BR112013018516B1

BR112013018516B1 - Construto de expressão de ácido nucleico, método de produção de uma proteína alfa-galactosidase humana recombinante, proteína alfagalactosidase humana, composição farmacêutica, e, uso de uma proteína alfagalactosidase humana ou de uma composição

Info

Publication number: BR112013018516B1
Application number: BR112013018516-3A
Authority: BR
Inventors: Avidor Shulman; Uri Hanania; Tali Kizhner; Yoseph Shaaltiel
Original assignee: Protalix Ltd
Priority date: 2011-01-20
Filing date: 2011-09-07
Publication date: 2023-11-07
Also published as: DK3272861T3; LT3272861T; PT3272861T; ES2774190T3; EP3272861B1; US9732333B2; SI3272861T1; AU2011356137A1; CA2824791A1; CN103443270B; RS60129B1; KR20140015330A; JP5913372B2; IL227552A0; CN103443270A; WO2012098537A8; IL227552B; BR112013018516A2; JP2014506450A; US20130295065A1

Abstract

construto de ácido nucléico para expressão de alfa-galactosidase em plantas e células de plantas são apresentados construtos de expressão de ácido nucléicos e, mais especificamente, construtos de ácido nucléicos para expressão de alfa-galactosidase humana em células de planta, as plantas expressando o construto de ácido nucléico, produzindo a alfa-galactosidase humana, e seus usos.

Description

CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção, em algumas de suas configurações, se refere a um construto de expressão de ácido nucléico e, mais especialmente, mas não exclusivamente, a um construto de ácido nucléico para expressão de α-galactosidase em células de plantas, células expressando o construto de ácido nucléico e a α-galactosidase humana e seus usos.

[002] A doença de Fabry é uma doença do armazenamento lisossomal ligada ao cromossomo X que é causada pela atividade deficiente da enzima α-galactosidase A (α-Gal A). Pacientes portadores da doença de Fabry clássica normalmente possuem uma atividade da α -Gal A abaixo de 1% e frequentemente apresentam o espectro total dos sintomas, incluindo dores graves nas extremidades (acroparestesias), hipo-hidrose, alterações córneas e lenticulares, lesões na pele (angioceratoma), insuficiência renal, doenças cardiovasculares, insuficiência pulmonar, sintomas neurológicos e derrames. Na doença de Fabry atípica, indivíduos com atividade residual da enzima apresentam sintomas tardios na vida, e os sintomas ficam normalmente limitados a um ou alguns poucos órgãos. Manifestações clínicas em portadoras fêmeas variam bastante devido à inativação randômica do cromossomo X. Embora as portadoras comumente permaneçam assintomáticas ao longo de suas vidas, muitas apresentam sintomas clínicos como variável e grave em comparação àqueles dos machos. De Duve sugeriu primeiramente que a substituição da enzima lisossomal faltante com enzima exógena biologicamente ativa poderia ser uma abordagem viável no tratamento de doenças do armazenamento lisossomal [Fed Proc. 23:1045 (1964)].

[003] A α-Galactosidase A recombinante para terapia de substituição da enzima foi produzida em células de inseto (sf9) (vide US 7.011.831) e fibroblasto humano (vide US 6.395.884) e em células de plantas (vide US 6.846.968 e WO2008/132743). Foram realizados estudos clínicos com α -Gal A recombinante (agalsidase beta [Fabrazyme®]: Genzyme Corporation, Cambridge, Mass; agalsidase alfa [Replagal®]: Shire Human Genetic Therapies Corporation, Cambridge, Mass), e os dois medicamentos foram aprovados para uso clínico. A partir de 2009, mais de 2000 pacientes foram tratados com cada uma das duas formulações disponíveis e, no geral, foram apresentadas segurança e eficácia para ambos (Hoffmann, Orphanet J Rare Dis. 2009; 4:21).

[004] A experiência clínica indicou que as composições de enzima recombinante disponíveis diferem com relação à tolerância do paciente, imunogenicidade, regime da dose e eficácia clínica (Hoffmann, Orphanet J Rare Dis. 2009; 4:21). Outra desvantagem associada à existência de enzimas recombinantes são seus custos, os quais podem implicar em uma sobrecarga econômica considerável nos sistemas de saúde. O alto custo dessas enzimas recombinantes, quando produzidas em culturas celulares mamíferas, biorreatores ou células de insetos resulta em um protocolo complexo de purificação e modificação, e os valores relativamente grandes da terapia necessária para tratamentos pré-existentes. Há, portanto, uma necessidade urgente de reduzir o custo da α-galactosidase, de forma que essa terapia de salvamento de vidas possa ser fornecida de forma mais economicamente viável a todos que dela necessitem.

[005] Enzimas lisossomais humanas podem ser produzidas em plantas transgênicas para resolver os problemas de segurança, infecções virais, reações imunológicas, rendimento de produção e custos. O pedido de patente US 2002/0088024 ensina a expressão em células de plantas de α- galactosidase humana recombinantes, utilizando um peptídeo sinal de endereçamento a RE de amilose de arroz, e uma sequência codificadora de α- galactosidase humana truncada na região C-terminal para expressão eficiente e secreção no fluido intracelular.

[006] O pedido de patente WO 97/10353 ensina a produção de enzimas lisossomais em plantas, especificamente IDUA e glucocerebrosidase, utilizando o promotor MeGA induzido por ferimento e tag FLAG para recuperação. O pedido de patente WO 97/10353 não apresenta diretrizes para estruturas específicas expressando α-galactosidase humana recombinante.

[007] Cramer et al. (Curr. Topics Trans. 1999 Plantas 95-118) revisa os métodos de expressão da glucocerebrosidase e IDUA em plantas de forma similar ao pedido de patente WO 97/10353, ou seja, a endomembrana (IF) das folhas de tabaco, e descreve a expressão de planta em geral, mas não apresenta diretrizes para expressão de α-galactosidase humana recombinante.

[008] O pedido de patente US-2006 0204487 ensina os métodos para expressão de enzimas lisossomais humanas em plantas, empregando uma variedade de estratégias para endereçar os polipeptídeos recombinantes (especificamente, glucocerebrosidase) para glicosilação eficiente e remodelação da glicana. Não é divulgada a clonagem e expressão da α- galactosidase humana recombinante a partir de estruturas específicas.

[009] O pedido de patente WO2007/010533 ensina a administração de células de plantas expressando moléculas bioativas recombinantes, por exemplo, enzimas lisossomais como a glucocerebrosidase e a α-galactosidase humana. Não é divulgada a clonagem e expressão da α-galactosidase humana recombinante.

[0010] O WO2008/132743 descreve a clonagem de uma sequência de codificação de α-galactosidase humana em um vetor de expressão de planta e sua expressão em células de tabaco, resultando em uma enzima α- galactosidase glicosilada de comprimento total, biologicamente ativa que apresentou absorção em fibroblastos. Contudo, são necessários vetores de expressão de α-galactosidase mais avançados para eficiência da expressão ainda maior e produção de proteína α-galactosidase humana recombinante possuindo farmacocinética melhorada em condições clínicas.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0011] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provida uma estrutura de expressão de ácido nucleico, a estrutura compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína α-galactosidase humana, em que a proteína α-galactosidase humana é fusionada traducionalmente no terminal N a um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático da ABPI de Arabidopsis e em que a proteína α-galactosidase humana é fusionada traducionalmente no terminal C a um peptídeo sinal de retenção no retículo endoplasmático.

[0012] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provida uma proteína α-galactosidase humana possuindo resíduo de glicina no terminal N, em que a proteína α-galactosidase humana é fusionada traducionalmente no terminal C a um peptídeo sinal de retenção no retículo endoplasmático.

[0013] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácido nucleico compreende o SEQ ID NO: 22.

[0014] De acordo com algumas configurações da invenção, o peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático da ABPI Arabidopsis é como mostrado no SEQ ID NO: 4.

[0015] De acordo com algumas configurações da invenção, a estrutura de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando o peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático como mostrado no SEQ ID NO: 5.

[0016] De acordo com algumas configurações da invenção, o peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático como mostrado no SEQ ID NO: 6.

[0017] De acordo com algumas configurações da invenção, a estrutura de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático como mostrado no SEQ ID NO: 19.

[0018] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácido nucleico é a sequência como a mostrada no SEQ ID NO: 2.

[0019] De acordo com algumas configurações da invenção, a proteína α-galactosidase humana tem uma sequência de aminoácidos como a mostrada no SEQ ID NO: 1.

[0020] De acordo com algumas configurações da invenção, a utilização do códon da sequência de ácido nucleico é otimizada para Nicotinia tabaccum.

[0021] De acordo com alguns aspectos de algumas configurações da invenção é provida uma célula isolada compreendendo a estrutura de ácido nucleico da invenção.

[0022] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula produz de maneira recombinante a enzima α-galactosidase humana.

[0023] De acordo com algumas configurações da invenção, a α- galactosidase humana compreende um resíduo de glicina no terminal N.

[0024] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula é uma célula vegetal.

[0025] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula hospedeira é uma célula tabaco.

[0026] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula de tabaco é uma célula BY-2.

[0027] De acordo com algumas configurações da invenção, a proteína α-galactosidase humana é produzida de maneira recombinante de modo a ter pelo menos um resíduo de manose exposto.

[0028] De acordo com algumas configurações da invenção, a proteína α-galactosidase humana é produzida de maneira recombinante de modo a ter pelo menos uma xilose de núcleo β-(1,2) ou pelo menos uma fucose de núcleo α-(1,3) ou ambas.

[0029] De acordo com algumas configurações da invenção, a estrutura de ácido nucleico é integrada de maneira estável no genoma da célula.

[0030] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula é uma célula de Agrobacterium tumefaciens.

[0031] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método para produção de uma proteína α- galactosidase recombinante humana, compreendendo: prover uma célula de acordo com a invenção; e cultivar a célula de modo a produzir a proteína α- galactosidase humana recombinante; e isolar a proteína α-galactosidase humana recombinante da célula.

[0032] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula é uma célula isolada cultivada em meio de cultura de célula.

[0033] De acordo com algumas configurações da invenção, a cultura é realizada em um biorreator descartável.

[0034] De acordo com algumas configurações da invenção, a proteína α-galactosidase humana tem uma sequência de aminoácidos como a mostrada no SEQ ID NO: 16.

[0035] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica compreendendo, como ingrediente ativo, a proteína α-galactosidase humana da presente invenção e um portador farmaceuticamente aceitável.

[0036] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica compreendendo como ingrediente ativo, a célula da presente invenção e um portador farmaceuticamente aceitável.

[0037] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica compreendendo como ingrediente ativo, uma população de proteínas α-galactosidase humanas da invenção, em que as estruturas de glicano predominantes de referida população de proteínas α-galactosidase humanas são manose 4-β-(1,2) xilose (M4X); manose 3-β-(1,2) xilose-α-(1,3) fucose [Fc(3)M3X] e manose 8 (M8) e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0038] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método para tratar a doença de Fabry em um indivíduo que precisar desse tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da invenção.

[0039] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica compreendendo a proteína α-galactosidase humana da invenção, possuindo uma estrutura de glicano compreendendo nove resíduos de manose, em que três são resíduos de manose expostos e um portador farmaceuticamente aceitável. A proteína α- galactosidase humana possuindo uma estrutura de glicano compreendendo nove resíduos de manose, em que três são resíduos de manose expostos e podem ser 0,5%, 0,8%, 1,0%, 1,3%, 2% ou mais da população de proteínas α- galactosidase humanas da composição.

[0040] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método para tratamento da doença de Fabry em um indivíduo que precisar, compreendendo administrar ao indivíduo a composição farmacêutica que compreende a célula da invenção.

[0041] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido o uso da proteína α-galactosidase humana da invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento da doença de Fabry em um indivíduo que precisar.

[0042] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e/ou científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado comumente entendido por alguém com habilidade na técnica ao qual pertence à invenção. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no ensaio de configurações da invenção, métodos e/ou materiais exemplificativos são descritos abaixo. Em caso de conflito, o relatório da patente, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não se destinam a ser necessariamente limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0043] Algumas configurações da invenção são aqui descritas a título de exemplo somente, com referência aos desenhos anexos. Com referência específica agora aos desenhos em detalhes, destaca-se que os detalhes mostrados são ilustrados a título de exemplo e com o objetivo de propiciar uma discussão ilustrativa das configurações da invenção. A esse respeito, a descrição feita com base nos desenhos torna evidente para aqueles com habilidade na técnica como as configurações da invenção podem ser colocadas em prática.

Nos desenhos:

[0044] A figura 1 é um alinhamento da sequência de aminoácidos da α-galactosidase codificada pelo ácido nucleico da invenção (SEQ ID NO: 1, sequência inferior) e proteína α-galactosidase nativa humana (GenBank: X05790, sequência superior), incluindo o peptídeo líder sinal nativo (SEQ ID NO: 3, destacado em vermelho). O peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI de Arabidopsis (SEQ ID NO: 4) é destacado em verde. O peptídeo sinal de retenção no retículo endoplasmático SEKDEL (SEQ ID NO: 6) está localizado no terminal C da proteína expressa na planta. A sequência da proteína enzimática α-galactosidase nativa madura (SEQ ID NO: 7) é destacada em amarelo.

[0045] A figura 2 é uma imagem digital de um gel para SDS-PAGE ilustrando os níveis de expressão de diversas estruturas de α-galactosidase humana em plantas. Extratos de folhas de plantas N. benthamiana infiltrados com diferentes estruturas de α-galactosidase humana foram separados em um gel reduzido a 12% para SDS-PAGE e pigmentados com Azul de Coomassie para visualização da proteína. Posição 1 = produtos da expressão de uma estrutura (SEQ ID NO: 8) codificando uma α-galactosidase com peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de pectinase da maçã (peptídeo sinal de pectinase da maçã = SEQ ID NO: 9). Posição 2 = produtos de expressão do SEQ ID NO: 2, codificando uma α-galactosidase com um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático (peptídeo sinal ABPI = SEQ ID NO: 4). Posição 3 = produtos de expressão do SEQ ID NO: 11, codificando o SEQ ID NO: 12 com um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de pectinase da maçã (SEQ ID NO: 9). Posição 4 = Controle negativo (sem sequência de codificação de α-galactosidase). A banda saliente na posição 2 (seta) corresponde ao tamanho do monômero de α-galactosidase recombinante maduro (SEQ ID NO: 21). A banda pigmentada com Coomassie indica proteína α-galactosidase abundante; A figura 3 é um histograma que demonstra os níveis de atividade catalítica em extratos de plantas que expressam diversas estruturas de α-galactosidase humana. Folhas de plantas N. benthamiana foram infiltradas com diferentes estruturas de α-galactosidase humana como segue: A= SEQ ID NO: 8, codificando uma proteína α-galactosidase com peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de pectinase da maçã (peptídeo sinal de pectinase da maçã = SEQ ID NO: 9). B = SEQ ID NO: 2, codificando uma α-galactosidase com um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático (peptídeo sinal ABPI SEQ ID NO: 4). C = SEQ ID NO: 13, codificando uma proteína α-galactosidase com peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de endoquitinase B (proteína sinal de endoquitinase = SEQ ID NO: 14) . D = SEQ ID NO: 11, codificando uma proteína α-galactosidase (SEQ ID NO: 12) com um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de pectinase da maçã (sequência sinal de pectinase da maçã = SEQ ID NO: 9). Folhas das respectivas plantas foram extraídas em tampão de ensaio de atividade e a atividade catalítica foi determinada utilizando p-nitrofenilalfa-D-galactopiranosida (pNP-alfa-D-Gal, GBB1290, IRIS Biotech, Alemanha) como substrato de hidrólise. A geração do cromóforo de p-nitrofenolato foi monitorada a 405 nm; A figura 4 é um gráfico comparando a estabilidade de duas α- galactosidases recombinantes humanas de planta no plasma humano (37 °C) medida pela atividade catalítica residual. A α-galactosidase das folhas de plantas N. benthamiana transformada com o SEQ ID NO: 11, codificando o SEQ ID NO: 12 com um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de pectinase da maçã (quadrados abertos) e a α-galactosidase das folhas das plantas N. benthamiana transformada com o SEQ ID NO: 2, codificando uma α-galactosidase (SEQ ID NO: 1) possuindo um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI (quadrados fechados) foram purificadas por dilaceração de planta, colocação em solução salina e cromatografia e incubadas em plasma humano a 37 °C por até 1 hora, para simular a farmacocinética in vivo. As amostras foram analisadas para atividade catalítica da α-galactosidase pelo ensaio PNP-G nos intervalos indicados. Observe a maior estabilidade da α-galactosidase de folhas de plantas N. benthamiana expressando o SEQ ID NO: 1 (quadrados fechados); A figura 5 é um gráfico comparando a estabilidade da atividade catalítica da α-galactosidase expressa nas células vegetais (quadrados fechados) com a atividade da α-galactosidase recombinante humana comercial expressa em cultura de células humanas (Replagal®, triângulos abertos). O extrato não purificado de células BY2 expressando o SEQ ID NO: 2, codificando uma α-galactosidase (SEQ ID NO: 1) possuindo um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI (quadrados fechados) e a α-galactosidase recombinante humana expressa na cultura de células de mamífero (Replagal®, triângulos abertos) foram incubados em plasma a 37 °C por até 1 hora, para simular a farmacocinética in vivo. As amostras foram analisadas para atividade catalítica da α- galactosidase pelo ensaio PNP-G nos intervalos indicados. Observe a estabilidade semelhante das enzimas expressas nas células vegetais e a das enzimas expressas nas células humanas; A figura 6 é um gráfico comparando a estabilidade da atividade catalítica da α-galactosidase expressa em planta (quadrados fechados) à estabilidade da α-galactosidase recombinante humana comercial expressa na cultura de células humanas (Replagal®, triângulos abertos). O extrato não purificado de células BY2 expressando o SEQ ID NO: 2, codificando uma α-galactosidase (SEQ ID NO: 1) possuindo um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI (quadrados fechados) e α-galactosidase recombinante humana expressa na cultura de células de mamíferos (Replagal®, triângulos abertos), foram incubadas em condições que simulam o ambiente lisossomal [ácido (pH 4,6)] a 370C por até 11 dias. As amostras foram analisadas para a atividade catalítica da α- galactosidase pelo ensaio PNP-G nos intervalos indicados, quando incubadas. Observe a estabilidade semelhante das enzimas expressas na planta e a das enzimas expressas nas células de mamíferos por até 9 dias; A figura 7 é um cromograma mostrando a distribuição de estruturas de glicanos nos produtos de digestão de glicosilase da α- galactosidase expressa nas células vegetais. As amostras de extrato de células BY2 expressando a SEQ ID NO: 2, codificando uma α-galactosidase (SEQ ID NO: 1) possuindo um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI foram reduzidas, alquiladas e separadas em SDS- PAGE. As bandas de proteína foram retiradas para análise de glicanos pela digestão de tripsina seguida de digestão de PNGase A e PNGase F. Os glicanos livres resultantes foram extraídos, purificados, marcados com antranilamida reagente florescente (2AB), separados utilizando HPLC em fase normal com Amido em gel TSK 80 e detectados utilizando um detector de fluorescência. Observe os picos maiores a 5,9 e 8,9 GU (84,55 minutos e 108,05 minutos) e um pico menor de M9 a 112,35; A figura 8 é uma tabela mostrando o perfil de glicanos da α- galactosidase expressa em células vegetais, como área percentual dos glicanos individuais representados no cromograma da figura 7. Observe os perfis idênticos de cada análise independente (A e B).

DESCRIÇÃO DAS CONFIGURAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[0046] A presente invenção, em algumas de suas configurações, refere-se a um vetor de expressão para expressão recombinante de α- galactosidase humana em células vegetais, métodos para sua expressão em células vegetais e a α-galactosidase humana produzida por meio destes.

[0047] Deve-se compreender que a invenção não está necessariamente limitada em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na descrição que se segue ou nos Exemplos. A invenção é passível de outras configurações ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras.

[0048] Os presentes inventores construíram um vetor de expressão para expressão recombinante de α-galactosidase humana em células vegetais, plantas de tabaco transformadas e células vegetais com o vetor e isolaram a α- galactosidase humana cataliticamente ativa das plantas e culturas de célula. A α-galactosidase humana recombinante expressa manteve a atividade catalítica favorável em condições que simulam aquelas normalmente encontradas na administração in vivo, sugerindo melhor farmacocinética simulada em comparação a outra α-galactosidase recombinante humana derivada de planta e semelhante às da α-galactosidase humana recombinante expressa em células de mamíferos (Replagal®).

[0049] Portanto, de acordo com um aspecto da presente invenção, é provida uma estrutura de expressão de ácido nucleico, a estrutura compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína α- galactosidase humana, em que a proteína α-galactosidase humana é fusionada traducionalmente no terminal N a um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI de Arabidopsis e em que a proteína α- galactosidase humana é fusionada traducionalmente no terminal C a um peptídeo sinal de retenção no retículo endoplasmático.

[0050] Como aqui utilizado, o termo "proteína α-galactosidase humana" refere-se a um polipeptídeo de α-galactosidase humana A (a-D- galactosídeo galactoidrolase; EC 3.2.1.22; a-Gal A). De acordo com algumas configurações da invenção, a proteína α-galactosidase humana é a proteína α- galactosidase humana madura, possuindo a sequência de aminoácidos apresentada no SEQ ID NO: 7 (A-Gal humana madura). Deve-se verificar que a proteína α-galactosidase humana pode ser uma proteína α-galactosidase humana modificada possuindo uma sequência de aminoácidos diferente daquela do SEQ ID NO: 7. Um exemplo não limitador de uma proteína α- galactosidase humana modificada codificada pelo vetor de expressão da invenção é o SEQ ID NO: 16 (G-A-Gal). Em outro exemplo não limitador a proteína α-galactosidase humana codificada pelo vetor de expressão pode ser uma mistura de proteínas α-galactosidase humanas compreendendo proteínas α-galactosidase possuindo resíduo de glicina (G) no terminal N, como, por exemplo, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 21, como também sem resíduo de glicina no terminal N, como, por exemplo, sem limitação, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 20.

[0051] De acordo com outro aspecto da invenção, a proteína α- galactosidase humana é fusionada traducionalmente no terminal N a um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI de Arabidopsis e a proteína α-galactosidase humana também é fusionada traducionalmente no terminal C em um peptídeo sinal de retenção de retículo endoplasmático.

[0052] Como aqui utilizado o termo "fundido traducionalmente no terminal N" ou "fundido traducionalmente no terminal C" refere-se à fixação covalente do peptídeo indicado via ligação de peptídeo no aminoácido terminal N ou terminal C da proteína α-galactosidase humana madura geralmente como resultado da expressão recombinante.

[0053] Como aqui utilizado, o termo "peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI de Arabidopsis" refere-se à sequência de peptídeo líder da proteína de ligação de auxina da Arabidopsis thaliana (Uni-Prot Acesso N° P33487), que é capaz de direcionar a proteína expressa ao retículo endoplasmático dentro da célula vegetal. Em uma configuração, o peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI de Arabidopsis é um polipeptídeo de 33 aminoácidos como mostrado no SEQ ID NO: 4.

[0054] Como aqui utilizado, o termo "peptídeo sinal de retenção no retículo endoplasmático" refere-se a uma sequência de peptídeos que, quando presente no término N ou término C de um polipeptídeo, faz com que o polipeptídeo seja recuperado do aparelho de Golgi e retido no retículo endoplasmático (veja Rayon et al. Journal of Experimental Botany, Vol. 49, N.° 326, pp. 1463-1472, 1998; e Neumann, et al - Annals of Botany, 2003; 92:167-180). Em uma configuração, o peptídeo sinal de retenção no retículo endoplasmático é KDEL (SEQ ID NO: 17) ou SEKDEL (SEQ ID NO: 6). Outros sinais do retículo endoplasmático vegetal adequados são conhecidos na técnica (veja Pagny et al, Journal of Experimental Botany, Vol. 50, pp. 157-64). Portanto, de acordo com uma configuração da presente invenção, a proteína α-galactosidase humana fusionada traducionalmente no terminal-N em um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI Arabidopsis e a proteína α-galactosidase humana fusionada traducionalmente no terminal C a um peptídeo sinal de retenção no retículo endoplasmático possuem uma sequência de aminoácidos como a mostrada no SEQ ID NO: 1.

[0055] Conforme utilizado no presente, o termo "sequência de ácido nucleico" refere-se a uma sequência única ou dupla de ácido nucleico que é isolada e apresentada na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), uma sequência de polinucleotídeo genômica e/ou sequências de polinucleotídeos compostas (por exemplo: uma combinação do exposto acima).

[0056] Conforme aqui utilizada, a frase "sequência complementar de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência que resulta da transcrição reversa do RNA mensageiro utilizando uma transcriptase reversa ou qualquer outra DNA polimerase dependente do RNA. Essa sequência pode ser subsequentemente amplificada in vivo ou in vitro utilizando uma DNA polimerase dependente do DNA.

[0057] Conforme aqui utilizada, a frase "sequência genômica de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência derivada (isolada) a partir de um cromossomo e, assim, representa uma parte contígua de um cromossomo.

[0058] Conforme aqui utilizada, a frase "sequência composta de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência que seja pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. Uma sequência composta pode incluir algumas sequências exonais necessárias para codificar o polipeptídio da presente invenção, bem como algumas sequências intrônicas que se interpõem entre elas. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, inclusive de outros genes, e tipicamente incluirão sequências de sinal de splicing conservadas. Essas sequências intrônicas podem ainda incluir elementos reguladores de expressão de ação cis.

[0059] De acordo com algumas configurações da presente invenção, as sequências de ácido nucleico codificando os polipeptídeos da presente invenção são otimizadas para expressão. Exemplos de tais modificações de sequência incluem, mas não se limitam a, um conteúdo G/C alterado para abordar mais de forma mais próxima aquele tipicamente encontrado em espécies de plantas de interesse, e a remoção de códons encontrados atipicamente em espécies de plantas comumente referidas como otimização de códon. Em uma configuração, a utilização de códon da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína α-galactosidase humana fusionada traducionalmente no terminal N em um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI Arabidopsis e a proteína α-galactosidase humana e fusionada traducionalmente no terminal C em um peptídeo sinal de retenção no retículo endoplasmático é otimizada para a Nicotiana tabaccum ou Nicotiana benthamiana.

[0060] A frase "otimização de códon" refere-se à seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para uso dentro de um gene estrutural ou fragmento deste que se aproxima do uso do códon dentro de uma planta de interesse. Portanto, um gene ou sequência de ácido nucleico otimizado refere- se a um gene no qual a sequência de nucleotídeo de um gene nativo ou de ocorrência natural foi modificada para utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro de uma planta. A sequência de nucleotídeo é tipicamente analisada pelo nível do DNA e pela região de codificação otimizada para expressão na espécie de planta determinada utilizando qualquer procedimento adequado, por exemplo, conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). Neste método, o desvio padrão do uso do códon, uma medida do desvio do uso do códon, pode ser calculado primeiramente encontrando-se o desvio proporcional quadrado do uso de cada códon do gene nativo em relação àquele de genes de planta altamente expressos, seguido de um cálculo do desvio quadrado médio. A fórmula utilizada é: 1 SDCU = n = 1 N [ ( Xn - Yn) / Yn ] 2 / N, onde Xn refere-se à frequência de uso do códon em genes de planta de alta expressão, onde Yn refere-se à frequência de uso do códon no gene de interesse e N refere-se ao número total de códons no gene de interesse. Uma Tabela do uso de códon a partir de genes altamente expressos de plantas dicotiledôneas é compilada utilizando os dados de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498).

[0061] Um método de otimização da sequência de ácido nucleico, de acordo com o uso de códon preferido para um tipo de célula de planta em particular, é feito com base no uso direto, sem a realização de quaisquer cálculos estatísticos adicionais ou das Tabelas de otimização de códon, como aquelas providas on-line na base de dados de uso de códon do banco de DNA do NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences [Instituto Nacional de Ciências Agrobiológica]) no Japão (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) kazusa (dot) ou (dot) jp/codon/) . A base de dados de uso de códon contém tabelas de uso de códon para diversas espécies diferentes, onde cada tabela de uso de códon foi estatisticamente determinada com base nos dados presentes no Genbank.

[0062] Utilizando as Tabelas acima para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos para cada aminoácido em uma espécie em particular (por exemplo, arroz), uma sequência de nucleotídeo de ocorrência natural que codifica uma proteína de interesse pode ser o códon otimizado para aquela espécie de planta em particular. Isso é afetado pela substituição de códons que podem ter uma baixa incidência estatística no genoma da espécie em particular com códons correspondentes, com relação a um aminoácido, que são estatisticamente mais favorecidos. No entanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para excluir locais de restrição existentes, para criar novos locais em junções potencialmente úteis (terminações 5' e 3' para adicionar peptídeo de sinal ou cassetes de terminação, locais internos que podem ser utilizados para cortar e unir segmentos para produzir uma sequência de comprimento total correta), ou para eliminar sequência de nucleotídeos que podem afetar negativamente a estabilidade ou a expressão do mRNA.

[0063] A sequência de nucleotídeo de codificação desejada pode, antes de qualquer modificação, conter um número de códons que corresponde a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie de planta em particular. Portanto, a otimização de códon da sequência nativa de nucleotídeo pode compreender a determinação de quais códons, dentro da sequência desejada de nucleotídeo, não são estatisticamente favorecidos em relação a uma planta em particular, e a modificação desses códons de acordo com uma tabela de uso de códon da planta em particular para produzir um derivado de códon otimizado. Uma sequência modificada de nucleotídeo pode ser totalmente ou parcialmente otimizada para uso de códon da planta contanto que a proteína codificada pela sequência modificada de nucleotídeo seja produzida em um nível mais elevado que a proteína codificada pelo gene correspondente de ocorrência natural ou nativo. A estrutura de genes sintéticos por meio da alteração do uso de códon é descrita, por exemplo, no pedido de patente PCT 93/07278.

[0064] De acordo com algumas configurações da invenção, a proteína α-galactosidase humana é codificada por uma sequência de ácido nucleico como a mostrada no SEQ ID NO: 18. De acordo com outras configurações da invenção, o peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI Arabidopsis é codificado por uma sequência de ácido nucleico como a mostrada no SEQ ID NO: 5. De acordo ainda com outras configurações da invenção, o peptídeo sinal de retenção de retículo endoplasmático é codificado por uma sequência de ácido nucleico como a mostrada no SEQ ID NO: 19. De acordo ainda com outras configurações da invenção, a proteína α-galactosidase humana fusionada traducionalmente no terminal N em um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de ABPI Arabidopsis e a proteína α-galactosidase humana fusionada traducionalmente no terminal C em um peptídeo sinal de retenção de retículo endoplasmático são codificadas por uma sequência de ácido nucleico como a mostrada no SEQ ID NO: 2.

[0065] Como aqui utilizado o termo "estrutura de expressão de ácido nucleico" se refere a uma estrutura de ácido nucleico que inclui o ácido nucleico de algumas configurações da invenção (por exemplo: SEQ ID NO: 2) e pelo menos um promotor para direcionar a transcrição de ácido nucleico em uma célula vegetal hospedeira. Mais detalhes da abordagem de transformação adequada são fornecidos abaixo.

[0066] De acordo com algumas configurações da invenção, é provida uma estrutura de expressão de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico da invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico em uma célula vegetal hospedeira.

[0067] De acordo com algumas configurações da invenção, o ácido nucleico é operavelmente ligado à sequência do promotor.

[0068] Uma sequência de ácido nucleico codificadora é "operavelmente ligada" a uma sequência reguladora (por exemplo: promotor) se a sequência reguladora for capaz de exercer um efeito regulatório sobre a sequência codificadora ligada a ela.

[0069] Qualquer sequência promotora adequada pode ser utilizada pela estrutura de ácido nucleico da presente invenção. De forma preferencial, o promotor é um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido ou induzível.

[0070] Como aqui utilizada, a expressão "expressivo da planta" refere-se a uma sequência de promotor, incluindo quaisquer elementos reguladores adicionais adicionados ou contidos, pelo menos capazes de induzir, conferir, ativar ou melhorar a expressão em uma célula de planta, tecido ou órgão, de preferência, célula, tecido ou órgão de planta monocotiledônea ou dicotiledônea. Esse promotor pode ser constitutivo, ou seja, capaz de direcionar alto nível de expressão genética em uma pluralidade de tecidos, tecido específico, ou seja, capaz de direcionar a expressão genética em um tecido ou tecidos em particular, induzível, ou seja, capaz de direcionar a expressão genética sob estímulo ou quimérica, ou seja, formada de porções de pelo menos dois promotores diferentes.

[0071] Exemplos de promotores preferidos úteis para os métodos de algumas configurações da invenção são apresentados nas Tabelas I, II, III e IV. Tabela I Exemplos de promotores constitutivos para uso na realização de algumas configurações da invenção Tabela II Exemplos de promotores de semente preferidos para uso na realização de algumas configurações da invenção Tabela III Exemplos de promotores específicos de flores para uso na realização da invenção Tabela IV Promotores de arroz alternativos para uso na realização da presente invenção

[0072] De acordo com uma configuração específica, o promotor utilizado pela presente invenção é um promotor constitutivo forte de modo que a superexpressão dos insertos da estrutura seja obtida após a transformação. Em certas configurações, o promotor é o promotor Arabidopsis Actin 2 (ACT2) (Acesso N°: U41998, vide Tabela I acima).

[0073] A estrutura de ácido nucleico de algumas configurações da invenção pode ainda incluir um marcador selecionável adequado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas configurações da invenção, a estrutura de ácido nucleico utilizada é um vetor-ponte, que pode se propagar tanto em E. coli (onde a estrutura compreende um marcador selecionável adequado e uma origem de replicação) e pode ser compatível com a propagação em células. A estrutura de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmídeo, um fagómido, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

[0074] A estrutura de ácido nucleico de algumas configurações da invenção pode ser utilizada para transformar as células de planta de forma estável ou temporária. Na transformação estável, o ácido nucleico é integrado no genoma da planta e, dessa forma, representa uma característica estável e herdada. Na transformação temporária, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, porém não é integrado no genoma e, dessa forma, representa uma característica temporária.

[0075] Portanto, de acordo com alguns aspectos da presente invenção, é provida uma célula isolada compreendendo a estrutura de ácido nucleico da invenção.

[0076] Como aqui utilizado, o termo "célula isolada" se refere a uma célula pelo menos parcialmente separada do ambiente natural, por exemplo, de uma planta. Em algumas configurações, a célula isolada é uma célula vegetal de uma planta inteira. Em algumas configurações, a célula isolada é uma célula vegetal, por exemplo, uma célula vegetal em cultura.

[0077] O termo "planta", conforme aqui utilizado, abrange plantas totais, ancestrais e progênie de plantas e partes de plantas, incluindo sementes, brotos, caules, raízes (incluindo tubérculos), bem como células, tecidos e órgãos de plantas. A planta pode estar em qualquer forma, inclusive culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calos, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos. As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluindo uma forrageira ou legume forrageiro, planta ornamental, cultivo de alimento, árvore, ou arbusto selecionado da lista que compreende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Fiemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratíssima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobíum stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargo, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve de folha, linhaça, couve, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba, cana de açúcar, girassol, tomate, abóbora espaguete, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilha, lentilha e alfafa, algodão, semente de colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela, eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, uma grama perene e um cultivo de forragem. Alternativamente, algas e outras espécies não Viridiplantae podem ser utilizadas para os métodos da presente invenção.

[0078] De acordo com algumas configurações da invenção, a planta utilizada pelo método da invenção são plantas de cultivo tais como arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, palmeira de óleo, banana, soja, girassol, canola, cana de açúcar, alfafa, painço, leguminosas (feijão, ervilha), linho, lupinus, colza, tabaco, cholpo e algodão.

[0079] De acordo com outras configurações, as células vegetais incluem células de tabaco, célula de raiz transformada por Agrobacterium rhizogenes, célula de salsão, célula de gengibre, célula de raiz forte e células de cenoura. Em uma configuração, as células de tabaco são de uma linha de células de tabaco, como, por exemplo, entre outras, células de Nicotiana tabacum L. cv Bright Yellow (BY-2) (Nagata et al, Int Rev Cytol 1992;132:l- 30). As células vegetais podem ser cultivadas de acordo com qualquer tipo de método de cultura adequado, incluindo, mas não se limitando à cultura em superficie sólida (como, por exemplo, um vaso de cultura plástico ou prato) ou em suspensão. Deve-se observar que algumas células, como as células BY- 2 e células de cenoura podem ser cultivadas e produzidas em suspensão. Dispositivos e métodos adequados para cultivar células vegetais em suspensão são conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito nos Pedidos de Patente Internacionais PCT WO98/13469, WO2005/080544 e WO2007/010533. Em outra configuração, as células são células de plantas de tabaco inteiras ou tecidos vegetais, incluindo, mas não se limitando à Nicotiana benthamiana.

[0080] Há diversos métodos de se introduzir genes estranhos tanto em plantas monocotiledôneas quanto em dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).

[0081] Os métodos básicos para realizar a integração estável de DNA exógeno no DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais: (i) Transferência de gene mediada por agrobactérias: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S, and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112. (ii) Captação direta de DNA: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para absorção direta de DNA em protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Captação de DNA induzida por rápido choque elétrico de células de planta: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de DNA em células de planta ou tecidos por bombardeamento de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pelo uso de sistemas de micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; fibras de vidro ou transformação de whisker com carbeto de silício de culturas celulares, embriões ou tecido de calos, Patente dos EUA N° 5.464.765 ou pela incubação direta de DNA com pólen germinativo, DeWet et al. em Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, Londres, (1985) p. 197-209; and Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

[0082] O sistema de Agrobacterium inclui o uso de vetores de plasmídeo que contêm segmentos definidos de DNA que se integram no DNA genômico da planta. Os métodos de inoculação do tecido da planta variam dependendo da espécie de planta e do sistema de liberação da agrobactéria. Uma abordagem amplamente utilizada é o procedimento de disco de folha que pode ser realizado com qualquer explante de tecido que ofereça uma boa fonte para o início de toda a diferenciação da planta. Vide, por exemplo, Horsch et al. em Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem emprega o sistema de liberação de agrobactéria em combinação com infiltração a vácuo. O sistema de Agrobacterium é especialmente viável na criação de plantas dicotiledôneas transgênicas.

[0083] Há vários métodos de transferência direta de DNA em células de planta. Na eletroporação, os protoplastos são rapidamente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente nas células utilizando micropipetas muito pequenas. No bombardeamento de micropartículas, o DNA é adsorvido em microprojéteis, por exemplo, cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio, e os microprojéteis são fisicamente acelerados em células ou tecidos de planta.

[0084] Após a transformação estável, é realizada a propagação da planta. O método mais comum de propagação de planta é por semente. A regeneração por propagação de semente, no entanto, tem uma deficiência. Devido à heterozigosidade, há uma ausência de uniformidade no cultivo, uma vez que as sementes são produzidas por plantas de acordo com as variâncias genéticas regidas pelas leis de Mendel. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma crescerá com suas próprias características específicas. Portanto, é preferido que a planta transformada seja produzida de modo que a planta regenerada tenha as características idênticas e as características da planta transgênica precursora. Assim, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação, que gera uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.

[0085] A micropropagação é um processo de crescimento de plantas de nova geração a partir de um único pedaço de tecido que foi retirado de uma planta precursora selecionada ou cultivar. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas tendo o tecido preferido que expressa a proteína de fusão. As plantas de nova geração que são produzidas são geneticamente idênticas e possuem todas as características da planta original. A micropropagação permite a produção em massa de material de planta de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta original transgênica ou transformada. As vantagens da clonagem de plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e uniformidade das plantas produzidas.

[0086] A micropropagação é um procedimento de múltiplos estágios que exige a alteração do meio de cultura ou das condições de crescimento entre os estágios. Assim, o processo de micropropagação envolve quatro estágios básicos: Estágio um, cultura inicial do tecido; estágio dois, multiplicação da cultura do tecido; estágio três, diferenciação e formação da planta; e estágio quatro, cultura e endurecimento em estufa. Durante o estágio um, a cultura inicial do tecido, a cultura do tecido é definida e certificada como livre de contaminantes. Durante o estágio dois, a cultura inicial do tecido é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido seja produzido para atender os objetivos de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecido cultivadas no estágio dois são divididas e cultivadas em pequenas plantas individuais. No estágio quatro, as pequenas plantas individuais transformadas são transferidas para uma estufa para endurecimento onde a tolerância das plantas à luz aumenta gradualmente, de modo que possa ser cultivada no ambiente natural.

[0087] De acordo com algumas configurações da invenção, as plantas transgênicas são geradas por transformação temporária de células de folha, células meristemáticas ou toda a planta.

[0088] A transformação temporária pode ser realizada por qualquer um dos métodos de transferência direta de DNA descritos acima ou por infecção viral utilizando vírus de planta modificados.

[0089] Os vírus que demonstraram ser úteis para a transformação dos hospedeiros da planta incluem CaMV, vírus do mosaico do tabaco (TMV), vírus do mosaico do bromo (BMV) e vírus do mosaico comum do feijoeiro (BV ou BCMV). A transformação de plantas utilizando vírus de plantas é descrito na Patente dos EUA N.° 4.855.237 (vírus do mosaico dourado do feijoeiro; BGV), EP-A 67,553 (TMV), Pedido Japonês Publicado 63-14693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York, pp. 172-189 (1988). Partículas de pseudovírus para uso na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas, são descritos na WO 87/06261.

[0090] De acordo com algumas configurações da invenção, o vírus utilizado para as transformações temporárias é não virulento e, assim, incapaz de causar graves sintomas, tais como menor taxa de crescimento, mosaico, manchas em anel, enrolamento da folha, amarelamento, aparecimento de listras, formação de erupções, formação de tumor e formação de furos. Um vírus não virulento adequado pode ser um vírus não virulento de ocorrência natural ou um vírus atenuado artificialmente. A atenuação do vírus pode ser realizada utilizando-se métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, entre outros, aquecimento sub-letal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese orientada conforme descrito, por exemplo, por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Gal-on et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et al. (1994).

[0091] Cepas adequadas de vírus podem ser obtidas de fontes disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection [Coleção de Cultura Tipo Americana (ATCC) ou por isolamento de plantas infectadas. O isolamento de vírus de tecidos de planta infectada pode ser realizado por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito por Foster e Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol. 81)", Humana Press, 1998. Resumidamente, os tecidos de uma planta infectada que supostamente contenha uma alta concentração de vírus adequados, preferencialmente folhas jovens e pétalas de flores, são triturados em uma solução tampão (por exemplo, solução tampão de fosfato) para produzir uma seiva infectada pelo vírus que pode ser utilizada em inoculações subsequentes.

[0092] A estrutura dos vírus de RNA da planta para a introdução e expressão de sequências de ácido nucleico não viral em plantas é demonstrada pelas referências acima, bem como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e na Patente dos EUA 5,316,931.

[0093] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser realizadas no próprio vírus. Alternativamente, o vírus pode ser primeiro clonado em um plasmídeo bacteriano para facilitar a estrutura do vetor viral desejado com o DNA estranho. O vírus pode ser então extraído do plasmídeo. Se o vírus for um vírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser anexada ao DNA viral, que é então replicado pelas bactérias. A transcrição e translação desse DNA produzirá a proteína de revestimento que irá encapsidar o DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um cDNA e inserido em um plasmídio. O plasmídio é então utilizado para fazer todas as estruturas. O vírus de RNA é então produzido pela transcrição da sequência viral do plasmídio e pela translação dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que fazem a encapsidação do RNA viral.

[0094] Em uma configuração, é provido um polinucleotídio viral de planta no qual a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa foi deletada de um polinucleotídio viral, e foi inserida uma sequência de codificação de proteína de revestimento viral de planta não nativa e um promotor não nativo, preferencialmente o promotor subgenômico da sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa, capaz de realizar a expressão no hospedeiro da planta, o empacotamento do polinucleotídeo viral de planta recombinante, e de garantir uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídio viral de planta recombinante. Alternativamente, o gene da proteína de revestimento pode ser inativado pela inserção da sequência de polinucleotídio não nativo em seu interior, de modo que uma proteína seja produzida. O polinucleotídeo viral de planta recombinante pode conter um ou mais promotores subgenômicos adicionais não nativos. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou expressar genes adjacentes ou sequências de polinucleotídoo no hospedeiro da planta e incapaz de realizar a recombinação entre si e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativos (estranhos) podem ser inseridas adjacentes ao promotor subgenômico viral nativo da planta ou aos promotores subgenômicos virais nativos e não nativos da planta caso mais que uma sequência de polinucleotídio seja incluída. As sequências de polinucleotídeo não nativo são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle do promotor subgenômico para gerar os produtos desejados.

[0095] Em uma segunda configuração, um polinucleotídeo viral de planta recombinante é provido como na primeira configuração, exceto pelo fato de que a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa é colocada adjacente a um dos promotores subgenômicos de proteína de revestimento não nativa em vez de uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.

[0096] Em uma terceira configuração, é provido um polinucleotídeo viral de planta recombinante no qual o gene da proteína de revestimento nativa está adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foram inseridos no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos inseridos são capazes de transcrever ou expressar genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de realizar recombinação entre si e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativo podem ser inseridas adjacentes aos promotores subgenômicos virais não nativos de planta, de modo que as sequências sejam transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle dos promotores subgenômicos para gerar o produto desejado.

[0097] Em uma quarta configuração, é provido um polinucleotídeo viral de planta recombinante como na terceira configuração, exceto pelo fato de que a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa é substituída por uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.

[0098] Os vetores virais são encapsidados pela proteína de revestimento codificada pelo polinucleotídeo viral de planta recombinante para produzir um vírus de planta recombinante. O polinucleotídeo viral de planta recombinante ou vírus de planta recombinante é utilizado para infectar plantas hospedeiras adequadas. O polinucleotídeo viral de planta recombinante é capaz de realizar a replicação no hospedeiro, a difusão sistêmica no hospedeiro e a transcrição ou expressão de gene(s) estranho(s) (polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.

[0099] As técnicas de inoculação de vírus em plantas podem ser encontradas em Foster and Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol. 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh and Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, Nova York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, Nova York, 1985; e Kado and Agrawa, eds. "Principles and Techniques in Plant Virology", Van NostrandReinhold, Nova York.

[00100] Além do que foi acima exposto, o polinucleotídeo da presente invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto, permitindo assim a expressão do cloroplasto.

[00101] Uma técnica para a introdução de sequências de ácido nucleico exógenas ao genoma de cloroplastos é conhecida. Essa técnica envolve os seguintes procedimentos. Primeiro, as células de planta são quimicamente tratadas de modo a reduzir o número de cloroplastos por célula para aproximadamente um. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido por bombardeamento de partículas nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula de polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos são selecionados de forma que são integráveis no genoma de cloroplastos via recombinação homóloga, que é prontamente feita pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Para essa finalidade, a sequência de ácido nucleico inclui, além de um gene de interesse, pelo menos um estiramento de polinucleotídeo que é derivado do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável, que serve, por meio de procedimentos de seleção sequencial, para determinar que todas ou substancialmente todas as cópias dos genomas do cloroplasto após essa seleção incluirão o polinucleotídeo exógeno. Mais detalhes referentes a esta técnica são encontrados nas Patentes dos EUA N°s. 4,945,050; e 5,693,507 que são aqui incorporadas por referência. Um polipeptídeo pode, então, ser produzido pelo sistema de expressão da proteína do cloroplasto e se integrar à membrana interna do cloroplasto.

[00102] De acordo com algumas configurações da invenção, o método compreende ainda cultivar a célula vegetal que expressa o ácido nucleico. A célula vegetal pode ser cultivada como parte de uma planta inteira, ou, alternativamente, na cultura de células vegetais. Em uma configuração, a célula vegetal é cultivada em cultura de suspensão axênica em um biorreator. Biorreatores adequados para o cultivo de suspensões de células vegetais da invenção e métodos para produção de células vegetais em suspensão são descritos em detalhes nas patentes dos EUA, entre outras, n°s. 6,391,638 e 7,951,557 e PCTs WO98/13469, WO2005/080544, WO2007/010533, WO2008/135991 e WO2008/132743, todas elas incorporadas por referência como se totalmente aqui mostradas.

[00103] Portanto, a invenção abrange plantas ou culturas de plantas que expressam as sequências de ácido nucleico de modo a produzir a proteína α-galactosidase humana recombinante da invenção. Uma vez expresso dentro da célula da planta ou da planta inteira, o nível da proteína α-galactosidase humana codificado pela sequência de ácido nucleico pode ser determinado por métodos bastante conhecidos na técnica tais como, ensaios de atividade, Western blots utilizando anticorpos capazes de ligar especificamente a proteína α-galactosidase humana, Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima (ELISA), ensaios radioimunológicos (RIA), imunohistoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e similares.

[00104] Métodos para determinar, na planta, o nível do RNA transcrito a partir da sequência de ácido nucleico são bastante conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, análise de Northern blot, análise de reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa (RT-PCR) (incluindo RT-PCR quantitativa, semiquantitativa ou em tempo real) e hibridização de RNA in situ.

[00105] A análise de glicanos da proteína α-galactosidase recombinante humana expressa da presente invenção indica que o polipeptídeo é glicosilado na célula vegetal, resultando em uma proteína α- galactosidase humana que possui manose exposta e resíduos de glicano recombinante específicos da planta (vide o Exemplo IV abaixo). Portanto, de acordo com algumas configurações da invenção, as células que expressam o vetor de expressão da invenção produzem a proteína α-galactosidase humana possuindo pelo menos um, opcionalmente pelo menos dois, opcionalmente pelo menos três ou opcionalmente pelo menos quatro ou mais resíduos de xilose de núcleo Q-(1,2). Ainda em certas outras configurações as células que expressam o vetor de expressão da invenção produzem a proteína α- galactosidase humana possuindo pelo menos um, opcionalmente pelo menos dois, opcionalmente pelo menos três ou opcionalmente pelo menos quatro ou mais resíduos de fucose de núcleo α-(1,3). Em outras configurações, as células que expressam o vetor de expressão da invenção produzem a proteína α-galactosidase humana possuindo pelo menos um, opcionalmente pelo menos dois, opcionalmente pelo menos três ou opcionalmente pelo menos quatro ou mais acetilglicosamina no terminal 3(1-2)N. Em outras configurações, as células que expressam o vetor de expressão da invenção produzem a proteína α-galactosidase humana possuindo pelo menos um, opcionalmente pelo menos dois, opcionalmente pelo menos três ou opcionalmente pelo menos quatro ou mais resíduos de manose expostos. Em uma configuração em particular, as células que expressam o vetor de expressão da invenção produzem a proteína α-galactosidase humana possuindo nove resíduos de manose (M9), pelo menos um, opcionalmente pelo menos dois, opcionalmente pelo menos três deles sendo resíduos de manose expostos. Em uma configuração, as células que expressam o vetor de expressão da invenção produzem a proteína α-galactosidase humana possuindo pelo menos um resíduo de manose exposto, pelo menos um resíduo de xilose de núcleo β-(1,2) e pelo menos um resíduo de fucose α-(1,3).

[00106] Ainda, de acordo com algumas configurações da invenção, é provida uma composição compreendendo uma pluralidade de moléculas de proteína α-galactosidase humana produzidas por células que expressam o vetor de expressão da invenção, em que as estruturas de glicanos mais predominantes da pluralidade de moléculas de proteína α-galactosidase humana são manose 3-β-(1,2) xilose-α-(1,3) fucose [Fc(3)M3X] e/ou manose 4-β-(1,2) xilose (M4X); e manose 8 (M8). Em algumas configurações da invenção, as estruturas de glicanos com manose 3-β-(1,2) xilose-α-(1,3) fucose [Fc(3)M3X] e/ou manose 4-β-(1,2) xilose (M4X) compreendem aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35% ou aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% do perfil das moléculas de proteína n-galactosidase humana na pluralidade e a estrutura de glicano manose 8 (M8) compreende 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35% ou aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% do perfil das moléculas de proteína o-galactosidase humana na pluralidade.

[00107] Ainda em outras configurações da presente invenção, a composição compreende uma pluralidade de moléculas de proteína α- galactosidase humana produzidas pelas células que expressam o vetor de expressão da invenção, em que a referida pluralidade de moléculas da proteína α-galactosidase humana compreende pelo menos aproximadamente 0,5%, pelo menos aproximadamente 0,6 %, aproximadamente 0,7 %, aproximadamente 0,8 %, aproximadamente 0,9 %, aproximadamente 1,0 %, aproximadamente 1,1 %, aproximadamente 1,2 %, aproximadamente 1,3 %, aproximadamente 1,4 %, aproximadamente 1,5 %, aproximadamente 1,75 %, aproximadamente 2,0 %, aproximadamente 2,5 %, aproximadamente 3,0 %, aproximadamente 3,5 %, aproximadamente 4,0 aproximadamente 4,5 aproximadamente 5,0 ou mais moléculas da proteína α-galactosidase humana possuindo estruturas de glicano de nove resíduos de manose, pelo menos uma, opcionalmente pelo menos duas, opcionalmente pelo menos três delas sendo resíduos de manose expostos.

[00108] A proteína α-galactosidase humana produzida pelas células que expressam o vetor de expressão da invenção mostrou ter atividade catalítica de α-galactosidase idêntica à da enzima α-galactosidase humana nativa. A exposição da α-galactosidase recombinante da invenção às condições que simulam um ambiente in vivo da enzima quando administrada para terapia de reposição enzimática, indica ainda que a proteína a- galactosidase humana produzida pelas células que expressam o vetor de expressão poderia possuir farmacocinética semelhante à da α-galactosidase humana recombinante expressa em células de mamíferos (Replagal®) (vide Exemplo 3 e figuras. 2 e 3 deste documento).

[00109] Portanto, a proteína α-galactosidase humana produzida pelas células que expressam o vetor de expressão da invenção pode ser utilizada para produzir uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica pode ser utilizada para tratamento ou prevenção da doença de Fabry em um indivíduo que precisar. Em algumas configurações, as células que expressam a proteína a- galactosidase humana podem ser utilizadas para tratamento ou prevenção da doença de Fabry em um indivíduo que precisar. Métodos para preparação e administração de células vegetais que expressam proteínas humanas de maneira recombinante são conhecidas na técnica, por exemplo, no PCT WO2007/010533 de Shaaltiel et al.

[00110] Portanto, de acordo com outro aspecto da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica que inclui, como seu ingrediente ativo, a proteína α-galactosidase humana fusionada traducionalmente no terminal C em um peptídeo sinal de retenção no retículo endoplasmático, e um portador farmacêutico aceitável. Em algumas configurações da presente invenção, a proteína α-galactosidase humana possui um resíduo de glicina no terminal N. Em algumas configurações da presente invenção, a proteína α-galactosidase humana possui uma sequência de aminoácidos, como a mostrada no SEQ ID NO: 16. Em algumas configurações, a proteína α-galactosidase humana fusionada traducionalmente no terminal C em um peptídeo sinal de retenção de retículo endoplasmático possui uma sequência de aminoácidos, como a mostrada no SEQ ID NO: 21.

[00111] Como aqui utilizado o termo "composição farmacêutica" se refere a uma preparação de um ou mais princípios ativos aqui descritos com outros componentes químicos, tais como transportadores e excipientes fisiologicamente adequados. A finalidade de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo.

[00112] Aqui, o termo "ingrediente ativo" se refere à proteína α- galactosidase recombinante humana responsável pelo efeito biológico.

[00113] Daqui em diante, as frases "transportador fisiologicamente aceitável" e "transportador farmaceuticamente aceitável" que podem ser utilizadas uma no lugar da outra se referem a um transportador ou diluente que não provoca irritação significativa em um organismo e não anula a atividade biológica e propriedades do composto administrado. Um adjuvante é incluído nessas frases.

[00114] Aqui o termo "excipiente" se refere a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar ainda a administração de um princípio ativo. Exemplos de excipientes, sem limitação, incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietileno glicol.

[00115] Técnicas para formulação e administração de medicamentos podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição, que é aqui incorporado por referência.

[00116] Vias de administração adequadas podem incluir, por exemplo, oral, retal, transmucosal, especialmente transnasal, intestinal ou infusão parenteral, incluindo intramuscular, subcutânea e injeções intramedulares, bem como intratecal, intraventricular direta, intracardíaca, por exemplo, na cavidade ventricular direita ou esquerda, na artéria coronária comum, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, ou injeções intraoculares.

[00117] Abordagens convencionais para a liberação do medicamento no sistema nervoso central (SNC) incluem: estratégias neurocirúrgicas (por exemplo, injeção intracerebral ou infusão intracerebroventricular); manipulação molecular do agente (por exemplo, produção de uma proteína de fusão quimérica que compreende um peptídeo de transporte que possui uma afinidade com uma molécula de superfície celular endotelial combinada com um agente que por si é incapaz de cruzar a BBB) em uma tentativa de explorar uma das rotas de transporte endógenas da BBB; estratégias farmacológicas concebidas para aumentar a solubilidade lipídica de um agente (por exemplo, conjugação de agentes solúveis em água em lipídio ou portadores de colesterol); e o rompimento transitório da integridade da BBB por divisão hiperosmótica (resultante da infusão de uma solução de manitol na artéria carótida ou do uso de um agente biologicamente ativo tal como um peptídeo angiotensina). No entanto, cada uma dessas estratégias possui limitações, tais como os riscos inerentes associados a um procedimento cirúrgico invasivo, uma limitação de tamanho imposta por uma limitação inerente aos sistemas de transporte endógenos, efeitos colaterais biológicos potencialmente indesejáveis associados à administração sistêmica de uma molécula quimérica composta de um portador, motivo que poderia estar ativo fora do SNC e o possível risco de dano cerebral em regiões do cérebro onde a BBB é dividida, o que o torna um método de liberação abaixo do ideal.

[00118] Alternativamente, pode-se administrar a composição farmacêutica em um local em vez de maneira sistêmica, por exemplo, via injeção da composição farmacêutica diretamente em uma região do tecido do paciente.

[00119] O termo "tecido" se refere à parte de um organismo que consiste de células desenvolvidas para realizar uma função ou funções. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, tecido de cérebro, retina, tecido epidérmico, tecido hepático, tecido pancreático, tecido ósseo, cartilagem, tecido conjuntivo, tecido sanguíneo, tecido muscular, tecido cardíaco, tecido cerebral, tecido vascular, tecido renal, tecido pulmonar, tecido gonadal e tecido hematopoiético.

[00120] Composições farmacêuticas da invenção podem ser fabricadas por processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágeas, pulverização, emulsificação, encapsulamento, aprisionamento ou liofilização.

[00121] As composições farmacêuticas para uso de acordo com algumas configurações da invenção podem ser formuladas de maneira convencional utilizando um ou mais transportadores fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares, os quais facilitam o processamento dos ingredientes ativos em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada depende da via de administração escolhida.

[00122] Para injeção, os princípios ativos da composição farmacêutica podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, como a solução de Hank, a solução de Ringer ou tampão de sal fisiológico. Para administração transmucosal, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são utilizados na formulação. Esses penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.

[00123] Para administração oral, os ingredientes ativos podem ser opcionalmente formulados por meio da administração das células inteiras que produzem a proteína α-galactosidase humana de acordo com a presente invenção. Os ingredientes ativos também podem ser opcionalmente formulados combinando os ingredientes ativos e/ou as células com portadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica, produzindo composições farmacêuticas. Tais veículos permitem que células e/ou a composição farmacêutica sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e afins, para ingestão oral por um paciente. Quando utilizadas para administração oral, as células inteiras, ou frações de células, podem ser frescas ou processadas (por exemplo, liofilizadas, congeladas, secas, etc.).

[00124] Preparações farmacológicas para uso oral podem ser feitas utilizando um excipiente sólido, opcionalmente triturando a mistura resultante e processando a mistura de grânulos, após adicionar auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágeas. Excipientes adequados são, em particular, enchimentos tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose, como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil celulose, carbometilcelulose de sódio; e/ou polímeros fisiologicamente aceitáveis, tais como polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, podem ser adicionados agentes desintegrastes, como polivinilpirrolidona de ligação transversal, ágar, ou ácido algínico ou um sal deste, tal como alginato de sódio.

[00125] Núcleos de drágeas são providos com revestimentos adequados. Para essa finalidade, soluções de açúcar concentrado podem ser utilizadas, as quais podem, opcionalmente, conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, carbopol gel, polietileno glicol, dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos de drágeas para identificação ou para caracterizar combinações diferentes de doses de composto ativo.

[00126] Composições farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente incluem cápsulas duras feitas de gelatina, bem como cápsulas moles, vedadas, feitas de gelatina e um plastificante como glicerol ou sorbitol. As cápsulas duras podem conter os princípios ativos na mistura com o enchimento, como a lactose, aglutinantes como os amidos, lubrificantes como o talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Nas cápsulas moles, os princípios ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como os óleos gordurosos, parafina líquida ou polietilenoglicol líquido. Além disso, podem ser adicionados estabilizantes. Todas as formulações para administração oral devem ser em dosagens adequadas para a via de administração escolhida.

[00127] Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou pílulas formuladas de maneira convencional.

[00128] Para administração por inalação nasal, os princípios ativos para uso de acordo com a invenção são fornecidos convenientemente na forma de uma apresentação spray aerossol por meio de uma embalagem pressurizada ou nebulizador com o uso de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano ou dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para aplicar uma quantidade dosimetrada. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para uso em um aplicador, podem ser formulados contendo uma mistura do composto em pó e uma base em pá adequada, como lactose ou amido.

[00129] A composição farmacêutica descrita na presente pode ser formulada para administração parenteral, por exemplo, por injeção em bólus ou infusão contínua. Formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dose unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidose, opcionalmente, com a adição de conservante. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

[00130] Composições farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas da preparação ativa em forma solúvel em água. Além disso, suspensões dos princípios ativos podem ser preparadas como suspensões oleosas apropriadas ou de injeção à base de água. Solventes lipofílicos adequados ou veículos incluem óleos graxos, tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como oleato de etila, triglicérides ou lipossomas. Suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetil celulose de sódio, sorbitol ou dextran. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes adequados, ou agentes que aumentam a solubilidade dos princípios ativos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[00131] Alternativamente, o princípio ativo pode ser em forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, solução estéril à base de água livre de pirogênio, antes do uso.

[00132] A composição farmacêutica de algumas configurações da invenção também pode ser formulada em composições retais, tais como supositórios ou enemas de retenção, utilizando, por exemplo, bases para supositórios convencionais, tais como manteiga de cacau ou outros glicerídeos.

[00133] As composições farmacêuticas adequadas para uso no contexto de algumas configurações da invenção incluem composições nas quais os ingredientes ativos estejam contidos em quantidade eficiente para realizar a finalidade pretendida. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de princípios ativos (α- galactosidase) eficazes para prevenir, aliviar ou atenuar os sintomas de uma doença (por exemplo, Doença de Fabry) ou prolongar a sobrevivência do paciente em tratamento.

[00134] A determinação da quantidade terapeuticamente eficiente está bem inserida na capacidade daqueles com habilidade na técnica, especialmente à luz da descrição detalhada aqui fornecida.

[00135] Para qualquer preparação utilizada nos métodos da invenção, a quantidade ou dose terapeuticamente eficiente pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro e de cultura de células. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos com animais para atingir a concentração desejada ou titulação. Essas informações podem ser utilizadas para determinar mais precisamente doses úteis em humanos.

[00136] A toxicidade e eficácia terapêutica dos princípios ativos aqui descritos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão in vitro, em culturas de células ou experimentos com animais. Os dados obtidos a partir desses ensaios in vitro e de cultura de células e estudos com animais podem ser utilizados na formulação do intervalo de dosagem para uso em humanos. A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. A formulação exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico tendo em vista a condição do paciente. (vide, por exemplo, Fingl, et al., 1975, em "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1 p. 1).

[00137] A dose e o intervalo podem ser ajustados individualmente para que os níveis do princípio ativo na célula ou soro sejam suficientes para induzir ou suprimir o efeito biológico (concentração mínima efetiva, CME). A CME varia para cada preparação, mas pode ser estimada a partir dos dados in vitro. Dosagens necessárias para obter CME dependem das características individuais e da via de administração. Podem ser utilizados ensaios de detecção para determinar as concentrações plasmáticas.

[00138] Dependendo da gravidade e da resposta da doença a ser tratada, a dose pode ser de uma única administração ou uma pluralidade de administrações, com o curso de tratamento durante desde vários dias até várias semanas ou até ser obtida a cura ou diminuição da doença.

[00139] A quantidade de uma composição a ser administrada, naturalmente, dependerá do indivíduo que está sendo tratado, da gravidade da doença, da forma de administração, do discernimento do médico que a prescreve, etc.

[00140] Composições de algumas configurações da invenção podem, se desejado, ser apresentadas em uma embalagem ou dispositivo aplicador, como o kit aprovado pela FDA, (Agência Norte-Americana de Vigilância de Alimentos e Medicamentos), que pode conter uma ou mais formas de dosagem contendo o princípio ativo. A embalagem, por exemplo, pode compreender folha de metal ou plástico, como uma embalagem blister. A embalagem ou dispositivo aplicador pode ser acompanhada de instruções para a administração. A embalagem ou aplicador também podem ser acompanhados de um aviso relacionado ao recipiente na forma determinada pela agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, cujo aviso deve refletir a aprovação por essa agência da forma das composições ou administração humana ou veterinária. Esse aviso, por exemplo, pode ser a rotulagem aprovada pela FDA para medicamentos vendidos com receita ou bula do produto aprovada. As composições que consistem de um preparado da invenção formulado num veículo farmacologicamente compatível podem também ser preparadas, colocadas num recipiente apropriado e rotuladas para o tratamento de uma condição indicada, conforme está detalhado supra.

[00141] A composição farmacêutica pode ser utilizada para tratamento ou prevenção da doença de Fabry em um indivíduo que precisar. Portanto, de acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um método para tratar ou prevenir doença de Fabry em um indivíduo que precisar, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um composto farmacêutico que inclui como seu ingrediente ativo a proteína α- galactosidase humana fusionada traducionalmente no terminal C em um peptídeo sinal de retenção de retículo endoplasmático e um portador farmacêutico aceitável. Em algumas configurações da presente invenção, a proteína α-galactosidase humana possui um resíduo de glicina no terminal N. Em outras configurações, a proteína α-galactosidase humana possui uma sequência de aminoácidos como a mostrada no SEQ ID NO: 16.

[00142] O termo "tratar" refere-se à inibição, prevenção ou interrupção do desenvolvimento de uma patologia (doença, distúrbio ou condição) e/ou provocar uma redução, remissão ou regressão de uma patologia. Aqueles com habilidade na técnica entenderão que várias metodologias e ensaios podem ser utilizados para avaliar o desenvolvimento de uma patologia e, similarmente, várias metodologias e ensaios podem ser utilizados para avaliar a redução, remissão ou regressão de uma patologia.

[00143] Como aqui utilizado, o termo "prevenir" se refere a impedir que a doença, disfunção ou condição ocorra em um indivíduo que tem risco para a doença, mas que ainda não foi diagnosticado como tendo a doença.

[00144] Conforme utilizado no presente, o termo "indivíduo" inclui mamíferos, preferivelmente seres humanos de qualquer idade que sofrem da patologia. De preferência, esse termo abrange indivíduos que têm risco de desenvolver a patologia.

[00145] Como aqui utilizada a frase "regime de tratamento" se refere a um plano de tratamento que especifica o tipo de tratamento, dosagem, cronograma e/ou duração do tratamento fornecido ao indivíduo que precisar (por exemplo, indivíduo diagnosticado com a patologia). O regime de tratamento selecionado pode ser agressivo, que deve resultar no melhor desfecho clínico (por exemplo, cura completa da patologia), ou um mais moderado, que pode aliviar os sintomas da patologia, ainda que resulte em cura incompleta da patologia. Deve ser observado que em certos casos, o regime de tratamento mais agressivo pode estar associado a algum desconforto ou efeitos colaterais adversos para o indivíduo (por exemplo, dano às células saudáveis ou tecido). O tipo de tratamento pode incluir uma intervenção cirúrgica (por exemplo, retirada da lesão, células doentes, tecido ou órgão), uma terapia de reposição celular, administração de uma droga terapêutica (por exemplo, agonistas receptores, antagonistas, hormônios, agentes quimioterápicos) de modo local ou sistêmico, uma exposição à radioterapia utilizando uma fonte externa (por exemplo, feixe externo) e/ou fonte interna (por exemplo, braquiterapia) e/ou qualquer combinação destes. A dosagem, cronograma e duração do tratamento podem variar, dependendo da gravidade da patologia e do tipo de tratamento selecionado e aqueles com habilidade na técnica são capazes de ajustar o tipo de tratamento com a dosagem, cronograma e duração do tratamento.

[00146] É esperado que durante a vida de um paciente que amadurece a partir dessa aplicação, muitos vetores relevantes, elementos promotores, células vegetais e portadores serão desenvolvidos e o escopo dos termos aqui providos pretende incluir todas essas novas tecnologias a priori.

[00147] Como aqui utilizado o termo "aproximadamente" se refere a ± 10%.

[00148] Os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tendo" e seus conjugados significam "incluindo, mas não limitado a".

[00149] O termo "consistindo de" significa "incluindo e limitado a".

[00150] O termo "consistindo essencialmente de" significa que a composição, método ou estrutura podem incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas apenas se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem de maneira importante as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicada.

[00151] Como aqui utilizado, a forma singular "um/a" e "o/a" incluem referências plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas dos mesmos.

[00152] Ao longo deste pedido, várias configurações desta invenção podem ser apresentadas em formato de faixa. Deve ser compreendido que a descrição em formato de faixa é simplesmente para fins de conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível do escopo da invenção. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo descrito especificamente todas as subfaixas possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro daquela faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa como de 1 a 6 deve ser considerada como tendo especificamente descrito subfaixas como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro daquela faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independente da amplitude da faixa.

[00153] Sempre que uma faixa numérica for indicada no presente documento, ela deve incluir qualquer numeral citado (fracional ou integral) dentro da faixa indicada. As frases "variando/varia entre" um primeiro número indicado e um segundo número indicado e variando/varia entre" um primeiro número indicado até um segundo número indicado são utilizadas uma no lugar da outra e destinam-se a incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os numerais fracionais ou integrais entre eles.

[00154] Como aqui utilizado, o termo "método" se refere a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma dada tarefa, incluindo, entre outros, aquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos ou prontamente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos pelos profissionais de técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.

[00155] Como aqui utilizado, o termo "tratar" inclui exterminar, inibir substancialmente, retardar ou inverter o avanço de uma doença, melhorando substancialmente os sintomas clínicos e estéticos de uma doença ou prevenindo substancialmente o aparecimento de sintomas clínicos ou estéticos de uma doença.

[00156] Observa-se que determinadas características da invenção, as quais, para fins de clareza, são descritas no contexto de configuração separados, também podem ser previstas em combinação em uma única configuração. De maneira inversa, várias características da invenção, as quais, para fins de concisão, são descritas no contexto de uma única configuração também podem ser previstas separadamente ou em qualquer subcombinação ou como adequado em qualquer outra configuração da invenção descrita. Certas características descritas no contexto de várias configurações não devem ser consideradas características essenciais dessas configurações, a menos que a configuração não seja operante sem esses elementos.

[00157] Várias configurações e aspectos da presente invenção como descritos acima e reivindicados na parte de reivindicações abaixo, encontram apoio experimental nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

[00158] Faz-se referência agora aos seguintes exemplos, os quais, juntamente com as descrições acima, ilustram algumas configurações da invenção sem limitação.

[00159] Geralmente, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura. Consulte, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nova York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nova York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York (1998); metodologias apresentadas nas Patentes dos EUA N.°s* 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 e 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8' Edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nova York (1980); imunoensaios disponíveis são amplamente descritos na literatura de patente e científica, veja, por exemplo, Patentes dos EUA N.°s* 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 e 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 12, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos aqui incorporados por referência conforme aqui integralmente apresentados. Outras referências gerais são dadas ao longo de todo este documento. Os procedimentos aqui contidos são considerados bem conhecidos na técnica e são fornecidos para conveniência do leitor. Todas as informações neles contidas são aqui incorporadas por referência.

EXEMPLO I: ESTRUTURA DA EXPRESSÃO DE α-galactosidase EM PLANTA

[00160] O cDNA que codifica a proteína α-galactosidase humana (EC 3.2.1-22 GenBank: X05790) foi otimizado e sintetizado pela GENEART AG (Regensburg, Alemanha). A utilização do códon sem o peptídeo líder (peptídeo sinal de alvo de retículo endoplasmático) foi adaptada à tendência de códon dos genes de Nicotiana tabacum. Durante o processo de otimização, os seguintes motivos de sequência de elementos reguladores de ação cis foram evitados: TATA-boxes internos, sítios chi e sítios de entrada ribossômica, trechos da sequência ricos em AT ou GC, elementos de instabilidade de RNA ("elementos destruidores"), sequências repetidas e estruturas secundárias de RNA, doador de "splice" (críptico) e sítios aceitantes, pontos de ramificação. Além disso, as regiões de conteúdo de GC muito alto (> 80%) ou muito baixo (< 30%) GC foram evitadas.

[00161] A sequência de nucleotídeos do peptídeo líder de α- galactosidase humana nativa (peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático) (figura 1, primeiros 31 aminoácidos em vermelho) da proteína α-galactosidase humana de comprimento total (GenBank: X05790) foi substituída pela sequência de nucleotídeos codificando o peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de 33 aminoácidos (peptídeo líder) da proteína ABPI Arabidopsis (marcada em verde na figura 1, SEQ ID NO: 4). Esse peptídeo sinal fornece localização eficiente de α-galactosidase no trajeto secretário e é clivado do polipeptídeo, por peptidase sinal, uma vez a proteína tenha sido translocada para o retículo endoplasmático. A sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 19) codificando o sinal de retenção no retículo endoplasmático SEKDEL (SEQ ID NO: 6) foi adicionada à sequência de cDNA no término 3', permitindo recuperação da proteína expressa do aparelho de Golgi, mantendo efetivamente a proteína no retículo endoplasmático. SEQ ID NO: 2 representa a sequência de codificação completa da α-galactosidase humana recombinante expressa (SEQ ID NO: 1), incluindo o peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI no terminal N, a proteína α-galactosidase humana e o sinal de retenção no retículo endoplasmático SEKDEL.

EXEMPLO II: EXPRESSÃO DE α-GALACTOSIDASE RECOMBINANTE HUMANA EM PLANTAS Sistema de expressão transitória em N. benthamiana

[00162] O uso de vetores vitais vegetais foi escolhido neste caso como alternativa às plantas transgênicas, permitindo expressão rápida e transitória de alto nível de proteínas em plantas inteiras maduras.

[00163] A proteína de interesse foi expressa a partir de um forte promotor de proteína de revestimento viral subgenômico. O sistema se baseia na amplificação transitória (por agroinfecção) de vetores virais aplicados à planta por Agrobacterium, na qual o promotor funcional da planta e o cDNA codificando um replicon viral são transferidos como T-DNA da agrobacterium para as células vegetais. O T-DNA é transcrito in-planta pelo promotor da planta para gerar o RNA viral biologicamente ativo que inicia a autorreplicação.

[00164] Para a expressão transitória, foi utilizado um sistema de recombinação de 3 vetores com base no sistema anteriormente desenvolvido como descrito (Gleba et al., Vaccine 23 2042-2048, 2005). O cDNA de α- galactosidase foi inserido em um dos vetores e nos dois outros vetores contendo genes para estrutura do replicon viral inteiro (RdRp e Integrase), gerando com isso um RNA viral biologicamente ativo capaz de iniciar a autorreplicação.

Transfecção de plantas inteiras

[00165] Plantas N. benthamiana foram germinadas e cultivadas em solo de mistura comercial (Givaat Ada, IL) suplementado com fertilizante granular de liberação lenta (Scott Marysville, OH) em regime de luz de um dia inteiro (16 horas de luz / 8 horas de escuro) em 24 °C-25 °C.

[00166] Agrobactérias foram transformadas com o sistema de vetor com base em replicon pICH20866-alfa-GAL utilizando eletroporação (2500V, 5mseg) [den Dulk-Ra, A. e Hooykaas, P.J. (1995) Methods Mol. Biol. 55:63-72]. As plantas foram infiltradas com Agrobactérias contendo 3 plasmídeos ICON por infiltração a vácuo com métodos padrão conhecidos na técnica. Em resumo, plantas N. benthamiana com 5-6 semanas de idade foram infiltradas por imersão de todos os órgãos aéreos da planta em uma suspensão bacteriana e foram colocadas em uma câmara a vácuo. Foi aplicado menos (-) 0,8 bar de vácuo por 1 minuto, seguido de um rápido retorno à pressão atmosférica. As plantas foram recolocadas na estufa por mais 5-7 dias nas mesmas condições de cultivo.

Extrato da Planta de Tabaco:

[00167] Amostras de folhas de Nicotiana benthamiana foram colhidas 5 dias após a infiltração e extraídas em tampão de Laemmli para SDS-PAGE, ou em tampão de análise de atividade (20 mM de ácido cítrico, 30 mM de fosfato de sódio, 0,1% de BSA e 0,67% de etanol, pH 4,6.) para análise da atividade catalítica da proteína expressa na planta.

Purificação do Extrato de Planta de Tabaco:

[00168] A proteína α-galactosidase humana dos extratos vegetais foi purificada por precipitação diferencial com sulfato de amônio em duas etapas ("imersão em solução salina": la etapa 0,57M; 2' etapa 2,27M), seguida de cromatografia por interação hidrofóbica (resina Fenil 650 M) e cromatografia por troca de cátions.

Expressão estável em células de N. tabaccum BY2

[00169] A transformação mediada por agrobactéria é amplamente utilizada para introduzir genes estranhos no genoma de uma célula vegetal. Essa técnica se baseia na capacidade natural da agrobactéria de transformar células vegetais transferindo o segmento DNA de plasmídeo, o DNA transferido (T-DNA), em genoma da célula hospedeira. Utilizando esse método, uma molécula de T-DNA consistindo de um gene estranho e de seus elementos reguladores é introduzida aleatoriamente no genoma da planta. O local de integração, bem como o número de cópias das inserções genéticas não são controlados, portanto, o processo de transformação resulta em um 'grupo' de células transgênicas compostas de células com vários níveis de expressão do transgene. O "grupo" transgênico é subsequentemente utilizado para isolar o clone. O isolamento do clone resulta no estabelecimento de muitas linhas celulares únicas das quais o clone com o nível de expressão mais alto do gene estranho é então selecionado.

[00170] A cultura por suspensão de BY2 foi co-cultivada por 48 horas, com a cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens transportando o vetor que hospeda o gene a-GAL e o gene de seleção de fosfotransferase de neomicina (NPTII).

[00171] Subsequentemente, as células foram mantidas em meio suplementado com 50 mg/L de Canamicina e 250 mg/L de Cefotaxima. O gene NPTII confere resistência à Canamicina, portanto, apenas células BY2 NPTII positivas sobrevivem nesse meio de seleção. A Cefotaxima foi utilizada para eliminar seletivamente a agrobactéria, as células vegetais sendo resistentes a esse antibiótico. Assim que uma suspensão celular transgênica habilmente cultivada foi estabelecida, ela foi utilizada para selecionar e isolar linhas celulares individuais. Para permitir a seleção de linhas celulares individuais, alíquotas de suspensão celular altamente diluída foram espalhadas no meio BY-2 sólido. As células então cresceram até que pequenos calos se desenvolvessem. Cada calo foi então recolocado em suspensão em cultura líquida. Foram coletadas amostras das células e as amostras foram avaliadas para os níveis de α-GAL. As linhas que expressavam níveis de atividade de α-GAL relativamente altos foram então reanalisadas e comparadas aos níveis de α-GAL terminando com a seleção final das linhas de expressão de α-GAL candidatas.

Extrato de Célula de Tabaco:

[00172] 100 mg de células BY2 transformadas expressando a proteína α-galactosidase humana foram homogeneizados por 5 minutos em 200 ul 20 mM de tampão de fosfato 0,5 M contendo 20 mM EDTA, 2 mM DTT e 2 mM PMSF, pH=7,2. O homogenato foi centrifugado e o sobrenadante contendo a proteína α-galactosidase recombinante humana foi coletado [extrato cru]. A atividade catalítica da α-galactosidase no extrato cru foi determinada pelo ensaio PNP-G.

Ensaio PNP-G

[00173] A atividade de hidrolase dos galactosídeos da α-galactosidase foi determinada utilizando p-nitrofenilalfa-D-galactopiranosida (pNP-alfa-D- Gal, GBB1290, IRIS Biotech, Alemanha) como substrato de hidrólise. O tampão do ensaio continha 20 mM de ácido cítrico, 30 mM de fosfato de sódio, 0,1% de BSA e 0,67% de etanol com pH 4,6. As amostras (50 pl) foram incubadas com 150 pl de tampão para ensaio. O substrato (pNP-alfa-D- Gal) foi adicionado (30 pL) a uma concentração final de 8 mM de p-NP-alfa- D Gal. A mistura de reação foi incubada a 37 °C por 90 minutos. Após 90 minutos, a reação foi submetida à têmpera pela adição de 100 p1 de carbonato de sódio (2M) em cada poço, a fim de terminar a reação e possibilitar a geração do cromóforo de p-nitrofenolato. Os resultados foram calculados a partir da Absorbância medida em 405 nm.

[00174] Modificação da α-galactosidase humana expressa em planta: 0 sequenciamento do produto de proteína das plantas transformadas revelou que, em alguns casos, após a clivagem do peptídeo sinal ABPI, a proteína α- galactosidase recombinante humana retém o último aminoácido Glicina do peptídeo sinal no término N da proteína α-galactosidase madura. Portanto, a proteína α-galactosidase humana recombinante pode ser sem a Glicina do peptídeo sinal no término N (por exemplo, SEQ ID NO: 20, codificando a sequência como no SEQ ID NO: 22) ou incluindo a Glicina no término N (por exemplo, SEQ ID NO: 21, codificando a sequência como no SEQ ID NO: 23).

[00175] Análise de glicanos da α-galactosidase humana expressa na planta: Amostras de produto de proteína α-galactosidase recombinante humana das plantas transformadas foram reduzidas, alquiladas com DTT e iodoacetamida e separadas em 12,5% de SDS-PAGE. As bandas correspondentes ao peso molecular correto foram extirpadas, a proteína extraída e submetida à análise de glicanos consistindo de digestão de tripsina seguida de digestão de PNGase A e de PNGase F. A digestão de PNGase A libera todos os glicanos com ligação N e a digestão de PNGase F libera todos os glicanos exceto aqueles contendo fucose de núcleo a 1-3.

[00176] Os glicanos livres foram extraídos, purificados e então rotulados com antranilamida reagente fluorescente (2AB) seguindo-se a retirada de 2AB em excesso.

[00177] Os glicanos foram separados utilizando HPLC de fase normal com amido 80 em gel TSK e detectados utilizando um detector de fluorescência. Um hidrolisato de Dextran serviu de marcador de massa molecular (ladder) para o cálculo dos valores de unidade de glicose (GU). O perfil de glicanos é construído calculando as áreas de pico relativas a partir do cromatograma da digestão de PNGase A. A designação dos glicanos é estabelecida pelo cálculo dos valores de GU dos picos encontrados tanto nas digestões de endoglicosídeo como com base nas várias digestões de exoglicosídeos adicionais.

Resultados:

[00178] Comparando as diferentes estruturas de α-galactosidase, foi descoberto que a adição de um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI (SEQ ID NO: 4) ao polipeptídeo de α-galactosidase recombinante humana melhorou a expressão da proteína recombinante na expressão transitória de plantas N. benthamiana (figura 2, posição 2), em comparação às sequências de α-galactosidase expressas com um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de pectinase da maçã (peptídeo sinal de localização RE de pectinase da maçã como codificado pelo SEQ ID NO: 10) (proteína peptídeo sinal ao RE de pectinase de α- galactosidase de maçã como codificada pelo SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 11), ou proteína α-galactosidase expressa com um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de endoquitinase B (proteína sinal de endoquitinase, SEQ ID NO: 14, como codificada pelo SEQ ID NO: 15) . A análise da atividade catalítica (ver acima) confirmou que o aumento de proteína visto na figura 2 se reflete no aumento concomitante da atividade enzimática (figura 3, coluna B) por kg de folhas, em comparação às sequências de α-galactosidase expressas com um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de pectinase da maçã ou proteína α-galactosidase expressa com um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de endoquitinase B (proteína sinal de endoquitinase, SEQ ID NO: 14, como codificada pelo SEQ ID NO: 15).

[00179] A análise de glicanos do produto de proteína α-galactosidase recombinante humana das células de tabaco transformadas expressando a proteína α-galactosidase humana com a adição de um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI (por exemplo, SEQ ID NO: 1, codificada pelo SEQ ID NO: 2) revelou um perfil de glicanos compreendendo estruturas de glicano principais de estruturas de glicanos com alto teor de manose (por exemplo, 3 a 6, 7, 8 ou 9 resíduos de manose, com manose terminal, exposta) e glicanos característicos específicos para a planta, tais como xilose β-(1,2) e fucose α-(1,3) (Figura 7). As estruturas de glicanos predominantes representando uma alta porcentagem do perfil de glicanos incluíam aproximadamente 30% tendo manose 3-β-(1,2) xiloseα-(1,3) fucose [Fc(3)M3X] e/ou manose 4-β-(1,2) xilose (M4X); e aproximadamente 30% de glicanos de manose 8 (M8) (figura 8). A figura 8 é uma tabela ilustrada mostrando a distribuição das estruturas de glicanos dentro das amostras de proteínas das células transformadas. A-Gal A e A-Gal-B são duas análises representativas do produto proteína α-galactosidase recombinante humana a partir das células vegetais transformadas.

[00180] As estruturas de glicanos podem ser ainda classificadas em categorias de acordo com os resíduos de açúcar presentes nos glicanos complexos. A Tabela V abaixo detalha a distribuição de estruturas de glicanos no produto proteína α-galactosidase humana a partir de plantas transformadas, de acordo com açúcares específicos: Tabela V - Teor de sacarídeo nos glicanos

[00181] Portanto, o produto proteína α-galactosidase humana expresso na cultura de células de tabaco a partir da estrutura compreendendo SEQ ID NO: 2 foi caracterizado pela porcentagem significativa de estruturas de glicanos específicas da planta (tendo componentes como fucose e xilose), e alta glicosilação de manose.

EXEMPLO III - ESTABILIDADE DA α-GALACTOSIDASE RECOMBINANTE HUMANA EXPRESSA EM PLANTA EM CONDIÇÕES IN VIVO

[00182] A fim de aproximar a farmacocinética das preparações com α- galactosidase recombinante humana expressa em planta, as preparações de enzima recombinante foram expostas a condições in vivo simuladas e atividade catalítica monitorada.

Estabilidade no plasma:

[00183] A estabilidade de atividade enzimática no plasma foi avaliada adicionando extrato vegetal recombinante ou α-galactosidase purificada a partir de extrato vegetal no plasma humano até uma concentração final de 1 pg/ml (por exemplo, 10 μl de extrato ou α-galactosidase purificada para 190 μl de plasma humano), incubando a 37°C, e em seguida a atividade catalítica das amostras de α-galactosidase nos intervalos definidos ao longo de uma hora.

[00184] A comparação entre a α-galactosidase de plantas N. benthamiana transformadas com SEQ ID NO: 11, codificando uma α- galactosidase com um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de pectinase da maçã (SEQ ID NO: 12) e a α-galactosidase de plantas N. benthamiana transformadas com SEQ ID NO: 2, codificando a α-galactosidase com um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI (SEQ ID NO: 1) (figura 4) indica clara vantagem da α- galactosidase expressa por N. benthamiana a partir da estrutura que possui um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI (figura 4, quadrados fechados ou sólidos), em comparação à α-galactosidase recombinante expressa a partir da estrutura com peptídeo líder sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático de pectinase da maçã (figura 4, quadrados abertos).

[00185] A comparação entre a α-galactosidase expressa em células vegetais N. tabaccum (BY2) transformadas com o SEQ ID NO: 2, codificando uma proteína α-galactosidase com um peptídeo sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático ABPI (SEQ ID NO: 1), resultando em proteína e-galactosidase recombinante madura como mostrado no SEQ ID NO: 21 com a α-galactosidase expressa em células de mamíferos (REPLAGALTM) revelou estabilidade semelhante da atividade enzimática, quando incubadas no plasma por uma hora a 37°C (figura 5), e quando incubadas por 9 dias em condições semelhantes ao lisossomo (pH=4,6 e 37°C, figura 6). Essa semelhança em condições in vivo simuladas sugere que a α- galactosidase expressa em célula vegetal teria farmacocinética comparável à da enzima clinicamente aprovada, expressa em células de mamíferos

(REPLAGALTM)

[00186] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as configurações específicas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações ficarão evidentes para aqueles com experiência na técnica.

[00187] Consequentemente pretende-se abranger todas essas alternativas, modificações e variações que se enquadram na essência e amplo escopo das reivindicações anexas.

[00188] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados neste relatório são aqui incorporados em sua integralidade por referência no relatório, com o mesmo alcance que se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse indicado específica e individualmente para ser incorporado aqui por referência. Além disso, a menção ou identificação de qualquer referência neste pedido não deve ser interpretada como admissão de que essa referência está disponível como técnica anterior da presente invenção. Na medida em que são utilizados títulos nas seções, eles não devem ser interpretados necessariamente como uma limitação.

Claims

1. Construto de expressão de ácido nucléico, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína α-galactosidase humana como definida na SEQ ID NO: 7 ou uma sequência sintética da mesma compreendendo códons otimizados para expressão em células vegetais, em que a referida proteína α-galactosidase humana é fusionada traducionalmente na região N-terminal a um peptídeo sinal de endereçamento para o retículo endoplasmático ABPI de Arabidopsis como definido na SEQ ID NO: 4 e em que a referida proteína α-galactosidase humana é fusionada traducionalmente na região C-terminal a um peptídeo sinal de retenção no retículo endoplasmático como definido na SEQ ID NO: 6, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína α- galactosidase humana é conforme estabelecido na SEQ ID NO: 18 ou suas variantes com códons degenerados, o ácido nucleico que codifica o peptídeo de sinal de endereçamento para o retículo endoplasmático ABPI de Arabidopsis é conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5 ou suas variantes com códons degenerados e a sequência de ácido nucleico que codifica o peptídeo de retenção do retículo endoplasmático é conforme estabelecido na SEQ ID NO: 19 ou suas variantes com códons degenerados.

2. Construto de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sequência de ácido nucleico possuir uma sequência, conforme mostrada na SEQ ID N°: 2.

3. Método de produção de uma proteína α-galactosidase humana recombinante, caracterizado por compreender: fornecer uma célula vegetal compreendendo o construto de ácido nucleico como na reivindicação 1 ou 2; e cultivar a referida célula vegetal, de forma a produzir a referida proteína α-galactosidase humana recombinante; e isolar a referida proteína α-galactosidase humana recombinante a partir da referida célula vegetal.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida célula é uma linhagem de célula de tabaco tal como uma célula BY-2.

5. Proteína α-galactosidase humana tendo um resíduo de Glicina na região N-terminal, caracterizada por ser traducionalmente fusionada na região C-terminal a um peptídeo sinal de retenção no retículo endoplasmático, em que a referida proteína α-galactosidase humana tem uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 16.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender, como um ingrediente ativo, a proteína α-galactosidase humana como definida na reivindicação 5, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a proteína α-galactosidase humana possui uma estrutura de glicano compreendendo nove resíduos de manose, onde três são resíduos de manose expostos.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender, como um ingrediente ativo, uma população de proteínas α- galactosidase humanas, como definidas na reivindicação 5, em que pelo menos 0,5% da referida população possui uma estrutura de glicano compreendendo nove resíduos de manose, onde três são resíduos de manose expostos.

9. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender, como um ingrediente ativo, uma população de proteínas α- galactosidase humanas como definidas na reivindicação 5, em que as estruturas de glicano predominantes da referida população de proteínas α- galactosidase humanas serem manose 4-β-(1,2) xilose (M4X); manose 3-β- (1,2) xilose-α-(1,3) fucose [Fc(3)M3X] e manose 8 (M8), e um veículo farmaceuticamente aceitável.

10. Uso da proteína α-galactosidase humana como definida na reivindicação 5, ou da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado por ser para a manufatura de um medicamento para o tratamento da doença de Fabry em um indivíduo que o necessite.