WO2024096022A1 - 抗アディポネクチン受容体抗体及びその利用 - Google Patents

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尚美 浅原
浩一 和田
敏正 山内
美紀 岩部
孝 門脇
真人 岩部
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田辺三菱製薬株式会社
国立大学法人東京大学
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Definitions

  • the present disclosure relates to anti-adiponectin receptor antibodies and agents and medicines containing the same for treating or preventing adiponectin-related diseases.
  • Adiponectin is an adipokine produced mainly by fat cells, and contributes to maintaining homeostasis in glucose metabolism, lipid metabolism, and vascular endothelial function. It has been reported that reduced production of adiponectin due to causes such as obesity and lipodystrophy can lead to the onset and progression of metabolic diseases such as insulin resistance, dyslipidemia, type 2 diabetes, and nonalcoholic steatohepatitis (NASH), as well as coronary artery diseases such as myocardial infarction and cerebral infarction.
  • metabolic diseases such as insulin resistance, dyslipidemia, type 2 diabetes, and nonalcoholic steatohepatitis (NASH)
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • coronary artery diseases such as myocardial infarction and cerebral infarction.
  • adiponectin forms a polymeric structure with a trimer as the smallest unit, it is difficult to formulate a formulation that controls its ratio, and there are greater challenges in terms of industrial productivity than with recombinant protein formulations such as hormones and enzymes, so it has not yet been used in pharmaceutical development.
  • AdipoR adiponectin receptor
  • scFv and a fusion protein (scFv-Fc) of scFv and human IgG1 Fc region that exhibit binding affinity to a peptide in the C-terminal extracellular domain of AdipoR have been obtained from a single-chain antibody (single-chain variable fragment, scFv) library, and have been reported to exhibit some adiponectin-like activity, but also to have an inflammatory induction effect (Non-Patent Document 2).
  • AdipoR is a seven-transmembrane receptor with a different orientation from G protein-coupled receptors (GPCRs).
  • GPCRs G protein-coupled receptors
  • Recent advances in antibody acquisition technology have made it possible to obtain antibodies to multiple transmembrane receptors, such as GPCRs, but most of these are for analytical purposes or as antagonists, and there have been few reports of the development of agonist antibodies.
  • the ligand adiponectin forms a polymeric structure with a trimer as the minimum unit, so it was thought that it would not be easy to obtain AdipoR agonist antibodies using antibody class IgG, which exhibit sufficient agonist activity and can be used as an antibody drug.
  • the present disclosure has been made in consideration of the above circumstances, and provides an anti-AdipoR antibody with excellent properties, and a pharmaceutical for preventing or treating adiponectin-related diseases, including metabolic syndrome and type 2 diabetes.
  • an anti-AdipoR antibody having a specific complementarity determining region (CDR) sequence has excellent AdipoR binding properties and AdipoR agonistic activity. Furthermore, they have found that the anti-AdipoR antibody can be used to prevent or treat adiponectin-related diseases, including metabolic syndrome and type 2 diabetes, and have completed the present disclosure. That is, the present disclosure includes the following aspects.
  • LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 18
  • LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or 20
  • LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21
  • HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22
  • HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23
  • HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the anti-adiponectin receptor antibody is an antibody that binds to adiponectin receptor 1 and adiponectin receptor 2.
  • a nucleic acid molecule comprising a base sequence encoding the anti-adiponectin antibody or antibody fragment thereof according to any one of [1] to [9].
  • a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule according to [10].
  • a host cell comprising the recombinant vector according to [11].
  • a pharmaceutical composition comprising the anti-adiponectin antibody or antibody fragment thereof according to any one of [1] to [9].
  • the pharmaceutical composition according to [14] for the prevention or treatment of an adiponectin-related disease is selected from the group consisting of obesity-related diseases, metabolic syndrome, dyslipidemia, type 2 diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), myocardial infarction, cerebral infarction, cancer, psoriasis, chronic kidney disease, alopecia, liver cirrhosis, pancreatitis, cardiomyopathy, systemic sclerosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and pulmonary fibrosis.
  • the adiponectin-related disease is selected from the group consisting of obesity-related diseases, metabolic syndrome, dyslipidemia, type 2 diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), myocardial infarction, cerebral infarction, cancer
  • the present disclosure provides an anti-AdipoR antibody with excellent properties, and an excellent pharmaceutical agent for preventing or treating adiponectin-related diseases, including metabolic syndrome and type 2 diabetes.
  • Control mouse IgG2b 10 ⁇ g/mL is shown as a filled histogram, 10-127D11 1 ⁇ g/mL as a dotted line, 3 ⁇ g/mL as a dashed line, and 10 ⁇ g/mL as a solid line.
  • FIG. 1 Figure showing binding results of antibodies (mouse-human chimeric antibody (WT), rH127D11 Ver. 1 and Ver. 2) to CHO cells (lower panel), AdipoR1-expressing CHO cells (upper panel), or AdipoR2-expressing CHO cells (middle panel).
  • Control human IgG4 10 ⁇ g/mL is shown as a filled histogram, rH127D11 1 ⁇ g/mL as a dotted line, 3 ⁇ g/mL as a dashed line, and 10 ⁇ g/mL as a solid line.
  • Binding results of antibodies rH127D11 Ver. 3, Ver.
  • Control human IgG4 10 ⁇ g/mL is shown as a filled histogram, rH127D11 1 ⁇ g/mL as a dotted line, 3 ⁇ g/mL as a dashed line, and 10 ⁇ g/mL as a solid line.
  • FIG. 1 shows the results of comparing the expression levels of various markers when a control antibody or an antibody (r127D11) was administered to NASH model mice.
  • agonist activity refers to the ability to bind to a target of interest and activate any of the functions of that target.
  • Having agonist activity to AdipoR refers to the ability of an anti-AdipoR antibody to bind to AdipoR (either AdipoR1 or AdipoR2 or both) and thereby activate AdipoR signals. The evaluation of AdipoR signals and their activation will be described later.
  • isolated anti-AdipoR antibody in the context of isolated anti-AdipoR antibody means identified and separated and/or recovered from components in their natural state.
  • an anti-AdipoR antibody can be isolated by purification through at least one purification step, and an anti-AdipoR antibody purified through at least one purification step can be referred to as an "isolated anti-AdipoR antibody.”
  • human antibodies refers to an antibody in which both the light chain and the heavy chain are derived from human immunoglobulin. Depending on the difference in the constant region of the heavy chain, human antibodies include IgG (including IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) having a ⁇ heavy chain, IgM having a ⁇ heavy chain, IgA (including IgA1 and IgA2) having an ⁇ heavy chain, IgD having a ⁇ heavy chain, or IgE having an ⁇ heavy chain.
  • the light chain includes either a ⁇ chain or a ⁇ chain.
  • a humanized antibody refers to an antibody that is composed of a variable region consisting of a complementarity determining region of an antibody derived from a non-human animal and a framework region derived from a human antibody, and a constant region derived from a human antibody.
  • a chimeric antibody refers to an antibody in which the light chain, the heavy chain, or both, are composed of a variable region of non-human origin and a constant region of human origin.
  • an anti-AdipoR antibody refers to an immunoglobulin molecule or a modified molecule thereof that binds to AdipoR (either or both of AdipoR1 and AdipoR2).
  • the modified molecule includes a multispecific antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a functionally modified antibody, and a conjugated antibody.
  • a multispecific antibody is an asymmetric antibody that has two or more independent antigen recognition sites with two or more different antigen specificities, and examples of such antibodies include a bispecific antibody having two antigen specificities and a trispecific antibody having three antigen specificities.
  • a functionally modified antibody refers to an antibody whose function other than the antigen-binding function, such as a cell-killing function, a complement activation function, or a function to extend the blood half-life, has been modified by modifying the antibody sequence, glycan, etc.
  • a conjugated antibody refers to an antibody to which a functional molecule other than an antibody, such as a non-peptide polymer such as polyethylene glycol (PEG), a radioactive substance, a toxin, a low molecular weight compound, a cytokine, a growth factor, albumin, or an enzyme, is chemically or genetically bound.
  • a functional molecule other than an antibody such as polyethylene glycol (PEG), a radioactive substance, a toxin, a low molecular weight compound, a cytokine, a growth factor, albumin, or an enzyme, is chemically or genetically bound.
  • PEG polyethylene glycol
  • antibody fragment refers to an antigen-binding fragment unless otherwise specified.
  • An antibody fragment can also be called an antigen-binding molecule.
  • An antigen-binding fragment is a protein that contains a portion of an antibody and can bind to an antigen. Examples of antigen-binding fragments include F(ab') 2 , Fab', Fab, Fv (variable fragment of antibody), disulfide-linked Fv, single-chain antibody (scFv), and polymers thereof.
  • the antigen-binding fragment includes conjugated antigen-binding fragments that are chemically or genetically linked to functional molecules other than the anti-AdipoR antibody of the present disclosure, such as non-peptide polymers such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, toxins, low molecular weight compounds, cytokines, growth factors, albumin, enzymes, and other antibodies.
  • non-peptide polymers such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, toxins, low molecular weight compounds, cytokines, growth factors, albumin, enzymes, and other antibodies.
  • Complementarity determining region refers to the region of the variable region of an immunoglobulin molecule that forms an antigen binding site, also called hypervariable region, and refers to a portion in which the amino acid sequence varies greatly from one immunoglobulin molecule to another.
  • CDR Complementarity determining region
  • the CDRs of an immunoglobulin molecule are determined according to the Kabat numbering system (Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA).
  • Percent (%) identity with respect to an identified reference polypeptide sequence, such as a variable region, is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to the amino acid residues in a particular reference polypeptide sequence, after aligning the sequences, introducing gaps, if necessary, to obtain the maximum percent identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent identity can be achieved by a variety of methods within the skill of the art, such as using publicly available computer software, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, or Megalign (DNASTAR) software.
  • percent identity values are obtained by using the sequence comparison computer program BLAST in pairwise alignments.
  • percent identity of a given amino acid sequence A with a given amino acid sequence B is calculated as follows: 100 times the fraction X/Y, where X is the number of amino acid residues scored as identical by the sequence alignment program BLAST program alignment of A and B, and Y is the total number of amino acid residues in B.
  • “competing” with an anti-AdipoR antibody of the present disclosure means that the presence of the anti-AdipoR antibody or an antigen-binding fragment thereof significantly reduces the binding of the anti-AdipoR antibody of the present disclosure to AdipoR (either or both of AdipoR1 and AdipoR2) when measured by the flow cytometry method described herein.
  • Adiponectin receptor is a receptor for adiponectin, and is a molecule that transmits adiponectin signals when its ligand adiponectin binds to it.
  • AdipoR exists as AdipoR1 and AdipoR2.
  • AMPK AMP-activated kinase
  • PPAR peroxisome proliferator-activated receptor
  • AdipoR1 When AMPK signaling is activated, sugar and lipid metabolism is activated, and the expression of fat synthesis-related genes such as acetyl-CoA carboxylase 1 (ACC) is decreased, suppressing lipid synthesis. Furthermore, activation of PPAR ⁇ signaling activates lipid metabolism.
  • the accession number of the amino acid sequence of AdipoR1 described in NCBI is, for example, NP_001277558.1 (SEQ ID NO: 1), and the accession number of the nucleotide sequence of AdipoR1 mRNA is NM_001290629.1.
  • accession number of AdipoR2 is, for example, NP_078827.2 (SEQ ID NO: 2), and the accession number of the nucleotide sequence of AdipoR2 mRNA is NM_024551.2.
  • the biological origin of AdipoR is not limited as long as it has the function of transmitting an adiponectin signal by binding to adiponectin.
  • One embodiment of the present disclosure is a novel anti-AdipoR antibody.
  • This antibody has excellent AdipoR binding properties and AdipoR agonist activity, and is also excellent in storage stability, thermal stability, etc. Storage stability and thermal stability will be described later, and these are sometimes collectively referred to as stability.
  • This antibody can be used to prevent or treat, for example, adiponectin-related diseases. This method of prevention or treatment has minimal side effects because it uses an antibody, and is therefore excellent in terms of safety.
  • An anti-AdipoR antibody according to one embodiment of the present disclosure has excellent binding properties to AdipoR.
  • the antibody may bind to either AdipoR1 or AdipoR2, but is preferably an antibody that binds to both AdipoR1 and AdipoR2.
  • the anti-AdipoR antibody of the present disclosure binds to AdipoR, meaning that it specifically binds to AdipoR.
  • the anti-AdipoR antibody of the present disclosure has a low dissociation constant (KD) for either or both of AdipoR1 and AdipoR2, preferably either or both of human AdipoR1 and AdipoR2, and more preferably for both human AdipoR1 and human AdipoR2.
  • KD dissociation constant
  • the anti-AdipoR antibody exerts agonistic activity on AdipoR. That is, it acts on AdipoR and induces signal transduction similar to that caused when natural adiponectin acts on AdipoR. Addition of the anti-AdipoR antibody activates AMPK signaling via AdipoR1 and/or PPAR ⁇ signaling via AdipoR2.
  • the anti-AdipoR antibody of the present disclosure is preferably an antibody that activates both AMPK signaling and PPAR ⁇ signaling.
  • the anti-AdipoR antibodies of the present disclosure can activate AdipoR1-mediated AMPK signaling and/or AdipoR2-mediated PPAR ⁇ signaling by 50% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more, of the level activated by negative control stimulation.
  • AMPK signaling via AdipoR1 by anti-AdipoR antibodies can be evaluated by an AMPK phosphorylation test.
  • Adiponectin binds to AdipoR1 and induces phosphorylation of AMPK in cells such as skeletal muscle. It is preferable that anti-AdipoR antibodies induce phosphorylation of AMPK in the same way as natural adiponectin.
  • the level of AMPK phosphorylation by anti-AdipoR antibodies may be any level as long as the phosphorylated AMPK/AMPK ratio when anti-AdipoR antibodies are added to cells exceeds the phosphorylated AMPK/AMPK ratio when an isotype control antibody is added, but it is, for example, 1.1 times or more, preferably 2.0 times or more, more preferably 3.0 times or more, even more preferably 4.0 times or more, and particularly preferably 5.0 times or more.
  • the amount of AMPK and phosphorylated AMPK is quantified by Western blotting, and the AMPK/AMPK ratio is calculated.
  • homogeneous assays such as sandwich ELISA and FLET, and quantification by immunostaining can also be used as an alternative to Western blotting.
  • Activation of PPAR ⁇ signaling via AdipoR2 by anti-AdipoR antibodies can be evaluated by a transcription activation test using PPAR ⁇ .
  • Adiponectin binds to AdipoR2 and activates PPAR ⁇ signaling in hepatocytes, vascular endothelial cells, etc., i.e., activates the transcription of PPAR ⁇ target genes.
  • anti-AdipoR antibodies promote the transcription activation of PPAR ⁇ target genes in the same way as natural adiponectin.
  • the level of transcription activation promotion by anti-AdipoR antibodies may be any level that exceeds the level of transcription activation promotion by an isotype control antibody, for example, 1.1 times or more.
  • the increase in expression of a reporter gene or the increase in expression of a PPAR ⁇ target gene in AdipoR-expressing cells introduced with a vector in which a reporter gene (e.g. an enzyme such as luciferase) is linked downstream of a promoter containing a PPAR ⁇ binding element can be quantified.
  • a reporter gene e.g. an enzyme such as luciferase
  • the expression level can be measured by a general method such as quantitative PCR.
  • An anti-AdipoR antibody according to one embodiment of the present disclosure has excellent storage stability. Storage stability can be evaluated based on a decrease in binding to AdipoR, i.e., either or both of AdipoR1 and AdipoR2, after storage for a certain period of time, and the AdipoR binding amount of an anti-AdipoR antibody can be specifically measured by measuring antigen binding activity using a flow cytometry method.
  • An anti-AdipoR antibody according to one embodiment of the present disclosure when stored for one month at 40°C, can have an AdipoR binding amount of 90% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, or 97% or more compared to the AdipoR binding amount of the anti-AdipoR antibody or its antibody fragment before storage.
  • the anti-AdipoR antibody according to an embodiment of the present disclosure is preferably stable even when subjected to heat treatment, and more preferably stable even when subjected to heat treatment at or above 65° C. Stability during heat treatment can be evaluated based on an increase in the amount of aggregates or a decrease in binding activity to AdipoR after heat treatment, and it is preferable that there is no change compared to when not subjected to heat treatment. Moreover, the anti-AdipoR antibody according to an embodiment of the present disclosure preferably has excellent stability against freezing and thawing.
  • the stability against freezing and thawing can be evaluated based on an increase in the amount of aggregates or a decrease in binding activity to AdipoR after multiple freeze-thaw cycles, and it is preferable that there is no change compared to when no freeze-thawing is performed.
  • An anti-AdipoR antibody according to one embodiment of the present disclosure is preferably one that has few side effects.
  • side effects include induction of inflammatory reactions, injection site reactions, abnormalities in liver function tests, abnormal renal function, hepatotoxicity, nephrotoxicity, central nervous system abnormalities, myopathy, and fatigue.
  • an increase in ALT, AST, or ⁇ -GTP levels in the blood may indicate hepatotoxicity or abnormal liver function.
  • an increase in bilirubin may indicate hepatotoxicity or abnormal liver function.
  • an increase in urinary protein, creatinine in the blood, or an increase in BUN may indicate nephrotoxicity or abnormal renal function.
  • the anti-AdipoR antibodies of the present disclosure include monoclonal antibodies obtained by immunizing mammals such as mice or chickens with AdipoR, i.e., either AdipoR1 or AdipoR2 or a partial fragment thereof, or cells expressing either of them, to produce hybridomas, chimeric antibodies and humanized antibodies produced using recombinant gene technology, and human antibodies produced using transgenic animals producing human antibodies. They also include antibodies obtained by affinity maturation of the antibodies obtained above. When the anti-AdipoR antibodies or antibody fragments thereof of the present disclosure are administered to humans as medicines, humanized antibodies, human antibodies, or antibody fragments thereof are preferable from the viewpoint of side effects.
  • a vector carrying an antigen gene can be directly administered to an animal to be immunized to generate antigen-expressing cells in vivo, which can then be used as an immunogen.
  • a virus vector specifically, a retrovirus, a lentivirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes simplex virus, or the like, may be used.
  • Antigens expressed on the surface of non-infectious virus-like particles (lipoparticles) based on the retroviral budding system may also be used for immunization.
  • the antigen may be used for immunization as it is, or may be used as a complex with a carrier protein.
  • Condensing agents such as glutaraldehyde, carbodiimide, and maleimide active ester can be used to prepare the complex of the antigen and the carrier protein.
  • the carrier protein include bovine serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, and KLH.
  • Animals to be immunized include mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, pigs, goats, horses, and cows, as well as chickens and sharks, and inoculation methods include subcutaneous, intramuscular, or intraperitoneal administration.
  • the vaccine may be administered by mixing with complete or incomplete Freund's adjuvant, and is usually administered once every 1 to 5 weeks.
  • Antibody-producing cells obtained from the spleen or lymph nodes of an immunized animal are fused with myeloma cells and isolated as hybridomas. Myeloma cells derived from animals, such as mice, rats, humans, and chickens, are used.
  • monoclonal antibodies can be obtained as follows. That is, the above-mentioned antigen is used as an immunogen, and the immunogen, together with Freund's adjuvant as necessary, is injected subcutaneously, intramuscularly, intravenously, into the footpad, or intraperitoneally into the above-mentioned animal once or several times, or is implanted therein, thereby immunizing the animal. Usually, immunization is performed once to four times at intervals of about 1 to 14 days from the first immunization, and antibody-producing cells are obtained from the immunized animal about 1 to 5 days after the final immunization.
  • Monoclonal antibodies can be obtained using methods well known to those skilled in the art. See, for example, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987)) and Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).
  • hybridas that secrete monoclonal antibodies
  • they are prepared by cell fusion of antibody-producing cells contained in the spleen, etc. obtained from an immunized animal with myeloma cells that are not capable of producing autoantibodies, derived from an animal, preferably a mouse, rat, chicken, or human.
  • Myeloma cells that can be used for cell fusion include, for example, mouse-derived myeloma P3/X63-AG8.653 (653), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8. U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/O, Sp2), PAI, F0, and BW5147, rat-derived myeloma 210RCY3-Ag. 2.3, and human-derived myeloma U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11, and CEM-T15.
  • fusion promoters include polyethylene glycol
  • cell fusion can be achieved by reacting polyethylene glycol with an average molecular weight of 1000 to 4000 at a concentration of about 20 to 50%, at a temperature of 20 to 40°C, preferably 30 to 37°C, at a ratio of antibody-producing cells to myeloma cells of usually about 1:1 to 10:1, for about 1 to 10 minutes.
  • Hybridoma clones that produce monoclonal antibodies can be screened by culturing the hybridomas, for example, in a microtiter plate and measuring the reactivity of the culture supernatant in the wells to the immunogen by immunochemical methods such as ELISA or flow cytometry.
  • Hybridoma selection and breeding are usually performed in animal cell medium containing 10-20% fetal bovine serum with the addition of HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • Monoclonal antibodies can be produced from hybridomas by culturing the hybridomas in vitro or by growing them in vivo in ascites of animals such as mice, rats, and chickens, and isolating them from the resulting culture supernatant or from the ascites of the animal.
  • Basic media include, for example, low-calcium media such as Ham'F12 medium, MCDB153 medium, and low-calcium MEM medium, and high-calcium media such as MCDB104 medium, MEM medium, D-MEM medium, RPMI1640 medium, ASF104 medium, and RD medium.
  • the basic media can contain, for example, serum, hormones, cytokines, and/or various inorganic or organic substances, depending on the purpose.
  • Isolation and purification of monoclonal antibodies can be performed by subjecting the above-mentioned culture supernatant or ascites to saturated ammonium sulfate, euglobulin precipitation method, caproic acid method, caprylic acid method, ion exchange chromatography such as DEAE or DE52, affinity column chromatography such as anti-immunoglobulin column, protein A column or antigen-bound column, etc.
  • purification of monoclonal antibodies can be achieved by using known methods for purifying immunoglobulins, for example, ammonium sulfate fractionation method, PEG fractionation method, ethanol fractionation method, use of an anion exchanger, and further affinity chromatography using anti-immunoglobulin antibodies or protein A, etc.
  • Monoclonal antibodies can also be obtained by phage display.
  • phages selected from any phage antibody library are screened using the target immunogen to select phages having the desired binding affinity to the immunogen.
  • the antibody-corresponding sequence contained in the phage is isolated or sequenced, and an expression vector containing a nucleic acid molecule encoding an antibody or an antigen-binding domain is constructed based on the isolated sequence or the sequence information determined.
  • a cell line transfected with such an expression vector is cultured to produce a monoclonal antibody.
  • a human antibody library as the phage antibody library, a human antibody having the desired binding affinity can be generated.
  • monoclonal antibodies can also be obtained by in vitro immunization.
  • a preferred embodiment of the anti-AdipoR antibody of the present disclosure is a chimeric antibody.
  • An example of a "chimeric antibody” is a chimeric antibody whose variable region is derived from the immunoglobulin of a non-human animal such as a mouse, rat, hamster, or chicken, and whose constant region is derived from human immunoglobulin.
  • a chimeric antibody can be produced by immunizing a mouse with an antigen, excising the variable region that binds to the antigen from the gene of the mouse monoclonal antibody, and combining it with an antibody constant region derived from human bone marrow.
  • the constant region derived from human immunoglobulin has a unique amino acid sequence depending on the isotype, such as IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (e.g., IgA1, IgA2), IgD, and IgE, but the constant region of the recombinant chimeric antibody of the present disclosure may be the constant region of human immunoglobulin belonging to any isotype. Preferably, it is the constant region of human IgG.
  • An expression vector can be produced using the gene of the chimeric antibody produced in this way.
  • a host cell is transformed with the expression vector to obtain a transformed cell that produces a chimeric antibody, and the transformed cell is cultured to obtain the desired chimeric antibody from the culture supernatant.
  • the anti-AdipoR antibody of the present disclosure is a humanized antibody.
  • the "humanized antibody” is an antibody in which only the amino acid sequence of the antigen-binding site (CDR; also called the complementarity determining region) of a non-human animal antibody such as a mouse is transplanted into a human antibody gene, i.e., CDR grafting is performed.
  • CDR antigen-binding site
  • the antibody can be prepared by referring to the methods described in JP-A-4-506458 and JP Patent No. 2912618.
  • the humanized antibody refers to a humanized antibody in which some or all of the CDRs are CDRs derived from a monoclonal antibody of a non-human animal such as a mouse, rat, hamster, or chicken, all or part of the framework region of the variable region is a framework region of the variable region derived from human immunoglobulin, and the constant region is a constant region derived from human immunoglobulin.
  • the humanized antibody disclosed herein can be produced, for example, as follows. However, it goes without saying that the production method is not limited to this.
  • amino acid residues in the framework regions of a human antibody may be replaced with the corresponding residues from the CDR donor antibody.
  • Substitutions in the framework regions may be performed by methods known in the art, such as those described in Riechmann et al., Nature 1988 Mar 24;332(6162):323-327.
  • framework region amino acid residues important for antigen binding may be identified by modeling the interactions of the CDR and framework region amino acid residues.
  • unusual framework region amino acid residues at specific positions may be identified by sequence comparison. Humanization may also be performed by the methods described in Nishibori et al., Mol Immunol. 2006 Feb;43(6):634-42.
  • the human heavy chain gene with the amino acid sequence of the isolated mouse heavy chain CDR portion transplanted is introduced into an appropriate expression vector so that it can be expressed, and similarly, the human light chain gene with the amino acid sequence of the mouse light chain CDR portion transplanted is introduced into another appropriate expression vector so that it can be expressed.
  • the human heavy chain and light chain genes with the amino acid sequence of the mouse CDR portion transplanted can be introduced into the same expression vector so that they can be expressed.
  • a humanized antibody-producing transformed cell is obtained by transforming a host cell with the expression vector prepared in this way, and the desired humanized antibody is obtained from the culture supernatant by culturing the transformed cell.
  • a human antibody is an antibody in which all regions constituting the immunoglobulin, including the heavy chain variable region, heavy chain constant region, and light chain variable region, light chain constant region, are immunoglobulins derived from genes encoding human immunoglobulins, and can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse.
  • a transgenic animal produced by incorporating at least a human immunoglobulin gene into the gene locus of a non-human animal such as a mouse or chicken can be produced by immunizing the animal with an antigen in the same manner as the above-mentioned method for producing a monoclonal antibody.
  • transgenic mice producing human antibodies can be prepared according to the methods described in Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997; Published Japanese Translation of PCT International Publication No. 4-504365; Published Japanese Translation of PCT International Publication No. 7-509137; International Publication WO 94/25585; Nature, Vol. 368, p. 856-859, 1994; and Published Japanese Translation of PCT International Publication No. 6-500233. More specifically, examples of such mice include HuMab (registered trademark) mice (Medarex, Princeton NJ), KM mice (Kirin Pharma Company, Japan), and KM (FC ⁇ RIIb-KO) mice.
  • anti-adiponectin receptor antibodies include anti-AdipoR antibodies in which LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 18, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or 20, LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the anti-AdipoR antibody of the present disclosure is a) an anti-AdipoR antibody, in which LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, or b) an anti-AdipoR antibody, wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; Examples include:
  • one to several amino acids may be substituted in one or more of these CDRs.
  • one to several means, for example, one, two, or three.
  • the amino acid substitution is preferably a conservative substitution.
  • conservative substitution means replacing an amino acid residue with another chemically similar amino acid residue so as not to substantially alter the activity of the peptide.
  • a hydrophobic residue may be replaced with another hydrophobic residue, or a polar residue may be replaced with another polar residue having the same charge.
  • Examples of functionally similar amino acids that can be substituted in this way include non-polar or hydrophobic amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • Polar or neutral amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • Positively charged or basic amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • Negatively charged or acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • maintaining the characteristics of an antibody refers to maintaining these characteristics to the same extent as before the amino acid sequence modification of the CDR, for example, at 80% or more, preferably 90% or more, and more preferably 95% or more. Note that “maintaining” also includes improving.
  • the regions other than the CDRs are not particularly limited as long as they maintain the structure of an antibody and have a sequence that can exert its function, and may be any of mouse-derived sequences, human-derived sequences, sequences derived from other mammals, chicken-derived sequences, chimeric sequences thereof, and artificial sequences.
  • constant regions examples of the amino acid sequences of the heavy and light chain constant regions are those described in Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982, and Cell vol.22, p197, 1980.
  • anti-AdipoR antibodies disclosed herein include mouse antibodies in which the light chain variable region and the heavy chain variable region consist of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively, or contain the same amino acid sequences.
  • mouse-human chimeric antibodies include anti-AdipoR antibodies whose light chain variable region and heavy chain variable region consist of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28, respectively, or contain the same amino acid sequences.
  • humanized antibodies in which the regions other than the CDRs are of human origin.
  • Such humanized antibodies include a) an anti-AdipoR antibody whose light chain variable region and heavy chain variable region consist of or contain the amino acid sequences of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30, respectively; b) an anti-AdipoR antibody whose light chain variable region and heavy chain variable region consist of or contain the amino acid sequences of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32, respectively; c) an anti-AdipoR antibody whose light chain variable region and heavy chain variable region consist of or contain the amino acid sequences of SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34, respectively; d) anti-AdipoR antibodies whose light chain variable region and heavy chain variable region consist of or contain the amino acid sequences of SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36, respectively; and e) an anti-AdipoR antibody whose light chain variable region and heavy chain variable region consist of or contain the amino acid sequences of SEQ ID NO: 37
  • the anti-AdipoR antibody comprises: a-1) an anti-AdipoR antibody whose heavy and light chains consist of or contain the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 25 and 26, respectively; b-1) an anti-AdipoR antibody whose heavy and light chains consist of or contain the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively; c-1) an anti-AdipoR antibody whose heavy and light chains consist of or contain the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively; d-1) an anti-AdipoR antibody whose heavy and light chains consist of or contain the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, respectively; and e-1) an anti-AdipoR antibody whose heavy and light chains consist of or contain the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 11 and 12, respectively; f-1) an anti-AdipoR antibody whose heavy and light chains consist of or contain the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 11 and 12, respectively; f-
  • the heavy chain variable region and/or light chain variable region of the amino acid sequence of the anti-AdipoR antibody may have one or several amino acids, specifically, 1 to 20, 1 to 10, or 1 to 5 substitutions, deletions, additions, or insertions, as long as the property of binding to AdipoR1 and activating AMPK signaling, and/or binding to AdipoR2 and activating PPAR ⁇ signaling is maintained.
  • substitutions, deletions, and additions may be introduced into the CDRs, but are preferably introduced into regions other than the CDRs.
  • the amino acid substitutions are preferably conservative substitutions in order to maintain the properties of the present disclosure.
  • the amino acid sequence of the anti-AdipoR antibody of the present disclosure which includes substitutions, deletions, etc. in the light chain variable region and/or heavy chain variable region, may be an amino acid sequence in which the light chain variable region has 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, the amino acid sequence of SEQ ID NO:27, the amino acid sequence of SEQ ID NO:29, the amino acid sequence of SEQ ID NO:31, the amino acid sequence of SEQ ID NO:33, the amino acid sequence of SEQ ID NO:35, or the amino acid sequence of SEQ ID NO:37.
  • the heavy chain variable region may be an amino acid sequence in which the heavy chain variable region has 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, the amino acid sequence of SEQ ID NO:28, the amino acid sequence of SEQ ID NO:30, the amino acid sequence of SEQ ID NO:32, the amino acid sequence of SEQ ID NO:34, the amino acid sequence of SEQ ID NO:36, or the amino acid sequence of SEQ ID NO:38.
  • the anti-AdipoR antibody of the present disclosure also has a light chain that is 90% or more identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO:25, the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, the amino acid sequence of SEQ ID NO:11, the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, or the amino acid sequence of SEQ ID NO:15, more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, and even more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and even more preferably 10 ...
  • the heavy chain may be an anti-AdipoR antibody having an amino acid sequence having an identity of 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more, with the amino acid sequence of SEQ ID NO:26, the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, the amino acid sequence of SEQ ID NO:10, the amino acid sequence of SEQ ID NO:12, the amino acid sequence of SEQ ID NO:14, or the amino acid sequence of SEQ ID NO:16.
  • the anti-AdipoR antibodies disclosed herein include multispecific antibodies, functionally modified antibodies, and conjugated antibodies that have a CDR consisting of the specific amino acid sequence described above, or a variable region consisting of the specific amino acid sequence described above.
  • the anti-AdipoR antibody disclosed herein can be combined with an antibody having an antigen-binding specificity other than AdipoR by genetic engineering techniques to produce a multispecific antibody such as a bispecific antibody.
  • genetic engineering techniques have already been established in this field.
  • the desired bispecific antibody can be obtained by using the DVD-Ig technology described in Wu et al., Nature Biotechnology 25(11), 1290(2007) in which variable regions are linked in series, or the ART-Ig technology described in Kitazawa et al., Nature Medicine 18(10), 1570(2012) in which the heavy chains of two types of antibodies that bind to different antigens are combined by modifying the Fc region of the antibody.
  • a functionally modified antibody can be mentioned as an example of a modified molecule of the anti-AdipoR antibody of the present disclosure.
  • a functionally modified antibody refers to an antibody whose functions, such as cell killing function, complement activation function, and blood half-life extension function, have been modified by modifying the antibody sequence, glycan, etc. See, for example, Shitara Kenya, Yakugaku Zasshi, 2009, Vol. 129(1), p. 3; Ishii Akiko et al., Nihon Yakurigaku Zasshi, 2010, Vol. 136(5), p. 280; Hashiguchi Shuhei et al., Seikagaku, 2010, Vol. 82(8), p. 710, etc.
  • Anti-AdipoR antibody with modified functions is prepared by the following method. For example, when the anti-AdipoR antibody of the present disclosure is produced using CHO cells in which the ⁇ 1,6-fucosyltransferase (FUT8) gene has been destroyed as the host cell, an antibody with a reduced fucose content in the glycan and enhanced cell killing function is obtained, and when the antibody is produced using CHO cells in which the FUT8 gene has been introduced as the host cell, an antibody with reduced cell killing function is obtained. For example, see International Publication Nos. WO 2005/035586, WO 2002/31140, WO 00/61739, etc. In addition, complement activation function can be regulated by modifying amino acid residues in the Fc region.
  • FUT8 ⁇ 1,6-fucosyltransferase
  • Conjugate antibodies are examples of modified molecules of the anti-AdipoR antibody of the present disclosure.
  • conjugate antibodies include conjugate antibodies in which functional molecules other than the anti-AdipoR antibody of the present disclosure, such as non-peptide polymers such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, toxins, low molecular weight compounds, cytokines, growth factors, albumin, enzymes, and other antibodies, are chemically or genetically bonded to the anti-AdipoR antibody.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEG When PEG is attached as a functional molecule, any commonly used PEG may be used, and it may be either linear or branched. PEG can be attached to the amino group of an antibody, for example, by using an NHS active group.
  • radioactive substance When a radioactive substance is used as the functional molecule, 131 I, 125 I, 90 Y, 64 Cu, 99 Tc, 77 Lu, 211 At, etc. are used.
  • the radioactive substance can be directly bound to the antibody by the chloramine T method or the like.
  • luciferases such as firefly luciferase and bacterial luciferase
  • malate dehydrogenase urease
  • peroxidases such as horseradish peroxidase (HRPO), alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucoamylase, lysozyme
  • saccharide oxidases such as glucose oxidase, galactose oxidase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • heterocyclic oxidases such as uricase and xanthine oxidase, lactoperoxidase, microperoxidase, etc.
  • linkers used for chemically binding toxins, low molecular weight compounds, or enzymes include linkers represented by the following divalent radicals: alkylene, arylene, heteroarylene, etc. --( CR2 )nO( CR2 )n-, where R is an optional substituent and n is a positive integer; repeating units of alkoxy, such as polyethyleneoxy, PEG, and polymethyleneoxy; alkylamino, such as polyethyleneamino, JeffamineTM, etc.; and diacid esters and amides, such as succinate, succinamide, diglycolate, malonate, and caproamide. Chemical modification methods for binding functional molecules have already been established in this field.
  • the "antigen-binding fragment" of the anti-AdipoR antibody in the present disclosure means a partial region of the antibody having antigen-binding ability as described above, and specifically includes F(ab') 2 , Fab', Fab, Fv (variable fragment of antibody), disulfide-linked Fv, single-chain antibody (scFv), polymers thereof, etc.
  • the antigen-binding fragment includes conjugated antigen-binding fragments to which functional molecules other than the anti-AdipoR antibody of the present disclosure are chemically or genetically bound, such as non-peptide polymers such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, toxins, low molecular weight compounds, cytokines, growth factors (TGF- ⁇ , NGF, Neurotrophin, etc.), albumin, enzymes, other antibodies, etc.
  • non-peptide polymers such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, toxins, low molecular weight compounds, cytokines, growth factors (TGF- ⁇ , NGF, Neurotrophin, etc.), albumin, enzymes, other antibodies, etc.
  • F(ab') 2 " and "Fab” refer to antibody fragments produced by treating immunoglobulin with protease such as pepsin or papain, and digesting the antibody fragments before and after the disulfide bond between the two heavy chains in the hinge region.
  • protease such as pepsin or papain
  • IgG is treated with papain, it is cleaved upstream of the disulfide bond between the two heavy chains in the hinge region to produce two homologous antibody fragments in which a light chain consisting of VL (light chain variable region) and CL (light chain constant region) and a heavy chain fragment consisting of VH (heavy chain variable region) and CH ⁇ 1 ( ⁇ 1 region in the heavy chain constant region) are linked by a disulfide bond at the C-terminal region.
  • VL light chain variable region
  • CL light chain constant region
  • VH heavy chain variable region
  • CH ⁇ 1 ⁇ 1 region in the heavy chain constant region
  • Each of these two homologous antibody fragments is called Fab.
  • IgG When IgG is treated with pepsin, it is cleaved downstream of the disulfide bond between the two heavy chains in the hinge region to produce an antibody fragment that is slightly larger than the one in which the two Fabs are linked by the hinge region. This antibody fragment is called F(ab') 2 .
  • Conjugated antigen-binding fragments are examples of modified molecules of the antigen-binding fragments of the anti-AdipoR antibodies of the present disclosure.
  • conjugated antigen-binding fragments include conjugated antigen-binding fragments in which functional molecules other than the anti-AdipoR antibodies of the present disclosure, such as non-peptide polymers such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, toxins, low molecular weight compounds, cytokines, growth factors, albumin, enzymes, and other antibodies, are chemically or genetically bonded to a partial region of the anti-AdipoR antibody that has antigen-binding activity.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEG When PEG is attached as a functional molecule, any commonly used PEG may be used, and it may be either linear or branched. PEG can be attached to the amino group of the anti-AdipoR antibody, for example, by using an NHS active group.
  • radioactive substance When a radioactive substance is used as the functional molecule, 131 I, 125 I, 90 Y, 64 Cu, 99 Tc, 77 Lu, 211 At, etc. are used.
  • the radioactive substance can be directly bound to a part of the region having antigen-binding ability of the anti-AdipoR antibody by the chloramine T method or the like.
  • luciferases such as firefly luciferase and bacterial luciferase
  • malate dehydrogenase urease
  • peroxidases such as horseradish peroxidase (HRPO), alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucoamylase, lysozyme
  • saccharide oxidases such as glucose oxidase, galactose oxidase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • heterocyclic oxidases such as uricase and xanthine oxidase (), lactoperoxidase, microperoxidase, etc.
  • linkers used for chemically binding toxins, low molecular weight compounds or enzymes include divalent radicals such as alkylene, arylene, heteroarylene, etc., linkers represented by -( CR2 )nO( CR2 )n-, where R is an optional substituent and n is a positive integer, repeating units of alkoxy, such as polyethyleneoxy, PEG, polymethyleneoxy, etc., alkylamino, such as polyethyleneamino, JeffamineTM, etc., and diacid esters and amides, such as succinate, succinamide, diglycolate, malonate, caproamide, etc. Chemical modification methods for binding functional molecules have already been established in this field.
  • the anti-AdipoR antibody containing a CDR or variable region having a specific amino acid sequence preferably has a constant region that is a constant region of human IgG, such as IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4, in order to maintain a long half-life in the blood.
  • the anti-AdipoR antibodies and antigen-binding fragments thereof of the present disclosure also include anti-AdipoR antibodies and antigen-binding fragments thereof that compete with an antibody having the above-mentioned specific CDR amino acid sequence in binding to AdipoR, i.e., AdipoR1 and/or AdipoR2, as long as the property of binding to AdipoR1 and activating AMPK signaling and/or binding to AdipoR2 and activating PPAR ⁇ signaling is maintained.
  • Examples of antibodies that compete with an antibody having the above-mentioned specific CDR amino acid sequence in binding to AdipoR include antibodies having an epitope in the same region of AdipoR as an antibody having the above-mentioned specific CDR amino acid sequence.
  • the antibody can be obtained (screened) and evaluated by allowing the antibody having the above-mentioned CDR sequence to coexist with AdipoR in a binding system, for example, by screening using a flow cytometry method.
  • Anti-AdipoR antibodies that compete with anti-AdipoR antibodies containing the amino acid sequence of the specific CDRs described above for binding to AdipoR, i.e., AdipoR1 and/or AdipoR2 may be antibodies derived from any animal, such as mouse antibodies, human antibodies, rat antibodies, rabbit antibodies, goat antibodies, and camel antibodies, or may be chimeric antibodies or humanized antibodies that are combinations of these antibodies, but are preferably chimeric antibodies, humanized antibodies, or human antibodies.
  • the anti-AdipoR antibody or antibody fragment thereof of the present disclosure can be produced, for example, using a transformant or host cell containing a recombinant vector that includes the following nucleic acid molecule that encodes the anti-AdipoR antibody or antibody fragment thereof of the present disclosure.
  • nucleic acid molecule that is a polynucleotide encoding the anti-AdipoR antibody or an antibody fragment thereof of the present disclosure.
  • nucleic acid molecule contains the above-mentioned CDR, variable region, or full-length amino acid sequence and encodes a polypeptide having the property of binding to AdipoR1 and activating AMPK signaling, and/or binding to AdipoR2 and activating PPAR ⁇ signaling.
  • nucleic acid molecule examples include: a) a light chain variable region and a heavy chain variable region, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; b) a light chain variable region and a heavy chain variable region, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; c) a light chain variable region and a heavy chain variable region, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30; d) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, which are a light chain variable region and a heavy chain variable region; e) a light chain variable region and a heavy chain variable region, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; f) a light chain variable region and a heavy chain variable region, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 and the amino acid sequence of SEQ ID NO
  • nucleic acid molecules of the present disclosure include: a) the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 25 and 26, which are light and heavy chains; b) the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, which are the light and heavy chains; c) the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, which are the light and heavy chains; d) the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, which are the light and heavy chains; e) the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 11 and 12, which are the light and heavy chains; f) the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 13 and 14, which are light and heavy chains, and g) Polynucleotides comprising base sequences encoding the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 15 and 16, respectively, which are the light chain and the heavy chain.
  • nucleic acid molecules of the present disclosure include: A polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 39, which encodes the full-length light chain of an anti-AdipoR antibody, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 40, which encodes the full-length heavy chain of an anti-AdipoR antibody; A polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 41 encoding the full-length light chain of an anti-AdipoR antibody, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 42 encoding the full-length heavy chain of an anti-AdipoR antibody; A polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 43 encoding the full-length light chain of an anti-AdipoR antibody, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 44 encoding the full-length heavy chain of an anti-AdipoR antibody; A polynu
  • the nucleic acid molecule of the present disclosure may contain a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a complementary strand DNA of the base sequence of the heavy chain variable region or the light chain variable region, so long as it encodes an anti-AdipoR monoclonal antibody that binds to AdipoR1 and activates AMPK signaling, and/or binds to AdipoR2 and activates PPAR ⁇ signaling.
  • stringent conditions include, for example, conditions in which Southern hybridization is followed by washing at 68°C, 0.1xSSC, and a salt concentration equivalent to 0.1% SDS.
  • the nucleic acid molecule of the present disclosure may encode all of the heavy and light chain constant regions and variable regions, or may encode only the heavy and light chain variable regions.
  • the base sequences of the heavy and light chain constant regions are preferably those described in Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982, and Cell vol.22, p197, 1980.
  • the nucleic acid molecule of the present disclosure can be obtained, for example, by the following method. First, total RNA is prepared from cells such as hybridomas using a commercially available RNA extraction kit, and cDNA is synthesized by reverse transcriptase using random primers or the like. Next, cDNA encoding an antibody is amplified by PCR using oligonucleotides of sequences conserved in the variable regions of known human antibody heavy chain genes and light chain genes as primers. The sequence encoding the constant region can be obtained by amplifying a known sequence by PCR. The base sequence of the DNA can be determined by a conventional method, such as by incorporating it into a plasmid for sequencing. Alternatively, DNA encoding the monoclonal antibody of the present disclosure can be obtained by chemically synthesizing the sequence of the variable region or a portion thereof and linking it to a sequence containing the constant region.
  • the present disclosure also provides recombinant vectors comprising the nucleic acid molecules of the present disclosure and transformants or host cells comprising the recombinant vectors.
  • the recombinant vector may be a vector capable of being expressed in a prokaryotic cell such as Escherichia coli, for example, pBR322, pUC119, or a derivative thereof, but is preferably a vector capable of being expressed in a eukaryotic cell, and more preferably a vector capable of being expressed in a cell derived from a mammal.
  • vectors capable of being expressed in a cell derived from a mammal include plasmid vectors such as pcDNA3.1, pConPlus, pcDM8, pcDNA I/Amp, pcDNA3.1, and pREP4 manufactured by Invitrogen, and viral vectors such as pDON-AI DNA manufactured by Takara Bio.
  • the vector may be one vector containing a heavy chain coding sequence and a light chain coding sequence, or two vectors, one containing a heavy chain coding sequence and the other containing a light chain coding sequence.
  • the transformant into which the recombinant vector of the present disclosure is introduced may be a prokaryotic cell such as Escherichia coli or Bacillus subtilis, but is preferably a eukaryotic cell, and more preferably a cell derived from a mammal.
  • Examples of cells derived from a mammal include Chinese hamster ovary cells (CHO cells), COS, myeloma, BHK, HeLa, Vero, 293, NS0, Namalwa, YB2/0, etc.
  • Anti-AdipoR antibodies and antigen-binding fragments thereof obtained by the methods described in the specification or known methods can be purified to homogeneity. Separation and purification of antibodies and the like can be performed using methods used for separating and purifying proteins. For example, chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. can be appropriately selected and combined to separate and purify antibodies. For example, see Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, but are not limited to these. Examples of columns used in affinity chromatography include protein A columns, protein G columns, anti-immunoglobulin antibody binding columns, and antigen binding columns. For example, examples of Protein A columns include Hyper D, POROS, and Sepharose F. F. (Amersham Biosciences).
  • One embodiment of the present disclosure is a pharmaceutical composition comprising an anti-AdipoR antibody or antibody fragment thereof according to the above embodiments of the present disclosure.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure is not particularly limited in terms of other components, so long as it contains the anti-AdipoR antibody or antibody fragment of the present disclosure, and may contain, for example, a pharmacologically acceptable carrier.
  • Pharmacologically acceptable carriers are appropriately selected depending on the dosage form of the pharmaceutical composition, and examples include excipients, lubricants, binders, and disintegrants in solid preparations, and solvents, solubilizers, suspending agents, isotonicity agents, buffers, and soothing agents in liquid preparations. Furthermore, conventional additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners, adsorbents, and wetting agents can also be used in appropriate amounts as needed.
  • Dosage forms for parenteral administration of pharmaceutical compositions include, for example, infusion injections, intravenous injections, intramuscular injections, subcutaneous injections, intradermal injections, preparations for intracerebral administration, and preparations for intraspinal administration, as well as topical preparations such as ointments, poultices, and lotions, suppositories, inhalants, eye preparations, eye ointments, nasal drops, ear drops, and liposome preparations.
  • injectable formulations are usually prepared by dissolving the antibody in distilled water for injection, but solubilizers, buffers, pH adjusters, isotonicity agents, soothing agents, preservatives, stabilizers, etc. can be added as necessary. They can also be made into lyophilized formulations for preparation just before use.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition for oral administration may be a solid or liquid dosage form, specifically, a tablet, a coated tablet, a pill, fine granules, granules, powders, capsules, syrups, emulsions, suspensions, injections, troches, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure may further contain other therapeutically effective drugs, and may also contain ingredients such as bactericides, anti-inflammatory agents, vitamins, and amino acids, as necessary.
  • the pharmaceutical composition containing the anti-AdipoR antibody of the present disclosure can be used to treat or prevent adiponectin-related diseases.
  • One embodiment of the present disclosure is a pharmaceutical composition for treating or preventing an adiponectin-related disease, comprising an anti-AdipoR antibody or an antibody fragment thereof according to the above-described embodiment of the present disclosure.
  • One embodiment of the present disclosure is a method for treating or preventing an adiponectin-related disease, comprising the step of administering to a subject an effective amount of an anti-AdipoR antibody or antibody fragment thereof according to any of the above-mentioned embodiments of the present disclosure, or a pharmaceutical composition containing the anti-AdipoR antibody or antibody fragment thereof.
  • One embodiment of the present disclosure is the use of an anti-AdipoR antibody or an antibody fragment thereof according to any of the above-described embodiments of the present disclosure, or a pharmaceutical composition comprising the anti-AdipoR antibody or an antibody fragment thereof, for the manufacture of a medicament for treating or preventing an adiponectin-related disease.
  • One embodiment of the present disclosure is an anti-AdipoR antibody or an antibody fragment thereof according to the above-described embodiment of the present disclosure, or a pharmaceutical composition comprising the anti-AdipoR antibody or an antibody fragment thereof, for treating or preventing an adiponectin-related disease.
  • Adiponectin-related diseases are not particularly limited as long as they are diseases or symptoms that can occur due to abnormalities in the adiponectin signal pathway, and include diseases and symptoms that can occur due to decreased activation of the signal pathway mediated by the adiponectin receptor due to a decrease in the amount of adiponectin or functional abnormalities of the adiponectin molecule.
  • it is a disease caused by a decrease in the action of adiponectin, which leads to a decrease in activation of AMPK signaling and/or a decrease in activation of PPAR ⁇ signaling, and examples thereof include diseases caused by a decrease in adiponectin concentration, a decrease in the formation of adiponectin multimers required for activity, etc.
  • a decrease in adiponectin concentration can be caused by a decrease in production in adipocytes, which are the main adiponectin-producing cells, i.e., hypertrophy of adipocytes observed in obesity, etc., inhibition of production by drugs, or a decrease in the adipocytes themselves.
  • adiponectin-related diseases include obesity-related diseases, metabolic syndrome, dyslipidemia, type 2 diabetes, nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), NASH, arteriosclerosis, myocardial infarction, cerebral infarction, cancer, psoriasis, chronic kidney disease, alopecia, liver cirrhosis, pancreatitis, cardiomyopathy, systemic sclerosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and pulmonary fibrosis.
  • NAFLD nonalcoholic fatty liver disease
  • MAFLD metabolic dysfunction-associated fatty liver disease
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • obesity-related diseases, metabolic syndrome, type 2 diabetes, NASH, myocardial infarction, cerebral infarction, cancer, psoriasis, chronic kidney disease, liver cirrhosis, pancreatitis, cardiomyopathy, systemic sclerosis, COPD, and pulmonary fibrosis are included, more preferably, obesity-related diseases, metabolic syndrome, type 2 diabetes, and NASH are included, and even more preferably, NASH is included.
  • the AdipoR agonist action of the anti-AdipoR antibodies promotes or improves sugar and lipid metabolism, and through lowering blood glucose levels and improving insulin resistance, can exert therapeutic and preventive effects on adiponectin-related diseases such as the above-mentioned obesity-related diseases, metabolic syndrome, dyslipidemia, type 2 diabetes, NAFLD, MAFLD, NASH, chronic kidney disease, and alopecia. Improvement of atherosclerosis has been reported in adiponectin transgenic mice generated from mice with atherosclerosis, such as ApoE KO mice. For example, see THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, p. 2461-2468, 2003.
  • arteriosclerosis arteriosclerotic heart disease in which arteriosclerosis is involved in the pathogenesis
  • ischemic heart disease such as myocardial infarction, and cerebral infarction
  • treatment and prevention of these diseases can be expected by activating the adiponectin action by administering anti-AdipoR antibodies.
  • Decreased blood adiponectin levels have been reported as a risk factor for endometrial cancer, colorectal cancer, and breast cancer. For example, see Obesity Research & Clinical Practice 13 (2019) 329-339. It has also been reported that administered adiponectin suppresses the proliferation of cancer cells in mouse tumor models. For example, see Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101:2476-2481.
  • activating adiponectin action by administering anti-AdipoR antibodies is expected to have therapeutic and preventive effects against cancer. It has been reported that in psoriasis model mice, administered adiponectin suppresses the T helper 17 immune response, which is the main player in the pathology of psoriasis. For example, see Nat Commun 6: 7687, 2015. Therefore, activating adiponectin action by administering anti-AdipoR antibodies is expected to have therapeutic and preventive effects against psoriasis.
  • the present invention can exert an effect of preventing the onset and suppressing the aggravation of complications caused by decreased adiponectin activity, such as diabetes, liver cirrhosis, pancreatitis, cardiomyopathy, etc.
  • adiponectin knockout scleroderma model mice skin sclerosis is significantly enhanced compared to wild-type model mice, and in adiponectin transgenic scleroderma model mice, skin sclerosis is significantly reduced compared to wild-type model mice.
  • adiponectin transgenic scleroderma model mice For example, see Scientific Reports, 2017, 7, 4397. Therefore, activating adiponectin action by administering anti-AdipoR antibodies is expected to have therapeutic and preventive effects against systemic scleroderma.
  • Adiponectin knockout mice develop a pathology similar to that of COPD with age, and administration of adiponectin suppresses the progression of emphysema. For example, see American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2011, 183, 1164-1175. Therefore, activating adiponectin action by administering anti-AdipoR antibodies is expected to have therapeutic and preventive effects against COPD.
  • Adiponectin administered to a mouse pulmonary fibrosis model significantly suppresses inflammatory cell infiltration and fibrosis. (See, for example, PLOS ONE 2015, 10, e0125169.) Therefore, activating adiponectin action by administering anti-AdipoR antibodies is expected to have therapeutic and preventive effects against pulmonary fibrosis.
  • the "subject" to which the compound is administered includes one or more of humans or non-human mammals, such as mice, guinea pigs, hamsters, rats, mice, rabbits, pigs, sheep, goats, cows, horses, cats, dogs, marmosets, monkeys, and chimpanzees.
  • the "subject” may be a patient diagnosed with an adiponectin-related disease or a subject at risk of developing an adiponectin-related disease.
  • Treatment includes any treatment of a disease in a mammal, particularly a human, and includes inhibiting a symptom of the disease, i.e., arresting its progression or eliminating the disease or condition, and alleviating a symptom of the disease, i.e., causing regression of the disease or condition, or slowing the progression of the condition.
  • Prevention includes preventing the onset of the above-mentioned diseases in mammals, particularly humans.
  • the administration form of the anti-AdipoR antibody or antigen-binding fragment thereof, or the pharmaceutical composition containing the anti-AdipoR antibody or antibody fragment thereof disclosed herein is not particularly limited, and it can be administered to mammals, including humans, by any of the following administration routes: oral administration, parenteral administration, such as intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration, intracerebral administration, intraspinal administration, and other local administration.
  • the dosage of the anti-AdipoR antibody or antigen-binding fragment thereof, or the pharmaceutical composition comprising the anti-AdipoR antibody or antibody fragment thereof of the present disclosure is determined by a physician based on various factors, such as the route of administration, type of disease, severity of symptoms, age, sex, and weight of the patient, severity of the disease, pharmacological knowledge such as pharmacokinetic and toxicological characteristics, whether or not a drug delivery system is used, and whether or not the antibody is administered as part of a combination of other drugs.
  • oral administration is 1 to 5,000 ⁇ g/day, preferably 10 to 2,000 ⁇ g/day, and more preferably 50 to 2,000 ⁇ g/day
  • injection administration is 1 to 5,000 ⁇ g/day, preferably 5 to 2,000 ⁇ g/day, and more preferably 50 to 2,000 ⁇ g/day, which can be administered in one or several divided doses.
  • 10 to 100,000 ⁇ g/kg of body weight more preferably 100 to 50,000 ⁇ g/kg, and even more preferably 500 to 20,000 ⁇ g/kg can be administered once a day, week, or month, or 1 to 7 times a year.
  • continuous infusion can usually be performed at a rate of 10 to 100,000 ⁇ g/day, more preferably 100 to 10,000 ⁇ g/day, and even more preferably 500 to 5,000 ⁇ g/day per adult, for example, an adult weighing 60 kg.
  • Example 1 Preparation of human AdipoR1 protein expressing cells
  • a vector was prepared to express both the human AdipoR1 protein, specifically, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the fluorescent protein EGFP gene as an expression marker, and stably expressing cells were established using NS0 cells and CHO cells. From each of the established NS0 cells and CHO cells, cells were selected that were confirmed to produce fluorescent protein by visual inspection and to express human AdipoR1 gene by quantitative PCR (the primers used are described below).
  • a membrane fraction was prepared, and Western blotting was performed using anti-human AdipoR1 polyclonal antibody (Immunobiological Laboratories), and cells that produced a large amount of human AdipoR1 were selected.
  • the cultured NS0 cells were used as an immunogen, and the CHO cells were used to screen the antibody titers of immunized animals and for human AdipoR1 protein-binding antibodies.
  • Example 2 Preparation of human AdipoR 2 protein expressing cells
  • a vector expressing both the human AdipoR 2 protein, specifically, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence table, and the EGFP gene as an expression marker was prepared, and stable expression cells were established using NS0 cells and CHO cells. From each of the established NS0 cells and CHO cells, cells in which the production of fluorescent protein by visual observation and the expression of the human AdipoR 2 gene by quantitative PCR (the primers used are described below) were confirmed were selected.
  • the binding of fluorescently labeled human plasma-derived adiponectin to cells was quantified using the 8200 Cellular Detection System (Applied Biosystems), and clones with a large amount of binding were selected.
  • the cultured NS0 cells were used as an immunogen, and the CHO cells were used for screening the antibody titer of immunized animals and human AdipoR 2 protein-binding antibodies.
  • Example 3 Preparation of mouse anti-human AdipoR monoclonal antibody 1-2 ⁇ 10 7 cells/animal of human AdipoR1 protein-expressing NS0 cells prepared in Example 1 were immunized at several subcutaneous sites on the back of AdipoR1 gene knockout mice or AdipoR1 gene and AdipoR2 gene knockout mice. Thereafter, the mice were immunized with AdipoR1-expressing NS0 in the same manner every 1-2 weeks, and blood was collected after several immunizations. The antibody titer was measured by flow cytometry using human AdipoR1 protein-expressing CHO cells and human AdipoR2 protein-expressing CHO cells prepared in Examples 1 and 2, which will be described later (Example 4).
  • the spleens were collected after immunization with human AdipoR1 protein-expressing NS0 at least once.
  • the human AdipoR2 protein-expressing NS0 cells prepared in Example 2 were immunized subcutaneously at several sites on the back of AdipoR2 gene knockout mice or AdipoR1 gene and AdipoR2 gene knockout mice.
  • the spleen cells of each individual were mixed with half of the mouse myeloma cells (SP2/0, Sumitomo Dainippon Pharma), centrifuged to obtain a precipitate, to which polyethylene glycol (Roche Applied Science) was added to perform cell fusion. The centrifuged cells were then washed twice with D-MEM (Invitrogen).
  • the cells were resuspended in GIT medium (Nihon Seiyaku) containing 10% fetal bovine serum (Invitrogen), 1% BM condimed H1 (Roche Diagnostics) and HAT (Sigma-Aldrich), and seeded on a 96-well plate at 5 x 104 myeloma cells/well.
  • GIT medium Nahon Seiyaku
  • BM condimed H1 Roche Diagnostics
  • HAT Sigma-Aldrich
  • the antibody-producing cells obtained in the screening were cloned by limiting dilution, and monoclonal antibody-producing hybridoma cells that bind to 17 types of human AdipoR protein-expressing CHO cells were selected (Table 1).
  • Example 4 Measurement of antibody binding by flow cytometry using human AdipoR1 protein-expressing CHO cells and human AdipoR2 protein-expressing CHO cells
  • the cells cultured for a certain period were treated with accutase (Innovative Cell technologies, Inc.), dispersed, washed with PBS (assay buffer) containing 0.25% BSA and 0.05% NaN 3 , and reacted with serum or hybridoma culture supernatant diluted 100-fold with assay buffer at 4°C.
  • PBS assay buffer
  • the cells were washed with assay buffer and reacted with Allophycocyanin-conjugated anti-mouse IgG+IgM polyclonal antibody (Allophycocyanin-conjugated AffiPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L), Jackson ImmunoResearch Laboratories) at 4°C. After a certain period, the cells were washed with assay buffer, suspended again in assay buffer, and measured by flow cytometer. The host cells (CHO cells) were also measured in the same manner.
  • Allophycocyanin-conjugated anti-mouse IgG+IgM polyclonal antibody Allophycocyanin-conjugated AffiPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L), Jackson ImmunoResearch Laboratories
  • Example 5 Purification of monoclonal antibodies from hybridoma culture supernatants Culture supernatants of hybridoma cells producing monoclonal antibodies that bind to human AdipoR protein-expressing CHO cells selected in Example 3 were prepared, and for IgG, the culture supernatants were applied to an affinity column immobilized with Anti-Mouse IgG (Sigma-Aldrich) or an affinity column immobilized with Protein A (GE Healthcare), washed with phosphate buffer, and then eluted with 10m-100 mM glycine hydrochloride (pH 2.7-3.0) and promptly neutralized. The eluted neutralizing solution was then replaced with PBS using an ultrafiltration membrane.
  • Anti-Mouse IgG Sigma-Aldrich
  • Protein A GE Healthcare
  • the endotoxin was repurified using an endotoxin removal column so that the endotoxin concentration was 0.5 EU/mg or less.
  • the culture supernatant was applied to an affinity column (Sigma-Aldrich) with immobilized Anti-Mouse IgM, washed with phosphate buffer, then eluted with 10 mM glycine hydrochloride (pH 2.7), and immediately neutralized. The eluted neutralizing solution was then replaced with PBS using an ultrafiltration membrane.
  • the culture supernatant was applied to an affinity column (Kanto Chemical) mainly composed of MGPP, washed with 10 mM phosphate buffer pH 6.8 containing 200 mM sodium chloride, then eluted with 300 mM phosphate buffer (pH 6.8), and replaced with PBS using an ultrafiltration membrane. If necessary, the supernatant was repurified using an endotoxin removal column so that the endotoxin concentration was 0.5 EU/mg or less.
  • the isotypes of the purified antibodies were examined using an isotyping kit (IsoStrip Mouse Monoclonal antibody Isotyping Kit, Oral Diagnostics). All of the light chains were ⁇ , most of the heavy chains were mouse IgM, and there were four IgGs (Table 1).
  • Example 6 Measurement of binding activity of purified mouse antibodies by flow cytometry using human AdipoR1 protein-expressing CHO cells and human AdipoR2 protein-expressing CHO cells The binding activity of the mouse antibodies purified in Example 5 to human AdipoR1 protein-expressing CHO cells and human AdipoR2 protein-expressing CHO cells was measured in the same manner as in Example 4. 15 types of antibodies were found to specifically bind to both AdipoR1 protein-expressing CHO cells and human AdipoR2 protein-expressing CHO cells (Table 1). A representative example, 10-127D11, is shown in Figure 1.
  • Example 7 Detection of AMPK Phosphorylation Using the antibody purified in Example 5, AMPK phosphorylation activity, which is a representative downstream signal of AdipoR activation by adiponectin, was examined.
  • Mouse myoblasts C2C12 were cultured in a medium containing 2% horse serum, differentiated into myotubes, and then reacted with adiponectin or antibodies in serum-free medium to prepare lysates of the cells.
  • the phosphorylated AMPK and AMPK contents in the lysates were measured by Western blotting using a phosphorylated AMPK antibody (Cell Signaling Technology) and an AMPK antibody (Cell Signaling Technology), and the amount of phosphorylated AMPK per AMPK was calculated.
  • mouse adiponectin (Biovendor) significantly increased the amount of phosphorylated AMPK per AMPK compared to the solvent control, and AMPK phosphorylation activity was detected (Figure 2).
  • five types significantly increased the amount of phosphorylated AMPK per AMPK compared to the control antibody, and AMPK phosphorylation activity was detected. Of these, only 10-127D11 was an IgG type (Table 1) ( Figure 2).
  • the immunogen shown in the table is NS0 cells expressing AdipoR. Binding activity was evaluated as present (+) if the binding to CHO cells expressing AdipoR1 or AdipoR2 at a purified antibody concentration of 10 ⁇ g/mL was higher than when CHO cells were used, and not present (-) if there was no change. AMPK activation was evaluated as present (+) if the phosphorylated AMPK/AMPK value when tested at an antibody concentration of 10 ⁇ g/mL was significantly higher than the value of the control antibody, and not present (-) if there was no significant difference.
  • RNA was extracted from hybridoma cells producing the AdipoR agonist antibody 10-127D11. Using the total RNA as a template, cDNA encoding the antibody gene was synthesized by reverse transcription. Furthermore, using these as templates, genes of the light chain variable region and the heavy chain variable region of the antibody were PCR amplified and cloned into an E. coli plasmid. The cloned gene sequence was amplified by PCR and sequenced to determine the DNA sequence of the variable region of the mouse monoclonal antibody 10-127D11. The amino acid sequence encoded by the determined DNA sequence was as follows.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region is ETTVTQSPASLSMAIGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIENMLSEDVADYYCLQSDNLPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC Heavy chain variable region amino acid sequence, that is, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing: DVKLVESGEGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGDYIYYADTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRALEAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGD
  • Example 9 Preparation of Mouse Recombinant Antibody A recombinant mouse antibody of hybridoma-derived anti-AdipoR antibody 10-127D11 was prepared. Hereinafter, it is referred to as "r127D11".
  • DNA encoding the light and heavy chains of the hybridoma-derived antibodies was inserted into pcDNA3.4 (Thermo Fisher SCIENTIFC) to prepare an expression vector.
  • the expression vector was introduced into Expi293F cells (Thermo Fisher SCIENTIFC) using the ExpiFectamine 293 Transfection Kit (Thermo Fisher SCIENTIFC). The cells were cultured at 37°C and 8% carbon dioxide for 4 to 6 days, and the culture supernatant was collected.
  • the recombinant antibodies were purified by applying the culture supernatant to an affinity column AF-rProtein A HC-650F (Tosoh) or Ab-Capcher ExTra (Protenova) immobilized with Protein A.
  • the antibodies bound to the column were washed with PBS, eluted with 100 mM glycine hydrochloride (pH 3.5), and promptly neutralized and replaced with PBS. If it was necessary to increase the purity depending on the purpose of use, the antibody after purification with the Protein A immobilized column was purified with a Ceramic Hydroxyapatite Type 1 (CHT) column (BIORAD).
  • CHT Ceramic Hydroxyapatite Type 1
  • the antibody bound to the CHT column was washed with 10 or 50 mM Na 2 PO 4 (pH 6.5), 100 mM NaCl, and then linear gradient eluted with 10 or 50 mM Na 2 PO 4 (pH 6.5), 2000 mM NaCl. The eluted fraction was collected and replaced with PBS.
  • Example 10 Design of humanized antibody First, a mouse-human chimeric antibody WT was designed in which the amino acid sequences of the light and heavy chain variable regions of the mouse anti-AdipoR antibody 10-127D11, i.e., the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively, in the Sequence Listing, were grafted into the variable regions of a human IgG4 antibody.
  • human antibody sequences with high homology to the amino acid sequences of the light and heavy chain variable regions of the mouse anti-AdipoR antibody 10-127D11 were selected, and the CDR sequences of the mouse anti-AdipoR antibody 10-127D11 were grafted to the CDR sequence portions of the selected human antibody sequences to design humanized antibodies of the mouse anti-AdipoR antibody 10-127D11.
  • the CDRs were defined by Kabat.
  • rH127D11 (ver.1), rH127D11 (ver.2), rH127D11 (ver.3), rH127D11 (ver.4), and rH127D11 (MTPC)
  • the amino acid sequences of the light chain, heavy chain, light chain variable region, heavy chain variable region, and CDR sequences of each clone are shown in Table 2.
  • the nucleic acid sequences encoding the light chain and heavy chain of each clone are shown in Table 3.
  • Example 11 Preparation of mouse-human chimeric antibody and humanized antibody
  • the DNA of the designed mouse-human chimeric antibody WT and humanized antibody was introduced into Lonza CHOK1SV GS system, and culture supernatant was prepared.
  • the DNA of the partially humanized antibody was inserted into pcDNA3.4 (Thermo Fisher SCIENTIFC) to prepare an expression vector.
  • the expression vector was introduced into Expi293F cells (Thermo Fisher SCIENTIFC) using ExpiFectamine 293 Transfection Kit (Thermo Fisher SCIENTIFC).
  • the cells were cultured at 37°C and 8% carbon dioxide for 4-6 days, and the culture supernatant was collected.
  • the recombinant antibodies were purified by applying the culture supernatant to an affinity column immobilized with Protein A (Ab-Rapid Pure EX, Proteinnova, or MabSelect Sure, GE Healthcare) and washing with PBS or the like.
  • the antibodies bound to the column were then eluted with an acid such as 100 mM glycine hydrochloride (pH 3.5), which was then promptly neutralized and replaced with PBS.
  • Example 12 Measurement of binding activity of mouse-human chimeric antibody and humanized antibody by flow cytometry using human AdipoR1 protein-expressing CHO cells and human AdipoR2 protein-expressing CHO cells The humanized antibody specifically bound to human AdipoR1 protein-expressing CHO cells and human AdipoR2 protein-expressing CHO cells, similar to the mouse-human chimeric antibody ( Figures 3-1 and 3-2).
  • Example 13 Efficacy test using high-fat diet-fed mice According to the method described in Toshimasa Y et al., Nature Medicine (2007) 13: 332-339, high-fat diet mice were generated by feeding high-fat diet 32 (Nippon Clea) ad libitum to male C57BL/6 mice (WT mice).
  • AdipoR agonist antibody 10-127D11 or isotype control antibody was intraperitoneally administered at 100 ⁇ g/head to the high-fat diet mice three times at 5-day intervals.
  • An oral glucose tolerance test (OGTT) was performed 5 days after the third administration.
  • the AdipoR agonist antibody 10-127D11-treated group showed lower blood glucose (Fig.
  • Example 14 Efficacy Test Using NASH Model Mice NASH model mice were prepared with reference to Trevaskis JL et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2012) 302: G762-G772. Specifically, 8-week-old male C57BL/6J Ham Slc-ob/ob mice were fed a diet containing 40 kcal % high fat (20 kcal % high fructose, 2% w/w high cholesterol, and trans fatty acids (Research Diet, D09100301). Mice (ob/ob mice, Japan SLC) were fed ad libitum. Feeding continued until the end of the study.
  • mice Four weeks after the start of feeding, the mice were divided into groups based on body weight, plasma insulin, and plasma alanine aminotransferase, and r127D11 or an isotype control antibody (control antibody: Medical and Biological Laboratories, M077-3M2) was administered subcutaneously once a week for four weeks. Body weight was measured at the time of antibody administration and at autopsy. No significant difference was observed between the control antibody and r127D11 in body weight during the administration period and at autopsy.
  • the mice Four weeks after the start of antibody administration, the mice were killed by blood collection from the abdominal vena cava under anesthesia, and the liver was removed and a frozen block was prepared for immunostaining. The blocks were immersed overnight in RNAlater (Thermo Fisher Scientific) for gene expression analysis, and then frozen (-80°C) until use.
  • RNAlater Thermo Fisher Scientific
  • the expression of the inflammatory cytokine interleukin 6 (Il6) and the inflammatory chemokine chemokine (CC motif) ligand 2 (Ccl2) in the r127D11-administered group was significantly lower than that in the control antibody-administered group (Il6: p ⁇ 0.05, Ccl2: p ⁇ 0.01, Student's t-test) ( Figure 5), supporting the anti-inflammatory effect of r127D11.
  • the expression of the fibrosis-promoting gene TIMPL1 (Timp1) was significantly lower in the r127D11-treated group than in the control antibody-treated group (p ⁇ 0.05, Student's t-test) (Fig. 5), and the inhibitory effect on fibrosis was also observed.
  • Acc fat synthesis-related gene acetyl-CoA carboxylase 1
  • Ppara PPAR ⁇ gene

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Abstract

抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片は、LCDR1が配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を含み、LCDR2が配列番号１９又は２０のアミノ酸配列を含み、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列を含む。

Description

抗アディポネクチン受容体抗体及びその利用
　本開示は、抗アディポネクチン受容体抗体並びにそれを含むアディポネクチン関連疾患を治療又は予防するための剤及び医薬に関する。
　アディポネクチン（Adiponectin）は、主に脂肪細胞から産生されるAdipokineであり、糖代謝、脂質代謝、血管内皮機能の恒常性維持に寄与している。肥満や脂肪萎縮症等の原因によりアディポネクチンの産生が低下すると、インスリン抵抗性、脂質異常症、2型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）等の代謝性疾患や心筋梗塞等の冠動脈疾患、脳梗塞等の疾患の発症や進行が引き起こされることが報告されている。
　アディポネクチン組換え蛋白質の投与やアディポネクチン遺伝子を導入した動物において、病態改善が報告されており、アディポネクチン投与による病態発症予防や治療が期待されている。しかし、アディポネクチンが3量体を最小単位とする多量体構造を形成しているため、その比率をコントロールした製剤化は難易度が高く、これまでのホルモンや酵素といった組換え蛋白製剤よりも工業的生産性の課題が大きいため、医薬品開発には繋がっていないのが現状である。
　2003年にアディポネクチン受容体（AdipoR）が報告されてから、AdipoR欠損マウスやノックダウン細胞を用いた検討が行われ、多くのアディポネクチン作用はAdipoRを介することが示され、同時にアディポネクチンの作用を模倣するアプローチが試みられている。AdipoR低分子アゴニスト、AdipoRonが開発され（非特許文献１）、アディポネクチン様の作用をインビトロ、インビボで発揮することが示されている。
　また、一本鎖抗体(single-chain variable fragment, scFv)ライブラリーからAdipoRのC末端細胞外ドメインのペプチドに結合性を示すscFv, scFvとヒトIgG1 Fc領域の融合タンパク質(scFv-Fc)が取得され、アディポネクチン様作用の一部を示すことが報告されているが、炎症性惹起にかかわる作用も報告されている（非特許文献2）。
Nature volume 503, pages493-499 (2013) An adiponectin receptor agonist antibody stimulates glucose uptake and fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase. Cytokine 126, 154863(2020)
　代謝性疾患ではこれまで経口薬が中心であるが、服薬期間の長期化による、飲み忘れや服薬モチベーションの低下が治療効果の低下につながることが課題となっている。発明者らは、代謝性疾患に対し、半減期の長い抗体でアプローチすることにより一回の投与で効果が持続する服薬アドヒアランスの良い医薬品の開発を試みた。
　ターゲットであるAdipoRはG protein-coupled receptor（GPCR）とは配向性が異なる7回膜貫通型受容体である。近年抗体取得技術の進歩によりGPCRを代表とする複数回膜貫通型受容体の抗体も取得が可能となっているが、そのほとんどが分析用やアンタゴニスト抗体であり、アゴニスト抗体開発はあまり報告されていない。また、リガンドとなるアディポネクチンは3量体を最小単位とする多量体構造を形成しているため、十分なアゴニスト活性を示し、抗体医薬となり得る抗体クラスIgGによるAdipoRアゴニスト抗体の取得は容易ではないと考えられていた。
　本開示は上記事情に鑑みてなされたものであり、優れた特性を有する抗AdipoR抗体を提供すること、及びメタボリックシンドロームや2型糖尿病を含むアディポネクチン関連疾患の予防又は治療のための医薬を提供する。
　発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、特定の相補性決定領域（CDR）配列を有する抗AdipoR抗体が、優れたAdipoR結合特性及びAdipoRアゴニスト作用を有することを見出した。さらに、当該抗AdipoR抗体が、メタボリックシンドロームや2型糖尿病を含むアディポネクチン関連疾患の予防又は治療に使用しうることを見出し、本開示を完成するに至った。
　即ち、本開示は、以下の態様を含む。
［１］
LCDR1が配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を含み、LCDR2が配列番号１９又は２０のアミノ酸配列を含み、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
［２］
ａ）LCDR1が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、LCDR2が配列番号１９のアミノ酸配列を含み、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、及び
b）LCDR1が配列番号１８のアミノ酸配列を含み、LCDR2が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
から選択される、［１］に記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
［３］
ａ）LCDR1が配列番号１７のアミノ酸配列からなり、LCDR2が配列番号１９のアミノ酸配列からなり、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列からなり、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列からなり、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列からなり、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列からなる、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、及び
b）LCDR1が配列番号１8のアミノ酸配列からなり、LCDR2が配列番号２０のアミノ酸配列からなり、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列からなり、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列からなり、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列からなり、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列からなる、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
から選択される、［１］又は［２］に記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
［４］
ａ）配列番号３のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
配列番号４のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
b）配列番号２７のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
配列番号２８のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
c）配列番号２９のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
配列番号３０のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
d）配列番号３１のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
配列番号３２のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
e）配列番号３３のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
配列番号３４のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
f）配列番号３５のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
配列番号３６のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、並びに
g）配列番号３７のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
配列番号３８のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
から選択される、［１］～［３］のいずれかに記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
［５］
ａ－１）配列番号２５のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
配列番号２６のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
b－１）配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
配列番号６のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
c－１）配列番号７のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
配列番号８のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
d－１）配列番号９のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
e－１）配列番号１１のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
配列番号１２のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
f－１）配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
配列番号１４のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、並びに
g－１）配列番号１５のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
から選択される、［１］～［４］のいずれかに記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
［６］
抗アディポネクチン受容体抗体が、抗アディポネクチン受容体アゴニスト抗体である、［１］～［５］のいずれかに記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
［７］
抗アディポネクチン受容体抗体がアディポネクチン受容体１及びアディポネクチン受容体２に結合する抗体である。［１］～［６］のいずれかに記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
［８］
抗アディポネクチン受容体抗体がヒト化抗体である、［１］～［７］のいずれかに記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
［９］
抗アディポネクチン受容体抗体がヒトIgGの定常領域を有する、［１］～［８］のいずれかに記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
［１０］
［１］～［９］のいずれかに記載の抗アディポネクチン抗体又はその抗体断片をコードする塩基配列を含む核酸分子。
［１１］
［１０］に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
［１２］
［１１］に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
［１３］
［１］～［９］のいずれかに記載の抗アディポネクチン抗体又はその抗体断片の製造方法であって、［１２］に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
［１４］
［１］～［９］のいずれかに記載の抗アディポネクチン抗体又はその抗体断片を含む、医薬組成物。
［１５］
アディポネクチン関連疾患の予防又は治療のための［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］
アディポネクチン関連疾患が、肥満関連疾患、メタボリックシンドローム、脂質異常症、2型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、代謝機能障害関連脂肪肝疾患（MAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、心筋梗塞、脳梗塞、癌、乾癬、慢性腎臓病、脱毛症、肝硬変、膵炎、心筋症、全身性強皮症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)及び肺線維症からなる群から選択される、［１５］に記載の医薬組成物。
　本開示により、優れた特性を有する抗AdipoR抗体、及び優れたメタボリックシンドロームや2型糖尿病を含むアディポネクチン関連疾患の予防又は治療のための医薬が提供される。
コントロールマウスIgG2b、及び抗体（10-127D11）を用いたCHO細胞（右図）、AdipoR1発現CHO細胞（左図）、又はAdipoR2発現CHO細胞（真ん中図）に対する結合結果を示す図。コントロールマウスIgG2b 10μg/mLは塗りつぶしたヒストグラム、10-127D11 1μg/mLは点線、3μg/mLは破線、10μg/mLは実線で示した。 Adiponectin（左図）、コントロールマウスIgG2b（Control mab）（右図）、及び抗体（10-127D11）（右図）を用いた、AMPK活性化試験の結果を示す図。 抗体（マウスヒトキメラ抗体（WT）、rH127D11 Ver. 1及びVer. 2）を用いたCHO細胞（下図）、AdipoR1発現CHO細胞（上図）、又はAdipoR2発現CHO細胞（真ん中図）に対する結合結果を示す図。コントロールヒトIgG4 10μg/mLは塗りつぶしたヒストグラム、rH127D11 1μg/mLは点線、3μg/mLは破線、10μg/mLは実線で示した。 抗体（rH127D11 Ver. 3、Ver. 4及びMTPC）を用いたCHO細胞（下図）、AdipoR1発現CHO細胞（上図）、又はAdipoR2発現CHO細胞（真ん中図）に対する結合結果を示す図。コントロールヒトIgG4 10μg/mLは塗りつぶしたヒストグラム、rH127D11 1μg/mLは点線、3μg/mLは破線、10μg/mLは実線で示した。 コントロールマウスIgG2b（IgG）、及び抗体（10-127D11）の高脂肪食負荷マウス（WT）又はAdipoR1とAdipoR2をノックアウトしたマウスを用いた糖負荷試験における血中グルコース（a, c）、血中インスリン（b, d）、インスリン抵抗性インデックスに対する（e）効力試験の結果を示す図。 NASHモデルマウスにコントロール抗体又は抗体（r127D11）を投与したときの各種マーカーの発現量を比較した結果を示す図。
　本開示の理解を容易にするため、以下に本開示に用いられる用語を説明する。
［アゴニスト活性］
　本開示において「アゴニスト活性」とは目的の標的に結合し、かつ、その標的のいずれかの機能を活性化することができる作用のことをいう。そして、「AdipoRへのアゴニスト活性を有する」とは、抗AdipoR抗体がAdipoR（AdipoR1とAdipoR2のいずれか又は両方）に結合することにより、AdipoRのシグナルを活性化することをいう。AdipoRシグナル及びその活性化の評価については後述する。
［単離された］
　単離された抗AdipoR抗体等の「単離された」とは、同定され、かつ、分離された、及び／又は、自然状態での成分から回収された、という意味である。一般的に、抗AdipoR抗体を単離するには、少なくとも１つの精製工程によって精製すればよく、少なくとも１つの精製工程により精製された抗AdipoR抗体を「単離された抗AdipoR抗体」ということができる。
［ヒト抗体］
　ヒト抗体とは、軽鎖、重鎖ともにヒト免疫グロブリン由来の抗体をいう。ヒト抗体は、重鎖の定常領域の違いにより、γ鎖の重鎖を有するＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む）、μ鎖の重鎖を有するＩｇＭ、α鎖の重鎖を有するＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２を含む）、δ鎖の重鎖を有するＩｇＤ、又はε鎖の重鎖を有するＩｇＥを含む。また原則として軽鎖は、κ鎖とλ鎖のどちらか一方を含む。
［ヒト化抗体］
　ヒト化抗体は、非ヒト動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域とからなる可変領域、及びヒト抗体由来の定常領域からなる抗体をいう。
［キメラ抗体］
　キメラ抗体とは、軽鎖、重鎖、又はその両方が、非ヒト由来の可変領域と、ヒト由来の定常領域からなる抗体をいう。
［抗AdipoR抗体］
　本開示において抗AdipoR抗体は、AdipoR（AdipoR1とAdipoR2のいずれか又は両方）に結合する免疫グロブリン分子又はその改変分子のことをいう。改変分子には、マルチスペシフィック抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、機能改変抗体、及びコンジュゲート抗体を含むものとする。
［マルチスペシフィック抗体］
　マルチスペシフィック抗体とは、２つ以上の異なる抗原特異性を有する２つ以上の独立した抗原認識部位を持ち合わせた非対称の抗体であり、２つの抗原特異性を有するバイスペシフィック抗体、３つの抗原特異性を有するトリスペシフィック抗体等が挙げられる。
［機能改変抗体］
　本開示において機能改変抗体とは、抗体配列、糖鎖等を改変することにより、抗体の有する抗原結合機能以外の機能、例えば細胞殺傷機能、補体活性化機能や血中半減期延長機能を改変した抗体をいう。
［コンジュゲート抗体］
　本開示においてコンジュゲート抗体とは、抗体にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、成長因子、アルブミン、酵素等の抗体以外の機能分子を化学的又は遺伝子工学的に結合した抗体をいう。
［抗体断片］
　本開示において抗体断片とは、特に断らない限り、抗原結合断片を意味する。抗体断片を抗原結合分子と呼ぶこともできる。抗原結合断片とは、抗体の一部分を含むタンパク質であり、抗原に結合できるものをいう。抗原結合断片の例としては、F(ab')2、Fab'、Fab、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、及びこれらの重合体等が挙げられる。さらに、抗原結合断片は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、成長因子、アルブミン、酵素、他の抗体等の本開示の抗AdipoR抗体以外の機能分子を化学的又は遺伝子工学的に結合しているコンジュゲート抗原結合断片を含むものとする。
［相補性決定領域］
　相補性決定領域（ＣＤＲ）とは免疫グロブリン分子の可変領域のうち、抗原結合部位を形成する領域をいい、超可変領域とも呼ばれ、免疫グロブリン分子ごとに特にアミノ酸配列の変化が大きい部分をいう。ＣＤＲには軽鎖及び重鎖それぞれに３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、及びＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）がある。本開示では、免疫グロブリン分子のＣＤＲはカバット（Kabat）の番号付けシステム（Ｋａｂａｔら、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ）に従って決定される。
［アミノ酸配列のパーセント(％)同一性］
　可変領域等の、同定した参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)同一性」とは、配列を整列させ、最大の％同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定の参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。％同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％同一性値は、ペアワイズアラインメントにおいて、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用することによって得られる。
　アミノ酸配列比較にＢＬＡＳＴが用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの％同一性は次のように計算される：
　分率Ｘ／Ｙの１００倍
　ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＢＬＡＳＴのＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％同一性は、ＢのＡに対する％同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限りは、ここでの全ての％同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを用いて得られる。
［競合する］
　本開示において、本開示の抗AdipoR抗体と「競合する」とは、本明細書に記載されたフローサイトメトリー法によって測定した場合に、該抗AdipoR抗体又はその抗原結合断片の存在により、有意差をもって本開示の抗AdipoR抗体とAdipoR（AdipoR1とAdipoR2のいずれか又は両方）との結合が低下することをいう。
　以下、本開示を詳細に説明する。
＜アディポネクチン受容体（AdipoR）＞
　AdipoRは、アディポネクチンの受容体であり、リガンドであるアディポネクチンが結合することで、アディポネクチンシグナルを伝達する機能を有する分子である。AdipoRは、哺乳類では、AdipoR1とAdipoR2が存在する。アディポネクチンがAdipoR1に結合すると、AMPK（AMP活性化キナーゼ）シグナルを活性化し、アディポネクチンがAdipoR2に結合すると、PPAR（ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体）αシグナルを活性化する。
　AMPKシグナルが活性化されると糖や脂質の代謝が活性化されるとともに、acetyl-CoA carboxylase 1（ACC）等の脂肪合成関連遺伝子の発現が低下し、脂質合成が抑制される。
　また、PPARαシグナルが活性化されると脂質代謝が活性化される。
　AdipoR1のアミノ酸配列等の詳細は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）、又はHGNC（HUGO Gene Nomenclature Committee)等のWEBサイトから見ることができる。NCBIに記載されているAdipoR1のアミノ酸配列のアクセッションナンバーは、例えば、NP_001277558.1（配列番号１）であり、AdipoR1のmRNAの塩基配列のアクセッションナンバーは、NM_001290629.1である。AdipoR2のアクセッションナンバーは、例えば、NP_078827.2（配列番号２）であり、AdipoR2のmRNAの塩基配列のアクセッションナンバーは、NM_024551.2である。AdipoRは、アディポネクチンが結合することで、アディポネクチンシグナルを伝達する機能を有していれば、その生物由来は限定されない。
＜抗AdipoR抗体＞
　本開示の一実施形態は、新規の抗AdipoR抗体である。この抗体はAdipoR結合特性及びAdipoRアゴニスト活性に優れており、さらには、保存安定性や熱安定性等にも優れた抗AdipoR抗体である。保存安定性及び熱安定性等についてはそれぞれ後述するが、これらをまとめて安定性と呼ぶことがある。
　この抗体を用いれば、例えば、アディポネクチン関連疾患の予防又は治療を行うことができる。この予防又は治療方法は、抗体を使用するため副作用が小さく、安全性の観点から優れている。
　本開示の一実施形態に係る抗AdipoR抗体はAdipoRとの結合性に優れている。AdipoR1及びAdipoR2のいずれか一方に結合する抗体であればよいが、AdipoR1及びAdipoR2の両方に結合する抗体であることが好ましい。本開示の抗AdipoR抗体がAdipoRに結合するとは、AdipoR特異的な結合を意味する。本開示の抗AdipoR抗体は、AdipoR1及びAdipoR2のいずれか一方又は両方、好ましくはヒトAdipoR1及びAdipoR2のいずれか一方又は両方、より好ましくはヒトAdipoR1及びヒトAdipoR2の両方に対する解離定数（ＫＤ）が低いものである。
　本開示の一実施形態に係る抗AdipoR抗体は、AdipoRへのアゴニスト活性を発揮する。即ち、AdipoRに作用し、天然のアディポネクチンがAdipoRに作用する際と同様のシグナル伝達を引き起こす。抗AdipoR抗体を添加することで、AdipoR1を介したAMPKシグナル及び／又はAdipoR2を介したPPARαシグナルが活性化される。本開示の抗AdipoR抗体はAMPKシグナル及びPPARαシグナルの両方を活性化する抗体であることが好ましい。
本開示の抗AdipoR抗体はAdipoR1を介したAMPKシグナル及び／又はAdipoR2を介したPPARαシグナルを陰性コントロール刺激時の５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上活性化することができる。
　抗AdipoR抗体によるAdipoR1を介したAMPKシグナルの活性化はAMPKリン酸化試験によって評価できる。アディポネクチンはAdipoR1に結合して、骨格筋等の細胞でAMPKのリン酸化を引き起こす。抗AdipoR抗体は天然のアディポネクチンと同様にAMPKのリン酸化を引き起こすことが好ましい。抗AdipoR抗体によるAMPKリン酸化レベルは、抗AdipoR抗体を細胞に添加した時のリン酸化AMPK/AMPK比がアイソタイプコントロール抗体添加時のリン酸化AMPK/AMPK比を上回る程度であればいずれの程度でもよいが、例えば１．１倍以上、好ましくは２．０倍以上、より好ましくは３．０倍以上、さらに好ましくは４．０倍以上、特に好ましくは５．０倍以上である。測定方法としては、AMPKとリン酸化AMPKの量をウェスタンブロッティングにより定量し、AMPK/AMPK比を算出する。その他、ウェスタンブロッティングに代わる方法としてサンドイッチELISA、FLET等のホモジニアスアッセイや免疫染色による定量等でも測定可能である。
　抗AdipoR抗体によるAdipoR2を介したPPARαシグナルの活性化はPPARαによる転写活性化試験によって評価できる。アディポネクチンはAdipoR2に結合して、肝細胞や血管内皮の細胞等でPPARαシグナル伝達を活性化、即ち、PPARαの標的遺伝子の転写を活性化する。抗AdipoR抗体は天然のアディポネクチンと同様にPPARα標的遺伝子の転写活性化を促進することが好ましい。抗AdipoR抗体による転写活性化促進レベルはアイソタイプコントロール抗体による転写活性化促進レベルを上回る程度であればいずれの程度でもよいが、例えば1.1倍以上が挙げられる。測定方法としては、PPARα結合エレメントを含むプロモーターの下流にレポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼのような酵素）を繋げたベクターを導入したAdipoR発現細胞においてレポーター遺伝子の発現増加又はPPARα標的遺伝子の発現増加を定量することが挙げられる。PPARα標的遺伝子の発現量で評価する場合は、定量PCR等一般的な方法で発現量を測定することが挙げられる
　本開示の一実施形態に係る抗AdipoR抗体は保存（保管）安定性に優れている。保存安定性は一定期間保存後のAdipoR、即ち、AdipoR1及びAdipoR2のいずれか又は両方との結合の低下により評価することができ、抗AdipoR抗体のAdipoR結合量は、具体的には、フローサイトメトリー法を用いた抗原結合活性測定により測定することができる。本開示の一実施形態に係る抗AdipoR抗体は、例えば、40℃で1カ月間保存したとき、該保存前の抗AdipoR抗体又はその抗体断片が有するAdipoR結合量に比して、90％以上、93以上%、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上のAdipoR結合量を有し得る。
　本開示の一実施形態に係る抗AdipoR抗体は熱処理によっても安定であることが好ましく、65℃以上の熱処理によっても安定であることがより好ましい。熱処理における安定性は、熱処理した後の凝集体量の増加やAdipoRヘの結合活性の低下により評価可能であり、熱処理しない場合に比べて変化がないことが好ましい。
　また、本開示の一実施形態に係る抗AdipoR抗体は凍結融解における安定性に優れていることが好ましい。凍結融解における安定性は、凍結融解を複数回繰り返した後の凝集体量の増加やAdipoRヘの結合活性の低下により評価可能であり、凍結融解しない場合に比べて変化がないことが好ましい。
　本開示の一実施形態に係る抗AdipoR抗体は副作用の少ないものが望ましい。副作用としては、炎症性反応の惹起、注射部位反応、肝機能検査の異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、ミオパシー及び倦怠等が挙げられる。例えば、血液中のＡＬＴ、ＡＳＴ又はγ－ＧＴＰレベルの上昇は、肝毒性又は肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビンの上昇は、肝毒性又は肝機能異常を示し得る。また、尿タンパクの上昇、血液中のクレアチニン、もしくはＢＵＮの上昇は、腎毒性又は腎機能異常を示し得る。
　本開示の抗AdipoR抗体は、AdipoR、即ち、AdipoR1及びAdipoR2のいずれか又はその部分断片あるいはそれらを発現した細胞を抗原として、該抗原をマウス等の哺乳動物やニワトリ等に免疫し、ハイブリドーマを作製して得られるモノクローナル抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造されるキメラ抗体及びヒト化抗体、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造されるヒト抗体等が含まれる。また、上記で得られた抗体を親和性成熟して得られた抗体も含む。本開示の抗AdipoR抗体又はその抗体断片を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用の観点から、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はそれらの抗体断片が望ましい。
　抗原遺伝子を搭載したベクターを免疫動物に直接投与することにより生体内で抗原発現細胞を作製し、免疫原として使用することもできる。ベクターとしてウイルスベクター、具体的には、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び単純ヘルペスウイルス等を使用してもよい。
　レトロウイルスの出芽システムをベースに形成された，感染力のないウイルス様粒子（リポパーティクル）表面に発現させた抗原を免疫に使用してもよい。
　抗原はそのまま免疫に使用してもよいし、キャリアタンパク質との複合体として用いてもよい。抗原とキャリアタンパク質の複合体の調製にはグルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等の縮合剤を用いることができる。キャリアタンパク質は牛血清アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニン、ＫＬＨ等が例示される。
　免疫される動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマ又はウシ等の哺乳動物やニワトリ、サメが挙げられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内の投与が挙げられる。投与に際しては完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよく、投与は通常１～５週毎に１回ずつ行われる。免疫された動物の脾臓又はリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させ、ハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としては動物由来、例えばマウス、ラット、ヒト、ニワトリ等由来のものが使用される。
＜モノクローナル抗体＞
　モノクローナル抗体は、具体的には下記のようにして取得することができる。即ち、前述のような抗原を免疫原とし、該免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、上記のような動物の皮下、筋肉内、静脈内、フッドパッド内又は腹腔内に１～数回注射するか、あるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１～１４日毎に１～４回免疫を行って、最終免疫より約１～５日後に免疫感作された該動物から抗体産生細胞が取得される。
　モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて得ることができる。例えば、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987))、Antibodies:A Laboratory Manual, Ed.Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)等参照。
　モノクローナル抗体を分泌する「ハイブリドーマ」の調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法、ネイチャー(Nature) , 256,495, 1975参照、及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、免疫感作された動物から取得される脾臓等に含まれる抗体産生細胞と、動物、好ましくはマウス、ラット、ニワトリ又はヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞を細胞融合させることにより調製される。
　細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３－ＡＧ８．６５３（６５３）、Ｐ３／ＮＳＩ／１－Ａｇ４－１（ＮＳ－１）、Ｐ３／Ｘ６３－Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ、Ｓｐ２）、ＰＡＩ、Ｆ０及びＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３－Ａｇ．２．３．、並びに、ヒト由来ミエローマＵ－２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００－６ＴＧ－Ａ１－２、ＵＣ７２９－６、ＣＥＭ－ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１及びＣＥＭ－Ｔ１５等を使用することができる。
　融合促進剤としてはポリエチレングリコール等が挙げられ、通常には、２０～５０％程度の濃度であって、平均分子量１０００～４０００のポリエチレングリコールを用いて２０～４０℃、好ましくは３０～３７℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常１：１～１０：１程度、約１～１０分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。
　モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、ウェルの培養上清の免疫抗原に対する反応性をＥＬＩＳＡやフローサイトメトリー法等の免疫化学的方法によって測定することにより行うことができる。
　目的の抗体を産生するハイブリドーマを含むウェルから更に、限界希釈法によってクローニングを行い、クローンを得ることができる。ハイブリドーマの選別、育種は、通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０～２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地で行われる。
　ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養するか、又はマウス、ラット、ニワトリ等の動物の腹水中等でのインビボで増殖させ、得られた培養上清、又は動物の腹水から単離することにより行うことができる。
　インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるのに適した栄養培地を用いることが可能である。
　基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地及び低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地、並びに、ＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ－ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地及びＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられる。該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／又は種々の無機物質又は有機物質等を含有させることができる。
　モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清又は腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、ＤＥＡＥ又はＤＥ５２等のイオン交換クロマトグラフィー、抗イムノグロブリンカラム、プロテインＡカラム又は抗原を結合させたカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。具体的には、モノクローナル抗体の精製は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、例えば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらに抗イムノグロブリン抗体又はプロテインAを用いるアフィニティークロマトグラフィー等の手段により容易に達成することができる。
　モノクローナル抗体はファージディスプレイ法により取得することもできる。ファージディスプレイ法では、任意のファージ抗体ライブラリより選別したファージを、目的の免疫原を用いてスクリーニングを行い、免疫原に対する所望の結合性を有するファージを選択する。次に、ファージ内に含まれる抗体対応配列を単離又は配列決定し、単離された配列又は決定された配列情報に基づき、抗体又は抗原結合ドメインをコードする核酸分子を含む発現ベクターを構築する。そしてかかる発現ベクターをトランスフェクションされた細胞株を培養することにより、モノクローナル抗体を産生させることができる。ファージ抗体ライブラリとして、ヒト抗体ライブラリを用いることにより、所望の結合性を有するヒト抗体を生成することができる。
　なお、モノクローナル抗体は体外免疫法によって取得することもできる。
　本開示の抗AdipoR抗体の好ましい態様としてキメラ抗体が挙げられる。「キメラ抗体」としては、可変領域が、マウス、ラット、ハムスター、ニワトリ等の非ヒト動物のイムノグロブリン由来の可変領域であり、定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域である、キメラ抗体が例示される。例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する可変領域を切り出し、ヒト骨髄由来の抗体定常領域と結合して作製することができる。ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等のＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本開示における組換キメラ抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。このように作製したキメラ抗体の遺伝子を用いて発現ベクターを作製することができる。該発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりキメラ抗体産生形質転換細胞を得、該形質転換細胞を培養することにより培養上清中から目的のキメラ化抗体を得る。
　本開示の抗AdipoR抗体の別の好ましい態様としてヒト化抗体が挙げられる。本開示における「ヒト化抗体」は、マウス等の非ヒト動物抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ；相補性決定領域ともいう）のアミノ酸配列だけをヒト抗体遺伝子に移植、即ちＣＤＲグラフティングした抗体である。例えば、特表平４－５０６４５８号公報及び特許２９１２６１８号明細書等に記載の方法を参照して作製することができる。具体的には、そのＣＤＲの一部又は全部がマウス、ラット、ハムスター、ニワトリ等の非ヒト動物のモノクローナル抗体に由来するＣＤＲであり、その可変領域のフレームワーク領域の全部又は一部がヒトイムノグロブリン由来の可変領域のフレームワーク領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であるヒト化抗体を意味する。
　本開示におけるヒト化抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものでないことは言うまでもない。
　抗体をヒト化する方法には、当該技術分野で既知の種々の手法を使用することができ、例えば、Almagro et al., FRont Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-1633.等に記載の方法や、より具体的には、例えば、Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1;93(11):3922-3930. 等に記載のCDRグラフティング、roguska et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1;91(3):969-973.等に記載のRe-surfacing、又はDamschroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-3060. Epub 2007 Jan 22.等に記載のフレームワークシャッフル等が挙げられる。抗原結合を改変又は改善するために、ヒト抗体のフレームワーク領域のアミノ酸残基を、CDRドナー抗体からの対応する残基と置換してもよい。このフレームワーク領域における置換は、Riechmann et al., Nature 1988 Mar 24;332(6162):323-327.等に記載の当該技術分野で周知の方法によって実施可能である。例えば、CDRとフレームワーク領域のアミノ酸残基の相互作用のモデリングによって抗原結合に重要なフレームワーク領域のアミノ酸残基を同定してもよい。又は、配列比較によって、特定の位置で異常なフレームワーク領域のアミノ酸残基を同定してもよい。なお、Nishibori et al., Mol Immunol. 2006 Feb;43(6): 634-42に記載の方法でヒト化してもよい。
　単離したマウス重鎖ＣＤＲ部分のアミノ酸配列を移植したヒト重鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに導入し、同様にマウス軽鎖ＣＤＲ部分のアミノ酸配列を移植したヒト軽鎖遺伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクターに導入する。又は、マウスのＣＤＲ部分のアミノ酸配列を移植したヒトの重鎖及び軽鎖遺伝子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入することもできる。このようにして作製された発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりヒト化抗体産生形質転換細胞を得、該形質転換細胞を培養することにより培養上清中から目的のヒト化抗体を得る。
　本開示の抗AdipoR抗体の別の好ましい態様としてヒト抗体が挙げられる。ヒト抗体とは、イムノグロブリンを構成する重鎖の可変領域及び重鎖の定常領域並びに軽鎖の可変領域及び軽鎖の定常領域を含むすべての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンとなっている抗体であって、ヒト抗体遺伝子をマウスに導入して作製することができる。具体的には、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウスやニワトリ等のヒト以外の動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。
　例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；特表平4-504365号公報；特表平7-509137号公報；国際公開第９４／２５５８５号パンフレット；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994；及び特表平６－５００２３３号公報等に記載の方法に従って作製することができる。より具体的には、ＨｕＭａｂ(登録商標)マウス(Medarex, Princeton NJ)、ＫＭＴＭマウス (Kirin Pharma Company, Japan)、ＫＭ(ＦＣγＲＩＩｂ-ＫＯ)マウス等が挙げられる。
　本開示の抗アディポネクチン受容体抗体（抗AdipoR抗体）として具体的には、LCDR1が配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を含み、LCDR2が配列番号１９又は２０のアミノ酸配列を含み、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列を含む、抗AdipoR抗体が挙げられる。
　本開示の抗AdipoR抗体としてより好ましくは、
ａ）LCDR1が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、LCDR2が配列番号１９のアミノ酸配列を含み、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列を含む、抗AdipoR抗体、又は
b）LCDR1が配列番号１８のアミノ酸配列を含み、LCDR2が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列を含む、抗AdipoR抗体、
が挙げられる。
　なお、AdipoR1と結合しAMPKシグナルを活性化する、及び/又は、AdipoR2に結合しPPARαシグナルを活性化するという特性が維持される限り、これらのCDRの１つ以上において、１～数個のアミノ酸が置換されてもよい。ここで、１～数個とは、例えば、１個、２個、又は３個である。なお、該アミノ酸置換は保存的置換であることが好ましい。
　ここで「保存的置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、アミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合等が挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸の例として、非極性又は疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性又は中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ又は塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ又は酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。抗体の特性が維持されるとは、これらの特性がCDRのアミノ酸配列改変前と比較して同程度、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上に維持されることをいう。なお、維持は向上も含む。
　CDR以外の領域は抗体としての構造を維持し、機能を発揮できる配列であれば特に制限されず、マウス由来の配列、ヒト由来の配列、他の哺乳動物由来の配列、ニワトリ由来の配列、それらのキメラ配列、人工配列のいずれであってもよい。定常領域を含む場合においては、重鎖及び軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は、Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986、The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 及びCell vol.22, p197, 1980 に記載のものが例示される。
　本開示の抗AdipoR抗体として具体的には、マウス抗体として、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、それぞれ配列番号３のアミノ酸配列及び配列番号４のアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、が挙げられる。
　さらに、以下のマウスヒトキメラ抗体も例示される。具体的には、マウスヒトキメラ抗体として、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、それぞれ配列番号２７のアミノ酸配列及び配列番号２８のアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、が挙げられる。
　さらに、CDR以外をヒト由来としたヒト化抗体も例示される。
このようなヒト化抗体としては、
a)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、それぞれ配列番号２９のアミノ酸配列及び配列番号３０のアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、
b)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、それぞれ配列番号３１のアミノ酸配列及び配列番号３２のアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、
c)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、それぞれ配列番号３３のアミノ酸配列及び配列番号３４のアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、
d)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、それぞれ配列番号３５のアミノ酸配列及び配列番号３６のアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、及び
e)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、それぞれ配列番号３７のアミノ酸配列及び配列番号３８のアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、
からなる群から選ばれる1種以上の抗体が例示される。
　又は、本開示の一実施形態に係る抗AdipoR抗体は、
a-1)重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号２５及び２６で示されるアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、
b-1)重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号５及び６で示されるアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、
c-1)重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号７及び８で示されるアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、
d-1)重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号９及び１０で示されるアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、及び
e-1)重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号１１及び１２で示されるアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、
f-1)重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号１３及び１４で示されるアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、及び
g-1)重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号１５及び１６で示されるアミノ酸配列からなる、又は同アミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体、
からなる群から選ばれる1種以上の抗体であってもよい。
　なお、抗AdipoR抗体のアミノ酸配列の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域においては、AdipoR1と結合しAMPKシグナルを活性化する、及び/又は、AdipoR2に結合しPPARαシグナルを活性化するという特性が維持される限り、１又は数個のアミノ酸、具体的には、１～２０個、１～１０個又は１～５個の置換、欠失、付加又は挿入があってもよい。このような置換、欠失、付加はCDRに導入されてもよいが、CDR以外の領域に導入されることが好ましい。また、該アミノ酸置換は本開示の特性を維持するために保存的置換であることが好ましい。
　前記の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域において置換、欠失等が含まれた本開示の抗AdipoR抗体のアミノ酸配列は、軽鎖可変領域が、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸配列、配列番号３３のアミノ酸配列、配列番号３５のアミノ酸配列又は配列番号３７のアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。また、重鎖可変領域が、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列、配列番号３０のアミノ酸配列、配列番号３２のアミノ酸配列、配列番号３４のアミノ酸配列、配列番号３６のアミノ酸配列又は配列番号３８のアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
　本開示の抗AdipoR抗体はまた、AdipoR1と結合しAMPKシグナルを活性化する、及び/又は、AdipoR2に結合しPPARαシグナルを活性化するという特性が維持される限り、軽鎖が配列番号２５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸配列、配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１５のアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり得、重鎖が配列番号２６のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列、配列番号１２のアミノ酸配列、配列番号１４のアミノ酸配列又は配列番号１６のアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗AdipoR抗体であり得る。
　本開示の抗AdipoR抗体には、上記特定のアミノ酸配列からなるＣＤＲ、又は上記特定のアミノ酸配列からなる可変領域を有するマルチスペシフィック抗体、機能改変抗体、コンジュゲート抗体が含まれる。
　本開示の抗AdipoR抗体は、それ自体にAdipoR以外の別の抗原結合特異性を有する抗体を遺伝子工学的な手法により結合することにより、バイスペシフィック抗体等のマルチスペシフィック抗体を作製することができる。該遺伝子工学的な手法はこの分野において既に確立されている。例えば、Wuら、Nature Biotechnology 25(11), 1290(2007)等に記載の可変領域を直列に連結したＤＶＤ－Ｉｇや、抗体のＦｃ領域を改変することにより、異なった抗原に結合する2種類の抗体の重鎖が組み合わされる、Kitazawaら、Nature Medicine 18(10), 1570(2012) Kitazawaら、Nature Medicine 18(10), 1570(2012)等に記載のＡＲＴ－Ｉｇの技術を利用すれば所望のバイスペシフィック抗体が取得できる。
　本開示の抗AdipoR抗体の改変分子として機能改変抗体が挙げられる。機能改変抗体は、抗体配列、糖鎖等を改変することにより、細胞殺傷機能や補体活性化機能、血中半減期延長機能等の機能を改変した抗体を意味する。例えば、設楽研也、藥學雜誌、2009、Vol.129(1), p3；石井明子ら、日本薬理學雜誌、2010、Vol.136(5), p280；橋口周平ら、生化学、2010、Vol.82(8),p710等参照。
　抗AdipoR抗体の機能改変抗体は、以下のような方法で調製される。例えば、本開示の抗AdipoR抗体を、宿主細胞としてα１，６－フコース転移酵素（ＦＵＴ８）遺伝子を破壊したＣＨＯ細胞を用いて製造すると、糖鎖のフコース含量が低下して細胞殺傷機能が高まった抗体が得られ、ＦＵＴ８遺伝子を導入したＣＨＯ細胞を宿主細胞として製造すると、細胞殺傷機能が低い抗体が得られる。例えば、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号等参照。また、Ｆｃ領域のアミノ酸残基を改変することで補体活性化機能を調節することができる。例えば、米国特許第６７３７０５６号、米国特許第７２９７７７５号、米国特許第７３１７０９１号等参照。さらに、Ｆｃ受容体の１つであるＦｃＲｎへの結合を高めたＦｃ領域の変異体を使用することにより、血中半減期の延長を図ることができる。例えば、橋口周平ら、生化学、２０１０、Vol.82(8), p710等参照。これらの機能改変抗体は、遺伝子工学的に製造することができる。
　本開示の抗AdipoR抗体の改変分子としてコンジュゲート抗体が挙げられる。コンジュゲート抗体としては、抗AdipoR抗体にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、成長因子、アルブミン、酵素、他の抗体等の本開示の抗AdipoR抗体以外の機能分子を化学的又は遺伝子工学的に結合したコンジュゲート抗体が挙げられる。
　機能分子としてＰＥＧを結合する場合、通常用いられるものであればよく、直鎖型でもよく、ブランチ型のものでもよい。ＰＥＧは、例えばＮＨＳ活性基を用いることにより、抗体のアミノ基等に結合することができる。
　機能分子として放射性物質を用いる場合、131Ｉ、125Ｉ、90Ｙ、64Ｃｕ、99Ｔｃ、77Ｌｕ又は211Ａｔ等が用いられる。放射性物質は、ク口ラミンＴ法等によって抗体に直接結合させることができる。
　機能分子として、酵素を用いる場合、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ等のルシフェラーゼ、例えば、米国特許第４７３７４５６号等参照、、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ等のサッカライドオキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等の複素環式オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等が用いられる。
　毒素、低分子化合物又は酵素を化学的に結合する時に使用するリンカーとしては、例えば、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン等の二価ラジカル）－（ＣＲ2）ｎＯ（ＣＲ2）ｎ－、なお、Ｒは任意の置換基、ｎは正の整数である、で表されるリンカーやアルコキシの反復単位、例えば、ポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ等、及び例えば、ポリエチレンアミノ、ＪｅｆｆａｍｉｎｅＴＭ等のアルキルアミノ、並びに、スクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート及びカプロアミド等の二酸エステル及びアミド（が挙げられる。機能分子を結合させる化学的修飾方法はこの分野において既に確立されている。例えば、D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681等参照。
　本開示における抗AdipoR抗体の「抗原結合断片」としては、前述のような抗体の、抗原結合性を有する一部分の領域を意味し、具体的にはF(ab')2 、Fab'、Fab 、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、及びこれらの重合体等が挙げられる。さらに、抗原結合断片にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、成長因子（ＴＧＦ－β、ＮＧＦ、Ｎeurotrophin等）、アルブミン、酵素、他の抗体等の本開示の抗AdipoR抗体以外の機能分子を化学的又は遺伝子工学的に結合しているコンジュゲート抗原結合断片が含まれる。
　ここで、「F(ab')2」及び「Fab」とは、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素であるペプシン又はパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本の重鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本の重鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶＬ（軽鎖可変領域）とＣＬ（軽鎖定常領域）からなる軽鎖、及びＶＨ（重鎖可変領域）とＣＨγ1（重鎖定常領域中のγ1領域）とからなる重鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Fabという。またＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本の重鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのFabがヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをF(ab')2という。
　本開示の抗AdipoR抗体の抗原結合断片の改変分子としてコンジュゲート抗原結合断片が挙げられる。コンジュゲート抗原結合断片としては、抗AdipoR抗体の抗原結合性を有する一部分の領域にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、成長因子、アルブミン、酵素、他の抗体等の本開示の抗AdipoR抗体以外の機能分子を化学的又は遺伝子工学的に結合したコンジュゲート抗原結合断片が挙げられる。
　機能分子としてＰＥＧを結合する場合、通常用いられるものであればよく、直鎖型でもよく、ブランチ型のものでもよい。ＰＥＧは、例えばＮＨＳ活性基を用いることにより、抗AdipoR抗体のアミノ基等に結合することができる。
　機能分子として放射性物質を用いる場合、131Ｉ、125Ｉ、90Ｙ、64Ｃｕ、99Ｔｃ、77Ｌｕ又は211Ａｔ等が用いられる。放射性物質は、ク口ラミンＴ法等によって抗AdipoR抗体の抗原結合性を有する一部分の領域に直接結合させることができる。
　機能分子として、酵素を用いる場合、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ等のルシフェラーゼ、例えば、米国特許第４７３７４５６号等参照、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ等のサッカライドオキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等の複素環式オキシダーゼ（）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等が用いられる。
　毒素、低分子化合物又は酵素を化学的に結合する時に使用するリンカーとしては、例えば、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン等の二価ラジカル、－（ＣＲ2）ｎＯ（ＣＲ2）ｎ－、なお、Ｒは任意の置換基、ｎは正の整数、で表されるリンカーやアルコキシの反復単位、例えば、ポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ等、及び例えば、ポリエチレンアミノ、ＪｅｆｆａｍｉｎｅＴＭ等のアルキルアミノ、並びに、スクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート及びカプロアミド等の二酸エステル及びアミドが挙げられる。機能分子を結合させる化学的修飾方法はこの分野において既に確立されている 。例えば、D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681等参照。
　本開示の、特定のアミノ酸配列を有するＣＤＲ又は可変領域を含む抗AdipoR抗体は、血中半減期を長く維持するために、該定常領域がＩｇＧ１，ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のヒトＩｇＧの定常領域であることが好ましい。
　本開示の抗AdipoR抗体及びその抗原結合断片には、AdipoR1と結合しAMPKシグナルを活性化する、及び/又は、AdipoR2に結合しPPARαシグナルを活性化するという特性が維持される限り、上記のような特定のCDRのアミノ酸配列を有する抗体と、AdipoR、即ち、AdipoR1及び／又はAdipoR2との結合において競合する抗AdipoR抗体、及びその抗原結合断片も含まれる。上記のような特定のCDRのアミノ酸配列を有する抗体とAdipoRとの結合において競合する抗体としては、特定のCDRのアミノ酸配列を有する抗体とAdipoRの同じ領域にエピトープを有する抗体が例示される。
　該抗体は、上記のようなCDR配列を有する抗体とAdipoRとの結合系において、共存させることにより、取得（スクリーニング）したり、評価したりすることができる。例えば、フローサイトメトリー法によりスクリーニングすることにより取得できる。
　上記の特定のＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗AdipoR抗体に対し、AdipoR、即ち、AdipoR1及び／又はAdipoR2との結合が競合する、抗AdipoR抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体等、任意の動物由来の抗体であってもよいし、これらの抗体の組み合わせであるキメラ抗体やヒト化抗体であってもよいが、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であることが好ましい。
　本開示における抗AdipoR抗体又はその抗体断片は、例えば、本開示の抗AdipoR抗体又はその抗体断片をコードする下記の核酸分子を含む組換えベクターを含む形質転換体又は宿主細胞を用いて製造することができる。
＜核酸分子＞
　本開示の一実施形態は、本開示の抗AdipoR抗体又はその抗体断片をコードするポリヌクレオチドである核酸分子である。上述したＣＤＲ、可変領域、又は全長のアミノ酸配列を含み、AdipoR1と結合しAMPKシグナルを活性化する、及び/又は、AdipoR2に結合しPPARαシグナルを活性化するという特性を有するポリペプチドをコードする核酸分子であれば特に制限されないが、例として、
a)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域である、配列番号３のアミノ酸配列及び配列番号４のアミノ酸配列、
b)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域である、配列番号２７のアミノ酸配列及び配列番号２８のアミノ酸配列、
c)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域である、配列番号２９のアミノ酸配列及び配列番号３０のアミノ酸配列、
d)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域である、配列番号３１のアミノ酸配列及び配列番号３２のアミノ酸配列、
e)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域である、配列番号３３のアミノ酸配列及び配列番号３４のアミノ酸配列、
f)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域である、配列番号３５のアミノ酸配列及び配列番号３６のアミノ酸配列、及び
g)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域である、配列番号３７のアミノ酸配列及び配列番号３８のアミノ酸配列、をそれぞれコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　本開示の核酸分子の他の例として、
a)軽鎖及び重鎖である、配列番号２５及び２６で示されるアミノ酸配列、
b)軽鎖及び重鎖である、配列番号５及び６で示されるアミノ酸配列、
c)軽鎖及び重鎖である、配列番号７及び８で示されるアミノ酸配列、
d)軽鎖及び重鎖である、配列番号９及び１０で示されるアミノ酸配列、
e)軽鎖及び重鎖である、配列番号１１及び１２で示されるアミノ酸配列、
f)軽鎖及び重鎖である、配列番号１３及び１４で示されるアミノ酸配列、及び
g)軽鎖及び重鎖である、配列番号１５及び１６で示されるアミノ酸配列をそれぞれコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　本開示の核酸分子の他の例として、
　抗AdipoR抗体の軽鎖全長をコードする配列番号３９で示される塩基配列、及び抗AdipoR抗体の重鎖全長をコードする配列番号４０で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
　抗AdipoR抗体の軽鎖全長をコードする配列番号４１で示される塩基配列、及び抗AdipoR抗体の重鎖全長をコードする配列番号４２で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
　抗AdipoR抗体の軽鎖全長をコードする配列番号４３で示される塩基配列、及び抗AdipoR抗体の重鎖全長をコードする配列番号４４で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
　抗AdipoR抗体の軽鎖全長をコードする配列番号４５で示される塩基配列、及び抗AdipoR抗体の重鎖全長をコードする配列番号４６で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
　抗AdipoR抗体の軽鎖全長をコードする配列番号４７で示される塩基配列、及び抗AdipoR抗体の重鎖全長をコードする配列番号４８で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
　抗AdipoR抗体の軽鎖全長をコードする配列番号４９で示される塩基配列、及び抗AdipoR抗体の重鎖全長をコードする配列番号５０で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
　抗AdipoR抗体の軽鎖全長をコードする配列番号５１で示される塩基配列、及び抗AdipoR抗体の重鎖全長をコードする配列番号５２で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
が挙げられる。
　なお、本開示の核酸分子は、AdipoR1と結合しAMPKシグナルを活性化する、及び/又は、AdipoR2に結合しPPARαシグナルを活性化する抗AdipoRモノクローナル抗体をコードする限り、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の塩基配列の相補鎖DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むものであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、サザンハイブリダイゼーションの後、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄を行う条件が挙げられる。
　本開示の核酸分子は、重鎖と軽鎖の定常領域と可変領域の全てをコードするものであってもよいが、重鎖と軽鎖の可変領域のみをコードするものであってもよい。定常領域と可変領域の全てをコードする場合における重鎖及び軽鎖の定常領域の塩基配列は、Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986、The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 及びCell vol.22, p197, 1980に記載のものが好ましい。
　また、本開示の核酸分子は、例えば、以下の方法によって得ることができる。まず、ハイブリドーマ等の細胞から、市販のＲＮＡ抽出キットを用いてtotal ＲＮＡを調製し、ランダムプライマー等を用い、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。次いで、既知のヒト抗体重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の可変領域において、それぞれ保存されている配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。定常領域をコードする配列については、既知の配列をＰＣＲ法で増幅することによって得ることができる。ＤＮＡの塩基配列は、配列決定用プラスミドに組み込む等して、常法により決定することができる。
　あるいは、可変領域又はその一部の配列を化学合成し、定常領域を含む配列に結合することによっても本開示のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。
　本開示はまた、本開示の核酸分子を含む組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転換体又は宿主細胞を提供する。
　組換えベクターとしては、大腸菌（Echerichia coli）のような原核細胞において発現可能なベクター、例えば、pBR322、pUC119又はこれらの派生物であってもよいが、真核細胞において発現可能なベクターが好ましく、哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターがより好ましい。哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターとしては、例えば、Invitrogen社製のpcDNA3.1、ｐＣｏｎＰｌｕｓ、ｐｃＤＭ８、ｐｃＤＮＡ　Ｉ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲＥＰ４のようなプラスミドベクター、宝バイオ社製のpDON-AI DNA等のウイルスベクターを挙げることができる。重鎖コード配列と軽鎖コード配列を含む１つのベクターでもよいし、重鎖コード配列含むベクターと軽鎖コード配列を含むベクターの２つのベクターでもよい。
　本開示の組換えベクターを導入する形質転換体は、大腸菌、枯草菌のような原核細胞であってもよいが、真核細胞が好ましく、哺乳動物由来の細胞がより好ましい。哺乳動物由来の細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、２９３、ＮＳ０、Ｎａｍａｌｗａ、ＹＢ２／０等を挙げることができる。
　明細書中に記載の方法又は公知の方法により得られる抗AdipoR抗体やその抗原結合断片は、均一になるまで精製することができる。抗体等の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができ、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８等が参照されるが、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、抗免疫グロブリン抗体結合カラム、抗原結合カラム等が挙げられる。例えばプロテインＡカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ， ＰＯＲＯＳ， Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ． Ｆ．（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等が挙げられる。
＜医薬組成物＞
　本開示の一実施形態は、上記の本開示の実施形態に係る抗AdipoR抗体又はその抗体断片を含む、医薬組成物である。
　本開示の医薬組成物は、上記本開示に係る抗AdipoR抗体又は抗体断片を含む組成物であればそれ以外の成分は特に限定されないが、例えば、薬理学的に許容される担体を含んでいてもよい。
　薬理学的に許容される担体としては、医薬組成物の剤型によって適宜選択されるが、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
　医薬組成物の非経口投与のための剤型は、例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、脳内投与製剤、脊髄内投与製剤棟の注射用製剤、、例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤等の外用剤、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられる。
　例えば、注射用製剤は、通常、抗体を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤等を添加することができる。また、用時調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
　医薬組成物の経口投与のための剤型は、固体又は液体の剤型、具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、トローチ剤等が挙げられる。
　本開示の医薬組成物は、治療上有効な他の薬剤を更に含有していてもよく、また、必要に応じて、殺菌剤、消炎剤、ビタミン類、アミノ酸等の成分を配合することもできる。
　本開示の抗AdipoR抗体を含む医薬組成物は、アディポネクチン関連疾患を治療又は予防するために使用することができる。
　本開示の一実施形態は、上記の本開示の実施形態に係る抗AdipoR抗体又はその抗体断片を含む、アディポネクチン関連疾患の治療又は予防のための医薬組成物である。
　本開示の一実施形態は、有効量の上記の本開示の実施形態に係る抗AdipoR抗体又はその抗体断片、又は該抗AdipoR抗体又はその抗体断片を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む、アディポネクチン関連疾患の治療又は予防方法である。
　本開示の一実施形態は、アディポネクチン関連疾患の治療又は予防用の医薬を製造するための、上記の本開示の実施形態に係る抗AdipoR抗体又はその抗体断片、又は該抗AdipoR抗体又はその抗体断片を含む医薬組成物の使用である。
　本開示の一実施形態は、アディポネクチン関連疾患の治療又は予防のための、上記の本開示の実施形態に係る抗AdipoR抗体又はその抗体断片、又は該抗AdipoR抗体又はその抗体断片を含む医薬組成物である。
　アディポネクチン関連疾患としては、アディポネクチンシグナル経路の異常によって起こりうる疾患や症状であれば特に制限されないが、アディポネクチンの量の低下又はアディポネクチン分子の機能異常等により、アディポネクチン受容体を介したシグナル経路の活性化が減少することによって起こりうる疾患や症状が挙げられる。
　例えば、アディポネクチンによる作用が低下することにより、AMPKシグナル伝達の活性化の低下及び/又はPPARαシグナル伝達の活性化の低下が生じ、引き起こされる疾患であり、例えば、アディポネクチン濃度低下、活性に必要なアディポネクチン多量体形成低下等によって引き起こされる疾患が挙げられる。アディポネクチン濃度低下は、主なアディポネクチン産生細胞である脂肪細胞における産生低下、即ち、肥満等で認められる脂肪細胞の肥大化や薬剤による産生抑制、や脂肪細胞自身の減少により生じうる。
　アディポネクチン関連疾患としてより具体的には、肥満関連疾患、メタボリックシンドローム、脂質異常症、2型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、代謝機能障害関連脂肪肝疾患（MAFLD）、NASH、動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞、癌、乾癬、慢性腎臓病、脱毛症、肝硬変、膵炎、心筋症、全身性強皮症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺線維症等が挙げられる。好ましくは、肥満関連疾患、メタボリックシンドローム、2型糖尿病、NASH、心筋梗塞、脳梗塞、癌、乾癬、慢性腎臓病、肝硬変、膵炎、心筋症、全身性強皮症、COPD及び肺線維症が挙げられ、より好ましくは、肥満関連疾患、メタボリックシンドローム、2型糖尿病及びNASHが挙げられ、さらに好ましくは、NASHが挙げられる。
　抗AdipoR抗体投与により、抗AdipoR抗体が有するAdipoRアゴニスト作用により、糖や脂質の代謝が促進又は改善され、血糖値の低下やインスリン抵抗性の改善等を通じて、上記のような肥満関連疾患、メタボリックシンドローム、脂質異常症、2型糖尿病、NAFLD、MAFLD、NASH、慢性腎臓病、脱毛症等のアディポネクチン関連疾患の治療や予防効果を発揮させることができる。
　アテローム性動脈硬化を呈するマウス、例えばApoE KOマウス等から作製したアディポネクチントランスジェニックマウスでは、アテローム性動脈硬化症の改善が報告されている。例えば、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, p. 2461-2468, 2003等参照。したがって、動脈硬化症、動脈硬化が病態形成に関わる動脈硬化性心疾患、又は心筋梗塞等の虚血性心疾患や脳梗塞において、抗AdipoR抗体投与によってアディポネクチン作用を活性化することにより、これらの疾患に対する治療や予防効果が期待できる。
　子宮内膜癌、結腸直腸癌、乳癌では血中アディポネクチン濃度の低下がリスク因子として報告されている。例えば、Obesity Research & Clinical Practice 13 (2019) 329-339等参照。また、マウス腫瘍モデルでは投与したアディポネクチンが癌細胞の増殖を抑制することが報告されている。例えば、Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101:2476-2481等参照。したがって、抗AdipoR抗体投与によってアディポネクチン作用を活性化することにより、癌に対する治療や予防効果が期待できる。
　乾癬モデルマウスでは，投与したアディポネクチンが乾癬の病態の主役であるT helper 17系免疫反応を抑制することが報告されている。例えば、Nat Commun 6 : 7687, 2015.当参照。したがって、抗AdipoR抗体投与によってアディポネクチン作用を活性化することにより、乾癬に対する治療や予防効果が期待できる。
　また、脂肪萎縮症に関しては、アディポネクチン作用が減少することで生じる合併症、例えば、糖尿病、肝硬変、膵炎、心筋症等の発症予防や病態悪化抑制効果を発揮することができる。
　アディポネクチンノックアウト強皮症モデルマウスでは、野生型モデルマウスに比べて皮膚硬化が有意に亢進しており、アディポネクチントランスジェニック強皮症モデルマウスでは、野生型モデルマウスに比べて有意に低下している。例えば、Scientific Reports, 2017, 7, 4397等参照。したがって、抗AdipoR抗体投与によってアディポネクチン作用を活性化することにより、全身性強皮症に対する治療や予防効果が期待できる。
　アディポネクチンノックアウトマウスは加齢と共にCOPDと類似の病態を呈し、投与したアディポネクチンにより肺気腫の進展が抑制される。例えば、American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2011, 183, 1164-1175等参照。したがって、抗AdipoR抗体投与によってアディポネクチン作用を活性化することにより、COPDに対する治療や予防効果が期待できる。
　マウス肺線維症モデルにおいて投与したアディポネクチンは炎症性細胞浸潤、線維化を有意に抑制する。、例えば、PLOS ONE 2015, 10, e0125169等参照。したがって、抗AdipoR抗体投与によってアディポネクチン作用を活性化することにより、肺線維症に対する治療や予防効果が期待できる。
　投与対象である「対象」は、ヒト、又はヒトを除く哺乳動物、例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、又はチンパンジー等の1種以上を含む。「対象」は、アディポネクチン関連疾患を発症していると診断された患者又はアディポネクチン関連疾患を発症する危険性がある対象であってもよい。
　「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾患の任意の治療を含み、疾患症状を阻害する、即ち、その進行を阻止又は疾病又は症状を消滅させること、及び疾患症状を軽減すること、即ち、疾病又は症状の後退、又は症状の進行の遅延を引き起こすことを含む。
　「予防」とは、哺乳動物、特にヒトにおいて、上記疾患の発症を防止することを含む。
　本開示の抗AdipoR抗体又はその抗原結合断片、又は抗AdipoR抗体又はその抗体断片を含む医薬組成物の投与形態は特に制限されず、経口投与、非経口投与、例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、脳内投与、脊髄内投与、その他局所投与、のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができる。
　本開示の抗AdipoR抗体又はその抗原結合断片、又は抗AdipoR抗体又はその抗体断片を含む医薬組成物の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態及び毒物学的特徴等の薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、等様々な因子を元に、医師により決定されるが、通常、成人、例えば、体重６０ｋｇの成人あたり、経口投与では１～５０００μｇ／日、好ましくは１０～２０００μｇ／日、より好ましくは５０～２０００μｇ／日を、注射投与では１～５０００μｇ／日、好ましくは５～２０００μｇ／日、より好ましくは５０～２０００μｇ／日を、１回又は数回に分けて投与することができる。全身への非経口投与では体重あたり１０～１０００００μｇ／ｋｇ、より好ましくは１００～５００００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは５００～２００００μｇ／ｋｇを１日、１週間、1月間に1回、又は１年間に１～７回の間隔で投与することができる。浸透圧ポンプ等を利用した局所投与では、通常、成人、例えば、体重６０ｋｇの成人あたり、１０～１０００００μｇ／日、より好ましくは１００～１００００μｇ／日、さらに好ましくは５００～５０００μｇ／日の速度で持続注入することができる。
　以下に実施例を挙げて本開示を、より具体的に説明するが、これらは本開示の範囲を制限するものではない。
実施例1　ヒトAdipoR 1タンパク質発現細胞調製
　ヒトAdipoR 1タンパク質、具体的には、配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、と発現マーカーとして蛍光タンパク質EGFPの両遺伝子を発現するベクターを作製し、NS0細胞とCHO細胞を用いて安定発現細胞を樹立した。樹立したNS0細胞とCHO細胞の各々から目視による蛍光タンパク質の産生と定量PCRによるヒトAdipoR1遺伝子発現、なお、使用プライマーは以下に記載、が確認された細胞を選出した。さらに細胞膜での発現を確認するため膜画分を調製し、抗ヒトAdipoR1ポリクローナル抗体（免疫生物研究所）を用いてウェスタンブロッティングを行い、ヒトAdipoR1の産生量が多いものを選定した。
　培養したNS0細胞は免疫原として使用し、CHO細胞は免疫動物の抗体価やヒトAdipoR 1タンパク質結合抗体のスクリーニングに使用した。
実施例2　ヒトAdipoR 2タンパク質発現細胞調製
　ヒトAdipoR 2タンパク質、具体的には、配列表の配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、と発現マーカーとしてEGFPの両遺伝子を発現するベクターを作製し、NS0細胞とCHO細胞を用いて安定発現細胞を樹立した。樹立したNS0細胞とCHO細胞の各々から目視による蛍光タンパク質の産生と定量PCRによるヒトAdipoR2遺伝子発現、なお、使用プライマーは以下に記載、が確認された細胞を選出した。細胞膜での発現確認は特異抗体の入手が困難であったため、蛍光標識ヒト血漿由来adiponectin の細胞への結合を8200 Cellular Detection System（Applied Biosystems）により定量し、結合量が多かったクローンを選定した。培養したNS0細胞は免疫原として使用し、CHO細胞は免疫動物の抗体価やヒトAdipoR 2タンパク質結合抗体のスクリーニングに使用した。
・定量PCRに使用したプライマー
hAdipoR1用 5’ primer; CTGAGCGCTTCTTTCCTGGA（配列番号67）
hAdipoR1用 3’ primer; TCTAGGCCGTAACGGAATTC（配列番号68）
hAdipoR2用 5’ primer; CGAACGCTTTTTCCCTGGCA（配列番号69）
hAdipoR2用 3’ primer; AAACGAAACTCCTGGAGGT（配列番号70）
GAPDH（内部標準）用5’ primer; ATGCCCCCATGTTTGTGATG（配列番号71）
GAPDH（内部標準）用3’ primer; AGCCCTTCCACAATGCCAAA（配列番号72）
実施例3　マウス抗ヒトAdipoRモノク口ーナル抗体の作製
　実施例1で調製したヒトAdipoR1タンパク質発現NS0細胞1-2×107 cells/匹をAdipoR1遺伝子ノックアウトマウスあるいはAdipoR1遺伝子及びAdipoR2遺伝子ノックアウトマウスの背部皮下の数か所に免疫した。その後1～2週間おきに同様にAdipoR1発現NS0を免疫し、数回免疫後に採血した。後述（実施例4）する実施例1及び実施例2で調製したヒトAdipoR1タンパク質発現CHO細胞及びヒトAdipoR2タンパク質発現CHO細胞を用いたフローサイトメトリー法により抗体価を測定した。抗体価の上昇が認められた個体について、ヒトAdipoR1タンパク質発現NS0を1回以上免疫後に脾臓を回収した。
　実施例2で調製したヒトAdipoR2タンパク質発現NS0細胞1-2×107 cells/匹をAdipoR2遺伝子ノックアウトマウスあるいはAdipoR1遺伝子及びAdipoR2遺伝子ノックアウトマウスの背部皮下の数か所に免疫した。
　その後前記のヒトAdipoR1発現NS0細胞の免疫と同様に免疫と採血を行い、実施例1及び実施例2で調製したヒトAdipoR1タンパク質発現CHO細胞及びヒトAdipoR2タンパク質発現CHO細胞を用いたフローサイトメトリー法により抗体価を測定した。抗体価の上昇が認められた個体について、ヒトAdipoR2タンパク質発現NS0を1回以上免疫後に脾臓を回収した。
　細胞融合は前記各個体の脾細胞とその半数のマウスミエローマ細胞（SP2/0、大日本住友製薬）を混合し、遠心して得た沈殿画分にポリエチレングリコール（ロシュアプライドサイエンス）を加えて細胞融合させた。次いで遠心した細胞をD-MEM（インビトロジェン）で2回洗浄した。細胞を10%ウシ胎児血清（インビトロジェン）、1% BM condimed H1 （ロシユ・ダイアグノスティック）及びHAT(シグマアルドリッチ）を含むGIT培地（日本製薬製）に再懸濁し、各ウェル 5×104ミエローマ細胞／wellで96穴プレートに播種した。培養上清を回収し、実施例4のヒトAdipoR1タンパク質発現CHO細胞及びヒトAdipoR2タンパク質発現CHO細胞を用いたフローサイトメトリー法により、ヒトAdipoRタンパク質発現CHO細胞結合能を有する抗体産生細胞のスクリーニングを行った。
　スクリーニングで得られた抗体産生細胞を限界希釈法によりク口一二ングし、17種類のヒトAdipoRタンパク質発現CHO細胞に結合するモノク口ーナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を選定した（表1）。
実施例4　ヒトAdipoR1タンパク質発現CHO細胞及びヒトAdipoR2タンパク質発現CHO細胞を用いたフローサイトメトリー法による抗体の結合性測定
　一定期間培養した細胞をaccutase（Innovative Cell technologies, Inc.）で処理し、分散させた後、0.25% BSA、0.05%NaN3含有PBS（アッセイバッファー）で洗浄後、アッセイバッファーで100倍希釈した血清あるいはハイブリドーマ培養上清と4℃で反応させた。一定時間後、アッセイバッファーで洗浄後、Allophycocyanin標識抗マウスIgG+IgM ポリクローナル抗体（Allophycocyanin-conjugated AffiPure F(ab’)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)、Jackson ImmunoResearch Laboratories）と4℃で反応させた。一定時間後、アッセイバッファーで洗浄後、再度アッセイバッファーに懸濁し、フローサイトメーターにより測定した。
宿主細胞（CHO細胞）に対しても同様に測定した。
実施例5　ハイブリドーマ培養上清からのモノク口ーナル抗体の精製
　実施例3で選定したヒトAdipoRタンパク質発現CHO細胞に結合するモノク口ーナル抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養上清を調製し、IgGに関しては、Anti-Mouse IgG を固定化したアフィニティーカラム（シグマアルドリッチ）、あるいはProtein Aを固定化したアフィニティーカラム（GEヘルスケア）に培養上清をアプライした後、リン酸緩衝液で洗浄し、次いで10m-100 mMグリシン塩酸（pH2.7-3.0)で溶出し、すみやかに中和した。その後、溶出中和液を限外ろ過膜によりPBSに置換した。必要に応じてエンドトキシン除去カラムを用いてエンドトキシン濃度が0.5 EU/mg以下になるように再精製した。
　IgMに関しては、Anti-Mouse IgM を固定化したアフィニティーカラム（シグマアルドリッチ）に培養上清をアプライした後、リン酸緩衝液で洗浄し、次いで10 mMグリシン塩酸（pH2.7)で溶出後、すみやかに中和した。その後、溶出中和液を限外ろ過膜によりPBSに置換した。又はMGPPを主成分とするアフィニティーカラム（関東化学）に培養上清をアプライした後、200 mM 塩化ナトリウム含有 10mM リン酸緩衝液 pH6.8で洗浄し、次いで300 mM リン酸緩衝液（pH6.8）で溶出し、限外ろ過膜によりPBSに置換した。必要に応じてエンドトキシン除去カラムを用いてエンドトキシン濃度が0.5 EU/mg以下になるように再精製した。
　アイソタイピングキット（IsoStrip Mouse Monoclonal antibody Isotyping Kit、口シユ・ダイアグノスティック）を用いて精製抗体のアイソタイプを調べた。いずれも軽鎖はκ、重鎖のほとんどはマウスIgMで、IgGは4つであった（表1）。
実施例6　ヒトAdipoR1タンパク質発現CHO細胞及びヒトAdipoR2タンパク質発現CHO細胞を用いたフローサイトメトリー法によるマウス精製抗体の結合性測定
　実施例5で精製したマウス抗体を実施例4と同様な方法でヒトAdipoR1タンパク質発現CHO細胞及びヒトAdipoR2タンパク質発現CHO細胞に対する結合性を測定したところ、AdipoR1タンパク質発現CHOとヒトAdipoR2タンパク質発現CHOの両方に対する特異的な結合が認められたのは15種類であった（表1）。代表例10-127D11を図1に示す。
実施例7　AMPKリン酸化検出
　実施例5で精製した抗体を用いてadiponectinによる代表的なAdipoR活性化下流シグナルであるAMPKリン酸化活性を調べた。
　マウス筋芽細胞C2C12を2% ウマ血清含有培地に置き換えて培養し、筋管細胞に分化させたのち、無血清培地内でアディポネクチンあるいは抗体を反応させ、当該細胞の溶解物を調製した。リン酸化AMPK抗体（Cell Signaling TECHNOLOGY）とAMPK抗体を用いて（Cell Signaling TECHNOLOGY）を用いたウェスタンブロッティングにより溶解物中のリン酸化AMPKとAMPKの含量を測定し、AMPK当たりのリン酸化AMPK量を算出した。本系でマウスadiponectin （Biovendor）は溶媒コントロールに比べてAMPK当たりのリン酸化AMPK量を有意に上昇させ、AMPKリン酸化活性が検出された（図2）。供試抗体のうち、5種類がコントロール抗体ついてAMPK当たりのリン酸化AMPK量を有意に上昇させ、AMPKリン酸化活性が検出された。その中でIgGタイプは10-127D11のみであった（表1）（図2）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　免疫原は表中のAdipoRを発現するNS0細胞を示す。 結合活性は精製抗体濃度10μg/mL の時のAdipoR1、又はAdipoR2を発現するCHO細胞に対する結合がCHO細胞を使用した場合に比べて高い場合を結合有（+）、変わらない場合を無（-）とした。AMPK活性化は抗体濃度10μg/mLで試験した際のリン酸化AMPK/AMPKの値がコントロール抗体の値に対して有意に高い場合を活性有（+）、有意な差がない場合を活性無（-）とした。
実施例8　マウス抗体遺伝子の配列解析とク口一ニング
　AdipoRアゴニスト抗体10-127D11を産生するハイブリドーマ細胞から、total RNAを抽出した。Total RNAを鋳型にして、逆転写反応により抗体遺伝子をコードするcDNAを合成した。さらにそれらを鋳型に、抗体の軽鎖可変領域、並びに重鎖可変領域の遺伝子をPCR増幅し、大腸菌プラスミドにクローニングした。クローニングした遺伝子配列をPCRで増幅し、シーケンス解析をすることでマウスモノクローナル抗体10-127D11の可変領域のDNA配列を決定した。決定したDNA配列がコードするアミノ酸配列は、以下の通りであった。
軽鎖可変領域アミノ酸配列、即ち、配列表の配列番号3で表されるアミノ酸配列ETTVTQSPASLSMAIGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIENMLSEDVADYYCLQSDNLPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
重鎖可変領域アミノ酸配列、即ち、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列DVKLVESGEGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGDYIYYADTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRALEAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK
実施例9　マウス組換え抗体の調製
　ハイブリドーマ由来の抗AdipoR抗体10-127D11の組換えマウス抗体を調製した。以後、「r127D11」と記載する。
　ハイブリドーマ由来抗体の軽鎖及び重鎖をコードするDNAをpcDNA3.4(Thermo Fisher SCIENTIFC）に挿入し、発現ベクターを作製した。発現ベクターを、 Expi293F細胞（Thermo Fisher SCIENTIFC）にExpiFectamine 293 Transfection Kit（Thermo Fisher SCIENTIFC社製）を用いて導入した。細胞を37℃、8%炭酸ガス条件下で4～6日間培養した後、培養上清を回収した。組換え抗体の精製は、培養上清を、Protein Aを固定化したアフィニティーカラムAF-rProtein A HC-650F（東ソー）あるいはAb-Capcher ExTra（プロテノバ）にアプライし、カラムに結合した抗体をPBSで洗浄後、100 mMグリシン塩酸（pH 3.5）で溶出し、すみやかに中和した後、PBSに置換した。
　使用目的により、精製純度を高める必要がある場合は、ProteinA固定化カラム精製後の抗体を、CeramicHydroxyapatite Type1(CHT)カラム（BIORAD）にて精製した。CHTカラムに結合した抗体を10又は50 mM Na2PO4(pH6. 5), 100 mM NaClで洗浄後、10又は50 mM Na2PO4(pH6.5), 2000 mM NaClを用いてリニアグラジエント溶出した。溶出画分を回収後、PBSに置換した。
実施例10　ヒト化抗体の設計
　まずマウス抗AdipoR抗体10-127D11の軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列、即ち、それぞれ配列表の配列番号3及び4で表されるアミノ酸配列をヒトIgG4抗体の可変領域に移植したマウスヒトキメラ抗体WTを設計した。
　次にマウス抗AdipoR抗体10-127D11の軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列と相同性の高いヒト抗体配列を選定し、選定したヒト抗体配列の各CDR配列部分にマウス抗AdipoR抗体10-127D11の各CDR配列を移植することでマウス抗AdipoR抗体10-127D11のヒト化抗体を設計した。CDRはKabatで定義した。一部、抗原性等を考慮し部分最適化し、計5種類のヒト化抗AdipoR抗体、以後、rH127D11（ver.1）、rH127D11（ver.2）、rH127D11（ver.3）、rH127D11（ver.4）、rH127D11（MTPC）と記載、を設計した。
　各クローンの軽鎖、重鎖、軽鎖可変領域、重鎖可変領域及びCDR配列のアミノ酸配列を表２に示す。また、各クローンの軽鎖及び重鎖をコードする核酸配列を表３に示す。

 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 
実施例11　マウスヒトキメラ抗体とヒト化抗体の調製
　設計したマウスヒトキメラ抗体WTとヒト化抗体のDNAをロンザ社CHOK1SV GSシステムに導入し、培養上清を調製した。一部ヒト化抗体のDNA はpcDNA3.4(Thermo Fisher SCIENTIFC）に挿入し、発現ベクターを作製した。発現ベクターをExpi293F細胞（Thermo Fisher SCIENTIFC社）にExpiFectamine 293 Transfection Kit（Thermo Fisher SCIENTIFC社製）を用いて導入した。細胞を37℃、8%炭酸ガス条件下で4-6日間培養した後、培養上清を回収した。組換え抗体の精製は、培養上清を、Protein Aを固定化したアフィニティーカラム（Ab-Rapid Pure EX、プロテノバ、あるいはMabSelect Sure、GEヘルスケア）にアプライし、PBS等で洗浄後に、カラムに結合した抗体を100 mMグリシン塩酸（pH 3.5）等で酸溶出し、すみやかに中和した後、PBSに置換した。
実施例12　ヒトAdipoR1タンパク質発現CHO細胞及びヒトAdipoR2タンパク質発現CHO細胞を用いたフローサイトメトリー法によるマウスヒトキメラ抗体とヒト化抗体の結合性測定
　ヒト化抗体はマウスヒトキメラ抗体と同様にヒトAdipoR1タンパク質発現CHO細胞及びヒトAdipoR2タンパク質発現CHO細胞に特異的に結合した（図3-1及び図3-2）。
実施例13　高脂肪食負荷マウスを用いた効力試験
Toshimasa Y et al., Nature Medicine (2007) 13: 332-339に記載の方法に準じて、高脂肪食High Fat Diet 32(日本クレア）を雄性C57BL/6 mice(WT mice)にアドリブで給餌することにより高脂肪食負荷マウスを作製した。高脂肪食負荷マウスにAdipoRアゴニスト抗体10-127D11あるいはアイソタイプコントロール抗体（コントロール抗体：医学生物学研究所、M077-3M2）を100μg/headで5日おきに、計3回腹腔内投与した。3回目の投与終了5日後に糖負荷試験（OGTT）を行った。AdipoRアゴニスト抗体10-127D11投与群はアイソタイプコントロール抗体に比べて、糖負荷試験中の血中グルコース（図4a）、血中インスリン（図4b）は低値を示し、インスリン抵抗性インデックス（図4e）は有意に低値を示した。AdipoR1とAdipoR2をノックアウトしたマウスR1・R2 DKO miceを用いて同様な試験を行ったが、いずれの指標においてもAdipoRアゴニスト抗体10-127D11とアイソタイプコントロール抗体間で有意な差は認められなかった（図4c,d,e）。WTマウスで認められたAdipoRアゴニスト抗体10-127D11の作用はAdipoRを介したものであることが示唆された。
実施例14　NASHモデルマウスを用いた効力試験
　Trevaskis JL et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2012) 302: G762-G772を参考に、NASHモデルマウスを作製した。即ち、40 kcal %の高脂肪(、20 kcal %の高フルクトース 、2% w/wの高コレステロール、及びトランス脂肪酸含有飼料（リサーチダイエット、D09100301）を8週令の雄性C57BL/6J Ham Slc-ob/ob マウス（ob/obマウス、日本エスエルシー）にアドリブで給餌することにより作製した。給餌は試験終了まで行った。給餌開始から4週間後に体重、血漿インスリン、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼを指標に群分けし、r127D11あるいはアイソタイプコントロール抗体（コントロール抗体：医学生物学研究所、M077-3M2）を皮下に1回/週で4週間投与した。体重は抗体投与時及び解剖時に測定した。投与期間中及び解剖時の体重についてコントロール抗体とr127D11間で有意な差は認められなかった。抗体投与開始から4週間後に麻酔下で腹部大静脈から採血により致死させた後、肝臓を摘出し、免疫染色用に凍結ブロックを作製し、遺伝子発現解析用にRNAlater（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に一晩浸漬後使用まで凍結（-80℃）保存した。
　炎症性マクロファージのマーカーF4/80を抗マウスF4/80 抗体（T-2028、BMA Biomedicals）を用いて免疫染色法により検出したところ、r127D11投与群のF4/80陽性面積はコントロール抗体投与群に比し、有意に低値を示した（p＜0.05, Student's t－検定）（図5）。
　凍結保存した肝臓からtotal RNAを抽出し、Total RNAを鋳型にして、逆転写反応により調製したcDNAと表４に示すプライマー、プローブ（TaqMan Gene expression Assay、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて各遺伝子の発現をReal-Time PCR system 7500 Fast（Applied Biosystems）により定量解析したところ、r127D11投与群では炎症性サイトカインinterleukin 6（Il6）, 炎症性ケモカインchemokine (C-C motif) ligand 2（Ccl2）の発現がコントロール抗体投与群に比し、有意に低値を示し（Il6: p＜0.05、 Ccl2: p＜0.01, Student's t－検定）（図5）、抗炎症作用を裏付ける結果が示された。r127D11投与群では線維化促進に働くtissue metallopeptidase inhibitor 1（Timp1）の遺伝子発現に関してもコントロール抗体投与群に比し、有意に低値を示し（p＜0.05, Student's t－検定）（図5）、線維化の亢進を抑制する作用も認められた。AdipoR1 下流シグナルで脂肪合成関連遺伝子acetyl-CoA carboxylase 1（Acc）は、r127D11投与群でコントロール抗体投与群に比し、有意に低値を示した（p＜0.05, Student's t－検定）（図5）。AdipoR2 下流シグナルのPPARα遺伝子（Ppara）は、r127D11投与群でコントロール抗体投与群に比し、有意に高値を示した（p＜0.05, Student's t－検定）（図5）。
　以上の結果から、r127D11はNASH病態において治療効果を示す可能性が示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

Claims (16)

  1. LCDR1が配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を含み、LCDR2が配列番号１９又は２０のアミノ酸配列を含み、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
  2. ａ）LCDR1が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、LCDR2が配列番号１９のアミノ酸配列を含み、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、及び
    b）LCDR1が配列番号１8のアミノ酸配列を含み、LCDR2が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    から選択される、請求項１に記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
  3. ａ）LCDR1が配列番号１７のアミノ酸配列からなり、LCDR2が配列番号１９のアミノ酸配列からなり、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列からなり、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列からなり、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列からなり、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列からなる、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、及び
    b）LCDR1が配列番号１８のアミノ酸配列からなり、LCDR2が配列番号２０のアミノ酸配列からなり、LCDR3が配列番号２１のアミノ酸配列からなり、HCDR1が配列番号２２のアミノ酸配列からなり、HCDR2が配列番号２３のアミノ酸配列からなり、HCDR3が配列番２４のアミノ酸配列からなる、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    から選択される、請求項１に記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
  4. ａ）配列番号３のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号４のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    b）配列番号２７のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号２８のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    c）配列番号２９のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号３０のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    d）配列番号３１のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号３２のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    e）配列番号３３のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号３４のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    f）配列番号３５のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号３６のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、並びに
    g）配列番号３７のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号３８のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一性のあるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    から選択される、請求項１に記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
  5. ａ－１）配列番号２５のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
    配列番号２６のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    b－１）配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
    配列番号６のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    c－１）配列番号７のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
    配列番号８のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    d－１）配列番号９のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
    配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    e－１）配列番号１１のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
    配列番号１２のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    f－１）配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
    配列番号１４のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、並びに
    g－１）配列番号１５のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
    配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片、
    から選択される、請求項１に記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
  6. 抗アディポネクチン受容体抗体が、抗アディポネクチン受容体アゴニスト抗体である、請求項１に記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
  7. 抗アディポネクチン受容体抗体がアディポネクチン受容体１及びアディポネクチン受容体２に結合する抗体である。請求項１に記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
  8. 抗アディポネクチン受容体抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
  9. 抗アディポネクチン受容体抗体がヒトIgGの定常領域を有する、請求項１に記載の抗アディポネクチン受容体抗体又はその抗体断片。
  10. 請求項１～９のいずれか１項に記載の抗アディポネクチン抗体又はその抗体断片をコードする塩基配列を含む核酸分子。
  11. 請求項１０に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
  12. 請求項１１に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
  13. 請求項１～９のいずれか１項に記載の抗アディポネクチン抗体又はその抗体断片の製造方法であって、請求項１２に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
  14. 請求項１～９のいずれか１項に記載の抗アディポネクチン抗体又はその抗体断片を含む、医薬組成物。
  15. アディポネクチン関連疾患の予防又は治療のための請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. アディポネクチン関連疾患が、肥満関連疾患、メタボリックシンドローム、脂質異常症、2型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患、代謝機能障害関連脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞、癌、乾癬、慢性腎臓病、脱毛症、肝硬変、膵炎、心筋症、全身性強皮症、慢性閉塞性肺疾患及び肺線維症からなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
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