CN111787980A - 非酒精性脂肪性肝炎的抗huTNFR1疗法 - Google Patents

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Abstract

一种特异性识别人肿瘤坏死因子1(hu TNFR1)的抗体，用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及与其相关疾病状况。

Description

非酒精性脂肪性肝炎的抗huTNFR1疗法
技术领域
本发明涉及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及与其相关疾病状况的新治疗。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)表示在没有酒精滥用的情况下发生的一系列疾病，并且包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在西方国家，NAFLD显示出越来越高的发病率，并很大程度上的促成了肝细胞癌的发展。
从良性肝脂肪变性到进行性脂肪性肝炎的一个基本步骤是肝细胞死亡的出现，其被归类为细胞凋亡。坏死状凋亡(Necroptosis)已成为一种替代的程序性细胞死亡途径，并被发现在NASH患者的肝脏中被激活(Gautheron et al.Cellular and MolecularGastroenterology and Hepatology 2015,1:264-266)。
Aparicio-Vergara等人(Hepatology 2013,57(2):566-576)描述了TNFR1胞外结构域脱落在防止肝脏脂肪变性的发展或胰岛素抗性中的作用。TNFR1无法脱落不会在小鼠中引起肥胖、胰岛素抗性或肝脏脂肪变性。然而，包含非脱落突变的小鼠显示出朝向NASH的快速进展。发现TNFR1胞外结构域脱落的激活在减缓NASH的进展中起关键作用。
Cubero等人(Cell Death and Differentiation 2013,20:1580-1592)描述了在肝细胞和免疫细胞中的TNFR1在慢性肝病的作用模式中具有不同的作用。
Tomita等人(Gut 2006，55:415-424)描述了在NASH动物模型中，TNFa/TNFR介导的信号传导途径的增强可能与肝纤维化的发病机制极为相关。
Yaron Ilan(AASLD Liver Learning.Ilan Y.Nov 8 2014；60709)公开了用于治疗脂肪肝病的基于抗TNF的口服免疫疗法。将结合TNFα的抗TNF融合蛋白(PRX-106)用于高脂饮食小鼠模型。
通过诱导模拟配体的反应，发现TNFR1的抗体具有激动性潜力(agonisticpotential)。该反应表明，信号转导是由结合多价TNF三聚体的受体聚集引发的。
然而，TNFR1选择性抑制可以用TNFR1-特异性抗体来实现。例如，单克隆鼠抗体H398，以及在US5736138中描述的抗体对人类TNFR1具有选择性，显示出对TNF介导的信号转导和细胞毒性的抑制潜力(Moosmayer et al.1995,Ther.Immunol.2:31-40)。
WO2008/113515A2描述了H398的人源化版本。
WO2012035141公开了缺乏介导效应子功能的抗huTNFR1抗体。
在WO2017174586 A1中描述了单价抗huTNFR1抗体。
Zettlitz等人(LandesBioscience 2010,November/Dezember:639-647)描述了人源化TNFR1-特异性拮抗单克隆抗体的产生。
Richter等人(PLOS One 2013,8(8):1-13)描述了使用人源化拮抗抗-TNFR1抗体选择性抑制TNFR1信号传导，以降低TNF的促炎活性，同时使TNFR2不受影响。
Berger等人(Protein Engineering,Design&Selection 2013,26(10):581-587)描述了作为TNF作用的选择性拮抗剂的抗TNFR1 scFv-HAS融合蛋白。Feagins等人(Eur JGastroenterol Hepatol.2015,27(10):1154-1160)描述了用肿瘤坏死因子抑制剂(TNFi)治疗的患者发展为非酒精性脂肪性肝病(NASH或脂肪变性)。
治疗NASH的治疗可能性限制于或受限于生活方式的改变，因为目前为止还没有具体的药物。因此，需求提供NASH及其相关疾病活性的有效治疗。
发明内容
本发明的目的是提供用于NASH及相应的疾病状况的改进治疗。
所述目的通过本发明的主题来解决。
本发明提供了特异性识别人肿瘤坏死因子1(huTNFR1)的抗体的新医疗用途，该抗体用于治疗患有NASH和/或特别是与NASH相关的任何疾病状况的患者，其中包括肝脂肪变性、NAFLD疾病活性(NAS)、细胞凋亡、纤维化、高丙氨酸转氨酶(ALT)和胰岛素水平。因此，本发明为患有NASH及与其相关的疾病状况的患者提供了新的医疗治疗。
具体地，本发明提供了特异性识别huTNFR1的抗体，用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及与其相关疾病状况。
根据具体方面，抗体是分离的抗体。
根据具体方面，抗体是单克隆和/或重组抗体。
根据具体方面，抗体特异性识别膜(huTNFR1的CRD1的远端和/或CRD2的亚结构域A1)内的表位，优选特异性识别表现为在huTNFR1的N末端区域中的氨基酸1至115、或1至70的表位。具体地，huTNFR1的序列被鉴别为SEQ ID NO:32。
根据具体实施例，抗体是单特异性、二价全长抗体，或抗原结合抗体片段。
根据另一具体实施例，抗体是huTNFR1的单价结合物(binder)，仅包括一个抗原结合位点，该抗原结合位点具有结合huTNFR1的特异性。具体地，抗体单价识别huTNFR1。
根据具体实施例，抗体选自“单价抗体”组，该组由Fab分子、scFv分子、单可变结构域、二硫键稳定的Fv(dsFv)、半IgG1抗体和Fv结构域、或前述任一个的功能活性衍生物组成，优选地，其中抗体构建体偶联到亲水性聚合物(如PEG)和/或融合到多肽，例如人(或小鼠)血清白蛋白、转铁蛋白、白蛋白结合结构域或肽、Ig-结合结构域或肽、PEG模拟多肽延伸、抗体Fc片段、携带突变的抗体Fc片段，以允许优选的异源二聚化(相比同源二聚化)、或任意前述多肽的功能变体。
具体地，抗体是Fab、scFv、dsFv或Fv结构域中的任意，其融合到抗体Fc片段，其中Fc由CH2和CH3结构域的异二聚体组成，其中CH2和/或CH3结构域携带一个或多个允许比同源二聚化优先的异源二聚化点突变。具体地，修饰Fc中的一个或两个CH3结构域以改变氨基酸结构，例如获得含有CH3/CH3结构域的异源二聚体的Fc。
具体地，抗体构建体包括融合到抗体Fc区或片段的Fv结构域，具有或不具有其他抗体结构域，但仍保持抗体的单价结合结构。具体实例涉及融合到Fc或修饰的Fc的Fab部分或Fv部分。
优选的抗体包括重链和轻链，其中重链由VH结构域、CH2和CH3结构域组成，可选地还包括一个或多个连接体(linker)；并且轻链由VH结构域、CH2和CH3结构域组成，可选地还包括一个或多个连接体。
具体实施例包括人IgG1 Fc，其中CH2-CH3结构域通过一个或多个“隆突-入-穴(knobs-into-holes)”突变形成异源二聚体，例如，
“隆突”突变修饰CH3β-折叠的表面，该β-折叠存在于一个CH3结构域单体上，其为T366W；以及
“穴”突变修饰CH3β-折叠的表面，该β-折叠存在于另一个CH3结构域单体上，其选自由T366S、L368A、Y407V组成的组。
具体地，抗体包括Fc区，该Fc区包括一个或多个突变以下调效应子功能。根据具体方面，对Fc区进行糖工程化以下调效应子功能。
根据具体实施例，抗体构建体包括人或人工IgG1 Fc区，该Fc区是人IgG1 Fc的功能变体，具有60％、70％、80％、85％或90％序列同一性中的至少任一个，其经突变以下调效应子功能。优选地，Fc区包含重链，具有选自由E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S和P331S组成的组中的至少一个突变，优选地，包括A327G/A330S/P331S，(Kabat EU索引编号)。优选地，将六个突变中的至少两个所述突变，更优选地，至少三个、四个、五个或全部工程化到Fc序列中。SEQ ID NO:31鉴识人IgG1 Fc的序列。
具体地，抗体是PEG化的(PEGylated)、HES化的(HESylated)或PSA化的(PSAylated)。
具体地，用分子量范围在5,000至150,000g/mol之间的PEG将抗体聚乙二醇化(pegylated)，示例性抗体构建体，如Fab，用PEG 40,000聚乙二醇化。
具体地，抗体是半抗体IgG1，特征在于只有一个Fab部分、铰链区和一个Fc部分，其中铰链区和/或Fc部分(特别是人IgG1 Fc)包括一个或多个突变以避免重链二聚化(Gu etal.(2015)PLoS One 10(1):e0116419)，例如，选自以下组成的组：
-在铰链区的突变(SEQ ID NO:33)：C226S、C229S(EU编号)，以及
-在Fc部分的突变：P395A、F405R、Y407R、K409D(EU编号)。
具体地，抗体是Fv-Fc融合蛋白，其中Fv由VH/VL结构域对组成，并且其中VH通过第一铰链/连接体区融合到第一CH2-CH3结构域链，以及VL通过第二铰链/连接体区融合到第二CH2-CH3结构域链。优选地，第一和第二CH2-CH3结构域链在一个或多个点突变上彼此不同，例如，允许第一和第二CH2-CH3结构域链之间的优先异源二聚化，从而获得特征为Fc异二聚体的Fv-Fc制备物，例如，通过如上所述的“隆突-入穴”的突变。
具体地，抗体包括二硫键稳定的Fv(dsFv)，其特征在于一个或多个额外的(人工)域间二硫键。通过在适当的位置将一个或多个额外的半胱氨酸残基引入到VH或VL结构域中的任一者来获得这样的二硫键，该适当的位置可以用作二硫键桥接VH和VL结构域的的桥墩(bridge pier)，一旦还原(reducing)半胱氨酸即可获得的该二硫键。根据具体实例，可以将二硫键引入到VH中的任意以下位置的Fv中以及VL中的对应位置：VH中的44C和VL中的100C，VH中的108C和VL中的55C，VH中的106C和VL中的56C，或VH中的101C和VL中的46C。
具体地，抗体包括
a)重链可变结构域(VH)，该重链可变结构域包括互补决定区(CDR)：VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3；以及
b)轻链可变结构域(VL)，该轻链可变结构域包括CDR：VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，
其中
i)
VH-CDR1包括SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成；
VH-CDR2包括SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成
VH-CDR3包括SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3组成
VL-CDR1包括SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成
VL-CDR2包括SEQ ID NO:5或由SEQ ID NO:5组成
VL-CDR3包括SEQ ID NO:6或由SEQ ID NO:6组成；
或
ii)
VH-CDR1包括SEQ ID NO:23或由SEQ ID NO:23组成；
VH-CDR2包括SEQ ID NO:24或由SEQ ID NO:24组成
VH-CDR3包括SEQ ID NO:25或由SEQ ID NO:25组成
VL-CDR1包括SEQ ID NO:26或由SEQ ID NO:26组成
VL-CDR2包括SEQ ID NO:27或由SEQ ID NO:27组成
VL-CDR3包括SEQ ID NO:28或由SEQ ID NO:28组成；
其中根据Kabat EU索引进行编号；
或以上i)或ii)中任何一个的功能活性变体，其在每一个CDR序列中包括0、1或2(或至多1，即，0或1)个点突变，并且该功能活性变体特异性识别huTNFR1。
具体地，抗体包括VH和VL，
其中
VH-CDR1包括SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成；
VH-CDR2包括SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成；
VH-CDR3包括SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3组成；
VL-CDR1包括SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成；
VL-CDR2包括SEQ ID NO:5或由SEQ ID NO:5组成；以及
VL-CDR3包括SEQ ID NO:6或由SEQ ID NO:6组成；
其中根据Kabat EU索引进行编号；
或其功能活性变体在任何一个或多个、或每一个CDR序列中包含至多1(即，0或1)个点突变，并且该功能活性变体特异性识别huTNFR1。
具体地，VH和VL序列的特征在于VH-和VL-CDR序列，其中
i)
VH-CDR1包括SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成；
VH-CDR2包括SEQ ID NO:10或由SEQ ID NO:10组成，其中在位置5的X是S；
VH-CDR3包括SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3组成；
VL-CDR1包括SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成；
VL-CDR2包括SEQ ID NO:5或由SEQ ID NO:5组成；以及
VL-CDR3包括SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成，其中在位置3的X是G。
或ii)
VH-CDR1包括SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成；
VH-CDR2包括SEQ ID NO:10或由SEQ ID NO:10组成，其中在位置5的X是S；
VH-CDR3包括SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3组成；
VL-CDR1包括SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成；
VL-CDR2包括SEQ ID NO:5或由SEQ ID NO:5组成；以及
VL-CDR3包括SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成，其中在位置3的X是S。
具体地，抗体包括VH序列和VL序列或其功能活性变体，该VH序列包括SEQ ID NO:7或9或由SEQ ID NO:7或9组成；该VL序列包括SEQ ID NO:8或10或由SEQ ID NO:8或10组成，该功能活性变体在任何一个或多个、或每一个CDR序列中包含至多1个点突变，且在VH和VL的框架(FR)序列FR1-4的任何一个或多个、或每一个中具有至少60％的序列同一性。
包含能够特异性识别和结合huTNFR1的抗原结合位点的特定的VH/VL组合是以下任一个：
a)包括SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成的VH序列；以及包括SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的VL序列；或
b)包括SEQ ID NO:9或由SEQ ID NO:9组成的VL序列；以及包括SEQ ID NO:10或由SEQ ID NO:10组成的VL序列。
具体地，抗体是包括Fab或由Fab组成的全长或抗原结合抗体片段，其包括：
a)包括SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成的重链(HC)序列；以及
b)包括SEQ ID NO:12或由SEQ ID NO:12组成的轻链(LC)序列；
或其功能活性变体，该功能活性变体在分别包含在HC和LC中的VH和VL结构域的CDR序列的任何一个或多个、或每个中包括至多1个点突变，且在VH和VL结构域的FR序列FR1-4的任何一个或多个、或每一个中具有至少60％的序列同一性。
具体地，抗体包括：
a)包括SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成的HC序列；以及
b)包括SEQ ID NO:13或由SEQ ID NO:13组成的LC序列；
或其功能活性变体，该功能活性变体在分别包含在HC和LC中的VH和VL结构域的CDR序列的任何一个或多个、或每一个中包括至多1个点突变，且在VH和VL结构域的FR序列FR1-4的任何一个或多个、或每一个中具有至少60％的序列同一性。
抗体的特异性功能活性变体包括通过SEQ ID NO:18识别的HC和通过SEQ ID NO:13识别的LC，包括：
HC，该HC由以下组成：
a)包括SEQ ID NO:19或由SEQ ID NO:19组成的VH，或至少含在所述VH序列中的CDR序列；
b)连接体序列，该连接体序列由4-10个氨基酸，例如4、5、6、7、8、9或10个氨基酸组成，优选地由许多个甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸以任意组合组成，诸如，例如，由SEQ ID NO:15组成的连接体；
c)包括SEQ ID NO:16或由SEQ ID NO:16组成的CH2结构域；以及
d)包括SEQ ID NO:20或由SEQ ID NO:20组成的CH3结构域；
以及
LC，该LC由以下组成：
a)包括SEQ ID NO:14或由SEQ ID NO:14组成的VL，或至少包含在所述VH序列中的CDR序列；
b)连接体序列，该连接体序列由4-10个氨基酸，例如4、5、6、7、8、9或10个氨基酸组成，优选地由许多个甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸以任意组合组成，诸如，例如，由SEQ ID NO:15组成的连接体；
c)包括SEQ ID NO:16或由SEQ ID NO:16组成的CH2结构域；以及
d)包括SEQ ID NO:17或由SEQ ID NO:17组成的CH3结构域。
具体地，此类抗原结合抗体由一种或多种核酸分子编码，该核酸分子包含：
a)编码序列SEQ ID NO:22的HC；和
b)编码序列SEQ ID NO:21的LC；
或其功能活性变体，该功能活性变体在分别包含在HC和LC中的VH和VL结构域的CDR序列的任何一个或多个、或每一个中包括至多1个点突变，且在VH和VL结构域的FR序列FR1-4的任何一个或多个、每一个中具有至少60％的序列同一性。
根据具体实施例，抗体包括抗原结合位点，其特征在于以下六个CDR序列的组合，该抗体包括或由以下组成：
SEQ ID NO:23：VH-CDR1；
SEQ ID NO:24：VH-CDR2；
SEQ ID NO:25：VH-CDR3；
SEQ ID NO:26：VL-CDR1；
SEQ ID NO:27：VL-CDR2；和
SEQ ID NO:28：VL-CDR3；
或其功能活性变体，该功能活性变体在任何一个或多个、或每一个CDR序列中包括至多1个点突变，且其特异性识别huTNFR1。
具体地，抗体包括并入在VH和VL结构域中的抗原结合位点，其中
a)包括SEQ ID NO:29或由SEQ ID NO:29组成的VH；以及
b)包括SEQ ID NO:30或由SEQ ID NO:30组成的VL；
或其功能活性变体，该功能活性变体在VH和VL结构域的CDR序列的任何一个或多个、或每个中包括0、1或2(或至多1)个点突变，且在VH和VL结构域的FR序列FR1-4的任何一个或多个、或每一个中具有至少60％的序列同一性。
具体地，抗体包括VH和VL结构域，其中VH和VL结构域中的至少一个是亲本结构域的亲和力成熟的功能变体，其在互补决定区(CDR)序列中包括至少一个点突变，其中
a)亲本VH结构域的特征在于CDR序列：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；以及
b)亲本VL结构域的特征在于CDR序列：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。
具体地，所述至少一个点突变在SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:28的任一个中。
具体地，根据本发明，可以使用任何示例性抗体(其由本文提供的序列所表征的那些抗体)。同样，可以使用包括相同抗原结合位点和/或具有相同靶结合特异性的任何替代抗体。特别的替代抗体是那些为示例性抗体的功能变体，其中任何示例性抗体可以用作“亲本”来产生变体，其具有特异性识别huTNFR1靶的功能。
具体地，抗体是亲本抗体的亲和力成熟抗体，其特征在于本文提供的序列，特别是，其中CDR序列中的1、2、3、4、5或6个是功能活性CDR变体，相比于亲本抗体中的各自的CDR，该功能活性CDR变体包括至多1个点突变。
在具体的实施例中，功能活性变体抗体在每个CDR序列中仅包括0、1、2或3个点突变，优选在每个CDR序列中仅包括0、1或2个点突变，其中点突变是一个氨基酸的替换、插入或缺失中的任意。
本文所描述的抗体(亲本抗体)的任何功能活性变体的具体特征在于huTNFR1结合特异性。功能活性变体可以包括一个或多个突变FR序列，其包括一个或多个，例如，几个点突变，例如，至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个点突变，以获得相比于在亲本抗体中的各自的FR序列具有至少60％的序列同一性、或至少70％的序列同一性、或至少80％的序列同一性、或至少90％的序列同一性的变体序列。
具体地，抗体包括抗原结合部分，该抗原结合部分与huTNFR1结合的KD小于10-8M或5×10-9M，且koff小于10-3s-1。在用于确定单价结合的标准试验中，结合的亲和力以及结合特性(结合和分离)被具体确定，基本上不包括二价结合的结合力效应。标准试验是基于通过石英晶体微量天平(QCM)在生理温度(约37℃，或在37℃+/-1℃)下的测量。这样的亲和力测量特别以Fab格式执行。因此，如果抗体是Fab分子除外的任何其他抗体，则特别将抗原结合位点引入到各自的Fab分子中，用于在37℃下通过QCM进行亲和力测量。这确保了单价结合物的亲和力测量结果的可比性，而不管可能干扰亲和力测量的结合力效应。具体地，优选的QCM是中等受体密度下进行的。具体地，结合huTNFR1的抗体构建体的亲和力是，以Fab格式，通过QCM在37℃下确定Fab格式的抗体构建体与huTNFR1结合的亲和力，而中等受体密度在50-100Hz范围内(例如，在约50Hz、或在50Hz+/-10Hz、或在50Hz+/-5Hz)。
具体地，KD小于4×10-9M，或小于3×10-9M，或小于2×10-9M，或小于10-9M，或甚至小于10-10M。
具体地，且koff小于10-3，或小于5×10-4s-1，或小于10-4s-1，或小于10-5s-1。
具体地，抗原结合部分识别具有至少为10-5M-1s-1的kon的huTNFR1。
根据具体方面，疾病状况是肝脏脂肪变性、发炎的肝脏、肝纤维化(或凋亡)以及肝细胞癌中任意。具体地，治疗有发展任何疾病状况风险或已经患有任何疾病状况的NASH患者。NASH或相关疾病状况的几个指标包括NAFLD疾病活性(NAS)，以及高ALT和胰岛素血清水平，该指标可以通过本文所描述的治疗有效地降低。
具体地，患者还患有II型糖尿病、I型糖尿病、糖尿病前期、胰岛素抗性或肥胖，其中肥胖定义为患者体重指数≥30。
具体地，抗体以有效量施用于患者。具体地，所述量有效拮抗TNFa/huTNFR1信号传递。特别优选的是，抗体是拮抗抗体，从而避免基于细胞的分析中所测量的大量TNFa/TNFR介导的信号传递和信号转导。本文所描述的以及特征在于本文所提供的抗体序列的任何抗体特别理解为拮抗抗体。
根据具体方面，如在基于细胞的分析中确定的，抗体直接抑制TNF-huTNFR1受体相互作用，优选通过用于在Kym-1细胞中的TNFR1介导的细胞死亡抑制的检测，或通过用于抑制HeLa细胞或HT1080细胞释放IL-6或IL-8的检测。具体地，在Kym-1细胞中的TNFR1介导的细胞死亡抑制的检测中，IC50值小于5.0×10-9M。具体地，在抑制HeLa细胞释放IL-6的检测中，IC50值小于4.0×10-8M，或在抑制HT1080细胞释放IL-8的检测中，IC50值小于2.0×10-8M。
根据特定实施例，抗体用于通过单价相互作用与huTNFR1结合并减小显示出TNF-模拟激动性活性的风险。特别优选的是，具有TNFR1结合的高亲和力并有低解离速率(offrate)的抗体，其提供了TNFR1依赖性TNF反应的优秀抑制。
具体地，本文所描述的抗体提供在药物制剂中，该药物制剂包括抗体和药学上可接受的载体和/或赋形剂。由于抗体的拮抗特性，该药物制剂可以包括高抗体浓度，同时避免由激动性活性引起的副作用。
具体地，药物制剂配制成用于肠外使用，优选通过静脉或皮下给药。
具体地，本文描述的抗体具有低免疫原性，并且可以重复使用而不会形成抑制剂，例如抗药物抗体(ADA)。
出人意料的结果是，本文所描述的的抗体，特别是单价抗体，可以用于治疗正发生ADA的患者，例如，已经开发出针对免疫球蛋白的抗体或抗体免疫疗法。在现有技术中，这种ADA的存在将特别排除用针对TNFR1的抗体的进一步免疫疗法，因为ADA有可能在细胞表面上结合TNFR1时交联抗体，从而可能激动TNFR1信号传递。然而，本文所描述的抗体甚至在ADA存在时，也不会(或基本上不会)激动(agonise)TNFR1信号传递。
具体地，本文所描述的药物制剂可以施用于已经发生ADA的患者，例如，针对抗huTNFR1抗体或任何IgG结构的ADA。
具体地，对患有NASH的患者施用有效量的抗体，以降低以下任一项或多项：
a)肝组织中的脂肪变性、甘油三酯含量、炎症和/或细胞凋亡；
b)血清转氨酶水平；
c)胰岛素抗性以及可选地改善葡萄糖耐受性；和/或
d)NAFLD活性分数。
具体地，对患有NASH的患者给药剂量施用范围为0.05mg/kg至20mg/kg，优选0.2mg/kg至6mg/kg的抗体。在人类中有效的量可以从所描述的小鼠模型中的治疗有效量(20mg/kg)推断出。HED(人体当量剂量)是～1-2mg/kg。
优选抗体剂量是，例如，范围为0.5至1000mg，优选1-400mg。如果皮下给药，优选的剂量范围为0.5至400mg。
根据具体方面，抗体通过全身给药，以治疗有效量对患者给药，优选通过静脉输注或团注(bolus injection)。
根据具体实施例，定期用抗体对患者重复给药，例如，一周一次，静脉或皮下注射，在剂量为例如0.5-5mg/kg，特别是约2mg/kg。给药的药物频率和剂量可以适应于疾病状态和对治疗的反应。
具体地，抗体联合饮食治疗对患有NASH的患者给药。抗体治疗可以特别与抗炎药物诸如NSAP/NSAID或使用法尼醇X受体(farnesoid X receptor)(FXR)激动剂、胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂、或过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor)(PPAR)激动剂的疗法结合。
除非另有说明，否则本文中的位置根据Kabat的EU索引编号。Kabat编号方案的解释可以在Kabat，EA，等人，Sequences of proteins of immunological interest(NIH出版号91-3242,第5版(1991))中找到。
附图说明
图1：B6-huTNFR1-k/i-小鼠接受高脂饮食(HFD)32周，包括最后8周用抗TNFR1或对照抗体(Ab)治疗。相比来自用对照抗体治疗的小鼠的肝组织，用抗TNFR1-Ab处理的HFD小鼠的肝组织显示了在肝组织中，脂肪变性(A)、甘油三酯含量(B)和NAFLD活性评分(C)的显著降低。*p<0.05；**p<0.01；
图2：图1：B6-huTNFR1-k/i-小鼠接受高脂饮食(HFD)32周，包括最后8周用抗TNFR1或对照抗体(Ab)治疗。相比来自用对照抗体治疗的小鼠的肝组织(B)，通过天狼星红染色(Sirius Red staining)评估用抗TNFR1-Ab处理的HFD小鼠的肝组织(A)，显示了肝纤维化改善。*p<0.05；
图3：B6-huTNFR1-k/i-小鼠接受高脂饮食(HFD)32周，包括最后4周用抗TNFR1或对照抗体(Ab)治疗。与对照抗体相比，抗TNFR1抗体治疗导致肝组织中活化的胱天蛋白酶-3(caspase-3)显著降低。*p<0.05；
图4：B6-huTNFR1-k/i-小鼠接受高脂饮食(HFD)32周，包括最后8周用抗TNFR1或对照抗体(Ab)治疗。与对照抗体相比，抗TNFR1-Ab治疗导致ALT和胰岛素血清水平显著改善。*p<0.05；
图5：序列
SEQ ID NO:1：VH-CDR1
SEQ ID NO:2：VH-CDR2
SEQ ID NO:3：VH-CDR3
SEQ ID NO:4：VL-CDR1
SEQ ID NO:5：VL-CDR2
SEQ ID NO:6：VL-CDR3
SEQ ID NO:7：IgG13.7/Fab13.7的VH
SEQ ID NO:8：IgG13.7/Fab13.7的VL
SEQ ID NO:9：ATROSAB/IZI06.1的VH
SEQ ID NO 10：ATROSAB/IZI06.1的VL
SEQ ID NO:11：(Fab13.7重链[粗体＝VH])
SEQ ID NO 12：(Fab13.7轻链[粗体＝VL])
SEQ ID NO:13：VL1C(VL13.7-CH2-CH31；含有VL和CH1的链)；
SEQ ID NO:14：VL13.7
SEQ ID NO:15：连接体
SEQ ID NO:16：CH2
SEQ ID NO:17：CH31：CH31是散布在Ig恒定结构域，主要含有源自CH3的残基，也有来自CH1的残基；
SEQ ID NO:18：VHkC(VH13.7-CH2-CH3κ；含有VH和CLk的链)；
SEQ ID NO:19：VH13.7
SEQ ID NO:20：CH3k
SEQ ID NO:21：VL1C(VL13.7-CH2-CH31；含有VL和CH1的链)：
SEQ ID NO:22：VHkC(VH13.7-CH2-CH3κ；含有VH和CLk的链)：
SEQ ID NO:23：ATROSAB的VH-CDR1
SEQ ID NO:24：ATROSAB的VH-CDR2
SEQ ID NO:25：ATROSAB的VH-CDR3
SEQ ID NO:26：ATROSAB的VL-CDR1
SEQ ID NO:27：ATROSAB的VL-CDR2
SEQ ID NO:28：ATROSAB的VL-CDR3
SEQ ID NO:29：ATROSAB VH
SEQ ID NO:30：ATROSAB VL
SEQ ID NO:31：人IgG1 Fc
SEQ ID NO:32：huTNFR1序列；
SEQ ID NO:33：铰链区；
图6：Atrosimab(HC：SEQ ID NO:18，LC：SEQ ID NO:13)的生物化学表征。(a)Atrosimab的分子组分的代表性卡通(白色：源自Fc的恒定Ig结构域；亮灰色：VH以及源自CH1的序列；暗灰色：VL以及源自CLκ的序列)。Atrosimab的特征在于SEC(b)TSKgel SuperSWmAb HR，流速0.5ml/min，流动相Na2HPO4/NaH2PO4)和SDS-PAGE(c)在还原(R)或非还原(NR)条件下的NuPAGETM 4-12％Bis-TRIS Midi Gel)。M：标记。(d)通过动态光散射和得到的数据点的目视判读分析Atrosimab的热稳定性。通过ELISA中的对人TNFR1残留结合活性的检测分析孵育后Atrosimab在人血浆中的稳定性(e)。柱表示了三个单独实验的EC50值(平均数±SD)。一个样品在4℃下PBS中孵育，一个样品在人血浆中稀释后直接冷冻至-20℃作为对照；
图7：抗原与Fc受体和C1q补体蛋白结合并相互作用。通过ELISA分析Atrosimab对人类TNFR1-Fc的平衡结合((a)n＝3，平均数±SD)。Fab 13.7(含有相同的VH和VL)和ATROSAB(较低亲和力的二价版本)作为对照。(b)使用用于数据分析的1:1结合算法，通过QCM在五个浓度(128nM和4nM之间(1:2稀释步骤))，记录实时结合动力学，(c)通过ELISA分析固定化Atrosimab以及两个对照蛋白ATROSAB(沉默Fc)和利妥昔单抗(Rituximab)(野生型Fc部分)与人FcγRI、IIb和III以及补体蛋白C1q的相互作用(n＝2，平均数±SD)；
图8：Atrosimab的拮抗生物活性和激动性的缺失。Atrosimab在三种不同的体外实验中显示了激动活性的完全缺失：(a)由HeLa细胞释放的IL-6，(b)由HT1080细胞释放以及使用Kym 1细胞在细胞死亡诱导实验中的IL-8(c)。亲本Fab 13.7作为对照蛋白，显示了完全的激动特性以及二价IgG ATROSAB，在(a)和(b)中显示了轻微的激动作用。分析同一组蛋白对在HeLa、HT1080和Kym-1细胞的细胞表面的TNFR1抑制激活的潜力，该分析分别通过IL-6释放(d)、IL-8释放(e)以及细胞死亡诱导(f)来检测。用0.1nM TNF(d和e)或0.01nM TNF(f)活化TNFR1。所有的图表均代表三个单独实验的平均值，误差条表示SD；
图9：在抗人IgG抗体存在情况下缺乏Atrosimab激动。使用三种不同的鼠抗人IgG血清(a、b和c)在IL-8释放试验中，通过在药物特异抗体的常数浓度(大约15.8nM)下的Atrosimab，分析在HT1080细胞表面TNFR1的活化。鼠抗人IgG血清单独，未受刺激的细胞和TNF(33nM)作为对照。显示的是三个单独的实验的平均数±SD；
图10：Atrosimab的药代动力学分析。在C57BL/6J敲入小鼠中团注400μg蛋白后，测定小鼠血清中Atrosimab的循环浓度，其表达连接到鼠跨膜和胞内结构域的人TNFR1的胞外结构域而非完整的鼠蛋白。在ELISA中确定与人TNFR1-Fc结合的完整蛋白。该图显示了五只小鼠的平均值±SD。
具体实施方式
除非本文另有指示或与上下文明显矛盾，在描述本发明上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一(a)”和“一(an)”以及“所述(the)”和类似的引用理解为涵盖单数和复数。
除非另有说明，术语“包括(comprising)”“具有(having)”“包含(including)”和“含有(containing)”解释为开放式术语(即，意思是“包括，但不限于”)。为了本发明的目的，术语“由…组成(consisting of)”解释为是术语“包括(comprising of)”的优选实施例。如果在下文中，将组定义为包括至少一定数量的实施例，则这意味着还包括优选仅由这些实施例组成的组。
本文中的术语“抗体”理解为包括多肽或蛋白质，其由抗体结构域组成或包括抗体结构域，抗体结构域理解为免疫球蛋白的重链和/或轻链的恒定和/或可变结构域，其具有或不具有连接体序列。如果包括β-桶状结构，该结构由通过环序列连接的抗体结构域结构的至少两条β链(beta-strand)组成，则多肽理解为抗体结构域。抗体结构域可以是天然结构或通过诱变或衍生修饰的，例如，修饰抗原结合性能或任何其他性能，例如稳定或功能性能，例如结合Fc受体FcRn和/或Fcγ受体。
本文所使用的抗体包括至少一个抗原结合位点，其特异性识别huTNFR1或huTNFR1的表位。因此，抗体结合huTNFR1受体可以是单价地通过每个抗体中仅仅一个huTNFR1特异结合位点，或二价地通过两个huTNFR1特异结合位点。特别地，抗原结合位点是一个或两个抗体结构域。可以使用任何可变抗体结构域单独或组合，例如VH结构域单独，或VH和VL结构域的组合，构建抗原结合位点。具体地，抗原结合位点由CDR序列的组合形成。CDR序列的这种组合也被理解为CDR结合位点，例如，通过一个可变结构域的三个CDR序列形成的抗原结合口袋，如CDRH1、CDRH2和CDRH3的组合，或CDRL1、CDRL2和CDRL3的组合，或者两个可变结构域的六个CDR序列，如CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的组合。或者，可以采用从受体的天然配体衍生的抗原结合位点或人工构建体。本文所提及的CDR序列指定如下：
VH结构域的CDR：
VH-CDR1＝CDRH1
VH-CDR2＝CDRH2
VH-CDR3＝CDRH3
VL结构域的CDR：
VL-CDR1＝CDRL1
VL-CDR2＝CDRL2
VL-CDR3＝CDRL3
具体地，单个可变抗体结构域的CDR结合位点可以用作抗原结合位点，如可变结构域的重和轻链域的结合位点(如dAb、Fd、VL、Vκ、Vλ、VH、VHH)，或可变抗体结构域的结合位点对，例如VH/VL对。
因此，包含CDR结合位点的抗体可以包括单个可变抗体结构域或一对可变结合结构域，并且可选地，还包括具有相同或不同抗原结合特异性的其他可变结构域，例如，双特异性或多特异性抗体，其中只有一个抗原结合位点是针对huTNFR1，且至少一个另一个抗原结合位点是针对不同于huTNFR1的靶。可选地，抗体构建体还包括恒定抗体结构域，或具有或不具有连接序列或铰链区的可变和/或恒定抗体结构域的组合。
如本文所描述的可以使用的特异性抗体格式，例如，包括单个可变抗体结构域或由单个可变抗体结构域组成的抗体，例如VH、VL或VHH，或具有或不具有连接序列或铰链区的可变和/或恒定抗体结构域的组合，包括可变抗体结构域对，例如VL/VH对，包括VL/VH结构域对和恒定抗体结构域或由VL/VH结构域对和恒定抗体结构域组成的抗体，例如重链抗体、Fab、F(ab’)、(Fab)2、scFv、Fd、Fv，或全长抗体，例如，IgG类型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。术语“全长抗体”可用于指任何抗体分子，该抗体分子包括至少大部分Fc结构域和在自然存在抗体单体中常见的其他结构域。本文所使用的该短语用于强调特定的抗体分子，而不是抗体片段。
示例性单价、单特异性结合物是Fab、scFv、Fv、结构域抗体、IgG半抗体或单价IgG，例如单臂IgG，该单臂IgG由完整的轻链、一条完整的重链和缺少Fd(Fd＝VH-CH1)的额外Fc链组成，其可以根据隆突-入-穴技术(或其他非对称Fc部分)产生，从而避免Fc结构域的同源二聚化。
示例性二价或多价结合物是任何免疫球蛋白类型的全长抗体，或任何全长抗体的抗原结合抗体片段，其包括例如任何一个或多个Fab、F(ab’)、(Fab)2、scFv、或Fv中的至少两个抗原结合位点。
本文所使用的术语“Fv”理解为可变结构域的区域，其包括CDR结合位点，例如，VH、VL或VH/VL。因此，术语“Fv”，特别适用于VH、VL或VH/VL，其是通过两个可变结构域的β-折叠结构之间的相互作用的VL结构域关联的VH结构域，具有或不具有连接体。
本文所使用的术语“抗体”应具体包括抗体制剂中的分离形式的抗体，该抗体基本上不含针对不同靶抗原的其他抗体或包括抗体结构域的不同结构排列。尽管如此，分离的抗体可以包括在组合制剂中，该组合制剂含有分离的抗体的组合，例如，具有至少一种其它抗体，例如单克隆抗体或有不同特异性的抗体片段。
术语“抗体”应适用于动物来源的抗体，包括人类物种，如哺乳类，如人或小鼠，或禽类，如母鸡，该术语应特别包括基于动物来源的序列的重组抗体，例如，人序列，如在人抗体中的。人抗体通常包括衍生自人生殖免疫球蛋白序列的可变结构域和恒定区。优选使用如本文描述的人抗体，其可以包括不由人生殖免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性突变或体内体细胞突变引入的突变)，例如，在CDR中。人抗体包括从人免疫球蛋白文库或用于一种或多种人免疫球蛋白的动物转基因中分离的抗体。
然而，术语“抗体”进一步适用于有不同物种来源的序列的嵌合抗体，如小鼠和人源的序列，或人源化抗体，其含有人类来源的氨基酸序列和非人类来源(例如啮齿动物源)的氨基酸序列。
术语“抗体”特别适用于任何类别或亚类的抗体。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体指定为主要类别的抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的几个可以进一步划分进亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
所述术语还适用于单克隆或多克隆抗体，特别是重组抗体，该术语包括通过重组手段制备、表达、创造或分离的所有抗体和抗体结构，如源自动物的抗体，例如，包括人的哺乳动物，包括来自不同来源的基因或序列，例如鼠、嵌合、人源化抗体，或杂交瘤衍生抗体。进一步的实例涉及从转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，或从抗体或抗体结构域的重组、组合文文库分离的抗体，或通过任何其他手段制备、表达、创造或分离的抗体，所述其他手段包括抗体基因序列剪接给其他DNA序列。
抗体结构域可以是天然结构或通过诱变或衍生修饰的，例如，修改抗原结合性能或任何其他性能，例如稳定或功能性能，例如结合Fc受体FcRn和/或Fcγ受体(FCGR)。
具体实例指的是非自然存在的抗体，其是，经工程化以通过至少一个抗原结合位点来特异性识别靶huTNFR1的人工构建体，该抗原结合位点包括一个或多个人工CDR序列，或者经工程化以产生非自然存在抗体构建体，该抗体构建体具有不同于任何自然存在的免疫球蛋白结构的结构。
如本文所进一步描述的抗体的具体实例是非自然存在的，例如，如提供的有另一抗体或活性药物的组合制剂，该组合不是自然存在的。具体的进一步实例涉及自然存在的抗体的人工衍生物或变体，或自然存在的抗体的优化或亲和力成熟的变体，或具有框架-区域的抗体，该框架-区域经工程化以提高抗体稳定性。通过这种优化或工程化，抗体包括一个或多个合成结构或序列或特性，所述合成结构或序列或特性将不会在自然中的抗体情况中被发现。
可以理解的是，本文所使用的术语“抗体”应还涉及抗体的衍生物，特别是，功能活性衍生物，本文还涉及抗体的功能变体。
，特别地，通过融合或共价化学修饰产生的功能活性衍生物，融合或共价化学修饰不会改变抗体本身的一级氨基酸序列。衍生物可以，例如，具有期望的性质，包括，例如延长循环半衰期、增加稳定性、降低清除率或改变免疫原性。特异性抗体衍生物理解为一个或多个抗体结构域或抗体和/或融合蛋白的任意组合，其中抗体的任何结构域可以融合在一个或多个其他蛋白的任何位置，如其他抗体，例如，包括CDR环、受体多肽，以及配体、支架蛋白、酶、毒素等的结合结构。抗体的衍生物可以通过各种化学技术(如共价偶联、静电相互作用、二硫键等)与其他物质关联或或结合获得。与抗体结合的其他物质可以是脂质、碳水化合物、核酸、有机和无机分子或他们的任意组合(例如，PEG、前体药物或药物)。在具体实施例中，抗体是包括药物的衍生物，例如获得的抗体-药物结合物。
术语衍生物还包括抗体的片段、变体、类似物或同系物，例如，具有特定糖基化模式的抗体，例如，通过糖工程化产生的，该衍生物是功能性的并可以用作功能性变体，例如结合特定的靶。
关于抗体序列的术语“糖工程化”，应指的是由于糖工程化而具有修饰的免疫原性、ADCC和/或CDC的糖基化变异体。所有抗体在重链恒定区中保守位置都含有碳水化合物结构，每种同种类有不同系列的N-连接的碳水化合物结构，其容易影响蛋白质组装、分泌或功能活性。IgG1型抗体是糖蛋白，其在每个CH2结构域中的Asn297处具有保守的N连接糖基化位点。连接在Asn297的两个复杂的双触角寡糖被埋在CH2结构域之间，与多肽骨架形成广泛的接触，且它们的存在对于抗体介导效应子功能(mediate effector functions)(如抗体依赖性细胞毒性(ADCC))是必需的。在N297处的N-聚糖的去除，例如，通过突变N297为例如A或T299，通常会得到具有降低的ADCC的糖基化抗体。
在抗体糖基化中的主要差异发生在细胞系之间，并甚至对于在不同培养条件下生长的给定细胞系之间可以看到微小的差异。在细菌细胞中的表达通常提供非糖基化(aglycosylated)抗体。
抗体可以缺少活性Fc部分，因此，要么由不具有FCGR结合位点的抗体结构域组成，具体包括缺少CH2和CH3结构域的链的任何抗体，要么由缺失Fc效应子功能的抗体结构域组成，例如，通过修饰以降低Fc效应子功能，特别是消除或降低ADCC和/或CDC活性。这种修饰可以通过突变来实现，例如，在FCGR结合位点的突变，或者用抗体的ADCC和/或CDC活性通过衍生物或药物来干扰，从而实现Fc效应子功能的降低或Fc效应子功能的缺失，其通常理解为如通过ADCC和/或CDC活性测量，小于10％未修饰(野生型)抗体的Fc效应子功能，优选小于5％。
示例性抗体可以包括Fc片段或至少Fc片段的一部分，例如维持与FcRN的结合位点，以此获得具有体内实质半衰期的抗体。
然而，可以修饰Fc以获得可能的ADCC和/或CDC活性降低，例如，通过IgG1到IgG2亚型的切换或通过修改以减少结合Fc受体，例如，在人IgG1 Fc中通过E233P和/或L234V和/或L235A和/或D265G和/或A327Q和/或A330A和/或G236，缺失和/或A327G和/或A330S，其中编号是根据Kabat(EU-索引)。
进一步的实例涉及修饰以降低免疫原性，例如通过K.O.糖基化位点，如N297Q，其提供与凝集素受体的受损结合。
可以理解的是，术语“抗体”还指的是抗体的变体，包括具有亲本CDR序列的功能活性CDR变体的抗体和亲本抗体的功能活性变体抗体。例如，特征为本文中所提供的CDR结合序列和/或重链和轻链序列的那些抗体的功能变体，可以经工程化并用作本文所进一步描述的。
具体地，可以通过工程化亲本抗体的至少一个抗体序列来产生亲本抗体的抗体变体，例如本文所提供的任何示例性抗体，其中抗体变体包括重链可变结构域的至少3个CDR，并可选地还包括轻链可变结构域的至少3个CDR，其在至少一个CDR或FR区中具有至少一个点突变，或在重链(HC)或轻链(LC)的恒定区中仍具有功能活性，如通过特异性结合至靶huTNFR1测定的。
具体地，抗体变体是突变抗体或抗体片段，例如，通过突变方法获得，特别是，通过删除、交换、引入插入物到特定抗体氨基酸序列或区域中或化学衍生氨基酸序列。例如，在恒定结构域中来工程化抗体稳定性、效应子功能或半衰期，或在可变结构域中来改善抗原结合特性，例如，通过本领域中可用的亲和力成熟技术。可以采用任何已知的诱变方法，包括在期望位置的点突变，例如通过随机化技术获得。在某些情况下，位置是随机选择的，例如，用任何可能的氨基酸或优选选择的氨基酸来随机化抗体序列。术语“诱变”指的是用于改变多核苷酸或多肽序列的任何公认的技术。诱变的优选类型包括错配PCR诱变、饱和诱变或其他定点诱变。
点突变特别理解为多核苷酸的工程化，其导致了氨基酸序列的表达，该氨基酸序列的表达与未经工程化的氨基酸序列在不同氨基酸的一个或多个单一(非连续的)或双重氨基酸的取代或交换、删除或插入不同。
具体地，通过亲本抗体或亲本抗体序列的修饰来产生功能活性变体抗体，该修饰为一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代，或下列中的一个或多个氨基酸残基的化学衍生：氨基酸序列，或核苷酸序列内的核苷酸，或序列远端的一者或两者，例如，在CDR序列中，N端和/或C端的1、2、3或4个氨基酸，和/或中心的1、2、3或4个氨基酸(即，在CDR序列的中间)，并且该修饰不影响，特别是不损害该序列的活性。在结合位点对选定的靶抗原具有特异性的情况下，抗体的功能活性变体仍将具有预定的结合特异性，或基本上相同的生物活性，尽管这可以被改变，例如，改变对特异性表位的精细特异性(fine specificity)、亲和力、结合力、Kon或Koff率等。例如，亲和力成熟抗体特别理解为功能活性变体抗体。因此，在亲和力成熟抗体中的经修饰的CDR序列理解为功能活性CDR变体。
亲和力成熟是通过产生与靶抗原增强的亲和力的抗体的过程。根据本文所公开的的本发明的各种实施例，可以采用本领域中可用的制备和/或使用亲和力成熟文库的任何一种或多种方法产生亲和力成熟抗体。示例性的这种亲和力成熟方法和用途，例如随机诱变、细菌突变菌株传代、定点诱变、突变热点靶向、简约诱变(parsimonious mutagenesis)、抗体改组、轻链改组、重链改组、CDR1和/或CDR1诱变，以及产生或使用用于实现根据本文所公开的的本发明的各种实施例的方法和用途的亲和力成熟文库的方法，包括，例如在Wark&Hudson,2006,Advanced Drug Delivery Reviews 58:657-670中公开的那些。
抗体的结构改变，包括氨基酸诱变或为在免疫球蛋白基因片段中体细胞突变的结果，产生抗原的结合位点的变体并选择更强的亲和力。亲和力成熟的抗体可表现出比亲本抗体强几个log倍的亲和力。单一亲本抗体可进行亲和力成熟。或者，与靶抗原具有相似结合亲和力的抗体池可以被认为是亲本结构，其经改变以获得亲和力成熟的单个抗体或这种抗体的亲和力成熟池。
本文所描述的抗体的优选亲和力成熟变体在结合亲和力中表现出至少2倍增加，优选至少5倍，优选至少10倍，优选至少50倍，或优选至少100倍增加。亲和力成熟可以采用在选择活性中采用各自的亲本分子文库，或具有中等结合亲和力的抗体以获得本文所描述的抗体。或者，亲和力甚至可以更大程度地增加，其通过本文所描述的抗体的亲和成熟，以获得对应于小于10-10M，或甚至小于10-11M的KD的高值。
在某些实施例中，结合亲和力是通过亲和ELISA试验来确定。在某些实施例中，结合亲和力通过BIAcore、ForteBio或MSD试验来确定。在某些实施例中，结合亲和力通过动力学方法来确定。在某些实施例中，结合亲和力通过平衡/溶液方法来确定。在某些实施例中，结合亲和力通过标准石英晶体微量天平(QCM)测量来确定，特别是，在与生理条件相似的预定条件下(约37℃，密度约50Hz)。
本文所描述的抗体的特异性功能是作为TNF-huTNFR1相互作用的抑制剂(也称为拮抗剂)的功能。如本文中所理解的，术语“抑制剂”是具有以下能力的物质：
a)在体外和/或体内调节(例如，减少或消除)TNFR1信号传递，和/或
b)在体外和/或体内抑制TNFR1介导的细胞死亡，和/或
c)在体外和/或体内抑制TNF介导的细胞刺激，以释放炎性细胞因子，
d)通过不同的机制抑制TNFR1信号传递。
特别地，本文所使用的抗体干扰一个或多个分子TNF与细胞表面上的一个或多个TNFR1分子的结合。对于治疗应用，不受理论的束缚，TNF-huTNFR1相互作用抑制剂可以抑制在TNF存在情况下的huTNFR1信号传递，或在TNF存在情况下的huTNFR1介导的细胞死亡，或在TNF存在情况下的释放炎性细胞因子的细胞刺激。
如本文所使用的，术语“信号传递”和“信号转导”表示生物化学过程，该生物化学过程涉及通过细胞表面受体，经由一系列特定的、连续的分子将细胞外刺激传递到细胞核内的基因导致细胞对刺激产生特定的反应。
如体外在基于细胞的试验中或体内以剂量依赖的方式测量的，huTNFR1相互作用的抑制可以导致TNFR1信号传递或信号转导效果的下调。如在体外基于细胞的试验中所确定的，本文所描述的抗体的功能活性的具体特征在于抑制功能，其抑制体内TNF-huTNFR1相互作用或LTα-huTNFR1相互作用。可以采用进一步的试验来排除交联TNFR1受体相关的实质性副作用，该交联TNFR1受体将激动TNF-TNFR1相互作用。合适的检测方法测定分别用于产生炎性细胞因子IL-6或IL-8的刺激活性缺失的在HeLa或HT1080上的抗体或变体。下面的实例部分描述了示例性测试。
抑制通常会导致huTNFR1相互作用或活性的效果降低至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或最大水平。用于产生或表征本文所描述的抗体的方法在本领域中是公知的。在优选实施例中，采用一种或多种表达huTNFR1的细胞的基于细胞试验或体内试验来产生抗体变体并筛选预定义的特性。对于这样的试验，通常外源性地添加抗体，使得细胞可以被结合，例如，在TNF存在和缺失的情况下，确定拮抗和激活活性。这些试验通常基于免疫球蛋白的功能；即是，抗体结合huTNFR1并介导某些生化事件的能力，例如，TNF结合所述细胞的阻断，例如，在竞争结合试验中，TNF/受体结合抑制、TNF存在或缺失情况下细胞因子的表达减少，特别是炎性白细胞介素，例如IL-6或IL-8，细胞凋亡等等。
本文所描述的抗体，优选地，仅具有TNF拮抗活性(特别是，没有可检测到的激动活性)，从而，减少因循环中增加的TNF水平引起的炎症反应，其可以导致不期望的炎症反应、细胞凋亡以及坏死或器官衰竭。如在半最大饱和浓度(half-maximal saturationconcentration)下使用TNF或LTα的基于细胞试验中测量的，优选分别在0.01-0.1nM TNF和LTα的范围内，优选抗体具有相应IC50小于100nM、优选小于20nM、更优选小于10nM、最优选个位数纳摩尔范围内或更小的拮抗活性。
然而，在不使用TNF的情况下，在相同的基于细胞的试验中，潜在的TNF模拟激动活性仍可以被测量到。如果在TNF缺失的情况下HeLa或HT1080的孵育导致细胞因子无诱导或仅轻微诱导，例如在抗体至少5nM或约10nM的浓度时升高IL-6或IL-8水平，则本文所描述的优选抗体没有显著的激动活性。优选地，没有或仅有微量或阴性细胞因子产生，其可以通过小于10pg/105个细胞的量来确定。在优选实例中，在18h内，细胞因子表达和释放小于2.5pg/100,000个细胞。因此，优选地，激动活性在基础水平之下，或小于同等TNF浓度反应的2％，优选地，小于等量或最大TNF反应的1％。
关于本文所描述的抗体序列“百分比(％)氨基酸序列同一性”，定义为在比对序列和引入间隙后(如果需要的话)，候选序列中与特定多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，以实现最大百分比序列同一性，且不考虑任何作为序列同一性的一部分的保守替换。本领域技术人员可以确定用于测定比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
本文所使用的术语“抗原”与术语“靶”或“靶抗原”可互换，应指的是由抗体结合位点识别的整个靶分子或这种分子的片段。具体地，抗原的亚结构，例如多肽或碳水化合物结构，通常指的是“表位”，例如免疫相关的B细胞表位或T细胞表位，可以通过这种结合位点识别。huTNFR1抗原是包括受体结构的抗原，在大多数人细胞表面，其能够以单体的或多聚体的细胞因子受体的形式特异性结合三聚体TNF或LTα。
本文所使用的术语“huTNFR1”应指的是TNF的CD120a TNFR1受体(p55/60，TNFRSF1A肿瘤坏死因子受体超家族，成员1A[智人(Homo sapiens)(人)]，基因ID：7132)，其在大多数人细胞上普遍表达。HuTNFR1的具体示例性序列提供为SEQ ID NO:32。
本文所使用的术语“表位”应特别指的是分子结构，其可以完全构成特异性结合配偶体或作为抗体结合位点的特异性结合配偶体的一部分。表位可以由碳水化合物、肽结构、脂肪酸、有机、生化或无机物质或其衍生物以及他们的任意组合组成。如果表位包含在肽结构中，例如肽、多肽或蛋白质，它通常将包括至少3个氨基酸，优选为5至40个氨基酸，更优选在约10-20个之间的氨基酸。表位可以是线性或构象表位。线性表位由多肽或碳水化合物链的一级序列的单个片段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。
构象表位由氨基酸或碳水化合物组成，氨基酸或碳水化合物一起通过折叠多肽形成三级结构，且氨基酸在线性序列中不一定彼此相邻。具体地，对于多肽抗原，构象或不连续表位的特征在于存在两个或更多的离散氨基酸残基，在一级序列中分开，但当多肽折叠成天然蛋白/抗原时，其在分子表面组装成一致的结构。
本文中的语“表位”应具体指的是huTNFR1中包含的表位，其是并入到膜(huTNFR1的远端CRD1和CDR2亚结构域A1)中的表位。
本文所使用的关于核酸、抗体或其他化合物的术语“分离的(isolated)”或“分离(isolation)”应指的是这样的化合物，该化合物已从与其天然相关的环境中充分分离，从而以“基本上纯的”形式存在。“分离的”不一定指将人造或合成的混合物排除于其他化合物或材料，或者存在不干扰基本活性的杂质，且该杂质可能例如由于不完全的纯化而存在。
关于多肽或蛋白质，如本文所描述的分离的抗体，术语“分离的”应具体指不含或基本上不含与化合物天然相关的材料的化合物，例如在化合物的自然环境中或在制备(例如，细胞培养)它们的环境中发现的其它化合物，当这样的制备是通过在体外或体内实践重组DNA技术时。分离的化合物可以用稀释剂或佐剂配制，并实际上仍可分离出来，例如，当用于诊断或治疗时，多肽或多核苷酸可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合。
本文所使用的术语“重组”应指“通过基因工程制备或是基因工程的结果”。重组宿主具体包括表达载体或克隆载体，或其已经过基因工程化为含有重组核酸序列，特别是，采用与宿主无关的核苷酸序列。重组蛋白是通过在宿主中表达各自的重组核酸来产生的。
本文所进一步描述的抗体可以是重组抗体。为此，本文所使用的术语“重组抗体”包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的抗体，例如(a)从动物(例如，小鼠)中分离的抗体，其对于人类免疫球蛋白基因或其制备的杂交瘤是转基因或跨染色体的，(b)从转化为表达抗体的宿主细胞中分离的抗体(例如，从转染瘤中)，(c)从重组的、组合的人抗体文库或抗体抗原结合序列的文库中分离的抗体，以及(d)通过任何其他手段制备、表达、创建或分离的抗体，其他手段包括人类免疫球蛋白基因序列剪接给其他DNA序列。这种重组抗体包括，工程化为包括发生重排和突变的抗体，例如，在抗体成熟期间。根据本发明，其在本领域的技术内可以采用常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中有详细的解释。参见，例如，Maniatis,Fritsch&Sambrook,"Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,(1982)。
优选地，本文所描述的抗体是作为通过使用宿主细胞重组表达系统产生的重组蛋白而产生，例如，通过在大肠杆菌(E.coli)的周质空间中表达，或通过在真核表达系统(如酵母或哺乳动物)中作为分泌蛋白表达，例如，通过CHO、HEK或人产物宿主细胞系。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞最常用于抗体产生。除了提供合适的糖基化模式外，这些细胞还允许一致地产生稳定遗传、高产出克隆细胞系。它们可以在使用无血清培养基的简单生物反应器中培养到高密度，并使安全开发和可再生生物过程成为可能。
最优选地，宿主细胞是在无血清条件下建立、适应和完全培养，以及可选地在不含任何动物来源的蛋白质/肽的培养基中培养。
本文所使用的“特异性”结合、识别或靶向，指结合物(例如，抗体或抗体的抗原结合位点)在各种分子群体中对靶抗原或各自的表位表现出明显的亲和力。因此，在指定的条件下(例如，免疫分析)，结合物特异性结合靶抗原，且不以显著的量结合样品中存在的其他分子。特异性结合指在所选的靶识别、高、中或低结合亲和力或结合力方面，结合是选择性的。与另一个靶标相比，如果结合常数或结合动力学至少为10倍差异(理解为至少1个log差异)，优选地，差异至少为100倍(理解为至少2个log差异)，以及更优选地，至少1000倍(理解为至少3个log差异)，则通常实现选择性结合。差异结合可以通过免疫分析来确定，优选免疫印迹、ELISA或其他免疫学方法。特定靶点的抗体分子的特异性可以通过竞争试验来确定，例如，在Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988中所描述的。选择性结合可以通过本领域中已知的重组抗体优化方法来工程化或改进。例如，本文所描述的免疫球蛋白链的可变结构域的某些区域可以受到一个或多个优化策略，包括轻链改组、目的地(destinational)诱变、CDR融合和所选CDR和/或框架区域的定向诱变。
术语“具有相同的特异性”、“具有相同的结合位点”或“结合相同的表位”的使用表示等量的单克隆抗体表现出相同或基本上相同即相似的免疫反应(结合)特征，并竞争结合到预先选择的靶结合序列。抗体分子对特定靶点的相对特异性可以通过竞争试验来相对确定，例如，如在Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)中所描述的。
本文的竞争指如通过竞争ELISA分析或通过ForteBio分析所确定的比约30％更大的相对抑制。可能需要将较高的相对抑制阈值设置为在特定环境下适当竞争水平的标准。例如，其中竞争分析是用来选择或筛选具有与抗原结合的预期功能的新抗体。因此，例如，在认为抗体有足够的竞争性之前，可以设置竞争结合的标准，其中，检测到至少40％的相对抑制，或至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至至少100％。
本文所使用的术语“患者”应指的是人和其他哺乳动物受试者。特别是，本文所描述的医疗用途或相应的治疗方法适用于需要预防或治疗NASH与NASH相关的疾病状况的的受试者。受试者可以是有NASH风险或患有NASH的患者，包括早期或晚期疾病。术语“患者”具体包括接受预防性和/或治疗性治疗的受试者。因此，术语“治疗”意味着包括预防性和治疗性治疗两者。
具体地，术语“疗法”指的是旨在包括给药以治愈疾病或减轻疾病症状的治疗措施。
具体地，术语“预防”指的是旨在降低疾病发生风险或疾病复发的预防措施。
本文所使用的术语“治疗有效量”，可与化合物的任何术语“有效量”或“足够量”互换，例如，本文所描述的抗体是当给药给受试者时足以产生有益或期望的结果(包括临床结果)的量或活性，并且因此，其有效量或其同义词取决于其应用的上下文。
有效量是指足以治疗、预防或抑制此类疾病或紊乱的化合物的量。在疾病的情况下，本文所描述的治疗有效量的抗体特别用于治疗、调节、减弱、逆转或影响受益于抑制TNF-TNFR1相互作用的疾病或状况。
对应于这样的有效量的化合物的量将根据各种因素而变化，例如给定的药物或化合物、药物配方、给药途径、疾病或紊乱的类型、正在治疗的受试者或宿主的身份，等等，但是仍然可以通过本领域的技术人员常规地确定。
如本文所进一步描述的，治疗患者的方法包括向有其需要的患者施用治疗有效量的上述定义的huTNFR1抗体的步骤。治疗有效量通常在0.5-500mg范围内，优选1-400mg，甚至更优选至多300mg、至多200mg、至多100mg或至多10mg，尽管表明可以是更高的剂量，例如，用于治疗肥胖患者或急性疾病状况。
本文所描述的优选药物组合物包括治疗有效量的huTNFR1抗体和任选的一种或多种额外的组分，该组分选自由药学上可接受的载体、药学上可接受的盐、助剂、稳定剂、稀释剂和溶剂或其任意组合组成的组。
在一个实施例中，本文所描述的抗体是施用于患者的唯一治疗活性剂，或者，本文所描述的抗体与一种或多种其他治疗剂组合施用，包括但不限于，TNF拮抗剂、消炎剂、细胞因子、生长因子或其他治疗剂。TNFR1拮抗抗体可以与一个或多个其他治疗方案(优选地，与抗TNF疗法，例如抗TNF抗体)同时或连续施用。本文所描述抗体优选作为一线治疗施用于患者，或在抗TNF治疗无效的情况下作为二线疗法，无论是作为急性或慢性治疗。特别优选的医疗用途是治疗慢性病。
此外，具有本文所描述的治疗有效量的抗体的受试者的治疗或预防方案可以由单次给药组成，或可替换地包括一系列应用。例如，抗体可以每年至少施用一次、每半年至少一次或每月至少一次。然而，在另一个实施例中，对于给定的治疗，抗体可以从大约每周施用一次到大约每天施用一次。治疗期的长短取决于多种因素，如疾病的严重程度、急性或慢性疾病、患者的年龄、抗体形式的浓度和活性。还应意识到，用于治疗或预防的有效剂量可以在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。剂量的改变可以通过本领域中已知的标准诊断检试验产生并变得显而易见。在某些情况下，可能需要长期施用。
“非酒精性脂肪性肝炎(NASH)”是一种肝脏疾病，与酒精消费无关，其特征在于肝细胞的脂肪改变，伴有小叶内炎症和纤维化。NASH是一种常见的，通常“沉默的”肝病。它类似于酒精性肝病，但发生在很少饮酒或不饮酒的人身上。NASH有三个主要特征，将其与代谢来源的其他肝病区分开来：肝脏中异常的脂肪堆积或沉积(肝脏脂肪变性)、肝脏炎症，以及肝损伤或肝组织损伤(纤维化)。
NASH是一种潜在的严重状况，具有发展为末期肝病、肝硬化和肝细胞癌的巨大风险。一些发展为肝硬化的患者有肝功能衰竭的风险，并可能最终需要肝移植。NAFLD可以通过NAFLD活性评分(NAS)(脂肪变性(0至3)、小叶炎症(0至2)和肝细胞肿胀(0至2)的肝活检组织病理学评分之和)区分于NASH。NAS<3对应于NAFLD，3-4对应于NASH临界，以及>5对应于NASH。活检也用于对纤维化评分(0至4)。
如本文所使用的，患有NASH的患者是具有NASH的患者，或已被诊断有NASH的患者，或具有患NASH的遗传倾向的患者，或由于他或她患有代谢综合征、肥胖、糖尿病或糖尿病前期而可能易患NASH的人。在另一些实施例中，患有NASH的患者是已经被测试并发现显示出NASH(肝脏中脂肪异常堆积、肝脏炎症和肝纤维化)临床表现特征的患者，即使他或她可能还没有表现出任何NASH的身体症状。在某些情况下，患有NASH的患者即使还没有做出诊断，也会表现出NASH的症状。
NASH的治疗可导致减缓或阻止NASH向肝硬化的进展。一些治疗方案旨在延迟与NASH相关的一个身体症状或一组身体症状或临床表征或表现的发作。在一些实施例中，治疗导致了至少一种可测量的NASH身体症状的改善，如体重减轻、虚弱或疲劳。在其他实施例中，治疗导致了至少一种NASH的临床参数或表现的改善，例如异常的肝脂肪堆积、通过活检确定的肝纤维化、肝脏炎症、肝酶异常水平(例如ALT)、炎症细胞因子或NAS评分的异常水平。在其他实施例中，治疗导致NASH的进展降低、抑制或减缓，或者物理性地通过例如稳定可测量的症状或症状组(例如疲劳、体重减轻或虚弱)；或临床/生理学上地通过例如稳定以下可测量的参数：例如肝脏中的异常脂肪堆积、肝酶异常水平、肝炎性标志物异常水平、肝活检中的异常表现、NAS评分，或两者兼具。在另一实施例中，治疗还可以在疾病或病症完全显现之前得以避免NASH的起因和/或效果或临床表现，或因NASH而引起的症状之一。在一些实施例中，治疗导致了NASH患者的存活率或生存时间的增加。在一些实施例中，治疗导致NASH患者需要肝移植的可能性降低。在其他实施例中，治疗消除了NASH患者进行肝移植的需要。在其他实施例中，它导致了NASH患者发展为肝硬化的几率降低。在其他实施例中，如组织学所确定的，它预防进展为肝硬化。
本文所描述的具体实施例指的是“单克隆”抗体(mAb)。单克隆抗体是通过将抗体基因克隆到单克隆宿主细胞或相应的细胞系中而产生的。单克隆抗体可以通过培养中的细胞系产生抗体分子的任何方法来产生，例如，培养重组真核(哺乳动物或昆虫)或原核(细菌)宿主细胞。用于制备单克隆抗体的合适方法的实例包括
Figure BDA0002595084790000251
&Milstein的杂交瘤方法(1975，Nature 256:495-497)和人B细胞杂交瘤方法(Kozbor，1984，J.Immunol.133：3001；和Brodeur et al.,1987,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,(Marcel Dekker,Inc.,New York),pp.51-63)。
本文所描述的抗体可以采用杂交瘤方法鉴定或获得。在这种方法中，小鼠或其他合适的宿主动物，如仓鼠，经免疫以诱导产生或能够产生抗体的淋巴细胞，该抗体将特异性结合用于免疫的蛋白。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
对杂交瘤细胞生长的培养基进行检测，以产生针对抗原的单克隆抗体。优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合分析(如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA))来确定。
然后，可以从杂交瘤上清液中纯化单克隆抗体以进一步测试其与目标抗原的特异性结合，并工程化抗体，例如，用于不同的诊断或治疗目的。
在某些情况下，huTNFR1特异性抗体通过对huTNFR1的筛选而出现。为了增加分离差异结合克隆的可能性，将通过不断筛选针对不同的抗原或表位来施加多重选择压力。
可以通过使用显示抗体序列或其抗原结合序列的文库展示技术(例如，使用噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞；或体外展示系统将核酸信息翻译成相应的(多)肽)，来完成用于识别所期望的选择性结合特性抗体的筛选方法。反应性可以基于ELISA、蛋白免疫印迹法(Western blotting)或流式细胞术表面染色来评估，例如，使用标准试验。
分离的抗原可以例如用于从抗体文库(例如(噬菌体-、噬菌粒(phagemid)-或酵母-展示的抗体文库)中选择抗体。
本文所描述的具体实施例指的是“药物组合物”，这种组合物可以包括本文所描述的抗体和药学上可接受的载体和/或赋形剂，特别是获得人造的、非自然存在的组合物。根据本发明，这些药物组合物可以作为团注或输注或通过连续输注来给药。适合于促进这种给药手段的药物载体在本领域中是公知的。
药学上可接受的载体通常包括与本文所描述的抗体或相关组合物或组合是生理上兼容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、涂层、抗菌(antibacterial)剂和抗真菌(antifungal)剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。药学上可接受的载体的进一步实例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的任意组合。
在一个这样的方面，抗体可以与适合期望给药途径的一种或多种载体相结合，抗体可以例如与乳糖、蔗糖、淀粉、烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷、聚乙烯醇中的任意混合，且可选地，进一步制成药片或封装胶囊以用于常规给药。或者，抗体可以溶解在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。载体可以包括受控释放材料或延时材料，例如单独或与蜡一起使用的单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯，或本领域公知的其他材料。
另外的药学上可接受的载体在本领域中是已知的，例如在REMINGTONSPHARMACEUTICAL SCIENCES中所描述的。液体配方可以是溶液、乳液或悬浮液，并可以包括赋形剂，如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。
考虑药物组合物，其中配制了本文所描述的抗体和一种或多种治疗活性剂。通过将具有期望纯度的所述抗体与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合以冻干制剂或水溶液的形式制备本文所描述的抗体的稳定制剂用于储存。用于体内给药的制剂是无菌的。这通过无菌过滤膜或其他方法通过过滤很容易完成。本文所公开的抗体和其他治疗活性物质也可以配制成免疫脂质体，和/或包裹在微胶囊中。
包含本文所描述的抗体的药物组合物的给药，可以以多种方式完成，包括口服、皮下、静脉内、鼻内、耳内、经皮、经粘膜、局部，例如凝胶、软膏(salve)、洗剂、乳膏等，腹腔内、肌肉内、肺内，例如采用可吸入技术或肺部递送系统，阴道、肠胃外、直肠或眼内。
用于肠胃外给药的示例性制剂，包括那些适合于皮下、肌肉内或静脉内注射，例如，无菌溶液、乳液或混悬液。
在一个实施例中，本文所描述的抗体是施用于受试者的唯一治疗活性剂，例如作为疾病改善或预防的单一疗法。
在另一个实施例中，本文所描述的抗体与其他活性物质组合，例如在部分的混合物或试剂盒中，以治疗有治疗或预防需要的受试者，例如疾病改善或预防组合疗法。
与一种或多种其他治疗或预防药物的组合可以包括标准治疗，例如抗生素、甾体或非甾体的炎症抑制剂，和/或其他基于抗体的治疗。该组合可以特别包括用于治疗原发性疾病的药物，其中炎症过程将导致继发性炎症、退行性或恶性疾病。原发性疾病是，例如NASH，且该组合将例如包括NSAID或其他新药，如FXR激动剂、GLP1R激动剂或PPAR激动剂。
在联合疗法中，抗体可以作为混合物进行给药，或随着一种或多种其他治疗方案给药，例如在伴随治疗之前、同时或之后。
本文所描述的抗体或相应药物制剂的生物学特性，可以在细胞、组织和整个生物体实验中进行体外表征。如本领域中已知的，药物经常在动物体内测试，包括但不限于，小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪和猴子，以便于测定对疾病或疾病模型治疗的药物效果，或测定药物的药代动力学、药效学、毒性和其他性能。动物可以称为疾病模型。疗法经常在小鼠身上测试，包括但不限于，裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。这样的实验可以提供有意义的数据，以用于确定抗体在被动免疫治疗时，用作具有适当的半衰期、效应子功能、抑制剂活性和/或免疫反应的治疗剂或预防剂的潜力。例如，由于它们与人类的基因相似，灵长类动物、猴子可以作为合适的治疗模型，并因此可以用来测试受试物或组合物的有效性、毒性、药代动力学、药效学、半衰期或其他性质。人体中的试验的最终要求是批准作为药物，因此当然要考虑这些实验。因此，本文所描述的抗体和相应的药物组合物可以在人体中测试，以确定它们的治疗或预防效果、毒性、免疫原性、药代动力学和/或其他临床特性。
因此，本发明提供了治疗NASH的新方法，并且特别是，与NASH相关的那些疾病状况。令人惊讶的是，如在小鼠模型中所显示的，抗TNFR1抗体显著改善了NASH的肝脏脂肪变性和组织学疾病活性。抑制TNFR1可显著导致肝脏脂肪变性百分率和甘油三酯含量的降低。此外，通过抗TNFR1抗体治疗，考虑到脂肪变性、肿胀和小叶炎症的NAFLD活性评分显著降低。令人意想不到的是，选择性TNFR1抑制正在改善NAFLD小鼠模型的肝纤维化，并甚至能够通过减少肝组织的纤维化来治疗和治疗肝纤维化。进一步显示抗TNFR1抗体治疗能减少肝组织细胞凋亡。此外，实现了ALT和胰岛素血清水平显著降低。因此，用抗TNFR1抗体治疗导致了NAFLD炎症和胰岛素抗性的显著改善。
特别令人惊讶的是，鉴于现有技术，抗TNFR1抗体显著改善了NASH的肝脏脂肪变性和组织学疾病活性，因为据报道NASH或脂肪变性的发展为TNFi治疗的副作用。Feagins等人报道了用英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)或依那西普(etanercept)治疗的患有克罗恩氏病(Crohn’s disease)、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎和强直性脊柱炎的患者，在TNFi治疗期间发展出异常ALT水平，并在肝活检中显示出NAFLD(ASH或脂肪变性)(Eur J Gastroenterol Hepatol.2015,27(10):1154-1160)。因此，令人非常意想不到的是，选择性抑制TNFR1对NASH是有效的。
本文所描述的示例性抗体是，例如，根据WO2012035141产生的全长抗体，和/或如WO2008113515A2中描述的它的亲本小鼠抗体H398，任何前述的亲和力成熟功能活性变体和/或抗体片段，或单价抗huTNFR1结合物以及包括任何前述的抗原结合位点的那些抗体，例如在WO2017174586A1中描述的单价抗体。
通过以下实例进一步说明本发明，但不限于此。
实例
实例1：用实验性NAFLD改善小鼠中的肝脏脂肪变性和组织学疾病活性
方法：
B6-huTNFR1-k/i-小鼠在饮用水中接受高脂饮食(HFD)24周，该高脂饮食由60％kcal脂肪+果糖/蔗糖组成(Kohli R et al.,Hepatology 2010)，补充以抗TNFR1(Atrosab)或对照抗体(西妥昔单抗(Cetuximab)，一种抗EGFR抗体，
Figure BDA0002595084790000281
ImClone Systems,Bristol-Myers Squibbund Merck KGaA)治疗(20mg/kg体重,2x/w)另外8周。
本文使用的Atrosab抗体是根据WO2012035141制备的全长抗体，并包括并入VH和VL结构域组合的抗原结合位点，该抗体包括6个CDR序列，该序列为：
SEQ ID NO:23:VH-CDR1
SEQ ID NO:24:VH-CDR2
SEQ ID NO:25:VH-CDR3
SEQ ID NO:26:VL-CDR1
SEQ ID NO:27:VL-CDR2
SEQ ID NO:28:VL-CDR3。
在治疗结束时，比较来自不同治疗组小鼠的肝组织，以获得脂肪变性、NAFLD活性评分、细胞凋亡和纤维化。
根据Kleiner等人(Hepatology 2005)，由病理学家评估脂肪变性的百分比以及NAFLD活性评分(NAS)。通过用酶试验(Roche Diagnostics)测定均质化肝组织中甘油三酯的含量。用活化的胱天蛋白酶-3(细胞信号传递)的抗体通过免疫组化检测细胞凋亡。根据厂商(Sigma Aldrich)的方案通过天狼星红染色检测纤维化，并如描述的进行定量(Schindelin J et al.,Nat Methods 2012)。
根据厂商的说明书，通过动态UV检测(Beckman Coulter)分析血清得到ALT水平，以及用超灵敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Crystal Chem.)测定胰岛素水平。
结果：
Atrosab治疗导致了用实验性NAFLD显著改善了小鼠的肝脏脂肪变性和组织学疾病活性。
对用抗TNFR1抗体(Atrosab)和对照(西妥昔单抗)抗体治疗的HFD小鼠的肝脏组织进行组织学分析，以得到肝脏脂肪变性百分率、甘油三酯含量和NAFLD活性评分(NAS)。对比用对照抗体治疗的小鼠，TNFR1抑制导致肝脏脂肪变性百分率的显著降低(p<0.05；图1A)，以及甘油三酯含量的显著降低(p<0.01；图1B)。此外，相比于对照小鼠，考虑脂肪变性、肿胀和小叶炎症的NAFLD活性评分(NAS)在Atrosab治疗组中显著降低(p<0.05)(图1C)。
实例2：选择性TNFR1抑制与NAFLD小鼠模型中肝纤维化的改善有关
已经证实，选择性TNFR1抑制改善了肝脏脂肪变性和NAS，也分析了Atrosab在减轻纤维化方面的作用。相比于那些用对照抗体治疗的小鼠，通过天狼星红染色评估证实了用抗TNFR1抗体治疗的小鼠的肝纤维化的改善(图2A)。纤维化面积的量化显示出，与对照小鼠相比，在来自用抗TNFR1抗体治疗的小鼠肝组织中，纤维化显著减少(p<0.05)(图2B)。
实例3：在用抗TNFR1抗体治疗的NAFLD小鼠肝组织中凋亡减少
在最初的实验中，小鼠接受HFD 20周，包括用抗TNFR1抗体或对照抗体治疗4周。通过活化胱天蛋白酶-3的免疫组织化学分析，已经证实在4周的治疗期内，抗TNFR1抗体治疗能够减少细胞凋亡。相比于对照抗体，在用抗TNFR1抗体治疗的小鼠肝组织中，观察到活化的胱天蛋白酶-3显著降低(p<0.05)(图3)。
实例4：在用抗TNFR1抗体治疗的NAFLD小鼠血清中ALT和胰岛素水平的改善
与用抗TNFR1抗体治疗的小鼠的组织学改善的观察一致(图1和图2)，与对照抗体治疗的那些小鼠相比，用抗TNFR1抗体治疗的小鼠的ALT(图4A)和胰岛素(图4B)血清水平显著降低(p<0.05)。因此，选择性抗TNFR1抑制导致症和胰岛素抗性的显著改善。
实例5：Atrosimab的说明-生产和表征
材料
如实例1所述获得Atrosab抗体。如WO2012035141所述生产重组人TNFR1-Fc融合蛋白。Atrosimab(HC：SEQ ID NO:18；LC：SEQ ID NO:13)由康泰伦特(康泰伦特药业(CatalentPharma Solutions)，萨默塞特，尤英，新泽西州，美国)在CHO细胞慢病毒转导后生产并纯化。抗His-HRP(His-6 His-Probe-HRP，sc-8036)购自圣克鲁斯生物技术公司(Santa CruzBiotechnology)(圣克鲁斯，加利福尼亚州，美国)。抗人IgG A(山羊，多克隆，2010-01)获得自SouthernBiotech公司，以及抗人IgG B(山羊，多克隆，MBS571163)以及抗人IgG B(山羊，多克隆，MBS571678)购自MyBioSource公司，(圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)。此外，抗人IgG(Fab特异性，A 0293)和抗人IgG(Fc特异性，A 0170)购自Sigma-Aldrich公司(Taufkirchen，德国)。
蛋白质生产
如WO2017174586A1所述，参考蛋白质Fab 13.7用聚乙烯亚胺(线性，25kDa，Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德国)在瞬时转染HEK293E细胞中产生，并严格按照厂商(CaptureSelectTM IgG-CH1 Affity Matrix，194320005，Thermo Fisher Science，德赖艾希，德国)推荐的，通过蛋白亲和层析纯化。
蛋白质表征
使用4μg纯化的蛋白质，在存在或不存在作为还原剂的β-巯基乙醇的情况下，通过SDS-PAGE分析Atrosimab的纯度和正确组装。用考马斯亮蓝染色凝胶中的蛋白质，并用水给凝胶脱色。用Waters 2695HPLC和Phenomenex Yarra SEC-2000色谱柱(300×7.8mm)通过尺寸排除色谱分析完整蛋白。标准蛋白：甲状腺球蛋白(669kDa)、脱铁铁蛋白(Apoferritin)(443kDa)、醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)(150kDa)、BSA(66kDa)、碳酸酐酶(Carbonicanhydrase)(29kDa)、FLAG肽(1kDa)。
热稳定性
用100μg PBS中的纯化蛋白，通过动态光散射(ZetaSizer Nano ZS，Malven，黑伦贝格，德国)确定Atrosimab的熔融/聚集温度(Tm)。所施加的温度以1℃的间隔从35℃提高到80℃，每次测量前有2分钟平衡时间。通过递增信号(kcps)的目视判读来确定Tm。
血浆稳定性
将纯化的Atrosimab样品在人血浆中稀释至100nM的浓度，并在37℃下孵育1、3和7天。在PBS中的2％脱脂牛奶(2％MPBS)以1至3.16(10的平方根)个步骤连续稀释后，通过ELISA对人TNFR1残余结合能力进行后续分析。对照样品在PBS中4℃孵育7天或在人血浆中稀释后直接冷冻。
酶联免疫吸附分析(ELISA)
用100μl的TNFR1-Fc融合蛋白(1μg/ml在PBS中)包覆微孔板并4℃孵育过夜。残余的结合位点用2％MPBS(PBS中的脱脂牛奶，每孔200μl)在室温下封闭2小时，并随后用PBS洗涤两次。将100μl稀释于2％MPBS中的样品在室温下孵育1h，在进行最后一步孵育前，在2％MPBS中加入100μl HRP偶联检测抗体。用100μl TMB底物溶液(1mg/ml 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺[TMB]，在100mM醋酸钠缓冲液中的0.006％H2O2，室温下pH6)检测结合的蛋白，通过加入50μl 1M H2SO4终止HRP反应，并用无限微量平板读取器(TECAN，Maennedorf，瑞士)测定在450nm波长的吸光度。在每个培养步骤之间和检测之前，将板用PBST清洗两次并用PBS清洗两次。
使用石英晶体微量天平的亲和力测量
通过石英晶体微量天平(Cell-200 C-Fast,Attana,斯德哥尔摩，瑞典)测量确定蛋白质-蛋白质相互作用的实时结合动力学。根据厂商的方案～94ΔHz的中等密度将其中一个结合配偶体(binding partner)(TNFR1-FC)化学固定在LNB羧基传感器芯片上(3623-3103，Attana,斯德哥尔摩，瑞典)。将样品(分析物)在128nm和4nm之间(1：2稀释顺序)，pH7.4，流速25μl/min，37℃条件下稀释在PBST(PBS，0.1％吐温20)中以进行结合实验。用25μl20mM甘氨酸，pH 2.0再生芯片。每三次测量，测量运行缓冲液的注入，该注入在数据分析之前从结合曲线中减去。使用Attana提供的软件收集数据，并通过Attaché办公评估软件(Attana，斯德哥尔摩，瑞典)和TraceDrawe(ridgview Instruments，万格，瑞典)分析。
白细胞介素释放试验
将每孔2×104个HeLa或HT1080细胞接种于96孔微滴定板中，并在100μl RPMI1640+5％FCS中生长过夜。第二天，更换上清液以去除组成型(constitutively)产生的细胞因子。在37℃、5％CO2条件下，细胞在稀释有系列样品的RPMI 1640+5％FCS中孵育。在竞争实验的情况下，两个分析的蛋白质样品分开制备(滴定或稀释到单一浓度)，并随后加入到板中。未刺激的细胞作为对照。16～20h后，将板以500g离心5min，细胞培养上清液按厂商的方案直接用ELISA法分析，上清液被稀释在RPMI 1640(不含FCS)中，将抗体稀释在试剂稀释液(0.1％BSA、0.05％吐温20、20mM TRIS、150mM NaCl、pH7.5)中。用1％BSA(牛血清白蛋白)在PBS中封闭包覆的微滴定板，并如上所述进行用于ELISA的洗涤并检测或测定。用于在细胞培养上清液中IL-6和IL-8检测的夹心ELISA试剂盒购自ImmunoTools，(Friesythe，德国)。
细胞毒性/细胞存活性试验
将细胞(每孔1×104个)接种于96孔微滴定板中，并在37℃和5％CO2中孵育过夜。将蛋白质稀释在RPMI 1640+10％FCS中，并加入到细胞中。细胞毒性试验为，在37℃和5％CO2孵育24小时后，弃掉上清液，并在孔中加入50μl结晶紫溶液。随后，将平板在ddH2O中洗涤20次并烘干。产生自活细胞和贴壁细胞的残余紫色染料，通过在染色液中含有的甲醇固定，加入100μl甲醇在室温下摇动10min溶解。使用无限微量滴定平板读取器(Tecan，Maennedorf，瑞士)测定平板。
药代动力学
在特定小鼠基因的基因座(locus)处携带人TNFR-1的胞外结构域基因的转基因C57BL/6J小鼠(C57BL/6J-huTNFRSF1Aecdtm1UEG/izi，Dong et al.,2016)，接受400μgAtrosimab的静脉注射。在3min、30min、1h、2h、6h以及3天和7天后采集血液样品并立即在冰上孵育。通过离心分离(13.000g，4℃，10分钟)血清并保存在-20℃下。通过上述结合ELISA检测血清中残余蛋白。从新鲜制备的分析蛋白质的标准结合曲线中插入ELISA信号。使用用于Microsoft Excel的PKsolver插件(add-in)分析，绘制确定的浓度与时间的关系图，得到药代动力学常量。
实例5.1：Atrosimab的生化表征
单价肿瘤坏死因子(TNF)受体1(TNFR1)特异性拮抗剂，认定为Atrosimab，通过将Fab 13.7的可变结构域融合到异源二聚化Fc模块Fc1k(一/κ)的N端而产生的。这一过程得到了尺寸增大的Fab样的单价分子，其具有与新生儿Fc受体相互作用的能力，以便能够扩大血清循环(图6a))。通过康泰伦特血浆溶液(康泰伦特药业，萨默塞特，尤英，新泽西州，美国)用蛋白A亲和层析和连续尺寸排除层析(SEC)纯化后，在CHO细胞中在几轮慢病毒转导后产生所得药物候选物Atrosimab。
Atrosimab在SEC中显示单峰，保留时间为17.9分钟，插入分子量为81kDa和斯托克斯半径(stokes radius)rs为3.5nm(图6b)。在还原条件下的SDS-PAGE中，检测到38kDa和43kDa两条带，在非还原条件下检测到70kDa一条带(图6c)。这些数据很好地对应经计算的72kDa的分子量(由35kDa和36kDa链组成)，表明两条多肽链的正确表达和功能性异源二聚体蛋白的正确组装。此外，如通过动态光散射(DLS，图6d)确定的，Atrosimab显示出64℃的聚集点(Tm)，其与也通过DLS分析的完整IgG分子的聚集点相当(Martin et al.,2014,Brader et al.,2015)。最后，Atrosimab与人TNFR1-Fc的结合活性在人血浆中孵育长达7天后保持不变，表明有良好的血浆稳定性(图6e)。
实例5.2：Atrosimab与TNFR1、Fcγ受体和补体蛋白C1q的结合
在平衡条件下，通过ELISA分析Atrosimab与其靶受体TNFR1的相互作用，得到EC50值为0.4nM(图7a)，表明当与亲本Fab 13.7相比，结合活性降低了2倍，当与二价IgGATROSAb相比，降低了4倍。此外，如通过1:1结合算法分析的，在实时结合研究中，使用石英晶体微量天平，在～94ΔHz的中等受体密度下固定，用表观KD值2.7nM、kon 3.7×105M-1s-1，以及koff 9.8×10-4M-1s-1，使Atrosimab结合人TNFR1(图7b)。值得注意的是，Atrosimab包括Fc区域，该区域经修饰以降低抗体介导的效应子功能(Armour et al.,1999)。因此，如通过ELISA所证实的，Atrosimab显示出几乎完全缺失与人Fcγ受体Ia、IIb和IIIa以及补体蛋白C1q的结合(图7c)。当与之前描述的抗人TNFR1 IgG ATROSAB(Zettlitz et al.,2010)相比，结合降低到类似的程度(FcγRI和FcγRIII)或甚至更显著(FcγRIIb和C1q)，关于Fcγ受体和C1q的结合，其携带了相同的Fc修饰。
实例5.3：Atrosimab体外抑制TNFR1的活化并且缺乏任何激动活性
在白细胞介素(IL)释放实验中，使用HeLa细胞分析IL-6以及HT1080细胞分析IL-8，以及在使用Kym-1细胞进行的细胞死亡诱导试验中，Atrosimab在50pM到500nM的分析浓度范围内显示出完全没有任何激动性生物活性(图3a-c)。在亲本Fab 13.7的情况下，检测到相同的缺乏激动性。相反，二价IgG ATROSAB在1nM至100nM的浓度下诱导IL-6和IL-8的轻微释放(marginal release)(图8a和b)，其证实了之前发表的数据(Richter et al.,2013)。相反，在Kym-1细胞死亡诱导试验中，不能检测到ATROSAB的轻微激动性活性(图8c)。
此外，Atrosimab抑制了在HeLa IL-6释放试验和HT1080 IL-8释放试验中通过0.1nM TNF诱导的TNFR1的活化，EC50值分别为54.5nM和24.2nM(图8d和e)。此外，Atrosimab抑制了Kym-1细胞中通过0.1nM TNF诱导的细胞死亡，其IC50值为16.2nM(图8f)。当与亲本Fab 13.7相比时，这些数据表现出1.5倍至1.9倍的生物活性降低(表1)。然而，与二价IgGATROSAB的生物活性相比，如分别在IL-6释放试验、IL-8释放试验和细胞死亡诱导试验中确定的，证实了Atrosimab有3.0倍、3.5倍和4.0倍更强的TNF介导TNFR1活化抑制(表1)。
表1 Atrosimab的生物活性
Atrosimab Fab 13.7 ATROSAB
IC<sub>50</sub>，IL-6[nM] 54.5 37.1 164.7
IC<sub>50</sub>，IL-8[nM] 24.2 12.7 84.1
IC<sub>50</sub>，细胞死亡诱导[nM] 16.2 9.5 64.4
解决由例如抗药抗体(ADA)介导的Atrosimab二次交联的潜在风险，使用HT1080细胞在IL-8释放检测中在三种不同的小鼠抗人IgG血清存在的情况下，分析Atrosimab的激动潜力(Richter et a.2013)。通过ELISA证实小鼠抗人IgG血清与Atrosimab、Fab 13.7和ATROSAB的结合(数据未示出)。值得注意的是，Atrosimab在分析浓度范围(50pM到500nM)内没有诱导任何IL-8的释放，这也在亲本Fab 13.7(图9a-c)中观察到。相反，当与图8中观察到的轻微释放相比，二价IgG ATROSAB诱导的IL-8的释放明显增加(图9a-c)，表明了与ATROSAB相比，即使在药物特异性抗体存在的情况下，Atrosimab明显降低了介导任何TNFR1活化的倾向。
实例5.4：Atrosimab的药代动力学
最后，使用携带人TNFR1胞外结构域的转基因的C57BL/6J-huTNFRSF1Aecd tm1UEG/izi(Dong et al.,2016)小鼠，在团注400μg蛋白后，记录Atrosimab的药代动力学特性(图10，表2)。Atrosimab从小鼠血液循环中被消除，初始半衰期为2.2±1.2小时，终末半衰期(terminal half-live)为41.8±18.1小时，得到曲线下面积为5856.0±1369.9μg/ml×h。
表2 Atrosimab的药代动力学分析
Figure BDA0002595084790000341
t1/2α，初始半衰期；t1/2β，终末半衰期；C0，插入的初始浓度；AUC 0-t，直到最后检测时间点的曲线下面积；Vss，分布体积(在稳定状态下)；CL，清除率。
参考文献
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Claims (15)

1.一种特异性识别人肿瘤坏死因子1(huTNFR1)的抗体，用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及与其相关的疾病状况。
2.根据权利要求1所述的使用的抗体，所述抗体特异性识别膜-huTNFR1的远端CRD1和/或CRD2的亚结构域A1内的表位，优选特异性识别huTNFR1的N-末端区域中的由氨基酸1至115所代表的表位。
3.根据权利要求1或2所述的使用的抗体，所述抗体是单克隆抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的使用的抗体，所述抗体是单特异性、二价全长抗体。
5.根据权利要求4所述的使用的抗体，所述抗体包括IgG1 Fc结构域，该IgG1 Fc结构域缺乏介导效应子功能，优选包括至少一个突变，该突变选自由E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S和P331S组成的组，优选包括A327G/A330S/P331S，其中根据Kabat EU索引进行编号。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的使用的抗体，所述抗体单价地识别huTNFR1。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的使用的抗体，所述抗体包括：
a)重链可变结构域(VH)，该重链可变结构域包括互补决定区(CDR)：VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3；以及
b)轻链可变结构域(VL)，该轻链可变结构域包括CDR：VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，
其中
i)
VH-CDR1包括SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成；
VH-CDR2包括SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成；
VH-CDR3包括SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3组成；
VL-CDR1包括SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成；
VL-CDR2包括SEQ ID NO:5或由SEQ ID NO:5组成；
VL-CDR3包括SEQ ID NO:6或由SEQ ID NO:6组成；
或
ii)
VH-CDR1包括SEQ ID NO:23或由SEQ ID NO:23组成；
VH-CDR2包括SEQ ID NO:24或由SEQ ID NO:24组成；
VH-CDR3包括SEQ ID NO:25或由SEQ ID NO:25组成；
VL-CDR1包括SEQ ID NO:26或由SEQ ID NO:26组成；
VL-CDR2包括SEQ ID NO:27或由SEQ ID NO:27组成；
VL-CDR3包括SEQ ID NO:28或由SEQ ID NO:28组成；
其中根据Kabat EU索引进行编号；
或以上i)或ii)中任何一项的功能活性变体，其在每一个CDR序列中包括0、1或2个点突变，并且其特异性识别huTNFR1。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的使用的抗体，所述抗体包括VH序列和VL序列，或其功能活性变体；所述VH序列包括SEQ ID NO:7或9或由SEQ ID NO:7或9组成；所述VL序列包括SEQ ID NO:8或10或由SEQ ID NO:8或10组成，所述功能活性变体在每一个CDR序列中包括至多1个点突变，并且在VH和VL的框架(FR)序列FR1-4中具有至少60％的序列同一性。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的使用的抗体，其中所述疾病状况是肝脏脂肪变性、肝脏发炎、肝纤维化以及肝细胞癌中的任意。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的使用的抗体，其中对患有NASH的患者施用有效量的所述抗体，以拮抗TNFa/huTNFR1信号传递。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的使用的抗体，其中对患有NASH的患者施用有效量的所述抗体，以降低以下任一项或多项：
a)肝组织中的脂肪变性、甘油三酯含量、炎症和/或细胞凋亡；
b)血清转氨酶水平；
c)胰岛素抗性以及可选地改善葡萄糖耐受性；和/或
d)NAFLD活性评分。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的使用的抗体，其中对患有NASH的患者施用剂量范围为0.05mg/kg至20mg/kg的所述抗体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的使用的抗体，其中与抗炎药物治疗，或使用法尼醇X受体(FXR)激动剂、胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂或过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)激动剂的疗法组合，对患有NASH的患者施用所述抗体。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的使用的抗体，其中将所述抗体施用于患者，所述患者还患有II型糖尿病、I型糖尿病、糖尿病前期、胰岛素抗性或肥胖，其中肥胖定义为患者具有至少30的体重指数。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的使用的抗体，其中使用包含有效量的所述抗体的药物制剂。
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