JP6633002B2 - 免疫原性複合タンパク質を生産する形質転換植物体の製造方法及びこれより収得された免疫原性複合タンパク質 - Google Patents

Description

本出願は、2014年06月12日に出願された大韓民国特許出願第10-2014-0071607号を優先権主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である。

本発明は、免疫原性複合タンパク質を生産する形質転換植物体の製造方法及びこれより収得された免疫原性複合タンパク質に関するものであって、より詳細には、（ａ）抗原を発現する形質転換植物体を製造する段階；（ｂ）前記（ａ）段階の抗原に特異的な抗体を発現する形質転換植物体を製造する段階；（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）段階の植物体を交配して交配植物を製造する段階を含む免疫原性複合タンパク質を生産する形質転換植物の製造方法、前記方法により製造された植物体及び前記植物体から収得された免疫原性複合タンパク質に関する。

ワクチンは病原菌感染に対する防御を目的に抗原に対する免疫反応を生成するようにために使用される医薬品であり、最近開発されているワクチンは主に、再組み合わせタンパク質を抗原として使用している。再組み合わせタンパク質は死菌ワクチンや弱毒化生ワクチンに比べて副作用が少なく安全ではあるが免疫原性が低いので、感染防御に十分な免疫力を生成するために免疫補助剤を共に使用する。免疫補助剤は自らは特異的な抗原−抗体免疫反応を有していないながらも、ワクチン抗原に対する免疫反応を刺戟させて増強された免疫力を誘導できる一種のワクチン添加剤としてラテン語で“助ける”又は“強化する”の意味を有する“adjuvare”から由来した。

免疫補助剤は作用機転によって大きく抗原の伝達体、免疫増強剤、免疫反応を刺戟すると同時に、抗原に対するマトリックスとして作用することなどの３種に区別される。免疫補助剤は効果的に使用すれば(1)再組み合わせ抗原の免疫原性を増加させ、(2)抗原投与量を減らすか又は免疫化回数を減らすことができ、(3)免疫力が弱い乳児と老人から免疫原性を向上させるなどの多様な効果が得られる。

現在ヨーロッパ及び米国で承認を受けてワクチンに使用されている免疫補助剤には、アルミニウム塩、MF59、AS03、AS04などがある。1926年ジフテリアトキソイドワクチンの免疫補助剤に開発されたアルミニウム塩は、現在最も広く使用される免疫補助剤であって、去る80余年間ヒトのワクチンに殆ど独占的に使用されている。アルミニウム塩は多様なワクチンに広く使用され、極めて安全なものと思われているが、アレルギー反応を誘発して神経毒性もあるものと推定されている。さらに、抗体が媒介された体液性免疫反応は強く誘導するが、細胞性免疫反応は殆ど誘導できず凍結保存が不可能な短所がある。

前記のように予防接種（又はワクチン接種、vaccination）をする時、免疫補助剤を使用するが、これによって副作用［例えば、autism spectrum disorders(ASD)］とallergyなどの多様な副作用が発生する問題を有しているのでadjuvant freeワクチンに対する要求が必要な状況である。

大韓民国登録特許10-1054851

Zhe Lu、Kyung-Jin Lee、Yingxue Shao、Jeong-Hwan Lee、Yangkang So、Young-Kug Choo、Doo-Byoung Oh、Kyjng-A Hwang、Seung Han Oh、Yeon Soo Han、and Ki sung Ko、Expression of GA733-Fc Fusion Protein as a Vaccine Candidate for Colorectal Cencer ib Transgenic Plants、Journal of Biomedicine and Biotechnology、Volume 2012、Article ID 364240、11 Pages。

ここに、本発明の発明者らは免疫補助剤非添加ワクチン(adjuvant free vaccine)生産に関して研究を重ねる中で、それぞれ抗原及び抗体を発現する形質転換植物体を他家受粉して生産された１世代植物体で生産された抗原−抗体複合体が免疫補助剤無しでも高免疫反応を起こすことを確認して本願発明を完成した。

従って、本発明の目的は（ａ）抗原を発現する形質転換植物体を製造する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階の抗原に特異的な抗体を発現する形質転換植物体を製造する段階；
（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）段階の植物体を交配して交配植物を製造する段階を含む免疫原性複合タンパク質を生産する形質転換植物の製造方法を提供することである。

本発明の他の目的は前記方法で製造された免疫原性複合タンパク質を生産する植物体を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記植物体から由来した免疫原性複合タンパク質を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記免疫原性複合タンパク質及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含むワクチン組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ワクチン製造の用途のための前記免疫原性複合タンパク質を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記免疫原性複合タンパク質を必要とする個体に有効量で投与することを特徴とする免疫化方法を提供することである。

前記の目的を達成するため、本発明は（ａ）抗原を発現する形質転換植物体を製造する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階の抗原に特異的な抗体を発現する形質転換植物体を製造する段階；
（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）段階の植物体を交配して交配植物を製造する段階を含む、免疫原性複合タンパク質を生産する形質転換植物の製造方法を提供する。

本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記方法で製造された免疫原性複合タンパク質を生産する植物体を提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するため、本発明は前記植物体から由来した免疫原性複合タンパク質を提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するため、本発明は前記免疫原性複合タンパク質及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含むワクチン組成物を提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するため、本発明はワクチン製造の用途のための前記免疫原性複合タンパク質を提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するため、本発明は前記免疫原性複合タンパク質を必要とする個体に有効量で投与することを特徴とする免疫化方法を提供する。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、
（ａ）抗原を発現する形質転換植物体を製造する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階の抗原に特異的な抗体を発現する形質転換植物体を製造する段階；
（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）段階の植物体を交配して交配植物を製造する段階を含む免疫原性複合タンパク質を生産する形質転換植物の製造方法を提供する。

（ａ）段階では抗原を発現する形質転換植物体を製造する。

前記本発明の用語“抗原”とは、適当な細胞と接触して流入するこことにより、敏感性及び／又は免疫反応性状態を誘導させ、生体内又は試験管内でこのように感作された対象体の免疫細胞及び／又は抗体と認識可能な方式で反応する全ての物質を指称する。本明細書で用語“抗原”とは、“免疫原”と言う用語と同一な意味で通称されて使用することができ、好ましくは宿主免疫体系がその抗原に特異的な分泌性、体液性及び／又は細胞性免疫反応を起こすように促進できる一つ又はそれ以上のエピトープを含む分子を意味する。さらに、本発明で用語“抗原性”又は“免疫原性”とは、前記抗原又は免疫原の性質を意味するもので、分泌性、体液性及び／又は細胞性免疫反応を起こす性質を意味する。

前記用語“免疫反応”とは、動物体内に存在する自己防御体系であって、外部から侵入する各種物質や生命体を自分自身と区別して侵入者を除去する生物学的現象である。このような自己防御のための監視体系は、大きく二つの機作によりなされるが、一つは体液性免疫、さらに、他の一つは細胞性免疫である。体液性免疫は血清内に存在する抗体によってなされるが、抗体は侵入した外部抗原物質と結合してそれを除去する重要な機能をする。一方、細胞性免疫はリンパ系に属する幾つかの種類の細胞によりなされるが、このような細胞は侵入した細胞や組織を直接破壊する機能を担当する。そのようにして体液性免疫は主に細胞外部に存在する細菌やウイルス、タンパク質、複合炭水化物のような外部物質に対して効果的であって、細胞性免疫は各種の寄生虫、組織、細胞内感染、ガン細胞などにその機能を発揮する。このような二重防御体系はＢ細胞やＴ細胞などの主に二種類のリンパ球により行われるが、Ｂ細胞は抗体を生産し、Ｔ細胞は細胞性免疫に加わっている。このようなＢ細胞やＴ細胞による免疫反応は一応体内に侵入した抗原に対して反応はするものの、必ず同じ種類の抗原が継続して存在するか又は繰返し侵入して来た場合に作用する免疫体系である。従って、このような免疫反応は特定抗原に対する特異的な反応である。このような抗原特異的免疫反応以外にも体内には、ある抗原に対して露出された経験がない場合であっても、直接的に反応して攻撃細胞を破壊する一種の自然免疫反応もあるが、このような免疫反応にはneutrophil、macrophage、NK(natural killer)細胞などが関与して、攻撃対象細胞の種類に別にこだわることなく多様な機能を発揮することが特徴である。

前記“エピトープ”とは、複雑な抗原分子上の最も簡単な形態の抗原決定基を指称し、これは抗体又はＴ細胞受容体により認識される抗原の特異的部分である。

本発明の抗原はこれに制限されないが、ポリペプチド又はタンパク質、非タンパク質分子及びこれらの断片を全て含む意味である。好ましくは本発明の抗原はポリペプチド又はタンパク質及び断片を意味する。

本願発明の抗原は当業者に公知の免疫原性物質でもあって、これに制限されないが、例えば、バクテリア抗原又はエピトープ、眞菌抗原又はエピトープ、植物抗原又はエピトープ、糸状菌抗原又はエピトープ、ウイルス抗原又はエピトープ、腫瘍（癌）細胞抗原又はエピトープ、毒素抗原又はエピトープ、化学的抗原又はエピトープ及び自己抗原又はエピトープを含む。

本願発明の抗原は好ましくは腫瘍連関抗原でもある。前記腫瘍連関抗原は当業者に公知の腫瘍（又は癌）連関抗原であれば、その種類が制限されないが、例えば、乳房癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頸部癌抗原、膵臓癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、睾丸癌抗原、咬耗細胞腫癌抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍と関連した抗原、多発生骨髄腫と関連した抗原、非ホジキンリンパ腫と関連した抗原、慢性リンパ球性白血病と関連した抗原又は大腸癌抗原を含む。

より具体的に前記腫瘍連関抗原はA33、ADAM-9、ALCAM、B1、BAGE、ベータカデニン、CA125、カルボキシペプチダーゼ M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD32B、CD36、CD40、CD45、CD46、CD56、CD79a、CD79b、CD103、CD154、CDK4、CEA、CTLA4、サイトケラチン8、EGF-R、エプリン受容体、ErbB1、ErbB3、ErbB4、GAGE-1、GAGE-2、GD2、GD3、GM2、gp100、HER-2/neu、ヒトのパピロマウイルス-E6、ヒトのパピロマウイルス-E7、インテグリンアルファーV-ベータ-6、JAM-3、KID3、KID31、KSA(17-1A)、LUCA-2、MAGE-1、MAGE-3、MART、MUC-1、MUM-1、N-アセチルグルコサミニルトランスファラーゼ、オンコスタチン（オンコスタチン受容体ベータ）、ｐ15、PIPA、PSA、PSMA、RAAG10、ROR1、SART、sTn、TES7、TNF-α受容体、TNF-β受容体、TNF-γ受容体、トランスフェリン受容体、VEGF受容体又はGA733でもあるがこれに制限されない。

本発明の抗原は好ましくは大腸癌細胞表面、特異タンパク質のGA733でもあって、前記GA733は上皮細胞付着分子（EpCAM:Epithelial Cell Adhesion Molecule、又は17-1A抗原、KSA、EGP40、GA733-2、ks1-4及びesaとも称される）である。EpCAMは簡単な上皮細胞及びこれより誘導された腫瘍細胞により発現された表面糖タンパク質である。EpCAM分子は健康な組織からの細胞表面に見えるが、その発現は悪性組織において上向調節される。EpCAMは背向されて極めて整列された形態で上皮細胞に固着する機能をする。

本発明の前記GA733は好ましくは配列番号１で表示されるポリペプチドでもある。

さらに、本発明で前記“抗原”とは、小胞体信号ペプチド（endoplasmic reticulum signal peptide、小胞体標的化配列と同じ意味）を追加して含むことができる。前記小胞体信号ペプチドは細胞質細網上の信号認識粒子によりタンパク質が認識されることを許容してタンパク質がER内腔内に転位させるアミノ酸配列を意味する。本発明で前記小胞体信号ペプチドは当業者に公知の植物小胞体信号ペプチドであればその種類及びアミノ酸配列が制限されず、例えば、US20130295065、WO20099158716などの文献を参考にすることができる。本発明で前記小胞体信号ペプチドは好ましくは配列番号３、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31及び配列番号32からなる群より選ばれたいずれか一つのポリペプチドでもあって、最も好ましくは配列番号３で表示されるペプチドでもある。

前記小胞体信号ペプチドの結合位置は植物細胞内で発現又は合成を目的とするタンパク質のN-末端に追加されることを特徴とする。

本発明で前記（ａ）段階の抗原は、好ましくは抗体Fc断片と融合した形態で提供できる。前記用語“融合”とは、化学的又は遺伝的融合を全て含む意味であって、本発明では好ましくは遺伝的融合を指称する。前記“遺伝的融合”とは、タンパク質をコーディングするDNA配列の遺伝的発現を通じて形成された線型の共有結合からなる連結を意味する。

このような形態で提供される抗原を本願発明ではキメラ抗原(chimeric antigen)と称する。つまり、本願発明の抗原は好ましくは下記（ｉ）及び（ii）を含むキメラ抗原である；（ｉ）抗原性タンパク質を含む免疫反応ドメイン(immune response domain、IRD)及び(ii)抗体Fc断片(Fc antibody fragment)を含む標的結合ドメイン(target binding domain、TBD)。

前記（ｉ）において免疫反応ドメインは、抗原性タンパク質の全体又は断片を含む実際的な免疫反応、つまり、体液性及び／又はＴ細胞反応を誘導する部分を指称する。

前記抗原性タンパク質とは、ポリペプチド又はタンパク質種類の抗原物質を指称するものであって前記抗原に対しては前述の通りである。

前記(ii)で標的結合ドメインは少なくとも一つ以上の抗体Fc断片由来のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含み、抗原提示細胞(antigen-presenting cell、APC)と結合できる部分を指称する。

本発明で用語“抗体”とは、“免疫グロブリン(immunoglobulin、以下、“Ig”と表記)”と混用して使用され、抗原に選択的に作用して生体免疫に関与するタンパク質の総称である。抗体は軽鎖及び重鎖の２つの対でなされる。このような抗体の軽鎖及び重鎖は複数のドメインでなされたポリペプチドである。全体の抗体からそれぞれの重鎖は重鎖可変部位(VH)及び重鎖不変部位を含む。重鎖不変部位は重鎖不変ドメインCH1、CH2及びCH3（抗体部類IgA、IgD及びIgG)及び任意で重鎖不変ドメインCH4（抗体部類IgE及びIgM)を含む。それぞれの軽鎖は軽鎖可変ドメイン(VL)及び軽鎖不変ドメイン(CL)を含む。一つの自然発生的全体抗体のIgG抗体の構造は例えば、図２に提示されている。可変ドメインVH及びVLはより保存された骨格部位(FR)と称される部位内に散在された相補性決定部位(CDR)と称される過可変性部位であって、さらに細分することができる。それぞれのVH及びVLは３個のCDR及び４個のFRであって、アミノ末端においてカルボキシ末端に配列された下記順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で構成されている(Janeway C.A. Jr.など(2001)。Immunobiology.、5th ed.、Garland Publishing;and woof、J. Burton D.、NatRav Immunol 4 (2004)89-99)。重鎖及び軽鎖の２個の対(HC/LC)は同一な抗原に特異的に結合することができる。従って、前記全体の抗体は２価、単一特異性抗体である。

ギリシャ文字α、δ、ε、γ及びμで表示された５種の類形の哺乳類抗体重鎖が存在する(Janeway、C.A.、Jr.等、(2001) Immunobiology.、5th ed.、Garland Publishing)。存在する重鎖の類形が抗体の部類を定義する；このような鎖はそれぞれIgA、IgD、IgE、IgG及びIgM抗体から発現される(Rhoades R.A.、Pflanzer RG(2002).Human Physiology、4th ed.、Thomson Learning)。区別される重鎖は大きさ及び組成が異なる；α及びγはおおよそ450個のアミノ酸を含む一方、μ及びεはおおよそ550個のアミノ酸を有する。それぞれの重鎖は不変部位と可変部位の２個の部位を有する。不変部位は同一な同形の全ての抗体で一致するが、相異する同形の抗体で相異する。重鎖γ、α及びδは３個の不変ドメインCH1、CH2及びCH3（一列に）で構成された不変ドメイン、及び柔軟性を加えるためのヒンジ部位を有して(Woof J.、Burton D.、Nat Rev Immunol 4 (2004)89-99);重鎖μ及びεは4個の不変ドメインCH1、CH2、CH3及びCH4で構成された不変部位を有する(Janeway C.A. Jr.など(2001).Immunobiology.、5th ed.、Garland Publishing)。重鎖の可変部位は相異したＢ細胞により生成される抗体では相異するものの、単一Ｂ細胞又はＢ細胞クロンにより生成される全ての抗体に対しては同一である。それぞれの重鎖の可変部位はおおよそ110個のアミノ酸の長さであって、単一抗体ドメインで構成される。

哺乳類にはラムダ(λ)及びカパ(κ)と称されるただ２種の軽鎖が存在する。軽鎖は１個の不変ドメインCL及び１個の可変ドメインVLの２個の連続ドメインを有する。軽鎖の概略的な長さは211乃至217個のアミノ酸である。

本願発明の明細書において特別な言及が無い限り、IgGを抗体の代表的な基本構造に説明される。

本発明のFc断片はIgG、IgA、IgD、IgE及びIgMからなる群より選ばれたいずれか一つから由来されたものでもあって、好ましくはIgG由来のFc断片でもある。前記IgGはさらに、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4に分けることができ、本発明のFc断片は最も好ましくIgG1由来のFc断片でもある。

本発明で用語“Fc断片”とは、免疫グロブリン分子をパパインで分解させる時、得られる分節であって、軽鎖の可変領域(VL)と不変領域(VC)及び重鎖の可変領域(VH)と重鎖不変領域1(CH1)が除去された領域である。つまり、前記Fc断片は２個のCH2-CH3ドメイン鎖の異量体を意味するものであって、前記二つの鎖は二硫化結合により異量体構造を形成する。さらに、前記Fc断片は重鎖不変領域に蝶番領域(hinge region)ペプチドの全体又は一部を含むことができる。さらに、天然型と実質的に同等であるか又は向上した効果を有する限り、重鎖不変領域1(CH1)及び／又は軽鎖不変領域1(CL1)の一部又は全体を含む拡張されたFc断片でもある。さらに、CH2及び／又はCH3に該当する、かなり長い一部アミノ酸配列が除去された断片でもある。

さらに、前記抗体Fc断片は、前記キメラ抗原を含む分子又は組成物が投与される宿主(対象体)と同一な種から由来されるか又は宿主に対して異種型抗体Fc断片でもある。例えば、宿主がヒトの場合、前記抗体Fc断片はヒトの抗体から由来されたものでもあって、異種型抗体Fc断片に対しては非ヒト哺乳類動物、例えば、牛、羊、豚、マウス、兎、ハムスタ、ラット、ギニピグ又はマウス由来抗体Fc断片でもある。

本発明の前記“抗体Fc断片”とは、当業者に知られた抗体Fc断片ペプチドであれば、その種類及びアミノ酸配列が制限されないが、例えば、配列番号４で表示されるポリペプチドでもあって(ヒトIgGのFc断片序列)、さらに、前記配列に蝶番領域が付加された配列番号６で表示されるポリペプチドでもある。

本発明の用語“抗原提示細胞”とは、抗原を内在化して、抗原をプロセシングし、主要組織適合性複合体(MHC)部類Ｉ又はII分子脈絡から抗原性エピトープをリンパ球に提示することにより、主に機能する抗原誘導性事件の補助細胞を指称する。APCと抗原間の相互作用は免疫誘導において、必須的段階であるが、これは、これによってリンパ球が抗原性分子と接触して、これを認識して活性化できるからである。例示的APCには大食細胞、単球、ランゲルハンス(Langerhans)細胞、互いに噛合っている樹枝状細胞、小胞性樹枝状細胞及びＢ細胞が含まれる。

本発明の前記“標的結合性ドメイン(TBD)”は少なくとも一つ以上の抗体Fc断片由来CH2及びCH3ドメインを含むので、APC上のFc受容体と結合することができる。抗体Fc断片はFc receptor binding siteを有し、前記Fc receptor binding siteにおいてAPC上のFc受容体と結合する。

前記免疫反応ドメイン(IRD)と標的結合性ドメイン(TBD)は、遺伝的融合手段により直接又は間接的に連結できる。従って、本発明の前記キメラ抗原はIDRをTBDに連結させる連結性分子の使用を含む。例示されるリンカ分子にはロイシンジッパー及びビオチン／アビジンが含まれる。例えば、前記キメラ抗原に使用できるその他のリンカーは、ペプチド配列である。このようなペプチドリンカ一は一般的に、長さが約２乃至約40個のアミノ酸(例えば、約4乃至10個のアミノ酸)である。例示されるペプチドリンカーにはアミノ酸配列“SPRQGGGS”が含まれる。その他のリンカーは当該分野に公知であり、一般的に、これらが連結させる領域ら間の可撓性を考慮してグリシン及び／又はアラニンが豊富である。

本発明のキメラ抗原は単量体性であるか（つまり、これらはIRD及びTBDを含む単一単位を含有する）、又はこれらを多量体性でもある（つまり、これらはそれぞれIRD及びTBDを含む多重単位を含有する）。多量体は、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体又は八量体でもある。このような多量体では個々の単位が同一であるか又は相異することがあるか、又は幾つかは同一であって他のものは相異することがある。本願発明のキメラ抗原は好ましくも二量体性であって、図１は本発明の二量体性キメラ抗原を図示したものである。

さらに、前記二量体性キメラ抗原に対してはUS8465745、US8029803及び大韓民国登録特許10-1054851を参考にすることができる。

本発明の前記キメラ抗原は好ましくは、
（ｉ）抗原性タンパク質を含む免疫反応ドメイン；及び
（ii）抗体蝶番領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む標的結合ドメインを含み、
前記免疫反応ドメインのＣ−末端が前記標的結合ドメインＮ−末端でペプチド結合により、連結された二量体タンパク質であることを特徴とする。

さらに、前記（ａ）段階で“抗原”とは、小胞体貯蔵誘導配列(または小胞体残留シグナルペプチド、ER retention signal peptide)を追加して含むことができる。前記小胞体貯蔵誘導配列は当業者に公知の植物小胞体貯蔵誘導配列であればその種類が制限されず、WO2009158716及び下記文献などを参照することができる；Pagny et al.、Signals and mechanisms for protein retention in the endoplasmic reticulum、Journal of Experimental Botany、Vol.50、No.331、pp.157-64、February 1999.

本発明の前記小胞体貯蔵誘導配列は好ましくもKDEL（配列番号８）、HDEL（配列番号23）及び前記配列に１乃至５個のアミノ酸が付加されたものでもあって、（例えば、配列番号24のSEKDEL、配列番号25のKHDEL、配列番号26のKEEL、配列番号27のSEHDEL等）、最も好ましくは配列番号８で表示されるKDELでもある。

前記KDELをコーディングするヌクレオチドを特定遺伝子(本発明では、抗原発現遺伝子)内に挿入することにより、最終産物のアミノ酸配列末端にKDELが露出されるようにする。これは生産されたタンパク質が植物細胞の外部に分泌されずに、形質転換された細胞内の小胞体に存在するように誘導する。前記特定遺伝子が導入された宿主細胞内で生産されるタンパク質はKDEL配列により、小胞体内に貯蔵されて植物体内でなされ得る翻訳後過程(post-translational modification)を経る。これは細胞内抗体タンパク質の発現量増加と異種間免疫反応の重要な役割をする異種間糖構造の差による問題点を解決するのに重要な役割をする。前記KDEL配列により小胞体の貯蔵過程を経て、生産された抗体ではhigh-mannose糖鎖構造(high-mannose glycan structure)が生産されるものと知られており、糖タンパク質からER-type糖鎖(またはoligomannose glycan-typeとも呼ばれている)が樹枝状細胞又は大食細胞においてマンノース受容体を通じて免疫反応を増加させるものと考えられている(Zhe Lu et al.、Expression of GA733-Fe Fusion Protein as a Vaccine Candidate for Colorectal Cancer in Transgenic Plants、Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2012、Article ID 364240、11 PAGES、DOI:10.1155/2012/364240)。

前記小胞体貯蔵誘導配列(KDEL)の挿入部位は、抗原の免疫原性又は抗体結合能力に影響を与えない限り、その部位が制限されない。本発明の抗原が前述した通り、キメラ抗原の形態で提供される場合において、前記小胞体貯蔵誘導配列の挿入部位はこれに制限されないが、好ましくは抗体Fc断片のＣ−末端部位でもある。

本発明の前記（ａ）段階の抗原は、配列番号９で表示されるGA733-FcKキメラ抗原であることを特徴とする。前記GA733-FcKキメラ抗原は、小胞体信号ペプチドが連結された大腸癌細胞表面GA733タンパク質、hinge regionを含むヒトのIgG1のFc断片及び小胞体貯蔵誘導配列(Kで表示)が連結された二量体タンパク質であって（図１参照）、本発明の発明者による登録特許10-1054851を参考にする。

前記用語“形質転換”とは、外来性ポリヌクレオチド導入による、宿主細胞の遺伝子型の変形を意味し、その形質転換に使用された方法とは関係無く外来性ポリヌクレオチドが宿主細胞内に導入されたことを意味する。宿主細胞内に導入された外来性ポリヌクレオチドは宿主細胞のゲノム内に統合されて維持又は統合されずに維持できるが、本発明は両者全てを含む。

前記用語“導入”とは、遺伝子又は遺伝子群を人為的に標的する細胞に挿入して、その遺伝子群を発現させるか又はその細胞のゲノムに他の遺伝子を付加する操作を意味する。このような遺伝子の導入はバクテリオファージによる形質導入、土壌細菌のAgrobacterium spp.を媒介にした間接的な方法、遺伝子銃(genegun)、電気刺戟、顕微注入(microinjection)法などによる方法で行うことができ、この他にも標的細胞及び挿入遺伝子の特徴によって当業者が公知の遺伝子導入技術を選択的に使用することができる。

本発明の前記（ａ）段階で形質転換とは、抗原（特に抗原性タンパク質）を符号化する（コーディングする）ポリヌクレオチドを植物細胞に導入することを意味し、本発明の（ａ）段階“抗原を発現する形質転換植物体製造”とは、公知の植物細胞形質転換方法により行うことができ、これに制限されないが、例えば、望む遺伝子をベクターに挿入して再組み合わせベクターを作り、前記再組み合わせベクターをAgrobacterium属の菌株に形質転換させて、前記菌株を植物細胞に感染させる方法でもある。

前記ベクターは一般的に、シグナル配列、複製起源、一つ以上のマーカー遺伝子、インハンサー要素、プロモータ及び転写終結配列の内、一つ以上を含むことであって好ましくは発現ベクターである。前記発現ベクターは選択されたポリヌクレオチドが発現できるベクターの一つの形態である。一つのポリヌクレオチドシーケンスは、調節シーケンスが前記ポリヌクレオチドシーケンスの発現（例えば、水準、タイミング又は発現の位置）に影響を与える場合、前記調節シーケンス(regulatory sequence)に“作動可能に連結”される。前記調節シーケンスはそれが作動可能に連結される核酸の発現（例えば、水準、タイミング又は発現の位置）に影響を与える配列である。前記調節シーケンスは、例えば、調節された核酸に直接的に又は一つ又はそれ以上の他の分子ら（例えば、前記調節シーケンス及び／又は前記核酸に結合するポリペプチドなど）の作用を通じてその影響が及ぶようにすることができる。前記調節シーケンスにはプロモータ、インハンサー及び他の発現調節要素などが含まれる。

前記の当分野に公知の分子生物学的技法の標準再組み合わせDNA及び分子クローニング技術は下記文献に記載されている(Sambrook J.、Fritsch E.F. and Maniatis T.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor、NY、1989;BY Silhavy T.J.、Bennan M.L. and Enquist L.W.、Experiments with Gene Fusions、Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor、NY、1984;and by Ausubel F.M. et al.、Current Protocole in Molecular Biology、published by Greene Publishing Assoc.and wiley-Interscience、1987)。

安定した形質転換後、引続き形質転換された植物を繁殖させる。前記繁殖は植物の個体数を増加させることを意味する。前記植物の繁殖は再生植物の特性と母遺伝子移植植物が発現する特性が同一に維持される方法であれば制限はされないが、好ましくは微細増殖でもある。

前記微細増殖は選択された母植物又は栽培種から切出した単一組織サンプルから第２世代植物を成長させる方法である。この方法により好ましい組織を有し、目的とするタンパク質を発現する植物の大量再生産が可能である。新たに生成された植物は最初の植物と遺伝学的に同一であって、最初植物の特徴全てを有する。微細増殖は短期間で優秀植物材料の大量生産を可能にし、最初遺伝子移植又は形質転換植物の特徴を保存しながら選択された作物を速やかに増殖可能にする。植物クローニング方法の利点として植物増殖の迅速性及び生産された植物の優秀性及び均一性が含まれる。

（ｂ）段階では前記（ａ）段階の抗原に特異的な抗体を発現する形質転換植物体を製造する。

前記“抗体”に関しては前述した通りである。

前記用語“特異的”とは、特異的に結合する分子の片方の分子が、その一つ又は複数の結合する相手側の分子以外の分子に対しては全く有意な結合を示さない状態を意味する。本願発明では抗体が、ただ一つの抗体にのみ結合できる特異性を意味し、さらに、抗原結合ドメインがいずれかの抗原の中に含まれる複数のエピトープの内、特定エピトープに対して特異的な場合にも使用される。さらに、抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の相異した抗原に含まれる場合には、当該抗原結合ドメインを有する抗原結合分子は当該エピトープを含む多様な抗原と結合することができる。

本発明の前記“（ａ）段階の抗原に特異的な抗体”とは、IgG、IgA、IgD、IgE及びIgMからなる群より選ばれたいずれか一つの種類でもあって、天然から由来される全体抗体形態で提供できる。さらに、前記（ａ）段階の抗原に特異的な抗体は単一クロン抗体（モノクロナル抗体）及び多クロン抗体（ポリクロナル抗体）を含み、好ましくは単一クロン抗体でもある。

本発明で用語“単一クロン抗体”とは、単一の抗原性部位（単一エピトープ）に対して指示され、これと特異的な結合をするタンパク質分子を意味する。モノクロナル抗体は実質的に同質（相同性）抗体の集団から収得された抗体を示し、つまり、集団を構成する個々の抗体は少量で存在が可能な天然的に存在する突然変異を除いては同一である。前記単一クロン抗体は当該技術分野で広く知られた公知の単一クロン抗体生産方法により製造することができ、これに制限されないが、例えば、文献（参照：Kohler et al.(1975)Nature 256:495)に初めて記載されたハイブリドーマ方法により製造できるか又は再組み合わせDNA方法（参照：米国特許第4816567号）により製造することができる。さらに、例えば、文献（参照：Clackson et al.(1991)Nature 352:624-628及び Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581-597及びpresta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116-731）に記述された技術を使用してファージ抗体ライブラリーから分離することができる。

本発明で用語“多クロン抗体”とは、単一クロン抗体が２個以上含まれる抗体混合物を意味し、複数のエピトープに反応することができる。

さらに、前記“（ａ）段階の抗原に特異的な抗体”とは、多価抗体を全て含むものの、好ましくは２価抗体でもある。前記２価抗体は同一なABSを２個有する両腕抗体(two armed antibody)の構造を示すものであって図２に図示した。

前記“多価”抗体とは、２以上の抗原結合部位を含む抗体である。多価抗体は２価、３価、４価、５価、６価、７価又は高次結合価抗体を含む。

前記（ａ）段階でキメラ抗原が使用される場合、（ｂ）段階の抗体は前記キメラ抗原に含まれたFc断片が由来された抗体と同じ種類の抗体を使用するのが好ましい。例えば、（ａ）段階でIgG由来のFc断片を含むキメラ抗原を使用する場合、（ｂ）段階の抗体は前記（ａ）段階のキメラ抗原に特異的なIgGである。

前記（ｂ）段階の抗体は、前記（ａ）段階のキメラ抗原を含む分子又は組成物が投与される宿主と同一な種から由来されるか、又は宿主に対して異種型の抗体でもある。例えば、宿主がヒトの場合、前記抗体はヒトから由来したものでもあって、異種型抗体に対しては非ヒト哺乳類動物、例えば、牛、羊、マウス、兎、ハムスタ、ラット、ギニピグ、又はマウス由来の抗体でもある。

本発明の（ｂ）段階で前記抗体は小胞体貯蔵誘導配列(KDEL)を追加して含むことができる。前記小胞体貯蔵誘導配列に関しては、前述した通りであって、挿入部位は抗体の抗原認識及び結合能力に影響を与えない限り、制限されないが、好ましくは抗体タンパク質ペプチド配列の末端でもあり、さらに、好ましくは抗体タンパク質ペプチド配列のＣ−末端部位でもある。

本発明の前記（ｂ）段階の抗体は配列番号11（重鎖）及び13（軽鎖）で表示される、前記GA733-Fckキメラ抗原に特異的な２価抗体（二量体タンパク質）であることを特徴とする。前記GA733-Fckキメラ抗原に特異的な抗体は、実質的な抗原性部位のGA733タンパク質に対する抗体としてCO17-1Aに命名される。本発明で前記（ｂ）段階の抗体は好ましくは前記配列番号11の重鎖Ｃ末端に小胞体貯蔵配列を含む配列番号12及び配列番号13で表示される２価抗体として本明細書でCO17-1AK（図２参照）に命名された。

前記（ｂ）段階で形質転換は前記抗体を符号化するポリヌクレオチドを植物細胞に導入することを意味し、前記“形質転換”及び形質転換植物の繁殖に対しては前述した通りである。

（ｃ）段階では前記（ａ）及び（ｂ）段階の植物体を交配して交配植物を製造する。

前記“交配”は有性生殖のため雌雄又は互いに異なる交配型の二つの個体間に多様な方法で受精がなされて、雌雄両配偶者が結合して接合体を形成することを意味し、この際、両親の遺伝子型が同じく又は異なることは問題にしない。遺伝子型が異なる二つの個体の交配は交雑(crossing)と称するが本発明の“交配”は交雑を含む。

本発明の前記交配は公知の交配又は交雑方法により行うことができて、これに制限されないが、例えば、他家受粉によるものでもある。

本発明の（ａ）乃至（ｃ）段階で前記“植物”の種等は（ａ）段階及び（ｂ）段階で使用された植物が同種であって、これらが交配された（ｃ）段階の植物も同種である場合、（ａ）段階及び（ｂ）段階で使用された植物が互いに異種であって、これらが交配された（ｃ）段階の植物も異種（特に雑種）である場合を全て含む。好ましくは（ａ）段階及び（ｂ）段階で使用された植物が同種で、これらが交配された（ｃ）段階の植物も同種の場合でもある。

本発明の（ａ）乃至（ｃ）段階で前記“植物”とは、外来遺伝子が導入され得る植物であれば制限はされないが、例えば、単子葉植物の稲、小麦、麦、竹の子、トウモロコシ、里芋、アスパラガス、玉葱、ニンニク、葱、ニラ、ひめにら、長芋及び生姜がある。双子葉植物の例には、これに制限されないが、シロイヌナズナ、茄子、煙草、唐辛子、トマト、牛蒡、しゅんぎく、ちさ、桔梗、ホウレン草、とうじき、サツマ芋、セロリ、ニンジン、芹、パセリ、白菜、キャベツ、大根、西瓜、真桑瓜、キュウリ、カボチャ、夕顔、イチゴ、大豆、緑豆、インゲン豆、バーズフットトレフォイル（ミヤコグサ）、ジャガ芋、ウキグサ、エゴマ、鳩豆及びエンドウ豆でもある。好ましくは煙草(Nicotina tabacum)でもある。

前記（ｃ）段階で生産された交配植物では、父母世代植物体（つまり（ａ）及び（ｂ））段階の植物）それぞれから生産される異種のタンパク質らが同時に発現するばかりでなく、前記異種タンパク質などの全体又は一部ドメインが融合された新たな形態の融合タンパク質が生産できる。具体的に本発明で生産される新たな形態の融合タンパク質は（ａ）段階のキメラ抗原及び（ｂ）段階の抗体それぞれから一部ドメインが融合されたタンパク質を意味し、図１０ｃでその一例を図示する。

図１０ｃの構造を有する融合タンパク質を本明細書において“Fab腕交換融合タンパク質(Fab arm exchanged fusion protein)”と称し、具体的には
(i)抗原性タンパク質；
(ii)前記(i)の抗原性タンパク質に特異的な抗体Fab断片；及び
(iii)抗体Fc断片を含む構造の融合タンパク質を意味する。

前記用語“抗原性タンパク質”及び“抗体Fc断片”に対しては前述した通りである。

本発明で用語“抗体Fab断片（又は腕、arm）”とは、一つの軽鎖及び一つの重鎖のCH1（第１不変ドメイン）及び可変領域からなる抗体断片を意味するものであって、つまり、重鎖のVH及びCH1ドメイン及び軽鎖のVL及びCLドメインを含み、抗原に対する単一特異性を表す断片である。抗体をパパインで分解すれば、それぞれ単一抗原結合部位を有する“Fab”断片と称される２個の同一な抗原結合断片、及び残りのFc断片が生成される。

本発明で用語“Fab腕交換(Fab arm exchange)”とは、一側のFab断片を含む抗体半分子(half moleculeつまり一つの重鎖及びこれに付着された軽鎖）が交換されたことを意味する。

前記本願発明の“Fab腕交換融合タンパク質”の構造は具体的に(iii)抗体Fc断片は対称軸を基準に一側CH2及びCH3ドメインが前記(i)の抗原性タンパク質と連結され、他の一側のCH2及びCH3ドメインは前記(ii)のFab断片に連結されていることを特徴とする（図１０ｃ参照）。

この時、(iii)抗体Fc断片の一側CH2及びCH3ドメイン及び前記(i)の抗原性タンパク質をは（ａ）段階のキメラ抗原から由来し、(iii)抗体Fc断片の他の一側CH2及びCH3ドメイン及び前記(ii)のFab断片は（ｂ）段階の抗体から由来することがその特徴である。

好ましくは本願発明のFab腕交換融合タンパク質は、前記GA733-FcKキメラ抗原及びGA733-FcKキメラ抗原に特異的な抗体（つまり、前記CO17-1AK)において一部ドメインが融合されて生成されたものであって；具体的に、
(i)大腸癌細胞表面タンパク質であるGA733;
(ii)前記(i)のGA733タンパク質に特異的なIgG Fab断片；及び
(iii)IgG Fc断片を含む融合タンパク質でもあって、この際、(iii)IgG Fc断片の一側CH2及びCH3ドメイン及び前記(i)のGA733は（ａ）段階のGA733-FcKキメラ抗原から由来して、(iii)IgG Fc断片の他の一側CH2及びCH3ドメイン及び前記(ii)のFab断片は（ｂ）段階のGA733-FcKキメラ抗原に特異的な抗体（つまり、CO17-1AK）から由来する。

前記（ｃ）段階で生産された交配植物には、免疫原性複合タンパク質が植物細胞の中で発現するのがその特徴である。

前記本発明の“免疫原性複合タンパク質”とは、抗原のエピトープ及び抗体の抗原結合部位が結合して抗原−抗体複合体をなすことを意味するものであって、具体的に前記（ａ）段階のキメラ抗原タンパク質のエピトープ部位（以下、“抗原性部位”と称す）が前記（ｂ）段階抗体の抗原結合部位(ABS)で結合してタンパク質複合体をなすことを意味する。前記“抗原性タンパク質のエピトープ部位及び抗体の抗原結合部位が結合すること”は当該分野に知られていて、好ましくは非共有的結合によるものでもある。

前記の通り、本発明の免疫原性複合タンパク質は、抗原性部位のエピトープと抗体の抗原結合部位でのみ結合がなされるもので、前述した融合の意味とは区別される。

前記（ａ）段階のキメラ抗原及び（ｂ）段階の抗体２種の組み合わせは、抗原−抗体複合体の具体的な形態がこれに制限されないが、例えば、一つのキメラ抗原及び一つの抗体が結合されたキメラ抗原−抗体単分子（図１０ａに図示）、抗体が架橋役割をして、キメラ抗原ら間の連結を媒介（つまり、キメラ抗原と抗体が互いに交叉結合）する線型構造（図１０ｂに図示）及び前記キメラ抗原−抗体単分子が重合された多量体構造（例えば、前記キメラ抗原−抗体単分子の五量体構造）を図１１ａ及び図１１ｂに図示する。

さらに、本発明の免疫原性複合タンパク質は、前述したFab腕交換融合タンパク質を含めてなされるものでもあり得る。例えば、Fab腕交換融合タンパク質が２個結合された形態（図１０ｄに図示）、又はFab腕交換融合タンパク質のみでなされ、２個以上が結合された線型構造の形態（図１０ｅに図示）でもある。さらに、図１０ｆに示した通り、前述したキメラ抗原、これに特異的に抗体及びFab腕交換融合タンパク質が共に線形構造に結合された形態でもある。この際、本発明の免疫原性複合タンパク質の構造的多様性は前記Fab腕交換融合タンパク質が抗原とその抗原に特異的な抗原結合部位を同時に有する構造的特徴に起因する。

前記多様な免疫原性複合タンパク質組み合わせは、図１０乃至図１１で図示した通り、巨大タンパク質４次構造を有するようになる。

タンパク質の構造は１次、２次、３次及び４次構造に定義される。１次構造はタンパク質を構成するアミノ酸配列の情報を指称し、２次構造はアミノ酸残基(residue)などが集って一定したパターンの螺旋構造(helix)、屏風構造(strand)又は非定型構造(random coil)を表すことを意味する。さらに、３次構造は２次構造らが集まって全体的に立体的な構造を有することを意味し、４次構造は幾つかのタンパク質鎖が集まって互いに相互作用する形態を指称するものである。

従って、本発明の前記（ａ）乃至（ｃ）段階を含む方法は、これにより製造される免疫原性複合タンパク質らが、強い結合をなして前述した通り、線形構造又は環状構造に巨大な４次分子構造形態を形成する戦略を通じて窮局的にオプソニン(opsonization)と類似して樹枝状細胞に入り、効率的にantigen presentingになれるワクチン構造を植物体内で構築する効果が優れている。

これは本発明の実施例で良く現れる。

本発明の明細書実施例４では、本発明の免疫原性複合タンパク質が図１１に図示された通り、IgMと類似してキメラ抗原−抗体単分子の五量体構造で生成されることを確認し、実施例５において、本発明に伴う免疫原性複合タンパク質のワクチン効果が優れたことを確認した。

従って、本発明は前記（ａ）乃至（ｃ）段階を含む方法で製造された免疫原性複合タンパク質を生産する植物体を提供する。

前記免疫原性複合タンパク質は前述した通りであって、具体的にGA733-FcKキメラ抗原及びこれに特異的な抗体に対するキメラ抗原−抗体複合体でもあって、前記抗原−抗体複合体の組み合わせ（つまり、免疫原性複合タンパク質組み合わせ）及び形態に関しては前述した通りである。

さらに、本発明は前記植物体から由来された免疫原性複合タンパク質を提供する。

前記免疫原性複合タンパク質は前記（ａ）乃至（ｃ）段階を経て製造された植物体から収得されることを特徴とする。

前記“植物体からタンパク質を収得する”ことは公知の植物細胞由来タンパク質収得方法により行われ、これに制限されないが、例えば、交配植物を破砕及び粉砕して抽出バッファーに均質化する方法でもある。前記抽出バッファーは公知の植物タンパク質抽出バッファーによるものでもあって、これに制限されないが、例えば、リン酸緩衝食塩水(phosphate buffered saline、PBS)でもあって、又はトリスHCl pH 8、ジチオトレイトール(DTT)、プロテアーゼ抑制剤（例えば、アプロチニン(aprotinin)、ペプスタチン(pepstatin)、ルペプチン(leupeptine)、フェニルメチルスルホニルフルオライド(phenyl methyl sulphonyl fluoride)及び［(N-(N-(L-3-トランスカルボキシオキシラン(carboxyoxirane)-2-カボニル）-Lルシール）-アグマンチン(agmantine)]などを含む組成物でもある。

これにタンパク質精製過程を追加して含め得る。前記“タンパク質精製”とは、通常の方式で精製することができ、例えば、塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（アセトン、エタノールなどを利用したタンパク質分画沈殿）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィー及び限外濾過などの技法を単独又は組み合わせで適用させることができる(Deutschess M.、Guide to Protein Purification Methods Enzymology、vol.182.Academic Press.Inc.、San Diago、CA(1990))。前記タンパク質精製過程により本願発明の免疫原性複合タンパク質（つまり、巨大４次構造抗原−抗体複合体）のみを高濃度で収得することができる。

従って、本願発明の前記免疫原性複合タンパク質は具体的に下記のような段階を含む方法で製造することができる。
（ａ）抗原を発現する形質転換植物体を製造する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階の抗原に特異的な抗体を発現する形質転換植物体を製造する段階；
（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）段階の植物体を交配して交配植物を製造する段階；及び
（ｄ）前記交配植物からタンパク質成分を収得する段階；
さらに、前記方法を追加的に
（ｅ）前記（ｄ）段階で収得したタンパク質を精製する段階；を含むことができる。

本発明の免疫原性複合タンパク質の組み合わせ及び形態（構造）に対しては、前述した通りであって（図１０乃至図１１参照）、具体的に線形構造又は環状構造を全て含む形態である。好ましくは、免疫原性複合タンパク質は環状構造でもある。

本発明の免疫原性複合タンパク質は図１０乃至図１１に示した通り、巨大４次元構造(large quaternary structure)を有することがその特徴であって、線形構造を有する場合には単量体で存在するタンパク質よりサイズが大きく、環状構造を形成するための前段階であって、環状構造を有するタンパク質よりは小さいこともあり得る。本発明の免疫原性複合タンパク質が環状構造を有する場合において、好ましくは直径10nm乃至50nm、最も好ましくは、抗原提示にさらに好ましい直径20nm乃至30nmの大きさを有するものでもある。

本発明の免疫原性複合タンパク質は図１０乃至図１１に示した通り、巨大４次元構造を有することにより、免疫反応増幅(boosting)効果が優れる。特に従来問題とされてきた免疫補助剤を使用しなくても宿主動物において抗体生成能力が優れている。さらに、従来のin vitroで抗原と抗体を同一地点に置かれた時、生成される抗原−抗体結合よりも本願発明の植物交配により生成された抗原−抗体複合体は、さらに強力な結合で複合体をなしていて免疫増強効果が優れる。

従って、本発明は前記免疫原性複合タンパク質を含むワクチン組成物を提供する。

さらに、本発明は発現するワクチン製造の用途のための前記免疫原性複合タンパク質を提供する。

本発明で用語“ワクチン”又は“ワクチン組成物”とは、免疫応答(immuno response)を刺戟する組成物を意味するものであって、免疫原性組成物と同一な意味であって、本明細書で混用して使用される。前記ワクチンは予防ワクチンと治療ワクチンを全て含む。予防ワクチンは個体が抗原に露出される時、さらに大きい免疫反応を内在するようにするため、抗原を含む物質に露出される前に免疫反応を誘導し、従って、抗原を運ぶ物質又は細胞に抵抗する能力を増加させることを意味する。治療ワクチンはワクチンの抗原と関連した疾患を既に有している個体に投与する方式で使用されるもので、前記治療ワクチンは抗原を運ぶ疾患又は細胞と戦うための増加された能力を提供して抗原に対する個体の免疫反応を増加させることができる。

前記ワクチン組成物は本発明の前記免疫原性複合タンパク質を含むことをその特徴とする。従って、前記ワクチン組成物が目的とする対象疾患は前記免疫原性複合タンパク質に含まれる実質的な免疫反応ドメインにより決定され、例えば、前記免疫反応ドメインが腫瘍ー連関抗原の場合、本発明のワクチン組成物は当該腫瘍疾患の予防及び治療目的に投与される。

本発明のワクチン組成物は単独で投与するか、又は対象疾患を予防及び治療する効果を有する公知の化合物と並行して投与することができる。

本発明の前記ワクチン組成物は、ヒトを始めとした哺乳動物にどのような方法でも投与することができる。例えば、経口又は非経口的に投与することができる。非経口的な投与方法にはこれに限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、境膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻孔内、腸管、局所、舌下又は直腸内投与でもある。

本発明のワクチン組成物は前記免疫原性複合タンパク質を含むことを特徴とし、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を追加して含有できる。前記にて“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容されてヒトに投与された時、活性成分の作用を阻害せず、通常的に胃腸障碍、眩気症のようなアレルギー反応又はこれと類似した反応を起こさない非毒性の組成物を意味する。

前記“担体”とは、細胞又は組織内に化合物の付加を容易にする物質を意味する。薬学的に許容される担体には、例えば、経口投与用担体又は非経口投与用担体を追加して含むことができる。経口投与用担体はラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸などを含む。従って、ペプチド製剤に対する経口投与用に使用される多様な薬剤伝達物質を含むことができる。さらに、非経口投与用担体は、水、適合したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含むことができて、安定化剤及び保存剤を追加して含むことができる。適合した安定化剤には亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適合した保存剤にはベンズアルコニウムクロライド、メチル又はプロフィールパラベン及びクロロブタノールがある。本発明の薬学的組成物は前記成分ら以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤などを追加して含むことができる。その他の薬学的に許容される担体及び製剤は下記文献に記載されていることを参考にできる（Remington's Pharmaecutical Sciences、19th ed.、Mack Publishing Company、Easton、PA、1995)。

さらに、本発明は前記免疫原性複合タンパク質を必要とする個体に有効量で投与することを特徴とする免疫化方法を提供する。

前記“個体”とは、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物でもあって、動物から由来した細胞、組織、器官などでもある。前記個体は治療が必要な患者でもある。

前記“免疫化”とは、本発明に伴う免疫原性複合タンパク質を個体に投与した時、個体内で前記免疫原性複合タンパク質に対する分泌性、体液性及び／又は細胞性免疫反応が誘発されることで、このような免疫化を通じて対象疾患に対する予防及び治療効果が現れれる。

前記対象疾患は本発明による免疫原性複合タンパク質に含まれる抗原、つまり、実質的な免疫反応ドメインにより決定されるもので、疾病を誘発する抗原が知られている疾患、つまり、疾病誘発抗原を本発明の免疫原性複合タンパク質に含めて、予防や治療に有用に使用できるものであれば、どのようなものでも適用可能である。その種類にはこれに制限されないが、例えば、腫瘍疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、退行性疾患、ウイルス性又は細菌性肝炎、プリオン疾患(prion disease)、運動神経疾患(motor neuron disease, MND)、などでもある。

前記対象疾患は具体的には、黒色腫、アデノカルシノマ(adenocarcinoma)、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、前立腺癌、膀胱癌、結腸癌、大腸癌、睾丸癌、Ｂ細胞悪性腫瘍、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、筋肉癌、膵臓癌、能腫瘍、星芽細胞腫(astroblastoma)、膠芽細胞腫癌(glioblastoma)、乳房癌、脊索腫、アレルギー、喘息、多発性硬化症、糖尿病、リューマチス性関節炎、尿失禁、骨多孔症、アルツハイマ病、シヌクレイン(synuclein)、タンパク質異常により発生するルイ小体病、（lewy body disorder、LBD）、パーキンソン病、多発性神経系萎縮(multiple system atrophy、MSA)などの神経退行性疾患、後天性免疫欠乏症(AIDS)、Ｂ型又はＣ型感染ウイルスで誘発される感染、ヒトの乳頭腫ウイルスによる感染と、これにより誘発される腫瘍、肺炎クラミジア(Chlamydia pneumonia)による感染、大腸菌による感染、ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)が誘発する胃潰瘍、マラリア、結核、カンジダアルビカンス(Candida albicans)などカンジダによる感染、炭疽病、敗血症(sepsis)、変形クロイツフェルトヤーコブ病(variant Creutzfeldt-Jakob disease、vCJD)、スクレイピ病(scrapie)、筋萎縮性側削硬化症(amyotropic lateral sclerosis、ALS)などでもある。

好ましくは本発明に伴う免疫原性複合タンパク質の対象疾患は腫瘍疾患でもあって、さらに、好ましくは大腸癌又は結腸癌でもある。

前記“有効量”とは、本発明の免疫原性複合タンパク質の対象疾患に対する予防や治療効果を示す量であって、投与された個体から本発明の免疫原性複合タンパク質に対する分泌性、体液性及び／又は細胞性免疫反応を誘導するに十分な量を意味する。

本発明のタンパク質の総有効量は単一投与量で個体に投与することができ、多重投与量が長期間投与される分割治療方法により投与することができる。さらに投与目的により有効成分の含量を異にすることができる。前記有効用量は対象疾患の類形及び重症度、投与経路及び投与回数だけでなく、投与が必要な個体の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率など多様な要因などを考慮して、各個体に対する有効投与量が決定されるものであるため、当該分野の通常的な知識を有する者であれば投与目的によって適切な有効投与量を決定することができる。さらに、本発明に伴うタンパク質を投与した後、免疫細胞の活性を決定する検定方法、又は広く知られた生体内検定を使用して、療法の効能をモニタリングすることにより決定することもできる。本発明の薬学的組成物は本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特別な制限はされない。

本発明による免疫原性複合タンパク質の投与経路は前述した通りである。本発明の免疫原性複合タンパク質は薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に投与できる。前記担体、賦形剤又は希釈剤は前述した通りである。

本発明に伴う免疫原性複合タンパク質は、単独で投与するか又は対象疾患を予防及び治療する効果を有する公知の化合物と並行して投与することができる。

本発明の（ａ）乃至（ｃ）段階を含む形質転換植物の製造方法及び前記方法で製造された形質転換植物体を通じて安全で経済的に免疫原性複合タンパク質を大量生産することができる。さらに、前記植物体から収得した免疫原性複合タンパク質は巨大４次元構造を有することにより、免疫反応増幅効果が優れて免疫補助剤の使用無くとも宿主動物において抗体生成能力が優れている。

図１はキメラ抗原を図示するもので、具体的に大腸癌細胞表面特異タンパク質ーFc-(GA733-FcK)の構造を示す。 図２は抗原に対する単一特異性２価抗体を図示するもので、具体的に大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fcに特異的な抗体(CO17-1AK)の構造を示す。 図３は大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fc(GA733-FcK)と大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fcの抗体(CO17-1AK)をそれぞれ発現する植物体を他家受粉を通じてT1世代の植物を得る過程の模式図である。 図４はT1世代植物体(1乃至13番)らにおいて、PCRを利用して２種の遺伝子（GA733-FcKとCO17-1AK）を有する植物体を選別した結果を示す（GA：標準GA733-FcK、CO:標準mAb CO17-1AK、NT:Non-Transgenic plant、HC:CO17-1AKの重鎖、LC:CO17-1AKの軽鎖）。 図５はそれぞれ３、４、６、９及び11番植物体からそれぞれGA733-FcK遺伝子(A)とCO17-1AK遺伝子(B)の発現をウエスタンブロットで確認した結果である。 図６はSDS-PAGEを利用して、T1世代植物４番植物体において２種のタンパク質(GA733-FcKとCO17-1AK）の精製有無を確認した結果を示す。 図７はT1世代植物４番植物体において精製されたタンパク質サンプルからtwo color western blotで２種のタンパク質が同時に発現されたか否かを確認した結果を示す。 図８ａはsandwich ELISAにおいてcapture antibodyと抗原（本願発明のキメラ抗原、具体的にGA733-FcKタンパク質）との結合及び前記結合された抗原−抗体complexを認知するdetection antibodyの結合形態を表す模式図である(capture antibody:緑色で表示、detection antibody:青色で表示）。 図８ｂはsandwich ELISAにおいて、同一なcapture antibody(CO^M又はCO^P)上にそれぞれの相異するタンパク質試料（GA^P、GA^P＋CO^P、GA^P×CO^P）を処理してこれらの結合signalを対照した結果を示す。 図９aはGA^Pが固定されたchipにCO^M、CO^P、GA^P＋CO^P、GA^P×CO^P試料を処理して、SPR方法で測定した結果を示す。 図９ｂはCO^Pが固定されたchipにGA^M、GA^P、GA^P＋CO^P、GA^P×CO^P試料を処理して、SPR方法で測定した結果を示す。 図１０は本発明のT1世代植物から発現される免疫原性複合体タンパク質の内、線形構造を示す複合体構造を例示する。具体的に、図１０ａはT1世代植物から発現されるキメラ抗原−抗体複合体の内、最も簡単な形態のキメラ抗原−抗体二合体構造(dimeric form)を図示する。 図１０は本発明のT1世代植物から発現される免疫原性複合体タンパク質の内、線形構造を示す複合体構造を例示する。具体的に、図１０ｂはT1世代植物から発現されるキメラ抗原−抗体複合体の内、線形構造(linear form)のキメラ抗原−抗体複合体の一例を図示する。 図１０は本発明のT1世代植物から発現される免疫原性複合体タンパク質の内、線形構造を示す複合体構造を例示する。具体的に、図１０ｃはT1世代植物から発現される融合タンパク質の一例を図示するものであって、本明細書で“Fab腕交換融合タンパク質”と称する融合タンパク質の構造を示す。 図１０は本発明のT1世代植物から発現される免疫原性複合体タンパク質の内、線形構造を示す複合体構造を例示する。具体的に、図１０ｄは前記“Fab腕交換融合タンパク質”によるタンパク質二合体構造を示す。 図１０は本発明のT1世代植物から発現される免疫原性複合体タンパク質の内、線形構造を示す複合体構造を例示する。具体的に、図１０ｅは前記“Fab腕交換融合タンパク質”によるタンパク質複合体の内、線形構造でなされた複合体の一例を図示する。 図１０は本発明のT1世代植物から発現される免疫原性複合体タンパク質の内、線形構造を示す複合体構造を例示する。具体的に、図１０ｆは前記“Fab腕交換融合タンパク質”によるタンパク質複合体の内、線形構造でなされた複合体のさらに他の一例を図示する。 図１１は本発明のT1世代植物から発現される免疫原性複合体タンパク質の内、環状構造を示す複合体構造を例示する、具体的に、図１１ａはT1世代植物から発現されるキメラ抗原−抗体単分子が環状に重合された形態の内、五量体(pentamer)構造の一例を図示する。 図１１は本発明のT1世代植物から発現される免疫原性複合体タンパク質の内、環状構造を示す複合体構造を例示する、具体的に、図１１ｂはT1世代植物から発現されるキメラ抗原−抗体単分子が環状に重合された形態の内、五量体構造のさらに他の一例を図示する。 図１２はGA733-FcK（キメラ抗原）を発現するように形質転換された父母世代の植物体から収得したタンパク質試料の構造を電子顕微鏡で観察した様子を示す。写真の白色横棒で表示したscale barは10nmを示す。 図１３はT1世代植物から収得したタンパク質試料の構造を電子顕微鏡で観察した様子を示す。写真の白色横棒で表示されたscale barは10nmを示す。 図１４はそれぞれのタンパク質試料を免疫補助剤無しでマウスに注入した後、ワクチン接種効果（血清内抗体生成効果）をSPR方法で確認した結果を示す。 図１５はそれぞれのタンパク質でワクチン接種したマウスからインターロイキン-4(IL-4)の生成を確認した結果を示す。 図１６はそれぞれのタンパク質でワクチン接種したマウスからインターロイキン-10(IL-10)の生成を確認した結果を示す。 図１７はそれぞれのワクチン候補物質を投与したマウスらから収得した血清から抗-大腸癌抗体の活性を確認したものであって、経時による大腸癌の大きさを比較した結果を示す 図１８はGA^P(GA733-FcK)、CO^P(CO17-1AK)、GA^P×CO^P(GA733-FcK×CO17-1AK)を植物から精製して、それぞれの糖構造をmass分析したもので、他家受粉を通じて得たGA^P×CO^Pは父母世代の植物と類似した糖構造パターンを有していることを確認した結果を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみであり、本発明の内容は、下記実施例に限定されない。

＜実施例１＞
抗原発現形質転換植物及び抗体発現形質転換植物体の製造、
大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fc(GA733-FcK antigen)は、本発明の発明者による大韓民國登録特許10-1054851及びZhe Lu et al.に記載された発明と同一に製作された。

簡略に30-aa plant ER signal peptide（配列番号３）でN-terminal extensionされた大腸癌細胞表面特異タンパク質GA733（配列番号１）とIgG Fc Cターミナルに小胞体残留シグナルペプチド(ER retention signal,配列番号8）が追加されたhuman IgG Fc配列（配列番号６）をコーディングする遺伝子らを配置して、GA733-FcK再組み合わせ融合タンパク質（配列番号９）を発現できるように遺伝子配列を配列した（配列番号10参照）。コリフラワーモザイクウイルス(caulifower mosaic virus、CaMV)35S promoterと煙草エッチウイルス 5-leader sequence(tobacco etch viral 5-leader sequence、TEV)をGA733-FcK遺伝子配列の前に位置させて発現カーセットを構築した。このように構築された大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fc発現カーセットを制限酵素HindIIIを使用してpBINPlusベクターに挿入して植物発現ベクターを製作した。

前記大腸癌細胞表面特異タンパク質(GA733)に対する抗体で知られたmAb CO17-1A(重鎖：配列番号11、軽鎖：配列番号13参照）を植物から発現させるために、前記mAb CO17-1AのIgG重鎖のＣ−ターミナルに小胞体残留シグナル遺伝子配列を追加し、これをmAb CO17-1AK(重鎖：配列番号12、軽鎖：配列番号13）に命名した。前記mAb CO17-IAKの重鎖及び軽鎖をコーディングする遺伝子配列をpBI121植物発現ベクターに挿入する。前記重鎖遺伝子の前にコリフラワーモザイクウイルス35S promoterとアルファルファモザイクウイルスアントランスレートリーダーシーケンス(alfalfa mosaic virus untranslated leader sequence、AMV)遺伝子を位置するように挿入する。さらに、potato proteinase inhibitor II promoter(Pin2p)を軽鎖遺伝子の前に挿入して発現カーセットを構築した。このように構築された重鎖及び軽鎖発現カーセットをHindIIIとEcoRIで制限酵素を処理して植物発現ベクターpBI121に入れる。

前記にて製造された植物発現ベクターは電気穿孔法(electroporation)を利用してAgrobacterium tumefaciensにそれぞれ導入し、挿入された遺伝子を保有するAgrobacteriumを選別及び培養した。培養されたAgrobacteriumに煙草の若葉を1〜3cm程度の傷を付けて入れた。さらに、植物の葉は固体植物培地に移した後、カルス(callus)が生成できるようにNAA(naphthaleneacetic acid)、BA(6-benzyl-amino-purine)などのホルモンとカナマイシン(100mg/L)が添加されたMurashige and Skoog solid medium(Dachfu、Haariem、Natherland)に培養した。培養３〜４週後に新たなtransformant植物らが生成された。

<実施例２>
抗原発現植物体及び抗体発現植物体の交配及び父母世代の形質を同時に発現する１世代植物体スクリーニング．

前記実施例１で生産された大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fc(GA733-FcK antigen)を発現する植物体の花の蕾に人為的に大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fcのantibody(mAb CO17-1AK antibody)の雄しべを付けて他家受粉する（図３参照）。前記他家受粉を通じて得た種子を23℃の条件で発芽及び植物体を誘導して総13個のT1世帯(GA733-FcK x CO17-1AK)植物体らを収得した。前記T1世代植物体らにおいて、PCR方法を利用して２種の遺伝子有無を確認して、一つの植物個体から２種の遺伝子を有する植物らを選別するスクリーニングをした（図４参照）。具体的な方法は下記の通りである。

大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fcを発現する植物と大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fcのantibodyを発現する植物、さらに、この二つの植物を他家受粉を通じて得た植物の葉からgenomic DNAをDneasyKit(Qiagen)を利用して分離精製した。植物の葉は、ほぼ90〜100gを採取して液体窒素を入れて瞬間的に凍結後破砕した。破砕後Dneasy Kit製造社の方法により純粋な植物genomic DNAを精製した。分離したそれぞれのgenomic DNAを鋳型にして、大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fcのプライマーと大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fcのantibodyの重鎖及び軽鎖のプライマーを利用してPCRを行った。葉から分離したgenomic DNA(1μl)とiTaq premix(intron biotechnol.)を混合して10pmol/μl濃度でGA733-FcKのforward primer 5'-GTCGACACGGCGACTTTTGCCGCAGCT-3'（配列番号17）とreverse primer 5'-GAGTTCATCTTTACCCGGGGACAG-3（配列番号18）を共に入れた。PCRの反応条件は94℃で30秒、67℃で30秒、72℃で30秒のdenaturation-annealing-elongation過程を30回繰返して行った。同じ方法でmAb CO17-1AKの重鎖forward primer 5'-ATGGAATGGAGCAGAGTCTTT-3'（配列番号19）とreverse primer 5'-ATCGATTTTACCCGGAGTCCG-3（配列番号20）、さらに、CO17-14Kの軽鎖forward primer 5'-ATGGGCATCAAGATCGAATCA-3'（配列番号21）とreverse primer 5'-ACACTCATTCCTGTTGAAGCT-3'（配列番号22）を利用してPCRをそれぞれ行った。
その結果、図４に示した通り、４番、６番、11番の植物体においてGA733-FcK及びCO17-1AKが全て発現したことを確認した。

<実施例３>
選別されたT1世代植物体から遺伝子発現確認
前記実施例２で選別された植物を対象に下記の通り抗原及び抗体の発現を確認した。

<３−１> ウェスタンブロット
前記実施例１の形質転換植物GA733-FcK、CO17-1AK及び前記実施例２のGA733-FcK×CO17-1AK（T1世帯植物など）のそれぞれより、100mgの新鮮な葉を採取して300μlの１×PBSに入れた後、十分に破砕した。破砕した葉の上層液を10%SDS-PAGEゲルに電気泳動をした。ニトロ繊維素膜(nitrocellulose)にtransferを経た後、5%のスキムミルクを利用して４℃で16時間blockingをした。Secondary antibodyはそれぞれanti-EpCAM/TROP1(R&D systems)とanti-mouse IgG H+L(Bethyl)を1:5000比率で希釈して処理した。1xPBSバッファーで10分ずつ３回membrane washingをした。Membraneにあるバッファーを除去した後、Supersignal chemiluminescence substrate(ThermoFisher)を処理して反応させた後、X-RAYフィルームに感光した。

前記ウェスタンブロット実験を通じてT1世代の内、４番、６番、11番の植物体から抗原（図５Ａ）と抗体（図５Ｂ）が全て同時に高い発現率を有することを確認した。

<３−２> 電気泳動及びtwo color western blot
前記実施例３−１で、抗原と抗体が全て発現が確認された植物の内、４番植物体をin vivo condition(greenhouse)で育てた。形質転換された植物の葉を利用して精製後蛋白質のmolecular sizeを通じて確認し、two color western blotを通じて２種の遺伝子を発現する植物体を確認した。具体的な実験方法は下記の通りである。

試験管内条件で確認した植物個体4、6、11 lineを育苗用上土(sunshine mix5)（真土）に植えた。グリーンハウスの温度は7〜9月平均34℃であり、湿度は64% RHであった。植物が成体になって花が咲いた時、葉だけを集めて収穫して氷点下70℃で保管した。さらに、集めた葉を利用して抗原−抗体蛋白質を精製した。植物精製は蛋白質 G column(GE healthcare)を使用して行った。それぞれの試料からGA^Mは前記GA733蛋白質とR&D systems社で販売する“Anti-Human EpCAM/TROP1 MAb［Clone 158210］(Mouse IgG2A、CATALOG# MAB960)”を使用して前記実施例１と同一な方法で製作したキメラ抗原蛋白質であって、CO^Mはマウス由来のmAb^M CO17-1Aを意味し、GA^P(GA733^P-FcK)、CO^P mAb^P CO17-1AK)、GA^P x CO^P (GA733^P -FcK x mAb^P CO17-1AK)は、前記実施例１及び実施例２でそれぞれのキメラ抗原と、これに対する抗体を発現する植物とこれらの他家受粉を通じて得た植物から収得した再組み合わせタンパク質である。SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)を10%ゲルを作り、前記それぞれのタンパク質試料らに対して電気泳動を行った。

Two color western blotは、精製されたそれぞれの試料GA^M(GA733とAnti-Human EpCAM/TROP1 MAbのキメラ抗原）、CA^P(GA733^P-FcK)、CO^M(mAb^M CO17-1A)、CO^P(mAb^P CO17-1AK)、GA^PxCO^P(GA733^P-FcK×mAb^P CO17-1AK)の0.5μg/μl濃度を8μlと5x loading buffer 2μlを混合する。10% SDS-PAGEを電気泳動を行い、ニトロ繊維素膜にtransferを経て、5%のスキムミルクバッファーにmenbraneを4℃で16時間blockingをした。Secondary antibody処理はgoat anti-human IRDye 800 CW(LI-COR)とgoat anti-mouse IRDye 680 LT(LI-COR)を1:15000比率でskim milkと混合して室温で16時間処理した。1xPBSバッファーで10分ずつ３回membane washingをした。さらに、membraneのバッファーを除去後、赤外線イメージシステムOdyssey(LI-COR) detectorを使用してタンパク質バンドを確認した。

その結果、前記SDA-PAGEを利用してT1世代植物からGA733-FcKとCO17-1AKの２種のタンパク質が精製されたことを確認した（図６参照）。さらに、T1世代植物から精製されたサンプルをTwo color western blotして、GA733-FcKとCO17-1AKの２種のタンパク質が同時に発現することを確認した（図７参照）。

<実施例４>
タンパク質の形態及び構造確認

<４−１> Sandwich ELISAを通じたタンパク質複合体構造予測
さらに、前記実施例３−２で精製したサンプルを使用してSandwich ELISAを行った。

具体的に96well plateそれぞれのwellにcapture antibodyとして、CO^M(mAb^M CO17-1A)、又はCO^P(mAb^P CO17-1AK)を5ng/μl濃度で100μlずつ分株して４℃でovernightさせた。バインディングされていない抗体を除去するために、wellから前記において処理した溶液を除去した後、1xPBSでplate wellを３回washingを行った。さらに、3% BSA溶液を150μlずつ分注して４℃でovernightを行った。処理した3% BSAを除去後、1xPBSで200μlずつ３回wellをwashingし、植物より精製したantigen GA^P (GA733^P-FcK)、GA^P＋CO^P(GA733^P-FcK＋mAb^P CO17-AK、植物から精製された同量のタンパク質をin vitro上で混合したもの）、GA^PxCO^P(GA733^P-FcK x mAb^P CO17-1AK、T1世代４番植物から精製されたタンパク質）を試料別700ng、350ng、125ng、62.5ngを処理した後、37℃で１時間30分間incubationさせた。さらに、1xPBSで３回washingを繰返した。Detection antibodyであるanti-human Fc-HRP(Jackson ImmunoReseach Labs)と3% BSA溶液を1:10000比率でそれぞれwellに150μlずつ分注して室温で２時間incubationさせた。Incubation後TMB(3.3、5.5-tetramethylbenzidine) substrate(KPL)を処理した。さらに、吸光度450nmで結果を確認した。前記Sandwich ELISAでcapture antibodyと抗原(本願発明のキメラ抗原、具体的にはGA733-FcKタンパク質)との結合及び前記結合された抗原−抗体complexを認知するdetection antibodyの結合形態を図８ａに示した。

その結果、図８ｂに示した通り、GA^P及びGA^P＋CO^Pより、GA^P×CO^Pから高い吸光度値を得た。特に、GA^P＋CO^Pの吸光信号はGA^Pに比べて小さかったが、これはGA^P×CO^PがGA^Pと比べて高い吸光度を示したことと対比されるものとして、GA^P＋CO^Pでは巨大４次構造が生成できなかったことを示す。これにより、一般的に、in vitro上で抗原及び抗体の人為的結合によって生成される抗原−抗体複合体よりは、本願発明の前記T1世代形質転換植物(特に4番植物体)で精製されたタンパク質の抗原−抗体複合体が強力なcomplexを成し、巨大分子を形成しているものと推定した。

<４−２> 表面プラスモン共鳴(SPR)を通じたタンパク質複合体構造予測
本発明の前記T1世代形質転換植物(特に4番植物体)から精製されたタンパク質の抗原−抗体複合体が強力なcomplexをなし、巨大分子を形成していることを証明するため、GA又は抗-GA抗体でコーティングされたSPR chipでSPRを行った。具体的にSPRはProteOn XPR36 sulface instrument(Bio-Rad)を利用して行われた。Amine coupling chemistryを利用するGLC sensor chip(Bio-Rad)に製造社のプロトコルによってGA^M(R&D systems)又はCO^Mを固定した。RU(resonance unit)は約16001800であった。chipの安定化は60秒間100μl/minの流量でPBS-T bufferを流しながら行われた。pH6.0状態で固定されたレセプターに対して25℃、50μl/minの流量でそれぞれの試料(15μg/ml)を流した。それぞれの測定後にsensor chipの表面はphosphoric acidを使用して再生された。全ての実験においてデータなどは０及び標準チャンネルによって調整された。分解及び速度定数はProteon Manager(Bio-Rad)を使用して計算された。

その結果、図９ａに示した通り、GAでコーティングされたSPR chipにおいて、GA^P×CO^P及びGA^P＋CO^Pのkinetic signalはCO^P及びCO^Mと比べてかなり低かった。それに加えて図９ｂに示した通り、抗GA抗体でコーティングされたSPR chipにおいてGA^P×CO^Pの信号水準がGA^P＋CO^Pより低かった。これは本発明のT1世代植物において巨大４次構造をなす抗原−抗体複合体が生成されたことを裏付ける。

<４−３> 電子顕微鏡観察
前記実施例４−１及び実施例４−２の結果からT1世代植物において、図１０乃至図１１の巨大４次構造らが現れてくるものと予測され、これを確認した。

具体的には、前記実施例１で製作された父母世代の抗原発現植物体(GA733-FcK antigen)と、前記実施例２で製作した子孫T1世代の植物体から収得したタンパク質試料それぞれに対して、染色及び電子顕微鏡でタンパク質構造と形態を確認した。タンパク質サンプルは１時間かけて37℃でincubationした。遠心分離した後、透過電子顕微鏡(TEM)の見本準備用PBSに再分散させた。サンプル溶液はglow ejectionで、親水性を有する炭素フイルームコーティングされたTEM gridにローデイングした。90秒後、過多なサンプル溶液は蒸留水で洗い流した。陰性染色のため、1%のuranyl acetateをgridに１分間ローデイングした後、過多な染色溶液は濾紙で拭き取った。サンプルはbio-transmission electron microscopeで撮影した。

図１２は、父母世代の植物体から発現されたGA733-FcKタンパク質(抗原)の構造を示し、図１３は前記GA733-FcKとこれに対する抗体(CO17-1AK)が同時に発現されたT1世代の植物体から収得したタンパク質の構造を電子顕微鏡で確認した結果を示す。図１２に示した通り、前記GA733-FcKタンパク質はＹ状(~15nm)及び多様な形態が観察され、単独で存在する抗原タンパク質が観察された。さらに、図１３に示した通り、前記T1世代の植物体から収得したタンパク質試料では図１１に示す環状の環状構造(20nm乃至30nm)が観察され、球状の構造と30nm以上の集合体も観察された。

前記結果を通じて大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fc(GA733-FcK antigen)を発現する植物と、前記大腸癌細胞表面特異タンパク質-Fcのantibody(mAb CO17-1AK antibody)を発現する植物の他家受粉を通じて生産された子孫世代の植物体から抗原と抗体が多様な形態の巨大４次構造を有する複合体をなしていることが分かる。

<実施例５>
ワクチン効果測定
<５−１> ワクチン接種に伴う免疫化測定（体内抗体生産量測定）
マウスに４種のタンパク質試料を注入してワクチン接種の効果を確認した。

本実験で使用された４種のタンパク質試料は下記の通りである：GA^M（GA733タンパク質とR&Dsystems社で販売する“Anti-Human EpCAM/TROP1 MAb [Clone 158210](Mouse IgG2A、CATALOG#.MAB960)”を使用して前記実施例１と同一な方法で製作したキメラ抗原タンパク質）、GA^P(GA733^P-FcK)、GA^M＋CO^M（GA733とAnti-Human EpCAM/TROP1 MAbのキメラ抗原及びmAb^M CO17-1Aの同量のタンパク質をin vitro上で混合したもの）、GA^P×CO^P(GA733^P-FcK×mAb^P CO17-1AK)

各グループ当り５匹のマウスを使用して、免疫補助剤無しで前記４種のタンパク質試料を注入した。対照群には1xPBSを投与した。試料を注入後各グループの血清を収得して実施例４−２のように、表面プラスモン共鳴方法で各グループ別血清内で生成された抗体の量を確認した。簡単に表面プラスモン共鳴はゴールドチップの上に大腸癌候補タンパク質GA^P(GA733-FcK)を付けた後、前記にてワクチン接種をしたマウスらの血清をそれぞれ10μlずつ流した。

マウスの血清内に生成された抗体の量を測定して、グループ別の差を確認した結果、図１４に示した通り、1xPBS(negative control)を注入したマウスの血清が最も低いsignalを示し、GA^PxCO^Pが他の実験群に比べて高い数値を示し、GA^PxCO^Pが他のワクチン候補群に比べて高い免疫反応を誘導することを確認した。特にin vitro上で製造した免疫複合体であるGA^M＋CO^Mの投与効果と比べて、本発明で植物体から収得した免疫複合体であるGA^PxCO^Pが優れた免疫増強効果を示すことを確認し、このような結果は従来in vitro上で抗原と抗体を同一地点に置いた時、生成される抗原−抗体結合より、本願発明の植物交配により生成された抗原−抗体複合体がより強力な結合により複合体をなしていることに起因するものと思われる。

<５−２> 免疫細胞活性化測定（サイトカイン生成測定）
前記実施例５−１で、ワクチン接種されたそれぞれのマウスの脾臓を摘出して培地のように破砕して、樹枝状細胞と抗原であるGA733-FcKを共に共同培養した。共同培養されたフラスコを37℃で３日間培養した。培養後、IL-4及びIL10に対してFACSを利用して測定した。本実験はT cellのCD4+が活性化されたかを確認した実験であって、CD4+はclassic Th1/Th2/Th17反応に分けることができ、IL-4とIL-10はTh2に含まれる因子である。

その結果、図１５乃至図１６で示した通り、1xPBS、GA^M、GA^P又はGA^M＋CO^Mで、免疫化されたマウスと比べて、GA^P×CO^Pを注入したマウスの脾臓から最も高いIL-4とIL-10サイトカイン数値を示した。これはGA^P×CO^Pを注入したマウスからＴ細胞活性化が増加されたことを提示する。この結果を通じて本発明の巨大分子抗原−抗体複合体がCD4＋を高めて、さらには抗体形成にも影響を与えるものであることを確認できた。

<５−３> in vivo癌成長抑制効果比較
ヒトの結腸癌細胞であるSW620細胞(1 x 10⁶ cell)を６週令BALB nu/nu mice（各グループ当り３匹ずつ、Japan SLC Inc.、Humamatsu、Shizuoka、Japan)の背に皮内(i.d.)接種して腫瘍移植マウスモデルを製作した。1×PBS、GA^M、GA^P、GA^M＋CO^M又はGA^P×CO^Pにそれぞれ免疫化されたBALB/c miceから収得された血清40μlを前記腫瘍異種移植マウスモデルの６個グループに３日間隔で総４回に渡って腹腔内注射した（７日間総160μl投与）。陽性対照群グループには精製したmAb CO17-1A(CO^M)を100μg注射した。腫瘍の成長つまり、腫瘍の嵩は最初ガン細胞注入日以後、8、10、12及び15日目に記録され、graduated calipersで測定された３個の主要な径に基づいて下記の式により計算された；(mm³)=width×length×height。

前記実験結果を図１７に示す。SW620ヒトの結腸ガン細胞が異種移植され、1×PBS、GA^M、GA^P、GA^M＋CO^M又はGA^P×CO^Pに、それぞれ免疫化されたBALA/c miceから収得した血清を注入したヌードマウスにおいて、腫瘍の症候は最初のガン細胞移植後から８日目に現れた。それ以降は他の実験群と比べて1×PBS処理群の腫瘍の大きさは急速に成長した。GA^P×CO^P血清又はCO^P血清投与群と比べてGA^M血清、GA^P血清、GA^M＋CO^M血清投与群では腫瘍がかなり早く成長し、15日目にGA^P×CO^P血清投与群の腫瘍の大きさは他の実験群に比べてかなり小さく、GA^P×CO^P血清投与群におけるこのような腫瘍成長抑制効果はCO^P血清投与群と類似した。

<実施例６>
１世代タンパク質の糖組成分析
GA^P、CO^P及びGA^P×CO^PのN-glycan profileを比較するために、mass分析を行った。

父母世代(GA^P、CO^P)及びT1世代(GA^PxCO^P)の植物からそれぞれ精製された再組み合わせタンパク質サンプルらを、まず、ペプシンを利用して糖ペプチドに分解した。PNGas A(Roche)を使用して前記糖ペプチドからN-glycanを放出させ、Carbograph(Alltech)からのgraphitized carbon resinを使用して前記放出されたN-glycanを精製した。90μl dimethyl sulfoxide(DMSO)、2.7μl water及び35μl iodomethane混合溶液に前記精製されたglycanを再懸濁した後、spin column method(Goetz JA et al.、2009)を利用してsolid phase permethylationを行った。このようにして収得したpermethylated glycanを同量の10mg/mL 2、5-dihydroxybenzoic acid溶液(1mM sodium acetate solutionで製造)と混合した。前記混合物をmetrix-assisted laser-desorption-inoization(MALDI)MSP96 ground steel target plateに適用して乾燥した後、MAHDI-TOF mass spectrometryを行った。全てのmass spectraは20KVの加速電圧から収得された。

図１８に示した通り、mass分析結果、全てのサンプルらにおいて、オリゴマンノスグリカン(oligomannose glycan、Man79)が存在することを確認した。CO^Pは主にMan7のグリカン構造を有し、GA^PはMan79 オリゴマンノスグリカン構造を有することを確認した。CO^P及びGA^Pのように、GA^P×CO^Pもオリゴマンノスグリカン構造を有している。さらに、GA^P×CO^PにおいてMan7及びMan9の相対的比率はCO^P及びGA^Pのそれぞれを合わせたものと類似した。これにより、T1世代で発現された免疫複合体は父母世代等のタンパク質とほぼ同一なグリカン構造を含有することが分かる。

以上説明した通り、本発明は免疫原性複合タンパク質を生産する形質転換植物体の製造方法及びこれより収得した免疫原性複合タンパク質に関するもので、さらに、詳細には（ａ）抗原を発現する形質転換植物体を製造する段階；（ｂ）前記（ａ）段階の抗原に特異的な抗体を発現する形質転換植物体を製造する段階；（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）段階の植物体を交配して交配植物を製造する段階を含む免疫原性複合タンパク質を生産する形質転換植物の製造方法、前記方法により製造された植物体及び前記植物体から収得した免疫原性複合タンパク質に関するものである。

本発明の（ａ）乃至（ｃ）段階を含む形質転換植物の製造方法及び前記方法で製造された形質転換植物体を通じて安全で経済的に免疫原性複合タンパク質を大量生産することができる。さらに、前記植物体から収得した免疫原性複合タンパク質(抗原−抗体複合体)は巨大４次元構造を有することにより、免疫反応増幅効果が優れて免疫補助剤の使用無くとも、宿主動物において抗体生成能力が優れている。

Claims (18)

1. （ａ）抗原を発現する形質転換植物体を製造する段階；
   （ｂ）前記（ａ）段階の抗原に特異的な抗体を発現する形質転換植物体を製造する段階；
   （ｃ）前記（ａ）段階の植物体及び前記（ｂ）段階の植物体を交配して交配植物を製造する段階を含む免疫原性複合タンパク質を生産する形質転換植物の製造方法。
2. 前記抗原は下記の(i)及び(ii)を含むキメラ抗原であることを特徴とする請求項１記載の方法；
   (i)抗原性タンパク質を含む免疫反応ドメイン(immune response domain)；及び
   (ii)抗体Fc断片(Fc antibody fragment)を含む標的結合ドメイン(target binding domain)。
3. 前記(ii)の標的結合ドメインは免疫グロブリン蝶番領域(hinge region)、重鎖CH1ドメイン又はリンカーを追加的に含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
4. 前記（ａ）段階の抗原は大腸ガン細胞表面タンパク質であるGA733であることを特徴とする請求項１記載の方法。
5. 前記(ii)の抗体Fc断片はGA733に特異的なIgGの蝶番領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
6. 前記（ａ）段階の抗原は配列番号９で表示されるGA733-FcKキメラ抗原であることを特徴とする請求項１記載の方法。
7. 前記（ｂ）段階の抗体は単一クロン抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
8. 前記（ｂ）段階の抗体は２価抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
9. 前記（ｂ）段階の抗体は配列番号12で表示される重鎖及び配列番号13で表示される軽鎖を含む、GA733-FcKキメラ抗原に特異的な抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
10. 前記（ａ）段階の抗原及び前記（ｂ）段階の抗体は小胞体貯蔵誘導配列を含むことを特徴とする請求項１乃至請求項９のいずれか一つの項に記載された方法。
11. 前記植物は煙草であることを特徴とする請求項１記載の方法。
12. 請求項１記載の方法で製造された免疫原性複合タンパク質を生産する植物体。
13. 前記免疫原性複合タンパク質はGA733-FcKキメラ抗原及びこれに特異的な抗体の抗原−抗体複合体であることを特徴とする請求項１２記載の植物体。
14. 請求項１２記載の植物体から収得された免疫原性複合タンパク質。
15. 前記免疫原性複合タンパク質はキメラ抗原−抗体単分子構造、前記キメラ抗原−抗体単分子が重合された五量体及びキメラ抗原と抗体が互いに交叉結合された線形構造からなる群より選ばれた一つ以上のものであることを特徴とする請求項１４記載の免疫原性複合タンパク質。
16. 請求項１４記載の免疫原性複合タンパク質及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含むワクチン組成物。
17. ワクチン製造の用途のための請求項１４記載の免疫原性複合タンパク質。
18. 請求項１４記載の免疫原性複合タンパク質をこれを必要とする動物（ヒトを除く）に有効量で投与することを特徴とする免疫化方法。