ES2279010T3 - Proteinas quimericas clivables por trombina. - Google Patents

Abstract

Derivado quimérico clivable por trombina de un cimógeno serina proteasa seleccionado de entre la proteína C o el factor X, caracterizado porque el péptido de activación nativo de dicho cimógeno es sustituido por el fibrinopéptido A, o por una parte del mismo, dicha sustitución generando una secuencia clivable por trombina P10P9P8P7P6P5P4P3P2P1P1''P2''P3'' donde P10P9P8P7P6P5P4P3P2P1 representa los aminoácidos P10 a P1 del fibrinopéptido A y P1''P2''P3'' representa Leu-IIe-Asp o IIe-Val-Gly.

Description

Proteínas quiméricas clivables por trombina.

La presente invención se refiere a las proteínas quiméricas clivables por trombina, particularmente a las proteínas derivadas a partir de la proteína C humana y a partir del factor X humano, y a las utilizaciones terapéuticas de las mismas.

La proteína C (en adelante, en esta memoria, referida como PC) es un factor esencial de un mecanismo principal para la regulación de coagulación, llamado "ruta anticoagulante". La forma activa de la PC (proteína C activada, en adelante referida en este documento como PCa) es una serina proteasa que, cuando se asocia con otro cofactor (proteína S), degrada dos factores de la cascada de coagulación esenciales para la generación masiva de trombina: factores Va y VIIIa. La destrucción de estos factores regula a la baja la cantidad de trombina formada, resultando en un efecto anticoagulante. El factor X (en adelante referido en la presente memoria como FX) es un factor esencial de la cascada de coagulación. La forma activada de FX (factor X activado, en adelante referido en esta memoria como FXa) es la única serina proteasa que, asociada con su cofactor (factor de coagulación Va), es capaz de activar la protrombina a trombina.

La PC es una glicoproteína de 62.000 Da sintetizada en el hígado. Antes de ser secretada en el plasma, su cadena de polipéptidos experimenta varias maduraciones postranslacionales con el fin de convertirse en una proenzima funcional. Estas maduraciones comprenden el clivaje del prepéptido y del propéptido, la \gamma-carboxilación de los primeros nueve glutamatos de la región amino-terminal, la \beta-hidroxilación del aspartato en la posición 71, la glicosilación de 4 residuos distribuidos a lo largo de la secuencia y la escisión del doblete Lys^{156}-Arg^{157}, separando la cadena ligera (amino-terminal) y la cadena pesada (carboxi-terminal), y resultando en la forma madura de la PC. Debido a una escisión incompleta del doblete Lys^{156}-Arg^{157} durante la maduración mediante las células hepáticas, entre el 10% y el 20% de PC plasmático se mantiene en forma de cadena simple. Sin embargo, la forma principal del plasma comprende dos cadenas de polipéptidos que se encuentran conectadas mediante un puente de disulfuro. La cadena ligera de 21.000 Da está compuesta de 155 aminoácidos, comprendiendo un pequeño dominio que alberga los ácidos \gamma-carboxiglutámicos, seguido por dos dominios de tipo Factor de Crecimiento Epidermal (EGF). La cadena pesada de 41.000 Da está compuesta de 262 aminoácidos y representa el futuro dominio catalítico, clasificado en la clase SA de la familia de serina proteasas (Shen y Dahlback, Handbook of proteolytic enzymes: Protein C. Barrett, A. J., Rawlings, N. D., Woessner J. F., eds. Academic Press, Orlando, FL. 1998).

El FX es una glicoproteína de 59.000 Da sintetizada en el hígado. Antes de ser secretada en el plasma, su cadena de polipéptidos experimenta varias maduraciones postranslacionales con el fin de convertirla en una proenzima funcional. Estas maduraciones comprenden el clivaje del prepéptido y del propéptido, la \gamma-carboxilación de los primeros once glutamatos de la región amino-terminal, la \beta-hidroxilación del aspartato en la posición 103, la glicosilación de por lo menos 5 residuos (incluyendo 4 en el péptido de activación) y la escisión del tripéptido Arg_{180}-Lys_{181}-Arg_{182}. A diferencia de la PC, virtualmente todo el FX maduro que circula en el plasma se encuentra en forma de cadena doble, con las cadenas conectadas mediante un puente disulfuro. La cadena ligera de 16.900 Da está compuesta de 139 aminoácidos, comprendiendo un pequeño dominio que alberga los ácidos \gamma-carboxiglutámicos, seguido por dos dominios EGF. La cadena pesada de 42.100 Da está compuesta de 306 aminoácidos y representa el futuro dominio catalítico, clasificado en la clase SA de la familia de serina proteasas (Stenflo, Handbook of proteolytic enzymes: Factor X. Barrett, A. J., Rawlings, N. D., Woessner J. F., eds. Academic Press, Orlando, FL. 1998).

Como la mayoría de los precursores de las serina proteasas, la PC y el FX son cimógenos que carecen de actividad catalítica. La activación de la misma es el resultado del clivaje proteolítico en sus cadenas pesadas. En la PC, este clivaje tiene lugar en el extremo N-terminal de la cadena pesada, liberando un péptido de "activación" de 12 aminoácidos. En el FX, este clivaje tiene lugar entre los residuos Arg_{234} y IIe_{235}, también liberando un péptido de "activación" de 52 aminoácidos.

La secuencia polipeptídica de la cadena pesada y de la cadena ligera de la forma madura de la PC está representada en la Figura 1, y en el listado de secuencias adjunto bajo el número SEQ ID NO:1. Las principales regiones de la PC están indicadas en la secuencia de la Figura 1. La cadena pesada está subrayada. El doblete Lys^{156}-Arg^{157} está representado en caracteres en negrita. El péptido de activación está recuadrado.

La secuencia polipeptídica de la cadena pesada y de la cadena ligera de la forma madura del FX está representada en la Figura 2, y en el listado de secuencias adjunto bajo el número SEQ ID NO:23. Las principales regiones del FX están indicadas en la secuencia de la Figura 2. La cadena pesada está subrayada. El triplete Arg^{180}-Lys^{181}-Arg^{182} está representado en caracteres en negrita. El péptido de activación está recuadrado.

Para localizar los residuos de aminoácidos en relación a la secuencia de la PC, pueden utilizarse diversos sistemas de numeración, y particularmente:

- un sistema de numeración con referencia a la secuencia deducida a partir del ADNc de la PC (Beckman et al., Nucleic Acid Res., 13, 5233-5247, 1995); esta numeración está representada en la Figura 1, bajo la secuencia peptídica;

- un sistema de numeración de residuos de la cadena pesada de la PC con referencia a la numeración de los residuos del dominio catalítico de la quimotripsina (Mathers et al., Embo J., 15, 6822-6831, 1996). Esta numeración, generalmente utilizada para las serina proteasas, está basada en las similitudes topológicas que existen entre estas enzimas, que facilita enormemente la comparación de las mismas. Esta numeración está representada en caracteres en itálica en la Figura 1 bajo la numeración con referencia a la secuencia de ADNc.

Para localizar los residuos de aminoácidos en relación a la secuencia del FX, también pueden utilizarse estos diversos sistemas de numeración, y particularmente:

- el sistema de numeración con referencia a la secuencia deducida a partir del ADNc del FX (Messier et al., Gene, 99, 291-294, 1991); esta numeración está representada en la Figura 2, bajo la secuencia peptídica;

- el sistema de numeración de los residuos de la cadena pesada del FX con referencia a la numeración de los residuos del dominio catalítico de la quimotripsina (Padmanabhan et al., J. Mol. Biol., 232, 1-20, 1993); esta numeración está representada en caracteres en itálica en la Figura 2, bajo la numeración con referencia a la secuencia de ADNc.

Por ejemplo, si la numeración se realiza con referencia a la forma madura de la PC, los residuos Arg y Leu que bordean el sitio de clivaje proteolítico que da lugar a la PCa son identificados mediante las posiciones Arg^{169} y Leu^{170}; si la numeración se realiza con referencia al dominio catalítico de la quimotripsina, estos mismos residuos son identificados mediante las posiciones Arg^{15} y Leu^{16}. De manera similar, si la numeración se realiza con referencia a la forma madura del FX, los residuos de Arg e IIe que bordean el sitio de clivaje proteolítico que da lugar a FXa son identificados mediante las posiciones Arg^{234} e IIe^{235}; si la numeración se realiza con referencia al dominio catalítico de la quimotripsina, estos mismos residuos son identificados mediante las posiciones Arg^{15} e IIe^{16}.

Otro sistema de numeración universal también utilizado se refiere al sitio de clivaje proteolítico. Las posiciones de los aminoácidos se proporcionan en orden ascendente a partir de este sitio de clivaje. Las posiciones a continuación del sitio se identifican mediante P, y las posiciones anteriores al sitio se identifican mediante P'. De esta manera, en el caso de la PC, P_{12} representa el aminoácido N-terminal del péptido de activación (el más alejado del sitio de clivaje), y P_{1} representa el aminoácido C-terminal del péptido de activación; P_{1}' representa el aminoácido N-terminal de la PCa.

La activación de la PC es el resultado de su clivaje por trombina que forma un complejo con un cofactor unido a membrana, trombomodulina, presente en la superficie del endotelio vascular. En ausencia de trombomodulina, la activación de la PC por trombina es aproximadamente 1.000 veces más lenta y genera sólo una cantidad despreciable de PCa.

Para una sección determinada del vaso, la cantidad de moléculas de trombomodulina por volumen irrigadas es mucho mayor en la microcirculación que en los vasos de gran calibre. Como resultado, en presencia de trombina, la generación de PCa es rápida en la microcirculación pero es lenta en los vasos de gran calibre. El papel fisiológico de la ruta anticoagulante se limita, por lo tanto, a la microcirculación.

La importancia de la ruta de anticoagulante se pone de manifiesto en la seriedad de las deficiencias genéticas o deficiencias adquiridas en las proteínas que participan en este sistema; una deficiencia en la PC o en la proteína S o en la resistencia del factor Va a la inactivación mediante la PCa puede ser identificada en más de un 30% de los accidentes trombóticos (AIACH et al., Seminars in Haematology, 34, 205-217, 1997). Ratones transgénicos en los que se ha inactivado el gen PC (Jalbert et al., J. Clin. Invest. 102 (8), 1481-1488, 1998) o en los que el gen trombomodulina no es funcional (Weiler-Guettler et al., J. Clin. Invest., 101, 1983-1991, 1998) presentan anomalías en la coagulación, materializadas particularmente por la aparición de depósitos de fibrina en diversos órganos.

Diversos estudios han demostrado que la PC presenta actividad biológica pleiotrópica: no sólo actividad antitrombótica (Taylor et al., J. Clin. Invest., 79, 918-925, 1987; Gruber et al., Blood, 73, 639-642, 1989; Circulation, 82, 578-585, 1990; Chesebro et al., Circulation, 86, III100-110, 1992; Hanson et al., J. Clin. Invest., 92, 2003-2012, 1993; Arnljots et al., Thromb. Haemost., 72, 415-420, 1994; Sakamoto et al., Circulation, 90, 427-432, 1994; Jang et al., Circulation, 92, 3041-3050, 1995; Kurz et al., Blood, 89, 534-540, 1997; Gresele et al., J. Clin. Invest., 101, 667-676, 1998; Mizutani et al., Blood, 95, 3781-3787, 2000; Bernard et al., N. Engl. J. Med., 344, 699-709, 2001), sino también actividad antiinflamatoria (Esmon, Biochim. Biophys. Acta., 1477, 349-360, 2000), actividad antiapoptótica (Joyce et al., J. Biol. Chem., 276, 11199-11203, 2001) y actividad profibrinolítica (Comp & Esmon, J. Clin. Invest., 68, 1221-1228, 1981; Rezaie, J. Biol. Chem., 276, 15567-15570, 2001). Este espectro farmacológico hace de de ella una candidata excelente para el tratamiento de la enfermedad trombótica en general, ya que en esta fisiopatología a menudo hay una reacción inflamatoria y a veces muerte celular asociados con este proceso trombótico.

Además, el mecanismo inducible de la activación de la PC la convierte en un antitrombótico autorregulado, cuya acción se dirige al trombo, limitando de esta manera el riesgo hemorrágico inherente a los antitrombóticos convencionales.

La administración de concentrados de PC ha demostrado ser beneficiosa en el tratamiento de deficiencias genéticas homocigóticas de PC y también deficiencias adquiridas tales como las infecciones meningococales asociadas con la purpura fulminans (Gerson et al., Pediatrics, 91, 418-422, 1993; Okajima et al., Am. J. Hematol., 33, 277-278, 1990; Dreyfus et al., N. Engl. J. Med., 325, 1565-1568, 1991; Manco-Johnson & Nuss, Am. J. Hematol., 40, 69-70, 1992; Rintala et al., Lancet, 347, 1767, 1996; Smith et al., Lancet, 350, 1590-1593, 1997; White et al., Blood, 96, 3719-3724, 2000). Esta terapia sustitutiva hace posible corregir desordenes asociados con estas deficiencias reconstituyendo un depósito de PC circulante.

Sin embargo, no resulta posible prever la utilización de concentrados de PC como un tratamiento antitrombótico en el caso de vasos grandes, trombosis arterial o trombosis venosa. Tal como se ha indicado anteriormente, la cantidad de trombomodulina disponible constituye un factor de limitación, incluso con concentraciones de saturación de PC, la activación de la misma se mantiene demasiada baja para obtener un efecto terapéutico adecuado.

Con el fin de extender la actividad biológica de la ruta anticoagulante de la PC al territorio vascular completo, se ha propuesto la utilización directa de la PCa. Esta solución ha demostrado ser eficaz (Bernard et al., N. Engl. J. Med., 344, 699-709, 2001) pero su utilización está limitada por la vida media muy corta (aproximadamente de 30 minutos) de la PCa en la circulación. De hecho, como sucede con la mayoría de las serina proteasas activadas, la PCa es rápidamente neutralizada por los inhibidores (serpinas) presentes en el plasma. Por lo tanto, el efecto terapéutico puede obtenerse sólo mediante una infusión continua.

Una de las soluciones ideadas con el fin de resolver esta limitación consiste en realizar modificaciones a la PCa de manera que se incrementa su resistencia a los inhibidores del plasma. Sin embargo, surge otro problema debido al hecho de que la utilización de la PCa no permite beneficiarse de una ventaja principal de la PC, particularmente la activación inducible mediante la presencia de la trombina. Una PCa resistente a los inhibidores y cuya formación no puede ser regulada presenta las desventajas de los antitrombóticos convencionales, particularmente una acción anticoagulante no limitada al área trombótica y el potencial riesgo hemorrágico resultante.

Otro enfoque que ha sido propuesto consiste en intentar modificar la PC con el fin de hacerla directamente activable por trombina en ausencia de trombomodulina, con el fin de permitir la formación de PCa a través del trombo y no sólo en la vecindad inmediata del endotelio vascular.

Richardson et al., (Protein Sci., 3, 711-712, 1994) da a conocer derivados de la proteína C en los que el residuo Asp en la posición P_{3}' en relación al sitio de clivaje proteolítico es sustituido por Asn, Gly, Ala o Lys. Los derivados sustituidos por Asn, Gly, Ala son activados por trombina en ausencia de trombomodulina con una velocidad entre 4 y 9 veces superior, y el derivado sustituido por Lys es activado con una velocidad 30 veces superior que la PC nativa.

La patente US 5453373 describe diversos derivados de la PC:

- el derivado denominado F167 es el resultado de sustituir el residuo Asp en la posición 167 de la forma madura de la PC (posición P_{3} del péptido de activación) por un residuo Phe; este derivado es activado por trombina en ausencia de trombomodulina a una velocidad 12 veces superior que la PC nativa;

- el derivado denominado LIN es el resultado de sustituir el residuo Asp en la posición 172 de la forma madura de la PC (posición P_{3}' en relación al sitio de clivaje proteolítico) por un residuo Asn; este derivado es activado por trombina en ausencia de tromobomodulina a una velocidad 4 veces superior que la PC nativa;

- el derivado denominado FLIN es el resultado de sustituir el residuo Asp en la posición 167 de la forma madura de la PC por un residuo Phe, y de sustituir el residuo Asp en la posición 172 de la forma madura de la PC por un residuo Asn; este derivado es activado por trombina en ausencia de trombomodulina a una velocidad 30 veces superior que la PC nativa;

- los derivados denominados Q313 y Q329 son el resultado, respectivamente, de sustituir el residuo Asn en la posición 313 o el residuo Asn en la posición 329 de la forma madura de la PC por un residuo Gln; estas modificaciones se llevaron a cabo con el fin de eliminar los sitios de glicosilación en estos residuos Asn, con el fin de incrementar la actividad anticoagulante de la PCa. El derivado Q313 es activado por trombina a una velocidad 2 veces superior que la PC nativa; su actividad anticoagulante es 1,8 veces superior que la de la PCa; el derivado Q329 es activado por trombina menos rápidamente que la PC nativa;

- el derivado denominado Q3Q9 es el resultado de sustituir el residuo Asn en la posición 313 y el residuo Asn en la posición 329 de la forma madura de la PC por residuos Gln; este derivado es activado por trombina en ausencia de trombomodulina a una velocidad 3,3 veces superior que la PC nativa.

Los derivados denominados FLIN-Q313 y FLIN-Q3Q9 combinan estas diversas modificaciones; se activan, respectivamente, mediante sólo trombina, a una velocidad 61 veces superior que la PC nativa y 84 veces superior que la PC nativa. Estas velocidades de activación se mantienen, sin embargo, muy inferiores a la PC nativa en presencia de trombomodulina.

Los presentes inventores han investigado otras modificaciones de la PC que harían posible incrementar más significativamente la velocidad de activación de la misma por trombina, independientemente de la trombomodulina.

De esta manera, los presentes inventores han demostrado dos tipos de modificaciones que estimulan una aceleración de la activación de PC por trombina (bajo condiciones fisiológicas y en ausencia de trombomodulina). Además, la combinación de esas modificaciones hace posible la obtención de PC modificadas, cuya activación en ausencia de trombomodulina es hasta 500 veces más rápida que la PC nativa bajo las mismas condiciones y produce PCa modificadas, cuya vida media en plasma es superior que la de la PCa nativa.

Un primera categoría de modificaciones concierne al péptido de activación: los presentes inventores observaron que reemplazando este péptido por los aminoácidos P_{10} a P_{1} del fibrinopéptido A (FpA) del fibrinogen (numerado con referencia al sitio de clivaje proteolítico) hizo posible obtener una velocidad de activación 40 veces superior que la de la PC normal expresada y caracterizada bajo las mismas condiciones (en comparación, el derivado F167 descrito en la patente US 5453373, que alberga una sustitución Asp\rightarrowPhe en la posición p_{3} del péptido de activación, es activada por trombina 12 veces más rápidamente que la PC nativa).

La coagulación sanguínea es el resultado de una cascada de reacciones enzimáticas, cuya última etapa es la generación de trombina, que induce la formación de un coágulo capaz de sellar la abertura vascular. La mayoría de estas reacciones implican la activación proteolítica de un cimógeno inactivo para activar la serina proteasa. Esta cascada de reacciones se divide convencionalmente en dos rutas denominadas: "ruta intrínseca" y "ruta factor tisular", o "ruta extrínseca", en función de si la activación del FX es el resultado de su clivaje por el factor IXa o por el factor VIIa. Por lo tanto, estas rutas convergen hacia la activación del FX a FXa. El FXa es una de las enzimas de coagulación clave ya que
el enlace de la misma a su cofactor, factor Va, forma el complejo protrombinasa, que activa la protrombina a trombina.

Una deficiencia cualitativa o cuantitativa en una de las proteínas implicadas en la coagulación lleva a manifestaciones trombóticas o hemorrágicas graves frecuentes, posiblemente amenazando la prognosis vital. En este contexto, se hará mención particular de la hemofilia A y B, que son el resultado, respectivamente, de una deficiencia en el factor VIII o en el factor IX.

Los tratamientos para la hemofilia propuestos en la actualidad son tratamientos de tipo sustitutivo o tratamientos basados en la utilización de una o más moléculas que puentean la etapa deficiente (Hedner, Thromb. Haemost., 82, 531-539, 1999).

La principal desventaja del tratamiento sustitutivo estriba en la antigenicidad potencial de la molécula inyectada, que puede ser vista como extraña por el sistema inmunológico del receptor. El desarrollo de aloanticuerpos neutralizantes dirigidos contra el factor utilizado representa una complicación seria del tratamiento sustitutivo que, poco a poco, la convierte en ineficaz. La principal desventaja de los tratamientos "de puenteo" disponibles o en ensayo en la actualidad es la ausencia de autorregulación (particularmente, la ausencia de localización y/o autoamplificación de la producción de trombina). Pueden llevar a efectos secundarios extraños pero graves: shocks anafilácticos y accidentes trombóticos (infarto de miocardio, coagulación intravascular diseminada).

Por lo tanto, parece deseable disponer de un tratamiento que no presentara estas desventajas. Con este objetivo, los presentes inventores han investigado derivados de FX activables por trombina que harían posible no sólo puentear las etapas deficientes de la cascada de coagulación, sino también reestablecer la autoamplificación de la generación de trombina. La forma activada de este derivado de FX (FXa*) sería, de hecho, capaz (en combinación con el factor Va) de formar un complejo protombinasa funcional y por lo tanto, sería capaz de activar la protrombina a trombina. A su vez, la trombina activaría moléculas derivadas de FX adicionales.

De esta manera, los presentes inventores han realizado en el FX modificaciones del mismo tipo que las indicadas anteriormente para la PC. Observaron que la sustitución del péptido de activación del FX por los aminoácidos P_{10} a P_{1} del fibrinopéptido A permite obtener un FX modificado que es activable por trombina, a diferencia del FX normal.

Por lo tanto, parece que la sustitución del péptido de activación nativo de un cimógeno activable por trombina por un FpA, o por un péptido que comprende por lo menos los aminoácidos P_{10} a P_{1} del mismo, hace posible incrementar la velocidad de activación de este cimógeno. Además, parece posible construir proteínas clivables por trombina a partir de cimógenos activables mediante otra serina proteasa, o incluso a partir de cualquier polipéptido, colocando en su extremo N-terminal por lo menos los aminoácidos P_{1}', P_{2}' y P_{3}' de un sitio de clivaje para trombina, precedidos por un péptido que comprende por lo menos los aminoácidos P_{10} a P_{1} del fibrinopéptido A. Los aminoácidos que pueden ser utilizados en las posiciones P_{1}', P_{2}' y P_{3}' para constituir un sitio para el clivaje por trombina son conocidos en sí; son descritas, por ejemplo, por Dawson et al., (J. Biol. Chem., 269, 15989-15992, 1994) en la patente US 5688664 o por Le Bonniec et al., (Biochemistry, 35, 7114-7122, 1996).

Por otra parte, aunque se ha considerado en la técnica anterior que la presencia de un residuo de prolina en la posición P_{2} del sitio de clivaje era necesaria para un clivaje óptimo por trombina (cf. particularmente Dawson et al., y la patente US 5688664, citados anteriormente), la presente invención proporciona proteínas clivables por trombina en las que el residuo en la posición P2 es una valina. Se supone que este residuo, y también la fenilalanina en la posición P_{9} y el glutamato en la posición P_{6} de FpA, permitirían la utilización de un sitio de enlace adicional en la trombina, no utilizado para un clivaje de la PC normal.

El objetivo de la presente invención es una proteína quimérica clivable por trombina que comprende en su extremo N-terminal un péptido de activación seguido de los aminoácidos P_{1}'-P_{2}'-P_{3}' de un sitio de clivaje por trombina, caracterizado en que dicho péptido de activación es un fibrinopéptido A, o una porción del mismo, que comprende por lo menos los aminoácidos P_{10} a P_{1} de dicho fibrinopéptido A.

Dicha proteína quimérica es derivada a partir de la PC o del FX reemplazando el péptido de activación de dicho cimógeno por fibrinopéptido A, o una porción del mismo, que comprende por lo menos los aminoácidos P_{10} a P_{1} de dicho fibrinopéptido A.

Por lo tanto, dicha proteína quimérica comprende una secuencia clivable por trombina, P_{10}P_{9}P_{8}P_{7}P_{6}P_{5}P_{4}P_{3}P_{2}P_{1}P_{1}'
P_{2}'P_{3}', que comprende los aminoácidos P_{10} a P_{1} del fibrinopéptido A y una secuencia P_{1}'-P_{2}'-P_{3}' que puede ser la secuencia Leu-IIe-Asp, que corresponde a la secuencia nativa P_{1}'-P_{2}'-P_{3}' de la PC, o la secuencia IIe-Val-Gly, que corresponde a la secuencia nativa P_{1}'-P_{2}'-P_{3}' del FX.

Para obtener una proteína quimérica de la presente invención, resulta posible prever la utilización del FpA (o por lo menos los aminoácidos P_{10}-P_{1} del mismo) de cualquier especie animal, siendo la secuencia del FpA muy conservada de una especie a otra, particularmente, respecto a la fenilalanina en la posición P_{9}, el glutamato en la posición P_{6} y la valina en la posición P_{2}. Sin embargo, para la producción de derivados de la PC o del FX, destinados a ser utilizados en la medicina humana, preferentemente se utilizará FpA humano, o la secuencia de péptidos DFLAEGGGVR (SEQ ID NO:2), correspondiente a los aminoácidos P_{10} a P_{1} del FpA humano. De hecho, estos péptidos presentan la ventaja de ser potencialmente relativamente no inmunogénicos ya que se encuentran expuestos, de manera natural, en el fibrinogen circulante.

De manera ventajosa, resulta también posible utilizar una secuencia P_{1}'-P_{2}'-P_{3}' en la que uno o más de los residuos P_{1}', P_{2}' o P_{3}' son modificados con el fin de mejorar adicionalmente la velocidad de activación por trombina. Diversas modificaciones que influencian la activación por trombina son descritas, por ejemplo, en la publicación de Le Bonniec et al., (1996), citada anteriormente.

Los residuos P_{1}' a P_{3}' (16 a 18 en la numeración de la quimotripsina) constituyen, en las serina proteasas, el extremo amino terminal del dominio catalítico de la enzima activa resultante del clivaje.

Están bien conservadas en las serina proteasas: la secuencia de consenso es IIe^{16}-Val^{17}-Gly^{18}. Particularmente, las posiciones P_{1}' y P_{2}' están ocupadas casi sistemáticamente por los residuos hidrofóbicos con cadenas laterales alifáticas, que desarrollan interacciones hidrofóbicas que juegan un importante papel en la formación y la estabilización del sitio catalítico de la serina proteasa activada.

En el caso de la PCa, el residuo 16 (P_{1}') es una leucina, el residuo 17 (P_{2}') es una isoleucina y el residuo 18 (P_{3}') es un aspartato. En el caso del FX, el residuo 16 (P_{1}') es una isoleucina, el residuo 17 (P_{2}') es una valina y el residuo 18 (P_{3}') es una glicina.

Sin embargo, la secuencia óptima para el clivaje por trombina en estos residuos es Ser-Phe-Arg (en la posición P_{1}', P_{2}' y P_{3}', respectivamente), es decir, una secuencia muy distante tanto de la secuencia de consenso de las serina proteasas como de la secuencia particular de la PC o del FX, particularmente debido a la presencia de un residuo hidrofílico (serina) en la posición P_{1}'.

Bajo estas condiciones, parece probable que, particularmente en el caso de la PC y del FX, se podría obtener una ganancia en afinidad para la trombina, que incrementa la velocidad de activación, en detrimento de la estabilidad del dominio catalítico, y por lo tanto de la actividad de la PC y del FX.

Sin embargo, los presentes inventores construyeron derivados de la PC y el FX que, además de albergar la secuencia FpA a continuación del sitio de clivaje activador, se modificaron con el fin de introducir una alanina o una serina en la posición P_{1}' del sitio de clivaje como una sustitución para la leucina de la PC o para la isoleucina del FX, y/o una fenilalanina en la posición P_{2}' como una sustitución para la isoleucina de la PC o para la valina del FX, y/o una glicina en la posición P_{3}' como una sustitución para el aspartato de la PC.

Los presentes inventores observaron que estas mutaciones estimulan el clivaje activador de la PC y del FX por trombina y que, además, los derivados de la PCa resultantes conservan una actividad catalítica que, aunque reducida, es compatible con la función fisiológica normal; además, esta reducción en la actividad catalítica es compensada por un incremento en la vida media (hasta de 10 veces) comparada con la de los homólogos no mutados de la PCa. Este incremento en la vida media es el resultado de una mayor resistencia a los inhibidores de la serina proteasa en el plasma, conferida por estas mutaciones.

Según una forma de realización preferente de un derivado de la PC o del FX, según la invención, la secuencia P_{1}'- P_{2}'- P_{3}' nativa de dicho cimógeno es también modificada mediante la sustitución del aminoácido en la posición P_{1}' por una alanina o una serina.

Entre otras modificaciones ventajosas de la secuencia P_{1}'-P_{2}'-P_{3}' nativa se incluyen, por ejemplo:

- la sustitución del aminoácido en la posición P_{2}' por una fenilalanina.

- la sustitución del aminoácido en la posición P_{3}' por una glicina.

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Los derivados particularmente preferentes son aquellos en los que el aminoácido en la posición P_{1}' es sustituido por una alanina.

El objetivo de la presente invención es también cualquier derivado de PCa, que puede obtenerse por clivaje por trombina de un derivado de la PC según la invención en el que uno o más residuos P_{1}' o P_{2}' del sitio de clivaje han sido modificados tal como se ha indicado anteriormente.

Los derivados de la PCa según la invención presentan la ventaja de ser más resistentes a las serpinas del plasma que la serina proteasa nativa correspondiente, y por lo tanto, de presentar una vida media más larga.

De esta manera, la implementación de la presente invención hace posible:

- obtener un clivaje para trombina de proteínas que no constituyen sustratos naturales para esta enzima, o acelerar el clivaje de proteínas que son naturalmente de clivaje lento por trombina; de esta manera resulta posible particularmente obtener, de manera fácil y relativamente barata, proteínas activas a partir de cimógenos, mediante un simple clivaje con trombina, que es una enzima barata y fácil de obtener;

- obtener, además, cuando se realiza la modificación indicada anteriormente, de uno o más de los residuos P_{1}', P_{2}' o P_{3}' del sitio de clivaje, los derivados de la serina proteasa que son resistentes a los inhibidores y por lo tanto presentan un vida media en plasma más larga.

De esta manera, a modo de ejemplo, en el caso de la PC, la implementación de la presente invención hace posible obtener derivados de la PC cuya velocidad de activación por trombina en ausencia de trombomodulina es muy superior que la de los derivados de la PC de la técnica anterior. Además, hace posible la preparación de PC activada a partir de estos derivados, utilizando trombina, mientras que normalmente se utiliza un activador extraído de veneno de serpiente, que es muy caro, para preparar PCa a partir de PC nativa. Respecto a los derivados de PCa que pueden ser obtenidos según la invención, su relativamente baja actividad es compensada, primero, por la velocidad de activación y, segundo, por su considerable resistencia a las serpinas del plasma. El resultado de esto es un efecto terapéutico mejor dirigido y que es más fácilmente controlado que el de la PCa o el de los derivados de la PC de la técnica
anterior.

También, a modo de ejemplo, la implementación de la presente invención hace posible obtener derivados de FX activables por trombina. Además, hace posible la preparación de FXa a partir de estos derivados, utilizando trombina, mientras que convencionalmente se utiliza un activador extraído de veneno de serpiente, que es muy caro, para preparar FXa a partir de FX.

Opcionalmente, resulta posible combinar las modificaciones específicas de los derivados de la invención con otras modificaciones que conciernen diferentes dominios de la proteína elegida y que pueden hacer posible la mejora de algunas de sus propiedades. De esta manera, en el caso de los derivados de la PC o de la PCa de la presente invención, resulta posible, por ejemplo, si se desea obtener un derivado de la PCa con una actividad anticoagulante ligeramente superior, sustituir los residuos Asn en las posiciones 313 y 329 (con referencia a la forma madura de la PC), tal como se describe en la patente US 5453373. En el caso de los derivados de FX de la presente invención, si se desea obtener un mejor rendimiento de la proteína \gamma-carboxilada madura, resulta posible sustituir el propéptido del FX nativo por el de la protrombina, tal como es descrito por Camire et al. (Biochemistry, 39, 14322-14329,
2000).

Un objetivo de la presente invención son también las moléculas de ácido nucleico que codifican los derivados de PC o FX según la invención.

Estas moléculas de ácido nucleico pueden obtenerse mediante procedimientos convencionales, bien conocidos por los expertos en la materia, particularmente mediante mutagénesis sitio dirigida del gen que codifica la proteína nativa para la que se desea permitir o acelerar el clivaje por trombina.

La presente invención también abarca pares de cebadores nucleótidos que pueden ser utilizados para obtener, mediante mutagénesis sitio dirigida, moléculas de ácido nucleico que codifican derivados de PC según la invención, y particularmente los siguientes pares de cebadores:

- un par de oligonucleótidos definido por las secuencias SEQ ID NO: 5 y 6,

- un par de oligonucleótidos definido por las secuencias SEQ ID NO: 7 y 8,

- un par de oligonucleótidos definido por las secuencias SEQ ID NO: 9 y 10,

- un par de oligonucleótidos definido por las secuencias SEQ ID NO: 11 y 12,

- un par de oligonucleótidos definido por las secuencias SEQ ID NO: 13 y 14.

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La presente invención también abarca pares de cebadores nucleótidos que pueden ser utilizados para obtener, mediante mutagénesis sitio dirigida, moléculas de ácido nucleico que codifican derivados de FX según la invención, y particularmente los siguientes pares de cebadores:

- un par de oligonucleótidos definido por las secuencias SEQ ID NO: 15 y 16,

- un par de oligonucleótidos definido por las secuencias SEQ ID NO: 17 y 18,

- un par de oligonucleótidos definido por las secuencias SEQ ID NO: 19 y 20,

- un par de oligonucleótidos definido por las secuencias SEQ ID NO: 21 y 22,

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La presente invención también abarca los casetes de expresión en los que una molécula de ácido nucleico de la invención está asociada con elementos adecuados para controlar la transcripción (particularmente un promotor y, opcionalmente, un terminador) y, opcionalmente la translación, y también los vectores recombinantes en los que se introduce una molécula de ácido nucleico según la invención. Estos vectores recombinantes pueden, por ejemplo, ser vectores de clonación, o vectores de expresión. La invención también incluye sistemas de suministro de genes que comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención, que puede ser utilizada en terapia génica in vivo o ex vivo. Esto incluye, por ejemplo, vectores de transferencia vírica tales como los derivados a partir de retrovirus, adenovirus, virus adeno asociados, lentivirus, que se utilizan convencionalmente en terapia génica. También incluye sistemas de suministro de genes que comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención y un vehículo de suministro génico no vírico. Entre los ejemplos de vehículos de suministro génico no víricos se incluyen liposomas y polímeros tales como polietileniminas, ciclodextrinas, polímeros histidina/lisina (HK),
etcétera.

Un objetivo de la presente invención son también las células huésped procariotas o eucariotas genéticamente transformadas con por lo menos una molécula de ácido nucléico según la invención. Preferentemente, para la expresión y la producción de derivados de la PC o del FX según la invención, se elegirán células eucariotas, particularmente células de mamífero.

La presente invención también abarca animales no humanos transgénicos, particularmente mamíferos no humanos transgénicos que presentan por lo menos un trasgen que comprende un casete de expresión de la invención. Dichos animales transgénicos pueden ser utilizados para producir las proteínas quiméricas de la invención, tal como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, por Brink et al., (Theriologenology, 53, 139-148, 2000).

La construcción de los vectores de expresión según la invención, la transformación de las células huésped, y la producción de los animales transgénicos pueden realizarse utilizando técnicas convencionales de la biología molecular.

Los derivados de la PC o del FX de la invención, pueden, por ejemplo, ser obtenidos mediante un cultivo de células genéticamente transformadas según la invención y recuperando el derivado expresado por dicha célula, del cultivo. A continuación, si resulta necesario, pueden ser purificadas mediante procedimientos convenciones, conocidos en sí por lo expertos en la materia, por ejemplo, mediante precipitación fraccionada, particularmente precipitación con sulfato de amonio, electroforesis, filtración en gel, cromatografía de afinidad, etcétera.

Particularmente, pueden utilizarse procedimientos convencionales para preparar y purificar las proteínas recombinantes para producir las proteínas según la invención. Por ejemplo, para producir los derivados de PC según la invención, pueden utilizarse los procedimientos tales como los descritos en las patentes US 4992373 y US 4981952.

También es un objetivo de la presente invención la utilización de derivados de PC, PCa o FX según la invención, o de las moléculas de ácido nucleico que codifican estos derivados, para la producción de productos medicinales.

Dichos productos medicinales son también parte de la invención. Se incluyen, por ejemplo:

- composiciones farmacéuticas que comprenden por lo menos una proteína quimérica, o el producto del clivaje por trombina de la misma, según la invención, y particularmente por lo menos un derivado de PC, PCa o FX según la invención, combinado con un excipiente adecuado.

- composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención asociada con un vehículo de suministro génico vírico o no vírico. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser utilizadas, de manera ventajosa, en terapia génica in vivo o ex vivo. Los vectores utilizados convencionalmente en terapia génica, tales como vectores víricos (por ejemplo, un vector de tipo adenovirus o retrovirus), liposomas, etcétera, pueden ser utilizados para la producción de productos medicinales según la invención.

Por ejemplo, los productos medicinales obtenidos a partir de derivados de PC o PCa según la invención puede ser utilizados en todas las aplicaciones típicas de PC o PCa, y particularmente como antitrombóticos, antiinflamatorios y agentes antiapoptóticos, y profibrinolíticos, en el contexto de la prevención o tratamiento de patologías que implican hipercoagulación. A modo de ejemplo, se hará mención de la trombosis venosa o arterial, particularmente de la trombosis que afecta a los vasos de gran calibre, infarto de miocardio, enfermedad trombótica, embolismo pulmonar, la prevención de reoclusiones coronarias después de una angioplastia o una trombólisis, y también el tratamiento o la prevención de anomalías de coagulación en pacientes que padecen anomalías genéticas que afectan al gen PC o al de la trombomodulina.

Los productos obtenidos a partir de derivados de FX según la invención pueden ser utilizados como procoagulantes. A modo de ejemplo, se hará mención de la prevención o el tratamiento de patologías de coagulación de tipo hemorrágico, particularmente como resultado de una deficiencia de factor VIII, IX o XI. Estas pueden ser particularmente hemofilias A o B, que pueden complicarse o no con la presencia de inhibidores (neutralizando los aloanticuerpos dirigidos contra el factor VIII o IX utilizados convencionalmente para el tratamiento); también pueden ser hemofilias adquiridas como resultado de la aparición de autoanticuerpos asociados con otra patología (enfermedad autoinmune, cáncer, síndrome linfoproliferativo, desorden idiopático, etcétera).

La presente invención se apreciará con mayor claridad a partir de las descripciones adicionales siguientes, que se refieren a ejemplos no limitativos de preparación y caracterización de derivados de PC y FX según la invención.

Ejemplo 1 Construcción de los vectores para expresión de variantes de PC

Los vectores destinados para la expresión de las variantes de PC se construyeron utilizando, como materia prima, el vector pCI-neo-PC, que expresa la proteína C humana normal después de la transfección a células de mamífero.

El ADNc de la PC se aisló a partir de células de hígado humano mediante una reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (PCR); los procedimientos utilizados para clonar el ADNc al vector pCI-Neo (Promega, Madison, USA) concuerdan con los descritos en la técnica (Sambrook et al., "Molecular cloning, A laboratory manual" (Segunda edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; White, PCR protocols, Methods in Molecular Biology, Walter J. H. editores, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1993).

Mutagénesis sitio dirigida del vector pCI-neo-PC

La mutagénesis sitio dirigida del vector pCI-neo-PC, para preparar los vectores destinados para la expresión de los análogos de la PC, se llevó a cabo utilizando un procedimiento derivado a partir del procedimiento de Jones et al. (Nature, 344, 793-794, 1990). La modificación del ADNc de la PC que hace posible la introducción de la secuencia FpA en sustitución del péptido de activación, se obtuvo en una única etapa de PCR, con el vector pCI-neo-PC como matriz y los pares de oligonucleótidos mostrados en la Tabla I como cebadores.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

En esta tabla, la primera columna indica la modificación introducida en el péptido de activación: DFLAEGGGVR se refiere a que, en el derivado preparado, el péptido de activación se sustituyó por la secuencia del fibrinopéptido A; \Delta_{DTEDQED} se refiere a que, en el derivado preparado, los primeros 7 residuos del péptido de activación normal fueron eliminados. Para cada mutagénesis, la secuencia del par de oligonucleótidos utilizada (sentido y antisentido) se muestra en la columna de la derecha. La columna central de la tabla indica la secuencia de aminoácidos P_{1}', P_{2}' y P_{3}' del sitio de activación.

La PCR se lleva a cabo en un volumen de 50 \mul que comprende 2,5 unidades de Pfu ADN polimerasa (Stratagene; Amsterdam Zuidoost, Holanda), en el tampón recomendado por el fabricante, una mezcla equimolar de cada dNTP (0,5 mM), 125 ng de cada cebador (sentido y antisentido, véase Tabla I) y 50 ng de matriz. Las PCR se llevan a cabo utilizando un dispositivo termociclador de ADN tipo 480 (Perkin Elmer, Roissy, Francia). Cada reacción comprende una etapa inicial de desnaturalización a 95ºC durante 5 minutos, seguida de 15 ciclos idénticos, cada uno de los cuales comprende 3 etapas sucesivas (desnaturalización, hibridación y elongación) de, respectivamente, 30 segundos a 95ºC, 60 segundos a 55ºC o 60ºC, y 20 minutos a 68ºC.

Para preparar el mutante DFLAEGGGVR con LID para los residuos P_{1}'-P_{3}' (es decir, los residuos naturales), la temperatura de hibridación del cebador es de 60ºC.

El ADNc que codifica este mutante es utilizado para preparar las otras variantes en las que la secuencia P_{1}'-P_{3}' difiere de LID; siendo la temperatura de hibridación de 55ºC.

Al final de estos 15 ciclos, el vector que fue utilizado como matriz es degradado a 37ºC durante 60 minutos, con 10 unidades de endonucleasa de restricción Dpnl (Ozyme, Saint Quentin en Yvelincs, Francia).

La preparación de la variante de \Delta_{DTEDQED} se lleva a cabo de la misma manera, con el vector pCI-neo-PC que contiene la secuencia que codifica la PC normal, como matriz de la PCR. La temperatura de hibridación es de
55ºC.

Las variantes en P_{1}'-P_{3}' del sitio de activación del derivado de PC que presenta FpA en sustitución del péptido de activación se obtuvieron de la misma manera, con el vector pCI-neo-PC-Fpa (con la secuencia FpA) como matriz y el correspondiente par de cebadores, tal como se indica en la Tabla I.

Preparación de los vectores derivados a partir de pCI-neo-PC

Las bacterias de la cepa DH5\alpha (Dam^{+}) se hacen competentes lavándolas a 4ºC en CalCl_{2} 100 mM y almacenándolas a -80ºC en una solución de CaCl_{2} 100 mM que contiene 15% de glicerol. Una alícuota de bacterias competentes (aproximadamente 10^{6} en 100 \mul) es transformada con entre 5 \mul y 10 \mul del producto de PCR digerido con Dpnl. La mezcla es incubada durante 30 minutos a 4ºC y a continuación es sometida a un choque de calor durante 2 minutos a 42ºC seguido por una incubación adicional a 4ºC durante 2 minutos. A continuación, las bacterias son incubadas a 37ºC durante 60 minutos en un medio LB (caldo Luthia Bertoni, Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia) con agitación vigorosa. El medio LB es decantando después de una centrifugación a 2.000 rpm durante 5 minutos, y las bacterias se colocan en agar (1,5% de Agar-Select en medio LB que contiene 100 \mug/ml de ampilicina). Los platos Petri son incubados en un incubador a 37ºC durante 36 horas. Se aíslan entre 6 y 12 colonias y se amplifican durante la noche con agitación vigorosa, a 37ºC, en 5 ml de medio LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina. El vector responsable de la resistencia a la ampicilina es purificado mediante un procedimiento de "lisis de ebullición" (Sambrook et al., citado anteriormente). De manera alternativa, para preparar grandes cantidades de plásmido, se utilizó el kit "Plasmid Midy Kit" (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) según las instrucciones del fabricante.

Secuenciación de los ADNc de las variantes de la PC

La secuencia de ADNc realizada mediante los derivados de pCI-neo-PC se controló utilizando un procedimiento derivado del procedimiento de Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977), utilizando un dispositivo secuenciador "Abi Prism 377" (Perkin Elmer). Se utilizó el kit "Abi Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit", según las instrucciones del fabricante. Todos los ADNc de los derivados de PC se secuenciaron utilizando 6 cebadores distribuidos a lo largo de la secuencia ADNc de la PC.

Ejemplo 2 Transfección y selección de células de mamífero que expresan una variante de la PC Transfección de células HEK293

La línea celular transfectada es una línea celular epitelial de hígado humano, HEK293 (CRL-1573), de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Estas células fueron transfectadas con los vectores derivados a partir de pCI-neo-PC mediante el procedimiento de coprecipitación con fosfato de calcio (Sambrook et al., citado anteriormente).

La células HEK293 se cultivan en platos Petri (80 mm de diámetro) a 37ºC en una atmosfera enriquecida con CO_{2} al 5%, en medio completo: "Dulbecco's Modified Eagle Medium" (DMEM), suplementado con 10% de suero fetal bovino, glutamato 2 mM, 5 U/ml de penicilina y 5 \mug/ml de estreptomicina (todos proporcionados por Invitrogen). Cuando las células alcanzan una confluencia del 80%, de 5 \mug a 40 \mug del vector a transfectar se diluyen en 220 \mul de H_{2}O y se añaden a 250 \mul de tampón Hepes 50 mM, pH 7,05, que contiene NaCl 280 mM, KCl 10 mM, Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM y dextrosa 12 mM (HBS, Hepes Buffered Saline). La coprecipitación del ADN se obtiene añadiendo, gota a gota y con una agitación lenta, 31 \mul de CaCl_{2} 2,5 M, seguida de de una incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se aclaran dos veces en tampón de fosfato (PBS, Invitrogen), y a continuación, se devuelven al medio completo fresco. A continuación, el precipitado de ADN es añadido y puesto en contacto con las células HEK293 durante 4 horas a 37ºC. Al final de esta incubación, las células se lavan con PBS y se devuelven al cultivo en medio completo fresco durante 24 horas. A continuación, las células se separan del plato Petri mediante incubación durante 5 minutos a 37ºC en presencia de 1,5 ml de una solución de Tripsina-EDTA (Invitrogen). A continuación, las células son distribuidas en tres platos Petri y son seleccionadas en medio completo que contiene 1 mg/ml de geneticina (Invitrogen). El medio de cultivo es renovado cada 2 días durante 2 a 3 semanas, hasta que se obtienen colonias. Se aislan y se transfieren aproximadamente 20 colonias en los tubos (2 cm^{2}) de un plato de cultivo de 24 tubos, y se devuelven al cultivo hasta la confluencia, en medio completo que contiene el agente de selección. A continuación, cada sobrenadante se somete a ensayo mediante Elisa (véase más adelante) con el fin de detectar la presencia de derivados de PC. Los clones que muestran la mejor expresión del derivado de la PC son amplificados y se aseguran congelándolos en nitrógeno líquido (conteniendo, cada vial aproximadamente 10^{6} células en 1 ml de suero bovino mezclado con 10% (v/v) de DMSO).

Identificación de clones que expresan una variante de la PC

La identificación de los clones que expresan un derivado de la PC y la estimación de la cantidad secretada se realizaron mediante Elisa. Se utiliza un anticuerpo monoclonal, P7058, descrito por Miletich y Broze (J. Biol. Chem., 265, 11397-11404, 1990) y comercializado por Sigma Aldrich (St Quentin Fallavier, Francia). Este anticuerpo es diluido en tampón Na_{2}HCO_{3} 50 mM, pH 9,6 y absorbido durante la noche a 4ºC (1 \mug en 100 \mul por cada tubo) a una placa de titración "Maxisorp" (Nunc, Polylabo, Strasbourg, Francia). Los tubos son lavados 3 veces en TTBS (Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 150 mM y 0,5% (v/v) de Tween 20) y a continuación son saturados durante 1 hora a temperatura ambiente con albúmina de suero bovino en TTBS (5% (p/v); 100 \mul por tubo). Una alícuota de cada sobrenadante a ensayar (100 \mul diluidos a 1/5 en medio DMEM que contiene EDTA 5mM) es añadida a uno de los tubos de la placa de microtitración saturada y se deja incubar durante una hora a temperatura ambiente. Los tubos son lavados 3 veces en TTBS, y un anticuerpo dirigido contra PC, es preparado en conejo y es acoplado a la peroxidasa (Dako, Clostrup, Dinamarca), es añadido después de la dilución de 1/1.000 en TTBS (100 \mul por tubo). Después de la incubación durante una hora a temperatura ambiente, los tubos son lavados de nuevo 3 veces en tampón TTBS. La presencia de PC enlazada al primer anticuerpo es revelada mediante la actividad peroxidasa mostrada por el segundo anticuerpo añadiendo 100 \mul de una solución de OPD (ácido cítrico 0,1 M, Na_{2}HPO_{4} 0,1 M, pH 5,0 que contiene 0,5% de H_{2}O_{2} (v/v) y 1 mg/ml de ortofenilendiamina). Después de entre 5 y 15 minutos, la reacción es detenida añadiendo 100 \mul de H_{2}SO_{4} 0,15 M y el producto de la reacción catalizada por peroxidasa es cuantificado mediante la medición de la absorbencia a 490 nm.

Ejemplo 3

Expresión y purificación de las variante de la PC

Las células HEK293 transfectadas son cultivadas en monocapa, en un incubador a 37ºC bajo una atmósfera controlada que contiene 5% CO_{2}, en medio completo. Los clones derivados a partir de las células HEK293 transfectadas y que secretan una variante de la PC son amplificadas mediante pasos sucesivos en matraces de área superficial creciente (hasta 300 cm^{2}). A continuación, cada matraz de 300 cm^{2} es utilizado para inocular dos botellas Roller con un área superficial de 850 cm^{2}. Los sobrenadantes, recogidos después de entre 2 a 6 días (dependiendo de la densidad celular) son centrifugados durante 10 minutos a 5.000 rpm para eliminar los restos celulares. Las proteasas posiblemente presentes en el medio de cultivo son inhibidas mediante la adición de EDTA 5 mM y benzamidina 10 mM, y el medio es almacenado a -20ºC antes de purificar la proteína recombinante.

Las variantes de la PC son purificadas a partir de los sobrenadantes de los cultivos mediante tres etapas de cromatografía. Dos litros de sobrenadante de cultivo son primeramente concentrados mediante absorción en una resina de intercambio de aniones. Estos 2 litros de sobrenadante de cultivo son diluidos con antelación en 4 litros de tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene EDTA 5 mM y benzamidina 10 mM, con el fin de reducir la fuerza iónica; a continuación, se añaden 4,5 g de Sephadex QAE A50 (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Suiza) y la mezcla es agitada lentamente durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la sedimentación de las perlas de Sephadex en una columna de cromatografía, las proteínas retenidas (incluyendo la PC) son eluídas con NaCl 0,5 mM en tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene EDTA 5 mM y benzamidina 10 mM. A continuación, la PC es purificada mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando resinas en las que se han injertado anticuerpos monoclonales (mab2) o HPC4 (Roche Diagnosis, Meylan, Francia) que reconocen la secuencia EDQVDPRLIDGK del péptido de activación. Estos anticuerpos monoclonales fueron acoplados a la Sepharose 4B activada por CNBr (aproximadamente 1 mg de anticuerpo por ml de gel), según las recomendaciones del proveedor (Amersham Pharmacia Biotech). La PC recombinante normal y su análogo, en el que el péptido de activación está truncado, se purificaron utilizando la resina acoplada al anticuerpo HPC4.

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La columna de afinidad se cargó con el eluato de la resina QAE después de haber llevado la concentración de Ca2+ hasta 5 mM. A continuación, la columna fue lavada en tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 0,5 M y Ca2+ 5 mM. La PC recombinante es eluída con un tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 0,15 M y EDTA 5 mM.

Los análogos de PC en los que la secuencia P_{3}-P_{3}' ya no es DPRLID fueron purificados utilizando la resina acoplada al anticuerpo mab2. En este caso, después de cargar la columna de afinidad con el eluato a partir de la resina QAE, y lavado en tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 0,5 M y EDTA 5 mM, la PC recombinante es eluída mediante acidificación en tampón de glicina 0,1 M, pH 2,7. El pH de la fracción eluída es inmediatamente corregido a 7,5 añadiendo Tris 2 M, pH 10. La etapa de purificación final es una cromatografía de intercambio de iones adicional, cuyo objetivo es reconcentrar y dializar el eluato a partir de la cromatografía de afinidad. Este eluato es diluido a 1/3 en un tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 50 mM, y a continuación es absorbido en un gel FAST Q (Amershan Pharmacia Biotech). Después de lavar en tampón de dilución (10 veces el volumen de la columna) para eliminar toda traza de glicina y EDTA, la PC es eluída con NaCl 0,5 M en tampón Tris 50 mM, pH 7,5. La concentración de PC es estimada a partir de su absorbencia a 280 nm, utilizando un coeficiente de absorción molar (E^{0,1%}) de 1,45. La pureza de cada análogo de PC es evaluada en un gel de poliacrilamida (al 12%, que contiene SDS al 1%) después de una desnaturalización y reducción de puentes disulfuro mediante incubación en presencia de 5% de \beta-mercaptoetanol. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 3.

Leyenda de la Figura 3:

Carril 1: marcadores de masa molecular. Carriles 2 a 7: 2 \mug de variante Fpa-LID, \Delta_{DTEDQED}, Fpa-LFG, Fpa-SIG, Fpa-AIG y Fpa-LIG, respectivamente. El peso molecular aparente (en kDa) se indica a la izquierda del gel. La posición de la forma de cadena simple de la PC normal, y también los de las cadenas ligeras y pesadas de la PC normal se indican a la derecha del gel.

Todas las preparaciones de PC obtenidas aparentan ser puras mediante gel SDS, pero dos formas están presentes. Una forma de cadena doble es el principal componente (entre 70% y 90%) con masas moleculares aparentes compatibles con las esperadas para las cadenas ligeras y pesadas (41.000 Da y 21.000 Da, respectivamente). El 10%-30% restante se obtiene en forma de cadena simple con una masa molecular aparente de 62.000 Da. El porcentaje de la forma de cadena simple no parece depender del análogo considerado, sino que parece depender de la colección de sobrenadante de cultivo a partir de la que se deriva la preparación, independientemente de la naturaleza de la mutación.

Sin embargo, debería observarse que al final de este protocolo de purificación, parte de la preparación de la PC se obtiene en forma activada (hasta un 50%). Debido a que la forma activada no puede distinguirse del cimógeno mediante análisis en gel de poliacrilamida SDS, este porcentaje se evalúa mediante la actividad amidolítica de la preparación (véase más adelante). El porcentaje de la forma activada parece depender tanto del análogo de PC considerado como del lote de preparación considerado. Resulta particularmente alto para los análogos de PC que presentan una serina o una alanina en sustitución de la leucina normal en la posición P_{1}' del sitio de activación.

Neutralización de las formas activas presentes en las preparaciones de variantes de PC

Con el fin de medir con exactitud la velocidad de activación por trombina de cada variante de PC, resulta esencial neutralizar, previamente, todas las trazas de PCa que puedan estar presentes en la preparación. Esta neutralización se lleva a cabo mediante la inhibición irreversible del sitio activo de la PCa. El inhibidor covalente utilizado es D-Phe-Pro-Arg-CH_{3}Cl (PPACK, Calbiochem, StCloud, Francia), que enlaza a His^{57} del sistema de estabilización de carga. En la práctica, se añade PPACK 5 mM a la preparación PC y la mezcla es incubada durante una hora a temperatura ambiente. Esta incubación se repite dos veces, añadiendo la misma cantidad de PPACK (fresco). El PPACK que no ha reaccionado es, a continuación, eliminado mediante cromatografía de intercambio de iones. La PC y la PCa inhibida (pero no el PPACK libre) son absorbidos a una columna Ressource Q (Amersham Pharmacia Biotech) después de la dilución (1/10, v/v) en tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 50 mM. Antes de la elución con NaCl 1 M en tampón Tris 50 mM, pH 7,5, la columna es lavada, con 20 veces su volumen del tampón de dilución. Después del tratamiento, el porcentaje de la forma activa es inferior al 0,1% para la mayoría de las preparaciones PC, y no excede el 0,4% para el análogo de PC en el que el residuo en la posición P_{1}' es una serina. La presencia de PCa neutralizada no interfiere con la activación de la trombina de la fracción cimógeno.

Ejemplo 4 Caracterización de las variantes de PC Determinación de la velocidad de activación

Las constantes de velocidad para la activación por trombina de las variantes de PC se determinaron bajo condiciones de seudo primer orden. En la práctica, la PC (1 \muM) fue incubada en presencia de trombina (de 10 nM a 50 nM, en función de la variante de PC) en tampón cinético (Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 0,15 M, 0,2% de PEG 8000 (p/v), 0,5 mg/ml de albúmina de suero bovino y CaCl_{2} 5 mM). Después de tiempos de incubación variables, se añadieron hirudina (200 unidades/ml) a 5 \mul de alícuotas de la mezcla de reacción (con el fin de detener la reacción y neutralizar la trombina).

A continuación, la cantidad de PCa generada es estimada mediante la medición de la velocidad inicial de hidrólisis de piroGlu-Pro-Arg-pNA 200 \muM (S2366, Biogenics, Lattes, Francia). Se graba la variación en absorbencia a 405 nm como una función del tiempo utilizando un lector de microplaca MR5000 (Dynex, Guyancourt, Francia), y la concentración de PCa es deducida mediante la referencia a una curva estándar.

A continuación, la constante de velocidad para la reacción es estimada mediante una regresión no lineal de la variación de la concentración de PCa como una función del tiempo utilizando una ecuación que representa un incremento exponencial de primer orden:

PCa_{(t)} = PC(1 - exp^{(-kt)}) + Cte;

en la que PCa_{(t)} representa la concentración de PCa en el tiempo t; PC representa la concentración total de PC (activable), y k representa la constante de velocidad de primer orden; Cte es una constante que se añade para tener en cuenta una posible (pequeña) actividad amidolítica presente al inicio, antes de la adición del activador (ruido de fondo). Los valores de k_{on} (constante de especifidad) se calculan formando la relación de k respecto a la concentración del activador (trombina). Los valores obtenidos (en M^{-1}s^{-1}) se resumen en la Tabla II.

TABLA II

2

La sustitución del péptido de activación de la PC por fibrinopéptido A (variante Fpa-L1D) incrementa el valor de k_{on} 40 veces. La sustitución adicional en esta variante del aspartato P_{3}' por una glicina (Fpa-LIG) sólo incrementa levemente k_{on}, pero si la isoleucina en P_{2}' es, además, sustituida por una fenilalanina (Fpa-LFG), el valor de k_{on} se hace 96 veces superior que el valor de la PC normal. Finalmente, cuando la leucina en P_{1}' es sustituida por una alanina (Fpa-AIG) o por una serina (Fpa-SIG), el valor de k_{on} se hace, respectivamente, 100 y 500 veces superior que el de la PC normal, un valor que no es tan lejano al de la activación de la PC normal en presencia de trombomodulina (PC+TM).

Activación preparativa de las variantes de PC

Para los estudios funcionales, la PC y sus derivados fueron activados en cantidades preparativas con un activador aislado a partir de veneno de serpiente de Agkistrodon contortrix contortrix (Protac, Kordia Leiden, Holanda). 9 unidades de Protac se acoplan a 1 ml de Sapharose-NHS activada (Hi-Trap, Amersham Pharmacia Biotech), respetando las recomendaciones del fabricante.

Una alícuota de 1 ml de PC (1 \muM) en tampón de activación (Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 50 mM, EDTA 5 mM y 0,2% (p/v) PEG) es inyectado en la columna injertada con Protac y equilibrada en el mismo tampón. La columna se cierra por ambos extremos y la incubación se mantiene durante 8 horas a temperatura ambiente. La PC activada es eluída de la columna inyectando 2 volúmenes de tampón de activación.

De manera alternativa, particularmente para los derivados de PC que pueden ser rápidamente activados por trombina, la activación se lleva a cabo en una columna de Sepharose injertada con trombina humana purificada (1 mg/ml de gel). El gel es preparado y utilizado bajo las mismas condiciones que las descritas anteriormente para la columna injertada con Protac. A continuación, las PCa son reconcentradas mediante una cromatografía de intercambio de iones en una columna Mono Q (Amersham Pharmacia Biotech). El eluato de la columna Hitrap es diluido (1/10; v/v) en Tris 50 mM, pH 7,5, y es cargado en la columna Mono Q, y la PCa es eluída con NaCl 0,5 M en Tris 50 mM, pH 7,5.

Titración de las variantes de PCa

La concentración de sitio activo de los derivados de la PCa activados se determina mediante titración con PPACK, que forma un complejo equimolar covalente con la PCa.

Diferentes concentraciones de PPACK, de entre 1 nM y 25 \muM, son incubadas con una cantidad fija de la PCa a titrar en tampón cinético. La mezcla es incubada a temperatura ambiente hasta completar la reacción. El tiempo de incubación requerido depende del derivado de PCa considerado y resulta necesario asegurarse de que la prolongación de la incubación no conlleva la inhibición de moléculas PCa adicionales: tres horas de incubación resultan suficientes para una PCa normal, pero 18 horas resultan preferentes para los derivados de PCa que presentan una serina o una alanina en la posición 16 y también para el derivado que presenta una fenilalanina en la posición 17.

Al final de esta incubación, la concentración residual de la PCa es estimada mediante la medición de la velocidad inicial de la hidrólisis de S2366 200 \muM. Se graba la variación en absorbencia a 405 nm como una función del tiempo (v_{s}) utilizando un lector de microplaca MR5000. A continuación, la concentración eficaz de PCa inicialmente presente (E_{t}) es estimada mediante una regresión no lineal de la dependencia de v_{s} como una función de la concentración de PPACK añadida, utilizando la ecuación "inhibición de unión fuerte" (CHA, Biochem. Pharmacol., 24, 2177-2185, 1975; Williams y Morrison, Methods Enzymol., 63, 437-467, 1979):

v_{s} = (v_{0}/2[E_{t}]){[(K_{i} + [PPACK] - [E_{t}])^{2} + 4K_{i}[E_{t}]]^{1/2} - (K_{i} + [PPACK] - E_{t})}

donde v_{0} es la velocidad inicial de hidrólisis de S2366 en ausencia del inhibidor, y K_{i} es una constante de inhibición aparente para el complejo inhibidor de la enzima.

Actividad amidolítica de las variantes de PCa

Con el fin de caracterizar el sitio activo de las variantes de PCa, las constantes k_{cat} y K_{M} fueron determinadas para la hidrólisis de dos sustratos cromogénicos: S2366 y D-Phe-Pip-Arg-pNA (S2238, Biogenic). Las hidrólisis se llevan a cabo en tampón cinético que contienen CaCl_{2} 5 mM o EDTA 5 mM, a temperatura ambiente. Diferentes concentraciones de sustrato, de entre 50 \muM y 3.000 \muM, son incubadas con una cantidad fija de PCa (de 10 nm a 50 nM en función de la variante). Se graba la variación en absorbencia a 405 nm como una función del tiempo utilizando un lector de microplaca MR5000, y la velocidad inicial de hidrólisis es estimada mediante una regresión lineal de las absorbencias correspondientes, como mucho, al 10% de hidrólisis. A continuación, las constantes k_{cat} y K_{M} son estimadas mediante una regresión no lineal de la variación de esta velocidad inicial como una función de la concentración de sustrato, utilizando la ecuación Michaelis-Menten.

Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla III.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA III

3

Las formas activas de los derivados de PC en las que el residuo en P_{1}' es una alanina (Fpa-AIG) o una serina (Fpa-SIG), y también el derivado que presenta una fenilalanina en P_{2}' (Fpa-LFG), muestran una reducción de su actividad amidolítica. ND: no determinado. Para el sustrato S2366, en presencia de Ca2+, la mutación de la isoleucina a fenilalanina en la posición P_{2}' causa un incremento superior a 8 veces en el K_{M} y una reducción de 1,7 veces en la k_{cat}. La sustitución de la leucina en la posición P_{1}' por una alanina o una serina genera un incremento de 7 veces y 8 veces en el valor de K_{M}, respectivamente. El valor de k_{cat} es reducido 3 veces con la variante que alberga una serina en P_{1}', mientras que, para la variante con una alanina, el valor de k_{cat} es comparable al determinado con la PCa. La dependencia de Ca^{2+} de la PCa con respecto a la hidrólisis de estos 2 sustratos es conservada con las diferentes variantes de PC: en presencia de EDTA, el valor k_{cat}/K_{M} se reduce ligeramente.

La forma activada de la variante Fpa-SIG es aquella para la que la constante de especificidad para hidrólisis de los sustratos S2238 y S2366 es la más reducida.

Determinación de la vida media en plasma de las variantes de PCa

La vida media de las variantes de PCa fue comparada con la de la PCa normal (PCa recombinante preparada bajo las mismas condiciones o PCa purificada a partir de plasma humano).

Para estimar esta vida media, la actividad residual de diversas PCa es medida después de la incubación para un periodo variado de tiempo en plasma normal, convertido en no coagulable mediante la adición de hirudina. La mezcla de reacción está compuesta, al 80% (v/v), de una colección de plasmas normales citrados y de PCa (de 50 nM a 200 nM en función de la variante) en tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 150 mM, 0,5 mg/ml de albúmina de suero bovino y 80 U/ml de hirudina. Después de la incubación, una alícuota de la mezcla plasma/PCa/hirudina (40 \mul) es añadida a 160 \mul de S2366 250 \muM, y la velocidad inicial de hidrólisis del sustrato es medida mediante la grabación del incremento en absorbencia a 405 nm en un lector de microplaca MR5000.

A continuación, la vida media de cada variante es estimada mediante una regresión no lineal de la variación en actividad residual como una función del tiempo utilizando una ecuación que representa una reducción exponencial de primer orden:

A_{(t)} = A_{0} exp^{(-Kt)} + Cte;

en la que A_{(t)} representa la actividad residual de la PCa en el tiempo t, A_{0} representa su actividad inicial, y k representa la constante de velocidad de primer orden. La constante Cte se añade para tener en cuenta una posible actividad independiente de la actividad de la variante de PCa (ruido de fondo).

A continuación, la vida media en plasma se calcula dividiendo ln(2) por k.

Los valores obtenidos (en min^{-1}) se resumen en la Tabla IV.

TABLA IV

4

Las vidas medias fueron determinadas en plasma citrado mediante la medición de la reducción en actividad PCa como una función del tiempo. La vida media es 10 veces más larga para la variante de PCa en la que el residuo en P_{1}' es una serina y el residuo en P_{3}' una glicina (Fpa-SIG).

La vida media en plasma de la forma activada de la variante Fpa-SIG es incrementada 10 veces comparada con la PCa normal.

Ensayos de coagulación

Las actividades anticoagulantes de la PCa y de sus derivados fueron determinadas mediante la medición de la prolongación del tiempo de cefalina con activador de una colección de plasma normal citrado recalcificado, en presencia de concentraciones variables de PCa o de uno de sus derivados (Richarson et al., Nature, 360, 261-264, 1992).

Estos ensayos se realizan por duplicado en una máquina ST4 (Diagnostica Stago, Asnières, Francia). Las formas activadas de las PCa se diluyen en un tampón Tris 50 mM, pH 7,5 que contiene NaCl 0,15 M y 0,5 mg/ml de albúmina de suero bovino. Para cada ensayo, 50 \mul de una dilución de PCa, 50 \mul del reactivo "APTT" (Organon Technika, Fresnes, Francia) y 50 \mul de la colección de plasma citrado se mezclan e incuban durante 3 minutos a 37ºC. La coagulación se inicia mediante la adición de 50 \mul de tampón de dilución que contiene CaCl_{2} 25 mM.

La Tabla V representa la actividad anticoagulante de los derivados de PCa, expresada como porcentaje de la actividad anticoagulante de la PCa normal 1 nM.

TABLA V

5

El porcentaje de la actividad anticoagulante está expresado en relación a la PCa normal, que sirve como referencia (100% corresponde a la actividad anticoagulante de la PCa 1 nM). Para cada variante, la concentración requerida para obtener una actividad anticoagulante equivalente a 1nM de PCa es estimada. La actividad anticoagulante de la variante Fpa-AIG es, por ejemplo, 20% de la actividad de la PCa normal (se requieren 5 nM de la variante para obtener la misma actividad que 1 nM de PCa normal).

La actividad anticoagulante de la variante Fpa-SIG representa el 6% de la actividad de la PCa normal.

Análisis de la formación de complejos de Las variantes activas Fpa-AIG y Fpa-SIG con \alpha1-antitripsina

La capacidad de las formas activas de las variantes Fpa-AIG y Fpa-SIG para formar un complejo estable con \alpha1-antitripsina (Calbiochem) se demostró mediante la incubación de variantes de PC activadas (5 \muM) con \alpha1-antitripsina 40 \muM, en tampón cinético, durante 5 horas a 37ºC.

El producto de reacción fue analizado en gel de poliacrilamida al 10% bajo condiciones de desnaturalización. Los resultados se muestran en la Figura 4.

Leyenda de la Figura 4:

Carril 1: Fpa-AIG incubada durante 5 horas a 37ºC en presencia de \alpha1-antitripsina, carril 2: Fpa-AIG sola (2 \mug). Carril 3: Fpa-SIG incubada en presencia de \alpha1-antitripsina, carril 4: Fpa-SIG sola. Carril 5: PCa normal incubada en presencia de \alpha1-antitripsina, carril 6: PCa normal sola. Carril 7: \alpha1-antitripsina sola. Todas las variantes de PCa forman un complejo covalente con \alpha1-antitripsina.

La formación de un complejo estable entre PCa y \alpha1-antitripsina da lugar a la formación de una banda de peso molecular elevado. Este gel revela que las variantes de PCa en las que el dominio catalítico presenta una alanina o una serina en la posición 16 son capaces de formar un complejo estable con \alpha1-antitripsina en la concentración fisiológica normal de la serpina.

Conclusión Efectos de la modificación del péptido de activación de la PC

En el caso del derivado de PC en el que 7 de los 12 residuos del péptido de activación (desde P_{12} hasta P_{6}, es decir, la secuencia DTEDQED) han sido eliminados, la velocidad de activación (bajo condiciones fisiológicas y en ausencia de trombomodulina) es doblada en comparación a la de la PC normal expresada y caracterizada bajo las mismas condiciones. Por lo tanto, esto muestra que el péptido de activación limita la capacidad de la trombina de clivar la PC; se cree que constituye una de las barreras que limitan su activación en ausencia de trombomodulina.

En el caso del derivado de PC en el que los 12 residuos del péptido de activación (desde P_{12} hasta P_{1}, es decir, la secuencia DTEDQEDQVDPR) han sido eliminados y sustituidos por la secuencia FpA humana (desde P_{10} a P_{1}, es decir, la secuencia DFLAGGGVR), la velocidad de activación (bajo condiciones fisiológicas y en ausencia de trombomodulina) es 40 veces superior que la de la PC normal expresada y caracterizada bajo las mismas condiciones. En conjunto, la modificación del péptido de activación de la PC hizo posible conseguir una constante de velocidad de activación de 2 x 104 M^{-1}s^{-1}.

Optimización de los residuos P_{1}',P_{2}' y P_{3}' del sitio de activación de la PC

Los presentes inventores han expresado y caracterizado variantes de PC que, además de presentar la secuencia FpA a continuación del sitio de clivaje activador, se modificaron en las posiciones 16, 17 y/o 18. En la posición 16, la leucina fue sustituida por una serina o una alanina; en la posición 17, la isoleucina fue sustituida por una fenilalanina, y en la posición 18, el aspartato fue sustituido por una glicina. Todas estas mutaciones desplazan, en mayor o menor grado, el sitio de activación de la PC más cerca de la secuencia de clivaje óptima de la trombina, y todas ellas incrementan eficazmente la susceptibilidad de cada variante al activador. La diferencia resulta particularmente espectacular con la variante que presenta una serina en la posición 16 y una glicina en la posición 18, ya que el valor de la constante de activación obtenido (1,6 x 10^{5} M^{-1}s^{-1}) es del mismo orden de magnitud que el obtenido para la PC normal en presencia de trombomodulina (5 x 10^{5} M^{-1}s^{-1}, Tabla II).

La ganancia en relación al derivado de PC que presenta sólo FpA a continuación del sitio de clivaje es, con este mutante, superior a 10 veces. Esta ganancia se debe especialmente a la mutación L16S, ya que la contribución de la mutación D18G es sólo de 1,6 veces (Tabla II).

Cuando el residuo 16 es una alanina, la ganancia es de aproximadamente 2 veces (en relación al mutante que presenta FpA y mutado en D18G); siendo esta ganancia similar a la obtenida cuando se sustituye la isoleucina en 17 por una fenilalanina.

Sin embargo, excepto para la mutación D18G, estas modificaciones presentan (en grados variables) una consecuencia perjudicial sobre la actividad catalítica de la PCa. Cuando el residuo 16 es una serina, la actividad anticoagulante es 20 veces inferior que la PCa normal, cuando el residuo 16 es una alanina, la actividad anticoagulante es 5 veces inferior, y la actividad catalítica es 13 veces inferior cuando el residuo 17 es una fenilalanina.

Esta pérdida (relativa) de actividad probablemente refleja un desemparejamiento de la propia maquinaria catalítica ya que el valor de la constante de especificidad (k_{cat}/K_{M}) para un sustrato cromogénico tal como S2366 o S2238 es reducido, en proporciones similares (27 veces cuando una serina está en la posición 16, 5 veces cuando es una alanina y 12 veces cuando el residuo 17 es una fenilalanina). Es concebible que la serina, y en un grado inferior la alanina, no hacen posible la formación de todos los contactos necesarios para la activación máxima de la maquinaria catalítica; siendo la hidrofobicidad de la alanina inferior a la de los otros residuos alifáticos, valina, leucina o isoleucina, mientras el residuo serina es de naturaleza hidrofílica. La hidrofobicidad probablemente no es, por otra parte, la causa de la pérdida de actividad resultante de la mutación en la posición 17, ya que la hidrofobicidad de una fenilalanina es comparable a la de una leucina. El efecto desestabilizador puede ser el resultado de un bloqueo estérico, presentando la cadena lateral de la fenilalanina un mayor volumen (190 A^{3}) que la leucina (124 A^{3}); de manera alternativa, puede producirse una repulsión entre la carga de Asp^{189} y la carga parcial del anillo aromático de la fenilalanina.

La deficiencia catalítica de los mutantes activados obviamente genera la pregunta acerca de la ganancia efectiva total como consecuencia de la mutación. A primera vista, esta ganancia no es favorable, ya que el incremento en la velocidad de activación parece perderse completamente debido a la deficiencia en actividad: la relación de la ganancia en velocidad de activación a la pérdida de actividad catalítica es inferior a uno (10/20 y 2/5 para la serina y la alanina en la posición 16, 2/13 para una fenilalanina en la posición 17).

Sin embargo, esta deficiencia en la actividad está acompañada por un resistencia relativa a los inhibidores de plasma y, por lo tanto, prolonga su acción. Por lo tanto, comparada con la PCa normal, la vida media en plasma del mutante que presenta una serina en la posición 16 es incrementada 10 veces, la del mutante que presenta una alanina es incrementada entre 5 y 6 veces, y la del mutante que presenta una fenilalanina en la posición 17 es incrementada 7 veces. Bajo estas condiciones, mientras la ganancia efectiva se mantiene inferior a 1 para el mutante con la fenilalanina en la posición 17, y permanece cercana a cero para la mutación L16S, se hace muy favorable para el mutante que presenta una alanina en la posición 16. En conjunto, a pesar de una reducción en la actividad catalítica, la velocidad de activación y el incremento en la vida media en plasma confieren al mutante L16A una ventaja considerable sobre los otros derivados de PC descritos hasta la fecha.

Ejemplo 5 Construcción de vectores para expresión de variantes de FX

Los vectores destinados para la expresión de las variantes de FX se construyeron utilizando, como materia prima, el vector pNUT-FX, que expresa el FX humano normal después de la transfección a células de mamífero (Bianchini et al., J. Biol. Chem. 277, 20527-20534, 2002).

Mutagénesis sitio dirigida del vector pNUT-FX

La mutagénesis sitio dirigida del vector pNUT con el fin de preparar los vectores destinados a la expresión de los análogos de FX se llevó a cabo mediante un procedimiento derivado del de Jones et al., (citado anteriormente). La modificación del ADNc de FX para la introducción de la secuencia FpA en sustitución del péptido de activación se obtuvo en una única etapa de PCR, con el vector pNUT-FX como matriz y los pares de oligonucleótidos mostrados en la Tabla VI como cebadores.

En el FX nativo, la secuencia de los residuos P_{3}-P_{2}-P_{1}-P_{1}'-P_{2}'-P_{3}' que bordean el sitio de clivaje (el clivaje teniendo lugar entre P_{1} y P_{1}') es LTR-IVG. Los cuatro análogos de FX preparados: FpA-IVG, FpA-IFG, FpA-AVG y FpA-AFG, tienen por secuencia P_{3}-P_{2}-P_{1}-P_{1}'-P_{2}'-P_{3}': GVR-IVG, GVR-IFG, GVR-AVG y GVR-AFG respectivamente.

Los vectores que expresan estos análogos de FX fueron preparados mediante mutagénesis sitio dirigida. La secuencia de los cebadores utilizados para esta mutagénesis del vector pNUT-FX es mostrada en la Tabla VI.

6

En esta tabla, la primera columna indica la modificación introducida en el péptido de activación: DFLAEGGGVR se refiere a que en el derivado preparado el péptido de activación de FX entero ha sido sustituido por la secuencia del fibrinopéptido A. Para cada mutagénesis, la secuencia del par de oligonucleótidos utilizados (sentido y antisentido) es mostrada en la columna de la derecha. La columna central de la tabla indica la secuencia P_{1}', P_{2}' y P_{3}' de aminoácidos del sitio de activación.

La PCR se lleva a cabo en un volumen de 50 \mul que contiene 2,5 unidades de Pfu ADN polimerasa (Stratagene; Amsterdam Zuidoost, Holanda) en el tampón recomendado por el fabricante, una mezcla equimolar de cada dNTP (0,5 mM), 125 ng de cada cebador (sentido y antisentido, ver Tabla VI) y 50 ng de matriz. La matriz utilizada para preparar los derivados DFLAEGGGVR-IVG y DFLAEGGGVR-IFG es pNUT-FX; la temperatura de hibridación es de 55ºC. La matriz utilizada para preparar los derivados DFLAEGGGVR-AVG y DFLAEGGGVR-AFG es pNUT-FX, derivándose DFLAEGGGVR-IVG previamente; la temperatura de hibridación es de 50ºC. Las PCR se llevaron a cabo utilizan un termociclador de ADN tipo 480 (Perkin Elmer). Cada reacción comprende una etapa inicial de desnaturalización a 95ºC durante 5 minutos, seguida de 16 ciclos idénticos, cada uno de los cuales comprende tres etapas (desnaturalización, hibridación y elongación) de, respectivamente, 45 segundos a 95ºC, 60 segundos a 55ºC (o 50ºC) y 26 minutos a 68ºC. Al final de estos 16 ciclos, el vector que ha servido como matriz es degradado a 37ºC durante 1 hora con 10 unidades de Dpnl (Ozyme).

Preparación de vectores derivados de pNUT-FX

Las bacterias, cepa DH5\alpha (Dam+) se hacen competentes lavándolas a 4ºC en CalCl_{2} 100 mM y se almacenan a -80ºC en una solución de CaCl_{2} 100 mM que contiene glicerol al 15%. Una alícuota de bacterias competentes (aproximadamente 10^{6} en 100 \mul) es transformada con 5 \mul-10 \mul del producto de la PCR digerido con Dpnl. La mezcla es incubada durante 30 minutos a 4ºC y a continuación, es sometida a un choque de calor durante 2 minutos a 42ºC seguido de una incubación adicional a 4ºC durante 2 minutos. A continuación, las bacterias son incubadas a 37ºC durante 60 minutos en un medio LB (caldo Luthia Bertoni, Invitrogen) con agitación vigorosa. El medio LB es decantado después de una centrifugación a 2.000 rpm durante 5 minutos, y las bacterias se colocan en agar (1,5% de Agar-Select en medio LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina). Los platos Petri son incubados en un incubador a 37ºC durante 36 horas. Entre 6 y 12 colonias son aisladas y amplificadas durante la noche con agitación vigorosa, a 37ºC, en 5 ml de medio LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina. El vector responsable de la resistencia a la ampicilina es purificado mediante el procedimiento de "lisis por ebullición" (Sambrook et al., citado anteriormente). De manera alternativa, para preparar grandes cantidades de plásmido, el kit "Plasmid Midy Kit" (Qiagen) fue utilizado según las instrucciones del fabricante.

Secuenciación de los ADNc de las variantes de FX

La secuencia del ADNc presente en los derivados de pNUT-FX se controló mediante un procedimiento derivado del procedimiento en Sanger et al., (citado anteriormente), utilizando un secuenciador "Abi Prism 377" (Perkin Elmer). Se utilizó el kit "Abi Prism dRhodamine Terminador Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" según las instrucciones del fabricante. La secuenciación del ADNc del FX completo contenida en los derivados de pNUT-FX se llevó a cabo utilizando un mínimo de 6 cebadores distribuidos a lo largo de la secuencia del ADNc del FX.

Ejemplo 6 Transfección y selección de células de mamífero que expresan una variante de FX Transfección de células BHK-21

Las proteínas recombinantes fueron expresadas en células de riñón de hamster recién nacido (BHK-21) proporcionadas por la Colección Europea de Cultivos Tipo (Sofia-antipolis, Francia). Estas células fueron transfectadas con los vectores derivados a partir de pNUT-FX, mediante el procedimiento de coprecipitación con fosfato de calcio (Sambrook et al., citado anteriormente).

Las células BHK-21 son cultivadas en platos Petri (80 mm de diámetro) en un incubador a 37ºC bajo una atmósfera de CO_{2} al 5%, en un medio completo de DMEM (Dulbecco's Modified Eagle 15 Medium; Invitrogen): suplementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen), L-glutamina 2 mM (Invitrogen), 100 unidades/ml de penicilina (Invitrogen) y 100 \mug/ml de estreptomicina (Invitrogen). Cuando alcanzan una confluencia de aproximadamente el 80%, las células son secadas dos veces en tampón PBS (Invitrogen) y a continuación son incubadas a 37ºC durante 1 hora en 4 ml de Opti-Mem (Invitrogen).

La transfección es llevada a cabo añadiendo 40 nM del vector pNUT-FX o uno de sus derivados (40 \mug en un volumen de 220 \mul ajustada con agua destilada) a 250 \mul de una solución, a un pH de exactamente 7,05, compuesta de Hepes 50 mM, Na_{2}HPO_{4} 1,5 M, NaCl 280 mM, KCl 10 mM y dextrosa 12 mM. La coprecipitación del ADN es obtenida añadiendo 31 \mul de CaCl_{2} 2,5 M, gota a gota y con agitación constante. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, el precipitado es añadido al medio cubriendo las células y se deja sedimentar durante 3 horas a 37ºC. Las células son lavadas con PBS (con el fin eliminar la mayor parte del precipitado) y devueltas al cultivo en medio DMEM completo durante 24 horas a 37ºC. Las células se separan de la placa Petri con 2 ml de una solución EDTA a 54 mM, pH 8,0, que contiene 0,5 mg/ml de tripsina, son resuspendidas en el medio de selección (DMEM completo que contiene 50 mg/l de metotrexato (Teva, Courbevoie, Francia), y son resembradas en dos nuevas placas Petri. El medio de cultivo es renovado cada dos días durante un intervalo entre dos y tres semanas, hasta que se obtienen las colonias, que son aisladas y transferidas a los tubos (2 cm^{2}) de una placa de cultivo, donde son multiplicadas hasta la confluencia en el medio de selección.

Identificación de clones que producen un derivado de FX

Los clones que expresan de manera estable un derivado de FX son detectados mediante inmunotransferencia. Una alícuota (30 \mul) del sobrenadante de un cultivo de células BHK-21, que permaneció en contacto con las células transfectadas por lo menos durante 48 horas, es añadida a 10 \mul de Tris 100 mM, pH 6,8, que contiene 40% (v/v) de glicerol, 8% (p/v) de SDS, 0,04% (p/v) de azul de bromofenol y 20% (v/v) de \beta-mercaptoetanol. Las proteínas en la muestra son desnaturalizadas a 95ºC durante 5 minutos, y son separadas en 12% de gel de poliacrilamida (entrecruzamiento 29/1) en un tampón Tris 25 mM, pH 7,5, que contiene glicina 0,1 M y 0,1% (p/v) SDS.

La electroforesis es seguida por una transferencia a una membrana de nitrocelulosa (Trans-Blot, Bio-Rad, Ivry sur Seine, Francia) en tampón Tris 25 mM, glicina 0,1 M, pH 7,5, que contiene 20% de metanol. La membrana es saturada mediante incubación durante 1 hora a temperatura ambiente en una solución de leche desnatada (5% p/v) en tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl de 150 mM y 0,1% de Tween 20 (TTBS), y a continuación lavada 3 veces durante 10 minutos en el mismo tampón. A continuación, la membrana es incubada durante un intervalo entre 1 hora y 12 horas en presencia de 50 ng/ml del anticuerpo monoclonal 9E10 (Clontech, Palo Alto, CA, USA) en TTBS.

Después de tres lavados (como se ha descrito anteriormente), la membrana es incubada durante una hora a temperatura ambiente en presencia de un anticuerpo policlonal IgC de cabra anti ratón marcado con fosfatasa alcalina (Bio-Rad), diluida a 1/3.000 en TTBS. La presencia de FX recombinante es revelada incubando la membrana en presencia de un sustrato cromogénico (mezcla en cantidades iguales de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato, sal de toluidina (BCIPT) y cloruro de nitrotetrazolio (NTC), diluido en tampón 0,1 M, pH 9,5, que contiene MgCl_{2} 0,5 M.

Ejemplo 7 Expresión y purificación de variantes de FX Cultivo de células y producción

Las células que expresan el derivado de FX son multiplicadas mediante pasos sucesivos en matraces de 150 cm^{2} que son utilizados para inocular botellas de 850 cm^{2}. La producción se lleva a cabo a 37ºC bajo una atmosfera controlada que contiene 5% de CO_{2}, en medio de selección que contiene ZnCl_{2} 50 \muM (para inducir el promotor de metalotioneína) y 5 \mug/ml de vitamina K (Roche, Neuilly sur Seine, Francia) para permitir la \gamma-carboxilación postranslacional. Los sobrenadantes del cultivo son recogidos en intervalos de 2 a 6 días (en función de la densidad celular), son clarificados mediante centrifugación durante 10 minutos a 5.000 g y son almacenados a -20ºC después de añadir EDTA 5 mM y benzamidina 10 mM.

Los derivados de FX son purificados en tres etapas. La primera es la absorción en resina de intercambio de aniones con el fin de concentrar las proteínas contenidas en el sobrenadante del cultivo. Los sobrenadantes son diluidos a 1/3 en Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene benzamidina 10 mM y EDTA 5 mM. Típicamente, se diluyen dos litros de sobrenadante en cuatro litros de tampón, se añaden 4,5 gramos de QAE Sephadex A50 (Amersham Pharmacia Biotech) y la mezcla es agitada lentamente durante 30 minutos a temperatura ambiente (utilizando un agitador de paleta rotatoria). Se dejan sedimentar las perlas de Sephadex y el sobrenadante se elimina. La resina cargada es transferida a una columna y las proteínas absorbidas son eluídas con tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 0,5 M. La segunda etapa es una cromatografía de afinidad para separar el derivado de FX de las otras proteínas contenidas en el eluato de QAE-Sephadex. El eluato es cargado en gel Affi-Prep-HZ (Bio-Rad) injertado (3 mg/ml de gel) con el anticuerpo monoclonal 9E10 (Clontech). Después del lavado en tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 0,5 M, el derivado de FX es eluído en tampón glicina-HCl 0,1M pH 2,7. El pH del eluato es ajustado a 7,5 añadiendo 30 \mul/ml de Tris 2 M, y la columna es reequilibrada en el tampón de lavado. La etapa final de la purificación es una cromatografía de intercambio de aniones adicional para eliminar la glicina y concentrar el derivado eluído de la columna de afinidad. Diversos eluatos, que hacen un total de entre 1 mg y 10 mg de derivado de FX, son recogidos, diluidos a 1/4 en tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene EDTA 5 mM, y son cargados en una columna Q-Sepharose Fast Flow (0,8 cm x 10 cm)(Amershan Pharmacia Biotech). Después del lavado en tampón de dilución, la columna es eluída con tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 0,5 M.

Se prepara un mínimo de 1 mg de cada derivado de FX; la pureza de cada preparación es controlada, después de la desnaturalización y la reducción de una muestra, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (12%, entrecruzamiento 29/1) y tintado con azul Coomassie. Todas las preparaciones obtenidas parecen ser puras en gel de poliacrilamida SDS, pero dos formas se encuentran sistemáticamente presentes: una forma principal de cadena doble (80% a 90%), con masas moleculares aparentes compatibles con las esperadas para las cadenas ligeras y pesadas de los derivados de FX, y una forma de cadena simple secundaria (10% a 20% en función de las preparaciones), con una masa molecular de 46 kDa. El porcentaje de la forma de cadena simple parece depender de la colección de sobrenadantes a partir de la que se deriva la preparación en vez de depender de la mutación introducida: para una mutación determinada, el porcentaje de la forma de cadena simple varía de una purificación a otra. Los derivados purificados se alicuotan y se almacenan a -80ºC hasta su utilización. La concentración de las alícuotas es estimada a partir de su absorbencia a 280 nm, tomando como coeficiente de absorción el valor 1,25 g^{-1}cm^{-1} (e%280).

Ejemplo 8 Caracterización de las variantes de FX Determinación de la velocidad de activación por trombina

Las constantes de velocidad para la activación por trombina de las variantes de FX fueron determinadas bajo condiciones de pseudoprimer orden. En la práctica, el derivado de FX (1 \muM o 2 \muM) es incubado en presencia de trombina (100 nM) en tampón cinético (Tris 50 mM, pH 7,8, que contiene NaCl 0,15 M, 0,2% de PEG 8000 (p/v) y CaCl_{2} 5 mM), a 37ºC. Después de diferentes tiempos de inoculación, se añaden (100 unidades/ml) de hirudina a 5 \mul de alícuota de la mezcla de reacción (con el fin de detener la reacción neutralizando la trombina).

A continuación, la proporción de FXa generada es estimada midiendo la velocidad inicial de hidrólisis de N-\alpha-Z-Arg-Gly-Arg-pNA 100 \muM (S2765, Biogenic). La variación en absorbencia a 405 nm es grabada como una función del tiempo utilizando un lector de microplaca MR5000. La reacción se mantiene hasta que se alcanza una meseta de activación (cuando la velocidad de la hidrólisis de S2765 ya no incrementa incluso con incubación más larga del derivado de FX con trombina).

A continuación, la constante de velocidad para la reacción es estimada mediante una regresión no lineal de la variación en velocidad de hidrólisis de S2765 como una función del tiempo de incubación del derivado de FX con trombina, utilizando una ecuación que representa un incremento exponencial de primer orden:

v_{(t)} = V_{max}(1-exp^{(-kt)}) + V_{0};

en la que v_{(t)} representa la velocidad de hidrólisis de S2765 en el tiempo t; V_{max} representa la velocidad máxima de hidrólisis (en la meseta) y k representa la constante de velocidad de primer orden; V_{0} es una constante que es añadida para tener en cuenta una posible (pequeña) actividad amidolítica presente al inicio, antes de la adición del activador (ruido de fondo). Los valores de k_{on} (constante de especifidad) son calculados formando la relación de k a la concentración del activador (trombina). Los valores obtenidos (en M^{-1}s^{-1}) se resumen en la Tabla VII.

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TABLA VII

7

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La sustitución del péptido de activación del FX por fibrinopéptido A (variante FpA-IVG) por lo tanto hace posible transformar FX (cuya activación por trombina no puede detectarse: ND) en un cimógeno sensible a trombina (k_{on} 4 x 10^{2} M^{-1}s^{-1}). La sustitución adicional en esta variante de la valina en la posición P_{2}' por una fenilalanina (FpA-IFG) incrementa esta velocidad 7,5 veces. Si la isoleucina en P_{1}' es sustituida por una alanina (FpA-AVG), esta velocidad incrementa 5,5 veces. Finalmente, cuando la isoleucina en P_{1}' es sustituida por una alanina y la valina en P_{2}' es sustituida por una fenilalanina (FpA-AFG), el valor de k_{on} se hace 625 veces superior que la del derivado FpA-IVG de FX. La actividad catalítica de los derivados activados obtenidos a partir de FpA-AIG, FpA-IFG y especialmente a partir de FpA-AFG es enormemente reducida en relación al derivado activado obtenido a partir de FpA-IVG. El derivado FpA-IVG debería generar, tras la activación, una FXa idéntica en todos los aspectos a la FXa normal, ya que el péptido de activación es liberado durante la activación. Los otros derivados generan FXa en las que el residuo P_{1}' y/o el residuo P_{2}' son modificados, lo que altera la actividad catalítica en mayor o menor grado.

Activación preparativa de las variantes de FX

Para los estudios funcionales, el FX y sus derivados fueron activados en cantidades preparativas. El FX (no activable por trombina) fue activado pasándolo a una columna de Sepharose-NHS (Hitrap, Amersham Pharmacia, Biotech) injertada, en 5 mg/ml de gel, con el activador FX aislado a partir de veneno de víbora Russel (RVV-X, Kordia, Leiden, Holanda) y preparado respetando las recomendaciones del fabricante. Los derivados de FX activables por trombina fueron activados a derivados de FXa pasándolos a una columna de Sepharose-NHS injertada, en 1 mg/ml de gel, con trombina, también preparada respetando las recomendaciones del fabricante.

Cuatro miligramos de derivado de FX en tampón cinético son introducidos en la columna de activación. La columna es cerrada en ambos extremos y la incubación se mantiene durante 16 horas a temperatura ambiente. El derivado activado es eluído con Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 0,5 M y CaCl_{2} 5 mM. El eluato contiene la forma activada pero, debido a que la activación no es siempre completa, posiblemente permanezca alguna forma no activada. Para separar la forma activada de la no activada, el eluato es diluido a 1/3 en Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene CaCl_{2} 5 mM (para reducir la fuerza iónica), se carga en una columna de Heparina-Sepharose Hitrap (Amersham Pharmacia Biotech) y es eluído con tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 0,5 M y CaCl_{2} 5 mM.

Titración de la forma activada de las variantes de FX

La concentración del sitio activo de los derivados de FX activados es determinada mediante titración con D-Phe-Phe-Arg-Ch_{3}Cl (FFRCK; comercializado por Calbiochem), que forma un complejo covalente equimolar con la FXa.

Diferentes concentraciones de FFRCK, de entre 20 nM y 12 \muM, son incubadas con una cantidad fija (de entre 0,5 \muM y 1 \muM) de derivado de FXa a titrar, en tampón cinético. La mezcla es incubada a temperatura ambiente hasta completar la reacción. El tiempo de incubación requerido depende del derivado de FXa considerado, y resulta necesario asegurarse de que la prolongación de la incubación no causa la inhibición de moléculas de FXa adicionales: tres horas de incubación resultan suficientes para la FXa normal y para la forma activada del derivado de FpA-IVG, pero 18 horas no resultan suficientes para los derivados de FXa que presentan una alanina en la posición 16 y/o una fenilalanina en la posición 17, y que resultan difíciles de titrar mediante este procedimiento.

Al final de esta incubación, la concentración residual de derivado de FXa es estimada midiendo la velocidad inicial de hidrólisis de S2765 100 \muM. La variación en absorbencia a 405 nm como una función del tiempo (v_{s}) es grabada utilizando un lector de microplaca MR5000. La concentración efectiva del derivado de FXa inicialmente presente (E_{t}) es a continuación estimada mediante una regresión no lineal de la dependencia de v_{s} como una función de la concentración de FFRCK añadida, utilizando la ecuación "inhibición de unión fuerte" (Cha; Williams y Morrison, citado anteriormente):

v_{s} = (v_{0}/2[E_{t}])\{[(K_{i} + [FFRCK] - [E_{t}])^{2} + 4K_{i}[E_{t}]]^{1/2} - (K_{i} + [FFRCK] - E_{t})\}

en la que v_{0} es la velocidad inicial de hidrólisis de S2765 en ausencia de inhibidor, y K_{i} es una constante de inhibición aparente para el complejo inhibidor de enzima.

Actividad amidolítica de la forma activada de la variante FpA_IVG

Con el fin de comparar el sitio activo de la forma activada de la variante FpA-IVG con el de la FXa normal, las constantes k_{cat} y K_{M} para la hidrólisis de dos sustratos cromogénicos fueron determinadas: S2756 y bencil-CO-IIe-Glu-(y-OR)-Gly-Arg-pNa (S2222), comercializados por Biogenic. Las hidrólisis se llevan a cabo en tampón cinético, a temperatura ambiente. Diferentes concentraciones de sustrato, de entre 6 \muM y 800 \muM, son incubadas con una cantidad fija del derivado activado de FX (10 nM). La variación en absorbencia a 405 nm como una función del tiempo es grabada utilizando un lector de microplaca MR5000, y la velocidad inicial de hidrólisis es estimada mediante una regresión lineal de las absorbencias correspondientes, como mucho al 10% de hidrólisis. Las constantes k_{cat} y K_{M} son a continuación estimada mediante una regresión no lineal de la variación de esta velocidad inicial como una función de la concentración de sustrato, utilizando la ecuación Michaelis-Menten.

Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla VIII.

TABLA VIII

8

Los valores de k_{cat} y K_{M}, y también la relación entre los mismos, para S2222 y S2765 son similares incluso cuando no son idénticos. Este resultado sugiere que la FXa generada por la activación por trombina del derivado FpA-IVG es de hecho la misma que la generada mediante la activación RVV-X de FX.

Inhibición por antitrombina de las formas activadas de las variantes de FX

La antitrombina es el principal inhibidor fisiológico de FXa. Por lo tanto, resultaba esencial determinar la capacidad de la antitrombina para interactuar con las formas activadas de los derivados de FX, ya que cualquier alteración de la vida media en plasma modificaría la acción procoagulante del derivado de FX.

Los presentes inventores compararon la capacidad de FXa de formar un complejo covalente estable con la antitrombina, con la capacidad de las formas activadas de los derivados FpA-IVG y Fpa-AVG de FX. La demostración de estos complejos entre la forma activada de los derivados de FX (1 \muM) y la antitrombina (2 \muM; purificada a partir de plasma humano según la técnica descrita por Mckay (Thromb. Res., 21, 375-25 382, 1981)) es llevada a cabo en presencia de 2 unidades/ml de heparina (Kordia). La incubación se mantiene durante una hora a temperatura ambiente, y la mezcla de reacción es analizada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (10%, entrecruzamiento 29/1), después de la desnaturalización y la reducción de la muestra. La presencia de complejos covalentes entre los derivados de FX activados y la antitrombina resulta en una reducción de la intensidad de la banda correspondiente a la antitrombina (60 kDa), una reducción en la intensidad de la banda correspondiente a la forma activada del derivado de FX (31 kDa), y la aparición de una nueva banda, con un peso molecular superior (aproximadamente 100 kDa), correspondiente al complejo covalente.

Los resultados se muestran en la Figura 5.

Carril 1: antitrombina sola; carriles 2 y 3: derivado de FX (normal) sin y con antitrombina; carriles 4 y 5: derivado FpA-IVG activado sin y con antitrombina. La formación de un complejo resulta en la aparición de una banda de peso molecular alto (carriles 3, 5), que está ausente cuando la antitrombina es utilizada sola o cuando una de las formas activadas del derivado de FX es utilizada sola (carriles 2, 4). Tras la electroforesis, las proteínas son tintadas con azul Coomassie.

Determinación de la vida media en plasma de la forma activada de la variante FpA-IVG del FX

La vida media de la forma activada de la variante Fpa-IVG fue comparada con la de la FXa normal.

Para estimar esta vida media, la actividad residual de la variante es medida después de la incubación durante diferentes tiempos en plasma normal, convertido en no coagulable mediante la adición de hirudina. La mezcla de reacción comprende 80% (v/v) de plasmas normales citrados y de 20% de tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 150 mM, CaCl_{2} 40 mM, 0,5 mg/ml de albúmina de suero bovino, 400 U/ml de hirudina y FXa 50 nm (normal o preparada a partir de la variante FpA-IVG). Tras la incubación, una alícuota de la mezcla plasma/FXa/hirudina (40 \mul) es añadida a 160 \mul de S2765 100 \muM, y la velocidad inicial de hidrólisis del sustrato es medida mediante la grabación del incremento en la absorbencia a 405 nm en un lector de microplaca MR5000.

La vida media de cada variante es estimada mediante una regresión no lineal de la variación en la actividad residual como una función del tiempo, utilizando una ecuación que representa una reducción exponencial de primer orden:

A_{(t)} = A_{0} exp^{(-kt)} + Cte;

en la que A_{(t)} representa la actividad residual de FXa en el tiempo t, A_{o} representa su actividad inicial y k representa la constante de velocidad de primer orden. La constante Cte es añadida para tener en cuenta una posible actividad independiente de la de la FXa (ruido de fondo). La vida media en plasma es a continuación calculada dividiendo ln(2) por k.

Los valores de vida media obtenidos (en segundos) se resumen en la Tabla IX.

TABLA IX

10

La vida media en plasma de la forma activada de la variante Fpa-IVG es, por lo tanto, comparable a la de la FXa normal, lo que sugiere una vez más que estas dos moléculas son similares, o incluso idénticas.

Actividad antihemofílica del derivado FpA-IVG del FX

La actividad antihemofílica del derivado FpA-IVG de FX se ensayó midiendo la cantidad de trombina producida en el tiempo: un ensayo normalmente denominado "tiempo de generación de trombina". Esta medición es realizada en plasma normal reconstituido (Diagnostica Stago, Asnières, Francia) o en plasma sin FVIII (también Diagnostica Stago) para simular hemofilia A grave. La cascada de coagulación es iniciada mediante recalcificación y adición de factor tisular. Con el fin de poder eliminar una alícuota en diferentes momentos, la formación de coágulos de fibrina es inhibida mediante la adición del péptido Gly-Pro-Arg-Pro 2,5 mM (GPRP; Sigma Aldrich) tal como se describe en Laudao et al. (Biochemistry 19, 1013-1019, 1980). La cantidad de trombina presente en un momento determinado después del inicio de la cascada de coagulación es medido utilizando un sustrato cromogénico (S2238).

En la práctica, 150 \mul de plasma reconstituido se mezclan con 150 \mul de tampón cinético que contiene el péptido GPRP 2,5 mM, y opcionalmente, derivado FpA-IVG de FX 50 nM o 1 U/ml de factor recombinante VIII (Hemofil M, Baxter Maurepas, Francia, correspondiente al tratamiento convencional para la hemofilia). Esta mezcla es preincubada durante 3 minutos a 37ºC. La cascada de coagulación es a continuación iniciada mediante la adición de 300 \mul de una solución de Neoplastine (Diagnostica Stago) diluida a 1/100 en tampón cinético. Alícuotas de 20 \mul son tomadas en diferentes momentos y son inmediatamente diluidas a 1/5 en una solución de parada (tampón cinético que contiene benzamidina 100 mM y EDTA 10mM). La cantidad de trombina es estimada mediante la adición de 20 \mul de cada alícuota diluida a 180 \mul de S2238 200 \muM. La variación en absorbencia a 405 nm como una función de tiempo es grabada utilizando un lector de microplaca MR5000 y la correspondiente cantidad de trombina es deducida con referencia a una curva estándar. La concentración de trombina se incrementa rápidamente durante los dos primeros minutos tras la adición del factor tisular, alcanza un máximo, y a continuación decrece lentamente después de su inhibición irreversible por la antitrombina. El máximo alcanzado, el tiempo requerido para alcanzar este máximo y el área bajo la curva son representativos del "tiempo de generación de trombina".

Los "tiempos de generación de trombina" obtenidos con el plasma normal reconstituido, plasma sin factor VIII, plasma sin factor VIII suplementado con factor VIII a 1 U/ml y plasma sin factor VIII suplementado con derivado FpA-IVG de FX 50 nM se muestran en la Figura 6.

La adición de derivado FpA-IVG de FX 50 nM hace posible restablecer una curva de generación de trombina similar a la observada con un plasma normal, mientras que la adición de 1 U/ml de factor VIII (la dosis terapéutica normal) sólo restablece parcialmente esta "generación de trombina".

Conclusión Efectos de la modificación del péptido de activación de FX

Cuando, en FX, el péptido de activación completo (52 residuos) es sustituido por FpA humano (desde P_{10} a P_{1}, es decir, la secuencia DFLAEGGGVR), el derivado se convierte en activable por trombina, a diferencia de su homólogo normal, todo ello bajo condiciones fisiológicas.

Cuando este derivado es activado por trombina, el producto obtenido es muy similar, o incluso idéntico (no parte de la reivindicación 6), a la FXa normal (su estructura de aminoácidos covalente es idéntica). La actividad catalítica, la vida media en plasma, y su inhibición por antitrombina son comparables. En conjunto, la modificación del péptido de activación de FX hizo posible obtener un derivado activable por trombina capaz de corregir el tiempo de generación de trombina en un plasma sin factor VIII.

INSERM

\hskip1cm

LE BONNIEC, Bernard

\hskip1cm

MARQUE, Pierre-Emmanuel

\hskip1cm

LOUVAIN, Virginie

\hskip1cm

CALMEL, Claire

\hskip1cm

BIANCHINI, Elsa

\hskip1cm

AIACH, Martine

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<120> Proteínas quiméricas clivables por trombina

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<130> MJPbv598/58PCT

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<160> 23

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 419

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

11

12

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<210> 2

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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\sa{Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 3

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gactttctag ctgaaggagg aggcgtgcgg ctcattgatg ggaagatgac c

\hfill

51

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<210> 4

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 4

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cacgctcctc cttcagctag aaagtctcgt ttcaggtgac tgcgcttctt

\hfill

50

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<210> 5

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 5

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gaaggaggag gcgtgcgctc ttcggcggga agatgaccag gcg

\hfill

43

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<210> 6

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<211> 41

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgcctggtca tcttcccgcc gaagagccgc acgcctcctt c

\hfill

41

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<210> 7

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<211> 44

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 7

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gaaggaggag gcgtgcggtc cattggcggg aagatgacca ggcg

\hfill

44

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<210> 8

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<211> 44

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 8

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cgcctggtca tcttcccgcc aatggaccgc acgcctcctc cttc

\hfill

44

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<210> 9

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<211> 44

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 9

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gaaggaggag gcgtgcgggc cattggcggg aagatgacca ggcg

\hfill

44

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<210> 10

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<211> 44

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 10

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcctggtca tcttcccgcc aatggcccgc acgcctcctc cttc

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggaggag gcgtgcggct cattggcggg aagatgacca ggcg

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcctggtca tcttcccgcc aatgagccgc acgctcctcc ttc

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcgcagtca cctgaaacga caagtagatc cgcggctcat

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgagccgcg gatctacttg tcgtttcagg tgactgcgct

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactttctag ctgaaggagg aggcgtgagg atcgtgggag gccaggaatg c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacgcctcct ccttcagcta gaaagtccct cttcctgcgt tccagggtct g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactttctag ctgaaggagg aggcgtgagg atcttcggag gccaggaatg caagg

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagatcctc acgcctcctc cttcagctag aaagtccctc ttcctgcgtt ccagggtctg

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggaggcg tgagggccgt gggaggccag gaatg

\hfill

35

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cattcctggc ctcccacggc cctcacgcct cctcc

\hfill

35

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggaggcg tgagggcctt cggaggccag gaatgcaag

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

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<400> 22

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\hskip-.1em\dddseqskip

cttgcattcc tggcctccga aggccctcac gcctcctcc

\hfill

39

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

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<211> 488

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 23

13

14

Claims (18)

1. Derivado quimérico clivable por trombina de un cimógeno serina proteasa seleccionado de entre la proteína C o el factor X, caracterizado porque el péptido de activación nativo de dicho cimógeno es sustituido por el fibrinopéptido A, o por una parte del mismo, dicha sustitución generando una secuencia clivable por trombina P_{10}P_{9}P_{8}P_{7}P_{6}P_{5}P_{4}P_{3}P_{2}P_{1}P_{1}'P_{2}'P_{3}' donde P_{10}P_{9}P_{8}P_{7}P_{6}P_{5}P_{4}P_{3}P_{2}P_{1} representa los aminoácidos P_{10} a P_{1} del fibrinopéptido A y P_{1}'P_{2}'P_{3}' representa Leu-IIe-Asp o IIe-Val-Gly.

2. Derivado quimérico de proteína C caracterizado porque es obtenido a partir de un derivado de proteína C según la reivindicación 1 sustituyendo el aspartato en la posición P_{3}' por una glicina.

3. Derivado quimérico de proteína C o factor X caracterizado porque puede obtenerse a partir de un derivado según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 sustituyendo la leucina o la isoleucina en la posición P_{1}' por una alanina o una serina.

4. Derivado quimérico de proteína C o factor X caracterizado porque puede obtenerse a partir de un derivado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 sustituyendo la isoleucina o la valina en la posición P_{2}' por una fenila-
lanina.

5. Procedimiento para la producción de una proteína C activada (PCa) o un factor X activado (FXa) o un derivado de los mismos en el que dicho procedimiento comprende el clivaje de un derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 con trombina.

6. Derivado de PCa obtenido mediante clivaje por trombina de un derivado quimérico de proteína C según cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4.

7. Molécula de ácido nucleico que codifica un derivado quimérico de proteína C o factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un derivado de PCa según la reivindicación 6.

8. Par de cebadores de amplificación para obtener una molécula de ácido nucleico que codifica un derivado quimérico de proteína C o factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichos cebadores se seleccionan de entre:

- el par de oligonucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 3 y 4,

- el par de oligonucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 5 y 6,

- el par de oligonucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 7 y 8,

- el par de oligonucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 9 y 10,

- el par de oligonucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 11 y 12,

- el par de oligonucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 13 y 14,

- el par de oligonucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 15 y 16,

- el par de oligonucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 17 y 18,

- el par de oligonucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 19 y 20,

- el par de oligonucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 21 y 22.

9. Vector recombinante, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7.

10. Sistema de suministro génico caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7.

11. Célula huésped transformada genéticamente con una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7.

12. Utilización de una proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o de una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7 para producir un producto medicinal.

13. Utilización de un derivado de PCa según la reivindicación 6 para la producción de un producto medicinal.

\newpage

14. Utilización según la reivindicación 12, caracterizada porque se utiliza una PC quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de ácido nucleico que codifica dicha PC quimérica para la producción de un producto medicinal antitrombótico.

15. Utilización según la reivindicación 12 caracterizada porque se utiliza un FX quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4 o una molécula de ácido nucleico que codifica dicho FX quimérico para la producción de un producto medicinal procoagulante.

16. Utilización según la reivindicación 13 caracterizada porque dicho derivado de PCa es utilizado para la producción de un producto medicinal antitrombótico.

17. Composición farmacéutica que comprende por lo menos una proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un derivado de PCa según la reivindicación 6 combinada con un excipiente adecuado.

18. Composición farmacéutica que comprende un sistema de suministro génico según la reivindicación 10.