BR112014019117B1 - Polipeptídeos de dnase i, polinucleotídeos codificando as mesmas, métodos de produção de dnase i e usos das mesmas em terapia - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEOS DE DNASE I, POLINUCLEOTÍDEOS CODIFICANDO AS MESMAS, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE DNASE I E USOS DAS MESMAS EM TERAPIA, compreende proteínas de DNase recombinante humana expressa por planta, estruturas de ácido nucleico para expressão da DNase I humana recombinante em células de planta, células expressando a estrutura de ácido nucleico e usos terapêuticos das mesmas são divulgados; particularmente, composições e métodos para tratar condições pulmonares e/ou respiratórias por inalação de DNase I humana recombinante expressa por planta são fornecidos.

Description

CAMPO DE APLICAÇÃO E HISTÓRICO

[001] O presente pedido de patente de invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se a uma estrutura de expressão de ácido nucleico de planta e, mais particularmente, mas não exclusivamente, a uma estrutura de ácido nucleico para expressão de DNase I em célula de planta, células que expressam a estrutura de ácido nucleico, DNase I expressa pela planta e usos terapêuticos respectivos.

[002] DNase I humana é um membro da família de DNase I de mamífero (EC 3.1.21.1). A DNase I pertence à classe de endonucleases dependentes de Mg” e Ca”, cuja atividade hidrolítica depende da presença de metais bivalentes. O Íon de magnésio está envolvido em catálise eletrofílica da clivagem de ligação de fosfodiéster, enquanto Ca' mantém conformação de enzima ideal. A DNase I cliva o DNA preferencialmente em ligações de fosfodiéster adjacentes a um nucleotídeo de pirimidina, rendendo polinucleotídeos terminados de 5'-fosfato com um grupo hidroxila livre na posição 3', nos tetranucleotídeos de produção média. Ela age em DNA de cadeia única, DNA de cadeia dupla e cromatina.

[003] O principal uso terapêutico de DNase humana tem sido reduzir a viscoelasticidade de secreções pulmonares (incluindo muco) em doenças tais como pneumonia e fibrose cística (FC cystic fibrosis), ajudando, deste modo, na limpeza das vias aéreas respiratórias. O muco também contribui para a morbidez de bronquite crônica, bronquite asmática, bronquiectasia, enfisema, sinusite crônica e aguda e mesmo o resfriado comum. A DNase I é eficaz na redução da viscoelasticidade de secreções pulmonares pela hidrolisação de DNA de alto peso molecular presente em secreções pulmonares. A DNase também foi proposta para doenças pulmonares, por exemplo, tratamento de infertilidade masculina e distúrbios uterinos (vide US 2007/0259367), inibição de crescimento metastático (vide US 7,612,032) e aplicada topicamente para condições virais.

[004] Seguindo o descontentamento inicial com DNase I de ocorrência natural no cenário clínico (principalmente devido às proteases de contaminação copurificadas e imunogenicidade de DNase bovina), DNA codificando a DNase I humana foi isolado, sequenciado e expresso em células hospedeiras recombinantes, permitindo, desse modo, a produção de DNase humana em quantidade comercialmente úteis. Foi descoberto que DNase humana recombinante (rhDNase) (por exemplo, alfa dornase; Pulmozyme®, Genentech, CA), expressa em células de ovário de hamster chinês (CHO 1 Chinese hamster ovary) é clinicamente eficaz para FC.

[005] A DNase I humana recombinante para uso terapêutico (alfa dornase; Pulmozyme®) é atualmente produzida em células de mamífero (células CH0). A expressão de DNase I recombinante também foi descrita em células de rim embrionário humano 293 (Shak et al, PNAS 1990; 87:9188-92) e em bactéria. A expressão de proteínas de fusão, incluindo DNase I recombinante humana, também foi sugerida em sistema de expressão de protozoário Tetrahymena (Weide et al, BMC Biotech 2006; 6:19), em plastos de planta ou alga (Pedido de Patente Norte-americana N° 2011/151515 para Heifetz et al), e em uma variedade de outras células hospedeiras (vide, por exemplo, o Pedido de Patente Norte-americana N° 2007/0037257 de Chisholm et al; Pedido de Patente Norte-americana N° 2005/0019925 de Krummer et al e Pedido de Patente Norte-americana N° 2004/0077013 de Ashkenazi et al). A DNase humana recombinante (rhDNase) (por exemplo, alfa dornase; Pulmozyme®, Genentech, CA), expressa em células de ovário de hamster chinês (CHO) foi aprovada para uso clínico pela FDA em 1994, e ensaios clínicos humanos adicionais com DNase I humana recombinante estão atualmente em progresso para CF (vide NCT01155752; NCT0017998; NCT00117208 e NCT00204685) e outras doenças respiratórias crônicas, tais como atelectasia (vide NCT01095276 e NCT00671323) e Síndrome de Sjogren. A partir de 2011 milhares de pacientes, entre uma população de aproximadamente 30.000 pacientes nos EUA e em todo o mundo, foram tratados com DNase I humana recombinante e, em geral, a segurança e eficácia de ambos foram demonstradas.

[006] As enzimas humanas podem ser produzidas em plantas transgênicas a fim de resolver os problemas de segurança, infecções virais, reações imunes, rendimento e custo de produção. A Patente Norte-americana N° 6.391.638 e o PCT W02008/135991 apresentam dispositivos biorretaores para produção em escala comercial de polipeptídeos recombinantes de cultura de célula de planta. A Patente Norte-americana N° 7.951.557 e os Pedidos de Patente Norte-americana N° 10/554.387 e 11/790.991 apresentam uma estrutura e expressão de vetores de ácido nucleico para expressão recombinante de enzimas humanas em células de planta. O PCT W02007/010533 apresenta a expressão de polipeptídeos humanos recombinantes, incluindo DNase I, em células de planta, para administração entérica.

SUMÁRIO

[007] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de DNase I humana, caracterizado pela referida proteína de DNase I humana ser translacionalmente fundida no terminal N a um peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático.

[008] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, um uso de códon da sequência de ácido nucleico é otimizado por Nicotinia tabaccum.

[009] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a DNase I humana compreende um resíduo de Glicina N-terminal.

[0010] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana compreende a sequência de aminoácido, conforme estabelecido na SEQ ID N° 6.

[0011] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de DNase I humana compreende a SEQ ID N° 9.

[0012] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana compreende a sequência de aminoácido, conforme estabelecido na SEQ ID N° 5.

[0013] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de DNase I humana compreende a SEQ ID N° 277.

[0014] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático, conforme estabelecido na SEQ ID N° 10.

[0015] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucleico tem uma sequência, conforme estabelecido na SEQ ID N° 12.

[0016] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana tem uma sequência de aminoácido, conforme estabelecido na SEQ ID N° 1 ou conforme estabelecido na SEQ ID N° 5.

[0017] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma estrutura de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de DNase I humana, caracterizado pela referida proteína de DNase I humana ser translacionalmente fundida no terminal N a um peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático de planta.

[0018] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma célula compreendendo a estrutura de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção.

[0019] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a célula é uma célula de planta.

[0020] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a célula de planta é uma célula de tabaco.

[0021] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a célula de tabaco é uma célula BY-2.

[0022] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a célula de tabaco é uma célula de tabaco BY2 em suspensão.

[0023] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a estrutura de ácido nucleico é estavelmente integrada no genoma da referida célula.

[0024] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de produção de uma proteína de DNase I humana recombinante, compreendendo: prover uma célula de acordo com o presente pedido de patente de invenção; e cultivar a célula de modo a produzir a referida proteína de DNase I humana recombinante.

[0025] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método ainda compreende isolar a proteína de DNase I humana recombinante da célula.

[0026] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a célula é uma célula isolada cultivada em um meio de cultura de célula de planta.

[0027] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método ainda compreende isolar a proteína de DNase I humana recombinante do meio de cultura de célula de planta.

[0028] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a cultura é afetada em um biorreator disponível.

[0029] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma proteína de DNase I humana isolada tendo um resíduo de Glicina N-terminal.

[0030] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína isolada tem uma sequência de aminoácido, conforme estabelecido na SEQ ID N° 5.

[0031] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana tem, pelo menos, uma xilose central e, pelo menos, uma a-(1,3) fucose central.

[0032] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase humana reduziu a susceptibilidade para inibição da actina da atividade de endonuclease, conforme comparado com aquela da célula de mamífero que expressou a DNase I humana recombinante.

[0033] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase humana tem uma constante de Michaelis inferior (Km) e maior velocidade de reação (Vmax) para atividade de endonuclease conforme comparado com aquela da célula de mamífero que expressou a DNase I humana recombinante.

[0034] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma proteína de DNase I humana em que a proteína de DNase I é translacionalmente fundida no terminal N a um peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático de planta.

[0035] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático de planta é um sinal de Arabidposis ABPI.

[0036] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana tem uma sequência de aminoácido, conforme estabelecido na SEQ ID N° 1.

[0037] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo, como um princípio ativo, a proteína de DNase I humana do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I sendo translacionalmente fundida no terminal N a um peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático de planta, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0038] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a composição farmacêutica ainda compreende, como um princípio ativo, um sal de magnésio.

[0039] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a composição farmacêutica ainda compreende, como um princípio ativo, um agente para inibir a formação de actina G e/ou melhorar a formação de actina F.

[0040] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a composição farmacêutica é formulada para administrar através do nebulizador.

[0041] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana é pelo menos 90 a 95% de proteína de DNase I humana pura.

[0042] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a composição farmacêutica ainda compreendendo proteína de enzima beta-acetil-hexosaminidase de planta. Em algumas aplicações, a proteína de enzima beta-acetil-hexosaminidase de planta é proteína de enzima beta-acetil-hexosaminidase inativada. Em algumas aplicações, a proteína de enzima beta-acetil-hexosaminidase é proteína de enzima beta-acetil-hexosaminidase inativada por calor.

[0043] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de redução do módulo viscoso de muco, o método compreende expor o muco a uma concentração eficaz da proteína de DNase I humana do presente pedido de patente de invenção.

[0044] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de redução do módulo elástico do muco, o método compreendendo expor o muco a uma concentração eficaz da proteína de DNase I humana do presente pedido de patente de invenção.

[0045] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo em necessidade respectiva, o método compreendendo administrar ao indivíduo a composição farmacêutica do presente pedido de patente de invenção.

[0046] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, doença ou condição está associada com DNA extracelular em excesso em um fluido, secreção ou tecido do referido indivíduo, e a referida administração das referidas composições farmacêuticas resulta em nucleólise do referido DNA extracelular.

[0047] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, administração da composição farmacêutica é efetivada através do nebulizador.

[0048] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o indivíduo está sofrendo de uma doença ou condição pulmonar.

[0049] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a doença ou condição pulmonar é selecionada do grupo consistindo em doença broncopulmonar aguda ou crônica, atelectasia devido à impactação traqueal ou brônquica, e complicações da traqueostomia.

[0050] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a doença broncopulmonar aguda ou crônica é selecionada do grupo consistindo em pneumonia infecciosa, bronquite ou traqueobronquite, bronquiectasia, fibrose cística, asma, TB ou infecções fúngicas.

[0051] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de Fibrose Cística no indivíduo em necessidade respectiva, o método compreendendo administrar ao indivíduo a composição farmacêutica do presente pedido de patente de invenção.

[0052] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o indivíduo está sofrendo de uma doença ou condição selecionada do grupo consistindo em infertilidade masculina, câncer metastático, uma sepsia por infecção viral, bacteriana, fúngica ou protozoário, aterosclerose, diabetes, hipersensibilidade tipo tardia e um distúrbio uterino.

[0053] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a composição farmacêutica é formulada para administração através de um método selecionado do grupo consistindo em inalação, administração local direta, administração parentérica, administração oral, administração intravenosa, administração subcutânea, administração intramuscular, administração intraperitoneal e administração mucosal.

[0054] Salvo indicação ao contrário, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um técnico no assunto ao qual pertence o presente pedido de patente de invenção. Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser utilizados na prática ou teste das aplicações do presente pedido de patente de invenção, métodos exemplares e/ou materiais são descritos abaixo. No caso de conflito, o relatório descritivo de patente, incluindo definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser necessariamente limitastes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0055] Algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção são aqui descritas, a título de exemplo apenas, com referência aos desenhos anexos. Com referência específica agora aos desenhos em detalhe, salienta-se que as particularidades mostradas são, a título de exemplo, para fins de discussão ilustrativa das aplicações do presente pedido de patente de invenção. A esse respeito, a descrição tomada com os desenhos torna aparente para aqueles técnicos no assunto como as aplicações do presente pedido de patente de invenção podem ser praticas.

[0056] Nos desenhos: A figura 1 é um alinhamento da sequência de aminoácido da DNase I humana recombinante de planta (DNase I prh) codificada pelo ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção [SEQ ID N° 1, sequência (b)], e proteína de DNase I humana natural [(GenBank: NM005223, sequência (a)] (SEQ ID N° 2), incluindo o peptídeo líder de sinal natural (destacado de vermelho, SEQ ID N° 3). O peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático Arabidopsis ABPI (SEQ ID N° 4) é destacado de verde.

[0057] A figura 2 é um gráfico mostrando os resultados da expressão de direcionamento da DNase I humana recombinante para diferentes organelas de planta. rhDNase I foi expressa em plantas de tabaco inteiras e marcadas para secreção (para o apoplasto) através de um peptídeo de sinal de direcionamento ER N-terminal (APO), direcionado para o vacúolo, através de um sinal de direcionamento ER N-terminal e um peptídeo de sinal de direcionamento vacuolar C-terminal (VAC) e direcionado para o retículo endoplasmático através de um peptídeo de sinal de direcionamento ER N- terminal e um peptídeo de sinal de retenção ER C-terminal (ER). Atividade de rhDNase I nas células da planta de tabaco foi monitorada por imunorreatividade (ELISA) e de acordo com a atividade catalítica (ensaio verde de DNA-metila), ajustada para a quantidade de biomassa na amostra e expressa como phrDNase I em relação à expressão em células direcionadas ao apoplasto (100%). Note o rendimento significativamente maior quando a rhDNase I é direcionada ao apoplasto.

[0058] A figura 3 mostra um gel de SDS-PAGE ilustrando o tamanho e pureza da DNase I rh expressa pela planta. 1,25pg, 2, 5pg, 5pg e 10pg de DNase humana comercial (Pulmozyme®) (faixas 1 a 4, respectivamente) ou DNase I prh purificada (faixas 6 a 9, respectivamente) foram separados em 15% de Tris-Glicina SDS-PAGE, manchados com azul de Coomassie, e analisados em comparação aos padrões do peso molecular (faixas 5 e 10). Observe a banda predominante, única, da enzima expressa pela planta migrando ligeiramente, mas perceptivelmente mais rápido do que aquela da DNase humana comercial (Pulmozyme®), e a ausência de impurezas de proteína detectáveis.

[0059] A figura 4 mostra um gel de SDS-PAGE ilustrando o tamanho, pureza e identidade antigênica da DNase I rh expressa pela planta. lOng, 5Ong, 10Ong e 200ng de DNase humana comercial (Pulmozyme®) (faixas 1 a 4, respectivamente) ou DNase I prh purificada (faixas 6 a 9, respectivamente) foram separados em 15% de Tris-Glicina SDS-PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose, sondados com anticorpo primário antissoro completo obtido dos coelhos imunizados contra Pulmozyme®, e visualizados com anticorpo conjugado por HPR de IgG de cabra anticoelho. Observe a banda predominante, única, da enzima expressa pela planta, imunorreativa migrando e reagindo similarmente àquela da DNase humana comercial (Pulmozyme®), e a ausência de impurezas de proteína detectáveis.

[0060] As figuras 5A a 5D mostram um gel de IEF e eletroferograma capilar de DNase humana (Pulmozyme®) e DNase I rh expressa pela planta, purificada. A figura 5A mostra a resolução de 6pg de DNase humana comercial (Pulmozyme®) (faixa 1) ou 6 pg de DNase I rh expressa pela planta, purificada (faixas 2 e 3) em um gel com foco isoelétrico. A figura 5B mostra a resolução de 8pg de DNase humana comercial (Pulmozyme®) (faixa 3) ou 8pg de DNase I rh expressa pela planta, purificada de uma linhagem diferente de células BY2 expressando a DNase I prh (faixa 2) em um gel com foco isoelétrico. Observe que Pulmozyme® resolve em múltiplas bandas com pontos isoelétricos (pI) entre pI 3,5 e pI 4,5 em um pH gradiente de pH 3 a pH 7, enquanto e ambas as preparações de DNase I rh expressa pela planta, purificada, a DNase I resolvida em um ponto isoelétrico (pI) entre pI 4,2 e pI 4,5, nas duas bandas maiores e uma banda menor. As condições de eletroforese incluíram 100mV-1 hora, 200mV-1 hora e 500mV-1,5 hora. A faixa 4 (Figura 5A) e faixa 1 (Figura 5B) contêm padrões de proteína para comparação. A figura 5D é um eletroferograma de análise com foco isoelétrico capilar da imagem (escala = pI 3,3-6,1) de DNase I rh expressa pela planta, purificada, mostrando a resolução da DNase I prh conforme observado no gel de IEF [um pico maior (3) a pI 4,41 e dois picos menores (4 e 5) a pI 4,27 e 4,21). 1 e 2 são marcadores de pI 5,85 e 3,59. A Figura 5C é um eletroferograma da escala vazia com marcadores de pI 1 e 2.

[0061] As figuras 6A e 6B mostram a análise de massa molecular de DNase I rh expressa pela planta, purificada pela espectrometria de massa utilizando 2,5 microgramas da DNase I prh purificada utilizando um espectrômetro de massa de tempo de voo de ionização de dessorção a laser assistida pela matriz (MALDI-ToF), com ácido sinapínico como uma matriz. A figura 6A mostrando o espectro total de 20000 a 180000 m/z e a figura 6B mostrando um segmento aumentado do pico de DNase I prh a cerca de 32000 m/z.

[0062] A figura 7 é uma figura representando uma sequência de aminoácido putativa da DNase I rh expressa pela planta, purificada (SEQ ID N° 5), derivada das sequências de peptídeos de sobreposição produzidos pela digestão proteolítica parcial (vide SEQ ID N° 17-276) e separados e analisados em RP-HPLC e espectrometria de massa. Os aminoácidos não confirmados são marcados em vermelho, os locais de glicosilação são sublinhados e o resíduo de Glicina N-terminal é marcado em verde.

[0063] As figuras 8A a 8C representam a análise da estrutura de glicano da DNase I rh expressa pela planta, purificada, conforme determinado pela digestão exoglucosidase e análise de NP-HPLC dos polipeptídeos deglicosilados resultantes. A figura 8A é um perfil de NP-HPLC dos glicanos totais liberados seguindo a digestão de PNGase A da DNase I prh glicosilada, derivada de três lotes exemplares separados de DNase I prh. Os números acima dos picos discretos correspondem às estruturas de glicano específicas ilustradas na figura 8B. A figura 8B é um gráfico mostrando as estruturas de glicano individuais liberadas de DNase I prh pela digestão de PNGase A, e sua abundância relativa (em porcentagens) dos glicanos totais liberados, para cada um dos três lotes exemplares testados. Observe a predominância de dois principais picos de glicano representando uma alta porcentagem de estruturas de glicano (acima de 80%) contendo manose 3- p-(1,2) xilose- a-(1,3) fucose [Fc(3)M3X] e/ou manose 4- a-(1,2) xilose. A figura 8C mostra um perfil de NP-HPLC de glicanos totais liberados de DNase I prh utilizando PNGase A endoglicosidase (top) comparado ao perfil de glicanos N-ligados liberados de Pulmozyme® utilizando PNGase F endoglicosidase (específica para glicanos de alta manose) mostrando uma multiplicidade de variações de glicano. Os principais picos são anotados com estruturas de glicano correspondentes. Observe a ampla variação no padrão de glicosilação encontrada em Pulmozyme®, devido à abundância de glicanos bi e trirramificados, e resíduos de ácido siálico.

[0064] As figuras 9A a 9D são cromatogramas de RP-HPLC de DNase I rh expressa pela planta, purificada, analisada a 214 nm (figura 9A, 9B) e 280 nm (figura 9C, 9D), indicando uma preparação da DNase I prh tendo menos de 7% de impurezas (93,77% puro medido em 214nm, e 93,62% puro medido em 280 nm). Inserções (figuras 9B e 9D) são vistas expandidas do pico de DNase I prh em 214 nm e 280 nm, respectivamente.

[0065] As figuras 10A e 10B são gráficos representando lotes cinéticos de inibição de substrato de DNase I prh purificada (círculos abertos O) e DNase humana comercial (Pulmozyme®) (círculos fechados •), utilizando o substrato fluorométrico DNaseAlert ® detectado em 535 nm e 565 nm. A figura 10A é um lote da velocidade inicial como uma função de concentração de substrato. Observe a cinética superior (Vmax superior, KM inferior, por exemplo, atividade especifica superior) da DNase I prh purificada. A figura 10B é um lote recíproco duplo de velocidade inicial como uma função da concentração do substrato. Os valores de KM e \Tina, foram calculados utilizando as equações de regressão linear a seguir (plotadas na concentração do substrato de 2 a 15 UM) e valores de R2: DNase I prh: y = 41,377x + 1,8693, R2 = 0,9894; Pulmozyme®: y = 120,17x + 4,8316, R2 = 0,9921, indicando cinética tipo inibição do substrato para ambos DNase I prh e Pulmozyme®.

[0066] A figura 11 é um lote de atividade da DNase I rh expressa pela planta, purificada (círculos abertos o) e DNase humana comercial (Pulmozyme®) (círculos fechados •), ilustrando resistências à inibição de actina de atividade de DNase I. 60D (620 nm) é plotado como uma função da concentração de actina G, utilizando o substrato Verde de Metila, para render valores de ICH. Observe a susceptibilidade reduzida para inibição da actina G da DNase I prh purificada, comparada àquela da DNase humana comercial (Pulmozyme®).

[0067] A figuras 12A a D são histogramas ilustrando o efeito de concentrações crescentes de DNase I no módulo elástico do muco de pacientes com Fibrose Cística, determinado utilizando medições de tempo de varrimento com um reômetro (HAAKE RheoStress I, Thermo Fisher Scientific GmBH, Alemanha). A figura 12A representa uma comparação do efeito de DNase I rh expressa pela planta, purificada (barras escuras) e DNase humana comercial (Pulmozyme®) (barras tracejadas) no módulo elástico de escarro de paciente com FC, medido em 2, 10 e 20pg de DNase I/g de muco. O conteúdo de DNA do muco foi de 4,66pg de DNA/ g de muco. Cada valor representa pelo menos 2 determinações medidas de cada amostra de muco. As figuras 12B a 12D mostram o efeito de DNase I prh no módulo elástico do escarro coletado de pacientes individuais. Observe a redução marcada, superior e consistente, dependente de dose do módulo elástico do muco seguindo à incubação com DNase I prh, conforme comparado ao Pulmozyme®.

[0068] As figuras 13A a D são histogramas ilustrando o efeito de concentrações crescentes de DNase I no módulo viscoso do muco de pacientes com Fibrose Cística, medido utilizando técnica de tempo de varrimento com um reômetro (HAAKE RheoStress I, Thermo Fisher Scientific GmBH, Alemanha). A figura 13A representa uma comparação do efeito de DNase I rh expressa pela planta, purificada (barras escuras) e DNase humana comercial (Pulmozyme®) (barras tracejadas) no módulo viscoso do escarro do paciente com FC, medido em 2, 10 e 20pg de DNase I/g de muco. O conteúdo de DNA do muco foi de 4,66 pg de DNA/ g de muco. Cada valor representa pelo menos 2 determinações medidas de cada amostra de muco. As figuras 13B a 13D mostram o efeito de DNase I prh no módulo viscoso do escarro coletado de pacientes individuais. Observe a redução marcada, superior e consistente, dependente de dose do muco módulo viscoso seguindo à incubação com DNase I prh, conforme comparado ao Pulmozyme®.

[0069] As figuras 14A e 14B são histogramas representando o efeito de DNase I prh nas propriedades reológicas do muco de pacientes com Fibrose Cística, medidas utilizando técnica de tempo de varrimento, expressa como propriedades reológicas de mudança percentual (módulo elástico, figura 14A e módulo viscoso, figura 14B) comparado a uma amostra não tratada. A figura 14A mostra a mudança percentual do módulo elástico do escarro de 4 pacientes individuais (barras pretas= amostras de controle não tratadas; barras tracejadas = 2pg de DNase I prh; barras cinzas= 20pg de DNase I prh). A figura 14B mostra a mudança percentual do módulo viscoso do escarro de 4 pacientes individuais (barras pretas= amostras de controle não tratadas; barras tracejadas=2pg de DNase I prh; barras cinzas= 20pg de DNase I prh). Observe a redução marcada consistente em propriedades reológicas seguindo a incubação do escarro com DNase I prh.

[0070] A figura 15 é um histograma ilustrando o efeito sinérgico de DNase I rh expressa pela planta, purificada na redução do módulo elástico do muco de FC por Magnésio (MgC12) (0, 25, 50 e 100 mM), medido utilizando técnica de tempo de varrimento, com reômetro (HAAKE RheoStress I, Thermo Fisher Scientific GmBH, Alemanha). O módulo elástico do muco foi determinado em concentrações indicadas de Mg' (mM MgC12) na presença (barras transversais tracejadas) ou ausência (barras escuras, tampão apenas) de DNase I prh (2pg de DNase I prh/g de muco). Cada valor representa pelo menos 2 determinações. Observe a redução sinérgica do módulo elástico do muco seguindo incubação com a DNase I prh e Magnésio, conforme comparado ao Magnésio sozinho.

[0071] A figura 16 é um histograma ilustrando o efeito dos sais de Magnésio na redução de DNase I do módulo viscoso do muco em FC. A figura 16 mostra o efeito sinérgico de DNase I rh expressa pela planta, purificada na redução do módulo viscoso do muco de FC por Magnésio (MgC12) (0, 25, 50 e 100 mM), medido com um reômetro (HAAKE RheoStress I, Thermo Fisher Scientific GmBH, Alemanha). O módulo viscoso do muco foi determinado nas concentrações indicadas de Mg2+ (mM MgC12) na presença (barras transversais tracejadas) ou ausência (barras cinzas, tampão apenas) de DNase I prh (2 pg de DNase I /g de muco). Cada valor representa pelo menos 2 determinações. Observe a redução sinérgica do módulo viscoso do muco seguindo incubação com a DNase I prh e Magnésio, conforme comparado ao Magnésio sozinho.

[0072] A figura 17 é um gráfico ilustrando o efeito dos diferentes sais de Magnésio na atividade catalítica de DNase da DNase I rh expressa pela planta, purificada. A atividade catalítica de DNase I rh foi medida na presença de concentrações crescentes (0,5 a 100 mM) de cloreto de Magnésio (MgC12, círculos fechados •) ou sulfato de Magnésio (MgSO4, diamantes abertos O), utilizando o substrato verde de metila e expresso como a mudança na absorvência a 630 nm (6 OD 630 nm) após 3 horas de incubação com a enzima. Observe que o sal de magnésio inibiu a atividade de DNase I rh até 50 mM, e que a atividade de DNase I rh foi apenas ligeiramente prejudicada por MgSO4 a 100 mM.

[0073] As figuras 18A a 18D são histogramas ilustrando o efeito de concentrações crescentes de DNase I nas propriedades reológicas do muco de pacientes com Fibrose Cística, determinadas utilizando a técnica de tempo de varrimento com um reômetro (HAAKE RheoStress I, Thermo Fisher Scientific GmBH, Alemanha), expresso como a tensão (Pa) no cruzamento dos módulos elástico e viscoso (ângulo de fase = 450). As figuras 18A a 18D representam uma comparação do efeito de DNase I rh expressa pela planta, purificada (barras escuras) e DNase humana comercial (Pulmozyme®) (barras tracejadas) nas propriedades reológicas de quatro escarros de paciente individual com FC, medida em 0,2, 2 e 20pg de DNase I /g de muco. O conteúdo do DNA do muco foi de 3,09 mg de DNA/g de muco, 3,15 mg de DNA/ g de muco, 8,36 mg de DNA/g de muco e 3,89 mg de DNA/g de muco (figuras 18A a 18D, respectivamente). Cada valor representa, pelo menos, 2 determinações medidas de cada amostra de muco. Observe a redução marcada e consistente, dependente de dose em valores de tensão de cruzamento seguindo incubação com DNase I prh.

[0074] As figuras 19A a 19D são histogramas representando o efeito de DNase I prh e Pulmozyme® nas propriedades reológicas do muco de quatro pacientes diferentes com Fibrose Cística (19A-19D), medidas utilizando técnica de tempo de varrimento, expressa como tensão (Pa) no cruzamento dos módulos elástico e viscoso (ângulo de fase = 45'). O conteúdo de DNA do muco foi de 2,16 mg de DNA/ g de muco, 2,63 mg de DNA/ g de muco, 3,45 mg de DNA/ g de muco e 4,17 mg de DNA/ g de muco (figuras 19A a 19D, respectivamente) Barras pretas= DNase I prh; barras tracejadas= Pulmozyme®. A concentração de DNase I (0, 2 ou 20 pg de DNase I/ g de muco). Observe a redução marcada consistente nas propriedades reológicas seguindo incubação do escarro com DNase I prh, significativamente superando Pulmozyme® em 3 dos quatro pacientes.

[0075] As figuras 20A a 20C são histogramas ilustrando o efeito de sais de Magnésio e DNase I nas propriedades reológicas das amostras de muco de FC de três pacientes diferentes com Fibrose Cística, medidas utilizando a técnica de tempo de varrimento com um reômetro (HAAKE RheoStress I, Thermo Fisher Scientific GmBH, Alemanha), expresso como a tensão (Pa) no cruzamento dos módulos elástico e viscoso (ângulo de fase = 45°). O paciente A da figura 20A (1,84 mg de DNA/g de muco), o paciente B da figura 20B (3,46 mg de DNA/g de muco) e a figura 20C (2,39mg de DNA/g de muco). As colunas escuras são medições sem Magnésio, as colunas cinza são medições com MgSO4a 100 mM, medidas em O (controle) 2 e 20pg de DNase I/g de muco. Cada valor representa pelo menos 2 determinações medidas de cada amostra de muco. Observe a interrupção marcada e sinérgica da estrutura elástica do muco seguindo incubação com DNase I prh e MgSO4.

DESCRIÇÃO DAS APLICAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[0076] O presente pedido de patente de invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se a um polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo de DNase I humana, um vetor de expressão de planta para expressão recombinante do polipeptídeo de DNase I humana em células de planta, métodos para a expressão do mesmo em células de planta e o polipeptídeo de DNase I humana produzido desse modo. Em particular, o presente pedido de patente de invenção refere-se à utilização terapêutico da DNase I humana expressa por planta para distúrbios pulmonares e outros, tais como Fibrose Cística.

[0077] Deve ser entendido que o presente pedido de patente de invenção não é necessariamente limitad0 em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na descrição seguinte ou exemplificados pelos Exemplos. O presente pedido de patente de invenção é capaz de outras aplicações ou de ser praticado ou realizado em várias maneiras.

[0078] Experiência clínica, começando com DNase I pancreática bovina, indicou que as composições de enzima recombinante disponíveis podem diferir com relação à tolerância do paciente, imunogenicidade, regime de dosagem e eficácia clínica. Outra desvantagem associada com as enzimas recombinantes existentes é sua despesa, que pode colocar um pesado encargo econômico nos sistemas de cuidado da saúde. Os rendimentos da Genentech a partir de Pulmozyme® ultrapassaram os 300 milhões de dólares, anualmente, por mais de três anos desde 2008. O alto custo dessas enzimas recombinantes, quando produzidas nas culturas de célula de mamífero ou biorreatores resulta de uma purificação complexa e protocolo de modificação, e as quantidades relativamente grandes dos terapêuticos requeridos para os tratamentos existentes.

[0079] Além disso, rendimentos e eficácia clínica de algumas proteínas recombinantes, dentre eles alguns terapeuticamente importantes tais como enzimas, muitas vezes decepcionaram no passado. Ainda também, julgar pela ausência de novos ensaios clínicos, alguns ou nenhum dos candidatos para a “próxima geração” de DNase I humana recombinante clinicamente adequada viera à tona. A produção eficaz de DNase I humana em um sistema de expressão à base de célula de planta, para eficácia aumentada de expressão e produção de DNase I humana recombinante tendo atividade catalítica melhorada e farmacocinéticos em condições clínicas poderia reduzir significativamente o custo da DNase I de modo que essa terapia de salvamento de vida possa ser fornecida mais acessível a todos que requeiram.

[0080] Além disso, os presentes inventores também tentaram resolver o fenômeno de inibição de actina da atividade catalítica de endonuclease, que ameaça reduzir a eficácia da administração de DNase I para doenças respiratórias e outras condições associadas com acúmulo de muco. Junto do DNA liberado das células seguindo atividade de neutrófilos em doença broncopulmonar, a actina acumula, ainda contribuindo para a viscosidade do muco resultante. A inibição da atividade catalítica de DNase pela actina foi documentada, e é crítica para a eficácia da terapia de inalação de DNase. Estudos da interação de actina-DNase I revelaram que a forma G da actina é altamente inibitória da atividade de DNase I, enquanto a forma de actina F não é.

[0081] Os presentes inventores rastrearam um vetor de expressão de planta para expressão recombinante de DNase I humana em células de planta compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de DNase I humana, transformaram plantas de tabaco com o vetor e isolaram a DNase I humana cataliticamente ativa das plantas. As propriedades bioquímicas da DNase I humana recombinante expressa por planta comparam favoravelmente com aquelas de Pulmozyme® de padrão clínico comercialmente disponível (Dornase alfa), e os resultados com muco de FC sugerem um efeito vantajoso da DNase I humana recombinante expressa por planta na redução dos parâmetros reológicos do muco, bem como susceptibilidade reduzida para inibição de actina da atividade de DNase endonuclease.

[0082] As diferenças estruturais não cobertas entre a DNase I humana recombinante expressa por planta e DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme®) (mobilidade em PAGE, unidade de espécie de DNase I imunorreaciva, conforme detectado em Western blots, vide adiante) sugerem que ambas as modificações de sequência de aminoácido e modificação pós-translacional resultante de processamento do polipeptídeo expresso pela célula de planta podem ser responsáveis por algumas das características funcionais distintivas da enzima recombinante expressa pela planta.

[0083] Assim, de acordo com um aspecto do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de DNase I humana, em que a proteína de DNase I humana é contiguamente ligada ao N- terminal para um peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático de planta.

[0084] Conforme utilizado aqui, o termo “proteína de DNase I humana” refere-se ao polipeptídeo de DNase I humana (desoxirribonuclease I; EC 3.1.21.1; DNase I). A DNase I humana é classificada como uma endonuclease, que cliva o DNA para produzir produtos finais de 5' fosfodi- e 5' fosfo-oligonucleotídeo, com uma preferência para substratos de DNA de cadeia dupla e pH alcalino ideal. Outros membros da família de endonucleases DNase I são DNase X, DNase lâmbda, DNASIL2 e lipocalina da lágrima em humanos. DNase I também é conhecida, inter alia, como DNase alcalina, DNase pancreática bovina (bp), DNase A, DNA fosfatase e DNA endonuclease, por exemplo, em Bos taurus. De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana é a proteína madura de DNase I humana, tendo a sequência de aminoácido, conforme estabelecido na SEQ ID N° 6. Será apreciado que a proteína de DNase I humana pode ser uma proteína de DNase I humana modificada, tendo uma sequência de aminoácido diferente daquela da SEQ ID N° 6 enquanto mantém a estrutura característica e/ou função de DNase I. Um exemplo não limitaste de uma proteína de DNase I humana modificada codificada pelo vetor de expressão do presente pedido de patente de invenção é SEQ ID N° 5.

[0085] Ainda de acordo com outras aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase humana expressa por planta é uma proteína de DNase humana variante. As proteínas de DNase humana variante, que têm propriedades catalíticas alteradas e/ou outras bioquímicas e estruturais, tais como afinidade de activa alterada, requisitos de cofator, pH ideal, vida de prateleira aumentada no armazenamento e similar, expressão recombinante aumentada ou proteínas de fusão foram divulgadas (vide, por exemplo, EC 3.1.21.2; EC 3.1.21.3; EC 3.1.21.4; EC 3.1.21.5; EC 3.1.21.6 e EC 3.1.21.7). Os polipeptídeos de DNase I modificados adequados incluem, entre outros, polipeptídeos de DNase divulgados em US 6.348.343; US 6.391.607; US 7.407.785; US 7.297.526 e W02008/039989.

[0086] De acordo com algumas aplicações, o polipeptídeo de DNase é um polipeptídeo de proteína tipo DNase. O termo “proteína tipo DNase I” refere-se a uma enzima que tem uma classificação de enzima de EC 3.1.21.x, onde “x” é um número inteiro positivo. Conforme utilizado aqui, “proteínas tipo DNase I” são um subconjunto de “DNases.” A sequência de aminoácidos de muitas DNases, e as sequências de codificação tais como proteínas de DNase são bem conhecidas na técnica, disponível das bases de dados genômicos públicos tais como GenBank, SwissProt, EMBL e muitos outros.

[0087] Ainda de acordo com outras aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana compreende uma glicina N-terminal, e a proteína de DNase I humana contiguamente ligada ao N- terminal para um peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático Arabidopsis ABPI é codificada por uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID N° 12.

[0088] Conforme mencionado, de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana compreende a sequência de aminoácido, conforme estabelecido na SEQ ID N° 5. Quando a DNase I humana recombinante expressa pela planta do presente pedido de patente de invenção foi submetida à digestão proteolítica controlada, espectrometria de massa dos oligopeptídeos resultantes revelou que o polipeptídeo de DNase I humana poderia ser caracterizado por um grupo de fragmentos de peptídeo de sobreposição, que juntos indicaram que o comprimento total de DNase I humana recombinante expressa pelas células de planta era idêntico, em sequência de aminoácido, para aquele da DNase I humana nativa, com a adição de um resíduo de glicina N-terminal (vide Exemplo 2 e Tabelas V e Va, adiante). Outra análise da sequência de aminoácido confirmou a exatidão da sequência e identidade com a DNase I humana nativa. Assim, de acordo com algumas aplicações de alguns aspectos do presente pedido de patente de invenção, a composição farmacêutica inalável compreende uma DNase I prh compreendendo uma pluralidade de fragmentos de peptídeo de proteína de DNase I, os fragmentos tendo a sequência de aminoácido, conforme estabelecido nas SEQ ID N° 17-276 e 278-291. Em algumas outras aplicações, a DNase I prh tem um resíduo de glicina N-terminal adicional, e em outras aplicações, a DNase I prh é desfornecida de um resíduo de glicina N-terminal. Em algumas aplicações, a DNase I humana recombinante caracterizado por fragmentos de peptídeo de sobreposição consecutivos, em que o fragmento de peptídeo SEQ ID N° 17 representa um fragmento N-terminal da DNase humana recombinante e fragmento de peptídeo SEQ ID N° 276 representa um fragmento C-terminal da DNase humana recombinante, e fragmentos intermediários de sobreposição incluem todos ou qualquer um dos fragmentos de peptídeo representados pelas sequências de aminoácido, conforme estabelecido nas SEQ ID N° 18 a 275 e 278 a 291.

[0089] De acordo com algumas aplicações de alguns aspectos do presente pedido de patente de invenção, a massa molecular do polipeptídeo de DNase humana recombinante expressa pela planta é similar à massa molecular, conforme medido por PAGE e/ou espectrometria de massa, da DNase I humana recombinante expressa em células de mamíferos (Pulmozyme@). Assim, em algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polipeptídeo de DNase humana recombinante expressa pela planta tem uma massa molecular de cerca de 30 kD, conforme medido por SDS-PAGE, e cerca de 32 kD, conforme medido por espectrometria de massa. De acordo com algumas aplicações, a mobilidade eletroforética da proteína glicosilada de DNase I humana recombinante expressa pela planta é maior do que aquela da DNase I humana recombinante expressa em células de mamíferos (Pulmozyme0). Ainda em outras aplicações, o polipeptídeo de DNase humana recombinante expressa pela planta é uma proteína glicosilada, compreendendo uma porção de polipeptídeo que tem uma massa molecular de cerca de 29 kD.

[0090] Conforme mostrado nos Exemplos 2 e 3, DNase I humana recombinante expressa por planta é totalmente reativa de forma cruzada com DNase I recombinante anti-humana antissoro produzida contra DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme®), por exemplo, conforme detectado por Western blotting da DNase I humana recombinante expressa por planta separada por gel (vide Figura 4) e com ELISA (vide Exemplo 3). Assim, de acordo com algumas aplicações, a proteína de DNase I humana recombinante expressa pela planta é imunorreativa com DNase I anti-humana antissoro. O anticorpo da DNase I anti-humana pode ser qualquer anticorpo policlonal, produzido contra DNase I humana em um mamífero, por exemplo, coelho, cabra, cavalo, etc., ou em outros, vertebrados não mamíferos, por exemplo, anticorpo de gema de galinha IgY, podem ser um anticorpo isolado ou pode estar na forma de antissoro ou pode ser um anticorpo de DNase anti-humana monoclonal.

[0091] Conforme mostrado nas figuras 5A a 5D, focagem isoelétrica da proteína de DNase I humana recombinante expressa pela planta revelou que a proteína de DNase I humana recombinante expressa pela planta é caracterizado por duas isoformas principais com pontos isoelétricos entre 4,2 e 4,5 e uma isoforma menor com um pI entre 4,2 e 3,5. Assim, em algumas aplicações, a proteína de DNase I humana recombinante expressa pela planta é caracterizada por duas isoformas principais com pontos isoelétricos entre 4,2 e 4,5. Em outras aplicações, a proteína de DNase I humana recombinante expressa pela planta é ainda caracterizada por uma isoforma menor com um pI entre 4,2 e 3,5.

[0092] De acordo com algumas aplicações de alguns aspectos do presente pedido de patente de invenção, a DNase I prh é uma proteína de DNase humana expressa pela célula de planta secretada no meio. Purificação da proteína de DNase humana expressa pela célula de planta secretada do meio rendeu uma composição compreendendo a proteína de DNase prh humana, que descobriu que inclui menos de 7% de impurezas (material não DNase I), conforme monitorado por RP-HPLC (vide Figuras 9A a 9D). Assim, em algumas aplicações, a proteína de DNase I prh humana é uma proteína purificada, caracterizada por uma pureza de, pelo menos, 85%, pelo menos 87%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 91,5%, pelo menos 92%, pelo menos 92,5%, pelo menos 93%, pelo menos 93,1%, pelo menos 93,2%, pelo menos 93,3%, pelo menos 93,4%, pelo menos 93,5%, pelo menos 93,6%, pelo menos 93,7%, pelo menos 93,8%, pelo menos 93,9%, pelo menos 94%, pelo menos 94,5%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,1%, pelo menos 99,2%, pelo menos 99,3%, pelo menos 99,4%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8%, pelo menos 99,9%, em uma faixa de, pelo menos, 95,0 a 99,8% ou 100% de pureza. Em algumas aplicações, a pureza da proteína de DNase I humana recombinante expressa pela planta é medida por HPLC.

[0093] Em algumas aplicações, a composição de DNase I humana recombinante expressa por planta compreende impurezas derivadas de célula hospedeira de planta, tais como, entre outros, ácido nucleicos e polinucleotídeos, aminoácidos, oligopeptídeos e polipeptídeos, glicanos e outros carboidratos, lipídios e similares. Em algumas aplicações, as impurezas derivadas da célula hospedeira compreendem molécula biologicamente ativas, tais como enzimas. Em outras aplicações, a composição de DNase I humana recombinante expressa por planta compreende beta-N-acetil-hexosaminidase de planta. Onde a célula hospedeira é uma célula de tabaco, ou célula da linhagem de célula de tabaco, a beta-N-acetil-hexosaminidase de planta é uma beta-N-acetil-hexosaminidase de tabaco.

[0094] Em outras aplicações, a beta-N-acetil-hexosaminidase de planta é beta-N-acetil-hexosaminidase de planta inativada. Inativação da beta- N-acetil-hexosaminidase de planta pode ser efetivada por meios físicos, meios químicos ou meios bioquímicos. A inativação física pode ser realizada por aquecimento, congelamento, dissecação, etc. A inativação química pode ser realizada por extremos de pH, desnaturação química, adição ou remoção de cadeias laterais, glicanos, aminoácidos, etc. A inativação bioquímica inclui, entre outros, inibição aos inibidores reversíveis ou irreversíveis. Os inibidores de beta-N-acetil-hexosaminidase exemplares incluem inibidores de produto final tais como N-acetil-D-glucosamina e beta-metilN-acetil glucosamina, e inibidores seletivos tais como os compostos divulgados nos Pedidos de Patente Norte-Americana US 2010016386, US 20110237631, US 20100087477 e US 20120046337. Será apreciado que os métodos preferidos para inibição e/ou inativação da beta-N-acetil-hexosaminidase de planta são aqueles que também preservam eficazmente a integridade estrutural e funcional da enzima de DNase I humana expressa pela planta.

[0095] Em algumas aplicações, a beta-N-acetil-hexosaminidase de planta é inativada por aquecimento da composição de DNase I humana recombinante expressa por planta. Temperaturas adequadas para inibição de beta-N-acetil-hexosaminidase de planta e/ou ativação incluem aquecimento dentro de uma faixa de 37 a 60°C por um período de 2 a 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou mais minutos. Será apreciado que inibição e/ou inativação eficaz da beta-N-acetil-hexosaminidase de planta é alcançada mais rapidamente em temperaturas mais altas e mais lentamente em temperaturas mais baixas da faixa. Em algumas aplicações, a composição de DNase I humana recombinante expressa por planta é aquecida na faixa de 45 a 55°C por 2 a 10 minutos. Em algumas aplicações, a inibição/inativação resulta em 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80% ou mais de inativação da beta-N-acetil-hexosaminidase de planta.

[0096] De acordo com outro aspecto do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana é contiguamente ligada ao N- terminal a um peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático Arabidopsis ABPI.

[0097] Conforme utilizado aqui, termo “contiguamente ligado no N- terminal” refere-se ao anexo covalente do peptídeo indicado através de um peptídeo ligado ao aminoácido N-terminal da proteína madura, por exemplo, proteína de DNase I humana. “Contiguamente ligado ao C-terminal” refere-se ao anexo covalente do peptídeo indicado através de um peptídeo ligado ao aminoácido C-terminal da proteína madura, por exemplo, proteína de DNase I humana.

[0098] Conforme utilizado aqui, o termo “peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático Arabidopsis ABPI” refere-se à sequência de peptídeo líder da proteína de ligação de auxina Arabidopsis thaliana, que é capaz de direcionar a proteína expressa para o retículo endoplasmático dentro da célula de planta. Em uma aplicação, o peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático Arabidopsis ABPI é um polipeptídeo de aminoácido 33 conforme estabelecido na SEQ ID N° 4.

[0099] Assim, de acordo com outro aspecto do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana contiguamente ligada ao N-terminal para um peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático Arabidopsis ABPI e a proteína de DNase I humana tem uma sequência de aminoácido, conforme estabelecido na SEQ ID N° 1.

[00100] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana é codificada por uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID N° 9. De acordo com outras aplicações do presente pedido de patente de invenção, o peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático Arabidopsis ABPI é codificado por uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID N° 10. De acordo ainda com outras aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana contiguamente ligada ao N-terminal para um peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático Arabidopsis ABPI é codificado por uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID N° 12.

[00101] A fim de expressar o polipeptídeo, a sequência codificando a mesma é ligada em um “construto de expressão de ácido nucleico de planta”.

[00102] Conforme utilizado aqui, o termo “construto de expressão de ácido nucleico de planta” refere-se a um construto de ácido nucleico que inclui o ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção e, pelo menos, um promotor para direcionar a transcrição do ácido nucleico em uma célula hospedeira de planta. Outros detalhes de abordagens de transformação adequada são fornecidos adiante.

[00103] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida um construto de expressão de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção, e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira de planta.

[00104] Conforme utilizado aqui, o termo “sequência de ácido nucleico” refere-se a uma sequência de ácido nucleico de cadeia única ou dupla que é isolada e fornecida na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), uma sequência de polinucleotídeo genômico e/ou sequência de polinucleotídeo compósito (por exemplo, uma combinação do acima).

[00105] Conforme utilizado aqui, a expressão “sequência de polinucleotídeo complementar” refere-se a uma sequência, que resulta de transcrição reversa do RNA mensageiro utilizando uma transcriptase reversa ou qualquer outro RNA dependente de DNA polimerase. Tal sequência pode ser subsequentemente amplificada in vivo ou in vitro utilizando um DNA dependente DNA polimerase.

[00106] Conforme utilizado aqui, a expressão “sequência de polinucleotídeo genômico” refere-se a uma sequência derivada (isolada) de um cromossomo e, assim, representa uma porção contígua de um cromossomo.

[00107] Conforme utilizado aqui, a expressão “sequência de polinucleotídeo compósito” refere-se a uma sequência, que é pelo menos parcialmente complementar e, pelo menos, parcialmente genômica. Uma sequência de compósito pode incluir algumas sequências exonais requeridas para codificar o polipeptídeo do presente pedido de patente de invenção, bem como algumas sequências intrônicas interpondo entre elas. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindo de outros genes, e tipicamente incluirão sequências de sinal de junção conservadas. Tais sequências intrônicas podem ainda incluir elementos regulatórios de expressão de ação cis.

[00108] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, as sequências de ácido nucleico codificando os polipeptídeos do presente pedido de patente de invenção são otimizadas para expressão em plantas. Exemplos de tais modificações de sequência incluem, entre outros, um conteúdo G/C alterado para abordagem mais próxima que é tipicamente encontrada nas espécies de planta de interesse, e a remoção dos códons atipicamente encontrada nas espécies de planta comumente referidas a uma otimização de códon. Em uma aplicação, a utilização do códon da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de DNase I humana, a proteína de DNase .I humana contiguamente ligada ao N-terminal para um peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático Arabidopsis ABPI, ou qualquer outra proteína de DNase I humana descrita aqui é otimizada para Nicotiana tabacuum ou Nicotiana benthamiana.

[00109] A expressão “otimização de códon” refere-se à seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para uso dentro de um gene estrutural ou fragmento do mesmo que se aproxima a utilização do códon dentro da planta de interesse. Portanto, um gene otimizado ou sequência de ácido nucleico refere-se a um gene em que a sequência de nucleotídeo de um gene nativo ou de ocorrência natural foi modificada a fim de utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro da planta. A sequência de nucleotídeo tipicamente é examinada no nível de DNA e a região de codificação otimizada para expressão nas espécies de planta determinadas utilizando qualquer procedimento adequado, por exemplo, conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). Nesse método, o desvio padrão da utilização de códon, uma medida da polarização da utilização do códon, pode ser calculado pela primeira descoberta do desvio proporcional quadrado da utilização de cada códon do genenativo em relação àquele dos genes de planta altamente expressos, seguido por um cálculo do desvio médio quadrado. A fórmula usada é: 1 SDCU = n = 1 N [(Xn - Yn) / Yn] 2 / N, onde Xn refere-se à frequência da utilização do códon n em genes de planta altamente expressos, onde Yn para a frequência da utilização do códon n no gene de interesse e N refere-se ao número total de códons no gene de interesse. Uma tabela de uso do códon de genes altamente expressos de plantas dicotiledôneas foi compilada utilizando os dados de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498).

[00110] Um método de otimização da sequência de ácido nucleico de acordo com a utilização do códon preferido para um tipo de célula de planta particular é baseado na utilização direto, sem realizar nenhum cálculo estatístico extra, de tabelas de otimização de códon tais como aquelas fornecidas on-line no Banco de Dados de Uso do Códon através do banco de DNA do NIAS [National Institute of Agrobiological Sciences 1 Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas] no Japão (http://www (ponto) kazusa (ponto) ou (ponto) jp/códon/). O Banco de Dados de Uso do Códon contém tabelas de uso do códon para várias espécies diferentes, com cada tabela de uso do códon sendo estatisticamente determinada com base nos dados apresentados em Genbank.

[00111] Ao usar tais tabelas de otimização de códon para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos para cada aminoácido em uma espécie particular (por exemplo, arroz), uma sequência de nucleotídeo de ocorrência natural codificando uma proteína de interesse pode ser otimizada no códon para aquela espécie de planta particular. Isso é feito pela substituição dos códons que podem ter uma incidência estatística baixa no genoma da espécie particular com códons correspondentes, em relação a um aminoácido, que são estatisticamente mais favorecidos. Entretanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para excluir os locais de restrição, para criar novos em juncos potencialmente úteis (extremidades 5' e 3' para adicionar peptídeo de sinal ou cassetes de terminação, locais internos que podem ser utilizados para cortar e unir segmentos juntos para produzir uma correta sequência de comprimento total), ou para eliminar as sequências de nucleotídeo que pode afetar negativamente a estabilidade ou expressão do RNAm.

[00112] A desejada sequência de nucleotídeo de codificação já pode, antes de qualquer modificação, conter vários códons que correspondam a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie de planta particular. Portanto, a otimização do códon da sequência de nucleotídeo nativa pode compreender determinação dos códons, dentro da sequência de nucleotídeo desejada, que não são estatisticamente favorecidos com relação a uma planta particular, e modificação desses códons de acordo com uma tabela de uso do códon da planta particular para produzir um derivado otimizado de códon. Uma sequência de nucleotídeo modificada pode ser total ou parcialmente otimizada para uso do códon de planta contanto que a proteína codificada pela sequência de nucleotídeo modificada seja produzida em um nível mais alto do que a proteína codificada pelo gene nativo ou de ocorrência natural correspondente. A construção dos genes sintéticos pela alteração da utilização do códon é descrita no, por exemplo, Pedido de Patente PCT 93/07278.

[00113] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o ácido nucleico é operacionalmente ligado à sequência de promotor.

[00114] Uma sequência de ácido nucleico de codificação é “operacionalmente ligada” a uma sequência regulatória (por exemplo, promotor) se a sequência regulatória for capaz de exercer um efeito regulatório na (por exemplo, efeito na expressão de) sequência de codificação ligada a ele.

[00115] Qualquer sequência do promotor adequada pode ser usada pela estrutura de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção. Preferencialmente, o promotor é um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido ou um indutível.

[00116] Conforme usada aqui, a expressão “expressável em planta” refere-se a uma sequência do promotor, incluindo quaisquer elementos regulatórios adicionais adicionados a ela ou contidos nela, que é pelo menos capaz de induzir, conferir, ativar ou melhorar a expressão em uma célula, tecido ou órgão de planta, preferencialmente uma célula, tecido ou órgão de planta monocotiledônea ou dicotiledônea. Tal promotor pode ser constitutivo, isto é, capaz de direcionar o alto nível de expressão de gene em uma pluralidade de tecidos, tecido especifico, isto é, capaz de direcionar a expressão de gene em um tecido particular ou tecidos, indutível, isto é, capaz de direcionar a expressão de gene em um estímulo, ou quimérico, isto é, formado de porções de, pelo menos, dois promotores diferentes.

[00117] Exemplos de promotores preferidos úteis para os métodos de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção são apresentados na Tabela I, II, III e IV. Tabela I Promotores constitutivos exemplares para uso no desempenho de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção Tabela II Promotores preferidos de semente exemplares para uso no desempenho de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção TABELA III Promotores específicos de flor exemplares para uso no desempenho do presente pedido de patente de invenção TABELA IV

[00118] Promotores de arroz alternatives para uso no desempenho do presente pedido de patente de invenção

[00119] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção também pode incluir um marcador selecionável apropriado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a estrutura de ácido nucleico utilizada é um vetor de retribuição, que pode propagar em E. coli (em que a estrutura compreende um marcador selecionável apropriado e origem de replicação) e ser compatível com propagação em células. A estrutura de acordo com o presente pedido de patente de invenção pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmídeo, um fagemídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

[00120] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção pode ser utilizada para transformar estavelmente ou transientemente as células de planta. Em transformação estável, o ácido nucleico está integrado no genoma da planta e como tal representa um traço estável e herdado. Na transformação transiente, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, mas não é integrado no genoma e como tal representa um traço transiente.

[00121] Assim, de acordo com alguns aspectos do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma célula isolada compreendendo a estrutura de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção.

[00122] Conforme utilizado aqui, o termo “célula isolada” refere-se a uma célula pelo menos parcialmente separada do ambiente natural, por exemplo, de uma planta. Em algumas aplicações, a célula isolada é uma célula de planta de uma planta inteira. Em algumas aplicações, a célula isolada é uma célula de planta, por exemplo, uma célula de planta em cultura.

[00123] O termo “planta” conforme utilizado aqui engloba as plantas inteiras, ancestrais e descendência das plantas e partes da planta, incluindo sementes, rebentos, caules, raízes (incluindo tubérculos), e células, tecidos e órgãos de planta. A planta pode estar em qualquer forma incluindo culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen, e microesporos. As plantas que são particularmente úteis nos métodos do presente pedido de patente de invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular plantas monocotiledônea e dicotiledônea incluindo um forradeiras ou forragem vegetal, planta ornamental, cultura alimentar, árvore, ou arbusto selecionado da lista compreendendo Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vilosa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseupontosuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbeilata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcaçofra, aspargos, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve, lingo, couve, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, feijão de soja, palha, beterraba sacarina, cana de açúcar, girassol, tomate, chá de abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilha, lentilha e alfafa, algodão, colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela, eucalipto, um árvore, uma planta ornamental, um grama perene e uma plantação de forragem. Alternativamente, algas e outras não Viridiplantae podem ser usadas para os métodos do presente pedido de patente de invenção.

[00124] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta ou célula de planta é uma planta de lentilha, célula ou nódulo. Planta de lentilha (membros da família monocotiledônea Lemnaceae, ou Lemna) ou cultura de nódulo de lentilha pode ser eficazmente transformada com um cassete de expressão contendo uma sequência de nucleotídeo de interesse por qualquer um dos vários métodos incluindo transferência de gene mediada por agrobactéria, bombardeamento balístico, ou eletroporação. Métodos para engenharia molecular de células de lentilha e descrição detalhada dos sistemas de expressão de lentilha para produção comercial de polipeptídeos são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patentes Norte-Americanas N°. 6.040.498 e 6.815.184 de Stomp, et al, e 8.022.270 de Dickey et al, todos os quais estão incorporados em sua totalmente, por referência, neste documento).

[00125] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta ou célula de planta usada pelo método do presente pedido de patente de invenção é uma planta de colheita ou célula de uma planta de colheita tal como arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, óleo de palma, banana, feijão de soja, girassol, canola, cana de açúcar, alfafa, milhete, leguminosas (feijão, ervilha), linho, lupinus, semente de colza, tabaco, álamo e algodão.

[00126] De acordo com outras aplicações, as células de planta incluem células de tabaco, célula de raiz transformada em Agrobacterium rihzogenes, célula de aipo, célula de gengibre, célula de rábano e células de cenoura. Em uma aplicação, as células de tabaco são de uma linhagem de célula de tabaco, tal como, entre outros, Nicotiana tabacum L. cv células Amarelo Brilhante (BY-2). As células de planta podem ser cultivadas de acordo com qualquer tipo de método de cultivo adequado, incluindo, entre outros, cultura em uma superfície sólida (tal como um vaso ou prato plástico de cultura, por exemplo) ou em suspensão. Será observado que algumas células, tais como células BY- 2 e de cenoura podem ser cultivadas e crescidas em suspensão. Os dispositivos e métodos adequados para cultura de células de planta em suspensões são conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito no Pedido de Patente Internacional PCT IL2008/000614. Ainda em outra aplicação, a células são células de plantas de tabaco inteiras ou tecidos de planta, incluindo, entre outros, Nicotiana benthamiana.

[00127] Há vários métodos de introdução de genes estrangeiros em ambas as plantas monocotiledônea e dicotiledônea (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).

[00128] Os métodos principais de causar a integração estável de DNA exógeno no DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais: transferência de gene mediada por agrobactéria: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93112.

[00129] Absorção direta de DNA: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para absorção direta de DNA em protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:10721074. A absorção de DNA induzida por breve choque elétrico de células de planta: Zhang et al. PLant cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. A injeção de DNA nas células de planta ou tecidos por bombardeamento de partícula, Klein et al.

[00130] Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al.

[00131] Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pela utilização de sistemas de micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformação de whisker de fibras de vidro ou carbeto de silício das culturas de célula, embriãos ou tecido de calo, Patente Norte-Americana n° 5.464.765 ou pela incubação direta de DNA com pólen de germinação, DeWet et al. em Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; and Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

[00132] O sistema de agrobactéria inclui a utilização de vetores de plasmídeo que contêm segmentos de DNA definidos que integram no DNA genômico de planta. Métodos de inoculação do tecido de planta variam dependendo da espécie de planta e o sistema de administração de agrobactéria. Uma abordagem amplamente usada é o procedimento de disco de folha que pode ser realizado com qualquer tecido explantado que provê uma boa fonte para iniciação de diferenciação de planta inteira. Vide, por exemplo, Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem suplementar emprega o sistema de administração de Agrobactéria em combinação com infiltração a vácuo. O sistema de Agrobactéria é especialmente viável na criação de plantas dicotiledôneas transgênicas.

[00133] Há vários métodos de transferência direta de DNA nas células de planta. Em eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos em um campo elétrico forte. Em microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente nas células utilizando micropipetas muito pequenas. Em bombardeamento de micropartícula, o DNA é absorvido em microprojéteis tais como cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio, e os microprojéteis são fisicamente acelerados em células ou tecidos de planta.

[00134] Seguindo a transformação estável, a propagação da planta é exercida. O método mais comum da propagação da planta é pela semente. A regeneração pela propagação da semente, entretanto, tem a deficiência que devido à heterozigosidade há uma falta de uniformidade na colheita, uma vez que as sementes são produzidas pelas plantas de acordo com as variações genéticas governadas por regras mendelianas. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma crescerá com seus próprios traços específicos. Portanto, é preferido que a planta transformada seja produzida de modo que a planta regenerada tenha os traços idênticos e características da planta transgênica principal. Portanto, é preferido que a planta transformada seja regenerada por micropropagação que provê uma reprodução rápida, consistente das plantas transformadas.

[00135] A micropropagação é um processo de cultivo de novas plantas de geração de uma peça única de tecido que foi extirpada de uma planta ou cultivar principal selecionado. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas que têm o tecido preferido expressando a proteína de fusão. As plantas da nova geração que são produzidas são geneticamente idênticas a, e têm todas as características da, planta original. A micropropagação permite a produção em massa de material de planta de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta transformada ou transgênica original. As vantagens de clonar as plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e uniformidade das plantas produzidas.

[00136] A micropropagação é um procedimento multiestágio que requer a alteração de meio de cultura ou condições de cultivo entre os estágios. Assim, o processo de micropropagação envolve quatro estágios básicos: estágio um, cultura de tecido inicial; estágio dois, multiplicação da cultura de tecido; estágio três, diferenciação e formação da planta e estágio quatro, cultura e endurecimento da estufa. Durante o estágio um, a cultura de tecido inicial, a cultura de tecido é estabelecida e certificada livre de contaminante. Durante o estágio dois, a cultura de tecido inicial é multiplicada até um número suficiente de amostras de tecido ser produzido para alcançar os objetivos de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecido cultivadas no estágio dois são divididas e cultivadas em mudas individuais. No estágio quarto, as mudas transformadas são transferidas para uma estufa para endurecimento onde a tolerância das plantas à luz é gradualmente aumentada de modo que pode ser cultivada em ambiente natural.

[00137] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, as plantas transgênicas são geradas por transformação transiente de células de folha, células meristemáticas ou a planta inteira.

[00138] A transformação transiente pode ser efetuada por qualquer um dos métodos de transferência direta de DNA descritos acima ou por infecção virai utilizando vírus de planta modificados.

[00139] Os vírus que mostraram ser úteis para a transformação de plantas hospedeiras incluem CaMV, vírus do mosaico do tabaco (TMV), bírus do mosaico de bromo (BMV) e Vírus do Mosaico de Feijão Comum (BV ou BCMV). A transformação das plantas utilizando vírus de planta é descrita na Patente Norte-Americana n° 4.855.237 (vírus do mosaico de feijão dourado; BGV), EP-A 67,553 (TMV), Pedido Publicado de Patente Japonesa n° 6314693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). As partículas de pseudovírus para uso em DNA estrangeiro de expressão em muitos hospedeiros, incluindo plantas, são descritas em WO 87/06261.

[00140] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o vírus utilizado para transformações transientes é avirulento e assim é incapaz de causar sintomas graves tais como taxa de cultivo reduzida, mosaico, manchas de anel, rolo foliar, amarelamento, estrias, formação de varíola, formação de tumor e corrosão. Um vírus avirulento adequado pode ser um vírus avirulente de ocorrência natural ou um vírus artificialmente atenuado. A atenuação do vírus pode ser efetuada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, entre outros, aquecimento subletal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese direcionadas tais como descritas, por exemplo, por Kurihara and Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Gal-on et al. (1992), Atreya et al. (1992) and Huet et al. (1994).

[00141] As cepas de vírus adequadas podem ser obtidas de fontes disponíveis tais como, por exemplo, a Coleção de Cultura Tipo Americana (ATCC) ou por isolamento das plantas infectadas. Isolamento dos vírus de tecidos de planta infectada pode ser efetuado por técnicas bem conhecidas na técnica tais como descritas, por exemplo, por Foster and Tatlor, Eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Human Pr), Vol 81)”, Human Press, 1998. Brevemente, acredita-se que os tecidos de uma planta infectada contenham uma alta concentração de um vírus adequado, preferencialmente, folhas jovens e pétalas de flores, são moídas em uma solução tampão (por exemplo, solução tampão de fosfato) para produzir uma seiva infectada por vírus que pode ser usada em inoculações subsequentes.

[00142] Construção dos vírus de RNA de planta para a introdução e expressão de sequências de ácido nucleico não virais em plantas é demonstrada pelas referências acima bem como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e U.S. Pat. No. 5,316,931.

[00143] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser feitas para o próprio vírus. Alternativamente, o vírus pode ser clonado em um plasmídeo bacteriano para facilitar a construção do vetor viral desejado com o DNA estrangeiro. O vírus pode então ser extirpado do plasmídeo. Se o vírus é um vírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser anexada ao DNA viral, que é então replicado pelas bactérias. A transcrição e tradução desse DNA produzirá a proteína de revestimento que encapsulará o DNA viral. Se o vírus é um vírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um cDNA e inserido em um plasmídeo. O plasmídeo é então utilizado para fazer todas as construções. O vírus de RNA é então produzido através da transcrição da sequência viral do plasmídeo e tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que encapsula o RNA viral.

[00144] Em uma aplicação, um polinucleotídeo viral de planta é fornecido em que a sequência de codificação de proteína de revestimento foi excluída de um polinucleotídeo viral, uma sequência de codificação de proteína de revestimento viral de planta não nativa e um promotor não nativo, preferencialmente o promotor subgenômico da sequência de codificação de proteína de revestimento não nativo, capaz de expressar no hospedeiro da planta, embalar o polinucleotídeo viral de planta recombinante, e garantir uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo viral de planta recombinante, foi inserido. Alternativamente, o gene de proteína de revestimento pode ser inativado pela inserção da sequência de polinucleotídeo não nativo dentro dele, de modo que uma proteína seja produzida. O polinucleotídeo viral de planta recombinante pode conter um ou mais promotores subgenômicos não nativos adicionais. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou expressar genes adjacentes ou sequências de polinucleotídeo no hospedeiro da planta e incapaz de recombinar entre si e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativo (estrangeiro) podem ser inseridas adjacentes ao promotor subgenômico viral de planta nativa ou os promotores subgenômicos virais de planta nativa e não nativa se mais de uma sequência de polinucleotídeo estiver incluída. As sequências de polinucleotídeo não nativo são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados.

[00145] Em uma segunda aplicação, um polinucleotídeo viral de planta recombinante é fornecido como na primeira aplicação exceto que a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa é colocada adjacente um dos promotores subgenômicos de proteína de revestimento não nativa em vez de uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.

[00146] Em uma terceira aplicação, um polinucleotídeo viral de planta recombinante é fornecido, no qual o gene de proteína de revestimento nativa é adjacente a seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foram inseridos no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos inseridos são capazes de transcrever ou expressar genes adjacentes em uma planta hospedeira e são incapazes de recombinar entre si e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativo podem ser inseridas adjacentes aos promotores subgenômicos virais de planta não nativos de modo que as sequências sejam transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle dos promotores subgenômicos para produzir o produto desejado.

[00147] Em uma quarta aplicação, um polinucleotídeo viral de planta recombinante é fornecido como na terceira aplicação exceto que a sequência de codificação da proteína de revestimento nativa é substituída por uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.

[00148] Os vetores virais são encapsulados pelas proteínas de revestimento codificadas pelo polinucleotídeo viral de planta recombinante para produzir um vírus de planta recombinante. O polinucleotídeo viral de planta recombinante ou vírus de planta recombinante é utilizado para infectar plantas hospedeiras apropriadas. polinucleotídeo viral de planta recombinante é capaz de replica no hospedeiro, difusão sistêmica no hospedeiro, e transcrição ou expressão de gene(s) estrangeiro(s) (polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.

[00149] Técnicas para inoculação de vírus para plantas podem ser encontradas em Foster and Taylor, eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998; Maramorosh and Koprowski, eds. “Methods in Virology” 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. “Methods in Plant Virology”, Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. “Applied Plant Virology”, Wiley, New York, 1985; and Kado and Agrawa, eds. “Principies and Techniques in Plant Virology”, Van NostrandReinhold, New York.

[00150] Além do exposto acima, o polinucleotídeo do presente pedido de patente de invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto, permitindo desta forma a expressão de cloroplasto.

[00151] Uma técnica para introdução de sequências exógenas de ácido nucleico para o genoma dos cloroplastos é conhecida. Essa técnica envolve os procedimentos a seguir. Primeiro, as células de planta são quimicamente tratadas de modo a reduzir o número de cloroplastos por célula para cerca de um. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido através de bombardeamento de partícula nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula de polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos selecionados de modo que sejam integráveis no genoma do cloroplasto através de recombinação homóloga que é facilmente efetuada pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Para essa finalidade, a sequência de ácido nucleico inclui, além do gene de interesse, pelo menos uma extensão do polinucleotídeo que é derivado do genoma de cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável, que serve por procedimentos de seleção sequencial para determinar que todas ou substancialmente todas as cópias dos genomas de cloroplasto seguindo tal seleção incluirão o polinucleotídeo exógeno. Outros detalhes relacionados a essa técnica são encontrados nas Patentes Norte-Americanas n° 4.945.050; e 5.693.507 que são incorporadas aqui por referência. Um polipeptídeo pode assim ser produzido pelo sistema de expressão de proteína do cloroplasto e se tornar integrado na membrana interna do cloroplasto.

[00152] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método ainda compreende cultivar a célula de planta expressando o ácido nucleico. As células de planta podem ser quaisquer células de planta desejadas. As células de planta podem ser células cultivadas, células em tecido cultivado ou órgãos cultivados, ou células em uma planta. Em algumas aplicações, as células de planta são células cultivadas, ou células em tecido cultivado ou órgãos cultivados. Ainda em outras aplicações, as células de planta são qualquer tipo de planta que é usada na transferência de gene. A célula de planta pode ser geminada como parte de uma planta inteira, ou, alternativamente, em cultura de célula de planta.

[00153] De acordo com alguns aspectos do presente pedido de patente de invenção, as células de planta são geminadas em uma cultura de suspensão de célula de planta. Conforme utilizado aqui, o termo “cultura de suspensão” refere-se ao cultivo de células separadas do organismo. A cultura de suspensão pode ser facilitada através da utilização de um meio líquido (um “meio de suspensão”). A cultura de suspensão pode se referir ao cultivo de células em meios de nutriente líquido. Métodos e dispositivos adequados para cultivo de células de planta do presente pedido de patente de invenção na cultura de suspensão de célula de planta são descritos em detalhes em, por exemplo, PCT W02008/135991, Patente Norte-Americana n° 6.391.683, Pedido de Patente Norte-Americana n° 10/784.295; Publicações de Patente Internacional PCT n° W02004/091475, W02005/080544 e WO 2006/040761, todos os quais são incorporadas aqui por referência como se totalmente estabelecido aqui.

[00154] Assim, o presente pedido de patente de invenção engloba plantas ou culturas de planta expressando as sequências de ácido nucleico, de modo a produzir a proteína de DNase I humana recombinante do presente pedido de patente de invenção. Uma vez expressa dentro da célula de planta ou de toda a planta, o nível da proteína de DNase I humana codificada pela sequência de ácido nucleico pode ser determinado pelos métodos bem conhecidos na técnica, tais como, ensaios de atividade, Western blots utilizando anticorpos capazes de especificamente se ligarem à proteína de DNase I humana, Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), imuno-histoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e similares.

[00155] Métodos de determinação do nível da planta do RNA transcrito a partir da sequência de ácido nucleico são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, análise Northern blot, análise de reação de cadeia polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) (incluindo RT-PCR quantitativa, semiquantitativa ou de tempo real) e hibridização de RNA-in situ.

[00156] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana recombinante expressa do presente pedido de patente de invenção é glicosilada na célula de planta, resultando em uma proteína de DNase I humana recombinante tendo alta glicosilação de manose (por exemplo, resíduos de açúcar de manose expostos), e resíduos de glicano específicos de planta. Assim, de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, as células que expressam o vetor de expressão do presente pedido de patente de invenção produzem uma proteína de DNase I humana que tem, pelo menos um, opcionalmente, pelo menos, dois, opcionalmente, pelo menos, três ou opcionalmente, pelo menos, quatro ou mais resíduos de manose expostos. Em outras aplicações, as células que expressam o vetor de expressão do presente pedido de patente de invenção produzem uma proteína de DNase I humana que tem, pelo menos, um, opcionalmente, pelo menos, dois, opcionalmente, pelo menos, três ou opcionalmente, pelo menos, quatro ou mais resíduos de xilose do núcleo. Ainda em outras aplicações, as células que expressam o vetor de expressão do presente pedido de patente de invenção produzem uma proteína de DNase I humana que tem, pelo menos um, opcionalmente, pelo menos dois, opcionalmente, pelo menos três ou opcionalmente, pelo menos quatro ou mais resíduo de a-(1,3) fucose do núcleo. Em uma aplicação, as células que expressam o vetor de expressão do presente pedido de patente de invenção produzem uma proteína de DNase I humana que tem, pelo menos, um resíduo de manose exposto, pelo menos um resíduo de xilose do núcleo e, pelo menos, um resíduo de a-(1,3) fucose. Ainda em outras aplicações, as células que expressam o vetor de expressão do presente pedido de patente de invenção produzem uma proteína de DNase I humana que tem, pelo menos, um, pelo menos dois, pelo menos 3 ou mais substituições de glucosamina N- acetila terminal nos açúcares de manose externos.

[00157] A análise de glicano da proteína de DNase I humana expressa em células de planta indicou que a DNase I prh está sem resíduos de ácido siálico. Assim, ainda em outras aplicações, as células que expressam o vetor de expressão do presente pedido de patente de invenção produzem uma proteína de DNase I humana recombinante desfornecida de resíduos de ácido siálico.

[00158] A proteína de DNase I humana produzida pelas células que expressam o vetor de expressão do presente pedido de patente de invenção mostrou ter atividade catalítica de DNase I similar ou superior àquela de uma enzima de DNase I produzida por célula de mamífero ou humano nativa.

[00159] Conforme mostrado no Exemplo 3 aqui, quando a cinética da enzima da proteína de DNase I humana recombinante expressa pela planta foi medida (vide Tabela VI), maior afinidade de substrato (Km) e maior velocidade de reação (Vmax) foram observadas para a proteína de DNase I humana recombinante expressa pela planta, conforme comparado àquelas de DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme0). Assim, de acordo com algumas aplicações, a DNase I humana recombinante expressa por planta é biologicamente ativa. Em algumas aplicações, a atividade biológica é atividade catalítica de endonuclease. Ainda em outras aplicações, a atividade biológica da proteína de DNase I humana recombinante expressa pela planta é caracterizada por maior afinidade de substrato (KM) e maior velocidade de reação (Vmax), conforme comparado àquelas da DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme3). Métodos para medir a atividade biológica de DNase I são bem conhecidos na técnica, e incluem, inter alia, atividade catalítica (por exemplo, ensaio de verde metila, ensaio com base em DNaseAlertTM, ensaio com base em fluorescência, conforme descrito aqui), imunorreatividade com anticorpo anti-DNase I, ensaio de hipercromicidade com base em Kunitz, ensaios de medição de próton mediante hidrólise de DNA, que pode ser monitorada utilizando indicadores de íon H+ cromofórico e similar. Ainda em outras aplicações, a atividade biológica da proteína de DNase I humana recombinante expressa pela planta é caracterizada por atividade específica (unidades de atividade catalítica de DNase I por mg de proteína de enzima) maior que aquela da DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme®). Em algumas aplicações, a atividade específica da proteína de DNase I humana recombinante expressa pela planta está em uma faixa de cerca de 1 a 10, cerca de 1 a 1,1, cerca de 1 a 1,25, cerca de 1 a 1,5, cerca de 1 a 1,75, cerca de 1 a 2, cerca de 1 a 2,25, cerca de 1 a 2,5, cerca de 1 a 2,75, cerca de 1 a 3,0, cerca de 1 a 3,25, cerca de 1 a 3,5, cerca de 1 a 3,75, cerca de 1 a 4,0, cerca de 2,5 a 3,0, cerca de 2,5 a 3,1, cerca de 2,5 a 3,2, cerca de 2,5 a 3,3, cerca de 2,5 a 3,4, cerca de 2,5 a 3,5, cerca de 1 a 4,5, cerca de 1 a 5,0 ou mais vezes daquela da atividade específica (por exemplo U/mg) de DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme®). Em algumas aplicações, a atividade específica da proteína de DNase I humana recombinante expressa pela planta é cerca de 3,0 a 3,5 vezes daquela da atividade específica (por exemplo, U/mg) de DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme®).

[00160] Conforme mostrado no Exemplo 4 aqui, quando a atividade da enzima de proteína de DNase I foi medida (vide Tabela VIII) na presença de concentrações crescentes de actina, maior resistência da DNase I humana recombinante expressa por planta para inibir a atividade catalítica por actina foi observada, comparado àquela de DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme(D). Assim, de acordo com algumas aplicações, a DNase I humana recombinante expressa por planta tem maior resistência para inibir a actina da atividade catalítica de DNase I quando comparado àquela da DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme@). Em algumas aplicações, a inibição da atividade catalítica de DNase I é expressa como concentração inibitória semimáxima de actina (ICH, pg de actina/ml), utilizando, por exemplo, o ensaio de DNase I de verde metila. Assim, em algumas aplicações, a concentração de actina ICH para inibição da DNase I humana recombinante expressa pela planta é pelo menos 1 a 10, 2 a 6, 1 a 1,1, 1 a 1,2, 1 a 1,25, 1 a 1,3, 1 a 1,4, 1 a 1,5, 1 a 1,6, 1 a 1,7, 1 a 1,8, 1 a 1,9, 1 a 2, 1 a 2,1, 1 a 2,2, 1 a 2,25, 1 a 2,5, 1 a 2,75, 1 a 3,0, 1 a 3,25, 1 a 3,5, 1 a 3,75, 1 a 4,0, 1 a 4,5 a 1 a 5,0 ou mais, ou uma faixa de cerca de 1,5 a 2,5 daquela da DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme@). Em algumas aplicações, a ICH concentração de actina para inibição da atividade de DNase I humana recombinante expressa pela planta é de cerca de 2,0 a 2,2 vezes daquela da DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozymee).

[00161] Conforme mostrado no Exemplo 5, DNase I humana recombinante expressa pela planta reduz eficazmente as propriedades reológicas do muco. Quando medida em um ensaio in-vitro, a incubação da DNase I humana recombinante expressa pela planta com amostras de muco de FC resulta na redução do módulo viscoso (como expresso pelo módulo de perda, G”) e redução da elasticidade (como expresso pelo módulo de armazenamento, G') da amostra do muco (vide Figuras 12A-12D, 13A-13D, 14A-14B, 16 e 17). Quando comparado à redução de parâmetros reológicos das amostras de muco incubadas com DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme®), a DNase I humana recombinante expressa pela planta exibiu maior eficácia na redução da viscosidade e elasticidade do que aquela da DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme®) (Figuras 12 e 13). Assim, de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a DNase I humana recombinante expressa pela planta reduz o módulo viscoso e/ou módulo elástico do muco. Em outras aplicações, a redução no módulo viscoso e elástico é expressa como G” e G', respectivamente. Ainda em outra aplicação, a redução do módulo viscoso e/ou elástico do muco pela DNase I humana recombinante expressa pela planta é maior que aquela da DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (por exemplo, Pulmozyme®) medida com a mesma técnica de ensaio. As propriedades reológicas do muco podem ser medidas utilizando métodos de avaliação de oscilação dinâmica, recuperação lenta, relaxamento de extensão e similares, utilizando um reômetro, extensográfico, alveográfico, etc. Medição do módulo viscoso e elástico pela oscilação dinâmica em um reômetro é detalhada a seguir. Em outras aplicações, as propriedades reológicas do muco são ensaiadas utilizando medições de varrimento de tensão, e podem ser caracterizadas pelos pontos de cruzamento de valores de tensão elástica e viscosa.

[00162] Será apreciado que as propriedades biológicas da DNase I prh do presente pedido de patente de invenção (isto é, endonuclease, inibição da actina reduzida) fazem a DNase I prh do presente pedido de patente de invenção um candidato atrativo para lise de DNA em qualquer composição, por exemplo, uma composição aquosa ou semiaquosa, tal como, entre outros, mucosidade, muco, esperma, ou outras secreções, em que a redução do conteúdo de DNA, e subsequente redução das propriedades reológicas é desejável. Tais propriedades reológicas aumentadas de secreções são frequentemente o resultado de cultivo viral ou microbiano e resposta citotóxica da imunidade celular do hospedeiro.

[00163] Assim, em algumas aplicações, a DNase I humana recombinante expressa pela planta do presente pedido de patente de invenção é biologicamente ativa, tendo atividade catalítica, cinética enzimática e atividade específica comparável ou superior àquela da DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero, e eficaz na redução das propriedades reológicas de muco de FC. Assim, de acordo com alguns aspectos de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para reduzir uma propriedade reológica de um DNA contendo secreção, o método compreendendo expor a secreção a uma concentração eficaz da DNase I humana recombinante expressa pela planta do presente pedido de patente de invenção, reduzindo desta forma uma propriedade reológica da secreção. Em algumas aplicações, exportar a secreção reduz o módulo elástico da secreção. Em outras aplicações, expor a mucosidade reduz o módulo viscoso da secreção. Em algumas aplicações, a secreção é uma secreção humana, selecionada do grupo consistindo em muco, mucosidade e esperma. Em outra aplicação, a secreção é muco ou mucosidade. Ainda em outra aplicação, a secreção é associada com uma doença ou condição resultando em quantidades aumentadas de DNA na secreção, conforme comparado ao conteúdo de DNA de secreção similar de um indivíduo saudável.

[00164] Será apreciado que DNase I prh pode ser usada para reduzir o conteúdo de DNA dos fluidos biológicos diferentes de secreções, por exemplo, sangue, plasma, linfa, CSF e similar, ou no ambiente local de um órgão interno de um organismo, por exemplo, indivíduo animal e/ou humano. Em algumas aplicações, a administração de DNase I prh para o organismo resulta em atividade de endonuclease aumentada no sangue, por exemplo, no sangue em circulação, ou em um tecido do organismo. Ainda em outras aplicações, o conteúdo do DNA do fluido biológico, por exemplo, sangue está associado com uma doença ou condição resultando em quantidade aumentadas de DNA na secreção, conforme comparado ao conteúdo de DNA de secreção similar de um indivíduo saudável.

[00165] Assim, a proteína de DNase I humana expressa em células de planta de acordo com o presente pedido de patente de invenção pode ser usada para produzir uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica pode ser utilizada para tratamento ou prevenção de qualquer condição ou doença por qualquer via de administração. De acordo com alguns aspectos do presente pedido de patente de invenção, a composição farmacêutica pode ser usada para tratamento ou prevenção de condições associadas à mucosidade em um indivíduo em necessidade respectiva. De acordo com outros aspectos do presente pedido de patente de invenção, a composição farmacêutica pode ser usada para reduzir a quantidade de DNA em uma secreção pulmonar ou fluido em um indivíduo em necessidade respectiva. Em algumas aplicações, as condições associadas à mucosidade compreendem doença respiratória ou pulmonar ou condições. Em outras aplicações, métodos para tratamento ou prevenção de condições respiratórias ou pulmonares compreendem administrar a(s) composição(ões) farmacêutica(s) do presente pedido de patente de invenção por inalação.

[00166] As condições ou doenças respiratórias que podem ser tratadas pela administração de proteína de DNase I humana recombinante expressa pela célula de planta a do presente pedido de patente de invenção incluem condições associadas com acúmulo de muco, por exemplo, nas vias aéreas. Tais condições incluem, entre outros, doença broncopulmonar aguda ou crônica, atelectasia devido à impactação traqueal ou brônquica e complicações de bronquite crônica de traqueostomia, bronquite asmática, Fibrose Cística, pneumonia, doenças alérgicas tais como asma alérgica, asma não alérgica, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjogren, bronquiectasia, enfisema, sinusite aguda e crônica e ainda o resfriado comum.

[00167] Assim, de acordo com outro aspecto do presente pedido de patente de invenção é fornecida uma composição farmacêutica que inclui, como um princípio ativo da mesma, uma proteína de DNase I humana expressa pela planta (DNase I prh), em um transportador farmacêutico aceitável. Em algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana tem uma sequência de aminoácido, conforme estabelecido na SEQ ID N° 6. E algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana tem um resíduo de Glicina N-terminal (SEQ ID N° 5). Ainda em outras aplicações, a proteína de DNase humana é contiguamente ligada ao N-terminal para um peptídeo de sinal de retículo endoplasmático da SEQ ID N° 1. Ainda em outras aplicações, a proteína de DNase I humana é ligada ao N-terminal para um peptídeo de sinal de ER e tem um resíduo de Glicina N-terminal.

[00168] Em outras aplicações, a atividade biológica da DNase I humana recombinante expressa pela planta do presente pedido de patente de invenção é melhorada pela presença de um agente farmacológico adicional, por exemplo, um agente que reduz a inibição de activa da atividade de DNase, tal como um ou mais sais inorgânicos selecionados de sais de potássio, magnésio, cálcio, zinco, lítio, manganês, cádmio, níquel, cobalto, amônio, poliamina e poliamônio macrocíclico. Agentes adequados para combinação com a DNase I humana recombinante expressa pela planta do presente pedido de patente de invenção, para aplicações terapêuticas tais como tratamento de condições pulmonares (por exemplo, FC) conforme descrito em detalhes em US 7.432.308 de Demeester et al., que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[00169] Em algumas aplicações, a combinação da DNase I humana recombinante expressa pela planta com um agente farmacêutico adicional resulta na melhor, e melhora opcionalmente sinérgica na redução das propriedades reológicas (por exemplo, módulo viscoso e/ou módulo elástico) do muco. Em algumas aplicações, o agente adicional é cloreto de magnésio ou sulfato de magnésio.

[00170] Em algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a composição farmacêutica é combinada com ou administrada junto de um agente farmacêutico adicional, o agente farmacêutico adicional incluindo, entre outros, um ou mais outros agentes farmacológicos utilizados para tratar as condições listadas acima, tis como antibióticos, broncodilatadores, agentes anti-inflamatórios, mucolítios (por exemplo n- acetil-cisteína), ligação de actina ou proteínas de corte de actina [por exemplo, gelsolina; Matsudaira et al., Cell 54:139-140 (1988); Stossel, et al., Publicação da Patente PCT n° WO 94/22465], inibidores de protease, ou produto de terapia de gene [por exemplo, compreendendo o gene regulador de condutância de transmembrana de Fibrose Cística (CFTR), Riordan, et al., Science 245:1066-1073 (1989)]. Os agentes farmacêuticos podem ser administrados antes, junto, subsequente ou em qualquer outra combinação temporal com a composição farmacêutica do presente pedido de patente de invenção. Regime para combinação da composição farmacêutica do presente pedido de patente de invenção com agentes adicionais pode ser formulado de acordo com parâmetros tais como condições ou doenças específicas, estado de saúde do indivíduo, métodos e dose de administração, e similar. A determinação de tal regime de combinação pode ser feita, por exemplo, por profissionais tais como médicos assistentes, funcionários do hospital, e também de acordo com protocolos predeterminados.

[00171] Conforme usada aqui, uma “composição farmacêutica” refere- se a uma preparação de um ou mais princípios ativos descritos aqui com outros componentes químicos tais como transportadores e excipientes fisiologicamente adequados. A finalidade de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo.

[00172] Aqui, o termo “princípio ativo” refere-se à proteína de DNase I humana recombinante responsável pelo efeito biológico.

[00173] Daqui em diante, as expressões “transportador fisiologicamente aceitável” e “transportador farmaceuticamente aceitável” que podem ser alternadamente usadas se referem a um transportador ou um diluente que não causa irritação significativa a um organismo e não revoga a atividade biológica e propriedades do composto administrado. Um adjuvante é incluído sob essas expressões.

[00174] Aqui, o termo “excipiente” refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para ainda facilitar a administração de um princípio ativo. Exemplos, sem limitação, de excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietileno glicóis.

[00175] Ainda em outras aplicações, a composição farmacêutica é combinada com, ou administrada junto de uma mistura de ingredientes particulados sólidos com um transportador de óleo.

[00176] Preferencialmente, as composições são anidras.

[00177] Especificamente, as composições farmacêuticas compreendem uma mistura de nanopartículas de sílica farmacologicamente inerte tendo uma superfície hidrofóbica, um polissacarídeo, onde a mistura do particulado é suspenso ou incorporado em um óleo. Descrição detalhada de tal mistura é fornecida, por exemplo, no Pedido de Patente Norte-Americana 2010/297245 to Vol, et al.

[00178] Técnicas para formulação e administração de fármacos podem ser encontradas em “Remington's Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição, que é incorporada aqui por referência.

[00179] As vias de administração adequadas podem, por exemplo, incluir administração oral, retal, transmucosal, especialmente transnasal, intestinal ou parenteral, incluindo injeções intramusculares, subcutâneas e intramedulares, bem como injeções intratecais, intraventriculares direitas, intracardíacas, por exemplo, na cavidade ventricular direita ou esquerda, na artéria coronária comum, intravenosas, intraperitoneais, intranasais, ou intraoculares.

[00180] Abordagens convencionais para administração de fármaco no sistema nervosa central (SNC) incluem: estratégias neurocirúrgicas (por exemplo, injeção intracerebral ou infusão intracerebroventricular); manipulação molecular do agente (por exemplo, produção de uma proteína de fusão quimérica que compreende um peptídeo de transporte que tem uma afinidade para uma molécula de superfície de célula enpontoelial em combinação com um agente que é ele mesmo incapaz de cruzar o BBB) em uma tentativa de explorar um dos caminhos de transporte endógenos do BBB; estratégias farmacológicas projetadas para aumentar a solubilidade de lipídio de um agente (por exemplo, conjugação dos agentes solúveis em água para transportadores de lipídio ou colesterol); e uma interrupção transitória da integridade do BBB por interrupção hiperosmótica (resultando da infusão de uma solução de manitol na artéria carótida ou a utilização de um agente biologicamente ativo tal como um peptídeo de angiotensina). Entretanto, cada uma dessas estratégias tem limitações, tais como os riscos inerentes associados com um procedimento cirúrgico invasivo, uma limitação de tamanho imposta por uma limitação inerente nos sistemas de transporte endógeno, efeitos colaterais potencialmente indesejáveis associados com a administração sistêmica de uma molécula quimérica compreendida de um motivo transportador que poderia ser ativo fora do SNC, e o possível risco de dano cerebral dentro das regiões do cérebro onde o BBB é interrompido, que rende a ele um método de administração subideal.

[00181] Alternativamente, pode-se administrar a composição farmacêutica em um local diferente da maneira sistêmica, por exemplo, via injeção da composição farmacêutica diretamente em uma região do tecido de um paciente ou outro indivíduo em necessidade da mesma.

[00182] Para tratamento e/ou prevenção de distúrbios respiratórios e/ou pulmonares, a DNase I humana recombinante do presente pedido de patente de invenção pode ser administrada diretamente nas vias aéreas pela administração pulmonar.

[00183] Conforme utilizado aqui, o termo “indivíduo em necessidade respectiva” refere-se a um indivíduo diagnosticado com ou exibindo uma ou mais condições associados com uma doença ou condição tratável pela administração de DNase I, um indivíduo que foi diagnosticado com ou exibiu uma ou mais condições tratáveis pela administração de DNase I no passado, ou um indivíduo que foi considerado em risco de desenvolver uma ou mais condições associadas com uma doença ou condição tratável pela administração de DNase I no futuro devido à hereditariedade ou fatores ambientais. Em certas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o indivíduo em necessidade da mesma está sofrendo de uma doença ou condição tal como, entre outros, doença ou condição respiratória e/ou pulmonar, infertilidade masculina, infecção viral, bacteriana, fúngica ou protozoário, um distúrbio uterino, um distúrbio ou condição endometrial, câncer, câncer primário e/ou câncer metastático.

[00184] Em algumas aplicações, um indivíduo em necessidade da mesma refere-se a um indivíduo com uma condição pulmonar que tem valores de espirometria clinicamente anormais. Exemplos de parâmetros de espirometria que podem indicar a necessidade de um indivíduo incluem, mas não são restritos a volume de expiração forçada (FEV1), capacidade vital forçada (FVC), fluxo expiratório forçado (FEF25-75) e similar. Em algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a administração da prhDNase no indivíduo resulta em uma melhora em um ou mais dos parâmetros espirométricos.

ADMINISTRAÇÃO PULMONAR DE DNASE

[00185] A administração pulmonar pode ser realizada por meios adequados conhecidos pelos técnicos no assunto. A administração pulmonar de DNase requer dispersa da substância biologicamente ativa de um dispositivo de administração na cavidade oral de um indivíduo durante a inalação. Para as finalidades do presente pedido de patente de invenção, as composições compreendendo DNase são administradas via inalação de um aerossol ou outra preparação adequada que é obtida de uma forma de solução ou suspensão aquosa ou não aquosa, ou uma forma de pó sólido ou seco da composição farmacêutica, dependendo do dispositivo de administração utilizado. Tais dispositivos de administração são bem conhecidos na técnica e incluem, entre outros, nebulizadores, inaladores de dose medida, e inaladores de pó seco, ou quaisquer outros mecanismos de administração apropriados que permitem a dispensa de uma composição farmacêutica como uma solução ou suspensão aquosa ou não aquosa ou como uma forma de pó sólido ou seco. Métodos para administrar DNase, incluindo DNase I, a um indivíduo via administração pulmonar, incluindo administração direta à(s) região(ões) do pulmão central(is) e/ou periférica(s), incluem, entre outros, um inalador de pó seco (DPI), um dispositivo inalador de dose medida (MDI), e um nebulizador.

NEBULIZADOR/INALADOR LÍQUIDO

[00186] Em uma aplicação, a DNase, incluindo uma porção enzimaticamente ativa da mesma, é administrada a um indivíduo utilizando um nebulizador ou inalador líquido. Geralmente, os nebulizadores usam ar comprimido para administrar medicamento como aerossol úmido ou névoa para inalação, e, portanto, requerem que o fármaco seja solúvel em água. Os dispositivos nebulizadores podem administrar doses relativamente amplas em comparação a dispositivos de MDI (inalador de dose medida) ou DPI (inalador de pó seco), e são especialmente eficazes para administrar ao pulmão profundo (região periférica do pulmão). Não são requeridos propelentes para nebulizadores, que inclui nebulizadores a jato (nebulizadores a jato de ar e nebulizadores de jato líquido) e nebulizadores ultrassônicos. Exemplos de nebulizadores incluem AkitaTM (Activaero GmbH) (vide Patente Norte-Americana n° 7.766.012, EP1258264), um sistema de inalação de nebulizador do topo da mesa com base em Pari's LC Star que provê controle total sobre o padrão de respiração do paciente e os nebulizadores Aeroneb® Go/Pro/Lab portáteis (AeroGen). O nebulizador Aeroneb® é com base em tecnologia OnQTM, isto é, uma microbomba eletrônica rodeada por um elemento vibracional e adaptável às necessidades de uma ampla faixa de pacientes, incluindo crianças e idosos; uso único ou múltiplo de paciente.

[00187] O AerocurrentTM portátil (AerovertRx corp) também pode ser utilizado nos métodos e composições do presente pedido de patente de invenção (vide W02006006963).

[00188] StaccatoTM (Alexza Pharma) também pode ser utilizado nos métodos e composições do presente pedido de patente de invenção (vide W003095012). A chave para a tecnologia StaccatoTM é vaporização de um fármaco sem degradação térmica. AERx® (Aradigm), um dispositivo operado por bateria portátil, também pode ser utilizado nos métodos e composições do presente pedido de patente de invenção (vide W09848873, Patente Norte- Americana n° 5,469,750, Patente Norte-Americana n° 5,509,404, Patente Norte-Americana n° 5,522,385, Patente Norte-Americana n° 5,694,919, Patente Norte-Americana n° 5,735,263, Patente Norte-Americana n° 5,855,564). Outro exemplo de um dispositivo nebulizador que também pode ser utilizado nos métodos e composições do presente pedido de patente de invenção inclui Respimat® (Boehringer), um sistema de reservatório multidose. A DNase também pode ser administrada utilizando o Collegium NebulizerTM (Collegium Pharma). Outro exemplo de um dispositivo nebulizador que também pode ser utilizado nos métodos e composições do presente pedido de patente de invenção inclui o Inspiration® 626 (Respironics), um nebulizador à base de compressor para assistência domiciliar administrando um tamanho de partícula entre 0,5 a 5 micra, tecnologia Adaptive Aerossol Delivery® (Respironics), que administra doses de fármacos inalados precisas e reprodutíveis.

[00189] Os sistemas Adaptive Aerossol Delivery (AAD)C, incorporam eletrônicos e sensores dentro da peça manual para monitorar o padrão respiratório do paciente detectando as mudanças de pressão durante inspiração e expiração, permitindo que o paciente faça pausas na terapia sem desperdiçar a medicação. Exemplos de nebulizadores de sistema AAD® incluem o HaloLite® AAD®, ProDose® AAD®, e I-Neb® AAD®. O HaloLite® Adaptive Aerossol Delivery (AAD)® (Respironics) é um sistema de aerolização pneumática alimentado por um compressor portátil (vide EP 0910421, incorporado aqui por referência).

[00190] O ProDos AAD® (Respironics) é um sistema aerossol pneumático alimentado por um compressor portátil, controlado pelo sistema “ProDose DiscTM” (Respironics) (vide EP1245244). Promixin® pode ser administrado através de Prodose AAD® para gerenciamento das infecções de pulmão pseudomonas aeruginosa, particularmente em Fibrose Cística. Promixin® é fornecido como um pó para nebulização que é reconstituído antes da utilização. O I-neb AAD® é um sistema portátil, miniaturizado AAD® sem a necessidade de um compressor separado (“I-Neb”), com base em uma combinação de tecnologia de aerolização com base em malha eletrônica (Omron) e tecnologia AAD®. I-neb AAD® foi utilizado para administração de Ventavis® (iloprost) (CoTherix/Schering AG).

[00191] Outro exemplo de um nebulizador que pode ser utilizado nos métodos e composições do presente pedido de patente de invenção é AriaTM (Chrysalis). Aria é com base em um sistema de geração aerossol capilar com MMAD variando de 0,5 a 2,Opm.

[00192] Em outra aplicação, o nebulizador TouchSpray' (Odem), que utiliza uma membrana perfurada, que vibra em frequências ultrassônicas, em contato com o fluido do reservatório, para gerar a nuvem de aerossol (vide Patente Norte-Americana n° 6,659,364) pode ser utilizado para administrar DNase de acordo com o presente pedido de patente de invenção. Os nebulizadores adicionais que podem ser utilizado no presente pedido de patente de invenção incluem nebulizadores que são unidades portáteis que maximizam a saída de aerossol quando o paciente inala e minimiza a saída de aerossol quando o paciente exala utilizando duas válvulas de sentido único (vide nebulizadores PARI (PARI GmbH), que pode ser projetado para populações de paciente específicas, tais como pacientes com menos de três anos de idade (PARI BABYTM) e nebulizadores para pacientes mais velhos (PARI LC PLUS® e PARI LC STAR9.

[00193] Um nebulizador adicional que pode ser utilizado no presente pedido de patente de invenção é o nebulizador e-Flow® (PARI GmbH) que usa tecnologia de vibração de membrana para aerolizar a solução do fármaco, bem como as suspensões ou dispersões coloidais (TouchSprayTM; ODEM (Reino Unido)), conforme descrito na Patente Norte-Americana n° 6.962.151. Nebulizadores adicionais que podem ser utilizados no presente pedido de patente de invenção incluem o nebulizador Hudson T-Updraft I ou II (compressor Pulmo-Aide), nebulizador Marquest Acorn I ou II (compressor Pulmo-Aide), Durable Sidestream (compressor Portaneb), o nebulizador eletrônico Microair® (Omron) (vide Patente Norte-Americana n° 6.901.926) e um nebulizador MysticTM (Ventaira) (vide Patente Norte-Americana n° 6.397.838). O dispositivo MysticTM é ativado pela respiração, e foi utilizado com Corus 1030TM (lidocaína HC1), Resmycin® (cloridrato de doxorrubicina), Acuair (propionato de fluticasona), NCE com ViroPharm, e NCE com Pfizer. Assim, em uma aplicação, o presente pedido de patente de invenção provê um recipiente para uso com um dispositivo nebulizador para administração pulmonar de DNase a um indivíduo, o recipiente compreendendo uma solução ou suspensão inalável livre de propulsor compreendendo a DNase.

[00194] A DNase pode ser administrada a um indivíduo através da inalação de acordo com um regime de dosagem projetado para alcançar um efeito terapêutico. Em uma aplicação, um regime de dosagem múltiplo pode ser utilizado para tratar distúrbios em que DNase é benéfica utilizando os métodos descritos aqui. Métodos de tratamento de múltiplas doses variáveis também pode ser utilizado para tratar distúrbios em que DNase é benéfica.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00195] DNase para uso nos métodos do presente pedido de patente de invenção, pode ser incorporada nas composições farmacêuticas adequadas para administração pulmonar a um indivíduo. As composições para uso nos métodos e composições do presente pedido de patente de invenção podem estar em uma variedade de formas de acordo com o modo de inalação e aplicação terapêutica. Em uma aplicação, o presente pedido de patente de invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo uma DNase e um transportador farmaceuticamente aceitável, em que a composição farmacêutica é adequada para inalação por um indivíduo. Assim, a DNase é formulada em uma composição farmacêutica adequada para inalação. Exemplos de composições farmacêuticas que são adequadas para inalação incluem, entre outros, um aerossol contendo propulsor, e uma solução ou suspensão inalável livre de propulsor. Tais composições farmacêuticas podem ser administradas de acordo com os dispositivos descritos acima. Por exemplo, uma solução inalável livre de propulsor compreendendo a DNase pode ser administrada ao indivíduo através de um nebulizador. Outras preparações adequadas incluem, entre outros, névoa, vapor, ou preparações em spray contanto que as partículas compreendendo a composição de proteína são administradas em uma faixa de tamanho com aquela descrita para o dispositivo de administração, por exemplo, uma forma de pó seco da composição farmacêutica.

[00196] Onde uma solução ou suspensão líquida é usada no dispositivo de administração, um nebulizador, um inalador de dose medida, ou outro dispositivo de administração adequada administra, em uma dose fracionai única ou múltipla, por inalação pulmonar, uma quantidade farmaceuticamente eficaz da composição para os pulmões do indivíduo como gotículas que têm a mesma faixa de tamanho de partícula observada acima para a forma de pó seco. Métodos para preparar e usar formulações adequadas para uso como líquido ou suspensão são conhecidos na técnica, por exemplo, a matriz à base de óleo ensinada no PCT WO 2011/004476.

[00197] Onde a composição farmacêutica líquida é liofilizada antes da utilização nos métodos de administração do presente pedido de patente de invenção, a composição liofilizada pode ser moída para obter o pó seco finamente dividido consistindo em partículas dentro da faixa de tamanho desejada observada acima. Onde secagem por atomização é usada para obter uma forma de pó seco da composição farmacêutica líquida, o processo é realizado em condições que resultam em um pó seco finamente dividido substancialmente amorfo consistindo em partículas dentro da faixa de tamanho desejada observada acima. Similarmente, se a composição farmacêutica de partida já está em uma forma liofilizada, a composição pode ser moída para obter a forma de pó seco para subsequente preparação como um aerossol ou outra preparação adequada para inalação pulmonar. Onde a composição farmacêutica de partida está em sua forma secada por atomização, a composição foi preferencialmente preparada de modo que já estivesse em uma forma de pó seco que tem o tamanho de partícula apropriado para dispensar como uma solução ou suspensão aquosa ou não aquosa de acordo com os métodos de administração pulmonar do presente pedido de patente de invenção. Para métodos de preparação das formas de pó seco das composições farmacêuticas, vide, por exemplo, WO 96/32149, WO 97/41833, WO 98/29096, e Patentes Norte-Americanas n° 5.976.574, 5.985.248, e 6.001.336; incorporadas aqui por referência.

[00198] A forma de pó seco resultante da composição é então colocada dentro de um dispositivo de administração apropriado para subsequente preparação como um aerossol ou outra preparação adequada que é administrada ao indivíduo através de inalação pulmonar. Onde a forma de pó seco da composição farmacêutica deve ser preparada e dispensada como uma solução ou suspensão aquosa ou não aquosa, um inalador de dose medida ou outro dispositivo de administração apropriado é utilizado.

[00199] A forma de pó seco da composição farmacêutica compreendendo uma DNase pode ser reconstituída para uma solução aquosa para subsequente administração como um aerossol de solução aquosa utilizando um nebulizador, um inalador de dose medida, ou outro dispositivo de administração adequada. No caso de um nebulizador, a solução aquosa mantida dentro de um reservatório de fluido é convertida em um spray aquoso, apenas uma porção pequena da qual leva o nebulizador para administrar ao indivíduo em qualquer dado momento. O spray restante drena de volta em um reservatório de fluido dentro do nebulizador, onde é aerolizado novamente em um spray aquoso. Esse processo é repetido até o reservatório de fluido ser completamente dispensado ou até administração do spray aerolizado ser terminado. Exemplos de nebulizadores são descritos acima.

[00200] A composição do presente pedido de patente de invenção pode ser formulada com adição de ingredientes. Esses podem conter quaisquer dos ingredientes seguintes, ou compostos de uma natureza similar: um aglutinante tal como celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose, um agente de desintegração tal como ácido algínico, PrimogelTM, ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio ou SterotesTM; um glidante tal como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante tal como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante tal como menta, salicilato de metila, ou aromatizante laranja. Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, ela pode conter, além do material do tipo acima, um transportador líquido. Além disso, as formas unitárias de dosagem podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar, goma laca ou outros agentes entéricos.

[00201] As composições liofilizadas estabilizadas ou secadas por atomização podem ser formuladas utilizado um agente de tamponamento, que mantém o pH da composição farmacêutica dentro de uma faixa aceitável quando em uma fase líquida, tal como durante o processo de formulação ou seguindo a reconstituição da forma seca da composição. Em algumas aplicações, o pH está na faixa de cerca de pH 4,0 a cerca de pH 8,5, cerca de pH 4,5 a cerca de pH 7,5, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5, cerca de pH 5,6 a cerca de pH 6,3, e cerca de pH 5,7 a cerca de pH 6,2. Os pH's adequados incluem cerca de 4,0, cerca de 4,5, cerca de 5,0, cerca de 5,1, cerca de 5,2, cerca de 5,3, cerca de 5,4, cerca de 5,5, cerca de 5,6, cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9, cerca de 6,0, cerca de 6,1, cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, cerca de 6,5, cerca de 6,6, cerca de 6,7, cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, cerca de 7,5, cerca de 7,7, cerca de 7,8, cerca de 7,9, cerca de 8,0, cerca de 8,2, cerca de 8,4, cerca de 8,6, cerca de 8,8, cerca de 9,0, na faixa de 3,5 a 9,0, 4,0 a 8,0, 4,5,0 a 7,5, 5,0 a 7,5, 5,5 a 7,0 e 6,0 a 7,0. Em uma aplicação particular, o pH é cerca de 7,0 a 8,2. Os agentes de tamponamento adequados incluem, entre outros, tampão de citrato, tampão de fosfato, tampão de succinato, mais particularmente um citrato de sódio /ácido cítrico.

[00202] Alternativamente, imidazol ou histidina ou outra base/ácido que mantém o pH na faixa de cerca de pH 4,0 a cerca de 8,5 pode ser utilizado. Tampões são escolhidos de modo que eles sejam compatíveis com o processo de secagem e não afetam a qualidade, pureza, potência e estabilidade da proteína durante processamento e mediante armazenamento.

[00203] Quaisquer das composições farmacêuticas compreendendo DNase contemplada para a utilização nos métodos do presente pedido de patente de invenção podem ser formuladas com, pelo menos, um tensoativo. Para administração intracelular pulmonar da DNase, o tensoativo pode ser em uma quantidade suficiente para melhorar a absorção das partículas inaladas compreendendo DNase para obter uma composição absorvível para uso em inalação pulmonar de acordo com os métodos descritos aqui. Qualquer tensoativo que melhora a absorção de uma composição farmacêutica compreendendo DNase da mesma na maneira divulgada aqui pode ser utilizado para obter essas composições farmacêuticas contendo proteína absorvível. Os tensoativos adequados para uso em absorção melhorada da DNase inalada incluem, entre outros, ésteres de polioxietileno sorbitol tal como polissorbato 80 (Tween 80) e polissorbato 20 (Tween 20); ésteres de polioxipropileno-polioxieileno tais como Poloxamer 188; álcoois de polioxietileno tais como Brij 35; uma mistura de tensoativos de polissorbato com fosfolipídios tais como fosfatidilcolina e derivados (dipalmitoila, dioleoíla, dimiristila, ou derivados mistos tais como l-palmitoíla, 2-olcoíla, etc.), dimiristolgicerol e outros membros da série de fosfolipídio glicerol; lisofosfatidilcolina e derivados da mesma; misturas de polissorbatos com lisolecitina ou colesterol; uma mistura de tensoativos de polissorbato com tensoativos sorbitano (tal como monoleato de sorbitano, dioleato, trioleato ou outros dessa classe); tensoativos de poloxâmero; sais biliares e seus derivados tais como colato de sódio, desoxicolato de sódio, glicodesoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, etc.; micelas mistas de DNase com sais biliares e fosfolipídios; tensoativos de Brij (tal como Brij 35-PEG923) álcool laurílico, etc.). A quantidade de tensoativo a ser adicionada está na faixa de cerca de 0,005% a cerca de 1,0% (p/v), preferencialmente cerca de 0,005% a cerca de 0,5%, mais preferencialmente cerca de 0,01% a cerca de 0,4%, ainda mais preferencialmente cerca de 0,03% a cerca de 0,3%, mais preferencialmente cerca de 0,05% a cerca de 0,2%.

[00204] A composição farmacêutica do presente pedido de patente de invenção pode incluir uma dosagem adequada de acordo com o distúrbio a ser tratado. Em uma aplicação, a composição farmacêutica do presente pedido de patente de invenção compreende uma dose de cerca de 0,01 mg a 10 mg de DNase ou porção enzimaticamente ativa da mesma. Alternativamente, a composição farmacêutica do presente pedido de patente de invenção compreende uma dose de cerca de 0,1 mg a 5 mg; cerca de 1 mg a 5 mg; cerca de 2,5 mg a 5 mg, cerca de 2,0 a 4,5 mg, cerca de 2,2 a 4,0 mg, cerca de 2,0 a 3,0 mg, cerca de 2,2 a 3,0 mg, cerca de 2,3 a 3,0 mg, cerca de 2,4 a 2,8 mg, cerca de 2,4 a 2,6 mg; ou cerca de 2,5 mg da DNase ou porção enzimaticamente ativa da mesma. Em outra aplicação, a composição farmacêutica compreende uma dose acima de 10 mg. Deve ser observado que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada. Também deve ser entendido que para qualquer indivíduo particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade indivíduo e a avaliação profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de dosagem estabelecidas aqui são exemplares apenas e não pretendem limitar o escopo ou prática da composição reivindicada.

[00205] As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada a alta concentração de fármaco. As soluções inaláveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo (isto é, rhDNase, DNase I ou outra DNase) na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerada acima, conforme requerido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básica e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. A fluidez adequada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso da dispersão e pela utilização de tensoativos. A ação prolongada de composições inaláveis pode ser trazida incluindo na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[00206] Em uma aplicação, a DNase ou porção ativa para uso nos métodos do presente pedido de patente de invenção é incorporada em uma formulação farmacêutica conforme descrito aqui. Os compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições para administração pulmonar. Em certas aplicações, uma DNase ou porção ativa para uso nos métodos do presente pedido de patente de invenção é coformulada com e/ou coadministrada com um ou mais agentes terapêuticos adicionais mencionados anteriormente. Por exemplo, DNase I ou porção ativa do presente pedido de patente de invenção pode ser coformulada e/ou coadministrada com uma ou mais composições adicionais que reduzem a inibição de actina (por exemplo, sais de magnésio ou potássio), e/ou um ou mais agentes químicos que inibem a produção de muco (tal como agentes antiinflamatórios, broncodilatadores e/ou bloqueadores de secreção de muco, conforme descrito no documento US 7.763.610) ou qualquer combinação da mesma. Além disso, a DNase do presente pedido de patente de invenção pode ser usada em combinação com dois ou mais dos agentes terapêuticos anteriores. Tias terapias de combinação podem vantajosamente utilizar dosagens inferiores dos agentes terapêuticos administrados, evitando assim possíveis efeitos colaterais, complicações ou baixo nível de resposta pelo paciente associado com as várias monoterapias.

[00207] As composições farmacêuticas do presente pedido de patente de invenção podem incluir uma “quantidade terapeuticamente eficaz” ou uma “quantidade profilaticamente eficaz” de uma proteína de DNase ou porção ativa do presente pedido de patente de invenção. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz da DNase pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a habilidade da DNase ou porção ativa da mesma para provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da DNase são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma “quantidade profilaticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é utilizada em indivíduos antes de ou em um estágio inicial da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.

[00208] O presente pedido de patente de invenção também pertence a composições farmacêuticas embaladas ou kits para administração pulmonar de uma DNase, por exemplo, DNase I. Em uma aplicação do presente pedido de patente de invenção, o kit compreende uma DNase, tal como DNase I, e instruções para administração pulmonar da DNase, em que a DNase está em uma formulação adequada para inalação. As instruções podem descrever quando, por exemplo, no dia 1, dia 4, semana 0, semana 2, semana 4, etc., as diferentes doses de DNase devem ser administradas através de inalação a um indivíduo para tratamento.

[00209] Outro aspecto do presente pedido de patente de invenção pertence aos kits contendo uma composição farmacêutica compreendendo uma DNase, tal como DNase I, e um transportador farmaceuticamente aceitável, e uma ou mais composições farmacêuticas cada compreendendo um agente terapêutico adicional, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[00210] A embalagem ou kit alternativamente pode conter a DNase e pode ser promovida para uso, ou dentro da embalagem ou através de informação anexa, para os usos ou tratamento dos distúrbios descritos aqui. Os produtos farmacêuticos embalados ou kits ainda podem incluir um segundo agente (conforme descrito aqui) embalado com ou copromovido com instruções para uso do segundo agente com um primeiro agente (conforme descrito aqui).

[00211] O termo “tecido” refere-se à parte de um organismo consistindo em células projetadas para realizar uma função ou funções. Exemplos incluem, entre outros, tecido cerebral, retina, tecido de pele, tecido hepático, tecido pancreático, osso, cartilagem, tecido conectivo, tecido sanguíneo, tecido muscular, tecido cardíaco, tecido cerebral, tecido vascular, tecido renal, tecido pulmonar, tecido gonadal, tecido hematopoiético.

[00212] As composições farmacêuticas de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção podem ser fabricadas pelos processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de mistura convencional, dissolução, granulação, fabricação de drágea, levigação, emulsificação, encapsulamento, aprisionamento ou processos de liofilização.

[00213] Composições farmacêuticas para uso de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção podem ser assim formuladas em maneira convencional utilizando um ou mais transportadores fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares, que facilitam o processamento dos princípios ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação adequada é dependente da via de administração escolhida.

[00214] Para injeção, os princípios ativos da composição farmacêutica podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou tampão de sal fisiológico. Para administração transmucosa, penetrantes apropriados à barreira para serem permeados são utilizados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica, por exemplo, os tensoativos descritos anteriormente.

[00215] Para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada facilmente combinando os compostos ativos com transportadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Tais transportadores permitem que a composição farmacêutica seja formulada como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e similares, para ingestão oral por um paciente. As preparações farmacológicas para uso oral podem ser feitas utilizando um excipiente sólido, opcionalmente moendo a mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, após adicionar os auxiliares adequados se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágeas. Os excipientes adequados são, em particular, preenchedores tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose,

[00216] hidroxipropilmetil-celulose, carbometilcelulose de sódio; e/ou polímeros fisiologicamente aceitáveis tais como polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, os agentes de desintegração podem ser adicionados, tais como polivinil pirrolidona reticulada, ágar ou ácido ou um sal do mesmo tal como alginato de sódio.

[00217] Núcleos de drágea são fornecidos com revestimentos adequados. Para essa finalidade, as soluções de açúcar concentradas podem ser usadas que podem conter opcionalmente goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, carbopol gel, polietileno glicol, dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solvente. Corantes ou pigmentos podem ser adicionado aos revestimentos de comprimidos ou drágea para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses de composto ativo.

[00218] Composições farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina bem como cápsulas macias, vedadas feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter os princípios ativos em mistura com preenchedores tais como lactose, aglutinantes tais como amidos, lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas macias, os princípios ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida, ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, os estabilizadores podem ser adicionados. Todas as formulações para administração oral deveriam estar em dosagens adequadas para a via de administração escolhida.

[00219] Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou lozangos em maneira convencional.

[00220] A composição farmacêutica descrita aqui pode ser formulada para administração parentérica, por exemplo, por injeção de bólus ou infusão contínua. As formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidose com opcionalmente, um conservante adicionado. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formulatórios tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

[00221] Composições farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas da preparação ativa em forma solúvel em água. Adicionalmente, suspensões dos princípios ativos podem ser preparadas conforme suspensões de injeção oleosa ou à base de água. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim ou ésteres de ácidos graxos sintéticos tais como oleato de etila, triglicerídeos ou lipossomas. As suspensões aquosas de injeção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tal como carboximetil celulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode ainda conter estabilizadores adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos princípios ativos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[00222] Alternativamente, o princípio ativo pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, solução estéril, à base de água livre de pirogênio, antes da utilização, conforme detalhado acima.

[00223] A composição farmacêutica de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção também pode ser formulada em composições retais tais como supositórios ou enemas de retenção, utilizando, por exemplo, bases de supositório convencional tais como manteiga de cacau ou outros glicerídeos.

[00224] As composições farmacêuticas adequadas para uso no contexto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção incluem composições em que os princípios ativos são contidos em uma quantidade eficaz para alcançar a finalidade pretendida. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de princípios ativos (DNase I humana recombinante) eficazes para prevenir, aliviar ou atenuar os sintomas de um distúrbio (por exemplo, Fibrose Cística) ou prolongar a sobrevivência do indivíduo que é tratado.

[00225] Determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade dos técnicos no assunto, especialmente à luz da divulgação detalhada fornecida aqui.

[00226] Para qualquer preparação usada nos métodos do presente pedido de patente de invenção, a quantidade ou dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de célula e in vitro. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar a concentração ou titulação desejada. Tal informação pode ser usada para determinar mais precisamente doses úteis em humanos.

[00227] Toxicidade e eficácia terapêutica dos princípios ativos descritos aqui podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão in vitro, uma cultura de célula ou animais experimentais. Os dados obtidos desses ensaios de cultura de célula e in vitro e estudos de animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. A formulação exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico do indivíduo em vista da condição do paciente. (Vide, por exemplo, Fingl, et al., 1975, em “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1).

[00228] A quantidade de dosagem e intervalo pode ser ajustada individualmente, por exemplo, para prover níveis de soro e célula do princípio ativo que são suficientes para induzir ou suprimir o efeito biológico (concentração mínima eficaz, MEC). A MEC variará para cada preparação, mas pode ser estimada a partir de dados in vitro. As dosagens necessárias para alcançar a MEC dependerão das características individuais e via de administração. Os ensaios de detecção podem ser utilizados para determinar as concentrações no plasma.

[00229] Dependendo da gravidade responsividade da condição a ser tratada, a dosagem pode ser de uma pluralidade de administrações ou únicas, com curso de tratamento durando de vários dias a várias semanas ou até a cura ser efetuada ou diminuição do estado da doença ser alcançada.

[00230] A quantidade de uma composição a ser administrada será, é claro, dependente do indivíduo que é tratado, a gravidade da aflição, a maneira da administração, o julgamento do médico prescritor, etc.

[00231] Composições de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção podem, se desejado, ser apresentadas em uma embalagem ou dispositivo distribuidor, tal como um kit aprovado pela FDA, que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o princípio ativo. A embalagem pode, por exemplo, compreender uma folha metálica ou plástica, tal como uma embalagem de bolhas. A embalagem ou dispositivo distribuidor pode ser acompanhado pelas instruções para administração. A embalagem ou distribuidor também pode ser acomodado por uma notícia associada com o recipiente em uma forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, notícia que é o reflexo de aprovação pela agência da forma das composições ou administração humana ou veterinária. Tal notícia, por exemplo, pode ser de marcação aprovada pela Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos [FDA 1 U.S. Food and Drug Administration] para prescrição de fármaco ou de uma bula do produto aprovado. As composições compreendendo uma preparação do presente pedido de patente de invenção formulada em um transportador farmacêutico compatível também podem ser preparadas, colocadas em um recipiente apropriado, e marcado para o tratamento de uma condição indicada, como é detalhado acima.

[00232] A composição farmacêutica pode ser usada para o tratamento ou prevenção de uma condição respiratória relacionada ao muco em um indivíduo em necessidade da mesma. Assim, de acordo com outro aspecto do presente pedido de patente de invenção é fornecido um método para tratar ou prevenir uma condição respiratória tal como Fibrose Cística (FC) ou COPD em um indivíduo em necessidade respectiva, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que inclui, como um princípio ativo da mesma, uma proteína de DNase I humana, e um transportador farmacêutico aceitável. Em algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a proteína de DNase I humana tem um resíduo de Glicina N-terminal. Em outras aplicações, a proteína de DNase I humana tem uma sequência de aminoácido, conforme estabelecido na SEQ ID N° 5.

[00233] Em algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o tratamento de Fibrose Cística é efetuado pela administração pulmonar da DNase I prh, a dosagem eficaz estando em uma faixa de 0.1 a 50 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose, 0.1 a 50 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose, 0.5 a 25 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose, 1.0 a 20 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose, 1.5 a 15 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose, 2.0 a 10 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose, 2.5 a 7.5 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose, 2.75 a 5 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose ou de 2.0 a 3.0 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose. Em algumas aplicações, a dose eficaz da DNase I prh é 2.0 a 3.0 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose, 2.1 a 2.9 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose, 2.2 a 2.8 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose, 2.3 a 2.7 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose ou 2.4 a 2.6 mg de proteína de DNase I (como princípio ativo) por dose. Em algumas aplicações, a dosagem eficaz de DNase I prh é administrada uma vez ao dia, uma vez a cada 2 dias, uma vez a cada 2 a 5 dias, uma vez a cada 2 a 10 dias ou mais. Em algumas aplicações, a dosagem eficaz de DNase I prh é administrada 2, 3, de 2 a 4, de 2 a 6, de 2 a 8 ou mais vezes por dia. Em algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, 2.5 mg de DNase I prh são administrados através da administração pulmonar uma vez ao dia para tratamento de Fibrose Cística.

[00234] DNA em excesso, acumulado em secreções, fluidos ou tecidos, foi associado com várias condições patológicas e relacionadas à doença, não apenas em condições pulmonares, mas também em condições tais como sepsia, infertilidade e disseminação metastática do câncer. A DNase I prh do presente pedido de patente de invenção, administrada de modo a alcançar o local de DNA extracelular em excesso, pode eficazmente lisar tal DNA extracelular e desta forma reduzir a gravidade, aliviar os sintomas, tratar, prevenir ou curar a condição relacionada ao DNA. Assim, de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a doença ou condição é associada com DNA extracelular em excesso em um fluido, secreção ou tecido do referido indivíduo, e a referida administração das referidas composições farmacêuticas resulta em nucleólise do referido DNA extracelular.

[00235] Ainda em outras aplicações, a DNase humana recombinante expressa pela planta pode ser usada para tratamento ou prevenção de infertilidade masculina (vide, por exemplo US20110033438, de Bartoov et al. e US20070259367, de Ax et al.), e para o tratamento ou prevenção de doença infecciosa causada por bactérias, vírus, fungos e protozoários, tratamento ou prevenção de sepsia (por exemplo, sepsia bacteriana), tratamento ou prevenção de tumores, ambos primário e metastático, para prevenção ou redução de germinação metastática, tratamento e prevenção de aterosclerose, diabetes, reação de hipersensibilidade tipo atrasada, tratamento e prevenção de doenças causadas por mutação de célula somática e para melhorar a longevidade em um organismo (vide, por exemplo, US20080004561, de Genkin et al). O tratamento da infertilidade masculina por phr DNase I pode ser direcionado para reduzir a quantidade de DNA em amostras de sêmen, como ensinado, por exemplo, por Ax et al, via ex-vivo provendo as amostras de sêmen com DNase I prh. Em outras aplicações, o tratamento da infertilidade masculina, tumores, transformação e crescimento metastático, aterosclerose, distúrbios uterinos e endometriais, sepsia, infecções virais, bacterianas, fúngicas e protozoários, reação de hipersensibilidade tipo atrasada e doenças causadas por mutação somática da célula é direcionado para reduzir a quantidade de DNA em uma indivíduo, in-vivo, e a DNase pode ser administrada por qualquer via ou método adequado para administração da DNase ao alvo desejado dentro do corpo do indivíduo.

[00236] Assim, em algumas aplicações, é fornecido método de tratamento de um indivíduo, em que o indivíduo está sofrendo de uma doença ou condição selecionada do grupo consistindo em infertilidade masculina, câncer metastático, uma infecção viral, bacteriana, fúngica ou protozoária, sepsia, aterosclerose, diabetes, hipersensibilidade tipo atrasada e um distúrbio uterino, através da administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz da DNase I prh do presente pedido de patente de invenção. Os métodos para tal administração in vivo incluem, entre outros: administração oral, inalação, injeção intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intramuscular ou qualquer outra forma de administração sistêmica (vide, por exemplo, US20110033438 ou US20080004561). Em algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a DNase I prh é administrada como uma composição farmacêutica.

[00237] O termo “tratando” refere-se à inibição, prevenção ou detenção do desenvolvimento de uma patologia (doença, distúrbio ou condição) e/ou causando a redução, remissão ou regressão de uma patologia. Os técnicos no assunto entenderão que várias metodologias e ensaios podem ser utilizados para avaliar o desenvolvimento de uma patologia, e similarmente, várias metodologias e ensaios podem ser utilizados para avaliar a redução, remissão ou regressão de uma patologia.

[00238] Conforme utilizado aqui, o termo “prevenção” refere-se a manter uma doença, distúrbio ou condição de ocorrer em um indivíduo que pode estar em risco da doença, mas ainda não foi diagnosticado como tendo a doença.

[00239] Conforme utilizado aqui, o termo “indivíduo” inclui mamíferos, preferencialmente humanos estando em qualquer idade que sofra da patologia. Preferencialmente, esse termo engloba indivíduos que estão em risco de desenvolver a patologia.

[00240] Conforme utilizado aqui, a expressão “regime de tratamento” refere-se a um plano de tratamento que especifica o tipo de tratamento, dosagem, horário e/ou duração de um tratamento fornecido a um indivíduo em necessidade respectiva (por exemplo, um indivíduo diagnosticado com a patologia). O regime de tratamento selecionado pode ser um agressivo que se espera que resulte no melhor resultado clínico (por exemplo, cura completa da patologia) ou um mais moderado que pode aliviar os sintomas da patologia que ainda resulta em cura incompleta da patologia. Será apreciado que em certos casos o regime de tratamento mais agressivo pode estar associado com algum desconforto para o indivíduo ou efeitos colaterais adversos (por exemplo, um dano às células saudáveis ou tecido). O tipo de tratamento pode incluir uma intervenção cirúrgica (por exemplo, remoção da lesão, células doenças, tecido, ou órgão), uma terapia de substituição da célula, uma administração de um fármaco terapêutico (por exemplo, agonistas do receptor, antagonistas, hormônios, agentes quimioterápicos) em um modo local ou sistêmico, uma exposição à terapia de radiação utilizando uma fonte externa (por exemplo, feixe externo) e/ou uma fonte interna (por exemplo, braquiterapia) e/ou qualquer combinação do mesmo. A dosagem, horário e duração do tratamento pode variar, dependendo da gravidade da patologia e o tipo de tratamento selecionado, e os técnicos no assunto são capazes de ajustar o tipo de tratamento com a dosagem, horário e duração do tratamento.

[00241] Espera-se que durante a vida de uma patente que vence a partir desse pedido de patente, muitos vetores relevantes, elementos promotores, células de planta e transportadores serão desenvolvidos e o escopo dos termos fornecidos aqui pretendem incluir todas as novas tecnologias a priori.

[00242] Conforme utilizado aqui, o termo “cerca de” refere-se a ± 10%.

[00243] Os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tendo” e seus conjugados significam “incluindo entre outros,”.

[00244] O termo “consistindo em” significa “incluindo e limitado a”.

[00245] O termo “consistindo essencialmente em” significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas apenas se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicada.

[00246] Conforme utilizado aqui, a forma singular “um”, “uma” e “o/a” incluem referências plurais, salvo indicação clara do contexto em contrário. Por exemplo, o termo “um composto” ou “pelo menos um composto” pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas dos mesmos.

[00247] Em todo esse pedido de patente, várias aplicações desse pedido de patente de invenção podem ser apresentadas em um formato de gama. Deve ser entendido que a descrição no formato de gama é meramente para conveniência e brevidade e não deve ser interpretado como uma limitação inflexível no escopo do presente pedido de patente de invenção. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser considerada por ter especificamente divulgado todas as subfaixas possíveis bem como valores numéricos individuais dentro daquela faixa. Por exemplo, descrição de uma faixa tal como de 1 a 6 deve ser considerada por ter especificamente divulgado as subfaixas tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, e 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro daquela faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isso se aplica independente da largura da faixa.

[00248] Sempre que uma faixa numérica está indicada aqui, significa que inclui qualquer numeral citado (fracional ou integral) dentro da faixa indicada. As expressões “variando/varia entre” um primeiro número de indicação e um Segundo número de indicação e “variando/varia de” um primeiro número de indicação “para” um segundo número de indicação são usadas aqui intercambiavelmente e pretendem incluir o primeiro e segundo números indicados e todos os numerais fracionais e inteiros entre os mesmos.

[00249] Conforme utilizado aqui, o termo “método” refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma dada tarefa, incluindo, entre outros, aquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos também conhecidos ou facilmente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos pelos praticantes das técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.

[00250] Conforme utilizado aqui, o termo “tratando” inclui revogar, substancialmente inibir, retardar ou reverter a progressão de uma condição, substancialmente melhorar os sintomas clínicos e estéticos de uma condição ou substancialmente prevenir o aparecimento de sintomas clínicos ou estéticos de uma condição.

[00251] É apreciado que certos aspectos do presente pedido de patente de invenção, que são, para clareza, descritos no contexto de aplicações separadas, também podem ser fornecidos em combinação em uma aplicação única. Inversamente, vários aspectos do presente pedido de patente de invenção, que são, para brevidade, descritos no contexto de uma única aplicação, também podem ser fornecidos separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou conforme adequado em qualquer outra aplicação descrita do presente pedido de patente de invenção. Certos aspectos descritos no contexto de várias aplicações não devem ser considerados aspectos essenciais daquelas aplicações, a menos que a aplicação esteja inoperante sem aqueles elementos.

[00252] Várias aplicações e aspectos do presente pedido de patente de invenção conforme delineado acima e conforme reivindicado na seção de reivindicações abaixo encontram suporte experimental nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

[00253] Referência é feita agora para os exemplos a seguir, que junto com as descrições acima ilustram algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em uma maneira não limitaste.

[00254] Geralmente, a nomenclatura utilizada neste documento e os procedimentos laboratoriais utilizados no presente pedido de patente de invenção incluem técnicas de DNA molecular, bioquímico, microbiológico e recombinante DNA. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura. Vide, por exemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias, conforme estabelecido nas Patentes Norte-americanas N°. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; “Current Protocols in Immunology” Volumes Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980); imunoenssaios disponíveis são extensivamente descritos na patente e literatura científica, vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Transiation” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) and “Methods in Enzymology” Vol. 1, 2, 317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purificação and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); todas as quais são incorporadas por referência como se totalmente estabelecidas aqui. Outras referências gerais são fornecidas em todo este documento. Acredita-se que os procedimentos daqui são bem conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as informações contidas aqui estão incorporadas por referência.

EXEMPLO I: CONSTRUÇÃO DA ESTRUTURA DE EXPRESSÃO DE DESOXIRRIBONUCLEASE I DE PLANTA

[00255] cDNA codificando a proteína de desoxirribonuclease I (DNase I) humana (EC 3.1.21.1 GenBank: NM 005223) foi otimizado e sintetizado por GENEART AG (Regensburg, Alemanha). A utilização do códon sem os 22 peptídeos líderes de aminoácido (por exemplo, peptídeo de sinal de direcionamento do retículo endoplasmático) foi adaptado ao códon bias dos genes Nicotiana tabacum. Durante o processo de otimização, os motivos da sequência de activa cis a seguir foram evitados: caixas TATA internas, locais de entrada de ribossomos e locais chi, extensões de sequências GC enriquecidas e AT enriquecidas, elementos de instabilidade do RNA (“motivos letais”), estruturas secundárias de RNA e sequências de repetição, sites de receptores e doador de excisão (críptico), pontos de marca. Além disso, regiões de teor GC muito alta (>80%) ou muito baixa (<30%) foram evitados.

[00256] A sequência de nucleotídeo do peptídeo líder de DNase I humana (peptídeo de sinal de direcionamento do retículo endoplasmático) (Figura 1, primeiros 22 aminoácidos em vermelho) da proteína de DNase I humana de comprimento total (GenBank: NM005223) foi substituída com uma sequência de nucleotídeo codificando os 33 aminoácidos do peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático (peptídeo líder) da proteína Arabidopsis ABPI (marcada em verde na Figura 1, SEQ ID N° 4). Esse peptídeo de sinal de direcionamento do ER provê direcionamento eficaz da DNase I para o trajeto secretário e é então clivado a partir do polipeptídeo, pela peptidase de sinal, uma vez que a proteína foi translocada no retículo endoplasmático. Em alguns casos, a clivagem do sinal de ABPI não é completa e o último aminoácido Glicina (C-terminal) do peptídeo de sinal permanece, sendo adicionado ao N terminal da proteína de DNase I madura. Como a sequência de codificação da DNase I otimizada não contém nenhum sinal de localização de compartimento (organela) no terminal 3', a DNase I recombinante, na ausência de um sinal de localização C-terminal é direcionada para o apoplasto da célula de planta (o espaço extracelular em torno do simplasto da célula de planta), e quando expressa em culturas de célula de planta, é subsequentemente secretada no meio de cultura. SEQ ID N° 1 representa a sequência de codificação completa do polipeptídeo expresso de DNase I humana recombinante, incluindo o peptídeo de sinal de direcionamento de retículo endoplasmático N-terminal ABPI (SEQ ID N° 4) e a proteína de DNase I humana (SEQ ID N° 6).

EXEMPLO 2: EXPRESSÃO DE hDnase I RECOMBINANTE EM PLANTAS Sistema de Expressão Transiente em N. Bentamiana

[00257] A utilização de vetores virais de planta foi escolhida nesse caso como uma alternativa às plantas transgênicas, permitindo uma expressão de proteínas rápida, transiente de alto nível em plantas inteiras maduras.

[00258] A proteína de interesse foi expressa a partir de um promotor de proteína de revestimento viral subgenômico forte. O sistema confia na amplificação transiente (por agroinfecção) de vetores virais administrados a uma planta por Agrobacterium, em que o promotor funcional da planta e o cDNA codificando uma replicação viral são transferidos como T-DNA de Agrobacterium para as células de planta. O T-DNA é transcrito in-plant pelo promotor da planta para gerar RNA viral biologicamente ativo que inicia autorreplicação.

[00259] Para a expressão transiente, um sistema de recombinação de vetor 3 com base no sistema previamente desenvolvido como descrito (Gleba et al., Vaccine 23 2042-2048, 2005) foi empregado. 0 cDNA da DNase I foi inserido em um dos vetores, e os dois outros vetores continham genes para construção da replicação viral inteira (RdRp e Integrase), gerando assim um RNA viral biologicamente ativo capaz de iniciar a autorreplicação.

TRANSFECÇÃO DE PLANTAS INTEIRAS

[00260] As plantas N. Benthamiana foram germinadas e cultivadas em solo misto comercial (Givaat Ada, IL) suplementado com fertilizante de liberação lenta granular (Scott Marysville, OH) sob um regime de luz ao longo do dia (16h claro / 8h escuro) a 24°C-25°C.

[00261] Agrobacteria foram transformadas com o sistema vetor de replicação com base em pICH20866-DNaseI utilizando eletroporação (2500V, 5msec) [den Dulk-Ra, A. and Hooykaas, P.J. (1995) Methods Mol. Biol. 55:63-72]. As plantas foram infiltradas com Agrobacteria contendo os plasmídeos 3 ICON por filtração a vácuo com métodos padrão conhecidos na técnica. Resumidamente, as plantas N. benthamiana de 5 a 6 semanas de idade foram infiltradas por imersão em todos os órgãos de planta aéreos em uma suspensão bacteriana e foram colocadas em uma câmara a vácuo. Um vácuo de menos (-) 0,8 bar foi aplicado por 1 minuto, seguido por um rápido retorno à pressão atmosférica. As plantas foram retornadas à estufa por mais 5 a 7 dias sob as mesmas condições de cultivo.

[00262] A triagem para direcionamento dos compartimentos da célula de planta foi realizada utilizando o sistema de recombinação do vetor 3 descrito acima, com o vetor à base de DNase I incluindo uma sequência codificando um peptídeo de sinal N-terminal Arabidopsis ABPI (marcado em verde na Figura 1, SEQ ID N° 4), seguido pela sequência de nucleotídeo da DNase I humana, e ainda seguido por um dos abaixo: Uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID N° 14) codificando o sinal de retenção do retículo endoplasmático SEKDEL (SEQ ID 13), permitindo a recuperação da proteína expressa do aparelho de Golgi, mantendo efetivamente a proteína no retículo endoplasmático; Uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID N° 16) codificando para o peptídeo de sinal de direcionamento de vacúolo GLLVDTM (SEQ ID 15), permitindo a transferência da proteína expressa do aparelho de Golgi para o vacúolo da célula; ou Sem adição de nenhum sinal de localização do compartimento no terminal 3' da sequência de ácido nucleico, direcionando a localização da proteína de DNase I expressa para o apoplasto de célula de planta, por padrão.

EXTRATO DE PLANTA DE TABACO:

[00263] Amostras de folhas de Nicotiana benthamiana foram colhidas 5 dias após a infiltração em tampão de Laemmli por SDS-PAGE, ou em tampão de extração (HEPES-NaOH a 25mM, CaC12a 40mM, MgC12a 40mM, pH 7,5) para ensaios de atividade catalítica e ELISA da proteína expressa pela planta.

PURIFICAÇÃO DO EXTRATO DA PLANTA DE TABACO:

[00264] A proteína de DNase I humana dos extratos de planta foi purificada por centrifugação da massa de planta homogeneizada, descartando os detritos da planta. O sobrenadante foi aquecido a 60°C por 10 minutos e filtrado através de um filtro de 3 pm, seguido pela filtração através de um filtro de 0,65 pm. O filtrado foi então purificado em uma resina cromatográfica de interação hidrofóbica (Butil 650C, Toyopearl) seguida por outra purificação em uma resina de cromatografia de troca de ânion (Poros 50HQ). O final material foi filtrado por esterilidade (0,2 pm).

EXPRESSÃO ESTÁVEL EM CÉLULAS DE N. TABACUM BY2

[00265] Transformação mediada por Agrobacterium é amplamente usada para introduzir genes estrangeiros em um genoma de célula de planta. Essa técnica é baseada na capacidade natural de agrobacterium transformar as células de planta pela transferência de um segmento de DNA plasmídeo, o DNA transferido (T-DNA), no genoma de célula hospedeira. Utilizando essa abordagem, uma molécula de T-DNA, consistindo em um gene estrangeiro e seus elementos regulatórios, é aleatoriamente introduzida no genoma da planta. O local de integração, bem como o número da cópia das inserções do gene não é controlado, assim o processo de transformação resulta em um 'poço' de células transgênicas compostas de células com vários níveis de expressão transgênica. O 'poço' transgênico é subsequentemente utilizado para isolamento do clone. O isolamento do clone resulta no estabelecimento de muitas linhagens de célula única, a partir das quais o clone com o nível de expressão mais elevado do gene estrangeiro é então selecionado.

[00266] A cultura de suspensão BY2 (Amarelo Brilhante 2) foi cultivada, por 48 horas, com a cepa Agrobacterium tumefactiens EHA105 carregando o vetor abrigando o gene de DNase I e o gene de seleção de neomicina fosfotransferase (NPTII).

[00267] Subsequentemente, as células foram mantidas nos meios suplementados com 50mg/L de Kanamicina e 250mg/L de Cefotaxima. O gene NPTII confere resistência à Kanamicina, assim apenas células de BY2 positivas NPTII sobrevivem nesses meios de seleção. A Cefotaxima foi usada para matar seletivamente a agrobactéria, as células de planta sendo resistentes a esse antibiótico. Uma vez que uma suspensão de célula transgênica bem crescida foi estabelecida, ela foi usada para triagem e isolamento das linhagens de célula individuais. Para permitir a seleção das linhagens de célula individuais, alíquotas de suspensão de célula altamente diluída foram espalhadas em meio sólido de BY-2. As células foram então cultivadas até desenvolver pequenos calos. Cada calo foi então ressuspenso em cultura líquida, O meio foi então amostrado e avaliado para níveis de DNase I. As linhagens que secretaram níveis de DNase I relativamente altos foram então reanalisadas e comparadas com os níveis de DNase terminando com a seleção final das linhagens de expressão de DNase I candidatada.

[00268] As amostras médias de células de BY2 transformadas expressando a proteína de DNase I humana foram coletadas e quando requerido, concentradas 5x por filtros centrífugos (Amicon. Ultra, 10K, #UFC501096). A atividade catalítica de DNase I nos meios de célula foi determinada por ensaio de Verde Metila de DNA e comparado com a quantidade total de DNase I, determinada por ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA 1) conforme descrito abaixo.

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA DAS CÉLULAS BY-2:

[00269] A proteína DNase-I humana recombinante secretada das células de planta de suspensão de tabaco foi purificada pelas etapas a seguir: no final da fermentação, as células de tabaco intactas foram separadas dos meios pela filtração utilizando bolsas de filtro de 100 mesh. As células foram descartadas e os meios contendo o prhDNAse-I foi coletado para filtração adicional com folhas de filtro de 0,2pm utilizando aparelho de pressão de filtro. A DNase nos meios filtrados foi ainda purificada por duas etapas de colunas de cromatografia de uma resina de troca de ânion (Poros 50HQ, Applied Biosystems, EUA) seguidas por cromatografia de interação hidrofóbica de resina de Fenila 650C (Toyopearl, Japão). A DNase purificada coletada da última coluna foi de 0,2 pm filtrada e armazenada a 4°C.

ELETROFORESE DE GEL: Eletroforese de Gel

[00270] Dodecil Sulfato-Poliacrilamida de Sódio (SDS-PAGE) separa as proteínas primeiramente por seu peso molecular, as proteínas migrando como uma função linear do logaritmo de seu peso molecular em SDS-PAGE. Para estimar o peso molecular de DNase I prh, migração em SDS-PAGE foi comparada às proteínas padrão de peso molecular comercial (New England BioLabs; cat No. P7708S) e para a migração de DNase I humana recombinante derivada de célula de mamífero, comercialmente disponível, Pulmozyme® (Genentech, CA), expressa em células de CHO. DNase I prh e Pulmozyme foram analisados por 15% de Tris-Glicina SDS-PAGE. Eletroforese foi realizada utilizando aparelho de eletroforese vertical de célula CriterionTM (Bio-Rad Lab.) com eletroforese pré-misturada de tampão de execução de Tris-Glicina-SDS (Bio-Rad Laboratories). Quinze por cento de géis de acrilamida foram preparados utilizando soluções pré- M %1.%',s

[00271] misturadas de 40% de 0Acrilamida/f~10% de solução de SDS. Identificação das proteínas foi realizada utilizando dois métodos de detecção: coloração azul brilhante de Coomassie e análise Western blot utilizando anticorpos específicos e Luminecência Química Aumentada (ECL).

COLORAÇÃO AZUL DE COOMASSIE

[00272] Seguindo SDS-PAGE, os géis foram manchados com Bio- SafeTM Coomasie Stain (Bio-Rad) de acordo com as instruções dos fabricantes.

Western Blotting Western blot Anticorpos: Detecção de DNasel rh foi realizada utilizando:

[00273] antissoro inteiro obtido de coelhos imunizados contra Pulmozyme®. Esses anticorpos foram preparados de acordo com um protocolo de preparação de anticorpo policlonal padrão incluindo quatro imunizações com 3 mg de antígeno por coelho, e coleção do soro após a quarta imunização; ou afinidade de DNase I anti-prh de coelho purificada e DNase I anti-prh de cabra adquirida seguindo imunização dos coelhos e cabras com DNase prh e purificação de afinidade em uma coluna de Pulmozyme®. Assim, os anticorpos purificados detectam a sequência de estrutura comum de Pulmozyme e prhDNase. Esses anticorpos foram preparados por GenScript USA Inc de acordo com o protocolo de preparação de anticorpo policlonal padrão GenScript incluindo quatro imunizações com 3 mg de antígeno por coelho e 8 mg de antígeno por cabra, e coleção do soro após a quarta imunização.

PAGE and Blotting:

[00274] Seguindo SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas a uma membrana de nitrocelulose utilizando iBlotTM Dry Blotting System (Invitrogen). A transferência foi realizada à temperatura ambiente por 8 min. Então, a membrana foi bloqueada com 5% (v/p) de leite em pó seco sem gordura em PBS suplementado com 0,05% (v/v) de Tween-20, lavado com PBS suplementado com 0,05% (v/v) de Tween-20, ligado ao anticorpo primário, seguido pela lavagem com PBS suplementado com 0,05% (v/v) de Tween-20 e incubação com anticorpo conjugado por HRP secundário. O anticorpo primário foi diluído 1:5000 (antissoro inteiro) ou 1:10000 (antiDNase I prh de coelho e cabra purificada por afinidade) em 1% (w/v) de leite em pó seco sem gordura em PBS suplementado com 0,05% (v/v) de Tween- 20, e o anticorpo conjugado de HRP de anti-coelho ou coelho anti-cabra de cabra de anticorpo secundário (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., PA; cat No. 111-035-003 e cat No. 305-035-003, respectivamente) foi diluído 1:10.000 em 1% (w/v) de leite em pó seco sem gordura em PBS suplementado com 0,05% (v/v) de Tween-20. A reação de Quimiluminescência Aumentada (ECL) foi realizada com kit de detecção de ECL (Pierce; cat. No. 34080). As bandas imunorreativas foram detectadas e documentadas utilizando o Sistema Gel Doc XR do Imageador Molecular (Bio-Rad Laboratories, UK) para intervalos de tempo de até 60 segundos, conforme necessidade.

FOCAGEM ISOELÉTRICA Focagem isoelétrica

[00275] (IEF) separa as proteínas na base de sua carga em um campo elétrico. A proteína migra em um pH gradiente gerado por um campo elétrico até alcançar um ponto em que sua carga líquida iguala a zero, e aquele pH reflete seu ponto isoelétrico (pI). Para identificar o pI da DNase I rh, a proteína foi analisada por géis de poliacrilamida IEF utilizando uma Célula de Eletroforese XCell SureLock equipada com uma fonte de energia Powerpac (BIO-RAD) e pela focagem isoelétrica capilar trabalhada (iCE) utilizando um analisador iCE280 (Convergent Bioscience, Toronto Canada). Os géis IEF de poliacrilamida pré-moldados com uma faixa de pH de 3 a 7 foram obtidos de Invitrogen (Novex®, Invitrogen, cat No. EC6645B0X/EC66452B0X); os tampões foram obtidos de Invitrogen (tampão de anodo: Novex®, cat. No LC5300; tampão de catodo: Novex®, cat. No. 5370; tampão de amostra: Novex®, cat. No. 5371); os padrões de proteína de pI foram obtidos de SERVA (cat. No. 39212). Condições de eletroforese: 100mV-lh, 200mV-lh, 500mV-1.5h. As bandas foram visualizadas por Bio-SafeTM Coomassie Stain (Bio-Rad, cat No. 161-0787) de acordo com as instruções de fabricante. O perfil pI de DNase I rh foi estimado utilizando os padrões de proteína de pI, e então o perfil de bandagem foi comparado àquele de Pulmozyme.

[00276] Para análise de focagem isoelétrica capilar trabalhada, uma amostra contida em DNase I prh, marcadores de pI 3,59 e 5,85 (proteína simples, cat No. 102222 e 102225, respectivamente), 0,35% de metilcelulose (proteína simples, cat N°. 101876), e SERVALYT pH 3-7 (SERVA, cat No. 42945.01) foi introduzida ao capilar através de um automostrador (PrinCE) e foi focalizado em uma coluna capilar em alta tensão. O processo de focalização foi monitorado em tempo real suando uma detecção e formação de imagem de coluna inteira (WCID). A espécie de carga solucionada aparece como picos eletroforéticos que são detectados em um comprimento de onda fixo de UV280 nm. Os valores de pI e áreas de pico para cada espécie foram determinados dos eletroferogramas resultantes.

ESPECTROMETRIA DE MASSA ANÁLISE DO PESO MOLECULAR

[00277] A análise do peso molecular foi realizada por espectrometria de massa (MS) da DNase I rh, utilizando um espectrômetro de massa de tempo de voo de ionização de dessorção a laser assistida pela matriz (MALDI-ToF) e ácido sinapínico como uma matriz. O equipamento foi calibrado utilizando padrões de peso molecular. Cerca de 2,5 microgramas de rh DNase foram suados para análise da massa.

SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL

[00278] A sequência de DNase I prh foi analisada utilizando HPLC de fase reversa (RP-) acoplada à espectrometria de massa.

[00279] As amostras de proteína foram reduzidas utilizando DTT a 2,8 mM (60°C por 30 minutos), modificadas utilizando iodoacetamida a 8,8 mM em bicarbonato de amônio a 100 mM (no escuro, à temperatura ambiente por 30 minutos) e digeridas em 10% de ACN e bicarbonato de amônio a 10 mM com tripsina modificada (Promega) ou com quimiotripsina durante a noite a 37°C em uma razão de 1:50 de enzima para substrato. 3% dos peptídeos resultantes foram solucionados pela cromatografia líquida de fase reversa em capilares de sílica fundida de 0,075 X 200 mm (J&W) embalados com material de fase reversa Reprosil (Dr Maisch, GmbH, Alemanha). Os peptídeos foram eluídos com um gradiente linear por 60 minutos de 5 a 45% seguido por 15 minutos a 95% de acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico em água em vazões de 0,25 pL/min. A espectrometria de massa on line foi realizada por um espectrômetro de massa e armadilha iônica (Orbitrap, Thermo) em um modo positivo utilizando repetitivamente varredura de MS total seguida pela dissociação induzida por colisão (CID) dos 7 íons mais dominantes selecionados da primeira varredura de MS. Os dados de espectrometria de massa foram analisados utilizando o software Sequest 3.31 (J. Eng and J.Yates, University of Washington and Finnigan, San Jose), comparado à sequência de referência humana.

[00280] Outros dados de sequencialmente e caracterização estrutural foram obtidos de digestão de tripsina de DNase I prh, com ou sem uma digestão adicional com PNGaseA na presença e ausência de e análise por espectrometria de massa.

Ligações de Dissulfeto e Conteúdo de Sulfidrila Livre

[00281] A sequência de DNase-1 humana inclui quatro resíduos de cisteína e contém duas ligações de dissulfeto. Espera-se que a estrutura de uma DNase-1 humana recombinante expressa em células de planta (DNase I prh), seja similar à proteína humana autêntica.

[00282] O conteúdo de tiol da avaliação da DNase I prh foi obtido o método de Ellman, que é um método rápido e sensível para análise quantitativa dos tióis livres totais em peptídeos e proteínas. O número de tióis livres encontrados em DNase I prh também indica o número de resíduos de cisteína que são envolvidos em ligações de dissulfeto.

[00283] A análise de tióis livres de DNase I prh e Pulmozyme® foi realizada de acordo com o método de Ellman padrão em condições de desnaturação. A reação foi realizada pela mistura da solução de proteína em tampão de fosfato de sódio com Cloridrato de Guanidina a 6M e o substrato ativo de DTNB [5, 5'-Ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico)]. As soluções foram incubadas em condições ambiente por 5 a 15 min. Durante a reação, TNB (ácido 2-nitro-5-tiobenzoico) foi liberado. Uma reação de 1 mol de DTNB com 1 mol de tiol liberou 1 mol de ânion de TNB com um coeficiente de extinção de 13.700 1,4-1 cm-1 a 412nm. O número de tióis foi calculado como razão direta entre concentração de TNB e concentração de DNase I prh na amostra analisada. Uma proteína, contendo tióis livres, foi usada como controle positivo e tampão de formulação de DNase I (CaC12 a 1mM, NaC1 a 150mM, pH 6,1-6,5) foi utilizado como vazio para análise. ESTRUTURA DE GLICANO DA DNase rh

Análise de Glicano da Dnase I Humana Expressa pela Planta:

[00284] Amostras de produto de proteína de DNAse I humana recombinante das células transformadas foram reduzidas com DTT alquilado com iodoacetamida, e separadas em um SDS-PAGE de 12,5%. As bandas correspondendo ao peso molecular correto foram extirpadas e submetidas à análise de glicano consistindo em digestão de tripsina seguida pela extração de peptídeo e por digestão de PNGase A e PNGase F. A digestão de PNGase A libera todos os glicanos N-ligados e PNGase F libera todos os glicanos exceto aqueles que contêm a 1-3 core fucose.

[00285] Os glicanos livres foram liberados, purificados e então marcados com a antranilamida de reagente fluorescente (2AB) seguida pela remoção de 2AB em excesso.

[00286] Glicanos foram separados utilizando uma HPLC de fase normal de Amida 80 de gel TSK e detectados utilizando um detector de fluorescência. Um dextrano hidrolisado serviu como uma escada para cálculo dos valores de unidade de glicose (GU). O perfil de Glicano é construído pelo cálculo das áreas de pico relativas do cromatograma da digestão de PNGase A. Atribuição dos glicanos é estabelecida pelo cálculo dos valores de GU dos picos encontrados em ambas as digestões de endoglicosídeo e baseada em várias digestões de exoglicosídeo adicionais, comparação com o banco de dados conhecidos e confirmação dos resultados pelos métodos espectrométricos de massa.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA DE FASE REVERSA (RP-HPLC)

[00287] RP-HPLC foi utilizada como um método de análise para a determinação de pureza de DNase I hr. A análise empregou uma coluna Jupiter 3p, C18, 300Ã, 250x4,6mm por Phenomenex. As análises foram realizadas em um sistema Dionex, Ultimate 3000 HPLC equipado com um detector de matriz de fotodiodo. Os cromatogramas foram rotineiramente gravados em 2 comprimentos de onda, 214 e 280nm.

SOLVENTES DE ELUIÇÃO:

[00288] Solvente A: 1 litro, 0,1% de TFA/H2O (grau de HPLC, J.T.Baker, cat # 4218-03). Solvente A foi preparado pela adição de 1,0 mL de TFA (Sigma, cat. # T6508) para 0,999 litro de água (grau de HPLC, J.T. Baker, cat. # 4218-0.3).

[00289] Solvente B: 1 litro, 0,1% de TFA/Acetonitrila (grau de HPLC, Sigma, cat. # 34888). Solvente B foi preparado pela adição de 1,0 mL de TFA (Sigma, cat. # T6508) para 0,999 litro de acetonitrila (grau de HPLC, Sigma, cat. # 34888).

MÉTODO CROMATOGRÁFICO:

[00290] As separações cromatográficas foram realizadas em uma coluna Jupiter 3p, C18, 300Á, 250x4,6mm (Phenomenex, cat. 00G-4263-E0). Os cromatogramas foram obtidos utilizando um gradiente linear de 5% de B por 3 min, seguido por 5% de B a 43% de B por 10 min, seguido por 43% de B a 55% de B por 30 min, seguido por 55% de B a 95% de B por 10 min ,seguido por 95% de B por 3 min seguido por 95% de B a 5% de B por 2min, seguido por 5% de B por 21 min em uma vazão de 1 ml/min e em uma temperatura de 55°C. Cada sequência de análise foi iniciada com uma execução de tampão de formulação de DNase I (CaC12 a 1mM • NaC1 a 150mM, pH 6,1 a 6,5) como uma lacuna para DNase I rh.

[00291] Amostras de DNase I prh (25pg) em tampão de formulação de DNase I foram analisadas. 25pg da DNase I rh foram pipetadas em uma inserção de vidro (250 pL), que foi inserida em um frasco de vidro automostrador de HPLC.

RESULTADOS Caracterização da Dnase I Hr Expressa pela Planta:

[00292] Rendimentos de DNase I hr expressa em células de planta do tabaco plantas inteiras de tabaco variaram com direcionamento a organelas de plantas diferentes. A Figura 2 mostra as diferenças de rendimento da DNase I humana expressa pela planta (relativas àquela do direcionamento de apoplasto) quando DNase I phr foi expressa de uma estrutura de DNase I codificando um peptídeo de sinal de direcionamento de ER N-terminal apenas (APO) direcionando a proteína para o apoplasto, de uma estrutura de DNase I codificando um peptídeo de sinal de direcionamento de ER N-terminal e um peptídeo de sinal de direcionamento vacuolar C-terminal (VAC), ou de uma estrutura de DNase I codificando um peptídeo de sinal de direcionamento de ER N-terminal e um peptídeo de sinal de retenção de ER C-terminal, direcionando a proteína para retenção na ER (ER). Claramente, direcionamento ao apoplasto resulta no rendimento mais elevado dessas três opções de expressão. Além disso, a Figura 2 também revela a correlação consistente entre os níveis de proteína de DNase I imunorreativa e atividade catalítica.

[00293] A Figura 3 mostra um resultado exemplar da migração de DNase I prh em SDS-PAGE (faixas 6-9), comparado com DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (Pulmozyme®) (faixas 1-4). A DNase I prh expressa pela planta consiste em uma banda maior em um peso molecular de -30 KDa, migrando similarmente àquele da preparação comercial. A preparação de DNase I prh não continha nenhuma contaminação detectável, indicando uma alta pureza. Uma diferença ligeira aparente em características de migração foi observada foi entre a DNase I prh e a preparação comercial, dom a DNase I expressa pela planta parecendo para migrar mais rápido. Sem desejar aderir a uma hipótese única, uma explicação possível para tal diferença em características de migração poderia ser uma diferença nos padrões de glicosilação entre a planta e enzimas expressas por célula de mamífero. A fim de comparar por consistência entre expressão de phrDNase I da cultura de planta e célula de planta, 3 lotes de DNase I prh extraídos das plantas inteiras e 3 lotes de DNase I prh extraídos das células cultivadas foram analisados em SDS-PAGE, e foram observados por ter o mesmo padrão característico de migração no gel.

[00294] A Figura 4 mostra um resultado exemplar de reatividade de cruzamento imunológico da DNase I prh separada em SDS-PAGE (faixas 6- 9), comparado com a DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero, comercial (Pulmozyme) (faixas 1-4), quando reagidos com soro imune de DNase I anti-humana de coelho não fracionada. Uma proteína de DNase I prh reativa cruzada expressa pela planta migrou como o peso molecular de 30 kDa, similar à preparação comercial. Além disso, observe que a preparação de DNase I prh expressa pela planta não contém nenhuma outra espécie imunorreativa detectável relacionada à DNase I, indicando alta pureza da preparação. Três lotes de DNase extraída da planta inteira e 3 lotes de DNase extraída das células cultivadas foram analisados e mostraram as mesmas características de migração. Além disso, os mesmos resultados foram obtidos utilizando anti- prh DNase de coelho purificada de afinidade.

[00295] As figuras 5A a 5D mostram uma análise típica de pI da DNase I prh expressa pela planta como comparado a Pulmozyme®. A DNase I rh é caracterizada por 3 bandas; duas isoformas maiores variando entre 4,24,5 e uma isoforma menor com um pI ligeiramente inferior pI (Figura 5A, faixas 2 e 3 e 5B, faixa 2). Isso está em contraste ao padrão comercial, Pulmozyme® (Figura 5A, faixa 1 e 5B, faixa 3), que é caracterizada por uma variedade de isoformas variando de pI 3,5 a pI 4,5. Sem desejar aderir a uma hipótese única, uma explicação possível para tal diferença em pI poderia ser uma diferença em padrões de glicosilação entre a planta e enzimas expressas por célula de mamífero. Três lotes de DNase extraída da planta inteira e 3 lotes de DNase extraída das células cultivadas das culturas de diferentes linhagens de BY2 transformado foram analisados e demonstraram o mesmo padrão de migração mediante análise de pI. Os valores de pI para cada espécie foram determinados de electroferogramas de focagem isoelétrica capilar trabalhada (Figuras 5C e 5D). Um pico principal (MP, pI 4,41) e dois picos ácidos (pré-MP1 e pré-MP2 com pI de 4.27 e 4.21) foram observadas, consistentes com o perfil de pI observado nos géis de IEF (Figuras 5A e 5B).

[00296] As figuras 6A e 6B descrevem uma análise do peso molecular da DNase I prh expressa pela planta por MALDI-ToF, mostrando o espectro inteiro de 20000 a 180000 m/z (6A) ou uma ampliação do pico de DNase I prh a cerca de 32000 m/z (6B). O peso molecular da enzima de DNase I prh extraída das células de planta foi de aproximadamente 32.070 Da, enquanto o peso molecular teórico do polipeptídeo de DNase I prh, com base na sequência de aminoácido das proteínas 261, é 29.311 Da. Sem desejar aderir a uma hipótese única, uma explicação semelhante para tal diferença nas características cromatográficas é a diferença nos padrões de glicosilação. Portanto, as estruturas de glicano podem adicionar os 2760 Dáltons restantes. Três lotes de DNase I prh extraída das células cultivadas foram analisados e mostraram características similares.

[00297] A diferença no peso molecular das três isoformas principais de phr DNase I vista na análise de MALDI foi aproximadamente 200 Da. (Figura 6B) Isso pode corresponder a uma diferença em estruturas de glicano que pode ser atribuída a um ou dois resíduos de N-Acetilglucosamina (203 Da). A mesma indicação pode ser encontrada na variabilidade das estruturas de glicano.

[00298] Assim, os resultados da análise de espectrometria de massa confirmam a determinação do peso molecular da análise de SDS-PAGE (vide Figura 3), e ambos são consistentes com um peso molecular da DNase I prh comparável ao peso molecular calculado do polipeptídeo expresso, e consistente com o peso molecular da DNase I humana recombinante expressa por célula de mamífero (Pulmozyme0).

SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO DA DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA

[00299] Análise de espectrometria de massa dos peptídeos gerados pela digestão de tripsina e quimiotripsina da DNase I rh expressa pela planta mostrou mais de 97,3% de cobertura das 261 sequências de aminoácido de DNase I que corresponderam sequência de aminoácido predita com base na sequência de DNA do cassete de expressão (SEQ ID N° 6). A figura 7 representa a sequência de aminoácido de compósito derivada dos peptídeos de sobreposição, com aminoácidos não confirmados em vermelho, locais de glicosilação putativa em negrito e sublinhados, e a glicina N-terminal adicional marcada em verde. Quando comparada à sequência de peptídeo da enzima humana nativa (SEQ ID N° 6, GenBank Acesso N°: NP 005214.2) está aparente que a sequência de aminoácido da DNase I rh expressa pela planta é idêntica àquela da dornase alfa comercial, expressa pela célula de mamífero (Pulmozyme®), e em algumas aplicações, com um resíduo de glicina adicional na posição 1 no terminal N, derivado do peptídeo de sinal ABPI. De fato, outra análise de HPLC e MS de uma digestão de tripsina e subdigestão de quimiotripsina da DNase I rh expressa pela planta proveu uma sequência de aminoácido 261 completa, confirmando a precisão da sequência derivada de peptídeos de sobreposição (FIG 7) e a identidade da sequência de aminoácido da DNase I rh expressa pela planta e aquela de dornase alfa comercial, expressa de célula de mamífero (Pulmozyme®), com a adição de um resíduo na posição 1 no terminal N, derivado do peptídeo de sinal ABPI. Além disso, a análise da digestão de tripsina da DNase I prh tratada e não tratada com PNGase A revelou a presença dos locais de glicano em Asp 19 e Asp 107, conforme suportado pelos dados de análise de glicano na figura 8 (abaixo). Além disso, as pontes de dissulfeto foram observadas entre Cys102 e Cys105 e entre Cys174 e Cys210.

[00300] Os peptídeos de sobreposição são apresentados na tabela de cobertura seguinte (Tabela V), em que o primeiro aminoácido de DNase I rh expressa pela planta, Gly, é numerado como aminoácido 33, e onde os aminoácidos 1-32 são compreendidos da sequência do sinal ABPI (SEQ ID N° 4), que são clivados do polipeptídeo expresso seguindo transferência para o retículo endoplasmático. A Tabela Va mostra peptídeos produzidos pela tripsina e digestão de PNGase. Nessa tabela, Gly é indicado como aminoácido número 1. TABELA V PEPTÍDEOS IDENTIFICADOS SEGUINDO DIGESTÃO COM TRIPSINA E QUIMIOTRIPSINA TABELA Va- PEPTÍDEOS IDENTIFICADOS SEGUINDO DIGESTÃO COM TRIPSINA E PNGASE

CONTEÚDO DE SULFIDRILA LIVRE (MÉTODO DE ELLMAN)

[00301] O ensaio quantitativo dos tióis livres indicou que a proteína de DNase I phr e Pulmozyme® falta sulfidrilas livres, enquanto o controle positivo detectou quatro sulfidrilas livres (tióis) conforme esperado. Esses resultados confirmam que em DNase I phr quatro aminoácidos de Cisteína são ligados em 2 ligações de dissulfeto (Cys 102-Cys 105 and Cys 174- Cys210) conforme foi sugerido para DNase-1 e Pulmozyme®.

ANÁLISE DE GLICANO:

[00302] A análise preliminar foi realizada para caracterizar as várias estruturas de glicano de DNase I prh produzida da cultura de célula BY2. As figuras 8A a 8C mostram perfil de NP-HPLC de glicanos derivados de três lotes separados de DNase I prh utilizando PNGase A para liberar os glicanos. Liberação dos glicanos por PNGase F indicou uma baixa abundância de glicanos sem estruturas de fucose de núcleo em DNase I prh. O perfil de glicano de todos os três lotes de DNase I prh indicou um perfil similar. Picos nos perfis mostrados na Figura 8A correlaciona as estruturas detalhadas na Figura 8B indicando as quantidades relativas de glicanos liberadas dos lotes de DNase I prh.

[00303] A análise de glicano do produto de proteína de DNAse I humana recombinante das células de tabaco transformadas revelou um perfil de glicano compreendendo dois picos de glicano principais consistindo em pelo menos quatro estruturas de glicano (por exemplo, picos 3+4 e 5). As estruturas de glicano predominantes representando uma alta porcentagem do perfil de glicano (mais de 80%) contêm manose 3- 13-(1,2) xilose- a-(1,3) fucose [Fc(3) M3X] e/ou manose 4- a-(1,2) xilose (M4X) com uma substituição de um ou duas N-acetilglucosamina adicionais nos açúcares externos de manose (Figura 8B). Os outros glicanos contêm estruturas menores que não têm substituições de fucose ou N-acetilglucosamina (3 a 6%) ou estruturas híbridas (até 14%).

[00304] A figura 8C mostra uma comparação de glicanos encontrada em DNase I prh liberada por PNGase A comparado aos glicanos liberados de Pulmozyme® por PNGase F. As amplas variações no padrão de glicosilação encontradas em Pulmozyme® são devido à abundância de glicanos bi e trirramificados com resíduos de ácido siálico adicionais anexados, conduzindo a uma mistura de porções de glicano carregado e não carregado. Claramente, a glicosilação phr DNase I é mais homogênea e não inclui glicanos carregados.

PUREZA DE PREPARAÇAO DE rh DNase EXPRESSA PELA PLANTA:

[00305] Figuras 8A a 8D representam um cromatograma típico da DNase I prh expressa pela planta, analisado por RP-HPLC a 214nm (9A, 9B) e a 280nm (9C, 9D), após subtração de lacuna de início de sequência. Inserções 9B e 9D são vistas expandidas do pico de DNase I prh. Em ambos os cromatogramas, a DNase I prh soluciona como um pico principal (>93,6% de pureza) com um tempo de retenção de 28,3 minutos e dois picos pequenos adicionais, uma característica padrão de todos os lotes da DNase I prh testada.

[00306] Assim, a preparação de DNase I prh é caracterizada por peso molecular, pI, conteúdo de sulfidrila livre, reatividade cruzada imune e sequência de aminoácido comparável a mas distinto daquela da DNase I expressa de célula de mamífero comercialmente disponível, e consistente com o produto de tradução da sequência de codificação de DNase I humana expressa de SEQ ID N° 9. Além disso, a DNase I rh expressa pela planta é secretada no meio das células em cultura de suspensão, e pode ser purificada a um alto grau de pureza, contendo menos de 7% de impurezas detectadas por HPLC em 214 e 280nm.

EXEMPLO 3: ATIVIDADE BIOLÓGICA DA DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA

[00307] Atividade biológica da DNase I rh expressa pela planta foi ensaiada utilizando diversos ensaios, e comparada àquela da enzima recombinante humana de célula de mamífero comercialmente disponível Pulmozyme® (Genentech, MA).

MÉTODOS: ENSAIO DE DNA DE VERDE DE METILA

[00308] Desoxirribonuclease (DNase I) é uma endonuclease que cliva DNA preferencialmente em ligações de fosfodiéster, rendendo polinucleotídeos de 5'-fosfato terminado com um grupo hidroxila livre na posição 3', em tetranucleotídeos de produção média.

[00309] Atividade de DNase I foi avaliada pelo ensaio de atividade enzimática de Verde de Metila, empregando o DNA de Salmon Testis (Sigma cat No. D1626) complexado com o corante verde de metila (Sigma cat No. M8884) como um substrato. O verde de metila intercala entre as bases empilhadas de DNA de cadeia dupla. Uma vez que as moléculas longas de DNA são hidrolisadas em tetranucleotídeos como um resultado de atividade de DNasel, ocorre a dissociação de verde de metila do DNA, a descoloração do verde de metila livre é uma segunda reação, não enzimática. A descoloração espontânea do verde de metila livre em pH neutro é provável de resultar de tautomerização do corante.

[00310] As curvas padrão foram preparadas pela diluição de phrDNase I padrão purificada em Tampão de atividade (HEPES-NaOH a 25mM, CaC12 a 4mM, MgCl2 a 4mM, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20, pH 7,5) em concentrações variando de 0,3 a 20 ng/ml em diluições em série de 2 vezes. Amostras e controles foram preparados em uma maneira similar. Cem microlitros de padrões, controles e amostras foram adicionados em duplicado a uma placa de 96 poços (NUNC) contendo 100p1 de substrato de verde de metila de DNA e os conteúdos foram misturados totalmente. As placas foram então vedadas e agitadas por 30 min à temperatura ambiente, então foram incubadas durante a noite a 37 °C e absorvência medida a 620nm. Absorvência foi plotada versus concentrações padrão e os dados foram ajustados a um modelo logístico de 4 parâmetros pelo método de regressão não linear de Marquardt.

[00311] A atividade de DNase I em diferentes sistemas de expressão foi expressa como porcentagem da atividade medida nas células direcionadas de apoplasto (100%) (vide Figura 2).

ENSAIO DE IMUNOADSORÇÁO ENZIMÁTICA (ELISA)

[00312] O ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) foi utilizado para detectar a presença de DNase I rh imunorreativo em uma amostra. Dois métodos diferentes de ELISA foram realizados. O primeiro ensaio de ELISA (ELISA 1) foi desenvolvido utilizando anticorpos adquiridos contra Pulmozyme®. O segundo ensaio de ELISA (ELISA 2) foi desenvolvido utilizando anticorpos adquiridos contra DNase I derivada de planta.

[00313] O conteúdo total da DNase I prh foi avaliado por ensaios de ELISA intercalados indiretos. Os anticorpos utilizados em ELISA 1 incluem antissoro de DNase I anti-humana de coelho não fracionada e fração IgY de gema de frango. Esses anticorpos foram preparados seguindo imunização de coelhos e frangos com DNase I humana expressa por célula de mamífero comercialmente disponível (Pulmozyme9. Antissoro de DNase I anti-humana de coelho não fracionada foi preparado de acordo com um protocolo de preparação de anticorpo policlonal padrão incluindo quatro imunizações com 3 mg de antígeno por coelho, e coleção do soro após a quarta imunização. A fração IgY de gema da DNase I anti-humana foi preparada de acordo com um protocolo de preparação policlonal padrão de anticorpo incluindo quatro imunizações com 2,5 mg de antígeno por frango, e coleção das gemas após a quarta imunização.

[00314] Os anticorpos utilizados em ELISA 2 incluíram DNase I anti- prh de coelho e DNase I anti-prh de cabra. Esses anticorpos foram preparados por imunização de coelhos e cabras com DNase prh e afinidade de purificação em uma coluna Pulmozyme®. Assim, os anticorpos purificados detectam/se ligam à sequência do suporte principal comum de Pulmozyme® e DNase I prh. Os anticorpos foram preparados por GenScript USA Inc de acordo com protocolo de preparação de anticorpo policlonal padrão GenScript incluindo quatro imunizações com 3 mg de antígeno por coelho e 8 mg de antígeno por cabra, e coleção do soro após a quarta imunização.

[00315] Placas de microtitulação de 96 poços (Costar cat No. 9018 para ELISA 1 e NUNC cat No. 442404 for ELISA 2) foram incubadas durante a noite a 4°C com 100 pl/poço do antissoro de coelho total diluído 2500 vezes (ELISA 1) ou lug/ml de anticorpo DNase I anti-prh de cabra (ELISA 2) e diluído em tampão de carbonato-bicarbonato pH 9,6 (Sigma cat No. C3041). Placas foram então lavadas quatro vezes com tampão de lavagem preparada de acordo com as instruções do fabricante (KPL cat No. 50-63-00), bloqueadas com 300 pl de Blocker CaseinTM (Pierce cat No. 37528), incubadas por uma hora a 25 °C e lavadas novamente quatro vezes com tampão de lavagem. Uma curva padrão foi preparada por diluição da DNase I prh padrão em tampão de diluição (1% (w/v) de BSA em solução salina tamponada de fosfato) em concentrações variando de 0,3125 a 20 ng/ml (ELISA 1) ou 0,1562 a 10 ng/ml (ELISA 2) em diluições em série 2 vezes. Similarmente, amostras e controles foram diluídos de 100 a 100.000 vezes em tampão de diluição. Cem microlitros de controles e amostras padrão foram adicionados em duplicata aos poços de placas pré-revestidas e pré- bloqueadas, e agitadas por duas horas a 25°C ou incubadas durante a noite a 4°C. Placas foram então lavadas 4 vezes e incubadas por 1,5 hora a 25° C com 100 pl/poço de fração IgY de gema de frango diluídos 20.000 vezes no tampão de diluição (ELISA 1) ou anticorpo DNase I anti-prh de coelho diluído 10.000 vezes no tampão de diluição. Seguindo quatro etapas de lavagem adicionais, 100 pl de anticorpo conjugado de HRP anti-frango de jumento (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., PA; cat No. 703-035155) (ELISA 1) ou anticorpo conjugado de HRP anti-coelho de jumento (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., PA; cat No. 711-035-152) (ELISA 2), diluídos 5.000 vezes no tampão de diluição, foram adicionados e as placas incubadas por uma hora a 25°C. Em seguida, as placas foram lavadas extensivamente e suplementadas com 100 pl de solução de TMB (Millipore; cat No. ES001). Mediante o desenvolvimento da cor, a reação foi interrompida pela adição de 100 pl de 10% (v/v) de HC1 e então lida em 450 nm. Absorvência foi plotada versus as concentrações padrão e dados foram ajustados a um modelo logístico de 4 parâmetros pelo método de regressão não linear de Marquardt.

[00316] Imunorreatividade de DNase I em diferentes sistemas de expressão foi expressa como porcentagem da atividade medida nas células direcionadas de apoplasto (100%) (vide figura 2).

CINÉTICA ENZIMÁTICA:

[00317] A cinética de uma reação enzimática é tipicamente estudada pela variação da concentração do substrato e plotagem da taxa da formação do produto como uma função de concentração do substrato (velocidade). No caso convencional, isso rende uma curva de Michaelis-Menten hiperbólica típica e um lote de Lineweaver-Burk recíproco linear, do qual as constantes cinéticas da enzima podem ser calculadas. Para reações enzimáticas que exibem cinética simples de Michaelis-Menten, a constante de Michaelis (KM), ou a concentração do substrato em velocidade na metade do valor máximo (Vmax/2) representa a constante de dissociação do complexo de enzima-substrato (ES) ou a afinidade para o substrato. Os valores baixos de KM indicam afinidade de substrato mais elevada.

[00318] A constante cinética (k2), frequentemente chamada kcat, representa o número de moléculas de substrato convertidas no produto por unidade de tempo em um local catalítico único quando a enzima é totalmente saturada com substrato. kcat é usualmente a etapa de limitação da taxa de reação e é calculada dividindo Vmax pela concentração da enzima. kcat/KM é frequentemente pensada como uma medida da eficácia da enzima.

[00319] Muitas enzimas não se comportam em uma maneira convencional, suas curvas de velocidade se elevando a um máximo e então declinando como as elevações da concentração do substrato, referidas como inibição do substrato, e pensadas como o resultado da ligação de mais de uma molécula de substrato para um local ativo. A inibição do substrato é considerada um mecanismo regulatório biologicamente relevante embora seja

[00320] frequentemente observado ao usar concentrações de substrato artificialmente altas, em um ambiente de laboratório.

[00321] Os lotes cinéticos para inibição do substrato representam variação da velocidade inicial como uma função da concentração do substrato ou como lote recíproco duplo da variação da velocidade inicial com concentração do substrato. Uma vez que os mesmos compostos agem ao mesmo tempo como substrato e inibidor, o lote recíproco duplo não rende uma linha reta. Pode-se presumir que o efeito inibitório é desprezível em baixa concentração do substrato e de uma assíntota para a curva nessa região KM e V. pode ser estimado.

[00322] Ensaios da cinética enzimática da atividade de DNase I foram realizados utilizando uma sonda de oligonucleotídeo extinta de fluorescência DNaseAlertTM (personalizado por IDT), que tem um corante repórter HEXTM (hexaclorofluoresceína) em uma extremidade e um supressor escuro na outra extremidade, e que emite um sinal fluorescente detectável mediante degradação da nuclease. A sequência de DNA foi cuidadosamente otimizada para reagir com uma ampla variedade de nucleases; ela contém domínios que reagirão com endonucleases de cadeia única, certas exonucleases de cadeia única e nucleases de cadeia dupla. O substrato intacto tem pouca ou nenhuma fluorescência, mas quando clivado por uma DNase, o substrato hidrolizado fluoresce rosa (536 nm ou excitação de UV, 556 nm de emissão) quando clivado, e pode ser detectado visualmente ou utilizando um fluorômetro. Lotes de velocidade inicial de DNase I versus concentração de substrato exibem uma curva de velocidade que se eleva a um máximo e então declina conforme a concentração de substrato aumenta (Figura 10A). Esse padrão pode caracterizar um comportamento de inibição de substrato típico. O lote recíproco duplo permite a extração de valores de KM e Vmx por interceptação de abscissa com uma assíntota para a região alta do substrato (abordando a origem), onde predomina o efeito inibitório (Figura 10B).

ENSAIO CINÉTICO COM BASE EM DNaseAlertTM

[00323] O substrato de DNaseAlertTM (IDT; personalizado) foi diluído em Tampão de Atividade (HEPES-NaOH a 25mM, CaCl2 a 4mM, MgC12 a 4mM, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20, pH 7,5) em concentrações variando de 1 a 40 pM. Dez microlitros do substrato foram divididos em duplicado em uma placa preta de 96 poços (Greiner cat No. 655900) e a reação foi iniciado por adição rápida de 10 ul de DNase I para uma concentração final de 50 ng/mL. A placa foi imediatamente incubada em um fluorômetro e dados em tempo real foram coletados (535 nm d excitação, 565 nm de emissão) em intervalos de 30 segundos por 3 minutos. Velocidades iniciais foram extraídas pela utilização da curva padrão do produto fluorescente. A curva padrão do produto foi preparada pela diluição de 6- HEX (AnaSpec) em tampão de atividade em concentrações variando de 7 a 250 nM em diluições em série de 1,67 vez. As unidades de fluorescência foram transformadas em valores de concentração (pM) aplicando a fórmula da curva de calibração (y=ax+b quando y=FU e a=nM). Um lote recíproco duplo da velocidade inicial versus concentração de substrato (em 2 a 15 pM) permite a extração de valores de KM and Vmx pela interceptação de abscissa com uma assíntota para a região alta do substrato (Figura 10B).

ATIVIDADE ESPECÍFICA

[00324] Atividade específica de DNase I humana foi avaliada utilizando a sonda de oligonucleotídeo extinta por fluorescência DNaseAlertTM (fornecida por Ambion, cat #AM1970, fabricada por IDT) que emite um sinal fluorescente mediante degradação da nuclease. Uma unidade (U) de DNase é definida como a quantidade de enzima que libera 1 pmol do produto fluorescente por minuto a 22°C. O valor da atividade específica (U/mg) é calculada dividindo o valor da atividade total (U) pela quantidade de enzima usada na reação. A concentração da enzima foi determinada pela absorvência a 280nm, baseada em coeficiente de extinção. O coeficiente de extinção calculado de DNase I phr é 1,45 g/L.

[00325] 2 nmols do substrato DNaseAlertTM (Ambion, cat #AM1970) foram ressuspensos com 1 mL de nuclease livre de água. Amostras de DNase I prh e Pulmozyme® foram diluídas de 10.000 a 40.000 vezes no tampão de atividade (HEPES-NaOH a 25mM, CaC12 a 4mM, MgC12 a 4mM, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20, pH 7,5). 80 uL do tampão de atividade foram divididos em duplicado para uma placa preta de 96 poços (Greiner cat No. 655900). Dez microlitros de substrato foram então adicionados e a reação foi iniciada por rápida adição de lOul de DNase I rh ou Pulmozyme®. A placa foi imediatamente incubada em um fluorômetro e dados em tempo real foram coletados (535 nm de excitação, 565 nm de emissão) em intervalos de 30 segundos por 3 minutos. A curva padrão do produto foi preparada pela diluição de 6-HEX (AnaSpec cat # 81019) no tampão de atividade em concentrações variando de 7 a 250 nM em diluições em série de 1,67 vez. As unidades de fluorescência foram transformadas em valores de concentração (pM) aplicando a fórmula da curva de calibragem (y=ax+b quando y=FU e a=nM). 1 U é definida como a quantidade de enzima que libera 1 pmol de produto fluorescente por minuto a 22°C. O valor da atividade específica (U/mg) foi calculado dividindo o valor da atividade total (U) pela quantidade de enzima usada na reação.

RESULTADOS: A DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA TEM CINÉTICA ENZIMÁTICA SUPERIOR COMPARADA À DNase I HUMANA EXPRESSA POR CÉLULA DE MAMÍFERO

[00326] Figura 10A mostra lotes cinéticos de inibição de substrato representativo da DNase I rh expressa pela planta e Pulmozyme®. Velocidade inicial versus lotes de concentração de substrato rendeu uma curva que é típica para um padrão de inibição de substrato (vide Tabela VI) para ambas as enzimas. Os valores de KM, e Vmax foram calculados a partir de equação assíntota plotada em uma região de baixas concentrações de substrato (2-15 □M) em lotes recíprocos duplos (Figura 10B). Os valores de kcat da DNase I phr e Pulmozyme® foram calculados dividindo V. com concentração da enzima (Tabela VI), ainda indicando que a cinética enzimática de DNase I prh e Pulmozyme® exibe características do modelo cinético de inibição do substrato.

[00327] Entretanto, está evidente que embora ambas as enzimas compreendam a mesma sequência de aminoácido de DNase I, DNase I prh exibe propriedades cinéticas melhoradas (maior afinidade do substrato e maior velocidade da enzima) comparadas a Pulmozyme®. Sem desejar aderir a uma hipótese única, isso pode ser devido às modificações pós-translacionais únicas da DNase I rh expressa pela planta gerada como um resultado de expressão da estrutura de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção em planta, em vez de sistemas de expressão de mamífero. Três lotes de DNase extraída das células cultivadas foram analisados e mostraram características similares. Outra análise dos lotes de DNase extraída das células amostradas de diferentes linhagens de células BY2 transformadas em diferentes momentos confirmaram a reprodutibilidade, características cinéticas favoráveis da DNase rh expressa pela planta conforme comparado a Pulmozyme®. TABELA VI PARÂMETROS CINÉTICOS DE DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA VS. Pulmozyme® TABELA VIa PARÂMETROS CINÉTICOS DE 3 LOTES DE DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA

ATIVIDADE ESPECÍFICA DA DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA

[00328] Valores de atividade específica de DNase I rh expressa pela planta e DNase I expressa por célula de mamífero (Pulmozyme®) são apresentados na Tabela VII. Significativamente, a atividade específica da DNase I rh expressa pela planta, conforme ensaiado com a sonda de oligonucleotídeo extinto por fluorescência DNaseAlertTM é cerca de 3 vezes maior que aquela de Pulmozyme®. Essa diferença na DNase I rh expressa pela planta e atividade específica de Pulmozyme® reflete nas propriedades cinéticas melhoradas da DNase I rh expressa pela planta comparado a Pulmozyme® (vide Figuras 10A e 10B e Tabela VI acima). TABELA VII ATIVIDADE ESPECÍFICA DE DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA VS. Pulmozyme Assim, DNase I prh expressa pela planta é catalítica e totalmente ativa, para substratos de DNase I convencional, exibe cinética enzimática significativamente superior, e possui uma atividade específica mais elevada, consistente com a cinética enzimática melhorada, quando comparada àquela da DNase I expressa por célula de mamífero recombinante de padrão clínico, comercialmente disponível.

EXEMPLO 4- RESISTÊNCIA SUPERIOR DE DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA PARA INIBIÇÃO DE ACTINA

[00329] Análise da composição de muco de FC revela grandes quantidades (3 a 14 mg/ml) de DNA e actina (0,06 a 5 mg/ml) liberadas por necrose dos neutrófilos após seu recrutamento dentro das vias aéreas durante a resposta à infecção. Além da hidrólise do ácido desoxinucleico, DNase I pode polimerizar actina filamentosa (F-actina). A actina globular monomérica (G-actina) é um potente inibidor (Ki 1 nM) de atividade enzimática de DNase I, influenciando potencialmente a eficácia da DNase I inalada em pulmões com FC.

[00330] Para avaliar o efeito inibitório da G-actina na atividade de DNase I, um ensaio de ICH (metade da concentração máxima inibitória) foi desenvolvido, aplicando ensaio de atividade enzimática de Verde de Metila na presença de concentrações elevadas de actina não muscular humana (Cytoskeleton; cat No. APHL99).

[00331] Cem microlitros de mistura de actina/DNase-I foram divididos em duplicado em uma placa de 96 poços (NUNC cat No. 442404) contendo 100 ul de substrato de verde de metila de DNA. A actina não muscular humana (Cytoskeleton; cat No. APHL99) foi diluída em tampão de atividade (HEPES-NaOH a 25mM, CaC12 a 4mM, MgC12 a 4mM, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20, pH 7,5) contendo ATP a 0,1mM (Sigma cat No. A26209) para alcançar concentrações variando de 100 a 0,1 ug/mL, em diluições em série de 2 vezes. DNase I prh e Pulmozyme® (controle) foram diluídos para alcançar a concentração de 100 ng/mL. Cada conteúdo da placa foi então misturado completamente, as placas foram lidas a 620 nm, vedadas e incubadas por 4 h a 37 °C e lidas novamente (620nm). A mudança da absorvência foi plotada versus concentrações de actina e parâmetros de IC50 foram calculados pelo ajuste não linear utilizando o software GraFit (Erithacus Software, UK).

RESULTADOS: DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA EXIBE RESISTÊNCIA MELHORADA À INIBIÇÃO DE ACTINA

[00332] A Figura 11, mostra lotes que descrevem a DNase I rh expressa pela planta e atividade catalítica de Pulmozyme® (expressa como 60D620m) na presença de concentrações crescentes de G-actina humana. O lote da mudança em absorvência versus concentração de actina rende curvas hiperbólicas que permitem a extração de IC50 (Tabela VIII, abaixo). Embora ambas as enzimas tenham a mesma sequência de aminoácido, a DNase I rh expressa pela planta exibe maior resistência à inibição pela actina humana do que aquela da DNase comercial, expressa pela célula de mamífero (Pulmozyme®). Três lotes da DNase extraída das células cultivadas foram analisados e mostraram características similares. Ainda, além disso, comparação da resistência/susceptibilidade para inibição da actina da rhDNase I expressa pela planta amostrada de diferentes linhagens de células transformadas de BY2 que expressam a enzima recombinante (vide Tabela VIIIa abaixo) confirmou a resistência melhorada reproduzível para inibição da actina. Sem desejar ser limitado a uma hipótese única, uma explicação para essas resistências melhoradas para inibição de actina poderia ser o resultado da afinidade melhorada da enzima expressa pela planta para seu substrato de DNA, conforme comparado àquele da enzima expressa de mamífero, ou afinidade real reduzida da DNase I prh para monômeros de actina, ou ambos. TABELA VIII ICH DE DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA VS. Pulmozyme® Tabela VIIIa ICH DE DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA VS. Pulmozyme®

EXEMPLO 5- EFEITO DE DNase I rh NAS PROPRIEDADES REOLÓGICAS DO MUCO

[00333] Muco é definido como o gel heterogêneo, adesivo, viscoelástico produzido células caliciformes e glândulas submucosais. No nível químico, o muco é uma estrutura integrada de biopolímeros. Seu comportamento físico é complexo (não Newtoniano), com propriedades altamente variáveis que estão entre áqueas de um líquido viscoso e um sólido elástico. A caracterização das propriedades físicas do muco foca amplamente em duas propriedades: (i) módulo viscoso, também denominado módulo de perda (G”, expresso em segundos Pascais Pa.$), que é a extensão do qual o gel resiste à tendência de fluir, e (ii) módulo elástico, também denominado módulo de armazenamento (G', expresso em segundos Pascais Pa.$), que expressa a tendência do gel em recuperar seu formato original seguindo deformação induzida por estresse. Juntas, essas propriedades descrevem a reologia de fluidos biológicos complexos. O ângulo de fase ou perda de valor tangente 5, calculado da tangente inversa de G”/ G' (tan 5 = G”/ G') também é um parâmetro comum do muco de caracterização, refletindo a natureza elástica ou viscosa total da amostra e utilizada para quantificar a extensão do comportamento elástico do material. Um ângulo de fase fechado a zero indica comportamento fortemente elástico, como em oposição a 90°, que indica comportamento puramente viscoso. Um ângulo de fase de 45° é considerado o valor “cruzado” entre G” e G'.

[00334] Coleção de muco de FC, armazenamento e tratamento da amostra As amostras de muco de FC foram coletadas dos pacientes com grave doença pulmonar atendendo os Centros de Fibrose Cística. O muco foi diretamente expectorado em um recipiente hermeticamente vedado estéril e transportado no gelo para laboratórios equipados para caracterização reológica. A saliva foi removida e cada amostra de muco foi higienizada levemente e dividida em 200-300 mg de alíquotas e armazenada a -70 °C até ser analisada. As amostras congeladas foram descongeladas à temperatura ambiente antes da análise, já que o congelamento das amostras de muco seguido por uma etapa simples de descongelamento mostrou proporcionar análise precisa e reprodutível da reologia do muco, similar àquelas da amostra fresca antes do congelamento.

[00335] A fim de garantir que o muco seja livre de atividade exógena de DNase I (por exemplo Pulmozyme®), amostras de muco foram coletadas 12 a 24 horas após o tratamento com Pulmozyme® aerossol, conforme foi relatado que a DNase I inalada em aerossol é limpa a partir do muco dos pacientes mais breve de duas horas.

PROJETO DO ESTUDO

[00336] Cada alíquota do muco foi incubada por 30 min a 37°C com tampão da formulação de DNase I (CaC12 a 1mM, NaC1 a 150mM, pH 6,16,5) contendo DNase I prh ou Pulmozyme® (concentração final 0,2, 2, 5, 10 e 20 ug/g de muco). As amostras de controle foram tratadas com tampão de formulação de DNase I apenas.

[00337] Quatro por cento (vol/p) de fármaco ou controle foram adicionados à amostra de muco.

[00338] Seguindo a incubação, propriedades reológicas das amostras de muco foram imediatamente medidas.

ENSAIO DE REOLOGIA DO MUCO

[00339] As propriedades reológicas das amostras de muco foram determinadas utilizando um reômetro de estresse controlado (HAAKE RheoStress 1, Thermo Fisher Scientific GmbH, Karlsruhe, Alemanha). As medições foram conduzidas a 20 °C utilizando duas técnicas: um tempo de varrimento (Figuras 12A-12D e 13A-13D) e um varrimento de estresse (Figuras 18A-18D e 19A-19D).

[00340] As medições de varrimento de tempo foram realizadas utilizando uma configuração de placa de cone de 35 mm. O ângulo entre o cone e a placa foi de 0,5° e o volume da amostra requerido foi de 150 ul. A tensão oscilatória não destrutiva foi aplicada à amostra e os módulos elástico (G') e viscoso (G”) foram gravados versus tempo. Para evitar a interrupção da rede do biopolímero fraco no muco devido às forças de oscilação, as medições foram realizadas na região viscoelástica linear em uma frequência constante de 1 Hz com uma tensão de 0,10 Pascals (Pa).

[00341] As medições de varrimento de tensão foram realizadas utilizando 20 mm de geometria de placa paralela aerada. As amostras de muco (200 ul) foram carregadas no reômetro com uma largura de lacuna de 0,5 mm. Um varrimento de tensão foi realizado de 0,1 a 100 Pa em uma frequência constante de 1 Hz e o módulo elástico, (G'), módulo viscoso (G”) e ângulo de fase (5) foram medidos. A tensão aplicada em que o cruzamento de G' e G” (ou ângulo de fase alcança 45°) é a tensão em que a amostra começa a agir mais tipo líquida do que tipo sólida. Nesse ponto, os valores de tensão foram gravados e comparados entre DNase I tratada e amostras não tratadas.

[00342] Os parâmetros reológicos foram determinados utilizando RheoWin 4 (HAAKE, Thermo Fisher Scientific GmbH, Karlsruhe, Alemanha). Antes das medições, as amostras de muco foram carregadas na placa de reômetro e equilibradas por 30 segundos para permitir relaxamento da estrutura em gel original. A fim de retardar a desidratação do muco, uma armadilha de solvente foi utilizada. Experimentos foram realizados em pelo menos duas frações de muco tomadas de cada amostra de muco e os dados foram medidos.

MEDIÇÕES DO CONTEÚDO DE DNA NO MUCO

[00343] O conteúdo de DNA no muco foi determinado pelo ensaio de ácido aminobenzoico modificado (DABA). O DNA de esperma do salmão (Sigma #D1626, -2mg/mL) e amostras de muco (-100mg) foram diluídas 10 vezes em um tampão de diluição (HEPES-NaOH a 25mM, CaC12 a 4mM, MgC12 a 4mM, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20, pH 7.5) e incubadas a 60°C por 1 hora. As amostras foram repetidamente submetidas a vórtex para permitir a desintegração do muco. A concentração de DNA da amostra de esperma de salmão diluída foi então medida (NanoDrop 2000, Thermo Fisher Scientific) e a curva padrão foi preparada pela diluição da amostra de esperma de salmão no tampão de diluição em concentrações variando de 3.13 a 200 pg/ml em diluições em série por 2 vezes. Similarmente, as amostras de muco foram também diluídas em diluição em série por 2 vezes até 1280 vezes. Em seguida, cinquenta microlitros de padrões e amostras foram adicionados a uma placa preta de 96 poços (Greiner cat No. 655900) e incubadas com 50 pL de 20% de ácido 3,5-diaminobenzoico (TCI Europe cat No. D0079) a 60°C por 1 hora. Cinquenta (50) ul de HC1 a 5N foram então adicionados para interromper a reação e fluorescência foi medida por fluorômetro (390 nm de excitação /530 nm de emissão). As unidades de fluorescência foram plotadas versus concentrações padrão de DNA e os dados foram ajustados para um modelo logístico de 4 parâmetros pelo método de regressão não linear de Marquardt. A concentração de DNA no muco foi então intercalada.

CLORETO DE MAGNÉSIO E EFEITO DE DNase I rh NAS PROPRIEDADES REOLÓGICAS DO MUCO

[00344] Íon de magnésio é um cofator de DNase I, promovendo, por isso, a hidrólise de DNA. Os estudos sugerem que a concentração de magnésio crescente na superfície líquida das vias aéreas por aerolização das soluções de magnésio ou suplementos orais de magnésio poderiam melhorar a remoção de muco altamente viscos em doença pulmonar crônica melhorando a atividade de DNase. Além disso, foi sugerido que o magnésio aciona indiretamente a atividade de rhDNase I em muco de FC promovendo polimerização de G-actina em F-actina, por isso, reduzindo a inibição de DNase-I por G-actina. Consequentemente, o suplemento de magnésio pode superar baixa resposta ao tratamento de rhDNase em pacientes de FC não respondestes que exibem os baixos níveis de magnésio em seu muco.

SULFATO DE MAGNÉSIO E EFEITO DE DNase I rh NA ATIVIDADE CATALÍTICA DE DNase I rh

[00345] Diversos ensaios conduzidos com sulfato de magnésio inalado em pacientes com asma aguda mostraram que inalação com sulfato de magnésio é tolerável. Os íons de magnésio, requeridos para atividade de DNase I, podem, portanto, ser suplementados para a formulação de DNase I rh como sulfato de magnésio. Para verificar que o sulfato de magnésio não produz um efeito inibitório na atividade de DNase I Rh, um ensaio de atividade de verde de metila foi aplicado na presença de concentrações elevadas de sulfato de magnésio e comparado ao efeito de cloreto de magnésio.

[00346] Cem microlitros de DNase I rh expressa pela planta foram divididos em duplicado em uma placa de 96 poços (NUNC cat No. 442404) contendo 100 ul de substrato de verde de metila de DNA para alcançar a concentração de 100 ng/mL. A reação foi preparada em um tampão de atividade modificada (HEPES-NaOH a 25mM, CaC12 a 4mM, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20, pH 7,5) contendo concentração elevada de sulfato de magnésio ou cloreto de magnésio (0.5-100mM). Os conteúdos da placa foram então misturados completamente, e as placas foram lidas a 620nm, vedadas e incubadas por 3 h a 37°C relidas (620nm). Mudança na absorvência foi plotada versus concentrações de sulfato de magnésio ou cloreto de magnésio adicionadas.

RESULTADOS: DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA É ALTAMENTE EFICA NA REDUÇÃO DAS PROPRIEDADES REOLÓGICAS DO MUCO DE PACIENTES COM FC.

[00347] As propriedades reológicas das amostras do muco foram medidas seguindo incubação de muco de FC com tampão de formulação de DNase I ou diferentes concentrações de DNase I rh expressa pela planta e Pulmozyme®, diluídas em tampão de formulação de DNase I (concentração final 0,2, 2, 5, 10 and 20 ug/g de muco) (vide Figuras 12A- 12D; 13A- 13D; 18A-18D e 19A-19D). As concentrações de DNase I correspondem às concentrações detectadas 15 min após aerolização da dose terapêutica recomendada de Pulmozyme® (valor médio de 2,9 pg/ml de muco).

[00348] A medição do varrimento de tempo (Figuras 12A-12D e 13A- 13D) claramente revelou que a incubação com a DNase I rh expressa pela planta significativamente reduziu o módulo elástico do muco (Figura 12A- 12D) e o módulo viscoso (Figura 13A-13D), em uma maneira dependente da concentração, e com uma eficácia consistentemente maior (por ug DNase I; Figura 12A) do que o Pulmozyme® clinicamente aprovado expresso por célula de mamífero. Expressão ainda maior das propriedades reológicas melhoradas do escarro tratado com DNase I prh foi observada quando a redução do módulo viscoso e elástico seguindo incubação com DNase I prh foi expressa como mudança de porcentagem comparada com o controle não tratado (vide Figures 14A e 14B). Além disso, as medições de varrimento de tensão (vide Figuras 18A-18D e 19A-19D) revela que a DNase I rh expressa pela planta interrompe a estrutura elástica do escarro (a rede interna do escarro) em uma maneira dose-dependente e com maior eficácia que o Pulmozyme® clinicamente aprovado expresso por célula de mamífero. A eficácia melhorada da DNase I prh é consistente com a cinética enzimática melhorada e a atividade específica mais elevada da DNase I prh, comparado a Pulmozyme® (vide Exemplos 2 e 3 acima).

REDUÇÃO SINÉRGICA DE PROPRIEDADES REOLÓGICAS DE MUCO DE FC COM DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA E MAGNÉSIO

[00349] As medições de varrimento de tempo avaliando as propriedades reológicas de muco de FC foram realizadas seguindo incubação das amostras de muco com DNase I rh expressa pela planta proteína, diluída em tampão de formulação de DNase I (concentração final de 2 ug/g de muco), ou tampão de formulação de DNase I (controle), na presença ou ausência de 25, 50 e 100 mM de cloreto de magnésio, preparado no tampão de formulação de DNase I. As figuras 15 e 16 indicam claramente que a incubação do muco com 25 a 100 mM de cloreto de magnésio (barras cinzas), ou prhDNase sozinho (“0” MgC12 nas Figuras 15 e 16) resulta na redução em ambos os módulos elástico (Figura 15) e viscoso (Figura 16) do muco. Quando o muco é incubado com cloreto de magnésio e DNase I rh expressa pela planta, (barras tracejadas, 25 a 100 mM de MgC12), uma redução sinérgica significativa pode ser observada seguindo um limiar de Mg adicionado (nesse experimento de 100 mM de Mg) em ambas as propriedades reológicas ensaiadas [módulo elástico (Figura 15) e viscoso (Figura 16) do muco].

[00350] As medições de varrimento da tensão foram realizadas seguindo incubação das amostras de muco com proteína de DNase I rh expressa pela planta, diluída no tampão de formulação de DNase I, ou tampão de formulação de DNase I (controle), na presença ou ausência de 100 mM de sulfato de magnésio, preparado no tampão de formulação de DNase I (vide figuras 20A-20C). Tomados juntos, esses resultados demonstram que a incubação de muco de FC com sulfato de magnésio (Figura 20A-20C, barras cinzas) e prhDNase (Figura 20A-20C, barras escuras) resulta em uma interrupção sinergicamente maior e mais significativa na estrutura elástica do muco do que a incubação com prhDNase ou sulfato de magnésio sozinho. Isso está particularmente evidente em amostra A de paciente, figura 20A, onde a redução nos valores de varrimento de tensão para amostra de muco por prhDNase foi detectada primariamente quando o sulfato de magnésio é adicionado.

SAIS DE MAGNÉSIO NÃO INIBEM A ATIVIDADE DE DNase I rh EXPRESSA PELA PLANTA

[00351] Quando a atividade catalítica de DNase I rh expressa pela planta foi ensaiada na presença de diferentes concentrações de sulfato de magnésio e cloreto de magnésio, uma melhora dependente de dose da atividade hidrolítica de DNA foi observada com concentrações entre 0,5 a 10 mM de magnésio, sem diferença entre a atividade na presença de sal de cloreto (MgC12) ou sal de sulfato (MgSO4) (Figura 16). A atividade hidrolítica de DNA da DNase I rh expressa pela planta permaneceu ideal com sulfato de magnésio e cloreto de magnésio em concentração de 10 a 50 mM, com apenas uma leve depressão da atividade com sulfato de magnésio, comparado ao cloreto de magnésio, a 100 mM. Assim, nem o sal de cloreto (MgC12) nem o sal de sulfato (MgSO4) significativamente prejudica a atividade hidrolítica de DNA da DNase I rh expressa pela planta sobre uma ampla faixa de concentrações.

[00352] Tomados juntos, esses resultados mostram que incubação com DNase I rh expressa pela planta melhora as propriedades reológicas de muco de FC. A redução dependente de dose nas propriedades reológicas do muco alcançadas com DNase I prh é mais dramática do que aquela observada com DNase I expressa pela célula de mamífero (Pulmozyme0). Além disso, foi observado que adição de cloreto de magnésio pode melhorar o efeito de DNase I rh expressa pela planta nas propriedades reológicas do muco, e que a atividade hidrolítica do DNA da DNase I rh expressa pela planta é melhorada pelo cloreto de magnésio e sulfato de magnésio sobre uma ampla faixa de concentrações. Assim, sulfato de magnésio pode ser suplementado para DNase I prh para melhorar a atividade mucolítica de DNase I prh in-vivo.

[00353] Embora o presente pedido de patente de invenção tenha sido descrito em conjunto com aplicações específicas das mesmas, está evidente que muitas alternativas, modificações e variações estarão aparentes para os técnicos no assunto. Consequentemente, pretende-se incluir todas essas alternativas, modificações e variações abrangidas no espírito e amplo escopo das reivindicações anexas.

[00354] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesse relatório descritivo são incorporados aqui em sua totalidade por referência no relatório descritivo, na mesma medida como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado aqui por referência. Além disso, citação ou identificação de qualquer referência nesse pedido de patente não deve ser interpretada como uma admissão de modo que tal referência esteja disponível como técnica anterior para o presente pedido de patente de invenção. Na medida em que os cabeçalhos da seção são utilizados, eles não devem ser interpretados como necessariamente limitastes.

Claims (13)

1. Proteína DNase I humana isolada expressa em planta caracterizada pelo fato de compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 e um resíduo de glicina N-terminal na posição 1 da referida proteína DNase I humana.

2. Polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína DNase I humana ligada no N-terminal a um peptídeo de sinal de direcionamento do retículo endoplasmático de Arabidopsis ABPI, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12 ou sua sequência degenerada.

3. Construto de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo isolado como definido na reivindicação 2 e uma promotor que é expressa em planta.

4. Método de produção de uma proteína DNase I humana recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma célula de planta compreendendo um construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 3; e cultivar a referida célula em uma suspensão de modo a produzir a referida proteína DNase I humana recombinante e, opcionalmente, compreender ainda o isolamento da referida proteína DNase I humana recombinante da referida célula.

5. Proteína DNase I humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que possui uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5.

6. Proteína DNase I humana, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que possui pelo menos um núcleo xilose e pelo menos um núcleo α-(1,3) fucose.

7. Proteína DNase humana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 5 e 6, caracterizada pelo fato de possuir suscetibilidade reduzida à inibição da atividade da endonuclease por actina em comparação com a DNase I recombinante humana expressa em células de mamífero ou com constante de Michaelis (Km) mais baixa e maior velocidade de reação (Vmax) para atividade de endonuclease em comparação com a de DNase I recombinante humana expressa em células de mamífero.

8. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende, como ingrediente ativo, a proteína DNase I humana isolada de qualquer uma das reivindicações 1 e 5 a 7 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica inalável.

10. Composição farmacêutica inalável, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida proteína DNase I humana é formulada em lipossomas

11. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizada pelo fato de que a referida proteína DNase I humana isolada é pelo menos 90-95% de proteína DNase I humana pura ou em que a composição farmacêutica compreende ainda a proteína da enzima beta-acetilhexosaminidase vegetal.

12. Proteína DNase I humana isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 5 a 7, caracterizado pelo fato de ser para uso na redução do módulo viscoso do escarro e, opcionalmente, para uso na redução do módulo elástico do escarro.

13. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença ou condição relacionada à DNase-I em um sujeito que dela necessite.