CN101855232A - 植物培养物中高甘露糖蛋白的生产 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于在植物培养物中产生糖基化蛋白、特别是具有高甘露糖糖基化的蛋白质,同时使这类蛋白质靶向ER信号和/或绕过高尔基体的装置、系统和方法。本发明另涉及使用转基因植物根,特别是胡萝卜细胞表达和产生有酶促活性的高甘露糖溶酶体酶的载体和方法。更具体的讲,本发明涉及宿主细胞,特别是转基因的悬浮胡萝卜细胞,用于高产量地表达和产生有生物活性的高甘露糖葡糖脑苷脂酶(GCD)的载体和方法。本发明进一步提供用于治疗溶酶体贮积病的组合物和方法。
Description
发明领域
本发明涉及用于产生高甘露糖蛋白的转化宿主细胞,以及用于产生这些蛋白质,特别是在植物培养物中产生这些蛋白质的方法和系统。
发明背景
戈谢病(Gaucher’s disease)是最流行的溶酶体贮积病。它是由导致葡糖脑苷脂酶(亦称葡糖神经酰胺酶)缺乏的隐性遗传疾病(染色体1q21-q31)引起的,该酶是膜结合溶酶体酶,催化鞘糖脂葡糖脑苷脂(葡糖神经酰胺,GlcCer)水解成葡萄糖和神经酰胺。戈谢病由hGCD(人葡糖脑苷脂酶)基因(GBA)的点突变引起,它导致GlcCer在巨噬细胞的溶酶体中积累。这种特有的贮藏细胞(称为戈谢细胞)存在于肝、脾和骨髓中。有关临床症状包括严重的肝脾大、贫血、血小板减少和骨骼退变。
1985年首次对人GCD的编码基因进行了测序(6)。该蛋白质由得自536聚体肽原(pro-peptide)的497个氨基酸组成。成熟hGCD含有5个N-糖基化氨基酸共有序列(Asn-X-Ser/Thr)。这些位点中的4个通常被糖基化。第一位点的糖基化是产生活性蛋白质所必需的。已经鉴定出高甘露糖和复合寡糖链(7)。得自胎盘的hGCD含有7%的糖类,其中20%为高甘露糖型(8)。生化诱变和定点诱变研究提供了对折叠、激活因子相互作用和活性位点定位十分重要的初步的区域和残基图(9)。
用胎盘hGCD与神经氨酸酶(产脱唾液酸酶)治疗导致大鼠肝细胞的清除率和摄入率提高,同时肝的酶促活性增加(Furbish等,1981,Biochim.Biophys.Acta 673:425-434)。这种聚糖修饰的胎盘hGC目前被用作治疗戈谢病的治疗药。生化诱变和定点诱变研究提供了对折叠、激活因子相互作用和活性位点定位十分重要的初步的区域和残基图[Grace等,J.Biol.Chem.269:2283-2291(1994)]。
有三种不同类型的戈谢病,各取决于hGC的活性水平。受该病所累的主要细胞是巨噬细胞,由于GlcCer积累使之变得很大,因此亦称“戈谢细胞”。
把鉴定出GCD缺陷作为戈谢病的主要病因导致了将酶置换疗法发展成为该病的治疗策略。
另一种已充分表征的溶酶体贮积病是法布莱病(Fabry disease)。法布莱病是X连锁溶酶体贮积病,是由溶酶体酶α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)活性缺乏引起的。患典型法布莱病的患者的α-Gal A活性通常低于1%,常常显示全部症状,包括四肢剧痛(肢端感觉异常)、少汗、角膜和晶状体改变、皮肤损害(血管角化瘤)、肾衰竭、心血管疾病、肺衰竭、神经病症状和中风。在非典型的法布莱病中,带有残留酶活性的个体在生命晚期显示出症状,该症状通常限于一个或数个器官。由于随机X-染色体失活,女性携带者临床表现差异相当大。虽然携带者一般在整个生命中无症状,但是许多人表现出的临床症状与受累男性的临床症状一样多变和严重。
De Duve最早提出用外源有生物活性的酶置换缺失的溶酶体酶,可能是治疗溶酶体贮积病的可行方法[Fed Proc.23:1045(1964)]。
自此,各种研究提出酶置换疗法有利于治疗各种溶酶体贮积病。用由胎盘制备(CeredaseTM),或者最近经重组制备(CerezymeTM)的外源酶(β-葡糖脑苷脂酶)治疗的I型戈谢病个体,显示取得了重大成功。
得自天然来源的未修饰的葡糖脑苷脂酶是具有4条糖链的糖蛋白。这种蛋白质在体内不会靶向吞噬细胞,因此治疗价值有限。在开发用于戈谢病的最新疗法时,通过用三种不同的糖苷酶处理相继脱去葡糖脑苷脂酶糖链上的末端糖。这种糖苷酶处理产生了其末端糖由甘露糖残基组成的糖蛋白。因为吞噬细胞具有甘露糖受体,能识别其中寡糖链终止于甘露糖残基的糖蛋白和糖肽,所以葡糖脑苷脂酶的糖重塑提高了酶对这些细胞的靶向作用[Furbish等,Biochem.Biophys.Acta 673:425,(1981)]。
如本文所述,糖基化在hGCD活性中起至关重要的作用,因此使用衣霉素(Sf9细胞)或破坏所有糖基化位点的点突变(Sf9细胞和COS-1细胞两者)使在该细胞系中表达的hGCD去糖基化,导致酶促活性完全丧失。另外,发现在大肠杆菌(E.coli)中表达的hGCD无活性。进一步的研究表明了各个糖基化位点对于蛋白质活性的重要性。除糖基化在实际蛋白质活性中的作用外,商业化生产的酶含有促进特定药物递送的聚糖序列修饰。在提取糖基化蛋白后对其进行重塑以仅包括含有甘露糖的聚糖序列。
人GCD酶含有4个糖基化位点和22个赖氨酸。重组产生的酶(CerezymeTm)在495位上不同于胎盘的酶(CeredaseTM),此位置上精氨酸被组氨酸取代。此外,寡糖组成在重组GCD与胎盘GCD之间不同,因为前者具有较多的岩藻糖和N-乙酰基-葡糖胺残基,而后者保留一条高甘露糖链。如上所述,GCD的两种类型用三种不同的糖苷酶(神经氨酸酶、半乳糖苷酶和P-N乙酰-葡糖苷酶)处理以暴露出末端甘露糖,这使得能够靶向吞噬细胞。一种包含重组产生的酶的药物制品参见US 5,549,892。应当注意的是,所有所提及的参考文献均通过引用并入本文如同全文列于本文。
已在昆虫(sf9)细胞(参见US 7,011,831)、人成纤维细胞(参见US6,395,884)和植物细胞(参见US 6,846,968)中生成用于酶置换疗法的重组α-半乳糖苷酶A。已经对重组a-Gal A(β-半乳糖苷酶[法布瑞酶(Fabrazyme)]:Genzyme Corporation,Cambridge,Mass;α-半乳糖苷酶[Replagal]:TKT Corporation,Cambridge,Mass)进行了临床试验,两种药物都获准用于临床应用。
与现有溶酶体酶置换疗法治疗有关的一个缺点是由于例如摄取少、对特定细胞(其中底物聚集)溶酶体的靶向作用水平低以及在溶酶体中的功能性体内半寿期短,使得酶的体内生物活性不理想地偏低。
现有GCD重组酶的另一个主要缺点是其费用,这可能给卫生保健系统带来沉重的经济负担。这些重组酶的高昂成本是复杂的纯化方案和现有治疗需要相对大量的治疗药造成的。因此急需降低GCD的成本,以便能够向需要更支付得起的疗法的所有人提供这种挽救生命的疗法。
用于药物应用的蛋白质传统上在哺乳动物或细菌表达系统中产生。在过去的十多年内,已在植物中开发出一种新的表达系统。该方法利用土壤杆菌属(Agrobacterium),这是一种能够将单链DNA分子(T-DNA)插入植物基因组的细菌。由于导入用于大量生产蛋白质和肽的基因相对简单,因此该方法越来越普遍地成为替代的蛋白质表达系统(1)。
虽然细菌表达系统中不存在翻译后修饰,但是植物衍生的表达系统却有利于已知对蛋白质表达和活性至关重要的这些修饰。哺乳动物蛋白质表达系统和植物蛋白质表达系统之间的一个主要差别是由生物合成途径的不同所引起的蛋白质糖侧链的差异。研究表明糖基化对活性、折叠、稳定性、溶解度、对蛋白酶的敏感性、血液清除率和蛋白质的抗原潜力都有重要作用。因此,在植物中产生的任何蛋白质都应考虑植物糖基化的可能后果。
蛋白质糖基化被分成两类:N联修饰和O联修饰(2)。两个类型的不同在于聚糖部分所连接的氨基酸--N联是与Asn残基连接,而O联则是与Ser或Thr残基连接。另外,每个类型的聚糖序列具有独特的区别性特征。在两个类型中,N联糖基化非常丰富,其对蛋白质功能的作用已得到广泛深入的研究。另一方面,O联聚糖相对稀少,可获取的有关它对蛋白质作用的信息较少。
发明概述
背景技术没有教导或提出用于在植物培养物中生产糖基化蛋白的装置、系统或方法。背景技术也没有教导或提出用于在植物培养物中产生高甘露糖蛋白的这类装置、系统或方法。背景技术也没有教导或提出在植物培养物中通过内质网(ER)产生蛋白质的装置、系统或方法。背景技术也没有教导或提出在植物培养物中通过内质网(ER)同时绕过高尔基体产生蛋白质的这类装置、系统或方法。背景技术也没有教导或提出用于在植物培养物中通过利用ER信号以绕过高尔基体来产生蛋白质的这类装置、系统或方法。
本发明通过提供用于在植物培养物中产生糖基化蛋白、特别是具有高甘露糖糖基化的蛋白质的装置、系统和方法,克服了这些背景技术的缺点,同时任选和优选用ER信号靶向(和/或另外操纵这类蛋白质的加工)这类蛋白质。我们无意受一种假设的限制,但是我们认为这类寻靶使蛋白质绕过高尔基体并由此保留下所需要的糖基化,特别是高甘露糖糖基化。应当注意的是,本文所用术语“植物培养物”包括在培养物中生长的任何类型的转基因和/或其它经遗传工程改造的植物细胞。遗传工程可任选为永久或瞬时的。培养物的特征优选为不装配形成完整植株的细胞,使得至少一个植物的生物结构不存在。培养物的特征可任选和优选为多种不同类型的植物细胞,但优选培养物的特征为特定类型的植物细胞。应当注意的是,以特定类型的植物细胞为特征的植物培养物任选可最初衍生自多种不同类型的这类植物细胞。
可按照任何适当的培养方法类型使植物细胞生长,包括但不限于培养在固体表面(例如塑料培养容器或培养板)或培养悬液中。
本发明进一步涉及采用转基因植物根、特别是胡萝卜细胞用于表达和产生有酶促活性的高甘露糖溶酶体酶的载体和方法。更具体地讲,本发明涉及用于以高产量表达和产生有生物活性的高甘露糖葡糖脑苷脂酶(GCD)和α-半乳糖苷酶A的宿主细胞、特别是转基因的悬浮胡萝卜细胞、载体和方法。本发明进一步提供用于治疗溶酶体贮积病的组合物和方法。
本发明还涉及用于向缺陷型细胞提供足够量的有生物活性的溶酶体酶、特别是人GCD和α-半乳糖苷酶A的装置、系统和方法。本发明还涉及包含新的载体组成的宿主细胞,所述载体组成使得能够有效产生编码溶酶体酶(例如GCD和α-半乳糖苷酶A)的基因。
本发明因此解决了长期以来深有感受的对经济适用技术的需要,所述技术可产生具有特定糖基化要求的蛋白质,例如溶酶体酶的高甘露糖糖基化(例如GCD和α-半乳糖苷酶A)。本发明能够利用植物细胞培养物解决这个长期以来深有感受的需要。
为了进一步说明本发明,现提供对高甘露糖蛋白生物合成途径的简要说明。在所有真核生物中,高甘露糖和复合N联聚糖的基本生物合成途径是高度保守的。生物合成始于内质网(ER),其中通过寡糖基转移酶将聚糖前体从多萜醇脂质载体转移到蛋白质的特定Asn残基上。该前体随后在ER中被糖苷酶I和糖苷酶II及假定的甘露糖苷酶修饰,产生高甘露糖结构,类似于发生在哺乳动物中的过程。
聚糖序列进一步修饰成复杂结构及杂合结构发生在高尔基体中。这类修饰包括通过α-甘露糖苷酶I脱去4个甘露糖残基中的1个,加入1个N-乙酰基葡糖胺残基,通过α-甘露糖苷酶II脱去另外2个甘露糖残基,加入N-乙酰基葡糖胺,任选在这个阶段,可加入木糖和岩藻糖残基以得到植物特有的N联聚糖。在木糖和岩藻糖转移到核心(core)上之后,可通过加入末端岩藻糖和半乳糖,进一步加工成复合型N-聚糖。进一步的修饰可发生在糖蛋白转运期间。
背景技术中目前使用若干方法用于控制并调节植物蛋白质糖基化,所有这些方法都有重大缺陷,特别是与本发明比较时。总体修饰,例如完全抑制糖基化或从肽链脱去糖基化位点是一种策略。然而,这种方法可能导致结构缺陷。另一种方法包括敲除和导入特定的糖加工酶。同样,这种方法十分困难,而且还可能对植物细胞本身带来有害作用。
本发明通过利用ER信号和/或通过阻断自ER向高尔基体的分泌,克服了背景技术方法的这些不足。我们无意受一种假设的限制,因为溶酶体酶的高甘露糖结构是优选的,如果可以阻断分泌,则可将蛋白质保留在ER中,而不需要重塑便可得到天然存在的高甘露糖结构。
如上所述,经由内膜系统转运的蛋白质最先进入内质网。该步骤必需的转运信号由分子N端的信号序列表示,即所谓的信号肽。一旦该信号肽完成其功能,即将连接在自身上的前体蛋白插入内质网中,其则经蛋白水解从前体蛋白上裂解下来。由于其功能特殊,因此在所有活细胞中,不论是细菌、酵母、真菌、动物还是植物,该类型的信号肽序列在进化进程中高度保守。
通过信号肽插入内质网的许多植物蛋白质并不停留在ER中,而是由内质网转运到高尔基体中,并继续由高尔基体运输到液泡中。用于该运输停留的这类分选信号中的一类是存在于前体蛋白C端部分的信号[Neuhaus和Rogers,(1998)Plant Mol.Biol.38:127-144]。预期同时含有用于插入内质网的N端信号肽和C端液泡引导信号的蛋白质含有在高尔基体中与之连接的复合聚糖[Lerouge等,(1998)PlantMol.Biol.38:31-48]。这类C端分选信号的性质可发生非常大的变化。US 6,054,637披露了从烟草碱性几丁质酶区获得的肽片段,这是一种用作液泡引导肽的液泡蛋白。含有C端引导信号和复合聚糖的液泡蛋白的实例是菜豆种子贮存蛋白即菜豆蛋白[Frigerio等(1998)Plant Cell10:1031-1042;Frigerio等(2001)Plant Cell 13:1109-1126]。
在所有真核细胞中典型的模式是液泡蛋白穿过ER和高尔基体后,被隔离在液泡中作为其终点。预料不到的是,本发明的转化植物根细胞产生预料不到的高甘露糖GCD和α-半乳糖苷酶A。有利的是发现这种高甘露糖产物具有生物活性,因此其活化无需更多的步骤。我们无意受一种假设的限制,但似乎是使用ER信号与在植物细胞培养中产生的重组蛋白能够克服向高尔基体的转运,因此保留了所需要的高甘露糖糖基化。任选可按照本发明利用能够产生高甘露糖糖基化的任何机制类型,包括绕过高尔基体的任何机制类型。
第一方面,本发明涉及产生目标高甘露糖重组蛋白的宿主细胞。该细胞可用编码目标蛋白质的重组核酸分子或包含该核酸分子的表达载体转化或转染。这类核酸分子包含编码目标蛋白质的第一核酸序列,其与编码液泡引导信号肽的第二核酸序列可操作性连接。第一核酸序列可任选与编码ER(内质网)引导信号肽的第三核酸序列进一步可操作性连接。本发明的宿主细胞的特征是目标蛋白质由细胞以高甘露糖化的形式产生。
本发明的宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。
在一个实施方案中,本发明的宿主细胞是原核细胞,优选为细菌细胞,最优选为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞。这些细胞用来感染下述优选的植物宿主细胞。
在另一个优选的实施方案中,本发明的宿主细胞可以是真核细胞,优选为植物细胞,最优选为选自以下的植物根细胞:发根土壤杆菌(Agrobacterium rihzogenes)转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。
在一个优选的实施方案中,植物根细胞为胡萝卜细胞。应当注意的是,本发明转化的胡萝卜细胞生长在悬液中。如上文和实施例中所述,这些细胞用根癌土壤杆菌细胞转化。
在另一个实施方案中,包含在本发明宿主细胞内的重组核酸分子,包含编码溶酶体酶的第一核酸序列,其与编码液泡引导信号肽的第二核酸序列可操作性连接,所述第二核酸序列得自碱性烟草几丁质酶A基因。该液泡信号肽具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。第一核酸序列可任选与编码由SEQ ID NO:1表示的ER(内质网)引导信号肽的第三核酸序列进一步可操作性连接。在一个实施方案中,包含在本发明宿主细胞内的重组核酸分子另包含在植物细胞中起作用的启动子。该启动子应与本发明的重组分子可操作性连接。
在另一个实施方案中,该重组核酸分子还任选另包含在植物细胞中优选起作用的可操作性连接的终止子。本发明的重组核酸分子还任选另包含另外的调控元件、启动元件和调节元件和/或选择标记。应当注意的是,这些调节元件与重组分子可操作性连接。
在一个优选的实施方案中,由本发明的宿主细胞产生的目标高甘露糖蛋白可以是具有暴露出来的甘露糖末端残基的高甘露糖糖蛋白。
根据另一个优选的实施方案,这类高甘露糖蛋白可以是选自以下的溶酶体酶:葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(α-N-acetylgalactosaminidise)、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。在一个优选的实施方案中,溶酶体酶可以是人葡糖脑苷脂酶(GCD)或α-半乳糖苷酶A。在下文中,重组GCD、rGCD、rhGCD均是指重组人GCD的各种形式,除非另有说明。因此A-gal、A-gal A、重组A-gal、rA-gal、rhA-gal均是指重组人α-半乳糖苷酶A的各种形式[Genbank保藏号NM000169(编码序列)和CAA29232(氨基酸序列)],除非另有说明。
如前所述,戈谢病这种最流行的溶酶体贮积病是由hGCD(人葡糖脑苷脂酶)基因(GBA)的点突变引起的,它导致GlcCer在巨噬细胞溶酶体中积累。把鉴定出GCD缺陷作为戈谢病的主要病因导致了将酶置换疗法发展成为该病的治疗策略。然而,糖基化在hGCD活性和靶细胞摄取中起至关重要的作用。
因此,根据本发明其它优选的实施方案,优选通过在植物细胞培养物中控制hGCD或hα-半乳糖苷酶A的表达,任选和更优选通过提供ER信号和/或另外任选和更优选通过阻断向高尔基体转运,来提供适当糖基化的hGCD或α-半乳糖苷酶A。
任选和优选hGCD或α-半乳糖苷酶A具有至少一条包含暴露出来的甘露糖残基的寡糖链用于预防或治疗戈谢病。
再者,在一个具体实施方案中,该优选的宿主细胞用重组核酸分子转化或转染,所述重组核酸分子另包含得自花椰菜花叶病毒的35S启动子、得自根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶终止子和TMV(烟草花叶病毒)Ω翻译增强子元件。根据优选的实施方案,该重组核酸分子包含基本上由SEQ ID NO:13表示的核酸序列,编码具有基本上由SEQ IDNO:14或15表示的氨基酸序列的高甘露糖GCD。
应当了解的是,本发明进一步提供表达载体,该载体包含编码有生物活性的溶酶体酶的核酸分子。
在一个优选的实施方案中,本发明的表达载体包含编码有生物活性的高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)或α-半乳糖苷酶A的核酸分子。该优选的表达载体优选包含具有基本上由SEQ ID NO:13、17或19表示的核酸序列的重组核酸分子。
第二方面,本发明涉及由本发明的宿主细胞产生的重组高甘露糖蛋白。
在一个优选的实施方案中,这种高甘露糖蛋白可以是选自以下的有生物活性的高甘露糖溶酶体酶:葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最优选这种溶酶体酶可以是人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
再者,本发明提供有生物活性的重组高甘露糖溶酶体酶,该酶具有至少一条包含暴露出来的甘露糖残基的寡糖链。
根据优选的实施方案,本发明的重组溶酶体酶可在靶部位上与靶细胞的甘露糖受体结合。优选这个部位可在患有溶酶体贮积病的受治疗者的体内。
应当注意的是,与天然存在的靶细胞溶酶体酶相应的亲和力相比,重组溶酶体酶对靶细胞的亲和力提高。在一个具体实施方案中,靶部位的靶细胞可以是受治疗者肝中的枯否氏细胞。
在一个优选的实施方案中,重组溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
该重组溶酶体酶最优选为葡糖脑苷脂酶(GCD)。
第三方面,本发明涉及产生高甘露糖蛋白的方法。因此,本发明的方法包括以下步骤:(a)制备重组宿主细胞培养物,所述细胞用编码目标重组蛋白的重组核酸分子或用包含该重组核酸分子的表达载体转化或转染;(b)在允许蛋白质表达的条件下,对由步骤(a)制备的这些宿主细胞培养物进行培养,其中宿主细胞以高甘露糖化的形式产生蛋白质;(c)从细胞中回收蛋白质,并由从(a)得到的培养物中收获细胞;(d)通过适当的蛋白质纯化方法对步骤(c)的蛋白质进行纯化。
根据优选的实施方案,该方法所用的宿主细胞是本发明的宿主细胞。
在另一个优选的实施方案中,由本发明方法产生的高甘露糖蛋白可以是有生物活性的高甘露糖溶酶体酶,具有至少一条包含暴露出来的甘露糖残基的寡糖链。
该重组酶可在靶部位上与靶细胞的甘露糖受体结合。更特别的是,与天然存在的靶细胞溶酶体酶相应的亲和力相比,通过本发明方法产生的重组酶对靶细胞的亲和力提高。因此,靶部位的靶细胞可以是受治疗者肝中的枯否氏细胞。
在一个具体实施方案中,这种溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最优选这种溶酶体酶可以是葡糖脑苷脂酶(GCD)或α-半乳糖苷酶A。
在另一个优选的实施方案中,本发明方法所采用的宿主细胞可以是选自以下的植物根细胞:发根土壤杆菌转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。植物根细胞最优选为胡萝卜细胞。应当特别注意的是在本发明的方法中,转化的宿主胡萝卜细胞生长在悬液中。
又一方面,本发明涉及使用外源重组溶酶体酶治疗患有溶酶体贮积病的受治疗者的方法,该方法包括:(a)提供重组生物活性形式的溶酶体酶,该溶酶体酶由转化的植物根细胞纯化,能够有效靶向异常缺乏溶酶体酶的细胞。该有生物活性的重组酶在其附带的寡糖上具有暴露出来的末端甘露糖残基;(b)给予受治疗者有效量的有生物活性的重组溶酶体酶。在一个优选的实施方案中,本发明方法所采用的重组高甘露糖溶酶体酶可由本发明的宿主细胞产生。宿主细胞优选为胡萝卜细胞。
在另一个优选的实施方案中,本发明方法所采用的溶酶体酶可为高甘露糖酶,该高甘露糖酶包含至少一条具有暴露出来的甘露糖残基的寡糖链。该重组酶可有在受治疗者体内的靶部位与靶细胞的甘露糖受体结合。与天然存在的靶细胞溶酶体酶相应的亲和力相比,更优选该重组溶酶体酶对这些靶细胞的亲和力提高。
更准确地讲,本发明方法所采用的溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。这种溶酶体酶优选为葡糖脑苷脂酶(GCD)。
根据优选的实施方案,本发明的方法因此可用于治疗溶酶体贮积病,特别是戈谢病。
在这种情况下,靶部位的靶细胞可以是受治疗者肝中的枯否氏细胞。
本发明进一步提供用于治疗溶酶体贮积病的药物组合物,该药物组合物包含本发明限定的活性成分即有生物活性的重组高甘露糖溶酶体酶。本发明的组合物还任选另包含药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
在一个具体实施方案中,本发明的组合物意在用来治疗戈谢病。这类组合物可优选包含本发明限定的有效成分即有生物活性的高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
本发明进一步涉及本发明有生物活性的重组高甘露糖溶酶体酶在制备用于预防或治疗溶酶体贮积病的药物中的用途。更特别的是,这类疾病可为戈谢病。
因此,这种有生物活性的溶酶体酶是本发明限定的有生物活性的高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
根据本发明,提供产生高甘露糖重组蛋白宿主细胞,该细胞包含编码重组蛋白的多核苷酸和用来产生重组蛋白(为高甘露糖蛋白)的信号。多核苷酸优选包含编码目标蛋白质的第一核酸序列,其与编码信号肽的第二核酸序列可操作性连接。信号肽任选包含ER(内质网)引导信号肽。优选多核苷酸另包含编码液泡引导信号肽的第三核酸序列。
优选该信号使重组蛋白靶向ER。更优选该信号包含用于使重组蛋白靶向ER的信号肽。最优选多核苷酸包含用于编码信号肽的核酸区段。
任选和优选该信号使重组蛋白绕过高尔基体。优选该信号包含用于使重组蛋白不靶向高尔基体的信号肽。更优选多核苷酸包含用于编码信号肽的核酸区段。
任选和优选宿主细胞为真核细胞和原核细胞中的任一种。原核细胞任选为细菌细胞,优选为根癌土壤杆菌细胞。优选真核细胞为植物细胞。更优选植物细胞为选自以下的植物根细胞:发根土壤杆菌转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。植物根细胞最优选为胡萝卜细胞。
优选重组多核苷酸包含编码目标蛋白质的第一核酸序列,其与编码液泡引导信号肽的第二核酸序列可操作性连接,所述第二核酸序列衍生自碱性烟草几丁质酶A基因,所述液泡信号肽具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列,其中第一核酸序列任选与编码由SEQ ID NO:1表示的ER(内质网)引导信号肽的第三核酸序列进一步可操作性连接。
更优选重组多核苷酸另包含在植物细胞中起作用的启动子,其中该启动子与重组分子可操作性连接。
最优选重组多核苷酸另包含在植物细胞中起作用的终止子,其中该终止子与重组分子可操作性连接。
同样最优选重组多核苷酸任选另包含另外的调控元件、启动元件和调节元件和/或选择标记,其中所述调节元件与重组分子可操作性连接。
优选高甘露糖蛋白是糖基化的高甘露糖糖蛋白,具有至少一个暴露出来的甘露糖残基。更优选高甘露糖蛋白是选自以下的有生物活性的高甘露糖溶酶体酶:葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
最优选溶酶体酶是人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
优选GCD包含基本由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列,该氨基酸序列由SEQ ID NO:7表示的核酸序列编码。
更优选细胞用重组多核苷酸或用包含该分子的表达载体转化或转染,重组多核苷酸另包含得自花椰菜花叶病毒的35S启动子、得自根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶终止子,调节元件是TMV(烟草花叶病毒)Ω翻译增强子元件,具有基本上由SEQ ID NO:13表示的核酸序列,该核酸序列编码具有基本上由SEQ ID NO:14或15表示的氨基酸序列的GCD。
根据优选的实施方案,提供由上述宿主细胞产生的重组高甘露糖蛋白。
优选高甘露糖蛋白是选自以下的有生物活性的高甘露糖溶酶体酶:葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
更优选溶酶体酶是人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
根据本发明其它优选的实施方案,提供有生物活性的重组高甘露糖溶酶体酶,该酶具有至少一条包含暴露出来的甘露糖残基的寡糖链。
根据另外其它的优选实施方案,提供重组蛋白,该重组蛋白包含具有信号肽活性的第一部分和具有溶酶体酶活性的第二部分,第一部分引起第二部分在植物细胞内加工成具有至少一条包含暴露出来的甘露糖残基的寡糖链。
优选溶酶体酶包括用于预防或治疗戈谢病的蛋白质。
更优选该蛋白质包括hGCD。
在另一个实施方案中,溶酶体酶包括用于预防或治疗法布莱病的蛋白质。
更优选蛋白质包括α-半乳糖苷酶A。
优选第一部分包括植物细胞ER引导信号肽。更优选重组酶可在患有溶酶体贮积病的受治疗者体内靶部位上与靶细胞的甘露糖受体结合。最优选与天然存在的靶细胞溶酶体酶相应的亲和力相比,重组溶酶体酶对靶细胞的亲和力提高。靶细胞可以是具有甘露糖受体的成纤维细胞、巨噬细胞等。
同样最优选重组溶酶体酶选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
优选重组溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
同样优选靶部位的靶细胞是受治疗者肝中的枯否氏细胞。
根据另外其它的优选实施方案,提供在植物细胞培养物中产生的重组高甘露糖蛋白。优选该蛋白质的特征是使蛋白质靶向ER的植物信号肽。
更优选植物信号肽包含用于使蛋白质靶向植物根细胞培养物中的ER的肽。最优选植物根细胞培养物包含胡萝卜细胞。
根据又一些其它的优选实施方案,提供植物根细胞培养物中产生的富含甘露糖的重组hGCD或α-半乳糖苷酶A蛋白。
根据另外其它的优选实施方案,提供用于产生高甘露糖蛋白的植物细胞培养物的用途。
根据其它优选的实施方案,提供产生高甘露糖蛋白的方法,该方法包括:制备重组宿主细胞培养物,该宿主细胞用编码重组蛋白的重组多核苷酸转化或转染;在允许蛋白质表达的条件下,对宿主细胞培养物进行培养,其中宿主细胞以高甘露糖化的形式产生蛋白质。
优选宿主细胞培养物培养在悬液中。更优选该方法进一步包括对蛋白质进行纯化。
根据其它优选的实施方案,用如前所述的宿主细胞实施该方法。优选高甘露糖蛋白是有生物活性的高甘露糖溶酶体酶,该溶酶体酶具有至少一条包含暴露出来的甘露糖残基的寡糖链。更优选该重组酶在靶部位上与靶细胞的甘露糖受体结合。最优选与天然存在的靶细胞溶酶体酶相应的亲和力相比,该重组酶对靶细胞的亲和力提高。
优选溶酶体酶选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
更优选溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶(GCD)或α-半乳糖苷酶A。最优选靶部位的靶细胞是成纤维细胞或受治疗者肝中的枯否氏细胞。
优选宿主细胞是选自以下的植物根细胞:发根土壤杆菌转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。在另一个实施方案中,宿主细胞是烟草细胞。
更优选植物根细胞是胡萝卜细胞。
最优选转化的宿主胡萝卜细胞生长在悬液中。
根据另外其它的优选实施方案,提供使用外源重组溶酶体酶治疗患有溶酶体贮积病的受治疗者的方法,该方法包括:提供有生物活性形式的重组溶酶体酶,该溶酶体酶由转化的植物根细胞纯化,能够有效靶向异常缺乏溶酶体酶的细胞,其中有生物活性的重组酶在其附带的寡糖上具有暴露出来的末端甘露糖残基;给予受治疗者治疗有效量的有生物活性的重组溶酶体酶。可任选用如前所述的任何宿主细胞和/或蛋白质实施该方法。
优选重组酶可以在受治疗者体内的靶部位上与靶细胞的甘露糖受体结合。更优选与天然存在的靶细胞溶酶体酶相应的亲和力相比,重组溶酶体酶对靶细胞的亲和力提高。最优选溶酶体酶选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。同样最优选溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCD)。
同样最优选溶酶体贮积病为戈谢病。同样最优选靶部位的靶细胞是受治疗者肝中的枯否氏细胞。
在另一个实施方案中,贮积病是法布莱病,溶酶体酶是α-半乳糖苷酶A,靶细胞是成纤维细胞。
根据另外其它的优选实施方案,提供用于治疗溶酶体贮积病的药物组合物,该组合物包含作为活性成分的上述有生物活性的重组高甘露糖溶酶体酶,该组合物任选另包含药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。优选溶酶体贮积病是戈谢病。更优选重组溶酶体酶是有生物活性的高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
根据另外其它的优选实施方案,提供上述有生物活性富含甘露糖的重组溶酶体酶在制备用于预防或治疗溶酶体贮积病的药物中的用途。优选该病是戈谢病。更优选有生物活性的溶酶体酶是有生物活性的高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
在另一个实施方案中,所述疾病是法布莱病,有生物活性的溶酶体酶是α-半乳糖苷酶A。
本发明按照下列附图作进一步的描述,下图只是示例性的,并不限制同样由随附权利要求书定义的本发明的范围。
附图简述
本发明参照附图仅通过举例进行描述,其中:
图1A-1B
1A表示所得到的表达盒,该表达盒包含得自花椰菜花叶病毒的35S启动子、TMV(烟草花叶病毒)Ω翻译增强子元件、ER引导信号、人GCD序列(亦由SEQ ID NO:7表示)、液泡信号和得自根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶终止子序列。
图1B表示pGreenII质粒主链的示意图。
图2表示使用抗hGCD特异性抗体进行的hGCD转化细胞提取物的蛋白质印迹分析。标准Cerezyme(泳道1)用作阳性对照,未转化的愈伤组织用作阴性对照(泳道2),各个选出的愈伤组织提取物见泳道3-8。
图3A-3C表示在装填到XK柱(2.6x20cm)中的强阳离子交换树脂(Macro-Prep high-S support,Bio-Rad)上进行rhGCD纯化的第一步。将柱与AKTA prime系统(Amersham Pharmacia Biotech)连接供导电监测、pH和280nm下的吸光度检测之用。用含有600mM NaCl的平衡缓冲液洗脱出rh-GCD。图3A表示该纯化步骤的标准运行。在运行期间收集的流分通过酶活性测定法监测,如图3B所示,合并具有酶促活性(洗脱峰中)的各管。图3C表示活性测定用洗脱流分的考马斯蓝染色。
图3D-3F如同图3A-3C表示相应的图,但为第二柱的图。
图4A-C表示在装填到XK柱(2.6x20cm)中的疏水相互作用树脂(TSK凝胶,Toyopearl Phenyl-650C,Tosoh Corp.)上进行重组hGCD的最终纯化步骤。将该柱与AKTA prime系统(Amersham PharmaciaBiotech)连接以供导电监测、pH和280nm下的吸光度检测之用。由之前各柱合并的GCD洗脱液以6ml/分钟加载,接着用平衡缓冲液洗涤直到UV吸光度达到基线为止。纯的GCD用含有50%乙醇的10mM柠檬酸缓冲液洗脱。
图4A表示该纯化步骤的标准运行。
图4B表示在运行期间通过酶活性测定法监测收集的流分。
图4C表示活性测定用洗脱流分的考马斯蓝染色。
图5表示在经腹膜巨噬细胞摄取后重组hGCD的活性(图5A-5C),而图5D表示本发明重组GCD的蛋白质印迹。
图6表示本发明rGCD的糖基化结构与CerezymeTM糖基化结构的比较。
图7表示本发明rGCD的糖基化结构。
图8a-8d表示本发明rGCD的其它N-聚糖糖基化结构。
图9a-9b表示本发明的纯化重组人GCD和哺乳动物CHO细胞中重组产生的市售人GCD的抗原特征和电泳特征。图9a是植物产生的本发明hGCD(泳道1和泳道2,分别为5μg和10μg蛋白质)与(泳道3和泳道4,分别为5μg和10μg蛋白质)的考马斯蓝染色SDS-PAGE分析。图9b是SDS-PAGE分离的本发明重组人GCD(泳道1和泳道2,分别为50ng和10ng)的蛋白质印迹分析与市售酶的比较。将SDS-PAGE分离的蛋白质点到硝化纤维上(泳道3和泳道4,分别为50ng和100ng抗原),使用多克隆抗GCD抗体和过氧化物酶缀合的山羊抗兔HRP第二抗体进行免疫测定。注意本发明的植物重组GCD与哺乳动物细胞(CHO)制备的酶之间大小和免疫反应性的一致性。MW=分子量标准标记。
图10a-10b是本发明重组人GCD的聚糖结构的示意图。图10a表示GCD主要聚糖结构分析的结果,表明所有结构及其基于HPLC、酶阵列消化和MALDI的相对量。对各个聚糖的保留时间与给出葡萄糖单元(GU)梯的葡聚糖标准部分水解物的保留时间进行比较。图10b表示在体外修饰加工之前和之后哺乳动物细胞(CHO)制备的酶的聚糖结构。注意本发明的重组人GCD中木糖和暴露出来的甘露糖糖苷的优势。
图11是本发明重组人GCD的聚糖特征的HP-阴离子交换层析分析,显示批次之间重组人GCD的聚糖结构是一致且是可再现的。
图12动力学分析显示本发明的重组人GCD(空心三角形)和哺乳动物细胞(CHO)制备的酶(实心方形)具有相同的催化动力学特征。在MES缓冲液(50mM,pH 5.5)中,使用C6-NBDGlcCer对本发明的重组人GCD和(0.2μg)进行了测定(5分钟,37℃)。应用GraphPad Prism软件进行了米-曼动力学分析。数据是两次独立实验的平均值。
图13A和13B曲线图是烟草植物中表达的人重组α-半乳糖苷酶A分子量的分析结果。图13A表示通过本文所述的凝胶过滤测定的分子量。图13B表示通过质谱法(MALDI-Tof)测定的分子量。注意在48.6kDa上的主峰(MS上)相当于天然人α-半乳糖苷酶A的MW。
图14A和图14B是烟草植物中表达的人重组α-半乳糖苷酶A的PAGE分析和氨基酸序列。图14A显示在PAGE中分离的两条截然不同的人重组α-半乳糖苷酶A的条带,对应于62kDa和47.6kDa。图14B表示分别从两条条带(标记为“上条带”和“下条带”)中得到的氨基酸序列。各条带中可供测序的多肽部分用红色表示。不能提供序列数据(可能被聚糖结构掩蔽)的区域用黑色表示。注意上条带和下条带之间已测序区域完全一致,表示同一多肽在聚糖结构上可能存在明显差别。
图15是显示在烟草植物中表达的人重组α-半乳糖苷酶A的免疫反应性的蛋白质印迹照片。从表达靶向液泡的人α-半乳糖苷酶A(α-gal-vac,泳道“vac”)或者表达具有ER保留信号(α-gal-KDEL,泳道“KDEL”)的人α-半乳糖苷酶的烟草植物中提取的蛋白质用PAGE分离,点在硝化纤维上,与抗α-半乳糖苷酶A抗体(针对人α-半乳糖苷酶的氨基酸326-429)反应,用HRP第二抗体显色。注意α-gal-vac和α-gal-KDEL表达的蛋白质具有强特异性反应,而由转基因对照植物(GFP)提取的蛋白质无反应性。
图16A和16B曲线图表示对植物中表达的人重组α-半乳糖苷酶催化性质进行的动力学分析。图16A是对植物表达的人重组α-半乳糖苷酶A和市售重组α-半乳糖苷酶A制剂进行比较的米-曼图(Michaelis-Menten plot)。图16B是由图16A推导的酶动力学的Lineweaver-Burke图,显示出Km和Vmax(详情见表中插图)。绿色表示植物表达的人重组α-半乳糖苷酶;黑色表示法布瑞酶,蓝色表示Replagal。注意植物表达的人重组α-半乳糖苷酶和市售制剂之间酶动力学的密切关系。
图17A和17B是表示在各种温度下植物中表达的人重组α-半乳糖苷酶稳定性的SDS-PAGE照片。将植物中表达的人重组α-半乳糖苷酶(植物α-Gal)和市售人重组α-半乳糖苷酶(Replagal)在活性缓冲液(图17A)或细胞培养基(图17B)中在指定温度下孵育2小时,用SDS-PAGE分离,按照本文所述方法显色。
图18是成纤维细胞裂解物的蛋白质印迹分析照片,显示在法布莱成纤维细胞中植物表达的人重组α-半乳糖苷酶的摄取和保留。泳道“植物αGalA”是人法布莱(α-半乳糖苷酶缺陷型)成纤维细胞与植物表达的人重组α-半乳糖苷酶一起孵育2小时、洗涤并裂解的成纤维细胞裂解物。最右边的泳道是介于之中的是分子量梯。
图19是显示特有聚糖结构峰值的NP-HPLC曲线谱图以及聚糖本身的示意图。
发明详述
传统上在哺乳动物或细菌表达系统中产生用于药物应用的蛋白质。在过去几年中,在植物中发现一种有前景的新的表达系统。由于导入新的基因相对简单,并且可大量产生蛋白质和肽,因此“分子医药农业(molecular pharming)”作为蛋白质表达系统变得越来越普遍。
哺乳动物和植物蛋白质表达系统之间的一个主要差别是由生物合成途径的不同所引起的蛋白质糖基化序列的变化。研究表明糖基化对活性、折叠、稳定性、溶解度、对蛋白酶的敏感性、血液清除率和蛋白质的抗原潜力具有重要作用。因此,植物中产生的任何蛋白质都应考虑植物糖基化的潜在分枝。
以往在植物中产生有生物活性的哺乳动物蛋白所做的努力都遇到了困难,就充分说明这一点。例如,Radin等人的美国专利号5,929,304(Crop Tech,Inc)公开了在烟草植物产生人α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)和葡糖脑苷脂酶(hGC),该方法通过将有关人溶酶体酶编码序列插入二元质粒(binary plasmid)表达盒中用于根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)介导的烟草植物转化。尽管证实了在转基因植物中产生了重组人溶酶体蛋白质,并且在重组蛋白中检测出催化活性,但是没有披露与靶细胞结合或者摄取进入靶细胞内,而且溶酶体酶的组成仍不适于治疗应用,据推测是由于缺乏精确的蛋白质糖基化,而且多肽随后不能通过特异性受体与它们的靶细胞/组织有效地相互作用。
糖部分是一种最常见的蛋白质翻译后修饰。蛋白质糖基化被分成两类:N联和O联。两个类型的区别在于聚糖部分在蛋白质上所连接的氨基酸--N联是与Asn残基连接,而O联则是与Ser或Thr残基连接。另外,各个类型的聚糖序列具有独特的区别性特征。在两个类型中,N联糖基化较丰富,对蛋白质的作用已得到广泛深入的研究。另一方面,O联聚糖相对稀少,可获取的有关它对蛋白质作用的信息较少。可获取的有关植物中蛋白质糖基化的大部分数据集中在N联聚糖,而不是O联聚糖。
本发明在此描述了基于转基因植物细胞的植物表达系统,该系统优选为根细胞,任选和优选生长在悬液中。这一表达系统特别设计用于有效产生目标高甘露糖蛋白。术语“高甘露糖”包括具有至少一个暴露出来的甘露糖残基的糖基化。
因此,第一方面,本发明涉及产生目标高甘露糖重组蛋白的宿主细胞。优选重组蛋白的特征是ER(内质网)信号肽,更优选是ER引导信号肽。又或者,重组蛋白的特征是使蛋白质绕过高尔基体的信号。该信号优选能够使重组蛋白以高甘露糖糖基化为特征,更优选保留这类糖基化,最优选靶向ER和/或绕过高尔基体。如本文所详述,这类信号优选作为信号肽发挥作用,信号肽更优选形成蛋白质序列的组成部分,任选和更优选通过对蛋白质进行工程改造也使信号肽以作为蛋白质的组成部分为特征。应当注意的是,信号可任选为引导信号、保留信号、回避(旁路)信号或其任何组合,或能够提供所需要的高甘露糖糖基化结构的任何其它类型的信号。
我们无意受一种假设的限制,但似乎是利用ER引导信号与植物细胞培养物中产生的重组蛋白能够阻止向高尔基体的转运,因此保留了所需要的高甘露糖糖基化。任选可按照本发明利用能够产生高甘露糖糖基化的任何机制类型,包括绕过高尔基体的任何机制类型。ER引导信号肽是本领域众所周知的;它们是N端信号肽。任选任何合适的ER引导信号肽均可用于本发明。
本发明的宿主细胞可任选用编码目标蛋白质的重组核酸分子或用包含该核酸分子的表达载体转化或转染(永久和/或瞬时)。这类核酸分子包含编码目标蛋白质的第一核酸序列,任选和优选与编码液泡引导信号肽的第二核酸序列可操作性连接。应当注意的是,本文术语“可操作性(operably)”连接不必是指体连接(physical linkage)。第一核酸序列可任选和优选与编码ER(内质网)引导信号肽的第三核酸序列进一步可操作性连接。在一个实施方案中,本发明细胞的特征是目标蛋白质由细胞以包括至少一个暴露出来的甘露糖残基的形式产生,只是优选为高甘露糖化的形式。在一个更优选的实施方案中,目标蛋白质由细胞以包括暴露出来的甘露糖和至少一个木糖残基的形式产生,在又一个更优选的实施方案中,是以进一步包括暴露出来的甘露糖和至少一个岩藻糖残基的形式产生。在一个最优选的实施方案中,蛋白质由细胞以包括暴露出来的甘露糖、核心α(1,2)木糖残基和核心α-(1,3)岩藻糖残基的形式产生。
术语“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。要理解的是这类术语不仅是指具体的受试细胞,而且还是指这类细胞的子代或潜在的子代。因为某些修饰由于突变或环境影响可以发生在随后的世代中,实际上,这类子代可能与母细胞不相同,但它仍落入本文所用术语的范围内。本文所用的“细胞”或“宿主细胞”是指可用采用重组DNA技术构建的裸DNA或表达载体转化的细胞。本文术语“转染”是指通过核酸介导的基因转移将核酸(例如裸DNA或表达载体)导入受体细胞。本文所用“转化”是指这样一个过程,其中由于细胞摄入外源DNA或RNA使细胞的基因型发生改变,并且转化细胞表达例如重组形式的所需蛋白质。
应当了解的是,抗药性或其它选择标记部分意图在于促进转化体的选择。另外,选择标记(例如抗药性标记)的存在可用于阻止污染性微生物在培养基中繁殖。可通过在诱导表型存活所必需的条件下培养细胞,来获得这类转化宿主细胞纯的培养物。
如上所述,本发明的宿主细胞可以用核酸分子转染或转化。本文所用术语“核酸”是指多核苷酸,例如脱氧核糖核酸(DNA),且适当时可为核糖核酸(RNA)。该术语还应理解为包括由核苷酸类似物制备的RNA或DNA的等同物、类似物形式的,并适用于所述实施方案的单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸。
在又一个实施方案中,本发明的细胞可用包含重组核酸分子的表达载体转染或转化。本文所用“表达载体”包括载体例如质粒、病毒、噬菌体、可整合DNA片段和能够将DNA片段整合到宿主基因组中的其它载体。表达载体通常是自我复制的DNA或RNA构建体,含有所需要的基因或其片段以及可操作性连接的遗传调控元件,该调控元件在合适宿主细胞中被识别并使所需基因进行表达。这些调控元件能够在合适宿主中进行表达。遗传调控元件一般可包括原核启动子系统或真核启动子表达调控系统。这类系统通常包括转录启动子、任选控制转录启始的操纵基因、提高RNA表达水平的转录增强子、编码合适核糖体结合位点的序列、RNA剪接点(splice junctions)、终止转录和翻译的序列等等。表达载体通常含有使载体独立于宿主细胞进行复制的复制起点。
质粒是最常用的载体形式,但是提供等同功能以及作为或成为本领域已知的其它载体形式也适用于本文。参见例如Pouwels等,Cloning Vectors:a Laboratory Manual(1985与增刊),Elsevier,N.Y.;以及Rodriquez等(主编)Vectors:a Survey of Molecular CloningVectors and their Uses,Buttersworth,Boston,Mass(1988),该文献通过引用结合到本文中。
一般而言,这类载体另含有能够在转化细胞中提供表型选择的特定基因。还包括使用原核和真核病毒表达载体以表达编码本发明多肽的基因。
任选载体可以是通用植物载体(如下面有关实施例中所述)。或者,载体可任选对根细胞具有特异性。
在一个优选的实施方案中,本发明的细胞可以是真核细胞或原核细胞。
在一个具体实施方案中,本发明的细胞是原核细胞,优选为细菌细胞,最优选为根癌土壤杆菌细胞。这些细胞被用于感染下述优选的植物宿主细胞。
在另一个优选的实施方案中,本发明的细胞可以是真核细胞,优选为植物细胞,最优选为选自以下的植物根细胞:发根土壤杆菌转化的植物根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。
在一个优选的实施方案中,植物根细胞是胡萝卜细胞。应当注意的是,本发明转化的胡萝卜细胞生长在悬液中。如上文和实施例中所述,这些细胞用本发明的根癌土壤杆菌细胞转化。
用于转染或转化本发明宿主细胞的表达载体或重组核酸分子可按照本领域技术人员已知的添加、剔除方法进一步修饰,又或者对肽信号序列进行修饰以改变信号肽切割,或者增加或改变已表达的溶酶体酶通过植物内膜系统的寻靶。例如但不限于可对表达构建体进行特定的工程改造以使溶酶体酶实现分泌或液泡定位或保留内质网(ER)中。
在一个实施方案中,可对表达载体或重组核酸分子进行工程改造,以整合编码将溶酶体酶靶向植物液泡的信号的核苷酸序列。例如但不限于,本发明宿主细胞内所包含的重组核酸分子包含编码溶酶体酶的第一核酸序列,其与编码液泡引导信号肽的第二核酸序列可操作性连接,所述引导信号肽得自碱性烟草几丁质酶A基因。该液泡信号肽具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。第一核酸序列可任选与编码ER(内质网)引导信号肽的第三核酸序列进一步可操作性连接,该引导信号肽由SEQ ID NO:1表示。在一个实施方案中,本发明宿主细胞内所包含的重组核酸分子另包含在植物细胞中起作用的启动子。该启动子应与本发明的重组分子可操作性连接。
术语“可操作性连接”在本文中用来表明当第一核酸序列被放在与第二核酸序列具有功能关系的位置上时,第一核酸序列与第二核酸序列可操作性连接。例如,如果启动子影响编码序列的转录或表达,则启动子与编码序列可操作性连接。当必需将两个蛋白质编码区相连接在同一读框时,任选和优选可操作性连接的DNA序列是邻接(例如体连接(physically linked))的。因此,DNA序列和调节序列以这类方式连接,以便当合适分子(例如转录激活蛋白)与调节序列结合时允许基因进行表达。
在另一个实施方案中,该重组核酸分子可任选另包含优选在植物细胞中起作用的可操作性连接的终止子。本发明的重组核酸分子还任选另包含另外的调控元件、启动元件和调节元件和/或选择标记。应当注意的是,这些调节元件与重组分子可操作性连接。
可用于表达构建体的调节元件包括可以是与植物细胞同源或异源的启动子。启动子可以是能够驱动连接序列在植物细胞和植物中高水平转录的植物启动子或非植物启动子。可用来有效实施本发明的植物启动子的非限制性实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S、rbcS、叶绿素a/b结合蛋白的启动子、AdhI、NOS和HMG2或其修饰物或衍生物。启动子可以是组成型或诱导型的。例如但不限于,诱导型的启动子可以是促进表达的启动子,或者在植物、植物组织或植物细胞受机械性基因激活(MGA)后增加溶酶体酶核苷酸序列表达的启动子。
可按照本领域技术人员已知的提高或优化异源基因在植物和植物细胞中表达的方法,对用于转染或转化本发明宿主细胞的表达载体进行额外的修饰。这类修饰包括但不限于使DNA调节元件突变以提高启动子强度或改变目标蛋白质。
在一个优选的实施方案中,由本发明的宿主细胞产生的目标高甘露糖蛋白可以是富含甘露糖的糖蛋白,该糖蛋白具有至少一个暴露出来的甘露糖残基(至少一个末端甘露糖残基)。在另一个实施方案中,本发明的糖蛋白中,大部分(大于75%)的甘露糖残基是末端暴露出来的甘露糖残基。
根据另一个优选的实施方案,这类高甘露糖蛋白可以是选自以下的溶酶体酶:葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
在本文所用的有关任何这类溶酶体酶和在本发明所述植物表达系统中产生的产物中的术语“溶酶体酶”,是指由编码人或动物溶酶体酶的核苷酸序列在转基因植物细胞中表达的重组肽、经修饰的人或动物溶酶体酶或者这类酶的片段、衍生物或修饰物。有益的经修饰的人或动物溶酶体酶包括但不限于具有一个或若干个天然存在的或人工导入的氨基酸添加、缺失和/或取代的人或动物溶酶体酶。
可溶性溶酶体酶与分泌性蛋白有共同的生物合成的最初步骤,即在核糖体上合成,N端信号肽与粗面内质网(ER)表面结合,转运至ER腔,在此将信号肽切割,并将寡糖添加到特定的天冬酰胺残基上(N联),接着新生蛋白质在高尔基体内进行进一步修饰[von Figura和Hasilik,Annu.Rev.Biochem.55:167-193(1986)]。N联寡糖可以是复杂、多样和异源的,可含有高甘露糖残基。蛋白质在内质网后高尔基体前的区室以及在高尔基体内侧进行进一步加工,形成用于使酶定位于溶酶体的N联甘露糖-6-磷酸(M-6-P)寡糖依赖性识别信号或N联M-6-P寡糖非依赖性识别信号[Kornfeld和Mellman,Ann.Rev.CellBiol.,5:483-525(1989);Kaplan等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:2026(1977)]。M-6-P识别信号的存在导致酶与M-6-P受体(MPR)结合。这些结合酶保留在细胞内,最终包装到溶酶体内,从而与以分泌为目标或靶向质膜的蛋白质分隔开来。
在一个优选的实施方案中,溶酶体酶可以是人葡糖脑苷脂酶(GCD)或人α-半乳糖苷酶A。
再者,在一个具体实施方案中,该优选的宿主细胞被重组核酸分子转化或转染,该重组核酸分子另包含得自花椰菜花叶病毒的35S启动子,优选具有由SEQ ID NO:9表示的核酸序列、根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶终止子,优选具有由SEQ ID NO:12表示的核酸序列和TMV(烟草花叶病毒)Ω翻译增强子元件。根据优选的实施方案,该重组核酸分子包含基本上由SEQ ID NO:13表示的核酸序列,编码具有基本上由SEQ ID NO:14或15表示的氨基酸序列的高甘露糖GCD。
应当了解的是,本发明进一步提供表达载体,该表达载体包含编码有生物活性的高甘露糖溶酶体酶的核酸分子。
在所述方面的一个优选实施方案中,本发明的表达载体包含编码有生物活性的高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)的核酸分子。这种优选的表达载体优选包含具有基本上由SEQ ID NO:13表示的核酸序列的重组核酸分子。根据一个具体的实施方案,优选的表达载体利用下面实施例1中所述的pGREEN II质粒。在本发明另一个实施方案中,表达载体包含编码有生物活性的高甘露糖人α-半乳糖苷酶(α-gal-A)的核酸分子。这种优选的表达载体优选包含重组核酸分子,该分子具有基本上由SEQ ID NO:17或19表示的核酸序列。根据一个具体的实施方案,优选的表达载体利用下面实施例5a所述的pICH19170质粒。
还要注意的是,本发明提供上述表达载体内所包含的表达盒。
第二方面,本发明涉及由本发明的宿主细胞产生的重组高甘露糖蛋白。
在一个优选的实施方案中,这种高甘露糖蛋白可以是选自以下的有生物活性的高甘露糖溶酶体酶:葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最优选这种溶酶体酶可以是人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
本文所用的有关在植物表达系统中产生的任何重组溶酶体酶的术语“生物活性”,是指能够以可检测水平水解相应的人或动物溶酶体酶的天然底物或类似物或合成底物的重组溶酶体酶。
再者,本发明提供有生物活性富含甘露糖的重组溶酶体酶,该酶具有至少一条包含暴露出来的甘露糖残基的寡糖链。
根据优选的实施方案,本发明的重组溶酶体酶可在靶部位上与靶细胞的甘露糖受体结合。优选这个部位可在患有溶酶体贮积病的受治疗者的体内。
任选和更优选与天然存在的靶细胞溶酶体酶相应的亲和力相比,重组溶酶体酶对靶细胞的亲和力提高。在一个具体实施方案中,靶部位的靶细胞可以是受治疗者肝中的枯否氏细胞。
在一个优选的实施方案中,重组溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
该重组溶酶体酶最优选为葡糖脑苷脂酶(GCD)或α-半乳糖苷酶A。
第三方面,本发明涉及产生高甘露糖蛋白的方法。因此,本发明的方法包括以下步骤:(a)制备重组宿主细胞培养物,所述细胞用编码目标重组蛋白的重组核酸分子或用包含该重组核酸分子的表达载体转化或转染;(b)在允许高甘露糖蛋白表达的条件下,将由步骤(a)制备的宿主细胞培养物培养在悬液中,其中宿主细胞以高甘露糖化的形式产生蛋白质;(c)由从(a)得到的培养物中收获细胞,并从细胞中回收蛋白质;(d)通过适当的蛋白质纯化方法对步骤(c)的蛋白质进行纯化。
任选和优选可通过将本发明的植物细胞培养在美国专利第6,391,638号(2002年5月21日授予专利权,通过引用结合到本文中如同全部陈述于此一样)中所述的装置中,来制备重组蛋白。用该装置将植物细胞培养在悬液中的条件参见本发明的发明人之一的名称为“CELL/TISSUE CULTURING DEVICE,SYSTEM ANDMETHOD(细胞/组织培养装置、系统和方法)”的美国专利申请,该专利与本申请一样为共同拥有,通过引用结合到本文中如同全部陈述于此一样,该与本申请同一天提出申请。
根据本发明实施方案的又一个方面,重组蛋白可以在整株植物或其部分中表达。因此,本发明的方法包括以下步骤:(a)用编码目标重组蛋白的重组核酸分子或用包含该重组核酸分子的表达载体转化或转染植物或植物细胞;(b)在允许富含甘露糖的蛋白质表达的条件下,使通过步骤(a)制备的经转化或转染的植物或细胞生长,其中植物细胞以具有暴露出来的末端甘露糖残基的甘露糖基化形式产生蛋白质;(c)由从(a)得到的植物或植物组织中收获植物或组织,并从细胞中回收蛋白质;(d)通过适当的蛋白质纯化方法对步骤(c)的蛋白质进行纯化。在本发明另一个实施方案中,用载体转化的植物为稳定转化,在步骤(b)之后对表达目标重组蛋白的植物进行选择,对选出的转基因植物进行繁殖后,收获和回收重组蛋白。对于组成型表达或条件性表达所需要的哺乳动物多肽,用重组表达载体转化的植物或植物组织(包括但不限于愈伤组织、未成熟胚、花粉、种子、培养物及植物原位(in planta)中的苗端部分)是本领域众所周知的,例如,对于根癌土壤杆菌介导的转化烟草植物使用二元质粒(参见美国专利第5,763,748号)、使用共整合载体或者使用转移载体(mobilization vector)。
对用本发明方法产生的目标高甘露糖蛋白进行回收和纯化的具体非限制性实例可参见下面的实施例。实施例表明本发明产生的重组h-GCD预料不到地与本发明转化的胡萝卜细胞内膜结合,不分泌到培养基中。可按照本领域已知方法(例如过滤或沉淀),从细胞碎片和其它不溶性组分中分离出可溶性rh-GCD。例如,在一次冻融循环之后,细胞遭到破坏,释放出胞内可溶性蛋白质,而h-GCD保持与不溶膜碎片结合。接着对这种可溶和不溶膜碎片混合物进行离心,除去可溶性流分,从而使纯化方法简化。然后在温和洗涤剂、蛋白酶抑制剂和中和氧化试剂存在下通过机械破坏,使膜结合的h-GCD溶解。可溶性酶可采用层析技术进一步纯化,例如阳离子交换和疏水相互作用层析柱。在生物反应器中生产rh-GCD期间和纯化过程中,可通过一个或多个生化实验测定h-GCD特征、产量、纯度和酶活性。包括但不限于检测酶底物或底物类似物的水解、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和ELISA和蛋白质印迹等免疫分析。
可通过一个或多个生化实验,对在整株植物和植物组织中表达的重组蛋白的产量、纯度、酶活性、抗原特性、生物活性以及聚糖特征进行评价,正如下面实施例中所描述的一样,实验包括但不限于检测酶底物或底物类似物的水解、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析、ELISA和蛋白质印迹等免疫分析、通过糖苷酶和层析法对聚糖进行分析。
根据优选的实施方案,本方法所采用的宿主细胞包括本发明的宿主细胞。
在另一个优选的实施方案中,由本发明方法产生的高甘露糖蛋白可以是有生物活性的高甘露糖溶酶体酶,该酶具有至少一条包含暴露出来的甘露糖残基的寡糖链。
该重组酶可在靶部位上与靶细胞的甘露糖受体结合。更特别的是与天然存在的靶细胞溶酶体酶相应的亲和力相比,通过本发明方法产生的重组酶对靶细胞的亲和力提高。因此,靶部位的靶细胞可以是受治疗者肝中的枯否氏细胞。
在一个具体实施方案中,这种溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最优选这种溶酶体酶可以是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
在另一个优选的实施方案中,本发明方法所采用的宿主细胞可以是选自以下的植物根细胞:发根土壤杆菌转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。植物根细胞最优选为胡萝卜细胞。特别应当注意的是转化的宿主胡萝卜细胞生长在悬液中。
又一方面,本发明涉及通过使用外源重组溶酶体酶来治疗患有溶酶体贮积病的受治疗者、优选为哺乳动物受治疗者的方法。
要了解的是,本发明不局限于已公开和描述的具体实施例、方法步骤和本文所公开的用作这类方法步骤的材料,所述材料可略有变化。还要了解的是,本文所用术语仅用于描述具体实施方案的目的,并不是限制性的,因为本发明的范围仅受随附权利要求书及其等同内容的限制。
除非另有说明,否则贯穿本说明书和随附权利要求书的术语“包含”及其变体,应理解为是指包括一个或多个所述整体或步骤,但并不排斥其它任一个或多个的整体或步骤。
必须注意的是,本说明书和随附权利要求书所用的未加数词修饰的单数形式包括其复数形式,除非文中另有明确说明。
下面的实施例是本发明的发明人在实施本发明各方面所采用的代表性技术。应当了解的是,虽然这些技术对于实施本发明是示例性的优选实施方案,但是本领域技术人员应了解根据本公开内容,在不偏离本发明的精神和既定范围的情况下可进行多种改动。
实施例
实验方案:
质粒载体
*CE-T-由获自Galili教授的质粒CE构建[美国专利5,367,110,1994年11月22日]。
质粒CE用SalI消化。
使用DNA聚合酶I的大片段将SalI黏性末端制成平端。然后质粒用PstI消化,与编码得自碱性内切几丁质酶基因的ER引导信号的DNA片段连接[拟南芥(Arabidopsis thaliana)]ATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCA
CTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTC,液泡引导信号得自用SmaI和PstI消化的烟草几丁质酶A:GATCTTTTAGTCGATACTATG。
*pGREENII-得自P.Mullineaux教授[Roger P.Hellens等(2000)Plant Mol.Bio.42:819-832]。pGREENII载体的表达受得自花椰菜花叶病毒的35S启动子、TMV(烟草花叶病毒)Ω翻译增强子元件和得自根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶终止子序列的控制。
cDNA
hGCD-得自ATCC(保藏号65696),含有葡糖苷酶β酸(glucosidase beta acid)[葡糖脑苷脂酶]的GC-2.2[GCS-2kb;λ-EZZ-γ3人]。插入片段长度(kb):2.20;组织:成纤维细胞WI-38细胞。
表达质粒的构建
使用正向引物:5’CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3’和反向引物:5’CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3’,对编码hGCD的cDNA(ATTC克隆号65696)进行扩增。纯化的PCR DNA产物用内切核酸酶EcoRI和BglII消化(见引物中有下划线的识别序列),并连接到中间载体上,该载体具有用同一酶消化的表达盒E-T。切下表达盒,从中间载体上洗脱出来,使用限制性内切酶SmaI和XbaI连接到二元载体pGREENII上,形成最终的表达载体。通过与pGREEN载体一起获得的由nos启动子驱动的NPTII基因赋予卡那霉素抗性(图1B)。所得表达盒由图1A表示。
使用下列测序引物,对所得质粒进行测序以确保信号的正确框内融合:5’35S启动子:5’CTCAGAAGACCAGAGGGC 3’,3’终止子:5’CAAAGCGGCCATCGTGC 3’。
建立胡萝卜愈伤组织和细胞悬浮培养物
我们按照Torres K.C.之前所描述的方法,建立了胡萝卜愈伤组织和细胞悬浮培养物(Tissue culture techniques for horticular crops,第111页,169)。
胡萝卜细胞的转化和转化细胞的分离
通过前述方法的修改方法,使用土壤杆菌属转化进行胡萝卜细胞的转化[Wurtele,E.S.和Bulka,K.Plant Sci.61:253-262(1989)]。在整个方法中使用生长在液体培养基中的细胞而不是愈伤组织。调整孵育和生长时间以适应细胞液体培养物的转化。简单地说,土壤杆菌通过电穿孔用pGREENII载体转化[den Dulk-Ra,A.和Hooykaas,P.J.(1995)Methods Mol.Biol.55:63-72],然后使用30mg/ml巴龙霉素(paromomycine)抗生素进行选择。胡萝卜细胞在液体培养基中用土壤杆菌转化,使用60mg/ml巴龙霉素抗生素选择。
筛选转化的胡萝卜细胞用于分离表达高水平GCD的愈伤组织
转化后14天,将得自培养物的细胞按3%压紧细胞体积的稀释度接种到固体培养基上,以便由各个细胞聚簇形成愈伤组织。当各愈伤组织直径达到1-2cm时,将细胞在SDS样品缓冲液中匀浆,所得蛋白质提取物用SDS-PAGE分离[Laemmli U.,(1970)Nature227:680-685]后,转移到硝化纤维膜(hybond C硝化纤维,0.45微米,得自Amersham Life Science目录号:RPN203C)上。使用多克隆抗hGCD抗体,对GCD进行蛋白质印迹检测(如下文中所述)。使表达显著水平GCD的愈伤组织扩增后,转移在液体培养基中生长用于规模放大、蛋白质纯化和分析。
制备多克隆抗体
将75微克重组GCD(CerezymeTM)悬浮于3ml完全弗氏佐剂中,给两只兔子的每一只注射。2周后给每只兔子加强注射。加强注射后10天左右给兔子抽血,按一周间隔再次加强注射直到抗体效价开始下降。除去血块后,将血清分成等分量并保存在-20℃下。
生长在生物反应器中的培养物的规模放大
将约1cm(单位直径)经遗传修饰含有rh-GCD基因的胡萝卜细胞的愈伤组织接种到Murashige和Skoog(MS)9cm直径琼脂培养板上,培养板含有4.4gr/l MSD培养基(Duchefa)、9.9mg/l盐酸硫胺素(Duchefa)、0.5mg叶酸(Sigma)、0.5mg/l生物素(Duchefa)、0.8g/l酪蛋白水解物(Ducifa)、糖30g/l和激素2-4D(Sigma)。使愈伤组织在25℃下生长14天。
正如本领域所熟知的一样,通过将转化的愈伤组织在含有0.2mg/l 2,4-二氯乙酸)的MSD液体培养基(Murashige和Skoog(1962))中进行继代培养来制备悬浮细胞培养物。在25℃下,将悬浮细胞在250ml锥形瓶(工作体积始于25ml,7天后增至50ml)中培养,振荡速度为60rpm。随后,在相同条件下,通过将工作体积加到300ml,将细胞培养物体积加大至1L锥形瓶。通过加入400ml得自两个培养7天的1L锥形瓶的悬浮细胞,获得装有4L MSD培养基的小生物反应器(10L)[参见WO98/13469]的接种物。在25℃下用1Lpm通气培养一周后,将MDS培养基加到高达10L,在相同条件下继续培养。再培养5天后,收获大部分细胞,使细胞培养基通过80μ网后收集。挤出多余的培养基,将压紧的细胞滤饼保存在-70℃下。
生物反应器装置的更多详情可参见2002年5月21日授予专利权的美国专利第6,391,638号,之前已通过引用予以结合。
蛋白质纯化
为了分离培养基中的不溶性GCD,将含有约100g湿重细胞的冷冻细胞滤饼融化,接着将融化的细胞在4℃下以17000xg离心20分钟。将不溶性物质和完整细胞重新悬浮于100ml洗涤缓冲液(20mM磷酸钠(pH 7.2),20mM EDTA)中进行洗涤,然后在4℃下以17000g离心20分钟使之沉淀。提取rh-GCD(重组人GCD),在200ml提取缓冲液(20mM磷酸钠(pH 7.2)、20mM EDTA、1mM PMSF、20mM抗坏血酸、3.8g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、1mM DTT和1%曲通-x-100)中使沉淀匀浆增溶。然后在室温下使匀浆振荡30分钟,在4℃下以17000xg离心20分钟澄清。弃去沉淀后,加入浓柠檬酸调节上清液的pH至pH 5.5。在上述相同条件下,将PH调节后所形成的混浊液通过离心澄清。
进一步的纯化用层析柱方法如下进行:将200ml澄清的培养基加到在25mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)平衡的装入XK柱(2.6x20cm)的20ml强阳离子交换树脂(Macro-Prep high-S support,Bio-Rad)上。将柱与AKTA(prime系统(Amersham Pharmacia Biotech)连接以供监测传导率、pH和280nm下的吸光度之用。样品以20ml/分钟加载,之后用平衡缓冲液(25mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5))以12ml/分钟的流速洗涤柱,直到UV吸光度达到基线为止。rh-GCD用含有200mMNaCl的平衡缓冲液预洗脱,用含有600mM NaCl的平衡缓冲液得到洗脱液。在运行期间收集的流分通过酶活性测定法进行监测,合并具有酶促活性(洗脱峰处)的管。合并的样品用含有5%乙醇的水稀释(1∶5)后,用NaOH调节pH至6.0。将含有rh-GCD的样品加到第二根XK柱(1.6x20cm)上,第二根柱装有10ml与前述柱相同的树脂。此柱的树脂用含有5%乙醇的20mM柠檬酸盐缓冲液((pH 6.0))平衡。加载样品后,用平衡缓冲液洗涤柱,GCD通过洗脱缓冲液(20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)、5%乙醇和1M NaCl)从柱中洗脱出来。合并洗脱步骤中吸收峰的流分,加到第三根柱上。
最终的纯化步骤在装有8ml疏水相互作用树脂(TSK凝胶,Toyopearl Phenyl-650C,Tosoh Corp.)的XK柱(1.6x20cm)上进行。树脂用含有5%乙醇的10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡。将由之前各柱合并的GCD洗脱液以6ml/分钟加样后,用平衡缓冲液洗涤直到UV吸收达到基线。纯的GCD用含有50%乙醇的10mM柠檬酸缓冲液洗脱,合并后保存在-20℃下。
测定蛋白质浓度
采用牛血清白蛋白标准(流分V Sigma),通过Lowry/Bradford法(Bio Rad蛋白质测定法)[Bradford,M.,Anal.Biochem.(1976)72:248],对细胞提取物和流分中的蛋白质浓度进行测定。或者,通过280nm下的吸收求出匀质蛋白质样品的浓度,1mg/ml=1.4O.D280。纯度通过280/260nm比率求出。
GCD酶活性测定法
采用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma)作为底物,测定GCD的酶促活性。测定缓冲液含有60mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH=6)、4mM β-巯基乙醇、1.3mM EDTA、0.15%曲通X-100、0.125%牛磺胆酸钠。测定在96孔ELISA板中进行,将0-50微升的样品与250微升测定缓冲液一起孵育,将底物加至终浓度为4mM。使反应物在37℃下孵育60分钟。通过405nm下的吸光度检测产物(对硝基苯基;pNP)的形成。在t=0和在终点时监测405nm下的吸光度。60分钟后,将6微升5N NaOH加到各孔中,再次监测405nm下的吸光度。平行测定的参比标准曲线,用来定量测定受试样品中GCD的浓度[Friedman等,(1999)Blood,93(9):2807-16]。
动力学研究:
对于动力学研究,按照上述方法做一些改动,使用葡糖神经酰胺的荧光短酰基链类似物N-[6-[(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]己酰基]-D赤-葡糖鞘氨醇(C6-NBD-D-赤-GlcCer)来测定GCD的活性。按照Schwarzmann和Sandhoff(1987)所述方法,使用6-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基己酸琥珀酰亚胺酯使葡糖鞘氨醇N酰化,来合成C6-NBD-GlcCer。使用最终体积为200μl MES缓冲液(50mM,(pH5.5))中的0.2μg或0.2μg本发明的植物GCD进行测定。C6-NBD-GlcCer的浓度介于0.25-100μM。在37℃下继续进行反应5分钟,加入1.5ml氯仿/甲醇(1∶2,体积/体积)停止反应后,提取荧光脂质并进行分析。
生化分析:
凝胶中的蛋白酶解和质谱法分析
用干净的剃须刀片切割凝胶中染色的蛋白质条带,凝胶中的蛋白质用10mM DTT还原后,用100mM碘乙酰胺的10mM碳酸氢铵溶液修饰。凝胶切段用50%乙腈的10mM碳酸氢铵溶液处理以将蛋白质脱色,然后将凝胶切段干燥。干燥的凝胶切段用含有约0.1μg胰蛋白酶/样品的10%乙腈的10mM碳酸氢铵溶液再水化。使凝胶切段在37℃下孵育过夜后,所得肽用含0.1%三氟乙酸盐的60%乙腈回收。
胰蛋白酶消化的肽段用反相层析法分离(用多孔R2(Persepective)自行充填的0.1X 300-mm熔融硅胶毛细管(J&W,内径100微米))。以1μl/分钟的流速,用线性梯度含0.1%乙酸的5-95%乙腈水溶液洗脱肽段80分钟。将过柱液体电喷雾到离子阱质谱仪(LCQ,Finnegan,San Jose,CA)中。以阳离子模式采用重复性完全MS扫描,接着通过选自第一次MS扫描的最主要离子的碰撞诱导解离(CID)来进行质谱法分析。应用Sequest软件[J.Eng和J.Yates,University of Washingtonand Finnegan,San Jose],将质谱数据与NR-NCBI数据库中模拟蛋白酶解和蛋白质的CID进行比较。
按照产品说明书,在肽测序仪(Peptide Sequencer)494A(PerkinElmer)上对蛋白质的氨基端进行测序。
腹膜巨噬细胞的GCD摄取
已知将GCD靶向并摄入巨噬细胞是由甘露糖/N-乙酰基葡糖胺受体介导的,可按照Stahl P.和Gordon S.所描述的方法[J.Cell Biol.(1982)93(1):49-56],使用从小鼠中获得的巯基乙酸盐诱导的腹膜巨噬细胞来测定。简单地说,经腹膜内给小鼠(雌性,品系C57-B6)注射不含葡萄糖的2.5ml 2.4%细菌用巯基乙酸盐(Bacto-thioglycolate)培养基(Difco目录号0363-17-2)。4-5天后,经处理的小鼠通过颈脱位法处死,腹膜腔用磷酸缓冲盐溶液冲洗。将细胞通过离心(1000xg 10分钟)沉淀后,重新悬浮于含有10%胎牛血清的DMEM(Beit Haemek,Israel)中。然后将细胞以1-2x105细胞/孔接种到96孔组织培养板上,在37℃下孵育。90分钟后,未贴壁细胞使用PBS洗涤三次后,在酵母甘露聚糖(2-10,5mg/ml)存在和不存在下,将贴壁巨噬细胞在含有规定量的rhGCD的培养基中于37℃孵育90分钟,最终体积的范围为200微升中0-40微克。孵育后,弃去含有过量rGCD的培养基,细胞用PBS洗涤三次,然后用裂解缓冲液(10mM Tris(pH=7.3)、1mM MgCl2、0.5%NP-40和蛋白酶抑制剂)裂解。对细胞裂解物进行上述体外糖苷酶测定法以测定由细胞摄入的rGCD的活性。
实施例1
表达质粒的构建
就以下各实施例而言,本实施例更详细地描述了所用示例性表达质粒的构建。
使用正向引物:5’CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3’(亦由SEQ ID NO:1表示)和反向引物:5’CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3’(亦由SEQ ID NO:2表示),使编码hGCD的cDNA(ATTC克隆号65696)进行扩增。
纯化的PCR DNA产物用内切核酸酶EcoRI和BglII消化(见引物中有下划线的识别序列),并连接到中间载体上,该载体具有用同一酶消化的表达盒CE-T。CE-T包括得自碱性内切几丁质酶基因[拟南芥]的ER引导信号MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEA(亦由SEQ ID NO:3表示)及得自烟草几丁质酶A的液泡引导信号:DLLVDTM*(亦由SEQ ID NO:4表示)。
切下表达盒,从中间载体上洗脱出,使用限制性内切酶SmaI和XbaI连接到二元载体pGREENII上,形成最终的表达载体。通过由nos启动子驱动的NPTII基因连同pGREEN载体一起赋予卡那霉素抗性(图1B)。所得表达盒由图1A表示。
使用下列测序引物,对所得质粒进行测序以确保信号的正确框内融合:
得自5’35S启动子的引物:5’CTCAGAAGACCAGAGGGC 3’(亦由SEQ ID NO:5表示)和3’终止子:5’CAAAGCGGCCATCGTGC3’(亦由SEQ ID NO:6表示)。经证实的克隆hGCD编码序列由SEQID NO:7表示。
实施例2
转化胡萝卜细胞和筛选表达rhGCD的转化细胞
本实施例描述了转化本发明胡萝卜细胞的示例性方法,同样用于以下实施例中。
通过前述土壤杆菌属转化法[Wurtele和Bulka(1989),出处同上],进行了胡萝卜细胞的转化。将经遗传修饰的胡萝卜细胞接种在Murashige和Skoog(MS)琼脂培养基上,其中具有用于选择转化体的抗生素。如图2所示,使用抗hGCD抗体,通过蛋白质印迹分析,对由所产生的愈伤组织中制备的提取物的GCD表达进行了测定,与Cerezyme标准(阳性对照)和非转化细胞提取物(阴性对照)进行了比较。所测试的各个愈伤组织中,选出一个愈伤组织(编号22)用于规模放大生长和蛋白质纯化。
如下进行蛋白质印迹法。
对于该测定法,所获得样品的蛋白质用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,转移到硝化纤维上。为此,如下制备SDS聚丙烯酰胺凝胶。SDS凝胶由层积胶和分离胶组成(按照Laemmli,UK 1970,Cleavage of structural proteins during assembly of the head ofbacteriphage T4(噬菌体T4头部装配期间结构蛋白质的切割),Nature227,680-685)。分离胶的组成如下:12%丙烯酰胺(Bio-Rad)、每10ml凝胶溶液4微升TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺;Sigma目录号T9281)、0.1%SDS、375mM Tris-HCl(pH 8.8)和0.1%过硫酸铵(APS)。在这种情况下,TEMED和过硫酸铵用作聚合的自由基引发剂(freeradical starter)。在开始聚合之后约20分钟,将层积胶(3%丙烯酰胺、0.1%SDS、126mM Tris-HCl(pH 6.8)、0.1%APS和5微升TEMED/5ml层积胶溶液)倒在分离胶之上,插入12或18个间隔梳以形成样品孔。
阳极槽和阴极槽加载了相同的缓冲液溶液:含有SDS(Biorad,目录号161-0772)的Tris甘氨酸缓冲液(pH 8.3)。含抗原的材料用0.5体积的加样缓冲液(30ml甘油(Sigma目录号G9012)、9%SDS、15ml巯基乙醇(Sigma目录号M6250)、187.5mM Tris-HCl(pH 6.8)、500微升溴酚蓝,每100ml样品缓冲液的所有组分的体积)处理,然后将混合物在100℃下加热5分钟后,加到层积胶中。
电泳在室温下进行适当的时间,例如对于大小为13x9cm的凝胶,采用50-70伏特的恒定电流强度进行45-60分钟,接着在180-200伏特下进行45-60分钟。然后将抗原转移到硝化纤维(Schleicher和Schuell,Dassel)上。
基本上按照本文所述方法进行蛋白质转移。将凝胶与相贴的硝化纤维一起放在Whatmann 3MM滤纸、0.5cm厚的传导性泡沫材料和通过铂电极导电的电极丝之间。滤纸、泡沫材料和硝化纤维用转移缓冲液(得自Biorad的TG缓冲液,目录号161-0771,用甲醇和水缓冲液(20%甲醇)稀释10倍)充分浸泡。转移在4℃下以100伏特进行90分钟。
转移之后,使硝化纤维上的游离结合位点在4℃下用封闭缓冲液过夜饱和,封闭缓冲液含有1%奶粉(Dairy America)和用磷酸盐缓冲液(Riedel deHaen,目录号30435)稀释的0.1%吐温20(Sigma目录P1379)。将印迹条带与抗体(按1∶6500在上述含有1%奶粉和0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液中稀释,pH 7.5)在37℃下一起孵育1小时。
与抗体孵育之后,洗涤印迹三次,每次用PBS(磷酸盐缓冲的磷酸钠缓冲液(Riedel deHaen,目录号30435))洗涤10分钟。印迹条带然后与按1∶3000用缓冲液稀释的合适的第二抗体(山羊抗兔(完整分子)HRP(Sigma目录号A-4914))在室温下孵育1小时,该缓冲液含有1%奶粉(Dairy America)和用磷酸盐缓冲液(Riedel deHaen,目录号30435)稀释的0.1%吐温20(Sigma目录号P1379)。用PBS洗涤几次后,印迹条带用ECL显影剂(Amersham RPN 2209)染色。
将印迹浸入ECL试剂之后,将印迹暴露于X光片FUJI Super RX18x24,用FUJI-ANATOMIX显影剂和定影剂(FUJI-X fix目录号FIXRTU两者之一)显影。特载有被抗体结合的蛋白质的条带在此处理后显现出来。
在生物反应器中培养物的规模放大
将转化的愈伤组织在液体培养基进行继代培养,获得愈伤组织22的悬浮培养物。将细胞在振荡的锥形瓶中培养,直到总体积足以接种到生物反应器(如本实验方案所述)中为止。经遗传修饰的转基因胡萝卜细胞可以培养数月,可在5-7天的循环中收获细胞(未显示数据)。在培养的第7天,胡萝卜细胞中产生的rh-GCD的量达到峰值时,使培养物通过100目网来收获细胞。应当注意的是,细胞可通过本领域已知方法收获,例如过滤或离心。压紧后的细胞滤饼(提供用于纯化h-GCD至均质的材料)可保存在冷冻温度下。
实施例3
得自转化的胡萝卜细胞的重组活性hGCD蛋白的纯化
发现在转化的胡萝卜细胞中表达的重组h-GCD与细胞的内膜结合,不分泌到培养基中。机械性破坏细胞使rGCD保持与不溶膜碎片结合(未显示数据)。rGCD然后用温和洗涤剂溶解,从细胞碎片和其它不溶性组分中分离出来。可溶性酶采用本实验方案所述的层析技术(包括阳离子交换和疏水相互作用层析柱)进一步纯化。
为将培养基与不溶性GCD分离,将含有约100g湿重细胞的冷冻细胞饼融化,接着在4℃下以17000xg离心20分钟。将不溶性物质和完整细胞重新悬浮于100ml洗涤缓冲液(20mM磷酸钠(pH 7.2),20mM EDTA)进行洗涤后,在4℃下以17000g离心20分钟使之沉淀。将200ml提取缓冲液(20mM磷酸钠(pH 7.2)、20mM EDTA、1mMPMSF、20mM抗坏血酸、3.8g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、1mM DTT、1%曲通-x-100(Sigma))中的沉淀进行匀浆,提取rGCD并增溶。使匀浆在室温下振荡30分钟后,在4℃下以17000g离心20分钟澄清。弃去沉淀后,加入浓柠檬酸调节上清液的pH至pH 5.5。将调节pH后所形成的混浊液在上述相同条件下离心澄清。
进一步的纯化通过层析柱如下进行:在最初阶段,将200ml澄清的提取物加到用25mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)平衡的装填在XK柱(2.6x20cm)中的20ml强阳离子交换树脂(Macro-Prep high-Ssupport,Bio-Rad)上。将柱与AKTA prime系统(Amersham PharmaciaBiotech)连接以供监测传导率、pH和280nm下的吸光度之用。样品以20ml/分钟加载,之后用平衡缓冲液(25mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5))以12ml/分钟的流速洗涤柱,直到UV吸光度达到基线为止。Rh-GCD用含有200mM NaCl的平衡缓冲液预洗脱,用含有600mM NaCl的平衡缓冲液得到洗脱液。在运行期间收集的流分通过酶活性测定法进行监测,合并具有酶促活性(在洗脱峰中)的管。合并的样品用含有5%乙醇的水稀释(1∶5),用NaOH调节pH至6.0。
图3A表示该纯化阶段的标准运行。在运行期间收集的流分通过酶活性测定法监测,如图3B所示,图3C表示活性测定用洗脱流分的考马斯蓝染色。
将含有rGCD的洗脱流分加到第二根XK柱(1.6x20cm)用于第二纯化阶段,第二根柱装有10ml与前述柱相同的树脂。此柱的树脂用含有5%乙醇的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡。加载样品后,柱用平衡缓冲液洗涤,rGCD通过洗脱缓冲液(20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)、5%乙醇和1M NaCl)从柱中洗脱出来。图3D表示该纯化阶段的标准运行。在运行期间收集的流分通过酶活性测定法监测,如图3E所示,图3F显示活性测定用洗脱流分的考马斯蓝染色。
合并洗脱步骤中吸收峰的流分,加到第三根柱上用于第三纯化阶段。第三纯化阶段在装填8ml疏水相互作用树脂(TSK凝胶,ToyopearlPhenyl-650C,Tosoh Corp.)的XK柱(1.6x20cm)上进行。树脂用含有5%乙醇的10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡。由之前各柱合并的GCD洗脱液以6ml/分钟加载,接着用平衡缓冲液洗涤,直到UV吸光度达到基线。纯的GCD用含有50%乙醇的10mM柠檬酸缓冲液洗脱,合并后保存在-20℃下。
图4A表示该纯化阶段的标准运行。在运行期间收集的流分通过酶活性测定法监测(图4B),图4C显示活性测定用洗脱流分的考马斯蓝染色。
在被加工细胞的批纯化中,rGCD蛋白被纯化到大于95%的水平;如果只进行第一和第三阶段,则纯度达到约80%的水平(结果未显示)。
生化分析
为了证实纯化的rhGCD的特性,进行了Mass-Spec Mass-Spec(MSMS)分析。所得结果显示,与基于表达盒DNA的预期的氨基酸序列相匹配的蛋白质序列的覆盖率(coverage)为49%,所述表达盒包括前导肽和前导序列。
prGCD的表征和测序:为了进一步表征本发明植物产生的人重组GCD,在抗氧化剂存在下,用曲通X-100使rhGCD增溶,并通过阳离子交换和疏水层析法纯化至均质(图9a)。对本发明植物产生的人重组GCD进行的氨基酸测序表明rhGCD序列(SEQ ID NO:15)相当于人GCD的序列(Swiss Prot P04062,蛋白质编号AAA35873),并包括得自用于信号肽融合的接头N端的2个额外氨基酸(EF)(相应地标为-2和-1),以及得自液泡引导信号C端的7个额外氨基酸(标为497-503)。
通过对SDS-PAGE分离的蛋白质与蛋白进行了蛋白质印迹法(图9b),用抗GCD多克隆抗体对经纯化的植物产生的本发明人重组GCD进行了免疫检测,证实了植物产生的蛋白质和CHO产生的蛋白质的抗原特性。
重组hGCD的酶促活性:
使用荧光GlcCer类似物,对本发明植物产生的人重组GCD的活性与的活性进行了比较。图12显示得到类似的比活,其中对于prGCD,Vmax值为0.47±0.08Kmol形成的C6-NBD-神经酰胺/分钟/mg蛋白质,对于为0.43±0.06,Km值相似(,对于本发明的GCD为20.7±0.7KM,对于为15.2±4.8KM)。因此,这些动力学研究表明本发明植物产生的人重组GCD的活性类似于CHO表达的酶的活性。
腹膜巨噬细胞中重组hGCD的摄取和活性
为了确定胡萝卜中产生的rhGCD是否被正确地糖基化并可被靶细胞摄取,从而可用于治疗戈谢病,紧接着对rhGCD与巨噬细胞结合的能力以及被巨噬细胞摄入的能力进行了测定。rhGCD靶向巨噬细胞是由甘露糖/N-乙酰基葡糖胺(Man/GlcNAc)受体介导的,可使用巯基乙酸盐诱导的腹膜巨噬细胞来测定。如图5所示,rGCD被细胞以高水平摄取。图5A显示与甘露聚糖浓度相关的被细胞摄取的本发明rGCD。
图5A表示在与CerezymeTM(该制剂仅通过上述第一和第三阶段的纯化过程制备成80%纯度)相当水平上的摄取。
图5B和5C表示以比CerezymeTM高的水平摄取rGCD,该制剂通过上述所有三个阶段的纯化过程制备成95%的纯度。
至于图5C,显然4mg/ml甘露聚糖抑制的占总活性的比活百分比,对于本发明的GCD(rGCD或重组人GCD)大于现有的市售产品:GCD(CB-mix1,这是本发明的rGCD)-75%、Cerezyme-65%。此外,如图所示,加入甘露聚糖明显抑制细胞与rGCD的结合。在2mg/ml甘露聚糖的浓度下,抑制rGCD的结合达50%。
这些结果表明,即使没有聚糖结构重塑,由转化的胡萝卜细胞表达和纯化的rhGCD都可通过Man/GlcNAc受体靶向巨噬细胞而被特异性摄取。此外,该重组rhGCD具有酶促活性。
实施例4
毒性试验
按照标准毒性试验方案(Guidance for Industry on Single DoseAcute Toxicity Testing for Pharmaceuticals,Center for Drug Evaluationand Research(药品单剂量急性毒性试验产业指导原则),药品评价和研究中心(Center for Drug Evaluation and Research,CDER)PT 1(61FR43934,1996年8月26日)以及ICH M3(M)药品人临床试验的非临床安全性研究规范CPMP/ICH/286/95修改(Non-clinical Safety Studiesfor the Conduct of Human Clinical Trials for PharmaceuticalsCPMP/ICH/286/95 modification),2000年11月16日),对按照上述纯化方法得到的产物进行了试验。
按下述方法给小鼠注射:初期剂量1.8mg/kg(临床剂量)之后,使用9mg/kg和18mg/kg的剂量。试验组包括6只小鼠(ICR CD-1;3只雄性和3只雌性),接受本发明的rGCD(溶于特征是25mM柠檬酸盐缓冲液、150mM NaCl、0.01%吐温80、5%乙醇的液体载体中),另外6只小鼠只用载体处理作为对照组。然后观察小鼠14天并使之安乐死。
两项毒性研究未显示明显的与治疗有关的不良反应,即使在最高给药剂量下也未观察到大的病理学发现、体重变化和死亡发生。此外,对取自给予临床剂量10倍的高剂量组动物的血样进行了血液学和临床化学测试。所有血液学值和临床化学值都在正常范围内。另外,对高剂量治疗的动物的肝、脾和肾进行了组织病理学检查,没有发现宏观或微观的组织病理学发现。
实施例5
糖基化分析
对存在于按照前述实施例产生的rGCD上的聚糖结构进行了分析。正如下面更详细的描述一样,结果表明大部分聚糖含有末端甘露糖残基及高甘露糖结构。有利的是,发现这种高甘露糖产物具有生物活性,因此对于其活化无需更多的步骤。
采用下述方法确定按照上述实施例产生的重组hGCD的糖基化结构。简单地说,采用水解和GC-MS策略,测定N-聚糖和O-聚糖的单糖键。该方法对糖类与肽的键合类型和糖蛋白的总体单糖组成进行了估算。根据现有技术及各种单糖之间的比率,该方法可表明糖蛋白上聚糖的类型。这一信息对于估计蛋白质上存在的可能的聚糖结构十分重要。
另一方法以N-聚糖群的寡糖分析为特征。进行了FAB-MS和MALDI-TOF MS,用胰蛋白酶和肽N-糖苷酶F(PNGaseF)消化等分量的样品,并使聚糖全甲基化。使用该方法从酶消化的糖蛋白上剥离和分离N联糖类。测定分离聚糖混合物中聚糖群的质量,并根据单糖组成分析将其质量与数据库已知结构进行比较。所提出的结构还基于源生物体的糖基化方式。
另一方法包括在还原消除胰蛋白酶和PNGase F处理的糖肽、脱盐和全甲基化后,对O-聚糖群进行分析。PNGase F不会释放出O-聚糖,因此,保持与肽连接的聚糖很可能是O联聚糖。然后通过还原消除释放出这些聚糖,并分析其质量。
单糖组成分析(有关概述见下文)揭示了植物糖基化特有的己糖、己糖胺和戊糖的特征性分布。GlcNac和甘露糖的比率,表明了特征性N联结构是主要的聚糖群。
对来自上述方法产生的hGCD的N-聚糖质谱分析,表明了主要的N-聚糖群具有单糖组成Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2。
材料与方法
利用气相层析-质谱法(GC-MS)、快速原子轰击-质谱法(FAB-MS)和延迟引出-基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(DE-MALDI-TOF MS)联用,进行了分析。
对于寡糖分析,在用胰蛋白酶和肽N-糖苷酶F(PNGaseF)消化等分量的样品并使聚糖全甲基化之后,用FAB-MS和MALDI-TOF MS对N-聚糖群进行了分析。在还原消除胰蛋白酶和PNGase F处理的糖肽、脱盐和全甲基化后,对O-聚糖群进行了分析。
采用水解、衍生化GC-MS策略,对N-聚糖和O-聚糖两者的单糖键进行了测定。
实验描述
样品
如下给所接收的样品小瓶编上唯一编号(表1):
表1
产品 | 参考号 |
葡糖脑苷脂酶。4只管每管装有1ml样品,标示浓度为0.8mg/ml,溶于25mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0),0.01%吐温80 | 62995629966299762998 |
样品保存在-10℃和-30℃之间备用。
蛋白质化学
完整样品的透析
将1个小瓶(装有1ml标示浓度为0.8mg/ml的蛋白质)注入Slide-A-Lyzer透析盒(10kDa截留分子量),在4℃下在水中透析24小时,换水3次。在透析之后,从盒中取出样品后冻干。
胰蛋白酶消化的完整样品用于寡糖筛选
按照SOP B001和SOP B003,将经透析的冻干样品重新悬浮于50mM碳酸氢铵缓冲液中,用10%氨水调整至pH 8.4,用TPCK处理的胰蛋白酶在37℃下消化4小时。放在95℃加热块上2分钟终止反应后冻干。
糖化学
肽N-糖苷酶A消化
胰蛋白酶裂解的糖蛋白样品的肽/糖肽混合物用酶肽N-糖苷酶A(PNGaseA)在乙酸铵缓冲液(pH 5.5)中于37℃处理15小时。通过冷冻干燥停止反应。所得产物使用C18Sep-Pak柱体纯化。
还原消除
将含有可能的O联糖肽的Sep-Pak流分溶于10mg/ml硼氢化钠的0.05M氢氧化钠溶液,在45℃下孵育16小时。加入冰醋酸终止反应。
还原消除产物的脱盐
按照SOP B022,使用Dowex小珠粒进行脱盐。将样品加载到柱上,用4ml 5%乙酸水溶液洗脱。将所收集的流分冻干。
释出糖的全甲基化
用5%乙酸水溶液洗脱的N联糖Sep-Pak流分以及通过还原消除释放的可能的O联聚糖,采用氢氧化钠(NaOH)/甲基碘(MeI)方法(SOPB018)全甲基化。通过FAB-MS和MALDI-TOF MS对一部分全甲基化N联聚糖混合物进行分析,剩余的进行连接分析。
N联糖的连接分析
衍生化
将胰蛋白酶和PNGase A消化或还原消除后获得的全甲基化聚糖样品混合物水解(2M TFA,120℃下2小时)并还原(硼氘化钠(NaBD4)的2M NH4OH溶液,室温下2小时,SOP B025)。通过3次加入甲醇含于冰醋酸的混合物(90∶10),除去分解硼氘化物所产生的硼酸盐后冻干。样品然后用乙酸酐(100℃下1小时)乙酰化。通过萃取到氯仿中将乙酰化样品纯化。然后用气相层析/质谱法(GC/MS)对部分甲基化糖醇乙酸酯(alditol acetate)进行分析。部分甲基化糖醇乙酸酯的标准混合物和空白对照也在相同条件下进行分析。
气液层析法/质谱法(GC/MS)
在下列条件下,采用Perkin Elmer Turbomass Gold质谱仪与Autosystem XL气相色谱仪和Dell数据系统,通过GC/MS对溶于己烷的等分量(1μl)的衍生化糖样品进行分析:
气相层析
柱: DB5
注射: 柱上
注射器温度: 40℃
程序: 40℃下1分钟,然后70℃/分钟至100℃,保持在100℃1分钟,然后8℃/分钟至290℃,最终保持在290℃5分钟。
载气: 氦
质谱法
电离电压:70eV
获取模式:扫描
质量范围:35-450道尔顿
MS分辨率:单位
完整葡糖脑苷脂酶的糖分析
衍生化
将相当于500μg葡糖脑苷脂酶的等分量与10μg阿糖醇作为内标一起冻干。然后使之在80℃下进行甲醇分解过夜后,在氮气下干燥。按照SOP B023,使用甲醇、吡啶和乙酸酐的溶液,使释放出的单糖再次N-乙酰化,再次在氮气下干燥后,转化成其三甲基甲硅烷基(TMS)衍生物。TMS衍生物在氮气下减少体积,溶于2ml己烷后,超声处理3分钟。然后将样品在4℃下平衡过夜。平行制备含有10μg阿糖醇的空白对照以及含有岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基神经氨酸和阿糖醇各10μg的标准单糖混合物。然后用气相层析/质谱法(GC/MS)对TMS衍生物进行了分析。
气液层析/质谱法
(GC/MS)
在下列条件下,采用Perkin Elmer Turbomass Gold质谱仪与Autosystem XL气相色谱仪和Dell数据系统,通过GC/MS对溶于己烷的等分量(1μl)的衍生化糖样品进行了分析:
气相层析
柱: DB5
注射: 柱上
注射器温度: 40℃
程序: 90℃下1分钟,然后25℃/分钟至140℃,5℃/分钟至220℃,最终10℃/分钟至300℃,并保持在300℃5分钟。
载气: 氦
质谱法
电离电压:70eV
获取模式:扫描
质量范围:50-620道尔顿
MS分辨率:单位
延迟引出-基质辅助激光解吸电离质谱法(DE-MALDI-MS)和快速
原子轰击-质谱法(FAB-MS)
采用Voyager STR Biospectrometry Research Station激光解吸质谱仪与延迟引出(DE)联用,进行MALDI-TOF质谱法分析。
将干的全甲基化聚糖溶于甲醇∶水(80∶20),使用2,5-二羟基苯甲酸的基质进行分析。缓激肽、血管紧张素和ACTH用作外标。
阳离子快速原子轰击质谱分析在M-Scan′s VG AutoSpecE质谱仪上进行,对于完全灵敏度的4500质量范围,在Vacc=8kV下操作,分辨率约为2500。使用铯离子枪在30kV操作以产生光谱。应用Opus软件,用VAX数据系统3100M76记录光谱。
将干的全甲基化聚糖溶于甲醇,并加到之前用2-4μl硫代甘油作为基质涂片的屏极上后插入源(source)中。
在第二组糖基化分析中,采用类似方法确定糖基化模式,并鉴定出由本发明胡萝卜细胞悬浮培养物产生的主要的糖基化产物。
由国家生物工程学学院糖生物学中心(Glycobiology Center of theNational Institute for Biotechnology(Ben Gurion University,BeerSheba,Israel))用各种外切糖苷酶依次消化,对糖基化模式进行分析以确定聚糖结构和相对含量。将本发明的植物GCD样品在SDS-PAGE上电泳,切取61KDa条带,与PNGase A孵育,或者依次与胰蛋白酶与PNGase A孵育以释放出N联聚糖。用氨基苯甲酰胺(anthranilamide)(2AB)对聚糖进行荧光标记,并用正相HPLC过柱。
通过依次用各种外切糖苷酶消化,接着进行HPLC分析,获得标记的聚糖库的顺序。将各聚糖的保留时间与给出葡萄糖单元(GU)梯的葡聚糖标准部分水解物的保留时间进行了比较。将未标记的聚糖进行进一步纯化,并通过MALDI质谱法进行分析。所用外切糖苷酶:牛肾(Bovine kidney)_-岩藻糖苷酶(消化_1-6和_1-3核心岩藻糖,Prozyme)、矮刀豆(Jack bean)甘露糖苷酶(消除_1-2,6>3甘露糖,Prozyme)、黄单胞菌属β1,2-木糖苷酶(仅在除去_-联甘露糖后消除_1-2木糖,Calbiochem)。
牛睾丸-半乳糖苷酶(水解非还原末端半乳糖_1-3和_1-4键,Prozyme)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)氨基己糖苷酶(消化_1-2,3,4,6GalNAc和GlcNAc,Prozyme)。采用气相层析质谱法(GC-MS)、快速原子轰击-质谱法(FAB-MS)和延迟引出-基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法(DE-MALDI-TOF MS),通过M-Scan(Berkshire,England)对糖基化进行了进一步的分析。对于寡糖测定,样品在用胰蛋白酶和PNGase A消化并使聚糖全甲基化后,通过FAB-MS和MALDI-TOF MS对N-聚糖群进行了分析。在还原消除胰蛋白酶和PNGase A处理的糖肽、脱盐和全甲基化之后,对O-聚糖进行了分析。
为了证实prGCD批次之间的一致性,在用胰蛋白酶和PNGase A消化之后,通过高效阴离子交换层析法与脉冲安培检测法(HPAEC-PAD,Dionex方法)对不同批次prGCD的N-聚糖的相似性进行了分析,得到从糖蛋白中释放出的寡糖的层析图谱。该方法允许以定性和定量的方式对寡糖模式进行层析法比较。
结果与讨论
葡糖脑苷脂酶的TMS糖分析
N联寡糖筛选
完整糖蛋白进行透析后,进行胰蛋白酶消化,冻干产物使用PNGase A消化,然后采用C18Sep-Pak纯化。使5%乙酸水溶液(含N联寡糖)流分全甲基化,用片段离子的低质量范围中的一部分衍生化寡糖获得FAB质谱,用分子离子的高质量范围中的一部分衍生化寡糖,获得DE-MALDI-TOF质谱。
得自葡糖脑苷脂酶的N-聚糖的分析
表1列出存在于FAB谱的主要片段离子和存在于MALDI谱的分子离子。分子离子区(附录III中所示)含有主要信号m/z 1505.8(对于具有组成Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2的结构,与[M+Na]+准分子离子一致)。还检测到与复杂的高甘露糖结构一致的多种强度较低准分子离子。检出的高甘露糖结构的范围大小自Hex5.HexNAc2的m/z1579.8到Hex8.HexNAc2的m/z 2193.0。由不太广泛加工的N-聚糖例如m/z 1331.7(对于具有组成Pent.Hex3.HexNAc2的结构,与[M+Na]+准分子离子一致)或者以下较大的N-聚糖产生综合信号(complexsignal):例如m/z 1751.0(对于具有组成Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc3的结构,与[M+Na]+准分子离子一致)、m/z 2375.4(对于具有组成Pent.deoxyHex2.Hex4.HexNAc4的结构,与[M+Na]+准分子离子一致)和m/z 2753.6(对于具有组成Pent.deoxyHex3.Hex5.HexNAc4的结构,与[M+Na]+准分子离子一致)。
FAB质谱通过质谱低质量区的片段离子提供有关天线结构的信息(未显示数据)。检测所述信号,将己糖(m/z 219处)和HexNAc(m/z260处)鉴定为N-聚糖中非还原末端的单糖。
表2:胰蛋白酶和肽N-糖苷酶A消化后全甲基化葡糖脑苷脂酶(参考号62996)光谱中观察到的质量
所观察到的信号(m/z) | 可能的排布 |
低质量 | |
219 | Hex+ |
228 | HexNAc+(-甲醇) |
260 | HexNAc+ |
高质量 | |
1032.4 | Pent.Hex3.HexNAc+ |
1171.5 | Hex3.HexNAc2OMe+Na+ |
1299.6 | 由m/z 1505.8消除岩藻糖 |
1331.6 | Pent.Hex3.HexNAc2OMe+Na+ |
1345.6 | deoxyHex.Hex3.HexNAc2OMe+Na+ |
1505.7 | Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2OMe+Na+ |
1579.8 | Hex5.HexNAc2OMe+Na+ |
1709.9 | Pent.deoxyHex.Hex4.HexNAc2OMe+Na+ |
1750.9 | Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc3OMe+Na+ |
1783.9 | Hex6.HexNAc2OMe+Na+ |
1989.0 | Hex7.HexNAc2OMe+Na+ |
1997.0 | Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc4OMe+Na+ |
2027.0 | 未确定排布 |
2099.0 | 未确定排布 |
2130.0 | Pent.deoxyHex2.Hex4.HexNAc3OMe+Na+ |
2193.1 | Hex8.HexNAc2OMe+Na+ |
2375.2 | Pent.deoxyHex2.Hex4.HexNAc4OMe+Na+ |
所观察到的信号(m/z) | 可能的排布 |
2753.4 | Pent.deoxyHex3.Hex5.HexNAc4OMe+Na+ |
一号柱的所有质量都均为单同位素的,除非另有说明。质量数可能不与原始数据直接有关,因为该软件常常为13C同位素峰,特别是1700Da以上的质量的13C同位素峰赋予质量数。
得自葡糖脑苷脂酶的N-聚糖的连接分析
在PNGase A消化、Sep-Pak纯化和全甲基化之后,对释出的N联糖类进行了连接分析。
由一些来自衍生化试剂的含杂质峰获得综合层析图。将保留时间和光谱与标准混合物进行比较,以供表3中所列含有糖的峰的临时排布。
表3:胰蛋白酶和肽N-糖苷酶A消化后葡糖脑苷脂酶(参考号62996)的GC-MS分析中测出作为其部分甲基化糖醇乙酸酯的不同联接单糖的保留时间
所观察的化合物 | 葡糖脑苷脂酶(62996)的保留时间(分钟) |
末端木糖 | 10.41 |
末端岩藻糖 | 10.84 |
末端甘露糖 | 12.29(主要) |
末端半乳糖 | 12.55 |
2-联甘露糖 | 13.40 |
4-联葡萄糖 | 13.58 |
2,6-联甘露糖 | 14.91 |
3,6-联甘露糖 | 15.08 |
2,3,6-联甘露糖 | 15.87 |
4-联GlcNAc | 16.73 |
3,4-联GlcNAc | 17.59 |
4.3O联寡糖筛选
在胰蛋白酶和PNGase A消化之后,对来自葡糖脑苷脂酶Sep-Pak纯化的60%2-丙醇流分(可能的O联糖肽流分)进行还原消除。终止反应后使样品脱盐,并在除去硼酸后,使样品全甲基化。使用片段离子的低质量范围中的一部分衍生化寡糖得到FAB质谱,使用分子离子的高质量范围中的一部分衍生化寡糖得到DE-MALDI-TOF质谱。未观察到与存在O联聚糖一致的信号(未显示数据)。
来自葡糖脑苷脂酶的O-聚糖的连接分析
连接分析在全甲基化后还原消除的产物上进行。未观察到与典型O联聚糖存在一致的信号(未显示数据)。
图6表示一些示例性聚糖结构,作为得自CHO(中国仓鼠卵巢)细胞(为哺乳动物细胞)的GCD(CerezymeTM)与得自本发明的胡萝卜细胞GCD的比较。如图所示,这些结构的重塑需要得到由于CerezymeTM而暴露的甘露糖残基。相比之下,对于得自本发明的植物细胞的GCD,这类暴露出来的甘露糖残基可直接获得,无需例如用糖基化酶进一步操作。
图7表示存在于rGCD中的主要聚糖结构。图7表示以下的拟定结构:a)胡萝卜细胞悬液中表达的hGC上发现的主要寡糖群(1505.7m/z);b)典型的N联核心;c)岩藻糖化的植物N联核心。N联聚糖通过天冬酰胺以及通过图右侧GlcNac残基上的还原末端(GN)与蛋白质偶联。植物N糖基化模式,岩藻糖残基可以是核心结构的组成部分,用α(1-3)糖苷键与第一GlcNac结合,而哺乳动物结构通常采用α(1-6)糖苷键。
图8A-8D表示所有本发明rGCD蛋白上检出的N-聚糖的可能结构。
鉴定出的主要聚糖结构是核心聚糖结构,存在于豌豆、水稻、玉米和其它食用植物等大多数植物糖蛋白中。该结构含有核心木糖残基以及核心α-(1,3)-岩藻糖。Bardor等人所做的研究(33)表明50%的非变应性血液捐献者(nonallergic blood donor)在他们的血清中具有核心木糖特异性抗体,25%具有抗核心α-(1,3)-岩藻糖特异性抗体。然而还是对这类抗体是否会引起植物衍生的生物制药糖蛋白的使用受限制进行了研究。
上述方法产生的hGCD的次要聚糖群主要是高甘露糖结构Hex4HexNAc2至Hex8HexNAc2。在所显示的复杂结构中,检出较少比例的例如Pent.deoxyHex2.Hex4.HexNAc3和Pent.deoxyHex3.Hex5.HexNAc3.Pent.Hex3.HexNAc2的结构。
主要的末端单糖是己糖(甘露糖或半乳糖)和N-乙酰基己糖胺,这与高甘露糖结构和部分加工的复杂结构的存在一致。
至于O联寡糖筛选,未观察到与典型的O联聚糖一致的信号。本领域已知GCD不具有O联寡糖,使得这些结果与得自包括天然GCD和在哺乳动物培养物系统中产生的重组GCD在内的其它细胞系统的GCD的已知糖基化一致。然而,单糖组成中,未检测到与阿拉伯糖一致的信号。
有关本发明的一个重点在于,hGCD蛋白N-聚糖组成分析表明大部分的N-聚糖终止于甘露糖残基。这符合对以甘露糖结尾的N-聚糖的需要,该聚糖有助于通过巨噬细胞甘露糖受体摄取治疗性hGCD。然而,在哺乳动物细胞中产生的天然GCD和重组GCD都不是高甘露糖。因此,本发明克服了商业化生产hGCD蛋白的重大缺点,原因在于这种蛋白是被修饰而终止于甘露糖的,与上述产生的蛋白质不一样。
对植物细胞中制备的纯化的人重组葡糖脑苷脂酶进行了进一步的糖基化分析。用各种外切糖苷酶依次消化,对糖基化进行了分析(国家生物工程学学院糖生物学中心(Ben Gurion University,Beer Sheba,Israel)以确定聚糖结构和聚糖的定量比率(参见上述方法)。在该分析中,发现N联聚糖具有两个GlcNAc残基和1-4联甘露糖的主要核心,与另外两个甘露糖残基以_1-3和_1-6键连接。存在的另外的残基如图10a中所示,该图表示所有结构及其基于HPLC、酶阵列消化和MALDI的相对含量。图10b显示在体外酶加工之前和之后的聚糖结构。值得注意的是,本发明GCD的聚糖结构分析揭示>90%的聚糖是富含甘露糖的带有暴露出来的末端甘露糖残基(图10a),而在的情况下,甘露糖残基只是在复杂的体外方法之后才暴露出来(图10b)。本发明GCD中的主要聚糖是存在于大多数糖蛋白中的核心结构,该糖蛋白自豌豆、水稻、玉米和其它食用植物中纯化。该结构含有核心_-(1,2)-木糖残基以及核心_-(1,3)-岩藻糖(图10a)。DE-MALDI-MS数据不含有与典型O联聚糖一致的信号。为了评价胡萝卜细胞系统中产生的GCD在批次之间的再现性,对得自不同生产批次的本发明GCD的聚糖图谱进行了进一步的分析。如图11中所示,本发明的植物GCD的聚糖群在批次之间具有高度的再现性。
实施例5a
植物细胞中有生物活性的α-半乳糖苷酶的表达
对人α-半乳糖苷酶A进行了测序和克隆,该酶在X连锁溶酶体贮积病即法布莱病中病变。为了检测能否在植物细胞产生适于治疗性应用的α-半乳糖苷酶A,使包括靶向植物内质网的人α-半乳糖苷酶A编码序列的载体在植物细胞中表达,对植物衍生的重组人α-半乳糖苷酶A的多肽序列、生物活性和聚糖结构进行了评价。
人α-半乳糖苷酶A表达载体:构建了含有人α-半乳糖苷酶A编码序列和用于将翻译的蛋白质靶向植物内质网(ER)分泌系统N端苹果果胶酶前导肽(SEQ ID NO:16-MALKTQLLWSFVVVFVVSFSTTSCSG)的载体。克隆了两个不同的构建体,带有设计成能将翻译的蛋白质保持在特定细胞区室中的不同的C端序列。一个构建体(α-gal-vac,SEQ ID NO:17)含有C端液泡引导信号(DLLVDTM,SEQ ID NO:4),设计成能用于将蛋白质从ER转运到植物液泡保留起来。第二个构建体(α-gal-KDEL,SEQ IDNO:19)缺乏C端液泡引导信号,而含有C端ER保留序列(KDEL,SEQ ID NO:23),设计成能使蛋白质从高尔基体内侧逆转运回ER保留起来(参见Rayon等,Journal of Experimental Botany,第49卷,第326期,第1463-1472页,1998;Evron等,2007FASEB J)。
α-gal-vac克隆:
通过GENEART AG.(Regensburg;Germany)(SEQ ID NO:17)对人α-gal编码序列进行人工合成。α-gal-vac序列包括苹果果胶酶前导序列(SEQ ID NO:16)(MALKTQLLWSFVVVFVVSFSTTSCSG)、成熟α-半乳糖苷酶序列(SEQ ID NO:24)和液泡保留信号(SEQ ID NO:4)。合成的基因周围是限制位点以利于亚克隆。
用NCOI和HindIII把该基因克隆到由ICON genetics(Halle,Germany)开发的载体中,用于在烟草(Nicotiana benthamiana)植物中瞬时表达。
α-gal-KDEL克隆:
为了构建具有C端ER保留信号的克隆,通过加入置换BglII-HindIII片段的磷酸化接头(SEQ ID NO:21和22),用ER保留信号置换液泡信号。磷酸化接头编码ER保留信号,并具有与用酶BglII和HindIII形成的末端相容的黏性末端:
S E K D E L * *
G A T C T T A G T G A G A A G G A C G A G C T C T G A T A A (SEQ ID NO:21)
A A T C A C T C T T C C T G C T C G A G AC T A T T T C G A (SEQ ID NO:22)
Sac I
为了产生α-gal-KDEL构建体,使α-gal-vac构建体(SEQ ID NO:17)用BglII和HindIII消化后,与上述接头连接。通过SacI限制性切割,证实接头的插入。然后将所得构建体克隆到本文所述的ICON载体,用于在烟草中瞬时表达。
烟草中的瞬时表达系统
在这种情况下选择使用植物病毒载体作为转基因植物的替代,便于蛋白质在整株植物中进行快速的高水平瞬时表达。
目标蛋白质由强复制的病毒启动子(例如外被蛋白亚基因组启动子)进行表达。系统依靠通过土壤杆菌属递送到植物的病毒载体瞬时扩增(土壤杆菌感染法)。在土壤杆菌感染法中,植物功能性启动子和RNA病毒cDNA作为T-DNA自土壤杆菌属转移进入植物细胞。T-DNA在植物体内转录产生可启动自我复制的有生物活性的病毒RNA。
这种方法可供各种蛋白质变体快速装配和表达。这种方法不仅是通用的,而且还能在仅仅几天内提供毫克量的蛋白质。
整株植物的转染
在长日照(16小时光照/8小时避光)光照方案(50μE)下,使烟草植物(N.Benthamiana)在补充了颗粒状长效肥(Scott Marysville,OH)的市售混合土壤(Givaat Ada,IL)中在24℃-25℃下萌发和生长。
对于瞬时表达,按照文献所述方法(Gleba等,Vaccine 232042-2048,2005),使用由ICON genetics(Weinbergweg,Germany)开发的三载体重组系统,载体之一被插入α-半乳糖苷酶cDNA,另外两个载体含有构建完整病毒复制子的基因(RdRp和整合酶),因此产生可以起动自我复制的有生物活性的病毒RNA。
应用电穿孔(2500V,5msec)[den Dulk-Ra,A.和Hooykaas,P.J.(1995)Methods Mol.Biol.55:63-72],用含有质粒的α-半乳糖苷酶载体转化土壤杆菌。按本领域已知的标准方法通过真空浸润,用含有3ICON质粒的土壤杆菌浸润植物。简单地说,通过将所有空气中的植物器官浸入细菌悬液中并放在真空室中,将生长5-6周的烟草植物浸润。使用-0.8巴真空1分钟,之后迅速回到大气压。将植物送回温室在相同条件再保持5-7天。
蛋白质纯化:
将烟草叶冷冻后,用研钵和研杵研磨。按1∶1体积重量比,将磨碎叶重新悬浮于含有20mM Tris、20mM EDTA、20mM抗坏血酸、1mM DTT、1mM PMSF(pH 7.2)的提取缓冲液中。此后,使细胞破碎后匀浆。用切刀匀浆器,使悬液进一步匀浆。使细胞悬液通过微流细胞破碎机,将所得制备物离心。弃去沉淀后,上清液用硫酸铵处理后离心。然后将沉淀溶于柠檬酸盐缓冲液(20mM pH 6),将溶液进一步酸化(pH 5.5),离心,过滤(0.45μM)。把滤液加载到疏水相互作用层析柱中,合并洗脱的流分,加载到阳离子交换层析法柱。合并洗脱的流分,分析催化活性。
蛋白质印迹法:
采用多克隆兔抗α-gal A抗体,进行蛋白质印迹法以鉴定来自转化烟草植物的α-半乳糖苷酶分子。
基本上按照本文所述方法进行蛋白质转移。简单地说,从凝胶向硝化纤维转移在4℃下于100伏特进行90分钟。转移之后,印迹用封闭缓冲液(1%奶粉,0.1%吐温20(Sigma目录号P1379)的磷酸盐缓冲液)封闭。然后,通过与抗体孵育,洗涤,与合适的第二抗体(Jackson-Labs HRP缀合的山羊抗兔Ab)反应,对印迹进行免疫检测。然后用ECL显影剂(Amersham RPN 2209)对印迹进行显影,并放射自显影用于显现。
α-半乳糖苷酶酶活性的测定:
对浓度范围为200-12.5ng/ml的市售α-半乳糖苷酶法布瑞酶(Genzyme,Cambridge,Mass)的活性绘制标准曲线,根据标准曲线求出植物α-半乳糖苷酶A的活性水平。使用对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(Sigma)作为水解底物,测定活性。测定缓冲液含有20mM柠檬酸、30mM磷酸钠、0.1%BSA和0.67%乙醇(pH 4.6)。实验在96孔ELISA板(Greiner#655061,96W)中进行,将50微升样品与150微升测定缓冲液一起孵育,加入30微升底物至终浓度8mM。将反应混合物在37℃下孵育90分钟,结果对标准结果作图。通过405nm下的吸光度检测产物(对硝基苯基;pNP)形成。在t=0和在终点时监测405nm下的吸光度。90分钟后,将100微升1.98M碳酸钠加到各孔中,再次监测405nm下的吸光度。
动力学研究:
为了求出Km,使对硝基苯基pNP(Sigma)的浓度在1000μM至45000μM的范围内变化。使含有25ng/mL α-半乳糖苷酶和不同浓度的底物的反应混合物在37℃下反应85-105分钟的时段。反应样品用饱和碳酸钠猝灭,在430nm下检测对硝基苯酚产物的吸光度。
生化分析
来自PAGE的蛋白质条带的胰蛋白酶消化由Smoler蛋白质组学中心(Smoler Proteomics Center)(Technion,Haifa,IL)进行。简单地说,用干净的剃须刀片切取凝胶中经染色的蛋白质条带,凝胶中的蛋白质用10mM DTT还原后,用100mM碘乙酰胺的10mM碳酸氢铵溶液修饰。凝胶切段用50%乙腈的10mM碳酸氢铵溶液处理以将蛋白质脱色后,将凝胶切段干燥。干燥的凝胶切段用含有约0.1μg胰蛋白酶/样品的10%乙腈的10mM碳酸氢铵溶液再水化。使凝胶切段在37℃下孵育过夜后,所得肽用含0.1%三氟乙酸盐的60%乙腈回收。
胰蛋白酶消化的肽段用反相层析法分离(用多孔R2(Persepective)自行充填的0.1X 300-mm熔融硅胶毛细管(J&W,内径100微米))。以1μl/分钟的流速,用含0.1%乙酸水溶液的线性梯度5-95%乙腈洗脱肽段80分钟。将过柱的液体电喷雾到离子阱质谱仪(LTQ Orbitrap,Waltham,MA)。以阳离子方式采用重复性完全MS扫描,接着通过选自第一次MS扫描最主要离子的碰撞诱导解离(CID)来进行质谱法分析。应用Sequest软件[J.Eng and J.Yates,University of Washingtonand Finnegan,San Jose],将质谱法数据与NR-NCBI数据库中模拟蛋白酶解和蛋白质的CID进行比较。
按照产品说明书,在肽测序仪494A(Perkin Elmer)上对蛋白质氨基端进行测序。MALDI-TOF:
按照本领域已知方法,采用MALDI TOF TOF 4700(AppliedBiosystems),在Smoler蛋白质组学中心(Technion,Haifa,IL)进行了MALDI-TOF质谱法。
凝胶过滤:
凝胶过滤层析法以大小为基础对蛋白质进行分离。分子通过多孔小珠粒移动,扩散到小珠粒中,较小的分子进一步扩散到小珠粒的微孔中,因此较慢地通过该空间移动,而较大的分子较少进入或完全不进入,因此较快地通过该空间移动。分子量和三维形状都能影响保留程度。将植物α-半乳糖苷酶样品重新悬浮于分析缓冲液(50mM磷酸钠,(pH=6.0)),按流速0.5ml/分钟,将100μg样品加载到柱(-TSK Gel-2000,Tosoh Bioscience,San Francisco,CA)上。
成纤维细胞的α-半乳糖苷酶摄取:
对得自法布莱病患者的人成纤维细胞(分类编号GM02775Cornell Institute)进行了α-半乳糖苷酶的寻靶和摄取试验。将成纤维细胞在补充了12%FBS、5ml L-谷氨酰胺、5ml MEM Eagle维生素溶液、10ml MEM氨基酸溶液、5ml MEM Eagle非必需氨基酸溶液和5mlPen-Strep溶液的DMEM培养基(目录号D5546,Sigma)中培养,所有补充成分都得自Biological Indusries(Beit Haemek,IL)。使细胞与300μg/ml植物α-半乳糖苷酶A一起在补充了12%FBS的PBS中孵育4小时,然后洗涤并裂解(20mM磷酸盐缓冲液(pH 6.8)、0.1%曲通+蛋白酶抑制剂混合物(Sigma P-2714),通过两次冻融循环)。将20μl样品加载到12%SDS凝胶上,通过蛋白质印迹法进行分析(见上文)。
SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)主要通过分子量对蛋白质进行分离。另外,该技术提供有关蛋白质纯度和组成的大量信息。按照标准凝胶分离方案,采用考马斯亮蓝染色,通过SDS-PAGE分析对由烟草植物产生的α-半乳糖苷酶的分子量特性和蛋白质杂质模式进行了研究。简言之,SDS凝胶由层积胶(3%)和分离胶(12%)组成。电泳缓冲液为Tris/SDS(pH 8.3),加样缓冲液为甘油-Tris-巯基乙醇(pH 6.8)。
结果:
图13A和图13B表示通过本发明方法用凝胶过滤(图13A)和质谱法(图13B)对在烟草植物表达和产生的植物衍生的重组α-半乳糖苷酶分子量的表征。质谱图显示植物表达的α-半乳糖苷酶的分子量估计值由48-52KDa范围的若干群组成。由于αGal是非共价二聚体,所以MALDI-TOF的能量引起二聚体解离为单体。该分子量反映了贡献出46.3kDa的407个氨基酸,以及用以保持分子量的聚糖结构的加入。质谱法证实蛋白质为48.6kDa,这些结果恰好在天然人α-半乳糖苷酶(约51kDa)分子量的范围内。凝胶过滤标准曲线显示对应于植物α-半乳糖苷酶主峰保留时间(18.41分钟)的分子量为76.56kDa,这表示是二聚体。按照标准曲线在20.403分钟处的非常小的峰相当于单体(43.27kDa)。由于凝胶过滤分析在温和条件下进行,所以能够观察到蛋白质的二聚体形式。
经PAGE分析对重组α-半乳糖苷酶进行的解析显示出两条主带(图14A),表明成熟重组酶的糖基化中的差异。对PAGE的分离条带进行测序,表明情况的确如此,因为可供测序的多肽区(即未被聚糖掩蔽),虽然没有相同地位于两条带上,但是在重叠处显示出100%同一性(参见图14B,红色测序部分)。图14B(下条带)显示序列完全相同的去糖基化α-半乳糖苷酶[使用PNGase F(Sigma)进行去糖基化]。红色序列表明之前鉴定的序列。绿色序列表明在脱去聚糖后可用于测序的序列。黑色序列表明尚未鉴定出的序列。天然糖基化位点用黄色来突出表示。用抗KDEL抗体(Santa Cruz,CA)证实了C端KDEL。总之,这些结果表明本发明方法表达的α-半乳糖苷酶蛋白质与预期的克隆序列相同。
植物表达的人重组α-半乳糖苷酶与天然重组α-半乳糖苷酶的抗原性相同:
通过对蛋白质印迹上植物表达的α-半乳糖苷酶的免疫检测,对本发明构建体在植物重组系统中精确表达人溶酶体酶的适宜性提供了进一验证。图15表示得自α-gal-vac(泳道“vac”)和α-gal-KDEL(泳道“KDEL”)构建体在烟草植物中表达的多肽包括用兔多克隆抗体检测出的流分,该抗体是针对天然人α-半乳糖苷酶氨基酸326和429间所表示的多肽片段产生的。用GFP(泳道“GFP”)转化的对照植物,无法产生任何免疫反应性条带。
重组α-半乳糖苷酶的动力学分析:
为了评价植物表达的人重组α-半乳糖苷酶的适宜性,对得自烟草植物的纯化的重组α-半乳糖苷酶进行了动力学分析,并求出Km和Vmax值。图16A和图16B表示与市售重组人α-半乳糖苷酶(黑色标记)和(蓝色标记)相比,重组α-半乳糖苷酶(红色标记)的动力学特征。Km和Vmax的计算值表明靶向ER并在ER中表达的本发明的重组α-半乳糖苷酶具有与市售酶十分相似的Km和Vmax参数,其中比起具有较高的Vmax和较低的Km,比起具有较大的Vmax和略高的Km,这就表明在植物中可精确表达和加工多肽,并具有适于临床应用的催化活性。
在大温度范围内植物表达的重组人α-半乳糖苷酶保持稳定:
为了进一步评价按照本发明的一个实施方案从植物中表达和纯化的重组人α-半乳糖苷酶,对一定温度范围(4℃-37℃)内多肽的稳定性进行了测定。图17A和图17B显示,植物表达的重组人α-半乳糖苷酶(植物a-Gal)的电泳迁移率未发生任何改变,在所测试的所有温度下,即使不比市售的得自哺乳动物细胞的重组α-半乳糖苷酶更稳定,也与之一样稳定。不论是在活性缓冲液(图17A)还是在细胞培养基缓冲液(图17B)中孵育,重组α-半乳糖苷酶的稳定性都是显而易见的。
人成纤维细胞主动摄入植物表达的重组α-半乳糖苷酶:
为了确定烟草中产生的重组α-半乳糖苷酶是否可被靶细胞摄取,从而可用来治疗法布莱病,对重组人α-半乳糖苷酶与成纤维细胞的结合能力以及被成纤维细胞摄取的能力进行了实验。如图18所示,重组α-半乳糖苷酶被细胞摄取(泳道“植物αGalA”表示取自成纤维细胞裂解物20μl样品中的αGal与作为标准的20ng市售重组αGal(Replagal,右起第一泳道)一起电泳的免疫检测)。之间为分子量标记梯。
这些结果表明,即使没有聚糖结构重塑,自转化的烟草植物表达和纯化的重组α-半乳糖苷酶可经过摄取以靶向α-半乳糖苷酶缺陷型成纤维细胞。此外,重组α-半乳糖苷酶具有酶促活性。
植物表达的重组人α-半乳糖苷酶的聚糖图谱:
对按照前述实施例中所述方法产生的人α-半乳糖苷酶中存在的聚糖结构进行了分析。正如下面更为详细的描述,结果表明大部分聚糖含有末端甘露糖残基以及高甘露糖结构。有利的是,发现这种高甘露糖产物具有生物活性,因此其活化无需更多的步骤。
在胰蛋白酶消化,聚糖用荧光标记,以及用外切糖苷酶BKF、JBM、XYL和JBH依次消化,接着HPLC之后,在对鉴定为人α-半乳糖苷酶的PAGE分离的条带进行测序时,便可辨别糖基化的特征模式(图19,87分钟)。具有暴露出来的甘露糖的聚糖结构占优势。
单糖组成分析(参见图19)显示植物糖基化特有的己糖、己糖胺和戊糖分布。GlcNac和甘露糖之比表明特征性N联结构是主要的聚糖群。
实施例6
本发明的治疗
根据本发明产生的重组蛋白优选包含由植物细胞培养物产生的适当糖基化的蛋白质,例如,该蛋白质优选为溶酶体酶和/或高甘露糖糖基化蛋白。
根据本文优选的实施方案,根据本发明产生的蛋白质适于治疗溶酶体酶相关疾病,例如溶酶体贮积病等。
治疗方法任选和优选包括:(a)提供生物活性形式的重组溶酶体酶,该溶酶体酶由转化的植物根细胞纯化,能够有效靶向异常缺乏溶酶体酶的细胞。该有生物活性的重组酶在其附带的寡糖上具有暴露出来的末端甘露糖残基;(b)给予受治疗者有效量的有生物活性的重组溶酶体酶或包含所述重组溶酶体酶的组合物。在一个优选的实施方案中,本发明方法所采用的重组高甘露糖溶酶体酶可由本发明的宿主细胞产生。宿主细胞优选为胡萝卜细胞。
所谓“哺乳动物受治疗者”或“哺乳动物患者”是指需要基因疗法的任何哺乳动物,包括人、牛、马、犬和猫受治疗者,最优选为人受治疗者。
应当注意的是,术语“治疗”也包括改善或减轻病理病症和/或其一种或多种症状、治疗这类病症或者预防这类病症的发生。
在另一个优选的实施方案中,本发明方法所采用的溶酶体酶可为高甘露糖酶,该高甘露糖酶包含至少一条具有暴露出来的甘露糖残基的寡糖链。该重组酶可在受治疗者体内的靶部位与靶细胞上的甘露糖受体结合。更优选与天然存在的靶细胞溶酶体酶相应的亲和力相比,该重组溶酶体酶对这些靶细胞的亲和力提高。因此,各剂量取决于靶向异常缺乏GCD的细胞的有效性,这中形式的GCD的各个剂量基本上小于另以类似方式给予以达到治疗效果的天然存在的GCD的剂量。
根据本发明优选的实施方案,该蛋白质适于治疗溶酶体贮积病,使得本发明还包括用于治疗这类疾病的方法。溶酶体贮积病是一组超过40种病症的疾病,该病是分解细胞溶酶体内糖脂或多糖废弃物的酶的编码基因发生缺陷的结果。酶解产物,例如糖和脂质然后经重新循环成为新的产物。这些病症的每一种是由影响溶酶体中酶水平的遗传性常染色体或X连锁隐性性状导致的。在受累个体的细胞和组织中,受影响的酶一般没有生物或功能活性。在这类疾病中,酶功能的缺乏造成体内细胞溶酶体内脂质或糖底物逐步系统性沉积,最终引起器官机能丧失和死亡。Scriver等人详细描述了溶酶体贮积病的遗传病因、临床表现、分子生物学和可能性[Scriver等主编,The Metabolic andMolecular Basis of Inherited Disease,第7版,第II卷,McGraw Hill,(1995)]。
溶酶体贮积病(及其相关的缺陷型酶)的实例包括但不限于法布莱病(α-半乳糖苷酶)、法伯病(Farber disease)(神经酰胺酶)、戈谢病(葡糖脑苷脂酶)、Gml神经节苷脂沉积症(β-半乳糖苷酶)、泰-萨病(Tay-Sachs disease)(β-氨基己糖苷酶)、尼曼-皮克病(Niemann-Pickdisease)(鞘磷脂酶)、Schindler病(α-N-乙酰半乳糖苷酶)、亨特综合征(Hunter syndrome)(艾杜糖醛酸-2硫酸酯酶)、斯赖综合征(Slysyndrome)(β-葡糖醛酸糖苷酶)、胡尔勒综合征与胡尔勒-沙伊综合征(Hurler and Hurler/Scheie syndrome)(艾杜糖苷酸酶)以及I-细胞/桑菲利波综合征(San Filipo syndrome)(甘露糖6-磷酸转运蛋白(transporter))。
戈谢病是最常见的人的溶酶体贮积病,德系犹太人群中发病的频率最高。美国有大约5,000-10,000人患有此病[Grabowski,Adv.Hum.Genet.21:377-441(1993)]。戈谢病由葡糖脑苷脂酶(hGCD;葡糖神经酰胺酶)缺乏引起。这种缺乏导致酶底物葡糖脑苷脂在骨髓、脾和肝的网状内皮细胞内积累,引起明显的骨骼并发症例如骨髓膨胀(bonemarrow expansion)和骨退化,以及脾功能亢进、肝肿大、血小板减少、贫血和肺部并发症[Grabowski(1993),出处同上;Lee,Prog.Clin.Biol.Res.95:177-217(1982)]。
更具体而言,本发明方法所采用的溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。优选如果受治医病是戈谢病,则本发明方法所采用的溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
本发明的蛋白质可用来生产药物组合物。因此,根据本发明另一个方面,提供包括作为其活性成分的蛋白质和药学上可接受的载体的药物组合物。本文所用“药物组合物”是指一种或多种本文所述活性成分(例如重组蛋白)与其它化学组分(例如传统药物)、生理上适宜的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是便于将蛋白质或细胞给予生物体。可通过本领域众所周知的方法,例如通过常规混合、溶解、制粒、制锭剂、磨细、乳化、包囊、包埋或冻干工序,来制备本发明的药物组合物。
在一个优选的实施方案中,术语“药学上可接受的”是指经过联邦政府或州政府管理机构批准或者在美国药典或其它普遍公认的药典中列出以用于动物,更特别用于人。下文中,术语“生理上适宜的载体”和“药学上可接受的载体”可互换使用,是指经批准的载体或稀释剂不会对生物造成严重刺激,不削弱生物活性和所给予的缀合物的性质。
术语“载体”是指与治疗药一同给予的稀释剂、辅助剂、赋形剂或载体。这类药用载体可为水和油等无菌液体,包括石油、动物、植物或合成来源,例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内给予药物组合物时,水是优选的载体。盐溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体,特别是用于注射溶液。合适药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。需要时,组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可呈溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。组合物可用传统的粘合剂和载体(例如甘油三酯)配成栓剂。口服剂型可包括标准载体,例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药用载体的实例参见E.W.Martin的“Remington′s PharmaceuticalSciences”。这类组合物可含有治疗有效量的蛋白质(优选为纯化形式)以及适量的载体,使得能提供用于适于给予患者的形式。剂型应适合于给药方式。
本文术语“赋形剂”是指加到药物组合物中以更利于活性成分加工和给药的惰性物质。赋形剂的实例包括而不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
活性成分的制备和给药的更多技术可参见“Remington’sPharmaceutical Sciences”,Mack Publishing Co.,Easton,PA,最新版本,该文献通过引用结合到本文中如同全部陈述于此一样。
本文所述的药物组合物还可包含合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。这类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。
合适的给药途径可包括例如口服、直肠、经黏膜、经皮、经肠或胃肠外递送,包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
用于本发明的药物组合物因此可以常规方式使用一种或多种药学上可接受的载体配制,所述载体包含可以用于制药的有利于将活性成分加工成制剂的赋形剂和助剂。合适的剂型取决于所选择的给药途径。
对于注射,本发明的活性成分可以在水溶液中制备,优选在生理上相容的缓冲液例如Hank溶液、林格氏液(Ringer’s solution)或生理盐水缓冲液中制备。对经黏膜给药,剂型中可使用渗透剂。这类渗透剂是本领域普通已知的。
对于口服给药,活性成分可任选配制成能通过给予产生本发明蛋白质(例如GCD或α-半乳糖苷酶等)的完整细胞的形式。活性成分还可通过将活性成分和/或细胞与本领域众所周知的药学上可接受的载体相混合来配制。这类载体能够使本发明的活性成分配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等,用于患者口服服用。口服使用的药物制剂可用固体赋形剂制备,任选研磨所得混合物,加工成颗粒混合物,如有需要在加入合适助剂后,得到片剂或锭剂芯。合适赋形剂特别为填充剂,例如糖,包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇;纤维素制剂,例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠;和/或生理上可接受的聚合物,例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如有需要,可加入崩解剂,例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐,例如藻酸盐。
锭剂芯与合适的包衣一起提供。为此,可使用浓糖溶液,其中可任选含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、清漆溶液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加到片剂或锭剂包衣中用于区分或表征不同组合的活性成分剂量。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合胶囊剂以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊剂。推入配合胶囊剂可含有活性成分以及与之混合的填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)、润滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁),任选稳定剂。在软胶囊剂中,活性成分可溶于或悬浮于合适液体中,例如脂肪油、液状石腊或液体聚乙二醇。另外,可加入稳定剂。口服给药的所有剂型应为适于所选给药途径的剂量。
对于口含给药,组合物可呈以常规方式配制的片剂或糖锭剂的形式。
对于吸入给药,便于以其中使用合适抛射剂的加压包装或喷雾器产生的喷雾剂外观形式递送用于本发明用途的活性成分,抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在压缩气雾剂的情况下,剂量单位可通过提供给出计量量的阀来确定。可以制成例如用于吸入器或吹入器的明胶的容器和药筒,其中装有活性成分和合适的粉状基质(例如乳糖或淀粉)的粉状混合物。
可配制本文所述活性成分用于胃肠外给药,例如通过推注或连续输注。用于注射的剂型可呈单位剂型,例如在安瓿或多剂量容器中,任选加入防腐剂。组合物可以是油性载体或水性载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂,并可含有调配剂(formulatory agent),例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠外给药的药物组合物包括水溶形式的活性制剂的水溶液。另外,活性成分的混悬剂可制成合适的油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯、甘油三酯)或脂质体。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂粘度的物质,例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选混悬剂还可含有合适的稳定剂或增加活性成分溶解度的物质以供制备高浓缩溶液剂。
在一个优选的实施方案中,按照常规方法将组合物配制成适于人类静脉内给药的药物组合物。静脉内给药的药物组合物通常是无菌等渗含水缓冲液形式的溶液剂。各成分一般是单独的或混合在单位剂型中提供,例如作为干燥冻干粉或无水浓缩剂,装在标明活性剂含量的密封容器中,例如安瓿或小袋。如果组合物通过输注给予,则可分散在装有无菌药用级水或盐水的输液瓶中。如果组合物通过注射给予,可提供安瓿装的无菌注射水或盐水,以便可在给药前将各成分混合。
可将本发明的药物组合物配制成中性形式或盐的形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐和与阳离子形成的盐,与阴离子形成的盐例如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等得到的盐,与阳离子形成的盐例如由钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等得到的盐。
本发明的活性成分还可使用例如常用的栓剂基质例如可可脂或其它甘油脂,配制成直肠组合物,例如栓剂或滞留型灌肠剂。
本文所述的药物组合物还可包含凝胶相载体或赋形剂的合适固体。这类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。
任选使用局部途径,并辅以局部载体。局部载体是通常适于局部给予活性成分的载体,包括本领域已知的任何这类物质。选择这样的局部载体以便提供所需形式的组合物,例如作为液体载体或非液体载体、洗剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、散剂、软膏剂、溶剂、液体稀释剂、滴剂等,局部载体可由天然存在的或合成来源的材料组成。所选择的载体不得不利地影响局部剂型的活性剂或其它组分,且对于局部剂型所有组分是稳定的,这无疑是绝对必需的。合适的用于本文的局部载体的实例包括水、醇和其它无毒有机溶剂、甘油、矿物油、硅酮、石油膏、羊毛脂、脂肪酸、植物油、对羟基苯甲酸酯、蜡等。本文优选的剂型是无色无味的软膏剂、液体制剂、洗剂、乳膏剂和凝胶剂。
软膏剂通常是基于凡士林或其它石油衍生物的半固体制剂。正如本领域技术人员应了解的一样,所采用的具体软膏剂基质,是可提供最佳活性成分递送的基质,优选还可提供其它所需的特征,例如软化性等。与其它载体或溶媒一样,软膏剂基质应是惰性稳定的,无刺激性,无致敏性。有关详述参见Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Co.,1995),第1399-1404页。软膏剂基质可分成四类:油脂性基质、可乳化基质(emulsifiable base)、乳剂基质(emulsion base)、水溶性基质。油脂性软膏剂基质包括例如植物油、从动物中获得的脂肪和从石油获得的半固体烃。可乳化软膏剂基质,亦称吸收软膏剂基质,含有少量水或不含水,包括例如硫酸羟基甘油三硬脂酸酯、无水羊毛脂和亲水性矿脂。乳剂软膏剂基质为油包水(W/O)乳剂或水包油(O/W)乳剂,包括例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸。优选的水溶性软膏剂基质由不同分子量的聚乙二醇制备;更多信息同样可参考《雷明顿:制药科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)。
洗剂是不用磨擦而用于皮肤表面的制剂,通常是液体或半液体制剂,其中包括活性剂在内的固体颗粒存在于水或醇基质中。洗剂通常是固体的混悬剂,可包括水包油型的液体油性乳剂。洗剂是本文用于治疗大身体面积的优选剂型,因为易于使用较为流动的组合物。洗剂中不溶性物质一般必需是细碎的。洗剂通常可含有悬浮剂以产生更好的分散作用以及在与皮肤接触时用于将活性剂定位并保持住的活性成分,例如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等。
含有所选活性成分的乳膏剂是本领域已知的水包油或油包水的黏性液体或半固体乳剂。乳膏剂基质是水洗型的,含有油相、乳化剂和水相。油相,有时亦称“内”相,一般由凡士林和脂肪醇(例如鲸蜡醇或硬脂醇)组成;水相的体积通常(尽管不是必需)超过油相,一般含有湿润剂。乳膏剂型中的乳化剂(参见Remington,同上)一般为非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或两性表面活性剂。
凝胶剂型优选应用于头皮。正如局部活性成分制剂领域工作人员了解的一样,凝胶剂为半固体、混悬型系统。单相凝胶含有基本均匀分布在整个载体液体中的有机大分子,通常是含水的,但也优选含有醇,并任选含有油。
本领域技术人员已知的各种添加剂可包括在本发明的局部剂型中。例如可以使用溶剂使某些活性成分物质增溶。其它任选添加剂包括皮肤渗透促进剂、遮光剂、抗氧化剂、胶凝剂、增稠剂、稳定剂等。
还可使用常规皮肤型贴剂或制品递送本发明的局部组合物,其中活性成分组合物包含在层状结构中,层状结构用作贴附在皮肤上的递药装置。在这类结构中,活性成分组合物包含在上部衬底层之下的药层或“贮库”中。层状结构可含有单个贮库,或者可含有多个贮库。在一个实施方案中,贮库包含药学上可接受的接触胶黏材料的聚合物基质,用于在活性成分递送期间将该系统贴附在皮肤上。合适的皮肤接触胶黏物质的实例包括但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯等。所选的具体聚合物黏合剂将取决于具体的活性成分、溶媒等,也就是说,黏合剂必需与含有活性成分的组合物中的所有组分相容。或者,含有活性成分的贮库和皮肤接触胶黏剂存在于完全不同的独立片层,在这种情况下,在贮库之下的黏合剂可以是如上所述的聚合物基质,或者可以是液体或水凝胶贮库,或者可呈某种其它形式。
用作该装置上表面的这些片层的衬底层,起层状结构主要结构元件的作用,并为该装置提供大量柔性。应如此选择选用于衬底材料的材料,以使得它基本上不能透过活性成分和含有活性成分的组合物的任何其它组分,从而防止任何组分通过该装置的上表面丧失。衬底层可以是封闭或非封闭的,这取决于在活性成分递送期间皮肤是否需要被水化。衬底优选由优选的柔性高弹性材料片层或薄膜制成。适用于衬底层的聚合物的实例包括聚乙烯、聚丙烯和聚酯。
在贮存期间以及使用之前,层状结构包括释放衬垫。临用前,从装置撕去该层暴露出其基底面,即活性成分贮库或独立的接触胶黏剂层,使得该系统可以黏附在皮肤上。释放释放衬垫应由防止活性成分/溶媒渗漏的材料制备。
这类装置可用本领域已知常规技术制造,例如将胶黏剂、活性成分和溶媒的液体混合物浇到衬底层上,接着压上释放衬垫。同样,可将胶黏剂混合物浇到释放衬垫上,接着压上衬底层。或者,可以在不存在活性成分或赋形剂时制备活性成分贮库,然后通过“浸泡”在活性成分/溶媒混合物中加载。
如同本发明的局部剂型的情形一样,包含在这些片层系统的活性成分贮库内的活性成分组合物可含有多种组分。在一些情况下,活性成分可以被“净”递送,也就是说不存在其它液体。然而,在大多数情况下,可将活性成分溶于、分散于或悬浮于合适药学上可接受的溶媒(通常为溶剂或凝胶剂)中。可存在的其它组分包括防腐剂、稳定剂、表面活性剂等。
应当注意的是,本发明的蛋白质,例如高甘露糖溶酶体酶,优选按有效量给予有需要的患者。本文所用“有效量”是指达到特定结果所必需的量。例如,可选择有效量的本发明组合物用于治疗溶酶体贮积病。
适用于本发明用途的药物组合物包括其中所包含的活性成分是获得既定目的的有效量的组合物。更准确地讲,治疗有效量是指有效预防、减轻或改善疾病症状或延长受治疗者生存的活性成分的量。
治疗有效量的确定尽在本领域技术人员掌握之中,尤其是根据本文提供的详细公开内容。
对于用于本发明方法的任何活性成分,可由动物活性测定法对治疗有效量或剂量作出初步估计。例如,可以在动物模型中调配剂量以达到包括由活性测定法测出的IC50在内的循环浓度范围。
本文所述活性成分的毒性和治疗功效可通过实验动物的标准药学规程测定,例如通过测定主题活性成分的IC50和LD50(引起受试动物50%死亡的致死剂量)。从这些活性测定法和动物研究得到的数据可用来调配用于人的剂量范围。例如,可以从使用这些疾病的动物模型进行的实验确定适于治疗遗传疾病的治疗有效剂量。
剂量可根据所使用的剂型和所采用的给药途径而变化。可由各医师根据患者的病况来选择确切的剂型、给药途径和剂量(参见例如Fingl等,1975,“The Pharmacological Basis of Therapeutics”,第1章,第1页)。
可以各别调整剂量和剂量间隔以提供足以维持调节作用的活性部分的血浆水平,其被称为最小有效浓度(MEC)。对于各制剂,MEC可发生变化,但可任选由全体动物数据作出估计。
剂量间隔还可用MEC值确定。任选可采用在特定时间的10-90%、优选介于30-90%之间、最优选为50-90%内维持MEC以上血浆水平的方案,来给予制剂。
根据待治疗疾病的严重程度和反应性,剂量方案还可以是一次给予上文所述的缓释组合物,其中疗程持续数天到数周,或者直到治疗产生效果,或者疾病状况减轻。
如有需要,本发明的组合物可以药包或配药装置(dispenser device)形式提供,例如FDA批准的药盒,其中可装有一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如,药包可装有金属或塑料薄片,例如泡罩包装。药包或配药装置可附有给药说明书。药包或配药器还可附加附在容器中的说明书,该说明书由管理药品生产、使用或销售的政府机构规定格式,该说明书上反映出组合物的形式或者人用药物或兽用药物已获政府机构批准。例如,这类说明书可以是由美国食品与药物管理局批准用于处方药的标签,或是获准的产品插页。还可制备包含在相容的药用载体中配制的本发明活性成分的组合物,将该组合物放入合适的容器中,并标明用于指定疾病的治疗。
本文术语“调节”包括基本上抑制、减缓或逆转疾病的进程,基本上改善疾病或病症的临床症状,或者基本上预防疾病或病症临床症状的出现。因此,“调节剂”包括调节疾病或病症的药剂。
其它实施方案
要了解的是,虽然结合详细描述对本发明进行了说明,但是前面的描述旨在举例说明,并不限制本发明的范围,该范围由随附权利要求书限定。其它方面、优势和改动都落入随附权利要求书的范围内。
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Claims (60)
1.一种分离核酸序列,所述核酸序列编码与C端液泡引导信号和N端内质网信号肽邻接连接的人溶酶体蛋白,其中所述人溶酶体蛋白是人α-半乳糖苷酶。
2.一种分离核酸序列,所述核酸序列编码与C端内质网保留信号和N端内质网信号肽邻接连接的人溶酶体蛋白,其中所述人溶酶体蛋白是人α-半乳糖苷酶。
3.权利要求1或2的分离核酸,其中所述人α-半乳糖苷酶如SEQ ID NO:24所示。
4.权利要求1的分离核酸构建体,其中所述液泡引导信号是SEQ ID NO:4。
5.权利要求2的分离核酸构建体,其中所述内质网保留信号是SEQ ID NO:23(KDEL)。
6.权利要求2的分离核酸构建体,所述构建体如SEQ ID NO:19所示。
7.权利要求1的分离核酸构建体,所述构建体如SEQ ID NO:17所示。
8.权利要求1的分离核酸构建体,其中所述人溶酶体蛋白是人α-半乳糖苷酶。
9.权利要求1的分离核酸构建体,其中所述人溶酶体蛋白如SEQID NO:24所示。
10.一种能够在植物细胞内表达的核酸构建体,所述构建体包含权利要求1的分离核酸。
11.一种能够在植物细胞内表达的核酸构建体,所述构建体包含权利要求2的分离核酸。
12.一种细胞,所述细胞包含权利要求10的核酸构建体。
13.一种细胞,所述细胞包含权利要求11的核酸构建体。
14.权利要求13的细胞,所述细胞经重组产生所述人溶酶体酶。
15.权利要求13的细胞,其中所述人溶酶体蛋白是重组产生的,以致具有至少一个木糖和至少一个暴露出来的甘露糖残基。
16.权利要求13的细胞,其中所述人溶酶体蛋白是重组产生的,以致具有至少一个核心α-(1,2)木糖和至少一个核心α-(1,3)岩藻糖。
17.权利要求13的细胞,其中所述细胞是植物细胞。
18.权利要求17的细胞,其中所述植物细胞是选自以下的植物根细胞:发根土壤杆菌(Agrobacterium rihzogenes)转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。
19.权利要求18的细胞,其中所述植物细胞是烟草细胞。
20.权利要求13的细胞,其中所述细胞是根癌土壤杆菌细胞(Agrobacterium tumefaciens)。
21.权利要求13的细胞,其中所述人溶酶体蛋白具有至少一个核心α-(1,2)木糖和至少一个核心α-(1,3)岩藻糖。
22.一种人溶酶体蛋白,所述溶酶体蛋白包含至少一个暴露出来的甘露糖残基和至少一个具有α(1-3)糖苷键的岩藻糖残基。
23.权利要求22的人溶酶体蛋白,所述溶酶体蛋白另包含至少一个木糖残基。
24.权利要求23的人溶酶体蛋白,其中所述木糖残基是核心α-(1,2)木糖残基。
25.权利要求22的人溶酶体蛋白,其中所述溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶。
26.权利要求22的人溶酶体蛋白,其中所述溶酶体酶是α-半乳糖苷酶。
27.权利要求22的人溶酶体蛋白,其中所述人溶酶体蛋白与C端液泡引导信号邻接连接。
28.权利要求22的人溶酶体蛋白,其中所述人溶酶体蛋白与C端液泡引导信号和N端内质网信号肽邻接连接。
29.权利要求22的人溶酶体蛋白,其中所述人溶酶体蛋白与C端内质网保留信号和N端内质网信号肽邻接连接。
30.权利要求27的人溶酶体蛋白,其中所述液泡引导信号是碱性烟草几丁质酶A基因液泡引导信号。
31.权利要求30的人溶酶体蛋白,其中所述液泡引导信号如SEQ ID NO:2所示。
32.权利要求28的人溶酶体蛋白,其中所述内质网信号肽如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:16所示。
33.权利要求25的人溶酶体蛋白,其中所述人葡糖脑苷脂酶包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
34.权利要求25的人溶酶体蛋白,其中所述人溶酶体蛋白包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
35.权利要求26的人溶酶体蛋白,其中所述人葡糖脑苷脂酶包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
36.权利要求26的人溶酶体蛋白,其中所述人溶酶体蛋白包含如SEQ ID NO:18或20所示的氨基酸序列。
37.权利要求22的人溶酶体蛋白,其中所述溶酶体蛋白具有生物活性。
38.权利要求37的人溶酶体蛋白,其中所述生物活性是摄入到巨噬细胞内。
39.权利要求37的人溶酶体蛋白,其中所述生物活性是摄入到成纤维细胞内。
40.权利要求37的人溶酶体蛋白,其中所述生物活性是酶促活性。
41.权利要求37的人溶酶体蛋白,所述溶酶体蛋白与天然存在的溶酶体蛋白对所述巨噬细胞的相应亲和力相比,对所述巨噬细胞的亲和力提高。
42.一种药物组合物,所述组合物包含权利要求22的人溶酶体蛋白和药学上可接受的载体。
43.一种植物细胞制备物,所述细胞制备物包含人溶酶体蛋白,所述溶酶体蛋白包含至少一个暴露出来的甘露糖残基和至少一个具有α(1-3)糖苷键的岩藻糖残基。
44.权利要求43的植物细胞制备物,所述细胞制备物另包含至少一个木糖残基。
45.权利要求44的植物细胞制备物,其中所述木糖是核心α-(1,2)木糖。
46.权利要求45的植物细胞制备物,其中所述溶酶体蛋白是人葡糖脑苷脂酶。
47.权利要求46的植物细胞制备物,其中所述人溶酶体蛋白包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
48.权利要求46的植物细胞制备物,其中所述人溶酶体蛋白包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
49.权利要求45的植物细胞制备物,其中所述溶酶体蛋白是人α-半乳糖苷酶。
50.权利要求49的植物细胞制备物,其中所述人葡糖脑苷脂酶包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
51.权利要求49的植物细胞制备物,其中所述人溶酶体蛋白包含如SEQ ID NO:18或20所示的氨基酸序列。
52.权利要求43的植物细胞制备物,其中所述人溶酶体蛋白与C端液泡引导信号邻接连接。
53.权利要求43的植物细胞制备物,其中所述人溶酶体蛋白与C端液泡引导信号和N端内质网信号肽邻接连接。
54.权利要求43的植物细胞制备物,其中所述人溶酶体蛋白与C端内质网保留信号和N端内质网信号肽邻接连接。
55.权利要求54的植物细胞制备物,其中所述液泡引导信号是碱性烟草几丁质酶A基因液泡引导信号。
56.权利要求55的植物细胞制备物,其中所述液泡引导信号如SEQ ID NO:2所示。
57.权利要求55的植物细胞制备物,其中所述内质网信号肽如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:16所示。
58.权利要求43的植物细胞制备物,其中所述具有至少一个暴露出来的甘露糖残基的人溶酶体蛋白包含如连接分析中所测定的所述溶酶体蛋白的主要流分。
59.一种药物组合物,所述药物组合物包含权利要求43的植物细胞制备物和药学上可接受的载体。
60.权利要求37的有生物活性的溶酶体酶在制备用于治疗溶酶体贮积病的药物中的用途。
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