosfatidilcolina como componente más abundante. Hasta la fecha, se
han identificado cuatro proteínas asociadas a surfactante que
pueden dividirse en dos grupos: las proteínas surfactantes
hidrófilas (SP) SP-A y SP-D, y las
proteínas surfactantes hidrófobas SP-B y
SP-C (revisado en [11, 12]).
En los últimos años, la aplicación de
preparaciones de surfactante exógeno se ha convertido en un enfoque
interesante para restaurar la disfunción del surfactante en
afecciones patológicas, tales como ARDS o IRDS. Por ejemplo, la
Solicitud Internacional PCT [13] divulga una preparación
farmacéutica para tratar síndrome de dificultad respiratoria del
lactante o lesión pulmonar aguda, que comprende al menos una
modificación de SP-B y al menos una modificación de
SP-C. Los autores han descubierto que añadiendo
modificaciones de SP-C a preparaciones de
surfactante pulmonar que contienen modificaciones de
SP-B, se obtienen preparaciones farmacéuticas con
propiedades ventajosas. Las modificaciones de las proteínas
surfactantes pueden ser proteínas recombinantes. La Patente de
Estados Unidos [14] describe una composición para administración por
vía pulmonar de un compuesto farmacéuticamente activo que comprende
un compuesto formador de liposomas, así como al menos una proteína
surfactante alveolar en una cantidad eficaz para mejorar el
transporte de los liposomas a lo largo de una superficie pulmonar.
Finalmente, la Patente de Estados Unidos [15] describe varios
fragmentos de SP-B que muestran actividad
surfactante cuando se mezclan con fosfolípidos. Estos fragmentos son
compuestos adecuados para la preparación de formulaciones
terapéuticamente eficaces para el tratamiento de una enfermedad
respiratoria.
Se supone que las anormalidades surfactantes
representan sucesos clave en el desarrollo del fallo respiratorio
agudo y crónico. La alteración de la función surfactante biofísica
con una tensión superficial mínima aumentada y perfiles de
fosfolípidos y proteínas surfactantes alterados se han observado de
forma sistemática en pacientes con ARDS, neumonía grave así como
enfermedad pulmonar intersticial (revisado en [1, 2]). Además, se ha
establecido que la formación de fibrina alveolar representa el
mecanismo inhibidor de surfactante más potente descrito hasta el
momento. La generación de un coágulo de fibrina en presencia de
surfactante pulmonar dio como resultado una incorporación casi
completa de componentes surfactantes hidrófobos, tales como
fosfolípidos y las proteínas surfactantes SP-B y
SP-C, en la matriz de fibrina naciente junto con una
grave pérdida de propiedades rebajantes de la tensión superficial.
Además, la fibrina que contiene surfactante representa una
estructura única dentro del espacio alveolar con distintas
propiedades. En comparación con coágulos de fibrina "normales"
(extra-alveolares), los coágulos de fibrina
alveolares se caracterizan por una arquitectura del coágulo
alterada, propiedades mecánicas alteradas y una susceptibilidad
reducida a la degradación proteolítica (revisado en [1]).
Por lo tanto, una corrección del desequilibrio
hemostático descrito anteriormente aumentando la actividad
fibrinolítica alveolar puede representar un enfoque terapéutico
razonable para restaurar la función surfactante. Y de hecho,
estudios in vivo e in vitro han tenido éxito en la
consecución de este objetivo. Una regulación positiva de los
niveles de uroquinasa mediante transferencia génica mediada por
adenovirus redujo el grado de fibrosis pulmonar inducida por
bleomicina en ratones [16]. Además, en pulmones de conejo
perfundidos al tratamiento con uroquinasa le seguía una mejora
pronunciada del intercambio gaseoso [17]. Se demostró que la
escisión in vitro de fibrina que incorpora surfactante
rescata material surfactante atrapado en la matriz de fibrina, con
sus propiedades rebajadoras de la tensión superficial estando
conservadas [18, 19].
Esta estrategia, sin embargo, podría estar
dificultada por la inducción de hemorragia en sitios pulmonares y
extra-pulmonares, incluso si el agente fibrinolítico
está distribuido principalmente en el espacio alveolar. Además,
podrían provocarse efectos desfavorables sobre la función
surfactante. Para superar estas limitaciones, deben desarrollarse
herramientas que mejoren la selectividad y potencia de una terapia
fibrinolítica contra fibrina que contiene
surfactante.
surfactante.
Ruppert y col., han establecido recientemente
dicha herramienta molecular para fijar como objetivo la fibrina
alveolar acoplando químicamente un anticuerpo monoclonar
anti-SP-B, denominado 8B5E, para
uroquinasa humana usando un reticulador heterobifunctional [20]. En
otro estudio [21], los mismos autores describieron reticulación
química de uroquinasa humana con SP-B bovina
purificada. Se descubrió que ambas de estas proteínas híbridas: (1)
conservan las actividades biofísicas en comparación con
SP-B nativa, y (2) son aproximadamente
2-3 veces más eficaces en la lisis de coágulos de
fibrina que contienen surfactante y aproximadamente
3-5 veces más resistentes a PAI-1
que u-PA nativo, dando como resultado, por lo tanto,
enzimas quiméricas con especificidad por el sustrato mejorada. Por
otro lado, debido al esfuerzo necesario para purificar las
proteínas, en particular con respecto a SP-B, que
se purifica a partir de una fuente natural, que se acoplará mediante
métodos de purificación convencionales, esta estrategia requiere
tiempo y es bastante laboriosa. Esta desventaja, sin embargo, puede
superarse parcialmente mediante la producción recombinante de las
dos proteínas aisladas (por ejemplo uroquinasa y
SP-B), seguida de su reticulación química.
Para este fin, podría obtenerse
SP-B madura recombinante de acuerdo con la Patente
de Estados Unidos [22]. Esta patente describe un proceso para
producir SP-B alveolar madura usando una proteína
precursora de SP-B que tiene un polipéptido
solamente en su extremo N pero que carece de un propéptido
C-terminal. En [22], el procesamiento del
polipéptido N-terminal se realiza in vitro
usando un sitio de escisión de hidroxilamina manipulado
genéticamente. Esto da como resultado la liberación del péptido
maduro.
La uroquinasa recombinante humana podría
obtenerse de acuerdo con la Patente de Estados Unidos [23]. Además,
se han divulgado activadores del plasminógeno híbridos, por ejemplo,
en las siguientes Patentes de Estados Unidos: [24] divulga una
proteína híbrida de dos cadenas fibrinolíticamente activa, en la que
las cadenas se obtienen de la misma o de diferentes proteasas de
dos cadenas. La Patente de Estados Unidos [25] describe un
activador del plasminógeno de tipo uroquinasa de dos cadenas
específico de fibrina en una forma de dosificación terapéutica para
disolver coágulos in vivo, mientras que [26] describe la
producción recombinante de activadores del plasminógeno quiméricos
de cadena sencilla compuestos por al menos dos subsecuencias de
activador del plasminógeno tisular humano y activador del
plasminógeno de tipo uroquinasa humano. Los activadores del
plasminógeno descritos en [23-26] son solamente para
aplicación sistémica.
Otra característica deseable de una herramienta
fibrinolítica eficaz para fijar como objetivo fibrina alveolar
sería su especificidad por coágulos de fibrina que contienen
surfactante. La Patente de Estados Unidos [27] describe una
proteína de fusión de lisozima y el polipéptido
C-terminal de SP-B con los diez
restos de aminoácidos precedentes del péptido SP-B
maduro incluidos, que se administra en un medio farmacéuticamente
aceptable a un individuo para prevenir y/o tratar infecciones
bacterianas, particularmente infecciones respiratorias bacterianas.
Al fusionar la lisozima a una porción de una proteína surfactante,
la enzima se administra al pulmón como el sitio de la infección
diana. De este modo, de acuerdo con [27] puede emplearse un
fragmento de SP-B para dirigir una actividad
enzimática que está fusionada a éste hacia una región confinada del
cuerpo.
Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad
de herramientas moleculares adecuadas para una terapia fibrinolítica
contra fibrina que contiene surfactante. Aunque las dos proteínas
híbridas descritas anteriormente [20, 21] son realmente
funcionales, tienen algunas desventajas fundamentales: en primer
lugar, el acoplamiento químico requiere la purificación de las
proteínas a acoplar, lo que puede ser muy laborioso y requerir mucho
tiempo por sí solo (véase anteriormente). En segundo lugar, en la
gran mayoría de los casos la precisa composición y/o estructura del
conjugado obtenido se desconoce debido a ambigüedades respecto a los
restos de aminoácidos que realmente experimentan sucesos de
acoplamiento. En tercer lugar, no todas las proteínas y todos los
agentes reticulantes son aplicables al acoplamiento químico en un
entorno experimental dado, y cuarto las eficacias de la etapa de
acoplamiento pueden variar entre experimentos del mismo tipo.
Por lo tanto, el problema a resolver por la
presente invención es superar estas limitaciones y proporcionar una
herramienta molecular, que no solamente se dirija a coágulos de
fibrina que contienen surfactante y lise eficazmente dichos coágulos
sino que también pueda producirse fácilmente en cantidades
suficientes para aplicaciones terapéuticas.
\newpage
Estos objetivos se consiguen mediante una
proteína de fusión que tiene las características de las
reivindicaciones independientes, así como mediante el método para su
producción. Dicha proteína de fusión comprende:
- (a)
- un precursor de proteína surfactante de mamífero que carece de su polipéptido C-terminal, y
- (b)
- un activador del plasminógeno de mamífero,
en la que el precursor de proteína surfactante
está fusionado en su extremo C al extremo N del activador del
plasminógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Como alternativa, una proteína de fusión de la
presente invención comprende:
- (a)
- una proteína surfactante de mamífero madura, y
- (b)
- un activador del plasminógeno de mamífero,
en la que la proteína surfactante madura está
fusionada en su extremo C o su extremo N al extremo N o al extremo C
del activador del plasminógeno, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Dichas proteínas de fusión "de cadena
sencilla" de la presente invención (en comparación con las
proteínas híbridas de "cadena doble" generadas mediante
acoplamiento químico) parecen conservar tanto las propiedades
biofísicas de la proteína surfactante como la actividad
fibrinolítica del activador del plasminógeno, y son dirigidas
eficazmente a coágulos de fibrina que contienen surfactante
intra-alveolares. Además, la presente invención
proporciona la ventaja de que la posterior purificación de la
proteína recombinante naciente es también directa y normalmente
puede realizarse en un día. Adicionalmente, al emplear este método
recombinante se asegura que las proteínas de fusión estén
ensambladas de una manera 1:1, es decir tienen una composición
definida.
Considerando la síntesis y el procesamiento de
las proteínas surfactantes SP-B y
SP-C in vivo, la aparente retención de las
propiedades biofísicas de la proteína surfactante por la proteína de
fusión de la invención es particularmente sorprendente dado que
ésta contiene el polipéptido N-terminal de la
proteína surfactante de mamífero. Tanto SP-B como
SP-C se sintetizan como proteínas precursoras por
células alveolares de tipo II. Estos precursores son procesados a
los péptidos maduros durante el tránsito a través de la ruta
secretora (revisado en [9, 10, 12]). Debido a la hidrofobicidad de
SP-B y SP-C maduras,
respectivamente, es fisiológicamente indispensable escoltarlas en
forma de proteínas precursoras antes de la asociación con lípidos
surfactantes. En caso contrario, alterarían inmediatamente las
membranas lipídicas, lo que podría dar como resultado, a su vez, la
lisis celular (por esta razón, hasta el momento no ha sido posible
producir SP-B madura recombinante en sistemas de
cultivo celular tales como células HeLa o CHO).
Por lo tanto, debe suponerse que el propéptido
impide que la proteína surfactante madura muestre su actividad
biofísica durante la administración a las células alveolares, lo que
significa que el propéptido proporciona en cierta medida a nivel
molecular un "escudo" contra la (en ese momento muy
perjudicial) función y las propiedades dañinas para las célula de
la proteína surfactante madura. Por consiguiente, fue una sorpresa
para los inventores descubrir que, a pesar de la presencia del
polipéptido N-terminal, las proteínas de fusión de
la invención parecen poseer las propiedades biofísicas de la
proteína surfactante madura.
Las proteínas de fusión de la invención se
generan por medio de tecnología de ADN recombinante, que permite el
completo control de la secuencia de una proteína de fusión
individual y, por lo tanto, de sus características biofísicas. Las
mutaciones dentro de la secuencia de aminoácidos pueden realizarse
muy fácilmente a nivel del ADN usando procedimientos convencionales
establecidos [28].
Posibles alteraciones de la secuencia de
aminoácidos son inserciones o deleciones así como sustituciones de
aminoácidos. Dichas sustituciones pueden ser conservativas, es decir
un resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido
químicamente similar. Las compilaciones de las propiedades de los
restos de aminoácidos se conocen bien en la técnica. Son ejemplos
de sustituciones conservativas las sustituciones entre los miembros
de los siguientes grupos: 1) alanina, serina y treonina; 2) ácido
aspártico y ácido glutámico; 3) asparagina y glutamina; 4) arginina
y lisina; 5) isoleucina, leucina, metionina y valina; y 6)
fenilalanina, tirosina y triptófano.
Por otro lado, también es posible introducir
alteraciones no conservativas en la secuencia de aminoácidos.
Puesto que SP-B, por ejemplo, es rica en restos de
cisteína, que forman puentes disulfuro inter- así como
intramoleculares, una de dichas sustituciones podría ser la
sustitución de un resto de cisteína por alanina para evitar la
formación de puentes disulfuro que pueden interferir en las
propiedades biofísicas y/o catalíticas de las proteínas de fusión
de la invención. Otra posible sustitución podría ser la sustitución
de uno o más restos de valina de SP-C, por ejemplo,
por glicina para reducir la hidrofobicidad de esta proteína. Sin
embargo, no solamente es posible cambiar restos de aminoácidos
individuales sino también dominios completos de la proteína de
fusión de acuerdo con la invención. Por ejemplo, porciones de la
proteína que no están implicados en la catálisis y no son cruciales
para el plegamiento en una estructura tridimensional funcional
podrían retirarse para reducir el tamaño de la proteína de fusión,
lo que podría ser ventajoso en muchos aspectos.
En general, dichas modificaciones de la
secuencia de aminoácidos pretenden mejorar las características
biofísicas y/o las propiedades catalíticas de la proteína de fusión
de la invención (por ejemplo, la semi-vida in
vivo, la permeabilidad de la membrana o su resistencia al ácido
en caso de administración oral).
Las expresiones "proteína precursora" o
"precursor" como se usan en el presente documento, se refieren
a una proteína que no está completamente procesada a su forma
madura sino que sigue comprendiendo sus propéptidos N- y/o
C-terminales. Las expresiones "componente de
proteína" o "componente" se refieren a los precursores de
proteínas surfactantes así como los activadores del plasminógeno que
comprenden las proteínas de fusión de la invención.
En realizaciones preferidas de la invención, al
menos un componente de la proteína de fusión como se describe en el
presente documento, es decir el componente de proteína surfactante y
el componente de activador del plasminógeno, respectivamente, es
una proteína humana. Las más preferidas son las proteínas de fusión
en las que ambos componentes son proteínas humanas (véase también la
figura 2).
La invención también incluye componentes de
proteínas de fusión, que difieren de lo que se denomina como
proteína "de tipo silvestre" como resultado de corte y empalme
alternativo de una molécula pre-ARNm común, pero sin
embargo son funcionales.
El componente de proteína surfactante de la
proteína de fusión puede ser cualquier proteína surfactante
conocida, es decir la proteína surfactante SP-A,
-B, -C, o -D, prefiriéndose las proteínas hidrófobas
SP-B y SP-C, y prefiriéndose más la
SP-B. Como ya se ha descrito en el presente
documento, la formación de fibrina en presencia de surfactante
pulmonar ha demostrado dar como resultado una incorporación casi
completa de estas dos proteínas en el coágulo de fibrina, lo que
les hace candidatos adecuados para dirigir a otra proteína, en este
caso un activador del plasminógeno, a coágulos que contienen
surfactante.
El precursor de SP-B (SEC ID Nº
1) comprende el "péptido maduro" (79 aminoácidos) flanqueado
por un polipéptido N-terminal de 200 aminoácidos
(incluyendo un péptido señal de 23 aminoácidos) y un propéptido
C-terminal de 102 aminoácidos, respectivamente. Se
demostró que el fragmento que comprende el polipéptido
N-terminal y el péptido maduro (como se muestra en
la SEC ID Nº 2) es necesario y suficiente para el correcto
plegamiento y el transporte de SP-B. La retirada
del polipéptido N-terminal y la liberación de
SP-B madura (SEC ID Nº 3) se producen en células
alveolares de tipo II. Hasta la fecha, no ha sido posible producir
SP-B madura en ningún sistema de cultivo celular
convencional, tal como células HeLa o células CHO (véase
anteriormente).
Por lo tanto, en una realización preferida de la
invención, el componente de proteína surfactante de la proteína de
fusión es la SEC ID Nº 2.
En una realización preferida alternativa de la
invención, el componente de proteína surfactante de la proteína de
fusión es la SEC ID Nº 3.
El procesamiento
post-traduccional del precursor de
SP-C (SEC ID Nº 8) es muy similar al de
SP-B. La SP-C madura (SEC ID Nº
10), una pequeña proteína de solamente 35 aminoácidos, es producida
mediante la posterior escisión del polipéptido C- y
N-terminal, respectivamente (revisado en [9, 10,
12]).
En otra realización preferida de la invención,
el precursor de proteína surfactante de la proteína de fusión es
SP-C (como se muestra en la SEC ID Nº 9).
En una realización preferida adicional, el
componente de proteína surfactante de la proteína de fusión es la
SEC ID Nº 10.
Un socio de fusión preferido para
SP-B y SP-C, respectivamente, con
respecto a un objeto de la invención, es decir lisis de coágulos de
fibrina que contienen surfactante, es el activador del plasminógeno
de tipo uroquinasa (u-PA), puesto que éste es el
activador del plasminógeno predominante en el espacio alveolar. El
activador del plasminógeno de tipo uroquinasa se sintetiza como una
proteína precursora de 411 aminoácidos también, que se denomina
u-PA de cadena sencilla (o
pro-uroquinasa; SEC ID Nº 4). La escisión entre
Lys-158 e Ile-159 da como resultado
la formación de u-Pa de cadena doble de alto peso
molecular (HMW-u-PA). El
procesamiento adicional mediante escisión entre
Lys-135 y Lys-136 genera
u-Pa de cadena doble de bajo peso molecular
(LMW-u-PA; SEC ID Nº 5), que se
describe que tiene una actividad enzimática similar a la de la forma
de alto peso molecular. Las dos cadenas de la proteína están
conectadas por un puente disulfuro entre Cys-148 y
Cys-279.
En una realización preferida adicional de la
invención, el activador del plasminógeno de la proteína de fusión es
LMW-u-PA (SEC ID Nº 5).
De la forma más preferible, la proteína de
fusión de la invención se selecciona entre el grupo constituido por
la SEC ID Nº 19 y la SEC ID Nº 20 que comprenden quimeras del
precursor de SP-B (SP-B_{\Delta
C}) y LMW-u-PA, que se denominan
como SPUC1A y SPUC1B, respectivamente (véase también las figuras 1A
y 1B).
\newpage
En otra realización preferida particular de la
invención, la proteína de fusión se selecciona entre el grupo
constituido por la SEC ID Nº 25 y la SEC ID Nº 26 que comprenden
quimeras de la SP-B madura
(SP-B_{madura}) y
LMW-u-PA, que se denominan como
SPUC2C y SPUC3B, respectivamente (véase también las figuras 1C y
1D).
También se prefiere una proteína de fusión que
comprende activador del plasminógeno tisular (t-PA;
SEC ID Nº 11) como componente activador del plasminógeno.
Son ejemplos no limitantes adicionales de
activadores del plasminógeno adecuados para proteínas de fusión de
acuerdo con la invención: u-Pa de cadena doble de
alto peso molecular (HMW-u-PA),
Cadena B de LMW-u-PA,
u-Pa de cadena sencilla recombinante
(r-scu-PA), t-PA
recombinante (rt-PA), y sus variantes
r-PA, n-PA y
TNK-t-PA, y fragmentos y mutantes
de los mismos que tienen actividad de activador del plasminógeno.
Ejemplos de activadores del plasminógeno adecuados se ilustran
también en la figura 2.
En una realización preferida adicional de la
invención, la proteína de fusión porta una marca de afinidad
proteica o peptídica en su extremo N y/o en su extremo C para
permitir la fácil detección y/o purificación de la proteína
recombinante. Las marcas de afinidad adecuadas son, por ejemplo, la
marca myc, la marca FLAG, la marca His_{6}, la marca
Strep-Tag® o la marca HA.
La presente invención también se refiere a
moléculas de ácido nucleico (ADN y ARN) que comprenden secuencias
de nucleótidos que codifican proteínas de fusión como se describen
en el presente documento. Puesto que la degeneración del código
genético permite sustituciones de algunos codones con otros codones
que especifican el mismo aminoácido, la invención no se limita a
una molécula de ácido nucleico específica que codifica una proteína
de fusión de la invención pero incluye todas las moléculas de ácido
nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una
proteína de fusión funcional.
La invención también incluye moléculas de ácido
nucleico que codifican una proteína de fusión funcional que
comprende secuencias de ácido nucleico diferentes de lo que se
denomina como secuencia de ácido nucleico "de tipo silvestre"
debido al corte y empalme alternativo de una molécula
pre-ARNm común. Dichos sucesos de corte y empalme
incluyen el uso alternativo de exones (es decir secuencias de ácido
nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos), intercambio
de exones (es decir una disposición alternativa de exones) y la
retención de intrones (es decir secuencias intermedias que
normalmente no codifican una secuencia de aminoácidos) dentro de la
molécula de ARNm madura.
En realizaciones preferidas de la invención al
menos un componente de la proteína de fusión, es decir el componente
de proteína surfactante y el componente de activador del
plasminógeno, respectivamente, es codificado por una secuencia de
ácido nucleico humana. Lo más preferido son proteínas de fusión en
las que ambos componentes son codificados por secuencias de ácido
nucleico humanas (véase también la figura 2).
En otra realización preferida, la secuencia de
ácido nucleico que codifica el componente de proteína surfactante de
la proteína de fusión como se describe en el presente documento se
selecciona entre el grupo constituido por la SEC ID Nº 2 y la SEC ID
Nº 9, prefiriéndose la primera.
También se prefieren las secuencias de ácido
nucleico que codifican una proteína de fusión como se describe en el
presente documento, en las que el componente de proteína surfactante
se selecciona entre el grupo constituido por la SEC ID Nº 3 y la SEC
ID Nº 10, prefiriéndose la primera.
De la forma más preferible, la molécula de ácido
nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada
entre el grupo constituido por la SEC ID Nº 6 y la SEC ID Nº 7
(véase también las figuras 1A y 1B).
En una realización preferida particular
adicional de la invención, la molécula de ácido nucleico comprende
una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo
constituido por la SEC ID Nº 12 y la SEC ID Nº 13 (véase también las
figuras 1C y 1D).
Una molécula de ácido nucleico descrita en esta
solicitud puede estar "unida de forma operativa" a una
secuencia reguladora (o secuencias reguladoras) para permitir la
expresión de esta molécula de ácido nucleico.
Una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, se
denomina como "capaz de expresar una molécula de ácido
nucleico" o capaz "de permitir la expresión de una secuencia
de nucleótidos" si comprende elementos de secuencia que
contienen información respecto a la regulación transcripcional y/o
traduccional, y dichas secuencias están "unidas de forma
operativa" a la secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido. Una unión operativa es una unión en la que los
elementos de secuencia reguladora y la secuencia a expresar están
conectados de una manera que permite la expresión génica. La
naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para la
expresión génica puede variar entre especies, pero en general estas
regiones comprenden un promotor que, en procariotas, contiene tanto
el promotor per se, es decir elementos de ADN que dirigen el
inicio de la transcripción, así como elementos de ADN que, cuando
se transcriben a ARN, señalizarán el inicio de la traducción.
Dichas regiones promotoras normalmente incluyen secuencias no
codificantes en posición 5' implicadas en el inicio de la
trascripción y la traducción, tales como las secuencias -35/-10 y el
elemento de Shine-Dalgarno en procariotas o la
secuencia TATA, secuencias CAAT, y elementos de formación de
"caperuzas" en 5' en eucariotas. Estas regiones también pueden
incluir elementos potenciadores o represores así como secuencias
señal y líder traducidas para dirigir al polipéptido nativo a un
compartimento específico de una célula huésped.
Además, las secuencias no codificantes 3' pueden
contener elementos reguladores implicados en la terminación de la
transcripción, poliadenilación o similares. Si, sin embargo, estas
secuencias de terminación no son satisfactoriamente funcionales en
una célula huésped particular, entonces pueden sustituirse con
señales funcionales en esa célula.
Por lo tanto, una molécula de ácido nucleico de
la invención puede incluir una secuencia reguladora, preferiblemente
una secuencia promotora. En otra realización preferida, una
molécula de ácido nucleico de la invención comprende una secuencia
promotora y una secuencia de terminación de la transcripción. Son
promotores procariotas adecuados, por ejemplo, el promotor
lacUV5 o el promotor T7. Los ejemplos de promotores útiles
para la expresión en células eucariotas son el promotor SV40 o el
promotor CMV.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
también pueden estar comprendidas en un vector u otros vehículos de
clonación, tales como plásmidos, fagémidos, fagos, baculovirus,
cósmidos o cromosomas artificiales. En una realización preferida,
la molécula de ácido nucleico está comprendida en un vector,
particularmente en un vector de expresión. Dicho vector de
expresión puede incluir, además de las secuencias reguladoras
descritas anteriormente y una secuencia de ácido nucleico que
codifica una proteína de fusión de la invención, secuencias de
replicación y de control obtenidas de una especie compatible con el
huésped que se usa para expresión así como marcadores de selección
que otorgan un fenotipo seleccionable en células transformadas o
transfectadas. De la forma más preferible, la molécula de ácido
nucleico está incluida en un vector de expresión adaptado para la
expresión de una secuencia codificante eucariota. En la técnica se
conoce un gran número de vectores adecuados, y están disponibles en
el mercado.
La molécula de ADN que codifica proteínas de
fusión de la invención, y en particular un vector que contiene la
secuencia codificante de dicha proteína de fusión puede
transformarse en una célula huésped capaz de expresar el gen. La
transformación puede realizarse usando técnicas convencionales [28].
Por lo tanto, la invención también se refiere a una célula huésped
que contiene una molécula de ácido nucleico como se describe en el
presente documento.
Las células huésped transformadas se cultivan en
condiciones adecuadas para la expresión de la secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína de fusión de la invención. Las
células huésped adecuadas pueden ser procariotas, tales como
Escherichia coli (E. coli) o Bacillus subtilis, o
eucariotas, tales como Saccharomyces cerevisiae, Pichia
pastoris, SF9 o células de insecto High5, líneas celulares de
mamífero inmortalizadas (por ejemplo células HeLa o células CHO),
células primarias de mamífero o células madre pulmonares.
La invención también se refiere a un método para
la producción recombinante de proteínas de fusión de acuerdo con la
invención. Este método comprende:
- (a)
- introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión en un vector adecuado, y
- (b)
- introducir el vector recombinante obtenido en (a) en una célula huésped adecuada o en un extracto celular adecuado.
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa (a) puede realizarse con una molécula
de ácido nucleico que solamente codifica la proteína de fusión.
Como alternativa, ésta puede realizarse con una molécula de ácido
nucleico en la que la secuencia que codifica la proteína de fusión
está unida de forma operativa a secuencias reguladoras.
Opcionalmente, la molécula de ácido nucleico de la invención
también puede estar fusionada a una secuencia que codifica un socio
de fusión tal como una marca de afinidad que permite la fácil
detección y/o purificación de la proteína de fusión recombinante.
En otra realización del método de la invención, las secuencias de
ácido nucleico que codifican la proteína surfactante y el
componente de activador del plasminógeno, respectivamente, de la
proteína de fusión como se describe en el presente documento pueden
insertarse independientemente entre sí en un vector adecuado. La
expresión génica puede conseguirse en una célula recombinante o un
extracto celular adecuado, que contiene todos los factores
necesarios para la transcripción y la traducción.
Además, la presente invención se refiere a usos
farmacéuticos de la proteína de fusión de la invención. En una
realización, la invención se refiere a un método para la profilaxis
y/o el tratamiento de enfermedades pulmonares inflamatorias e
intersticiales, que comprende la etapa de administrar una proteína
de fusión como se describe en el presente documento en solitario o
junto con otros compuestos farmacéuticamente activos y un excipiente
farmacéuticamente activo a un mamífero, y en particular a un ser
humano.
Las enfermedades pulmonares inflamatorias e
intersticiales o trastornos pulmonares agudos o crónicos que pueden
prevenirse o tratarse con una proteína de fusión descrita en esta
solicitud incluyen el síndrome de dificultad respiratoria aguda (o
en el adulto) (ARDS), lesión pulmonar aguda (ALI), enfermedad
pulmonar intersticial (ILD), fibrosis pulmonar idiopática (IPF),
sarcoidosis, neumonitis por hipersensibilidad, inflamación pulmonar,
neumonía, bronquitis, asma, fibrosis quística, anormalidades
surfactantes en sucesos potencial o aparentemente letales
recurrentes (ALTE) o el síndrome de la muerte súbita del lactante
(SIDS), proteinosis alveolar congénita y el síndrome respiratorio
agudo grave (SARS).
Las proteínas de fusión de acuerdo con la
invención pueden administrarse mediante cualquier vía parenteral,
no parenteral (enteral) o tópica (intratraqueal) que sea
terapéuticamente eficaz para fármacos proteináceos. Los métodos de
aplicación parenteral comprenden, por ejemplo, técnicas de inyección
e infusión intracutánea, subcutánea, intramuscular o intravenosa,
por ejemplo en forma de soluciones para inyección, soluciones o
tinturas para infusión, así como instilación e inhalación de
aerosol, por ejemplo en forma de mezclas de aerosol, pulverizaciones
o polvos secos. Los modos de administración no parenteral son, por
ejemplo, por vía oral, por ejemplo en forma de píldoras,
comprimidos, cápsulas, soluciones o suspensiones, o por vía rectal,
por ejemplo en forma de supositorios. Las proteínas de fusión de la
invención pueden administrarse por vía sistémica o por vía tópica en
formulaciones que contienen excipientes o portadores, aditivos y
vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales,
según se desee.
En una realización preferida de la presente
invención, la proteína de fusión se administra por vía parenteral a
un mamífero, y en particular a seres humanos, con administración en
aerosol o instilación intratraqueal, siendo el método de aplicación
más preferible.
La dosificación de la proteína de fusión de la
presente invención puede variar dentro de límites amplios para
conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente
particular. Ésta dependerá, por ejemplo, de la actividad
enzimática, es decir fibrinolítica, de la proteína de fusión así
como de su semi-vida in vivo, el modo de
administración, la gravedad de la enfermedad/trastorno que se está
tratando, así como el estado médico del paciente. Por ejemplo, el
tratamiento de trastornos agudos de corta duración, tales como un
ataque asmático o lesión pulmonar aguda, podría realizarse mejor
cuando se usa una dosis tan alta como sostenible. Por el contrario,
para el tratamiento de trastornos crónicos de larga duración, tales
como enfermedad pulmonar intersticial o fibrosis pulmonar
idiopática, una dosificación más baja, administrada opcionalmente en
una formulación de liberación sostenida, podría ser más adecuada.
El establecimiento de una cantidad de dosificación terapéuticamente
eficaz para un individuo dado está dentro de las competencias de un
especialista en la técnica.
En general, una dosis diaria de aproximadamente
500 \mug a 200 mg de proteína de fusión por kilogramo de peso
corporal puede ser apropiada. Los niveles de dosificación preferidos
varían entre 0,5 mg y 50 mg/kg de peso corporal/día para un régimen
de larga duración y entre 50 mg y 200 mg/kg de peso corporal/día
para tratamientos de corta duración. La proteína de fusión puede
aplicarse como una única dosis o puede dividirse en varias, por
ejemplo, de dos a cuatro, administraciones parciales.
Por lo tanto, la invención también se refiere a
una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión
como se ha descrito anteriormente y un excipiente farmacéuticamente
activo. En particular, la invención se refiere a una composición
farmacéutica, que tiene actividad fibrinolítica.
Las proteínas de fusión recombinantes de la
invención pueden formularse en composiciones usando ingredientes
farmacéuticamente aceptables así como métodos de preparación
establecidos [29]. Para preparar las composiciones farmacéuticas,
pueden usarse excipientes inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente
inertes. Para preparar por ejemplo píldoras, polvos, cápsulas de
gelatina o supositorios, por ejemplo, lactosa, talco, ácido
esteárico y sus sales, grasas, ceras, polioles sólidos o líquidos,
aceites naturales y endurecidos. Los excipientes adecuados para la
producción de soluciones, suspensiones, emulsiones, mezclas de
aerosol o polvos para reconstitución en soluciones o mezclas de
aerosol antes del uso incluyen agua, alcoholes, glicerol, polioles,
y mezclas adecuadas de los mismos, así como aceites vegetales.
La composición farmacéutica también puede
contener aditivos, tales como, por ejemplo, cargas, aglutinantes,
agentes humectantes, glidantes, estabilizantes, conservantes,
emulsionantes, y además disolventes o solubilizantes o agentes para
conseguir un efecto de depósito. Éste último es que las proteínas de
fusión pueden incorporarse en sistemas de administración dirigida o
liberación lenta o sostenida, tales como liposomas, nanopartículas y
microcápsulas.
Por ejemplo, las proteínas de fusión de la
invención pueden mezclarse con preparaciones surfactantes
disponibles en el mercado y administrarse mediante administración
en aerosol o instilación transbronquial o mediante un broncoscopio.
Las preparaciones surfactantes adecuadas incluyen, por ejemplo,
Survanta® así como Alveofact®, dos preparaciones surfactantes
bovinas naturales, Infasud®, un extracto de surfactante de pulmón de
ternero y Exosurf®, una composición surfactante sintética que carece
de las proteínas hidrófobas SP-B y
SP-C.
La invención se ilustra adicionalmente mediante
las siguientes Figuras y Ejemplos no limitantes.
La Figura 1 muestra representaciones
esquemáticas de cuatro vectores de expresión ejemplares de acuerdo
con la invención. Los vectores ilustrados en las figuras 1A y 1B
codifican proteínas de fusión constituidas por
SP-B_{\Delta C} fusionada en el extremo
N-terminal a
LMW-u-PA (SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 7,
respectivamente). pSPUC1A (figura 1A) se obtiene de pcDNA3.1(-)
(Invitrogen), mientras que pSPUC1B (figura 1B) se obtiene de
pSecTag2A (Invitrogen). La figura 1C ilustra pSPUC2C que codifica
una proteína de fusión compuesta por SP-B_{madura}
fusionada en el extremo N-terminal a
LMW-u-PA (SEC ID Nº 12), en la que
esta fusión génica está precedida por un segmento que codifica el
péptido señal SP-B así como un elemento separador de
6 nucleótidos. La figura 1D represente el vector pSPUC3B que
codifica una proteína de fusión constituida por
SP-B_{madura} fusionada en el extremo
C-terminal a
LMW-u-PA (SEC ID Nº 13), en la que
el ADNc de LMW-u-PA está precedido
por un segmento que codifica el péptido señal u-PA
así como un elemento separador de 6 nucleótidos
La Figura 2 ilustra esquemáticamente el diseño
de una proteína de fusión de acuerdo con la invención. Un componente
de proteína surfactante de mamífero está fusionado en su extremo C
al extremo N de un activador del plasminógeno de mamífero. Uno o
ambos de estos componentes pueden ser proteínas humanas. Los dos
componentes de proteína pueden seleccionarse entre los ejemplos no
limitantes indicados en la parte inferior de la figura. En gran
medida, si el componente de proteína surfactante es una proteína
surfactante madura, también está dentro del alcance de la invención
que la proteína surfactante madura pueda fusionarse con su extremo N
al extremo C de un activador del plasminógeno.
La Figura 3 documenta la expresión con éxito de
SPUC1A recombinante (SEC ID Nº 6) en células de ovario de hámster
chino (CHO). 35 horas después de la transfección con pSPUC, las
células se recogieron y se marcaron con
[^{35}S]-metionina/cisteína durante 6 horas. Los
sobrenadantes (S) y los lisados celulares (C) se inmunoprecipitaron
con los anticuerpos indicados, y las proteínas unidas se separaron
mediante SDS-PAGE. Se visualizaron señales mediante
autorradiografía. Una proteína de fusión del tamaño correcto
(aproximadamente 65 kDa) podía detectarse de forma concordante con
anticuerpos específicos para ambos componentes de la proteína,
respectivamente.
La Figura 4 representa la actividad amidolítica
de SPUC1A (SEC ID Nº 6) en comparación con SP-B de
longitud completa (SP-B_{FL}; SEC ID Nº 1) y
LMW-u-PA (SEC ID Nº 5) en células
CHO. Se recogieron muestras de células 20 horas (sobrenadantes, S) o
44 horas (sobrenadantes, S y lisados celulares, C) después de la
transfección con los ADN respectivos, se transfirieron a placas de
microvaloración y se incubaron con el sustrato cromogénico,
Chromozyme U (sustrato directo para u-PA) y
S-2251 (sustrato indirecto, adición de plasminógeno
necesaria), respectivamente. La absorbancia (405 nm) de las muestras
se determinó en un lector de microplacas. Las células transfectadas
con pSPUC1A mostraban actividad amidolítica, que era más pronunciada
después de la adición de plasminógeno. Por lo tanto, SPUC
recombinante es funcional cuando se expresa en células CHO.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector pSPUC1A (figura 1A) que codifica una
proteína de fusión (denominada SPUC1A; SEC ID Nº 6) constituida por
SP-B_{\Delta C} humana (SEC ID Nº 2) fusionada en
el extremo N-terminal al activador del plasminógeno
de tipo uroquinasa de bajo peso molecular humano
(LMW-u-PA; SEC ID Nº 5) se construyó
usando métodos convencionales [28]. Los respectivos fragmentos de
ADNc se insertaron en el sitio de clonación múltiple del vector de
expresión pcDNA3.1(-) (Invitrogen) bajo el control del promotor
CMV. El ADNc de SP-B_{\Delta C} se clonó entre los
sitios XhoI y HindIII del sitio de clonación múltiple, y el ADNc de
LMW-u-PA entre los sitios HindIII y
AflII.
La mezcla de ligamiento obtenida se transformó
en E. coli, y se cribaron clones individuales para detectar
la presencia del inserto correcto mediante análisis por PCR usando
cebadores que flanquean el sitio de inserción. Los transformantes
positivos se amplificaron en E. coli. El ADN del vector se
purifico mediante cromatografía de intercambio iónico y se
secuenció usando un sistema automatizado (ABI Prism 310 Genetic
Analyzer; Perkin Elmer).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células de ovario de hámster chino
(CHO) (American Type Culture Collection) como monocapas a 37ºC y el
10% de CO_{2}. El medio de cultivo estaba constituido por una
mezcla 1:1 de DMEM y DMEM-F12 suplementada con el
10% de suero fetal de ternero, glutamina 20 mM, 100 U/ml de
penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. La transfección de
ADN se realizó usando 2,5 \mug de pSPUC1A y Lipofectamine Plus
(Life Technologies/GIBCO BRL) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
La expresión de SPUC1A (SEC ID Nº 6) se analizó
usando el marcado de células con [^{35}S] e inmunoprecipitación
(figura 3). 35 h después de la transfección, el medio de cultivo se
sustituyó por DMEM suplementado con el 10% de FCS y HEPES 25 mM,
pero sin metionina/cisteína. Después de un periodo de incubación de
40 min, las células se marcaron durante 6 h con 0,5 mCi/ml de
[^{35}S]-metionina/cisteína
(Pro-mix [^{35}S] in vitro cell labeling
mix;
Amersham).
Amersham).
Los sobrenadantes (S) así como los lisados
celulares (C) se inmunoprecipitaron a continuación con un anticuerpo
policlonal de conejo
anti-pro-SP-B humana
(Chemicon) y un anticuerpo monoclonal de ratón
anti-u-PA humano (American
Diagnostica), respectivamente. Proteína G-Sepharose
(30 \mul; Zymed Laboratories) y suero de conejo (5 \mul) se
añadieron a cada tubo y las muestras se incubaron en una centrífuga
a 4ºC durante 12 h. Después del centrifugado a 1.000 x g, los
sobrenadantes se transfirieron a nuevos tubos, y se añadieron 30
\mul de Proteína-G-Sepharose y 5
\mul del anticuerpo respectivo. Después de otro periodo de
incubación (12 h, 4ºC) y centrifugado del sobrenadante, los
sedimentos se lavaron cuatro veces con tampón de lavado A (NaCl 150
mM, Tris 50 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 al 0,1%, SDS
al 0,02%, pH 7,6) y dos veces con tampón de lavado B (NaCl 150 mM,
Tris 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7.6). Las muestras se suspendieron en
tampón de Laemmli, se llevaron a ebullición durante 5 min, y se
corrieron en un gel de SDS-PAGE al 10%. El gel se
fijó durante 1 h en metanol al 40%/ácido glacial al 10%/glicerol al
4%, se incubó durante 30 min en solución potenciadora, se secó en
cámara de vacío y se expuso a una película de rayos X (Kodak Biomax
MR).
Una proteína de fusión del tamaño esperado
(aproximadamente 65 kDa) podía detectarse de forma concordante con
anticuerpos específicos para ambos componentes de la proteína,
respectivamente (figura 3). Por lo tanto, SPUC1A recombinante puede
expresarse con éxito en células CHO. Una cuantificación preliminar
de los niveles de SPUC1A mediante análisis de ELISA usando el
anticuerpo monoclonal de ratón
anti-u-PA humano (no se muestran
los datos) dio como resultado concentraciones que variaban entre 34
y 58 ng/ml de sobrenadante.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad amidolítica de SPUC1A recombinante
(SEC ID Nº 6) en sobrenadantes y lisados de células CHO se determinó
usando los sustratos cromogénicos Chromozyme U (Roche Diagnostics) y
S-2251 (Chromogenix), respectivamente. El tampón de
ensayo estaba constituido por Tris 100 mM, pH 7,6,
Tween-20 al 0,5%, y 100 \mug/ml de BSA.
Chromozyme U es un sustrato directo para
u-PA. Las muestras de ensayo (sobrenadantes
celulares 20 y 44 h después de la transfección así como lisados
celulares) se transfirieron en un volumen de 50 \mul a una placa
de microvaloración y se incubaron con 100 \mul de tampón de
ensayo y 100 \mul de Chromozyme U (1 mg/ml). Las reacciones se
finalizaron mediante la adición de 50 \mul de ácido acético
(solución al 50%), y la absorbancia se determinó a 405 nm.
S-2251, por otro lado, es un sustrato indirecto para
u-PA que se escinde después de la activación del
plasminógeno a plasmina. Las muestras de ensayo se transfirieron
también a una placa de microvaloración y se mezclaron con 100
\mul de una solución de plasminógeno diluido (50 \mug/ml) y 100
\mul de S-2251 (2 mM) disuelto en tampón de
ensayo. Después de la incubación, las reacciones se finalizaron
mediante la adición de 50 \mul de ácido acético, y se midió la
absorbancia a 405 nm. Células transfectadas con pSPB_{FL} que
codifica SP-B humana de longitud completa (SEC ID Nº
1) sirvieron como control negativo, mientras que células
transfectadas con pLMW-u-PA que
codifica activador del plasminógeno de tipo uroquinasa de bajo peso
molecular humano (SEC ID Nº 5) sirvieron como control
positivo.
positivo.
Después de la transfección de células CHO con
pSPUC1A, podía detectarse actividad amidolítica en los sobrenadantes
celulares (figura 4). Sin embargo, el efecto era más pronunciado
después de la adición de plasminógeno cuando se usaba
S-2251 como sustrato. En células transfectadas con
pSPB_{FL} no se observó actividad amidolítica medible, como se
esperaba. Las células transfectadas con
pLMW-u-PA mostraban niveles mucho
más altos de actividad de u-PA en comparación con
células transfectadas con pSPUC1A. La razón para este descubrimiento
sigue sin ser clara y hay que abordarla en estudios adicionales.
Sin embargo, estos resultados confirmaban que SPUC1A recombinante
es, de hecho, funcional cuando se expresa de forma heterogénea en
células CHO.
\vskip1.000000\baselineskip
Como segunda medición de la actividad de
activador del plasminógeno, se analizaron sobrenadantes y lisados
celulares de células CHO mediante autografía en gel de fibrina, que
se realizó como se ha descrito [30]. Las muestras se separaron
mediante SDS-PAGE usando geles de resolución de
acrilamida al 10%. El gel se empapó durante 1,5 h en fosfato sódico
0,1 M pH 7,2 con Triton X-100 al 5% para neutralizar
SDS y a continuación se colocó sobre un gel indicador de fibrina.
En resumen, una solución de agarosa al 2% (p/v) se llevó a
ebullición, se enfrió a 45ºC y se mezcló con solución salina
tamponada con fosfato pre-calentada que contenía 140
\mug/ml de plasminógeno y 0,8 U/ml de trombina. Se añadió
fibrinógeno (10 mg/ml) en PBS (37ºC) y la mezcla se vertió en una
placa de vidrio. Las concentraciones finales eran del 1% de agarosa,
35 \mug/ml de plasminógeno, 0,2 U/ml de trombina y 2 mg/ml de
fibrinógeno. El gel de fibrina se desarrolló en una cámara de
humidificación y se fotografió. Los activadores del plasminógeno se
revelaron mediante la formación de zonas líticas oscuras en la
matriz de fibrina opaca del gen
indicador.
indicador.
En células CHO transfectadas con pSPUC1A, podía
identificarse una zona lítica que migraba a aproximadamente 65 kDa
en los sobrenadantes y en lisados celulares (no se muestran los
datos). Este descubrimiento está completamente de acuerdo con los
resultados obtenidos en los estudios de marcado de
células/inmunoprecipitación (figura 3; Ejemplo 2) así como los
experimentos de escisión (figura 4; Ejemplo 3) descritos
anteriormente, que corroboran adicionalmente la funcionalidad de
SPUC1A recombinante.
\newpage
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<160> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1143
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1143)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del precursor
de proteína surfactante B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 837
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(837)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del precursor
de proteína surfactante B que carece del propéptido
C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(237)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de la proteína
surfactante B madura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1293
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1293)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del activador
de plasminógeno tipo uroquinasa monocatenario
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 828
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(828)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del activador
de plasminógeno tipo uroquinasa bicatenario de bajo peso
molecular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(837)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del precursor
de proteína surfactante B que carece del propéptido
C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (844)...(1671)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del activador
de plasminógeno tipo uroquinasa bicatenario de bajo peso
molecular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1674
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(837)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del precursor
de proteína surfactante B que carece del propéptido
C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (847)...(1674)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del activador
de plasminógeno tipo uroquinasa bicatenario de bajo peso
molecular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(591)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del precursor
de proteína surfactante C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(174)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del precursor
de proteína surfactante C que carece del propéptido
C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(105)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de la proteína
surfactante C madura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1686
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1686)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del activador
de plasminógeno tisular
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1158
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(69)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal de la proteína
surfactante B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (76)...(312)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de la proteína
surfactante B madura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (313)...(1140)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del activador
de plasminógeno tipo uroquinasa bicatenario de bajo peso
molecular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1141)...(1158)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Marcador de afinidad de
hexahistidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal del activador de
plasminógeno tipo uroquinasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (67)...(894)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del activador
de plasminógeno tipo uroquinasa bicatenario de bajo peso
molecular
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (895)...(1131)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de la proteína
surfactante B madura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1132)...(1149)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Marcador de afinidad
hexahistidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(381)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Precursor de proteína surfactante
B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 279
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(279)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Precursor de proteína surfactante B
que carece del propéptido C-terminal
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(79)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína surfactante B madura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 431
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(431)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Activador de plasminógeno tipo
uroquinasa monocatenario
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 276
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(276)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Activador de plasminógeno tipo
uroquinasa bicatenario de bajo peso molecular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 557
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(279)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Precursor de proteína surfactante B
que carece del propéptido C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (282)...(557)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Activador de plasminógeno tipo
uroquinasa bicatenario de bajo peso molecular
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 558
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(279)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Precursor de proteína surfactante B
que carece del propéptido C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (283)...(558)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Activador de plasminógeno tipo
uroquinasa bicatenario de bajo peso molecular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(197)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Precursor de proteína surfactante
C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(58)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Precursor de proteína surfactante C
que carece del propéptido C-terminal
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína surfactante C madura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 562
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(562)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Activador del plasminógeno
tisular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 386
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal de la proteína
surfactante B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)...(104)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína surfactante B madura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (105)...(380)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Activador de plasminógeno tipo
uroquinasa bicatenario de bajo peso molecular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (381)...(386)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Marcador de afinidad de
hexahistidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIGNAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal del activador del
plasminógeno de tipo uroquinasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)...(298)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Activador de plasminógeno tipo
uroquinasa bicatenario de bajo peso molecular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (299)...(377)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de la proteína
surfactante B madura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (378)...(383)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Marcador de afinidad de
hexahistidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
Claims (16)
1. Una proteína de fusión que comprende:
- (a)
- un precursor de proteína surfactante hidrófoba pulmonar de mamífero que carece de su polipéptido C-terminal, y
- (b)
- un activador del plasminógeno de mamífero,
en la que el precursor de proteína surfactante
está fusionado en su extremo C al extremo N del activador del
plasminógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1,
en la que uno de los componentes de la proteína (a) o (b) es una
proteína humana.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 1
ó 2, en la que ambos componentes de la proteína (a) y (b) son
proteínas humanas.
4. La proteína de fusión de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que el precursor de proteína
surfactante pulmonar de mamífero se selecciona entre la proteína
surfactante B (SP-B) o la proteína surfactante C
(SP-C).
5. La proteína de fusión de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que el precursor de proteína
surfactante pulmonar de mamífero es la proteína surfactante B
(SP-B).
6. Una proteína de fusión que comprende:
- (a)
- una proteína surfactante hidrófoba pulmonar de mamífero madura, y
- (b)
- un activador del plasminógeno de mamífero,
en la que la proteína surfactante madura está
fusionada en su extremo C o su extremo N al extremo N o al extremo C
del activador del plasminógeno, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
7. La proteína de fusión de la reivindicación 6,
en la que uno de los componentes de la proteína (a) o (b) es una
proteína humana.
8. La proteína de fusión de la reivindicación 6
ó 7, en la que ambos componentes de la proteína (a) y (b) son
proteínas humanas.
9. La proteína de fusión de cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en la que la proteína surfactante pulmonar
de mamífero madura se selecciona entre el grupo constituido por la
proteína surfactante B (SP-B) y la proteína
surfactante C (SP-C).
10. La proteína de fusión de cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, en la que la proteína surfactante pulmonar
de mamífero madura es la proteína surfactante B
(SP-B).
11. Una proteína de fusión de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en la que el activador del plasminógeno de
mamífero se selecciona entre el grupo constituido por activador del
plasminógeno de tipo uroquinasa de cadena doble de alto peso
molecular (HMW-u-PA),
u-Pa de cadena doble de bajo peso molecular
(LMW-u-PA), cadena B de
u-PA de bajo peso molecular, u-Pa de
cadena sencilla recombinante
(r-scu-PA), activador del
plasminógeno tisular (t-PA), t-PA
recombinante (rt-PA), sus variantes
r-PA, n-PA y
TNK-t-PA, y fragmentos y mutantes de
los mismos que tienen actividad de activador del plasminógeno.
12. La proteína de fusión de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende el precursor
de la proteína surfactante B (SP-B) fusionado en el
extremo N-terminal al u-Pa de cadena
doble de bajo peso molecular
(LMW-u-PA), como se muestra en la
SEC ID Nº 19 y en la SEC ID Nº 20, respectivamente.
13. La proteína de fusión de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, que comprende la proteína
surfactante madura B (SP-B) fusionada al
u-Pa de cadena doble de bajo peso molecular
(LMW-u-PA), como se muestra en la
SEC ID Nº 25 y en la SEC ID Nº 26, respectivamente.
14. La proteína de fusión de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, que porta una marca de afinidad proteica o
peptídica en su extremo N y/o en su extremo C.
\newpage
15. Una secuencia de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de
fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Una composición farmacéutica que comprende
una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones
1-14.
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