KR20180098404A - 돌연변이된 폰 빌레브란트 인자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인자 VIII에 결합하는 변형된 폴리펩타이드를 제공한다. 변형된 폴리펩타이드는 서열번호 3에 나타낸 서열을 포함하고, 상기 서열은, 상기 변형된 폴리펩타이드가 변형되지 않은 서열번호 3을 포함하는 참조 폴리펩타이드에 비해 더 낮은 오프 속도(off rate)로 인자 VIII에 결합하도록, L18, V42, K149, N248, S279, V320, T325, Q395 및 K418로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 변형을 포함한다.
Description
출원 데이터
본 출원은 2016년 1월 7일에 출원된 호주 특허 출원 2016900033호와 관련된 것으로 그에 대한 우선권을 주장하며, 그 특허 문헌의 내용 전체는 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 폴리펩타이드, 특히 인자 VIII (Factor VIII)에 대해 개선된 결합 친화도를 나타내는 변형된 폰 빌레브란트 인자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폴리펩타이드 및 FVIII를 포함하는 복합체, 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 출혈성 질환을 치료하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드 또는 복합체의 치료적 또는 예방적 용도에 관한 것이다.
혈액 응고 인자의 결핍으로 유발되는 다양한 출혈성 질환들이 존재한다. 가장 흔한 질환은 A형 및 B형 혈우병이며, 이들은 각각 혈액 응고 인자 VIII 및 IX의 결핍으로 인해 발병한다. 알려져 있는 다른 출혈성 질환은 폰 빌레브란트 질병을 들 수 있다.
혈장에는, FVIII가 VWF와 비공유 복합체로 우세하게 존재하여 막 결합된 활성화 인자 X 생성 복합체 내에서 활성화 인자 IX에 대한 보조인자로서 작용한다.
세포성 수용체들과의 상호작용을 감소시킴으로써(WO 03/093313A2호, WO 02/060951A2호), FVIII에 중합체를 공유결합시킴으로써(WO 94/15625호, WO 97/11957호 및 US 4970300호), FVIII를 캡슐화함으로써(WO 99/55306호), 새로운 금속 결합 부위들을 도입함으로써(WO 97/03193호), 펩타이드 결합(WO 97/40145호 및 WO 03/087355호) 또는 이황화 결합(WO 02/103024A2호)에 의해 A2 도메인을 A3 도메인에 공유 결합시킴으로써, 또는 A1 도메인을 A2 도메인에 공유 결합시킴으로써(WO2006/108590호) 비활성화 FVIII의 반감기를 연장시키기 위한 여러 시도들이 있어왔다.
FVIII 또는 VWF의 기능적인 반감기를 개선하기 위한 또 다른 접근법은 FVIII의 페길화(PEGylation)(WO 2007/126808호, WO 2006/053299호, WO 2004/075923호)에 의한 방법이다. VWF의 페길화(WO 2006/071801호)에 대해서도 혈장 내에 존재하는 FVIII의 반감기를 간접적으로 개선하기 위한 노력이 시도되어 왔다. 또한, FVIII의 융합단백질들에 대해서도 기술된 바 있다(WO 2004/101740호, WO2008/077616호 및 WO 2009/156137호).
서로 다른 형태의 폰 빌레브란트 질병(VWD)들 중에서 결핍되어 있거나, 기능적으로 결함이 있거나, 또는 감소된 양으로만 이용가능한 VWF는 혈장내에 존재하는 다중 결합성 부착 당단백질로서 다수의 생리학적 기능들을 가진다. 1차 지혈동안, VWF는 혈소판 표면 상의 특정 수용체들과, 콜라겐과 같은 세포외 기질의 성분들 사이에서 매개체로서 작용한다. 또한, VWF는 응혈촉진성 FVIII을 위한 운반체 및 안정화 단백질로서 작용한다. VWF는 2813개의 아미노산 전구체 분자로서 내피세포 및 거핵세포 내에서 합성된다. 야생형 VWF의 아미노산 서열 및 cDNA 서열은 문헌[Collins et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4393-4397]에 개시되어 있다. 전구체 폴리펩타이드인 프리-프로-VWF(pre-pro-VWF)는 22개의 잔기 신호 펩타이드, 741 개의 잔기 프로-펩타이드 및 혈장에서 발견되는 2050개의 잔기 폴리펩타이드로 이루어진다(Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). 소포체 내 신호 펩타이드의 분해 후, VWF의 두 단량체들 사이에 C-말단 이황화 브릿지가 형성된다. 분비 경로를 통해 추가로 수송하는 동안, 12개의 N 및 10개의 O가 결합된 탄수화물 측쇄들이 부가된다. 중요한 것은, VWF 이량체들은 N-말단 이황화 브릿지를 통해 다중결합되며, 741개의 아미노산들의 프로펩타이드는 후기 골지체 내에서 효소 PACE/퓨린에 의해 분해된다는 것이다. VWF의 고분자량 다량체들(VWF-HMWM) 뿐만 아니라 프로펩타이드는 내피세포의 바이벨-팔레이드(Weibel-Pallade)체 또는 혈소판의 α-과립들내에 저장된다.
혈장으로 일단 분비되면, 프로테아제 ADAMTS13은 VWF의 A1 도메인 내에서 VWF를 분해시킨다. 혈장 VWF는 500kDa의 단일 이량체로부터 10,000kDa 이상의 분자량의 20개 이상의 이량체들로 이루어진 다량체들까지의 다량체 범위로 이루어진다. 일반적으로, VWF 고분자량 다량체들(VWF-HMWM)은 가장 강력한 지혈 활성을 가지며, 이는 리스토세틴 보조인자 활성에서 측정될 수 있다(VWF:RCo). VWF:RCo/VWF 항원의 비율이 높을수록, 고분자량 다량체들의 상대적인 양도 커진다.
VWF 내 결함들은 폰 빌레브란트 질병(VWD)의 원인이 되며, 이는 다소 현저한 출혈 표현형을 특징으로 한다. 제3형 VWD는 VWF가 완전히 결핍되어 있는 가장 심각한 형태이며, 제1형 VWD는 VWF의 정량적인 손실에 관한 것으로, 그 표현형이 매우 경미할 수 있다. 제2형 VWD는 VWF의 정성적인 결함에 관한 것으로, 제3형 VWD 만큼 심각할 수 있다. 제2형 VWD는 많은 하위 형태들을 가지며, 이들 중 일부는 고분자량 다량체들의 손실 또는 감소와 관련되어 있다. 제2a형 VWD는 중형 및 대형 다량체를 모두 손실한 것을 특징으로 한다. 제2b형 VWD는 가장 분자량이 큰 다량체의 손실을 특징으로 한다.
VWD는 인간에게 가장 빈번한 유전적인 출혈 질환으로, 혈장 또는 재조합체 기원의 VWF를 함유하는 농축물을 사용하는 대체 요법에 의해 치료될 수 있다. VWF는 예를 들어 EP 05503991호에 설명되어 있는 바와 같이 인간 혈장으로부터 제조될 수 있다. EP 0784632호에는 재조합체 VWF를 제조 및 분리하는 방법이 설명되어 있다.
혈장에서 FVIII는 높은 친화도로 VWF에 결합하는데, 이 VWF가 조기 이화작용으로부터 FVIII를 보호하기 때문에 그의 1차 지혈 작용의 역할에 더해서 FVIII의 혈장 수준의 조절에 있어서 중요한 역할을 하게 되는 것이며, 결과적으로 2차 지혈의 조절에 있어서도 중심 요인이 된다. VWF에 결합된 비활성화 FVIII의 반감기는 혈장에서 약 12시간 내지 14시간이다. 제3형 폰 빌레브란트 질병에서, VWF가 존재하지 않거나 거의 존재하지 않는 경우에 FVIII의 반감기는 겨우 약 6시간에 불과하기 때문에, 이 경우에 감소된 FVIII의 농도로 인해 이 질병이 있는 환자들에서는 경미한 정도 내지 중간 정도의 A형 혈우병 증상을 유발된다. FVIII에 대한 VWF의 안정화 효과는 CHO 세포내 FVIII의 재조합 발현을 보조하는데에도 사용된 바 있다(Kaufman et al. 1989, Mol Cell Biol).
현재 함께 계류중인 본 출원인의 국제 특허 출원 PCT/AU2015/050369호에서는, VWF의 도메인 D’에서의 다수의 변형이 인자 VIII에 대한 결합을 증가시킬 수 있음을 개시하고 있다. 상기 출원의 개시내용은 상호참조로서 본원에 포함된다. 현재, 본 발명자들은 인자 VIII에 대한 VWF의 결합이 D'에서 다른 변형에 의해, 특히 D3 도메인에서의 변형에 의해 증가될 수 있다는 점을 발견하였다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 인자 VIII에 결합하는 변형된 폴리펩타이드로서, 상기 변형된 폴리펩타이드는 서열번호 3에 나타낸 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 상기 서열은 L18, V42, K149, N248, S279, V320, T325, Q395 및 K418로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 변형을 포함하며; 상기 변형된 폴리펩타이드는 변형되지 않은 서열번호 3을 포함하는 참조 폴리펩타이드(reference polypeptide)에 비해 더 낮은 오프 속도(off rate)로 인자 VIII에 결합하는 것인, 변형된 폴리펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 인자 VIII 분자 및 본 발명의 변형된 폴리펩타이드를 포함하는 복합체 및 상기 변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드도 제공한다.
또한, 본 발명은 출혈성 질환의 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 변형된 폴리펩타이드 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 상기 출혈성 질환의 치료 방법도 제공한다.
도 1: 중성 pH에서 스크린의 샘플 센서그램. 가장 강한 친화도 및 가장 느린 오프 속도를 갖는 두 후보물질에 동그라미를 그려놓았다.
도 2: pH 7에서 두 돌연변이체 D'D3-HSA 후보물질에 대한 CSL627의 상세한 동역학을 보여주는 샘플 센서그램. a) 돌연변이: V1083A, S764G, S766Y를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA; b) 돌연변이: S764G, S766Y를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA; c) 돌연변이: V1083A, S764P, S766W를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA; d) 돌연변이: S764P, S766W를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA.
도 3: pH 5.5에서 두 돌연변이체 D'D3-HSA 후보물질에 대한 인자 VIII의 상세한 동역학을 보여주는 샘플 센서그램. a) 돌연변이: V1083A, S764G, S766Y를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA; b) 돌연변이: S764G, S766Y를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA; c) 돌연변이: V1083A, S764P, S766W를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA; d) 돌연변이: S764P, S766W를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA.
도 4: a) 중성 pH에서 돌연변이: V1083A, S764E, S766Y를 갖는 CSL627 결합 D’D3-HSA 이량체; b) 중성 pH에서 CSL627 결합 야생형 D’D3-HSA 이량체.
도 5: a) 돌연변이: V1083A, S764E, S766Y를 갖는 CSL627 결합 D’D3-HSA 이량체; b) pH 5.5에서 CSL627 결합 야생형 D’D3-HSA 이량체.
도 2: pH 7에서 두 돌연변이체 D'D3-HSA 후보물질에 대한 CSL627의 상세한 동역학을 보여주는 샘플 센서그램. a) 돌연변이: V1083A, S764G, S766Y를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA; b) 돌연변이: S764G, S766Y를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA; c) 돌연변이: V1083A, S764P, S766W를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA; d) 돌연변이: S764P, S766W를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA.
도 3: pH 5.5에서 두 돌연변이체 D'D3-HSA 후보물질에 대한 인자 VIII의 상세한 동역학을 보여주는 샘플 센서그램. a) 돌연변이: V1083A, S764G, S766Y를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA; b) 돌연변이: S764G, S766Y를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA; c) 돌연변이: V1083A, S764P, S766W를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA; d) 돌연변이: S764P, S766W를 갖는 인자 VIII 결합 D'D3-HSA.
도 4: a) 중성 pH에서 돌연변이: V1083A, S764E, S766Y를 갖는 CSL627 결합 D’D3-HSA 이량체; b) 중성 pH에서 CSL627 결합 야생형 D’D3-HSA 이량체.
도 5: a) 돌연변이: V1083A, S764E, S766Y를 갖는 CSL627 결합 D’D3-HSA 이량체; b) pH 5.5에서 CSL627 결합 야생형 D’D3-HSA 이량체.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 해석해야 할 경우가 아니라면, “포함하다”라는 단어, 또는 “포함하는” 또는 “포함하고”와 같은 변형태는 언급된 구성요소 또는 정수 또는 상기 구성요소 또는 정수의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 구성요소 또는 정수 또는 상기 구성요소 또는 정수의 그룹을 배제하지는 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 이전의 임의의 간행물 (또는 그로부터 유래된 정보) 또는 공지되어 있는 임의의 자료에 대한 언급은, 상기 이전의 임의의 간행물 (또는 그로부터 유래된 정보) 또는 공지되어 있는 자료가 본 명세서가 관계되는 활동 분야에서 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것에 대한 인정 또는 시인 또는 임의 형태의 시사가 아니고, 그렇게 받아들여져서도 안된다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물들은 그 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용된 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 양태들도 포함한다. 따라서, 예를 들어, “제제”에 대한 언급은 단일 제제 뿐만 아니라 2개 이상의 제제를 포함하며; “분자”에 대한 언급은 단일 분자 뿐만 아니라 2개 이상의 분자 등을 포함한다.
VWF
본원에서 사용된 "폰 빌레브란트 인자" 또는 "VWF"라는 용어는 야생형 VWF의 생물학적 활성, 특히 인자 VIII에 결합하는 능력을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 야생형 VWF를 인코딩하는 유전자는 9kb의 mRNA로 전사되며, 이는 310,000Da의 추정 분자량을 갖는 2813개의 아미노산들의 프리-프로폴리펩티드로 번역된다. 상기 프리-프로폴리펩타이드는 22개의 아미노산 신호 펩티드, 741개의 아미노산 프로-폴리펩티드 및 성숙한 서브유닛을 함유한다. N-말단에서 741개의 아미노산 프로폴리펩티드를 분해시키면, 2050개의 아미노산들로 이루어진 성숙한 VWF가 생성된다. VWF 프리-프로폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타나 있다. 달리 지시하지 않는 한, 본 출원에서 VWF 잔기의 아미노산 넘버링은 상기 VWF 분자가 서열번호 2의 모든 잔기를 포함할 필요가 없는 경우조차도 서열번호 2를 지칭한다. 성숙한 VWF의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타나 있다. 본원에서 사용된 "VWF"라는 용어는, 달리 지시하지 않는 한, 성숙한 형태의 VWF를 가리킨다.
야생형 VWF의 프로폴리펩타이드는 하기 순서로 배열된 다중 도메인들을 포함한다:
D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK
D1 및 D2 도메인은, 분해되어 성숙한 VWF를 생성시키는 프로펩티드를 나타낸다. D'-D3 도메인은 인자 VIII에 대한 결합을 담당하는 아미노산을 망라한다. 야생형 VWF의 적어도 일부의 D'-D3 도메인에 대한 아미노산 서열은 서열번호 3에 나타나 있다. 카르복시 말단 90개의 잔기들은 단백질의 "시스테인 노트(knot)" 상과(superfamily)와 상동성인 "CK" 도메인을 포함한다. 상기 상과 멤버들은 이황화 결합을 통해 이량체화하는 경향을 갖는다.
바람직하게는, 야생형 VWF은 서열번호 2에 나타낸 것과 같은 성숙한 VWF의 아미노산 서열을 포함한다. 또한, VWF의 생물학적 활성, 특히 FVIII에 결합할 수 있는 능력이 보존되는 한, VWF의 부가, 삽입, N-말단, C-말단 또는 내부 결실도 포함된다. 결실을 갖는 VWF가 야생형 VWF의 생물학적 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 75%를 보유하는 경우, 본 발명의 관점에서 생물학적 활성은 보유되는 것이다. 야생형 VWF의 생물학적 활성은, 리스토세틴 보조인자 활성을 위한 방법(Federici AB et al. 2004. Haematologica 89:77-85), 혈소판 당단백질 복합체 Ib-V-IX의 GP Ibα에 대한 VWF의 결합(Sucker et al. 2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12:305-310), 또는 콜라겐 결합 분석(Kallas & Talpsep. 2001. Annals of Hematology 80:466-471)을 사용하여 당업자에 의해 측정될 수 있다. VWF의 생물학적 활성이 FVIII에 결합할 수 있는 능력인 경우, 이는 여러가지 방법으로 측정될 수 있지만, 본원의 실시예 1에 기술된 방법으로 측정하는 것이 바람직하다.
인자 VIII
본원에서, "혈액 응고 인자 VIII", "인자 VIII" 및 "FVIII"라는 용어들은 상호교환되어 사용된다. "혈액 응고 인자 VIII"은 야생형 혈액 응고 FVIII의 응혈촉진 활성을 갖는 야생형 혈액 응고 FVIII의 유도체들 뿐만 아니라 야생형 혈액 응고 FVIII를 포함한다. 유도체들은 야생형 FVIII의 아미노산 서열과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 부가를 가질 수 있다. FVIII이라는 용어는 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 예를 들면 활성화전 형태와 같은, FVIII의 단백질가수분해 처리된 형태들을 포함한다. B 도메인이 결실된 FVIII를 비롯한 혈장 유도성 및 재조합 FVIII이 포함된다. 시판 제품의 예로는 Advate®, Kogenate®, Xyntha®, Loctate® 및 Novoeight®를 포함한다.
"FVIII"이라는 용어는 야생형 인자 VIII의 생물학적 활성의 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 75%를 갖는 임의의 FVIII 변이체 또는 돌연변이를 포함한다.
비제한적인 예로서, FVIII 분자로는, APC 분해를 예방 또는 감소시키는 FVIII 돌연변이체(Amano 1998. Thromb. Haemost. 79:557-563), A2 도메인을 더욱 안정화시키는 FVIII 돌연변이체(WO 97/40145), 발현이 증가된 FVIII 돌연변이체(Swaroop et al. 1997. JBC 272:24121-24124), 면역원성이 감소된 FVIII 돌연변이체(Lollar 1999. Thromb. Haemost. 82:505-508), 서로 다르게 발현된 중쇄 및 경쇄로부터 재구성된 FVIII(Oh et al. 1999. Exp. Mol. Med. 31:95-100), HSPG(헤파란 설페이트 프로테오글리칸) 및/또는 LRP(저밀도 지질단백질 수용체관련 단백질)와 같이 FVIII의 이화작용을 유도하는 수용체에 대한 결합이 감소된 FVIII 돌연변이체(Ananyeva et al. 2001. TCM, 11:251-257), 이황화 결합-안정화된 FVIII 돌연변이체(Gale et al., 2006. J. Thromb. Hemost. 4:1315-1322), 개선된 분비 특성을 갖는 FVIII 돌연변이체(Miao et al., 2004. Blood 103:3412-3419), 보조인자 특이적 활성이 증가된 FVIII 돌연변이체(Wakabayashi et al., 2005. Biochemistry 44:10298-304), 생합성과 분비가 개선되고, ER 샤프론 상호작용이 감소되며, ER-골지 수송이 개선되고, 활성화 또는 비활성화에 대한 내성이 증가되며, 반감기가 개선된 FVIII 돌연변이체(Pipe 2004. Sem. Thromb. Hemost. 30:227-237에 의해 요약됨)를 포함한다. 특히 바람직한 또 다른 예로는 문헌 [Zollner et al 2013, Thrombosis Research, 132:280-287]에 설명된 바와 같은 재조합 형태의 FVIII이다. 이러한 모든 FVIII 돌연변이체와 변이체들은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
바람직하게는, FVIII은 서열번호 14에 나타낸 바와 같이 FVIII의 전장 서열을 포함한다. 또한, FVIII의 생물학적 활성이 보유되는 한, FVIII의 부가, 삽입, 치환, N-말단, C-말단 또는 내부 결실도 포함된다. 변형을 갖는 FVIII가 야생형 FVIII의 생물학적 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 75%를 보유하는 경우, 본 발명의 관점에서 생물학적 활성은 보유되는 것이다. FVIII의 생물학적 활성은 이하에 설명된 바와 같이 당업자에 의해 측정될 수 있다.
FVIII의 생물학적 활성을 측정하기 위한 적당한 시험은, 예를 들어, 1단계 또는 2단계 응고 분석(Rizza et al. 1982. Coagulation assay of FVIII:C and FIXa in Bloom ed. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992) 또는 색원체성 기질 FVIII:C 분석(S. Rosen, 1984. Scand J Haematol 33: 139-145, suppl.)이다. 상기 참고문헌들의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
인간 혈액응고 FVIII의 성숙한 야생형 형태의 아미노산 서열은 서열번호 14에 개시되어 있다. 특정한 서열의 아미노산 위치에 대한 언급은 FVIII 야생형 단백질내 상기 아미노산의 위치를 의미하며, 인용되는 서열 내 다른 위치들에서 돌연변이, 예를 들면 결실, 삽입 및/또는 치환이 존재하는 것을 배제하지 않는다. 예를 들면, 서열번호 14를 언급하는 "Glu2004"에서의 돌연변이는 변형된 상동체에서 서열번호 14의 1번 내지 2332번의 위치에서 하나 이상의 아미노산들이 소실되는 것을 배제하지 않는다.
상기 정의 내에서 "FVIII" 및/또는 "VWF"는, 한 개체에서 존재하여 또 다른 개체로 발생할 수 있는 천연 대립유전자 변이들도 포함한다. 상기 정의 내에서 "FVIII" 및/또는 "VWF"는 FVIII 및/또는 VWF의 변이체를 더 포함한다. 이러한 변이체들은 야생형 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기들에 있어서 서로 다르다. 이러한 차이의 예들로는 보존적 아미노산 치환, 즉 유사한 특징을 갖는 아미노산 그룹, 예를 들면 (1) 소형 아미노산, (2) 산성 아미노산, (3) 극성 아미노산, (4) 염기성 아미노산, (5) 소수성 아미노산 및 (6) 방향족 아미노산 내에서의 치환을 포함할 수 있다. 이러한 보존적 치환의 예를 표 1에 나타내었다.
[표 1]
변형된 VWF
본 발명의 변형된 VWF는 야생형 VWF의 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에 따르면, 변형된 VWF는 서열번호 3에 개시된 바와 같이, 야생형 VWF의 D'-D3 도메인의 아미노산 서열과 비교했을 때, D'-D3 도메인 내에 적어도 하나의 아미노산 치환을 가진다.
상기 변형된 VWF의 D'-D3 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 3에 대하여 하나 이상의 아미노산 치환들을 가질 수 있다. 상기 변형된 VWF의 D'-D3 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 3에 대하여 1개 또는 2개 또는 3개의 아미노산 치환들을 가질 수 있다.
상기 변형된 VWF는 서열번호 3의 320번 위치에서 변형을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 이 위치에서 V가 A로 치환되는 것이 바람직하다. 추가의 바람직한 형태에서, 상기 변형된 VWF는, 320번 위치에서의 변형 이외에도, 서열번호 3의 1번 및/또는 3번의 위치, 바람직하게는 1번과 3번 위치 모두 변형된다.
또한, 서열번호 3의 1번 위치에서의 S가 G, P, V, E, Y, A 및 L로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환되는 것이 바람직하다.
또한, 서열번호 3의 3번 위치에서의 S가 Y, I, M, V, F, H, R 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환되는 것이 바람직하다.
바람직한 치환의 조합으로는 S764P/S766W/V1083A, S764G/S766Y/V1083A, S764E/S766Y/V1083A, N1011S/V1083A/K1181E, S766Y/V1083A, V805/Q1158L 및 K912E/T1088S를 포함한다.
본 발명의 양태에 따르면, FVIII에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합 친화도는 서열번호 3에서의 변형을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 참조 폴리펩티드의 결합 친화도보다 높다.
인자 VIII 분자에 대한 VWF 분자의 결합친화도는 당업계에 사용된 결합 분석에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, VWF 분자를 고체 지지체 상에 고정시킬 수 있고, 증가하는 농도의 인자 VIII을 적용하며, 특정 시간 동안 항온배양하고, 세척 후에, 결합된 인자 VIII을 발색성 분석에 의해 확인한다. 이후, 친화도 상수 또는 해리 상수는 스캐차드 분석 또는 또 다른 적당한 방법에 의해 측정될 수 있다. 폰 빌레브란트 인자에 대한 인간 인자 VIII의 결합 친화도를 측정하는 방법은 문헌 [Vlot et al. (1995), Blood, Volume 85, Number 11, 3150-3157]에 설명되어 있다. 그러나, 바람직하게는, 인자 VIII에 대한 VWF의 친화도는 본 출원의 실시예 1에 기술된 바와 같이 측정된다.
해리 상수를 비롯한, 친화도에 대한 본원의 임의의 언급은 바람직하게는 FVIII에 대한 본 발명의 변형된 VWF 또는 본 발명의 폴리펩티드의 결합을 지칭한다. FVIII의 단일쇄의 아미노산 서열은 서열번호 14에 나타나 있다.
VWF와 FVIII의 상호작용이 높은 온 속도(on-rate)를 가지기 때문에, 해리 상수의 변화는 오프 속도의 변화에 크게 좌우된다. 따라서, VWF와 FVIII와의 결합을 증가시키는 것에 있어서 주요 초점은 FVIII와 VWF 사이의 오프 속도를 감소시키기 위한 노력과 관련이 있다. 바람직하게는 야생형 VWF와 FVIII에 비해 변형된 VWF와 FVIII의 오프 속도는 적어도 2배 낮고, 보다 바람직하게는 적어도 5배 낮고, 바람직하게는 적어도 10배 낮고, 보다 바람직하게는 적어도 20배 낮다.
VWF와 FVIII로 이루어진 복합체의 해리 상수는 바람직하게는 0.2 nmol/L 이하, 보다 바람직하게는 0.175 nmol/L 이하, 보다 바람직하게는 0.15 nmol/L 이하, 보다 바람직하게는 0.125 nmol/L 이하, 보다 바람직하게는 0.1 nmol/L 이하, 보다 바람직하게는 0.05 nmol/L 이하, 가장 바람직하게는 0.01 nmol/L 이하이다.
본 발명의 폴리펩티드와 서열번호 14의 인자 VIII의 복합체의 해리 상수 KD는 보통 참조 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 4의 폴리펩티드)와 서열번호 14의 인자 VIII의 복합체의 해리 상수 KD의 90% 미만이다. 본 발명의 폴리펩티드와 서열번호 14의 인자 VIII의 복합체의 해리 상수 KD는 바람직하게는 참조 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 4의 폴리펩티드) 및 서열번호 14의 인자 VIII의 복합체의 해리 상수 KD의 75% 미만, 보다 바람직하게는 50% 미만, 보다 바람직하게는 25% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만이다.
상기 참조 폴리펩티드는 VWF의 D'-D3 도메인내 돌연변이를 제외하고는, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 즉, 상기 참조 폴리펩티드는 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지지만, 단 상기 참조 폴리펩티드 내 D'-D3 도메인은 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진다. 다시 말해서, 본 발명의 폴리펩티드와 참조 폴리펩티드 사이의 서열에 있어서 유일한 차이는 D'-D3 도메인의 아미노산 서열에 있다. 상기 참조 폴리펩티드는 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드와 같은 조건 하에 제조되어 왔다.
반감기 연장 모이어티
본 발명의 폴리펩타이드는 변형된 VWF로 이루어질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 반감기 연장 모이어티를 더 포함할 수 있다. 상기 반감기 연장 모이어티는 상기 절단된 VWF에 융합된 이종성 아미노산 서열일 수 있다. 다르게는, 상기 반감기 연장 모이어티는 펩타이드 결합과 다른 공유 결합에 의해 상기 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드에 화학적으로 접합될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 반감기는 화학적 변형, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(페길화), 글리코실화된 PEG, 하이드록실 에틸 전분(헤실화(HESylation)), 폴리시알산, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드, 헤파로산 중합체 또는 히알루론산과 같은 반감기 연장 모이어티의 부착에 의해 연장된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 화학적 링커를 통해 알부민과 같은 HLEP에 접합된다. 이러한 접합 기술의 원리는 컨주켐 엘엘씨(Conjuchem LLC)에 의한 예시적 방식으로 기술된 바 있다(예를 들어, 미국 특허 7,256,253호를 참조한다).
반감기 증진 폴리펩타이드 (HLEP)
바람직하게는, 상기 반감기 연장 모이어티는 반감기 연장 폴리펩타이드(HLEP)이고, 보다 바람직하게는, HLEP는 알부민 또는 이의 단편, 면역글로불린 불변 영역 및 이의 부분, 예컨대, Fc 단편, 큰 유체역학적 체적을 갖는 용매화된 무작위 사슬(예컨대, XTEN (Schellenberger et al. 2009; Nature Biotechnol. 27:1186-1190)), 동종-아미노산 반복(HAP) 또는 프롤린-알라닌-세린 반복(PAS), 아파민, 알파-태아단백질, 비타민 D 결합 단백질, 트랜스페린 또는 이의 변이체, 인간 융모성 고나도트로핀-β 서브유닛의 카르복실-말단 펩타이드(CTP), 생리학적 조건 하에 알부민 또는 면역글로불린 불변 영역에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 또는 지질로부터 선택된다.
본원에 사용된 "반감기 증진 폴리펩타이드"는 바람직하게는 알부민, 알부민-패밀리의 구성원, 면역글로불린 G의 불변 영역 및 이의 단편, 생리학적 조건 하에 알부민, 알부민 패밀리의 구성원 뿐만 아니라 면역글로불린 불변 영역의 부분에 결합할 수 있는 영역 및 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이는 본원에 기술되어 있는 전장 반감기 증진 단백질(예컨대, 알부민, 알부민-패밀리의 구성원 또는 면역글로불린 G의 불변 영역), 또는 혈액응고 인자의 치료학적 활성 또는 생물학적 활성을 안정화시키거나 연장시킬 수 있는 이의 1개 이상의 단편일 수 있다. 이러한 단편은 10개 이상의 아미노산 길이로 이루어질 수 있거나, 또는 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 50개, 적어도 약 100개, 또는 그 이상의 연속된 HLEP 서열의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 HLEP 단편이 해당 HLEP 부재 하에 각 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 25%의 기능적 반감기 연장을 제공하는 한, 각 HLEP의 특정 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 HLEP 부분은 야생형 HLEP의 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 보존적 또는 비보존적인 삽입, 결실 및 치환을 포함하고, 이 경우, 그러한 변화는 실질적으로 상기 절단된 VWF의 FVIII-결합 활성을 변화시키지 않는다.
특히, 본 발명에서 제안된 VWF HLEP 융합 작제물은 HLEP의 자연 발생형 다형성 변이체 및 HLEP의 단편을 포함할 수 있다. 상기 HLEP는 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유동물, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 양 또는 돼지로부터 유래될 수 있다. 비포유동물 HLEP로는 수탉 및 연어가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
한 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기 구조를 갖는다:
mVWF - L1 - H, [화학식 1]
상기 식 중에서, mVWF는 상기 변형된 VWF이고, L1은 화학 결합 또는 링커 서열이고, H는 HLEP이다.
L1은 하나 이상의 아미노산, 예를 들어, 1 내지 50, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 3(예컨대, 1, 2 또는 3)개의 아미노산들로 이루어진 화학 결합 또는 링커 서열일 수 있고, 이들은 서로 동일하거나 서로 다를 수 있다. 통상적으로, 상기 링커 서열은 야생형 VWF 내의 상응하는 위치에 존재하지 않는다. L1에 존재하는 적절한 아미노산의 예로는 Gly 및 Ser이 포함된다. 상기 링커는 비면역원성이어야 하고, 절단불가능한 링커 또는 절단가능한 링커일 수 있다. 절단불가능한 링커는 WO2007/090584호에 예시된 바와 같이 글리신과 세린 잔기가 교번하는 형태로 구성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 절단된 VWF 모이어티와 알부민 모이어티 사이의 펩타이드성 링커는 펩타이드 서열들로 이루어지고, 이는 인간 단백질 내의 천연 도메인간 링커로서 작용한다. 바람직하게는, 이런 천연 환경에 있는 이러한 펩타이드 서열은 단백질 표면에 가깝에 위치해 면역계에 접근가능하기 때문에, 이러한 서열에 대해 자연적 내성을 가질 수 있다고 추정할 수 있다. 그 예들은 WO2007/090584호에 제공되어 있다. 절단가능한 링커 서열은 예를 들어, WO 2013/120939 A1호에 기술되어 있다.
바람직한 HLEP 서열들은 상기에 기술되어 있다. 마찬가지로, 각 HLEP의 정확한 "N-말단 아미노산"에 대한 융합 또는 정확한 “C-말단 아미노산"에 대한 융합, 또는 각 HLEP의 "N-말단 아미노산” 또는 “C-말단 아미노산"에 대한 융합이 본 발명에 포함되고, 이는 HLEP의 하나 이상의 아미노산에 대한 N-말단 결실을 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 1개 초과의 HLEP 서열, 예를 들어, 2개 또는 3개의 HLEP 서열을 포함할 수 있다. 이러한 다중 HLEP 서열들은 VWF의 C-말단 부분에 탠덤(tandem)식으로, 예를 들면, 연속적인 반복으로서 융합될 수 있다.
HLEP로서의 알부민
"인간 혈청 알부민"(HSA) 및 "인간 알부민"(HA) 및 "알부민"(ALB)이라는 용어는 본 출원에서 상호 교환하여 사용된다. "알부민" 및 "혈청 알부민"이라는 용어가 더 광의적으로, 인간 혈청 알부민(및 그의 단편들 및 변이체들) 뿐만 아니라 다른 종들의 알부민(및 그의 단편들 및 변이체들)을 망라한다.
본원에서, "알부민"은 알부민의 하나 이상의 기능적 활성(예를 들면, 생물학적 활성)을 갖는, 알부민 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 단편 또는 변이체를 총괄하여 지칭한다. 특히, "알부민"은 인간 알부민 또는 이의 단편, 특히 본원의 서열번호 16에 나타낸 인간 알부민 또는 다른 척추동의 알부민의 성숙된 형태 또는 이의 단편들, 또는 이러한 분자들의 유사체 또는 변이체 또는 이의 단편을 지칭한다.
특히, 본 발명의 제시된 폴리펩타이드는 인간 알부민의 자연 발생형 다형성 변이체 및 인간 알부민의 단편을 포함할 수 있다. 일반적으로 말하면, 알부민 단편 또는 변이체는 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 40개, 가장 바람직하게는 70개 이상의 아미노산 길이를 가질 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태들은 FcRn 수용체에 대한 결합이 증강된, 본 발명의 폴리펩타이드의 HLEP로서 사용된 알부민 변이체를 포함한다. 이러한 알부민 변이체는 절단된 VWF의 야생형 알부민과의 융합과 비교했을 때 상기 절단된 VWF 알부민 변이체 융합 단백질의 보다 긴 혈장 반감기를 유도할 수 있다. 상기 변이체들은 WO 2014072481호, WO 2012150319호, WO 2013135896호, WO 2011124718호, WO 2011051489호 및 WO 2012059486호에 기술된 것들을 포함하며, 상기 문헌의 개시내용은 상호참조에 의하여 본원에 포함된다.
본 발명의 본 발명의 폴리펩타이드의 알부민 부분은 HA의 적어도 하나의 서브도메인 또는 도메인, 또는 이들의 보존적 변형을 포함할 수 있다.
HLEP로서의 면역글로불린
면역글로불린 G(IgG) 불변 영역(Fc)은 치료용 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 당업계에 알려져 있다 (Dumont JA et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). 중쇄의 IgG 불변 영역은 3개의 도메인(CH1-CH3)과 힌지 영역으로 이루어져 있다. 면역글로불린 서열은 임의의 포유동물, 또는 그의 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 각각 유도될 수 있다. 항원-결합 도메인이 없는 IgG 및 IgG 단편들이 HLEP로서 사용될 수도 있다. 치료용 폴리펩타이드 부분은 바람직하게는 항체 또는 펩타이드 링커의 힌지 영역을 통해 IgG 또는 IgG 단편에 연결되며, 이는 심지어 절단할 수도 있다. 수개의 특허 및 특허출원들이 치료용 단백질의 생체내 반감기를 개선하기 위해 면역글로불린 불변 영역에 상기 치료용 단백질을 융합시키는 것에 대하여 기술하고 있다. US 2004/0087778호 및 WO 2005/001025호는 펩타이드의 반감기를 증가시키고 그렇지 않으면 생체내에서 신속하게 제거되는, 생물학적으로 활성인 펩타이드를 갖는 면역글로불린 불변영역의 적어도 일부 또는 Fc 도메인의 융합 단백질에 대하여 설명하고 있다. 증강된 생물학적 활성, 연장된 순환성 반감기 및 더 큰 용해도가 달성된 Fc-IFN-β 융합 단백질에 대해서도 기술되었다 (WO 2006/000448호). 연장된 혈청 반감기 및 증가된 생체내 효능을 갖는 Fc-EPO 단백질(WO 2005/063808호) 뿐만 아니라, G-CSF와의 Fc 융합(WO 2003/076567호), 글루카곤-유사 펩타이드-1(WO 2005/000892호), 응고 인자(WO 2004/101740호) 및 인터루킨-10(미국 특허 6,403,077호)도 개시되어 있으며, 이들은 모두 반감기 증강 특성들을 가진다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 각종 HLEP는 WO 2013/120939 A1호에 상세하게 기술되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용도 상호참조에 의하여 본원에 포함된다.
링커 서열
본 발명에 따르면, 치료용 폴리펩타이드 모이어티는 펩타이드 링커에 의해 HLEP 모이어티에 결합될 수 있다. 상기 링커는 비면역원성이어야 하고, 절단불가능한 링커 또는 절단가능한 링커일 수 있다.
절단불가능한 링커는 WO2007/090584호에 예시된 바와 같이 글리신과 세린 잔기가 교번하는 형태로 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, VWF 모이어티와 알부민 모이어티 사이의 펩타이드성 링커는 펩타이드 서열들로 이루어지고, 이는 인간 단백질 내의 천연 도메인간 링커로서 작용한다. 바람직하게는, 이런 천연 환경에 있는 이러한 펩타이드 서열은 단백질 표면에 가깝에 위치해 면역계에 접근가능하기 때문에, 이러한 서열에 대해 자연적 내성을 가질 수 있다고 추정할 수 있다. 그 예들은 WO2007/090584호에 제공되어 있다.
절단가능한 링커는 프로테아제에 의해 절단되기에 충분하게 유연해야 한다. 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질이 변형된 FVIII인 경우, 융합 단백질내 FVIII의 활성화로 인해 링커의 절단은 비교적 신속하게 진행한다.
절단가능한 링커는 바람직하게는
(a) 치료용 폴리펩타이드가 활성화되는 동안 단백질 가수분해로 절단된 단백질 가수분해성 절단 부위를 함유하는 경우 자체 투여되는 상기 치료용 폴리펩타이드,
(b) 치료용 폴리펩타이드의 관여에 의해 활성화되거나 형성되는 프로테아제에 의해 절단된 기질 폴리펩타이드, 또는
(c) 응고 또는 섬유소분해에 관여되는 폴리펩타이드
로부터 유도된 서열을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서의 링커 영역은 VWF의 서열을 포함하는데, 이는 발현된 융합 단백질의 신생항원 특성들이 생길 위험을 감소시켜 줄 것이다.
상기 링커 펩타이드는 바람직하게는 응고 시스템의 프로테아제, 예를 들어 FIIa, FIXa, FXa, FXIa, FXIIa 및 FVIIa에 의해 절단된다.
치료용 폴리펩타이드, 절단가능한 링커 및 HLEP의 예시적인 조합은 WO2007/090584호(예를 들면, 표 2와 도 4) 및 WO2007/144173호(예를 들면, 표 3a와 3b)에 열거된 작제물들을 포함하지만, 여기에 국한되지는 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 폴리펩티드와 복합체화된 FVIII의 기능성 반감기는 야생형 VWF, 또는 야생형 VWF와 복합체화된 FVIII, 또는 상기 정의된 참조 폴리펩티드와 복합체화된 FVIII의 반감기에 비해 연장된다. 상기 증가는 15% 이상, 예를 들어 적어도 20% 또는 적어도 50%일 수 있다. 다시, 상기 기능성 반감기 값은, 변형된 VWF 또는 FVIII와 변형된 VWF의 복합체가 함께 투여된 후, 상기 포유동물로부터 서로 다른 시간 간격으로 채취된 혈액 샘플에서 시험관내 측정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드와 복합체화된 FVIII은 야생형 VWF 또는 야생형 VWF와 복합체화된 FVIII, 또는 상기 정의된 참조 폴리펩티드와 복합체화된 FVIII에 비해 개선된 생체내 회수율을 나타낸다. 상기 생체내 회수율은, 상응하는 야생형 VWF 또는 상기 정의된 참조 폴리펩티드와 비교하여 정맥내 투여 직후(5분 내지 10분) 순환시에 항원 또는 활성 분석에 의해 FVIII의 비율이 증가될 것이라 기대되는 FVIII 녹아웃 마우스와 같이, 예를 들어 정상적인 동물 또는 A형 혈우병의 동물 모델에서 생체내 측정될 수 있다.
상기 생체내 회수율은 야생형 VWF 또는 상기 정의된 참조 폴리펩티드와 복합체화된 FVIII에 비해 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 더 바람직하게는 적어도 40%까지 증가된다.
폴리뉴클레오타이드
본 발명은 추가로 본 출원에 설명된 바와 같이 변형된 VWF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. "폴리뉴클레오티드(들)"라는 용어는 일반적으로, 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 가리킨다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드(들)"라는 용어는 하나 이상의 변형된 염기 및/또는 특이한 염기, 예컨대 이노신을 포함하는 DNA 또는 RNA도 포함한다. 당업계의 숙련자들에게 공지된 여러가지 유용한 목적들을 제공하는 다양한 변형들이 DNA 및 RNA에 행해질 수 있음은 분명할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이 "폴리뉴클레오티드(들)"이라는 용어는 이러한 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 예를 들어 바이러스 및 간단한 세포와 복잡한 세포를 포함하는 세포의 DNA 및 RNA 특성의 화학적 형태들을 포괄한다.
당업자라면 유전자 코드의 중복성(degeneracy)으로 인해 주어진 폴리펩티드가 다른 폴리뉴클레오티드들에 의해서도 인코딩될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 "변이체"들도 본 발명에 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드이다. "분리된" 폴리뉴클레오티드라는 용어는 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA에 국한되지 않는 다른 핵산 서열들이 실질적으로 없는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 당업자에게 공지된 통상적인 핵산 정제 방법을 사용하여 분리된 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있다. 상기 용어는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 변형된 VWF, 또는 상기 변형된 VWF를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 함께 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 그룹에 관한 것이다. 상기 그룹 내의 제1 폴리뉴클레오티드는 변형된 VWF의 N-말단부를 인코딩할 수 있으며, 제2 폴리뉴클레오티드는 변형된 VWF의 C-말단부를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터이다. 바람직하게는, 상기 플라스미드 또는 벡터는 발현 벡터이다. 특정 실시양태에서, 벡터는 인간 유전자 요법에 사용하기 위한 전이 벡터이다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드의 그룹을 포함하는 플라스미드 또는 벡터의 그룹에 관한 것이다. 제1 플라스미드 또는 벡터는 상기 제1 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 제2 플라스미드 또는 벡터는 상기 제2 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 다르게는, 2개의 별도의 프로모터 서열 또는 하나의 프로모터와, 예를 들어, 퓨린의 발현을 지시하여 성숙한 VWF의 생성을 증강시키는데 사용될 수 있는 내부 리보솜 유입점(IRES) 구성요소를 사용하여, 상기 양 코딩 서열을 모두 하나의 발현 벡터 내로 클로닝한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 또는 벡터, 또는 본원에 설명된 폴리뉴클레오티드의 그룹, 또는 플라스미드 또는 벡터의 그룹을 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명의 숙주 세포는, 본 발명의 일부인, 변형된 VWF 또는 상기 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 목적하는 변형된 단백질이 발현되도록 하는 조건 하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 숙주 세포, 또는 배양 배지로부터 목적하는 변형된 단백질을 선택적으로 회수하는 단계.
본 발명의 변형된 VWF, 또는 상기 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드를 80% 이상의 순도, 보다 바람직하게는 95% 이상의 순도로 정제하는 것이 바람직하며, 오염성 거대 분자, 특히 다른 단백질과 핵산과 관련하여 99.9% 이상 순수하고, 감염원 및 발열원이 없는 약학적으로 순수한 상태가 특히 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 분리되거나 정제된 변형된 VWF, 또는 본 발명의 폴리펩티드는 관련이 없는 다른 폴리펩티드들이 실질적으로 없다.
본 발명의 다양한 생성물들은 약제로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 변형된 VWF 또는 상기 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 A형 혈우병 또는 B형 혈우병 또는 VWD와 같은 혈액 응고 질환으로 고통받는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 기술된 유효량의 (i) FVIII 및 변형된 VWF 또는 상기 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드, 또는 (ii) FVIII와 상기 변형된 VWF와의 복합체, 또는 (iii) FVIII와 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드와의 복합체를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다르게는, 상기 방법은 본원에 설명된 유효량의 본 발명의 숙주 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
변형된 폴리펩타이드의 발현
적당한 숙주 세포 내에서 재조합 변이체 단백질들을 높은 수준으로 제조하는데 있어서는, 당업계의 숙련자들에게 공지된 방법에 따른 다양한 발현 시스템에서 증식될 수 있는 재조합 발현 벡터 내에서 적절한 조절 요소들과 함께, 상기 언급한 변형된 폴리뉴클레오타이드, 통상 cDNA를 효과적인 전사 유닛으로 조립할 필요가 있다. 효과적인 전사 조절 요소들은 그들의 천연 숙주로서 동물 세포를 갖는 바이러스로부터, 또는 동물 세포의 염색체 DNA로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는, 시미안(Simian) 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 또는 로우스(Rous) 사코마 바이러스의 긴 말단 반복으로부터 유도된 프로모터-인핸서 조합, 또는 베타-액틴 또는 GRP78과 같이 동물 세포 내에서 구성적으로 강하게 전사된 유전자들을 포함하는 프로모터-인핸서 조합이 사용될 수 있다. cDNA로부터 전사된 안정적인 높은 수준의 mRNA를 얻기 위해서는, 상기 전사 유닛은 전사 종결-폴리아데닐화 서열을 인코딩하는 DNA 영역을 그의 3'-근위부에 함유하여야 한다. 바람직하게는, 이 서열은 시미안 바이러스 40 초기 전사영역, 래빗 베타-글로빈 유전자, 또는 인간 조직 플라스미노겐 활성화제 유전자로부터 유도된다.
이후, 상기 cDNA는 변형된 FVIII 및/또는 VWF 단백질의 발현을 위한 적당한 숙주세포주의 게놈으로 통합된다. 바람직하게는, 이 세포주는 배양 배지로의 분비 뿐만 아니라 정확한 폴딩, 이황화 결합 형성, 아스파라긴-결합된 글리코실화 및 기타 번역후 변형을 보장하기 위해서 척추동물 기원의 동물 세포주이어야 한다. 기타 번역후 변형들에 대한 예들은 초기 폴리펩티드 사슬의 티로신 O-황산화 및 단백질 가수분해적 처리이다. 사용될 수 있는 세포주의 예로는 원숭이 COS-세포, 마우스 L-세포, 마우스 C127-세포, 햄스터 BHK-21 세포, 인간 배아 신장 293 세포 및 햄스터 CHO-세포를 들 수 있다.
상응하는 cDNA를 인코딩하는 재조합 발현 벡터는 여러가지 다른 방식으로 동물 세포주에 도입될 수 있다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 서로 다른 동물 바이러스들을 기반으로 한 벡터들로부터 생성될 수 있다. 이러한 것의 예로는 배큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 바람직하게는 소 유두종 바이러스를 기반으로 한 벡터들이다.
상응하는 DNA를 인코딩하는 전사 유닛도, 게놈에 재조합 DNA를 포함시킨 특정 세포 클론들의 분리를 용이하게 하기 위해, 상기 세포들 내에서 우성 선택성 마커로서 기능할 수 있는 다른 재조합 유전자와 함께 동물 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 유형의 우성 선택성 마커 유전자의 예로는 젠타마이신(G418)에 대한 내성을 부여하는 Tn5 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 및 퓨로마이신에 대한 내성을 부여하는 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제를 들 수 있다. 이러한 선택성 마커를 인코딩하는 재조합 발현 벡터는 원하는 단백질의 cDNA를 인코딩하는 벡터와 같은 벡터 상에 존재할 수 있거나, 또는 이는 숙주 세포의 게놈에 동시에 도입 및 통합되는 별도의 벡터 상에서 인코딩될 수 있어, 서로 다른 전사 유닛들 사이에서 치밀한 물리적 결합을 생성하는 경우가 많다.
원하는 단백질의 cDNA와 함께 사용될 수 있는 기타 유형의 선택성 마커 유전자들은 디하이드로폴레이트 환원효소(dhfr)를 인코딩하는 다양한 전사유닛들을 기반으로 한다. 이러한 유형의 유전자를 내인성 dhfr-활성이 결여된 세포, 우선적으로 CHO-세포(DUKX-B11, DG-44)에 도입한 후에는, 뉴클레오시드가 결여된 배지 내에서 이들이 증식하는 것이 가능할 것이다. 이러한 배지의 예로는 하이폭산틴, 티미딘 및 글리신이 없는 Ham's F12를 들 수 있다. 이러한 dhfr-유전자들은 동일한 벡터 상에서, 또는 서로 다른 벡터 상에서 결합된, 상기 유형의 CHO-세포 내로 FVIII cDNA 전사 유닛과 함께 도입될 수 있어, 재조합 단백질을 생성하는 dhfr-양성 세포주를 형성하게 된다.
상기 세포주들이 세포독성 dhfr-억제제 메토트렉세이트의 존재 하에 성장하는 경우, 메토트렉세이트에 대한 내성이 있는 새로운 세포주들이 출현할 것이다. 이러한 세포주들은 증폭된 수의 결합된 dhfr 및 원하는 단백질의 전사 유닛들로 인해 재조합 단백질을 증가된 비율로 생성할 수 있다. 증가하는 농도의 메토트렉세이트(1-10000nM)에서 이러한 세포주들을 증식시키는 경우, 원하는 단백질을 매우 높은 비율로 생성하는 새로운 세포주들이 수득될 수 있다.
목적하는 단백질을 생성하는 상기 세포주들은 현탁액 배양물 내에서 또는 다양한 고체 지지체 상에서 대규모로 증식될 수 있다. 이러한 지지체들의 예로는 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스에 기초한 미세담체, 또는 중공 섬유 또는 다양한 세라믹 재료 형태의 고체 지지체들을 들 수 있다. 세포 현탁액 배양물 내에서, 또는 미세담체 상에서 증식되는 경우, 상기 세포주들의 배양은 장시간에 걸쳐 컨디셔닝된 배지를 연속적으로 제조하면서 욕조(bath) 배양으로 또는 관류 배양으로 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 상기 세포주들은 원하는 재조합 변이체 단백질들을 제조하기 위한 산업적 방법을 개발하는데 매우 적합하다.
정제 및 제제
상기 유형의 분비성 세포들의 배지 내에 축적하는, 상기 재조합 변형된 VWF 단백질은 세포 배양 배지 내에서 원하는 단백질과 다른 물질들 간의 크기, 전하, 소수성, 용해도, 특이적 친화도 등의 차이를 이용하는 방법을 비롯한 다양한 생화학적 및 크로마토그래피 방법들에 의해 농축 및 정제될 수 있다.
이러한 정제의 예로는, 예컨대, HLEP, 바람직하게는 인간 알부민에 대한, 또는 각 응고인자에 대한, 고체 지지체 상에 고정된 모노클론 항체에 대한 재조합 변이체 단백질의 흡착을 들 수 있다. 상기 지지체에 대한 변형된 VWF의 흡착, 세척 및 탈착 후, 단백질은 상기 특성들에 기초한 다양한 크로마토그래피 기법들에 의해 추가로 정제될 수 있다.
정제 단계의 순서는 예컨대, 해당 단계의 수용력과 선택성, 지지체의 안정성 또는 다른 양상들에 따라 선택된다. 바람직한 정제 단계로는, 이온 교환 크로마토그래피 단계, 면역 친화성 크로마토그래피 단계, 친화성 크로마토그래피 단계, 소수성 상호반응 크로마토그래피 단계, 염색 크로마토그래피 단계, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단계, 다중모드 크로마토그래피 단계 및 크기 배제 크로마토그래피 단계를 포함하지만, 여기에 국한되지는 않는다.
바이러스 오염의 이론적인 위험을 최소화하기 위해, 바이러스를 효과적으로 불활성화시키거나 제거하는 추가 단계들이 공정에 포함될 수 있다. 이러한 단계들로는, 예컨대, 액체 또는 고체 상태에서의 열처리, 용매 및/또는 세제에 의한 처리, 가시광선 또는 UV 스펙트럼의 방사선, 감마-방사선 또는 나노여과를 들 수 있다.
본 발명의 변형된 폴리뉴클레오티드(예를 들면, DNA)는 인간 유전자 요법에 사용하기 위한 전이 벡터로 통합될 수도 있다.
본원에 기술된 다양한 실시양태들은 서로 조합될 수 있다. 본 발명은 하기의 실시예에서 보다 상세히 추가로 설명될 것이다. 본 발명의 특정 실시양태들은 첨부된 도면들과 함께 설명될 것이다.
본 발명에 설명된 바와 같은 변형된 VWF는 치료적 용도를 위한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 정제된 단백질은 임의로 약제학적 부형제가 첨가될 수 있는 생리학적으로 적합한 통상의 완충 수용액에 용해시켜 약제학적 제제를 제공할 수 있다.
이러한 약학적 담체 및 부형제 뿐만 아니라 적절한 약학적 제제들은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들면, ["Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000)] 또는 ["Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)] 참조). 표준 약학적 제제화 기법들은 당업자들에게 잘 알려져 있다(예를 들면, 2005 Physicians' Desk Reference®, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Gennaro et al., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000 참조). 특히, 본 발명의 폴리펩티드 변이체를 포함하는 약학적 조성물은 동결건조된 형태 또는 안정한 액체 형태로 제제화될 수 있다. 상기 폴리펩티드 변이체는 당업계에 공지된 다양한 과정들에 의해 동결건조될 수 있다. 동결건조된 제제들은 주사용 멸균수 또는 멸균 생리식염용액과 같은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제들을 첨가하여 사용하기 전에 재구성된다.
조성물의 제제는 임의의 약학적으로 적합한 투여 수단에 의해 개체에게 전달된다. 다양한 전달 시스템들이 공지되어 있어, 임의의 편리한 경로에 의해 상기 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 우선적으로는, 본 발명의 조성물은 전신 투여된다. 전신적 사용을 위해, 본 발명의 단백질은 종래 방법에 따른 비경구적(예를 들면, 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비강내 또는 경피) 또는 장내(예를 들면, 경구, 질내 또는 직장내) 전달을 위해 제제화된다. 가장 우선적인 투여 경로는 정맥내 및 피하 투여이다. 제제는 주입 또는 볼루스 주사에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 일부 제제들은 서방형 시스템을 포함한다.
본 발명의 단백질은 허용되지 않는 부작용을 일으키는 용량에 도달하지 않으면서, 치료 중인 질환 또는 징후의 중증도 또는 확산을 예방하거나 경감시키고, 목적하는 효과를 달성하기에 충분한 용량을 의미하는 치료학적 유효량으로 환자에게 투여된다. 정확한 용량은 여러가지 요인들, 예를 들면 증상, 제제 및 투여 방법에 따라 다르며, 각 증상에 대한 임상전 및 임상 실험에서 측정되어야 한다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제들과 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 제제들은 동일한 약제의 일부로서 포함될 수 있다. 이러한 제제의 한 예는 변형된 VWF와 FVIII와의 조합이다.
본원에 언급된 서열의 개요를 표 2에 나열하였다.
[표 2]
실시예
실시예 1
개선된 FVIII 결합을 갖는 vWF 돌연변이체
배경
상기 및 함께 계류 중인 국제 특허 출원 PCT/AU2015/050369호에서 논의한 바와 같이, 대부분의 순환하는 FVIII은 VWF와의 복합체이다. 인간에 있어서, FVIII는 VWF의 부재 및 존재 하에 각각 약 2시간 및 16시간의 t1/2로 혈액으로부터 소거된다. VWF가 FVIII 반감기 증가를 부여하더라도, 이는 자신의 반감기에 의해 지시되는 t1/2에 대한 상한도 설정하고 있다. 미국특허 8,575,104호에는 VWF-알부민 융합 단백질이 개시되어 있다. 이 융합 단백질은 설치류 모델에서 야생형 VWF보다 5배 긴 반감기를 가진다. 이 융합 단백질과 FVIII 간의 안정한 복합체는 FVIII에 대하여 추가적인 반감기 이익을 제공할 수 있다. FVIII/VWF 상호작용을 위한 평형 결합상수가 높더라도, 결합 반응 속도가 빨라서 VWF-알부민 융합 단백질과의 복합체 내의 임의의 FVIII은 융합시 내인성 VWF와 신속하게 교류할 것이다. 따라서, VWF-알부민 융합에 의한 FVIII의 오프 속도가 네이티브 VWF에 의한 FVIII의 오프 속도와 실질적으로 균등하다면, VWF-알부민 융합은 FVIII의 반감기에 임의의 실질적인 증가를 제공하지 않을 것이다.
따라서, FVIII의 반감기를 연장하기 위해 VWF-알부민 융합의 더 긴 반감기의 이점을 취하기 위해, VWF-알부민 융합에 의해 FVIII의 오프 속도를 감소시킬 필요가 있다. VWF의 수준은 정상이지만 FVIII에 결합할 수 있는 VWF의 능력이 심각하게 저하된 2N형 폰 빌레브란트 질병을 갖는 환자들에서 행해진 측정을 이용하는 모델링 연구로부터, FVIII 반감기에 있어서 임상적으로 관련된 개선을 하기 위해서는 적어도 5배의 오프 속도의 감소가 필요한 것으로 추정된다. FVIII VWF-알부민 융합 오프 속도에서의 감소와 FVIII 반감기에서의 증가 사이에 상정된 관계를 표 3에 나타내었다.
[표 3]
FVIII VWF-알부민 융합 오프 속도를 감소시키기 위한 노력으로, 돌연변이체 VWF-알부민 융합 단백질이 현저히 더 느린 FVIII 오프 속도를 제공할 수 있는지의 여부를 평가하기 위해 실험을 진행하여, VWF-알부민 융합 단백질과의 안정적인 결합을 통해 FVIII의 반감기를 연장시키기 위한 실현가능한 옵션을 제공하였다.
PCT/AU2015/050369호에 기술된 작업의 연장으로, 추가의 돌연변이 및 돌연변이들의 조합을 D3 도메인 내의 변형에 중점을 두면서 연구하였다. 이러한 실험들에서, FVIII의 재조합 형태가 사용되었다. 이 FVIII은 문헌 [Zollner et al 2013, Thrombosis Research, 132:280-287]에 설명되어 있다.
방법
인간 폰 빌레브란트 인자(vWF; 아미노산(aa) 764-1242 (서열번호 2); GenBank 등록번호 NP_000543에 기초함)의 D' 및 D3 도메인들을 인코딩하는 합성된 코돈-최적화 cDNA는 GeneART AG(독일 로젠버그 소재)로부터 입수하였다. 5' 말단에서는 자신의 신호 펩티드(aa1-22)를 인코딩하고 3' 말단에서는 글리신 세린 링커를 통해 인간 혈청 알부민 (HSA)을 인코딩하기 위해 이를 변형시켰다. 상기 작제물(Hu-vWF[764-1270]-HSA)은 개시 메티오닌의 코작(Kozak) 컨센서스 서열(GCCACC) 업스트림과 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에서의 이중 정지 코돈(TGA) 및 자동화 시퀀싱에 의해 확인된 플라스미드 서열을 갖는, pcDNA3.1 포유동물 발현벡터(미국 인비트로겐(Invitrogen)사 제조) 내로 방향성있게 클로닝되었다. 이후, 이 발현 플라스미드는 표준 PCR 기술들을 이용해 단일, 이중 또는 삼중 잔기 변화를 주기 위한 주형으로서 사용되었고, 상기 작제물을 pcDNA3.1로 클로닝한 후, 상기 설명한 바와 같이 시퀀싱하였다. C-말단 FLAG 태그(DYKDDDDK)를 갖는 Hu-vWF의 D1 및 D2 도메인(aa1-762)을 인코딩하는 제2 코돈-최적화 cDNA도 합성하였고, GeneArt으로부터 입수하였으며; 이는 상기와 같이 pcDNA3.1 내로 클로닝하여 시퀀싱하였다.
일시적인 포유동물 발현을 위해, 프리스타일(Freestyle)TM 293 현탁액 세포(인비트로겐)를 5㎖의 프리스타일 발현 배지(인비트로겐) 내에서 1.1 × 106개의 세포/㎖로 증식시켰다. 7 μL의 293Fectin(인비트로겐) 형질감염 제제를 167 μL의 Opti-MEM I 배지(인비트로겐)와 5분간 사전 항온배양시킨 후, 야생형/돌연변이체 Hu-vWF[764-1242]-8His를 인코딩하는 플라스미드 DNA 2.5 ㎍ 및 Hu-vWF[1-762]-FLAG를 인코딩하는 플라스미드 DNA 2.5 ㎍를 첨가하고, 상기 혼합물을 추가로 20분 동안 항온배양하였다. 상기 DNA-293Fectin 복합체를 세포에 첨가하고, 이를 250rpm의 진탕 항온배양기 중에서 37℃, 8% CO2에서 6일간 배양하였다. 2000 rpm에서 5분간 원심분리에 의해 배양물 상청액을 수거하여 4℃에서 분석을 위해 저장하였다.
표준 NHS/EDC 커플링 화학을 사용하여, 마우스 항-HSA 항체를 CM5 칩 상에 고정시켰다. 통상적으로, 고정 수준은 14,000 RU이었다. 각각의 vWF-HSA의 돌연변이를 0.1~1㎍/㎖ 범위의 다양한 농도에서 2분간 각 유동 세포 중의 하나의 지점에서 포획하였다. 포획 수준은 100-200 RU 범위였다. 항-HSA가 고정되었지만 vWF-HSA가 포획되지 않은 인접한 지점을 기준으로서 사용하였다. FVIII 결합 분석전에 매 주기마다 포획을 수행하였다.
중성 pH에서 초기 실험을 수립하여 최상의 친화도 및 오프 속도가 개선된 vWF-HSA 돌연변이체에 대하여 일련의 돌연변이들을 스크리닝하였다. 인자 VIII를 5, 1 및 1.25 nM로 사용하여 모든 유동 세포들 및 모든 지점들에 대하여 무작위적으로 2회씩 주사하였다. 이 스크린의 결과를 표 4에 나타내었다.
[표 4]
실시예 2
세부 동역학 분석
대조군을 비롯한 최상의 두 후보물질들에 대하여 pH7에서의 세부 동역학을 수립하는, 정제된 물질을 사용하는 후속 실험을 수행하였다. vWF-HAS 단백질은 Capture SelectTM 인간 알부민 친화성 수지를 이용하여 정제하고, vWF-HAS 이량체는 분취용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 이후, 정제된 물질을 분석하기 전에 4℃에 보관하였다. vWF-HAS 이량체의 포획을 상기와 같이 수행한 후, 인자 VIII을 1, 0.5, 0.25, 0.125 및 0.06 nM로 주사하였다. 유사한 방식으로, 최상의 두 후보물질에 대한 세부 동역학 분석을 pH 5.5에서 수립하였고, 이 경우 상호작용에 가장 적합한 다양한 농도로 인자 VIII를 주사하였다.
모든 실험에서, 포획된 모든 단백질에 대해 완충제 블랭크도 주사하였다. “스크리닝” 실험 동안 인자 VIII의 결합과 해리를 각각 3분간 모니터링하였다. 중성 pH에서 “세부 동역학 분석” 실험을 수행하는 동안, CSL627의 결합을 5분간 모니터링하였고, 해리를 20분과 60분간 모니터링하였다. pH 5.5에서, 최상의 적합한 상호반응이 일어나는 다양한 시간 프레임에 대하여 FVIII의 결합 및 해리를 모니터링하였다.
해리 기간 이후, 25 mM의 글리신(pH 2.6)을 45초 주사하여 표면을 재생시켰다. 실행 완충제(running buffer)의 처리량은 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10 mM 시트르산나트륨, 2.5 mM CaCl2, 0.1% BSA, pH 7.3 및 pH 5이었으며, 한편 유속은 30㎕/분이었다. 각 상호반응은 37℃에서 적어도 2회 측정되었다 (n=2).
기준 지점에 대한 결합 반응들은 vWF-HSA 포획된 지점들의 반응들로부터 차감하였다. 이후, 블랭크 주사로부터의 반응들은 다른 모든 샘플들의 반응들로부터 차감하여 이중 참조된 센서그램들을 생성하였다. 이중 참조된 센서그램들을, 질량 전달 제한(mass transport limitation)에 대한 한계점을 포함하는, 1:1 동역학 모델로 핏팅하였다. 결합 및 해리 속도를 전반적으로 핏팅하고, Rmax를 국소적으로 핏팅하였다. 결과를 표 5와 6 및 도 1-3에 나타내었다.
[표 5]
[표 6]
실시예 3
추가의 동역학 분석
방법의 개요:
HAS (Hu-vWF [1-1242]-HAS)에 융합된 네이티브 VWF의 D1D2D’D3 영역을 인코딩하는 단일 DNS 작제물을 사용하여 제조된 최상의 후보물질 단백질에 대하여 pH 7과 pH 5.5에서 추가의 세부 동역학 분석을 수립하는 후속 실험을 수행하였다. 전과 같이, 이 작제물은 단일, 이중 또는 삼중 변화를 만들기 위해 주형으로 사용하였다. vWF-HAS 이량체의 형질감염과 정제를 전과 같이 수행하였다.
표준 NHS/EDC 커플링 화학을 사용하여, 마우스 항-HSA 항체를 CM5 칩 상에 고정시켰다. 통상적으로, 고정 수준은 14,000 RU이었다. 각각의 D’D3-HSA의 이량체 돌연변이를 0.2~0.7㎍/㎖ 범위의 다양한 농도에서 2분간 각 유동 세포 중의 하나의 지점에서 포획하였다. 포획 수준은 50-250 RU 범위이었다. 항-HSA가 고정되었지만 D’D3-HSA가 포획되지 않은 인접한 지점을 기준으로서 사용하였다. FVIII (CSL627) 결합 분석전에 매 주기마다 포획을 수행하였다.
CSL627를 모든 유동 세포 내의 모든 지점들에 대하여 무작위적으로 2회 주사하였다. 중성 pH에서, CSL627를 1, 0.5, 0.25, 0.125 및 0.06 nM로 주사하였다. 결합에 대해 5분간 모니터링했던 반면, 1 nM 농도에서 해리에 대해서 20분간 뿐만 아니라 1시간 동안 모니터링하였다. 완충제 블랭크도 주사하였다. pH 5.5에서, 최상의 적합한 상호반응이 일어나는 다양한 농도 및 시간 프레임으로 CSL627를 주사하였다.
해리 기간 이후, 25 mM의 글리신(pH 2.6)을 45초 주사하여 표면을 재생시켰다. 실행 완충제의 처리량은 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10 mM 시트르산나트륨, 2.5 mM CaCl2, 0.1% BSA, pH 7.3 및 pH 5이었으며, 한편 유속은 30㎕/분이었다. 각 상호반응은 37℃에서 4회 측정되었다 (n=4).
기준 지점에 대한 결합 반응들은 vWF-HSA 포획된 지점들의 반응들로부터 차감하였다. 이후, 블랭크 주사로부터의 반응들은 다른 모든 샘플들의 반응들로부터 차감하여 이중 참조된 센서그램들을 생성하였다. 이중 참조된 센서그램들을, 질량 전달 제한(mass transport limitation)에 대한 한계점을 포함하는, 1:1 동역학 모델로 핏팅하였다. 결합 및 해리 속도를 전반적으로 핏팅하고, Rmax를 국소적으로 핏팅하였다.
결과를 표 7와 8 및 도 4와 5에 나타내었다.
[표 7]
[표 8]
실시예 4
PK 분석 및
FVIII
반감기에 대한 영향
방법
표준 실험 방법을 사용하여 Hu vWF D’D3-FP S764E; S766Y 변이체를 발현하는 안정한 CHO 유래된 세포주를 생성하였다. 10L의 생물반응기 중에서 안정한 세포주로부터 물질을 제조하였고, vWF D’D3-FP S764E; S766Y 이량체를 상기 기술된 바와 같이 정제하였다.
FVIII 수준에 대한 야생형 및 vWF D’D3-FP S764E; S766Y 변이체의 상대적 영향을 평가하기 위해, 재조합 FVIII (200 Iu/kg의 CSL627) 및 vWF-FP 단백질의 조합을 표 9에 나타낸 용량으로 CD 랫트 (3 마리의 동물/그룹)에 투여하였다. Iv 투여 후 0, 3, 8, 24, 48, 56 및 72시간째에 혈장 샘플을 채취하고, Asserachrom FVIII:Ag ELISA를 사용하여 FVIII 수준을 측정하였다. 이후, 이 데이터를 사용하여 표 9에 나타낸 FVIII 반감기 및 평균 체류 시간을 측정하였다.
[표 9]
결론
초기 스크린으로부터, 돌연변이: S764P, S766W, V1083A (PWA 돌연변이체로 지칭됨) 및 S764G, S766Y, V1083A (GYA 돌연변이체로 지칭됨)를 갖는 D’D3-HSA는 인자 VIII에 대해 가장 강한 친화도 및 가장 느린 오프 속도를 가지는 것으로 나타났다.
중성 pH에서, CSL627 (인자 VIII)에 대하여 가장 개선된 친화도 및 오프 속도를 갖는 vWF D’D3-HSA 돌연변이체 이량체는, 5 pM의 KD 및 10-5 1/s의 오프 속도를 갖는 S764G/S766Y/V1083A (GYA), S764E/S766Y/V1083A (EYA) 및 S766Y/V1083A (YA)이다. 이것은 야생형 이량체에 비하여 친화도에서 약 20배가 개선된 것이고, 오프 속도에서 약 40배가 개선된 것이다.
산성 pH에서, CSL627에 대하여 가장 개선된 친화도 및 오프 속도를 갖는 vWF D’D3-HSA 돌연변이체 이량체는 500 pM의 KD 및 10-3 1/s의 오프 속도를 갖는 EYA였다. 이를 토대로 하면, EYA에 대한 친화도 및 오프 속도에서의 개선은 야생형 이량체에 비해 각각 약 100배 및 적어도 10배이다.
EYA 이량체는 중성 및 산성 pH 모두에서 CSL627에 대하여 S764P/S766I와 동일한 유사한 반응 속도 및 친화도를 가지는 것으로 나타났다.
SEQUENCE LISTING
<110> CSL Ltd
<120> Mutated Von Willebrand Factor
<130> 35260939
<150> 2016900033
<151> 2016-01-07
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8442
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc acaggtcaat cacacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac gtccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgcctgcttc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct gtatgtggag 3780
gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga cctggtcttc 3840
ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa ggcctttgtg 3900
gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc cgtggtggag 3960
taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc gtcagagctg 4020
cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac cagcgaggtc 4080
ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc ctcccgcatc 4140
gccctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt tgtccgctac 4200
gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg gccccatgcc 4260
aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc cttcgtgctg 4320
agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct ctgtgacctt 4380
gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc ccccacatgg cacaagtcac tgtgggcccg 4440
gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact ccatggttct ggatgtggcg 4500
ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag caaggagttc 4560
atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt cacggtgctg 4620
cagtactcct acatggtgac cgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc caaaggggac 4680
atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa cactgggctg 4740
gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg ggagcaggcg 4800
cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa gaggctgcct 4860
ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca ggagctggag 4920
aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct cccccgagag 4980
gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat ccccaccctc 5040
tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga tggctcctcc 5100
agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt catttcaaaa 5160
gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag catcaccacc 5220
attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct tgtggacgtc 5280
atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc tgtgcgatac 5340
ttgacttcag aaatgcatgg ggcgcgcccg ggagcctcaa aggcggtggt catcctggtc 5400
acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc caacagagtg 5460
acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg gatcttggca 5520
ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct ccctaccatg 5580
gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag gatttgcatg 5640
gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga ccagtgccac 5700
accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt caactgtgac 5760
cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga agagacctgt 5820
ggctgccgct ggacctgccc ctgcgtgtgc acaggcagct ccactcggca catcgtgacc 5880
tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt tcaaaacaag 5940
gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc aaggcagggc 6000
tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagctgca cagtgacatg 6060
gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa catggaagtc 6120
aacgtttatg gtgccatcat gcatgaggtc agattcaatc accttggtca catcttcaca 6180
ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt tgcttcaaag 6240
acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca atgacttcat gctgagggat 6300
ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca gcggccaggg 6360
cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgacagctc ccactgccag 6420
gtcctcctct taccactgtt tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc cacattctat 6480
gccatctgcc agcaggacag ttgccaccag gagcaagtgt gtgaggtgat cgcctcttat 6540
gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga ggacacctga tttctgtgct 6600
atgtcatgcc caccatctct ggtttataac cactgtgagc atggctgtcc ccggcactgt 6660
gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag gctgtttctg ccctccagat 6720
aaagtcatgt tggaaggcag ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg cattggtgag 6780
gatggagtcc agcaccagtt cctggaagcc tgggtcccgg accaccagcc ctgtcagatc 6840
tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc agccctgccc cacggccaaa 6900
gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga ccagtgctgc 6960
cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc tgcccccagt gcctcactgt 7020
gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa cttcacctgc 7080
gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc gcaccgtttg 7140
cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa ctgtgtcaac 7200
tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaaccg ccaccaatga ctgtggctgt 7260
accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat ctaccctgtg 7320
ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga ggatgccgtg 7380
atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg tcggtcgggc 7440
ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc tgcctgtgag 7500
gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt cggctcccag 7560
tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa ggaggaggtc 7620
tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg cccctcgggc 7680
tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga gcgcatggag 7740
gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat cgatgtgtgc 7800
acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct ggagtgcagg 7860
aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac aggtgaatgt 7920
tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca gatcatgaca 7980
ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa ggtcaatgag 8040
agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga tgaacacaag 8100
tgtctggctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga cacatgtgag 8160
gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg aagctgtaag 8220
tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa agccatgtac 8280
tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccag tgctcctgct gctctccgac acggacggag 8340
cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga ggttctcaat 8400
gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt ga 8442
<210> 2
<211> 2813
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
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Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
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Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
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565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
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645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
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690 695 700
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Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
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770 775 780
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820 825 830
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850 855 860
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Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
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930 935 940
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Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
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His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
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995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
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1130 1135 1140
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1145 1150 1155
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His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
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Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
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1310 1315 1320
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu
1370 1375 1380
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
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1400 1405 1410
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met
1460 1465 1470
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
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1625 1630 1635
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
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Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
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Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser
1940 1945 1950
Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu
1955 1960 1965
Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp
1970 1975 1980
Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg
1985 1990 1995
Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser
2000 2005 2010
Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu
2015 2020 2025
Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr
2030 2035 2040
Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile
2045 2050 2055
Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser
2060 2065 2070
Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys
2075 2080 2085
Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
2090 2095 2100
Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg
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Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
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Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
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Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val
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2210 2215 2220
Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro
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Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala
2240 2245 2250
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
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2270 2275 2280
Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr
2285 2290 2295
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2330 2335 2340
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2345 2350 2355
Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro
2360 2365 2370
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2600 2605 2610
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2615 2620 2625
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2630 2635 2640
Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2645 2650 2655
Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2660 2665 2670
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2675 2680 2685
Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala
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2705 2710 2715
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2720 2725 2730
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2750 2755 2760
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2765 2770 2775
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2780 2785 2790
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Arg Lys Cys Ser Lys
2810
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<211> 479
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
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Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165 170 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180 185 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
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Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325 330 335
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
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Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser
1385 1390 1395
Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser
1400 1405 1410
Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val
1415 1420 1425
Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu
1430 1435 1440
Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu
1445 1450 1455
Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys
1460 1465 1470
Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
1475 1480 1485
Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys
1490 1495 1500
Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu
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Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile
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Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg
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Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu
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Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys
1580 1585 1590
Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His
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Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu
1610 1615 1620
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Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
1640 1645 1650
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile
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Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp
1670 1675 1680
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
1685 1690 1695
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
1700 1705 1710
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
1715 1720 1725
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe
1730 1735 1740
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
1745 1750 1755
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
1760 1765 1770
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
1775 1780 1785
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
1790 1795 1800
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1805 1810 1815
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1820 1825 1830
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
1835 1840 1845
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
1850 1855 1860
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
1865 1870 1875
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1880 1885 1890
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1895 1900 1905
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1910 1915 1920
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1925 1930 1935
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1940 1945 1950
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1955 1960 1965
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1970 1975 1980
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1985 1990 1995
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
2000 2005 2010
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
2015 2020 2025
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
2030 2035 2040
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
2045 2050 2055
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
2060 2065 2070
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
2075 2080 2085
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
2090 2095 2100
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
2105 2110 2115
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
2120 2125 2130
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
2135 2140 2145
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
2150 2155 2160
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2165 2170 2175
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
2180 2185 2190
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
2195 2200 2205
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
2210 2215 2220
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
2225 2230 2235
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
2240 2245 2250
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
2255 2260 2265
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
2270 2275 2280
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
2285 2290 2295
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
2300 2305 2310
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
2315 2320 2325
Gln Asp Leu Tyr
2330
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> mature single chain Factor VIII
<400> 15
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
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195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
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260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
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340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
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370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
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515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Arg Ser Thr Arg
740 745 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Thr Thr Leu Gln
755 760 765
Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met
770 775 780
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785 790 795 800
Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu
805 810 815
Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn
820 825 830
Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln
835 840 845
Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu
850 855 860
Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu
865 870 875 880
Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
885 890 895
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala
900 905 910
Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe
915 920 925
Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys
930 935 940
Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
945 950 955 960
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn
965 970 975
Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe
980 985 990
Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu
995 1000 1005
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1010 1015 1020
Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met
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1070 1075 1080
Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val
1085 1090 1095
Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu
1100 1105 1110
Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
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Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His
1130 1135 1140
Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp
1145 1150 1155
Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala
1160 1165 1170
Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu
1175 1180 1185
Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln
1190 1195 1200
Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser
1205 1210 1215
Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly
1220 1225 1230
Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys
1235 1240 1245
His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu
1250 1255 1260
His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu
1265 1270 1275
Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu
1280 1285 1290
Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe
1295 1300 1305
Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His
1310 1315 1320
Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro
1325 1330 1335
Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr
1340 1345 1350
Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr
1355 1360 1365
Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp
1370 1375 1380
Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn
1385 1390 1395
Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu
1400 1405 1410
Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln
1415 1420 1425
Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu
1430 1435 1440
Tyr
<210> 16
<211> 585
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
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1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
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465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 17
<211> 479
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Modified D'-D3 domain of VWFPRT
<400> 17
Ser Leu Tyr Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
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20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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405 410 415
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420 425 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450 455 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly
465 470 475
Claims (45)
- 인자 VIII에 결합하는 변형된 폴리펩타이드로서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 서열번호 3에 나타낸 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 서열이 L18, V42, K149, N248, S279, V320, T325, Q395 및 K418로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 변형을 포함하며; 상기 변형된 폴리펩타이드가 변형되지 않은 서열번호 3을 포함하는 참조 폴리펩타이드에 비해 더 낮은 오프 속도(off rate)로 인자 VIII에 결합하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 상기 참조 폴리펩타이드보다 적어도 5배 낮은 오프 속도로 인자 VIII에 결합하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 상기 참조 폴리펩타이드보다 적어도 10배 낮은 오프 속도로 인자 VIII에 결합하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 상기 참조 폴리펩타이드보다 적어도 5배 낮은 KD로 인자 VIII에 결합하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제4항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 상기 참조 폴리펩타이드보다 적어도 10배 낮은 오프 속도로 인자 VIII에 결합하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 적어도 2개의 변형을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 적어도 3개의 변형을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 서열번호 5 (S764P/S766W/V1083A)를 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 서열번호 6 (S764G/S766Y/V1083A)을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 서열번호 7 (S764E/S766Y/V1083A)을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 서열번호 8 (N1011S/V1083A/K1181E)을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 서열번호 17 (S766Y/V1083A)을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 서열번호 9 (V1083A)를 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 서열번호 10 (S1042T)을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 서열번호 11 (V805A/Q1158L)을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 서열번호 12 (K912E/T1088S)를 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 서열번호 13 (L781P)을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 인자 VIII에 결합하는 변형된 폴리펩타이드로서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 서열번호 3에 나타낸 서열을 포함하고, 상기 서열이, 상기 변형된 폴리펩타이드가 변형되지 않은 서열번호 3을 포함하는 참조 폴리펩타이드보다 낮은 오프 속도로 인자 VIII에 결합하도록, 적어도 320번 위치와 1번 및/또는 3번 위치에서의 변형을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제6항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 적어도 서열번호 3의 1번, 3번 및 320번 위치에서의 변형을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 서열번호 3이, 320번 위치의 잔기가 A가 되도록 변형되는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3이, 3번 위치의 잔기가 Y, I, M, V, F, H, R 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되도록 변형되는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3이, 1번 위치의 잔기가 G, P, V, E, Y, A 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되도록 변형되는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 변형된 폰 빌레브란트 인자(VWF)인 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드가 반감기 연장 모이어티를 더 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제24항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 상기 절단된 VWF에 융합된 이종성 아미노산 서열인 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제25항에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 면역글로불린 불변 영역 및 이의 부분, 예컨대 Fc 단편, 트랜스페린 및 이의 단편, 인간 융모성 성선자극호르몬의 C-말단 펩타이드, XTEN으로서 공지되어 있는 큰 유체역학적 체적(hydrodynamic volume)을 갖는 용매화된 무작위 사슬(random chain), 동종-아미노산 반복(HAP), 프롤린-알라닌-세린 반복(PAS), 알부민, 아파민, 알파-태아단백질, 비타민 D 결합 단백질, 생리학적 조건 하에 알부민 또는 면역글로불린 불변 영역에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하거나 이러한 폴리펩타이드로 이루어지는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 상기 변형된 폴리펩타이드에 접합되는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제27항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리시알산(PSA), 엘라스틴 유사 폴리펩타이드, 헤파로산 중합체, 히알루론산 및 알부민 결합 리간드, 예컨대 지방산 사슬, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제28항에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 알부민을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제29항에 있어서, 상기 알부민의 N-말단이 직접 또는 스페이서를 통해 상기 변형된 폴리펩타이드 서열의 C-말단에 융합되는 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 제30항에 있어서, 상기 변형된 폴리펩타이드의 천연 C-말단의 1개 내지 5개의 아미노산이 결실된 것인, 변형된 폴리펩타이드.
- 인자 VIII 분자 및 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 변형된 폴리펩타이드를 포함하는 복합체.
- 출혈성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제32항의 복합체.
- 제33항에 있어서, 상기 출혈성 질환이 폰 빌레브란트 병 (VWD) 또는 A형 혈우병인 것인, 폴리펩타이드 또는 복합체.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 변형된 폴리펩타이드 또는 제32항의 복합체를 포함하는 약학 조성물.
- 약학적 유효량의 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제32항의 복합체를 출혈성 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 출혈성 질환의 치료 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 출혈성 질환이 폰 빌레브란트 병 (VWD) 또는 A형 혈우병인 것인, 방법.
- 출혈성 질환 치료용 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 변형된 폴리펩타이드 또는 제32항의 복합체의 용도.
- 제38항에 있어서, 상기 출혈성 질환이 폰 빌레브란트 병 (VWD) 또는 A형 혈우병인 것인, 용도.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제40항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터.
- 제41항에 있어서, 상기 플라스미드 또는 벡터가 발현 벡터인 것인, 플라스미드 또는 벡터.
- 제40항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제41항 또는 제42항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
- 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
(i) 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드가 발현되도록 하는 조건 하에 제43항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(ii) 임의로 상기 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드를 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 회수하는 단계
를 포함하는 것인, 방법. - 인자 VIII를 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 변형된 폴리펩타이드와 혼합하는 단계를 포함하는, 인자 VIII의 반감기를 증가시키는 방법.
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