CN104808004A - Metrnl蛋白作为结肠癌诊断标志物的应用及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了METRNL蛋白在作为检测结肠癌的蛋白质分子标记物及在制备检测结肠癌诊断试剂或试剂盒中的用途。本发明通过免疫组织化学实验，对30对人类结肠癌组织与癌旁组织进行免疫组织化学，证实了METRNL蛋白在人类结肠癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达。因此，可根据METRNL蛋白在结肠组织中的表达量来检测患者是否患有结肠癌。

Description

METRNL蛋白作为结肠癌诊断标志物的应用及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及METRNL蛋白作为结肠癌诊断标志物，及其在制备结肠癌的诊断试剂或试剂盒中的用途。

背景技术

结肠癌是由于结肠粘膜上皮在环境和遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性癌变，是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在许多国家是导致死亡的主要病因。结肠癌起病隐匿，早期常无明显的临床症状，而且病情发展较慢，病人出现明显症状时大多已经到了中晚期。目前，结肠的治疗主要是以手术为主，但结肠癌转移后的化疗效果差，术后约有40％的患者出现复发，且晚期患者术后生存率较低。因此，寻找发现有价值的肿瘤标志物对于提高结肠癌的诊断和预测发生、发展及改善预后具有重要的临床指导意义。结肠癌是一种多因素协同作用的结果，与饮食、环境、遗传等密切相关，但其具体的分子机制尚未完全阐明。尽管有许多学者已经做了大量成功的关于结肠癌分子水平的研究，但是目前仍然缺乏有效地早期诊断结肠癌的分子标志物。肿瘤标志物可以有效地作为临床诊断依据，可以监听高位人群、早期诊断、指导治疗、判断治疗疗效、检测复发及转移，是肿瘤患者的重要检查指标、具有重要的临床意义。结肠癌的发生前期会有一段时间的癌前病变，如结肠息肉，因此在早期发现并阻断或延迟癌症的发展，有极其重要的意义

Metrnl蛋白共由311个氨基酸组成，在NCBI中的注册号为NM_001004431.1，注释为人神经胶质细胞分化调节因子meteorin样分子。Metrnl蛋白已经在人、小鼠、牛、鸡、非洲瓜蟾和斑马鱼中鉴定出来。中国专利文献CN200980137344.4，公开了Metrnl的治疗用途，用于制备治疗神经系统的疾病、疾患或损害的药物，并指出Metrnl是分泌性生长因子，可促进神经迁移、再生和分化，可用于治疗一般性的神经系统疾病，特别是用于治疗涉及脑、脑干或脊髓和/或外周神经损伤的疾病。中国专利文献CN201310525184.9，公开了Metrnl蛋白在制备降血糖药物或保健食品中的应用。

然而，关于Metrnl蛋白作为结肠癌诊断血清标志物的应用及其试剂盒，还目前还未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供METRNL蛋白的新用途。

本发明通过免疫组织化学芯片，对30对人类结肠癌组织与癌旁组织进行免疫组织化学，证实了METRNL蛋白在人类结肠癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中表达上调)。

基于METRNL蛋白与结肠癌的这种相关性，发明人认为METRNL蛋白可以作为检测结肠癌的蛋白质分子标记物，或用于制备检测结肠癌的诊断试剂或试剂盒，通过对METRNL蛋白的表达量进行定性或定量检测，用于检测结肠癌。

本发明的目的是针对现有技术中的不足，METRNL蛋白在作为检测结肠癌的蛋白分子标记物的用途。

本发明的再一的目的是，提供METRNL蛋白在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用。

所述的METRNL蛋白在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用，其中的肿瘤具体指结肠癌。

所述的METRNL蛋白在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用，是以常规方法制备抗METRNL蛋白的抗体，建立检测METRNL蛋白的定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒。

所述的以常规方法制备抗METRNL蛋白的抗体，常规的方法可以是指用外源表达的METRNL蛋白或化学合成的METRNL蛋白多肽作为抗原免疫动物试验制备的抗体(参见《抗体制备与使用实验指南》，科学出版社，2010年)。

所述的抗METRNL蛋白的抗体，包括单克隆抗体或多克隆抗体。

所述的检测METRNL蛋白的定性或定量的方法及配套的试剂或试剂盒，具体是体外检测结肠组织中METRNL蛋白的表达是否异常。

体外检测结肠组织中METRNL蛋白的表达是否异常，首先是检测待测结肠组织中METRNL蛋白的表达量，其次是与正常结肠组织中的METRNL蛋白的表达量进行比较，最后判断这种蛋白质分子标记物在待测结肠组织中是否存在上调表达。

所述的试剂或试剂盒，可以是联酶免疫ELISA试剂盒、化学发光法试剂盒、固态或液态芯片试剂盒，或者根据抗体包被检测抗原的方法制备的其它试剂盒。

鉴于到目前为止，尚未有关METRNL蛋白与结肠癌的任何相关性报道。因此，本发明的这一发现将为结肠癌的诊断提供一条全新的途径。

附图说明

附图1为结肠癌组织芯片中METRNL蛋白的免疫组织化学实验结果；其中，从左到右点位置纵坐标分别为1-10；从上到下点位置横坐标分别为A-G；点位置(G,1)、(G,2)为定位备用点。

具体实施方式

本发明提供的具体实施方式作详细说明，但本发明的实施并不仅限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照《分子克隆》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施。

实施例 METRNL蛋白在结肠癌组织芯片中的免疫组织化学分析

为证实METRNL蛋白在结肠癌组织和癌旁组织之间的表达差异，随机选取30对结肠癌的癌组织和对应的癌旁组织样本，使用结肠癌组织芯片(OD-CT-DgCol03-003，购自上海芯超生物科技有限公司)进行免疫组织化学研究，其中选取的样本的具体资料如表1所示。

免疫组织化学研究的实验过程及结果判定：

实验过程：

1、人类结肠癌组织芯片用含10％的山羊血清的PBS室温封闭20分钟；

2、加入鼠抗人metrnl抗体(购自Sigma公司，1：180稀释)，4度过夜，PBS洗3次，每次5分钟；

3、加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠的抗体(购自KLP公司，1:1000稀释)，室温孵育30分钟，PBS洗3次，每次5分钟；

4、二氨基联苯胺(DAB)(购自Sigma公司)显色；

5、苏木精-伊红(购自Sigma公司)染色20秒；

6、组织切片依次使用：50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、100％乙醇、二甲苯/乙醇(1:1)、二甲苯，进行脱水透明处理；

7、使用中性树脂封片，于显微镜观察。

免疫组化结果如图1所示。从图中可以看出metrnl在结肠癌组织中呈阳性，在癌旁组织中呈中等阳性或弱阳性。

根据染色强度和阳性率对组织芯片进行打分评估，染色强度打分标准为：阴性为0分、弱阳性为1分、中等阳性为2分、强阳性为3分；阳性率打分标准为：低于5％为0分，5％-30％为1分，31-60％为2分，60％以上为3分。将染色强度的得分与阳性率的得分相加，获得组织切片的综合得分，得分结果如表1所示。

表1、OD-CT-DgCol03-003结肠癌组织芯片及打分结果

      

      

根据表1的结果：结肠癌组织的平均综合得分为6；癌旁组织的平均综合得分为4.16，两者具有极显著差异，P值为0.0001。统计发现，在超过90％的样本对中，METRNL蛋白在结肠癌组织中显著上调表达。

由上述可知，METRNL蛋白在结肠癌组织和癌旁组织中存在明显的差异表达，显然与结肠癌的发生发展有着密切的相关性，因此它的表达量可以用于检测肝细胞癌。相应的，特异性抗METRNL蛋白的抗体，包括各种单克隆抗体和多克隆抗体，由于其能够用于检测METRNL蛋白的表达量，因而可以用于检测结肠癌，或者用于制备检测结肠癌的试剂或试剂盒，这对本领域人员来说是显而易见的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.METRNL蛋白在作为检测结肠癌的蛋白分子标记物的用途。

2.METRNL蛋白在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的METRNL蛋白在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的肿瘤具体指结肠癌。

4.根据权利要求3所述的METRNL蛋白在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，以常规方法制备抗METRNL蛋白的抗体，建立检测METRNL蛋白的定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒。

5.根据权利要求4所述的METRNL蛋白在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的抗METRNL蛋白的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。