PT97604A - Processo para a preparacao recombinante de hirudinas - Google Patents

Description

FARMITALIA CARLO EKBA S.R.L. "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO RECOMBINANTE DE HXRUDINAS" A presente, invenção refere-se â preparação de hirudi-na que foi isolada e originalmente a partir de Sanguessuga Hiru-do medicinalis assim como para a preparação dos seus derivados.

Os péptidos anticoagulantes mais comuns são provaval-mente os que pertencem à família das hirudinas. A hirudina, inicialmente isolada a partir de sanguessuga medicinal, Hirudo medicinalis , é um polipep.tído bem conhecido e bem caracterizado inibidor da traiibina 1,2. Mais especialmente, esta liga-se com a trombina por interacções iônicas, portanto, impedindo a cisão do fibrinogénio com formação de fibrina e a subsequente formação do coagulo de fibrina. Estudos em animais com hirudina demonstraram a eficácia desta para impedir a trombose venosa, a oclusão de desvio vascular e a coagulação intravascular disseminada induzida pela trombina. Alem disso, a hirudina exibe bai xa toxicidade, pouca ou nenhuma àntigenicidade e tem um tempo „ 3 de aepuraçao muito curto na circulação .

As três variantes naturais da hirudina são conhecidas. A sequência duma primeira variante designada por HVl foi determinada por Dodt fet al, FEBS 165, 180-184, (1984), A sequência de HVl ê, de acordo com o codigo de tris letras, (Eur. J. Biochem. Ή8, 9-37, 1984):

Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Vai-Cys-Gly-Gln-Gly—Asn-Lys-Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Xle-Pro- -2

Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln,

I

so3H A segunda variante designada por HV2, foi descrita por Dodt et al, Biol. Chem. Hope-Seyler 367, 803-811, (1986). A HV2 difere da HV1 nos aspectos seguintes; Xle na posição 1 em substituição de Vai; Thr na posição 2 em substitui ção de Vai: Lys na posição 24 em substiuição de Gin; Asn na posição 33 em substituição de Asp; Lys na posição 35 em substitui ção de Glu; Gly na posição 36 em substituição de Lys; Asn na po sição 47 em substituição de Lys; Glu na posição 49 em substitui ção de Gin e Asn na posição 53 em substituição de Asp. A terceira variante designada por HV3, foi descrita por Harvey et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1084-1Q88 (1986). A HV3 i idêntica ã HV2 nas posições de 1 a 32 e então difere da HV1 nos seguintes aspectos: Gin na posição 33 em substituição de Asp; Lys na posição 35 em substituição de Glu; Asp na posição 36 em substituição de Lys; Gin na posição 53 em substituição de Asp; Pro na posição 58 em substituição de Glu; Asp na posição 62 em substituição de Glu; Ala na posição 63 em substituição de Tyr (SO^H); Asp na posição 64 em substituição de Leu e Glu na posição 65 em substituição de Gin. A nova via para a preparação de hirudinas e polipeptí dos semelhantes a hirudina foi agora planeada. Esta via ê basea da na síntese química de uma sequência nucleotidíca que codifica uma hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina e â expressão da hirudina ou do polipeptído semelhante a hirudina em organismos recombinantes. A cultura de organismos modificados geneticamente conduz ã produção do produto pretendido que apresenta actividade biolõgica total.

Deste modo, a presente invenção proporciona um vector de expressão que contém uma sequêcia de DNA que codifica uma hi rudina ou um polipeptído semelhante a hirudina. A presente invenção proporciona ainda um hospedeiro transformado com um vector de expressão compatível de acordo com a presente invenção e também proporciona uma DNA sintético que codifica uma hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina. Um fragmento de DNA que codifica uma hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudi na pode ser de cadeia dupla ou de cadeia simples.

Um hospedeiro em que uma hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina estã apto a ser expresso é preparado mediante a transformação de um hospedeiro com um vector de expressão compatível com a presente invenção. 0 vector de expressão ê geralmente preparado por: (a) síntese química de DNA que codifica uma hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina; e (b) a inserção do referido DNA num vector de expressão.

Uma hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina ê consequentemente preparado por obtenção de um hospedeiro trans formado de acordo com a presente invenção sob tais condições que a hirudina ou o polipeptído semelhante a hirudina é expresso ne£ ta. A hirudina ou o polipeptído semelhante a hirudina pode depois ser isolado. Neste sentido, pode obter-se sob a forma pura uma hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina, 0 termo "uma hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina" como aqui se utiliza, refere-se a hirudina nas suas formas naturais HV1, HV2 e HV3, assim como aos seus derivados, por exemplo, por meio de substituições de aminoãcidos, delecções, inserções, extensões, funcionalização e modificações químicas. Esta invenção, pode, portanto, ser aplicada a derivados de HVl, HV2 ou HV3, exibindo actividade antitrombina. A sequência de aminoâcidos HVl, HV2 ou HV3 pode ser modificada por uma ou mais substituições, inserções e/ou delec-ções de aminoâcidos ou por uma extrusão em qualquer das suas ex tremidades. Um derivado composto de uma sequência destas modifi cada deve evidentemente também exibir actividade antitrombina. Tipicamente, existe um grau de homologia de 75% ou mais entre a sequência de aminoâcidos de HVl, HV2 ou HV3 e a sequência de aminoâcidos de um seu derivado. 0 grau de homologia pode ser 85% ou mais, ou 95% ou mais.

Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoâcidos da se quência de HVl, HV2 ou HV3 podem ser substituídos ou delectados ou podem ser inseridos um ou mais resíduos de aminoâcidos adicionais . 0 carácter fisicoquímico da sequência original pode ser hidrofobicidado/hidrofilicidado, dimensão e configuração.

As substiuições candidatas, baseadas no cõdigo de uma letra (Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984): A para G e vice versa, V por A, L ou G; K por R; S por T e vice versa; E por D e vice versa; e Q por N e Vice Versa.

Tanto quanto as extensões estão em causa, pode ser pro porcionada em qualquer dos terminais uma sequência curta até 50 resíduos de aminoãcido. A sequência pode ter ate 30, por exemplo, atê 20 ou atê 10 resíduos de aminoãcido, A hirudina ou o polipeptído semelhante a hirudina podem ser submetidos a uma ou mais modificações pos-translacio-nais tais como glicosilação, sulfatação, amidação CQOH, acila-ção ou alterações químicas da cadeia polipeptídica. O resíduo Tyr na posição 63, por exemplo, pode ser sulfatado» Uma hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina recombinantes obtidos de acordo com esta invenção não são normalmente sulfatados nesta posição, diferentemente de HVl, HV2 ou HV3 naturais. Alem disso, a presente invenção pode ser aplicada â produção de deri_ vados de peso molecular menor que não têm as porções N-terminal ou C-terminal de HVl, HV2 ou HV3. A presente invenção ê aplicável particularmente â pro dução de HVl e de um derivado de HVl composta dos primeiros 46 resíduos de HVl seguida por uma sequência de aminoãcidos do resíduo 47 a 65 da variante HV2: HVl:

Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-

Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu-

Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-

Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-

Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln

Hybrid HV1/HV2 (designado HV12):

Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-

Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu-

Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-

Pro-Asn-Pro-Glu-Ser-His-Asn-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Xle-Pro-

Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln em que a sequência sublinhada constitui a fracção de Hy2, o polipeptído HV12, como descrito anteriormente e os seus derivados

constituem um outro aspecto da presente invenção

As hirudinas e os polipeptídos semelhantes a hirudinas são preparados por. tecnologia da recombinaçao de DNA. Prepara-se um gene sintético codificador de uma hirudina ou de um polipeptí do semelhante a hirudina. A sequência de DNA codificadora não inclui tipicamente introns. 0 gene sintético é inserido num vector de expressão apto a dirigir a produção do produto de recombinaçao. 0 gene sinte tico é habitualmente preparado por síntese química de oligonucleõ tidos que, no total, correspondem ao gene pretendido. Os oligonu cleôtidos são depois reunidos para se obter o gene. 0 gene pode, portanto, ser construído a partir de quatro oligonucleotidos sintetizados por via química representando, cada um, cerca de metade de uma cadeia de um gene de DNA de cadeia dupla. Os oligonucleotidos são ligados e circularizados para se obter o gene pretendido. Se apropriado, a sequência genética pode ser modificada por mutagênese de sítio dirigido para se introduzir uma ou mais alterações de codão. Habitualmente, é cons truído um gene com sítios de restrição em cada extremidade a fim de facilitar a sua manipulação subsequente.

Uma sequência de DNA preferida codificadora de HV1 esta representada na figura 1 dos desenhos acompanhantes. A sequência de DNA preferida codificadora de HV2 está representada na figura 3. Qualquer das sequências pode ser modificada para codificar para um derivado.

Pode proporcionar-se uma sequência de DNA que codifique também um piptido leader. 0 péptido leader ê capaz de orientar a secreção, da hirudina ou do polipeptído semelhante a hirudina, das células, em que a hirudina ou o polipeptído semelhante a hirudina deve ser expresso. A sequência que codifica o péptido leader ê normalmente fundida na extremidade 5 da sequência de DNA que codifica a hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina, 0 pêptido leader ê, de preferência, o pêptido leader OmpA quando se requer a expressão num hospedeiro bacteriano, tal como, E. coli. 0 pêptido leader ê, de preferencia, a proteína G do vírus de estomatite vesicular (proteína VSV G) quando a expressão. se destina a células de insecto. As sequências de DNA apropriadas que codificam OmpA e a proteína leader VSV G estio representadas nas Figuras 5 e 8, respectivamente.

Uma sequência de DNA pode ser proporcionada a qual codifica uma proteína de fusão que ê cindível para libertar uma hi rudina ou um polipeptído semelhante a hirudina. Pode ser utiliza da uma sequência de DNA que codifica uma sequência polipeptidica veicular ligada via uma ligação cindível a um terminal-N de uma hirudina ou de um polipeptído semelhante a hirudina. A ligação cindível pode ser uma ligação cindível por brometo de cianoginio.

Para a expressão de um polipeptído de hirudina ou seme lhante a hirudina, constrói-se um vector de expressão que contêm uma sequência de DNA que codifica um polipeptído de hirudina ou semelhante a hirudina e que é capaz da expressão da hirudina ou do polipeptído semelhante a hirudina quando proporcionado num hospedeiro apropriado. São fornecidos elementos de controlo tran£ cricional e translacional apropriados que inclui um promotor para a sequência de DNA, um sítio de terminação da transcrição e co does de início da tradução e de paragem. A sequência de DNA ê pro porcionada na cadeia correcta de tal forma que permite a expressão de polipeptído em um hospedeiro compatível com o vector.

Habitualmente, o vector de expressão contêm uma origem de replicação e, se apropriado, um gene marcador seleccionãvel tal como um gene de resistência a um antibiótico, Operacionalmen te, liga-se um promotor a sequência de DNA que codifica um poli-peptído de hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina. 0 vector de expressão pode ser um plasmido. Neste caso, preferencialmente, o promotor ê escolhido entre os promotores Pt3rp e Plcc/lac' 1;Í9aâo operacionalmente â sequência de DNA. Alternativamente, o vector de expressão pode ser um vírus, 0 vírus pode ser um baculovírus recombinante em que o promotor de polihedrina i ligado de forma operacional à sequência de DNA que codifica uma hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina.

Um vector de expressão capaz de exprimir hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina, pode ser preparado de qual quer modo conveniente. Um fragmento de DNA que codifica hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina pode ser inserido num sí tio de restrição apropriado num vector de expressão, por exemplo, num vector plasmídico. Pode preparar-se o baculovírus recombinan te por: (i) clonagem de um gene que codifica um polipeptído de hirudina ou semelhante a hirudina ou um vector de transferência de baculovírus no sítio de restrição a jusante do promotor de poli-hedrina; e (ii) co-transfecção de células de insectos susceptíveis de infectarem baculovírus com o vector de transferência recombinante preparado na fase (i) e DNA de baculovírus do tipo natural intacto.

Ocorre recombinação de homologus, resultante num baculovírus recombinante comportando um gene de hirudina ou um gene que codifica um polipeptído idêntico a hirudina a jusante do pro motor de polihedrina. 0 vector de transferência de baculovírus pode ser um contendo um sítio de clonagem único a jusante do cõ-dão de iniciação ATG de polihedrina. 0 produto que em seguida é expresso pelo baculovírus recombinante resultante serã uma proteína de fusão em que uma porção N-terminal de proteína de poli-hedrina se fundiu com o N-terminal de uma hirudina ou de um poli peptído idêntico a hirudina. Como indicado anteriormente, pode ser proporcionado uma ligação de clivagem na junção da fusão.

As células de insecto empregadas na fase (ii) são tipicamente células de Spodoptera frugipe rda. O baculovírus de tipo natural ê tipicamente um vírus de poli-hedrose nuclear Autographa californica (AcNPV).

Um vector de expressão que codifica uma hirudina ou um polipeptído semelhante a hirudina e proporcionado num hospedeiro apropriado. As células são transformadas com o gene para uma hirudina ou para um polipeptído idêntico a hirudina. Ê proporcionado uma hospedeira transformada sob tais condições que a hirudina ou o polipeptído idêntico a hirudina são expressos nesta. As cêlu las transformadas, por exemplo, são cultivadas de tal forma que permite a ocorrência da expressão.. Qualquer sistema vectorial hos pedeiro compatível pode ser utilizado. A hospedeira transformada pode ser uma hospedeira euca-riõtica ou procariõtica. Pode-se utilizar uma hospedeira bactéria na ou de levedura, por exemplo de E, coli ou de S, cerevisiae. Po de utilizar-se uma bactéria gram-positiva. Um hospedeiro bactéria i ..... no preferido é uma estirpe da' EV coli do tipo B. As células de in secto podem ser utilizadas alternativamente e neste caso o sistema de expressão baculovírus é o apropriado. As células de insecto são tipicamente células de Spodoptera frugiperda. Como uma outra alternativa, podem ser transformadas células de uma linha de célu las de mamífero. Pode-se proporcionar um animal transgênico, por exemplo, um mamífero não humano em que ê produzida uma hirudina ou um polipeptído idêntico a hirudina. A hirudina ou o polipeptí do idêntico a hirudina que ê expresso podem ser isolados e purificados.

Pode-se utilizar a hirudina ou o polipeptído semelhante a hirudina preparado de acordo com a presente invenção em com posições farmacêuticas conjuntamente com um veículo ou axcipien-te aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Uma composição destas ê habitualmente para administração endovenosa e neste caso o veículo ê, de um modo geral, uma solução de cloreto estéril ou água de pureza aceitável. A hirudina, ou o polipeptído semelhante a hirudina preparados de acordo com a presente invenção, constitui uma anti-trombina e ê apropriado para o tratamento de eventos tromboembõlicos tais como a coagulação do sangue, normal mente num doente humano. Num aspecto da presente invenção, administra-se a hirudina ou o polipeptído idêntico a hirudina conjun tamente com um activador do plasminogénio, tal como o activador . do plasminogénio de tecido. A hirudina, ou o polipeptído semelhan te a hirudina preparado de acordo com a presente invenção, tem-se verificado ser compatível com este ultimo.

Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção.

Nos desenhos acompanhantes; A Figura 1 apresenta a sequência nucleõtidica de quatro oligonucleõtidos que codificam para a maior parte da cadeia de hirudina HVl. A sequência sublinhada indica o sítio Bali que tem sido utilizado para construções posteriores,. A parte inferior da figura mostra o modo de reunião dos quatro oligonucleõtidos.

Para permitir posteriores manipulações foram incluídos -11-

sítios Hindlll e PstI, A Figura 2 representa q Esquema da construção do pias mxdo intermédio M13-HV1, que e origem de um fragmento de DNA Ball-BamHl para posteriores construções, A Figura 3 representa a sequência nucleotidíca de quatro oligonucleõtidos que codificam a maioria da cadeia de hiru-dina HV12. A sequência sublinhada indica o sítio Bali que tem sido utilizado para construções posteriores, A parte interior da figura mostra o modo de reunião dos quatro oligonucleõtidos. E foram incluídos os sítios Hindlll e PstI para manipulações sub sequentes. A Figura 4 representa o Esquema da construção do plas-mído intermédio M13-HV12 que é origem de um fragmento de DNA BalI-BamHI para todas as construções de hirudina subsequentes. A Figura 5 apresenta esquematicamente a construção de novos M13s recombinantes designados por 0MP-HV1 e 0MP-HV12 que transportam respectivamente o gene completo de HVl e o gene completo de HV12 ligado ao péptldo leader OmpA. A sequência peptídi ca leader estã sublinhada duas vezes enquanto que a extremidade cortada Bali ou a extremidade coincidente Hindlll estão sublinha das apenas uma vez. A Figura 6 apresenta esquematicamente a construção de pFC-HVl e pFC-HV12 que são os plasmidos utilizados para a produção de HVl e HV12 em E. coli. A Figura 7 representa a estrutura geral do plasmido pOMP-HVl utilizado para a produção de hirudina em E« coli. Utili zaram-se técnicas de manipulação genética tradicionais para preparar este novo plasmido em que o gene de hirudina esta sob o controlo transcricional do promotor hibrído P^pp/lac' Aind-a nes“ te caso, o péptido leader OmpA conduz a secreção de hirudina pa- -12-

ra o periplasma de E, coli. A Figura 8 mostra a sequência nucleotidica e a reunião de oligos sintéticos utilizados para a secreção de hirudi na de células de insectos. A sequência sublinhada indica o pe£ tido leader da proteína VSV G. A Figura 9 ê a representação esquemática da construção de um novo M13 recombinante, designado por VSV-HV12 em que o gene completo estã ligado ao peptldo leader da proteína VSV G. A Figura 10 mostra a construção esquemática de pAc--HV12 que tem sido utilizada como vector de transferência para o genoma de baculovlrus pAcYMl e o plasmídeo inicial utilizado correntemente como um aceitador de sequências heterologas para serem transferidas para o. vírus. A Figura 11 mostra a sequência nucleotidica e a reunião de oligos sintéticos que codificam para a iniciação da ca deia de hirudina. O codão ATG que codifica o resíduo metionina adicional estã sublinhado. A Figura 12 mostra esquematicamente a construção de pAcFTl que tem sido utilizada para a expressão intracelular de hirudina. A Figura 13 é a representação esquemática dos novos plasmldeos de transferência designados por pAcFTl e pAcFTl--HV12, que transportam, respectivamente, as sequências de HVl e HY12 completas ligadas aos primeiros dezoito aminoãcidos de polihedrina. Estes plasmldeos têm sido utilizados para transferir a sequência heterologa para o genoma de baculovlrus.

Exemplo 1: Síntese química dos genes de HVl e Hyl2

As sequências codificadoras de nucleotido foram desi£ „ ..........4 nadas com base nos codoes preferidos de Escherichia coli «

Alem disso, foi construído por técnicas de genética um sítio de restrição Bali muito próximo da extremidade 51 dos genes sintéticos para permitir a inserção de sequências codifi cadoras em diferentes vectores de expressão.

De facto, os mesmos genes sintéticos foram utilizados para a expressão em células bacterianas e de insectos. No caso de células de insecto os métodos foram desenvolvidos para produzirem produtos segregados ou citoplãsmicos.

Todas as manipulações de DNA plasmídico foram realiza 5 das como descrito por Maniatis et al .

Foi sintetizado o gene HVl e reunião do seguinte modo: quatro oligonucleõtidos complementares sintéticos foram prepara dos através da aplicação de um sintetizador de DNA automático (Applied Biosystems) e a sua sequência esta representada na Figura 1. Apõs a fosforilação enzimâtica dos quatro oligos foram reunidos utilizando-se DNA ligase e a sequência de dupla cadeia resultante foi inserida no vector fãgico M13, mpl8, obtendo-se o plasmídeo recombinante M13-HV1 que esta representado na Figura 2.A fim de permitir a inserção do gene da hirudina no vector M13 foram adicionados também sítios HindIII e PstI nos oligos sintéticos. A sequência nucleõtidica correcta foi verificada pelo g método de Sanger na cadeia unica do DNA fagido .

Foi utilizado o plasmido recombinante M13-HV1 como fonte do gene HVl para todos os vectores de expressão utilizados nos Exemplos, 0 gene HV12 foi sintetizado e reunido da mesma manei- ra. Os oligos utilizados para reunir o gene estio representados na figura 3. Os oligos 3 e 4 codificam para aminoãcidos diferen tes dos oligos 3 e 4 da Figura 1. Na Figura 3 estã representado o plasmído recombinante M13-HV12 obtido.

Exemplo 2: Expressão e secreção da hirudina de células de E« coli A fim de se obter a secreção no periplasma do produto recombinante ê necessário sintetizar as moléculas de HV1 e HV12 cada uma na forma de uma pré-proteína. Mais particularmente, deve estar presente, uma sequência de aminoãcidos designada por "péptido leader" responsável por uma secreção eficiente na extremidade NH^ de HVl ou HV12 ' . Esta sequência extra i depois separada in vivo, durante a secreção, por uma peptídase leader «r de E. coli específica, produzindo a sequência madura correcta .

Na bibliografia foram descritos muitos exemplos de si£ temas secretores10'11. Entre estes seleccionou-se o sistema com base no sinal de secreção da proteína de membrana mais externa 12 de E. coli (OmpA) publicada anteriormente .. Portanto, designaram-se dois oligonucleotidos complementares adicionais que codi_ ficam para o pêptido leader OmpA precedido por uma sequência

OmpA Shine-Dalgarno conhecida por ser responsável pela tradução 13 eficiente do RNA mensageiro A sua sequência, representada na Figura 5, inclui tam bêm a iniciação do gene HVl que codifica para os primeiros dez aminoãcidos. A presença do sítio Bali permitiu a junção desta peça sintética ao resto da sequência codificadora de Hyi enquan to que a presença do sítio HindIII a montante permitiu a ligação correctora M13, Portanto, α fragmento sintético Hindm--Ball foi ligado a uma peça BalI-BamHI de M13-HY1 e inserido em -15

Ml3mpl8 obtendo-se trai novo plasmído designado por 0MP-HV1, A representação esquemática desta nova construção plasmidica também esta representada na Figura 5« Manipulações equivalentes partindo de M13-HV12 fornecerem 0MP-HV12 (Figura 5) . A partir de 0MP-HV1 pode ser excisado o gene de hiru dina sob a forma de um fragmento HindIII-BamHI que codifica pa ra OmpA Shine-Dalgarno e peptído leader seguido por uma sequên cia codificadora de hirudina, Este fragmento restrição está de novo pronto para ser inserido no vector de expressão apropriado.

Teoricamente, podem ser utilizados vários sistemas de expressão para se obter uma produção elevada de proteínas hete- rõlogas nas bactérias. 0 sistema com base no promotor P ' tem trp sido utilizado com êxito no laboratõrio, no passado . De novo, no caso do promotor escolhido, os níveis de expressão de um dado polipeptído não se podem prever. 0 uso do promotor P^· para 9 a expressão de hirudina nunca foi referido atê ao presente momen to, / 0 plasmido pFC33, representado na Figura 6, jã tem sido citado na bibliografia (13). Este transporta a resistência ã ampícilina e o promotor bacteriano , que orienta a expressão de proapolipoproteína Al. Apõs a digestão de pFC33 com HindIII e BamHI foi isolado o grande fragmento HindIII-BamHI transportando o gene da resistência ao antibiótico e o promotor e ligado com o fragmento HindIII-BamHI de QMP-HV1 ou de 0MP-HY12 que codifica para a hirudina HV1 ou para o seu derivado HV12, Os pormenores desta construção estão apresentados na Figura 6. ISO laram-se novos plasmídos designados por pFC-HVl e por pFC-HVl2 -16- que sao os plasmidias finais para a produção de Hyl de HV12 em E. coli. 0 objectivo principal da presente invenção ê a utilização das estirpes de E. coli do tipo B para a expressão e secreção no periplasma de hirudina e seus derivados. De facto, ve rificamos que a inserção do plasmídio pFC-HVl em estirpes do ti po B da bactéria E. coli confere uma grande produção de hirudi na, É interessante que diferentes estirpes de EY coli não são tão eficientes e, portanto, parece que o tipo de estirpe hospedeira é crucial para o sucesso da produção de hirudinas.

Estão disponíveis vários tipos de estirpes B de E, coli e podem ser utilizadas para a produção de uma hirudina ou de um polipeptído idêntico a hirudina. As estirpes preferidas são ATCC 12407, ATCC 11303, NCTC 10537. Em seguida apresenta-se um exemplo da transformação da estirpe NCTC 10537 com o plasmídio pFC-HVl e subsequente cultura da transformante.

Foram preparadas células competentes da estirpe NCTC 10537 utilizando-se o processo do cloreto de cálcio de Mandei 14 e Higa . Transformaram-se aproximadamente 200 μΐ de uma prepa ração destas células na concentração de 1x10® células por mili litro, com 2 pl do DNA plasmídico (concentração aproximada 5

As transformantes foram escolhidas em placas de L--agar contendo 100 jjlg/ml de ampicilina. Duas pequenas colónias foram inoculadas com palhetas de 1a para dentes (cada uma ao longo de 1 cm aproximadamente) em L-agar contendo o mesmo antibiótico, Após 12 horas de incubação ã temperatura de 37°c foram retiradas algumas porções dos sulcos e testadas para a produção de hirudina por inoculação em 10 ml de meio LB (contendo ampici-

lina com uma concentração de 150 pg/ml) e incubadas durante a noite â temperatura de 37°C. No dia seguinte, as culturas foram diluídas 1:100 com um meio M9, contendo a mesma concentração em ampicilina, e incubaram-se de novo durante 6 horas ã temperatura de 37°C.

Centrifugaram-se 20 ml desta cultura a L2Q0Q x g â temperatura de 4 C, durante 10 minutos. Resuspendeu-se o aglomerado bacteriano em 2 ml de 33 mM HC1 Tris pH 8; em seguida, adicionou-se igual volume, de uma segunda solução de 33 mM EDTA, sacarose a 40% e incubou-se a mistura total sob condições de agitação moderada â temperatura de 37°C, durante 10 minutos.

Apõs centrifugação, resuspenderam-se as células permeabilizadas em 2 ml de água arrefecida e abandonaram-se durante 10 minutos sobre gelo. O sobrenadante resultante foi isolado por centrifugação representando a fracção periplasmãtica da célula bactéria na.

Utilizando-se um ensaio cromogénico que ê baseado na inibição da capacidade da trombina para cindir um substrato sin 15 tético S-2238 , mediu-se a presença da actividade anti-trombi- na na fracção periplasmãtica das células produtoras de hirudina. Nestas amostras, a actividade de hirudina apresentou-se com um valor aproximado de 50 pg/ml. Esta actividade não se apresentou nas fracções periplasmãticas de controlo. No caso de pFC--HV12, a produtividade da hirudina na variante HV12 foi equivalente a 80 pg/ml.

Com aproximação semelhante também se construiu um novo plasmidio de expressão/secreção para hirudina em que o pro-16 motor pippy]_ac estã presente em substituição do promotor ptrp* Este plasmidio diferente designado por pOMP-HVl estã represen- -18-

tado na Figura 7, Após a inserção deste plasmidio em estirpes E. coii do tipo B, obtiveram-se também grandes níveis de hiru-dina activa (40-80 jig/ml) . Como plasmídio de iniciação para a construção de pOMP-HVl utilizou-se o plasmídio pIN-lll-ompA3 descrito por Ghrayb et al^. As condiçoes para cultura e indução da expressão com isopropil-^-D-tiogalactopiranosido (IPTG) foram descritas anteriormente^.

Exemplo 3: Actividade anti coagulante de HVl recombinante obtido em E. coli A actividade anticoagulante da variante de hirudina HVl também foi testada num teste de determinação do tempo de tromboplastina parcial activada e no teste tempo de trombina (T.T.). Ambos os testes se realizaram num coagulômetro automático, ACL300 Research, Instrumentation Laboratory, Milão, Itália.

Adicionaram-se a plasma humano citratado normal, con centrações crescentes de hirudina HVl produzida por via recombinante. As amostras foram em seguida analisadas num coagulôme tro automático permitindo a determinação dos tempos de aPTT e T.T. mediante a adição automática ao plasma de reagentes apropriados e registo da velocidade de formação do coágulo. 0 tempo aPTT foi determinado aplicando-se cefalina e cloreto de cãl cio (reagente APTT automatizado, General Diagnostic, USA) e o T.T. foi determinado com trombina humana (.Fibrindex, Qrtho Diaç[ nostic, Milão, Itália) na concentração de 50 V,I./ml. Prepararam-se os reagentes, concentraram-se e aplicaram-se de acordo com as instruções dos preparadores.

Os tempos de coagulação obtidos nos testes aPTT e T,T, foram colocados versus concentrações da proteína recombinante.

Em cada teste, calcularam-se as concentrações que duplicaram os tempos de coagulação relativos a um plasma normal, 0 valor obti do para o teste aPTT foi de 210 ng/ml e para o teste T.T. 90 ng/ /ml.

Exemplo 4; Expressão e secreção de HV12 em células de jnsectos

Para se obter a secreção de HV12 de células de insec-tos, juntaram-se a sequência codificadora de HV12 com um peptido leader que ê eficaz em reconhecer estas células. Utilizou-se o peptido leader da proteína G do vírus da estomatite Vesicular (VSV) . A utilização desta sequência para a produção de hirudi-na e dos seus derivados em células de insecto nunca fora referi da. Identicamente ao descrito anteriormente, preparou-se uma se quência de DNA sintética codificadora para o peptido leader da proteína G (VSV) seguida por a iniciação do gene de HV12 e a sequência nucleotídica esta representada na Figura 8. Também neste caso se proporcionaram sítios de restrição convenientes, Indlll, BamHI e Bali para permitir a junção ou o resto do gene de HV12 e para o vector de expressão. O fragmento sintético HindITI-BalI foi unido com um fragmento purificado BalI-BamHI de M13-HV12 transportando o gene HV12 e inseriu-se em Ml3mpl8 preyiamente cortado com Hindlll e BamHI, Esta construção que gerou um novo plasmídio designado por VSV-HV12 esta esquematicamente representada na Figura 9, De VSV--HV12 excisou-se um fragmento de DNA BamHI-BamHI transportando o gene HV12 unido com o peptido leader VSV que tinha sido então in -20- -20-

18 serido no vector pAcYMl , como se representa na Figura 10. 0 plasmídio resultante foi designado por pAc-Hyi2.

Para se obter a expressão em células de insectos, a sequência codificadora VSV-HV12 teve que ser transferida para o genoma de baculovírus sob o controlo transcricional do promo tor de poli-hedrina. Para este fim, co-transfectaram-se células de insecto com um DNA de baculovlrus do tipo natural e com um vector de transferência pAc-HV12. Como células de insecto, escolheram-se as células de Spcdoptera frugiperda para servirem como células hospedeiras. Os pormenores experimentais são. os se guintes:

Transfectarara-se células S. frugiperda com uma mistura de DNA AcNPV infeccioso e DNA plasmídio representando os vectores de transferência recombinantes individuais por uma mo- 19 dificaçao do processo descrito por Summers et al . Misturou-se um micrograma de DNA virai com 25-100 jig de DNA plasmídico e precipitou-se com (concentrações finais) cloreto de cálcio 0,125M na presença de 20 mM de tampão HEPES, pH 7,5, 1 mM de hidrogeno-ortofosfato dissédico, 5 mM de cloreto de potássio, 140 mM de cloreto de sõdio e 10 mM de glucose (volume total 1 ml). A suspensão de DNA foi inoculada numa monocamada de 10 células S. frugiperda numa placa de cultura de tecidos de 35-mm deixando-se absorver as células durante 1 hora ã tempera tura ambiente e em seguida substitui-se com 1 ml de meio. Apôs incubação ã temperatura de 28°C, durante 3 dias, recolheram-se os líquidos sobrenadantes e utilizaram-se para a produção de pia cas em monocamadas de células de S. frugiperda. As placas conten do o vírus recombinante foram identificadas pela sua ausência de pollhedra quando examinadas ao microcõspio, 0 vírus destas pia- cas foi recuperado e, apõe posterior purificação da placa/ foi utilizado para produzir estoques de. vírus negativos a poli-hedri na. 0 processo descrito anteriormente permitiu isolar um baculovírus recombinante cujo genoma transportava o gene HV12 sob o control do promotor de poli-hedrina e do pêptido leader da proteína VSV G. Utilizou-se este vírus para infectar células 19 de S. frugiperda por processos bem reconhecidos , numa multipli cidade de infecção de 10, As células infectadas foram em seguida cultivadas numa cultura giratória ou em monocamadas na presença - 19 de soro de vitela fetal a 10% de acordo com métodos publicados Em diferentes momentos após a infecção avaliou-se a actividade antitrombina (ATU) no sobrenadante utilizando-se o ensaio cromo-génico S-2238. 0 Quadro seguinte resume os resultados:

Quadro; ACTIVIDADE DE HIRUDINA ATU/10^ células tempo' pós-infecção 0 horas 24 horas 48 horas 72 horas Cultura Spinner 0,8 0,9 1,4 1,8

Monocamadas 0,8 0,8 2,0 5,1

Exemplo 5: Expressão de HVl e ffyl2 em citoplasma de células de insecto A hirudina e os seus derivados podem também ser produzidos e acumulados no citoplasma de células de S« frugiperda. Esta via geralmente fornece um rendimento melhor de proteínas hete-rôlogas, uma vez que utiliza sinais de expressão de poli-hedrina -22- que e uma proteína virai não segregada.

Esta via, para se obterem grandes quantidades de Hyi e HV12 recombinantes, tem como base a expressão de um polipeptí do de fusão em que os primeiros 18 aminoãcidos da. poli-hedrina estão ligados na cadeia com 65 aminoãcidos de Hyi ou HV12, a pre sença da sequência da extremidade NE^ de poli-hedrina permite grandes níveis de expressão^. Alem disso, entre a fracção de po li-hedrina e a sequência de HVl ou HV12 colocou-se um resíduo me tionina que permite a libertação da fracção de HVl ou de HV12 me diante o tratamento da proteína híbrida com cianeto de bromo.

Identicamente âs vias anteriores, preparou-se um fragmento de DNA sintético que permite a ligação do fragmento Ball--BamHl de M13-HV1 ou M13-HV12 a um vector de transferência apropriado. A nova peça sintética, apresentada na Figura 11, também inclui os sítios BamHI e Bali para manipulações subsequentes.

Obteve-se um vector de transferência diferente, pAcFTl, transportando a sequência nucleotidíca codificadora para os 18 aminoãcidos de poli-hedrina (Figura 12). Resumidamente, o frag- 18 mento EcoRV-BamHI de pAcYMl tinha sido substituído por um oli-gonucleõtido sintético contendo a sequência do gene de poli-hedri na do nucleõtido -92 até ao nucleõtido +55. Depois desta sequência estava presente um sítio conveniente de BamHI e foi utilizado para a inserção da sequência codificadora completa de HVl ou HV12 de acordo com o esquema representado na Figura 13. Através desta construção obtiveram-se dois plasmídios, designados por pAcFTl--HVl e pAcFTl-HV12, que tinham sido utilizados para transferir os genes híbridos para o genoma de baculovírus,

Obtiveram-se os baculovírus recombinantes como descrito no Exemplo 4. A infecção de células SV frugiperda. foi realizada de acordo com processos convencionais19, A cultnra de células de insectos infectadas conduziu â acumulação no citoplasma da proteína de fusão. Esta proteína híbrida foi a fonte de HV1 ou HV12 recombinantes, Estão disponí veis vários métodos na bibliografia que se podem utilizar para 21 22 ~ separar o híbrido com brometo de cianogênio 1 « A aplicação _ 22 do método de Olson et al , tem permitido a obtenção de HVl e HV12 de sequências polipeptídicas correctas. Estas duas moléculas desempenham actividade anti-trombina. -24- -24-

REFERÊNCIAS 1) Markwardt, F. 1970, Methods in Enzymology, JL9, p. 924 2) Markwardt, F. 1985, Biomed. Biochim. Acta. 44, p. 1007 3) Markwardt, F. Hauptmann, J., Nowak, G., Klessen, C., and Walsmann, P. 1982. Thromb. Haemostasis 47, p. 226. 4) Grosjeans H. and Fiers W. 1982. Gene, 18, p. 199

5) Maniatis T., Fritsch E.F. and Sambrook J. 1982. Cold Spring Harbor, NY 6) Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, p. 5463. 7) Blobel G. and Dobberstain B. 1975. J. Cell Biology, 67, p. 83 8) Pages J.M. 1983, Biochimie, 65/ p. 531 9) Wolfe P.B. 1983. J. Biol. Chem. 2£8, p. 12073 10) Talmadge K., Stahl S. and Gilbert W. 1980. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, p. 3369 11) Oka T., Sakamoto S., Miyoshi K., Fuwa T., Yoda K., Yamasaki M., Tamura G. and Miyake K. 1985. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, p. 7212 12) Henning V., Royer H.D., Teather R.M., Hindennach I. and Hollenberg C.P. 1979. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, p. 4360 13) Isacchi A., Sarmientos P., Lorenzetti R. and Soria M. 1989, Gene 21/ P· 129 14) Mandei M. and Higa A.J. 1970. J. Mol. Biology, 52/ P· 154 15) Krstenansky, J.K., and Mao, S.J.T. 1987. FEBS Lett. 211. p. 10 16) Ghrayeb J., Kimura H., Takahara M., Hsiung H., Masui Y. and Inouye M. 1984. EMBO Journal 3, p. 2437 17) Bailey, M.J., McLeod, D.A., Kang, C., and Bishop, D.H.L. 1989. Virology 169, p. 323 18) Matsuura, Y., Possee, R.D., Overton, H.A. and Bishop. D.H.L. 1987. J. Gen. Virol. 68/ P· 1233 -25- 19) Summers, M.D., and Smith, G.E. 1987, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 20) Luckow, V.A. and Suminers, M.D. 1988, Virology, 167. p.56 21) Gross E. 1967. Methods in Enzymology, ΐχ, p. 238 22) Olson H., Lind P., Pohl G., Henrichson C., Mutt V., Jornvall H., Josephson S., Uhlen M. and Lake M. 1987, Peptides, 9, p. 301

Claims (16)

1. / -26-

   RE I V INDICAÇÕES Processo para a preparação de um polipeptido semelhante a hirudina de HV12 com a sequência seguinte: Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu- Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu- Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr- Pro-Asn-?ro-Glu-Ser-His-Asn-Asn-Glv-Asp-Phe-Glu-Glu-Tle-?-rn- Glu-Glu-Tvr-Leu-Gln caracterizado pelo facto de utilizar a recombinação de ADN e de incluir a obtenção de um hospedeiro transformado com um vector de expressão compatível que comporta uma sequência de ADN codifi cadora do referido polipeptido semelhante a hirudina de HV12.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo facto de a sequência de ADN codificar também um peptido líder capaz de dirigir a secreção do referido polipepti do idêntico â hirudina das células em que é expresso esse poli£ tido idêntico ã hirudina.
3. 3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, carac-terizado pelo facto de o peptido líder ser OnroA ou o peptido lí der da proteína G de vírus da estomatite vesicular (VSV).
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo facto de a sequência de ADN codificar uma proteína de fusão que é separável para libertar o referido polipepti-do idêntico a hirudina.
5. 5. - Processo.de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo facto de o referido vector de expressão ser um plasmídeo.
6. 6.- Processo de acordo com a reivindicação 5, carac-terizado pelo facto de um promotor seleccionado entre os promotores Ptrp e plpp/lac estar ligado de modo operativo ã referida sequência de ADN.
7. 7.- Processo de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo facto de o referido vector de expressão ser um vírus.
8. 8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracte rizado pelo facto de o vírus ser um baculovírus recombinante, em que o promotor de poli-hedrina está ligado de modo operativo â referida sequência de ADN.
9. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o hospedeiro ser uma bactéria.
10. 10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, carac-terizado pelo facto de a bactéria ser de uma estirpe de E. coli tipo B.
11. 11, - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo facto de o hospedeiro ser um hospedeiro eucariõti-co seleccionado entre leveduras, linhas de células de mamíferos, linhas de células de insectos e animais.
12. 12. - Processo-de acordo com a reivindicação 11, caraç terizado pelo facto de o hospedeiro ser uma linha de células de Spodoptera frugiperda.
13. 13.- Processo de recombinação de ADN para a prepara- * c ção de hirudinas ou de polipeptidos semelhantes ã hirudina, ca-racterizado pelo facto de incluir a obtenção de uma linha de cê lulas de Spodoptera frugiperda transformada com um vector de ex pressão de baculovírus recombinante, o qual contém um promotor de poli-hedrina ligado de modo operativo a uma sequência de ADN codificadora de hirudina ou de um polipeptido semelhante a hiru dina.
14. 14.- Processo de acordo com a reivindicação 13, ca-racterizado pelo facto de a sequência de ADN também codificar um peptido líder, capaz de dirigir a secreção da hirudina ou do polipeptido semelhante à hirudina, das células de Spodoptera frugiperda.
15. 15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, ca-racterizado pe1o facto de o peptido líder ser o peptido líder da proteína G de VSV.
16. 16. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo facto de o polipeptido de hirudina ser hirudina de HVl. Lisboa, 8 de Maio de 1991 fjsnte Ofic.ai a* Proprteaade Inaustrta· >