BR112015022300B1 - Proteínas específicas para baff e b7rp1, seu método de produção bem como seu uso, composições farmacêuticas, ácido nucleico, vetor e célula hospedeira microbiana - Google Patents

Abstract

PROTEÍNAS ESPECÍFICAS PARA BAFF E B7RP1, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO BEM COMO SEU USO, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR E CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA. Descrevem-se aqui as proteínas biespecíficos para FABF e B7RP1, ácidos nucleicos que codificam tais proteínas, métodos de preparação de tais proteínas e utilizações para tais proteínas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US N°s 61/780.260, depositado em 13 de março de 2013 e 61/942.776 de-positado em 21 de fevereiro de 2014, cada um dos quais é incorporado neste documento em sua totalidade.

CAMPO

[0002] As moléculas biespecíficas descritas neste documento estão dentro do campo de proteínas terapêuticas.

FUNDAMENTOS

[0003] A maioria das proteínas terapêuticas liga-se a uma única pro teína alvo com elevada especificidade interferindo, desse modo, com a atividade desta única proteína alvo. Essa proteína pode ser uma parte de uma ou mais vias biológicas que mediam uma doença humana sendo tratada e a proteína terapêutica pode, portanto, inibir a progressão da doença. Entretanto, a eficácia de proteínas terapêuticas é raramente completa para todos os pacientes. A eficácia incompleta de proteínas terapêuticas pode ser devida, em alguns casos, à complexidade de uma doença. Por exemplo, algumas doenças podem ser mediadas por múltiplas vias biológicas ou diferentes vias biológicas podem desempenhar um papel predominante na mediação da atividade da doença em diferentes pacientes com a mesma condição clinicamente definida. Conse-quentemente, em algumas doenças pode ser vantajoso inibir simultaneamente em pelo menos duas vias biológicas.

RESUMO

[0004] Neste documento é provida uma proteína biespecífica que se pode se ligar e inibir a atividade biológica tanto de proteína 1 relacionada a B7 humano (B7RP1, também conhecido como GL50 e ligando co-estimulador de células T (ICOSLG)) quanto fator de ativação de células B humanas (BAFF, também conhecido como superfamília de fator de necrose tumoral, membro 13b (TNFSF13B)). BAFF desempenha um papel na sobrevivência de células B, e B7RP1 desempenha um papel na co-estimulação de células T. Deste modo, uma proteína que inibe a atividade de ambas as proteínas interfere com a atividade tanto de células B quanto T.

[0005] Proteína biespecífica é descrita neste documento, em que a proteína pode inibir a proliferação mediada por BAFF de células B hu-manas e em que a proteína pode inibir a proliferação mediada por B7RP1 de células T humanas. A proteína biespecífica pode compreender um anticorpo IgG compreendendo duas cadeias pesadas de imuno- globulina tendo diferentes sequências de aminoácidos e duas cadeias leves de imunoglobulina tendo diferentes sequências de aminoácidos. O anticorpo IgG pode inibir a proliferação de células B humanas mediada por BAFF e proliferação de células T humanas mediada por B7RP1. O anticorpo IgG pode ser um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 e pode ser um anticorpo IgG humano ou humanizado. A proteína biespecífica pode compreender uma região 1 de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDR1) compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 8, uma região 2 de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDR2) compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 9, uma região 3 de determinação de complemen-taridade de cadeia leve (CDR3) compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 10, uma cadeia pesada CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, uma cadeia pesada CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia pesada CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Adicionalmente, a proteína biespecífica pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 15 ou uma variante desta e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 14 ou uma variante desta. Tais sequências variantes podem compreender não mais do que 10 de- leções, inserções de substituições de um único aminoácido por 100 ami- noácidos em relação a uma sequência de referência.

[0006] Em uma modalidade alternativa, uma proteína biespecífica que pode inibir a proliferação de células B humanas mediada por BAFF e que pode inibir a proliferação de células T humanas mediada por B7RP1 pode compreender: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo a seguinte fórmula: A-L1-P-L2-P, em que A é uma cadeia pesada de imunoglobulina de um anticorpo IgG, L1 é um primeiro ligante dentre o que está ausente ou tem de 3 a 40 ami- noácidos de comprimento, P é um peptídeo de ligação de BAFF que tem de 10 a 40 aminoácidos de comprimento, e L2 é um peptídeo ligante que está ausente ou tem de 5 a 50 aminoácidos de comprimento; e (b) uma cadeia leve de imunoglobulina. A cadeia pesada de imunoglobulina de (a) e a cadeia leve de imunoglobulina de (b) podem formar um anticorpo IgG, compreendendo duas moléculas do polipeptídeo de (a) e duas moléculas de cadeia leve de (b), que pode ligar B7RP1 e/ou pode inibir a proliferação de células T humanas mediada por B7RP1. A cadeia pesada de imunoglobulina pode estar em falta de uma lisina em sua extremidade C-terminal logo a montante de L1. O anticorpo IgG pode ser um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano ou humanizado. O peptídeo P de ligação de BAFF pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3. L1 pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 37, 38, 39 ou 40. L2 pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, 6, ou 7. A proteína biespecífica pode compreender uma cadeia leve CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (RASQGISNWLA), uma cadeia leve CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (AASSLQS), uma cadeia leve CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (QQYDSYPRT), uma cadeia pesada CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (SYWMS), uma cadeia pesada CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (YIKQDGNEKYYV- DSVKG) e uma cadeia pesada CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (EGILWFGDLPTF). A proteína biespe- cífica pode compreender uma região variável de cadeia leve de imuno- globulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e/ou uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. A proteína biespecífica pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou uma variante desta e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou 18 ou variantes desta. Tais sequências variantes podem compreender não mais do que 10 deleções, inserções de substituições de um único aminoácido por 100 aminoácidos em relação à sequência de referência.

[0007] Em um aspecto adicional, é descrito neste documento uma proteína biespecífica compreendendo: (a) um polipeptídeo compreen-dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18 ou variantes desta; e (b) outro polipeptídeo compreendendo a se-quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou uma variante desta. Tais sequências variantes podem compreender não mais do que 10 dele- ções, inserções de substituições de um único aminoácido por 100 ami- noácidos em relação à sequência de referência. A proteína biespecífica pode inibir a proliferação de células B humanas mediada por BAFF e proliferação de células T humanas mediada por B7RP1. A proteína bi- específica pode ser um tetrâmero compreendendo duas moléculas do polipeptídeo de (a) e duas moléculas do polipeptídeo de (b).

[0008] Em outra modalidade, é provido neste documento uma pro teína compreendendo um ligante compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, esta proteína pode inibir a proliferação de células B humanas mediada por BAFF e/ou a proliferação de células T humanas mediada por B7RP1. Tal proteína pode compreender as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 14 e/ou SEQ ID NO: 15. Tal proteína pode compreender uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos duas cópias de SEQ ID NO: 1 separados por SEQ ID NO: 6 ou 7. Em uma modalidade adicional, tal proteína pode incluir uma cadeia leve de imunoglobulina e uma pesada de imunoglobulina, e SEQ ID NO: 6 ou 7 pode estar a jusante do C-terminal da cadeia pesada. Em tais modalidades, a SEQ ID NO: 6 ou 7 pode ser flanqueada por peptí- deos que se ligam a uma proteína que não seja aquela ligada pelas cadeias pesadas e leves.

[0009] Adicionalmente, é descrito neste documento uma composi ção farmacêutica compreendendo qualquer uma das proteínas biespe- cíficas descritas neste documento ou a proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou 7 e um excipiente fisiolo- gicamente aceitável.

[00010] Também é descrito neste documento um ácido nucleico que codifica qualquer polipeptídeo incluído em uma dentre as proteínas bi- específicas ou as proteínas compreendendo a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7 descritas neste documento. Ácidos nucleicos exemplares codificando um polipeptídeo incluído em uma proteína biespecífica incluem, por exemplo, ID SEQ NOs: 55, 56, 60, 61, 62 e 63, entre outras. Vetores compreendendo tais ácidos nucleicos e as células hospedeiras contendo tais vetores e/ou ácidos nucleicos são descritos. Adicionalmente, é descrito neste documento o método para fazer uma proteína biespecífica compreendendo cultura de célula hospedeira contendo um ácido nucleico codificando qualquer uma das proteínas biespecíficas descritas neste documento em condições de tal modo que o ácido nu- cleico seja expresso e recuperação da proteína a partir da massa celular ou do meio de cultura. A célula hospedeira pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula CHO ou uma célula bacteriana, tal como Escherichia coli.

[00011] Em outro aspecto, é descrito neste documento um método para tratar lúpus eritematoso sistêmico, incluindo nefrite lúpica, compreendendo administrar a um paciente uma quantia terapeuticamente eficaz de qualquer uma das proteínas biespecíficas descritas neste documento ou uma composição farmacêutica compreendendo tal proteína biespecífica. Outro terapêutico pode ser administrado ao paciente antes, depois ou simultaneamente com a proteína biespecífica. O outro terapêutico pode ser um corticosteroide, um antimalárico, ácido reti- nóico, um NSAID, ciclofosfamida, desidroepiandrosterona, micofenolato mofetil, azatioprina, clorambucil, metotrexato, tacrolimo, dapsona, tali- domida, leflunomida ou ciclosporina.

[00012] Em um aspecto adicional, é descrito neste documento um método de tratamento compreendendo administrar a um paciente uma quantia terapeuticamente eficaz de qualquer uma dentre as proteínas biespecíficas descritas neste documento ou uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína biespecífica descrita neste documento, em que o paciente tem uma doença selecionada a partir do grupo consistindo em: Vasculite ANCA positiva, artrite reumatoide (RA), doença de Crohn, colite ulcerativa, doença celíaca, pênfigo, penfigoide, lúpus eritematoso cutâneo subagudo (SCLE), esclerose múltipla, poli- neuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), miastenia grave, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite, anemia hemolítica autoimune (AIHA), púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), hepatite crônica ativa, cirrose biliar primária, síndrome de Sjogren, esclerose sistêmica, tireoidite de Hashimoto, doença de Graves, doença de Addison e neoplasia endócrina múltipla (MEN).

[00013] Em outro aspecto, é descrita neste documento uma compo-sição farmacêutica compreendendo qualquer uma dentre as proteínas biespecíficas ou as proteínas compreendendo a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7 descritas neste documento. A composição farmacêutica pode ser, por exemplo, para o tratamento de lúpus eritematoso sistêmico ou o nefrite lúpica.

[00014] Em outro aspecto, a utilização de qualquer uma dentre as proteínas biespecíficas providas neste documento como um medica-mento é descrita.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00015] Figura 1: Diagramas de proteínas biespecíficas que se ligam a BAFF e B7RP1. Por toda a linha superior é listado o identificador para cada construto. Por toda a segunda linha está uma breve frase descritiva referente à estrutura de cada construto. Por toda a linha de fundo está um diagrama da estrutura de cada construto. Os ovais não preenchidos representam regiões constantes de uma cadeia pesada ou leve de imunoglobulina. Os ovais preenchidos com linhas horizontais representam regiões variáveis de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina (VH ou VL). Os pequenos quadrados e laços solidamente preenchidos representam peptídeos de ligação de BAFF. As regiões de articulação são mostradas como linhas verticais pesadas, enquanto as pontes de dissulfeto são mostradas como linhas horizontais pesadas. A sequência de "G4S" na Figura 1, é divulgada na SEQ ID NO: 72.

[00016] Figura 2: Atividade de proteínas biespecíficas em um ensaio de proliferação de células B humanas. Os dados mostrados nas Figuras 2A (topo) e 2B (fundo) são de ensaios de proliferação de células B executados como descrito no Exemplo 1. Em ambos os painéis, o eixo x indica a concentração (log [nM]) da proteína biespecífica contida na mistura de ensaio e o eixo y indica a quantia de absorção de 3H-timidina (contagens por minuto (cpm)). O significado de cada símbolo é indicado por um identificador para cada proteína ensaiada. Significados dos identificadores são mostrados na Figura 1 e explicados no Exemplo 1.

[00017] Figura 3: Atividade de proteínas biespecíficas em um ensaio de proliferação de células T humanas. Os dados mostrados são a partir de ensaios de proliferação de células T executados como descrito no Exemplo 1. O eixo x indica a concentração (log [nM]) do anticorpo bies- pecífico ou aB7RP1 na mistura de ensaio e o eixo y indica o percentual de absorção de 3H-timidina de células T na presença de inibidores de B7RP1 nas concentrações indicadas em relação à absorção de 3H-timi- dina de células T sem inibidores de B7RP1 (percentual de controle). O identificador para cada proteína testada é indicado.

[00018] Figura 4: Liberação de citocina por células de amígdala hu-mana estimuladas com enterotoxina B de Staphylococcus (SEB). Os métodos são descritos no Exemplo 1. Os eixos y mostram os níveis de sinal detectado para as várias citocinas medidos utilizando kits Meso Scale Discovery (Rockville, Maryland) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram tratadas ou com aB7RP1 (faixa 1), P74293 (faixa 2), CTLA4-Ig (faixa 3) ou IgG humano (faixa 4). As citocinas ensaiadas são indicadas na figura.

[00019] Figura 5: Perfil farmacocinético de construtos biespecíficos em camundongos. Métodos para avaliar as propriedades farmacociné- ticas in vivo de P71617, P71619, P71621, P71622, P74293 e P74294 em camundongos são descritos no Exemplo 1. Como explicado no Exemplo 1, as proteínas biespecíficas foram detectadas por dois en-saios diferentes, um dos quais detectou apenas a porção Fc das proteínas (pontos de dados indicados por losangos preenchidos; ensaio de Fc) e um dos quais detectou tanto a porção Fc quanto a de ligação de BAFF das proteínas (pontos de dados indicados por quadrados preen-chidos; ensaio intacto). O eixo x indica o tempo pós-injeção (horas) e o eixo y indica a concentração da proteína detectada no soro (ng/ml). O construto injetado é indicado em cada painel.

[00020] Figura 6A: Inibição de proliferação de células B murinas por uma molécula biespecífica de representante murino (o "representante murino") que se liga a BAFF e B7RP1. O ensaio foi executado como descrito no Exemplo 2. O representante murino compreende um anti-corpo IgG B7RP1 anti-murino que tem duas cópias de um peptídeo de ligação de BAFF ligado ao C-terminal da cadeia pesada de imunoglobu- lina do anticorpo, como explicado no Exemplo 2. O controle positivo foi um pepticorpo de ligação de BAFF ("aBAFF "). Dados a partir do representante murino e aBAFF são indicados, respectivamente, por círculos e quadrados solidamente preenchidos. O eixo x indica a concentração destas proteínas de teste no ensaio (log [pM]) e o eixo y indica incorporação de 3H-timidina (cpm).

[00021] Figura 6B: Inibição da ligação de B7RP1 a células T murinas pelo representante murino. O ensaio foi executado como descrito no Exemplo 2. Um anticorpo IgG B7RP1 anti-murino ("anti-mB7RP1") foi usado como um controle positivo. Os dados do representante murino e anti-mB7RP1 são indicados, respectivamente, por círculos e quadrados solidamente preenchidos. O eixo x indica a concentração destas proteínas de teste no ensaio (log [pM]) e o eixo y indica a percentagem de B7RP1-Fc murino ligado às células T.

[00022] Figura 7: Efeitos in vivo sobre os parâmetros imunológicos de administração de glóbulos vermelhos de ovelha a camundongos. To-dos os resultados mostrados nesta figura são a partir de ensaios descritos no Exemplo 2. As proteínas com que os camundongos foram tratados são indicadas pelo preenchimento em cada barra da seguinte forma: não preenchida, anti-mB7RP1; linhas verticais, aBAFF; linhas horizontais, anti-mB7RP1 mais aBAFF; linhas diagonais, o represen-tante murino; quadriculado, mIgG1; e preenchimento sólido (apenas no painel de fundo), camundongos não desafiados com SBRC. Painel de topo, percentagem de células B do baço em camundongos desafiados com glóbulos vermelhos de ovelhas (SRBC). O eixo y indica a percentagem de células a partir do baço que são células B. Painel mediano, percentagem células CD4+T de baço que são células T de memória em camundongos desafiados com SRBC. Painel de fundo, níveis de anticorpos anti-SRBC em soro de camundongos desafiados com SRBC.

[00023] Figura 8A: Proteinúria em camundongos NZB/NZW tratados com várias proteínas. Os métodos são descritos no Exemplo 2. O trata-mento para cada grupo de camundongos é indicado da seguinte forma: círculos preenchidos, tampão salino-fosfato (PBS); quadrados preenchidos, murino IgG1 (um controle de isotipo; 5 mg/kg); quadrados não preenchidos, anti-mB7RP1 (4,68 mg/kg); triângulos preenchidos apontando para cima, aBAFF (1,88 mg/kg); triângulos não preenchidos apontando para cima, aBAFF (1,88 mg/kg) mais anti-mB7RP1 (4,68 mg/kg); e triângulos não preenchidos apontando para baixo, o representante murino (5 mg/kg). O eixo X indica a idade dos camundongos (meses) e o eixo y indica a percentagem de camundongos que exibiram proteinúria, isto é, >300 mb/dl de proteína na urina.

[00024] Figura 8B: Níveis de anticorpos contra DNA de filamento du-plo (dsDNA) em camundongos NZB/NZW de 8,5 meses de idade tratados com várias proteínas. Os métodos são descritos no Exemplo 2. O eixo X indica a identidade da(s) molécula(s) que os camundongos foram tratados da seguinte forma: 1, anti-mB7RP1 (4,68 mg/kg); 2, aBAFF (1,88 mg/kg); 3, aBAFF (1,88 mg/kg) mais anti-mB7RP1 (4,68 mg/kg); 4, o biespecífico representante murino (5 mg/kg); e 5, mIgG1 (o controle de isotipo; 5 mg/kg). O eixo y indica os níveis de anticorpos anti-dsDNA detectados como uma percentagem do controle positivo. Cada ponto indica dados a partir de um único camundongo.

[00025] Figura 9A: Os níveis de lgG anti-dsDNA em camundongos NZB/NZW. Os métodos são descritos no Exemplo 2. Dados a partir de vários grupos de camundongos são identificados da seguinte forma: 1, camundongos que receberam anti-mB7RP1 (14 mg/kg); 2, camundongos que receberam aBAFF (5,6 mg/kg); 3, camundongos que receberam uma combinação de anti-mB7RP1 (14 mg/kg) e aBAFF (5,6 mg/kg); 4, camundongos que receberam o representante murino (15 mg/kg); 5, camundongos que receberam o controle de isotipo de mIgG (15 mg/kg); e 6, camundongos que receberam PBS. Os asteriscos acima das faixas 1, 3 e 4 indicam uma diferença significante (*, p<0,05; ***, p<0,0001) entre dados nessas faixas e dados a partir da faixa 5 (mIgG).

[00026] Figura 9B: Percentagens de camundongos NZB/WF1 em cada grupo tendo proteinúria. Os métodos são descritos no Exemplo 2. Dados a partir de vários grupos de camundongos são identificados da seguinte forma: quadrados não preenchidos, camundongos que receberam anti-mB7RP1 (14 mg/kg); triângulos preenchidos apontando para cima, camundongos que receberam aBAFF (5,6 mg/kg); triângulos não preenchidos apontando para cima, camundongos que receberam uma combinação de anti-mB7RP1 (14 mg/kg) e aBAFF (5,6 mg/kg); triângulos não preenchidos apontando para baixo, camundongos que receberam o representante murino (15 mg/kg); quadrados preenchidos, camundongos que receberam o controle de isotipo de mIgG (15 mg/kg); e círculos preenchidos, camundongos que receberam PBS. Diferenças significantes foram detectadas entre o representante murino versus anti- mB7RP1 (p<0,01), aBAFF (p<0,0001) e mIgG (p<0,0001). A janela de tempo em que o tratamento ocorreu é indicada.

[00027] Figura 10: Resultados renais de camundongos NZB/WF1. Como explicado no Exemplo 2, rins foram coletados quando um camundongo morreu, se isso acontecesse antes do final do estudo ou no final do estudo. Resultados renais foram determinados como descrito no Exemplo 2, com resultados superiores indicando doença renal mais grave. São mostradas médias para cada grupo de camundongos mais barras de erro apropriadas. Os grupos de camundongos receberam os seguintes tratamentos: 1) anti-mB7RP1 (14 mg/kg), barra preenchida com linhas verticais; 2) aBAFF (5,6 mg/kg), barra preenchida com linhas horizontais; 3) combinação de anti-mB7RP1 (14 mg/kg) e aBAFF (5,6 mg/kg), barra preenchida com listras horizontais e verticais; 4) o representante murino (15 mg/kg), barra preenchida com padrão xadrez; 5) mIgG (15 mg/kg), barra preenchida com pontos brancos em um fundo preto; e 6) PBS, barra solidamente preenchida. Asteriscos indicam uma diferença significante a partir de camundongos tratados com mIgG com um valor p de <0,05 (*) ou <0,001 (***).

[00028] Figura 11: Efeitos da inibição de BAFF e/ou B7RP1 na artrite induzida por colágeno murino. Os métodos são descritos no Exemplo 4. Os cinco grupos de camundongos foram tratados com substâncias de teste indicadas da seguinte forma: mIgG, quadrados preenchidos conectados por linhas contínuas; PBS, quadrados preenchidos conectados por linhas tracejadas; anti-mB7RP1, círculos preenchidos conectados por linhas tracejadas; aBAFF, círculos abertos conectados por linhas contínuas; e combinação de anti-mB7RP1 e aBAFF, círculos preenchidos conectados por linhas contínuas. O painel de topo mostra a percentagem de incidência de artrite dos vários grupos e o painel de fundo mostra os resultados de artrite médios dos grupos. A seta vertical apontando para baixo em cada painel indica o tempo da segunda imunização com colágeno bovino. BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00029] São providas neste documento proteínas biespecíficas que se ligam e inibem tanto o fator de ativação de células B (BAFF; também conhecido como BLYS, TALL1, THANK ou TNFSF13B) quanto proteína 1 relacionada com B7 (B7RP1; também conhecido como ligando de ICOS, ICOSL, LICOS, Homólogo 2 de B7, B7H2 e GL50), ácidos nuclei- cos codificando estas proteínas biespecíficas e métodos para fazer e utilizar estas proteínas. As proteínas biespecíficas podem inibir tanto a proliferação de B mediada por BAFF e proliferação de células T mediada por B7RP1. Em outro aspecto, as proteínas biespecíficas podem inibir ligação de B7RP1 a células T. Tal proteína biespecífica pode ser um anticorpo IgG compreendendo duas cadeias pesadas de imunoglobuli- nas diferentes e duas cadeias leves de imunoglobulina diferentes, onde um par de cadeia pesada/cadeia leve se liga a BAFF e o outro se liga a B7RP1. Alternativamente, a porção de ligação B7RP1 da proteína bies- pecífica pode compreender um anticorpo IgG incluindo duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas, e a porção de ligação de BAFF da proteína biespecífica pode compreender um ou mais peptí- deos de ligação de BAFF, que podem ser fundidos ao anticorpo anti- B7RP1, opcionalmente por meio do N-terminal da cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, o carboxi-terminal da cadeia pesada de imuno- globulina, e/ou dentro da região CH2 e/ou CH3 da cadeia pesada de imunoglobulina.

Definições

[00030] Um "anticorpo", conforme indicado neste documento, é uma proteína compreendendo uma região variável de imunoglobulina de cadeia pesada e/ou leve.

[00031] Uma proteína "biespecífica", conforme indicado neste documento, é uma proteína que se pode se ligar especificamente a duas moléculas diferentes, que, em algumas modalidades, são proteínas. Por exemplo, em algumas modalidades, uma proteína biespecífica pode se ligar tanto a BAFF quanto a B7RP1.

[00032] Um paciente recebendo tratamento "concorrente" com dois ou mais terapêuticos quando o paciente recebe os dois ou mais terapêuticos durante o mesmo período de tempo geral, opcionalmente, ao mesmo tempo. Por exemplo, se um paciente fosse dosado com um terapêutico diário em uma base contínua e também fosse dosado com outro terapêutico uma vez por mês em uma base contínua, o paciente estaria recebendo estes dois medicamentos simultaneamente. Da mesma forma, um paciente dosado com dois terapêuticos diferentes, cada um administrado a cada duas semanas, mas não no mesmo dia, estaria recebendo tratamento concomitante com os dois terapêuticos. Adicionalmente, um paciente recebendo um terapêutico em uma base contínua uma vez por semana e outro terapêutico uma vez por dia por apenas três dias, estaria recebendo tratamento por um curto período de tempo com estes dois agentes terapêuticos.

[00033] Conforme indicado neste documento, uma "região Fc" é um dímero consistindo em duas cadeias de polipeptídeo unidas por uma ou mais ligações de dissulfeto, cada cadeia compreendendo parte ou a totalidade de um domínio de articulação mais um domínio CH2 e um CH3. Cada uma das cadeias de polipeptídeo é referida como uma "cadeia de polipeptídeo Fc". Mais especificamente, as regiões Fc contempladas para utilização com a presente invenção são as regiões Fc de IgG, que podem ser de mamífero, por exemplo, humano, regiões Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Entre as regiões Fc de IgG1 humano, pelo menos dois tipos alélicos são conhecidos. As sequências de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo Fc podem variar daquelas de um polipeptí- deo Fc de mamífero por não mais do que 20, 15, 12, 10, 8, 5 ou 3 substituições, inserções ou deleções de um único aminoácido em relação a uma sequência de aminoácidos de polipeptídeo Fc de mamífero. Alternativamente ou em adição, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo Fc pode variar a partir da sequência de uma cadeia de polipeptídeo Fc conhecida ou ocorrendo naturalmente por não mais do que 10 inserções, deleções ou substituições de um único aminoácido por cada 100 aminoácidos da sequência. Em algumas modalidades, tais variações podem ser "alterações de heterodimerização" que facilitam a formação de heterodímeros sobre homodímeros. Ao referir-se a posições particulares dentro de uma cadeia de polipeptídeo Fc, o sistema de numeração EU (Edelman et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. 63: 78- 85) é usado, como ilustrado no alinhamento de cadeias de polipeptídeos Fc de IgG humano na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Alinhamento de sequências de aminoácidos de regiões Fc de IgG humano

[00034] Em algumas posições, polimorfismos ocorrendo naturalmente pode ocorrer. Por exemplo, a metionina na posição 282 na sequência IgG2 dada acima é mais normalmente uma valina em sequências IgG2 ocorrendo naturalmente. Da mesma forma, a tirosina na posição 296 em uma sequência IgG3 também pode ser uma fenilalanina.

[00035] "Alterações de heterodimerização" geralmente referem- se a alterações nas regiões CH3 de duas cadeias pesadas de IgG diferentes que facilitam a formação de dímeros de cadeia pesada heterodi- mérica, isto é, cadeias pesadas dimerizadas que não têm sequências de aminoácidos idênticas. Alterações de heterodimerização podem ser assimétricas, isto é, uma cadeia pesada tendo certa alteração pode parear com outra cadeia pesada tendo uma alteração diferente. Estas alterações facilitam a heterodimerização e desfavorecem a homodimerização. Um exemplo de tais alterações de heterodimerização pareadas são as assim chamadas substituições de "saliências e orifícios". Veja, por exemplo, a Patente US 7.695.936 e Publicação de Pedido de Patente US 2003/0078385, cujas porções descrevem tais mutações, são incorporadas neste documento por referência. Conforme indicado neste documento, par de cadeia pesada-cadeia pesada que contenha um par de substituições de saliências e orifícios, contém uma substituição em uma cadeia pesada e outra substituição na outra cadeia pesada. Por exemplo, descobriu-se que as seguintes substituições de saliências e orifícios aumentam a formação de heterodímero como comparado com aquela encontrada com cadeias pesadas não modificadas: 1) Y407T em uma cadeia e T366Y na outra; 2) Y407A em uma cadeia e T366W na outra; 3) F405A em uma cadeia e T394W na outra; 4) F405W em uma cadeia e T394S na outra; 5) Y407T em uma cadeia e T366Y na outra; 6) T366Y e F405A em uma cadeia e T394W e Y407T na outra; 7) T366W e F405W em uma cadeia e T394S e Y407A na outra; 8) F405W e Y407A em uma cadeia e T366W e T394S na outra; e 9) T366W em um polipeptídeo do Fc e T366S, L368A e Y407V na outra. Conforme indicado neste documento, mutações em um polipeptídeo Fc são denotadas da seguinte maneira. O aminoácido (utilizando o código de uma letra) normalmente presente em uma dada posição na região CH3 utili-zando o sistema de numeração EU (que é apresentado em Edelman et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. 63: 78-85) é seguido pelo número de posição EU, que é seguido pelo aminoácido alternativo que está presente naquela posição. Por exemplo, Y407T indica que a tirosina normalmente presente na posição 407 EU é substituída por uma treonina. Por uma questão de clareza, o sistema de numeração EU é ilustrado na Tabela 1 abaixo. Alternativamente ou em adição a tais alterações, substituições criando novas pontes de dissulfeto podem facilitar a formação de heterodímero. Veja, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US 2003/0078385, cujas porções descrevem tais mutações, são incorporadas neste documento por referência. Tais alterações em uma região Fc de IgG1 incluem, por exemplo, as seguintes substituições: Y349C em uma cadeia de polipeptídeo Fc e S354C na outra; Y349C em uma cadeia de polipeptídeo Fc e E356C na outra; Y349C em uma cadeia de polipeptídeo Fc e E357C na outra; L351C em uma cadeia de polipeptídeo Fc e S354C na outra; T394C em uma cadeia de polipeptí- deo Fc e E397C na outra; D399C em numa cadeia de polipeptídeo Fc e K392C na outra. Da mesma forma, substituições mudando a carga de um ou mais resíduos, por exemplo, na interface de CH3-CH3, pode aumentar a formação de heterodímero, como explicado em WO 2009/089004, cujas porções descrevem tais substituições, são incorporadas neste documento por referência. Tais substituições são referidas neste documento como "substituições de par de cargas", e uma região Fc contendo um par de substituições de par de cargas contém uma substituição em uma cadeia pesada e uma substituição diferente na outra. Exemplos gerais de substituições de par de cargas incluem as seguintes: 1) R409D, R409E, K409D ou K409E em uma cadeia mais D399K ou D399R na outra; 2) N392D, N392E, K392D ou K392E em uma cadeia mais D399K ou D399R na outra; 3) K439D ou K439E em uma cadeia mais E356K, E356R, D356K ou D356R na outra; e 4) K370D ou K370E em uma cadeia mais E357K ou E357R na outra. Além disso, as substituições Q355D, Q355E, R355D, R355E, K360D ou K360R em ambas as cadeias podem estabilizar heterodímeros quando usadas com outras alterações de heterodimerização. Substituições de par de cargas específicas podem ser utilizadas por si só ou com outras substituições de par de cargas. Exemplos específicos de pares únicos de substituições de par de cargas e combinações destes incluem as seguintes: 1) K409E em uma cadeia mais D399K na outra; 2) K409E em uma cadeia mais D399R na outra; 3) K409D em uma cadeia mais D399K na outra; 4) K409D em uma cadeia mais D399R na outra; 5) K392E em uma cadeia mais D399R na outra; 6) K392E em uma cadeia mais D399K na outra; 7) K392D em uma cadeia mais D399R na outra; 8) K392D em uma cadeia mais D399K na outra; 9) K409D e K360D em uma cadeia mais D399K e E356K na outra; 10) K409D e K370D em uma cadeia mais D399K e E357K na outra; 11) K409D e K392D em uma cadeia mais D399K, E356K e E357K na outra; 12) K409D e K392D em uma cadeia e D399K na outra; 13) K409D e K392D em uma cadeia mais D399K e E356K na outra; 14) K409D e K392D em uma cadeia mais D399K e D357K na outra; 15) K409D e K370D em uma cadeia mais D399K e D357K na outra; 16) D399K em uma cadeia mais K409D e K360D na outra; e 17) K409D e K439D em uma cadeia mais D399K e E356K na outra. Qualquer uma destas alterações de heterodimerização pode ser parte de uma cadeia pesada de IgG de imunoglobulina como descrito neste documento.

[00036] Um anticorpo ou proteína "humana", conforme indicado neste documento, é um anticorpo ou proteína codificada por uma sequência de ácido nucleico de origem humana. Um anticorpo ou proteína humana pode ser feita em células não humanas de cultura ou in vivo em um organismo transgênico no qual uma molécula de ácido nucleico codificando o anticorpo ou proteína humana tenha sido introduzida. Alternativamente, um anticorpo ou proteína humana pode ser feita em células humanas de cultura ou em um ser humano in vivo.

[00037] Um "anticorpo IgG," conforme indicado neste documento, é um anticorpo que consiste essencialmente nos domínios de imunoglo- bulina presentes na maioria de anticorpos IgG ocorrendo naturalmente, isto é, uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH), uma primeira região constante de cadeia pesada (CH1), uma região de articulação, uma segunda região constante de cadeia pesada (CH2) e uma terceira região constante de cadeia pesada (CH3) e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). Inúmeras sequências de tais domínios de imunoglobulina são relatadas por toda a literatura científica, por exemplo, em SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Serviço de Saúde Pública, N.I.H, Bethesda, MD, 1991. Um anticorpo IgG, conforme indicado neste documento, é um tetrâmero consistindo essencialmente em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Anticorpos ocorrendo naturalmente incluindo apenas duas cadeias pesadas de imunoglobulina e nenhuma cadeia leve de imunoglobulina, tal como algumas encontradas em camelos e tubarões (veja, por exemplo, Muyldermans et al., 2001, J. Bio- technol. 74:277-302; Desmyter et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:2628590; Streltsov et al. (2005), Protein Science 14: 2901-2909), não são "anticorpos IgG" conforme indicado neste documento. Um anticorpo IgG pode ser humano ou pode ser de outra espécie. Além disso, um anticorpo IgG pode conter não mais do que 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 ou 5 substituições, inserções e/ou deleções de um único aminoácido em relação à sequência de aminoácidos das cadeias pesadas ou leves de um anticorpo IgG ocorrendo naturalmente.

[00038] Uma "cadeia pesada de imunoglobulina" refere-se a uma cadeia pesada de um anticorpo IgG, IgA, IgM, IgE ou IgD ou variantes destes contendo não mais do que 40, 30, 25, 20, 15, 10 ou 5 inserções, deleções ou substituições de um único aminoácido em relação a uma cadeia pesada de imunoglobulina codificada por sequências de ácido nucleico originário na natureza. Uma "cadeia pesada de IgG de imu- noglobulina" está limitada a cadeias pesadas de anticorpos IgG ou variantes destes contendo não mais do que 40, 30, 25, 20, 15, 10 ou 5 inserções, deleções ou substituições de um único aminoácido em relação à sequência de aminoácidos de uma pesada cadeia de IgG codificada por sequências de ácido nucleico originário na natureza. Uma cadeia pesada de imunoglobulina consistindo essencialmente em um número de regiões ou domínios distintos incluindo uma região VH, uma região CH1, uma região de articulação, uma região CH2 e uma região CH3. Em alguns outros isotipos, isto é, IgM e IgA, regiões adicionais são incluídas a jusante da região CH3. Cadeias pesadas de imunoglobulina e as regiões nelas incluídas estão geralmente descritas em, por exemplo, Carayannopoulos e Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, pág. 283-314 em FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3a Ed., Paul, ed., Raven Press, Nova Iorque, 1993, que é incorporado neste documento por referência. Além disso, inúmeras sequências de sub-regiões de cadeias pesadas de imunoglobulina são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Serviço de Saúde Pública N.I.H., Bethesda, MD, 1991. Em alguns casos, uma cadeia de polipeptídeo que inclui uma cadeia pesada de imunoglobulina mais algumas sequências de não imu- noglobulina será referida neste documento como uma "cadeia pesada".

[00039] Uma "cadeia leve de imunoglobulina," conforme indicado neste documento, é uma cadeia kappa ou lambda de um anticorpo humano ou um anticorpo de outra espécie. Também incluído entre cadeias leves de imunoglobulina, conforme indicado neste documento, são proteínas com não mais do que 20, 15, 10 ou 5 inserções, deleções e/ou substituições de um único aminoácido em relação a uma cadeia leve de imunoglobulina codificada por sequências de ácido nucleico de origem natural. Cadeias leves de imunoglobulina são geralmente descritas em, por exemplo, Carayannopoulos e Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, pág. 283-314 em FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3a Ed., Paul, ed., Raven Press, Nova Iorque, 1993, que é incorporado neste documento por referência. Uma cadeia leve de imunoglobulina contém uma região VL e uma região CL. Inúmeras sequências dessas regiões são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Serviço de Saúde Pública N.I.H., Bethesda, MD, 1991. Em alguns casos, uma cadeia de polipeptídeo que inclui uma cadeia leve de imunoglobu- lina mais algumas sequências de não imunoglobulina será referida neste documento como uma "cadeia leve".

[00040] Uma "região variável de imunoglobulina," conforme indicado neste documento, é uma região VH ou VL, que pode ser de origem humana ou de outra espécie. Regiões variáveis de imunoglobulina são geralmente descritas em, por exemplo, Carayannopoulos e Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, pág. 283-314 em FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3a Ed., Paul, ed., Raven Press, Nova Iorque, 1993, que é incorporado neste documento por referência. Também incluído entre regiões variáveis de imunoglobulina, conforme indicado neste documento, são proteínas com não mais do que 20, 15, 10 ou 5 inserções, deleções e/ou substituições de um único aminoácido em relação a uma região variável de imunoglobulina codificada por sequên-cias de ácido nucleico de origem natural. Uma região variável de imu- noglobulina contém três regiões hipervariáveis, conhecidas como região 1 de determinação de complementaridade (CDR1), região 2 de determinação de complementaridade (CDR2) e região 3 de determinação de complementaridade (CDR3). Estas regiões formam o local de ligação de antígeno de um anticorpo. As CDRs são incorporadas dentro das regiões de estrutura menos variável (FR1-FR4). A ordem destas sub- regiões dentro de uma região variável é da seguinte forma: FR1-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Inúmeras sequências de regiões variáveis de imunoglobulina são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Serviço de Saúde Pública N.I.H., Bethesda, MD, 1991.

[00041] CDR pode ser localizada em uma sequência de região VH da seguinte maneira. CDR1 começa em aproximadamente 31 resíduos da região VH madura e tem geralmente cerca de 5 a 7 aminoácidos de comprimento, e é quase sempre precedida por um Cys-Xxx-Xxx-Xxx- Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx (SEQ ID NO: 20) (em que "Xxx" é qualquer ami- noácido). O resíduo na sequência de cadeia pesada CDR1 é quase sempre um triptofano, frequentemente, um Trp-Val, um Trp-Ile ou um Trp-Ala. Catorze aminoácidos estão quase sempre entre o último resíduo em CDR1 e o primeiro em CDR2, e CDR2 normalmente contém de 16 a 19 aminoácidos. CDR2 pode ser imediatamente precedida por Leu- Glu-Trp-Ile-Gly (SEQ ID NO: 21) e pode ser imediatamente seguida por Lys/Arg-Leu/Ile /Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. Outros aminoácidos podem preceder ou seguir CDR2. Trinta e dois aminoácidos estão quase sempre entre o último resíduo em CDR2 e primeiro em CDR3, e CDR3 pode ter de cerca de 3 a 25 resíduos de comprimento. Um Cys- Xxx-Xxx quase sempre imediatamente precede CDR3, e um Trp-Gly- Xxx-Gly (SEQ ID NO: 22) quase sempre segue CDR3.

[00042] CDRs de cadeia leve podem ser localizadas em uma região VL da seguinte maneira. CDR1 começa em aproximadamente 24 resíduos do anticorpo maduro e tem geralmente cerca de 10 a 17 resíduos de comprimento. É quase sempre precedida por um Cys. Existem quase sempre de 15 aminoácidos entre o último resíduo de CDR1 e o primeiro resíduo de CDR2, e CDR2 tem quase sempre 7 resíduos de comprimento. CDR2 é normalmente precedida por Ile-Tyr, Val-Tir, Ile-Lys ou Ile-Phe. Existem quase sempre 32 resíduos entre CDR2 e CDR3, e CDR3 tem geralmente cerca de 7 a 10 aminoácidos de comprimento. CDR3 é quase sempre precedida por Cys e geralmente seguida de Phe- Gly-Xxx-Gly (SEQ ID NO: 23).

[00043] Um "ligante", conforme indicado neste documento, é um peptídeo que liga dois polipeptídeos. Um ligante pode ter de 1 a 80 ami- noácidos de comprimento. Em algumas modalidades, um ligante pode ter de 2 a 40, 3 a 30 ou 3 a 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, um ligante pode ser um peptídeo de não mais do que 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades, um ligante pode ter de 5 a 25, 5 a 15, 10 a 20 ou 20 a 30 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades, um li- gante pode ter de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos de comprimento. Em muitos casos, os ligantes carecem de resíduos de cisteína livres (isto é, e não são, portanto, envolvidos em ligações de dissulfeto) e também não contêm locais de N-glicosilação (isto é, Asn - Xxx - Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido, exceto prolina).

[00044] Um "pepticorpo," conforme indicado neste documento, é um ou mais peptídeos biologicamente ativos fundidos a uma região Fc. Shimamoto et al. (2012), mAbs 4 (5): 586-591, cujas porções explicam a estrutura de um pepticorpo e como fazê-lo, são incorporadas neste documento por referência.

[00045] Um "peptídeo", conforme indicado neste documento, é um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos curta, que pode ou não ser glicosilada e/ou conter aminoácidos modificados. Um peptídeo pode ter de 2 a 75 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, um peptídeo tem de 3 a 60, 3 a 50, 3 a 40, 3 a 30 ou 3 a 20 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades, um peptídeo pode ter de 5 a 25, 5 a 15, 10 a 20 ou 20 a 30 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades, um peptídeo pode ter de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos de comprimento.

[00046] Uma "quantia terapeuticamente eficaz" de um medicamento usado para tratar uma doença é uma quantia que pode reduzir a gravidade de uma doença, reduzir a gravidade de um ou mais sintomas associados com a doença ou seu tratamento, ou retardar o surgimento de sintomas mais graves ou uma doença mais grave que pode ocorrer com alguma frequência seguindo a condição tratada.

[00047] "Tratamento" de qualquer doença mencionada neste documento abrange um alivio de pelo menos um sintoma da doença, uma redução na gravidade da doença ou o atraso ou prevenção da progressão da doença para os sintomas mais graves que podem, em alguns casos, acompanhar a doença ou levar a pelo menos outra doença. Tratamento não precisa significar que a doença seja totalmente curada. Um agente terapêutico útil necessita apenas reduzir a gravidade de uma doença, reduzir a gravidade de um ou mais sintomas associados com a doença ou o seu tratamento, ou retardar o surgimento de sintomas mais graves ou uma doença mais grave que ocorre com alguma frequência seguinte a condição tratada. Por exemplo, se a doença fosse uma doença inflamatória do intestino, um agente terapêutico utilizado como um tratamento pode reduzir o número de locais distintos de inflamação no tubo digestivo ou a extensão total do tubo digestivo afetado. Ele pode reduzir a dor e/ou inchaço, reduzir os sintomas, tal como diarreia, constipação ou vômitos e/ou impedir a perfuração do tubo digestivo. Uma condição do paciente pode ser avaliada por técnicas padrão, tal como um raio-X executado seguindo um enema de bário ou enteróclise, en- doscopia, colonoscopia e/ou uma biopsia. Procedimentos adequados variam de acordo com as condições e sintomas do paciente. Da mesma forma, se a doença tratada fosse lúpus eritematoso sistêmico (SLE), atividade de doença pode ser avaliada utilizando o índice SLEDAI para a classificação, como explicado abaixo.

[00048] Proteínas biespecíficas que se ligam a BAFF e B7RP1

[00049] São divulgadas neste documento proteínas biespecíficas que se ligam a B7RP1 e BAFF e/ou que podem inibir a proliferação de células T mediada por B7RP1 e proliferação de células B in vitro mediada por BAFF. As proteínas BAFF e B7RP1 a que uma proteína bies- pecífica como descrito neste documento se liga, podem ser proteínas humanas e/ou podem ser proteínas de outra espécie, tal como macaco cinomolgo, macaco rhesus, chimpanzés, camundongo e/ou coelho, entre outros. Em algumas modalidades, uma proteína biespecífica como descrito neste documento pode, por exemplo, se ligar tanto a proteínas B7RP1 e BAFF humanas (Homo sapiens) quanto de macaco cinomolgo (Macaca fascicularis).

[00050] Em algumas modalidades, estas proteínas biespecíficas podem ser anticorpos lgG biespecíficos em que a porção de ligação de B7RP1 e a porção de ligação de BAFF, cada uma consiste essencialmente em uma cadeia pesada de lgG de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina. Deste modo, tal anticorpo biespecífico contém duas cadeias pesadas de imunoglobulina diferentes e duas cadeias leves de imunoglobulina diferentes. Juntos, estes dois pares de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina formam um anticorpo IgG biespecí- fico completo. Anticorpos lgG biespecíficos são conhecidos na técnica, e um número de outros formatos para anticorpos biespecíficos também são conhecidos. Veja, por exemplo, Kontermann, Bispecific Antibodies: Developments and Current Perspectives, pág. 1-28 em BISPECIFIC ANTIBODIES, Kontermann, ed., Springer-Verlag, Berlim, Heidelberg, 2011, cujas porções descrevem estes anticorpos, são incorporadas neste documento por referência. Os anticorpos que podem se ligar a BAFF e B7RP1, independentemente do formato, são contemplados neste documento. Anticorpos lgG biespecíficos podem ser humanos, humanizados ou quiméricos e podem ser do isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas modalidades, os anticorpos IgG biespecíficos po-dem ser conjugados a outras frações. As sequências de aminoácidos de anticorpos anti-BAFF e anti-B7RP1 são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, a Patente U.S. 7.737.111 e Publicação de Pedido de Patente US 2011/0117093. As porções destes documentos que descrevem tais anticorpos são incorporadas neste documento por referência. Em algumas modalidades, tais anticorpos biespecíficos podem compreender "alterações de heterodimerização", como definido acima, incluindo substituições de par de cargas, que facilitam a formação de um anticorpo IgG biespecífico heterotetramérico.

[00051] Em outras modalidades, as proteínas biespecíficas descritas neste documento podem ser proteínas de fusão compreendendo um anticorpo que se liga a B7RP1, o que compreende uma cadeia pesada de IgG de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina e um pep- tídeo que se liga a BAFF. O peptídeo de ligação de BAFF pode estar presente em uma ou múltiplas cópias, tal como duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou até 16 cópias. O peptídeo de ligação de BAFF pode se ligar a proteínas BAFF a partir de espécies, tal como camundongo, macaco cinomolgos e/ou humanos, entre muitas outras espécies possíveis. O anticorpo pode ser um anticorpo IgG de anti-B7RP1, opcionalmente, um anticorpo humano ou humanizado que se liga a B7RP1 humano e/ou de macaco cinomolgo. Em algumas modalidades, um ligante pode ser ligado ao C-terminal da cadeia pesada do anticorpo IgG de anti-B7RP1, seguido por um primeiro peptídeo de ligação de BAFF, outro ligante e um segundo peptídeo de ligação de BAFF. Um terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo ou até décimo sexto peptídeo de ligação de BAFF pode seguir estas duas, opcionalmente intercaladas com ligantes. Alternativamente ou em adição, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito peptídeos de ligação de BAFF podem ser inseridos em outras partes no anticorpo anti-B7RP1, por exemplo, no N-ter- minal da cadeia pesada de imunoglobulina ou cadeia leve de imunoglo- bulina ou em uma região de laço na região CH2 ou CH3. O anticorpo IgG pode ser um anticorpo de mamífero, tal como um anticorpo humano ou murino. O anticorpo anti-B7RP1 pode ser um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano ou humanizado. Em tais proteínas de fusão bies- pecíficas compreendendo um anticorpo IgG de anti-B7RP1, a proteína biespecífica pode compreender uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:18 e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO:19. Variantes compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos contendo não mais do que 30, 25, 20, 15, 10, 5 ou 3 inserções, deleções ou substituições de um único aminoácido em relação à SEQ ID NO: 17 ou 18 são contempladas. Da mesma forma, variantes compreendendo uma cadeia leve de imu- noglobulina tendo uma sequência de aminoácidos contendo não mais do que 20, 15, 10, 8, 7, 5 ou 3 inserções, deleções ou substituições ou um único aminoácido em relação à SEQ ID NO:19 são contempladas. Tais proteínas biespecíficas podem ser tetrâmeros compreendendo dois polipeptídeos compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17 ou 18 ou uma variante destas e duas cadeias leves compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19 ou uma variante desta.

[00052] Uma porção peptídeo de ligação de BAFF de uma proteína de fusão biespecífica, como descrito acima, pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3. Tais peptídeos de ligação de BAFF são descritos na Patente U.S. 7.737.111, cujas porções relevantes são incorporadas neste documento por referência. Em algumas modalidades, pode haver um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze, quinze ou dezesseis cópias de tal peptídeo de ligação de BAFF presente na proteína biespecífica. Um peptídeo de ligação de BAFF pode ser ligado à extremidade carboxi do anticorpo anti-B7RP1, por exemplo, por meio de um ligante. Por exemplo, a extremidade carboxi de um anticorpo lgG anti-B7RP1 pode ser seguido por um ligante tendo, por exem-plo, a sequência de aminoácidos de Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:4). Exemplos de outros ligantes adequados incluem Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:37), Gly-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO:38), Gly- Gly-Gly-Gln (SEQ ID NO:39) e Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:40), entre muitos outros. Este ligante pode ser seguido por um peptídeo de ligação de BAFF. O peptídeo de ligação de BAFF pode ser seguido por outro ligante compreendendo, por exemplo, a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:24. Outro ligante também poderia ser utilizado. Este ligante pode ser seguido por outro peptídeo de ligação de BAFF compreendendo, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

[00053] Nas proteínas de fusão biespecífica descritas imediatamente acima ou nos anticorpos IgG biespecíficos heterotetraméricos descritos acima, uma região VL pode conter uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente. Uma região VH CDR1, CDR2 e CDR3 pode compreender as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente. Em algumas modalidades, uma região VL do anticorpo IgG pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou uma variante desta e a região VH pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou uma variante desta. Tais sequências variantes podem compreender não mais do que 10 deleções, inserções de substituições de um único aminoácido por 100 aminoácidos em relação a uma sequência de referência.

[00054] Proteínas Compreendendo um Ligante

[00055] São providos neste documento ligantes tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, 6 ou 7, que conferem propriedades físicas favoráveis em uma proteína que os contenha. Como mostrado no Exemplo 1 abaixo, a utilização de dois ligantes particulares, isto é, aqueles tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, tiveram efeitos positivos nas propriedades, tal como expressão, estabilidade e viscosidade de uma molécula biespecífica. Deste modo, uma variedade de proteínas contendo estes ligantes pode ter tais propriedades favoráveis como comparado às proteínas similares contendo outros ligantes.

[00056] Utilizações Terapêuticas de Proteínas Biespecíficas

[00057] As proteínas biespecíficas que se ligam a BAFF e B7RP1 descritas neste documento podem ser usadas como terapêuticas para uma variedade de indicações, doenças particularmente causadas por auto-anticorpos e/ou doenças mediadas tanto por células T quanto células B. Tais doenças incluem, por exemplo, SLE, lúpus, nefrite, vascu- lite ANCA positiva, artrite reumatoide (RA), dermatomiosite, polimiosite, doenças gastrointestinais, tais como doença de Crohn, colite ulcerativa e doença celíaca, doenças da pele, tais como pênfigo, penfigoide e lúpus eritematoso cutâneo subagudo (SCLE), doenças do sistema nervoso, tais como esclerose múltipla e polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), doenças neuromusculares, tais como mias- tenia grave, doenças envolvendo os rins, tais como síndrome de Goodpasture e glomerulonefrite, doenças hematológicas, tais como anemia hemolítica autoimune (AIHA), púrpura trombocitopênica idiopática (ITP) e neutropenia autoimune, doenças hepáticas, tais como a hepatite crônica ativa e cirrose biliar primária, síndrome de Sjogren, esclerose sistêmica e doenças endócrinas incluindo tiroidite de Hashimoto, doença de Graves, doença de Addison e insuficiência autoimune endócrina múltipla (comumente incluindo diabetes, hipotireoidismo, doença de Addison e insuficiência gonadal). Uma quantia terapeuticamente eficaz de uma proteína biespecífica, como descrito neste documento, pode ser administrada a um paciente sofrendo de qualquer uma destas doenças para tratar a doença.

[00058] Em uma modalidade, uma proteína biespecífica que pode inibir a proliferação de células B mediada por BAFF e a proliferação de células T mediada por B7RP1 pode ser utilizada para tratar um doente sofrendo de SLE. O SLE é uma doença autoimune de etiologia desconhecida marcada por autorreatividade a auto-antígenos nucleares. Suas manifestações clínicas são tão diversas que é questionável se é verda-deiramente uma única doença ou um grupo de doenças relacionadas. Kotzin (1996) Systemic lupus erythematosus. Cell 85: 303-306; Rahman e Isenberg (2008), Systemic lupus erythematosus. N. Engl. J. Med. 358: 929-939. Os sintomas podem incluir os seguintes: sintomas constitucionais, tais como mal-estar, fadiga, febre, anorexia e perda de peso; sintomas de pele diversos incluindo erupções cutâneas faciais agudas transitórias em adultos, doença bolhosa e erupções cutâneas crônicas e desfigurantes da cabeça e pescoço; artrite; dor e/ou fraqueza muscular; sintomas cardiovasculares, tais como espessamento da válvula mitral, vegetações, regurgitação, estenose, pericardite e doença isquêmica do coração, algumas das quais podem culminar em acidente vascular cerebral, doença embólica, insuficiência cardíaca, endocardite infecciosa ou falha da válvula; nefrite, que é uma causa principal de morbidade em SLE; sintomas neurológicos incluindo disfunção cognitiva, depressão, psicose, coma, distúrbios convulsivos, enxaqueca e outras síndromes de dor de cabeça, meningite asséptica, coreia, acidente vascular cerebral e neuropatias cranianas; sintomas hematológicos incluindo leucopenia, trombocitopenia, serosite, anemia, anormalidades de coagulação, esplenomegalia e linfadenopatia; e várias anormalidades gastrointestinais. Id; Vratsanos et al., "Systemic Lupus Erythematosus," Capítulo 39 em Samter’s Immunological Diseases, 6a Edição, Austen et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Phiiladelphia, PA, 2001. A gravidade dos sintomas varia amplamente, assim como o curso da doença. SLE pode ser mortal.

[00059] Um paciente com SLE pode ser tratado com uma proteína biespecífica que inibe BAFF e B7RP1 antes, depois ou simultaneamente com o tratamento utilizando uma terapia existente para SLE. Tais terapias existentes para SLE incluem corticosteroides, tais como predni- sona, prednisolona e metilprednisolona, antimaláricos, tais como hidro- xicloroquina, quinacrina e cloroquina, ácido retinóico, aspirina e outros medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), ciclofosfa- mida, desidroepiandrosterona, micofenolato mofetil, azatioprina, clo- rambucil, metotrexato, tacrolimo, dapsona, talidomida, leflunomida, ci- closporina, belimumab, anticorpos anti-CD20, tais como rituximab e proteínas de fusão, tal como o abatacept.

[00060] A atividade da doença de pacientes com SLE pode ser classificada utilizando um instrumento, tal como o Índice de Atividade de Doença de Lúpus Eritematoso Sistêmico (SLEDAI), que provê um resultado para a atividade da doença que leva em consideração os seguintes sintomas, que são ponderados de acordo com a gravidade: convulsão, psicose, síndrome cerebral orgânica, distúrbios visuais, distúrbios de nervo cranial, dor de cabeça por lúpus, vasculite, artrite, miosite, cilindros urinários, hematúria, proteinúria, piúria, nova erupção cutânea, alopecia, úlceras mucosas, pleurisia, pericardite, baixo complemento, ligação de DNA aumentada, febre, trombocitopenia e leucopenia. Bombardier et al. (1992), Arthr. & Rheum. 35(6): 630-640, das quais porções relevantes são incorporadas neste documento por referência. Os tratamentos descritos neste documento podem ser úteis na redução ou eliminação de sintomas de SLE, como medido por SLEDAI. Métodos de tratamento descritos neste documento podem melhorar um resultado de SLEDAI do paciente comparado com um valor basal para o mesmo paciente antes do início do tratamento com uma proteína biespecífica, como descrito neste documento.

[00061] Outro método para avaliar atividade da doença em SLE é o índice de Grupo de Avaliação de Lúpus de Ilhas Britânicas (BILAG), que é um sistema de avaliação de atividade de doença para pacientes com SLE com base no princípio da intenção de tratar do médico. Stoll et al. (1996), Ann. Rheum Dis. 55: 756-760; Hay et al. (1993), Q.J. Med. 86: 447-458. As porções destas referências descrevendo o BILAG são incorporadas neste documento por referência. O resultado de BILAG é atribuído ao fornecer resultados de atividade da doença numéricas ou alfabéticas separadas em cada um dos oito sistemas com base em órgãos, em geral (tal como febre e fadiga), mucocutânea (tais como erupções cutâneas e alopecia, entre muitos outros sintomas), neurológicos (tais como convulsões, enxaquecas e psicose, entre muitos outros sintomas), músculoesquelético (tal como artrite), cardiorrespiratórios (tal como insuficiência cardíaca e função pulmonar diminuída), vasculite e trombose, renais (tal como nefrite) e hematológicas. Id. Os tratamentos descritos neste documento podem ser úteis na redução ou eliminação de sintomas de SLE, conforme medido pelo índice BILAG ou na diminuição de uma contagem de BILAG do paciente como comparado a um valor basal antes do início do tratamento com uma proteína biespecífica, como descrito neste documento.

[00062] Uma proteína biespecífica, como descrito neste documento, que inibe a proliferação de células B mediada por BAFF e proliferação de células T mediada por B7RP1, também pode ser usado para tratar artrite reumatoide (RA). RA é uma doença crônica com sintomas sistêmicos, assim como sintomas relacionados especificamente às articulações. Os sintomas comumente incluem sinovite, levando a dor e articulações inchadas, e várias anormalidades laboratoriais, tais como níveis maiores do que o normal de fator reumatoide, anticorpos de proteína modificada por anti-citrulina (anti-CCP), e proteína C-reativa (CRP) e uma elevada taxa de sedimentação de eritrócitos (ESR). Os sintomas menos comuns incluem vários sintomas extra-articulares envolvendo, por exemplo, tendões, ligamentos, vasos sanguíneos, o coração e os pulmões. A atividade da doença pode ser frequentemente medida utilizando uma variedade de índices. Veja, por exemplo, Anderson et al. (2012), Arthritis care & Res. 64 (5): 640-647, cujas porções que discutem tais índices são incorporadas neste documento por referência. Elementos incluídos em tais índices de avaliação incluem o número de articulações doloridas, o número de articulações inchadas, avaliações funcionais e vários achados laboratoriais, tal como CRP, ESR, etc.

[00063] Em algumas modaldiades, um paciente sofrendo de RA pode ser tratado com uma proteína biespecífica que inibe a proliferação de células B mediada por BAFF e proliferação de células T mediada por B7RP1 antes, depois ou simultaneamente com o tratamento com um medicamento em utilização atual para RA. Terapêuticos atualmente em utilização para artrite reumatoide (RA) incluem medicamentos não este- roidais anti-inflamatórios (NSAIDs) (tal como aspirina e inibidores de ci- clooxigenase-2 (COX-2)), medicamentos anti-inflamatórios modificadores da doença (DMARDs, tal como metotrexato, leflunomida e sulfasa- lazina), anti-maláricos (tal como hidroxicloroquina), ciclofosfamida, D- penicilamina, azatioprina, sais de ouro, inibidores de fator de necrose de tumor (tais como etanercept, infliximab, adalimumab, golimumab e certolizumab pegol), inibidores de CD20, tal como rituximab, antagonistas de IL-1, tal como anakinra, inibidores de IL-6, tal como tocilizumab, inibidores de Janus quinase (JAKs, tal como tofacitinib), abatacept e corticosteroides, entre outros.

[00064] Uma quantia terapeuticamente eficaz de uma proteína bies- pecífica, como descrito neste documento, que inibe a proliferação de células B mediada por BAFF e proliferação de células T mediada por B7RP1, também pode ser utilizada para tratar uma doença inflamatória do intestino, tal como doença de Crohn ou colite ulcerativa. Doença de Crohn envolve uma inflamação anormal de qualquer porção do trato digestivo da boca até o ânus, embora na maioria dos pacientes inflamação anormal esteja confinada às regiões ileocólicas, do intestino delgado e colo-retais. Normalmente, a inflamação é descontínua. Os sintomas comuns incluem dor abdominal, anorexia, perda de peso, febre, diarreia, sensação de plenitude e/ou sensibilidade no quadrante inferior direito do abdômen, constipação, vômito e desconforto e descarga perianal. Outros sintomas possíveis incluem artrite periférica, retardo de crescimento, episclerite, estomatite aftosa, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, pedras nos rins, diluição urinária prejudicada e alcaliniza- ção, má absorção e cálculos biliares, entre outros. Veja, por exemplo, Strober et al., Medical Immunology, 10a Edição, Seção III, Cap. 35 (2001); Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17a Edição, Seção 3, Cap. 31 (1999). Os macrófagos isolados a partir de pacientes com doença de Crohn produzem quantias aumentadas de IL-12, IFN?, TNFa e outras citocinas inflamatórias.

[00065] A colite ulcerativa, embora as vezes difícil de distinguir da doença de Crohn, é distinta da doença de Crohn em diversos aspectos. Em primeiro lugar, é geralmente limitada ao cólon, enquanto a doença de Crohn pode ocorrer por todo o trato digestivo. Em segundo lugar, a colite ulcerativa envolve, principalmente, inflamação apenas das camadas superficiais do intestino, ao contrário da doença de Crohn em que a inflamação pode penetrar todo o caminho através da parede do intestino ou outro local no trato digestivo. Finalmente, colite ulcerativa envolve normalmente uma área de inflamação contínua, em vez dos locais da inflamação descontínua típica da doença de Crohn. Como a doença de Crohn, colite ulcerativa é encontrada principalmente em áreas urbanas. Além disso, fatores genéticos provavelmente desempenham um papel na colite ulcerativa uma vez que haja uma agregação familiar de casos. Os auto-anticorpos são observados em pacientes com colite ulcerativa mais frequentemente do que pacientes com doença de Crohn. Os auto- anticorpos são frequentemente direcionados para componentes de células epiteliais do cólon. Entre os mais comuns estão anticorpos citoplasmáticos anti-neutrófilos com especificidades para catalase, a- enolase e lactoferrina. Em alguns casos, tais anticorpos reagiram de forma cruzada com micro-organismos do cólon.

[00066] Em ensaios clínicos, a atividade da doença de Crohn é fre-quentemente avaliada utilizando o Índice de Atividade de Doença de Crohn (CDAI). O CDAI provê um resultado de atividade de doença com base em oito fatores incluindo (1) o número de fezes líquidas ou moles por dia, (2) uma classificação de paciente da quantia de for abdominal por dia, (3) uma classificação de paciente de bem-estar geral, (4) um relatório de paciente de outros sintomas incluindo artrite, irite, uveíte, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, estomatite aftosa, fissura anal, fístula ou abcesso, outra fístula ou febre, (5) relatório de paciente tomando lomotil ou outros opiáceos para diarreia, (6) massa abdominal, (7) hematócrito e (8) peso corporal. Veja, por exemplo, Best et al. (1976), Gastroenterol. 70: 439-444, cujas porções relevantes são incorporadas neste documento por referência.

[00067] Sintomas de colite ulcerativa são disponíveis. Eles podem incluir diarreia, tenesmo, cólicas abdominais, sangue e muco nas fezes, febre e sangramento retal. Megacólon tóxico, uma condição potencialmente fatal em que o cólon é dilatado além de cerca de 6 centímetros e pode perder o seu tônus muscular e/ou se perfurar, também podem ocorrer. Outros sintomas que podem acompanhar a colite ulcerativa incluem artrite periférica, espondilite anquilosante, sacroileíte, uveíte anterior, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, episclerite, hepatite autoi- mune, colangite esclerosante primária, cirrose e retardo de crescimento e desenvolvimento em crianças.

[00068] Em algumas modalidades, um paciente sofrendo de uma doença inflamatória intestinal (IBD), tal como a doença de Crohn ou colite ulcerativa, pode ser tratado com uma proteína biespecífica que se liga a BAFF e B7RP1 antes, depois ou simultaneamente com o tratamento com uma terapia existente para a IBD. Terapêuticos existentes para IBD incluem, por exemplo, sulfasalazina, ácido 5-aminossalicílico e seus de-rivados (tal como olsalazina, balsalazida e mesalamina), anticorpos anti- TNF (incluindo infliximab, adalimumab, golimumab e certolizumab pe- gol), corticosteroides para administração oral ou parenteral (incluindo prednisona, metilprednisolona, budesonida ou hidrocortisona), hormônio adrenocorticotrópico, antibióticos (incluindo metronidazol, ciprofloxa- cina ou rifaximina), azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, ciclos- porina, tacrolimus e talidomida.

[00069] Ácidos Nucleicos Codificando Proteínas Biespecíficas

[00070] São providos neste documento ácidos nucleicos codificando uma proteína biespecífica que pode inibir a proliferação de células T mediada por B7RP1 e proliferação de células B mediada por BAFF. Por exemplo, SEQ ID NO: 52 codifica a região VL tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 53 codifica a região VH tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. Da mesma forma, SEQ ID NOs: 55 e 56 codificam as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 17 e 18, respectivamente, que são polipeptídeos compreendendo a cadeia pesada de um anticorpo anti-B7RP1 fundido a dois peptídeos de ligação de BAFF. SEQ ID NO: 57 codifica a cadeia leve de um anticorpo anti-B7RP1, que pode ser parte de um anticorpo IgG bies- pecífico heterotetramérico ou uma proteína de fusão biespecífica, como descrito acima. Qualquer sequência de ácido nucleico codificando qualquer sequência de aminoácidos provida neste documento é contemplada. Da mesma forma, variantes de sequência de nucleotídeo inclu-indo mutações silenciosas em relação às sequências divulgadas neste documento ou codificando as variantes de sequência de aminoácidos descritas acima também estão incluídas dentro do âmbito da invenção. Mais especificamente, as sequências de nucleotídeo codificando sequências de aminoácidos que variam em não mais do que 10 inserções, deleções ou substituições de um único aminoácido por 100 aminoácidos a partir de sequências de aminoácidos divulgadas neste documento são contempladas.

[00071] Sequências de ácido nucleico codificando proteínas biespe- cíficas descritas neste documento podem ser determinadas por alguém versado na técnica com base nas sequências de aminoácidos providas neste documento e conhecimentos na técnica. Além de métodos mais tradicionais para produzir segmentos de DNA clonados codificando uma sequência de aminoácidos particular, empresas, tal como DNA 2.0 (Menlo Park, CA, USA) e BlueHeron (Bothell, WA, USA), entre outras, agora rotineiramente produzem DNAs de tamanho de gene quimicamente sintetizados de qualquer sequência desejada para ordenar, deste modo, simplificando o processo para produzir tais DNAs. Uso de códons pode ser ajustado de modo a otimizar a expressão no sistema de escolha.

[00072] Métodos para Fazer Proteínas Biespecíficas que se Ligam a BAFF e B7RP1

[00073] Ácidos nucleicos codificando as proteínas biespecíficas descritos neste documento podem ser inseridos em vetores apropriados para a célula hospedeira em que o ácido nucleico será expresso. Estes ácidos nucleicos podem ser introduzidos nas células hospedeiras por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica. Células hospedeiras que podem ser utilizadas incluem bactérias, incluindo Escherichia coli, levedura, incluindo Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris, células de insectos, incluindo células de Spodoptera frugiperda, células de plantas e células de mamífero, incluindo as células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco, células HeLa, células de carcinoma hepatocelular humano e células 293, entre muitas outras. Estas células hospedeiras podem ser cultivadas em condições de tal modo que os ácidos nucleicos introduzidos serão expressos e a proteína biespecífica pode ser recuperada a partir do sobrenadante de cultura ou a massa celular.

[00074] Geralmente, o procedimento utilizado para introduzir os ácidos nucleicos nas células hospedeiras pode depender da célula hospedeira em que os ácidos nucleicos devem ser introduzidos. Métodos para introduzir ácidos nucleicos em bactérias são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, eletroporação ou transformação de cloreto de cálcio são comumente utilizados. Métodos para introdução de ácidos nuclei- cos em levedura também são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, métodos de transformação utilizando acetato de lítio e de po- lietilenoglicol. Métodos para introduzir polinucleotídeos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a, transfecção mediada por dextrano, precipitação por fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de proto- plasto, eletroporação, encapsulamento do(s) polinucleotídeo(s) em li- possomas e microinjeção direta do DNA nos núcleos.

[00075] Os vetores de expressão utilizados em qualquer uma das células hospedeiras pode conter sequências necessárias para a replica- ção de DNA, seleção de células hospedeiras contendo o vetor e a expressão das sequências de nucleotídeo exógenas. Tais sequências podem normalmente incluir uma ou mais dentre as seguintes sequências de nucleotídeo: um promotor, uma ou mais sequências potencializado- ras, uma origem de replicação, uma sequência de terminação transcri- cional, uma sequência de intron completa contendo um local de splice doador e receptor, uma sequência codificando uma sequência principal para secreção de polipeptídeo, um local de ligação ao ribossomo, uma sequência de poliadenilação, uma região de poliligante para inserir o ácido nucleico codificando o polipeptídeo a ser expresso e um elemento marcador selecionável. Inúmeros vetores de expressão apropriados para expressão em várias células hospedeiras são conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente.

[00076] Composições Farmacêuticas, Dosagens e Métodos de

Administração

[00077] Composições farmacêuticas compreendendo as proteínas biespecíficas descritas neste documento são providas. Tais composições podem compreender uma quantia terapeuticamente eficaz de uma proteína biespecífica com um ou mais componentes adicionais, tal como um veículo, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável. Tais componentes adicionais podem incluir tampões, carboidratos, polióis, ami- noácidos, agentes quelantes, estabilizadores e/ou conservantes, entre muitas possibilidades. Muitos destes componentes adicionais são descritos em, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edição, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company, cujas porções relevantes são incorporadas neste documento por referência.

[00078] Dosagem das proteínas biespecíficas descritas neste documento pode ser ajustada para atingir os efeitos desejados. Em muitos casos, a dosagem repetida será necessária em função da natureza crônica da doença sendo tratada. Por exemplo, uma proteína biespecífica, como descrito neste documento pode ser dosada duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez semanas ou uma vez a cada dois, três, quatro, cinco ou seis meses. A quantia da proteína biespecífica administrada em cada dia que seja administrada pode ser de cerca de 0,0036 mg a cerca de 700 mg. Alternativamente, a dose pode ser calibrada de acordo com a superfície de pele estimada de um paciente, e cada dose pode ser de cerca de 0,002 Qg/m2 a cerca de 350 mg/m2. Em outra alternativa, a dose pode ser calibrada de acordo com o peso do paciente, e cada dose pode ser de cerca de 0,000051 mg/kg a cerca de 10,0 mg/kg.

[00079] As proteínas biespecíficas ou composições farmacêuticas contendo estas moléculas, podem ser administradas por qualquer método viável. Terapêuticos que compreendem uma proteína irão ser ordinariamente administrados por uma via parenteral, por exemplo, por injeção, uma vez que administração oral, na ausência de alguma formulação ou circunstância especial, levaria à hidrólise da proteína no ambiente ácido do estômago. Injeções subcutâneas, intramusculares, intravenosas, intra-arteriais, intralesionais e de bólus peritoneal são possíveis vias de administração. As proteínas biespecíficas também podem ser administradas por meio de infusão, por exemplo, por infusão intravenosa ou subcutânea. A administração tópica também é possível, especialmente para doenças que envolvem a pele. Alternativamente, as proteínas biespecíficas podem ser administradas através de contacto com uma membrana mucosa, por exemplo, por administração intranasal, sublingual, vaginal ou retal ou administração como um inalante. Alternativamente, certas composições farmacêuticas apropriadas compreendendo uma proteína biespecífica podem ser administradas oralmente.

[00080] Tendo descrito a invenção em termos gerais acima, os exemplos que se seguem são oferecidos a título de ilustração e não de limitação.

[00081] EXEMPLOS

[00082] Exemplo 1: Projetar e testar uma molécula biespecífica de BAFF/B7RP1 para utilização terapêutica humana

[00083] O objetivo desta série de experiências foi o de encontrar uma molécula biespecífica que (1) iniba a proliferação de células B mediada por BAFF e proliferação de células T mediada por B7RP1, (2) seja altamente ativa em ensaios biológicos e (3) tenha propriedades biofísicas favoráveis. Um número de projetos esquemáticos para a fusão de um peptídeo que liga o BAFF humano a um anticorpo lgG de B7RP1 anti- humano (anti-huB7RP1) é ilustrado na Figura 1. A sequência do peptí- deo de ligação de BAFF é provida na SEQ ID NO: 1, e as sequências das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina de anti-huB7RP1 são providas em SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 19, respectivamente.

[00084] Para determinar qual projeto tinha as melhores propriedades biofísicas, ao manter a atividade biológica, as moléculas biespecíficas diagramadas na Figura 1 foram feitas e testadas. Em um construto, duas cópias em tandem do peptídeo de ligação de BAFF com um ligante in-terveniente (o "ligante 1K", tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24) foram fundidas com o N-terminal ou da cadeia pesada de imunoglobulina (P71617) ou cadeia leve de imunoglobulina (P71618) de anti-huB7RP1. Veja a Figura 1. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada P71617 é provida na SEQ ID NO: 26 e a sequência de aminoá- cidos da cadeia leve de P71617 é a mesma que aquela da cadeia leve de imunoglobulina de anti-huB7RP1 (SEQ ID NO: 19). A sequência de aminoácidos da cadeia leve P71618 é provida em SEQ ID NO: 27 e a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de P71618 é a mesma que a cadeia pesada de imunoglobulina de anti-huB7RP1 (SEQ ID NO: 25). Duas cópias em tandem do peptídeo de ligação de BAFF também foram fundidas à extremidade C-terminal da cadeia pesada de imunoglobulina de anti-huB7RP1 (tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25) utilizando ou o ligante 1K mencionado acima (tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; P71619) ou um ligante 5X(G4S) (SEQ ID NO: 71) entre os dois peptídeos de ligação de BAFF (P71620). As sequências de aminoácidos das cadeias pesadas destes dois constru- tos de fusão são providas em SEQ ID NO: 16 (P71619) e SEQ ID NO: 28 (P71620). No construto de P71621, duas cópias em tandem do pep- tídeo de ligação de BAFF com um ligante 1K interveniente foram inseridas no domínio CH3 do anticorpo entre resíduos 358 e 359 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de imunoglobulina do anticorpo anti-huB7RP1). A sequência da cadeia pesada do construto de P71621 é provida em SEQ ID NO: 29. No construto de P71622, o peptídeo de ligação de BAFF foi inserido no domínio CH3 da cadeia pesada de imunoglobulina de anti- huB7RP1 (entre resíduos 358 e 359 da SEQ ID NO: 25 e uma segunda cópia do peptídeo de ligação de BAFF foi fundida com a extremidade C- terminal da cadeia pesada. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada de P71622 é provida em SEQ ID NO: 30. No construto de P71623, um peptídeo de ligação de BAFF foi inserido na região CH2 (entre resíduos 268 e 269 da SEQ ID NO: 25), e um segundo peptídeo de ligação de BAFF foi inserido na região CH3 (entre resíduos 358 e 359 da SEQ ID NO: 25). SEQ ID NO: 31 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de P71623. Todos os construtos P71619-P71623 têm a cadeia leve de imunoglobulina de anti-huB7RP1 (SEQ ID NO: 19).

[00085] Nos construtos P74293 e P74294, o ligante entre as duas cópias em tandem dos peptídeos de ligação de BAFF no construto de P71619 foi modificado. As sequências de aminoácidos das cadeias pesadas de P74293 e P74294 são providas em SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, respectivamente. As cadeias leves de imunoglobulina destes construtos também têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

[00086] Os ácidos nucleicos codificando os construtos descritos acima foram feitos da seguinte forma. Os ácidos nucleicos codificando a porção N-terminal das fusões de peptídeo de BAFF N-terminal (P71617 e P71618), incluindo duas cópias do peptídeo de ligação de BAFF mais uma região variável de cadeia pesada ou leve de imunoglo- bulina, foram geradas sinteticamente. Estes foram ligados, através de locais de endonuclease de restrição conveniente, para ácidos nucleicos codificando a região constante de cadeia pesada ou leve de imunoglo- bulina em vetores apropriados. Ácidos nucleicos codificando as fusões C-terminais de região constante de cadeia pesada (P71619 e P71620), inserções de Fc-laço (P71621 e P71623), e a fusão de inserção Fc- laço/C-terminal (P71622) foram todas geradas sinteticamente e ligadas em um vetor contendo a região variável da cadeia pesada através de locais de endonuclease de restrição conveniente.

[00087] Os vários construtos biespecíficos descritos acima foram expressos tanto em células 293 transitoriamente transfectadas quanto células CHO estavelmente transfectadas. As proteínas de fusão foram purificadas e testadas para atividade biológica. Não foram observadas diferenças nas proteínas produzidas nestes dois tipos diferentes de células hospedeiras.

[00088] As atividades inibidoras de BAFF das moléculas biespecífi- cas foram testadas em um ensaio de proliferação de células B primárias humanas mediada por BAFF. Em suma, células B humanas foram purificadas a partir de células mononucelares de sangue periférico (PBMCs) utilizando seleção negativa utilizando um kit II de células B humanas a partir de Miltenyi Biotec (Auburn, CA). Cerca de 105 de células B purificadas foram cultivadas em placas de microtitulação de 96 poços em Meio Essencial Mínimo (MEM) mais 10% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS) na presença de 50 ng/ml de proteína BAFF humana, 2 ?g/ml IgM anti-humano de F(ab') 2 de cabra (Jackson ImmunoResearch) e concentrações variantes de uma das proteínas biespecíficas descritas acima a 37°C em 5% de CO2 por 48 horas. Um pepticorpo de anti-BAFF foi utilizado como um controle positivo ("aBAFF", que é um homodímero contendo duas cadeias de polipeptídeos, cada uma com-preendendo dois peptídeos de ligação de BAFF fundidos com um poli- peptídeo Fc). A molécula de aBAFF é descrita com detalhes na Patente US 7.259.137, e a sequência de aminoácidos de uma cadeia de poli- peptídeo deste homodímero é provida na SEQ ID NO: 32. As porções de Patente US 7.259.137 descrevendo aBAFF são incorporadas neste documento por referência. A proliferação foi medida pela absorção de 3H-timidina radioativa durante as últimas 18 horas de incubação. Os re-sultados são mostrados nas Figuras 2A e 2B.

[00089] Os dados na Figura 2A indicam que os dois construtos de fusão C-terminal (P71619 e P71620) foram comparáveis entre si na inibição da proliferação de células B mediada por BAFF e mais potente do que todos os outros construtos de fusão testados nesta experiência. P71620 não foi aprofundado em função de ele tender a agregar, uma propriedade que é altamente indesejável em uma proteína terapêutica. Os dados na Figura 2B indicam que P71619 é comparável às duas versões ligeiramente modificadas deste construto descrito acima (P74293 e P74294) e a um controle positivo (aBAFF) na inibição de proliferação de células B mediada por BAFF. Deste modo, entre os construtos bies- pecíficos testados, P71619, P71620, P74293 e P74294 tinham uma atividade comparável neste ensaio de proliferação de células B mediada por BAFF e melhor atividade do que todos os outros construtos testados.

[00090] A atividade inibidora de B7RP1 de P71619, P74293 e P74294 foi ensaiada utilizando um ensaio de proliferação de células T mediada por B7RP1-Fc humano. Células T humanas primárias purificadas a partir de PBMCs de doadores humanos saudáveis utilizando um kit de isolamento de células T Pan a partir de Miltenyi Biotec (Auburn, CA) e estimuladas com anticorpo anti-CD3 ligado à placa (1 Qg/ml) e uma proteína de fusão de B7RP1-Fc (3 ng/ml) na presença de concentrações variantes das proteínas biespecíficas descritas acima ou um anticorpo IgG2 anti-humano de B7RP1 (referido neste documento como "aB7RP1 "). 3H-timidina foi adicionada às células após 48 horas e a incorporação da 3H-timidina foi medida 24 horas mais tarde. Todos os anticorpos biespecíficos que foram testados tinham IC50 similar, que foram similares àquele de aB7RP1 (Figura 3). Deste modo, estes dados sugerem que a conjugação dos peptídeos de ligação de BAFF ao anticorpo anti-huB7RP1 tiveram pouco ou nenhum efeito sobre a capacidade do anticorpo para inibir a atividade de B7RP1.

[00091] As afinidades de ligação dos anticorpos biespecíficos hete- rodiméricos P74293 e P74294 a BAFF e B7RP1 foram medidas por Ensaio de Exclusão Cinética (KinExA®; Sapidyne Instruments, Boise, Idaho). Ambos os anticorpos têm afinidades de ligação elevadas a BAFF humano (tendo Kd de aproximadamente 30 pM) e B7RP1 humano (tendo Kd de aproximadamente 40 pM). Veja a Tabela 2 abaixo. Além disso, ambos destes bispecificos têm afinidades de ligação similares ao BAFF de macaco cinomolgo comparados a BAFF humano e ao B7RP1 de macaco cinomolgo comparado ao B7RP1 humano. Tabela 2. Tabela 2: afinidade de ligação e potência celular de P74293 e P74294. *ND significa não determinado.

[00092] Para adicionalmente avaliar a atividade de P74293 em um sistema in vitro utilizando células humanas, a produção de citocinas por células de amígdala humanas ativadas por enterotoxina B de Staphylococcus (SEB) foi avaliada na presença de várias moléculas de teste. Resumidamente, células de amígdala humanas foram isoladas a partir de tecido e estimuladas com SEB (Wg/ml) na presença de uma das seguintes moléculas: (1) aB7RP1, (2) P74293, (3) CTLA4-Ig (um controle positivo) ou (4) IgG humana (um controle negativo). Após 72 horas de cultura, o sobrenadante celular foi coletado, e os níveis de citocina foram ensaiados utilizando kits a partir de Meso Scale Discovery de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados são mostrados na Figura 4.

[00093] Todos os três dentre aB7RP1, P74293 e CTLA4-Ig, barras 1, 2 e 3, respectivamente, em todos os painéis da Figura 4, libertação inibida de IL-17, IL-10, IL-4 e IFND. A libertação de IL-2 foi inibida apenas por CTLA4-Ig. Deste modo, aB7RP1 e o P74293 biespecífico anti- BAFF/B7RP1 tiveram efeitos comparáveis e específicos sobre a secreção de citocinas por células da amígdala humanas ativadas por SEB.

[00094] Três proteínas heterodiméricas biespecíficas, isto é, P71619, P74293 e P74294 foram examinadas para propriedades adicionais. Títulos de proteínas a partir de culturas de células hospedeiras produzindo estas proteínas indicaram que P74293 e P74294 foram produzidas em cerca de duas vezes os níveis em que P71619 foi produzida. P74293 e P74294 também foram mais estáveis do que P71619 após armazenamento por duas semanas a 40°C como avaliado por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). P74293 formou uma solução límpida no início do armazenamento e após 4 semanas de armazenamento, considerando que soluções contendo P74394 fossem turvas em todos os pontos de tempo. Soluções de P74293 e P74294 eram menos viscosas do que as soluções de P71619. Deste modo, P74293 e P74294 foram expressas em níveis mais elevados do que P71619 e também foram mais estáveis e menos viscosas no intervalo de concentração testado do que P71619. A diferença mais óbvia entre estas moléculas se encontra no ligante entre os dois peptídeos de ligação de BAFF. Estes dados sugerem que os ligantes em P74293 e P74294 (SEQ ID NOs: 6 e 7) podem conferir propriedades melhoradas sobre estas moléculas.

[00095] As propriedades farmacocinéticas das moléculas biespecífi- cas descritas foram avaliadas em camundongos. Foi dado a camundongos CD-1 machos uma dose intravenosa única (IV) (5 mg/kg) das proteínas de fusão biespecífica P71617, P71619, P71621, P71622, P74293 ou P74294. As amostras de soro foram coletadas antes da dosagem e em 0,5, 2, 8, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336, 408 e 504 horas após a dosagem. A concentração da molécula biespecífica no soro foi determinada por dois métodos ELISA, um registrando a presença da porção Fc e um registrando a presença tanto da porção Fc quanto da porção de peptídeo de ligação de BAFF. Para a medição da porção Fc, um anticorpo anti-Fc biotinilado foi utilizado como reagente de captura, e anticorpo anti-fc rotulado ALEXA FLUOR® 647 foi utilizado como o reagente de detecção. Para detectar a porção de ligação de BAFF e a porção Fc do biespecífico, uma proteína de BAFF biotinilado foi utilizada como o reagente de captura, e anticorpo anti-fc rotulado ALEXA FLUOR® 647 foi utilizado como o reagente de detecção. As proteínas biespecíficas com duas cópias em tandem de peptídeos de ligação de BAFF fundidos com o N-terminal (P71617), C-terminal (P71619, P74293 e P74294) ou o domínio CH3 (P71621) da cadeia pesada têm perfis PK muito similares em camundongos. Figura 5. A proteína biespecífica com uma cópia de peptídeo de ligação de BAFF inserida no domínio CH3 e outra cópia fundida à extremidade C-terminal da cadeia pesada (P71622) teve menor exposição comparada com as outras proteínas biespecíficas. Figura 5. Além disso, os dois ensaios de ELISA diferentes resultaram em concentrações de soro similares das proteínas biespecíficas, sugerindo que nenhuma clivagem significante das proteínas biespecíficas ocorreram in vivo.

[00096] Parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos dos anticorpos biespecíficos heterodiméricos P74293 e P74294 também foram avaliados por um estudo de dose única em macacos cinomolgos. Foi dado a macacos cinomolgos machos naive (n=4) uma dose única de bólus intravenoso ou subcutâneo de P74293 (10 mg/kg), ou uma dose única subcutânea de P74294 (10 mg/kg). Ambas as moléculas biespe- cíficas têm perfis PK similares àqueles de um anticorpo IgG. Os parâmetros farmacocinéticos observados para P74293 e P74294, assim como para anti-huB7RP1, são relatados na Tabela 3 abaixo. Tabela 3: Parâmetros farmacocinéticos em macacos ci- Nomolgos

[00097] Os dados na Tabela 3 indicam que os parâmetros farmaco- cinéticos de P74293 e P75294 são comparáveis entre si e àqueles de anticorpo anti-huB7RP1.

Exemplo 2: Projetar e testar uma molécula representante biespecí- fica murina

[00098] Para conduzir estudos pré-clínicos em camundongos, uma molécula biespecífica de representante murina que poderia ligar o B7RP1 murino e BAFF murino (doravante, o "representante murino") foi calculado. O anticorpo anti-huB7RP1 utilizado para construir os cons- trutos biespecíficos descritos no Exemplo 1, não se liga a B7RP1 mu- rino, enquanto o peptídeo de ligação de BAFF utilizado nestes constru- tos não se ligam tanto a BAFF humano quanto murino. Dados não mostrados. O representante murino compreende um anticorpo B7RP1 anti- murino IgG antagonístico (chamado "anti-mB7RP1" neste documento), que era uma quimera de regiões constantes de imunoglobulina de camundongo e regiões variáveis de imunoglobulina B7RP1 de anti-murino de rato. A utilização de anti-mB7RP1 é descrita em Hu et al. (2009), J. Immunol. 182: 1421, onde é designado 1B7-V2. O representante murino tem duas cópias de um peptídeo de ligação de BAFF (SEQ ID NO: 1) fundido por meio de um ligante curto (cinco aminoácidos de comprimento) com o C-terminal da cadeia pesada de imunoglobulina de anti- mB7RP1. As duas cópias do peptídeo de ligação de BAFF são separadas por outro ligante que tenha 23 aminoácidos de comprimento. Ácidos nucleicos codificando a cadeia pesada do representante murino foram feitos utilizando PCR de sobreposição para unir ácidos nucleicos codificando a porção de ligação de BAFF de aBAFF à extremidade a jusante de ácidos nucleicos codificando a cadeia pesada de 1B7-V2, isto é, anti- mB7RP1.

[00099] Inibição de BAFF pelo representante murino foi avaliada em um ensaio de proliferação de células B mediada por BAFF. Linfócitos B de camundongo foram isolados a partir de C57BL/6 de baços por seleção negativa com microgrânulos MACS CD43 (ly-48) de acordo com as instruções dos fabricantes (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) ou a partir de PBMC utilizando um kit de isolamento de células B (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). As células B purificadas foram estimuladas com 0,1 Qg/ml de anti-IgM e 200 ng/ml de BAFF na presença de concentrações variantes do representante murino ou aBAFF. Proliferação de células B foi medida por incorporação de 3H-timidina no dia 4. Os IC50 do representante mu- rino e aBAFF foram 0,59 nM e 0,73 nM, respectivamente. Veja a Figura 6A. Deste modo, o representante murino inibiu de forma eficaz BAFF com potência comparável àquele de aBAFF.

[000100] Para medir inibição de ligação de B7RP1 ao seu receptor pelo representante murino, células de baço de camundongo foram primeiro ativadas para intensificar sua expressão do receptor B7RP1 ao incubá-las em poços de microtitulação revestidos com um anticorpo anti-CD3 (5 Qg/ml) por 24 horas. As células do baço ativadas foram lavadas com tampão fosfato-salino (PBS) e então incubadas com 5 ?g/ml de muB7RP1:Fc biotinilado na presença de concentrações variantes do representante murino a 4oC por 30 minutos. As células foram lavadas e então coradas com anticorpo CD3 anti-camundongo conjugado com aloficocianina (APC) e estreptavidina-ficoeritrina (Estreptavi- dina-PE) por 20 minutos adicionais. A ligação de B7RP1-Fc às células T foi analisada por citometria de fluxo. O IC50 do representante murino e anti-mB7RP1 eram 4,01 pM e 2,08 pM, respectivamente. Veja a Figura 6B. Consequentemente, a atividade do representante murino foi similar àquela de anti-mB7RP1 neste ensaio. Deste modo, o representante mu- rino inibe tanto BAFF quanto B7RP1.

[000101] Os efeitos farmacodinâmicos in vivo do representante murino foram avaliados em camundongos imunizados com os glóbulos vermelhos de ovelha (SRBC). Em suma, camundongos BALB/c (8 semanas de idade) receberam uma imunização primária no dia 0 e uma imunização de reforço no dia 28 com 2 X 108 SRBC em 0,2 ml de PBS por meio de injeção intraperitoneal. Os camundongos (n=5 para cada molécula) foram tratados duas vezes por semana a partir do dia 0 até o dia 33 com uma das seguintes moléculas a 5 mg/kg: o representante murino; aBAFF; anti-mB7RP1; ou lgG1 de murino. Camundongos tratados com SBRC, mas não recebendo outro tratamento, serviram como controles positivos. Os camundongos foram sacrificados no dia 34, e soro e baços foram coletados.

[000102] Para medir a proporção de células B e células T de memória no baço, células de baço foram coletadas ao moer o tecido de baço através de um filtro celular. As células de baço foram pré-incubadas com anti-CD16/32 não rotuladas para bloquear a ligação não específica de anticorpos contra os receptores de Fc gama (Fc R). A proporção de células B foi determinada ao colorir com anti-B220 rotulado com PE (que é expressa em células B). A proporção de células de células T de memória (células CD44hiCD62LloCD4 T) foi determinada ao colorir com anti-CD44 conjugado com FITC, anti-CD62L conjugado com PE, anti- CD4 conjugado com APC e anti-CD3 conjugado com PerCP. Todos os anticorpos de coloração foram adquiridos a partir de BD Bioscience (San Diego, CA). Tanto para determinações de células B quanto T, citometria de fluxo foi realizada com um FACSCALIBURTM (BD Bioscience, San Jose, CA) citômetro de fluxo, e os dados foram analisados utilizando o software FLOWJO® (TreeStar Inc., Ashland, OR) para análise de dados de citometria de fluxo. Os resultados são mostrados na Figura 7.

[000103] Para medir níveis de anticorpos anti-SBRC no soro, placas de microtitulação revestidas com 10 Qg/ml de antígeno SRBC solúvel foram incubadas por duas horas à temperatura ambiente com soro diluído a partir de camundongos tratados. Limite de Ig específico de SRBC a partir do soro foi detectado com anticorpos lgG e lgM de anti-camun- dongo de cabra policlonais conjugados com HPR (Southern Biotech, Birmingham, AL). A reação de substrato foi executada utilizando substrato de peroxidase de micropoços SUREBLUETM TMB (KPL, Gaithersburg, MD) de acordo com as instruções do fabricante, e a densidade óptica foi lida utilizando um leitor de microplacas Spectrum Max (Molecular Devices). Como um controle positivo, diluições em série de uma mistura de soros a partir de camundongos imunizados com SRBC sem qualquer tratamento foram adicionadas a cada placa, e uma curva padrão foi construída a partir das leituras a partir destes poços. Os níveis de anticorpos anti-SBRC de outras amostras são relatados na Figura 7 como uma percentagem deste controle positivo.

[000104] A percentagem de células de baço que são células B foi reduzida em camundongos tratados com o representante murino como comparado com a percentagem observada em camundongos tratados com lgG1 de murino. Figura 7 (painel de topo). Uma redução similar foi observada em camundongos tratados com aBAFF ou aBAFF mais anti- mB7RP1, mas não em camundongos tratados com anti-mB7RP1 sozinho. Figura 7 (painel de topo). No que diz respeito às células T de memória, camundongos tratados com o representante murino, anti- mB7RP1 ou anti-mB7RP1 mais aBAFF tinha proporções reduzidas de células T de memória comparadas àquelas observadas em camundongos tratados com muIgG1. Figura 7 (painel mediano). Por outro lado, tratamento com aBAFF não alterou a população de células T de memória no baço comparada àquela observada com o tratamento mulgG. Figura 7 (painel mediano). O representante murino também mostrou redução potente do nível de anticorpo anti-SRBC em soro, similar àquele observado após tratamento com anti-mB7RP1 ou anti-mB7RP1 mais aBAFF ou em camundongos que não foram injetados com SRBC. Fi-gura 7 (painel de fundo). Inibição moderada de nível de anticorpo anti- SRBC, comparado ao nível observado com o tratamento de mIgG1, foi observada em camundongos tratados com aBAFF sozinho. Figura 7 (painel de fundo). Estes dados indicam que o representante murino tinha efeitos inibidores duplos em compartimentos de células B e de células T em camundongos in vivo.

[000105] O impacto do representante murino na doença foi avaliada no modelo de lúpus NZB/W F1 utilizando duas quantias de dose diferentes para cada uma das moléculas testadas. Camundongos NZB/W F1 fêmeas (4,5 meses de idade, n=20) foram tratadas duas vezes por semana por injeção intraperitoneal por 18 semanas utilizando cada um dos seguintes regimes de dosagem: 5 ou 15 mg/kg de representante murino (MW=160kDa); 4,68 ou 14 mg/kg de anti-mB7RP1 (MW=150KDa); 1,88 ou 5,6 mg/kg aBAFF (MW=64KDa); uma combinação de aBAFF (1,88 ou 5,6 mg/kg) e anti-mB7RP1 (4,68 ou 14 mg/kg); lgG1 de murino (15 mg/kg; um controle de isotipo); ou tampão fosfato-salino (PBS) (um controle negativo). Proteinúria foi medida na urina utilizando ALBUSTIX® (Bayer, Elkhart, IN) a cada duas semanas começando aos 5 meses de idade. A incidência de proteinúria foi expressa como a percentagem de camundongos com a proteína de urina em uma concentração de pelo menos 300 mg/dl em duas medições consecutivas. Nível de IgG anti- dsDNA de soro foi medido por ELISA. A avaliação para doença renal de todos os camundongos foi executada por análise de amostras de tecido de rim para oito tipos de lesões diferentes, isto é, proliferação capilar glomerular, hiperplasia da célula mesangial, aumento de matriz mesangial, adesão de tufos glomerulares, hiperplasia epitelial parietal, nefrite intersticial, dilatação tubular/cilindros de proteína e atrofia tubular/fi- brose intersticial. A cada tipo de lesão foi dada uma pontuação de gravidade de 0 a 5, para uma pontuação máxima possível de 32. Os resultados de cada grupo de camundongos foram em média. A sobrevivência foi monitorizada.

[000106] Aos 12 meses de idade, nenhum dos camundongos tratados com o representante murino em cada nível de dose desenvolveu protei- núria. Por outro lado, 100% de camundongos tratados com lgG1 ou PBS de murino em ambos os níveis de dose testados exibiram proteinúria. Figuras 8A e 9B. Cerca de 60% e 35% de camundongos tratados com os níveis de dose inferiores de anti-mB7RP1 e aBAFF, respectivamente, e cerca de 50% e 25% de camundongos tratados com os níveis de dose mais elevados de anti-mB7RP1 e aBAFF, respectivamente, desenvolveram proteinúria. Figuras 8A e 9B. Além disso, o tratamento de representante murino em ambos os níveis de dose resultou em uma redução significante em níveis de soro de IgG anti-dsDNA como comparado com o controle negativo tratado com muIgG1. Figura 8B e 9A. O tratamento biespecífico também melhorou significantemente a sobrevivência comparada com os grupos de controle mlgG e PBS. Dados não mostrados. Entretanto, nenhuma diferença clara em sobrevivência foi observada entre tratamentos biespecíficos versus de agente único no momento da conclusão de experiência.

[000107] Rins a partir de todos os camundongos tratados, incluindo camundongos falecidos antes do final do estudo, foram coletados para histologia pontuando a gravidade de doença renal. Os grupos de ca-mundongos tratados com aBAFF, a combinação de aBAFF mais anti- mB7RP1, ou o representante murino tiveram resultados significativamente inferiores para doença renal como comparado ao grupo de controle tratado com mIgG1. Figura 10. Grupos tratados com o representante biespecífico ou a combinação também mostrou uma tendência para a patologia renal reduzida comparada com os grupos de tratamento de agente único, um resultado que se correlaciona bem com os resultados de proteinúria descritos acima. Comparar a Figura 10 às Figuras 8A e 9B. Em resumo, a inibição dupla de BAFF e B7RP1 pelo representante murino ou por um tratamento de combinação com aBAFF mais anti-mB7RP1 foi mais eficaz do que a inibição de apenas BAFF (aBAFF) ou apenas B7RP1 (anti-mB7RP1) na prevenção do surgimento e progressão de doença no modelo de lúpus NZB/W F1.

[000108] Para determinar se a inibição tanto de BAFF quanto de B7RP1 pode inibir de forma eficaz os sintomas de artrite induzida por colágeno murino, a seguinte experiência foi feita. Camundongos DBA machos foram imunizados com 100 Dg de colágeno tipo II bovino emul- sificado em 2 x de adjuvante de Freund Completo (CFA) no dia 0 e reforçado com colágeno tipo II bovino em adjuvante de Freund Incompleto (IFA) no dia 21. Camundongos foram tratados com uma dentre as substâncias de teste duas vezes por semana durante o curso de 41 semanas do estudo, começando no dia 0. A percentagem de camundongos em cada grupo exibindo sintomas de artrite e um resultado de artrite média para cada grupo foi avaliada em cada ponto de tempo. Resultados da artrite foram determinadas ao examinar cada membro e atribuir um resultado de 0 a 3 para cada membro, com pontuações mais elevadas para membros mais inchados e/ou inflamados. Assim, o resultado de artrite total máxima é de 12. Um camundongo foi contado como tendo artrite se tivesse um resultado de artrite de pelo menos 1 em qualquer membro.

[000109] Os resultados são mostrados na Figura 11. Estes dados indicam que a combinação de aBAFF e anti-mB7RP1 (círculos preenchidos conectados por linhas contínuas) foi muito mais eficaz na supressão de sintomas de artrite do que ou aBAFF (círculos abertos conectados por linhas contínuas) ou anti-mB7RP1 (círculos preenchidos conectados por linhas tracejadas) sozinho. Os grupos de controle negativo tratados com mIgG (quadrados preenchidos conectados por linhas contínuas) ou PBS (quadrados preenchidos conectados por linhas tracejadas) tiveram a incidência percentual de artrite mais elevada e pontuações de artrite mais elevada. Estes resultados sugerem que a inibição tanto de BAFF quanto B7RP1, em oposição a inibição de apenas uma destas vias, pode ser um tratamento eficaz de um autoimune e/ou doença artrítica inflamatória, tal como artrite reumatoide.

Claims (28)

1. Proteína biespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos com a seguinte fórmula: A-L1-P-L2-P, em que A é uma cadeia pesada de imunoglobulina de um anticorpo IgG, L1 é um primeiro ligante de peptídeo, P é um peptídeo de ligação ao BAFF com 10 a 40 amino- ácidos de comprimento e L2 é um segundo ligante de peptídeo; e (b) uma cadeia leve de imunoglobulina de um anticorpo IgG, em que a cadeia pesada de imunoglobulina de (a) e a cadeia leve de imunoglobulina de (b) formam um anticorpo IgG que se liga a B7RP1; em que a proteína compreende duas moléculas do polipeptídeo de (a) e duas moléculas da cadeia leve de (b), em que A compreende uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11, uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12 e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; em que L1 compreende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40; em que L2 compreende SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 24; ou SEQ ID NO: 71; em que P compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 (LPGCKWDLLIKQWVCDPL); em que a cadeia leve de imunoglobulina compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9, e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10; em que a proteína inibe a proliferação mediada por BAFF de células B humanas, e em que a proteína inibe a proliferação mediada por B7RP1 de células T humanas.

2. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cadeia pesada de imunoglobulina está ausente de uma lisina na sua extremidade C-terminal, logo a montante de L1.

3. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o anticorpo IgG é um anticorpo anti- B7RP1 IgG1 humano ou humanizado.

4. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-B7RP1 é um anticorpo IgG2 humano ou humanizado.

5. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-B7RP1 é anticorpo IgG4 humano ou humanizado.

6. Proteína biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que L1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 (GGGGG).

7. Proteína biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que L2 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

8. Proteína biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que L2 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

9. Proteína biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que L2 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

10. Proteína biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

11. Proteína biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

12. Proteína biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizada pelo fato de que a cadeia leve de imunoglobulina de (b) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

13. Proteína biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-12, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de (a) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou 18.

14. Proteína biespecífica de acordo a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: (a) um polipeptídeo (a) como definido na reivindicação 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18, e (b) polipeptídeo (b) como definido na reivindicação 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

15. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de (a) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

16. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de (b) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

17. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína biespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16 e um excipiente fisiologicamente aceitável.

18. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptídeo (a) ou cadeia leve de imunoglobulina (b) da proteína biespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 ou SEQ ID NO: 57 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas codificando as mesmas sequências de amino- ácidos.

19. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 18.

20. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou uma de levedura compreendendo o ácido nucleico como definido na reivindicação 18 e/ou o vetor como definido na reivindicação 19.

21. Método para fazer uma proteína biespecífica, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico como definido na reivindicação 18 e/ou o vetor como definido na reivindicação 19 sob condições tais que o ácido nu- cleico seja expresso e recuperando a proteína a partir da massa celular ou do meio de cultura.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de mamífero ou uma célula de Escherichia coli, preferencialmente em que a célula de mamífero é uma célula CHO.

23. Proteína biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de lúpus eritematoso sistêmico.

24. Proteína biespecífica, proteína ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que outra terapêutica é administrada ao paciente antes, depois ou simultaneamente com a proteína biespecífica, e em que a outra tera-pêutica é um corticosteróide, um antimalárico, ácido retinóico, um NSAID, ciclofosfamida, desidroepiandrosterona, micofenolato mofetil, azatioprina, clorambucil, metotrexato, tacrolimo, dapsona, talidomida, leflunomida ou ciclosporina, preferencialmente em que o outro terapêutico é micofenolato de mofetil, um corticosteróide, um antimalárico, me- totrexato ou azatioprina.

25. Proteína biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença selecionada do grupo que consiste em: vasculite ANCA positiva, artrite reumatóide (AR), doença de Crohn, colite ulcera- tiva, doença celíaca, pênfigo, penfigóide, lúpus eritematoso cutâneo su- bagudo (LECS), esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), miastenia gravis, síndrome de Goodpasture, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite, anemia hemolítica auto- imune (AIHA), ITP ativa, trombocitopenia crônica ITP, cirrose biliar primária, síndrome de Sjogren, esclerose sistêmica, tireoidite de Hashimoto, doença de Graves, doença de Addison e neoplasia endócrina múltipla (MEN).

26. Proteína biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que é para uso como medicamento.

27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína biespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, para uso no tratamento de lúpus erite- matoso sistêmico ou nefrite lúpica.

28. Uso de uma proteína biespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, caracterizada pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma do-ença selecionada do grupo que consiste em: vasculite ANCA positiva, artrite reumatóide (AR), doença de Crohn, colite ulcerativa, doença ce-líaca, pênfigo, penfigóide, lúpus eritematoso cutâneo subagudo (LECS), esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), miastenia gravis, síndrome de Goodpasture, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite, anemia hemolítica auto-imune (AIHA), ITP ativa, trombocitopenia crônica ITP, cirrose biliar primária, síndrome de Sjogren, esclerose sistêmica, tireoidite de Hashimoto, doença de Graves, doença de Addison e neoplasia endócrina múltipla (MEN).