JP2016527514A - 対象の癌リスクを明らかにするための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

対象からの体液標本及びｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質などのマーカーのためのアッセイを用いて、対象の頭頚部扁平上皮癌などの癌リスクの測定するための組成物及び方法を本明細書が開示される。前記リスクに基づいて対象を治療する方法も開示される。癌治療の有効性を測定するための方法も開示される。

Description

本出願は、２０１３年７月３１日に出願された米国特許仮出願第６１／８６０，６６９号及び２０１４年６月７日に出願された米国特許仮出願第６２／００９，１７５号、及び２０１４年７月８日に出願された米国特許仮出願第６２／０２１，９９８号に対する優先権の利益を主張し、それぞれの全体が参照として本明細書に組み込まれる。

本発明は、アメリカ国立衛生研究所により付与された認可番号Ｒ０１ＣＡ１１８５８４及び ＲＯ３ ＣＡ１０７８２８のもとアメリカ政府の支援を受けた。本発明は、フロリダ保健局からのバンクヘッドコーリー許可番号１０ＢＧ０２のもと支援も受けた。アメリカ政府は本発明の特定の権利を有している。

頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）は、不同を特徴とする衰弱させ、命取りの疾患であり、黒人の死亡率が白人の２倍である。これは、女性より男性によくみられる（Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｆｉｇｕｒｅｓ−２０１３．Ａｔｌａｎｔａ： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１３）。ＨＮＳＣＣは、上部気道消化管（ＵＡＤＴ）に関与する癌のほぼ９０％を占めている（Ｍｕｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｕｐｐｅｒ ａｅｒｏｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ（１９９５）７５：１４７−５３）。毎年、米国では５０，０００人が、世界で６００，０００人が当該疾患を来す。末期の患者のほとんどの治癒率が３０％ほどで低いため、生存率は低い（Ｖｏｋｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（１９９３）３２８：１８４−９４）。早期に発見すれば、そのうち８０〜９０％は当該疾患を治癒することができる（Ｍａｒｋｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｉｖａｒｙ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｏｒａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｏｐｅｎ Ｄｅｎｔ Ｊ．（２０１０）４：１７２−１７８）。

ケースコントロール研究デザインを用いて多数の潜在マーカーからいくつかの候補マーカーを特定するために現在実施されているＨＮＳＣＣバイオマーカー試験の多くが「オミクス」アプローチを用いている（Ｓｈａｎｋａｒ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｓａｌｉｖａｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ − ａ ５−ｙｅａｒ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｏｒａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００７−２０１１．Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ（２０１２）４８：ｅ２２−３；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００４）１０：８４４２−８４５０；Ｐａｒｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡ： ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００９）１５：５４７３−５４７７；Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００８）１４：６２４６−６２５２；Ｃａｒｖａｌｈｏ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂｏｄｙ ｆｌｕｉｄｓ ａｓ ａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ／ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００８）１４：９７−１０７；Ｅｌａｓｈｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ（２０１２）２１（４）：６６４−７２）。さらに試験すると、マーカーは通常、同様にうまく機能しない。例えば、メチル化マーカーのパネルが３５〜８５％の感度及び３０〜９０％の特異度をもたらし（Ｃａｒｖａｌｈｏ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂｏｄｙ ｆｌｕｉｄｓ ａｓ ａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ／ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００８）１４：９７−１０７）、一方、ｍＲＮＡマーカーのパネルが４５〜７９％の感度及び７２〜７７％の特異度をもたらす（Ｅｌａｓｈｏｆｆ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ（２０１２）２１（４）：６６４−７２）。

ＨＮＳＣＣの発現の最も重要な準備因子は、タバコ、アルコール及び通常、ＨＰＶ型１６によるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染である（Ｍｕｓｃａｔ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｂａｃｃｏ，ａｌｃｏｈｏｌ，ａｓｂｅｓｔｏｓ，ａｎｄ ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９２）６９：２２４４−５１；Ｂｌｏｔ，ｅｔ ａｌ．Ｓｍｏｋｉｎｇ ａｎｄ ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｒａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９８８）４８：３２８２−７；Ｂｕｒｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｂａｃｃｏ，ａｌｃｏｈｏｌ，ａｓｂｅｓｔｏｓ，ａｎｄ ｎｉｃｋｅｌ ｉｎ ｔｈｅ ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｒｙｎｘ： ａ ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（１９８１）６７：１２１９−２４；Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ ｕｓｅ ａｎｄ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｇｌｏｂａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｊ Ｄｅｎｔａｌ Ｅｄｕ（２００１）６５：３２８−３３９；Ｂａｌａｒａｍ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｉｎｄｉａ： ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｍｏｋｉｎｇ，ｄｒｉｎｋｉｎｇ，ｐａａｎ−ｃｈｅｗｉｎｇ ａｎｄ ｏｒａｌ ｈｙｇｉｅｎｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ（２００２）９８：４４０−４５；Ｌｅｗｉｎ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｓｍｏｋｉｎｇ ｔｏｂａｃｃｏ，ｏｒａｌ ｓｎｕｆｆ ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９８）８２：１３６７−７５；Ｍａｓｈｂｅｒｇ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｂａｃｃｏ ｓｍｏｋｉｎｇ，ａｌｃｏｈｏｌ ｄｒｉｎｋｉｎｇ，ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ａｎｄ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｘ ａｍｏｎｇ Ｕ．Ｓ．ｖｅｔｅｒａｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９３）７２：１３６９−７５；Ｔａｌａｍｉｎｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ａｎｄｐｈａｒｙｎｘ ｉｎ ｎｏｎｓｍｏｋｅｒｓ ｗｈｏ ｄｒｉｎｋ ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ ｉｎ ｎｏｎｄｒｉｎｋｅｒｓ ｗｈｏ ｓｍｏｋｅ ｔｏｂａｃｃｏ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（１９９８）９０：１９０１−３；Ｌｉｎ ＢＭ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ａｍｏｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＰＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ．（２０１３）；Ｄ’Ｓｏｕｚａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２００７）３５６：１９４４−５６；Ｇａｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｂａｓｉｃ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｆｒｏｎｔ Ｍｅｄ ２０１２；６：３３９−５３）。タバコは頭頚部癌の強力なリスクファクターであり、アルコールと相乗作用し、リスクを増大させる（Ｍｕｓｃａｔ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｂａｃｃｏ，ａｌｃｏｈｏｌ，ａｓｂｅｓｔｏｓ，ａｎｄ ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９２）；６９：２２４４−５１；Ｂｌｏｔ，ｅｔ ａｌ．Ｓｍｏｋｉｎｇ ａｎｄ ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｒａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９８８）４８：３２８２−７；Ｂｕｒｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｂａｃｃｏ，ａｌｃｏｈｏｌ，ａｓｂｅｓｔｏｓ，ａｎｄ ｎｉｃｋｅｌ ｉｎ ｔｈｅ ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｒｙｎｘ： ａ ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（１９８１）６７：１２１９−２４；Ｊｏｈｎｓｏｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ ｕｓｅ ａｎｄ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｇｌｏｂａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｊ Ｄｅｎｔａｌ Ｅｄｕ（２００１）６５：３２８−３３９；Ｂａｌａｒａｍ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｉｎｄｉａ： ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｍｏｋｉｎｇ，ｄｒｉｎｋｉｎｇ，ｐａａｎ−ｃｈｅｗｉｎｇ ａｎｄ ｏｒａｌ ｈｙｇｉｅｎｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ（２００２）９８：４４０−４５；Ｌｅｗｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｍｏｋｉｎｇ ｔｏｂａｃｃｏ，ｏｒａｌ ｓｎｕｆｆ ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９８）８２：１３６７−７５；Ｍａｓｈｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｂａｃｃｏ ｓｍｏｋｉｎｇ，ａｌｃｏｈｏｌ ｄｒｉｎｋｉｎｇ，ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ａｎｄ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｘ ａｍｏｎｇ Ｕ．Ｓ．ｖｅｔｅｒａｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９３）７２：１３６９−７５；Ｔａｌａｍｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ａｎｄｐｈａｒｙｎｘ ｉｎ ｎｏｎｓｍｏｋｅｒｓ ｗｈｏ ｄｒｉｎｋ ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ ｉｎ ｎｏｎｄｒｉｎｋｅｒｓ ｗｈｏ ｓｍｏｋｅ ｔｏｂａｃｃｏ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（１９９８）９０：１９０１−３；Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ａｍｏｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＰＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１３；Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ａｔｔｒｉｂｕｔａｂｌｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌ ｆｏｒ ｕｐｐｅｒ ａｅｒｏｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１１）４７：７２５−３１）。ＨＰＶ関連ＨＮＳＣＣは、米国で発症率が増加している数少ない癌のうちのひとつである。主にＨＰＶによって引き起こされる腫瘍は予後に優れているが、ＨＰＶ腫瘍の大半は喫煙歴がある患者にみられる（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ａｍｏｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＰＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１３；Ａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２０１０）３６３（１）：２４−３５）。喫煙者のＨＰＶ 陽性腫瘍は、予後が不良である（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ａｍｏｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＰＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１３；Ｋｕｍａｒ，ｅｔ ａｌ．ＥＧＦＲ，ｐ１６，ＨＰＶ Ｔｉｔｅｒ，Ｂｃｌ−ｘＬ ａｎｄ ｐ５３，ｓｅｘ，ａｎｄ ｓｍｏｋｉｎｇ ａｓ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２００８）２６：３１２８−３７）。

現在のスクリーニングの「至適基準」は理学的検査に続く生検であるが、感度がわずか６４％であり、特異度が７４％である（Ｂｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ（２０１０）１１：ＣＤ００４１５０）。口腔癌の発見を助けるためにさまざまな技術があるが、それらがスクリーニングに裸眼より優れているという証拠はない。当技術分野に必要なものは、癌リスクを明らかにし、癌の予後をもたらし、または治療中に癌の進行を監視する方法である。本明細書に開示した構成要件は、これらの必要性及び他の必要性に言及している。

本明細書に、対象から体液の標本を提供すること；標本中のｓｏｌＣＤ４４の試験量を測定すること；標本中の総タンパク質の試験量を測定すること；健康な個体及び癌の個体の集団からのｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを用いてｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルを統計的分析によって測定し、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルがさまざまな統計的に有意な癌リスクの範囲を定め、ｓｏｌＣＤ４４の参照レベル及び総タンパク質の参照レベルを提供すること、及びｓｏｌＣＤ４４の試験量及び総タンパク質の試験量がｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベル以上または以下かどうかを測定することによって対象の癌リスクを測定することを含む、対象の癌リスクを測定する方法が開示される。当該癌はＨＮＳＣＣとすることができるが、他の種類の癌とすることもできる。

対象の体液の標本を提供すること；標本中のｓｏｌＣＤ４４の試験量を測定すること；標本中の総タンパク質の試験量を測定すること；癌の予後良好の個体及び予後不良の個体の集団からのｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを用いてｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルを測定し、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルがさまざまな統計的に有意な癌の予後の範囲を定め、ｓｏｌＣＤ４４の参照レベル及び総タンパク質の参照レベルを提供すること、ｓｏｌＣＤ４４の試験量及び総タンパク質の試験量がｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベル以上または以下かどうかを測定することによって対象の癌の予後を判定する方法を含む、対象の癌の予後を判定する方法も開示される。

対象の体液の標本を提供すること；標本中のｓｏｌＣＤ４４の試験量を測定すること；標本中の総タンパク質の試験量を測定すること；健康な個体及び癌の個体の集団からのｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを用いることによってｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルを測定し、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルが癌のさまざまな、統計的に有意な転帰の範囲を定め、ｓｏｌＣＤ４４の参照レベル及び総タンパク質の参照レベルを提供すること；ｓｏｌＣＤ４４の試験量及び総タンパク質の試験量がｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベル以上または以下かどうかを測定することによって癌治療の有効性を測定することを含む、癌を治療する対象の癌治療の有効性を測定する方法も開示される。

生理食塩液；経口生理食塩すすぎ液を受けるためのカップ；特異的にＣＤ４４を結合する少なくとも１つの抗体；総タンパク質濃度を測定するための試薬；ならびに健康な個体及び癌の個体の集団からのｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを用いて多変量分析またはロジスティック回帰計算によってｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルが測定され、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルがさまざまな、統計的に有意な癌リスクの範囲を定める、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベル、を含むキットも開示される。

続く説明及び図の部分にさらに利点が示され、部分的に説明から明らかであるか、または以下に記載した態様の実施によってわかると思われる。以下に記載した利点は、特に添付のクレームに示した構成要素及び組み合わせによって認識及び得ることができる。以下の一般的説明及び以下の詳細な説明はともに例示的なものであり説明的なものにすぎず、制限的なものではないと理解しなければならない。

添付する図は、本明細書の一部に組み込まれ一部をなし、本発明のいくつかの態様を示し、説明とともに本発明の原理を説明する役割を果たす。
図１は、ｓｉＲＮＡによってＣＤ４４を標的にすると腫瘍の成長、ＥＧＦＲ発現及びＣＡＬ２７のリン酸化を抑制することを示す。図１Ａは、ＣＡＬ２７の腫瘍成長曲線及びそのＣＤ４４−ｓｉＲＮＡ安定したトランスフェクタント（３Ｃ３）を示す。図１Ｂは、腫瘍断面（２０Ｘ）の免疫細胞化学染色を示す。 図２Ａ及び２Ｂは、クリニックに基づいたケースコホート１３７例の無増悪生存率（ＰＦＳ）が高ｓｏｌＣＤ４４レベル（＞１０ｎｇ／ｍＬ）（図２Ａ）及び高タンパク質レベル（＞１ｎｇ／ｍＬ）（図２Ｂ）の患者で低いことを示す。高ｓｏｌＣＤ４４レベルの陰性効果は、試験した各人種民族グループ、黒人、白人ヒスパニック（ＷＨ）、及び白人非−ヒスパニック（ＷＮＨ）でみられる（図２Ｃ）。 図３は、１年間隔で取ったＣＤ４４測定値の差の分布を示す。 図４Ａ及び４Ｂは、ｓｏｌＣＤ４４（図４Ａ）及びタンパク質レベル（図４Ｂ）を測定したときのコントロールの子宮頚部ＰＡＰスミア結果を示す。 図５Ａ〜Ｆは、ＣＤ４４及びタンパク質レベルカットポイントに基づくＰＦＳ（図５Ａ）及びＯＳ（図５Ｂ）の有意な差を示すプラン−マイヤー曲線を示す。１年間のＣＤ４４（図５Ｃ）及びタンパク質（図５Ｅ）レベルの差は、正規分布に従っている。線形回帰分析は、１年間のレベルの減少傾向はＣＤ４４（図５Ｄ）及びタンパク質（図５Ｆ）のともに有意であることを示す。

本明細書に記載した組成物及び方法は、開示した構成要件の具体的な態様ならびに実施例及びそれに含まれる図の以下の詳細な説明を参照することによってさらに容易に理解することができる。

本組成物及び方法を開示し、記載する前に、以下に記載した態様は、具体的な合成方法または具体的な試薬を制限するものではなく、言うまでもなく変えることができると理解しなければならない。このほか、本明細書で使用する専門用語は、具体的な態様を記載する目的だけのためにあり、限定することを意図しないものであると理解しなければならない。

また、本明細書全体にわたって、さまざまな刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、開示した事項が関係する当技術分野の状態をさらに完全に記載するために全体が参照により本出願に組み入れられる。また、開示した参考文献は、参考文献に依拠する文章に記載され、それらに含まれる資料について、参照により本明細書に個々にかつ具体的に組み入れられる。

一般的な定義
本明細書及び続くクレームでは、多くの用語に言及され、以下の意味があると定義される。
本明細書の説明及びクレームを通じて、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及びこの単語の他の形、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は、含むが限定されないことを意味し、例えば、他の添加剤、成分、整数またはステップを除外することを意図しないことを意味する。

説明及び添付されたクレームで使用される場合、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示物を含む。このため、例えば、「１つの組成物」への言及が２つ以上のかかる組成物の混合物を含むこと、「１つの試薬」への言及が２つ以上のかかる試薬の混合物を含むこと、「当該成分」への言及が２つ以上のかかる成分の混合物を含むことなどである。

「任意の」または「任意に」は、その後に記載した事象または環境が生じる可能性がある、または可能性がないこと、説明は当該事象または環境が生じる例及び生じない例を含むことを意味する。

本明細書で範囲は、「約」１つの特定の値から、及び／または「約」他の特定の値までを表すことができる。「約」は、当該値の５％以内を意味し、例えば、当該値の４、３、２、１％以内である。かかる範囲が表される場合、もうひとつの例は、１つの特定の値から及び／または他の詳細な値までを含む。同様に、値が概算を表す場合、先行語「約」の使用によって、特定の値がもうひとつの例を形成するものとする。さらに範囲のそれぞれの端点は、他の端点と関連して、及び他の端点と独立して、ともに重要であるものとする。

本発明で使用する場合、「対象」は個体を意味する。このため、「対象」は、飼育動物（例えば、ネコ、イヌ、等）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、等）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、等）、及び鳥を含むことができる。「対象」は、霊長動物またはヒトなどの哺乳動物を含むこともできる。用語「対象」及び「患者」は、本明細書全体を通じて交換可能に用いられる。

「マーカー」または「バイオマーカー」は、本明細書で交換可能に用いられ、例えば、コントロール対象（例えば、陰性診断の人、正常または健康な対象）から採取した比較可能な標本と比べて、癌の患者から採取した標本に特異的に存在する（特定の明白な分子量の、または、ＨＡの場合では、二糖繰り返し単位で生成された分子の）ポリペプチドを指す。

語句「特異的に存在する」は、コントロール対象と比べて、例えば、癌の患者から採取した標本に存在するマーカーの量及び／または頻度の差を意味する。例えば、マーカーは、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の患者の標本中にコントロール対象の標本と比べて上昇したレベルでまたは低下したレベルで存在しているポリペプチドとすることができる。あるいは、マーカーは、コントロール対象の標本と比べて患者の標本中に高い頻度でまたは低い頻度で検出されるポリペプチドとすることができる。マーカーは、量、頻度または両者の点から特異的に存在することができる。

一方の標本中のマーカー、化合物、組成物または物質の量が他方の標本中のマーカー、化合物、組成物または物質の量と統計的に有意に異なっている場合マーカー、化合物、組成物または物質が２つの標本の間で特異的に存在する。例えば、化合物が他方の標本に存在するより、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％多く存在する場合、または一方の標本で検出可能であり、他方の標本で検出できない場合、化合物が２つの標本の間で特異的に存在する。

代わりにまたはさらに、患者の標本中でポリペプチドを検出する頻度がコントロール標本中より統計的に有意に高いまたは低い場合、マーカー、化合物、組成物または物質が２組の標本の間で特異的に存在する。例えば、バイオマーカーが他方の組の標本より一方の組の標本中でみられる頻度が少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％多くまたは少なく検出される場合、バイオマーカーが２組の標本の間で特異的に存在する。これらの例示的な値にもかかわらず、当業者であればマーカーが特異的に存在するかどうかを明らかにするための統計的に有意な差を表すカットオフポイント等を決定することができると予測される。

「診断」は病的状態の存在または性質を明らかにすることを意味し、癌を発症するリスクがある患者を明らかにすることを含む。診断方法は、その感度及び特異度で異なる。診断アッセイの「感度」は、試験の結果が陽性である疾患のある個体のパーセンテージ（「真陽性者」のパーセンテージ）である。アッセイによって検出されない疾患のある個体が「偽陰性者」である。疾患がなくアッセイで試験の結果が陰性である対象を「真陰性者」と呼ぶ。診断アッセイの「特異度」は、１から偽陽性率を引き算したものであり、「偽陽性」率は試験の結果が陽性である疾患のない人の割合と定義される。特定の診断方法が状態の確定診断を提供しない可能性があるが、方法が診断を助ける陽性誘導を提供すれば十分である。

用語「検出」、「検出すること」などは、バイオマーカーを検出する文脈で、またはＨＮＳＣＣのような癌を検出する文脈（例えば陽性のアッセイの結果が得られる場合）で用いることができる。後者の文脈では、「検出すること」及び「診断すること」は同意語とみなされる。

マーカーの「試験量」は、試験する標本に存在するマーカーの量を指す。試験量は、絶対量（例えば、ｎｇ／ｍＬ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度）のいずれかとすることができる。

マーカーの「診断量」は、癌の診断または腫瘍量の相対量（例えば、シグナルの相対強度）と一致している対象の標本中のマーカーの量を指す。

マーカーの「コントロール量」は、マーカーの試験量と比較される任意の量または量の範囲とすることができる。例えば、マーカーのコントロール量は、癌ではない人のマーカーの量とすることができる。コントロール量は、絶対量または相対量（例えば、シグナルの相対強度）のいずれかとすることができる。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書に交換可能で用いられ、アミノ酸残基のポリマー、特に、自然アミノ酸のポリマーを指す。当該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する自然アミノ酸の類似化合物または擬似化合物であるアミノ酸ポリマーならびに自然アミノ酸ポリマーに当てはまる。ポリペプチドを変性することができ、例えば、糖残基を添加することによって糖タンパク質を生成することができる。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、糖タンパク質、ならびに非糖タンパク質を含む。

「検出可能部分」または「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識としては、３２ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般に用いられるような酵素）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、抗血清もしくは単クローン性抗体が利用できるハプテン及びタンパク質、または標的に相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能部分は、放射性、色素産生、または蛍光シグナルなどの測定可能シグナルを生成することが多く、これを用いて標本中の結合検出可能部分の量を計ることができる。例えば、シンチレーション計数法、デンシトメトリー、またはフローサイトメトリーによってシグナルを計量する。

「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコード化されたポリペプチド配位子もしくは免疫グロブリン遺伝子、またはこれらのフラグメントを指し、特異的にエピトープ（例えば、抗原）を結合し、認識する。認識された免疫グロブリン遺伝子としては、κ及びλＬ鎖定常領域遺伝子、α、γ、δ、ε及びμＨ鎖定常領域遺伝子、ならびにミリアド免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。抗体は、例えばインタクト免疫グロブリンとしてまたはさまざまなペプチダーゼによる消化によって生成された多くの特性が明らかになったフラグメントとして存在する。これには、例えば、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２フラグメントを含む。用語「抗体」は、本明細書に用いられる場合、抗体全体の改質によって生成された抗体フラグメントまたは組み換えＤＮＡ法を用いて新生合成した抗体フラグメントのいずれかも含む。抗体には、多クローン性抗体、単クローン性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単一鎖抗体も含む。抗体の「Ｆｃ」部分は、１つ以上のＨ鎖定常領域ドメインを含むがＨ鎖可変領域を含まない免疫グロブリンＨ鎖の一部を指す。

「結合アッセイ」とは、バイオマーカーが抗体などの薬剤に結合することによって検出される、生化学的アッセイを意味し、これにより検出プロセスが実施される。検出プロセスは、放射性または蛍光標識などを含むことができる。アッセイはバイオマーカーの固定化を含むことができ、または溶液中で実施することができる。

「イムノアッセイ」は、特異的に抗原（例えば、マーカー）に結合する抗体を用いるアッセイである。イムノアッセイは、特定の抗体の特異的結合特性を使用して、抗原を分離する、標的にする、及び／または計量することを特徴とする。

語句、抗体に「特異的に（または選択的に）結合」またはタンパク質またはペプチドに言及する場合、「特異的に（または選択的に）免疫反応して」は、タンパク質及び他の生物学的製剤の不均一集団中でタンパク質の存在を明らかにする結合反応を指す。このため、指定イムノアッセイ条件下では、特定の抗体は、この環境で少なくとも２回特定のタンパク質に結合し、標本中に存在する他タンパク質に有意な量で実質的に結合しない。かかる条件下で抗体に特異的に結合するには特定のタンパク質へのその特異度のために選択される抗体を必要とする可能性がある。さまざまなイムノアッセイフォーマットを用いて特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを規定どおりに用いてタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択する（特異的免疫反応性を明らかにするために用いることができるイムノアッセイフォーマット及び条件の説明には、例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照）。

「標本」は、本明細書に用いられる場合、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体フラグメント及びこれらの誘導体を含むことができる。「標本」は、体液；細胞が成長する細胞製剤、または培地の可溶性画分；細胞から分離した、または抽出した染色体、細胞小器官、または膜；溶液中のまたは培養基に結合したゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、またはペプチド；細胞；組織；組織プリント；指紋、唾液、血液、皮膚または頭毛；フラグメント及びこれらの誘導体とすることができる、またはこれらに由来するものとすることができる。

「リスクがある」とは、正常な対象と比べて、またはコントロール群、例えば、患者集団と比べてリスクが増大していることを意味する。このため、癌を発症する「リスクがある」対象は、正常な対象または集団と比べて、リスクが増大している癌の再発の「リスクがある」対象は、治療した全患者の再発リスクと比べて再発するリスクが増大していることと考えることができる。

「リスクの増大」または「リスクの上昇」は、例えば、対象が癌を発症する、または再発する可能性の統計的に有意な増大を意味する。リスクは、比較するコントロール群より好ましくは少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、なおさらに好ましくは少なくとも５０％増大している。

用語「予後」は、特に疾患の緩解、疾患の再発、腫瘍の再発、転移、及び死の見込みに関する疾患の起こりうる経過または疾患の進行についての予測を意味する。「予後良好」は、頭頚部扁平上皮癌などの癌を患った患者が、疾患のない（すなわち癌のない）状態のままである見込みを指す。「予後不良」は、患者が原癌または腫瘍の再発（ｒｅｌａｐｓｅ）または再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）、転移、または死となる見込みを指す。「転帰良好」と分類される癌患者は、原癌または腫瘍のない状態のままである。これに対して、「転帰不良」の癌患者は、疾患再発、腫瘍再発、転移、または死となる。具体的な例では、予後及び転帰を推定するための時間枠は、例えば、１年未満、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０年またはこれ以上である。本明細書に用いられる場合、予後を推定するのに関係する時間または疾患のない生存時間は、腫瘍の外科的切除または抑制、鎮静、または腫瘍成長の阻害に始まる。このため、例えば、具体的な例では、「予後良好」は、頭頚部扁平上皮癌患者が原少なくとも５年間、さらに具体的には、少なくとも１０年間癌または腫瘍のない状態のままである見込みを指す。さらなる例では、「予後不良」は、頭頚部扁平上皮癌患者が５年未満、さらに具体的には１０年未満に疾患の再発、腫瘍の再発、転移、または死となる見込みを指す。前記に提供した予後及び転帰を推定するための時間枠は、説明的なものであり、限定することを意図しない

用語「治療」は、疾患、病的状態、または障害を治癒、改善、安定、または予防することを意図した患者の医療管理を指す。この用語は、有効な治療、すなわち、疾患、病的状態、または障害の改善に特異的に向けた治療を含み、原因治療、すなわち、関係した疾患、病的状態、または障害の原因の除去に向けた治療も含む。また、この用語は、緩和的治療、すなわち、疾患、病的状態、または障害の治癒よりも症状の緩和を意図した治療；予防的治療、すなわち、関係した疾患、病的状態、または障害の発症を最小化する、または部分的にまたは完全に阻止することを意図した治療；支持治療、すなわち、関係した疾患、病的状態、または障害の改善に向けたもうひとつの特異的治療を補完するために用いられる治療を含む。

用語「生活習慣カウンセリング」または「リスクファクター管理カウンセリング」は患者の生活習慣に関して患者に行う専門家のカウンセリングを指す。例えば、患者は、喫煙、飲酒、または薬物使用などの依存のためのカウンセリングを受けることができ、または低リスクの性行動、コンドーム使用等に関するカウンセリングなどの性行動に関するカウンセリングを受けることができる。「生活習慣カウンセリング」は、食事の改良またはストレス管理を指すこともできる。生活習慣カウンセリングは、専門家によって行われ、１つ以上の治療セッション、文献、専門家のビデオ、等を含むことができる。

語句、集団中の個体と「ほぼ同じ」年齢とは、対象の年齢とほぼ同じ年齢であり、集団の平均年齢が対象の１０歳以内、例えば５歳以内であることを意味する。また、語句、集団中の個体と「ほぼ同じ」人種とは、対象の人種とほぼ同じ人種であり、対象が集団中の個体の大半と同じ人種である少なくとも１つの親細胞である、またはを有することを意味する。語句、集団中の個体と「ほぼ同じ」病歴とは、対象とほぼ同じアルコール消費歴、喫煙歴であり、アルコールまたは喫煙の平均年数が対象の１０年以内、例えば、５年であることを意味する。

方法
上部気道消化管（ＵＡＤＴ）粘膜が、明白な悪性腫瘍の発現前に前癌期の形成異常から進行する。形成異常が可逆的であるため、このステージの病変を特定することが好ましい（Ｐｉｎｄｂｏｒｇ，Ａ ｆｏｌｌｏｗ ｕｐ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｉｘｔｙ ｏｎｅ ｏｒａｌ ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｎｄｉａｎ ｖｉｌｌａｇｅｒｓ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ（１９７７）４３：３８３−９０）ａｎｄ ｃａｎ ｒｅｇｒｅｓｓ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｏｒ ｗｉｔｈ ｔｏｂａｃｃｏ ｃｅｓｓａｔｉｏｎ（Ｌａｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｎｕｆｆ ｄｉｐｐｅｒｓ’ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｗｅｄｉｓｈ ｍｏｉｓｔ ｓｎｕｆｆ ｕｓｅｒｓ： ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ ｓｔｕｄｙ．Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｍｅｄ．（１９９１）２０（６）：２５８−６４；Ｇｒｉｚｚｌｅ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｃｉｐｉｅｎｄ，ｐｒｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｏｒ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ（２０１０）９：２１−３９）。残念ながら、形成異常はしばしば目視できるだけであり、良性の炎症でもみられる所見に似ていることが多い。さらに進行し、結果として末期の診断となるまで形成異常肉眼で見えないままであることが多い（Ｐｏｈ，ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｏｃｃｕｌｔ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ｏｒａｌ ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ ｄｅｖｉｃｅ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ（２００７）２９（１）：７１−６）。

ＣＤ４４、細胞表面膜貫通糖タンパク質は、細胞増殖、細胞移動、腫瘍イニシエーションに関与している（Ｓｃｒｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２）８９：１２１６０−４；Ｐｏｎｔａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００３）４：３３−４５；Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１２；Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００７）１０４：９７３）ｉｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ ｌｅｓｉｏｎｓ（Ｈｉｒｖｉｋｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．（１９９９）４３４３７−４４；Ｉｏａｃｈｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ（１９９９）１４：１１１３−８）。粘膜変化が正常から重度の形成異常に進行すると、ＣＤ４４発現が上皮細胞の全層に関与する基底層から進む（Ｈｉｒｖｉｋｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．（１９９９）４３４３７−４４；Ｉｏａｃｈｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ（１９９９）１４：１１１３−８）。さらに、ＣＤ４４がプロテイナーゼによって体液中で検出可能である可溶性形態（ｓｏｌＣＤ４４）に放出される（Ｋａｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００１）１５３：８９３−９０４）。総タンパク質も効果的な腫瘍 マーカーである（Ｆｒａｎｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｄ ＆ ｎｅｃｋ（２０１２）３４：６８７−９５；Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ（２０１１）１０：２４１−９；Ｆｒａｎｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ（２００７）１６：１３４８−５５）。

可溶性ＣＤ４４（ｓｏｌＣＤ４４）イムノアッセイ及び総タンパク質アッセイを用いて体液標本中のマーカーを測定する非侵襲的診断検査が本明細書に開示されている。中のｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルはＨＮＳＣＣにおいて、ともにコントロールと比べて高く、予後不良を伴い、標準的な口答試験によって癌が目に見える前に上昇している。さらに、肺及び膀胱などの他の部位の癌を検出することができることを示している（実施例１）。

経時的にｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを監視すると、臨床医が細分化専門家検査、分子画像及び組織生検が必要な患者を正確に特定することができる。疾患の証拠のない状態から前癌または癌と確認された状態に進行した患者のデータ（実施例１）は、いくつかのケースで、癌または前癌が臨床的に目に見える２年以上前に、ｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質レベルが正常より増大していることを示している。このリードタイムにより、前癌が可逆的状態となり（Ｐｉｎｄｂｏｒｇ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｉｘｔｙ−ｏｎｅ ｏｒａｌ ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｎｄｉａｎ ｖｉｌｌａｇｅｒｓ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ．（１９７７）４３：３８３−９０）、 禁煙により後退する可能性がある（Ｌａｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｎｕｆｆ ｄｉｐｐｅｒｓ’ ｌｅｓｉｏｎ ｉｎ Ｓｗｅｄｉｓｈ ｍｏｉｓｔ ｓｎｕｆｆ ｕｓｅｒｓ： ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ ｓｔｕｄｙ．Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｍｅｄ（１９９１）２０（６）：２５８−６４）ため、禁煙介入を容易にすることができる。

本明細書に、対象から体液の標本を提供すること；標本中のｓｏｌＣＤ４４のレベル、すなわち、ｓｏｌＣＤ４４の試験量を測定すること；標本中の総タンパク質のレベル、すなわち、総タンパク質の試験量を測定すること；健康な個体及び癌の個体の集団からのｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを用いてｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルを測定し、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルがさまざまな統計的に有意な癌リスクの範囲を定め、ｓｏｌＣＤ４４の参照レベル及び総タンパク質の参照レベルを提供すること、及びｓｏｌＣＤ４４の試験量及び総タンパク質の試験量がｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベル以上または以下かどうかを測定することによって対象の癌リスクを明らかにすることを含む、対象の癌リスクを明らかにする方法が開示される。すなわち、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルは、統計的に有意なリスクの間で限界値として用いられ、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の対象の試験レベル参照レベル以下である場合と比べて、この参照レベル以上のｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の試験量が、対象に癌がある統計的に有意なリスク（例えば約２倍、約１０倍など）を示す。

対象の体液の標本を提供すること；標本中のｓｏｌＣＤ４４の試験量を測定すること；標本中の総タンパク質の試験量を測定すること；癌の予後良好の個体及び予後不良の個体の集団からのｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを用いてｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルを測定し、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルがさまざまな統計的に有意な癌の予後の範囲を定め、ｓｏｌＣＤ４４の参照レベル及び総タンパク質の参照レベルを提供すること、ｓｏｌＣＤ４４の試験量及び総タンパク質の試験量がｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベル以上または以下かどうかを測定することによって対象の癌の予後を明らかにする方法を含む、対象の癌の予後を明らかにする方法も開示される。ここで、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルは、統計的に有意な予後（良好対不良）の間で限界値として用いられ、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の対象の試験レベルが参照レベル以下である場合と比べて、この参照レベル以上のｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の試験量が、対象の予後が不良である統計的に有意な予後（例えば約２倍、約１０倍など）を示す。

対象の体液の標本を提供すること；標本中のｓｏｌＣＤ４４の試験量を測定すること；標本中の総タンパク質の試験量を測定すること；健康な個体及び癌の個体の集団からのｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを用いることによってｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルを測定し、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルが癌のさまざまな、統計的に有意な転帰の範囲を定め、ｓｏｌＣＤ４４の参照レベル及び総タンパク質の参照レベルを提供すること；ｓｏｌＣＤ４４の試験量及び総タンパク質の試験量がｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベル以上または以下かどうかを測定することによって癌治療の有効性を明らかにすることを含む、癌を治療する対象の癌治療の有効性を明らかにする方法も開示される。ここで、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルは、統計的に有意な転帰（癌に対して）の間で限界値として用いられ、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の対象の試験レベル参照レベル以下である場合と比べて、この参照レベル以上のｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の試験量が、対象に所与の転帰（例えば、緩解）がある統計的に有意な転帰（例えば約２倍、約１０倍など）を示す。

本明細書に記載した方法は、癌である対象とｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルの関連性を示す。特に、本明細書に開示した方法は、対象の癌リスクを明らかにすることができる。対象が「高リスク」カテゴリーにある可能性があるとは、癌との関連性を示すとみられる１つ以上のリスクファクターが対象にあることを意味する。この「高リスク」カテゴリーは、これらに限定されないが、対象の年齢、人種、喫煙状態、アルコール消費、癌の病歴、及び／またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）アッセイの陽性結果を含むことができる。ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の試験量ともにこのリスクファクターを用いて、対象が癌、または前癌を発症する見込みを明らかにすることができる。「前癌」は、まだ悪性ではないが、悪性となりそうな組織と定義される。前癌成長の例としては、結腸のポリープ、皮膚の日光角化症、子宮頸の形成異常、肺の変質形成、及び白板症（口腔内の白斑）が挙げられる。いくつかの例では、前癌が必ずしも臨床的症状を示すものではない。

対象は前癌または癌と診断されない可能性がある、または本明細書に開示したアッセイ前に検査されない可能性がある。対象に癌または前癌の臨床的に目にみえる徴候がない可能性がある。

限界値レベル以上のｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質のレベルの診断後、さらなる分析及び治療のために患者を専門家に委ねることができる。その後、前の値と値の比較に基づいて以前に手術、放射線、または化学療法、またはこれらの組み合わせを受けていない対象に手術、放射線、または化学療法、またはこれらの組み合わせ、を受けさせることができる。対象にリスクファクター管理、または生活習慣、カウンセリングを提供することもできる。例えば、喫煙、飲酒、及び他のリスクがある行動に関して、対象をカウンセリングすることができる。例えば、対象を禁煙プログラムに登録することができる。

追跡測定及びアッセイに戻るように対象に求めることができる。毎週、毎月、６ヵ月毎、毎年、または５年毎、またはこれらの間の任意の時点に、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルについて対象を再試験することができる。本明細書に記載したとおり、専門医師への訪問及びリスクファクター管理カウンセリングとともに、これを行うことができる。

「対象の癌リスクを明らかにすること」は、バイオマーカーの組み合わせの過剰発現が、腫瘍、転移、または死の見込みの増加と関係していることを意味すること意図している。例えば、「対象の癌リスク」が１年以内、５年以内、１０年以内、またはこれ以上、またはこれらの間の任意の時点以内に癌または腫瘍、転移、または死の見込みが増すことを指すものとすることができる。コントロールと比べて、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはこれ以上ｓｏｌＣＤ４４または総タンパク質が過剰発現する可能性がある。

ＣＤ４４
頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の大半のケースで、ｓｏｌＣＤ４４が上昇しており、高特異度の良性疾患と癌を識別する。ＣＤ４４が正常な上部気道消化管上皮細胞の基底面上に発現する。ＣＤ４４発現が増加し、上皮細胞の全層に関与し、ケースの９０％で組織学的成形異常の変化を伴う。ＣＤ４４ｖが、マトリックスメタロプロテイナーゼと相互作用するため腫瘍発生を助長する。ＭＭＰ型１がＣＤ４４を切断し、可溶性形態（ｓｏｌＣＤ４４）とする。ＨＮＳＣＣ患者の経口うがい液ではｓｏｌＣＤ４４レベルが正常なコントロールより７倍高かったことを示している。ＨＮＳＣＣの８０％で、コントロールは上昇しなかったが、唾液ｓｏｌＣＤ４４が上昇した。

腫瘍生物学で知られる分子の役割に根ざしているＣＤ４４に基づくスクリーニングテストが発見された。タバコ誘発性遺伝的損傷の結果としてＣＤ４４が過剰発現し、腫瘍イニシエーションに必要である。腫瘍がＨＰＶ陽性であっても、ほとんどのＨＮＳＣＣが喫煙者に発症する（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ａｍｏｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＰＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ（２０１３）。それぞれが突然変異（Ｐｆｅｉｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｂａｃｃｏ ｓｍｏｋｅ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ，ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｐ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｍｏｋｉｎｇ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００２）２１：７４３５−５１）及び二本鎖切断（Ｗｅｒｂｒｏｕｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｇｅｎｅｓ： ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｏｂａｃｃｏ ｕｓｅ ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓ（２００８）６５６：７４−８１）に導くＤＮＡ付加物及び酸化損傷を引き起こすことによって、タバコの煙が損傷を誘発する。切断が正常に修復されない場合、遺伝子増幅などの遺伝的染色体異常が起こり（Ｍｏｎｄｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ −ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓ ２０１０；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＥＴ ｗｉｔｈ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｆｒａｇｉｌｅ ｓｉｔｅ ＦＲＡ７Ｇ ａｎｄ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＥＴ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００６）２５：４０９−１８；Ｊａｒｖｉｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｏｆ ｔｏｎｇｕｅ ａｎｄ ｌａｒｙｎｘ．Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ＆Ｃａｎｃｅｒ（２００８）４７：５００−９）、ＣＤ４４及び他の遺伝子生成物の過剰発現に導く（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＥＴ ｗｉｔｈ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｆｒａｇｉｌｅ ｓｉｔｅ ＦＲＡ７Ｇ ａｎｄ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＥＴ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００６）２５：４０９−１８；Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（１９７８））。ＣＤ４４が、代わりに結合したエキソン（エキソン５−１４）の共通領域及び可変領域を有する膜貫通糖タンパク質のファミリーを示している（Ｓｃｒｅａｔｏｎ ＧＲ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｈｏｍｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ４４ ｒｅｖｅａｌｓ ａｔ ｌｅａｓｔ １２ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｅｘｏｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２）８９：１２１６０−４）。ＣＤ４４アイソフォームが、細胞外マトリックス成分（ヒアルロン酸）（ＨＡ）、膜タンパク質（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２）、細胞骨格成分（エズリン、ラディキシン、モエシン及びメルリン）及び核内タンパク質（ＳＴＡＴ３）を含む多くの他の分子と相互作用し、結果として発癌シグナリングとなる（Ｐｏｎｔａ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ４４： ｆｒｏｍ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００３）４：３３−４５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｋｙｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＣＤ４４ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９４）１２６：１０９９−１１０９；Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡＴ３ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４４．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００９）１８５：９４９−５７）。このシグナリングは、さらに遺伝的損傷及び悪性形質転換を助長する細胞消滅（Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ４４ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＥＧＦＲ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ．（２０１３）４：３０６−１３；Ｌａｋｓｈｍａｎ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ４４ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ（２００４）７７：１８−２５）を抑制する。

ＣＤ４４は腫瘍発生の副生物だけでなく、腫瘍イニシエーションのドライバーであり、経口うがい液試験によって容易に及び非侵襲的に検出することができる。ＣＤ４４陽性（ＣＤ４４＋）である腫瘍細胞には、腫瘍開始能力がある（Ｐｒｉｎｃｅ ＭＥ，ｅｔ ａｌ ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００７）１０４：９７３−８）。数千個の細胞の注入によりＣＤ４４＋細胞が３０の移植のうち２０に腫瘍を生成したが、ＣＤ４４陰性（ＣＤ４４−）腫瘍細胞は、４０の移植のうち１つだけに腫瘍を生成した（Ｐｒｉｎｃｅ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００７）１０４：９７３−８）。

ＣＤ４４はヒアルロン酸の受容体であり、オステオポンチン、コラーゲン、及びＭＭＰなどの他の配位子と相互作用する可能性がある。ＣＤ４４は、細胞増殖、細胞分化、細胞移動、血管形成、対応する受容体にサイトカイン、ケモカイン及び成長因子の提示、及び細胞膜でのプロテアーゼのドッキング、ならびに細胞生存のシグナリングに関与している多構造及び多機能細胞表面分子である。これらの生物学的特性のすべては、正常な細胞の生理活性に不可欠であるが、癌細胞の病的活性とも関係している。Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｔｙｐｅ１ＭＭＰ（ＭＴ１−ＭＭＰ）などのプロテアーゼがＣＤ４４を切断しその可溶性形態（ｓｏｌＣＤ４４）とするため、ＣＤ４４発現は、体液中で容易に測定することができる（Ｋａｊｉｔａ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ １ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｃｌｅａｖｅｓ ＣＤ４４ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００１）１５３：８９３−９０４）。

開示したアッセイは、対象からの標本中でＣＤ４４（例えば、可溶性ＣＤ４４（ｓｏｌＣＤ４４））などの１つ以上のバイオマーカーの検出を含む。用いて対象のＨＮＳＣＣを診断及び監視することができるバイオマーカーの説明について、Ｆｒａｎｚｍａｎｎらによる米国特許第８，０８８，５９１号の全体が参照により組み入れられる。

ＣＤ４４は、多くの哺乳動物の細胞型で発現する。標準的なアイソフォーム、エキソン１−５及び１６−２０を含む指定したＣＤ４４は、ほとんどの細胞型で発現する。可変エキソンを含むＣＤ４４スプライス変種が指定したＣＤ４４ｖである。いくつかの上皮細胞はエキソンｖ８−１０を含むより大きなアイソフォーム（ＣＤ４４Ｅ）も発現する。ＣＤ４４タンパク質は、プロテアーゼを通じて可溶性形態（ｓｏｌＣＤ４４）でも放出される（Ｋａｊｉｔａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００１）１５３：８９３−９０４）ａｎｄ ａｒｅ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（Ｎａｏｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９７）７１：２４１−３１９；Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９４）５４：４２２−６；Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ（１９９７）７４：４４３−５；Ｒｉｓｔａｍａｋｉ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０：４０３９−４５；Ｙａｍａｎｅ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９９）５６：２３２−８；Ｓｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ（２０００）９：１２１１−４；Ｖａｎ Ｈａｌ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９９）５：３５３４−４）。ｓｏｌＣＤ４４の循環レベルがいくつかの腫瘍の転移と関係している（Ｒｉｓｔａｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０：４０３９−４５；Ｙａｍａｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９９）５６：２３２−８）。

イムノアッセイによってｓｏｌＣＤ４４を測定することができる。イムノアッセイとしては、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＭＥＬＩＳＡ、ＣＥＤＩＡ、イムノスクリーニング、ラテラルフロー試験（ラテラルフローアッセイ）、磁気イムノアッセイ、放射性イムノアッセイ、またはサラウンドオプティカルファイバーイムノアッセイ（ＳＯＦＩＡ）が挙げられる。別の例としては、エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラテラルフローアッセイが挙げられる。

総タンパク質
総タンパク質（ＴＰ）は、本明細書で言及する場合、標本、例えば、経口うがい液に存在する全タンパク質の量である。溶液中のタンパク質の最も単純で最も直接的なアッセイ方法は２８０ｎｍ（紫外線の範囲）で吸光度を測定することである。芳香族側鎖（すなわち、チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニン）を含有するアミノ酸は、強力な紫外線吸光度を示す。このため、タンパク質及びペプチドは、その芳香族アミノ酸含有量及び総濃度に比例して紫外線を吸収する。ＨＰＬＣによるアミノ酸分析に従来より用いられるもうひとつの方法は、ニンヒドリンまたはオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）などの着色または蛍光色素で全第一級アミン（すなわち、リジン残基のＮ−末端及び側鎖）標識付けすることである。いくつかの比色、試薬に基づくタンパク質アッセイ技術も知られている。タンパク質を試薬に添加し、添加した量に比例して色が変化する。公知の精製参照タンパク質の濃度からなる標準曲線を参照してタンパク質濃度を決定する。

総タンパク質アッセイの例としては、ブラッドフォードアッセイ、ローリーアッセイ、改良ローリー、及びピアースＢＣＡタンパク質アッセイが挙げられる。ローリーアッセイは、溶液中のタンパク質の総レベルを測定するための生化学的アッセイである。総タンパク質濃度は、タンパク質濃度に比例する標本溶液の色の変化によって示され、その後、比色技術を用いて測定することができる。本明細書に開示した方法で用いることができるローリーアッセイの改良もある。１つの実施例がＰｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９７７）８３（２）：３４６−３５６）にみられる。

統計的分析
本明細書に開示したとおり、健康な個体及び癌の個体の集団からのｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを用いることによって、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルを測定することができ、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルが癌のさまざまな、統計的に有意なリスクの範囲を定める。これらの参照レベルを、ロジスティック回帰計算などの統計的分析にかけることができる。統計的分析に多変量分析を用いることもできる。多変量分析でロジスティック回帰計算を用いる方法が当技術分野に知られており、例えば、米国特許第６，１１０，１０９号に記載されており、参照により全体が本明細書に組み入れられる。

健康な個体、ならびに癌の個体からのｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルを回帰分析にかけることができる。例えば、ＨＮＳＣＣなどの特定の型の癌の個体にこの分析をかけることができることに注目する。これらのスコアを分析して癌リスクの統計的に有意な境界を決定することができる。これらのスコアが得られると、これらのスコアを本明細書に開示した方法に適用し、患者のｓｏｌＣＤ４４の試験量及び総タンパク質の試験量がｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベル以上または以下であるかを明らかにすることによって対象の癌リスクを明らかにすることができる。この比較に基づいて個々の患者のリスクレベルを評価することができる。

ロジスティック回帰を計算する方法、ならびに多変量分析方法が、Ｇａｒｅｔｈ Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）．Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｐ．６；Ｈａｒｒｅｌｌ，Ｆｒａｎｋ Ｅ．（２００１）．Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．ＩＳＢＮ ０−３８７−９５２３２−２；Ｈｏｓｍｅｒ，Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（２ｎｄ ｅｄ．）．Ｗｉｌｅｙ．ＩＳＢＮ ０−４７１−３５６３２−８；Ｍｅｎａｒｄ，Ｓｃｏｔｔ Ｗ．（２００２）．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（２ｎｄ ｅｄ．）．ＳＡＧＥ．ＩＳＢＮ ９７８−０−７６１９−２２０８−７；Ｃｏｈｅｎ，Ｊａｃｏｂ ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ／Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（３ｒｄ ｅｄ．）．Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ．ＩＳＢＮ ９７８−０−８０５８−２２２３−６；Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ 及び Ｍａｓｓ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｓｓｕｅｓ．Ｔｈｅ Ａｐｐｒａｉｓａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｊａｎ．ｐｐ．８９−１０９）に開示されており，すべてがロジスティック回帰計算及び多変量分析に関係する技術について参照により全体として本明細書に組み入れられる。

標本採集
本明細書に開示した方法に用いられる標本は、任意の体液から得ることができる。例えば、体液は、経口うがい液、唾液、痰、呼気凝縮液、血液、血漿、血清、及び尿からなる群から選択することができる。好ましくは、標本は、唾液または経口うがい液である。多くの方法を用いて唾液を採集することができる。１つの一般的な方法は、全唾液採集である。唾液は、前口腔から採集され、ある一定の時間をかけることが多く、大半が静止状態下で放出される。経口うがい液は、口の中で扱われ、口腔、喉頭及び咽頭の内面に付着した物質を放出するのを助ける一定量の液体を使用し、生理食塩水の場合が多い。

経口うがい液標本を得る前に対象に摂食、飲用、または喫煙を控えるよう求めことができる。例えば、対象に１０、２０、３０、４０、５０、または６０分間またはそれ以上控えるように求めることができる。

癌
本明細書に開示した方法を用いて、任意の種類の癌、または一種類以上の癌の組み合わせを検出することができる。例としては、これらに限定されないが、白血病、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、固形腫瘍、肉腫及び癌腫、繊維肉腫、粘液肉、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊椎腫、血管肉腫、内皮細胞血症、リンパ管肉腫、ａリンパ管内皮肉腫、滑膜肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横絞筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、膠様腺癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛膜癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮細胞癌、神経膠腫、星膠腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上皮腫、松果体腫瘍、血管芽腫、内耳神経鞘腫、乏突起膠腫、メナンギオーマ（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経細胞腫、及び網膜芽腫が挙げられる。（かかる障害の再検討には、Ｆｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２ｄ Ｅｄ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照）
特に、癌は、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、黒色腫、白血病／リンパ腫、乳癌、及び骨肉腫からなる群から選択することができる。

特に、増生、変質形成からなる非新生物細胞成長または最も具体的には、形成異常が起こる、新生物または癌への進行より前に起こる「前癌」も本明細書に開示している（かかる異常な成長状況の再検討には、Ｒｏｂｂｉｎｓ 及び Ａｎｇｅｌｌ，１９７６，Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８−７９を参照）。増生は、構造または機能の有意な変性がなく、組織または器官の細胞数の増加に関与している制御された細胞増殖の形態である。ただ１つの例として、子宮内膜増生が子宮内膜癌より前に起こることが多い。変質形成は、１つの種類の成人または完全分化細胞がもうひとつの種類の成人細胞の代わりになる制御された細胞成長の形態である。変質形成は、上皮または結合組織細胞で起きる可能性がある。典型的な変質形成は、いくぶん無秩序な化生性上皮細胞を含む。形成異常は癌の徴候であることが多く、及び主に上皮でみられ、非新生物細胞成長の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性及び細胞の構造的指向の損失に関係している。形成異常細胞には異常に大きく、濃く着色した核があることが多く、多形態性を示す。形成異常は、特徴的に慢性刺激または炎症が存在するところに起き、子宮頸部、呼吸通路、口腔、及び胆嚢にみられることが多い。

患者のリスク
総タンパク質及びｓｏｌＣＤ４４の測定値以外のリスクファクターについて本明細書に開示した対象を分析することができる。例えば、患者のリスクファクターは、飲酒、喫煙、またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を含むことができる。患者のリスクファクターは、もうひとつの癌マーカーに関する実験結果も含むことができる。

従来より、ＨＮＳＣＣの８０％−９０％が喫煙及び飲酒に起因している（Ｓｔｕｒｇｉｓ，ｅｔ ａｌ．癌（２００７）１１０：１４２９−３５）。喫煙者がＨＮＳＣＣを発症するリスクは、非喫煙者より５〜２５倍大きく、リスクは喫煙の頻度、期間、及び程度による用量反応方法で増加する（Ｍａｒｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｃ．（２００８）８３：４８９−５０１；Ｓｔｕｒｇｉｓ，ｅｔ ａｌ．癌（２００７）１１０：１４２９−３５；Ｒａｇｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ（２００７）８６：１０４−１４；Ｃｕｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｎｃｏｌ．（２００９）２１：１９４−２００）。このリスクが喫煙経験のない者のレベルに達することはないが、リスクは、禁煙から時間が経つにつれて実質的に減少する（Ｓｃｈｌｅｃｔ，ｅｔ ａｌ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ（１９９９）１０：４１２−１８；Ｂｏｓｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ（２００８）１６７：４６８−７３）。あるイタリア人の研究で、７５歳で全上部気道消化管癌となる累積リスクは、任意の種類のタバコの喫煙を継続した男性で６．３％、５０歳あたりで喫煙を停止した男性で３．１％、３０歳あたりで喫煙を停止した男性で１．２％、及び生涯非喫煙者で０．８％であったことがわかった（Ｂｏｓｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．（２００８）１６７：４６８−７３）。能動喫煙はＨＮＳＣＣの主なリスクファクターであるが、受動喫煙または間接喫煙も癌リスクの増加と関係している。国際的プール分析では、受動喫煙は、家庭及び職場ともに、１５年以上にわたって起きると記載されており、受動喫煙に長期にさらされることは、ＨＮＳＣＣ、特に咽頭及び喉頭癌のリスクの増加と関係していた（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．癌 Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ（２００８）１７：１９７４−８１）。

アルコールが相乗作用で喫煙に起因するＨＮＳＣＣリスクを増加させることも示されている（Ｒａｇｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ（２００７）８６：１０４−１４）。多量のアルコール消費だけでもＨＮＳＣＣの独立したリスクファクターである。１日当たり３回以上の飲酒と定義される高頻度の飲酒が、口部、下咽頭、及び喉頭の癌リスクの増加と独立して関係していた（Ｈａｓｈｉｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（２００７）９９：７７７−８９）。

ＨＮＳＣＣと関係している多のリスクファクターは、食様式、ウイルス、及び職業被暴を含む。多くの試験ではＨＮＳＣＣをビタミンＡ不足と関係づけ、一方、他の試験では果物及び野菜摂取の多さとの逆の相関を記載している（Ｍａｒｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｃ．（２００８）８３：４８９−５０１；Ｃｕｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｎｃｏｌ．（２００９）２１：１９４−２００）。関係するウイルスは、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を含み、クロム、ニッケル、及びラジウムなどの職業被暴も特に副鼻腔癌と関係している（Ｍａｒｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｃ．（２００８）８３：４８９−５０１）。

ＨＰＶ
喫煙−関連ＨＮＳＣＣの発症は、１９７５年以来、米国で減少しており、一方、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に起因する可能性があるＨＮＳＣＣの割合は増加している。毎年、米国だけでＨＰＶ−関連口咽頭扁平上皮癌（ＯＰＳＣＣ）の２，３７０件を超える新たなケースが女性で診断され、約９，３５６件のケースが男性で診断されている。性的に活動的な女性の子宮頸部のＨＰＶ感染の推定生涯リスクは最大８０％である。ＨＰＶと誘発された口咽頭癌、及び子宮頚部癌との免疫学的関連が本明細書に開示されている。ＰＤ−１（プログラム細胞死）受容体は、腫瘍の免疫回避の一般的な関係である（２００８，Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２００８；Ｇｏｏｄｍａｎ，ＭＴ，ｅｔ ａｌ．；２０１２，Ｌｙｆｏｒｄ−Ｐｉｋｅ，Ｓ，ｅｔ ａｌ．）。
ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルの組み合わせは、コントロールとＨＮＳＣＣを識別するのにいずれかのマーカーだけより効果的である。しかし、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染の対象では、ｓｏｌＣＤ４４レベルが低い可能性がある。実際、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを用いる二変量分析が、ＨＰＶ感染がみられることが少ない黒人女性で最もうまく機能する。このため、ＨＰＶ状態を多変量分析に含めるとアッセイの感度及び精度を改善し及びＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣを検出することができる（実施例２）。

総タンパク質、ｓｏｌＣＤ４４、及びＨＰＶ検出と、ＨＮＳＣＣ検出または予後に関係した他のバイオマーカーを併用して、開示した方法の感度及び／または精度を改善することができる。例えば、年齢及び喫煙状態に基づいてｓｏｌＣＤ４４レベルを変えることができる。多変量分析に用いることができるＨＮＳＣＣリスクファクター及び人口学的因子の例としては、タバコ被爆、アルコール被爆、人種、民族特性、歯科衛生、性別、教育レベル、年齢、一般的健康、癌の家族歴、性行為に関する病歴及び社会経済状態が挙げられ、多変量分析に１つ以上のリスクファクターまたは人口学的因子を用いて複合スコアを決定する。

直接または間接にＨＰＶを測定することによってＨＰＶ感染を測定することができる。３つのカテゴリーの分子アッセイが、現在、組織及び剥離した細胞標本のＨＰＶ感染の検出に利用できる。すべてが、（１）非増幅ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットハイブリダイゼーション（ＳＴＨ）、ドットブロットハイブリダイゼーション（ＤＢ）及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ））；（２）ハイブリッドキャプチャーアッセイなどのシグナル増幅ハイブリダイゼーションアッセイ；及び（３）、ＰＣＲ及びｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲなどの標的増幅アッセイを含むＨＰＶＤＮＡの検出に基づいている。サザンブロットハイブリダイゼーションは大量のＤＮＡを必要とし、困難なものであり、再現可能ではなく、一方、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは中程度のＨＰＶ感度にすぎない。ＰＣＲに基づくＨＰＶの検出は、きわめて感度が高く特異的である。このアプローチを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによってｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルスＤＮＡを増幅し、十分な量の標的を生成し、その後、ゲル上に直接視覚化する、または（さらに特異的なアプローチ）従来のハイブリダイゼーション法を用いて特異的プローブによって検出する。実際には、ＰＣＲに基づく方法の感度は、１００ｎｇ細胞ＤＮＡのバックグラウンドで約１０〜１００ＨＰＶウイルスゲノムである。ＰＣＲは、きわめて少量のＤＮＡ（１０〜１００ｎｇ）上で実施することができるため、ＤＮＡ含有量の少ない試験片に用いるのに理想的なものである。

遺伝因子
他の例では、本明細書に開示した方法には１つ以上の以下の癌の準備因子を示す患者を選択することができる。癌に関係した染色体転座、家族性ポリポーシスまたはガードナー症候群（結腸癌の徴候の可能性）、良性単クローン免疫グロブリン血症（多発性骨髄腫の徴候の可能性）、及びメンデル（遺伝）遺伝様式を示す癌または前癌の疾患がある人と一親等（例えば、結腸の家族性ポリポーシス、ガードナー症候群、遺伝的外骨腫、多内分泌腺腫症、アミロイド産生甲状腺髄様癌及び褐色細胞種、ポイツ−ジェガース症候群、フォンレックリングハウゼン神経線維腫症、網膜芽細胞腫、頸動脈体腫瘍、皮膚黒色癌、眼内黒色癌、色素性乾皮症、毛細血管拡張性失調症、チェディアック−ヒガシ症候群、白皮症、ファンコニ再生不良性貧血、及びブルーム症候群；Ｒｏｂｂｉｎｓ ａｎｄ Ａｎｇｅｌｌ，１９７６，Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．１１２−１１３）等を参照）。
ＨＡ及びＨＡａｓｅ
標本中でヒアルロン酸（ＨＡ）及びヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）のレベルも測定することができる。ＨＡは非硫酸化グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、特定の癌に過剰発現する。ＨＡは、ヒアルロナン合成酵素によって細胞の表面に合成され、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二糖繰り返し単位からなる。ＨＡは、体液、組織、及び細胞外マトリックスに存在する。ＨＡは、細胞表面受容体（例えばＣＤ４４、ＲＨＡＭＭ等）と相互反応し、この相互反応により、細胞付着、移動、及び増殖を調節する。腫瘍の種類に応じて、ストローマ細胞、腫瘍細胞または両者によりＨＡを合成することができる。腫瘍組織では、ＨＡが腫瘍細胞移動を促進すること、免疫監視に対する保護を与えること及び細胞成長及び移動の接触媒介抑制（ｃｏｎｔａｃｔ−ｍｅｄｉｃａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）一部を失わせることによって転移を助長する。ＨＡの小フラグメントは脈管形成性であり、膀胱癌患者の尿、前立腺癌組織、及びＨＮＳＣＣ患者からの唾液から分離されている。ＨＡの濃度は、結腸、乳、前立腺、膀胱及び肺癌を含むいくつかの癌で上昇している。結腸及び乳腺などの腫瘍での組織発現が、予後不良を示す。

ＨＡａｓｅは、ＨＡを小さな脈管形成性ＨＡフラグメントに分解するエンドグリコシダーゼである。ＨＡ及びＨＡフラグメントが、フォーカルアドヒージョンキナーゼ及びＭＡＰキナーゼ経路を活性化することによって内皮細胞の増殖、付着及び移動を刺激する。ＨＡａｓｅがＣＤ４４アイソフォームの発現を変え、腫瘍細胞循環の増加と関係している。異なる遺伝子によってコード化された６つのヒトＨＡａｓｅのうち３つは、タンパク質レベルで特徴づけられる。

キット
生理食塩液；経口生理食塩すすぎ液を受けるためのカップ；特異的にＣＤ４４を結合する少なくとも１つの抗体；総タンパク質濃度を測定するための試薬；ならびに健康な個体及び癌の個体の集団からのｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを用いることによってｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルが測定され、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルがさまざまな、統計的に有意な癌リスクの範囲を定める、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルを含むキットも本明細書に開示される。

以下の実施例を記載し、開示した構成要件に従った方法、組成物、及び結果を示す。これらの例が本明細書に開示した構成要件の全態様に含まれることを意図しておらず、代表的な方法、組成物、及び結果を示すことを意図している。これらの実施例は本発明の均等物及び変更を除外することを意図しておらず、当業者に明らかである。

実施例１：ＣＤ４４及び総タンパク質の経口うがい液試験
ｓｏｌＣＤ４４／総タンパク質経口うがい液試験は、初期及び浸襲性ＨＮＳＣＣを同定するための強力な手段である。癌ケース１５０例及びクリニックに基づく、頻度が一致したコントロール１５０例の試験では、経口うがい液ＣＤ４４／総タンパク質試験が黒人男性のサブセットで約９０％の精度でＨＮＳＣＣケースをコントロールと識別した。ケース中のｓｏｌＣＤ４４の高レベルが、タンパク質レベル、疾患の種類（口部、口腔）、腫瘍ステージ、及び他の補助変量に関係なく無憎悪生存率（ＰＦＳ）及び全生存率（ＯＳ）の低さと関係していた。

ｓｏｌＣＤ４４／タンパク質経口うがい液試験の特異度は、地域に基づいたコホートで予期したものより優れている。マイアミデイド郡に位置する社会経済的恵まれない市（「地域コホート」）（Ｄｉｅｔｚ ＮＡ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｂｕｒｄｅｎ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐａｔｉａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｊ Ｃａｒｃｉｎｏｇ ２０１１；１０：２２）、北中部のマイアミデイド郡の少数が富む、経済的恵まれない地域を含むサウスフロリダでは、喫煙率の高さ及びいくつかのタバコに関連した癌のクラスターがある。サウスフロリダの他の地域と比べて地域コホートクラスターの癌の率がすべて有意に高かった：肺相対リスク（ＲＲ）＝１．４；ｐ＜０．０００１；口腔ＲＲ＝１．５；ｐ＜０．０１；及び子宮頚部ＲＲ＝２．６；ｐ＜０．０００１（Ｄｉｅｔｚ ＮＡ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｂｕｒｄｅｎ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐａｔｉａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｊ Ｃａｒｃｉｎｏｇ ２０１１；１０：２２）。地域コホートのＨＮＳＣＣ初期検出及び予防プログラムが開発された。この高リスク集団のＣＤ４４及びタンパク質レベル及び経時的なその変動を評価し、禁煙の結果、レベルが減少したかどうかを明らかにした。経口うがい液試験が受け入れ可能かどうかも評価した。地域コホートからの対象で経口うがい液試験の特異度を確認し、この試験が１００％感度及び９２％特異度で黒人男性ＨＮＳＣＣケース（クリニックに基づいた試験に登録した）を地域コホートコントロールと識別することがわかった。「偽陽性」７例のうち、１例が確認された肺癌癌を発症し、もうひとつの例は口腔前癌が疑われる。経口うがい液試験はうまく受け入れられている。さらに、年１回の来院に戻った対象では平均ｓｏｌＣＤ４４レベルが９％減少し、癌リスクがスクリーニングコホートで減少する可能性があることを示している。このため、このプログラムは、有意に及び確かにＨＮＳＣＣのリスクがある患者に影響を与えることができる。

データ
ＣＤ４４は腫瘍イニシエーション及び進行に関与している：ＣＤ４４は細胞表面に発現する膜貫通タンパク質である及び腫瘍イニシエーションに関与している。正常な粘膜では、ＣＤ４４ステイニングは基底層及び傍基底層に限定されるが、増加すると形成異常及び浸潤癌を増やす全層に関与する。低分化腫瘍は、血管周囲に及び癌膨張の領域の周囲に局所ＣＤ４４ステイニングを示す（Ｇｅｒｍａｎｉ，Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ ２００９；１４１：５２−８）。ＣＤ４４のノックダウンがヌードマウスの腫瘍成長をきわめて減らすことを示している（図 １Ａ）（Ｐ＜０．０５）（Ｐｅｒｅｚ Ａ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ４４ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＥＧＦＲ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１３；４：３０６−１３）。図１Ｂは、表皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ＨＮＳＣＣの主な分子ドライバー、及びそのリン酸化形態（Ｙ１０６８）が、ＣＤ４４−ｓｉＲＮＡ上で減少することを示し、２つの分子が機能的に関係していることを示している。

腫瘍イニシエーションでのＣＤ４４の公知の役割のため（Ｐｒｉｎｃｅ ＭＥ，ｅｔ ａｌ ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００７；１０４：９７３−８）、癌患者及びコントロールからの経口うがい液でｓｏｌＣＤ４４を評価した。試験が正確にＨＮＳＣＣを正常なコントロール及び頭頚部の良性の疾患のコントロールと識別することを示している（Ｆｒａｎｚｍａｎｎ ＥＪ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４４： ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００５；１４：７３５−７３９；Ｆｒａｎｚｍａｎｎ ＥＪ，ｅｔ ａｌ．Ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４４ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００７；１６：１３４８−１３５５；Ｆｒａｎｚｍａｎｎ ＥＪ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｓｏｌＣＤ４４ ｌｅｖｅｌｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ．２０１２；３４：６８７−９５）。単純なローリー−様アッセイによって測定した総タンパク質が、コントロールと比べてＨＮＳＣＣで上昇したこと（Ｆｒａｎｚｍａｎｎ ＥＪ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｓｏｌＣＤ４４ ｌｅｖｅｌｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ．２０１２；３４：６８７−９５）及びｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを組み合わせるといずれかのマーカーだけよりＨＮＳＣＣをコントロールとさらに効率的に識別することも発見した（Ｆｒａｎｚｍａｎｎ ＥＪ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｓｏｌＣＤ４４ ｌｅｖｅｌｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ．２０１２；３４：６８７−９５；Ｐｅｒｅｉｒａ ＬＨ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｄａｔａ： ａ ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ．２０１１；１０：２４１−９）。

多施設、盲検化、頻度−一致、ケース−コントロール試験（＝３００）：
口腔癌ケース１５０例及び頻度一致、クリニックに基づいたコントロール１５０例を登録した。２００７年及び２０１２年の間に、マイアミ大学メディカルキャンパスのプライベートプライマリケアクリニック及びジャクソン記念病院系によって運営されるインナーシティカウンティクリニック、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｒｅａｖｅｓ，Ｓｒ．Ｈｅａｌｔｈ Ｃｅｎｔｅｒからコントロールを登録した。ｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質アッセイを実行しているとき試験担当者にケース−コントロール状況を盲検化した。盲検解除前にＰＩにより適格決定を行った。

７８％に喫煙歴があり、約５０％が中程度または重度の飲酒を認めたため、ケース及びコントロールのコホート全体（ｎ＝３００）がタバコ関連癌のリスクが高かった。両群の約４０％が口腔衛生不良による６本以上の歯の欠損があった。ケース群は、５３％ＪＭＨの（カウンティホスピタル）対象を含み、４４％が６０歳以上であり、８１％が男性であり、１７％が黒人であり、及び５１％がヒスパニックであった。年齢、性別、人種、民族特性、口腔衛生（抜歯の数）、これまでの喫煙歴、アルコール習慣またはプライベートホスピタルシステムに対するカウンティの登録数を含む主な補助変量に関してケース及びコントロールの間に有意な差はなかった（ｐ＜０．０５）。

コントロールに比べてケースでｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルがともに上昇した（ｓｏｌＣＤ４４： ５．５０ｎｇ／ｍＬ対２．８７ｎｇ／ｍＬ，ｐ＜０．０００１；タンパク質： ０．９４ｍｇ／ｍＬ 対０．７６ ｍｇ／ｍＬ，ｐ＝０．００７）。ケース及びコントロール群の間及び内でリスクファクターまたは人口学的変数の差に基づいてマーカーレベルを検討した。年齢、性別、人種／民族特性、喫煙習慣または飲酒習慣を考慮した場合、ｐ＜０．０５レベルのコントロールに比べてケースでｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質レベルが一般的に高かった年齢に基づいたｓｏｌＣＤ４４レベルの有意な差（高齢患者のレベルが高い）がケース群にみられた。

ステージ及びｐ１６状態（組織が入手できる場合に測定したＨＰＶの代用）などの腫瘍特性（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ａｍｏｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＰＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１３）は、腫瘍サイズによる差（Ｔ１−Ｔ２対Ｔ３−Ｔ４；ＣＤ４４：４．２３ｎｇ／ｍＬ対６．４ｎｇ／ｍＬ，ｐ＝０．０２６）がＣＤ４４でみられたがｌｏｇＣＤ４４でみられなかったことを除いて、ｓｏｌＣＤ４４またはタンパク質レベルに有意に影響を与えなかった。これらの所見に基づいて、ｌｏｇ２ ｓｏｌＣＤ４４、タンパク質及び年齢に基づいてＨＮＳＣＣをコントロールと識別するためにロジスティック回帰モデルを開発した。きわめて高いリスク及びさまざまなコホートにもかかわらず、曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定したとおりモデルは精度が０．６９であった（表３）。

アフリカ系アメリカ人（特に男性）は、不均等に口腔癌を患い、全生存率が低い。集団間の差を評価するためにｓｏｌＣＤ４４、タンパク質及び年齢を含む多変量ロジスティック回帰モデルを用いて人種、民族特性及び性別によってサブセット分析を実施した。黒人男性サブセットの結果は、モデルがＡＵＣ＝０．８９で正確にＨＮＳＣＣ患者をコントロールと識別することを示している（表４）。各黒人男性対象について回帰モデルに基づいた確率スコアを計算した。予測確率が０．３４１８を超えるまたは０．３４１８に等しいと観測を予測した。このカットポイントで、感度が１００％であり及び８７．１％の精度で特異度が７１．４％であった。

他の人種／民族特性及び性別群では、ｓｏｌＣＤ４４，タンパク質及び年齢を含む予測モデルの結果、以下のＡＵＣであった：白人非−ヒスパニック男性＝０．７６；白人ヒスパニック男性＝０．７６；全女性＝０．６４。おそらく小さな標本のサイズのせいで、黒人男性の年齢、及び白人、ヒスパニック男性の年齢、ｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質を除いて、個々のモデル成分のオッズ比は、有意に至らなかった（以下の表５）。このように、黒人男性と異なり、ヒスパニック男性のタンパク質レベルは、有意な保護効果と関係していた。

地域コホート初期検出及び予防試験：Ｂａｎｋｈｅａｄ−Ｃｏｌｅｙ（ＢＨＣ）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｇｒａｎｔを用いて地域コホートのｓｏｌＣＤ４４／タンパク質試験を試験した。黒人対象１５０例を登録し、試験し、ベースラインのマーカーレベルを得た。ＢＨＣ対象は、平均で１０歳若く（５１歳対６１歳、ｐ＜０．０５）、ＢＨＣ試験のヒスパニック黒人の割合が小さかった（＜１％対２７％、ｐ＜０．０５）ことを除いてリスクファクター及び人口統計の点でクリニックに基づいた試験からの黒人ケースとほぼ同じであった。クリニックに基づいた試験の黒人男性に対して導出したモデル及びカットポイント（表５）をＢＨＣ試験の黒人男性に適用し、及び８１例（９２．０５％）をコントロール及び７例（７．９５％）をケースと予測したことがわかった。これらの７例の「偽陽性」のうち１例が、ベースラインの陽性ｓｏｌＣＤ４４／タンパク質試験の１４ヵ月後、生検によって診断された肺癌を発症した。もうひとつの対象は前立腺癌の病歴があり、正常なベースライン試験であったが、確率マーカー結果は高かった。彼は経口うがい液採集の９ヵ月後に厄介な白板症を発症し、続く年１回の来院には進行していた。この対象のマーカーレベルは上昇しており、生検は保留中である。このようにいくつかの「偽陽性」でもおそらく真陽性であり、疾患を発症する、または遠隔疾患であった。

マーカー試験は、クリニックに基づいたコホートより地域に基づいたＢＨＣコホートで特異的である（９２％対７１．４％）。ｓｏｌＣＤ４４レベルは、黒人のクリニックに基づいたコントロールコホートよりＢＨＣコホートで低く、ｌｏｇ２ ＣＤ４４について有意に近い傾向に至っている（ＣＤ４４：１．８５ｎｇ／ｍＬ対２．６７ｎｇ／ｍＬ，ｌｏｇ２ＣＤ４４：０．６９ｎｇ／ｍＬ対１．１４ｎｇ／ｍＬ；ｐ＝０．０５７）。これはクリニックに基づいたコホートが地域に基づいたコホートよりリスクが高い群であることを示している。これを裏付けるものとして、ＢＨＣコホートの１％未満に対してクリニックに基づいた対象１５０例の１０％以上に以前に癌の病歴があった。癌の病歴があるクリニックに基づいたコントロールは、以前に癌のないコントロールと比べてｓｏｌＣＤ４４（中央値３対２．２ｎｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０５）及びタンパク質（中央値１．０３対０．６４ｍｇ／ｍＬ、ｐ＜＝０．０５）レベルが有意に増加した。

頻度一致基準のためクリニックに基づいた試験では黒人女性ケース９例であった。男女ともにモデルが好ましいＡＵＣを示した（表６）。

癌が目に見える前にｓｏｌＣＤ４４／タンパク質試験が癌を検出する：初期試験（１８）からのコントロール対象２例が経口うがい液のｓｏｌＣＤ４４レベルが上昇し、疾患はなく（偽陽性−）、２〜３年後に重度の形成異常及び浸潤癌を発現した。さらに、回帰木モデルに基づいたリスクがあり、クリニックに基づいたコントロールの参加者２例が、追跡期間にｉｎ ｓｉｔｕで癌または浸潤癌を発症した。ＢＨＣ試験からの患者１名が現在、肺癌を発症しており、診断の１４ヵ月前にマーカーレベルが上昇していた。厄介な口腔病変、前立腺癌の病歴があり、ｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質レベルが上昇している、もうひとつの対象が口腔の生検を保留している。

ｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質レベルの上昇は予後不良と関係している：図２Ａ−Ｃが追跡期間があるクリニックに基づいたケース１５０例のうちの１３７例のＰＦＳを示している。評価可能対象１４９例のうち死亡例５９例（追跡期間中央値２２．９ヵ月、範囲：０．７〜６５．１ヵ月）及び評価可能対象１３７例のうち進行事象６８例であった。平均３年ＰＦＳ及び全生存率（ＯＳ）が、それぞれ４８．８％及び５４．７％であった。ｓｏｌＣＤ４４（＞１０ｎｇ／ｍＬ）及び総タンパク質（＞１ｍｇ／ｍＬ）の高レベルは、ＰＦＳの減少と関係していた。単変量分析では、ＰＦＳ及びＯＳの予測変数は、ＣＤ４４（連続／カテゴリカル変数として）、タンパク質（連続／カテゴリカル変数）、ステージ、Ｔ４ステージ、人種（黒人人種の転帰の悪化）、及び年齢であった。性別、喫煙及びアルコール状態も、部位（口部、口腔）も有意な予測変数ではなかった。Ｐ１６だけがケースのサブセットに利用できた；ｐ１６−対ｐ１６＋の効果はＰＦＳで有意であったが（ＨＲ２．２０１，ｐ＝０．０４５８，ｎ＝７３）ＯＳでは有意ではなかった（ＨＲ１．５３１ｐ＝０．２９４１，ｎ＝７９）。逐次選択を用いて、モデルのＣＤ４４及びタンパク質にｐ１６を除く多変量分析した結果、ＣＤ４４、タンパク質、ステージ、人種、及び年齢を含むＰＦＳ及びＯＳの共通モデルとなった。このモデルのもとでは、ＰＦＳ（ＨＲ２．６２８、９５％ＣＩ：１．３２５、５．２１０，ｐ＝０．００５７）及びＯＳ（ＨＲ２．１０３、９５％ＣＩ：１．０３１、４．２９１、ｐ＝０．０４１１）の両者でｓｏｌＣＤ４４レベル≧１０の独立したリスク効果があった。タンパク質≧１ｍｇ／ｍＬのリスク効果はＰＦＳでは有意に近づいたが（ＨＲ１．５７１、９５％ＣＩ：０．９０６、２．７２５，ｐ＝０．１０７９）ＯＳでは有意ではなかった（ＨＲ１．４５９、ｐ＝０．２１５）。これらの所見は、ｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質レベルの上昇がさらに浸襲性の疾患と関係していることを示している。このように経口うがい液試験は、初期検出が最も必要な疾患を同定することができる。

経口うがい液試験を用いてＨＮＳＣＣをスクリーニングすると遠隔部位で癌を検出する：前立腺（７）、結腸（２）、膀胱（２）、黒色腫（２）、白血病／リンパ腫（１）、乳腺（１）、及び骨肉腫（１）を含む他の部位で以前に癌の病歴があるクリニックに基づいたコントロールでｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質レベルが上昇していた。マーカーがＵＡＤＴ以外の癌リスクを表すことでＢＨＣコントロールの１例が経口うがい液マーカー上昇試験の１４ヵ月後に肺癌を発症した。クリニックに基づいた試験では、採集時にＵＡＤＴ以外の部位に癌があることを発見したら、主要な分析からケース及びコントロール参加者を除外した。この理由によりケース２例及びコントロール３例を除外した。結腸及びＨＮＳＣＣに癌があるケース１例では、正常なレベルの２２倍であるｓｏｌＣＤ４４レベル６４．２ｎｇ／ｍＬであった。遠隔癌があるコントロール３例のうち１例には、膀胱癌があり、ｓｏｌＣＤ４４レベル１４ｎｇ／ｍＬ及びタンパク質レベル１．５ｍｇ／ｍＬであった。軽度口腔前癌の可能性のために除外したもうひとつのコントロールでは、ｓｏｌＣＤ４４レベル４．８ｎｇ／ｍＬ及びタンパク質レベル１．３ｍｇ／ｍＬであり、進行して肺癌．を発症した。このデータはｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質レベルが、臨床的に認識する前にさらに遠隔部位の疾患を示すことができることを示している。

実験手順１
地域コホート登録及びスクリーニング部位：１週間に１０００個体に食事を出す地域コホートのフードバンクならびに住宅団地の対象を登録した。Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ’ｓ Ｄｉｓｐａｒｉｔｉｅｓ及びＣｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｏｕｔｒｅａｃｈ Ｃｏｒｅ（ＤＣＯ）がこの地域に基づいた協力の成功を促進した。

対象：２年で対象１５０例の登録を終了した。生涯に１００本以上の喫煙歴があり４０歳以上であれば、患者を登録した。平均年齢は５１．２歳であり、５８．７％が男性であり、１００％が黒人であり、９９．３％が非−ヒスパニックであった。参加者１１７例を登録した。このうち、７４例が第１回及びまたは第２回の年に１度の追跡調査に戻り、５例がまだ追跡期間中にある。

質問票：以下の内容について、臨床研究担当者は結果の解釈に影響を与える可能性がある補助変量について詳細な情報を収集するために質問票に記入させた。質問票はＢＲＦＳＳ調査に基づいており、年齢、人種、民族特性、性別、喫煙及び飲酒、社会経済状態（ＳＥＳ）、教育、栄養及び口腔衛生に関する質問を含む（調査文書を参照）。これらのうちのすべてが頭頚部癌のリスクファクターの可能性があることを示している。ＵＡＤＴの良性疾患に関係した症状及び病歴に関して患者に質問し、癌を含む器官系疾患の再検討を実施する。参加者が処方箋医薬品、ハーブ療法、処方箋なしの医薬品及びビタミンを記入し、最近いつ喫煙した、または口腔洗浄液、歯みがきを用いた、または何を食べた、または飲んだかについて質問される。

頭頚部試験：以下の内容及び質問票の実施、ＰＩ、訓練された頭頚部外科医、がヘッドライト補助検査、口腔、舌根及び首の触診、頭蓋神経試験、鼻粘膜試験及び喉頭鏡試験を含む標準的頭頚部試験を実施する。悪性を示す可能性がある白色または赤色、浮き出したまたは潰瘍化した病変を記録し、生検を受けさせる。逆流変化及び感染などの他の異常を記録し、指示のとおり照会する。ＵＭまたはＪＭＨ頭頚部クリニックに治療または生検が必要な患者を照会しながら、地域コホート拠点で生検の理由になるほど十分に厄介な状態が現れていない反応性病変及び潰瘍性病変がある患者を追跡する。虫歯及び歯周病の相対量を考慮して、０〜２のスケールで記録する。データベース入力のために診断日とともに全異常を記録する。

経口うがい液の採集及び処理過程：血清中のｓｏｌＣＤ４４レベルが多くは正常な上皮コンパートメントに由来する変種アイソフォームによって汚染しているため、血清測定の代わりに経口うがい液を用いることができる（Ｖａｎ Ｈａｌ ＮＬ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４４ｖ６ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｅｒｕｍ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｌ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９；５：３５３４−４１）。経口うがい液は、主に生理食塩水と少量の唾液からなり、ＵＡＤＴ粘膜に接触させる。研究担当者は、スクリーニングの場所で対象から経口うがい液の採集を実施する。対象に採集の少なくとも１時間前に口腔清掃、喫煙、飲食及び飲料摂取しないよう求める（Ｎａｖａｚｅｓｈ Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｓａｌｉｖａ．Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９３；６９４：７２−７）。０〜２のスケールでＨＮＳＣＣ患者のうがいを記録した。採集後、標本を冷凍し、氷の上で実験室に移動し、遠心分離にかけ、ペレットを分離し、うがい液標本を分留し、この留分及びペレットを−８０℃で保存する。

追跡調査：試験の期間を通じて、年に１回、経口うがい液の採集、質問票及び診察を実施した。

データ収集：印刷済みログを用いて試験の所見を記録し、データベースに入力する。質問票、ログ、及び経口うがい液標本は、識別情報を含まないが、対象に対して重複しないコードでラベルを付ける。マスターログがこの数と識別情報を結びつける。このマスターログは、アッセイを実施しながら患者の秘密及び盲検性を維持するために分析に用いられるデータベースから分離しておく。

ｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質試験：製造業者（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ）によって提供された指示書に従い、複数の刊行物（１７−２０）に記載されたように変更してｓｏｌＣＤ４４ＥＬＩＳＡ試験を実施した。バッチで標本を試験し、全濃度で測定する。以前に公開されたとおり製造業者の手順に従ってタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を実施した（Ｆｒａｎｚｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４４： ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００５；１４：７３５−７３９；Ｆｒａｎｚｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４４ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００７；１６：１３４８−１３５５；Ｆｒａｎｚｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｓｏｌＣＤ４４ ｌｅｖｅｌｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ．２０１２；３４：６８７−９５；Ｐｅｒｅｉｒａ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｄａｔａ： ａ ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ．２０１１；１０：２４１−９）。分析まで患者情報を含むデータベースから分離しておくデータベースに標本コードによって結果を入力した。

品質管理：定義した品質管理基準に基づいて認められた範囲外で試験する標本を反復する。例えば、最も高い標準の吸光度は１．５−２．５の範囲とすることができる。個々の標本及びプレート内変動を１０％ＣＶまで認める。２０％ＣＶまでのレート内変動を認容する。１／２濃度で最も高い標準以上のレベルを反復する。技術的変動を減らすために同じ日及び同じＥＬＩＳＡプレートで全反復測定（例えば、個々の対象の年に１度の各採集）を実施する。

実施例データ：ＢＨＣ対象５１例についてベースライン及び最初の年に１回の来院時にマーカーレベル結果を得た。１年間に渡って個々の参加者のマーカーレベルの変化を定量し、その後、この変化をグラフ化しヒストグラムを作製した。総じて、ｓｏｌＣＤ４４、ｌｏｇ２ ＣＤ４４及びタンパク質では、参加者の最も高い割合はゼロ中央値に近い変動がある傾向があった。年に１回の平均ｓｏｌＣＤ４４レベルが１．６３から１．４８ｎｇ／ｍＬに減少し（ｐ＝０．０１８５）（図３及び表７）リスクが減少していることを示した。タンパク質は少しも変化しなかったが、ＣＤ４４のこの変化は、ｌｏｇ２ＣＤ４４有意な変化を伴っていた。
統計的分析：これは対象１５０例の縦断的試験であり、年に１回通算５年間にわたって続いた。登録時及びその後４回まで、ｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質のレベルを採取することができる。対象毎の観察数が等しくなく、経時的に間隔が等しくないことが予測され、分析方法はこれを考慮して設計される。分散を安定させ、正規分布フィットを改善するために必要に応じてマーカーデータを対数変換する。時系列プロットを用いて個々及び全体の軌跡を表示する。例えば、全体の時間関数として個々の対象の値とともに試験対象の平均レベルをグラフ化することによって、及び説明変数によってＣＤ４４発現の変化を描く。反復測定の一般的な混合効果モデルを用い、性別、年齢などの説明変数で調整して経時的なマーカーレベルの変化を表示する。予測した時間及び説明変数間の交互作用の有意性は、これらのいくつかの変数によって定義されるサブグループに経時的にマーカー発現のさまざまなパターンがみられる可能性があることである。変量効果モデルのＰＲＯＣ ＭＩＸＥＤ手順を用いてＳＡＳ（登録商標）９．３で分析を実行する。標準的統計基準に従って測定値間の従属性を示している分散共分散行列の構造を選択する。全体第一種過誤率を維持するための調整をして、時間の間、及び選択した時間でのサブグループの間で、事後対比較を実施する。

試験能力の説明：簡略化のために、対象１５０例、一人当たり２回の反復観察、及び２グループ（例えば喫煙カテゴリー）に基づいて能力の説明を示す。８０％能力がある対データ（例えば、ベースライン対１年追跡調査）を比較する対象１５０例の全体試験サイズを用いると、両側有意レベル５％で対ｔ検定に基づいて有効量０．２３を検出する。対象１００例または５０例の小さなグループサイズ（例えば、現在喫煙している人）内で２回の比較では、８０％能力を用いるとそれぞれ有効量０．２８または０．４０を検出する。２つの標本比較では、例えば、所与の時に（例えば、登録時）、現在喫煙している人５０例対以前喫煙していた人１００例では、両側有意レベル５％で２つの標本ｔ検定に基づいて有効量０．５６を検出するために８０％能力がある。

実験手順２
理想的な初期検出試験であれば可逆性ステージでＨＮＳＣＣを同定する。初期疾患が目に見えないことが多いため、このことが困難の原因となる（Ｐｏｈ ＣＦ，ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｏｃｃｕｌｔ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ｏｒａｌ ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ ｄｅｖｉｃｅ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ．２００７ Ｊａｎ；２９（１）：７１−６）。分子画像が役に立つ可能性があるが、限局性病変なしでは、患者に切除の選択がない。このため、病変がまだ同定されていない対象のリスクを減らす治療介入が最適である。禁煙後に血清のＣＤ４４アイソフォームが減少することを裏付ける証拠がない。実験手順２では、禁煙により経口うがい液のｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質レベルが減少することを示す。

全対象１２５例を登録した。このうち、２３例が３ヵ月で喫煙を止め、１５例が１年で喫煙を止めたと言った。少なくとも３ヵ月で喫煙を止めた対象のうち１５例でコチニン確認が得られた。ｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質レベルの有効結果を表８に示す。これらの対象のほとんどがコントロールの平均または平均以下のマーカーレベルである（ｓｏｌＣＤ４４＝１．８５ｎｇ／ｍＬ、タンパク質＝０．６３ｍｇ／ｍＬ）。

対象：対象は、少なくとも３ヵ月で喫煙を止めたが癌または前癌がない者である。主に地域コホート地域の地域組織及び全国の採用活動により参加者を採用する。治療介入プログラム（例えばグループまたは個人カウンセリング、ニコチン補充等）に登録しているかどうかにかかわらず喫煙をやめようとしている喫煙者を登録する。ＨＮＳＣＣのリスクが高い４０例以上を優先的に登録する。

禁煙プログラム：喫煙者を喫煙者が必要とするものを満たすリソースに紹介する（例えば、Ｆｌｏｒｉｄａ Ｓｍｏｋｅｒｓ’ Ｑｕｉｔ ｌｉｎｅ、プライマリーケア、自助材料、またはカウンセリングプログラム）。ニコチン補充と組み合わせた行動治療に興味がある現在喫煙している者を治療介入のためにＵＭクリニックに紹介する。プログラムは認知的行動学的戦略を用いる集中的、グループカウンセリングを含む。彼らが好ましい禁煙プログラムを終了し、電話及びメールにより参加者との連絡を維持するように参加者を追跡する。

経口うがい液、唾液標本、及び質問票：対象に経口うがい液、唾液標本を提供させ、及び禁煙前に禁煙クリニックで質問票に記入させる。禁煙後最初の４週間以内に血清ｓｏｌＣＤ４４レベルが２０−３０％減少する。このため、採集の１週間以上前に禁煙した対象を除外する（Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｐｕｔｅｄ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４４ ｉｓｏｆｏｒｍｓ（ｖ５ ａｎｄ ｖ６）ｉｎ ｓｍｏｋｅｒｓ ａｒｅ ｄｏｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｄ ｄｅｃｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｓｍｏｋｉｎｇ ｃｅｓｓａｔｉｏｎ．２０００ Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋ Ｐｒｅｖ ２０００；９：１２１１−４）。５分間、全ての未刺激唾液を標本カップに採集する。分析まで唾液標本を冷凍する。ベースライン（禁煙前）、及び禁煙後３ヵ月及び１年に採集及び質問票を行う。

ｓｏｌＣＤ４４、タンパク質及びコチニンアッセイ：コチニンはニコチンの主要代謝物であり、タバコ被爆のバイオマーカーとして広く用いられている。製造業者の指示書に従ってキット（Ｓａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ）を用いて唾液コチニンレベルを測定する。適宜にｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質アッセイを実施する。
追跡調査：禁煙クリニックで患者を追跡する。３回の経口うがい液及び質問票。

データ採集：標本採集及び質問票記入の日付、禁煙開始日及び禁煙終了日を含む禁煙に関するデータをログに記録し、プライバシー保護を用いてデータベースに入力する。

統計的分析：禁煙プログラムに登録した全試験対象から禁煙後３ヵ月及び１年にｓｏｌＣＤ４４、タンパク質及びコチニンのレベルを採集する。禁煙プログラムの終了後に、説明変数の調整を可能にするために２つの標本ｔ検定または重回帰モデルを用いて、マーカーレベルに関して禁煙者対非禁煙者を比較する。禁煙成功者の関心のマーカーの縦断的データの分析は、前記に記載した時間関数としてマーカーレベルの対象及びグループのプロットで開始しているものとほぼ同じである。

試験能力説明：能力の説明として、対データ（例えば、禁煙プログラム前対禁煙終了後３ヵ月及び１年）の比較のための禁煙者３０例からなる試験サイズでは、８０％能力があり、対ｔ検定及び両側有意レベル５％で対の観測値０．５の間の相関関係に基づいて効果量０．５３を検出する。ｌｏｇ２ ｓｏｌＣＤ４４測定値の平均（及び標準偏差）は現在喫煙している者で１．６（０．７）であった；このように、平均差０．４（０．８６）に対応する効果量０．５３であり、ｌｏｇ２ ｓｏｌＣＤ４４の２５％減少である（１．６から１．２）。禁煙プログラム終了の３ヵ月後にマーカーレベルに関する禁煙者対非禁煙者の比較では、両側有意レベル５％で２つの標本ｔ検定に基づいて、８０％能力であり、効果量０．６２を検出し、禁煙者３０例及び非禁煙者９０例の試験サイズと推定される。

実験手順３
選択基準：新たに診断し、生検で口腔または口部の扁平上皮癌と証明された場合、対象（ｎ＝３０）含まれる。治療（例えば手術、化学療法、放射線）を示し、統計的分析で扱う。ＵＭ及びＪＭＨの頭頚部クリニックから対象を登録する。手術切除材料検査報告により診断を確認する。

除外基準：以前にＵＡＤＴを含むすべての組織の癌があった患者を除外する。下咽頭、鼻咽頭部、副鼻腔、食道、唾液腺に、または喉頭にもしくは喉頭下に原発性扁平上皮癌の病歴がある患者を除外する。妊娠または授乳中の女性を除外する。以前に皮膚の扁平または基底細胞癌以外の別の部位に癌の病歴がある患者を除外する。

経口うがい液採集、ｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質アッセイ、データ採集：全採集（質問票を含む）及びアッセイ手順は、本明細書に記載したとおりである。完全なＡＪＣＣステージング情報、ｐ１６状態（施設基準値ごとに）、及び所与の治療例えば化学療法、放射線治療、手術の種類及び期間を含む病理学的特性を記録しなければならない。

治療前及び治療後の腫瘍の測定値：標準ＲＥＣＩＳＴ（固形癌の効果判定基準）を用いて測定値を決定する（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ ＥＡ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｕｒｓ： ｒｅｖｉｓｅｄ ＲＥＣＩＳＴ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．１）．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００９；４５：２２８−４７）。腫瘍は標準画像化によって測定可能なものとしなければならない。画像化時点は、施設の手順ごとにある。

経口うがい液採集の時点：診断時（ベースライン）、及び放射線を与える場合、治療終了の３ヵ月後（最終の線量を与えた後約３ヵ月間放射線が作用し続けてから）及び放射線を与えない場合、治療終了の１ヵ月後に、経口うがい液を採集する。

統計的分析：治療に応じてｓｏｌＣＤ４４マーカーレベルが減少することを明らかにした。分析のためのデータは１）経口うがい液からのｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質の結果及び２）治療前及び治療後の腫瘍側定値、３）腫瘍特性、治療、及びリスクファクター（例えば、喫煙）の記述を含む。平均及び標準偏差で定量的変数（例えば、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質）を集計する。正規フィットを改善するのに必要なようにデータを変える。カウント及びパーセンテージとしてカテゴリカル変数を集計する。全マーカーが治療前から治療後へどう変化するかを検討する。これは縦断的デザインに合っており、治療前及び治療後にｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質のレベルを採集する。反復測定に一般混合効果モデルを用いて、小標本サイズで補助変量を調整して、治療前対治療後でマーカーレベルの変化を表す。変量効果モデルのＰＲＯＣ ＭＩＸＥＤ手順を用いてＳＡＳ（登録商標）９．３で分析を実行する。標準的統計基準に従って測定値間の従属性を示している分散共分散行列の構造を選択する。全体第一種過誤率を維持するための調整をして、時間の間、及び特定の時間でのサブグループ（例えば、人種カテゴリー）の間で、対比較を実施する。

試験能力及び精度：ケースは、喫煙状況に応じて治療への完全著効（ＣＲ）がある可能性がある（Ｂｒｏｗｍａｎ ＧＰ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９３；３２８：１５９−６３）。治療前と治療後のマーカーレベルの評価では、ＣＲ患者１５例（５０％ＣＲ率）のサブグループに８０％能力があり、両側有意レベル５％で対のｔ検定に基づいて小から中程度の効果量０．６７を検出する可能性がある。ＣＲ患者２１例（ＣＲ率７０％）と仮定すると、８０％能力があり、効果量０．５５を検出する。

実施例２：ＨＰＶ陽性扁平上皮癌、ＣＤ４４、及びＨＰＶ陽性子宮頚部感染
方法
２００７年１月及び２０１３年９月の間に手順に従ってＨＮＳＣＣの患者１５０例及びコントロール１５０例を登録した。彼らは年齢、民族特性、喫煙及び飲酒の頻度が一致していた。耳鼻咽喉クリニック及び癌センターから彼らを登録した。クリニックが収集した質問票の喫煙または飲酒に対して「はい」と回答した場合、コントロール対象にアプローチした。癌状態の可能性がある場合、コントロールから除外した。ケース対象は、生検で全ステージ及び部位の頭頚部扁平上皮癌と証明された全患者であった。鼻咽頭癌の患者を除外した。妊娠、またはＨＩＶに感染している場合も対象から除外した。

口咽頭癌の女性３１例のサブグループを特定し、ＩＨＣを用いてＨＰＶ代用マーカー、ｐ１６について２１例を試験した。彼女たちのカルテを再検討して口咽頭ＨＰＶ状態を確認した。ＰＡＰスミア記録、及びプライマリーケアノートにより子宮頚部ＨＰＶ状態を評価するためのさらなるカルテ再検討を終了した。女性コントロール３４例のサブグループを特定した。ＰＡＰスミア記録、及びプライマリーケアノートにより子宮頚部ＨＰＶ状態を評価するためにこれらの対象についてさらなるカルテ再検討を終了した。少なくとも有意不明の異型扁平細胞（ＡＳＣＵＳ）の証拠をした場合、ＰＡＰスミア試験が陽性とみなした。

経口うがい液採集
５秒間、５ｍＬの正常な生理食塩水をうがいし、５秒間、音を出し、その後、標本カップに入れた。移動のため氷の上に唾液を置き、８０度で保存した。

タンパク質アッセイ
ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて総タンパク質濃度を測定した。タンパク質定量を重複して実施した。

可溶性ＣＤ４４アッセイ
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて経口うがい液標本中のｓｏｌＣＤ４４濃度を測定した。すべてが正常なＣＤ４４の変種アイソフォームであった。標本をボルテックスし、遠心分離にかけ、試験に上澄みを用いた。全実験を重複して実施した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ（ＭＷＷ）によって統計的分析を実施した。帰無仮説の非−パラメトリック試験を実施した。

結果
人口統計
個体３４例でコントロール群を構成した。白人非−ヒスパニック３％、黒人ヒスパニック６％、黒人非−ヒスパニック４４％、及び白人ヒスパニック４７％であった。個体３１例のケース群では、２９％が白人非−ヒスパニック、２６％が黒人非−ヒスパニック、及び４５％が白人ヒスパニックであった。

口咽頭扁平上皮癌及びｐ１６状態
個体２１例のグループでは、３６％がｐ１６陽性であった。このｐ１６陽性個体のうち、４例が黒人非−ヒスパニックであり及び４例が白人ヒスパニックであった。残りの６４％は、ｐ１６陰性であった。

子宮頚部ＰＡＰスミア
個体１９例のコントロール群では、２６％がＰＡＰスミア陽性であり、一方、７４％がＰＡＰスミア陰性であった。個体８例のケース群では、３８％がＰＡＰスミア陽性であり、一方、６２％がＰＡＰスミア陰性であった。コントロールのＰＡＰスミアの結果に基づいたｓｏｌＣＤ４４及びタンパク質レベルの差は図４Ａ及び４Ｂに見ることができる。

考察
口咽頭扁平上皮癌の全患者でｐ１６試験の測定を実施した。ＰＡＰスミア陽性が口咽頭扁平上皮癌のリスクファクターの可能性を示した。ＰＡＰスミア陽性の発生はケースの方がコントロールより高かった。ｓｏｌＣＤ４４のレベルは、ＰＡＰスミア陽性の患者の方がＰＡＰスミア陽性でない患者と比べて高い。

Ｂｉｒｏｎらが一般的な集団と比べて口咽頭扁平上皮癌患者が子宮頚部癌を発症するリスクの増加を示した。リスクが少なくとも２５倍大きく、扁桃腫瘍（５５％）がより一般的に現れ、舌根の腫瘍（２５％）がこれに続いたことを示した。２つのこれまでの試験が逆相関を検討した：般的な集団の女性と比べて子宮頚癌の女性の大きなコホートの第２腫瘍の比率、及び一口咽頭扁平上皮癌を発症するリスクは増加していた。疫学的相関は、子宮頸部及び口部の間でＨＰＶの同時感染の可能性を表している。

１つのケースが子宮頸癌及び再発性子宮頚癌ならびにｐ１６口腔癌の高リスクＨＰＶの患者を示した。ｐ１６口咽頭扁平上皮癌のもうひとりの患者は、２５年前に子宮摘除の病歴があり、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ｐ１６陽性及びＨＰＶ陽性であった。

実施例３：口腔癌スクリーニングのためのリスク層別化システム
多施設、ケース−コントロール、病院に基づいたデザインを用いて、年齢、性別、人種、民族特性、喫煙及び飲酒、及び社会経済的状態（ＳＥＳ）の頻度が一致した口腔癌患者１５０例及びコントロール１５０例からの経口うがい液中の可溶性ＣＤ４４（ＣＤ４４）及び総タンパク質レベルを測定した。多変量分析を実施し、マーカー及びケース／コントロール状態の間の相関を測定した。ケースで無増悪生存率（ＰＦＳ）及び全生存率（ＯＳ）を測定した。参照コントロール及びレベルとして役立った、進行中の地域に基づいた口腔癌スクリーニングプロジェクトからの対象（ｎ＝１５０）を、１年にわたって追跡し、マーカーレベル変動を評価した。

多変量再帰分割によりＣＤ４４及びタンパク質それぞれの２カットポイントに基づいて病院に基づいた対象を５グループに層化した。ＣＤ４４≧５．３３ｎｇ／ｍＬがケース状態と大きく関係していた（参照としての最低リスクグループＣＤ４４＜２．２２ｎｇ／ｍＬ及びタンパク質＜１．２３ｍｇ／ｍＬに対して調整後ＯＲ１４．７１４、９５％ＣＩ：６．０９４、３５．５２７；ｐ＜．０００１）。ＣＤ４４レベルが＜５．３３ｎｇ／ｍＬである場合、総タンパク質がケース状態の予測を助けた。ＣＤ４４≧５．３３ｎｇ／ｍＬが低いＰＦＳ（調整後ＨＲ＝３．５８８，９５％ＣＩ：１．５５８，８．２６５、ｐ＝０．００２７）及びＯＳ（調整後ＨＲ＝２．８８２，９５％ＣＩ：１．１６５，７．１３０、ｐ＝０．０２２）と関係していた。地域に基づいたスクリーニング試験の残りの対象（ｎ＝９５）では、１年間でマーカーレベルが有意に低下した（ＣＤ４４：２４％、ｐ＜．０００１、タンパク質：１６％、ｐ＝０．０３６）。

試験手順
２００７年及び２０１２年の間に、マイアミ大学シルベスター癌センター（ＵＭ）及びジャクソン記念病院（ＪＭＨ）クリニックから対象を採用した。世界医師会の倫理綱領（ヘルシンキ宣言）に従って各対象から書面による同意を得て全実験を始めた。この試験により年齢、性別、人種、民族特性、喫煙及び飲酒、及び社会経済的状態（ＳＥＳ）の頻度が一致した口腔癌患者１５０例及びコントロール１５０例の可溶性腫瘍マーカーを評価した。口腔癌ケースには新たに診断し、以前治療していない口部（ＯＰ）及び口腔（ＯＣ）を含むＨＮＳＣＣの対象が含まれる。ＵＭ、被保険患者を扱う私立大学病院系及びＪＭＨ、低所得患者を扱う国立大学病院系から均等に対象を採用した。対象が、人口統計、行動学的リスクファクター及びＳＥＳを含むベースライン質問票に記入した。ケースでは、医療記録及び腫瘍登録から腫瘍特性及び転帰に関するデータを引き出した。癌の厄介な病変があるコントロールを除外した。ＨＩＶ陽性または妊娠の個体を除外した。マーカーレベル結果を知ることなく除外を決定した。

確認のため、北マイアミデイド郡の低所得地域からの喫煙歴または飲酒歴がある個体１５０例からなるコントロールコホートに含めた。経時的にこの地域コホートを追跡した；ベースライン及び年１回の追跡調査に、経口うがい液を得て測定し、スクリーニング集団のマーカーの変動を評価した。もとから非喫煙者であった正常な志願者２１例のもうひとつのコントロールコホートも含めた。最後に、口腔及び口咽頭のケース２７例及びＵＡＤＴの良性疾患のリスクファクター及び病歴があり、そのレベルが以前の病院に基づいた試験の一部として試験されたコントロール３９例を含めた（Ｐｅｒｅｉｒａ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ ２０１１；１０：２４１−９）。

実験室による分析
以前に公開された手順を用いて経口うがい液標本を採集した（Ｆｒａｎｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ ２０１２；３４：６８７−９５；Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ ２０１１；１０：２４１−９；Ｆｒａｎｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００７；１６：１３４８−５５）。サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、以前に公開された変更によりｓｏｌＣＤ４４（正常及び変種アイソフォーム）のレベルを測定した。以前に公開されたように調製した唾液標本を用いて製造業者の手順に従ってＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を実施した（Ｆｒａｎｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｄ ＆ ｎｅｃｋ ２０１２；３４：６８７−９５；Ｐｅｒｅｉｒａ ＬＨ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ ２０１１；１０：２４１−９；Ｆｒａｎｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００７；１６：１３４８−５５）。重複して各標本を試験し、技術者に疾患状態を盲検化した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の吸光度を読み、標準曲線を用いて濃度を決定した。

利用できるケースからホルマリン固定及びパラフィン包埋標本を取り出した（ｎ＝７９）。認められたＨＰＶ状態の代用マーカーであるｐ１６ＩＮＫ４Ａ免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いてＨＰＶ状態を評価した（Ｈａｆｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２００８；１２２：２６５６−６４；Ｅｌ−Ｎａｇｇａｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ．２０１２，３４：４５９−６１）。製造業者のＩＨＣ手順に従って標本６８個にｐ１６ＩＮＫ４Ａを実施した。ＩＨＣ（ｎ＝１０）またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）（ｎ＝１）によるカルテ再検討でもＨＰＶ状態を評価した。患者の臨床的データを知らない試験病理学者（ＣＧ）によって全標本を再検討した。腫瘍標本の≧５０％に強力及び広がった核及び細胞質染色が存在した場合、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ発現が陽性と記録した（Ｅｌ−Ｎａｇｇａｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ．２０１２；３４：４５９−６１）。

統計的分析
カイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定を用いて重要である可能性のあるカテゴリカル補助変量に分布に関して患者グループを比較した。ＣＤ４４のデータを底を２とする対数変換し、分散の推定を安定させ、正規分布へのフィットを改善した。スチューデントのｔ検定または分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて連続変数を分析し、続いて平均対比較、及び−事前に指定したコントラストの検定のためにフィッシャーの最小有意差検定を実施した。ロジスティック回帰分析を用いてマーカー及び口腔癌のリスクの間の相関を評価した。対応９５％信頼区間（９５％ＣＩ）及びフィットしたモデルの動作特性曲線（ＲＯＣ）の曲線下面積（ＡＵＣ）でオッズ比（ＯＲ）推定値を報告した。また，マーカー及び補助変量の間に有意な交互作用を含んだフィットした，多変量ロジスティックモデルならびに多変量再帰分割分析（Ｂｒｅｉｍａｎ，ｅｔａｌ．１９８４ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ．Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いて導き出したＣＤ４４及びタンパク質のカットポイントに基づいたリスクグループを含むモデルから導き出した感度，特異度，及び精度の推定をＲ−ｐａｃｋａｇｅｓＭＶＰＡＲＴ（ｖ．１．６．１．）及び再帰分割及び回帰木（ＲＰＡＲＴ），ｖｅｒｓｉｏｎ１．６−０で実施した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ及びＣｏｘ回帰モデルを用いてＰＦＳ及び全ＯＳを評価した。ハザード比（ＨＲ）推定値及び対応９５％ＣＩを報告した。ＳＡＳｖｅｒｓｉｏｎ９．２（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）及びＲｐａｃｋａｇｅを用いて統計的分析実施した。

結果
病院に基づいたケース−コントロール試験特性
口腔癌の患者１５０例及びコントロール１５０例を含む、病院に基づいたケース−コントロール試験の明細を表９にまとめている。

年齢、性別、人種、民族特性、口腔衛生（抜歯の数）、これまでの喫煙歴、アルコール習慣またはプライベートホスピタル（ＵＭ）システムに対するカウンティ（ＪＭＨ）に登録したかどうか関してケース及びコントロールの間に有意な差はなかった。表１０は、ケースの癌特異的特性を示す。ＯＰ患者が末期ステージ（ＩＩＩ／ＩＶ対Ｉ／ＩＩ；ｐ＜．０００１）に存在する傾向が強く，さらに進行したＮ−状態（Ｎ１−Ｎ３対Ｎ０，Ｎｘ；ｐ＜．０００１）を示し、ＯＣ患者と比べてＨＰＶ＋対ＨＰＶ−腫瘍（ｐ＜．００１）がある。

ケース及びコントロールグループ内でリスクファクターまたは人口学的変数に関してこれ以降ＣＤ４４と呼ぶ、Ｌｏｇ_２ＣＤ４４、及び総タンパク質を評価した（表１１）。年齢、性別、人種／民族特性、喫煙習慣または飲酒習慣、歯の欠損またはうがい能力を考慮した場合、ｐ＜０．０５レベルのコントロールに比べてケースでＣＤ４４及びタンパク質レベルが高かった。ケース群では、ＣＤ４４レベルが年齢（高齢の患者で高レベル）、うがい（うがい能力が低いと高い）、及び歯の欠損（歯の欠損が多いと高い）で有意に変わったが、コントロール群では変わらなかった。ＣＤ４４及びタンパク質のレベルは、ＴＮＭ状態またはＨＰＶ状態で有意に異ならなかった。

リスクモデリング
単変量分析では、ＣＤ４４及び総タンパク質がＣＤ４４の１単位増加に対するオッズ比２．０３６（９５％ＣＩ：１．５５２，２．６７１、ｐ＜０．０００１、ＡＵＣ＝０．６８）及びタンパク質の１単位増加に対するオッズ比２．１５９（９５％ＣＩ：１．２８８、３．６１７、ｐ＜０．００３５、ＡＵＣ＝０．５９）で癌ケースをコントロールと識別した。ＡＵＣは重要な変数及びその交互作用の調整後で０．７５７に改善した；ＣＤ４４のＯＲは２．６６８に増加した（９５％ＣＩ：１．７９４、３．９６８、ｐ＜．０００１），一方、タンパク質のオッズ比は１未満及び非−有意性（ＯＲ＝０．６６１、９５％ＣＩ：０．３１２、１．３９９、ｐ＝０．２７９）となった（表１２パネルＡ）。

喫煙及び飲酒誘導腫瘍と比べて、口咽頭ＨＮＳＣＣの非喫煙者によくみられるＨＰＶ＋腫瘍の方が、予後良好である。ｐ１６ＩＮＫ４Ａ（ＨＰＶ状態の代用）によって層化した分析の所見は、複合分析とほぼ同じであった（Ｈａｆｋａｍｐ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２００８；１２２：２６５６−６４；Ｅｌ−Ｎａｇｇａｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ．２０１２，３４：４５９−６１）。ＨＰＶ−グループでは、タンパク質レベルは多変量分析後で有意な保護効果と関係していた（表１２パネルＢ）。

多変量再帰分割及びロジスティック回帰分析を用いてＣＤ４４、タンパク質及び疾患存在の予測（表１２パネルＣ）間の関係をさらによく理解した。分類木の結果、５つの有意なリスクグループとなり、ＣＤ４４及びタンパク質それぞれの２つのカットポイントに基づいて、グループ１（ＣＤ４４＜２．２２ｎｇ／ｍＬ及びタンパク質＜１．２３ｍｇ／ｍＬ、ｎ＝１０２）、及びグループ４（ＣＤ４４≧２．２２＆＜５．３３ｎｇ／ｍＬ及びタンパク質≧０．５５８ｍｇ／ｍＬ、ｎ＝１１６）の「コントロール」対象、及びグループ２（ＣＤ４４＜２．２２ｎｇ／ｍＬ及びタンパク質≧１．２３ｍｇ／ｍＬ、ｎ＝５）、グループ３（ＣＤ４４≧２．２２＆＜５．３３ｎｇ／ｍＬ及びタンパク質＜０．５５８ｍｇ／ｍＬ、ｎ＝２０）、及びグループ５（ＣＤ４４≧５．３３ｎｇ／ｍＬ、タンパク質レベルに関係なく、ｎ＝５７）の「ケース」対象に分類した（表１２パネルＣ）。タンパク質レベルに関係なく、ＣＤ４４≧５．３３ｎｇ／ｍＬが、ケース状態と大きく関係していた（ＯＲ＝１１．８３０、９５％ＣＩ：５．２７９、２６．５０８；ｐ＜０．０００１、比較としてグループ５対グループ１を比較して）。ＣＤ４４が５．３３ｎｇ／ｍＬ以下である場合、タンパク質がリスクの大きさを測定するのに寄与した。例えば、ＣＤ４４＜２．２２ｎｇ／ｍＬ及びタンパク質＞≧１．２３ｍｇ／ｍＬ（グループ２）の患者は、グループ１の患者と比べて、ケース（ＯＲ＝１０．０６９、９５％ＣＩ：１．０７９、９３．９３、ｐ＜０．０５）であるリスクの方が有意に高かった。ＣＤ４４≧２．２２＆＜５．３３ｎｇ／ｍＬ及びタンパク質が０．５５８ｍｇ／ｍＬ以下（グループ３）の患者もグループ１と比べて、ケース（ＯＲ＝１０．０６９，９５％ＣＩ：３．１０３、３２．６７２、ｐ＝０．０００１）であるリスクの方が有意に高かった。ＣＤ４４≧２．２２ｎｇ／ｍＬ＆＜５．３３ｎｇ／ｍＬ及びタンパク質≧０．５５８ｍｇ／ｍＬ（グループ４）の患者では、ケース（ＯＲ＝２．１９２，９５％ＣＩ：１．２４７、３．８５４、ｐ＝０．００６）であるリスクが低いが有意であることがみられた。人口統計学的及びリスクファクターを含む多変量モデルから導き出したＯＲは、ＣＤ４４レベル≧５．３３ｎｇ／ｍＬが継続してケース状態（調整ＯＲ＝１４．７１４、９５％ＣＩ：６．０９４、３５．５２７；ｐ＜．０００１）と大きく関係していたこと及び総タンパク質レベルがケース状態の予測を助けたことを示した（表１２パネルＣ）。

表１１、パネルがＡ、リスクグループ３の方がＨＰＶ＋対象の割合が高く、一方、リスクグループ４の方がＨＰＶ−対象の割合が高かったことを示している。腫瘍が進行していない患者と比べて、ステージＩＶ疾患の患者の方が、リスクグループ１または５によくみられる（表１３、パネルＡ）。

マーカーの予診的有意
リスクグループごとの無増悪生存率（ＰＦＳ）及び全生存率（ＯＳ）のカプラン−マイヤー曲線を図５Ａ及び５Ｂに示している。リスクグループごとのＰＦＳ及びＯＳハザード比（ＨＲ）の未調整及び調整予測値を表１３、パネルＢに示している。腫瘍ステージ，年齢，性別人種及び民族特性の調整による多変量分析に基づいて，リスクグループ５（ＣＤ４４が高い）に入った病院に基づいたケースは、リスクグループ１のケースと比べてＰＦＳ（調整ＨＲ＝３．５８８，９５％ＣＩ：１．５５８、８．２６５，ｐ＝０．００２７）及びＯＳ（調整ＨＲ＝２．８８２，９５％ＣＩ：１．１６５、７．１３０、ｐ＝０．０２２０）を減少させた。リスクグループ２がＰＦＳの減少（ＨＲ＝３．８６３，９５％ＣＩ：０．９６６，１５．４４５，ｐ＝０．０５６）とボーダーラインで関係しており、リスクグループ１のケースと比べてＯＳでは有意な差はなかった（ＨＲ＝２．４０６，９５％ＣＩ：０．５７９，９．９９０，ｐ＝０．２２６８）；しかし，このグループに４ケースだけが含まれた。

感度及び特異度
ケース状態を予測するための感度は８０．７％であった（表１３Ｃ）。これは２００６年の病院に基づいた試験（感度７７．８％）．３３で確認された。２０１２年の病院に基づいたケースでは、感度はステージＩ−ＩＩＩ癌で８８％に達している（表１３Ｃ）。特異度は病院に基づいたコントロール、ＨＮＳＣＣのリスクが高い地域（ｎ＝１５０、９８％喫煙者、医療にアクセスしにくい）及び主として非−喫煙者であった正常な志願者で確認された（表１３Ｃ）。特異度は正常な志願者コホートで最大であった（９５．２％）。さらなる評価では、地域コホートの１％未満に対して病院に基づいたコントロールの１０％以上に以前に癌のＵＡＤＴ以外の病歴があったことが分かった。以前に癌の病歴があった病院に基づいたコントロールの方が以前に癌がないコントロールと比べてｓｏｌＣＤ４４レベルが有意に高かった（ｐ＜０．０５）。

リスクの逆転
地域に基づいたコホートの患者計９５例がベースライン及び年に１回の追跡調査の採集をもたらした。１年間のＣＤ４４及びタンパク質レベルの変化の分布はそれぞれ図５Ｃ及び５Ｅに示されている。平均ＣＤ４４レベルは、ベースラインに１．８２９ｎｇ／ｍＬであり、１年追跡調査時に１．３９０ｎｇ／ｍＬであった。ＣＤ４４レベルの年平均減少−０．４３９ｎｇ／ｍＬ（２４％）は有意であった（ｐ＜．０００１）。線形回帰分析により低ＣＤ４４値の有意な線形傾向を確認した（Ｒ２＝０．２２７、切片＝０．７８５（ｐ＜．０００１）、傾き＝０．３３１（ｐ＜．０００１））（図５Ｄ）。線形回帰分析による確認で平均タンパク質レベルも０．６４４から０．５４３ｍｇ／ｍＬに有意に減少した（ｐ＝０．０３６）（Ｒ２＝０．１０８、切片＝０．２８４（ｐ＝０．００２）、傾き＝０．４０２（ｐ＜．０００１））（図５Ｆ）。この変化がその年の間のアッセイ条件の変動によるものかどうかを明らかにするために、各アッセイのかかるペア８１（タンパク質及びＣＤ４４）による年に１回の追跡調査の採集と同じプレートでベースラインの第２の分取（ベースライン２）を実施した。ベースライン２及び年に１回追跡調査のレベルの減少はＣＤ４４だけで有意であった（ＣＤ４４：−０．２９６ｎｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０２３；タンパク質：−０．０１３ｍｇ／ｍＬ、ｐ＝０．７９６）。一方、線形回帰が両マーカーの数の低下傾向を有意に示した（ＣＤ４４：Ｒ２＝０．２２７、切片＝０．８８２（ｐ＜．０００１）、傾き＝０．２８８（ｐ＜．０００１）；タンパク質：Ｒ２＝０．１５５、切片＝０．２５６（ｐ＝０．００８）、傾き＝０．５３４（ｐ＜．０００１）。ベースライン１とベースライン２の線形回帰により２つのベースラインを比較した。ＣＤ４４では、相関が高く（Ｒ＝０．８９９）、切片はゼロと有意な差がなく（ｐ＝０．１５０）及び傾きは１と有意な差がなく（ｐ＝０．８８１）、２つが同等であることを示していた。タンパク質でも、相関が高く（Ｒ＝０．９２５）、切片はゼロと有意な差がなかったが（ｐ＝０．７１２）、傾きは１と有意な差があった（０．８５、ｐ＜．００１）、タンパク質のベースライン間の差は予測した不規則変動内ではないことを示していた。

中等度（リスクグループ４、ｎ＝１４）または高リスク（リスクグループ２、ｎ＝１、リスクグループ３、ｎ＝５及びリスクグループ５、ｎ＝２）の地域対象２２例のうち、１年後の追跡調査で５例だけが依然としてリスクカテゴリー（リスクグループ４、ｎ＝３、リスクグループ２ｎ＝１、リスクグループ５ｎ＝１）にあった。

口腔癌または他の部位の癌を検出する際のＣＤ４４の役割
対象２例がリスク上昇カテゴリー（両者ともリスクグループ４）に入り、追跡期間に初期ＨＮＳＣＣ（口唇及びｉｎ ｓｉｔｕで喉頭の癌）を発症した。膀胱癌のために除外したコントロール１例が、ｓｏｌＣＤ４４レベル１４ｎｇ／ｍＬ及びタンパク質レベル１．５ｍｇ／ｍＬであった。口腔前癌のために除外したもうひとつのコントロールでは、ｓｏｌＣＤ４４レベル４．８ｎｇ／ｍＬ及びタンパク質レベル１．３ｍｇ／ｍＬであり、進行して肺癌を発症した。地域に基づいた試験からの患者１例が肺癌を発症し、診断１４ヵ月前にレベルが上昇していた（ＣＤ４４＝３．９７５ｎｇ／ｍＬ、タンパク質＝０．６５６ｍｇ／ｍＬ）。

考察
本明細書に開示した方法は、ＣＤ４４及びタンパク質に基づいた安価で、非侵襲性のスクリーニングツールが正確に口腔癌ケースをコントロールと識別することができることを示している。本明細書に特有の頻度マッチングが、喫煙または社会経済的状態などの補助変量による交絡を回避している。米国の８５００万以上の個体に口腔癌のリスクがあるが、これらの弱い個体のうち実際に口腔試験を受けるものはきわめて少ない。ここに記載した経口うがい液分子試験は、口腔癌リスクの単純で確実な測定を提供することによって口腔癌スクリーニングに大変革をもたらすことができ、プライマリーケア業者及び歯科医に熟達口腔試験の最も必要な個体の注意を喚起する。ＣＤ４４ＥＬＩＳＡアッセイ及びタンパク質試験は、既にラテラルフローテストストリップの原型に変わっている。このため、集団スクリーニングが実行可能である。

試験は、高ＣＤ４４がＰＦＳ及びＯＳの少なさと関係していることも示している。これらのマーカーは、治療の指針に有用である可能性がある（Ａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０ １；３６３：２４−３５）。試験は、末期ステージ（ＩＶ）疾患より初期ステージ（Ｉ−ＩＩＩ）口腔癌を検出できることに優れている。ＣＤ４４の役割は腫瘍イニシエーションに重要である可能性がある。

偽陽性と考えられていたこの試験の患者２例が追跡期間中にＨＮＳＣＣを発症した（Ｆｒａｎｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００７；１６：１３４８−５５）。さらに、肺及び膀胱を含む他の喫煙関連腫瘍の対象もＣＤ４４レベルが上昇していた。このように「偽陽性」が実際に潜在性口腔疾患またはリスクファクターに関係した他の癌の真陽性である可能性がある。ＣＤ４４が腫瘍イニシエーション因子であるため、リスクファクターが減少し、潜在性病変が消えるとレベルが下がる可能性がある。データは、１年間地域スクリーニングプログラムにとどまった個体ではＣＤ４４レベルが有意に減少したことを示している。全対象が禁煙に関する教育及び口腔清掃及び栄養を改善するのを助けるリソースへのアクセスを受けた。このように行動変化の結果、レベルが減少する可能がある。

Claims (42)

1. ａ）対象からの体液の標本中のｓｏｌＣＤ４４の試験量を測定すること；
   ｂ）前記標本中の総タンパク質の試験量を測定すること；
   ｃ）健康な個体及び癌の個体の集団からのｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを用いることによってｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルを測定し、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルがさまざまな，統計的に有意な癌リスクの範囲を定め、ｓｏｌＣＤ４４の参照レベル及び総タンパク質の参照レベルを提供すること；及び
   ｄ）前記ｓｏｌＣＤ４４の試験量及び総タンパク質の試験量がｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベル以上であるか、または以下であるかを明らかにすることによって前記対象の癌リスクを明らかにすることを含む、対象の癌リスクの測定方法。
2. 前記集団の前記個体が前記対象の社会人口統計学的及びリスクファクターとほぼ同じ年齢、人種、飲酒歴、喫煙歴、及び／または癌の病歴である請求項１に記載の方法。
3. 前記集団の前記個体が前記対象の社会人口統計学的及びリスクファクターとほぼ同じであるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染の状態にある、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
4. 前記体液が経口うがい液、唾液、痰、呼気凝縮液、血液、血漿、血清、及び尿からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記経口うがい液が経口生理食塩すすぎ液である、請求項４に記載の方法。
6. 前記経口うがい液が前記対象が食事、喫煙、及び飲料摂取した少なくとも１時間後に得られる、請求項４に記載の方法。
7. 前記癌が頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記癌が肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、黒色腫、白血病／リンパ腫、乳腺癌、または骨肉腫である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記対象が前記対象の年齢、人種、飲酒歴、喫煙歴、癌の病歴、及び／またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）アッセイの陽性結果に基づいて前記経口うがい液を提供するために選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記対象が臨床的に目にみえる癌または前癌がない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記対象が前記の特定したリスクに基づいて手術、放射線、または化学療法、またはこれらの組み合わせにより治療される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ｓｏｌＣＤ４４の試験量が前記癌リスクを測定する前に前記総タンパク質の試験量に標準化される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
13. イムノアッセイを用いて前記標本中の前記ｓｏｌＣＤ４４の試験量を測定する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
14. イムノアッセイを用いて前記集団からのｓｏｌＣＤ４４レベルを測定する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記標本中の前記ｓｏｌＣＤ４４の試験量及び／または前記集団からのｓｏｌＣＤ４４レベルを測定するために用いられる前記イムノアッセイが、エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラテラルフローアッセイである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
16. ローリーまたは改良ローリータンパク質アッセイを用いて前記標本中の前記総タンパク質の試験量を測定する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
17. ローリーまたは改良ローリータンパク質アッセイを用いて前記集団からの総タンパク質レベルを測定する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
18. さらに前記対象にリスクファクター管理カウンセリングを提供することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記リスクファクター管理カウンセリングが禁煙プログラムを含む、請求項１８に記載の方法。
20. さらに規則的時間間隔でステップａ）からｄ）を反復することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
21. ３ヵ月毎から６ヵ月毎にステップａ）からｄ）を反復する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
22. さらに癌専門家に前記対象を照会するステップｅ）を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
23. さらに前記標本中のヒアルロン酸（ＨＡ）及びヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）の少なくとも１つのレベルを測定することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記ｓｏｌＣＤ４４の参照レベルが約１０ｎｇ／ｍＬ、約５．５ｎｇ／ｍＬ、約５．３ｎｇ／ｍＬ、及び／または約２．２ｎｇ／ｍＬである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記総タンパク質の参照レベルが約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ、及び／または約０．６ｍｇ／ｍＬである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記ｓｏｌＣＤ４４の参照レベルが約２．２ｎｇ／ｍＬ及び約５．３ｎｇ／ｍＬであり、前記総タンパク質の参照レベルが約１．２ｍｇ／ｍＬである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記ｓｏｌＣＤ４４の参照レベルが約２．２ｎｇ／ｍＬ及び約５．３ｎｇ／ｍＬであり、前記総タンパク質の参照レベルが約０．５ｍｇ／ｍＬである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルがそれぞれ約２．２２ｎｇ／ｍＬ及び約１．２ｍｇ／ｍＬである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
29. 統計的分析を用いて参照レベルを測定する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
30. 統計的分析が多変量分析またはロジスティック回帰計算を含む、請求項２９に記載の方法。
31. 生理食塩液；経口生理食塩すすぎ液を受けるためのカップ；特異的にＣＤ４４を結合する少なくとも１つの抗体；総タンパク質濃度を測定するための試薬；ならびに健康な個体及び癌の個体の集団からのｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質レベルを用いることによってｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルが測定され、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルがさまざまな、統計的に有意な癌リスクの範囲を定める、ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベル；を含むキット。
32. さらにｐ１６ＩＮＫ４ａに結合する少なくとも１つの抗体を含む、請求項３１に記載のキット。
33. ｐ１６ＩＮＫ４ａに特異的に結合する前記少なくとも１つの抗体がＥ６Ｈ４抗体クローンのイディオタイプを含む、請求項３１または３２に記載のキット。
34. さらにＣＤ４４参照標本、ｐ１６参照標本、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３１から３２のいずれか一項に記載のキット。
35. さらに特異的にｐ１６ＩＮＫ４ａに結合する前記抗体，特異的にＣＤ４４に結合する前記抗体，またはこれらの組み合わせの前記検出のための１つ以上の比色剤を含む、請求項３１から３４のいずれか一項に記載のキット。
36. 前記キットがラテラルフローイムノアッセイである、請求項３１から３５のいずれか一項に記載のキット。
37. 前記キットが特異的にｐ１６ＩＮＫ４ａに結合する前記抗体，特異的にＣＤ４４に結合する前記抗体，またはこれらの組み合わせにより任意で被覆したマルチウェルプレートを含む、請求項３１から３６のいずれか一項に記載のキット。
38. 前記ｓｏｌＣＤ４４の参照レベルが約１０ｎｇ／ｍＬ、約５．５ｎｇ／ｍＬ、約５．３ｎｇ／ｍＬ、及び／または約２．２ｎｇ／ｍＬである、請求項３１から３７のいずれか一項に記載のキット。
39. 前記総タンパク質の参照レベルが約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ、及び／または約０．６ｍｇ／ｍＬである、請求項３１から３８のいずれか一項に記載のキット。
40. 前記ｓｏｌＣＤ４４の参照レベルが約２．２ｎｇ／ｍＬ及び約５．３ｎｇ／ｍＬであり、前記総タンパク質の参照レベルが約１．２ｍｇ／ｍＬである、請求項３１から３９のいずれか一項に記載のキット。
41. 前記ｓｏｌＣＤ４４の参照レベルが約２．２ｎｇ／ｍＬ及び約５．３ｎｇ／ｍＬであり、前記総タンパク質の参照レベルが約０．５ｍｇ／ｍＬである、請求項３１から４０のいずれか一項に記載のキット。
42. 前記ｓｏｌＣＤ４４及び総タンパク質の参照レベルがそれぞれ約２．２２ｎｇ／ｍＬ及び約１．２ｍｇ／ｍＬである、請求項３１から４１のいずれか一項に記載のキット。

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