BR112020010632A2 - anticorpos que reconhecem especificamente o fator de necrose tumoral 1 humano (hutnfr1) e seu uso médico - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS QUE RECONHECEM ESPECIFICAMENTE O FATOR DE NECROSE TUMORAL 1 HUMANO (huTNFR1) E SEU USO MÉDICO. A invenção se refere a anticorpos que reconhecem especificamente o fator de necrose tumoral 1 humano (huTNFR1), para uso no tratamento de esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e condições de doença associadas a ela.

Description

1 / 70 “ANTICORPOS QUE RECONHECEM ESPECIFICAMENTE O FATOR DE NECROSE TUMORAL 1 HUMANO (huTNFR1) E SEU USO MÉDICO”

CAMPO

[001] A invenção se refere a um novo tratamento de esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e condições de doença associadas a ela.

HISTÓRICO

[002] A doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) representa um espectro de doença que ocorre na ausência de abuso de álcool e inclui esteato- hepatite não alcoólica (NASH). A NAFLD mostra uma incidência crescente nos países ocidentais e contribui criticamente para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular.

[003] Um passo fundamental ao longo da sequência da esteatose hepática benigna em direção à esteato-hepatite progressiva é a ocorrência de morte celular por hepatócitos, classificada como apoptose. A necroptose emergiu como uma via alternativa programada de morte celular e foi ativada em fígados de pacientes com NASH (Gautheron et al. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology 2015, 1:264-266).

[004] Aparicio-Vergara et al. (Hepatology 2013, 57 (2): 566-576) descrevem o papel do derramamento de ectodomínio TNFR1 na prevenção do desenvolvimento de esteatose hepática ou resistência à insulina. A incapacidade do derramamento de TNFR1 não resultou em obesidade, resistência à insulina ou esteatose hepática em camundongos. No entanto, camundongos compreendendo uma mutação sem derramamento mostraram uma rápida progressão em direção à NASH. A ativação do derramamento de ectodomínio TNFR1 foi essencial para atenuar a progressão para NASH.

[005] Cubero et al. (Cell Death and Differentiation 2013, 20:1580-1592)

2 / 70 descrevem que o TNFR1 em hepatócitos e células imunológicas tem papéis diferentes em um modo de ação na doença hepática crônica.

[006] Tomita et al. (Gut 2006, 55:415-424) descrevem que o aprimoramento da via de sinalização mediada por TNFa/TNFR pode estar criticamente envolvido na patogênese da fibrose hepática em um modelo animal da NASH.

[007] Yaron Ilan (AASLD Liver Learning. Ilan Y. Nov 8 2014; 60709) divulga imunoterapia oral baseada em anti-TNF para o tratamento de doença hepática gordurosa. Uma proteína de fusão anti-TNF (PRX-106) que se liga ao TNFα foi usada em um modelo de camundongo com dieta rica em gordura.

[008] Verificou-se que os anticorpos contra o TNFR1 tinham um potencial agonístico ao induzir uma resposta imitando o ligando. Esta resposta sugere que a transdução de sinal é iniciada pela agregação de receptores pela ligação dos trimers TNF multivalentes.

[009] No entanto, a inibição seletiva de TNFR1 pode ser alcançada com anticorpos específicos para TNFR1. Por exemplo, um anticorpo monoclonal de murino, H398 e anticorpo descrito em US5736138, com seletividade para TNFR1 humano, mostrou inibição potente da transdução de sinal mediada por TNF e citotoxicidade (Moosmayer et al. 1995, Ther. Immunol. 2:31-40).

[010] Uma versão humanizada do H398 é descrita por WO2008/113515A2.

[011] O documento WO2012035141 divulga um anticorpo anti-huTNFR1 que é deficiente na mediação da função efetora.

[012] Anticorpos anti-huTNFR1 monovalentes são descritos em WO2017174586 A1.

[013] Zettlitz et al. (LandesBioscience 2010, November/Dezember:639-647) descrevem a geração de um anticorpo monoclonal antagonista específico para

3 / 70 TNFR1 humanizado.

[014] Richter et al. (PLOS One 2013, 8(8):1-13) descrever o uso de um anticorpo anti-TNFR1 antagonista humanizado para a inibição seletiva da sinalização do TNFR1 para reduzir a atividade pró-inflamatória do TNF, deixando o TNFR2 intocado.

[015] Berger et al. (Protein Engineering, Design & Selection 2013, 26(10):581-587) descrever uma proteína de fusão scFv-HAS anti-TNFR1 como antagonista seletivo da ação do TNF. Feagins et al. (Eur J Gastroenterol Hepatol.

2015, 27(10):1154-1160) descrevem que pacientes tratados com inibidores do fator de necrose tumoral (TNFi) desenvolvem doença hepática gordurosa não alcoólica (NASH ou esteatose).

[016] As possibilidades terapêuticas do tratamento da NASH são limitadas e restritas a modificações no estilo de vida, uma vez que medicamentos específicos não estão disponíveis até o momento. Existe, portanto, a necessidade de fornecer um tratamento efetivo das atividades de NASH e doenças associadas a ele.

RESUMO DA INVENÇÃO

[017] O objetivo da invenção é proporcionar um tratamento melhorado de NASH e respectivas condições de doença.

[018] O objetivo é resolvido pelo objeto da invenção.

[019] A invenção prevê o novo uso médico de anticorpos que reconhecem especificamente o fator de necrose tumoral 1 humano (huTNFR1) para o tratamento de pacientes que sofrem de NASH e/ou particularmente qualquer uma das doenças associadas à NASH, entre elas a esteatose hepática, a atividade da doença NAFLD (NAS), apoptose, fibrose e altos níveis de alanina transaminase (ALT) e insulina.

Portanto, a invenção prevê o novo tratamento médico de pacientes que sofrem de

4 / 70 NASH e doenças associadas a ele.

[020] Especificamente, a invenção fornece um anticorpo que reconhece especificamente o huTNFR1, para uso no tratamento de esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e condições de doença associadas a ele.

[021] De acordo com um aspecto específico, o anticorpo é um anticorpo isolado.

[022] De acordo com um aspecto específico, o anticorpo é um anticorpo monoclonal e/ou recombinante.

[023] De acordo com um aspecto específico, o anticorpo reconhece especificamente um epítopo no CRD1 distal da membrana e/ou subdomínio A1 do CRD2 do huTNFR1, preferencialmente reconhecendo especificamente um epítopo representado pelo aminoácido 1 a 115 ou 1 a 70 no terminal N região de huTNFR1.

Especificamente, a sequência de huTNFR1 é identificada como SEQ ID NO:32.

[024] De acordo com uma modalidade específica, o anticorpo é um anticorpo monoespecífico, bivalente de comprimento total ou um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno.

[025] De acordo com outra modalidade específica, o anticorpo é um ligante monovalente do huTNFR1, compreendendo apenas um local de ligação ao antígeno que tem uma especificidade para se ligar ao huTNFR1. Especificamente, o anticorpo reconhece monovalentemente o huTNFR1.

[026] De acordo com uma modalidade específica, o anticorpo é selecionado do grupo “anticorpo monovalente” que consiste de moléculas Fab, moléculas scFv, domínios variáveis únicos, Fv estabilizado com dissulfeto (dsFv), anticorpos semi- IgG1 e domínios Fv, ou um domínio funcionalmente ativo derivado de qualquer um dos anteriores, de preferência em que a construção de anticorpo é acoplada a um

5 / 70 polímero hidrofílico, como PEG, e/ou fundido a um polipeptídeo, como albumina sérica humana (ou camundongo), transferrina, domínios ou peptídeos de ligação à albumina, domínios ou peptídeos de ligação à Ig, extensões polipeptídicas miméticas ao PEG, um fragmento Fc do anticorpo, um fragmento Fc do anticorpo transportando mutações para permitir a heterodimerização preferida (sob homodimerização) ou uma variante funcional de qualquer um dos polipeptídeos anteriores.

[027] Especificamente, o anticorpo é qualquer um dos domínios Fab, scFv, dsFv ou Fv, que é fundido com um fragmento Fc do anticorpo, em que o Fc consiste de um heterodímero dos domínios CH2 e CH3, em que os domínios CH2 e/ou CH3 carregam um ou mais mutações pontuais que permitem heterodimerização preferencial sobre homodimerização. Especificamente, um ou ambos os domínios CH3 no Fc são modificados para alterar a estrutura de aminoácidos, de modo a obter um Fc contendo o heterodímero dos domínios CH3/CH3.

[028] Especificamente, a construção de anticorpo compreende domínios Fv fundidos com uma região ou fragmento Fc do anticorpo, com ou sem domínios adicionais de anticorpo, mantendo a estrutura de ligação monovalente do anticorpo.

Um exemplo específico refere-se a uma fração Fab ou Fv fundido a Fc ou Fc modificado.

[029] Um anticorpo preferido compreende uma cadeia pesada e uma leve, em que a cadeia pesada consiste de um domínio VH, um domínio CH2 e um CH3, incluindo opcionalmente ainda um ou mais aglutinantes; e a cadeia leve consiste de um domínio VL, um domínio CH2 e um CH3, opcionalmente incluindo ainda um ou mais aglutinantes.

[030] Modalidades específicas compreendem uma IgG1 Fc humana em que

6 / 70 os domínios CH2-CH3 formam um heterodímero por meio de uma ou mais mutações de “knobs-into-holes”, por exemplo

[031] mutações “knobs” que modificam a superfície das folhas beta CH3, presentes em um monômero de domínio CH3, que é T366W; e

[032] mutações “holes” que modificam a superfície das folhas beta CH3, presentes no outro monômero de domínio CH3, que são selecionadas do grupo que consiste em T366S, L368A, Y407V.

[033] Especificamente, o anticorpo compreende uma região Fc que compreende uma ou mais mutações para submodular a função efetora. De acordo com um aspecto específico, a região Fc é glicoengenharia para submodular a função efetora.

[034] De acordo com uma modalidade específica, a construção de anticorpo compreende uma região IgG1 Fc humana ou artificial que é uma variante funcional de uma IgG1 Fc humana com pelo menos qualquer uma das identidades de sequência 60%, 70%, 80%, 85% ou 90% de sequência, que é modificado para diminuir a função efetora. De preferência, a região Fc compreende uma cadeia pesada com pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em E233P, L234V, L235A, G236, A327G, A330S and P331S, preferencialmente compreendendo A327G/A330S/P331S, (numeração de índice Kabat EU). De preferência, pelo menos duas das referidas mutações, mais preferencialmente pelo menos três, quatro, cinco ou todas as seis mutações são manipuladas na sequência Fc. SEQ ID NO:31 identifica a sequência de IgG1 Fc humana

[035] Especificamente, o anticorpo é PEGuilado, HESilado ou PSAilado.

[036] Especificamente, o anticorpo é peguilado com um PEG de peso molecular variando entre 5.000 e 150.000 g/mol. Construções de anticorpos

7 / 70 exemplares, como Fabs, são peguiladas com PEG 40.000.

[037] Especificamente, o anticorpo é um meio anticorpo IgG1, caracterizado por apenas uma parte Fab, uma região de articulação e uma parte Fc, em que a região de articulação e/ou a parte Fc (particularmente a IgG1 Fc humana) compreende uma ou mais mutações para evitar lesões pesadas. dimerização da cadeia (Gu et al. (2015) PLoS One 10(1):e0116419), por exemplo, selecionado do grupo que consiste em - mutações na região da articulação (SEQ ID NO:33): C226S, C229S (Numeração da UE) e - mutações na parte Fc: P395A, F405R, Y407R, K409D (Numeração UE).

[038] Especificamente, o anticorpo é uma proteína de fusão Fv-Fc, em que o Fv consiste de um par de domínio VH/VL, e em que o VH é fundido a uma primeira cadeia de domínio CH2-CH3 através de uma primeira região de articulação/aglutinante, e o VL é fundido a uma segunda cadeia de domínio CH2- CH3 através de uma segunda região de articulação/aglutinante. Preferencialmente, a primeira e a segunda cadeias de domínio CH2-CH3 diferem entre si em uma ou mais mutações pontuais, de modo a permitir a heterodimerização preferencial entre a primeira e a segunda cadeia de domínio CH2-CH3, obtendo assim uma preparação Fv-Fc que é caracterizada pela Heterodímero Fc, por exemplo, através de mutações “knobs-into holes”, conforme indicado acima.

[039] Especificamente, o anticorpo compreende um Fv estabilizado com dissulfeto (dsFv), que é caracterizado por uma ou mais ligações dissolvidas de interdomínio (artificial) adicionais. Tais ligações dissulfeto são obtidas através da introdução de um ou mais resíduos de cisteína adicionais em um dos domínios VH e VL em posições adequadas que podem ser usadas como um píer de pontes de

8 / 70 ligações dissulfeto que interligam os domínios VH e VL, cujas ligações dissulfeto são obtidas após a redução da cisteínas. De acordo com exemplos específicos, uma ligação dissulfeto pode ser introduzida no Fv em qualquer uma das seguintes posições em VH e posições correspondentes em VL: 44C em VH e 100C em VL, 108C em VH e 55C em VL, 106C em VH e 56C em VL, ou 101C em VH e 46C em VL.

[040] Especificamente, o anticorpo compreende a) um domínio variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as regiões determinantes da complementaridade (CDRs): VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3; e b) um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo as CDRs: VL- CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3, em que i) VH-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1; VH-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 2 VH-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3 VL-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 4 VL-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 5 VL-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 6; ou ii) VH-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 23; VH-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 24 VH-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 25 VL-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 26

9 / 70 VL-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 27 VL-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 28; em que a numeração está de acordo com o índice Kabat EU; ou uma variante funcionalmente ativa de qualquer um dos i) ou ii) acima, que compreende 0, 1 ou 2 (ou até 1, isto é, 0 ou 1) mutações pontuais em cada uma das sequências de CDR e que reconhece especificamente o huTNFR1.

[041] Especificamente, o anticorpo compreende um VH e um VL, em que VH-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1; VH-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 2; VH-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3; VL-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 4; VL-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 5; e VL-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 6; em que a numeração está de acordo com o índice Kabat EU; ou uma variante funcionalmente ativa da mesma compreendendo até 1 (isto é, 0 ou 1) mutação pontual em qualquer uma ou mais, ou em cada uma das sequências CDR, e que reconhece especificamente o huTNFR1.

[042] Especificamente, as sequências VH e VL são caracterizadas pelas sequências VH- e VL-CDR, em que i) VH-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1; VH-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 10, em que X na posição 5 é S; VH-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3;

10 / 70 VL-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 4; VL-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 5; e VL-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 11, em que X na posição 3 é G; ou ii) VH-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1; VH-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 10, em que X na posição 5 é S; VH-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3; VL-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 4; VL-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 5; e VL-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 11, em que X na posição 3 é S;

[043] Especificamente, o anticorpo compreende uma sequência de VH que compreende ou consiste de SEQ ID NO: 7 ou 9; e uma sequência VL que compreende ou consiste de SEQ ID NO: 8 ou 10, ou uma variante funcionalmente ativa da mesma, compreendendo até 1 ponto de mutação em qualquer uma ou mais, ou em cada uma das sequências CDR, e pelo menos 60% de identidade de sequência em qualquer uma ou mais, ou em cada uma das sequências estruturais (FR) FR1-4 de VH e VL.

[044] Combinações específicas de VH/VL compreendendo um local de ligação ao antígeno capaz de reconhecer e se ligar especificamente ao huTNFR1 são: a) uma sequência de VH que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 7; e uma sequência de VL que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 8; ou

11 / 70 b) uma sequência de VL que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 9; e uma sequência VL que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 10.

Especificamente, o anticorpo é um fragmento de anticorpo de comprimento total ou de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste em um Fab, que compreende: a) uma sequência de cadeia pesada (HC) que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 11; e b) uma sequência de cadeia leve (LC) que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 12; ou uma variante funcionalmente ativa da mesma, compreendendo até 1 ponto de mutação em qualquer um ou mais, ou em cada uma das sequências CDR dos domínios VH e VL compreendidos no HC e LC, respectivamente, e pelo menos 60% de identidade de sequência em qualquer um ou mais, ou em cada uma das sequências FR FR1-4 dos domínios VH e VL.

[045] Especificamente, o anticorpo compreende: a) uma sequência HC que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 18; e b) uma sequência LC que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 13; ou uma variante funcionalmente ativa da mesma, compreendendo até 1 ponto de mutação em qualquer um ou mais, ou em cada uma das sequências CDR dos domínios VH e VL compreendidos no HC e LC, respectivamente, e pelo menos 60% de identidade de sequência em qualquer um ou mais, ou em cada uma das sequências FR FR1-4 dos domínios VH e VL.

[046] Variantes funcionalmente ativas específicas de um anticorpo compreendendo o HC identificado pela SEQ ID NO: 18 e o LC identificado pela SEQ ID NO: 13, compreendem

12 / 70 um HC consiste em: a) um VH que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 19, ou pelo menos as sequências CDR contidas na referida sequência VH; b) uma sequência ligante que consiste em 4-10 aminoácidos, por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos, de preferência consistindo em um número de glicina, serina ou treonina, em qualquer combinação, como por exemplo, o ligante que consiste em SEQ ID NO: 15; c) um domínio CH2 que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 16; e d) um domínio CH3 que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 20; e um LC consiste em: a) um VL que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 14, ou pelo menos as sequências CDR contidas na referida sequência VH; b) uma sequência ligante que consiste em 4-10 aminoácidos, por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos, de preferência consistindo em um número de glicina, serina ou treonina, em qualquer combinação, como por exemplo, o ligante que consiste em SEQ ID NO: 15; c) um domínio CH2 que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 16; e d) um domínio CH3 que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 17.

Especificamente, esse anticorpo de ligação ao antígeno é codificado por uma ou mais moléculas de ácido nucleico compreendendo a) a sequência codificadora de HC SEQ ID NO: 22; e b) a sequência de codificação LC SEQ ID NO: 21; ou uma variante funcionalmente ativa da mesma, compreendendo até 1 ponto de mutação em qualquer um ou mais, ou em cada uma das sequências CDR dos

13 / 70 domínios VH e VL compreendidos no HC e LC, respectivamente, e pelo menos 60% de identidade de sequência em qualquer um ou mais, ou em cada uma das sequências FR FR1-4 dos domínios VH e VL.

[047] De acordo com uma modalidade específica, o anticorpo compreende o local de ligação ao antígeno caracterizado pela seguinte combinação de seis sequências de CDR, que compreende ou consiste em: SEQ ID NO:23: VH-CDR1; SEQ ID NO:24: VH-CDR2; SEQ ID NO:25: VH-CDR3; SEQ ID NO:26: VL-CDR1; SEQ ID NO:27: VL-CDR2; e SEQ ID NO:28: VL-CDR3; ou uma variante funcionalmente ativa da mesma compreendendo até 1 mutação pontual em qualquer uma ou mais, ou em cada uma das sequências CDR, e que reconhece especificamente o huTNFR1.

[048] Especificamente, o anticorpo compreende um local de ligação ao antígeno incorporado em um domínio VH e VL, em que a) o VH compreende ou consiste em SEQ ID NO: 29; e b) a VL compreende ou consiste em SEQ ID NO: 30; ou uma variante funcionalmente ativa da mesma, compreendendo mutações pontuais de 0, 1 ou 2 (ou até 1) em qualquer um ou mais, ou em cada uma das sequências CDR dos domínios VH e VL e pelo menos 60% de identidade de sequência em qualquer um ou mais, ou em cada uma das sequências FR FR1-4 dos domínios VH e VL.

[049] Especificamente, o anticorpo compreende um domínio VH e VL, em

14 / 70 que pelo menos um dos domínios VH e VL é uma variante funcional maturada por afinidade de um domínio parental compreendendo pelo menos uma mutação pontual em qualquer uma das sequências da região determinante complementar (CDR), em que a) o domínio VH parental é caracterizado pelas sequências de CDR: SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 25; e b) o domínio VL parental é caracterizado pelas sequências de CDR: SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28.

[050] Especificamente, a referida pelo menos uma mutação pontual está em qualquer uma das SEQ ID NO: 24 e/ou SEQ ID NO:28.

[051] Especificamente, qualquer um dos anticorpos exemplares (que são os anticorpos caracterizados pelas sequências aqui fornecidas), pode ser usado de acordo com a invenção. Da mesma forma, quaisquer anticorpos alternativos que compreendem o mesmo local de ligação ao antígeno e/ou têm a mesma especificidade de ligação ao alvo podem ser utilizados. Anticorpos alternativos particulares são aqueles que são variantes funcionais dos anticorpos exemplares, em que qualquer um dos anticorpos exemplares pode ser usado como um “parental” para produzir uma variante, que tem a função de reconhecer especificamente o alvo huTNFR1.

[052] Especificamente, o anticorpo é um anticorpo amadurecido por afinidade de um anticorpo parental, caracterizado pelas sequências aqui fornecidas, em particular em que 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das sequências CDR são variantes de CDR funcionalmente ativas compreendendo até 1 mutação pontual em comparação com a respectiva CDR no anticorpo parental.

[053] Em modalidades específicas, um anticorpo variante funcionalmente

15 / 70 ativo compreende apenas mutações de 0, 1, 2 ou 3 pontos em cada uma das sequências de CDR, preferencialmente apenas mutações de 0, 1 ou 2 pontos em cada uma das sequências de CDR, em que uma mutação de ponto é qualquer substituição, inserção ou deleção de um aminoácido.

[054] Qualquer uma das variantes funcionalmente ativas de um anticorpo (um anticorpo parental) aqui descritas é caracterizada especificamente pela especificidade de ligação ao huTNFR1. A variante funcionalmente ativa pode compreender uma ou mais sequências FR mutantes, que incluem uma ou mais, por exemplo, várias mutações pontuais, por exemplo, até 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 mutações pontuais para obter uma sequência variante com pelo menos 60% de identidade de sequência ou pelo menos 70% identidade de sequência, ou pelo menos 80% de identidade de sequência, ou pelo menos 90% de identidade de sequência, em comparação com a respectiva sequência FR no anticorpo parental.

[055] Especificamente, o anticorpo compreende uma fração de ligação ao antígeno que se liga ao huTNFR1 com um KD inferior a 10-8M ou 5x10-9M e um koff inferior a 10-3 s-1. A afinidade das características de ligação e ligação (associação e dissociação) é determinada especificamente em um teste padrão para determinar a ligação monovalente, excluindo substancialmente os efeitos de avidez da ligação divalente. Um teste padrão é baseado na medição por microbalança de cristal de quartzo (QCM) à temperatura fisiológica (cerca de 37°C ou a 37°C +/- 1°C). Essa medição de afinidade é particularmente realizada em um formato Fab. Assim, se o anticorpo for outro que não uma molécula Fab, o local de ligação ao antígeno é particularmente introduzido em uma respectiva molécula Fab para medição de afinidade por QCM a 37°C. Isso garante a comparabilidade dos resultados da medição de afinidade de ligantes monovalentes, independentemente dos efeitos de

16 / 70 avidez que possam interferir na medição de afinidade. O QCM especificamente preferido é realizado a uma densidade moderada do receptor. Especificamente, a afinidade da construção do anticorpo que se liga ao huTNFR1 é determinada para o formato Fab por QCM a 37°C e densidade moderada do receptor dentro da faixa de 50-100 Hz, por exemplo, a cerca de 50 Hz, ou a 50 Hz +/- 10 Hz, ou a 50 Hz +/- 5 Hz.

[056] Especificamente, KD é menor que 4x10-9 M, ou menor que 3x10-9 M, ou menor que 2x10-9 M, ou menor que 10-9 M, ou menor que 10-10 M

[057] Especificamente, o koff é menor que 10-3, ou menor que 5x10-4 s-1, ou menor que 10-4 s-1, ou menor que 10-5 s-1.

[058] Especificamente, a fração de ligação ao antígeno está reconhecendo o huTNFR1 com um kon de pelo menos 105 M-1s-1.

[059] De acordo com um aspecto específico, as condições da doença são esteatose hepática, fígado inflamado, fibrose hepática (ou apoptose) e carcinoma hepatocelular. Especificamente, é tratado um paciente com NASH que corre o risco de se desenvolver ou já sofre de alguma das condições da doença. Vários indicadores de NASH ou condições de doenças relacionadas incluem a atividade da doença NAFLD (NAS) e altos níveis séricos de ALT e insulina, que podem ser efetivamente reduzidos pelo tratamento aqui descrito.

[060] Especificamente, o paciente também sofre de diabetes mellitus tipo II, diabetes mellitus tipo I, pré-diabetes, resistência à insulina ou obesidade, em que a obesidade é definida como o paciente com um índice de massa corporal de ≥ 30.

[061] Especificamente, o anticorpo é administrado ao paciente em uma quantidade eficaz. Especificamente, a quantidade é eficaz para antagonizar a sinalização de TNFa/huTNFR1. É especificamente preferido que o anticorpo seja um

17 / 70 anticorpo antagonista, evitando assim a sinalização e transdução mediada por TNFa/TNFR substanciais, conforme medido em um ensaio baseado em células.

Qualquer um dos anticorpos aqui descritos e caracterizados pelas sequências de anticorpos aqui fornecidas são particularmente entendidos como anticorpos antagônicos.

[062] De acordo com um aspecto específico, o anticorpo inibe diretamente a interação do receptor TNF - huTNFR1 conforme determinado em um ensaio baseado em células, preferencialmente por um ensaio para inibição da morte celular mediada por TNFR1 em células Kym-1 ou por um ensaio para inibição de liberação de IL-6 ou IL-8 a partir de células HeLa ou células HT1080, respectivamente.

Especificamente, em um ensaio para inibição da morte celular mediada por TNFR1 em células Kym-1, o valor de IC50 é inferior a 5,0 x 10-9 M. Especificamente, em um ensaio para inibição da liberação de IL-6 a partir de células HeLa, o valor de IC50 é inferior a 4,0 x 10-8 M, ou num ensaio para inibição da liberação de IL-8 a partir de células HT1080, o valor de IC50 é inferior a 2,0 x 10-8 M.

[063] De acordo com uma modalidade específica, é utilizado um anticorpo que se liga ao huTNFR1 por interação monovalente e tem um risco diminuído de exibir uma atividade agonística mimética ao TNF. Especificamente preferidos são os anticorpos com uma alta afinidade de ligação ao TNFR1 e uma baixa taxa de interrupção, que fornece inibição superior das respostas ao TNF dependentes do TNFR1.

[064] Especificamente, o anticorpo aqui descrito é fornecido em uma preparação farmacêutica compreendendo o anticorpo e um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Devido às propriedades antagonistas do anticorpo, a preparação farmacêutica pode compreender altas concentrações de anticorpos,

18 / 70 evitando os efeitos colaterais resultantes da atividade agonística.

[065] Especificamente, a preparação farmacêutica é formulada para uso parenteral, preferencialmente por administração intravenosa ou subcutânea.

[066] Especificamente, o anticorpo aqui descrito possui baixa imunogenicidade e pode ser utilizado repetidamente sem formação de inibidores, como anticorpos antifármacos (ADA).

[067] Surpreendentemente, descobriu-se que os anticorpos aqui descritos, particularmente anticorpos monovalentes, podem ser utilizados para o tratamento de pacientes que desenvolvem ADA, por exemplo, que desenvolveram anticorpos contra imunoglobulina ou imunoterapêutica de anticorpos. Na arte anterior, a presença de tal ADA excluiria particularmente outras imunoterapias com anticorpos direcionados contra o TNFR1, porque o ADA tem o potencial de reticular os anticorpos após a ligação do TNFR1 na superfície da célula, agonizando potencialmente a sinalização do TNFR1. No entanto, os anticorpos aqui descritos não agonizam (ou substancialmente não) a sinalização do TNFR1, mesmo na presença de ADA.

[068] Especificamente, a preparação farmacêutica aqui descrita pode ser administrada a pacientes que desenvolveram ADA, por exemplo, ADA contra anticorpos anti-huTNFR1 ou quaisquer estruturas IgG.

[069] Especificamente, a quantidade eficaz do anticorpo é administrada a um paciente que sofre de NASH, para reduzir qualquer um ou mais a) esteatose, conteúdo de triglicerídeos, inflamação e/ou apoptose no tecido hepático; b) o nível sérico de aminotransferase; c) resistência à insulina e, opcionalmente, para melhorar a tolerância à

19 / 70 glicose; e/ou d) o escore da atividade da NAFLD.

[070] Especificamente, o anticorpo é administrado a um paciente que sofre de NASH a uma dose que varia de 0,05 mg/kg a 20 mg/kg, preferencialmente 0,2 mg/kg a 6 mg/kg. A quantidade eficaz em seres humanos pode ser deduzida da dose terapeuticamente eficaz no modelo de camundongo descrito (20 mg/kg). Uma HED (dose equivalente humana) é de ~ 1-2 mg/kg.

[071] As doses de anticorpo preferidas são, por exemplo, variação de 0,5 a 1000 mg, preferencialmente 1-400 mg. Se administrada por via subcutânea, a dosagem preferida varia de 0,5 a 400 mg.

[072] De acordo com um aspecto específico, o anticorpo é administrado ao paciente em uma quantidade terapeuticamente eficaz por administração sistêmica, preferencialmente por infusão intravenosa ou injeção em bolus.

[073] De acordo com uma modalidade específica, o anticorpo é administrado repetidamente ao paciente com, por exemplo, semanalmente, injeções i.v. ou s.c., numa dose de, por exemplo, 0,5-5 mg/kg, em particular cerca de 2 mg/kg. A frequência e a dose do medicamento administrado podem ser adaptadas ao estado da doença e à resposta à terapia.

[074] Especificamente, o anticorpo é administrado a um paciente que sofre de NASH em combinação com um tratamento dietético. O tratamento com anticorpos pode ser especificamente combinado com drogas anti-inflamatórias, como NSAP / NSAID, ou terapias usando um agonista do receptor X farnesóide (FXR), um agonista do receptor peptídeo-1 do tipo glucagon (GLP1R) ou um receptor ativado por proliferador de peroxissomo (PPAR) agonista.

[075] Salvo indicação em contrário, as posições são numeradas de acordo

20 / 70 com o índice da UE de Kabat. Uma explicação do esquema de numeração de Kabat pode ser encontrada em Kabat, EA, et al., Sequências de proteínas de interesse imunológico (publicação do NIH nº 91-3242, 5ª edição (1991)).

FIGURAS

[076] Figura 1: Os camundongos B6-huTNFR1-k/i receberam uma dieta rica em gorduras (HFD) por 32 semanas, incluindo um tratamento com anti-TNFR1 ou anticorpo de controle (Ab) nas últimas 8 semanas. Os tecidos hepáticos de camundongos HFD tratados com anti-TNFR1-Ab mostraram uma redução significativa da esteatose (A), do conteúdo de triglicerídeos (B) e do escore de atividade da NAFLD (C) nos tecidos hepáticos, em comparação com os tecidos hepáticos de camundongos tratados com o anticorpo controle. *p<0,05; **p<0,01.

[077] Figura 2: Os camundongos B6-huTNFR1-k/i receberam uma dieta rica em gorduras (HFD) por 32 semanas, incluindo um tratamento com anti-TNFR1 ou anticorpo de controle (Ab) nas últimas 8 semanas. Os tecidos hepáticos de camundongos HFD tratados com anti-TNFR1-Ab mostraram uma melhora da fibrose hepática avaliada pela coloração Sirius Red (A), que foi significativa em comparação aos tecidos hepáticos de camundongos tratados com o anticorpo de controle (B).

*p<0,05.

[078] Figura 3: Os camundongos B6-huTNFR1-k/i receberam uma dieta rica em gorduras (HFD) por 20 semanas, incluindo um tratamento com anti-TNFR1 ou anticorpo de controle (Ab) nas últimas 4 semanas. Comparado ao anticorpo controle, o tratamento com anticorpo anti-TNFR1 resultou em uma redução significativa da ativação da caspase-3 nos tecidos hepáticos. *p<0,05.

[079] Figura 4: Os camundongos B6-huTNFR1-k/i receberam uma dieta rica em gorduras (HFD) por 32 semanas, incluindo um tratamento com anti-TNFR1 ou

21 / 70 anticorpo de controle (Ab) nas últimas 8 semanas. Comparado ao anticorpo de controle, o tratamento com o anti-TNFR1-Ab resultou em uma melhora significativa dos níveis séricos de ALT e insulina. * p<0,05

[080] Figura 5: Sequências SEQ ID NO:1: VH-CDR1 SEQ ID NO:2: VH-CDR2 SEQ ID NO:3: VH-CDR3 SEQ ID NO:4: VL-CDR1 SEQ ID NO:5: VL-CDR2 SEQ ID NO:6: VL-CDR3 SEQ ID NO:7: VH de IgG13.7/ Fab13.7 SEQ ID NO:8: VL de IgG13.7/ Fab13.7 SEQ ID NO:9: VH de ATROSAB/ IZI06.1 SEQ ID NO:10: VL de ATROSAB/ IZI06.1 SEQ ID NO:11: (Fab13.7 Cadeia pesada [negrito = VH]) SEQ ID NO:12: (Fab13.7 Cadeia leve [negrito = VL]) SEQ ID NO:13: VL1C (VL13.7-CH2-CH31; Cadeia contendo VL e CH1): SEQ ID NO:14: VL13.7 SEQ ID NO:15: Ligante SEQ ID NO:16: CH2 SEQ ID NO:17: CH31: CH31 é um domínio constante de Ig intercalado, que contém principalmente resíduos originários de CH3, mas também resíduos de CH1; SEQ ID NO:18: VHkC (VH13.7-CH2-CH3kappa; cadeia contendo VH e CLk): SEQ ID NO:19: VH13.7

22 / 70 SEQ ID NO:20: CH3k SEQ ID NO:21: VL1C (VL13.7-CH2-CH31; Cadeia contendo VL e CH1): SEQ ID NO:22: VHkC (VH13.7-CH2-CH3kappa; cadeia contendo VH e CLk): SEQ ID NO:23: VH-CDR1 de ATROSAB SEQ ID NO:24: VH-CDR2 de ATROSAB SEQ ID NO:25: VH-CDR3 de ATROSAB SEQ ID NO:26: VL-CDR1 de ATROSAB SEQ ID NO:27: VL-CDR2 de ATROSAB SEQ ID NO:28: VL-CDR3 de ATROSAB SEQ ID NO:29: ATROSAB VH SEQ ID NO:30: ATROSAB VL SEQ ID NO:31: IgG1 humana Fc SEQ ID NO:32: sequência huTNFR1: SEQ ID NO:33: região da articulação

[081] Figura 6: Caracterização bioquímica do Atrosimab (HC: SEQ ID NO:18, LC: SEQ ID NO:13). (a) desenho representativo da composição molecular do Atrosimab (branco: domínios Ig constantes originários do Fc; cinza brilhante: VH e sequências originárias de CH1; cinza escuro: VL e sequências originárias de CLκ). O atrosimab foi caracterizado por SEC (b) TSKgel SuperSW mAb HR, taxa de fluxo de 0,5 ml/min, fase móvel Na2HPO4/NaH2PO4) e SDS-PAGE (c) NuPAGETM 4-12% Bis-TRIS Midi Gel) sob redução (R) e condições não redutoras (NR). M: Marcador.

(d) A estabilidade térmica do Atrosimab foi analisada por espalhamento dinâmico de luz e interpretação visual dos pontos de dados obtidos. A estabilidade do Atrosimab após a incubação no plasma humano foi analisada pela detecção da atividade de ligação residual ao TNFR1 humano no ELISA (e). As barras representam os valores

23 / 70 de EC50 de três experiências individuais (média ± DP). Uma amostra incubada em PBS a 4°C e uma amostra congelada a -20°C diretamente após a diluição no plasma humano serviram como controle.

[082] Figura 7: Ligação ao antígeno e interação com os receptores Fc e a proteína do Complemento C1q. A ligação do equilíbrio do Atrosimab TNFR1-Fc humano foi analisada por ELISA ((a) n = 3, média ± DP). O Fab 13.7 (contém VH e VL idênticos) e ATROSAB (versão bivalente de menor afinidade) serviu como controle. (b) A cinética de ligação em tempo real foi registrada pelo QCM em cinco concentrações entre 128 nM e 4 nM (etapas de diluição 1:2) usando um algoritmo de ligação 1:1 para análise de dados. (c) A interação do Atrosimab imobilizado, bem como das duas proteínas de controle ATROSAB (Fc silenciosa) e Rituximab (parte Fc do tipo selvagem), com o FcγRI humano, IIb e III e também com a proteína complemento C1q, foi analisada por ELISA (n = 2, média ± DP).

[083] Figura 8: Bioatividade antagonista do Atrosimab e falta de agonismo. O atrosimab demonstrou uma completa falta de atividade agonística em três diferentes ensaios in vitro: (a) liberação de IL6 a partir de células HeLa, (b) liberação de IL-8 a partir de células HT1080 e num ensaio de indução de morte celular utilizando células Kym 1 (c). O Fab 13.7 parental, que demonstrou propriedades completamente agonísticas e o IgG ATROSAB bivalente, revelando efeitos marginalmente agonísticos em (a) e (b), serviu como proteínas de controle. O mesmo conjunto de proteínas foi analisado quanto ao potencial de inibir a ativação do TNFR1 na superfície celular nas células HeLa, HT1080 e Kym-1, conforme detectado pela liberação de IL-6 (d), liberação de IL-8 (e) e morte celular indução (f), respectivamente. O TNFR1 foi ativado usando TNF 0,1 nM (“d” e ”e”) ou TNF 0,01 nM (f). Todos os gráficos representam a média de três experiências individuais, as

24 / 70 barras de erro indicam SD.

[084] Figura 9: Falta de agonismo do Atrosimab na presença de anticorpos IgG anti-humanos. A ativação do TNFR1 na superfície das células HT1080 pelo Atrosimab na presença de uma concentração constante (ca. 15,8 nM) de anticorpos específicos de drogas foi analisada em um ensaio de liberação de IL-8 usando três soros IgG anti-humanos diferentes de camundongos (“a”, ”b” e ”c”). Apenas o soro anti-IgG humano de camundongo, células não estimuladas e TNF (33 nM) serviu como controle. São mostradas a média ± DP de três experimentos individuais.

[085] Figura 10: Análise farmacocinética de Atrosimab. As concentrações circulantes de Atrosimab foram determinadas no soro de camundongo após a injeção em bolus de 400 µg de proteína em camundongos knock-in C57BL/6J, que expressam o domínio extracelular do TNFR1 humano conectado à transmembrana murino e ao domínio intracelular em vez da proteína totalmente murina. A proteína intacta foi determinada após ligação ao TNFR1-Fc humano no ELISA. O gráfico mostra a média ± DP de cinco camundongos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[086] O uso dos termos “um” e “uma” e “o/a/os/as” e referentes semelhantes no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) deve ser interpretado para abranger tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto.

[087] Os termos “compreender,” “ter,” “incluir,” e “conter” devem ser interpretados como termos em aberto (isto é, significando “incluir, mas não se limitando a”), a menos que indicado de outra maneira. Para os fins da presente invenção, o termo “consistir em é considerado uma modalidade preferida do termo

25 / 70 “compreende de”. Se daqui em diante um grupo for definido para compreender pelo menos um certo número de modalidades, isso significa também abranger um grupo que de preferência consiste apenas nessas modalidades.

[088] O termo “anticorpo” é aqui entendido como aquele que abrange polipeptídeos ou proteínas que consistem em ou compreendem domínios de anticorpo, que são entendidos como domínios constantes e/ou variáveis das cadeias pesada e/ou leve de imunoglobulinas, com ou sem uma sequência de ligação. Os polipeptídeos são entendidos como domínios de anticorpo, se compreendendo uma estrutura de barril beta que consiste em pelo menos duas fitas beta de uma estrutura de domínio de anticorpo conectada por uma sequência de loop. Os domínios de anticorpo podem ser de estrutura nativa ou modificados por mutagênese ou derivatização, por exemplo, modificar as propriedades de ligação ao antígeno ou qualquer outra propriedade, como estabilidade ou propriedades funcionais, como a ligação aos receptores Fc FcRn e/ou receptor Fcgamma.

[089] O anticorpo como aqui utilizado compreende pelo menos um local de ligação ao antígeno, que reconhece especificamente o huTNFR1 ou um epítopo do huTNFR1. Assim, a ligação do anticorpo ao receptor huTNFR1 pode ser monovalentemente através de apenas um local de ligação específico para huTNFR1 por anticorpo ou bivalentemente através de dois locais de ligação específicos para huTNFR1. Em particular, o local de ligação ao antígeno é de um ou dois domínios de anticorpos. Qualquer um dos domínios variáveis de anticorpos isolados ou em combinação, como um domínio VH sozinho, ou uma combinação de domínios VH e VL, pode ser empregado para construir o local de ligação ao antígeno.

Especificamente, um local de ligação ao antígeno é formado por uma combinação de sequências de CDR. Essa combinação de sequências de CDR também é

26 / 70 entendida como um local de ligação a CDR, por exemplo, a bolsa de ligação ao antígeno formada por três sequências de CDR de um domínio variável, como a combinação de CDRH1, CDRH2 e CDRH3, ou a combinação de CDRL1, CDRL2 e CDRL3, ou ainda seis sequências CDR de dois domínios variáveis, como o combinação de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 e CDRL3.

Alternativamente, um local de ligação ao antígeno pode ser empregado que é derivado de um ligante natural ao receptor ou de uma construção artificial. As sequências de CDR aqui referidas são designadas da seguinte forma: CDRs de um domínio VH: VH-CDR1 = CDRH1 VH-CDR2 = CDRH2 VH-CDR3 = CDRH3 CDRs de um domínio VL: VL-CDR1 = CDRL1 VL-CDR2 = CDRL2 VL-CDR3 = CDRL3

[090] Especificamente, um local de ligação a CDR de um único domínio de anticorpo variável pode ser usado como local de ligação a antígeno, como um local de ligação de domínios das cadeias pesada e leve da região variável (como dAb, Fd, VL, Vkappa, Vlambda, VH, VHH) ou um local de ligação de pares de domínios variáveis de anticorpos, como um par VH/VL.

[091] Assim, o anticorpo que compreende um local de ligação a CDR pode compreender um único domínio de anticorpo variável ou um par de domínios de ligação variável e, opcionalmente, compreender outros domínios variáveis, com o mesmo ou com uma especificidade de ligação a antígeno diferente, por exemplo, um

27 / 70 anticorpo biespecífico ou poliespecífico, em que apenas um local de ligação ao antígeno é direcionado ao huTNFR1 e pelo menos um outro local de ligação ao antígeno é direcionado a um alvo diferente do huTNFR1. Opcionalmente, a construção de anticorpo compreende ainda domínios de anticorpos constantes, ou combinações de domínios de anticorpos variáveis e/ou constantes, com ou sem uma sequência de ligação ou região de articulação.

[092] Formatos de anticorpos específicos podem ser usados como aqui descrito, por exemplo, um anticorpo compreendendo ou consistindo em um único domínio variável de anticorpo, como VH, VL ou VHH, ou combinações de domínios variáveis e/ou constantes de anticorpos com ou sem uma sequência de ligação ou região de dobradiça, incluindo pares de domínios variáveis de anticorpos, como um par VL/VH, um anticorpo que compreende ou consiste em um par de domínios VL/VH e domínios constantes de anticorpos, como anticorpos de cadeia pesada, Fab, F(ab'), (Fab)2, scFv, Fd, Fv ou um anticorpo completo, por exemplo, de um tipo IgG (por exemplo, um subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), anticorpo IgA1, IgA2, IgD, IgE ou IgM. O termo “anticorpo de comprimento total” pode ser usado para se referir a qualquer molécula de anticorpo compreendendo pelo menos a maior parte do domínio Fc e outros domínios comumente encontrados em um monômero de anticorpo que ocorre naturalmente. Esta frase é usada aqui para enfatizar que uma molécula de anticorpo específica não é um fragmento de anticorpo.

[093] Ligantes monovalentes e monoespecíficos exemplares são Fab, scFv, Fv, anticorpos de domínio, semi-anticorpos IgG ou IgGs monovalentes, como uma IgG de um braço que consiste em uma cadeia leve completa, uma cadeia pesada completa e uma cadeia Fc adicional sem Fd ( Fd = VH-CH1), que pode ser produzido de acordo com as técnicas dos knobs-into holes (ou outras partes Fc

28 / 70 assimétricas), para evitar a homodimerização dos domínios Fc.

[094] Ligantes bi ou polivalentes exemplares são anticorpos completos de qualquer um dos tipos de imunoglobulina, ou um fragmento de anticorpo de ligação a antígenos de qualquer um dos anticorpos completos, que compreende pelo menos dois locais de ligação a antígenos, por exemplo, qualquer um ou mais de um Fab, F(ab '), (Fab)2, scFv ou Fv.

[095] O termo “Fv” é aqui entendido como a região de domínios variáveis que incorpora o local de ligação à CDR, por exemplo de VH, VL ou VH/VL. O termo “Fv”, portanto, aplica-se particularmente ao VH, VL ou VH / VL, que é o domínio VH associado a um domínio VL por uma interação entre a estrutura da folha-beta de ambos os domínios variáveis, com ou sem um vinculador.

[096] O termo “anticorpo”, conforme usado aqui, deverá incluir especificamente anticorpos na forma isolada em uma preparação de anticorpos, que é substancialmente livre de outros anticorpos direcionados contra diferentes antígenos alvo ou compreendendo um arranjo estrutural diferente de domínios de anticorpos. Ainda, um anticorpo isolado pode ser compreendido em uma preparação de combinação, contendo uma combinação do anticorpo isolado, por exemplo, com pelo menos um outro anticorpo, como anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo com especificidades diferentes.

[097] O termo “anticorpo” deverá ser aplicado a anticorpos de origem animal, incluindo espécies humanas, como mamíferos, como humanos ou murinos, ou aves, como galinha, termo que deverá incluir particularmente anticorpos recombinantes baseados em uma sequência de origem animal por exemplo, sequências humanas, como em anticorpos humanos. Os anticorpos humanos compreendem tipicamente regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha

29 / 70 germinativa humana. Anticorpos humanos são preferencialmente utilizados como aqui descrito, o que pode incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do local in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs. Anticorpos humanos incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas.

[098] Ainda, o termo “anticorpo” se aplica ainda a anticorpos quiméricos com sequências de origem de diferentes espécies, como sequências de origem murina e humana, ou a anticorpos humanizados, que contêm sequências de aminoácidos de origem humana e de não-humanos, por exemplo. origem de roedores.

[099] O termo “anticorpo” se aplica especificamente a anticorpos de qualquer classe ou subclasse. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos podem ser atribuídos às principais classes de anticorpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e vários deles podem ser divididos em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.

[0100] O termo aplica-se ainda a anticorpos monoclonais ou policlonais, especificamente um anticorpo recombinante, cujo termo inclui todos os anticorpos e estruturas de anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como anticorpos originários de animais, por exemplo, mamíferos incluindo humanos, que compreende genes ou sequências de diferentes origens, por exemplo, anticorpos murinos, quiméricos, humanizados ou derivados de hibridoma. Outros exemplos referem-se a anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, ou anticorpos isolados de uma

30 / 70 biblioteca combinatória recombinante de anticorpos ou domínios de anticorpos, ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a junção do gene do anticorpo sequências para outras sequências de DNA.

[0101] Os domínios de anticorpo podem ser de estrutura nativa ou modificados por mutagênese ou derivatização, por exemplo, modificar as propriedades de ligação ao antígeno ou qualquer outra propriedade, como estabilidade ou propriedades funcionais, como a ligação aos receptores Fc FcRn e/ou receptor Fcgamma (FCGR).

[0102] Exemplos específicos se referem a anticorpos de ocorrência não natural que são construções artificiais projetadas para reconhecer especificamente o huTNFR1 alvo por pelo menos um local de ligação ao antígeno que compreende uma ou mais sequências de CDR artificiais ou projetadas para produzir construções de anticorpos que não ocorrem naturalmente, que têm uma estrutura diferente de qualquer uma das estruturas de imunoglobulina que ocorrem naturalmente.

[0103] Exemplos específicos de um anticorpo, como descrito aqui mais adiante, não ocorrem naturalmente, por exemplo, conforme fornecido em uma preparação combinada com outro anticorpo ou agente ativo, cuja combinação não ocorre na natureza. Exemplos adicionais específicos se referem a um derivado artificial ou a uma variante de um anticorpo que ocorre naturalmente, ou a uma variante otimizada ou amadurecida por afinidade de um anticorpo que ocorre naturalmente ou a um anticorpo com uma região-estrutura projetada para melhorar a estabilidade do anticorpo. Por essa otimização ou engenharia, o anticorpo compreende uma ou mais estruturas ou sequências ou características sintéticas, que não seriam encontradas no contexto do anticorpo na natureza.

[0104] Entende-se que o termo “anticorpo”, conforme usado aqui, também

31 / 70 deverá se referir a derivados de um anticorpo, em particular derivados funcionalmente ativos, também aqui referidos como variantes funcionais de anticorpos.

[0105] Os derivados funcionalmente ativos são particularmente produzidos por fusão ou modificação química covalente que não altera a sequência de aminoácidos primária do próprio anticorpo. Os derivados podem, por exemplo, ter propriedades desejadas, incluindo, por exemplo, prolongando a meia-vida da circulação, aumentando a estabilidade, reduzindo a depuração ou alterando a imunogenicidade.

Derivados de anticorpos específicos são entendidos como qualquer combinação de um ou mais domínios ou anticorpos de anticorpo e/ou uma proteína de fusão, na qual qualquer domínio do anticorpo pode ser fundido em qualquer posição de uma ou mais outras proteínas, como outros anticorpos, por exemplo, uma estrutura de ligação compreendendo alças de CDR, um polipeptídeo receptor, mas também ligantes, proteínas de suporte, enzimas, toxinas e semelhantes. Um derivado do anticorpo pode ser obtido por associação ou ligação a outras substâncias por várias técnicas químicas, como acoplamento covalente, interação eletrostática, ligação di- sulfeto, etc. As outras substâncias ligadas ao anticorpo podem ser lipídeos, carboidratos, ácidos nucléicos, orgânicos e moléculas inorgânicas ou qualquer combinação delas (por exemplo, PEG, profármacos ou fármacos). Numa modalidade específica, o anticorpo é um derivado compreendendo um medicamento, por exemplo, para obter um conjugado anticorpo-medicamento.

[0106] O termo derivado também inclui fragmentos, variantes, análogos ou homólogos de anticorpos, por exemplo, com um padrão de modificação por glicoengenharia específico, por exemplo, produzido por glicoengenharia, que são funcionais e podem servir como variantes funcionais, por exemplo, ligação ao alvo

32 / 70 específico.

[0107] O termo “modificado por glicoengenharia” com relação às sequências de anticorpos deverá se referir a variantes de modificação por glicoengenharia com propriedades imunogênicas modificadas, ADCC e/ou CDC como resultado da glicoengenharia. Todos os anticorpos contêm estruturas de carboidratos em posições conservadas nas regiões constantes da cadeia pesada, com cada isótipo possuindo uma matriz distinta de estruturas de carboidratos ligadas a N, que afetam variavelmente a montagem, secreção ou atividade funcional de proteínas. Os anticorpos do tipo IgG1 são glicoproteínas que possuem um local de glicosilação ligado a N conservado em Asn297 em cada domínio CH2. Os dois oligossacarídeos bi-antenários complexos ligados ao Asn297 são enterrados entre os domínios CH2, formando contatos extensos com a espinha dorsal do polipeptídeo, e sua presença é essencial para que o anticorpo possa mediar funções efetoras, como citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). A remoção de N-Glicano em N297, por exemplo, através da mutação de N297, por exemplo, para A ou T299 normalmente resulta em anticorpos aglicosilados com ADCC reduzido.

[0108] As principais diferenças na glicosilação do anticorpo ocorrem entre as linhas celulares, e até mesmo pequenas diferenças são observadas para uma determinada linha celular cultivada sob diferentes condições de cultura. A expressão em células bacterianas tipicamente fornece um anticorpo aglicosilado.

[0109] Os anticorpos podem ser desprovidos de uma fração ativa de Fc, portanto, compostos por domínios de anticorpo que não possuem um local de ligação ao FCGR, incluindo especificamente qualquer anticorpo desprovido de uma cadeia de domínios CH2 e CH3 ou compreendendo domínios de anticorpo sem função efetiva de Fc, por exemplo, por modificações para reduzir as funções

33 / 70 efetoras de Fc, em particular para revogar ou reduzir a atividade do ADCC e/ou CDC. Tais modificações podem ser efetuadas por mutagênese, por exemplo, mutações no local de ligação ao FCGR ou por derivados ou agentes para interferir na atividade ADCC e/ou CDC de um anticorpo, de modo a obter redução da função efetiva de Fc ou falta da função efetiva de Fc, que é tipicamente entendido como se referindo à função efetora de Fc inferior a 10% do anticorpo não modificado (tipo selvagem), preferencialmente inferior a 5%, conforme medido pela atividade do ADCC e/ou CDC.

[0110] Anticorpos exemplares podem compreender um fragmento Fc ou pelo menos parte de um fragmento Fc, de modo a manter o local de ligação a FcRn, obtendo assim um anticorpo com meia-vida substantiva in vivo.

[0111] No entanto, o Fc pode ser modificado para obter redução da possível atividade de ADCC e/ou CDC, por exemplo, por uma troca do subtipo IgG1 para IgG2 ou por modificações para reduzir a ligação ao receptor Fc, por exemplo, por E233P e/ou L234V e/ou L235A e/ou D265G e/ou A327Q e/ou A330A e/ou G236, exclusão e/ou A327G e/ou A327G e/ou A330S em um IgG1 Fc humano, em que a numeração é de acordo com Kabat [Índice da UE].

[0112] Outros exemplos referem-se a uma modificação para reduzir a imunogenicidade, por exemplo, por um K.O. local de glicosilação, como N297Q, que fornece uma ligação prejudicada ao receptor de lectina.

[0113] Entende-se que o termo “anticorpo” também se refere a variantes de um anticorpo, incluindo anticorpos com variantes CDR funcionalmente ativas de uma sequência CDR parental e anticorpos variantes funcionais ativos de um anticorpo parental. Por exemplo, variantes funcionais daqueles anticorpos que são caracterizados pelas sequências de ligação a CDR e/ou pelas sequências de cadeia

34 / 70 pesada e leve aqui fornecidas, podem ser manipuladas e usadas como aqui descrito mais detalhadamente.

[0114] Especificamente, uma variante de anticorpo de um anticorpo parental pode ser produzida através da engenharia de pelo menos uma das sequências de anticorpos de um anticorpo parental, como qualquer um dos anticorpos exemplares aqui fornecidos, por exemplo, onde a variante de anticorpo compreende pelo menos 3 CDRs da variável da cadeia pesada região e, opcionalmente, pelo menos mais 3 CDRs da região variável da cadeia leve, com pelo menos uma mutação pontual em pelo menos uma das CDRs ou nas regiões FR, ou na região constante da cadeia pesada (HC) ou cadeia leve ( LC), ainda sendo funcionalmente ativo, conforme medido pela ligação específica ao huTNFR1 alvo.

[0115] Especificamente, a variante de anticorpo é um anticorpo mutante ou fragmento de anticorpo, por exemplo, obtido por métodos de mutagênese, em particular para excluir, trocar, introduzir inserções em uma sequência ou região específica de aminoácidos de anticorpo ou derivar quimicamente uma sequência de aminoácidos, por exemplo, na domínios constantes para projetar a estabilidade do anticorpo, função efetiva ou meia-vida ou nos domínios variáveis para melhorar as propriedades de ligação ao antígeno, por exemplo, pelas técnicas de maturação por afinidade disponíveis na técnica. Qualquer um dos métodos de mutagênese conhecidos pode ser empregado, incluindo mutações pontuais nas posições desejadas, por exemplo, obtidas por técnicas de randomização. Em alguns casos, as posições são escolhidas aleatoriamente, por exemplo, com qualquer um dos aminoácidos possíveis ou com uma seleção de aminoácidos preferidos para randomizar as sequências de anticorpos. O termo “mutagênese” refere-se a qualquer técnica reconhecida na técnica para alterar uma sequência polinucleotídica

35 / 70 ou polipeptídica. Os tipos preferidos de mutagênese incluem mutagênese por PCR propensa a erros, mutagênese de saturação ou outra mutagênese direcionada ao local.

[0116] Uma mutação pontual é particularmente entendida como a engenharia de um polinucleotídeo que resulta na expressão de uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos não projetada na substituição ou troca, exclusão ou inserção de um ou mais únicos (não consecutivos) ou dupletos de aminoácidos para diferentes aminoácidos.

[0117] Especificamente, um anticorpo variante funcionalmente ativo é produzido pela modificação de um anticorpo parental ou de uma sequência de anticorpos parental por qualquer um ou mais de inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos, ou derivatização química de um ou mais resíduos de aminoácidos no sequência de aminoácidos ou nucleotídeos dentro da sequência de nucleotídeos ou em uma ou ambas as extremidades distais da sequência, por exemplo, em uma sequência CDR, os aminoácidos N-terminal e/ou C-terminal 1, 2, 3 ou 4 e/ou os aminoácidos cêntricos 1, 2, 3 ou 4 (ou seja, no meio da sequência da CDR) e cuja modificação não afeta, em particular, prejudica a atividade dessa sequência. No caso de um local de ligação com especificidade para um antígeno alvo selecionado, a variante funcionalmente ativa de um anticorpo ainda teria a especificidade de ligação predeterminada ou substancialmente a mesma atividade biológica, embora isso possa ser alterado, por exemplo, para alterar a especificidade fina para um epítopo específico, a afinidade, a avidez, a taxa de Kon ou Koff, etc.

Por exemplo, um anticorpo amadurecido por afinidade é especificamente entendido como um anticorpo variante funcionalmente ativo. Portanto, a sequência CDR modificada em um anticorpo amadurecido por afinidade é entendida como uma

36 / 70 variante CDR funcionalmente ativa.

[0118] A maturação por afinidade é o processo pelo qual são produzidos anticorpos com maior afinidade por um antígeno alvo. Qualquer um ou mais métodos de preparação e/ou utilização de bibliotecas de maturação por afinidade disponíveis na técnica podem ser empregados para gerar anticorpos amadurecidos por afinidade, de acordo com várias modalidades da invenção aqui divulgadas.

Exemplos de métodos e usos de maturação por afinidade, como mutagênese aleatória, passagem de cepas de mutadores bacterianos, mutagênese direcionada a locais, pontos de acesso mutacionais direcionados, mutagênese parcimoniosa, embaralhamento de anticorpos, embaralhamento de cadeia leve, embaralhamento de cadeia pesada, mutagênese CDR1 e/ou CDR1 e métodos de produzir e usar bibliotecas de maturação por afinidade passíveis de implementar métodos e usos de acordo com várias modalidades da invenção divulgadas neste documento, incluem, por exemplo, aqueles divulgados em: Wark & Hudson, 2006, Advanced Drug Delivery Reviews 58: 657– 670.

[0119] Com alterações estruturais de um anticorpo, incluindo mutagênese de aminoácidos ou como consequência de mutação somática nos segmentos de genes de imunoglobulina, variantes de um local de ligação a um antígeno são produzidas e selecionadas para afinidades maiores. Os anticorpos amadurecidos por afinidade podem exibir uma afinidade várias vezes maior que um anticorpo parental. Os anticorpos monoparentais podem estar sujeitos a maturação por afinidade.

Alternativamente, conjuntos de anticorpos com afinidade de ligação semelhante ao antígeno alvo podem ser considerados como estruturas parentais que são variadas para obter anticorpos únicos amadurecidos por afinidade ou conjuntos amadurecidos por afinidade desses anticorpos.

37 / 70

[0120] A variante amadurecida por afinidade preferida de um anticorpo aqui descrito exibe pelo menos um aumento de 2 vezes na afinidade de ligação, preferencialmente pelo menos um 5-, preferencialmente pelo menos 10-, preferencialmente pelo menos 50- ou preferencialmente pelo menos 100 vezes. A maturação por afinidade pode ser empregada no decurso das campanhas de seleção empregando bibliotecas respectivas de moléculas parentais, ou com anticorpos possuindo afinidade de ligação média para obter o anticorpo aqui descrito. Alternativamente, a afinidade pode ser ainda mais aumentada pela maturação por afinidade do anticorpo aqui descrito para obter os altos valores correspondentes a um KD inferior a 10-10 M, ou mesmo inferior a 10-11 M.

[0121] Em certas modalidades, a afinidade de ligação é determinada por um ensaio ELISA de afinidade. Em certas modalidades, a afinidade de ligação é determinada por um ensaio BIAcore, ForteBio ou MSD. Em certas modalidades, a afinidade de ligação é determinada por um método cinético. Em certas modalidades, a afinidade de ligação é determinada por um método de equilíbrio/solução. Em certas modalidades, a afinidade de ligação é determinada por medições padrão de microbalança de cristal de quartzo (QCM), em particular em condições predeterminadas, que se assemelham às condições fisiológicas (cerca de 37°C, densidade de cerca de 50 Hz).

[0122] Uma função específica dos anticorpos aqui descritos é a função como inibidor (também chamado antagonista) da interação TNF-huTNFR1. O termo “inibidor”, como aqui entendido, é uma substância que tem a capacidade de a) modular (por exemplo, reduzir ou eliminar) a sinalização de TNFR1 in vitro e/ou in vivo, e/ou b) inibir a morte celular mediada por TNFR1 in vitro e/ou in vivo, e/ou

38 / 70 c) inibir a estimulação celular mediada por TNF para liberar citocinas inflamatórias in vitro e/ou in vivo, d) por inibição da sinalização de TNFR1 por um mecanismo diferente.

[0123] Em particular, o anticorpo como aqui utilizado interfere com a ligação de uma ou mais moléculas de TNF a uma ou mais moléculas de TNFR1 na superfície celular. Para aplicações terapêuticas, sem estar limitado pela teoria, os inibidores da interação TNF-huTNFR1 podem ter a capacidade de inibir a sinalização de huTNFR1 na presença de TNF ou morte celular mediada por huTNFR1 na presença de TNF ou inibir a estimulação celular para liberar citocinas inflamatórias em a presença de TNF.

[0124] Como usado aqui, o termo “sinalização” e “transdução de sinalização” representa o processo bioquímico que envolve a transmissão de estímulos extracelulares, via receptores da superfície celular através de uma série específica e sequencial de moléculas, a genes no núcleo, resultando em respostas celulares específicas aos estímulos.

[0125] A inibição da interação huTNFR1 pode levar a uma modulação negativa dos efeitos da sinalização ou transdução de sinal TNFR1, conforme medido ex vivo em um ensaio baseado em células ou in vivo, de maneira dependente da dose. A atividade funcional do anticorpo aqui descrito é caracterizada especificamente por uma função inibidora que inibe a interação TNF-huTNFR1 ou LT-huTNFR1 in vivo, conforme determinado em um ensaio baseado em células ex vivo. Um outro ensaio pode ser empregado para excluir efeitos colaterais substanciais associados à reticulação do receptor TNFR1 que agonizaria a interação TNF-TNFR1. Um ensaio adequado é determinar a atividade do anticorpo ou variante nas células HeLa ou HT1080 para a ausência de atividade estimulatória para

39 / 70 produzir as citocinas inflamatórias IL-6 ou IL-8, respectivamente. Um teste exemplar é descrito na seção de exemplos abaixo.

[0126] A inibição normalmente leva a uma redução dos efeitos da interação ou atividade do huTNFR1 em pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou no nível máximo. Os métodos para produzir e caracterizar um anticorpo aqui descrito são bem conhecidos na técnica. Numa modalidade preferida, variantes de anticorpo são produzidas e rastreadas quanto a propriedades predefinidas usando um ou mais ensaios baseados em células que empregam células que expressam huTNFR1 ou ensaios in vivo. Para tais ensaios, o anticorpo é tipicamente adicionado exogenamente, de modo que as células possam ser ligadas, por exemplo, na presença e ausência de TNF para determinar a atividade antagonista e agonística. Estes ensaios são tipicamente baseados na função da imunoglobulina; isto é, a capacidade do anticorpo de se ligar ao huTNFR1 e mediar algum evento bioquímico, por exemplo, o bloqueio da ligação do TNF às referidas células, por exemplo, em um ensaio de ligação competitiva, inibição da ligação do TNF/receptor, a redução da expressão de citocinas no presença ou ausência de TNF, interleucinas especificamente inflamatórias, como IL-6 ou IL-8, apoptose e similares.

[0127] O anticorpo aqui descrito preferencialmente possui apenas uma atividade antagonista do TNF (em particular, sem atividade agonística detectável), reduzindo assim a reação inflamatória causada por um nível aumentado de TNF na circulação que pode resultar em respostas inflamatórias indesejadas, apoptose e necrose ou falência do órgão. O anticorpo preferido tem uma atividade antagonista correspondente a um IC50 inferior a 100 nM, preferencialmente inferior a 20 nM, mais preferido inferior a 10 nM, mais preferido na faixa nanomolar de um dígito ou menos,

40 / 70 conforme medido em um ensaio baseado em células que emprega TNF ou LTalpha a uma concentração de saturação semi-máxima, preferencialmente na faixa de 0,01 - 0,1 nM TNF e LTalpha, respectivamente.

[0128] Uma potencial atividade agonística mimética ao TNF pode ser medida no mesmo ensaio baseado em células, no entanto, sem o emprego de TNF. O anticorpo aqui descrito preferencialmente não possui atividade agonística significativa, se a incubação de células HeLa ou HT1080 na ausência de TNF resultar em nenhuma ou apenas indução marginal de citocina, por exemplo, níveis elevados de IL-6 ou IL-8 inferiores a 0,5 ng/ml em concentrações de pelo menos 5 nM ou cerca de 10 nM do anticorpo. De preferência, não existe ou apenas produção marginal ou negativa de citocinas, que pode ser determinada pela quantidade inferior a 10 pg/105 células. Num exemplo preferido, a expressão e liberação de citocinas é inferior a 2,5 pg/100.000 células em 18 h. Preferencialmente, a atividade agonística é, portanto, abaixo do nível basal, ou inferior a 2% da resposta de uma concentração comparável de TNF, preferencialmente inferior a 1% da resposta equivalente ou máxima de TNF.

[0129] “Porcentagem (%) de identidade da sequência de aminoácidos” em relação às sequências de anticorpos aqui descritas é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica específica, após o alinhamento da sequência e introduzir lacunas, se necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerar substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. Os especialistas na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento

41 / 70 das sequências sendo comparadas.

[0130] O termo “antígeno”, conforme aqui utilizado, é intercambiável com os termos “alvo” ou “antígeno alvo” deverá se referir a uma molécula alvo inteira ou a um fragmento dessa molécula reconhecido por um local de ligação ao anticorpo.

Especificamente, subestruturas de um antígeno, por exemplo, uma estrutura de polipeptídeo ou carboidrato, geralmente referida como “epítopos”, por exemplo, epítopos de células B ou epítopo de células T, que são imunologicamente relevantes, pode ser reconhecida por esse local de ligação. O antígeno huTNFR1 é um antígeno que compreende estruturas receptoras que são capazes de ligar especificamente TNF ou LT como um receptor de citocina mono- ou multimérica na superfície da maioria das células humanas.

[0131] O termo “huTNFR1”, conforme usado aqui, deve se referir à superfamília do receptor de fator de necrose tumoral CD120a TNFR1 (p55/60, TNFRSF1A, membro 1A [Homo sapiens (humano)], ID do Gene: 7132) receptor de TNF, expresso ubiquamente na maioria das células humanas. Uma sequência exemplar específica de huTNFR1 é fornecida como SEQ ID NO: 32.

[0132] O termo “epítopo”, como aqui utilizado, deve se referir, em particular, a uma estrutura molecular que pode formar completamente um parceiro de ligação específico ou fazer parte de um parceiro de ligação específico a um local de ligação de um anticorpo. Um epítopo pode ser composto de um carboidrato, uma estrutura peptídica, um ácido graxo, uma substância orgânica, bioquímica ou inorgânica ou seus derivados e quaisquer combinações deles. Se um epítopo estiver compreendido em uma estrutura peptídica, como um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína, geralmente incluirá pelo menos 3 aminoácidos, preferencialmente 5 a 40 aminoácidos, e mais preferencialmente entre cerca de 10 a 20 aminoácidos. Os

42 / 70 epítopos podem ser epítopos lineares ou conformacionais. Um epítopo linear é composto por um único segmento de uma sequência primária de uma cadeia polipeptídica ou de carboidrato. Epítopos lineares podem ser contíguos ou sobrepostos.

[0133] Os epítopos conformacionais são compostos de aminoácidos ou carboidratos reunidos dobrando o polipeptídeo para formar uma estrutura terciária e os aminoácidos não são necessariamente adjacentes um ao outro na sequência linear. Especificamente e em relação aos antígenos polipeptídicos, um epítopo conformacional ou descontínuo é caracterizado pela presença de dois ou mais resíduos discretos de aminoácidos, separados na sequência primária, mas reunidos em uma estrutura consistente na superfície da molécula quando o polipeptídeo se dobra na proteína/antígeno nativo.

[0134] Aqui, o termo “epítopo” deverá se referir particularmente ao epítopo compreendido no huTNFR1, que é um epítopo incorporado no CRD1 distal da membrana e no subdomínio A1 do CDR2 do huTNFR1.

[0135] O termo “isolado” ou “isolamento”, conforme usados aqui, com relação a um ácido nucleico, um anticorpo ou outro composto deverá se referir a um composto que tenha sido suficientemente separado do ambiente com o qual seria naturalmente associado, de modo a existir em forma “substancialmente pura”.

“Isolado” não significa necessariamente a exclusão de misturas artificiais ou sintéticas com outros compostos ou materiais, ou a presença de impurezas que não interferem na atividade fundamental e que podem estar presentes, por exemplo, devido à purificação incompleta.

[0136] Com referência a polipeptídeos ou proteínas, como anticorpos isolados aqui descritos, o termo “isolado” deverá se referir especificamente a compostos que

43 / 70 são livres ou substancialmente livres de material com o qual estão naturalmente associados, como outros compostos com os quais são encontrados em sua natureza natural no seu ambiente natural ou no ambiente em que são preparados (por exemplo, cultura de células) quando essa preparação é realizada por tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Compostos isolados podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda para fins práticos ser isolados - por exemplo, os polipeptídeos ou polinucleotídeos podem ser misturados com veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis quando utilizados no diagnóstico ou terapia.

[0137] O termo “recombinante”, conforme usado aqui, deverá significar “estar sendo preparado por ou resultante de engenharia genética”. Um hospedeiro recombinante compreende especificamente um vetor de expressão ou vetor de clonagem, ou foi geneticamente modificado para conter uma sequência de ácido nucleico recombinante, em particular empregando sequência de nucleotídeo estranha ao hospedeiro. Uma proteína recombinante é produzida expressando um respectivo ácido nucleico recombinante em um hospedeiro.

[0138] O anticorpo ainda descrito aqui pode ser um anticorpo recombinante.

Para esse fim, o termo “anticorpo recombinante”, como aqui utilizado, inclui anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir dele, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória recombinante de anticorpos humanos ou biblioteca de sequências de

44 / 70 ligação a antígenos de um anticorpo, e (d) anticorpos preparado, expresso, criado ou isolado por qualquer outro meio que envolva a junção de sequências de genes de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos recombinantes compreendem anticorpos manipulados para incluir rearranjos e mutações que ocorrem, por exemplo, durante a maturação do anticorpo. De acordo com a presente invenção, podem ser empregadas técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante dentro da técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Veja, por exemplo, Maniatis, Fritsch & Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)”.

[0139] O anticorpo aqui descrito é de preferência fornecido como uma proteína recombinante produzida por um sistema de expressão recombinante que emprega uma célula hospedeira, por exemplo, por expressão no espaço periplásmico de E. coli ou por expressão como uma proteína secretada em um sistema de expressão eucariótico, como levedura ou mamífero, por exemplo por CHO, HEK ou linhas de células hospedeiras de produção humana.

[0140] As células do ovário de hamster chinês (CHO) têm sido mais comumente usadas para a produção de anticorpos. Além de fornecer padrões de glicosilação adequados, essas células permitem a geração consistente de linhas celulares clonais geneticamente estáveis e altamente produtivas. Eles podem ser cultivados em altas densidades em biorreatores simples, usando meios isentos de soro, e permitem o desenvolvimento de bioprocessos seguros e reproduzíveis.

[0141] As células hospedeiras são as mais preferidas, ao serem estabelecidas, adaptadas e completamente cultivadas sob condições livres de soro, e opcionalmente em meios isentos de qualquer proteína/peptídeo de origem animal.

45 / 70

[0142] A ligação “específica”, reconhecendo ou direcionando como aqui utilizado, significa que o ligante, por exemplo, local de ligação ao anticorpo ou ao antígeno de um anticorpo, exibe afinidade apreciável pelo antígeno alvo ou um respectivo epítopo em uma população heterogênea de moléculas. Assim, sob condições designadas (por exemplo, imunoensaio), um aglutinante se liga especificamente ao antígeno alvo e não se liga em uma quantidade significativa a outras moléculas presentes em uma amostra. A ligação específica significa que a ligação é seletiva em termos de identidade do alvo, alta, média ou baixa afinidade ou avidez, conforme selecionado. A ligação seletiva geralmente é alcançada se a constante de ligação ou a dinâmica de ligação for pelo menos 10 vezes diferente (entendida como pelo menos 1 diferença de log), de preferência a diferença for pelo menos 100 vezes (entendida como pelo menos 2 diferenças de log) e muito mais preferiu pelo menos 1000 vezes (entendido como pelo menos três logs de diferença) em comparação com outro destino. A ligação diferencial pode ser determinada por um imunoensaio, preferencialmente imunotransferência, ELISA ou outros métodos imunológicos. A especificidade de uma molécula de anticorpo para um alvo específico pode ser determinada por ensaios de competição, por exemplo, conforme descrito em Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988). A ligação seletiva pode ser manipulada ou aprimorada por métodos de otimização de anticorpos recombinantes conhecidos na técnica. Por exemplo, certas regiões das regiões variáveis das cadeias de imunoglobulina aqui descritas podem ser submetidas a uma ou mais estratégias de otimização, incluindo embaralhamento de cadeia leve, mutagênese destino, mutação de CDR e mutagênese direcionada de CDR e/ou regiões de estrutura selecionadas.

46 / 70

[0143] O uso do termo “tendo a mesma especificidade”, “tendo o mesmo local de ligação” ou “ligando o mesmo epítopo” indica que os anticorpos monoclonais equivalentes exibem o mesmo ou essencialmente o mesmo, ou seja, características de imunorreação (ligação) semelhantes e competem pela ligação a uma sequência de ligação ao alvo pré-selecionada. A especificidade relativa de uma molécula de anticorpo para um alvo específico pode ser relativamente determinada por ensaios de competição, por exemplo, conforme descrito em Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988).

[0144] A competição neste documento significa uma inibição relativa maior que cerca de 30%, conforme determinado pela análise ELISA da competição ou pela análise ForteBio. Pode ser desejável definir um limiar mais alto de inibição relativa como critério do nível adequado de competição em um contexto específico, por exemplo, onde a análise de competição é usada para selecionar ou rastrear novos anticorpos projetados com a função pretendida da ligação do antígeno. Assim, por exemplo, é possível definir critérios para a ligação competitiva, em que pelo menos 40% de inibição relativa é detectada, ou pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90 % ou até pelo menos 100%, antes que um anticorpo seja considerado suficientemente competitivo.

[0145] O termo “paciente”, conforme aqui utilizado, deve se referir a seres humanos e outros mamíferos. Em particular, o uso médico descrito neste documento ou o respectivo método de tratamento se aplica a um sujeito necessitado de profilaxia ou tratamento de NASH ou de uma condição de doença associada à NASH. O sujeito pode ser um paciente em risco ou que sofre de NASH, incluindo doença em estágio inicial ou em estágio avançado. O termo “paciente” inclui

47 / 70 especificamente indivíduos que recebem tratamento profilático e/ou terapêutico. O termo “tratamento” deve, portanto, incluir tanto o tratamento profilático quanto o terapêutico.

[0146] Especificamente, o termo “terapia” refere-se a medidas terapêuticas que se destinam a abranger a administração para curar a doença ou reduzir os sintomas da doença.

[0147] Especificamente, o termo “profilaxia” refere-se a medidas preventivas que visam reduzir o risco de ocorrência ou recorrência da doença.

[0148] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, aqui utilizado de forma intercambiável com qualquer um dos termos “quantidade eficaz” ou “quantidade suficiente” de um composto, por exemplo, um anticorpo aqui descrito, é uma quantidade ou atividade suficiente para, quando administrado ao efeito em questão, resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos, e, como tal, uma quantidade ou sinônimo eficaz depende do contexto em que está sendo aplicado.

[0149] Uma quantidade eficaz pretende significar a quantidade de um composto que é suficiente para tratar, prevenir ou inibir essas doenças ou distúrbios.

No contexto da doença, quantidades terapeuticamente eficazes do anticorpo como aqui descrito são usadas especificamente para tratar, modular, atenuar, reverter ou afetar uma doença ou condição que se beneficia de uma inibição da interação TNF- TNFR1.

[0150] A quantidade do composto que corresponderá a essa quantidade eficaz variará dependendo de vários fatores, como o medicamento ou composto fornecido, a formulação farmacêutica, a via de administração, o tipo de doença ou distúrbio, a identidade do sujeito ou hospedeiro sendo tratado e similares, mas ainda assim pode ser rotineiramente determinado por um especialista na técnica.

48 / 70

[0151] Como aqui descrito adicionalmente, um método de tratamento de um paciente compreende a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo huTNFR1 acima definido a um paciente em necessidade. Uma quantidade terapeuticamente eficaz está tipicamente na faixa de 0,5-500 mg, preferencialmente de 1-400 mg, ainda mais preferida até 300 mg, até 200 mg, até 100 mg ou até 10 mg, embora doses mais altas possam ser indicadas por exemplo para tratar pacientes obesos ou doenças agudas.

[0152] Uma composição farmacêutica preferida aqui descrita compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo huTNFR1 e, opcionalmente, um ou mais componentes adicionais selecionados do grupo que consiste em um veículo farmaceuticamente aceitável, sais farmaceuticamente aceitáveis, um agente auxiliar, um estabilizador, um diluente e um solvente, ou qualquer combinação deles.

[0153] Numa modalidade, um anticorpo aqui descrito é o único agente terapeuticamente ativo administrado a um paciente. Alternativamente, o anticorpo aqui descrito é administrado em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos, incluindo, entre outros, antagonistas do TNF, agentes anti- inflamatórios, citocinas, fatores de crescimento ou outros agentes terapêuticos. O anticorpo antagonista do TNFR1 pode ser administrado concomitantemente ou consecutivamente com um ou mais outros esquemas terapêuticos, preferencialmente com terapêutica anti-TNF, como anticorpos anti-TNF. O anticorpo aqui descrito é preferencialmente administrado ao paciente como um tratamento de primeira linha ou como uma terapia de segunda linha em que a terapêutica anti-TNF não era eficiente, como tratamento agudo ou crônico. O uso médico especificamente preferido é para o tratamento de doenças crônicas.

[0154] Além disso, um regime de tratamento ou prevenção de um sujeito com

49 / 70 uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo aqui descrito pode consistir em uma única administração ou, alternativamente, compreender uma série de aplicações. Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado pelo menos uma vez por ano, pelo menos uma vez por meio ano ou pelo menos uma vez por mês. No entanto, em outra modalidade, o anticorpo pode ser administrado ao sujeito de cerca de uma vez por semana a cerca de uma administração diária para um determinado tratamento. A duração do período de tratamento depende de vários fatores, como a gravidade da doença, doença aguda ou crônica, a idade do paciente, a concentração e a atividade do formato do anticorpo. Também será apreciado que a dosagem eficaz usada para o tratamento ou profilaxia pode aumentar ou diminuir ao longo de um determinado regime de tratamento ou profilaxia. Alterações na dosagem podem resultar e se tornar aparentes por ensaios de diagnóstico padrão conhecidos na técnica. Em alguns casos, a administração crônica pode ser necessária.

[0155] A “Esteato-hepatite não alcoólica (NASH)” é uma doença hepática, não associada ao consumo de álcool, caracterizada por alteração gordurosa dos hepatócitos, acompanhada de inflamação intralobular e fibrose. A NASH é uma doença hepática comum, geralmente “silenciosa”. Assemelha-se à doença hepática alcoólica, mas ocorre em pessoas que bebem pouco ou nenhum álcool. Três características principais caracterizam a NASH e o diferenciam de outras doenças hepáticas de origem metabólica: acúmulo ou deposição anormal de gordura no fígado (esteatose hepática), inflamação do fígado e lesão hepática ou lesão do tecido hepático (fibrose).

[0156] A NASH é uma condição potencialmente grave que acarreta um risco substancial de progressão para doença hepática terminal, cirrose e carcinoma

50 / 70 hepatocelular. Alguns pacientes que desenvolvem cirrose estão em risco de insuficiência hepática e podem eventualmente necessitar de um transplante de fígado. A NAFLD pode ser diferenciado da NASH pelo Pontuação da atividade da NAFLD (NAS), a soma dos escores histopatológicos de uma biópsia hepática para esteatose (0 a 3), inflamação lobular (0 a 2) e dilatação hepatocelular (0 a 2). Um NAS de <3 corresponde a NAFLD, 3-4 corresponde a NASH limítrofe e >5 corresponde a NASH. A biópsia também é pontuada para fibrose (0 a 4).

[0157] Como usado aqui, um paciente que sofre de NASH é um paciente com NASH, ou que foi diagnosticado com NASH, ou que é geneticamente predisposto ao desenvolvimento de NASH, ou que pode estar predisposto ao desenvolvimento de NASH, porque sofre de NASH síndrome metabólica, obesidade, diabetes ou pré- diabetes. Em ainda outras modalidades, um paciente que sofre de NASH é um paciente que foi testado e demonstrou apresentar os achados clínicos característicos de NASH (acúmulo anormal de gordura no fígado, inflamação do fígado e fibrose hepática), mesmo que ele ou ela não demonstrem quaisquer sintomas físicos de NASH ainda. Em alguns casos, um paciente que sofre de NASH exibe sintomas de NASH mesmo que um diagnóstico ainda não tenha sido feito.

[0158] O tratamento da NASH pode resultar em lentidão ou interrupção da progressão da NASH para cirrose. Alguns regimes de tratamento visam retardar o aparecimento de um sintoma físico ou conjunto de sintomas físicos ou manifestações clínicas ou achados associados à NASH. Em algumas modalidades, o tratamento resulta na melhoria de pelo menos um sintoma físico mensurável de NASH, como, por exemplo, perda de peso, fraqueza ou fadiga. Em outras modalidades, o tratamento resulta na melhoria de pelo menos um parâmetro clínico ou descoberta de NASH, como, por exemplo, acúmulo anormal de gordura no

51 / 70 fígado, fibrose hepática conforme determinado por biópsia, inflamação do fígado, níveis anormais de enzimas hepáticas (por exemplo, ALT), níveis anormais de citocinas inflamatórias ou escore da NAS. Em outras modalidades, o tratamento resulta na redução, inibição ou lentidão da progressão do NASH, fisicamente por, por exemplo, estabilização de um sintoma mensurável ou conjunto de sintomas (como fadiga, perda ou fraqueza de peso) ou clínica/fisiologicamente por, por exemplo, estabilização de um parâmetro mensurável, como acúmulo anormal de gordura no fígado, níveis anormais de enzimas hepáticas, níveis anormais de marcadores inflamatórios hepáticos, achados anormais em uma biópsia hepática, escore NAS ou ambos. Em outra modalidade, o tratamento também pode resultar na prevenção da causa e/ou efeitos ou manifestação clínica da NASH, ou um dos sintomas desenvolvidos como resultado da NASH, antes da doença ou distúrbio se manifestar completamente. Em algumas modalidades, o tratamento resulta em um aumento na taxa de sobrevivência ou no tempo de sobrevivência em um paciente com a NASH. Em algumas modalidades, o tratamento resulta na redução do potencial de um paciente com NASH que precisa de um transplante de fígado. Em outras modalidades, o tratamento resulta na eliminação da necessidade de um paciente com NASH se submeter a um transplante de fígado. Em outras modalidades, resulta na redução de chances de um paciente com NASH desenvolver cirrose. Em outras modalidades, resulta na prevenção da progressão para cirrose, conforme determinado pela histologia.

[0159] Modalidades específicas descritas aqui se referem a anticorpos “monoclonais” (mAbs). Os anticorpos monoclonais são produzidos pela clonagem dos genes de anticorpos nas células hospedeiras monoclonais ou nas respectivas linhas celulares. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando qualquer

52 / 70 método que produz moléculas de anticorpo por linhas celulares em cultura, por exemplo, cultivando células hospedeiras eucarióticas recombinantes (mamífero ou inseto) ou procarióticas (bacterianas). Exemplos de métodos adequados para a preparação de anticorpos monoclonais incluem os métodos de hibridoma de Köhler & Milstein (1975, Nature 256:495-497) e o método de hibridoma de células B humanas (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; e Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque), pp. 51-63).

[0160] Os anticorpos aqui descritos podem ser identificados ou obtidos utilizando um método de hibridoma. Nesse método, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, como um hamster, é imunizado para provocar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma.

[0161] O meio de cultura em que as células de hibridoma estão crescendo é analisado quanto à produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA).

[0162] Os anticorpos monoclonais podem então ser purificados a partir de sobrenadantes de hibridoma para testes adicionais quanto à sua ligação específica ao antígeno alvo e engenharia de anticorpos, por exemplo, para diferentes

53 / 70 finalidades diagnósticas ou terapêuticas.

[0163] Os anticorpos específicos para huTNFR1, em alguns casos, emergem através do rastreamento contra o antígeno huTNFR1. Para aumentar a probabilidade de isolar clones de ligação diferencial, aplicar-se-iam múltiplas pressões seletivas por triagem processual contra diferentes antígenos ou epítopos.

[0164] Os métodos de triagem para identificar anticorpos com as propriedades de ligação seletiva desejadas podem ser feitos por tecnologias de exibição usando uma biblioteca que exibe sequências de anticorpos ou sequências de ligação a antígenos (por exemplo, usando células fágicas, bacterianas, leveduras ou mamíferas; ou sistemas de exibição in vitro que traduzem ácido nucleico informação nos respectivos (poli)peptídeos). A reatividade pode ser avaliada com base em ELISA, Western blotting ou coloração de superfície com citometria de fluxo, por exemplo, usando ensaios padrão.

[0165] Os antígenos isolados podem, por exemplo, ser utilizados para selecionar anticorpos de uma biblioteca de anticorpos, por exemplo, uma biblioteca de anticorpos exibida em fagos, fagomídeos ou leveduras.

[0166] Modalidades específicas aqui descritas se referem a “composições farmacêuticas”, tais composições podem compreender o anticorpo como aqui descrito e um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável, em particular para obter uma composição artificial que não ocorre naturalmente. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas de acordo com a presente invenção como uma injeção ou infusão em bolus ou por infusão contínua. Os veículos farmacêuticos adequados para facilitar tais meios de administração são bem conhecidos na técnica.

[0167] Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem geralmente

54 / 70 todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis com um anticorpo ou composição ou combinação relacionada aqui descrita. Outros exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem água estéril, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como combinações de qualquer um deles.

[0168] Em um desses aspectos, um anticorpo pode ser combinado com um ou mais veículos apropriados a uma via de administração desejada, os anticorpos podem ser, por exemplo, misturados com qualquer um de lactose, sacarose, amido, ésteres de celulose de ácidos alcanóicos, ácido esteárico, talco, magnésio estearato, óxido de magnésio, sais de sódio e cálcio de ácidos fosfórico e sulfúrico, acácia, gelatina, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, álcool polivinílico e, opcionalmente, em comprimidos ou encapsulados para administração convencional.

Alternativamente, um anticorpo pode ser dissolvido em solução salina, água, polietileno glicol, propileno glicol, soluções coloidais de carboximetilcelulose, etanol, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, goma tragacanta e/ou vários tampões. Um veículo pode incluir um material de liberação controlada ou um material com atraso de tempo, como monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila sozinho ou com uma cera, ou outros materiais bem conhecidos na técnica.

[0169] Transportadores farmaceuticamente aceitáveis adicionais são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE REMINGTON. As formulações líquidas podem ser soluções, emulsões ou suspensões e podem incluir excipientes como agentes de suspensão,

55 / 70 solubilizadores, surfactantes, conservantes e agentes quelantes.

[0170] As composições farmacêuticas são contempladas em que o anticorpo aqui descrito e um ou mais agentes terapeuticamente ativos são formulados. As formulações estáveis do anticorpo aqui descritas são preparadas para armazenamento misturando o referido anticorpo com o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais, na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. As formulações a serem usadas para administração in vivo são estéreis. Isto é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis ou outros métodos. O anticorpo e outros agentes terapeuticamente ativos aqui divulgados também podem ser formulados como imunolipossomas e/ou aprisionados em microcápsulas.

[0171] A administração da composição farmacêutica compreendendo um anticorpo aqui descrito, pode ser feita de várias maneiras, incluindo oralmente, subcutaneamente, intravenosamente, intranasalmente, intraoticamente, transdermicamente, mucosa, topicamente, por exemplo, géis, pomadas, loções, cremes, etc., intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, por exemplo empregando tecnologia inalável ou sistemas de administração pulmonar, vaginal, parenteral, retal ou intraocular.

[0172] As formulações de exemplo utilizadas para administração parentérica incluem aquelas adequadas para injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa como, por exemplo, uma solução, emulsão ou suspensão estéril.

[0173] Em uma modalidade, o anticorpo aqui descrito é o único agente terapeuticamente ativo administrado a um indivíduo, por exemplo, como uma doença que modifica ou impede a monoterapia.

56 / 70

[0174] Em outra modalidade, o anticorpo aqui descrito é combinado com outras substâncias ativas, por exemplo, em uma mistura ou kit de partes, para tratar um sujeito necessitado de terapia ou profilaxia, como uma doença que modifica ou impede a terapia combinada.

[0175] A combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos ou profiláticos podem incluir tratamento padrão, por exemplo, antibióticos, inibidores de inflamação esteroides e não esteroides. e/ou outra terapia baseada em anticorpos. A combinação pode compreender especificamente agentes que são utilizados para o tratamento da doença primária, onde processos inflamatórios levariam a condições inflamatórias secundárias, doenças degenerativas ou malignas. A doença primária é, por exemplo, NASH e a combinação seria, por exemplo, incluem NSAID ou outros medicamentos novos, como agonistas de FXR, agonistas de GLP1R ou agonistas de PPAR.

[0176] Numa terapia combinada, o anticorpo pode ser administrado como uma mistura ou concomitantemente com um ou mais outros regimes terapêuticos, por exemplo, antes, simultaneamente ou após terapia concomitante.

[0177] As propriedades biológicas do anticorpo ou a respectiva preparação farmacêutica aqui descrita podem ser caracterizadas ex vivo em experiências com células, tecidos e organismos inteiros. Como é conhecido na técnica, os medicamentos são frequentemente testados in vivo em animais, incluindo, entre outros, camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e macacos, a fim de medir a eficácia de um medicamento no tratamento contra uma doença ou doença modelo, ou para medir a farmacocinética, farmacodinâmica, toxicidade e outras propriedades de um medicamento. Os animais podem ser referidos como modelos de doenças. A terapêutica é frequentemente testada em camundongos, incluindo, sem limitação,

57 / 70 camundongos nus, camundongos SCID, camundongos xenoenxertos e camundongos transgênicos (incluindo batidas e nocautes). Essa experimentação pode fornecer dados significativos para a determinação do potencial do anticorpo a ser usado como terapêutico ou profilático com a meia-vida apropriada, função efetora, atividade inibidora e/ou resposta imune após imunoterapia passiva.

Qualquer organismo, preferencialmente mamíferos, pode ser usado para teste. Por exemplo, devido à sua semelhança genética com seres humanos, primatas, macacos podem ser modelos terapêuticos adequados e, portanto, podem ser usados para testar a eficácia, toxicidade, farmacocinética, farmacodinâmica, meia- vida ou outra propriedade do agente ou composição em questão. Testes em humanos são necessários para aprovação como medicamentos e, é claro, essas experiências são contempladas. Assim, o anticorpo e as respectivas composições farmacêuticas aqui descritas podem ser testados em humanos para determinar sua eficácia terapêutica ou profilática, toxicidade, imunogenicidade, farmacocinética e/ou outras propriedades clínicas.

[0178] Portanto, a invenção fornece um novo método de tratamento da NASH, e em particular as condições de doença associadas à NASH. Foi surpreendente que um anticorpo anti-TNFR1 estivesse melhorando significativamente a esteatose hepática e a atividade histológica da doença no NASH, como mostrado em um modelo de camundongo. A inibição do TNFR1 resultou em uma redução significativa da porcentagem de esteatose hepática, bem como do conteúdo de triglicerídeos.

Além disso, o escore de atividade da NAFLD, que considera esteatose, estimulação por dilatação e inflamação lobular, diminuiu significativamente pelo tratamento com anticorpo anti-TNFR1. Era inesperado que a inibição seletiva do TNFR1 estivesse melhorando a fibrose hepática em um modelo de camundongo com NAFLD, e foi

58 / 70 capaz de tratar e fibrose hepática reduzindo a fibrose no tecido hepático. Foi ainda demonstrado que o tratamento com anticorpo anti-TNFR1 foi capaz de reduzir a apoptose nos tecidos do fígado. Além disso, foi alcançada uma redução significativa dos níveis séricos de ALT e insulina. Assim, o tratamento com um anticorpo anti- TNFR1 resultou em uma melhora significativa da inflamação e resistência à insulina na NAFLD.

[0179] Foi particularmente surpreendente que um anticorpo anti-TNFR1 melhore significativamente a esteatose hepática e a atividade histológica da doença na NASH em vista da técnica anterior, porque o desenvolvimento da NASH ou esteatose foi relatado como efeito colateral da terapia com TNFi. Feagins et al.

relataram que pacientes com doença de Crohn, artrite reumatoide, artrite psoriática e espondilite anquilosante que foram tratados com infliximabe, adalimumabe ou etanercepte desenvolveram níveis anormais de ALT durante o tratamento com TNFi e mostraram NAFLD (NASH ou esteatose) em biópsias hepáticas (Eur J Gastroenterol Hepatol. 2015, 27(10):1154-1160). Foi, portanto, altamente inesperado que a inibição seletiva do TNFR1 seja eficaz contra a NASH.

[0180] Anticorpos exemplares aqui descritos são, por exemplo, anticorpos completos produzidos de acordo com WO2012035141 e/ou seu anticorpo parental de camundongo H398, como descrito em WO2008113515A2, variantes funcionalmente ativas e com afinidade amadurecidas e/ou fragmentos de anticorpos de qualquer um dos anteriores, ou aqueles anticorpos que são ligantes anti- huTNFR1 monovalentes e compreendem o local de ligação ao antígeno de qualquer um dos anteriores, como os anticorpos monovalentes descritos no documento WO2017174586 A1.

[0181] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, sem

59 / 70 ser limitada aos mesmos.

EXEMPLOS

[0182] Exemplo 1: Melhoria da esteatose hepática e atividade da doença histológica em camundongos com NAFLD experimental MÉTODOS:

[0183] Os camundongos B6-huTNFR1-k/i receberam uma dieta rica em gorduras (HFD), que consiste em 60% de gordura kcal + frutose/sacarose na água potável (Kohli R et al., Hepatology 2010) por 24 semanas, complementadas com anti-TNFR1 (Atrosab) ou anticorpo de controle (Cetuximab, um anticorpo anti-EGFR, Erbitux®, ImClone Systems, Bristol-Myers Squibb e Merck KGaA) (20 mg/kg de peso corporal, 2x/s) por mais 8 semanas.

[0184] O anticorpo Atrosab aqui utilizado é um anticorpo completo produzido de acordo com o documento WO2012035141 e compreendendo o local de ligação ao antígeno incorporado na combinação de um domínio VH e VL, compreendendo seis sequências de CDR, que são: SEQ ID NO:23: VH-CDR1 SEQ ID NO:24: VH-CDR2 SEQ ID NO:25: VH-CDR3 SEQ ID NO:26: VL-CDR1 SEQ ID NO:27: VL-CDR2 SEQ ID NO:28: VL-CDR3.

[0185] No final do tratamento, os tecidos hepáticos dos camundongos tratados diferentemente foram comparados quanto à esteatose hepática, escore de atividade da NAFLD, apoptose e fibrose.

[0186] A porcentagem de esteatose e o escore de atividade NAFLD (NAS) de

60 / 70 acordo com Kleiner et al. (Hepatology 2005) foram avaliados por um patologista. O conteúdo de triglicerídeos foi determinado em tecidos hepáticos homogeneizados usando um teste enzimático (Roche Diagnostics). A apoptose foi investigada por imuno-histoquímica usando um anticorpo para a caspase-3 ativada (sinalização celular). A fibrose foi detectada pela coloração Sirius Red de acordo com o protocolo do fabricante (Sigma Aldrich) e quantificada conforme descrito (Schindelin J et al., Nat Methods 2012).

[0187] Os soros foram analisados quanto aos níveis de ALT por um teste cinético de UV (Beckman Coulter) e os níveis de insulina foram medidos usando o kit ELISA de insulina de camundongo ultrassensível (Crystal Chem.) De acordo com as instruções do fabricante.

RESULTADOS:

[0188] O tratamento com atrosab resultou em uma melhora significativa da esteatose hepática e da atividade histológica da doença em camundongos com NAFLD experimental.

[0189] Os tecidos hepáticos de camundongos HFD tratados com anticorpo anti-TNFR1 (Atrosab) ou anticorpo controle (Cetuximab) foram analisados histologicamente quanto à porcentagem de esteatose hepática, conteúdo de triglicerídeos e atividade da doença avaliados pelo escore de atividade da NAFLD (NAS). Comparado aos camundongos tratados com o anticorpo de controle, a inibição do TNFR1 resultou em uma redução significativa da porcentagem de esteatose hepática (p<0,05; Fig. 1A), bem como do conteúdo de triglicerídeos (p<0,01; Fig. 1B). Além disso, o escore de atividade da NAFLD (NAS), que considera esteatose, inflamação da dilatação e inflamação lobular, diminuiu significativamente (p<0,05) nos tratados com Atrosab em comparação aos ratos de controle (Fig. 1C).

61 / 70

[0190] Exemplo 2: A inibição seletiva do TNFR1 está associada à melhora da fibrose hepática no modelo de camundongo com NAFLD

[0191] Tendo demonstrado que a inibição seletiva do TNFR1 melhora a esteatose hepática e o NAS, o efeito do Atrosab na redução da fibrose foi analisado.

Foi demonstrada melhora da fibrose hepática, avaliada pela coloração Sirius Red, em camundongos tratados com o anticorpo anti-TNFR1 em comparação com aqueles tratados com anticorpo de controle (Fig. 2A). A quantificação da área fibrótica revelou uma redução significativa da fibrose (p<0,05) nos tecidos do fígado de camundongos tratados com anticorpo anti-TNFR1 em comparação com camundongos de controle (Fig. 2B).

[0192] Exemplo 3: Apoptose reduzida nos tecidos hepáticos de camundongos NAFLD tratados com anticorpo anti-TNFR1

[0193] Nas experiências iniciais, os camundongos receberam HFD por 20 semanas, incluindo um tratamento de 4 semanas com anticorpo anti-TNFR1 ou controle. Foi demonstrado que o tratamento com anticorpo anti-TNFR1 é capaz de reduzir a apoptose, avaliada por análise imuno-histoquímica da caspase-3 ativa, já dentro de um período de tratamento de 4 semanas. Comparado ao anticorpo controle, uma redução significativa (p<0,05) da caspase-3 ativa pode ser observada nos tecidos hepáticos de camundongos tratados com o anticorpo anti-TNFR1 (Fig.

3).

[0194] Exemplo 4: Melhoria dos níveis de ALT e insulina em soros de camundongos NAFLD tratados com anticorpo anti-TNFR1

[0195] De acordo com a observação da histologia aprimorada de camundongos tratados com anticorpo anti-TNFR1 (Fig. 1 e 2), uma redução significativa (p<0,05) dos níveis séricos de ALT (Fig. 4A) e insulina (Fig. 4B) em

62 / 70 camundongos foi tratado com anticorpo anti-TNFR1 em comparação com aqueles tratados com anticorpo de controle. Assim, a inibição seletiva do anti-TNFR1 resultou em uma melhora significativa da inflamação e resistência à insulina.

[0196] Exemplo 5: Descrição do Atrosimab - Produção e Caracterização

[0197] Materiais

[0198] O anticorpo Atrosab foi obtido como descrito no Exemplo 1. A proteína de fusão TNFR1-Fc humana recombinante foi produzida como descrito em WO2012035141. Atrosimab (HC: SEQ ID NO:18; LC:SEQ ID NO:13) foi produzido e purificado após transdução lentiviral em células CHO pela Catalent (Catalent Pharma Solutions, Somerset, Ewing, NJ, EUA). O anti-His-HRP (HIS-6 His-Probe- HRP, sc-8036) foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). A IgG anti-humana A (cabra, policlonal, 2010-01) foi adquirida da SouthernBiotech e a IgG B anti-humana (cabra, policlonal, MBS571163), bem como a IgG B anti-humana (cabra, policlonal, MBS571678) da MyBioSource, (San Diego, CA, EUA). Além disso, a IgG anti-humana (específica para Fab, A 0293) e a IgG anti-humana (específica para Fc, A 0170) foram adquiridas à Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Alemanha).

[0199] Produção de Proteínas

[0200] A proteína de referência Fab 13.7 foi produzida conforme descrito no documento WO2017174586A1 em células HEK 293E transfectadas transitoriamente usando polietilenimina (linear, 25 kDa, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha) e purificada por cromatografia em afinidade proteica estritamente conforme recomendado pelo fabricante (CaptureSelect™ IgG- CH1 Affinity Matrix, 194320005, Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Alemanha).

[0201] Caracterização de Proteínas

[0202] A pureza e a montagem correta do Atrosimab foram analisadas por

63 / 70 SDS-PAGE usando 4 µg de proteína purificada na presença e ausência de beta- mercaptoetanol como agente redutor. As proteínas no gel foram coradas usando Coomassie-Brilliant Blue e os géis foram descorados com água. A proteína intacta foi analisada por cromatografia de exclusão por tamanho usando uma HPLC Waters 2695 e uma coluna Phenomenex Yarra SEC-2000 (300 x 7,8 mm). Proteínas padrão: Tiroglobulina (669 kDa), apoferritina (443 kDa), álcool desidrogenase (150 kDa), BSA (66 kDa), anidrase carbônica (29 kDa), peptídeo FLAG (1 kDa).

[0203] Estabilidade Térmica

[0204] A Temperatura de fusão/agregação (Tm) do Atrosimab foi determinada por espalhamento dinâmico de luz (ZetaSizer Nano ZS, Malvern, Herrenberg, Alemanha) usando 100 µg de proteína purificada em PBS. A temperatura aplicada foi aumentada em intervalos de 1°C de 35°C a 80°C com tempos de equilíbrio de 2 minutos antes de cada medição. A Tm foi determinada por interpretação visual do sinal crescente (kcps).

[0205] Estabilidade do plasma

[0206] As amostras de Atrosimab purificado foram diluídas no plasma humano para uma concentração de 100 nM e incubadas a 37°C por 1, 3 e 7 dias. A análise subsequente da capacidade de ligação restante ao TNFR1 humano foi realizada por ELISA após diluição em série em 2% de leite desnatado em PBS (2% de MPBS) por etapas de 1 a 3,16 (raiz quadrada de 10). As amostras de controle foram incubadas a 4°C em PBS por 7 dias ou diretamente congeladas após diluição no plasma humano.

[0207] Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)

[0208] As placas de microtitulação foram revestidas com 100 µL de proteína de fusão TNFR1-Fc (1 µg/ml em PBS) e incubadas a 4°C durante a noite. Os locais

64 / 70 de ligação residual foram bloqueados com 2% de MPBS (leite desnatado em PBS, 200 µl por poço) à temperatura ambiente durante 2 horas e subsequentemente lavados duas vezes com PBS. 100 µl das amostras diluídas em 2% de MPBS foram incubadas à temperatura ambiente por 1 hora antes da última etapa de incubação com 100 µl dos anticorpos de detecção conjugados com HRP em 2% de MPBS. A proteína ligada foi detectada com 100 µl de solução de substrato TMB (1 mg/ml 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina [TMB], 0,006% de H2O2 em tampão Na-acetato 100 mM, pH 6 à temperatura ambiente), a reação de HRP foi interrompida pela adição de 50 µL de H2SO4 1 M e a absorção no comprimento de onda de 450 nm foi medida usando o leitor de placas de microtitulação Infinite (TECAN, Maennedorf, Suíça).

Entre cada etapa de incubação e antes da detecção, as placas foram lavadas duas vezes com PBST e duas vezes com PBS.

[0209] Medições de Afinidade usando a Microbalança de Quartzo Cristal

[0210] A dinâmica de ligação em tempo real nas interações proteína-proteína foi determinada por medições de microbalança de cristal de quartzo (Cell-200 C- Fast, Attana, Estocolmo, Suécia). Um dos parceiros de ligação (TNFR1-Fc) foi quimicamente imobilizado em um LNB Carboxyl Sensor Chip (3623-3103, Attana, Estocolmo, Suécia) de acordo com o protocolo do fabricante a uma densidade moderada de ~ 94 ΔHz. As experiências de ligação foram realizadas com amostras (analito) diluídas em PBST (PBS, 0,1% Tween 20) entre 128 nM e 4 nM (etapas de diluição 1:2) a pH 7,4 com uma taxa de fluxo de 25 µl/min a 37°C. O chip foi regenerado com 25 µl de glicina 20 mM, pH 2,0. A cada terceira medição, uma injeção de tampão de corrida foi medida, a qual foi subtraída da curva de ligação antes da análise dos dados. Os dados foram coletados utilizando o software fornecido pela Attana e analisados pelo software Attaché Office Evaluation (Attana,

65 / 70 Estocolmo, Suécia) e TraceDrawe (ridgview instruments, Vange, Suécia).

[0211] Ensaio de Liberação de Interleucina

[0212] 2 x 104 células HeLa ou HT1080 por poço foram semeadas em uma placa de microtitulação de 96 poços e cultivadas em 100 µL de RPMI 1640 + 5% de FCS durante a noite. No dia seguinte, os sobrenadantes foram trocados para remover citocinas produzidas constitutivamente. As células foram incubadas com séries de diluição de amostras em RPMI 1640 + 5% de FCS a 37°C, 5% de CO2. No caso de experimentos de competição, ambas as amostras de proteínas analisadas foram preparadas individualmente (tituladas ou diluídas para uma única concentração) e adicionadas posteriormente à placa. As células não estimuladas serviram como controle. Após 16-20 horas, as placas foram centrifugadas a 500 g por 5 minutos e os sobrenadantes celulares foram analisados diretamente por ELISA, que foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Os sobrenadantes foram diluídos em RPMI 1640 (sem FCS) e os anticorpos foram diluídos em Diluente de Reagente (BSA a 0,1%, Tween 20 a 0,05%, TRIS 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5).

As placas de microtitulação revestidas foram bloqueadas usando BSA a 1% (albumina de soro bovino) em PBS e a lavagem, bem como a detecção e medição foram realizadas como descrito acima para ELISA. Os kits ELISA sanduíche para a detecção de IL-6 e IL-8 no sobrenadante da cultura de células foram adquiridos à ImmunoTools, (Friesoythe, Alemanha).

[0213] Ensaio de Citotoxicidade/Viabilidade Celular

[0214] As células (1 x 104 por poço) foram semeadas em placas de microtitulação de 96 poços e incubadas durante a noite a 37°C e 5% de CO 2. As proteínas foram diluídas em RPMI 1640 + 10% de FCS e adicionadas às células. Os ensaios de citotoxicidade foram incubados a 37°C, 5% de CO2 por 24 horas antes do

66 / 70 sobrenadante ser descartado e 50 µl de solução de cristal violeta foram adicionados aos poços. Posteriormente, as placas foram lavadas em ddH 2O por 20 vezes e secas. O restante do corante violeta, resultante de células vivas e aderentes, que foram fixadas pelo metanol contido na solução de coloração, foi dissolvido pela adição de 100 µl de metanol por agitação à RT por 10 minutos. As placas foram medidas usando o leitor de microtitulação Infinite (Tecan, Maennedorf, Suíça).

[0215] Farmacocinética

[0216] Camundongos transgênicos C57BL/6J, portadores do gene do domínio extracelular do TNFR-1 humano no locus do gene particular do camundongo (C57BL/6J-huTNFRSF1Aecdtm1UEG/izi, Dong et al., 2016), receberam uma injeção intravenosa de 400 µg Atrosimab. As amostras de sangue foram coletadas após 3 min, 30 min, 1h, 2h e 6h, bem como após 3 dias e 7 dias e incubadas em gelo imediatamente. O soro foi separado por centrifugação (13.000 g, 4°C, 10 minutos) e armazenado a -20°C. A proteína remanescente no soro foi detectada por ligação a ELISA como descrito acima. O sinal ELISA foi interpolado a partir de uma curva de ligação padrão recém-preparada da proteína analisada. As concentrações determinadas foram plotadas contra o tempo e as constantes farmacocinéticas foram obtidas na análise usando o suplemento PKsolver para Microsoft Excel.

[0217] Exemplo 5.1: Caracterização Bioquímica do Atrosimab

[0218] Um antagonista específico do receptor 1 (TNFR1) do fator de necrose tumoral (TNF), designado Atrosimab, foi gerado por fusão dos domínios variáveis do Fab 13.7 aos terminais N de um módulo Fc heterodimerizador Fc1k (um/kapa). Esse processo resultou em uma molécula monovalente do tipo Fab de tamanho aumentado, equipada com a capacidade de interagir com o receptor Fc neonatal, a fim de permitir a circulação sérica prolongada (Fig. 6a). O candidato a medicamento

67 / 70 resultante Atrosimab foi produzido em células CHO após várias rodadas de transdução lentiviral, purificadas por cromatografia de afinidade por proteína A e cromatografia de exclusão por tamanho consecutiva (SEC) por Catalent Pharma Solutions (Catalent Pharma Solutions, Somerset, Ewing, NJ, EUA).

[0219] O Atrosimab revelou um pico único na SEC em um tempo de retenção de 17,9 minutos, com um peso molecular interpolado de 81 kDa e um raio de Stokes rS de 3,5 nm (Fig. 6b). No SDS-PAGE sob condições redutoras, duas bandas de 38 kDa e 43 kDa foram detectadas, assim como uma banda de 70 kDa em condições não redutoras (Fig. 6c). Estes dados correspondem bem à massa molecular calculada de 72 kDa (composta por cadeias de 35 kDa e 36 kDa), indicam expressão adequada de ambas as cadeias polipeptídicas e montagem correta da proteína heterodimérica funcional. Além disso, o Atrosimab revelou um ponto de agregação (Tm) de 64°C, determinado pelo espalhamento dinâmico da luz (DLS, Fig. 6d), que é comparável ao das moléculas de IgG intactas analisadas também pelo DLS (Martin et al., 2014, Brader et al., 2015)). Finalmente, a atividade de ligação do Atrosimab ao TNFR1-Fc humano permaneceu inalterada após a incubação no plasma humano por até 7 dias, indicando boa estabilidade plasmática (Fig. 6e).

[0220] Exemplo 5.2: Ligação do Atrosimab aos TNFR1, Receptores Fcγ e Proteína Complementar C1q

[0221] A interação do Atrosimab com seu receptor alvo TNFR1 foi analisada por ELISA em condições de equilíbrio, resultando em um valor de EC 50 de 0,4 nM (Fig. 7a), representando uma redução de duas vezes na atividade de ligação, quando comparado ao Fab 13.7 parental e a redução de quatro vezes em comparação com o IgG bivalente ATROSAB. Além disso, o Atrosimab se ligou em

68 / 70 um estudo de ligação em tempo real usando uma microbalança de cristal de quartzo ao TNFR1 humano, imobilizado a uma densidade moderada de receptores de ~94 ΔHz, com um valor aparente de KD valor de 2,7 nM, e kon 3,7 × 105 M-1s-1 de e um koff de 9,8 × 10-4 s-1 (Fig. 7b), conforme analisado por um algoritmo de ligação 1:1. Vale observar, o Atrosimab compreende uma região Fc que é modificada para reduzir as funções efetoras mediadas por anticorpos (Armour et al., 1999). Consequentemente, o Atrosimab revelou uma falta quase completa de ligação aos receptores Fcγ humanos Ia, IIb e IIIa, bem como à proteína complemento C1q, como demonstrado por ELISA (Fig. 7c). A ligação foi reduzida em uma extensão semelhante (FcγRI e FcγRIII) ou ainda mais pronunciada (FcγRIIb e C1q) quando comparada com o TNFR1 IgG ATROSAB anti-humano descrito anteriormente, (Zettlitz et al., 2010), que apresenta as mesmas modificações de Fc ao receptor Fcγ e ligação a C1q.

[0222] Exemplo 5.3: Atrosimab inibe a ativação do TNFR1 in vitro e carece de qualquer atividade agonística

[0223] O Atrosimab revelou ausência completa de qualquer bioatividade agonística dentro de uma faixa de concentração analisada entre 50 pM e 500 nM em experimentos de liberação de interleucina (IL), usando células HeLa para analisar células IL-6 e HT1080 para IL-8, bem como na indução de morte celular ensaios usando células Kym-1 (Fig. 3a-c). Uma falta idêntica de agonismo foi detectada no caso do Fab 13.7 parental. Em contraste, o IgG ATROSAB bivalente induziu uma liberação marginal de IL-6 e IL-8 em concentrações entre 1 nM e 100 nM (Fig. 8a e b), o que confirmou dados publicados anteriormente (Richter et al., 2013). Em contraste, a atividade agonística marginal de ATROSAB não pôde ser detectada no ensaio de indução de morte celular Kym-1 (Fig. 8c).

[0224] Além disso, o Atrosimab inibiu a ativação do TNFR1, induzido por TNF

69 / 70 0,1 nM no ensaio de liberação de HeLa IL-6 e no ensaio de liberação de HT1080 IL- 8 com valores de EC50 de 54,5 nM e 24,2 nM, respectivamente (Fig. 8d e). Além disso, a morte celular, induzida por 0,1 nM de TNF nas células Kym-1, foi inibida pelo Atrosimab com um valor de IC50 de 16,2 nM (Fig. 8f). Quando comparados com o Fab 13,7 parental, esses dados representam uma redução de 1,5 a 1,9 vezes na bioatividade (Tabela 1). No entanto, em comparação com a bioatividade do IgG ATROSAB bivalente, o Atrosimab demonstrou inibição mais potente em 3,0, 3,5 e 4,0 vezes mais da ativação de TNFR1 mediada por TNF, conforme determinado no ensaio de liberação de IL-6 a liberação de IL-8 ensaio de indução de morte celular, respectivamente (Tabela 1).

Tabela 1 Bioatividade do Atrosimab Atrosimab Fab 13.7 ATROSAB IC50, IL-6 [nM] 54,5 37,1 164,7 IC50, IL-8 [nM] 24,2 12,7 84,1 IC50, Indução de morte celular 16,2 9,5 64,4 [nM]

[0225] Abordando o risco potencial de reticulação secundária do Atrosimab, mediado por anticorpos antifármacos (ADAs), o potencial agonístico do Atrosimab foi analisado na presença de três soros IgG anti-humanos diferentes em ensaios de liberação de IL-8 usando células HT1080 (Richter et a. 2013). A ligação dos soros de IgG anti-humano e de camundongos a Atrosimab, Fab 13.7 e ATROSAB foi demonstrada por ELISA (dados não mostrados). Notavelmente, o Atrosimab não induziu nenhuma liberação de IL-8 dentro da faixa de concentração analisada (50 pM a 500 nM), o que também foi observado para o Fab 13,7 parental (Fig. 9a-c). Em contraste, o IgG ATROSAB bivalente induziu claramente uma liberação aumentada de IL-8 (Fig. 9a-c), quando comparado à liberação marginal observada na Figura 8,

70 / 70 indicando uma propensão claramente reduzida de Atrosimab para mediar qualquer ativação do TNFR1, mesmo na presença de anticorpos específicos do medicamento, quando comparado ao ATROSAB.

[0226] Exemplo 5.4: Farmacocinética do Atrosimab

[0227] Finalmente, as propriedades farmacocinéticas do Atrosimab foram registradas após a injeção em bolus de 400 µg de proteína usando camundongos C57BL/6J-huTNFRSF1Aecdtm1UEG/ izi (Dong et al., 2016) que transportam um transgene do domínio extracelular do TNFR1 humano (Fig. 10, Tabela 2) O Atrosimab foi eliminado da circulação do mouse com uma meia-vida inicial de 2,2 ± 1,2 horas e uma meia-vida terminal de 41,8 ± 18,1 horas, resultando em uma área sob a curva de 5856,0 ± 1369,9 µg/ml × h.

Tabela 2 Análise Farmacocinética do Atrosimab t1/2α (h) 2,2 ± 1,2 t1/2β (h) 41,8 ± 18,1 C0 (μg/ml) 324,7 ± 53,5 AUC 0-t (μg/ml × h) 5856,0 ± 1369,9 Vss (µg/(µg/ml)) 3,4 ± 1,3 CL ((μg)/(μg/ml)/h) 0,29 ± 0,20 t1/2α, meia-vida inicial; t1/2β, meia-vida terminal; C0, concentração inicial interpolada; AUC 0-t, área sob a curva até o lase detectar o ponto no tempo; Vss, volume de distribuição (em estado estacionário); CL, depuração.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. ANTICORPO QUE RECONHECE ESPECIFICAMENTE O FATOR DE NECROSE TUMORAL 1 HUMANO (huTNFR1), caracterizado para uso no tratamento de esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e condições de doença associadas a ela.

2. ANTICORPO para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por reconhecer especificamente um epítopo no CRD1 e/ou subdomínio A1 distal da membrana do CRD2 do huTNFR1, preferencialmente reconhecendo especificamente um epítopo representado pelo aminoácido 1 a 115 na região N- terminal do huTNFR1.

3. ANTICORPO para uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal.

4. ANTICORPO para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser um anticorpo monoespecífico e bivalente de corpo inteiro.

5. ANTICORPO para uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio IgG1 Fc que é deficiente na mediação da função efetora, de preferência compreendendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em E233P, L234V, L235A, G236, A327G, A330S e P331S, de preferência compreendendo A327G/A330S/P331S, em que a numeração é de acordo com o índice Kabat EU.

6. ANTICORPO para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por reconhecer monovalentemente o huTNFR1.

7. ANTICORPO para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende a) um domínio variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as regiões determinantes da complementaridade (CDRs): VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3; e b) um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo as CDRs: VL- CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3, em que i) VH-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1; VH-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 2 VH-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3 VL-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 4 VL-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 5 VL-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 6; ou ii) VH-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 23; VH-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 24 VH-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 25 VL-CDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 26 VL-CDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 27 VL-CDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 28; em que a numeração está de acordo com o índice Kabat EU; ou uma variante funcionalmente ativa de qualquer um dos i) ou ii) acima, que compreende 0, 1 ou 2 mutações pontuais em cada uma das sequências de CDR e que reconhece especificamente o huTNFR1.

8. ANTICORPO para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de VH compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO:7 ou 9; e uma sequência VL compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO:8 ou 10, ou uma variante funcionalmente ativa da mesma, compreendendo até 1 ponto de mutação em cada uma das sequências CDR e pelo menos 60% de identidade de sequência nas sequências estruturais (FR) FR1 -4 de VH e VL.

9. ANTICORPO para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as condições da doença são esteatose hepática, fígado inflamado, fibrose hepática e carcinoma hepatocelular.

10. ANTICORPO para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que uma quantidade eficaz do anticorpo é administrada a um paciente que sofre de NASH, para antagonizar a sinalização de TNFa/huTNFR1.

11. ANTICORPO para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que uma quantidade eficaz do anticorpo é administrada a um paciente que sofre de NASH, para reduzir qualquer um ou mais a) esteatose, conteúdo de triglicerídeos, inflamação e/ou apoptose no tecido hepático; b) o nível sérico de aminotransferase; c) resistência à insulina e, opcionalmente, para melhorar a tolerância à glicose; e/ou d) o escore da atividade da NAFLD.

12. ANTICORPO para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado a um paciente que sofre de NASH a uma dose que varia de 0,05 mg/kg a 20 mg/kg.

13. ANTICORPO para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado a um paciente que sofre de NASH em combinação com um tratamento com medicamentos anti- inflamatórias ou terapias usando um agonista do receptor X farnesóide (FXR), um glucagon agonista do receptor tipo peptídeo-1 (GLP1R) ou um agonista do receptor ativado por proliferador de peroxissomo (PPAR).

14. ANTICORPO para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado a um paciente que também sofre de diabetes mellitus tipo II, diabetes mellitus tipo I, pré-diabetes, resistência à insulina ou obesidade, em que a obesidade é definida como o paciente com um índice de massa corporal de pelo menos 30.

15. ANTICORPO para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que uma preparação farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do anticorpo é usada.