JPH02145184A - 新規血栓溶解蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は１組織プラスミノーゲン活性化因子型活性を有
する新規血栓溶解蛋白質に関するものである。より詳細
には１本発明は９組換新規血牟全溶解蛋白質、該蛋白質
をコードするＤＮＡ分子、遺伝的に操作した細胞から該
蛋白質を得る方法、該蛋白質を含有する医薬組成物、お
よび血栓溶解剤としての該物質の治療上の使用に関する
ものである。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

Ａｌａ　Ｌ−アラニン　　　　　Ｌｅｕ　Ｌ−ロイシン
Ａｒｇ　Ｌ−アルギニン　　　　Ｉ、ｙｌＳ　Ｌ−リジ
ンＡｓｎ　Ｌ−アスパラギン　　　ＭｅｔＬ−メチオニ
ンＡｓｐ　Ｌ−アスハラキン酸ＰｈｅＬ−フェニルアラ
ニンＣｙａ　Ｌ−システィン　　　　Ｐｒｏ　Ｌ−プロ
リンＧｉｎ　Ｌ−グルタミン　　　　Ｓｅｒ　Ｌ−セリ
ンＧｌｕ　Ｌ−グルタミン酸Ｔｈｒ　Ｌ−スレオニンＧ
ｔｙグリシン　　　　　　ＴｒｐＬ−トリプトファンＨ
４ｓ　Ｌ−ヒスチジン　　　　Ｔｙｒ　Ｌ−チロシン１
１ｅＬ−インロイシン　　　Ｖａｔ　Ｌ−バリンまた。

ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌクレオ
チドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、たとえ
ば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸ヲ示ス。）Ｔ　チ　ミ　ン（デオキシチ
ミジル酸を示す。）さらに、　（Ｈ２Ｎ）−及び−（Ｃ
ｏｏ）（）はそれぞれアミノ酸配列のアミン末端側及び
カルボキシ末端側を示すものであり、（５勺及び（３′
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

（従来の技術） ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ヒトｔ−ｐＡ）
は、従来の血栓溶解剤であるストレプトキナーゼ（ＳＫ
）およびウロキナーゼ（ＵＫ）に代わる血栓溶解剤とし
て注目されている〔松尾埋：　ｔ−ＰＡとｐｒｏ−ＵＫ
学際企画、　　１９８７．　ｐｐ７５−１７６）。

このヒトｔ−ＰＡを構成するアミノ酸配列およびヒトｔ
−ＰＡをコードするｃＤＮＡの塩基配列は。

Ｐｅｎｎ１ｃａらにより決定されており公知である［：
　Ｐｅｎｎ１ｃａ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒ
ｅ　３０１　（１９８３）　２１４２２１　：）。

本明細書中のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の番号体系は、こ
のＰｅｎｎ１ｃａらの論文に準じている。一方。

塩基配列の番号体系は便宜上ｔ−ＰＡの開始コドンＡＴ
ＧのＡを起点に番号付けを行っている。

ｔ−ＰＡは、血管内皮細胞においてプレプロ配列を含む
前駆体ｔ−ＰＡ　（５６２アミノ酸残基）として合成さ
れた後、細胞内の酵素によりＡｒｇ−（−１）−８ｅｔ
−（＋１）の結合が分解され５２７アミノ酸残基からな
る一本鎖の糖蛋白質として細胞外へ分泌される。この−
本領ｔ−ＰＡは、Ａｒｇ−２７５とＩ　ｌｅ　−２７６
の間でプラスミンによる分解を受け。

Ｎ末側のＨ（Ａ）鎖とＣ末側のＬ　（Ｂ）鎖の二本鎖に
変換する。Ｈ鎖は４つのドメイン構造からなることが他
の蛋白質との配列相同性から推定されている（　Ｎｙ、
　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８１　（１９８４）　５３５５−５３５９．　Ｐａｔｔ
ｈｙ、　Ｉ−、、Ｃｅ１ｌ　４１　（１９８５）６５７
−６６３１゜　それらはＮ末側からフィンガー（Ｆ”）
ドメイン、ＥＧＦ（上皮成長因子）ドメイン、第１クリ
ングル（Ｋ１）ドメインおよび第２クリングル（Ｋ、）
ドメインと呼ばれている。この２つのクリングルドメイ
ンは、アミノ酸配列において約５５％の高い相同性を有
している。Ｆおよびに２ドメインは、フィブリン親和性
およびフィブリン依存性の蛋白分解活性の促進に関与し
ていると考えられている（　Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ、　Ｊ
、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ　５（１９８６）
　３５２５３５３０．　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ　ｖａｎ　
Ａ−Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　２６１（１９８６）　１４２１４−１４
２１８　〕。一方、Ｌ鎖は。

蛋白分解活性を有し２種々のセリンプロテアーゼと高い
相同性を示している。

ヒトｔ−ＰＡの最も特徴的なことは、フィブリンに対す
る高い親和性である。ヒトｔ−ＰＡは。

フィブリン親和性を持たないＳＫおよびＵＫとは対照的
に、循環血中のプラスミノーゲン（Ｐｌｇ）を効率的て
活性化しないが、フィブリンと結合したＰｉｇを極めて
効率的に活性化するため、出血傾向等の副作用の少ない
血栓溶解剤であると考えられている。また、実際の臨床
試験の報告では、静脈内投与したヒトｔ−ＰＡが心筋梗
塞の患者における閉塞冠動脈の再潅流をもたらすのに有
効であることが示されている（Ｔｈｅ　ＴＩＭＩＳｔｕ
ｄｙ　Ｇｒｏｕｐ　：　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、Ｍｅｄ
、、　３１２　（１９８５）　９３２−９３６；　Ｆ：
ｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　５ｔｕｄｙ
　Ｇｒｏｕｐ　ｆｏｒ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｔＰ
Ａ、　Ｌａｎｃｅｔ　１　（１９８５）　８４２−８４
７　’］。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、血栓性疾病の治療におけるヒトｔ−ＰＡ
の使用上の不都合は、　　ｉｎ　ｖｉｖｏでの酵素活性
の血中半減期が極端に短かいこと（３−６分）である（
　Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ
、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ、。

２３５　（１９８５）　５０６−５１２　；　Ｖｅｒｓ
ｔｒａｅｔ’ｅ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｒｏｍ
ｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔ、＋　５６　（１９８６）　１−５　；
　Ｎｇｕｙｅｎ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｒｏｍ
ｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔ、、　５８　（１９８７）　４３７　（
Ａｂｓｔｒａｃｔ）’）。ｉｎ　ｖｉｖｏにおけルｔ−
ＰＡの急速な消失は、肝でのクリアランスが主因であり
、さらにｔ−ＰＡは、主にＨ鎖を介して肝に認識されて
いることが示唆されている（　　Ｒｉｊｋｅｎ、　　Ｄ
、　Ｃ，ａｎｄ　　Ｅｍｅｉｓ、　Ｊ、Ｊ、　　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　　Ｊ、　　２３８　　（１９８６）６４３
−６４６１゜よって、ヒトｔ−ＰＡによる血栓性疾病の
治療では十分な血中濃度を維持するために、持続静注投
与を必要とし、さらに多１のｔ−ＰＡ　（５０−１００
■）が必要である。それ故、ヒトｔ−ＰＡによる治療は
、非常に高価となり、また。

多量投与にともなう出血傾向、全身線溶先進も懸念され
る。

このような状況からフィブリン親和性およびフィブリン
依存性を維持したまま血中半減期が延長された新しいタ
イプのｔ−ＰＡの開発が望まれている。

（課題を解決するための手段） 本発明者等は、遺伝子組換の手法を用いて新しいタイプ
のｔ−ＰＡの開発を進めてきたが、従来のｔ−ＰＡにお
けるに、ドメインに含まれるアミノ酸配列を修飾した下
記のアミノ酸配列で示される新規な蛋白質が天然ｔ−Ｐ
Ａの望ましい生物学的活性を維持したまま、　　ｉｎ　
ｖｉｖｏの血中半減期が飛躍的に延長したすぐれた性質
を有していることを見い出し本発明を完成した。

すなわち２本発明は、下記一般式で示されるアミノ酸配
列からなる新規面枠溶解蛋白質である。

（Ｈ２Ｎ）−Ｒ５ｅｒ　Ｔｙｒ ９　　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ １７　　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ ２５　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ ３３　　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ ４１　　Ａｌａ　Ｇｌｎ ４９　　Ｌｙｓ　５ｅｒ ５７　　Ｐｈｅ　Ａｓｎ ６５　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ ７３　　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ Ｇｉｎ　Ｖａｌ　　ｌ１ｅ Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　５ｅｒ Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　５ｅｒ Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　　　８ １１ｅ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　　１６ Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　　２４ Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　　３２ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　　４０ Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　　４８ Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　　５６ Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　　６４ Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　　７２ Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　　８０ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ＩＪｅ　
Ａｓｐ　ＴｈｒＡｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙ
ｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＧｉｎＧｌｙ　　ｌｉｅ　　Ｓｅ
ｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　−Ｘ−３ｅｒ　
Ｔｈｒ　　Ａｌａ　Ｇｌｕ　、Ｓｅｒ　Ｇａｙ　Ａｌａ
　ＧｌｕＣｙｓ　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　
Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＡｌａＬｅｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｌｙ
ｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＡｒｇ　Ａｒｇ　
Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　ＬｅｕＧｌ
ｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ
　ＣｙｓＡｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａ
ｓｐ　Ｓｅｒ　ＬｙｓＰｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ
　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＡｌａＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔ
ｙｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　ＣｙｓＳｅｒ
　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　
ＧｌｙＡｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　
Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　ＨｉｓＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈ
ｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　５ｅｒＣｙｓ　
Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　’Ｉ’ｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ
　　ｌ１ｅＬｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　
Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＡｌａＧｌｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅ
ｒ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　ＣｙｓＡｒ
ｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｌａ
　ＬｙｓＰｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＡｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ
　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　ＣｙｓＡｓｐ　Ｖａｌ　Ｐ
ｒｏ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　ＣｙｓＧｌｙ
　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　
Ｐｒ。

Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇ
ｌｙ　ＬｅｕＰｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　　Ｉｌｅ　Ａｌ
ａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒ。

Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ａｌａ Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　５ｅｒ Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ Ｔｈｒ　Ｖａｌ　　Ｃｙｓ Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　Ｌｅｕ Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ Ｈｉｓ　　Ｇｌｕ　Ａｌａ Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ Ｖａｌ　　Ａｒｇ　Ｌｅｕ Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ、Ｇｉｎ Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｔ Ａｒｇ　Ｍｅｔ　　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ｉｌｅ　　Ｐｈｅ Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｌ１ｅ Ｔｒｐ　　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　　ｌ１ｅ Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ １１ｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ａｓｐ　Ｓｅｒ　　５ｅｒ Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　５ｅｒ Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ Ａｌａ　ＡＳｎ　　Ｌｅｕ Ｇｌｙ　Ａｓｐ　５ｅｒ Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ Ｌｅｕ　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ Ａｌａ　Ｌｙｓ Ｇｌｕ　Ａｒｇ Ｌｅｕ　　ｌ１ｅ Ｓｅｒ　Ａｌａ Ａｒｇ　Ｐｈｅ Ｖａｌ　　ｌ１ｅ Ｖａｌ　　Ｖａｌ Ｌｙｓ　Ｐｈｅ Ｖａｌ　　Ｈｉｓ Ｔｈｒ　Ｔｙｒ Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ Ａｒｇ　Ｃｙｓ Ｖａｌ　Ａｒｇ Ａｌａ　Ａｓｐ Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ Ｐｈｅ　Ｔｙｒ Ａｌａ　Ｈｉｓ Ｓｅｒ　Ａｒｇ Ｌｅｕ　Ａｓｎ Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ Ｈｉｓ　Ａｓｐ Ｇｕｙ　Ｇｕｙ Ａｓｐ　Ｇｌｙ １１ｅ　　Ｉｌｅ ４９７　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｃ
ｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　　５０４５０５　Ｌｙｓ　Ａｓ
ｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ
　　５１２５１３　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　
Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　　５２０５２１　１
１ｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｐｒ
ｏ−（ＣＯＯＨ）（式中、Ｒは存在しないか。

Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇ
ｌｙ　ＬｅｕＣｙｓ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ
　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　ＧｌｙＡｌａ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｖ
ａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ＧｉｎＧｌｕ　Ｉｌｅ
　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　ＡｒｇＧ
ｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ。

Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ。

Ｍｅｔ、　　または Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ であることを意味する。

またＸは、存在しないが、またはＴｒｐを除く天然の蛋
白質を構成するアミノ酸からなる群から選ばれた任意の
１個のアミノ酸であることを意味する。） 上記、Ｘの説明洗おいて、［Ｔｒｐを除く天然の蛋白質
を構成するアミノ酸Ｊとしては、たとえば、　　Ａｌａ
、　Ｇｌｕ、　Ｇｉｎ、　Ａｓｐ、　Ａｓｎ、　Ｌｅｕ
、　Ｇｌｙ。

Ｌｙｓ、　　Ｓｅｒ、　　Ｖａｌ、　　Ａｒｇ、　　Ｔ
ｈｒ、　　Ｐｒｏ、　　Ｉｌｅ、Ｍｅｔ。

Ｐｈｅ、　Ｔｙｒ、　Ｃｙｓ、　Ｈｉｓなどを挙げるこ
とができる。

これらのアミノ酸の中、好ましいものは、　Ａｌａ。

Ｇｌｕ、　Ａｓｐ、　Ｇｌｙ、　Ｌｙｓ、　Ｓｅｒ、　
Ａｒｇ、　Ｔｈｒ、　Ｐｒｏ。

Ｍｅ、ｔまたはＨｉｓである。また、さらに好ましいも
のとしては、　　Ｓｅｒ、　Ａｒｇ、　ＰｒｏまたはＨ
ｉｓを挙げることができる。

（以下余白） したがって２本発明の目的は、上記アミノ酸配列を有す
る新規血栓溶解蛋白質を提供することである。他の目的
は、該蛋白質をコードする新規ＤＮＡ分子およびその組
換発現ベクターを提供するものであり、また該ＤＮＡ分
子で形質転換した宿主細胞を培養し、得られた培養物か
ら該蛋白質を分離することを特徴とする新規血栓溶解蛋
白質の製造方法を提供することにある。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）　　ヒトｔ−ＰＡをコードするＤＮＡ分子の作成
本発明によれば、出発物質としてヒトｔ−ＰＡｃＤＮＡ
クローンを使用してＤＮＡ組換技術を用いることにより
、これらの新規な蛋白質を生産することが好ましい。ヒ
トｔ−ＰＡ前駆体をコードするｃＤＮＡクローン　（ヒ
トｔ−ＰＡｃＤ、ＮＡ）は、　　Ｂｏｗｅｓヒト黒色腫
紀胞系からのｍＲＮＡを出発材料に公知の手法によりｃ
ＤＮＡライブラリーを作成し、それよりコロニーハイブ
リダイゼーションの手法を用いて単離することができる
（実施例１参照）。

ヒ）　ｔ−ＰＡおよび本発明の新規血栓溶解蛋白質を発
現させるために使用した動物細胞用発現ベクターｐＶＹ
ＩＡは、外来遺伝子挿入のための制限酵素部位が、Ｂｇ
ｌ［部位である。一方。

ヒトｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡには、プレプロ配列と成熟ｔ−
ＰＡの接続部分（すなわちＡｒｇ−（−１）とＳｅｒ　
−（１）の部分）にＢｇｌ　［部位を持つが、プレプロ
配列のＮ末端より上流にＢｇｌ　［部位はない。そこで
、　　ＤＮＡ組換技術を用いてｔ　−ＰＡｃ　ＤＮＡを
ｐＶＹＩＡのＢｇｌ　Ｉ［部位へ簡単に挿入できるよう
改変するのが好ましい。それには、　Ａｒｇ（−１）と
５ｅｒ−（１）の部分に存在するＢｇｌ　、［部位は、
　　ＡｒｇをコードしていたコドンをＡＧＡからＣＧＡ
に変更することにより消失させ、プレプロ配列のＮ末端
のコドン（ＡＴＧ）の５′上流ては新たにＢｇｌ　’［
の制限酵素配列を付ける必要がある。また、必要以上に
長い３′非翻訳領域は、　ＸｈｏＬＩ哨化により除去す
ることが好ましい。こうして作製した修飾ｔ−ＰＡＤＮ
Ａは。

以下の新規血栓溶解蛋白質産生のため出発材料として用
いるべく２部位特異的突然変異実験の可能な、ファージ
ミド（たとえば、　　ｐ’ｒｚ１８／１９．　ｐＵｃ１
１８／１１９など）またはファージＤＮＡ　（たとえば
Ｍ　１３ｍｐ　１８／ｍｐ　１９など）に挿入する。

また、前述したようにｔ−ＰＡのアミノ酸配列は公知で
あるので、上記の修飾型ｔ−ＰＡＤＮＡは、アミノ酸を
指定するいくつかのコドンの中から適当なものを選び、
それを公知の化学合成の手法により作製することができ
る。

すなわちｔ−ＰＡに対応するＤＮＡを何本かのオリゴヌ
クレオチドに分けてそれらを化学合成し、各々のオリゴ
ヌクレオチドを常法により連結することにより作製する
ことができる。

各オリゴヌクレオチドの合成は市販の全自動ＤＮＡ合成
機を用いたホスファイト法による合成が好ましい。

また１発現用に選択した宿主細胞にあわせて、　　ｔ−
ＰＡ前駆体のプレプロ配列をもっとも産生効率の高い他
のプレプロ配列におきかえて修飾型ｔ−ＰＡＤＮＡを合
成してもよい。

（ｂ）　　新規血栓溶解蛋白質をコードするＤＮＡ分子
の作製 本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ分子は。

ｔ−ＰＡをコードするＤＮＡ配列を慣習的な部位特異的
突然変異誘発法により変異させることにより達成される
。また該蛋白質のアミノ酸配列に基づき、ＤＮＡ分子を
化学合成（前述）により作成することもできる。

（ｃ）新規血栓溶解蛋白質の製造方法 本発明のＤＮＡ分子は、新規血栓溶解蛋白質をコードし
ているので、このＤＮＡ分子を適当な宿主細胞において
発現させることにより該蛋白質を生産し得る。適当な哨
乳動物宿主細胞およびその発現ベクター、形質転換方法
、培養法、および生産産物の精製方法は。

本分野では既知である。例えば、　Ｈａｙｎｅｓ、　Ｊ
、　ａｎｄＷｅｌｓｓｍａｎｎ、Ｃ，、Ｎｕｃｌ、　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒａｓ、　１１　（１９８３）　６８７−７
０６；Ｂｅｂｂ　ｊｎｇｓｔｏｎ＋　Ｃ，Ｒ，ａｎｄ　
Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ、　Ｃ，Ｃ，Ｇ、、　Ｉｎ　：　Ｇ
ｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、（ｅｄ）ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎ
ｇ　　ｖｏｌ［［、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒ
ｄ　（１９８７）ｐｐ１６３−１８８　；　Ｆｒｅｓｈ
ｎｅｙ、Ｌ　１．、　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｎｉｍ
ａｌ　ｃｅｌｌｓ。

Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、ＮＹ１９８７　
：　Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，Ｉｎ　：　Ｇｌｏｖｅｒ。

Ｄ、Ｍ、（ｅｄ）　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｏｌ　
ｌｌ、　　Ｉ　ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ（１
９８５）　ｐｐ１４３−１９０　；　Ｐｅｒｂａｌ、　
Ｂ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｇｕｉｄｅｔｏ　ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉ　ｌ
ｅｙ＆５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、（１９８４）ｐｐ４８７−
５４３　；特公昭６２−１６９３１号（昭６２　（１９
８７）４月１５日公告）；日本生化学会編：続生化学実
験講座８血液（下）、東京化学同人（１９８７）ｐｐ６
０３−６１０ 実施例７では、該蛋白質をコードするＤＮＡ分子を発現
ベクターｐＶＹＩＡに挿入した。ｐＶＹＩＡは、プラス
ミドｐＫｓＶ１０　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＢａｍＨ
Ｉ−ＫｐｎＩ断片約２９００塩基対（ｂｐ）部分と。

プラスミドｐＡｄＤ２６ｓＶ（Ａ）　ｎｏ、３　　（東
京大学半田宏博士より入手）より構成される。上記のＢ
ａｍＨＩ　−Ｋｐｎ　Ｉ断片には、　ＳＶ４０の初期遺
伝子の転写ユニット（Ｓｖ４０初期プロモータ、介在配
列およびポリＡ付加シグナルなどを含む）が含まれ２本
発明のＤＮＡ分子はこの転写ユニットを利用して発現さ
れる。またｐＡｄＤ　２６ＳＶ　（Ａ）　ｎｏ、　３は
、アデノウィルス２型主要後期プロモータの制御下にマ
ウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードしてお
りメトトレキセート（ＭＴＸ）　　を用いた細胞内の遺
伝子増巾が可能である。また本発明の実施において使用
できる他の哺乳動物細胞は、　　ＶＥＲＯ細胞。

ＣＶ−１細胞、　　ＬＣＣ−ＭＫ２細胞、　　ＣＯ３−
１およびＣ０８−７細胞、　　ＨｅＬａ細胞、２９３細
胞、　　ＲＰＭＩ８２２６細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細
胞、ＷＩ３８細胞、　ＣＨＯ−Ｋｌ細抱等である。また
、該蛋白質をコードするＤＮＡは、　　ＳＶ４０初期プ
ロモーター以外に、ｔ−ＰＡやアクチンなどの細胞内遺
伝子由来のプロモーターやＳＶ４０後期遺伝子、アデノ
ウィルス主要後期遺伝子、サイトメガロウィルスｉｍｍ
ｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ遺伝子、各種レトロウィルス
のＬＴＲ（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ
）　などのウィルス遺伝子のプロモーターの制御下に発
現することができる。

また、該蛋白質は、適当な昆虫、酵母、および細菌細胞
において産生させることができるが、実施する際に有用
な宿主細胞９発現ベクター、形質転換方法、細胞培養法
および生産産物の精製法も本分野では知られている［前
田進、ウィルス、　３７　（１９８６）　１−１１　；
中尾ｊ員二；実験医学５　（１９８７）　１３６−１４
１　；山本修巳。

実験医学５　（１９８７）　１３１−１３５　；　Ｃａ
ｒｔｅｒ、Ｂ、Ｌ、Ａ。

ａｔ　ａｌ、、　Ｉｎ　Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、（ａ
ｄ）　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｏｌ［［、Ｉ　ＲＬ
Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ　（１９８７）　ｐｐ　１
４１−１６１　；　Ｍａｒｇｔｏｎ。

Ｆ、　Ａ、　Ｏ，Ｉｎ　Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｆｖｌ（
ｅｄ）　ＤＮＡ　ａｔｏｎｉｎｇ　ｖｏｌ　ｌ［、ＩＲ
ＬＰｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ　（１９８７）　ｐｐ５
９−８８　：　地神芳文・田中秀明、タンパク質工学実
験マニエアル（池原森男・三木敬三部編〕、講談社すイ
エンティフィク（１９８８）　ｐｐ９８−１２０　］動
物細胞中で分泌生産されたｔ−ＰＡは、Ｎ末端の切断さ
れる位置の違いにより２種々のＮ末端配列から始まるこ
とが知られている。

一般に知られているＮ末端配列は１本発明のアミノ酸配
列においてＲが存在しないもの。

あるいはＲが存在しない上に更にＮ末端側の３つのアミ
ノ酸（Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　）が切断されて。

Ｎ末端がＶａｌから始まるもの、あるいはＲがＧｌｙ　
Ａｌａ　Ａｒｇであるもの等がある。このように。

動物細胞を宿主として、　　ｔ−ＰＡを分泌生産する場
合、シグナルペプチダーゼあるいはプロテアーゼによる
グロセッシングの受は方が。

細胞の種類により異なるために、Ｎ末端の異なるｔ−Ｐ
Ａが生産されることもありうる。この現象は培養細胞に
よる分泌生産の場合にだけ該当することではなく、大腸
菌、枯草菌。

酵母等その他の細胞により生産されたｔ　−ＰＡＯＮ末
側の修飾のされ方に関しても、同様のことが考えられる
がいずれのＮ末端配列を有する該蛋白質も１本発明に含
まれる。

また、ヒトｔ−ＰＡをコードするＤＮＡを各種培養細胞
において発現した場合、使用する宿主細胞の種類により
ｔ−ＰＡＫ付加される糖鎖の有無およびその化学構造が
変化しうるが糖鎖部分を全く含まない該蛋白質でありて
も異種の糖鎖を有した該蛋白質であっても本発明のＤＮ
Ａ分子の発現によって得られる限り。

本発明に含まれる。

各宿主細胞で発現した該蛋白質は、全て既知の方法によ
って９回収・精製上、物理化学的、生化学的および臨床
的要素に関して解析を行なう。

（発明の効果） かくして得られた９本発明の新規血栓溶解蛋白質は、天
然ヒ）　ｔ−ＰＡの構造をより多（含むことにより、大
規模な改変（ドメインごとの欠失、置換、付加や他の蛋
白とのハイブリッド）をほどこしたｔ−ＰＡ改変体より
も天然ヒ）　ｔ　−ＰＡの立体構造の多くを保持し、天
然ｔ−ＰＡの望ましい生物学的活性を保持したまま、　
　ｉｎ　ｖｉｖｏの血中半減期が著しく延長したすぐれ
た性質を有している。したがって１本発明の蛋白質は、
天然型ｔ−ＰＡについて推奨される投与量を著しく減少
させ、しかも年回投与で、天然ｔ−ＰＡと同じ臨床効果
をもつことが予想される。

また１本発明の該蛋白質は、天然型ｔ−ＰＡと同様、深
部静脈血栓２肺動脈塞栓、末梢、動脈血栓、心臓あるい
は末梢動脈由来の塞栓、急性心筋梗塞および血栓性発作
を含む脈管向凝固を包含する多種多様の後天性疾病の治
療に有用である。

以下に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を制限するものではない。本発
明の実施にあたり１組換ＤＮＡ操作は、特に断わらない
限り下記の実装置に従って実施した。

Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２）また各制
限酵素によるＤＮＡ消化法は２％にここに述べない限り
購入光の使用説明書に従った。合成オリゴヌクレオチド
は、いずれも３８０Ａ型ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）によりβシアノホスホアミ
ダイド法により合成したものである。ＤＮＡオリゴマー
の合成、脱保護、樹脂からの切断および精製は３８０Ａ
型ＤＮＡ合成機マニュアルに従った。

実施例１．　　ｔ　−ＰＡ　ｃＤＮＡのクローニングＢ
ｏｗｅｓヒト黒色腫細胞（米国国立癌研究所Ｒｏｂｌｉ
ｎ。

Ｒ９博士より入手）を０ｐｄｅｎａｋｋｅｒ等の方法［
０ｐｄｅｎａ−ｋｋｅｒ、　Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１３１．４８１−４８７．　
（１９８３）　］に準じて培養した。ｔ−ＰＡ　　ｍＲ
ＮＡを誘導するため、　　Ｔ　Ｐ　Ａ　（１２−０−Ｔ
ｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ　ｐｈｏｒｂｏｌ　１３−Ａ
ｃｅｔａｔｅ　）を、最終濃度１００　ｎｇ／ｍｔ加え
、１６時間培養した。次に、　　Ｆｒｅｅｍａｎらの変
法［Ｏｋａｙａｍａ／ＢｅｒｇｃＤＮＡ　？　ニーアル
、３頁（１９８５）、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社鯛］に従
って培養細胞から全細胞ＲＮＡの抽出を行なった。オリ
ゴｄＴセルロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を用
いて、ボ’）　（Ａ）”　ＲＮ　Ａを全細胞ＲＮＡより
分離した。その結果、およそ１０９個の細胞より約４０
０μｇのポリＦＡ＞ＲＮＡを得た。

このボＩＪ　（Ａ）”　ＲＮ　Ａを常法に従い、シヨ塘
密度勾配遠心法により分画した。分画した各ポ１，１　
（ＡビＲＮＡの一部をとり、ｔ−ＰＡ　　ｍＲＮＡに特
異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたドツト・プ
ロット・ハイブリダイゼーション［Ｐｅｒｂａｌ、　Ｂ
、。

Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ＋　４１ＣＬ　（１９８４
）　。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、］を行な
いｔ−ＰＡ　　ｒｎＲＮＡ分画を推定した。この除用い
たプローブ（プローブＹ）は、　　５’　−ＧＣＴＴＧ
ＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡ−３’の塩基配列を有し、前
記Ｐｅｎｎ１ｃａ等の報告したｔ−ＰＡの＋２９１〜＋
２９７のアミノ酸紀伝をコードするｍＲＮＡ領域に相補
的な紀伝である。クローンＹの５′末端の放射線標識は
、実験書１２２頁に従い。

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）およびγ−［
３２Ｐ］ＡＴＰを用いて行なった。

プローブＹは、主に２０〜３ＯＳのポリ（ＡＩ　ＲＮ　
Ａと強くハイブリダイズした（この画分なＭ画分と呼ぶ
）。

Ｍ画分から得たポリ囚ＲＮ　Ａ　１０μｇを鋳型として
Ｇｕｂｌｅｒ　−Ｈｏｆｆｍａｎ法［Ｇｕｂｌｅｒ、　
Ｕ、　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ、　Ｂ。

Ｊ、、　Ｇｅｎｅ、　２５．２６３．　（１９８３）コ
に従い逆転写酵素（生化学工業）を用いて、３μｇの二
本鎖ｅＤＮＡを合成し、この３′末端にＤｅｎｇ　−Ｗ
ｕの方法［Ｄｅｎｇ。

Ｇ　−Ｒａｎｄ　Ｗｕ、　Ｒ，、Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９．４１７３゜（１９８１）　］
を用いてデオキシＣ鎖を付加した。次にこのデオキシＣ
鎖付加二本鎖ｃＤＮＡをＣＬ４ＢＳｅｐｈａｒｏｓｅ　
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）にてゲル渥過を行ない、約５
００ｂｐ以下の低分子量核酸を除去した後、Ｐｓｔ）部
位にデオキシＧ鎖を付加したｐ１３　Ｒ３２２（Ｂｅｔ
ｈｅ−ｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ、）と常法に
よりアニーリングした。

アニール後の混合物を用い、　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ
　１０１コンピテントセル（宝酒造）を形質転換した。

その結果、約４０，０００株の独立した形質転換体から
なるｃＤＮＡバンクを得た。

このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａバンクを前述のプローブＹを用いて
、　Ｗｏｏｄｓの方法［Ｗｏｏｄｓ、　Ｄ、、　Ｆｏｃ
ｕｓ、　６　（３Ｌ　１　、（］、９８４）；　Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ、社製］に従い
、　コロニーハイブリダイゼーションを行ない、プロー
ブＹと反応するクローンを得、そのうち、最も長い１−
ＰＡｃＤＮＡ（約２５００ｂｐ　）を含むクローンのプ
ラスミドｐＢ　Ｒ３２２ｔＰＡ　（＃４２）についてｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａ部分の塩基配列決定を行なった。方法はＭ
１３ファージベクターを用いるジデオキシ法［Ｃａｒｌ
ｓｏｎ、　Ｊ、　ｅｔ　ａＬ。

Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１．２５３．　
（１９８４）　］および］７−ＤＥＡＺＡ法　Ｍｉｚｕ
ｓａｗａ、　Ｓ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

１４、１３１９．　（１９８６）　］を用いて行なった
。その結果プラスミドｐＢＲ３２２ｔＰＡ　（＃４２）
は、　　ｔ−ＰＡ前、躯体の塩基配列を完全に含むこと
が判明した。

実施例２．　　ｐＴＺ１８ｔＰＡＯＯ２遺伝子の構築ｔ
−ＰＡをコードする構造遺伝子を発現ベクターｐ　ＶＹ
　Ｉ　Ａ　Ｋ　Ｂｇｌ　■部位で組み込むために、ｔ−
ＰＡコード領域内、ヌクレオチド１０３にあるＢｇｌ■
部位を欠失させ、ＡＴＧの直前に、新たなりｇｌ■部位
を付与した修飾型ｔ−ＰＡ遺伝子（ｔＰＡ００２遺伝子
）を構築した。ｔ　Ｐ　Ａ　００２遺伝子の構築方法を
第１図に示す。

まず、プラスミドｐＢＲ３２２ｔＰＡ（＃４２）を、Ｂ
ａｄ■（宝酒造）１次にＢｇｌＩＩ（宝酒造）で順次消
化後。

１０％のアガロースゲル上で電気泳動を行ない。

ｔ−ＰＡｅＤＮＡに由来する約１．９　ｋｂｐのＢｇｌ
　ｌ［−Ｂａｌ　Ｉ断片（Ａ断片）を切り出し、ＤＮＡ
セル（第一化学薬品）を用いた電気溶出法により、精製
した。抽出方法は、ＤＮＡセル取扱説明書に従った。

次に、下記塩基配列で示されるｌａ、　　ｌｂ、　　２
ａ。

２ｂの４本のオリゴヌクレオチドを合成した。

５’　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＴＧＧ　ＡＴＧ　ＣＡＡ　ＴＧ
Ａ　ＡＧＡ　ＧＡＧＧＧＣＴＣＴ　　ＧＣＴ　　ＧＴＧ
　ＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧ　　ＧＡＧ　　Ｃ ｌｂ ５’　ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＣＡＣＡＧＣ
ＡＧＣＡＧＣＡＣＡ　　ＣＡＧ　　ＣＡＧ　ＡＧＣＣＣ
Ｔ　　ＣＴＣＴＴＣＡＴＴＧＣＡ　　ＴＣＣＡＴＡ ａ ５’　ＡＧＴ　　ＣＴＴ　　ＣＧＴ　ＴＴＣＧＣＣＣＡ
Ｇ　ＣＣＡ　ＧＧＡＡＡＴ　　ＣＣＡ　ＴＧＣＣＣＧ　
ＡＴＴ　　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＡＧＧＣＧＣＣＣ３’ ｌｂ ｓ′ＧＡＴ　　ＣＧＧ　　ＧＣＧ　　ＣＣＴ　ＣＴＴ　
　ＣＴＧ　ＡＡＴ　　ＣＧＧＧＣＡ　ＴＧＧ　　ＡＴＴ
　ＴＣＣＴＧＧ　　ＣＴＧ　　ＧＧＣＧＡＡＡＣＧ　　
　３’ ＨＰＬＣを用いて精製後、　　１　ｂ　１００　ｐｍｏ
ｌをキナーゼバッファ　　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−Ｈ
ＣＩ　ｐＨ８，０，１０ｍＭＭｇ　Ｃ１２，５ｍＭ　Ｄ
ＴＴ、　　１ｍＭ　ＡＴ　Ｐ　）　５０μＺ中＋　　Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位と、３７°Ｃで９
０分間インキュベートし、リン酸化した後、フェノール
・クロロホルム抽出を行なった。２ａも同様にして、リ
ン酸化後、フェノール・クロロホルム抽出した。リン酸
化したｌｂと２ａを混ぜ、これにそれぞれ１００１００
ｐの１ａと２ｂ、ｔＲＮＡ７．８μｇを加え、エタノー
ル沈殿した。　遠心後、沈殿を４３μｔの滅菌水で溶解
し、７５°Ｃより徐冷した後Ｔ４　ＤＮＡリガーゼバッ
ファ　−（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　ｐＨ７，６
，６，６ｍＭ　Ｍｇ　ＣＩ２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、　０
．４ｍＭＡＴＰ）の１０倍濃度溶液５μｔとＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（宝酒造）７００単位を加え、１６℃で一晩イ
ンキーベートし、約１１０ｂｐの断片（Ｂ断片）を得た
。

ｔ−ＰＡ遺伝子由来のＡ断片、上記Ｂ断片を、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼバッファー中で、１６°Ｃ２−晩、　　Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ３５０単位とインキエベートし、連結さ
せ、７５°Ｃで１５分間熱処理したのち、　　Ｘｈｏ　
■（ペーリンガー・マンハイム）消化した。Ｂ断片は同
じ粘着末端をもつため、Ａ断片に対してふた通りの連結
形態をとる。２ｍ、　２ｂは元のＢｇｌ　ｌ（およびＸ
ｈｏ　ＩＩ　）部位を再生しないように塩基配列をかえ
ているので、　　２ａ、　　２ｂがＡ断片と連結した場
合は連結部位がＸｈｏ　■で切断されないが、１ａ。

ｌｂ′ｂ″−Ａ断片と連結した場合は連結部位がＸｈｏ
　■で切断される。約１．７　ｋｂｐの断片をゲルより
切り出し、電気溶出法により精製した。ここで得たＤＮ
Ａ断片は大部分がＡ断片とＢ断片が連結したのちＸｈｏ
　Ｉ［消化された約１．７　ｋｂｐのｔ　Ｐ　Ａ　００
２遺伝子断片（Ｃ断片）であるが、一部、Ａ断片がＸｈ
ｏ　：［［消化された約１．６　ｋｂｐの断片（Ｄ断片
）も含む。

次に、　　ｔ−ＰＡ遺伝子を一本鎖形にするために。

このｔＰＡＯＯ２遺伝子断片をｐＴＺ１８ＲのＢａｍＨ
■部位に挿入した。構築方法を第１図に示す。

まず、Ｃ断片とＤ断片の混合物をＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼによりリン酸化し、７５°Ｃで１５分間熱処理
した。一方、　　ｐ　ＴＺ　１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）　６．２５μｇをＢａｍＨＩ（宝酒造）消化し、フ
ェノール・クロロホルム抽出、エタノール化＄１ｔ　後
、　　０．９　Ｍ　Ｔｒ　ｉ　ｓ−ＨＣＩ　（Ｔ）Ｈ８
，０）中でアルカリ性ホスファターゼ（宝酒造）　０．
１３単位と６５℃で１時間インキエベートし、さらにフ
ェノール・クロロホルム抽出後。

エタノール沈殿を行なった。

このｐ’ｒｚ　１８Ｒ１ａｇと、　リン酸化したＣ断片
とＤ断片１μｇをＴ　４　ＤＮＡリガーゼ３５０単位で
連結させ、この反応液でＥ、　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２コ
ンピテントセル（フナコシ薬品）をＨａｎａｈａｎの方
法（Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、：　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、１６６　（１９８３）５５７）に従って形質
転換した。形質転換した細胞をアンビシリン含有ＬＭプ
レート（バクトドリプトン１０ｇ、イーストエクストラ
クト５ｇ。

ＮａＣ１ｌＱｇ、バクトアガー１５ｇ／乙、　０．ＯＩ
ＭＭｇ　ＳＯ２，０，１ｍＭ　Ｉ　Ｐ　Ｔ　Ｇ、　０．
００４％Ｘ−ｇａｌ）上、３７℃で一晩培養した。

生じた白いコロニーを２ｍｌのアンピシリン含有２×Ｙ
Ｔ（バクトドリプトン１６ｇ、イーストエクストラクト
１０ｇ、　ＮａＣ１５ｇ／ｌ）で培養した。次に、実験
書ｐ３６８−３６９に従℃・、ラビッド法（アルカリ溶
解法）によりプラスミドＤＮＡを得た。

次に、　　Ｓａｌ　ｌ（宝酒造）とＥｃｏＲＩ（宝酒造
）の二重消化により、約２．８５　ｋｂｐ　、約７４０
　ｂｐ　、約５５０ｂｐ。

約４７０　ｂｐのバンドが生じる。すなわちＣ断片を含
むプラミスドを選んだ。また、Ｃ断片はふた通りの向き
でｐＴＺ１８Ｒに組み込まれるが、５ａｃｋ（宝酒造）
消ｆヒにより約４．２　ｋｂｐ　、約４１０ｂｐの２本
のバンドが生じるプラスミド（ｐＴＺ　１８　ｔ　ＰＡ
　００２　）　　を以下の実験に用（・た。合成したＢ
断片が正しくＡ断片に連結していることは、Ｍ１３ブラ
イマーＭ４（宝酒造）を用いてｐＴＺ１８ｔＰＡＯＯ２
の塩基配列決定を行ない確認した。塩基配列の決定は、
Ｍ１３／ｐＵＣシークエンシングマニュアル（日本シー
ン社製、　　１９８６．　ｐｐ１９−２０）に準じて行
なった。

実施例３．−本領ｐ　ＴＺ　１８　ｔ　ＰＡ　００２の
調製まず、ｐＴＺ１８　ｔＰＡＯＯ２形質転換体より１
部位特異的突然変異に用いる１本鎖ＤＮＡを調製した。

アンピシリン、　　０．０１％チアミン含有２ＸＹＴ２
ｍｌで、ｐＴＺ１８　ｔＰＡＯＯ２形質転換体を一晩培
養した。

アンピシリン、チアミン含有２Ｘ　ＹＴ　１５ｍ１に、
形質転換体の一晩培養ｉ　１５０μｔを加え、３７°Ｃ
で１時間培養し、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（宝酒
造）２．５　Ｘ　１０９ｃｆｕ／ｍｔ２５０μｔを感染
させ、カナマイシン（２５ｍｇｌｍｌ　）　４２μｔを
加え、さらに−晩培養した。

この培養液を遠心チューブに移し、　　１２，０００ｒ
ｐｍ、０°Ｃ１５分間遠心後、上清を他の遠心チューブ
に移し、３ｍｌの２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ　−２，５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１溶液を加え、室温で２０分間放置した。これを１２
．０００　ｒｐｍ、　　２０℃１０分間遠心後、上清を
除き、沈殿をＴＥバッファー（ｐＨ８，０）で溶解し、
フェノール抽出を行なった。

遠心後、水層な他の遠心チューブに移し、エタノール沈
殿を行すｌ、−、−本領ｐＴＺ１８　ｔＰＡＯＯ２７，
６μｇを得た。

実施例４．　部位特異的突然変異誘発のためのプライマ
ーの合成 ヒトｔ−ＰＡ構造遺伝子を部位特異的突然変異誘発に付
し、　Ｔｒｐ−１０４を５ｅｒ−１０４にアミノ酸置換
した改良型ｔ−ＰＡを構築した。この特定部位における
突然変異誘発およびスクリーニングのため罠、以下の合
成オリゴヌクレオチド３．４．５をＸｓした。

天然のアミノ酸 配列 天然のＤＮＡ 配列 ｒｇ Ｔｈｒ ５　　　　ＧＧ ＡＧＡ ｌｙ ｌａ ＧＧＣ ＣＣＧ Ｔｈｒ　　Ｔｒｐ　　Ｓｅｒ １ｕ ＡＣＧ　　ＴＧＧ　　ＡＧＣ ＧＡ　　３’ 誘発用 Ｓｅｒ ５　　　ＧＧ　　ＧＧＣＡＣＧ　　ＴＣＴ　　ＡＧＣＡ
ＣＡ　　ＧＣＧ　　ＧＡ　　３’ ３　　　ＣＣＣＣＧ　　ＴＧＣＡＧＡ　　ＴＣＧブライ
マー５　５　　ＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴ
　　３ＤＮＡ配列 天然のｔ−ＰＡのアミノ酸配列および解読鎖の塩基配列
は、最初の４列に記載されている。プライマー３．およ
び検出用プローブ４は２反対鎖である。

実施列５０部位特異的突然変異の誘発 部位特異的突然変異体の作成は、　　Ｇｉｌｌａｍらの
方法（Ｇｉｌｌａｍ、　Ｓ、、　Ｚｏｌｌａｒ、　ＶＬ
　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍ、　：　Ｍｕｔａｎｔｃｏ
ｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、　Ｉｎ　ＤＨｌｏｎ、　Ｊ、　
Ａ。

Ｒ，、Ｎａ５１ｍ、　Ａ、ａｎｄ　Ｎｅｓｔｍａｎｎ、
　Ｅ、　Ｒｏ（Ｅｄｓ、）、　　Ｒｅｃｏ　−ｍｂｉｎ
ａｎｔ　　ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、　　Ｊｏ
ｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆５ｏｎｓ、　　１９８５゜ｐｐ、　
１５７−１８６）に従い、コロニー・・イブリダイゼー
ションは前述のＷｏｏｄｓの方法に従って行った。

合成プライマー３をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリ
ン酸化したもの４ｐｍｏｌと、−本領ｐＴｚ１８　ｔ　
Ｐ　Ａ　００２０．２　ｐｍｏｌをＫｌｅｎｏｗバッフ
ｙ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｒｎ
ＭＭｇＣ１２，５０ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭＤＴＴ）１
０μを中で、１００°０１分間インキエベートした後、
氷冷し、４０°Ｃで３０分間インキュベートした。ライ
ゲーション溶液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌｐＨ７
，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、　１
ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴ
Ｐ、　１ｍＭＡＴＰ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ５２５単位
）　１ｏμｔ、　Ｋｌｅ−ｎｏｗ　ｆ　ｒａｇｍｅｎｔ
　（全酒造）５単位を加え、プライマー延長を開始させ
た。　１５°Ｃで一晩インキユペートした後２反応混合
物で、　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９コンピテントセ
ル（全酒造）を形質転換し、アンピシリン含有２　ＸＹ
Ｔ寒天上で、３７°Ｃで一晩培養した。

生じたコロニーをニトロセルロースフィルターに移し、
このフィルターを０．５Ｍ　ＮａＯＨで１０分。

１０Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）で５分、
　　１．５Ｍ　ＮａＣ１−１，０Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＭＣ
Ｉ　（ｐＨ７，４）で５分間処理した後。

このフィルターを真空中において、８０°Ｃで９０分間
加熱した。次に、フィルターをプレハイブリダイゼーシ
ヲン液（６Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ、５Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔａ
　５ｏｌｕｔｉｏｎ。

０．２％ＳＤＳ、０．０５％ビロリン酸ナトリウム、１
１００ｐ／ｍｌ　Ｓａｌｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ　
）と−緒に５４°Ｃで２時間インキエベートし９次に、
５′末端をγ−３２ｐで標識した検出用のプローブ４を
加え、５４°Ｃで一晩・・イブリダイズさせた。１×Ｓ
ＳＣの組成は０．１５　Ｍ　ＮａＣ１゜０．０１５　Ｍ
クエン酸三ナトリウム、またＩ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ
ｓｓｏｌｕｔｉｏｎの組成は０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、
　０．０２％ポリビニルピロリドン０．０２％ＢＳＡで
ある。このフィルターを、　５ｘＳＳＣ。

００５％ビロリン酸ナトリウムで、室温で２回、４４℃
において２回、そして５４℃で１回洗浄した後、風乾し
、オートラジオグラフィーを行なった。

次に、黒く感光した（陽性）クローンを培養し。

ラビッド法によりプラスミドを得た。このプラスミドを
Ｈｇｉ　Ａｌ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｊｏｌａ
ｂｓ、　Ｉｎｃ）消化した。

部位特異的突然変異がおこり。

ＴＧＧＡＧＣＡＣＡ から ＴＣＴＡＧＣＡＣＡ に変わることにより、下線部のＨｇｌＡＩ部位が消失す
る。このためＨｇ１ＡＩ消化を行うと、　　２３９ｂｐ
と２４　ｂｐの断片が消失し、　　２６３ｂｐ　　の断
片が生じる。

このことより、　　Ｈｇ１ＡＩ消化物の２．０％アガロ
ースゲル電気泳動を行い、　　２３９ｂｐの断片が消失
し、２６３ｂｐの断片が生じたプラスミドを選んだ。次
に実施例４に示したブライマー５を用い、ジデオキシ法
により塩基配列決定を行ない、ｔ−ＰＡのＴｒｐ−１０
４に対応する塩基配列ＴＧＧがＳｅｔに対応するＴＣＴ
に変異しているプラスミド（ｐＴＺ１８　ｔＰＡＯ２１
）を選び、以下の実験に用いた。

プラスミドＤＮＡ　ｐＴＺ　１８　ｔＰＡＯ２１を制限
酵素Ｘｈｏ　ｎ消化後、１．２％アガロースゲル電気泳
動を行桁ない、約１．７　ｋｂｐのｔ　Ｐ　Ａ　０２１
遺伝子断片（Ｅ断片）を電気溶出法により単離した。

ｔ　Ｐ　Ａ　０２１遺伝子が本発明の該蛋白質をコード
していることは、　　ｐＴＺ　１８　ｔ　ＰＡＯ２１を
１２種類のカスタムプライマーを用いて塩基配列決定を
行ない確認した。ｔ　Ｐ　Ａ　０２１遺伝子に含まれる
該蛋白質の塩基配列を以下に示す。

５’　ＡＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣ
ＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧ
ＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧ
ＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧ
ＧＣＧＣＣＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＴＧ
ＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡ
ＴＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣ
ＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＣＧＧＧＴ
ＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＣＡＧＴＧＧＣ
ＡＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＣＡＧＴＧＣＣＴＧ
ＴＣＡＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＣＧＡＧＣＣＡＡＧＧＴＧ
ＴＴＴＣＡＡＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧ
ＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＣＡＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴ
ＧＣＣＡＧＴＧＣＣＣＣＧＡＡＧＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧ
ＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧ
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ＧＴＧＡ　　３ 実施例　６１発現ベクターｐＶＹＩＡの構築ｐＶＹＩＡ
の構築は、　第３図に示すごとく行った。

Ａ） ｐ　Ａ　ｄＤ　２６　Ｓ　Ｖ　（Ａ）　ｎｏ、　３　（
Ｎ）の構築およびそのＥｃｏＲＩ消化 先ず、ベクターｐＡ　ｄＤ　２６　Ｓ　Ｖ　（Ａ）ｎｏ
、　３　［東京大学半田宏博士より入手、　Ｍｏ１．　
Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、。

２（１１）、　１９８２の論文で公知であるコ　ＤＮＡ
を。

Ｂｇｌ　Ｈで切断し、フェノール・クロロホルム抽出、
エタノール沈殿後、滅菌蒸留水に溶解した。

次に＋　　Ｋ　ｌｅｎｏｗ酵素（ベーリンガー・マンハ
イム）を用いて常法により平滑末端とし、フェノール・
クロロホルム抽出、エタノール沈殿後、滅菌蒸留水に溶
解した。更に、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）
を用いて自己結合させた後。

Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０１コンピテントセルを形質
転換した。テトラサイクリン耐性を示す形質転換体より
プラスミドＤＮＡを得た。これらのＤＮＡの一部をＢｇ
Ｉ　ｎで切断後、０．７％アガロースゲルで電気泳動を
行い、Ｂｇｌ［部位を消失したクローンｐＡ　ｄＤ　２
６　Ｓ　Ｖ　（Ａ）ｎｏ、３　（Ｎ）を得た。

次に、このプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ　消化後、フ
ェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿後、滅菌
蒸留水に溶解し、マンノ・ビーン・ヌクレアーゼ（Ｐｈ
ｒａｍａｃｉａ　）を用いてＥｃ。

ＲＩ切断部位を平滑末端とし、フェノール嗜りロロホル
ム抽出、エタノール沈殿後、滅菌蒸留水に溶解した。

Ｂ）ｐＫｓＶｌｏからのＫｐｎ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　（
約２．９　Ｋｂｐ　）断片の単離 ｐＫＳＶ　１０　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　Ｄ　Ｎ　
Ａを常法により制限酵素Ｋｐｎ　ＩおよびＢａｍＨＩ　
で切断した後。

Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）およびＫｌｅ−ｆｉ
ＱＷ酵素により平滑末端とした（実験書３９４−３９５
　頁）。次ＫＯ，７％アガロースゲルで電気泳動を行な
い、約２．９　Ｋｂｐの断片を分離後、電気溶出法によ
り、ＤＮＡを回収した。

Ｃ）　　ｐｖｙ　Ｉ　Ａの構築 Ａ）項で得たＤＮＡ断片とＢ）項で得たＤＮＡ断片を、
ＤＮＡライゲーションキットを用いて。

結合させた後、　　Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０１　　
コンピテントセルを形質転換した。

テトラサイクリン耐性を示す形質転換体の中から常法に
よりプラスミドＤＮＡを調製した。

これらのプラスミドＤＮＡの一部なｐｓｔＩ（ベーリン
ガー・マンハイム）消化し１．０％アガロースゲル電気
泳動を行い、約３．６　Ｋｂｐ、約３．２５　Ｋｂｐ。

約１．５Ｋｂｐバンドを示すクローン（プラスミドｐＶ
ＹＩＡ）を得た。このクローン（Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ
　１０１．Ｐ’　ｐＶＹ　Ｉ　Ａは微工研菌寄第（ｏ４
ｏ’ｆ号として寄託されている。

実施例　７３発現ベクターｐＶＹＩＡへのｔＰＡＯ２１
遺伝子のサブクローニング ｔ　Ｐ　Ａ　０２１遺伝子をｐ　ＶＹ　Ｉ　Ａヘサブク
ローニングした。構築方法を第２図に示す。

発現ベクターｐｖｙＩＡをＢｇｌ［消化後、フェノール
・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行なった。こ
のＤＮＡを実施例２に記載した方法でアルカリホスファ
ターゼ処理し、フェノール・クロロホルム抽出後、エタ
ノール沈殿した。次にこのホスファターゼ処理したｐｖ
ｙＩＡと、実施例５で得たＥ断片をＴ４ＤＮＡＩＪガー
ゼを用いて連結させた。

この反応液で、　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　１０９　
　コンピテン＋セルを形質転換させ、テトラサイクリン
を含む２ＸＹＴ寒天上で一晩培養した。生じたコロニー
を、テトラサイクリンを含む２ＸＹＴで培養し。

ラピッド法によりプラスミドを得、ＰｓｔＩ消化により
挿入方向を確認した。すなわち、１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、　約３．６　Ｋｂｐ、　　約２．
３　Ｋｂｐ、約１．５　Ｋｂｐ　（２本）、約６２０　
ｂｐ、約４１０　ｂＬ　約ｓｏ　ｂｐ、　　約７０　ｂ
ｐ　のバンドを生じるものが、ｐＶＹＩＡ中のＳＶ４０
　　プロモーターにｔＰＡＯ２１遺伝子が正しく連結さ
れたものである（　ｐｖｙ　ＩＡ　ｔＰＡ　０２１　）
。

実施例８．　　ｔＰＡＯ２１のＣＨＯ細胞中での発現プ
ラスミドｐＶＹ　Ｉ　Ａ　ｔＰＡ　０２１をＤＨＦＲ欠
損ＣＨＯ細胞［Ｕｒｌａｕｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ　Ｓ　Ａ、　７７（７）、　ｐ４２１６〜４２２０　
（１９８０）　］　　にリン酸カルシウム法によりトラ
ンスフェクトした［　Ｇｒａ−ｈａｍ、　ｅｔ　ａｔ、
、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５２．４５６　（１９７３）
　］。メソトレキセート（ＭＴＸ）存在下で２選択培地
［ＭＥＭＡＬＰＨＡ（−）、　　ギプコ（ＧＩＢＣＯ）
コより得られた形質転換体、クローン　Ｓ　−２１−Ｍ
　２０−１は２７０ｕ／ｍｌ（フィブリン／アガロース
平板法による測定値、後述）のｔ−ＰＡ活性を産生ずる
ことが見出された。このクローンを以後の研究に充てた
。生産培地はＧＩＴ培地（和光紬薬工業）を用い、アプ
ロチニンを２０　Ｋ　Ｉ　Ｕ　／ｒｎｌ　［シグマ（Ｓ
ＩＧＭＡ）コ添加した。

実施例　９．　　ＣＨＯ細胞培養上清よりのｔ　Ｐ　Ａ
　０２１の精製 実施例８で得られた培養上清は抗ｔ−ＰＡモノクローナ
ル抗体アフィニティーカラムにより部分精製した。モノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマは天然型ヒト黒色腫
細胞由来のｔ−ＰＡに対して常法により作成された。マ
ウスに抗体産生ハイブリドーマを接種し、腹水中に出現
したモノクローナル抗体（サブクラス：ＩｇＧ１）を回
収し、これを硫安沈殿およびイオン交換クロマトグラフ
ィーを用いて精製した。抗体はＣＮＢｒ活性化セファロ
ース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）に、常法によりゲル１　
ｒｎｌ当り５ｆｆ１ｇの割合で結合させた。

培養上清４ｔに本抗体ゲル１０ｍＡを混合し、−夜４°
Ｃにて、ゆるやかに振とうした後、ゲルをカラム（１ｃ
ｍ径Ｘ　１０　ａｍ　）に充填した。次に■２５ＫＩＵ
／　ｍｌのアプロチニン（シグマ）、０．旧％（ｗ／ｖ
　）のツウィーン８０を含む５０ｍＭ）！Ｊスス−酸緩
衝液。

ｐＨ７，４（緩衝液Ａ）、００．５Ｍの食塩を含む緩衝
液Ａ、■４Ｍの尿素を含む緩衝液Ａ、■緩衝液Ａ（アプ
ロチニン不含）の順で、それぞれ５０ｍｔずつでゲルを
洗浄した。ゲルに結合したｔＰＡＯ２１は０．２Ｍグリ
シン−塩酸緩衝液、　ｐＨ２，５（０，０１％（ｗ／ｖ
）のツウィーン８０を含む）で溶出された。

活性のあるフラクシミンを回収、混合して５０ｍＭ酢酸
緩衝液ｐＨ４（１００ｍＭのＮａＣ１と０．０１％（ｗ
／ｖ）のツウィーン８０を含む）に対して限外−過膜を
用い透析及び濃縮を行った。

これを以後のｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの
評価に供した。最終的に８４０倍の比活性の上昇と６１
％のｔ−ＰＡ活性（フィブリン／アガロース平板法によ
る）の回収が得られた。

この活性画分を５ＤＳ−電気泳動と銀染色で分析したと
ころ還元状態では他の数本のバンドと共に６５キロダル
トン付近に非常に強いノ５ンドが認められた。天然型ｔ
−ＰＡも全く同じ位置に泳動された。また電気泳動後の
ゲルを２．５％（、／ｖ’）のトＩＪ　）ンＸ　−１０
０で処理した後、フィブリン／アガロース平板上に置き
、３７℃にてフィブリンオートグラフィーを実施したと
ころ６０キロダルトン付近に溶解窓が認められた。この
天然型ｔ−ＰＡも６０キロダルトン付近に出現した。本
実施例で精製された本発明の蛋白質ｔ　Ｐ　Ａ　０２１
のアミノ酸配列は、ｔＰＡＯ２１の発現に使用した前記
ｔＰＡ０２１遺伝子の塩基配列から推定して以下の通り
であると考えられる。

（Ｈ，Ｎ３４　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ ９　　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ １７　　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ ２５　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ ３３　　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ ４１　　Ａｌａ　Ｇｌｎ ４９　　Ｌｙｓ　５ｅｒ ５７　　Ｐｈｅ　Ａｓｎ ６５　　Ａｌａ　Ｌｅｕ ７３　　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ ８１　　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ Ｇｌｎ　Ｖａｌ　　ｌ１ｅ Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ Ａｒｇ　Ｓｅｒ、　Ａｓｎ Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　５ｅｒ Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　５ｅｒ Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ １１ｅ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒ。

Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　Ｖａｌ Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ １１ｅ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　　Ｐｒ。

Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ Ａｓｐ　Ａｌａ　　ｌ１ｅ Ａｓｎ　Ｈｉｓ　　Ａｓｎ Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｓｐ Ｔｙｒ　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ Ａｌａ　Ｃｙｓ　５ｅｒ Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ Ｔｒｐ　Ａｓｎ　５ｅｒ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ Ａｒｇ　Ｌｅｕ Ｔｙｒ　Ｃｙｓ Ｓｅｒ　Ｌｙｓ Ｌｙｓ　Ａｌａ Ｐｈｅ　Ｃｙｓ １ｕＧｌｙ Ｇｌｙ　Ａｓｎ Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ Ａｌａ　　Ｓｅｒ Ｍｅｔ　　Ｉｌｅ Ｌｅｕ　　ｌｉｅ　Ｇｌｙ Ｇｌｎ　Ａｓｎ　　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ Ａｓｐ　Ｖａｌ　　Ｐｒ。

Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ａｌａ Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　　５ｅｒ Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　Ｇｌｕ Ｔｈｒ　Ｖａｌ　　Ｃｙｓ Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　　Ｌｅｕ Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ Ｓｅｒ　Ａｌａ　　Ｇｉｎ Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ Ｈｌｓ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　５ｅｒ １１ｅ　　Ａｌａ　　５ｅｒ Ａｌａ　　Ｉｌｅ　　Ｐｈｅ Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｌ１ｅ Ｔｒｐ　　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ Ｐｈｅ　　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　　ｌ１ｅ Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ １１ｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ａｓｐ　Ｓｅｒ　５ｅｒ Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ Ｔｈｒ　Ａｌａ Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ｔｙｒ　Ｃｙｓ Ａｌａ　Ｌｙｓ Ｌｙｓ　Ａｓｎ Ｔｙｒ　Ｃｙｓ Ｔｈｒ　Ｃｙｓ Ｈｉｓ　　Ｐｒ。

Ａｌａ　Ｌｙｓ Ｇｌｕ　Ａｒｇ Ｌｅｕ　　ｌ１ｅ Ｓｅｒ　　Ａｌａ Ａｒｇ　Ｐｈｅ Ｖａｌ　　ｌ１ｅ Ｖａｌ　　Ｖａｌ Ｌｙｓ　Ｐｈｅ Ｖａｔ　　Ｈｉｓ Ｔｈｒ　Ｔｙｒ Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ Ａｒｇ　Ｃｙｓ Ｖａｌ　Ａｒｇ Ａｌａ　Ａｓｐ Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ Ｈｉｓ　　Ｇｌｕ　Ａｌａ Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ、Ｖａｌ Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ １１ｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　５ｅｒ Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ Ａｌａ　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ Ｇｌｙ　Ａｓｐ　５ｅｒ Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　　４２４ Ａｌａ　Ｈｉｓ　　４３２ Ｓｅｒ　Ａｒｇ　　４４０ Ｌｅｕ　Ａｓｎ　　４４８ Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　４５６ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　　４６４ Ｈｉｓ　Ａｓｐ　　４７２ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　　４８０ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　　４８８ １１ｅ　　Ｉｌｅ　　４９６ Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　　５０４ Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　　５１２ Ａｓｐ　Ｔｒｐ　　５２０ Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ） 実施例　１０．　　ｔＰＡＯ２１の比活性の測定部分積
ＭｔＰＡＯ２１の蛋白量の決定は総蛋白量をＢｒａｄｆ
ｏｒｄの方法［Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　７２
．２４８（１９７６）］により牛血清アルブミンを標準
蛋白として測定し、ｔ−ＰＡ抗原景の測定はＥＬＩＳＡ
法を用いた。ＥＬＩＳＡは前出の抗体カラムに用いたモ
ノクローナル抗体とビオチン化したウサギ抗ｔ−ＰＡ抗
体（アメリカンダイアグツステイカ）とによるサンドウ
ィッチ方式であり、ビオチン化ホースラディノシュバー
オキシダーゼーストレプタビジン複合体（アマジャム）
とその基質（３，３’。

５．５′−テトラメチルベンチジン）により発色させた
。標準ｔ−ＰＡとしてはアメリカンダイアグツステイカ
社のヒト黒色腫細胞由来の２本領ｔ−ＰＡを用いた。

線溶活性の測定はフィブリン／アガロース平板法および
１２５工標識フイブリンフイルム溶解法を用いた。フィ
ブリン／アガロース平板法は９５％凝固フィブリノーゲ
ンを原料として作製した寒天加フィブリン平板を用いた
。′２５ニーフィブリンフィルム溶解法はＨｏｙｒａｅ
ｒｔｓ等の方法［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

％程、　２９１２（１９８２）　］　Ｋ従った。すなわ
ち、１．８μＭのフィブリノーゲンに１２５Ｉ標識フィ
プリノーゲ−ン（ＩＣＮバイオメディカル）を適当量加
えて９６穴ミクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ　）に５
０μｔ／穴ずつ入れ、４０°Ｃで一晩乾燥させた。これ
に１．６　ｕ／ｒｎｌのトロンビン（持出製薬）を１０
０μ乙ずつ入れ。

３７℃で４時間放置してフィブリン化させた。このプレ
ートを２回、０．２％ウシ血清アルブミンと０．９％食
塩を含む１０ｍＭＩＪン酸緩衝液で洗浄した後、活性測
定に供した。各人５０μｔの２００　ｎＭのプラスミノ
ーゲンを入れ、さらに５０μｔのｔ−ＰＡ標準品もしく
はｔ　Ｐ　Ａ　０２１を添加し、混合した後３７℃で２
時間反応させた。各人５０μｔを取り、アロカ社製オー
トウェルガンマーカウンターにて溶解した１町−フィブ
リンを測定し、標準ｔ−ＰＡで作製した標準曲線より、
　　ｔ　Ｐ　Ａ　０２１の線溶活性を算出した。用いた
ｔ−ＰＡ標準品はインターナショナルｔ−ＰＡスタンダ
ード［Ｇａｆｆｕｅｙ　ａｎｄ　Ｃｕｒｔｉｓ。

Ｔ’ｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａａ、、　５３．１
３４　（１９８５）　］で標準化したバイオスコツト社
製のヒト黒色腫細胞由来のｔ−ＰＡである。

１２灯−フィブリンフィルム法で測定した活性値とＥＬ
ＩＳＡによる抗原量とにより算出した比活性値は４６０
，０００　ｕ／　ｌＴｌｇであった。

実施例　１１．　　ｔＰＡＯ２１のフィブリン親和性お
よびフィブリンによる活性化 Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎら［ＥＭＢＯＪ、、　５．３５２５
（１９８６）　］の方法に従い、　　ｔ　Ｐ　Ａ　０２
１のフィブリンに対する親和性を検討した。各種濃度の
フィブリノーゲンてｔ　Ｐ　Ａ　０２１あるいは天然ｔ
−ＦＡＩ’２μｇ／ｍ７）を加えさらに１ｕのトロンビ
ンを加えて室温で３分間反応させた。形成したフィブリ
ンクロットは１６．０００回転／分で８分間遠心して沈
降させ、上清中のフィブリンに結合しなかったｔ−ＰＡ
量をフィブリン／アガロース平板法での活性測定で求め
た結果、　　ｔ　Ｐ　Ａ　０２１は天然型に比ベフィブ
リンに対する親和性がわずかに低下しているのみであっ
た。

フィブリンの存在下または非存在下におけるｔＰＡ０２
１のプラスミノーゲン活性化速度を見るため以下の実験
を行った。

９６穴マイクロタイタープレートを使用して。

１ｍＭの合成バラニトロアニリド・トリペプチド合成基
質Ｓ　−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
　−ｐＮＡ・ＨＣＩ　、カビ社）、　　０．１５μＭプ
ラスミン不含プラスミノーゲン、フィブリンの可溶性代
替物質であるＤＥＳＡＦＩＢ　　（アメリカンダイアグ
ツステイカ社）１００ｐｇ／ｍｌもしくは緩衝液、　　
０．０１％ツウ（−７８０を含む５０ｍＭト！Ｊスー塩
酸緩衝液ｐＨ７，４に天然型ｔ−ＰＡまたはｔＰＡＯ２
１を加えて総容量１００μｔとし。

３７℃で保温した。一定時間後タイターチック　マルチ
スキャンにより、波長４０５　ｎｍにおける吸光度（Ａ
　４０５　ｎｍ　）を測定した。ｔ　Ｐ　Ａ　０２１は
天然型同様、フィブリン依存の活性化が認められた。

実施例　１２．　　ｔＰＡＯ２１のウサギの血流におけ
る線維未溶解活性の分析 ウサギにおける天然型ｔ−ＰＡと本発明ｔＰＡ０２１の
活性より見た薬効動態をみたところ、ｔＰＡ０２１は活
性値において半減期の顕著な延長を示した。具体的に述
べると、天然型ｔ−ＰＡの半減期１〜２分に対してｔ　
Ｐ　Ａ　０２１のそれは約５分であった。さらに、　　
ｔＰＡＯ２１は投与終了後３０分にお（・ても活性値に
５％の残存（投与終了後３０秒後の値を１００％とする
）を認めた。一方、天然型ｔ−ＰＡは３０分後には活性
値は０．２％以下であった。

本実験の方法は以下の通りである。

実験には２日本白色ウサギの体重２．５　ｋｇのものを
用いた。ベンドパルビタール麻酔下、耳の辺縁静脈より
ｔ−ＰＡを投与した。投与量はそれぞれｔ　Ｐ　Ａ　０
２１　：　０．２４　ｑ／ｋｇ一体重、天然型ｔ−ＰＡ
：０．１　ｍｇ／ｋｇ一体重であった。続いて種々の時
間間隔（０，５分から６０分）でカテーテルを用いて大
腿動脈より２．５　ｒｎｌずつ１／９容景のクエン酸Ｎ
ａ　（３，８％）中に採血した。採血後３０分以内に低
速遠心を行い、血漿を分離した。分離した血漿を用いて
血中のｔ−ＰＡ活性を測定した。

■　ｔ−ＰＡ活性測定 血漿０．２１ｎｌを３ｍＭの氷酢酸で１６倍に希釈後。

低速遠心して沈殿物を得る。沈殿物を血漿に等しい容量
の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）（ＣＩ　（ｐＨ７，４）、　
１４０ｍＭＮａＣ１緩衝液に溶解してニーグロブリン分
画を得ル。ｔ−ＰＡ活性はこのニーグロブリン分画をフ
ィブリン／アガロース平板中に添加して求めた。ｔ−Ｐ
Ａ活性は、平板を３７°Ｃ１６時間インキュベーション
した後、溶解斑として観察された。フィブリン／アガロ
ース平板は次のようにして作製した。

市販のフィブリノーゲン（コーンの分画Ｉ）をプラスミ
ノーゲンリッチフィブリノーゲンとしてフィブリン／ア
ガロース平板作製に用いた。

プラスミノーゲンリッチフィブリノーゲンの最。

終濃度は１３０　ｍＭ　Ｎａ　Ｃｌと１０−’Ｍ　Ｃａ
Ｃ５を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４
）緩衝液中で１，５ｍｇ／ＩＩＩｔであった。最終アガ
ロース濃度は同緩衝液中で０．７５％であった。１０ｍ
Ｚフィブリノーゲンーアガロース溶液にトロンビン（４
ＯＮＩＨ単位／ｒｎｌ）の１００μ２を加えて平板を作
製した。フィブリン／アガロース平板法の標準曲線は動
物への投与に用いたｔ−ＰＡを０．１〜１０，０００ｕ
／ｍｔに希釈して得た。こうして求めた血中ｔ−ＰＡ活
性は投与終了３０秒後に採血して得られたｔ−ＰＡ活性
を１００％としてパーセント表示した。結果を第４図に
示す。

天然の　　５’　ＡＣＡＧＧ　ＧＧＣＡＣＧ　ＴＧＧ　
ＡＧＣＡＣＡ　ＧＣ３’ＤＮＡ配列 ｉｓ ｓ’　　ＡＣＡＧＧＧＧＴ　ＡＣＣＣＡＴ　ＡＧＣＡＣ
Ａ　ＧＣ３’実施例１３．　　ｐＶＹＩＡ　ｔＰＡＯ２
７，ｐＶＹＩＡ　ｔＰＡＯ２８゜ｐＶＹ　Ｉ　Ａ　ｔ　
ＰＡ　０２９の構築実質的に実施例５に記載したものと
同様の方法により、−本領ｐ　Ｔ　Ｚ　１８　ｔ　Ｐ　
Ａ　００２と部位特異的突然変異誘発用プライマー６、
８．１０を用いて１０４位のＴｒｐをそれぞれＨ４ｓ、
　Ｐｒｏ、　Ａｒｇに対応するコドンに置換したプラス
ミドｐＴＺ　１８　ｔＰＡＯ２７（Ｔｒｐ　−＋Ｈｉｓ
　）、　　ｐＴＺ　１８　ｔＰ　ＡＯ２８（Ｔｒｐ−＋
Ｐｒｏ　）ｔ　ｐ’ｒｚ　Ｌ８ｔＰＡＯ２９１てＴｒｐ
　−＋　Ａｒｇ　）を構築した。誘発用プライマーには
、マーカーとしてＫｐｎ　■部位を付加した。以下に、
誘発用プライマーおよび検出用プローブの配列を示す。

ＤＮＡ配列 Ｐｒ。

５’　　ＡＣＡＧＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣＣＣＡ　ＡＧＣＡ
ＣＡ　ＧＣ３’ＤＮＡ配列 ＤＮＡ配列 Ａｒｇ ５’　　ＡＣＡＧＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣＡＧＧ　ＡＧＣＡ
ＣＡ　ＧＣ３’ＤＮＡ配列 ＤＮＡ配列 次に、ｐＴＺ１８ｔＰＡＯ２７，ｐＴＺ１８ｔＰＡＯ２
８およびｐＴＺ１８　ｔＰＡ０２９をＸｈｏＩ［消化後
、１．２％アガロース電気泳動を行ない約１．７　Ｋｂ
ＰのｔＰＡ０２７、　ｔＰＡＯ２８およびｔ　Ｐ　Ａ　
０２９遺伝子断片を単離した後、実施例７記載の方法に
よりｐＶＹＩＡベクターに挿入した（　ｐＶＹ　Ｉ　Ａ
　ｔＰＡＯ２７゜ｐＶＹ　ＩＡ　ｔＰＡ　０２８．　　
ｐＶＹ　ＩＡ　ｔＰＡ　０２９　）。

実施例１４．　　ｔＰＡＯ２７，ｔＰＡＯ２８およびｔ
　Ｐ　Ａ　０２９のＣＨＯ細胞中での発現と精製 実質的に実施例８と同様の方法によりｐＶＹＩＡｔＰＡ
Ｏ２７，ｐＶＹＩＡｔＰＡＯ２８およびｐｖｙ　Ｉ　Ａ
　ｔＰＡ０２９をＣＨＯ細胞において発現せしめ、実質
的に実施例９と同様の方法によりｔ　Ｐ　Ａ　０２７．
　　ｔ　Ｐ　Ａ　０２８およびｔ　Ｐ　Ａ　０２９を精
製した。これらの精製物は。

フィブリンオートグラフィーにおいて天然型を−ＰＡと
同じ６０キロダルトン付近に溶解窓を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、　　ｔ　Ｐ　Ａ　００２遺伝子の構築図およ
び該遺伝子を含むベクターｐＴＺ１８　ｔＰＡＯＯ２の
構築図を示す。 第２図は９合成プライマーを用いて、１本領ｐＴＺ１８
　ｔＰＡＯＯ２遺伝子から突然変異配列を含有するｔ−
ＰＡりｏ　−ン（ｐＶＹ　Ｉ　Ａ　ｔＰＡＯ２１）の組
立て工程図を示す。 第３図は９発現ベクターｐＶＹＩＡの構築図を示す。 第４図は１本発明の蛋白質ｔ　Ｐ　Ａ　０２１のウサギ
の血流における繊維素溶解活性を天然型１−ＰＡの活性
と対比した図である。 第１ｆｆｌ 第２図 Ｘｈｏ■ 第３図

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記一般式で示されるアミノ酸配列からなる新規
   血栓溶解蛋白質 【遺伝子配列があります】 （１）（式中、Ｒは存在しないか 【遺伝子配列があります】 または 【遺伝子配列があります】 であることを意味する。 また式中、Ｘは存在しないか、またはＴｒｐを除く天然
   の蛋白質を構成するアミノ酸か らなる群から選ばれた任意の１個のアミノ酸であること
   を意味する。）
2. （２）請求項（１）記載の一般式で示されるアミノ酸配
   列においてＸがＳｅｒ、Ｐｒｏ、ＡｒｇまたはＨｉｓの
   いずれかのアミノ酸であることを特徴とする新規血栓溶
   解蛋白質。
3. （３）請求項（１）または（２）で示されるアミノ酸配
   列をコードするＤＮＡ分子。
4. （４）請求項（３）記載のＤＮＡ分子を宿主細胞におい
   て発現させ得る複製可能な発現ベクターに組み入れ、宿
   主細胞を形質転換して組換宿主細胞を得、ＤＮＡ分子を
   発現させ得る条件下で培養して該ＤＮＡ分子がコードし
   ている蛋白質を産生させ、培養物より該蛋白質を得るこ
   とを特徴とする該蛋白質の製造方法。
5. （５）請求項（１）または（２）記載の蛋白質の治療上
   の有効量と薬学的に許容される担体との混合物から成る
   、血栓性疾病の治療剤