DE10102338A1

DE10102338A1 - Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten

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Publication number: DE10102338A1
Application number: DE10102338A
Authority: DE
Inventors: Jens Lerchl; Elke Duwenig; Friedrich Bischoff; Ernst Heinz; Hjoerdis Drexler; Jodi Scheffler
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2002-07-25
Also published as: NO20033268D0; NO20033268L; AU2002228053A1; CA2435091A1; WO2002057464A3; EP1356056A2; US20040049805A1; WO2002057464A2

Abstract

Die Erfindung betrifft Expressionskassetten, deren Kombination und Vektoren, enthaltend die Expressionskassetten, die pflanzliche Promotoren mit einer Expressionsspezifität für pflanzliche Samen, insbesondere Leinsamen, enthalten, sowie die Verwendung dieser Expressionskassetten oder Vektoren zur rekombinanten Expression heterologer Gene in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder trangenes Vermehrungsgut sowie die Verwendung derselben als Nahrungs-, Futtermittel oder Saatgut, Pharmazeutika, Feinchemikalien oder als industrieller Grundstoff.

Description

Die Erfindung betrifft Expressionskassetten, deren Kombination und Vektoren enthaltend die Expressionskassetten, die pflanzliche Promotoren mit einer Expressionsspezifität für pflanzliche Samen insbesondere Leinsamen enthalten, sowie die Verwendung dieser Ex pressionskassetten oder Vektoren zur rekombinanten Expression he terologer Gene in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte trans gene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben als Nahrungs-, Futtermittel oder Saatgut, Pharmazeutika, Feinchemikalien oder als industrieller Grundstoff.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten werden vorteilhaft in einem Verfahren zur Herstellung von ungesätttgten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen und/oder ein Verfahren zun Her stellung von Triglyceriden mit erhöhtem Gehalt an mehrfach unge sättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen verwen det. Im Verfahren finden vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder 11 Anwendung, die unter Verwendung der Expressionskassetten exprimiert werden. Diese vorgenannten Nukleinsäuren sind im Verfahren sowie zur Her stellung eines transgenen Organismuses bevorzugt einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Mikroorganismus mit erhöhtem Gehalt an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit ungesättigten C₁₈-, C₂₀- oder C₂₂-Fettsäuren geeignet. Außerdem können mit Hilfe der erfin dungsgemäßen Expressionskassetten weitere Gene neben den Nuklein säuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 11 oder seine Homologen, Derivate oder Analoga sowie Genkonstrukte, die diese Gene oder ihre Homologen, Derivate oder Analoga umfasst, sowie ihre Verwendung allein oder in Kombination mit weiteren Biosynthesegenen bevorzugt Biosynthesegene für poly ungesättigte Fettsäuren, wie vorteilhaft in SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 9 dargestellt, in Organismen bevorzugt Pflanzen exprimiert werden.

Eine Reihe von Produkten und Nebenprodukten natürlich vor kommender Stoffwechselprozesse in Mikroorganismen, tierischen und pflanzlichen Zellen sind für viele Industriezweige, ein schließlich der Futtermittel-, Nahrungsmittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie, nützlich. Zu diesen gemeinsam als "Feinchemikalien" bezeichneten Molekülen gehören beispielsweise Lipide und Fettsäuren, unter denen eine beispielhafte Klasse die mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind. Fettsäuren und Tri glyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebens mittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharma bereich. Je nachdem ob es sich um freie gesättigte oder unge sättigte Fettsäuren oder um Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet, so werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. PUFAs haben weiterhin einen positiven Einfluss auf den Cholesterinspiegel im Blut von Menschen und eignen sich daher zum Schutz gegen Herzkrankheiten. So finden sie in ver schiedenen diätischen Lebensmitteln oder Medikamenten Anwendung.

Besonders geeignete Mikroorganismen zur Herstellung von PUFAs sind Mikroorganismen wie Thraustochytrien oder Schizochytrien- Stämme, Algen wie Phaeodactylum tricornutum oder Crypthecodinium- Arten, Ciliaten, wie Stylonychia oder Colpidium, Pilze, wie Mortierella, Entomophthora oder Mucor. Durch Stammselektion ist eine Anzahl von Mutantenstämmen der entsprechenden Mikro organismen entwickelt worden, die eine Reihe wünschenswerter Verbindungen, einschließlich PUFAs, produzieren. Die Selektion von Stämmen mit verbesserter Produktion eines bestimmten Moleküls ist jedoch ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren.

Alternativ kann die Produktion von Feinchemikalien geeigneter weise über die Produktion von Pflanzen, die so entwickelt sind, dass sie die vorstehend genannten PUFAs herstellen, im großen Maßstab durchgeführt werden. Besonders gut für diesen Zweck geeignete Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten wie Raps, Canola, Lein, Soja, Sonnen blumen, Borretsch und Nachtkerze. Aber auch andere Nutzpflanzen, die Öle oder Lipide und Fettsäuren enthalten, sind gut geeignet, wie in der eingehenden Beschreibung dieser Erfindung erwähnt. Mittels herkömmlicher Züchtung ist eine Reihe von Mutanten pflanzen entwickelt worden, die ein Spektrum an wünschenswerten Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen produzieren. Die Selektion neuer Pflanzensorten mit verbesserter Produktion eines bestimmten Moleküls ist jedoch ein zeitaufwändiges und schwieriges Verfahren oder sogar unmöglich, wenn die Verbindung in der entsprechenden Pflanze nicht natürlich vorkommt, wie im Fall von mehrfach ungesättigten C₁₈-, C₂₀-Fettsäuren und C₂₂-Fett säuren und solchen mit längeren Kohlenstoffketten.

Aufgrund der positiven Eigenschaften ungesättigter Fettsäuren hat es in der Vergangenheit nicht an Ansätzen gefehlt, Gene, die an der Synthese von Fettsäuren bzw. Triglyceriden beteiligt sind, für die Herstellung von Ölen in verschiedenen Organismen mit geändertem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren verfügbar zu machen. So wird in WO 91/13972 und seinem US-Äquivalent eine Δ-9-Desaturase, beschrieben. In WO 93/11245 wird eine Δ-15-Desaturase in WO 94/11516 wird eine Δ-12-Desaturase bean sprucht. Δ-6-Desaturasen werden in WO 93/06712, US 5,614,393, WO 96/21022 und WO 99/27111 beschrieben. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 oder Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659 beschrieben. In WO 96/13591 wird eine Δ-6-Palmitoyl- ACP-Desaturase beschrieben und beansprucht. Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen Desaturasen ist jedoch bis her nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als membrangebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und charakterisieren sind (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71; 1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792).

In Hefen konnte sowohl eine Verschiebung des Fettsäurespektrums zu ungesättigten Fettsäuren hin als auch eine Steigerung der Produktivität nachgewiesen werden (siehe Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659, Napier et al., Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611-614). Die Expression der verschiedenen Desaturasen in trans genen Pflanzen zeigte allerdings nicht den gewünschten Erfolg. Eine Verschiebung des Fettsäurespektrum zu ungesättigten Fett säuren hin konnte gezeigt werden, gleichzeitig zeigte sich aber, dass die Syntheseleistung der tranagenen Pflanzen stark nachließ, das heißt gegenüber den Ausgangspflanzen konnten nur geringere Mengen an Ölen isoliert werden.

Weder in Hefen noch in Pflanzen werden natürlicherweise mehr fach ungesättigte C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül wie Arachidonsäure (ARA) und/oder Eicosapentaensäure (EPA) und/oder Docosahexaen säure (DHA) hergestellt.

Nach wie vor besteht daher ein großer Bedarf an neuen Genen, die für Enzyme kodieren, die an der Biosynthese ungesättigter Fettsäuren beteiligt sind und es ermöglichen, diese in einem technischen Maßstab herzustellen. Keines der bisher bekannten biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren liefert die vorgenannten Fettsäuren in wirtschaftlich nutzbaren Mengen.

Bei der Expression von Genen in Pflanzen gibt es immer wieder Probleme, das heißt, es kommt durch die Expression nicht zur er warteten Steigerung bei der Herstellung des gewünschten Wertpro dukts.

Verschiedene Methoden zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sind bekannt (Halford NG, Shewry PR, Br. Med. Bull., 2000; 56: 62-73). Ziel ist die Herstellung von Pflanzen mit vor teilhaften, neuen Eigenschaften, zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität, zur Qualitätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika (Dunwell JM, J. Exp. Bot., 2000: 51 Spec No: 487-96).

Eine Grundvoraussetzung für die transgene Expression bestimmter Gene ist die Bereitstellung pflanzenspezifischer Promotoren. Pro motoren sind wichtige Werkzeuge in der Pflanzenbiotechnologie, um die Expression eines bestimmten Gens in einer transgenen Pflanze lokal und zeitlich zu steuern und so bestimmte Wesensmerkmale der Pflanze auszunutzen bzw. erst zu erzielen. Verschiedene Promoto ren für diverse Pflanzenarten, bestimmte Pflanzengewebe und Ent wicklungsstadien sind bekannt.

Verwendet werden zum Beispiel konstitutive Promotoren wie der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpro motor oder der Promotor des 35S-Transkriptes des Blumenkohlmo saikvirus (CaMV) (Odell et al., Nature 1985: 313, 810-812), der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al., Plant Mol. Biol. 1995, 29: 637-646), die Promotoren der vakuolären ATPase Untereinheiten oder der Pro motor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991). Nachteilig bei diesen Promotoren ist, dass sie in fast allen Ge weben der Pflanze konstitutiv aktiv sind. Eine gezielte Expres sion von Genen in bestimmten Pflanzenteilen oder zu bestimmten Entwicklungszeitpunkten ist mit diesen Promotoren nicht möglich.

Promotoren, deren Aktivität gewebsspezifisch oder entwicklungsab hängig reguliert ist, wurden isoliert. Spezifitäten sind für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen beschrieben. Die Stringenz der Spezifität, als auch die Expres sionsaktivität dieser Promotoren ist sehr unterschiedlich. Zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression ge währleisten, wie der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kar toffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubi sco (Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promo tor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245).

Weitere Promotoren sind beispielsweise spezifische Promotoren für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Pa tatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhi bitors aus Kartoffel, der Promotor der Stärke Synthase (GBSS1) oder der Sporamin Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409 625), fruchtreifungspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifungspezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794), blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen-Syn thase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).

Eine Variation der Aktivität eines Promotoren anhängig vom Ent wicklungsstadium der Pflanze wurd unter anderem von Baerson et al. beschrieben (Baerson SR, Lamppa GK. Plant Mol Biol. 1993; 22 (2): 255-67).

Samenspezifische Promotoren sind aufgrund der Bedeutung des Sa mens als eine der Hauptnahrungs- bzw. Futterquellen von Mensch und Tier und als Produktionsort für Wertstoffe von besonderen In teresse. Bekannt sind Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. So wurden beispielsweise die Promotoren von Genen identifiziert, die für Speicherproteine ver schiedener Dicotyledonen kodieren. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5504200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989; 1(9): 839-53), des 2S Albumingens (Jo seffson LG et al., J Biol Chem 1987, 262: 12196-12201), des Legu mins (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989; 215(2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al., Molecular & General Genetics 1991, 225(3): 459-67), des Napin Gens (Stalberg K, et al., L. Planta 1996, 199: 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H et al., Mol Gen genet 1991, 225: 121-128). Diese steuern eine hohe samenspezifi sche Expression von Speicherproteinen.

Trotz der allgemeinen Annahme, daß pflanzliche Promotoren von ei ner Spezies auf die andere übertragbar sind und auch in artfrem den Pflanzenspezies ähnliche Aktivitäten und Spezifitäten aufwei sen, mehren sich Hinweise auf Einschränkungen von dieser Annahme. So zeigte es sich, daß die Höhe der transgenen Expression von he terologen Genen unter Kontrolle dieser Promotoren, oft stark von der Art der Wirtspflanze abhängig ist. Es wurde festgestellt, dass die Expression nicht immer absolut zelltypspezifisch ist.

Unterschiede im Expressionsmuster und der Expressionsstärke eines bestimmten Promotors können durch unterschiedliche Wirtspflanzen oder durch unterschiedliche Insertionsorte in das Genom der Wirtspflanze bedingt sein (Goossens A et al., Plant Phys 1999, 120: 1095-1104).

Durch eine Genexpression in anderen Pflanzenteilen kann die Ver wendung eines Promoters in einer anderen Pflanzenart sehr einge schränkt sein. Etwa wenn die Expression des Genes in den Metabo lismus der Zelle, die Zusammensetzung der Membranlipide oder die Biosynthese eingreift.

Es bestand daher die Aufgabe weitere Expressionskassetten für die Expression in Pflanzen zur Verfügung zu stellen. Und diese für die Expression von Genen vorteilhaft Biosynthesegenen allein oder gegebenenfalls in Kombination mit anderen Enzymen in einem Verfahren beispielsweise zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren zu verwenden. Diese Aufgabe wurde durch die erfin dungsgemäße Expressionskassette mit einer Struktur ausgewählt aus der Gruppe gelöst:

a) L1 - Promotor - Strukturgen - L2,
b) L1 - Promotor - Strukturgen - L2 - L1 - Promotor - Struktur gen - L2,
c) L1 - Promotor - Strukturgen - L2 - L1 - Promotor - Struktur gen - L2 - L1 - Promotor - Strukturgen - L2,

wobei L1, L2, Promotor und Strukturgen die folgende Bedeutung hat:
L1 = SEQ ID NO: 32 oder eine äquivalente Restriktionsschnittstel len enthaltende Sequenz,
L2 = unabhängig voneinander SEQ ID NO: 33, 34 oder 35 oder äqui valente Restriktionsschnittstellen enthaltende Sequenzen,
Promotor = pflanzlicher Promotor,
Strukturgen = eine in Pflanzen exprimierbare Nukleinsäuresequenz.

Vorteilhaft ist das Strukturgen ein Biosynthesegen, bevorzugt ist es ein Biosynthesegen des Lipid- oder Fettsäurestoffwechsels, vorteilhaft ein pflanzliches Gen. In einer besonders vorteilhaf ten Ausführungsform ist das Strukturgen eine Nukleinsäuresequenz, die für Proteine ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]- Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transfe rase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl- Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure- Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylgly cerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n), kodiert.

Ganz besonders bevorzugt ist das Strukturgen eine Nukleinsäurese quenz ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund des degenerierten geneti schen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erhalten werden,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Po lypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.

Unter einer äquivalente Restriktionsschnittstellen enthaltenden Sequenz im Sinne der Erfindung sind Sequenzen zu verstehen, die Restriktionsschnittstellen enthalten, die für den Aufbau multip ler Expressionskassetten geeignet sind, das heißt geeigneterweise nicht im Strukturgen vorhanden sind oder im binären Vektor. Solche Restriktionsschnittstellen wie beispielhaft EcoRI, BamHI, SacI, PstI, NcoI, NdeI, BglI, BglII, XhoI, Xba und weitere sind dem Fachmann bekannt und können einschlägigen Fachbüchern entnom men werden.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können für die Expres sion von Genen in wirtschaftlich wichtigen Kulturpflanzen wie beispielsweise Lein, für die keine endogenen samenspezifischen Promotoren bekannt waren, verwendet werden. Lein ist, wie die vorliegenden Arbeiten zeigten, für eine samenspezifische Expres sion von Genen besonders problematisch, da offensichtlich mehrere Promotoren, die vom Fachmann für samenspezifische Expression in anderen Pflanzen routinemäßig benutzt werden, in z. B. in anderen Pflanzen wie Lein nicht funktionieren, das heißt nicht zu einer Transkription bzw. letztlich zu einer Expression der mRNA des Strukturgens führt.

Verwendung der oben genannten erfindungsgemäßen Expressionskas setten in einem Verfahren zur Herstellung von Fettsäureestern mit einem erhöhtem Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erhalten werden,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID. NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäure sequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Amino säureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist,

in einen Fettsäureester produzierenden Organismus einbringt, anzieht und die dem Organismus enthaltenden Fettsäureester iso liert.

Bei den im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen handelt es sich um isolierte Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Δ-5-, Δ-6- oder Δ-12-Desaturaseaktivität codieren.

Im Verfahren werden vorteilhaft Fettsäureester mit mehrfach unge stättigten C₁₈-, C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuremolekülen mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäureester hergestellt. Bevorzugt enthalten diese Fettsäuremoleküle drei, vier oder fünf Doppelbindungen und führen vorteilhaft zur Synthese von Arachi donsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA) oder Docosahexaensäure (DHA).

Die Fettsäureester mit mehrfach ungesättigten C₁₈-, C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuremolekülen können aus den Organismen, die für die Her stellung der Fettsäureester verwendet wurden, in Form eines Öls oder Lipids beispielsweise in Form von Verbindungen wie Sphingo lipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglyceride, Diacylglyceride, Triacylglyceride oder sonstige Fettsäureester, die die mehrfach ungesättigten Fett säuren mit mindestens zwei Doppelbindungen enthalten, isoliert werden.

Als Organismus für die Herstellung im Verfahren kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eurkaryontischen Organismen wie proka ryontische oder eurkaryontische Mikroorganismen wie gram-positive oder gram-negative Bakterien, Pilze, Hefen, Algen, Ciliaten, tie rische oder pflanzliche Zellen, Tiere oder Pflanzen wie Moose, zweikeimblättrige oder einkeimblättrige Pflanzen in Frage. Vor teilhaft werden Organismen im erfindungsgemäßen Verfahren verwen det, die zu den Öl-produzierenden Organismen gehören, das heißt die für die Herstellung von Ölen verwendet werden, wie Mikroorga nismen wie Crypthecodinium, Thraustochytrium, Phaeodactylum und Mortierella, Entomophthora, Mucor, Crypthecodinium sowie andere Algen oder Pilze sowie Tiere oder Pflanzen, insbesondere Pflanzen bevorzugt Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Sojabohne, Erdnuss, Raps, Canola, (Sonnenblume, Safflor, Nachtkerze, Lein, Soja, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Ko kosnuss) oder Feldfrüchte, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, So lanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölplame, Kokosnuß) sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Besonders bevorzugte erfindungsge mäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Soja, Erdnuß, Raps, Ca nola, Lein, Nachtkerze, Sonnenblume, Safflor oder Bäume (Ölpalme, Kokosnuß).

Das Verfahren beinhaltet entweder die Züchtung eines geeigneten transgenen Organismus bzw. transgenen Mikroorganismus oder die Züchtung von transgenen Pflanzenzellen, -geweben, -organen oder ganzen Pflanzen, umfassend die erfindungsgemäßen Nukleotidsequen zen der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gegebenenfalls in Verbindungen mit den in SEQ ID NO: 7 und/oder SEQ ID NO: 9 dargestellten Se quenzen allein oder in Kombination mit Sequenzen von vorteilhaf ten erfindungsgemäßen Expressionskassetten in vorteilhaften Vek toren mit SEQ ID NO: 13-17 oder ihre Homologen, Derivate oder Analoga oder ein Genkonstrukt, das die SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 ggf. in Verbindung mit SEQ ID NO: 7 und/oder 9 oder ihre Homolo gen, Derivate oder Analoga umfasst, oder einen Vektor, der diese Sequenz oder das Genkonstrukt umfasst, welches die Expression er findungsgemäßer Nukleinsäuremoleküle herbeiführt, so dass eine Feinchemikalie produziert wird. Bei einer bevorzugten Ausfüh rungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens einer Zelle, die eine solche erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen enthält, wobei eine Zelle mit einer Desaturasenukleinsäurese quenz, einem Genkonstrukt oder einem Vektor, welche die Expression einer erfindungsgemäßen Desaturasenukleinsäure allein oder in Kombination herbeiführen, transformiert wird. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der Feinchemikalie aus der Kultur. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform gehört die Zelle zur Ordnung der Ciliaten, zu Mikroorganismen, wie Pilzen, oder zum Pflanzenreich, insbesondere zu Ölfruchtpflanzen, besonders bevorzugt sind Mikroorganismen oder Ölfruchtpflanzen beispielsweise Erdnuss, Raps, Canola, Lein, Soja, Safflower (Distel), Sonnenblumen oder Borretsch.

Unter transgen im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, daß die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder die erfindungsgemäßen Expressionskassetten nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Transgen bedeutet aber auch, dass die Nukleinsäuren oder Expressionskassetten an ihrem natür lichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Se quenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder daß die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfin dungsgemäßen Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Bevorzugte transgene Or ganismen sind die oben genannten transgenen Pflanzen bevorzugt Ölfruchtpflanzen.

Aus den im Verfahren hergestellten Fettsäureestern lassen sich die enthaltenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine Alkalibehandlung wie wässrige KOH oder NaOH vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol freisetzen und isolieren über beispielsweise Phasentrennung und anschließen der Ansäuerung über z. B. H₂SO₄.

Die im Verfahren hergestellten Fettsäureester fallen in Form von Ölen, Lipiden und/oder Fettsäuren an, die mindestens zwei Doppel bindungen in den Fettsäuremolekülen, bevorzugt drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen enthalten. Auch sind Zusammensetzun gen, die die genannten Öl-, Lipid- und/oder Fettsäuren enthalten, sowie die Verwendung der Öle, Lipide und/oder Fettsäuren oder der Zusammensetzungen in Futter, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika eine weitere Anwendungsmöglichkeit der vorgenannten Stoffe.

Ein weiterer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Modulation der Produktion eines Moleküls durch einen Mikroorganismus. Diese Ver fahren umfassen das Zusammenbringen der Zelle mit einer Substanz, welche die erfindungsgemäßen Desaturaseaktivität allein oder in Kombination oder die Desaturasenukleinsäureexpression moduliert, so dass eine zellassoziierte Aktivität relativ zu der gleichen Aktivität in Abwesenheit der Substanz verändert wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird/werden ein oder zwei Stoffwech selweg(e) der Zelle für Lipide und Fettsäuren, Cofaktoren und En zyme moduliert oder der Transport von Verbindungen über diese Membranen moduliert, so dass die Ausbeute oder die Rate der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Mikro organismus verbessert ist. Die Substanz, welche die Desaturase aktivität moduliert, kann eine Substanz sein, welche die Desaturaseaktivität oder Desaturasenukleinsäureexpression stimuliert oder die als Zwischenprodukt bei der Fettsäurebio synthese verwendet werden kann. Beispiele für Substanzen, welche die Desaturaseaktivität oder Desaturasenukleinsäureexpression stimulieren, sind u. a. kleine Moleküle, aktive Desaturasen sowie desaturasenkodierende Nukleinsäuren, die in die Zelle eingebracht worden sind. Beispiele für Substanzen, welche die Desaturase aktivität oder -expression hemmen, sind u. a. kleine Moleküle und Antisense-Desaturasenukleinsäuremoleküle.

Ein weiterer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Modulation der Ausbeuten einer gewünschten Verbindung aus einer Zelle, umfassend das Einbringen eines Wildtyp- oder Mutanten-Desaturasegens, das entweder auf einem separaten Plasmid gehalten oder in das Genom der Wirtszelle integriert wird, in eine Zelle. Bei Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein oder durch der artige Rekombination erfolgen, dass das native Gen durch die ein gebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion der ge wünschten Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder durch Verwendung eines Gens in trans, so dass das Gen mit einer funk tionellen Expressionseinheit, welche mindestens eine die Expres sion eines Gens gewährleistende Sequenz und mindestens eine die Polyadenylierung eines funktionell transkribierten Gens gewähr leistende Sequenz enthält, funktionell verbunden ist.

Bei einer bevorzugten Form des Verfahrens sind die Ausbeuten modifiziert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die gewünschte Chemikalie vermehrt, wobei unerwünschte störende Verbindungen vermindert werden können. Hei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die gewünschte Fein chemikalie ein Lipid oder eine Fettsäure, ein Cofaktor oder ein Enzym. Bei besonders bevorzugten Ausführungsform ist diese Chemikalie eine mehrfach ungesättigte Fettsäure. Stärker bevor zugt ist sie ausgewählt aus Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaen säure (EPA) oder Docosahexaensäure (DHA).

Die vorliegende Erfindung stellt vorteilhafte Multiexpressions kassetten und Konstrukte zur multiparallelen samenspezifischen Expression von Genkombinationen in Pflanzen zur Verfügung.

Diese können im oben beschriebenen Verfahren zur Expression von Genen, bevorzugt den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 beschriebenen, in Algen und Pilzen und Pflanzen, insbesondere Ölfruchtpflanzen sind bevorzugte Organismen für das Verfahren, verwendet werden.

Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten können im Verfahren in Verbindung mit den oben genannten Nuklein säuremoleküle zur gentechnologisch Veränderung von Pflanzen ver wendet werden, so dass sie schließlich zur Herstellung von besse ren oder effizienteren Produzenten einer oder mehrerer Feinchemi kalien führen. Diese verbesserte Produktion oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie kann durch eine direkte Wirkung der Manipulation eines erfindungsgemäßen Gens oder durch eine in direkte Wirkung dieser Manipulation hervorgerufen werden. Unter Feinchemikalien sind im Sinne der Erfindung beispielsweise Fett säureester, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen enthalten wie Sphingolipide, Phosphoglyce ride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglyceride, Dia cylglyceride, Triacylglyceride oder sonstige Fettsäureester, die die mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppel bindungen enthalten, zu verstehen. Weiter sind darunter zu ver stehen Verbindungen wie Vitamine beispielsweise Vitamin E, Vita min C, Vitamin B2, Vitamin B6, Pantolacton, Carotinoide wie Asta xanthin, β-Carotin, Zeaxanthin und andere.

Moose und Algen sind die einzigen bekannten Pflanzensysteme, die erhebliche Mengen an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie Arachidonsäure (ARA) und/oder Eicosapentaensäure (EPA) und/oder Docosahexaensäure (DHA) herstellen. Moose enthalten PUFAs in Membranlipiden, während Algen, algenverwandte Organismen und einige Pilze auch nennenswerte Mengen an PUFAs in der Triacyl glycerolfraktion akkumulieren. Daher eignen sich Nukleinsäure moleküle, die aus solchen Stämmen isoliert werden, die PUFAs auch in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren, besonders vorteil haft zur Modifikation des Lipid- und PUFA-Produktionssystems in einem Wirt, insbesondere in Mikroorganismen, wie den vorstehend erwähnten Mikroorganismen, und Pflanzen, wie Ölfruchtpflanzen, beispielsweise Raps, Canola, Lein, Soja, Sonnenblumen, Borretsch. Sie sind deshalb vorteilhaft im Verfahren verwendbar.

Die im Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Expres sionskassetten verwendeten Nukleinsäuresequenzen codieren für Desaturasen, die zur Produktion langkettiger mehrfach unge sättigter Fettsäuren, vorzugsweise mit mehr als sechzehn, achtzehn oder zwanzig Kohlenstoffatomen im Kohlenstoffgrundgerüst der Fettsäure und/oder mindestens zwei Doppelbindungen in der Kohlenstoffkette, geeignet sind, wobei eine Nukleinsäure für ein Enzym codiert, das Doppelbindungen in die Δ-5-Position, in einem anderen Fall in die Δ-6-Position und in einem weiteren Fall in die Δ-12-Position einführen kann. Mithilfe dieser Nukleinsäuren können hohe Mengen an PUFAs in der Triacylgycerolfraktion erhal ten werden. Weiterhin wurden weitere Desaturasen isoliert, die allein oder zusammen mit einer Δ-4-Desaturase für ein Verfahren zur Produktion polyungesättigter Fettsäuren genutzt werden kön nen. Dabei ist in der Anmeldung unter dem Singular, d. h. unter ei nem Desaturasegen oder -Protein, auch der Plural, d. h. die Desatu rasegene oder Proteine zu verstehen.

Die Herstellung einer Triensäure mit C₁₈-Kohlenstoffkette mit Hilfe von Desaturasen konnte bisher gezeigt werden. In diesen literaturbekannten Verfahren wurde die Herstellung von γ-Linolen säure beansprucht. Bisher konnte jedoch niemand die Herstellung sehr langkettiger mehrfach ungesättigter Fettsäuren (mit C₂₀- und längerer Kohlenstoffkette sowie von Triensäuren und höher unge sättigten Typen) allein durch modifizierte Organismen zeigen.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen langkettigen PUFAs müssen die mehrfach ungesättigten C₁₈-Fettsäuren zunächst durch die enzymatische Aktivität einer Elongase um mindestens zwei Kohlen stoffatome verlängert werden. Nach einer Elongationsrunde führt diese Enzymaktivität zu C₂₀-Fettsäuren, und nach zwei, drei und vier Elongationsrunden zu C₂₂-, C₂₄- oder C₂₆-Fettsäuren. Die in dieser Erfindung offenbarten Nukleinsäuresequenzen, die für ver schiedene Desaturasen codieren, können im Konzert mit Elongasen zu sehr langkettigen, polyungesättigten führen. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Desaturasen führt vorzugsweise zu C₁₈-, C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt zu C₁₈- und/oder C₂₀-Fett säuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit drei, vier oder fünf Doppelbindungen im Molekül. Die Fettsäureelongation kann durch Kombination der erfindungsge mäßen Desaturasen mit einer Elongaseaktivität erfolgen, wobei die durch die in SEQ ID NO: 9 codierte Elongase vorteilhaft verwendet werden kann. Nachdem die Verlängerung mit dem erfindungsgemäßen Enzym(en) stattgefunden hat, können weitere Desaturierungs schritte wie z. B. eine solche in Δ-5-Position erfolgen. Auch die Kombination mit anderen Elongasen wie solche, die zu einer Ver längerung von C₁₈- auf C₂₀- oder von C₂₀- auf C_22-24-Ketten, wie in WO/0012720 offenbart, führt, kann Verwendung finden und/oder eine Desaturase mit Aktivität für Δ-4-Position kann vorteilhaft ein gesetzt werden, um die hoch desaturierten Fettsäuren zu erhalten. Daher führen die Produkte der Desaturaseaktivitäten und der möglichen weiteren Desaturierung zu bevorzugten PUFAs mit einem höheren Desaturierungsgrad, wie Dihomo-gamma-Lonolensäure, Docosadiensäure, Arachidonsäure, ω6-Eicosatriendihomo-γ-linolen säure, Eicosapentaensäure, ω3-Eicosatriensäure, ω3-Eicosatetraen säure, Docosapentaensäure oder Docosahexaensäure. Substrate der erfindungsgemäßen Enzymaktivität sind zum Beispiel Taxolsäure; 6,9-Octadecadiensäure, Linolsäure, Pinolensäure, α- oder γ-Linolen säure oder Stearidonsäure sowie Arachidonsäure, Eicosatetraen säure, Docosapentaensäure, Eicosapentaensäure. Bevorzugte Sub strate sind Linolsäure, γ-Linolensäure und/oder α-Linolensäure sowie Arachidonsäure, Eicosatetraensäure, Docosapentaensäure, Eicosapentaensäure. Besonders bevorzugt als Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Arachidonsäure, Docosapentaen säure, Eicosapentaensäure. Die C₁₈-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen in der Fettsäure können durch die erfindungs gemäße enzymatische Aktivität in Form der freien Fettsäure oder in Form der Ester, wie Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide, Phosphoglyceride, Monoacylglyceride, Diacylglyceride oder Tri acylglyceride, verlängert werden.

Für die menschliche Ernährung ist konjugierte Linolsäure "CLA" von besonderer Bedeutung. Unter CLA versteht man insbesondere Fettsäuren wie C18 : 2 ^9cis,11trans oder das Isomer C18 : 2 ^{10trans, 12 cis}, die aufgrund menschlicher Enzymsysteme nach Aufnahme im Körper desaturiert bzw. elongiert werden können und zu gesundheits fördernden Effekten beitragen können. Mit den erfindungsgemäßen Desaturasen (Δ-12-Desaturase) können auch solche konjugierten Fettsäuren mit wenigstens zwei Doppelbindungen im Molekül desaturiert werden und damit solche gesundheitsfördernden Fettsäuren der menschlichen Ernährung zugeführt werden. Weitere Beispiele für konjugierte Fettsäuren sind alpha-Parinarsäure, Punicasäure, Eleostearinsäure und Calendulasäure.

Unter der Verwendung von der erfindungsgemäßen Expressionkasset te in Klonierungsvektoren in Pflanzen und bei der Pflanzentrans formation, wie denjenigen, die veröffentlicht sind in und dort zitiert sind: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Uti lization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225, lassen sich Gene vorteilhaft Biosynthesegene wie die oben beschriebenen Nukleinsäuren zur gentechnologischen Ver änderung eines breiten Spektrums an Pflanzen verwenden, so dass diese ein besserer oder effizienterer Produzent beispielsweise eines oder mehrerer von Lipiden hergeleiteter Produkte, wie PUFAs, werden. Diese verbesserte Produktion oder Effizienz der Pro duktion eines beispielsweise von Lipiden hergeleiteten Produktes, wie PUFAs, kann durch direkte Wirkung der Manipulation oder eine indirekte Wirkung dieser Manipulation hervorgerufen werden.

Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung eines erfindungsgemäßen Desaturaseproteins die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Fein chemikalie aus einer Ölfruchtpflanze oder einem Mikroorganismus aufgrund eines veränderten Proteins direkt beeinflussen kann. Die Anzahl oder Aktivität des Desaturaseproteins oder -Gens sowie von Genkombinationen von Desaturasen und Elongasen kann erhöht sein, so dass größere Mengen dieser Verbindungen de novo hergestellt werden, weil den Organismen diese Aktivität und Fähigkeit zur Biosynthese vor dem Einbringen des ent sprechenden Gens fehlte. Entsprechendes gilt für die Kombination mit weiteren Desaturasen oder Elongasen oder weiteren Enzymen aus dem Lipidstoffwechsel. Auch die Verwendung verschiedener divergenter, d. h. auf DNA-Sequenzebene unterschiedlicher Sequenzen kann dabei vorteilhaft sein bzw. die Verwendung von Promotoren zur Genexpression, die eine andere zeitliche Genexpression z. B. abhängig vom Reifegrad eines Samens oder Öl-speichernden Gewebes ermöglicht.

Durch das Einbringen eines Desaturasegens oder mehrerer Desatura segene unter Kontrolle der erfindungsgemäßen Expressionskassetten in einen Organismus allein oder in Kombination mit anderen Genen in eine Zelle kann nicht nur den Biosynthesefluss zum Endprodukt erhöht, sondern auch die entsprechende Zusammensetzung der Enpro dukte beispielsweise der Triacylglycerine erhöht oder de novo ge schaffen werden. Ebenso kann die Anzahl oder Aktivität anderer Gene, die am Import von Nährstoffen, dis zur Biosynthese einer oder mehrerer Feinchemikalien (z. B. Fettsäuren, polaren und neu tralen Lipiden) nötig sind, erhöht sein, so dass die Konzentra tion dieser Vorläufer, Cofaktoren oder Zwischenverbindungen in nerhalb der Zellen oder innerhalb des Speicherkompartiments er höht ist, wodurch die Fähigkeit der Zellen zur Produktion von PUFAs, wie im folgenden beschrieben, weiter gesteigert wird. Fett säuren und Lipide sind selbst als Feinchemikalien wünschenswert; durch Optimierung der Aktivität oder Erhöhung der Anzahl einer oder mehrerer Desaturasen, die an der Biosynthese dieser Verbin dungen beteiligt sind, oder durch Zerstören der Aktivität einer oder mehrerer Desaturasen, die am Abbau dieser Verbindungen be teiligt sind, kann es möglich sein, die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmolekülen aus Pflanzen oder Mikroorganismen zu steigern.

Die Mutagenese der/des erfindungsgemäßen Desaturasegene(s) kann weiterhin zu einem Desaturaseprotein mit geänderten Aktivitäten führen, welche die Produktion einer oder mehrerer gewünschter Feinchemikalien direkt oder indirekt beeinflussen. Beispiels weise kann die Anzahl oder Aktivität der/des erfindungsgemäßen Desaturasegens(e) gesteigert werden, so dass die normalen Stoff wechselabfälle oder -nebenprodukte der Zelle (deren Menge mög licherweise aufgrund der Überproduktion der gewünschten Fein chemikalie erhöht ist) effizient exportiert werden, bevor sie andere Moleküle oder Prozesse innerhalb der Zelle (welche die Lebensfähigkeit der Zelle senken würden) zerstören oder die Bio synthesewege der Feinchemikalie stören würden (wodurch die Aus beute, Produktion oder Effizienz der Produktion der gewünschten Feinchemikalie verringert wird). Ferner können die relativ großen intrazellulären Mengen der gewünschten Feinchemikalie selbst toxisch für die Zelle sein oder Enzym-Rückkopplungsmechanismen, wie die allosterische Regulation, stören, beispielsweise könnte sie durch Steigerung der Aktivität oder Anzahl anderer strom abwärts folgender Enzyme oder Entgiftungsenzyme des PUFA-Wegs die Allokation der PUFA in die Triacylgylcerin-Fraktion steigern, man könnte die Lebensfähigkeit von Saatzellen erhöhen, was wiederum zu besserer Entwicklung von Zellen in Kultur oder zu Saaten führt, die die gewünschte Feinchemikalie produzieren. Das erfindungsgemäße Desaturasegen kann auch so manipuliert werden, dass die entsprechenden Mengen der verschiedenen Lipid- und Fettsäuremoleküle hergestellt werden. Dies kann eine ein schneidende Wirkung auf die Lipidzusammensetzung der Membran der Zelle haben und erzeugt neue Öle zusätzlich zum Auftreten neusynthetisierter PUFAs. Da jeder Lipidtyp unterschiedliche physikalische Eigenschaften hat, kann eine Veränderung der Lipidzusammensetzung einer Membran die Membranfluidität erheb lich verändern. Änderungen der Membranfluidität können sich auf den Transport von Molekülen über die Membran sowie auf die Unversehrtheit der Zelle auswirken, die beide eine entscheidende Wirkung auf die Produktion von Feinchemikalien besitzen. In Pflanzen können diese Änderungen überdies auch andere Merk male, wie Toleranz gegenüber ablotischen und biotischen Stress situationen, beeinflussen.

Im Verfahren können isolierte Nukleinsäuremoleküle (z. B. cDNAs), umfassend Nukleotidsequenzen, die eine Desaturase oder mehrere Desaturasen oder biologisch aktive Teile davon codieren, oder Nu kleinsäurefragmente, die sich als Primer oder Hybridisierungsson den zum Nachweis oder zur Amplifikation desaturasekodierender Nukleinsäuren (z. B. DNA oder mRNA) eignen, verwendet werden. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Nukleinsäure molekül eine der in Sequenz ID NO: 1 bzw 3 und 5 dargestellten Nu kleotidseguenzen oder die kodierende Region oder ein Komplement einer dieser Nukleotidsequenzen. Bei anderen besonders bevorzug ten Ausführungsformen umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die an eine Nukleotidsequenz, wie in der Sequenz SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 dargestellt, oder einen Teil davon hybridisiert oder zu mindestens etwa 50%, vorzugsweise mindestens etwa 60%, stärker bevorzugt mindestens etwa 70%, 80% oder 90% und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog dazu ist. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen kodiert das isolierte Nukleinsäure molekül eine der in der Sequenz SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 darge stellten Aminosäuresequenzen. Das bevorzugte Desaturasegen be sitzt vorzugsweise auch mindestens eine der hier beschriebenen Desaturaseaktivitäten.

Bei einer weiteren Ausführungsform kodiert das isolierte Nukleinsäuremolekül ein Protein oder einen Teil davon, wobei das Protein oder der Teil davon eine Aminosäuresequenz enthält, die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 ist, dass das Protein oder der Teil davon eine Desaturaseaktivität beibehält. Vorzugsweise behält das Protein oder der Teil davon, das/der von dem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen von Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilzunehmen. Bei einer Ausführungsform ist das von dem Nukleinsäuremolekül kodierte Protein zu mindestens etwa 50%, vorzugsweise mindestens etwa 60% und stärker bevorzugt mindestens etwa 70%, 80% oder 90% und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12. Bei einer weiteren bevor zugten Ausführungsform ist das Protein ein Volllängen-Protein, das im wesentlichen in Teilen homolog zu einer gesamten Amino säuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 (die von dem in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten offenen Leserahmen herrührt) ist.

Bei anderen Ausführungsformen umfasst die isolierte Desaturase eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens etwa 50% homolog zu einer der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 ist und am Stoffwechsel von zum Aufbau von Fettsäuren in einem Mikro organismus oder einer Pflanzenzelle notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilnehmen kann, wobei desaturierte C₁₈- oder C_20-22-Kohlenstoffketten mit Doppel bindungen an mindestens zwei Stellen gemeint ist.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform rührt das isolierte Nukleinsäuremolekül von Phaeodactylum tricornutum UTEX646 her und kodiert ein Protein (z. B. ein Desaturasefusionsprotein), das eine biologisch aktive Domäne enthält, die zu mindestens etwa 50% oder mehr homolog zu einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 ist und die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen von Pflanzen notwendigen Ver bindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilzunehmen, beibehält oder zumindest eine der Desatutierungs aktivitäten resultierend in PUFAs wie GLA, ALA, Dihomo-gamma Linolensäure, ARA, EPA oder DHA oder deren Vorläufermoleküle besitzt, und umfasst auch heterologe Nukleinsäuresequenzen, die ein heterologes Polypeptid oder regulatorische Proteine kodieren.

Alternativ kann die isolierte Desaturase eine Aminosäuresequenz umfassen, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die an eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 hybridi siert, z. B. unter stringenten Bedingungen hybridisiert, oder zu mindestens etwa 50%, vorzugsweise mindestens etwa 60%, stärker bevorzugt mindestens etwa 70%, 80% oder 90% und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog dazu ist. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass die bevor zugten Desaturaseformen ebenfalls eine der hier beschriebenen Desaturaseaktivitäten besitzen.

Bei einer anderen Ausführungsform ist das isolierte Nukleinsäure molekül mindestens 15, 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an ein Nuklein säuremolekül, das eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 17 umfasst. Vorzugsweise entspricht das isolierte Nuklein säuremolekül einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Stärker bevorzugt kodiert das isolierte Nukleinsäuremolekül natürlich vorkommende Phaeodactylum-Desaturase oder einen biologisch aktiven Teil davon.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind Expressions kassetten, die die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 in den verschiedenen Organismen wie pflanzliche Zellen, Geweben, Teilen von Pflanzen oder ganzen Pflanzen ermöglichen.

Unter der erfindungsgemäßen Expressionskassette (= Nukleinsäure konstrukt oder -fragment) sind die in SEQ ID NO: 32 als L1 und einem Promotor, einem Strukturgen ausgewählt aus den vorteilhaf ten Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren funktionellen oder nicht funktionellen Derivate zu verstehen, und die Polylinder-Terminator-Polylinker-Sequenzen (= L2) SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 oder SEQ ID NO: 35 zu verstehen. Diese steuern vorteilhafterweise die Genexpression in der Wirts zelle. Diese in den Konstrukten enthaltenen regulatorischen Se quenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Protei nexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirts organismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei die sen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regu lieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder an stelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Se quenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht ent fernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mu tiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpres sion gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor ent halten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz er möglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatori sche Elemente oder Terminatoren. Die Δ-5-Desaturase-/Δ-6-Desatu rase- und/oder Δ-12-Desaturasegene können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Ver stärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem bei spielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, z. B. rekombinante Expressionsvektoren, die mindestens eine der erfin dungsgemäßen Expressionskassetten enthalten, und Wirtszellen, in die die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder diese Vekto ren eingebracht worden sind, insbesondere Mikroorganismen, Pflan zenzellen, Pflanzengewebe, -organe oder ganze Pflanzen. Bei einer Ausführungsform kann eine solche Wirtszelle Feinchemikalien-Ver bindungen, insbesondere PUFAs, speichern; zur Isolation der ge wünschten Verbindung werden die Zellen geerntet. Die Verbindung (Öle, Lipide, Triacylglyceride, Fettsäuren) oder die Desaturase können dann aus dem Medium oder der Wirtszelle, welche bei Pflan zen Zellen sind, die Feinchemikalien enthalten oder speichern, am stärksten bevorzugt Zellen von Speichergeweben, wie Samenhüllen, Knollen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe isoliert werden.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine genetisch veränderte transgene Pflanze, bevorzugt ein Ölfruchtpflanze, wie vorstehend erwähnt, besonders bevorzugt eine Raps- oder Lein pflanze, in die eine erfindungsgemäße Expressionskassette, die vorteilhaft weitere Gene wie Desaturasegen enthält, eingebracht worden ist. Bei einer Ausführungsform ist das Genom von Raps oder Lein durch Einbringen einer erfindungsgemäßen Expressionskassette vorteilhaft enthaltend weitere Nukleinsäuremoleküle, die beis pielsweise eine Wildtyp- oder mutierte Desaturasesequenz kodiert, als Transgen verändert worden. Bei einer bevorzugten Ausführungs form wird Raps oder Lein auch zur Produktion einer gewünschten Verbindung, wie Lipiden und Fettsäuren, wobei PUFAs besonders be vorzugt sind, verwendet.

Bei noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das Moos Physcomitrella patens zur Demonstration der Funktion einer Expressionskassette mit einem Desaturasesegen unter Verwendung homologer Rekombination auf der Basis der in dieser Erfindung be schriebenen Nukleinsäuren verwendet werden.

Das Desaturasepolypeptid oder ein biologisch aktiver Teil davon kann vorteilhaft unter Kontrolle der erfindungsgemäßen Expres sionskassette funktionsfähig mit einem weiteren Polypeptid, das eine andere enzymatische Aktivität als die Desaturasen hat bei spielsweise eine Elongase-, Acyltransferase- oder sonstige Akti vität verbunden werden, so dass ein Fusionsprotein gebildet wird. Vorteilhaft hat dieses Fusionsprotein eine Aktivität, die sich von derjenigen der Desaturase allein unterscheidet. Bei anderen bevorzugten Ausführungsform nimmt dieses Fusionsprotein am Stoffwechsel von Verbindungen, die zur Synthese von Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen in Mikroorganismen oder Pflanzen notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teil. Besonders vorteilhaft moduliert das Ein bringen dieses Fusionsproteins in einer Wirtszelle die Produktion einer gewünschten Verbindung innerhalb einer und durch die Zelle. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthalten diese Fusion sproteine auch Δ-4-, Δ-5- oder -Δ-6-, Δ-8-, Δ-15-, Δ-17- oder Δ-19-Desaturaseaktivitäten allein oder in Kombination. Ins besondere solche Genkombinationen sind bevorzugte Ausführungs formen, die aus SEQ ID NO: 7 oder 9 gewählt sind, bzw. Teilen davon, Derivate oder ihren Homologen. Insbesondere solche Kombinationen sind bevorzugt, die die vollständige Protein aktivität wie in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 enthalten und in Multiexpressionskassetten definiert durch SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16 und 17 eingefügt zur Transformation von Pflanzen und Expression in Pflanzen geeignet sind.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

Ein erfindungsgemäßer Gegenstand sind auch die Expressionskasset ten in Verbindung mit isolierten Nukleinsäuresequenz(en), die für ein Polypeptid mit Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dar gestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erhalten werden,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäurese quenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Amino säureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.

Weiterhin betrifft die Erfindung eine Aminosäuresequenz, die durch die oben genannte(n) Nukleinsäuresequenz(en) codiert werden (für die Erfindung soll der Singular den Plural und umgekehrt umfassen). Speziell betrifft die Erfindung Aminosäuresequenzen, die durch die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellte Sequenz codiert werden.

Die vorliegende Erfindung stellt Expressionskassetten bereit, die für die Expression von Nukleinsäuren und Proteinmoleküle mit De saturaseaktivität geeignet sind, und von Nukleinsäuren kodierend für Proteine, die am Stoffwechsel von Lipiden und Fettsäuren, PUFA-Cofaktoren und Enzymen in dem Moos Physcomitrella patens oder am Transport lipophiler Verbindungen über Membranen beteiligt sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich zur Modulation der Produktion von Feinchemikalien aus Organismen wie Pflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Ger ste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Linum-Arten wie Öl- oder Fa serlein, Brassica-Arten, wie Raps, Canola und Rübsen, Pfeffer, Sonnenblume, Borretsch, Nachtkerze und Tagetes, Solanacaen-Pflan zen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Maniok, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Sa lix-Arten, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss) und ausdauernden Gräsern und Futterfeldfrüchten, entweder direkt (z. B. wenn die Überex pression oder Optimierung eines Fettsäurebiosynthese-Proteins ei nen direkten Einfluss auf die Ausbeute, Produktion und/oder Effi zienz der Produktion der Fettsäure aus modifizierten Organismen hat) verwenden oder können eine indirekte Auswirkung haben, die dennoch zu einer Steigerung der Ausbeute, Produktion und/oder Ef fizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung oder einer Abnahme unerwünschter Verbindungen führt (z. B. wenn die Modula tion des Stoffwechsels von Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen zu Veränderungen der Ausbeute, Produktion und/oder Effi zienz der Produktion oder der Zusammensetzung der gewünschten Verbindungen innerhalb der Zellen führt, was wiederum die Produk tion einer oder mehrerer Feinchemikalien beeinflussen kann). As pekte der Erfindung sind nachstehend weiter erläutert.

I. Feinchemikalien und PUFAs

Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und umfasst Moleküle, die durch einen Organismus produziert worden sind und Anwendungen in verschiedenen Industrien finden, wie, aber nicht beschränkt auf, die pharmazeutische, Landwirtschafts-, Nahrungsmittel- und Kosmetik-Industrie. Diese Verbindungen um fassen Lipide, Fettsäuren, Cofaktoren und Enzyme usw. (wie z. B. beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related com pounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsgb., VCH: Weinheim und darin enthaltenen Literaturstellen), Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (z. B. Arachidonsäure), Vitamine und Cofaktoren (wie beschrieben in Ullmann's Ency clopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, Vitamins, S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und darin enthaltenen Literaturstellen; und Ong, A. S., Niki, E., & Packer, L. (1995) Nutrition, Lipids, Health and Disease Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086, und darin angegebenen Literaturstellen beschriebenen Chemikalien. Der Stoffwechsel und die Verwendungen bestimmter Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert.

Die Kombination verschiedener Vorläufermoleküle und Biosynthese enzyme führt zur Herstellung verschiedener Fettsäuremoleküle, was eine entscheidende Auswirkung auf die Zusammensetzung der Membran hat. Es kann angenommen werden, dass PUFAs nicht nur einfach in Triacylglycerin, sondern auch in Membranlipide eingebaut werden.

Vorläufer für die PUFA-Biosynthese sind beispielsweise Ölsäure, Linol- und Linolensäure. Diese C₁₈-Kohlenstoff-Fettsäuren müssen auf C₂₀ und C₂₂ verlängert werden, damit Fettsäuren vom Eicosa- und Docosa-Kettentyp erhalten werden. Mithilfe verschiedener Desaturasen, wie Enzymen, welche Δ-12-Desaturase, Δ-15-Desaturase, Δ-6-Desaturase-, Δ-5- und Δ-4-Desaturase aktivität aufweisen, können Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure sowie verschiedene andere langkettige PUFAs erhalten, extrahiert und für verschiedene Zwecke bei Nahrungs mittel-, Futter-, Kosmetik- oder pharmazeutischen Anwendungen verwendet werden.

Zur Herstellung langkettiger PUFAs müssen, wie oben erwähnt, die mehrfach ungesättigten C₁₈- bzw C₂₀-Fettsäuren mehrfach desaturiert werden. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kodieren erste funktionell aktive Desaturasen aus Phyeodactylum tricornutum, einem Mikroorganismus, der PUFAs in der Triacyl glycerolfraktion enthält. Mit den erfindungsgemäßen Desaturasen können Doppelbindungen in die Δ-5-, Δ-6- oder Δ-12-Position ein geführt werden. Die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Desaturasen führt vorzugsweise zu C₁₈- + C₂₀-Fettsäuren mit mindestens zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vor zugsweise zu C₂₀-Fettsäuren mit vorteilhaft drei, vier oder fünf Doppelbindungen im Fettsäuremolekül. Die Desaturierung kann vor oder nach Elongation der entsprechenden Fettsäure erfolgen. Daher führen die Produkte der Desaturaseaktivitäten und der mög lichen weiteren Desaturierung und Elongation zu bevorzugten PUFAs mit höherem Desaturierungsgrad, einschließlich einer weiteren Elongation von C₂₀ zu C₂₂-Fettsäuren, zu Fettsäuren wie Linolsäure, Docosadiensäure, dihomo-γ-linolensäure,Arachidonsäure, ω6-Eicosa triendihomo-γ-linolensäure, Eicosapentaensäure, ω3-Eicosatrien säure, ω3-Eicosatetraensäure, Docosapentaensäure oder Docosa hexaensäure. Substrate dieser erfindungsgemäßen Enzymaktivität sind zum Beispiel Taxolsäure, 6,9-Octadecadiensäure, Ölsäure, Linolsäure, γ-Linolensäure, Pinolensäure, α-Linolensäure, Ara chidonsäure, Eicosapentaensäure oder Stearidonsäure. Bevorzugte Substrate sind Linolsäure, γ-Linolensäure und/oder α-Linolensäure, dihomo-γ-linolensäure bzw. Arachidonsäure, Eicosatetraensäure oder Eicosapentaensäure. Die C₁₈- oder C₂₀-Fettsäuren mit min destens zwei Doppelbindungen in der Fettsäure können durch die erfindungsgemäße Enzymaktivität in Form der freien Fettsäure oder in Form der Ester, wie Phospholipide, Glykolipide, Sphingolipide, Phosphoglyceride, Monoacylglyceride, Diacylglyceride, Triacylgly ceride oder sonstige Ester, verlängert werden. Ferner müssen Fettsäuren anschließend an verschiedene Modifikationsorte transportiert und in das Triacylglycerin- Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsäuren auf die polaren Kopfgruppen, beispielsweise durch Glycerin-Fettsäure- Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5): 161-166).

Veröffentlichungen über die Pflanzen-Fettsäurebiosynthese, Desaturierung, den Lipidstoffwechsel und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation, Fettsäure modifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und -Assemblierung einschließlich der Literaturstellen darin siehe in den folgenden Artikeln: Kinney, 1997, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19: 149-166; Ohlrogge und Browse, 1995, Plant Cell 7: 957-970; Shanklin und Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 611-641; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18: 111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31: 397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256 : 181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34: 267-342; Stymne et al., 1993, in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb.: Murata und Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1): 1-16.

Vitamine, Cofaktoren und Nutraceutical wie PUFAs, umfassen eine Gruppe von Molekülen, die höhere Tiere nicht mehr synthetisieren können und somit aufnehmen müssen oder die höhere Tiere nicht mehr ausreichend selbst herstellen können und somit zusätzlich aufnehmen müssen, obwohl sie leicht von anderen Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden. Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die sie produzieren können, wie in Bakterien, ist im großen und ganzen charakterisiert worden (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A. S., Niki, E., & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research Asia, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S).

Die oben erwähnten Moleküle sind entweder selbst biologisch aktive Moleküle oder Vorstufen biologisch aktiver Substanzen, die entweder als Elektronenüberträger oder Zwischenprodukte bei einer Vielzahl von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antioxidantien und Katalysatoren oder andere Ver arbeitungshilfsstoffe. (Einen Überblick über Struktur, Aktivität und industrielle Anwendungen dieser Verbindungen siehe z. B. in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Mehrfach ungesättigte Fettsäuren haben verschiedene Funktionen und gesundheitsfördernde Wirkungen, beispielsweise bei koronarer Herzerkrankung, Ent zündungsmechanismen, Kinderernährung usw. Veröffentlichungen und Literaturstellen, einschließlich darin zitierter Literatur stellen, siehe in: Simopoulos, 1999, Am. J. Clin. Nutr. 70 (3. Suppl.): 560-569, Takahata et al., Biosc. Biotechnol. Biochem. 1998, 62(11): 2079-2085, Willich und Winther, 1995, Deutsche Medizinische Wochenschrift 120(7): 229ff.

II. Elemente und Verfahren der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht unter anderem auf der Entdeckung neuer Moleküle, die hier als Desaturasenukleinsäure- und -proteinmoleküle bezeichnet werden, welche eine Wirkung auf die Produktion von Zellmembranen und Lipiden Phaeodactylum tri cornutum ausüben und beispielsweise die Bewegung von Molekülen über diese Membranen beeinflussen. Bei einer Ausführungsform nehmen die Desaturasemoleküle am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Organismen, wie Mikroorganismen und Pflanzen, notwendigen Verbindungen teil oder beeinflussen indirekt den Transport von Molekülen über diese Membranen. Bei einer bevor zugten Ausführungsform hat die Aktivität der erfindungsgemäßen Desaturasemoleküle zur Regulation der Produktion von Membran komponenten und des Membrantransports eine Auswirkung auf die Produktion der gewünschten Feinchemikalie durch diesen Organismus. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Aktivität der erfindungsgemäßen Desaturasemoleküle moduliert, so dass die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der Stoffwechselwege von Mikroorganismen oder Pflanzen, welche die erfindungsgemäßen Desaturasen regulieren, moduliert sind und die Effizienz des Transport von Verbindungen durch die Membranen verändert ist, was entweder direkt oder indirekt die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch Mikroorganismen und Pflanzen moduliert.

Der Begriff "Desaturase" oder "Desaturasepolypeptid" umfasst Proteine, die an der Desaturierung von Fettsäuren teilnehmen. Beispiele für Desaturasen sind in der SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11 oder ihren Homologen, Derivaten oder Analoga offenbart. Die Begriffe Desaturase oder Desaturasenukleinsäuresequenz(en) umfassen Nukleinsäuresequenzen, die eine Desaturase kodieren und bei denen ein Teil eine kodierende Region und ebenfalls entsprechende 5'- und 3'-untranslatierte Sequenzbereiche sein können. Beispiele für Desaturase-Gene sind die in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 dargestellten. Die Begriffe Produktion oder Produktivität sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten die Konzentration des Fermentationsproduktes (zum Beispiel der gewünschten Feinchemikalie), das in einer bestimmten Zeitspanne und einem bestimmten Fermentationsvolumen gebildet wird (z. B. kg Produkt pro Stunde pro Liter). Der Begriff Effizienz der Produktion umfasst die Zeit, die zur Erzielung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist (z. B. wie lange die Zelle zur Auf richtung einer bestimmten Durchsatzrate einer Feinchemikalie benötigt). Der Begriff Ausbeute oder Produkt/Kohlenstoff- Ausbeute ist im Fachgebiet bekannt und umfasst die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt (d. h. die Feinchemikalie). Dies wird gewöhnlich beispielsweise ausgedrückt als kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Erhöhen der Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen festgelegten Zeitraum erhöht. Die Begriffe Biosynthese oder Biosyntheseweg sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Ver bindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen, beispiels weise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess. Die Begriffe Abbau oder Abbauweg sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe Moleküle) beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess. Der Begriff Stoffwechsel ist im Fachgebiet bekannt und umfasst die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die in einem Organismus stattfinden. Der Stoffwechsel einer bestimmten Verbindung (z. B. der Stoffwechsel einer Fettsäure) umfasst dann die Gesamtheit der Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege dieser Verbindung in der Zelle, die diese Verbindung betreffen.

Bei einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, die für Desaturase-Moleküle codieren, die Produktion eines gewünschten Moleküls, wie einer Feinchemikalie, in einem Mikroorganismus oder in Pflanzen modulieren. Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung einer erfindungsgemäßen Sequenz die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie aus einem Mikro organismus- oder Pflanzenstamm, die dieses veränderte Protein enthalten, direkt beeinflussen kann. Die Anzahl oder Aktivität von Desaturasen, die am Transport von Feinchemikalienmolekülen innerhalb oder aus der Zelle beteiligt sind, kann erhöht werden, so dass größere Mengen dieser Verbindungen über Membranen trans portiert werden, aus denen sie leichter gewonnen und ineinander umgewandelt werden. Ferner sind Fettsäuren, Triacylglycerine und/oder Lipide selbst wünschenswerte Feinchemikalien; durch Optimierung des Aktivität oder Steigern der Anzahl einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Desaturasen, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Stören der Aktivi tät einer oder mehrerer Desaturasen, die am Abbau dieser Ver bindungen beteiligt sind, kann es möglich sein, die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmolekülen aus Organismen, wie Mikroorganismen oder Pflanzen, zu erhöhen.

Die Mutagenese der genannten Nukleinsäuresequenzen kann Desatura sen mit veränderten Aktivitäten hervorbringen, welche die Produk tion einer oder mehrerer gewünschter Feinchemikalien aus Mikroor ganismen oder Pflanzen indirekt beeinflussen. Beispielsweise kön nen Desaturasen, die am Export von Abfallprodukten beteiligt sind, eine größere Anzahl oder höhere Aktivität aufweisen, so dass die normalen Stoffwechselabfälle der Zelle (deren Menge mög licherweise aufgrund der Überproduktion der gewünschten Feinche mikalie erhöht ist) effizient exportiert werden, bevor sie die Moleküle in der Zelle schädigen können (was die Lebensfähigkeit der Zelle herabsetzen würde) oder die Feinchemikalien-Biosynthe sewege stören können (was die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie senken würde). Die relativ großen intrazellulären Mengen der gewünschten Fein chemikalie selbst können ferner für die Zelle toxisch sein, so dass man durch Steigern der Aktivität oder Anzahl von Trans portern, die diese Verbindungen aus der Zelle exportieren können, die Lebensfähigkeit der Zelle in Kultur steigern kann, was wie derum zu einer größeren Anzahl an Zellen in der Kultur führt, welche die gewünschte Feinchemikalie produzieren. Die Desaturasen können auch so manipuliert werden, dass die entsprechenden Mengen unterschiedlicher Lipid- und Fettsäuremoleküle produziert werden. Dies kann eine erhebliche Auswirkung auf die Lipidzusammensetzung der Zellmembran haben. Da jeder Lipidtyp unterschiedliche physi kalische Eigenschaften aufweist, kann eine Veränderung der Lipid zusammensetzung einer Membran die Membranfluidität signifikant verändern. Änderungen der Membranfluidität können den Transport von Molekülen über die Membran sowie die Integrität der Zelle beeinflussen, was jeweils eine erhebliche Auswirkung auf die Produktion von Feinchemikalien aus Mikroorganismen und Pflanzen in Fermentationskultur im großen Maßstab hat. Pflanzenmembranen verleihen spezifische Eigenschaften, wie Toleranz gegenüber Wärme, Kälte, Salz, Trockenheit sowie Toleranz gegen Pathogene, wie Bakterien und Pilze.

Die genannten isolierten Nukleinsäuresequenzen sind im Genom ei nes Phaeodactylum tricornutum UTEX646-Stammes enthalten, der über die Algensammlung der University of Texas, Austin verfügbar ist.

Die Nukleotidsequenz der Phaeodactylum tricornutum cDNA und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Desaturasen sind in den SEQ ID NO: 1 bis 6 sowie 11 und 12 gezeigt. Es wurden Computera nalysen durchgeführt, die diese Nukleotidsequenzen als Sequenzen klassifizieren und/oder identifizieren, die am Stoffwechsel von Zellmembrankomponenten beteiligte Proteine oder am Transport von Verbindungen über Zellmembranen beteiligte Proteine bzw. der PUFA Biosynthese codieren. EST's mit der Datenbankeingabe-No: PT001070010R und PT001078032R durch die Erfinder stellen die er findungsgemäßen Sequenzen in SEQ ID NO: 1 und 3 dar. Die Sequenz des Fragments aus EST PT001070010R wurde ermittelt und ist wie dargestellt in SEQ ID NO: 5. Analog ist die Sequenz des Klones PT001078032R dargestellt in SEQ ID NO: 1. Den Klonen wurden Gen namen zugewiesen. Abkürzungen bedeuten: Pp = Physcomitrella pa tens, Pt = Phaeodactylum tricornutum. PT001070010R aus SEQ ID NO: 5 codiert für ein neues Gen homolog zu Δ-12-Desaturase und PT001078032R codiert für eine neuartige Δ-5-Desaturase. Pt_des6 kann gemäß Beispiel 5a mittels Polymerase Kettenreaktion unter Zuhilfenahme degenerierter Oligonukleotide isoliert werden. Ein so erhaltenes Fragment kann zum Sichten einer cDNA Bank aus Phaeodactylum tricornutum isoliert werden und die codierende Re gion einer Phaeodactylum tricornutum Δ-6-Desaturase erhalten wer den. Ein so isoliertes Gen wird in Tabelle 1 als Pt_des6 bezeich net und ist in SEQ ID NO: 3 dargestellt. Die korrespondierenden Azninosäuresequenzen werden durch Übersetzung des genetischen Co des der Sequenz ID NO: 1, 3 und 5 erhalten und sind als SEQ ID NO: 2, 4 und 6 definiert (siehe auch Tabelle 1). Auch eine wei tere Nukleinsäuresequenz, die für eine Δ-12-Desaturase codiert, ist Tabelle 1 zu entnehmen. Sie trägt die Klon-Nummer PT001072031R.

Tabelle 1

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Proteine mit einer Amino säuresequenz, die im wesentlichen homolog zu einer Aminosäure sequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 ist. Wie hier verwendet, ist ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen homolog zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz ist, zu min destens etwa 50% homolog zu der ausgewählten Aminosäuresequenz, z. B. der gesamten ausgewählten Aminosäuresequenz. Ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen homolog zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz ist, kann auch zu mindestens etwa 50 bis 60%, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70% und stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80%, 80 bis 90% oder 90 bis 95% und ein stärksten bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz sein.

Die Desaturasen oder der biologisch aktive Teile oder Fragmente davon können am Stoffwechsel von Lipiden zum Aufbau von Zellmem branen oder Speicherlipiden in Organismen teilnehmen und in Kom bination mit weiteren Genen, insbesondere solchen mit Elongaseak tivität zur Elongation von C₁₈- bzw. C_20-22-PUFAs benötigten Aktivi täten beitragen, so dass C₁₈, C₂₀-, C₂₂- oder C₂₄-PUFAs sowie ver wandte PUFAs erhalten werden.

Dabei können die Desaturasen in Kombination mit Elongasen und an deren Desaturasen in erfindungsgemäßen Expressionskassetten klo niert werden und zur Transformation von Pflanzen mithilfe von Agrobakterium eingesetzt werden.

Verschiedene Aspekte der Erfindung sind eingehender in den folgenden Unterabschnitten beschrieben.

A. Isolierte Nukleinsäuremoleküle

Eine Ausführungsform der Erfindung sind isolierte Nukleinsäuren, die von PUFA produzierenden Mikroorganismen stammen und für Poly peptide kodieren, die C₁₈- oder C_20-22-Fettsäuren mit mindestens einer, zwei, drei oder vier Doppelbindungen in der Fettsäure desaturieren.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform sind isolierte Nukleinsäuren, umfassend Nukleotidsequenzen, die für Polypeptide kodieren, die C₁₈- bzw. C₂₀-Fettsäuren mit mindestens ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen in der Fettsäure desaturieren und sind aus der Gruppe, bestehend aus

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dar gestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erhalten werden,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäure sequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Amino säureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.

Die oben genannte erfindungsgemäße Nukleinsäure stammt von Organismen, wie Ciliaten, Pilzen, Algen oder Dinoflagellaten, die PUFAs synthetisieren können, vorzugsweise von Phaeodactylum tricornutum oder nah verwandten Organismen.

Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Expressionskassetten sowie Nukleinsäuremoleküle, die Desaturase-Polypeptide oder bio logisch aktive Teile davon kodieren, sowie Nukleinsäurefragmente von diesen, die zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung einer Desaturase-kodierenden Nukleinsäure (z. B. Desaturase-DNA) ausreichen. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül", wie hier verwendet, soll DNA-Mole küle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA) sowie DNA- oder RNA-Analoga, die mittels Nukleotidanaloga erzeugt werden, umfassen. Dieser Begriff umfasst zudem die am 3'- und am 5'-Ende des kodierenden Genbereichs gelegene untranslatierte Se quenz: mindestens 500, bevorzugt 200, besonders bevorzugt 100 Nu kleotide der Sequenz stromaufwärts des 5'-Endes des kodierenden Bereichs und mindestens 100, bevorzugt 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Endes des kodierenden Genbereichs. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise doppelsträngige DNA. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäu remolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nu kleinsäure vorliegen. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugs weise keine Sequenzen, welche die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicher weise flankieren (z. B. Sequenzen, die sich an den 5'- und 3'-En den der Nukleinsäure befinden). Bei verschiedenen Ausführungsfor men kann das isolierte Desaturase-Nukleinsäuremolekül zum Bei spiel weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen enthalten, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt (z. B. eine Physcomitrella patens-Zelle) flankieren. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA- Molekül, kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellu lären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.

Eine erfindungsgemäße Expressionskassette mit der Struktur SEQ ID NO: 32-Promotor-, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 oder SEQ ID NO: 35 Nukleinsäuremolekül, z. B. ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nu kleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder eines Teils davon, kann unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Auch kann mit Hilfe von Vergleichsalgorithmen beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche auf DNA oder Aminosäureebene identifiziert werden. Beispielsweise kann aus ei ner Phaeodactylum tricornutum cDNA aus einer Phaeodactylum tri cornutum-Bank isoliert werden, indem die vollständige SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 oder ein Teil davon als Hybridisierungssonde sowie Standard-Hybridisierungstechniken (wie z. B. beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Labo ratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine voll ständige Sequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei Oligonu kleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz oder von Teilen davon, insbesondere Regionen um Motive aus Beispiel 5a erstellt werden oder Modifikationen ebensolcher in einzelnen definierten Aminosäuren, verwendet werden (z. B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die vollständige Sequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion unter Ver wendung von Oligonukleotidpriräern isoliert werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 er stellt worden sind). Zum Beispiel lässt sich mRNA aus Zellen iso lieren (z. B. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) und cDNA mittels Reverser Transkriptase (z. B. Moloney-MLV-Reverse-Trans kriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Re verse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL) herstellen. Synthetische Oligonukleotidprimer zur Amplifizierung mittels Polymerasekettenreaktion lassen sich auf der Basis einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 sowie der in Fig. 5a gezeigten Sequenzen oder mithilfe der in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA oder alternativ von genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß Standard-PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und mittels DNA-Sequenz analyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer Desaturase-Nukleotidsequenz entsprechen, können durch Standard- Syntheseverfahren, beispielsweise mit einem automatischen DNA- Synthesegerät, hergestellt werden.

Die in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigte cDNA umfasst Sequenzen, die Desaturasen kodieren, (d. h. den "kodierenden Bereich") sowie 5'-untranslatierte Sequenzen und 3'-untranslatierte Sequenzen. Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül nur den kodierenden Bereich einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 um fassen oder kann ganze genomische Fragmente, die aus genomischer DNA isoliert sind, enthalten.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül ein Nuklein säuremolekül, das ein Komplement einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten Nukleotidsequenzen oder eines Teils davon ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das zu einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten Nukleotidsequenzen komplementär ist, ist dann ausreichend komplementär, wenn es mit einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 angegebenen Sequenzen hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex entsteht.

Homologe der neuen Desaturase-Nukleinsäuresequenzen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 bedeutet beispielsweise allelische Varianten mit mindestens etwa 50 bis 60%, vorzugs weise mindestens etwa 60 bis 70%, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80%, 80 bis 90% oder 90 bis 95% und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Homologie zu einer in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten Nukleotidsequenzen oder ihren Homologen, Derivaten oder Analoga oder Teilen davon. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die an eine der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten Nukleotidsequenzen oder einen Teil davon hybridisiert, z. B. unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Allelische Varianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus/in der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 dargestellten Sequenz erhalten lassen, wobei aber die Absicht ist, dass die Enzym aktivität der davon herrührenden synthetisierten Proteine für die Insertion eines oder mehrerer Gene vorteilhafterweise bei behalten wird. Proteine, die noch die enzymatische Aktivität der Desaturase besitzen, das heißt deren Aktivität im wesentlichen nicht reduziert ist, bedeutet Proteine mit mindestens 10%, vor zugsweise 20%, besonders bevorzugt 30%, ganz besonders bevor zugt 40% der ursprünglichen Enzymaktivität, verglichen mit dem durch SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 kodierten Protein.

Homologen der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 bedeuten beispiels weise auch bakterielle Pilz- und Pflanzenhomologen, verkürzte Sequenzen, einzelsträngige DNA oder RNA der kodierenden und nicht-kodierenden DNA-Sequenz.

Homologen der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 bedeutet auch Derivate, wie beispielsweise Promotorvarianten. Die Promotoren stromaufwärts der angegebenen Nukleotidsequenzen können durch einen oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) modifiziert werden, ohne dass jedoch die Funktionalität oder Aktivität der Promotoren gestört wird. Es ist weiterhin möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht ist oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar aus heterologen Organismen, ersetzt werden.

Überdies kann das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül nur einen Teil des kodierenden Bereichs einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 umfassen, zum Beispiel ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, welches einen biologisch aktiven Abschnitt einer Desaturase kodiert. Die aus der Klonierung des Desaturase-Gens von Phaeodactylum tricornutum ermittelten Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identi fizierung und/oder Klonierung von Desaturase-Homologen in anderen Zelltypen und Organismen sowie Desaturase-Homologen aus anderen Mikroalgen oder verwandten Arten gestaltet sind. Die Sonde/der Primer umfasst gewöhnlich im wesentlichen gereinigtes Oligo nukleotid. Das Oligonukleotid umfasst gewöhnlich einen Nukleotid sequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise etwa 16, stärker bevorzugt etwa 25, 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 angegebenen Sequenzen, eines Antisense-Stranges einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 an gegebenen Sequenzen oder seiner Homologen, Derivate oder Analoga oder natürlich vorkommender Mutanten davon hybridisiert. Primer auf der Basis einer Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 können in PCR-Reaktionen zur Klonierung von Desaturase- Homologen verwendet werden. Sonden auf der Basis der Desaturase- Nukleotidsequenzen können zum Nachweis von Transkripten oder genomischen Sequenzen, die das gleiche oder homologe Proteine kodieren, verwendet werden. Bei bevorzugten Austührungsformen umfasst die Sonde zudem eine daran gebundene Markierungsgruppe, z. B. ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder einen Enzym-Cofaktor. Diese Sonden können als Teil eines Test-Rits für genomische Marker zur Identifizierung von Zellen, die eine Desaturase misexprimieren, beispielsweise durch Messen einer Menge einer Desaturase-kodierenden Nukleinsäure in einer Zellenprobe, z. B. Messen der Desaturase-mRNA-Spiegel, oder zur Bestimmung, ob ein genomisches Desaturase-Gen mutiert oder deletiert ist, verwendet werden.

Bei einer Ausführungsform kodiert das erfindungsgemäße Nuklein säuremolekül ein Protein oder einen Teil davon, das/der eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 ist, dass das Protein oder der Teil davon die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Mikroorganismen oder Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilzunehmen, beibehält. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "ausreichend homolog" Proteine oder Teile davon, deren Aminosäuresequenzen eine minimale Anzahl identischer oder äquivalenter Aminosäurereste (z. B. einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette, wie ein Aminosäurerest in einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 2) zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 aufweisen, so dass das Protein oder der Teil davon am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Mikro organismen oder Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Trans port von Molekülen über diese Membranen teilnehmen kann. Protein bestandteile dieser Stoffwechselwege für Membxankomponenten oder Membrantransportsysteme können, wie hier beschrieben, eine Rolle bei der Produktion und Sekretion einer oder mehrerer Feinchemikalien spielen. Beispiele für diese Aktivitäten sind hier ebenfalls beschrieben. Somit trägt die "Funktion einer Desaturase" entweder direkt oder indirekt zur Ausbeute, Pro duktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien bei. Beispiele für Desaturase-Substratspezifi täten der katalytischen Aktivität sind in Tabelle 5 und 6 angegeben.

Bei einer weiteren Ausführungsform kodieren Derivate des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls Proteine mit mindestens etwa 50 bis 60%, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70% und stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80%, 80 bis 90%, 90 bis 95% und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Homologie zu einer vollständigen Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2. Die Homologie der Aminosäure sequenz kann über den gesamten Sequenzbereich mit dem Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5, 1989: 151-153) oder BESTFIT oder GAP bestimmt (Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.)

Teile von Proteinen, die von den erfindungsgemäßen Desaturase- Nukleinsäuremolekülen kodiert werden, sind vorzugsweise bio logisch aktive Teile einer der Desaturasen. Wie hier verwendet, soll der Begriff "biologisch aktiver Teil einer Desaturase" einen Abschnitt, z. B. eine Domäne/ein Motiv, einer Desaturase umfassen, der am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Mikroorganismen oder Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilnehmen kann oder eine in Tabelle 5 und 6 angegebene Aktivität aufweist. Zur Bestimmung, ob eine Desaturase oder sin biologisch aktiver Teil davon am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Mikro organismen oder Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Trans port von Molekülen über diese Membranen teilnehmen kann, kann ein Test der enzymatischen Aktivität durchgeführt werden. Diese Testverfahren, wie eingehend in Beispiel 8 des Beispielteils beschrieben, sind dem Fachmann geläufig.

Zusätzliche Nukleinsäurefragmente, die biologisch aktive Abschnitte einer Desaturase kodieren, lassen sich durch Isolierung eines Teils einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11, Exprimieren des kodierten Abschnitt der Desaturase oder des Peptids (z. B. durch rekonibinante Expression in vitro) und Bestimmen der Aktivität des kodierten Teils der Desaturase oder des Peptids herstellen.

Die Erfindung umfasst zudem Nukleinsäuremoleküle, die sich von einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten Nukleotid sequenzen (und Teilen davon) aufgrund des d 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002010102338 00004 99880egenerierten genetischen Codes unterscheiden und somit die gleiche Desaturase kodieren wie diejenige, die von den in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten Nukleotidsequenzen kodiert wird. Bei einer anderen Aus führungsform hat ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäure molekül eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein mit einer in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert. Bei einer weiteren Ausführungsform kodiert das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein Vollängen-Desaturase-Protein, das zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 (die von einem in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten offenen Leseraster kodiert wird) im wesentlichen homolog ist und durch gängige Methoden identifizierbar und isolierbar ist.

Zusätzlich zu den in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten Desaturase-Nukleotidsequenzen erkennt der Fachmann, dass DNA- Sequenzpolymorphismen, die zu Änderungen in den Aminosäure sequenzen der Desaturasen führen, innerhalb einer Population (z. B. der Phaeodactylum tricornutum-Population) existieren können. Diese genetischen Polymorphismen im Desaturase-Gen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund von natürlicher Variation existieren. Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe "Gen" und "rekombinantes Gen" Nukleinsäuremoleküle mit einem offenen Leserahmen, der eine Desaturase, vorzugsweise eine Phaeodactylum tricornutum-Desaturase, kodiert. Diese natür lichen Varianten bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5% in der Nukleotidsequenz des Desaturase-Gens. Sämtliche und alle dieser Nukleotidvariationen und daraus resultierende Aminosäurepolymorphismen in der Desaturase, die das Ergebnis natürlicher Variation sind und die funktionelle Aktivität von Desaturasen nicht verändern, sollen im Umfang der Erfindung enthalten sein.

Nukleinsäuremoleküle, die den natürlichen Varianten entsprechen, und nicht-Phaeodactylum tricornutum-Homologen, -Derivate und -Analoga der Phaeodactylum tricornutum cDNA können auf der Grundlage ihrer Homologie zu der hier offenbarten Phaeodactylum tricornutum-Desaturase-Nukleinsäure unter Verwendung der Phaeo dactylum tricornutum cDNA oder eines Teils davon als Hybridi sierungssonde gemäß Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. Bei einer anderen Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridi siert unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 umfasst. Bei anderen Ausführungsformen ist die Nukleinsäure mindestens 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide lang. Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen", wie hier verwendet, soll Hybridi sierungs- und Waschbedingungen beschreiben, unter denen Nukleo tidsequenzen, die mindestens 60% homolog zueinander sind, ge wöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65%, stärker bevorzugt mindestens etwa 70% und noch stärker bevor zugt mindestens etwa 75% oder stärker zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6., finden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridi sierungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (sodium chloride/sodiumcitrate = SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C. Dem Fachmann ist bekannt, dass diese Hybridisierungsbedingungen sich je nach dem Typ der Nukleinsäure und, wenn beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers unterscheiden. Die Temperatur unterscheidet sich beispielsweise unter "Standard-Hybridisierungsbedingungen" je nach dem Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Falls organisches Lösungsmittel im oben genannten Puffer vorliegt, zum Beispiel 50% Formamid, ist die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride zum Beispiel 0,1 × SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA : RNA- Hybride zum Beispiel 0,1 × SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die vorstehend genannten Hybridisierungs temperaturen sind beispielsweise für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen anhand von Lehr büchern, wie dem vorstehend erwähnten oder aus den folgenden Lehrbüchern Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames und Higgins (Hrsgb.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford, bestimmt werden können.

Vorzugsweise entspricht ein erfindungsgemäßes isoliertes Nuklein säuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 hybridisiert, einem natürlich vor kommenden Nukleinsäuremolekül. Wie hier verwendet, betrifft ein "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA- oder DNA- Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (z. B. ein natürliches Protein kodiert). Bei einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure eine natürlich vorkommende Phyaeo dactylum tricornutum-Desaturase.

Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der Desaturase sequenz, die in der Population existieren können, erkennt der Fachmann ferner, dass auch Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 eingebracht werden können, was zu Änderungen der Aminosäuresequenz der kodierten Desaturase führt, ohne dass die Funktionsfähigkeit des Desaturaseproteins beeinträchtigt wird. Beispielsweise lassen sich Nukleotidsusbtitutionen, die an "nicht-essentiellen" Aminosäureresten zu Aminosäuresubstitutionen führen, in einer Sequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 herstellen. Ein "nicht-essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der sich in einer Wildtyp-Desaturasequenz einer der Desaturasen (SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12) verändern lässt, ohne dass die Aktivität der Desaturase verändert, das heißt wesentlich reduziert wird, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für die Desaturaseaktivität erforderlich ist. Andere Aminosäurereste (z. B. diejenigen, die in der Domäne mit Desaturaseaktivität nichtkonserviert oder lediglich semikonserviert sind) können jedoch für die Aktivität nicht essentiell sein und lassen sich somit verändern, ohne dass die Desaturaseaktivität verändert wird.

Folglich betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung Nuklein säuremoleküle, die Desaturasen kodieren, die veränderte Anno säurereste enthalten, die für die Desaturaseaktivität nicht essentiell sind. Diese Desaturasen unterscheiden sich in der Aninosäuresequenz von einer Sequenz in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 und behalten dennoch zumindest eine der hier beschriebenen Desaturaseaktivitäten. Das isolierte Nukleinsäuremolekül umfasst bei einer Ausführungsform eine Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 50% Homologie zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 umfasst und am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zell membranen in Phaeodactylum tricornutum notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilnehmen kann. Das von dem Nukleinsäuremolekül kodierte Protein ist vorzugsweise mindestens etwa 50 bis 60% homolog zu einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12, stärker bevorzugt min destens etwa 60 bis 70% homolog zu einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80%, 80 bis 90%, 90 bis 95% homolog zu einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98% oder 99% homolog zu einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12.

Zur Bestimuung der prozentualen Homologie von zwei Aminosäure sequenzen (z. B. einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 und einer mutierten Form davon) oder von zwei Nukleinsäuren werden die Sequenzen zum Zweck des optimalen Vergleichs unter einander geschrieben (z. B. können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingefügt werden, um ein opti males Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nuklein säure zu erzeugen). Dis Aminosäurereste oder Nukleotide an den entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz (z. B. einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12) durch den gleichen Aminosäurerest oder das gleiche Nukleotid wie die ent sprechende Stelle in der anderen Sequenz (z. B. einer mutierten Form der aus SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 ausgewählten Sequenz) belegt wird, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d. h. Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Homologie", wie hier ver wendet, entspricht Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Identität"). Die prozentuale Homologie zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, die den Sequenzen gemeinsam sind (d. h. % Homologie = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen × 100). Die Begriffe Homologie und Tdentität sind damit als Synonym anzusehen.

Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Desaturase kodiert, die zu einer Proteinsequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 homo log ist, kann durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotid substitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotid sequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 erzeugt werden, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingebracht werden. Mutationen können in eine der Sequenzen der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 durch Standardtechniken, wie stellenspezifische Muta genese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Amino säureresten hergestellt. Bei einer "konservativen Aminosäure substitution" wird der Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Ein vorhergesagter nichtessentieller Aminosäurerest in einer Desaturase wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. Alternativ können bei einer anderen Ausführungsform die Mutationen zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der Desaturase-kodierenden Sequenz ein gebracht werden, z. B. durch Sättigungsmutagenese, und die resul tierenden Mutanten können nach der hier beschriebenen Desaturase- Aktivität durchmustert werden, um Mutanten zu identifizieren, die Desaturaseaktivität beibehalten. Nach der Mutagenese einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann z. B. unter Verwendung der hier beschriebenen Tests (siehe Beispielteil) bestimmt werden.

Zusätzlich zu den Nukleinsäuremolekülen, welche die vorstehend beschriebenen Desaturasen kodieren, betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle, die "Antisense" zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen sind. Eine "Anti sense"-Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, die zu einer "Sense"-Nukleinsäure, welche ein Protein kodiert, komplementär ist, z. B. komplementär zum kodierenden Strang eines doppel strängigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Sequenz.

Eine Antisense-Nukleinsäure kann folglich über Wasserstoff brückenbindungen an eine Sense-Nukleinsäure binden. Die Anti sense-Nukleinsäure kann zu einem gesamten Desaturase-kodierenden Strang oder nur zu einem Teil davon komplementär sein. Bei einer Ausführungsform ist ein Antisense-Nukleinsäuremolekül "Antisense" zu einem "kodierenden Bereich" des kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, die eine Desaturase kodiert. Der Begriff "kodierender Bereich" betrifft den Bereich der Nukleotidsequenz, der Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden (z. B. den gesamten kodierenden Bereich, der mit dem Stopcodon beginnt und endet, d. h. dem letzten Codon vor dem Stopcodon). Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nuklein säuremolekül "Antisense" zu einem "nicht-kodierenden Bereich" des kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, die Desaturase kodiert. Der Begriff "nicht-kodierender Bereich" betrifft 5'- und 3'-Sequenzen, die den kodierenden Bereich flankieren und nicht in Aminosäuren translatiert werden (d. h. die man auch als 5'- und 3-untranslatierte Bereiche bezeichnet).

Unter Voraussetzung der hier offenbarten Desaturase-kodierenden Sequenzen des kodierenden Stranges (z. B. die in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 dargestellten Sequenzen) können erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuren gemäß den Regeln der Watson-Crick-Basen paarung gestaltet werden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zum gesamten kodierenden Bereich von Desaturase-mRNA sein, ist aber stärker bevorzugt ein Oligonukleotid, das nur zu einem Teil des kodierenden oder nicht-kodierenden Bereichs von Desaturase-mRNA "Antisense" ist. Das Antisense-Oligonukleotid kann z. B. zu dem Bereich, der die Translationsstartstelle von Desaturase-mRNA umgibt, komplementär sein. Ein Antisense-Oligo nukleotid kann z. B. etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 und mehr Nukleotide lang sein. Eine erfindungsgemäße Anti sense-Nukleinsäure kann unter Verwendung chemischer Synthese und enzymatischer Ligationsreaktionen mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäure (z. B. ein Antisense-Oligonukleotid) kann z. B. chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedent lich modifizierte Nukleotide verwendet werden, die so gestaltet sind, dass sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen oder die physikalische Stabilität des zwischen der Antisense- und der Sense-Nukleinsäure gebildeten Duplexes erhöhen, beispiels weise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleo tide, die zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, sind u. a. 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chlor uracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2- thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methyl guanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl- 2-thiouracil, Beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyl uracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentyladenin, Uracil- 5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Desaturaseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5- oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiburacil, 3-(3-Amino-3-N-2- carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Die Anti sense-Nukleinsäure kann alternativ biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in den eine Nuklein säure in Antisense-Richtung subkloniert worden ist (d. h. RNA, die von der eingebrachten Nukleinsäure transkribiert wird, ist zu einer Zielnukleinsäure von Interesse in Antisense-Richtung orientiert, was im nachstehenden Unterabschnitt weiter beschrieben ist).

Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden üblicherweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie mit der zellulären mRNA und/oder der genomischen DNA, die eine Desaturase kodiert, hybridisieren oder daran binden, um dadurch die Expression des Proteins, z. B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation, zu hemmen. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplexes oder z. B. im Fall eines Antisense- Nukleinsäuremoleküls, das DNA-Duplices bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix erfolgen. Das Antisense-Molekül kann so modifiziert sein, dass es spezi fisch an einen Rezeptor oder an ein auf einer ausgewählten Zell oberfläche exprimiertes Antigen bindet, z. B. durch Binden des Antisense-Nukleinsäuremoleküls an ein Peptid oder einen Anti körper, das/der an einen Zelloberflächenrezeptor oder ein Antigen bindet. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch unter Ver wendung der hier beschriebenen Vektoren den Zellen zugeführt werden. Zur Erzielung ausreichender intrazellulärer Konzentra tionen der Antisense-Moleküle sind Vektorkonstrukte, in denen sich das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken prokaryotischen, viralen oder eukaryotischen, einschließ lich pflanzlichen, Promotors befindet, bevorzugt.

Bei einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Anti sense-Nukleinsäuremolekül ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, wobei die Stränge im Gegensatz zu gewöhnlichen β-Einheiten parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6625-6641). Das Antisense- Nukleinsäuremolekül kann zudem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215: 327-330) umfassen.

Bei einer weiteren Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, spalten können, zu der sie einen komplementären Bereich haben. Somit können Ribozyme (z. B. Hammer head-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334: 585-591) zur katalytischen Spaltung von Desaturase-mRNA- Transkripten verwendet werden, um dadurch die Translation von Desaturase-mRNA zu hemmen. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Desaturase-kodierende Nukleinsäure kann auf der Basis der Nukleo tidsequenz einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 offenbarten Desaturase-cDNA (d. h. oder auf der Basis einer gemäß den in dieser Erfindung gelehrten Verfahren zu isolierenden heterologen Sequenz) gestaltet werden. Beispielsweise kann ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA konstruiert werden, wobei die Nukleotid sequenz der aktiven Stelle komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer Desaturase-kodierenden mRNA gespalten werden soll. Siehe z. B. Cech et al., US-Patent Nr. 4,987,071 und Cech et al., US-Patent Nr. 5,116,742. Alternativ kann Desaturase-mRNA zur Selektion einer katalytischen RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen verwendet werden. Siehe z. B. Bartel, D., und Szostak, J. W. (1993) Science 261: 1411-1418.

Alternativ lässt sich die Desaturase-Gen-Expression hemmen, indem Nukleotidsequenzen, die komplementär zum regulatorischen Bereich einer Desaturase-Nukleotidsequenz (z. B. einem Desaturase- Promotor und/oder -Enhancer) sind, so dirigiert werden, dass Dreifachhelix-Strukturen gebildet werden, welche die Transkrip tion eines Desaturase-Gens in Zielzellen hemmen. Siehe allgemein Helene, C. (1991) Anticancer Drug Res. 6(6) 569-84; Helene, C., et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27-36; und Maher. L. J. (1992) Bioassays 14(12): 807-815.

B. Genkonstrukt (= Nukleinsäurekonstrukt, -fragment oder Expressionskassette)

Unter der erfindungsgemäßen Expressionskassette sind die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 genannten Sequenzen, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren funktionellen oder nicht funktionellen Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden und welche vorteilhaft die Expression der codie renden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulations sequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätz lichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die Δ-5-Desaturase-/Δ-6-Desaturase- und/oder Δ-12-Desaturasegene können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind ein oder mehrere Genkonstrukte, die eine oder mehrere Sequenzen enthalten, die durch Seq ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 definiert sind und gem. SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 Polypeptide kodieren. Dabei stammen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 und 11 von Desaturasen, während SEQ ID NO: 9 für eine Elongase codiert. Desaturasen codierende Enzyme, die eine Doppelbindung in Δ-5-, Δ-6- oder Δ-12-Position einführen, wobei das Substrat ein, zwei, drei oder vier Doppel bindungen aufweisen. Die in SEQ ID NO: 9 dargestellte Sequenz codiert für eine Enzymaktivität, die eine Fettsäure um min destens zwei Kohlenstoffatome verlängert sowie ihre Homologen, Derivate oder Analoga, die funktionsfähig mit einem oder mehreren Regulationssignalen, vorteilhafterweise zur Steigerung der Genexpression, verbunden sind. Beispiele für diese Regula tionssequenzen sind Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätz lich zu diesen neuen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und, wenn geeignet, genetisch modifiziert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet worden ist und die Expression der Gene gesteigert worden ist. Das Genkonstrukt kann jedoch auch eine einfachere Struktur haben, d. h. dass keine zusätzlichen Regulationssignale vor der Sequenz SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 oder ihren Homologen inseriert worden sind und der natürliche Promotor mit seiner Regulation nicht deletiert worden ist. Statt dessen ist die natürliche Regula tionssequenz so mutiert worden, dass keine Regulation mehr statt findet und die Genexpression verstärkt ist. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte Enhancer-Sequenzen, die funktionsfähig mit dem Promotor verbunden sind und die gesteigerte Expressiori-der Nukleinsäuresequenz ermöglichen, umfassen. Es ist auch möglich, am 3'-Ende der DNA- Sequenzen zusätzlich vorteilhafte Sequenzen zu inserieren, bei spielsweise weitere Regulationselemente oder Terminatoren. Die Desaturasegene und das Elongasegen können im Genkonstrukt in einer oder mehreren Kopien vorliegen. Sie können in einem Genkonstrukt oder mehreren Genkonstrukten vorliegen. Dieses Genkonstrukt oder die Genkonstrukte können zusammen im Wirts organismus exprimiert werden. Dabei kann das Genkonstrukt oder die Genkonstrukte in einem oder mehreren Vektoren inseriert sein und frei in der Zelle vorliegen oder aber im Genom inseriert sein. Es ist vorteilhaft für die Insertion weiterer Gene in Organismen, wenn weitere Gene im Genkonstrukt vorliegen.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das neue Verfahren liegen beispielsweise in Promotoren vor, wie dem cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q- T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R oder λ-P_L-Promotor und werden vorteilhafterweise in Gram-negativen Bakterien angewendet. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen liegen beispielsweise in den Gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzen promotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor vor. In diesem Zusammenhang vorteilhaft sind ebenfalls induzier bare Promotoren, wie die in EP-A-0 388 186 (Benzylsulfonamid-induzierbar), Plant J. 2, 1992: 397-404 (Gatz et al., Tetra cyclin-induzierbar), EP A 0 335 528 (Abzisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar) be schriebenen Promotoren. Weitere geeignete Pflanzenpromotoren sind der Promotor von cytosolischer FBPase oder der ST-LSI-Promotor der Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), der Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase-Promotor aus Glycine max (Genbank-Zugangsnr. U87999) oder der in EP-A-0 249 676 beschriebene nodienspezifische Promotor. Besonders vorteilhafte Promotoren sind Promotoren, welche die Expression in Geweben ermöglichen, die an der Fettsäurebiosynthese beteiligt sind. Ganz besonders vorteilhaft sind samenspezifische Promotoren, wie der ausführungsgemäße USP Promotor, aber auch andere Promotoren wie der LeB4- (Baeumlein et al., Plant J., 1992, 2 (2): 233-239), DC3 (Thomas, Plant Cell 1996, 263: 359-368), Phaseolin- oder Napin-Promotor. Weitere besonders vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, die für monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden können und in US 5,608,152 (Napin-Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Oleosin-Promotor aus Arobidopsis), US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica), von Baeumlein et al., Plant J., 1992, 2 (2): 233-239 (LeB4- Promotor aus einer Leguminose) beschrieben sind, wobei sich diese Promotoren für Dikotyledonen eignen. Die folgenden Promotoren eignen sich beispielsweise für Monokotyledonen lpt-2- oder lpt-1-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230), Hordein-Promotor aus Gerste und andere, in WO 99/16890 beschriebene geeignete Promotoren.

Es ist im Prinzip möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das neue Ver fahren zu verwenden. Es ist ebenfalls möglich und vorteilhaft, zusätzlich synthetische Promotoren zu verwenden.

Das Genkonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene umfassen, die in die Organismen eingebracht werden sollen. Es ist möglich und vorteilhaft, in die Wirtsorganismen Regulationsgene, wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche durch ihre Enzymaktivität in die Regulation eines oder mehrerer Gene eines Biosynthesewegs eingreifen, einzubringen und darin zu exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Weiterhin können vorteilhaft im Nukleinsäurekon strukt bzw. Genkonstrukt weitere Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels enthalten sein oder aber diese Gene können auf einem weiteren oder mehreren weiteren Nukleinsäure konstrukten liegen. Vorteilhaft werden als Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ein Gen ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP(= acyl carrier protein)-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl- Transferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym, A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) oder deren Kombinationen verwendet.

Genkonstrukte umfassen vorteilhafterweise zur Expression der anderen vorliegenden Gene weitere 3'- und/oder 5'-terminale Regulationssequenzen zur Steigerung der Expression, die in Abhängigkeit vom gewählten Wirtsorganismus und dem Gen oder den Genen für die optimale Expression ausgewählt werden. Diese Regulationssequenzen sollen, wie oben erwähnt, die spezifische Expression der Gene und die Proteinexpression ermöglichen. Dies kann je nach dem Wirtsorganismus beispiels weise bedeuten, dass das Gen nur nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die Regulationssequenzen oder -faktoren können außerdem vorzugs weise eine vorteilhafte Wirkung auf die Expression der ein gebrachten Gene haben und diese somit steigern. Auf diese Weise ist es möglich, dass die Regulationselemente unter Verwendung starker Transkriptionssignale, wie Promotoren und/oder Enhancer, vorteilhafterweise auf Transkriptionsebene verstärkt werden. Es ist jedoch weiterhin auch möglich, die Translation zum Beispiel durch Verbesserung der mRNA-Stabilität zu verstärken.

C. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugs weise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die eine Desaturase allein (oder einen Teil davon) oder ein unter Punkt b beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt in dem die erfindungsgemäße Nukleinsäure allein oder in Kombination mit weiteren Biosynthesegenen des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels wie Desaturasen oder Elongasen enthalten ist. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzlichen DNA- Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (z. B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung und episomale Säugervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säugervektoren) werden beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben Expressionsvektoren, die für DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar ver wendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch diese anderen Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren (z. B. replikations defiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte Viren), die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen. Ferner soll der Begriff Vektor auch andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, wie Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA, umfassen.

Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt in einer Form, die sich zur Expression der Nuklein säure in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, dass die re kombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere Regulations sequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu ver wendenden Wirtszellen, die mit der zu exprimierenden Nuklein säuresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfasst. In einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig ver bunden", dass die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die Regulationssequenz(en) gebunden ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist und sie aneinander gebunden sind, so dass beide Sequenzen die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen (z. B. in einem In-vitro- Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird). Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z. B. Polyadenylierungs signale) umfassen. Diese Regulationssequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89-108, einschließlich der Literatur stellen darin. Reguiationssequenzen umfassen solche, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirts zelltypen steuern, und solche, welche die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann weiß, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins usw., abhängen kann. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingebracht werden, um dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteinen oder -peptiden, herzustellen, die von den Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, kodiert werden (z. B. Desaturasen, mutante Formen von Desaturasen, Fusionsproteine usw.).

Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von Desaturasen und Elongasen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen gestaltet sein. Beispielsweise können Desaturasegene in bakteriellen Zellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressions vektoren), Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M. A., et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; von den Hondel, C. A. M. J. J., et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Hennet & L. L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und von den Hondel, C. A. M. J. J., & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F., et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology. 1, 3: 239-251), Ciliaten der Typen: Holo trichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Para mecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Desaturase udocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella und Stylonychia, ins besondere der Gattung Stylonychia lemnae, mit Vektoren nach einem Transformationsverfahren, wie beschrieben in WO 98/01572, sowie Zellen vielzelliger Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leafand cotyledon explants" Plant Cell Rep.: 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (und darin zitierte Literaturstellen)) oder Säugerzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden ferner erörtert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, zum Beispiel unter Verwendung von T7-Promotor-Regulationssequenzen und T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.

Die Expression von Proteinen in Prokaryoten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren ent halten, welche die Expression von Fusions- oder nicht-Fusions proteinen steuern. Fusionsvektoren fügen eine Reihe von Amino säuren an ein darin kodiertes Protein an, gewöhnlich am Amino terminus des rekombinanten Proteins, aber auch am C-Terminus oder fusioniert innerhalb geeigneter Bereiche in den Proteinen. Diese Fusionsvektoren haben gewöhnlich drei Aufgaben: 1) die Verstärkung der Expression von rekombinantem Protein; 2) die Erhöhung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins und 3) die Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Wirkung als Ligand bei der Affinitätsreinigung. Bei Fusions- Expressionsvektoren wird oft eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindungsstelle der Fusionseinheit und des rekombinanten Proteins eingebracht, so dass die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusions proteins möglich ist. Diese Enzyme und ihre entsprechenden Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Entero kinase.

Typische Fusions-Expressionsvektoren sind u. a. pGEX (Pharmacia Biotech Inc. Smith, D. B., und Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird. Bei einer Ausführungs form ist die Desaturase-kodierende Sequenz in einen pGEX- Expressionsvektor kloniert, so dass ein Vektor erzeugt wird, der ein Fusionsprotein kodiert, das vom N-Terminus zum C-Terminus GST-Thrombin-Spaltstelle-X-Protein umfasst. Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Gluta thion-Agarose-Harz gereinigt werden. Rekombinante Desaturase, die nicht an GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusions proteins mit Thrombin gewonnen werden.

Beispiele für geeignete induzierbare nicht-Fusions-E. coli- Expressionsvektoren sind u. a. pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69: 301-315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89). Die Zielgenexpression vom pTrc-Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pET 11d-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gn10-lac- Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten viralen RNA-Poly merase (T7-gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gn1-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt.

Andere in prokaryotischen Organismen geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt, diese Vektoren sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, die pBR-Reihe, wie pBR322, die pUC-Reihe, wie pUC18 oder pUC19, die M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667. Eine Strategie zur Maximierung der Expression von rekombinantem Protein ist die Expression des Proteins in einem Wirtsbakterium, dessen Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins gestört ist (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 119-128). Eine weitere Strategie ist die Veränderung der Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu inserieren den Nukleinsäure, so dass die einzelnen Codons für jede Amino säure diejenigen sind, die vorzugsweise in einem zur Expression ausgewählten Bakterium, wie C. glutamicum, verwendet werden (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Diese Veränderung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen erfolgt durch Standard-DNA-Synthesetechniken.

Bei einer weiteren Ausführungsform ist der Desaturase- Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYeDesaturasec1 (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Kon struktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie den filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in von den Hondel, C. A. M. J. J., & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" in: Applied Molecular Genetics of fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi [J. W. Bennet & L. L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Academic Press: San Diego]. Weitere geeignete Hefevektoren sind beispielsweise pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23.

Alternativ können die erfindungsgemäßen Desaturasen in Insekten zellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (z. B. Sf9-Zellen) ver fügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31-39).

Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über mögliche geeignete Vektoren. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsgb. Pouwels, P. H., et al., Elsevier, Amsterdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0.444 904018).

Bei noch einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungs gemäße Nukleinsäure in Säugerzellen unter Verwendung eines Säuger-Expressionsvektors exprimiert. Unter Säugern werden im Sinne der Erfindung alle nicht-humanen Säuger verstanden. Beispiele für Säuger-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Bei der Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen des Espressionsvektors oft von viralen Regulationselementen bereitgestellt. Üblicherweise verwendete Promotoren stammen z. B. aus Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalie virus und Simian Virus 40. Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Bei einer anderen Ausführungsform kann der rekombinante Säuger- Expressionsvektor die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp steuern (z. B. werden gewebespezifische Regulationselemente zur Expression der Nukleinsäure verwendet). Gewebespezifische Regulationselemente sind im Fachgebiet bekannt. Nicht beschränkende Beispiele für geeignete gewebespezifische Promotoren sind u. a. der Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoidspezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) und Immunglobulinen (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), neuronspezifische Promotoren (z. B. Neurofilament- Promotor; Byrne und Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477), pankreas spezifische Promotoren (Edlund et al., (1985) Science 230: 912-916) und milchdrüsenspezifische Promotoren (z. B. Milch serum-Promotor; US-Patent Nr. 4,873,316 und Europäische Patent anmeldung-Veröffentlichung Nr. 264,166). Auch entwicklungs regulierte Promotoren sind umfasst, z. B. die hox-Promotoren der Maus (Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374-379) und der Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).

Bei einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Desaturasen in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatote et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 und darin zitierte Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z. B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; und Bevan, M. W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, welche die Geirexpression in Pflanzen zellen steuern können und funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevor zugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agro bacterium tumefaciens-t-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren sind geeignet.

Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptions ebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbunden Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaik virus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).

Die Pflanzengenexpression muss funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt. Bevorzugt sind Promotoren, welche die konstitutive Expression herbeiführen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 195 CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913) oder Pflanzenpromotoren, wie der in US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco.

Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktions fähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment notwendig sind (siehe eine Über sicht in Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423 und darin zitierte Literaturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Plastiden, wie Amylo plasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatischs Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.

Die Pflanzengenexpression lässt sich auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzier barer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.

Auch Promotoren, die auf biotische oder ablotische Stress bedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1-Gen-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), der hitzeinduzierbare hsp80- Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierbare Alpha amylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch Wunden induzierbare pinII-Promotor (EP-A-0 375 091).

Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Lipid- und Ölbiosynthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps (US 5,608,152), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), der Oleosin- Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9) sowie Promotoren, welche die samenspezifische Expression in Mono kotyledonen-Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der lpt2- oder lpt1-Gen-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin- Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum- Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin-Gen.

Insbesondere kann die multiparallele Expression von erfindungs gemäßen Desaturasen allein oder in Kombination mit anderen Desaturasen oder Elongasen gewünscht sein. Die Einführung solcher Expressionskassetten kann über eine simultane Transformation mehrerer einzelner Expressionskonstrukte erfolgen oder durch Kombination mehrerer Expressionskassetten auf einem Konstrukt. Auch können mehrere Vektoren mit jeweils mehreren Expressionskassetten transformiert und auf die Wirtszelle übertragen werden.

Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, welche die plastidenspezifische Expression herbeiführen, da Plastiden das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer sowie einige End produkte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete Promotoren, wie der virale RNA-Polynterase-Promotor, sind beschrieben in WO 95/16783 und WO 97/06250, und der clpP- Promotor aus Arabidopsis, beschrieben in WO 99/46394.

Die Erfindung stellt zudem einen rekombinanten Expressions vektor bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA Molekül, das in Antisense-Richtung in den Ezpressionsvektor kloniert ist. D. h. das DNA-Molekül ist derart mit einer regulatorischen Sequenz funktionsfähig verbunden, dass die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls, das zur Desaturase-mRNA "Antisense" ist, ermöglicht wird. Es können Regulationssequenzen ausgewählt werden, die funktionsfähig mit einer in Antisense-Richtung klonierten Nukleinsäure verbunden sind und die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Mole küls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern, zum Beispiel können virale Promotoren und/oder Enhancer oder Regulationssequenzen ausgewählt werden, welche die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen, in dem Antisensa-Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines hochwirksamen regulatorischen Bereichs produziert werden, dessen Aktivität durch den Zelltyp bestimmt werden kann, in den der Vektor eingebracht worden ist. Eine Erläuterung der Regulation der Genexpression mittels Antisense-Genen siehe in Weintraub, H., et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingebracht worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirts zelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Selbst verständlich betreffen diese Begriffe nicht nur die bestimmte Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen Nach kommen dieser Zelle. Da in aufeinanderfolgenden Generationen auf grund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, sind diese Nachkommen nicht unbedingt mit der Parentalzelle identisch, sind jedoch immer noch vom Umfang des Begriffs, wie hier verwendet, umfasst.

Unter Rekombinant oder Transgen beispielsweise rekombinanten Expressionsvektor oder rekombinanten Wirt oder Wirtszellen im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder deren natürliche Regulationssequenzen an 5'- und 3'-Position der Nukleinsäuren nicht in ihrer natürlichen Umgebung sind, das heißt entweder wurde die Lage der Sequenzen im Herkunftsorganismus verändert oder in diesem wurden die Nuklein säuresequenzen und/oder die Regulationssequenzen mutiert oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen wurden in einen anderen Organismus als den Herkunftsorganismus verbracht oder deren Regulationssequenzen. Auch Kombinationen dieser Veränderungen sind möglich. Unter natürlicher Umgebung ist die Lage einer Nukleinsäuresequenz in einem Organismus zu verstehen, wie er in der Natur vorkommt.

Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Zum Beispiel kann eine Desaturase in Bakterienzellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen, Pilzzellen oder Säugerzellen (wie Chinesischer Hamster-Ovarzellen (CHO) oder COS-Zellen), Algen, Ciliaten, Pflanzenzellen, Pilzen oder anderen Mikro organismen, wie C. glutamicum, exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig.

Vektor-DNA lässt sich in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken einbringen. Dis Begriffe "Transformation" und "Transfektion", Konjugation und Transduktion, wie hier verwendet, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (z. B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzi pitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, chemisch vermittelter Transfer, Elektro poration oder Teilchenbeschuss, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließ lich Pflanzenzellen, lassen sich finden in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsgb: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.

Über die stabile Transfektion von Säugerzellen ist bekannt, dass je nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter Transfektionstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom integriert. Zur Identifikation und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektier baren Marker (z. B. Resistenz gegen Antibiotika) kodiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevor zugte selektierbare Marker umfassen solche, welche Resistenz gegen Medikamente, wie G418, Hygromycin und Methotrexat, ver leihen, oder in Pflanzen solche, welche Resistenz gegen ein Herbizid, wie Glyphosphat oder Glufosinat, verleihen. Weitere ge eignete Marker sind beispielsweise Marker, welche Gene kodieren, die an Biosynthesewegen von zum Beispiel Zuckern oder Aminosäuren beteiligt sind, wie β-Galactodsidase, ura3 oder ilv2. Marker, welche Gene, wie Luziferase, gfp oder andere Fluoreszenzgene kodieren, sind ebenfalls geeignet. Diese Marker lassen sich in Mutanten verwenden, in denen diese Gene nicht funktionell sind, da sie beispielsweise mittels herkömmlicher Verfahren deletiert worden sind. Ferner können Marker, welche eine Nukleinsäure kodieren, die einen selektierbaren Marker kodiert, in eine Wirts zeile auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie derjenige, der eine Desaturase kodiert, oder können auf einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Medikamentenselektion identifiziert werden (z. B. überleben Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, wohin gegen die anderen Zellen absterben).

Zur Erzeugung eines homolog rekombinierten Mikroorganismus wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines Desaturasegens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht worden ist, um dadurch das Desaturasegen zu verändern, z. B. funktionell zu disrumpieren. Dieses Desatura segen ist vorzugsweise ein Phaeodactylum tricornutum Desaturase gen, es kann jedoch ein Homologon oder Analogon aus anderen Organismen, sogar aus einer Säuger-, Pilz- oder Insektenquelle verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor so gestaltet, dass das endogene Desaturasegen bei homo loger Rekombination funktionell disrumptiert wird (d. h. nicht länger ein funktionelles Protein kodiert, auch als Knock-out- Vektor bezeichnet). Alternativ kann der Vektor so gestaltet sein, dass das endogene Desaturasegen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert wird, aber immer noch ein funktionelles Protein kodiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich so verändert sein, dass da durch die Expression der endogenen Desaturase verändert wird). Zur Erzeugung einer Punktmutation über homologe Rekombination können auch als Chimeraplasty bekannte DNA-RNA-Hybride ver wendet werden, die aus Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acids Research 27(5): 1323-1330 und Kmiec, Gene therapy, 1999, American Scientist, 87(3): 240-247 bekannt sind.

Im Vektor für die homologe Rekombination ist der veränderte Abschnitt des Desaturasegens an seinem 5'- und 3'-Ende von zusätzlicher Nukleinsäure des Desaturasegens flankiert, so dass homologe Rekombination zwischen dem exogenen Desaturasegen, das auf dem Vektor vorliegt, und einem endogenen Desaturasegen in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze möglich ist. Die zusätz liche flankierende Desaturase-Nukleinsäure ist für eine erfolg reiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen hinreichend lang. Gewöhnlich sind im Vektor mehrere hundert Basenpaare bis zu Kilobasen flankierende DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) enthalten (eine Beschreibung von Vektoren zur homologen Rekombi nation siehe z. B. in Thomas, K. R., und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503 oder der Rekombination in Physcomitrella patens auf cDNA-Basis in Strepp et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (8): 4368-4373). Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle (z. B. mittels Polyethylenglycol-ver mittelter DNA) eingebracht, und Zellen, in denen das einge brachte Desaturasegen mit dem endogenen Desaturasegen homolog rekombiniert ist, werden unter Verwendung im Fachgebiet bekannter Techniken selektiert.

Bei einer anderen Ausführungsform können rekombinante Organismen, wie Mikroorganismen, hergestellt werden, die ausgewählte Systeme enthalten, welche eine regulierte Expression des eingebrachten Gens ermöglichen. Der Einschluß eines Desaturasegens in einem Vektor, wobei es unter die Kontrolle des lac-Operons gebracht wird, ermöglicht z. B. die Expression des Desaturasegens nur in Gegenwart von IPTG. Diese Regulationssysteme sind im Fachgebiet bekannt.

Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, in Kultur oder auf einem Feld wachsend, kann zur Produktion (d. h. Expression) einer Desaturase verwendet werden. In Pflanzen kann zusätzlich ein alternatives Verfahren durch direkten Transfer von DNA in sich entwickelnde Blüten über Elektroporation oder Gentransfer mittels Agrobacterium ange wendet werden. Die Erfindung stellt folglich ferner Verfahren zur Produktion von Desaturasen unter Verwendung der erfindungs gemäßen Wirtszellen bereit. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Anzucht der erfindungsgemäßen Wirtszelle ( in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der eine Desaturase kodiert, eingebracht worden ist, oder in deren Genom ein Gen eingebracht worden ist, das eine Wildtyp- oder veränderte Desaturase kodiert) in einem geeigneten Medium, bis die Desaturase produziert worden ist. Das Verfahren umfasst bei einer weiteren Ausführungsform das Isolieren der Desaturasen aus dem Medium oder der Wirtszelle.

Wirtszellen, die im Prinzip zum Aufnehmen der erfindungs gemäßen Nukleinsäure, des erfindungsgemäßen Genproduktes oder des erfindungsgemäßen Vektors geeignet sind, sind alle prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Die vorteil hafterweise verwendeten Wirtsorganismen sind Organismen, wie Bakterien, Pilze, Hefen, Tier- oder Pflanzenzellen. Weitere vor teilhafte Organismen sind Tiere oder vorzugsweise Pflanzen oder Teile davon. Pilze, Hefen oder Pflanzen werden vorzugsweise ver wendet, besonders bevorzugt Pilze oder Pflanzen, ganz besonders bevorzugt Pflanzen, wie Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Raps, Nachtkerze, Canola, Erdnuss, Lein, Soja, Safflor, Sonnenblume, Borretsch, oder Pflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölplame, Kokosnuß) sowie ausdauernde Gräser und Futterfeld früchte. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Soja, Erdnuss, Raps, Canola, Lein, Nacht kerze, Sonnenblume, Safflor, Bäume (Ölpalme, Kokosnuß).

D. Isolierte Desaturase

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Desaturasen und biologisch aktive Teile davon. Ein "isoliertes" oder "ge reinigtes" Protein oder ein biologisch aktiver Teil davon ist im wesentlichen frei von zellulärem Material, wenn es durch DNA- Rekombinationstechniken produziert wird, oder von chemischen Vor stufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird. Der Begriff "im wesentlichen frei von zellulärem Material" umfasst Desaturase-Präparationen, in denen das Protein von zellu lären Komponenten der Zellen, in denen es natürlich oder rekombi nant produziert wird, getrennt ist. Bei einer Ausführungsform um fasst der Ausdruck "im wesentlichen frei von zellulärem Material" Desaturase-Präparationen mit weniger als etwa 30% (bezogen auf das Trockengewicht) nicht-Desaturase (hier auch als "verunreini gendes Protein" bezeichnet), stärker bevorzugt weniger als etwa 20% nicht-Desaturase, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 10% nicht-Desaturase und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% nicht-Desaturase. Wenn die Desaturase oder ein biologisch aktiver Teil davon rekombinant hergestellt worden ist, ist sie/er auch im wesentlichen frei von Kulturmedium, d. h. das Kulturmedium macht weniger als etwa 20%, stärker bevorzugt weniger als etwa 10% und am stärksten bevörzugt weniget als etwa 5% des Volumens der Proteinpräparation aus. Der Begriff "im wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" umfasst Desatura se-Präparationen, in denen das Protein von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien getrennt ist, die an der Synthese des Proteins beteiligt sind. Bei einer Ausführungsform umfasst der Begriff "im wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" Desaturase-Präparationen mit weniger als etwa 30% (bezogen auf das Trockengewicht) chemischen Vorstufen oder nicht-Desaturase-Chemikalien, stärker bevorzugt weniger als etwa 20% chemischen Vorstufen oder nicht-Desaturase-Chemikalien, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 10% chemischen Vorstufen oder nicht-Desaturase-Chemikalien und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% chemischen Vorstufen oder nicht-Desaturase- Chemikalien. Bei bevorzugten Ausführungsformen weisen isolierte Proteine oder biologisch aktive Teile davon keine verunreinigen den Proteine aus dem gleichen Organismus auf, aus dem die Desaturase stammt. Diese Proteine werden gewöhnlich durch rekombinante Expression zum Beispiel Phaeodactylum tricornutum- Desaturase in Pflanzen wie Physcomitrella patens bzw. o. g. oder Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien, wie E. coli, Bacillus subtilis, C. glutamicum, Pilzen, wie Mortierella, Hefe, wie Saccharomyces, oder Ciliaten wie Colpidium oder Algen wie Phaeodactylum hergestellt.

Eine erfindungsgemäße isolierte Desaturase oder ein Teil davon kann auch am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Phaeodactylum tricornutum notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilnehmen. Bei bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Protein oder der Teil davon eine Aminosäuresequenz, die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 ist, dass das Protein oder der Teil davon die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Phaeodactylum tricornutum not wendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilzunehmen, beibehält. Der Teil des Proteins ist vor zugsweise ein biologisch aktiver Teil, wie hier beschrieben. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat eine erfindungs gemäße Desaturase eine der in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 gezeigten Aminosäuresequenzen. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat die Desaturase eine Aninosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die, zum Beispiel unter stringenten Bedingungen, an eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 hybridisiert. Bei noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat die Desaturäse eine Aminosäure sequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die mindestens etwa 50 bis 60%, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70%, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80%, 80 bis 90%, 90 bis 95% und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder noch homologer zu einer der Aminosäure sequenzen der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 18 ist. Die erfindungs gemäße bevorzugte Desaturase besitzt vorzugsweise auch mindestens eine der hier beschriebenen Desaturase-Aktivitäten. Zum Beispiel umfasst eine erfindungsgemäße bevorzugte Desaturase eine Amino säuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die, zum Beispiel unter stringenten Bedingungen, an eine Nukleotid sequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 hybridisiert und am Stoff wechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Phaeodactylum tri cornutum notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilnehmen kann oder eine Doppelbindung in eine Fettsäure mit ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen und einer Kettenlänge von C₁₈, C₂₀ oder C₂₂ einführt.

Bei anderen Ausführungsformen ist die Desaturase im wesentlichen homolog zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 und behält die funktionelle Aktivität des Proteins einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 bei, ihre Aminosäuresequenz unterscheidet sich jedoch aufgrund von natürlicher Variation oder Mutagenese, wie eingehend im obigen Unterabschnitt I beschrieben. Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Desaturase folglich ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens etwa 50 bis 60%, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70% und stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80%, 80 bis 90%, 90 bis 95% und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder noch homologer zu einer vollständigen Aminosäure sequenz der SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 ist und zumindest eine der hier beschriebenen Desaturase-Aktivitäten aufweist. Bei einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein vollständiges Phaeodactylum tricornutum-Protein, das im wesentlichen homolog zu einer vollständigen Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 ist.

Biologisch aktive Teile einer Desaturase umfassen Peptide, umfassend Aminosäuresequenzen, die von der Aminosäuresequenz einer Desaturase hergeleitet sind, z. B. eine in SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 gezeigte Aminosäuresequenz oder die Aminosäuresequenz eines Proteins, das zu einer Desaturase homolog ist, welche weniger Aminosäuren als die Vollängen-Desaturase oder das Vollängenprotein aufweisen, das zu einer Desaturase homolog ist, und zumindest eine Aktivität einer Desaturase aufweisen. Gewöhnlich umfassen biologisch aktive Teile, (Peptide; z. B. Peptide, die zum Beispiel 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sind) eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität einer Desaturase. Überdies können andere biologisch aktive Teile, in denen andere Bereiche des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Techniken hergestellt und bezüglich einer oder mehrerer der hier beschriebenen Aktivitäten untersucht werden. Die biologisch aktiven Teile einer Desaturase umfassen vorzugsweise ein/eine oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive oder Teile davon mit biologischer Aktivität.

Desaturasen werden vorzugsweise durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt. Zum Beispiel wird ein das Protein kodierendes Nukleinsäuremolekül in einen Expressionsvektor (wie vorstehend beschrieben) kloniert, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle (wie vorstehend beschrieben) eingebracht, und die Desaturase wird in der Wirtszelle exprimiert. Die Desaturase kann dann durch ein geeignetes Reinigungsschema mittels Standard- Proteinreinigungstechniken aus den Zellen isoliert werden. Alter nativ zur rekombinanten Expression kann eine Desaturase, ein -Polypeptid, oder -Peptid mittels Standard-Peptidsynthese techniken chemisch synthetisiert werden. Überdies kann native Desaturase aus Zellen (z. B. Endothelzellen) z. B. unter Verwendung eines Anti-Desaturase-Antikörpers isoliert werden, der durch Standardtechniken produziert werden kann, wobei eine erfindungs gemäße Desaturase oder ein Fragment davon verwendet wird.

Die Erfindung stellt auch chimäre Desaturase-Proteine oder Desaturase-Fusionsproteine bereit. Wie hier verwendet, umfasst ein "chimäres Desaturase-Protein" oder "Desaturase-Fusions protein" ein Desaturase-Polypeptid, das funktionsfähig an ein nicht-Desaturase-Polypeptid gebunden ist. Ein "Desaturase-Poly peptid" betrifft ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die einer Desaturase entspricht, wohingegen ein "nicht-Desaturase- Polypeptid" ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz betrifft, die einem Protein entspricht, das im wesentlichen nicht homolog zu der Desaturase ist, z. B. ein Protein, das sich vom der Desaturase unterscheidet und aus dem gleichen oder einem anderen Organismus stammt. Innerhalb des Fusionsproteins soll der Begriff "funktionsfähig verbunden" bedeuten, dass das Desaturase-Polypeptid und das nicht-Desaturase-Polypeptid so miteinander fusioniert sind, dass beide Sequenzen die vor hergesagte, der verwendeten Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen. Das nicht-Desaturase-Polypeptid kann an den N-Terminus oder den C-Terminus des Desaturase-Polypeptids fusioniert sein. Bei einer Ausführungsform ist das Fusionsprotein zum Beispiel ein GST-Desaturase-Fusionsprotein, bei dem die Desatutase- Sequenzen an den C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Diese Fusionsproteine können die Reinigung der rekombinanten Desaturasen erleichtern. Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Fusionsprotein eine Desaturase, die eine heterologe Signal sequenz an ihrem N-Terminus aufweist. In bestimmten Wirtszellen (z. B. Säuger-Wirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion einer Desaturase durch Verwendung einer heterologen Signalsequenz gesteigert werden.

Ein erfindungsgemäßes chimäres Desaturase-Protein oder Desaturase-Fusionsprotein wird durch Standard-DNA-Rekombinations techniken hergestellt. Zum Beispiel werden DNA-Fragmente, die unterschiedliche Polypeptidsequenzen kodieren, gemäß herkömm licher Techniken im Leseraster aneinander ligiert, indem beispielsweise glatte oder überhängende Enden zur Ligation, Restriktionsenzymspaltung zur Bereitstellung geeigneter Enden, Auffüllen kohäsiver Enden, wie erforderlich, Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um ungewollte Verknüpfungen zu ver meiden, und enzymatische Ligation eingesetzt werden. Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Fusionsgen durch herkömmliche Techniken, einschließlich DNA-Syntheseautomaten, synthetisiert werden. Alternativ kann eine PCR-Amplifizierung von Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern durchgeführt werden, die komplementäre Überhänge zwischen aufeinanderfolgenden Gen fragmenten erzeugen, die anschließend miteinander hybridisiert und reamplifiziert werden können, so dass eine chimäre Gensequenz erzeugt wird (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, Hrsgb. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992). Über dies sind viele Expressionsvektoren kommerziell erhältlich, die bereits eine Fusionseinheit (z. B. ein GST-Polypeptid) kodieren. Eine Desaturase-kodierende Nukleinsäure kann in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, so dass die Fusionseinheit im Leseraster mit dem Desaturase-Protein verbunden ist.

Homologe der Desaturase können durch Mutagenese, z. B. durch spezifische Punktmutation oder Verkürzung der Desaturase, erzeugt werden. Der Begriff "Homologe", wie hier verwendet, betrifft eine variante Form der Desaturase, die als Agonist oder Antagonist der Desaturase-Aktivität wirkt. Ein Agonist der Desaturase kann im wesentlichen die gleiche Aktivität wie die oder einen Teil der biologischen Aktivitäten der Desaturase beibehalten. Ein Antagonist der Desaturase kann eine oder mehrere Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form der Desaturase durch zum Beispiel kompetitive Bindung an ein stromabwärts oder -aufwärts gelegenes Element der Stoffwechselkaskade für Zellmembrankomponenten, welche die Desaturase umfasst, oder durch Bindungen eine Desaturase, welche den Transport von Verbindungen über Zell membranen vermittelt, hemmen, wodurch die Translokation gehemmt wird.

Bei einer alternativen Ausführungsform können Homologe der Desaturase durch Sichten kombinatorischer Banken von Mutanten, z. B. Verkürzungsmutanten, der Desaturase hinsichtlich Desaturase- Agonisten- oder -Antagonisten-Aktivität identifiziert werden. Bei einer Ausführungsform wird eine variegierte Bank von Desaturase- Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäure ebene erzeugt und durch eine variegierte Genbank kodiert. Eine variegierte Bank von Desaturase-Varianten kann z. B. durch enzymatische Ligation eines Gemisches von synthetischen Oligo nukleotiden in Gensequenzen hergestellt werden, so dass sich ein degenerierter Satz potentieller Desaturase-Sequenzen als individuelle Polypeptide oder alternativ als Satz größerer Fusionsproteine (z. B. für das Phage-Display), die diesen Satz von Desaturase-Sequenzen enthalten, exprimieren lässt. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Desaturase-Homologen aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA- Syntheseautomaten durchgeführt und das synthetische Gen dann in einen geeigneten Ezpressionsvektor ligiert werden. Die Ver wendung eines degenerierten Satzes von Genen ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen, die den gewünschten Satz an potentiellen Desaturase-Sequenzen kodieren, in einem Gemisch. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind im Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).

Zusätzlich können Banken von Desaturase-Fragmenten zur Her stellung einer variegierten Population von Desaturase-Fragmenten für das Sichten und für die anschließende Selektion von Homo logen einer Desaturase verwendet werden. Bei einer Ausführungs form kann eine Bank von Fragmenten der kodierenden Sequenz durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR-Fragmentes einer kodierenden Desaturase-Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, unter denen Doppelstrangbrüche nur etwa einmal pro Molekül erfolgen, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA, welche Sense/Antisense-Paare von verschiedenen Produkten mit Doppelstrangbrüchen umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Abschnitte aus neu gebildeten Duplices durch Behandlung mit S1-Nuklease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Mit diesem Verfahren kann eine Expressionsbank hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente der Desaturase verschiedener Größen kodiert.

Im Fachgebiet sind mehrere Techniken für das Sichten von Gen produkten in kombinatorischen Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und für das Sichten von cDNA-Banken nach Genprodukten mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Sichtung der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese von Desaturase-Homologen erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Sichtung großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterwoffen werden können, um fassen gewöhnlich das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren von geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Muta genese (REM), eine neue Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken erhöht, kann in Kombination mit den Sichtungstests zur Identifikation von Desaturase-Homologen ver wendet werden (Arkin und Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).

Eine weitere bekannte Technik zur Veränderung von katalytischen Eigenschaften von Enzymen bzw. deren codierenden Genen ist das "Gen-Shuffling" (siehe z. B. in Stemmer, PNAS 1994, 91: 10747-10751, WO 9720078 oder WO 9813487), das eine Kombination von Genfragmenten darstellt, wobei diese Neukombination zusätzlich noch durch fehlerhafte Polymerasekettenreaktionen variiert werden kann und somit eine hohe zu testende Sequenzdiversität schafft. Voraussetzung für den Einsatz eines solchen Ansatzes ist jedoch ein geeignetes Screeningsystem, um die erstellte Gendiversität auf Funktionalität zu überprüfen.

Insbesondere für die Sichtung von Desaturaseaktivitäten ist ein Sichtungsverfahren Voraussetzung, das PUFA-abhängig Enzymaktivität(en) erfaßt. Bzgl. Desaturaseaktivitäten mit Spezifität für PUFAs kann man in Mucor-Species, die durch bekannte Transformationsverfahren mit gewünschten Genkonstrukten transformierbar sind, die Toxizität von Arachidonsäure in An wesenheit eines toxischen Metaboliten (hier: Salicylsäure oder Salicylsäurederivate) nutzen (Eroshin et al., Mikrobiologiya, Vol. 65, No. 1 1996, Seiten 31-36), um eine wachstumsbasierte Erstsichtung durchzuführen. Resultierende Klone können dann einer Analyse ihrer Lipidinhaltstoffe mittels Gaschromatographie und Massenspektroskopie unterzogen werden, um Edukte und Produkte in Art und Menge zu erfassen.

Bei einer weiteren Ausführungsform können Tests auf Zellbasis zur Analyse einer variegierten Desaturase-Bank unter Verwendung von weiteren im Fachgebiet bekannten Verfahren ausgenutzt werden.

E. Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren

Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Protein homologen, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können bei einem oder mehreren der nachstehenden Verfahren ver wendet werden: Identifikation von Phaeodactylum und verwandten Organismen, Kartierung der Genome von Organismen, die mit Phaeodactylum tricornutum verwandt sind, Identifikation und Lokalisierung von Phaeodactylum tricornutum-Sequenzen von Interesse, Evolutionsstudien, Bestimmung von Desaturase-Protein bereichen, die für die Funktion notwendig sind, Modulation einer Desaturase-Aktivität; Modulation des Stoffwechsels einer oder mehrerer Zellmembrankomponenten; Modulation des Transmembran transports einer oder mehrerer Verbindungen sowie Modulation der zellulären Produktion einer gewünschten Verbindung, wie einer Feinchemikalie. Die erfindungsgemäßen Desaturase-Nukleinsäure moleküle haben eine Vielzahl von Verwendungen. Sie können zunächst zur Identifikation eines Organismus als Phaeodactylum tricornutum oder als naher Verwandter davon verwendet werden. Sie können auch zur Identifikation des Vorliegens von Phaeodactylum tricornutum oder eines Verwandten davon in einer Mischpopulation von Mikroorganismen verwendet werden. Die Erfindung stellt die Nukleinsäuresequenzen einer Reihe von Phaeodactylum tricornutum- Genen bereit; durch Sondieren der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer einheitlichen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, die einen Bereich eines Phaeodactylum tricornutum -Gens oder von Teilen davon überspannt, das für diesen Organismus einzigartig ist, kann man bestimmen, ob dieser Organismus vorliegt. Phaeo dactylum tricornutum selbst werden zur kommerziellen Produktion mehrfach ungesättigter Säuren verwendet und eignen darüber hinaus zur PUFA-Produktion auch in anderen Organismen insbesondere wenn erreicht werden soll, dass resultierende PUFAs auch in die Tri acylglycerolfraktion eingebaut werden sollen.

Ferner können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Protein moleküle als Marker für spezifische Bereiche des Genoms dienen. Dies ist nicht nur zur Kartierung des Genoms, sondern auch für funktionelle Phaeodactylum tricornutum-Proteine geeignet. Zur Identifikation des Genombereichs, an den ein bestimmites DNA- bindendes Protein von Phaeodactylum tricornutum bindet, könnte das Phaeodactylum tricornutum-Genom zum Beispiel gespalten werden und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen, die das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen, vorzugsweise mit leicht nachweisbaren Markierungen, sondiert werden; die Bindung eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genomfragment ermöglicht die Lokalisierung des Fragments auf der Genomkarte von Phaeodactylum tricornutum und erleichtert, wenn dies mehrmals mit unterschied lichen Enzymen durchgeführt wird, eine rasche Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an die das Protein bindet. Die erfindungs gemäßen Nukleinsäuremoleküle können-zudem ausreichend homolog zu den Sequenzen verwandter Arten sein, dass diese Nukleinsäure moleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte bei verwandten Pilzen oder Algen dienen können.

Die erfindungsgemäßen Desaturase-Nukleinsäuremoleküle eignen sich auch für Evolutions- und Proteinstruktur-Untersuchungen. Die Stoffwechsel- und Transportprozesse, an denen die er findungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, werden von vielen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen genutzt; durch Vergleich der Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure moleküle mit solchen, die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen kodieren, kann der Evolutions-Verwandschaftsgrad der Organismen bestimmt werden. Entsprechend ermöglicht ein solcher Vergleich die Bestimmung, welche Sequenzbereiche konserviert sind und welche nicht, was bei der Bestinnung von Bereichen des Proteins hilfreich sein kann, die für die Enzymfunktion essentiell sind.

Dieser Typ der Bestimmung ist für Proteinengineering-Unter suchungen wertvoll und kann einen Hinweis darauf geben, wieviel Mutagenese das Protein tolerieren kann, ohne die Funktion zu verlieren.

Die Manipulation der erfindungsgemäßen Desaturase-Nukleinsäure moleküle kann zur Produktion von Desaturasen mit funktionellen Unterschieden zu den Wildtyp-Desaturasen führen. Die Effizienz oder Aktivität dieser Proteine kann verbessert sein, sie können in größeren Anzahlen als gewöhnlich in der Zelle zugegen sein, oder ihre Effizienz oder Aktivität kann verringert sein. Ver besserte Effizienz oder Aktivität bedeutet beispielsweise, dass das Enzym eine höhere Selektivität und/oder Aktivität, vorzugs weise eine mindestens 10% höhere, besonders bevorzugt eine mindestens 20% höhere Aktivität, ganz besonders bevorzugt eine mindestens 30% höhere Aktivität als das ursprüngliche Enzym aufweist.

Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung einer erfindungsgemäßen Desaturase die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie, welche ein solches verändertes Protein enthält, direkt beeinflussen kann. Die Gewinnung von Feinchemikalien-Verbindungen aus Kulturen von Ciliaten, Algen oder Pilzen im großen Maßstab ist signifi kant verbessert, wenn die Zelle die gewünschten Verbindungen sezerniert, da diese Verbindungen aus dem Kulturmedium (im Gegen satz zur Extraktion aus der Masse der gezüchteten Zellen) leicht gereinigt werden können. Ansonsten lässt sich die Reinigung ver bessern, wenn die Zelle in vivo Verbindungen in einem speziali sierten Kompartiment mit einer Art Konzentrationsmechanismus speichert. Bei Pflanzen, die Desaturasen exprimieren, kann ein gesteigerter Transport zu besserer Verteilung innerhalb des Pflanzengewebes und der -organe führen. Durch Vergrößern der Anzahl oder der Aktivität von Transportermolekülen, welche Fein chemikalien aus der Zelle exportieren, kann es möglich sein, die Menge der produzierten Feinchemikalie, die im extrazellulären Medium zugegen ist, zu steigern, wodurch Ernte und Reinigung oder bei Pflanzen eine effizientere Verteilung erleichtert werden. Zur effizienten Überproduktion einer oder mehrerer Feinchemikalien sind dagegen erhöhte Mengen an Cofaktoren, Vorläufermolekülen und Zwischenverbindungen für die geeigneten Biosynthesewege erforder lich. Durch Vergrößern der Anzahl und/oder der Aktivität von Transporterproteinen, die am Import von Nährstoffen, wie Kohlen stoffquellen (d. h. Zuckern), Stickstoffquellen (d. h. Aminosäuren, Ammoniumsalzen), Phosphat und Schwefel, beteiligt sind, kann man die Produktion einer Feinchemikalie aufgrund der Beseitigung aller Einschränkungen des Nährstoffangebots beim Biosynthese prozess verbessern. Fettsäuren, wie PUFAs, und Lipide, die PUFAs enthalten, sind selbst wünschenswerte Feinchemikalien; durch Optimieren der Aktivität oder Erhöhen der Anzahl einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Desaturasen, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Stören der Aktivi tät einer oder mehrerer Desaturasen, die am Abbau dieser Ver bindungen beteiligt sind, kann man somit die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmole küle in Ciliaten, Algen, Pflanzen, Pilzen, Hefen oder anderen Mikroorganismen steigern.

Die Manipulation eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Desaturase-Gene kann ebenfalls zu Desaturasen mit veränderten Aktivitäten führen, welche die Produktion einer oder mehrerer gewünschter Feinchemikalien aus Algen, Pflanzen, Ciliaten oder Pilzen indirekt beeinflussen. Die normalen biochemischen Stoff wechselprozesse führen z. B. zur Produktion einer Vielzahl an Abfallprodukten (z. B. Wasserstoffperoxid und andere reaktive Sauerstoffspezies), die diese Stoffwechselprozesse aktiv stören können (z. B. nitriert Peroxynitrit bekanntlich Tyrosin-Seiten ketten, wodurch einige Enzyme mit Tyrosin im aktiven Zentrum inaktiviert werden (Groves, J. T. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2); 226-235)). Diese Abfallprodukte werden zwar üblicherweise ausgeschieden, aber die zur fermentativen Produktion im großen Maßstab verwendeten Zellen werden für die Überproduktion einer oder mehrerer Feinchemikalien optimiert und können somit mehr Abfallprodukte produzieren als für eine Wildtypzelle üblich. Durch Optimieren der Aktivität einer oder mehrerer erfindungs gemäßer Desaturasen, die am Export von Abfallmolekülen beteiligt sind, kann man die Lebensfähigkeit der Zelle verbessern und eine effiziente Stoffwechselaktivittt aufrechterhalten. Auch das Vorliegen hoher intrazellulärer Mengen der gewünschten Fein chemikalie kann tatsächlich für die Zelle toxisch sein, so dass man durch Steigern der Fähigkeit der Zelle zur Sekretion dieser Verbindungen die Lebensfähigkeit der Zelle verbessern kann.

Die erfindungsgemäßen Desaturasen können ferner so manipuliert sein, dass die relativen Mengen verschiedener Lipid- und Fett säuremoleküle verändert werden. Dies kann eine entscheidende Aus wirkung auf die Lipidzusammensetzung der Zellmembran haben. Da jeder Lipidtyp unterschiedliche physikalische Eigenschaften hat, kann eine Veränderung der Lipidzusammensetzung einer Membran die Membranfluidität signifikant verändern. Änderungen der Membran fluidität können den Transport von Molekülen über die Membran beeinflussen, was, wie vorstehend erläutert, den Export von Abfallprodukten oder der produzierten Feinchemikalie oder den Import notwendiger Nährstoffe modifizieren kann. Diese Änderungen der Membranfluidität können auch die Integrität der Zelle ent scheidend beeinflussen; Zellen mit vergleichsweise schwächeren Membranen sind anfälliger gegenüber ablotischen und biotischen Stressbedingungen, welche die Zelle beschädigen oder abtöten können. Durch Manipulieren von Desaturasen, die an der Produktion von Fettsäuren und Lipiden für den Membranaufbau beteiligt sind, so dass die resultierende Membran eine Membranzusanmensetzung hat, die für die in den Kulturen, die zur Produktion von Fein chemikalien verwendet werden, herrschenden Umweltbedingungen empfänglicher sind, sollte ein größerer Anteil der Zellen über leben und sich vermehren. Größere Mengen an produzierenden Zellen sollten sich in größeren Ausbeuten, höherer Produktion oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalie aus der Kultur manifestieren.

Die vorstehend genannten Mutagenesestrategien für Desaturasen, die zu erhöhten Ausbeuten einer Feinchemikalie führen sollen, sollen nicht beschränkend sein; Variationen dieser Strategien sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Unter Verwendung dieser Mechanismen und mit Hilfe der hier offenbarten Mechanismen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle zur Erzeugung von Algen, Ciliaten, Pflanzen, Tieren, Pilzen oder anderen Mikroorganismen, wie C. glutamicum, verwendet werden, die mutierte Desaturase-Nukleinsäure- und Proteinmoleküle expri mieren, so dass die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung verbessert wird. Diese gewünschte Verbindung kann ein beliebiges natürliches Produkt von Algen, Ciliaten, Pflanzen, Tieren, Pilzen oder Bakterien sein, welches die Endprodukte von Biosynthesewegen und Zwischenprodukte natürlich vorkommender Stoffwechselwege umfasst, sowie Moleküle, die im Stoffwechsel dieser Zellen nicht natürlich vorkommen, die jedoch von den erfindungsgemäßen Zellen produziert werden.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Verfahren zur Produktion von PUFAs, wobei das Verfahren das Züchten eines Organismus, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt oder einen erfindungsgemäßen Vektor umfasst, welche ein Polypeptid kodieren, das C₁₈-, C₂₀- oder C₂₂-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül um mindestens zwei Kohlenstoffatome unter Bedingungen, unter denen PUFAs in dem Organismus produziert werden, verlängert, umfasst. Durch dieses Verfahren hergestellte PUFAs lassen sich durch Ernten der Organismen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder von dem Feld, Aufbrechen und/oder Extrahieren des geernteten Materials mit einem organischen Lösungsmittel isolieren. Aus diesem Lösungsmittel kann das Öl, das Lipide, Phospholipide, Sphingolipide, Glyco lipide, Triacylglycerine und/oder freie Fettsäuren mit höherem Gehalt an PUFAs enthält, isoliert werden. Durch basische oder saure Hydrolyse der Lipide, Phospholipide, Sphingolipide, Glyco lipide, Triacylglycerine können die freien Fettsäuren mit höherem Gehalt an PUFAs isoliert werden. Ein höherer Gehalt an PUFAs bedeutet mindestens 5%, vorzugsweise 10%, besonders bevorzugt 20%, ganz besonders bevorzugt 40% mehr PUFAs als der ursprüng liche Organismus, der keine zusätzliche Nukleinsäure, die die erfindungsgemäße Desaturase kodiert, besitzt.

Vorzugsweise sind die durch dieses Verfahren produzierten PUFAs C₁₈- oder C_20-22-Fettsäuremoleküle mit mindestens zwei Doppel bindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise drei, vier, bei Kombination mit einer weiteren Elongasen und einer Δ-4 Desaturase fünf oder sechs Doppelbindungen. Diese C₁₈- oder C_20-22-Fettsäure moleküle lassen sich aus dem Organismus in Form eines Öls, Lipids oder einer freien Fettsäure isolieren. Geeignete Organismen sind beispielsweise die vorstehend erwähnten. Bevorzugte Organismen sind transgene Pflanzen.

Eine erfindungsgemäße Ausführungsform sind Öle, Lipide oder Fett säuren oder Fraktionen davon, die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt worden sind, besonders bevorzugt Öl, Lipid oder eine Fettsäurezusammensetzung, die PUFAs umfassen und von transgenen Pflanzen herrühren.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung des Öls, Lipids oder der Fettsäurezusammensetzung in Futter mitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Identifikation eines Antagonisten oder Agonisten von Desaturasen, umfassend

a) in Kontaktbringen der Zellen, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung exprimieren, mit einem Kandidaten stoff;
b) Testen der Desaturaseaktivität;
c) Vergleichen der Desaturaseaktivität mit einer Standard aktivität in Abwesenheit des Kandidatenstoffs, wobei ein Anstieg der Desaturaseaktivität über den Standard anzeigt, daß der Kandidatenstoff ein Agonist und ein Verringerung der Desaturaseaktivität anzeigt, daß der Kandidatenstoff ein Antagonist ist.

Der genannte Kandidatenstoff kann ein chemisch synthetisierter oder mikrobiologisch produzierter Stoff sein und z. B. in Zell extrakten von z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen auf treten. Weiterhin kann der genannte Stoff zwar im Stand der Technik bekannt sein, aber bisher nicht bekannt sein als die Aktivität der Desaturasen steigernd oder repremierend. Das Reak tionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden z. B. allgemein beschrieben in Alberts, Mole cular Biology the cell, 3rd Edition (1994), z. B. Kapitel 17. Die genannten Stoffe können z. B. zu dem Reaktionsgemisch oder dem Kulturmedium zugegeben werden oder den Zellen injiziert werden oder auf eine Pflanze gesprüht werden.

Wenn eine Probe, die ein nach der erfindungsgemäßen Methode aktiven Stoff beinhaltet, identifiziert wurde, dann is 95235 00070 552 001000280000000200012000285919512400040 0002010102338 00004 95116t es ent weder möglich, den Stoff direkt von der ursprünglichen Probe zu isolieren oder man kann die Probe in verschiedene Gruppen teilen, z. B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten besteht, um so die Zahl der verschiedenen Substanzen pro Probe zu reduzieren und dann das erfindungsgemäße Verfahren mit einer solchen "Unterprobe" der ursprünglichen Probe zu wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschrie benen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Probe nur noch eine geringe Anzahl von Substanzen oder nur noch eine Substanz umfaßt. Vorzugsweise wird der gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Stoff oder Derivate davon weiter formuliert, so, daß er für die Anwendung in der Pflanzenzüchtung oder Pflanzen-, zell- oder Gewebekultur geeignet ist.

Die Stoffe, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet und identifiziert wurden, können sein: Expressionsbibliotheken, z. B. cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäu ren, Antikörper, kleine organische Stoffe, Hormone, PNAs oder ähnliches (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen). Diese Stoffe könne auch funktionelle Derivate oder Analogon der bekannten Inhibitoren oder Aktivatoren sein. Verfahren zur Herstellung von chemischen Derivaten oder Analogon sind dem Fachmann bekannt. Die genannten Derivate und Analogon können gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik getestet werden. Weiterhin kann computergestütztes Design oder Peptidomimetics zur Herstellung geeigneter Derivate und Analogon verwendet werden. Die Zelle oder das Gewebe, die/das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, ist vorzugs weise eine erfindungsgemäße Wirtszelle, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe, wie in den oben genannten Ausführungsformen beschrieben.

Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Stoff, der gemäß den vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde. Der Stoff ist z. B. ein Homolog der erfindungsgemäßen Desaturasen. Homologe der Desaturasen können durch Mutagenese, z. B. durch Punktmutation oder Deletion der Desaturasen, erzeugt werden. Hierin verwendet wird der Begriff "Homolog" als eine variante Form der Desaturasen, die als Agonist oder Antagonist für die Aktivität der Desaturasen wirkt. Ein Agonist kann die im wesentlichen gleiche oder einen Teil der biologischen Aktivität der Desaturasen haben. Ein Antagonist der Desaturasen kann eine oder mehr Aktivitäten der natürlich vor kommenden Formen der Desaturasen inhibieren, z. B. kompetitiv an ein Downstream oder Upstrearn gelegenes Mitglied der Fettsäure synthese-Stoffwechselwege, die die Desaturasen einschließen, binden oder an Desaturasen binden und dabei die Aktivität reduzieren oder inhibieren.

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Antikörper oder ein Fragment davon, wie sie hierin beschrieben werden, der die Aktivität der erfindungsgemäßen Desaturasen inhibiert.

Bei einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Anti körper, der spezifisch den erfindungsgemäßen oben beschriebenen Agonisten oder Antagonisten erkennt bzw. bindet.

Ein weiterer Aspekt betrifft eine Zusammensetzung, die den Anti körper, den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Stopp oder das Antisense-Molekül umfaßt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, umfassend die erfindungsgemäße Nukleinsäure, das erfindungsgemäße Genkonstrukt, die erfindungsgemäße Amino säuresequenz, das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremolekül, den erfindungsgemäßen Antikörper und/oder Zusammensetzung, einen Antagonisten oder Agonisten, der nachdem erfindungsgemäßen Ver fahren hergestellt wurde, und/oder erfindungsgemäße Öle, Lipide und/oder Fettsäuren oder eine Fraktion davon. Ebenso kann das Kit die erfindungsgemäßen Wirtszellen, Organismen, Pflanzen oder Teile davon, erntbare Teile der erfindungsgemäßen Pflanzen oder Vermehrungsmaterial oder aber auch den erfindungsgemäßen Antagonisten oder Agonisten umfassen. Die Komponenten des Kits der vorliegenden Erfindung können in geeigneten Containern, bei spielsweise mit oder in Puffern oder anderen Lösungen verpackt sein. Ein oder mehr der genannten Komponenten können in ein und demselben Container verpackt sein. Zusätzlich oder alternativ können ein oder mehr der genannten Komponenten z. B. auf einer festen Oberfläche adsorbiert sein, z. B. Nitrozellulosefilter, Glasplatten, Chips, Nylonmembranen oder Mikrotiterplatten. Das Kit kann für jede der hierin beschriebenen Methoden und Aus führungsformen verwendet werden, z. B. für die Produktion von Wirtszellen, transgenen Pflanzen, zur Detektion von homologen Sequenzen, zur Identifikation von Antagonisten oder Agonisten usw. Weiterhin kann das Kit Anleitungen für die Verwendung des Kits für eine der genannten Anwendungen enthalten.

Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefaßt werden sollten. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.

Beispielteil Beispiel 1 Allgemeine Verfahren a) Allgemeine Klonierungsverfahren

Klonierungsverfahren, wie beispielsweise Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrocellulose- und Nylonmembranen, Verbindung von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli- und Hefe-Zellen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA, wurden durchgeführt wie beschrieben in Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) oder Kaiser, Michaelis und Mitchell (1994) "Methods in Yeast Genetics" (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-451-3). Die Transformation und Anzucht von Algen, wie Chlorella oder Phaeodactylum werden durchgeführt wie be schrieben von El-Sheekh (1999), Biologia Plantarum 42: 209-216; Apt et al. (1996) Molecular and General Genetics 252 (5): 872-9.

b) Chemikalien

Die verwendeten Chemikalien wurden, wenn im Text nicht anders angegeben, in p. A.-Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen) bezogen. Lösungen wurden unter Verwendung von reinem pyrogenfreiem Wasser, im nachstehenden Text als H₂O bezeichnet, aus einer Milli-Q-Wassersystem-Wasserreinigungs anlage (Millipore, Eschborn) hergestellt. Restriktionsendo nukleasen, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits wurden bezogen von den Firmen AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Biometra (Göttingen), Boehringer (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach /Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) und Stratagene (Amsterdam, Niederlande). Wenn nicht anders ange geben, wurden sie nach den Anweisungen des Herstellers ver wendet.

c) Zellmaterial

Die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuresequenzen sind im Genom eines Phaeodactylum tricornutum UTEX646-Stammes enthalten, der über die Algensammlung der University of Texas, Austin ver fügbar ist.

Phaeodactylum tricornutum wurde bei 25°C mit einem Licht/Dunkel Rhythmus von 14 : 10 Stunden bei 22°C und 35 microEinstein (ent spricht micromol Photonenpro Quadratmeter und Sekunde) in Glas röhren kultiviert, die von unten mit Luft begast wurden.

Als Kulturmedium für Phaeodactylum tricornutum wurde das f/2 Kulturmedium mit 10% organischen Medium nach Guillard, R. R. L. verwendet (1975; Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In: Smith, W. L. and Chanley, M. H. (Eds.) Culture of marine Invertebrate animals, NY Plenum Press, pp. 29-60.):
Es enthält
995,5 ml Seewasser (artifiziell)
1 ml NaNO₃ (75 g/l), 1 ml NaH₂PO₄ (5 g/l), 1 ml Spurenelemente lösung, 1 ml Tris/Cl pH 8.0, 0.5 ml f/2 Vitaminlösung
Spurenelementelösung: Na₂EDTA (4,36 g/l), FeCl₃ (3,15 g/l),
Primäre Spurenelemente: CuSO₄ (10 g/l), ZnSO₄ (22 g/l), CoCl₂ (10 g/l), MnCl₂ (18 g/l), NaMoO₄ (6,3 g/l)
f/2 Vitaminlösung: Biotin 10 mg/l, Thiamin 200 mg/l, Vit B12 0,1 mg/l
org-Medium: Na-Acetat (1 g/l), Glucose (6 g/l), Na-Succinat (3 g/l), Bacto-Trypton (4 g/l), Hefe-Extrakt (2 g/l)

Beispiel 2 Isolierung von Gesamt-DNA aus Phaeodactylum tri cornutum UTEX646 für Hybridisierungsexperimente

Die Einzelheiten der Isolierung von Gesamt-DNA betreffen die Auf arbeitung von Pflanzenmaterial mit einem Frischgewicht von einem Gramm.

CTAB-Puffer: 2% (Gew./Vol.) N-Acetyl-N,N,N-trimethylammonium bromid (CTAB); 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA.

N-Laurylsarkosin-Puffer: 10% (Gew./Vol.) N-Laurylsarkosin; 100 M Tris-HCl, pH 8,0; 20 mM EDTA.

Phaeodactylum tricornutum-Zellmaterial wurde unter flüssigem Stickstoff in einem Mörser verrieben, so dass ein feines Pulver erhalten wurde, und in 2 ml-Eppendorfgefäße überführt. Das ge frorene Pflanzenmaterial wurde dann mit einer Schicht von 1 ml Zersetzungspuffer (1 ml CTAB-Puffer, 100 ml N-Laurylsarkosin- Puffer, 20 ml β-Mercaptoethanol und 10 ml Proteinase K-Lösung, 10 mg/ml) überschichtet und eine Stunde unter kontinuierlichem Schütteln bei 60°C inkubiert. Das erhaltene Homogenat wurde in zwei Eppendorfgefäße (2 ml) aufgeteilt und zweimal durch Schütteln mit dem gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert. Zur Phasentrennung wurde eine Zentrifugation bei 8000 × g und RT (= Raumtemperatur = ∼ 23°C) jeweils 15 min lang durchgeführt. Die DNA wurde dann 30 min unter Verwendung von eiskaltem Isopropanol bei -70°C gefällt. Die gefällte DNA wurde bei 10000 g 30 min bei 4°C sedimentiert und in 180 ml TE-Puffer (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) resuspendiert. Zur weiteren Reinigung wurde die DNA mit NaCl (1,2 M Endkonzentration) behandelt und erneut 30 min unter Verwendung des zweifachen Volumens an absolutem Ethanol bei -70°C gefällt. Nach einem Waschschritt mit 70% Ethanol wurde die DNA getrocknet und anschließend in 50 ml H₂O + RNAse (50 mg/ml Endkonzentration) aufgenommen. Die DNA wurde über Nacht bei 4°C gelöst und die RNAse-Spaltung wurde anschließend 1 Std. bei 37°C durchgeführt. Die Aufbewahrung der DNA erfolgte bei 4°C.

Beispiel 3 Isolierung von Gesamt-RNA und poly(A)⁺-RNA aus Pflanzen und Phaeodactylum tricornutum

Die Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen wie Lein und Raps etc. erfolgt nach einer bei Logemann et al beschriebenen Methode (1987, Anal. Biochem. 163, 21) isoliert. Aus Moos kann die Gesamt-RNA Protonema-Gewebe nach dem GTC-Verfahren (Reski et al., 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352-359) gewonnen werden.

RNA Isolierung aus Phaeodactylum tricornutum

Tiefgefrorene Algenproben (-70°C) wurden in einem eiskalten Mörser unter Flüssigstickstoff zu feinem Pulver zerrieben. 2 Volumen Homogenisationsmedium (12,024 g Sorbitol, 40,0 ml 1 M Tris-HCl, pH 9 (0,2 M); 12,0 ml 5 M NaCl (0,3 M), 8,0 ml 250 mM EDTA, 761,0 mg EGTA, 40,0 ml 10% SDS wurden auf 200 ml mit H₂O aufgefüllt und der pH auf 8,5 eingestellt) und 4 Volumen Phenol mit 0,2% Mercaptoethanol wurden bei 40 bis 50°C unter gutem Mischen zu gefrorenem Zellpulver gegeben. Danach wurden 2 Volumen Chloroform hinzugefügt und für 15 min kräftig gerührt. Es wurde 10 min bei 10000 g zentrifugiert und die wässrige Phase mit Phenol/Chloroform (2 Vol) und abschließend mit Chloroform extrahiert.

Das erhaltene Volumen der wässrigen Phase wurde mit 1/20 Vol 4 M Na-Acetat (pH 6) und 1 Vol Isopropanol (eiskalt) versetzt und die Nukleinsäuren bei -20°C über Nacht (= ÜN) gefällt. Anschließend wurde 30 min bei 10000 g zentrifugiert und der Überstand abgesogen. Es folgte ein Waschschritt mit 70% EtOH und erneute Zentrifugation. Das Sediment wurde in Tris-Borat- Puffer (80 mM Tris-Borat-Puffer, 10 mM EDTA, pH 7,0) aufgenommen. Dann wurde der Überstand mit 1/3 Vol 8 M LiCl versetzt, gemischt und 30 min bei 4°C inkubiert. Nach erneutem Zentrifugieren wurde das Sediment mit 70% Ethanol gewaschen, zentrifugiert und das Sediment in RNAse-freiem Wasser gelöst.

Die Isolierung von poly(A)⁺-RNA erfolgte unter Verwendung von Dyna Beads® (Dynal, Oslo, Finnland) nach den Anweisungen im Protokoll des Herstellers.

Nach der Bestimmung der RNA- oder poly(A)⁺-RNA-Konzentration wurde die RNA durch Zugabe von 1/10 Volumina 3 M Natriumacetat, pH 4,6, und 2 Volumina Ethanol gefällt und bei -70°C aufbewahrt.

Für die Analyse wurden jeweils 20 µg RNA in einem Formaldehyd- haltigen 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt und auf Nylon Membranen (Hybond, Amersham) überführt. Der Nachweis spezifischer Transkripte wurde wie bei Amasino beschrieben durchgeführt ((1986) Anal. Biochem. 152, 304).

Beispiel 4 Konstruktion der cDNA-Bank

Zur Konstruktion der cDNA-Bank aus Phaeodactylum tricornutum wurde die Erststrangsynthese unter Verwendung von Reverser Transkriptase aus Maus-Leukämie-Virus (Roche, Mannheim, Deutschland) und Oligo-d(T)-Primern, die Zweitstrangsynthese durch Inkubation mit DNA-Polymerase I, Klenow-Enzym und RNAse H-Spaltung bei 12°C (2 Std.), 16°C (1 Std.) und 22°C (1 Std.) erzielt. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 65°C (10 min) gestoppt und anschließend auf Eis überführt. Doppelsträngige DNA- Moleküle wurde mit T4-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim) bei 37°C (30 min) mit glatten Enden versehen. Die Nukleotide wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Sephadex-G50-Zentrifugiersäulen entfernt. EcoRI/XhoI-Adapter (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) wurden mittels T4-DNA-Ligase (Roche, 12°C, über Nacht) an die cDNA-Enden ligiert, mit XhoI nachgeschnitten und durch Inkubation mit Polynukleotidkinase (Roche, 37°C, 30 min) phosphoryliert. Dieses Gemisch wurde der Trennung auf einem Low-Melting-Agarose- Gel unterworfen. DNA-Moleküle über 300 Basenpaaren wurden aus dem Gel eluiert, Phenol-extrahiert, auf Elutip-D-Säulen (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland) konzentriert und an Vektorarme ligiert und in lambda-ZAP-Express-Phagen unter Verwendung des Gigapack Gold-Kits (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) verpackt, wobei Material des Herstellers verwendet und seine Anweisungen befolgt wurden.

Beispiel 5 DNA-Sequenzierung und Computeranalyse

cDNA-Banken, wie im Beispiel 4 beschrieben, wurden zur DNA- Sequenzierung nach Standardverfahren, insbesondere durch das Kettenterminationsverfahren unter Verwendung des ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction-Kit (Perkin- Elmer, Weiterstadt, Deutschland), verwendet. Die Sequenzierung zufälliger, vereinzelter Klone wurde anschließend an die präparative Plasmidgewinnung aus cDNA-Banken über in vivo-Massen excision und Retransformation von DH10B auf Agarplatten durch geführt (Einzelheiten zu Material und Protokoll von Stratagene, Amsterdam, Niederlande). Plasmid-DNA wurde aus über Nacht gezüchteten E. coli-Kulturen, die in Luria-Brühe mit Ampicillin (siehe Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6)) gezüchtet worden waren, an einem Qiagen-DNA-Präparations-Roboter (Qiagen, Hilden) nach den Protokollen des Herstellers präpariert. Sequenzierprimer mit den folgenden Nukleotidsequenzen wurden verwendet:

Die Sequenzen wurden unter Verwendung des Standard-Softwarepa kets EST-MAX, das kommerziell von Bio-Max (München, Deutschland) geliefert wird, prozessiert und annotiert. Durch Nutzung von Vergleichsalgorithmen und unter Verwendung der in SEQ ID NO: 8 dargestellten Suchsequenz wurde mithilfe des BLAST-Programms nach homologen Genen gesucht (Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Zwei Sequenzen aus Phaeo dactylum tricornutum mit Homologien zur Suchsequenz aus Physco mitrella patens wurden eingehender charakterisiert.

Beispiel 5a Isolation von Desaturasen aus Phaeodactylum tri cornutum über Polymerase Kettenreaktion mit Hilfe degenerierter Oligonukleotide

Mit Hilfe von publizierten Desaturasen können Motive identifiziert werden, die für Δ-5 und Δ-6 Desaturasen typisch sind. Im folgen den sind Oligonukleotidsequenzen mit möglichen Variationen dar gestellt. Unter der Oligonukleotidsequenz ist im Ein-Buchstaben code die Aminosäure dargestellt, von der die Basenkombination abgeleitet werden kann. Z. B. bedeutet A/G, daß an dieser Position bei der Synthese des Bausteins statistisch gleichverteilt ent weder ein A oder ein G in das Oligonukleotid eingebaut wird, da das von der korrespondierenden Aminosäure abgeleitete Basen triplett entweder ein AAA oder ein AAG sein kann. Die DNA Sequenz kann auch ein Inosin (i) enthalten, wenn die Bestimmung einer Base an dieser Position aufgrund des genetischen Codes drei oder vier unterschiedliche Basen erlaubt. Folgende Sequenzen und Primer können verwendet werden:

5'-Vorwärts-Primer

3'- Reverse Primer

Aufgrund verschiedener Variationsmöglichkeiten sind viele abgeleitete Oligonukleotide möglich, jedoch überraschenderweise wurde gefunden , dass dargestellte Oligonukleotide besonders zur Isolation von Desaturasen geeignet sein können.

Die Primer können in allen Kombinationen für Polymerase Ketten reaktionen eingesetzt werden. Mithilfe einzelner Kombinationen konnten Desaturase-Fragmente isoliert werden, wenn nachfolgende Bedingungen berücksichtigt wurden: Für PCR Reaktionen wurden jeweils 10 nMol Primer und 10 ng einer durch in vivo Excision gewonnenen Plasmidbank eingesetzt. Die Plasmidbank konnte nach Protokollen des Herstellers (Stratagene) aus der Phagenbank isoliert werden. Die PCR-Reaktion wurde in einem Thermocycler (Biometra) mit der Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) und dem folgenden Temperaturprogramm durchgeführt: 3 min bei 96°C, gefolgt von 35 Zyklen mit 30 s bei 96°C, 30 s bei 55°C und 1 min bei 72°C. Dabei wurde die Anlagerungstemperatur nach dem ersten Schritt von 55°C schrittweise um je 3°C erniedrigt und nach dem fünften Zyklus eine Anlagerungstemperatur von 40°C beibehalten. Letztlich wurde ein Zyklus mit 10 min bei 72°C durchgeführt und der Ansatz durch Kühlen auf 4°C beendet.

Die Primerkombination F6a und R4a2 sind im Text unterstrichen gekennzeichnet und konnten erfolgreich zur Isolierung eines Desaturasefragmentes genutzt werden. Das resultierende Fragment konnte durch Sequenzierung verifiziert werden und zeigte Homo logien zu einer Desaturase mit der Genbank Accession Nr. T36617 aus Streptomyces coelicolor. Die Homologie wurde mit Hilfe des BLASTP Programmes erhalten. Der Vergleich ist in Fig. 4 dar gestellt. Es ergaben sich Identitäten von 34% und eine Homo logie von 43% zu Sequenz T36617. Das DNA-Fragment wurde gemäß Beispiel 7 in einem Hybridisierungsexperiment zur Isolierung eines Vollängengens nach Standardbedingungen erfindungsgemäß eingesetzt.

Die Codierregion einer so isolierten DNA-Sequenz wurde durch Übersetzung des genetischen Codes in eine Polypeptidsequenz erhalten. In SEQ ID NO: 3 ist eine 1434 Basenpaare lange Sequenz dargestellt, die durch beschriebenes Verfahren isoliert werden konnte. Die Sequenz besitzt ein Startcodon in Position 1 bis 3 und ein Stopcodon in Position 1432-1434 und konnte in ein 477 Aminosäuren langes Polypeptid übersetzt werden. Durch Ver gleich mit einer in WO 98/46763 beschriebenen Gensequenz wurde gefunden, dass ein nicht identisches aber homologes Fragment aus Phaeodactylum tricornutum codierend für 87 Aminosäuren vorbeschrieben wurde. Jedoch offenbart WO 98/46763 weder eine vollständige, funktionell aktive Desaturase noch Positions- oder Substratspezifität. Dies wird auch dadurch deutlich, dass sowohl Homologien zur Δ-5-, als auch zur Δ-6-Desaturase aus Mortierella alpina berichtet werden, ohne eine genaue Funktion festzulegen. Die erfindungsgemäße Sequenz hingegen codiert für eine funktionell aktive Δ-6-Acyl Lipid Desaturase.

Beispiel 6 Identifizierung von DNA Sequenzen codierend für Desaturasen aus Phaeodactylum tricornutum

Die Volllängensequenz der Δ-6-Acyl Lipid Desaturase Pp_des6 AJ222980 (NCBI Genbank Accession Nr.) aus dem Moos Physco mitrella patens (siehe auch Tabelle 1) sowie die Δ-12-acyl Lipid Desaturase Sequenz (Tabelle 1 siehe Ma_des12) aus Mortierella alpina AF110509 (AF110509 NCBI Genbank Accession Nr.) wurden für Sequenzvergleiche mit Hilfe des TBLASTN Suchalgorhythmus eingesetzt.

Die EST-Sequenzen PT0010070010R, PT001072031R sowie PT001078032R wurden zunächst aufgrund schwacher Homologien mit den Such sequenzen aus Physcomitrella und Mortierella unter weiteren Kandidatengenen als Zielgen in Betracht gezogen. In Fig. 1 und in Fig. 2 sowie Fig. 2a ist das Ergebnis der zwei gefundenen est-Sequenzen dargestellt. Die gefundenen Sequenzen sind Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren aus SEQ ID NO: 1 (Genname: Pt_des5, eigene Datenbank Nr. der Erfinder PT001078032R), SEQ ID NO: 5. (Genname: Pt_des12, eigene Datenbank NR. der Erfinder PT0010070010R) und SEQ ID NO: 11 (Genname: Pt_des12.2, eigene Datenbank des Erfinders PT001072031R). Buchstaben zeigen identische Aminosäuren an, während das Pluszeichen eine chemisch ähnliche Aminosäure bedeutet. Die Identitäten bzw. Homologien aller erfindungsgemäß gefundener Sequenzen gehen aus Tabelle 2 zusammenfassend hervor.

Desaturasen können Cytochrom b5 Domänen aufweisen, die auch in anderen nicht Desaturasen codierenden Genen vorkommen. Cytochrom b5 Domänen zeigen mithin hohe Homologien an, obwohl es sich um verschiedene Genfunktionen handelt. Desaturasen können schwach konservierter Bereiche lediglich als putative Kandidatengene identifiziert werden und müssen auf die Enzymaktivität und Positionsspezifität der enzymatischen Funktion hin geprüft werden. Beispielsweise zeigen auch verschiedene Hydroxylasen, Acetylenasen und Epoxygenasen ähnlich wie Desaturasen Histidin- Box Motive, so dass eine konkrete Funktion experimentell nach gewiesen werden muß und zusätzlich die Verifizierung der Doppel bindung erst eine sichere Enzymaktivität und Positionsspezifität einer Desaturase ermöglicht. Überraschenderweise wurde gefunden, dass erfindungsgemäße Δ-6- und Δ-5-Desaturase besonders geeig nete Substratspezifitäten aufweisen und besonders geeignet sind, um in Kombination mit einer Δ-6-Elongase aus Physcomitrella zur Produktion von polyungesättigten Fettsäuren wie Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure genutzt werden können.

Die Sequenzierung des vollständigen cDNA Fragmentes aus Klon PT001078032R ergab eine 1652 Basenpaare lange Sequenz. Die Sequenz codiert für ein Polypeptid von 469 Aminosäuren dar gestellt in SEQ ID NO: 2. Diese wurde erhalten durch Über setzung des genetischen Codes aus SEQ ID NO: 1 mit einem Start codon in Basenpaarposition 115-117 und mit einem Stopcodon in Basenpaarposition 1522-1524. Der Klon beinhaltet ein voll ständiges Desaturase-Polypeptid, wie aus dem Sequenzvergleich in Fig. 3 zu ersehen ist. Striche bedeuten identische Amino säuren während Doppelpunkte und Einzelpunkte chemisch aus tauschbare, d. h. chemisch äquivalente Aminosäuren darstellen. Der Vergleich wurde mit der BLOSUM62 Austauschmatrix für Amino säuren nach Henikoff & Henikoff durchgeführt: ((1992) Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919). Verwendete Parameter: Gap Weight: 8; Average Match: 2.912, Length Weight: 2, Average Mismatch: -2.003.

In Fig. 6 und Fig. 7 ist der Vergleich der MA_des12 Peptid sequenz mit den gefundenen Sequenzen dargestellt.

Die Sequenzierung des vollständigen cDNA Fragmentes aus Klon PT0010070010R ergab eine in SEQ ID NO: 5 dargestellte 1651 Basen paare lange Sequenz mit einem Startcodon in Position 67-69 und einem Stopcodon in Position 1552-1554. Die erfindungsgemäße Poly petidsequenz ist in SEQ ID NO: 6 dargestellt.

Die Sequenzierung des vollständigen identifizierten cDNA Fragmentes aus Klon PT0010072031R ergab eine in SEQ ID NO: 11 dargestellte 1526 Basenpaare lange Sequenz mit einem Startcodon in Position 92-94 und einem Stopcodon in Position 1400-1402. Die erfindungsgemäße Polypetidsequenz ist in SEQ ID NO: 12 dargestellt.

In Tabelle 2 sind die Identitäten und Homologien erfindungs gemäßer Desaturasen untereinander und mit der Desaturase aus Physcomitrella patens und Mortierella alpina dargestellt. Die Angaben wurden mit Hilfe des Programms Bestfit unter gegebenen Parametern wie unten definiert als Teilprogramm folgender Soft ware erhalten: Wisconsin Package Version 10.0 (Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc., USA). Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.

Weiterhin ist in Fig. 5 der Vergleich der Δ-6-acyl Lipid Desaturase aus Physaomitrella patens mit der Polypeptidsequenz des Klons Pt_des6 dargestellt.

Tabelle 2

n. d. = nicht durchgeführt

Mit Hilfe des Algorhythmus TBLASTN 2.0.10: Altschul et al 1997, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 wurden über einen lokalen Datenbankvergleich Sequenzen mit höchster Sequenz homologie bzw. Identität identifiziert. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 2A dargestellt.

Tabelle 2A

Homologe mit den höchsten Sequenzhomologien bzw. Identitäten zu erfindungsgemäßen Polypeptidsequenzen aus SEQ ID NO. 2, 4, 6 oder 12

Beispiel 7 Identifikation von Genen mittels Hybridisierung

Gensequenzen lassen sich zur Identifikation homologer oder heterologer Gene aus cDNA- oder genomischen Banken verwenden.

Homologe Gene (d. h. Voll-Längen-cDNA-Klone, die homolog sind, oder Homologen) lassen sich über Nukleinsäurehybridisierung unter Verwendung von beispielsweise cDNA-Banken isolieren: Ins besondere zur Isolierung von funktionell aktiven Voll-Längengenen der in SEQ ID NO: 3 gezeigten kann die Methode genutzt werden. Je nach der Häufigkeit des Gens von Interesse werden 100000 bis zu 1000000 rekombinante Bakteriophagen plattiert und auf eine Nylonmembran überführt. Nach der Denaturierung mit Alkali wurde die DNA auf der Membran z. B. durch UV-Vernetzung immobilisiert. Die Hybridisierung erfolgt bei hoch-stringenten Bedingungen. In wässriger Lösung werden die Hybridisierung und die Waschschritte bei einer Ionenstärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68°C durchgeführt. Hybridisierungssonden wurden z. B. durch Markierung mittels radioaktiver (³²P-) Nicktranskription (High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland) hergestellt. Die Signale werden mittels Autoradiographie nachgewiesen.

Partiell homologe oder heterologe Gene, die verwandt, aber nicht identisch sind, lassen sich analog zum oben beschriebenen Ver fahren unter Verwendung niedrig-stringenter Hybridisierungs- und Waschbedingungen identifizieren. Für die wässrige Hybridisierung wurde die Ionenstärke gewöhnlich bei 1 M NaCl gehalten, wobei die Temperatur nach und nach von 68 auf 42°C gesenkt wurde.

Die Isolierung von Gensequenzen, die nur zu einer einzelnen Domäne von beispielsweise 10 bis 20 Aminosäuren Homologien auf weisen, lässt sich unter Verwendung synthetischer, radioaktiv markierter Oligonukleotidsonden durchführen. Radioaktiv markierte Oligonukleotide werden mittels Phosphorylierung des 5'-Endes zweier komplementärer Oligonukleotide mit T4-Polynukleotidkinase hergestellt. Die komplementären Oligonukleotide werden aneinander hybridisiert und ligiert, so dass Konkatemere entstehen. Die doppelsträngigen Konkatemere werden beispielsweisg durch Nick transkription radioaktiv markiert. Die Hybridisierung erfolgt gewöhnlich bei niedrig-stringenten Bedingungen unter Verwendung hoher Oligonukleotidkonzentrationen.

Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:
6 × SSC
0,01 M Natriumphosphat
1 mM EDTA (pH 8)
0,5% SDS
100 mikrog/ml denaturierte Lachssperma-DNA
0,1% fettarme Trockenmilch

Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise auf 5 bis 10°C unter die berechnete Oligonukleotid-Tm oder bis auf Raum temperatur (bedeutet RT = ∼ 23°C in allen Experimenten, wenn nicht anders angegeben) gesenkt, gefolgt von Waschschritten und Auto radiographie. Das Waschen wird mit extrem niedriger Stringenz durchgeführt, zum Beispiel 3 Waschschritte unter Verwendung von 4 × SSC. Weitere Einzelheiten sind wie von Sambrook, J., et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder Ausubel, F. M., et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, beschrieben.

Beispiel 8 Identifikation von Zielgenen durch Sichtung von Expressionsbanken mit Antikörpern

Es wurden cDNA-Sequenzen zur Herstellung von rekombinantem Protein zum Beispiel in E. coli verwendet (z. B. Qiagen QIAexpress pQE-System). Die rekombinanten Proteine wurden dann gewöhnlich über Ni-NTA-Affinitätschromatographie (Qiagen) affinitäts gereinigt. Die rekombinanten Proteine wurden dann zur Herstellung spezifischer Antikörper beispielsweise unter Verwendung von Standardtechniken zur Immunisierung von Kaninchen verwendet. Anschließend wurden die Antikörper dann unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule, die mit rekombinantem Antigen vorgesättigt wird, affinitätsgereinigt, wie von Gu et al., (1994) BioTechniques 17: 257-262 beschrieben. Der Antikörper kann dann zur Durch musterung von Expressions-cDNA-Banken mittels immunologischer Sichtung verwendet werden (Sambrook, J., et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder Ausubel, F. M., et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).

Beispiel 9 Transformation von Agrobacterium

Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung des GV3101- (pMP90-) (Koncz und Schell, Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 383-396) oder LBA4404- (Clontech) oder C58C1 pGV2260 (Deblaere et al 1984, Nucl. Acids Res. 13, 4777-4788) Agrobacterium tumefaciens-Stamms durchgeführt werden. Die Transformation kann durch Standard-Transformationstechniken durchgeführt werden (ebenfalls Deblaere et al. 1984).

Beispiel 10 Pflanzentransformation

Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann unter Verwendung von Standard-Transformations- und Regenerations techniken durchgeführt werden (Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0-8493-5164-2).

Beispielsweise kann Raps mittels Kotyledonen- oder Hypokotyl transformation transformiert werden (Moloney et al., Plant Cell 8 (1989) 238-242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989) 694-701). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab. Die Rapsselektion wird gewöhnlich unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker durchgeführt.

Der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer in Lein (Linum usitatissimum) lässt sich unter Verwendung von beispielsweise einer von Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13; 282-285 beschriebenen Technik durchführen.

Die Transformation von Soja kann unter Verwendung von beispiels weise einer in EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) oder in EP A 0 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo) beschriebenen Technik durchgeführt werden.

Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchen beschuss, Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder über die Siliziumcarbonatfaser-Technik ist beispielsweise be schrieben von Freeling und Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York).

Beispiel 11 Plasmide für die Pflanzentransformation Geeignete binäre Vektoren und Transformationsmarker

Zur Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) oder pGPTV (Becker et al. 1992, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197) verwen det werden. Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Li gation der cDNA in Sense- oder Antisense-Orientierung in T- DNA erfolgen. 5' der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich 3' von der cDNA. Die binären Vektoren können unterschiedli che Markergene tragen. So kann etwa die Resistenz durch die Ex pression des nptII Markergens unter Kontrolle des 35S oder des nos Promoters erfolgen. Insbesondere kann das nptII-Markergen co dierend für Kanamycin-Resistenz vermittelt durch Neomycinphospho transferase gegen die herbizidresistente Form eines Acetolactat Synthasegens (AHAS oder ALS) ausgetauscht werden. Das ALS-Gen ist beschrieben in Ott et al., J. Mol. Biol. 1996, 263: 359-360. Geei gnet für manche Pflanzen ist auch die Verwendung des Hygromycin- Resistenz-Gens. Der v-ATPase-c1-Promotor kann in das Plasmid pBin19 oder pGPTV kloniert werden und durch Klonierung vor die kodierende Region des ALS Gens für die Markergenexpression ge nutzt werden. Der genannte v-ATPase-c1-Promotor entspricht einem 1153 Basenpaarfragment aus Beta vulgaris (Plant Mol Biol, 1999, 39: 463-475). Der genannte nos Promoter Dabei können sowohl Sul phonylharnstoffe als auch Imidazolinone wie Imazethapyr oder Sul phonylharnstoffe als Antimetaboliten zur Selektion verwendet wer den. Alternativ kann auch der nos-Promoter für die Markergenex pression verwendet werden.

Beispiel 12 Ermittlung von geeigneten Promotoren für die Expression in Lein

Die gewebespezifische Expression lässt sich unter Verwendung ei nes gewebespezifischen Promotors erzielen. Beispielsweise kann die samenspezifische Expression erreicht werden, indem der DC3- oder der LeB4- oder der USP-Promotor oder der Phaseolin-Promotor 5' der cDNA einkloniert wird. Auch jedes andere samenspezifische Promotorelement wie z. B. der Napin- oder Arcelin Promotor (Goos sens et al. 1999, Plant Phys. 120(4): 1095-1103 und Gerhardt et al. 2000, Hiochimica et Biophysica Acta 1490(1-2): 87-98) kann verwendet werden. Zur konstitutiven Expression in der ganzen Pflanze lässt sich der CaMV-35S-Promotor oder ein v-ATPase-c1 Promotor verwenden.

Um die Eigenschaften des Promotors zu bestimmen und die essen tiellen Elemente desselben, die seine Gewebespezifität ausmachen, zu identifizieren, ist es erforderlich, den Promotor selbst oder verschiedene Fragmente desselben vor ein sogenanntes Reportergen zu setzen, das eine Bestimmung der Expressionssaktivität ermög licht. Beispielhaft für ein Reportergen sei die bakterielle β-Glucuronidase (GUS) genannt (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907). Die β-Glucuronidase Aktivität kann in-situ mittels eines chromogenen Substrates wie 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl- β-D-Glucuronsäure im Rahmen einer Aktivitätsfärbung bestimmt wer den (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387-405). Für die Untersuchungen der Gewebespezifität wird das pflanzliche Gewebe geschnitten, eingebettet, gefärbt und analy siert wie beschrieben (z. B. Bäumlein H et al., 1991 Mol Gen Genet 225: 121-128).

Fluorimetrischer GUS-Test (nach Montgomery et al., 1993)

Dieser Assay erlaubt eine quantitative Bestimmung der GUS-Aktivi tät in dem untersuchten Gewebe. Für die quantitative Aktivitäts bestimmung wird als Substrat für die b-Glucuronidase MUG (4-Me thyl-umbelliferyl-beta-D-glucuronid) verwendet, das in MU (Me thyl-umbelliferon) und Glucuronsäure gespalten wird.

Dabei wird zunächst ein Proteinextrakt des gewünschten Gewebe hergestellt, dem dann das Substrat der GUS zugesetzt wird. Das Substrat ist erst nach der Umsetzung durch GUS fluorimetrisch messbar. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Proben entnommen, die anschließend im Fluorimeter gemessen werden. Dieser Test wurde mit Leinembryonen verschiedener Altersstadien durchgeführt (21, 24 oder 30 Tage nach Beginn der Blüte, daf = days after flo wering). Dazu wurde je ein Embryo in einem 2 ml-Reaktionsgefäß mit Hilfe einer Schwingmühle (Retsch MM 2000) in flüssigem Stick stoff zu Pulver zerrieben. Nach Zugabe von 100 ml EGL-Puffer wurde für 10 min bei 25°C und 14000 × g zentrifugiert. Der Über stand wurde abgenommen und ein zweites Mal zentrifugiert. Wieder wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bis zur weiteren Verwendung auf Eis gehalten. Von diesem Proteinex trakt wurden 25 ml mit 65 ml EGL-Puffer (ohne DTT) versetzt und für den GUS-Assay eingesetzt. Nun wurden 10 ml des Substrates MUG (10 mM 4-Methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronid) dazugegeben, gevor text und sofort 30 ml als Nullwert entnommen und mit 470 ml Stopp-Puffer (0,2 M Na₂CO₃) versetzt. Dieser Vorgang wurde für alle Proben in einem Abstand von 30 s wiederholt. Die entnommenen Proben wurden bis zur Messung im Kühlschrank gelagert. Weitere Messwerte wurden nach 1 h und nach 2 h entnommen. Für die Messung im Fluorimeter wurde eine Eichreihe erstellt, die Konzentrationen von 0,1 mM bis 10 mM MU (4-Methyl-umbelliferon) enthielt. Waren die Probenwerte außerhalb dieser Konzentrationen, wurde weniger Proteinextrakt eingesetzt (10 ml, 1 ml, 1 ml aus 1 : 10 Verdün nung), und es wurden kürzere Zeitabstände gemessen (0 h, 30 min, 1 h). Die Messung erfolgte bei einer Exitation von 365 nm und ei ner Emission von 445 nm in einem Fluoroscan II-Gerät (Labsystem). Alternativ kann die Substratspaltung unter alkalischen Bedingun gen fluorometrisch verfolgt werden (Anregung bei 365 nm, Messung der Emission bei 455 nm; SpectroFluorimeter BMG Polarstar+) wie beschrieben in Bustos M. M. et al., 1989 Plant Cell 1: 839-853. Alle Proben wurden einer Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford (1976) unterzogen, um so eine Aussage über die Promote raktivität und -stärke in verschiedenen Geweben und Pflanzen er lauben.

EGL-Puffer

0,1 M	KPO₄, pH 7,8
1 mM	EDTA
5%	Glycerin
1 M	DTT

Als weitere Beispiele für Reportergene, die äquivalent benutzt werden können, seien beispielhaft das grün fluoreszierende Pro tein (GFP) und dessen Derivate genannt (C. Reichel et al. (1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93, 5888-5893 und J. Sheen et al., (1995) Plant Journal 8, 777-784) und verschiedene Luciferasen (A. Millar et al. (1992) Plant Mol. Biol. Reporter 10, 324-414). Die ent sprechenden Detektionsmethoden sind dem Fachmann bekannt und z. B. in genannter Literatur beschrieben.

Beispiele für Promoter-Reportergen-Konstrukte für oben genannte Promotoren sind im folgenden gegeben. Von diesen Promotoren kön nen Fragmente mithilfe der Polymerasekettenreaktion isoliert und mit flankierenden Sequenzen nach Wahl auf Basis von synthetischen Oligonukleotiden maßgeschneidert werden.

Folgende Oligonukleotide können beispielsweise verwendet werden:

Die Methoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind allgemein literaturbekannt.

In einem ersten Schritt werden die Promotorfragmente über PCR am plifiziert, mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten und in die obigen Kassetten einkloniert. Beispielsweise wird das LeB4(700)-PCR-Fragment mit XbaI und HindIII geschnitten und in den Vektor pGPTV in die HindIII- und XbaI-Schnittstellen 5' vor dem GUS Reportergen kloniert. Das PCR-amplifizierte DC3-Promoter fragment kann mit BamHI und HindIII geschnitten, z. B. in pBlues cript (Stratagene) subkloniert und dann in pGPTV in geeignete Schnittstellen vor das GUS-Reportergen kloniert werden.

Beispielsweise kann ein mit obigen Primern PCR-amplifiziertes na pin-Promotorfragment mit einer Größe von 1055 bp nach Verdau mit HindIII und XbaI in pGPTV vor das GUS Reportergen einkloniert werden. Ein äquivalentes Konstrukt könnte ein Napin-Promoterfrag ment von 1100 bp 5'-kloniert vor ein GUS Reportergen mit Intron mit in 3' Richtung nachfolgendem Nos-Terminator in einem pHL9000-Vektor (Hausmann & Töpfer, 1999) sein.

Unter Verwendung von oben beschriebenen oder äquivalenten Kon strukten nach Transformation in Lein der Sorte Flanders, läßt sich die GUS-Aktivität in transgenen Leinembryonen verschiedener Altersstadien messen, die mit einem der folgenden Konstrukte transformiert wurden: Napin-GUS, 35S-GUS, LeB4-GUS, USP-GUS. Die Werte sind Mittelwerte aus ein bis fünf Messungen mit verschiede nen Proteinmengen. Pro Konstrukt wurden je drei Embryonen quanti tativ analysiert.

In der quantitativen Analyse ergaben sich große Unterschiede zwi schen den verschiedenen samenspezifischen Promotoren. Der Napin Promotor aus Brassica napus erwies sich als um zwei bis drei Zehnerpotenzen weniger aktiv als die beiden Promotoren aus Vicia faba (LeB4 und USP). Die GUS-Aktivität nahm in der Reihenfolge Napin, LeB4 und USP zu. Die Positivkontrolle 35S bewegte sich in ihrer Aktivität zwischen LeB4 und USP, wohingegen die Negativkon trolle, der nicht transformierte Wildtyp (Sorte Flanders), so gut wie keine Aktivität besaß. Die folgende Tabelle gibt die Mittel werte der Aktivitäten in den einzelnen Altersstadien sowie gesamt für jedes Konstrukt wieder.

Tabelle 3.4 Übersicht über die mittleren GUS-Aktivitäten von Leinembryonen, transformiert mit verschiedenen GUS-Konstrukten daf: Tage nach Beginn der Blüte.

Mit * markiert wurden Werte, die nur einer Messung zugrundelie gen.

Beispiel 13 Plasmide für die Pflanzentransformation

Zur Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) oder pGPTV (Becker et al 1992, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197) oder Derivate davon verwendet werden. Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in Sense- oder Antisense- Orientierung in T-DNA erfolgen. 5' der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylie rungssequenz befindet sich 3' von der cDNA. Die binären Vektoren können unterschiedliche Markergene tragen. Insbesondere kann das nptII-Markergen codierend für Kanamycin-Resistenz vermittelt durch Neomycinphosphotransferase gegen die herbizidresistente Form eines Acetolactat Synthasegens (Abkürzung: AHAS oder ALS) ausgetauscht werden. Das ALS-Gen ist beschrieben in Ott et al., J. Mol. Biol. 1996, 263: 359-360. Der v-ATPase-c1-Promotor kann in das Plasmid pBin19 oder pGPTV kloniert werden und durch Klonie rung vor das ALS Codierregion für die Markergenexpression genutzt werden. Der genannte Promotor entspricht einem 1153 Basenpaar fragment aus beta-Vulgaris (Plant Mol Biol, 1999, 39: 463-475). Dabei können sowohl Sulphonylharnstoffe als auch Imidazolinone wie Imazethapyr oder Sulphonylharnstoffe als Antimetaboliten zur Selektion verwendet werden.

Die gewebespezifische Expression lässt sich unter Verwendung eines gewebespezifischen Promotors erzielen. Beispielsweise kann die samenspezifische Expression erreicht werden, indem der DC3- oder der LeB4- oder der USP-Promotor oder der Phaseolin-Promotor 5' der cDNA einkloniert wird. Auch jedes andere samenspezifische Promotorelement wie z. B. der Napin- oder Arcelin Promotor (Goossens et al. 1999, Plant Phys. 120(4): 1095-1103 und Gerhardt et al. 2000, Biochimica et Biophysica Acta 1490(1-2): 87-98) kann verwendet werden. Zur konstitutiven Expression in der ganzen Pflanze lässt sich der CaMV-35S-Promotor oder ein v-ATPase C1 Promotor verwenden.

Insbesondere lassen sich Gene codierend für Desaturasen und Elongasen durch Konstruktion mehrerer Expressionskassetten hintereinander in einen binären Vektor klonieren, um den Stoffwechselweg in Pflanzen nachzubilden.

Innerhalb einer Expressionskassette kann das zu exprimierende Protein unter Verwendung eines Signalpeptids, beispielsweise für Plastiden, Mitochondrien oder das Endoplasmatische Retikulum, in ein zelluläres Kompartiment dirigiert werden (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423). Das Signalpeptid wird 5' im Leseraster mit der cDNA einkloniert, um die subzelluläre Lokali sierung des Fusionsprotein zu erreichen.

Beispiele für Multiexpressionskassetten sind im folgenden gegeben.

I.) Promotor-Terminator-Kassetten

Expressionskassetten bestehen aus wenigstens zwei funktionellen Einheiten wie einem Promotor und einem Terminator. Zwischen Promotor und Terminator können weitere gewünschte Gensequenzen wie Targetting-Sequenzen, Codierregionen von Genen oder Teilen davon etc. eingefügt werden. Zum Aufbau von Expressionskassetten werden Promotoren und Terminatoren (USP Promotor: Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67 ); OCS Terminator: Gielen et al. EMBO J. 3 (1984) 835ff.) mit Hilfe der Polymerase kettenreaktion isoliert und mit flankierenden Sequenzen nach Wahl auf Basis von synthetischen Oligonukleotiden maßgeschneidert.

Folgende Oligonukleide können beispielsweise verwendet werden:

In einem ersten Schritt werden ein Promotor und ein Terminator über PCR amplifiziert. Dann wird der Terminator in ein Empfänger plasmid kloniert und in einem zweiten Schritt der Promotor vor den Terminator inseriert. Mithin erhält man eine Expressions kassette auf einem Trägerplasmid. Auf Basis des Plamides pUC19 werden die Plasmide pUT1, pUT2 und pUT3 erstellt.

Die Konstrukte sind erfindungsgemäß in SEQ ID NO: 13, 14 und 15 definiert. Sie enthalten auf Basis von pUC19 den USP-Promotor und den OCS Terminator. Auf Basis dieser Plasmide wird das Konstrukt pUT12 erstellt, indem pUT1 mittels SalI/ScaI geschnitten wird und pUT2 mittels XhoI/ScaI geschnitten wird. Die die Expressions kassetten enthaltenden Fragmente werden ligiert und in E. coli XLI blue MRF transformiert. Es wird nach Vereinzelung ampicillin resistenter Kolonien DNA präpariert und per Restriktionsanalyse solche Klone identifiziert, die zwei Expressionskassetten ent halten. Die XhoI/SalI Ligation kompatibler Enden hat dabei die beiden Schnittstellen XhoI und SalI zwischen den Ezpressions kassetten eliminiert. Es resultiert das Plasmid pUT12, das in SEQ ID NO: 16 definiert ist. Anschließend wird pUT12 wiederum mittels Sal/ScaI geschnitten und pUT3 mittels XhoI/ScaI ge schnitten. Die die Expressionskassetten enthaltenden Fragmente werden ligiert und in E. coli XLI blue MRF transformiert. Es wird nach Vereinzelung ampicillinresistenter Kolonien DNA präpariert und per Restriktionsanalyse solche Klone identifiziert, die drei Expressionskassetten enthalten. Auf diese Weise wird ein Set von Multiexpressionskassetten geschaffen, dass für die Insertion ge wünschter DNA genutzt werden kann und in Tabelle 3 beschrieben wird und zudem noch weitere Expressionskassetten aufnehmen kann.

Diese enthalten folgende Elemente:

Tabelle 3

Weiterhin lassen sich wie beschrieben und wie in Tabelle 4 näher spezifiziert weitere Multiexpressionskassetten mit Hilfe des

a) USP-Promotors oder mit Hilfe des
b) ca. 700 Basenpaare 3'-Fragmentes des LeB4-Promotors oder mit Hilfe des
c) DC3-Promotors erzeugen und für samenspezifische Genexpression einsetzen.

Der DC3-Promotor ist beschrieben bei Thomas, Plant Cell 1996, 263: 359-368 und besteht lediglich aus der Region -117 bis +27, weshalb er mithin einer der kleinsten bekannten samenspezifischen Promotoren darstellt.

Von diesen Promotoren können Fragmente mit Hilfe der Polymerase kettenreaktion isoliert und mit flankierenden Sequenzen nach Wahl auf Basis von synthetischen Oligonukleotiden maßgeschneidert wer den.

Folgende Oligonukleotide können beispielsweise verwendet werden:

In einem ersten Schritt werden die Promotorfragmente über PCR am plifiziert, mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten und in die obigen Kassetten einkloniert. Beispielsweise wird das LeB4(700)-PCR-Fragment mit XhoI und BglII geschnitten und in die XhoI und BglII-Schnittstellen des Plasmids pUT3 eingesetzt, um pLT3 zu erhalten.

Vorteilhafte Expressionskassetten enthalten auf Basis von pUC19 (Vieira und Messing (1982); Gene 19, 259) die SEQ ID NO: 32, den LeB4-Promotor und die Sequenzen SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 oder SEQ ID NO: 35. Auf Basis dieser Plasmide wird das Konstrukt pLT12 erstellt, indem pUT1 mittels SalI/ScaI geschnitten wird und pUT2 mittels XhoI/ScaI geschnitten wird. Die die Expressionskassetten enthaltenden Fragmente werden ligiert und in E. coli XLI blue MRF transformiert. Es wird nach Vereinzelung Ampicillin-resistenter Kolonien DNA präpariert und per Restriktionsanalyse solche Klone identifiziert, die zwei Expressionskassetten enthalten. Die XhoI /SalI Ligation kompatibler Enden hat dabei die beiden Schnittstel len XhoI und SalI zwischen den Expressionskassetten eliminiert. Es resultiert das Plasmid pUT12, das in SEQ ID NO: 16 definiert ist. Anschließend wird pUT12 wiederum mittels Sal/ScaI geschnit ten und pUT3 mittels XhoI/ScaI geschnitten. Die die Expressions kassetten enthaltenden Fragmente werden ligiert und in E. coli XLI blue MRF transformiert. Es wird nach Vereinzelung Ampicillin- resistenter Kolonien DNA präpariert und per Restriktionsanalyse solche Klone identifiziert, die drei Expressionskassetten enthal ten. Auf diese Weise wird eine Auswahl von Multiexpressionskas setten geschaffen, die für die Insertion gewünschter DNA genutzt werden kann und in Tabelle 3 beschrieben wird und zudem noch wei tere Expressionskassetten aufnehmen kann.

Die Expressionskassetten können mehrfach den selben Promotor ent halten oder aber über drei verschiedene Promotoren aufgebaut wer den.

Tabelle 4

Multiple Expressionskassetten

* EcoRV Schnittstelle schneidet im 700 Basenpaarfragment des LeB4 Promotors (LeB4-700)

Analog lassen sich weitere Promotoren für Multigenkonstrukte erzeugen, insbesondere unter Verwendung des

a) 2,4 kB Fragmentes des LeB4-Promotors (Bäumlein et al., 1991: Mol.Gen.Genet. 225, 121-128) oder mit Hilfe des
b) Phaseolin-Promotors (Bustos et al. (1989) Plant Cell 1, 839-853) oder mit Hilfe des
c) konstitutiven v-ATPase c1-Promotors.

Es kann insbesondere wünschenswert sein, weitere besonders geei gnete Promotoren zum Aufbau samenspezifischer Multiexpressions kassetten, wie z. B. eines der Fragmente des Napin-Promotors (Stal berg et al., 1993: Plant Mol. Biol. 23, 671-683) oder den Arcelin-5 Promotor (A. Goossens et al., 1999: plant Physiol. 120, 1095-1104), zu verwenden.

ii) Erstellung von Expressionskonstrukten in pUC19- oder pGPTV Derivaten, die Promotor und Terminator erhalten und in Kombination mit gewünschten Gensequenzen zur PUFA Gen expression in pflanzlichen Expressionskassetten enthalten

Multiexpressionskassetten können mittels AscI direkt von pUC19-Derivaten aus Tabelle 3 in den Vektor pGPTV+AscI (siehe iii.)) über die AscI Schnittstelle inseriert werden und stehen zur Inserierung von Zielgenen zur Verfügung. Die entsprechenden Genkonstrukte (pBUT1 ist in SEQUENZ ID NO: 20, pBUT2 ist in SEQUENZ ID NO: 21, pBUT3 ist in SEQUENZ ID NO: 22, pBUT12 ist in SEQUENZ ID NO: 22 und pBUT123 ist in SEQUENZ ID NO: 24 dargestellt) stehen erfindunsgemäß als Kit zur Verfügung. Alternativ können Gensequenzen in die pUC19 basierten Expressionskassetten inseriert werden und als AscI Fragment in pGPTV+AscI eingesetzt werden.

In pUT12 wird zunächst über BstXI und XbaI die Δ-6-Elongase Pp_PSE1 in die erste Kassette inseriert. Dann wird die Δ-6-Desaturase aus Moos (Pp_des6) über BamHI/NaeI in die zweite Kassette inseriert. Es entsteht das Konstrukt pUT-ED. Das AscI Fragment aus dem Plasmid pUT-ED wird in den mit AscI ge schnittenen Vektor pGPTV+AscI inseriert und die Orientierung des inserierten Fragmentes mittels Restriktion oder Sequenzierung ermittelt. Es entsteht das Plasmid pB-DHGLA, dessen vollständige Sequenz in SEQUENZ ID NO: 25 dargestellt ist. Die Codierregion der Physcomitrella delta 6 Elongase ist in SEQUENZ ID NO: 26 dargestellt, die der delta 6 Desaturase aus Physcomitrella in SEQUENZ ID NO: 27.

In pUT123 wird zunächst über BstXI und XbaI die Δ-6-Elongase Pp_PSE1 in die erste Kassette inseriert. Dann wird die Δ-6-Desaturase aus Moos (Pp_des6) über BamHI/NaeI in die zweite Kassette inseriert und schließlich die Δ-5-Desaturase aus Phaeodactylum (Pt_des5) über BglII in die dritte Kassette inseriert. Das Dreifachkonstrukt erhält den Namen pARA1. Unter Berücksichtigung sequenzspezifischer Restriktionsschnittstellen können weitere Expressionskassetten gemäß Tabelle 5 mit der Bezeichnung pARA2, pARA3 und pARA4 erstellt werden.

Das AscI Fragment aus dem Plasmid pARA1 wird in den mit AscI geschnittenen Vektor pGPTV+AscI inseriert und die Orientierung des inserierten Fragmentes mittels Restriktion oder Sequenzierung ermittelt. Die vollständige Sequenz des resultierenden Plasmides pBARA1 ist in SEQUENZ ID NO. 28 dargestellt. Die Codierregion der Physcomitrella delta 6 Elongase ist in SEQUENZ ID NO. 29 dargestellt, die der delta 6 Desaturase aus Physcomitrella in SEQUENZ ID NO: 30 und die der delta-5 Desaturase aus Phaeodactylum tricornutum in SEQUENZ ID NO: 31.

Tabelle 5

Kombinationen von Desaturasen und Elongasen

Plasmide 1 bis 5 sind pUC Derivate, Plasmide 6 bis 7 sind binäre Pflanzentransformationsvektoren
Pp = Physcomitrella patens, Pt = Phaeodactylum tricornutum
Pp_PSE1 entspricht der Sequenz aus SEQ ID NO: 9.
PSE = PUFA spezifische Δ-6-Elongase
Ce_des5 = Δ-5-Desaturase aus Caenorhabditiselegans (Genbanic-Acc. Nr. AF078796)
Ce_des6 = Δ-6-Desaturase aus Caenorhabditis elegans (Genbank Acc. Nr. AF031477, Basen 11-1342)
Ce_PSE1 = Δ-6-Elongase aus Caenorhabditis elegans (Genbank Acc. Nr. AF244356, Basen 1-867)

Auch weitere Desaturasen oder Elongasegensequenzen können in Expressionskassetten beschriebener Art inseriert werden wie z. B. Genbank Acc. Nr. AF231981, NM_013402, AF206662, AF268031, AF226273, AF110510 oder AF110509.

iii) Transfer von Expressionskassetten in Vektoren zur Transformation von Agrobakterium tumefaciens und zur Transformation von Pflanzen

Chimäre Genkonstrukte auf Basis der in pUC19 beschriebenen können mittels AscI in den binären Vektor pGPTV inseriert. Die multiple Klonierungssequenz wird zu diesem Zweck um eine AscI Schnitt stelle erweitert. Zu diesem Zweck wird der Polylinker als zwei doppelsträngige Oligonukleotide neu synthetisiert, wobei eine zu sätzliche AscI DNA Sequenz eingefügt wird. Das Oligonukleotid wird mittels EcoRI und HindIII in den Vektor pGPTV inseriert. Es entsteht das Plasmid pGPTV+AscI. Die notwendigen Kloniertechniken sind dem Fachmann bekannt und können einfach wie in Beispiel 1 beschrieben nachgelesen werden.

Beispiel 14 In vivo-Mutagenese

Die in vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann mittels Passage der Plasmid- (oder einer anderen Vektor-) DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z. B. Bacillus spp. oder Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae), bei denen die Fähigkeiten, die Unversehrtheit ihrer genetischen Information aufrechtzuerhalten, gestört ist, erfolgen. Übliche Mutator-Stämme haben Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem (z. B. mutHLS, mutD, mutT usw.; als Literaturstelle siehe Rupp, W. D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, S. 2277-2294, ASM: Washington). Diese Stämme sind dem Fachmann bekannt. Die Verwendung dieser Stämme ist beispielsweise in Greener, A., und Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32-34, erläutert. Der Transfer mutierter DNA-Moleküle in Pflanzen erfolgt vorzugsweise nach Selektion und Test der Mikrooganismen. Transgene Pflanzen werden nach verschiedenen Beispielen im Beispielteil dieses Dokumentes erzeugt.

Beispiel 15 Untersuchung der Expression eines rekombinanten Genproduktes in einem transformierten Organismus

Die Aktivität eines rekombinanten Genproduktes im transformierten Wirtsorganismus kann auf der Transkriptions- und/oder der Translationsebene gemessen werden.

Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Menge an Transkription des Gens (ein Hinweis auf die Menge an RNA, die für die Translation des Genproduktes zur Verfügung steht) ist die Durchführung eines Northern-Blots wie unten ausgeführt (als Bezugsstelle siehe Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York, oder den oben erwähnten Beispielteil), wobei ein Primer, der so gestaltet ist, dass er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren Markierung (gewöhnlich radioaktiv oder chemilumineszent) markiert wird, so dass, wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix transferiert und mit dieser Sonde inkubiert wird, die Bindung und das Ausmaß der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge der mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information zeigt den Grad der Transkription des transformierten Gens an. Zelluläre Gesamt-RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen mit mehreren Verfahren, die alle im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel das von Bormann, E. R., et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326 beschriebene, präpariert werden.

Northern-Hybridisierung

Für die RNA-Hybridisierung wurden 20 µg Gesamt-RNA oder 1 µg poly(A)⁺-RNA mittels Gelelektrophorese in Agarosegelen mit einer Stärke von 1,25% unter Verwendung von Formaldehyd, wie beschrieben in Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304) auf getrennt, mittels Kapillaranziehung unter Verwendung von 10 × SSC auf positiv geladene Nylonmembranen (Hybond N+, Amersham, Braunschweig) übertragen, mittels UV-Licht immobilisiert und 3 Stunden bei 68°C unter Verwendung von Hybridisierungspuffer (10% Dextransulfat Gew./Vol., 1 M NaCl, 1% SDS, 100 mg Herings sperma-DNA) vorhybridisiert. Die Markierung der DNA-Sonde mit dem Highprime DNA labeling-Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) erfolgte während der Vorhybridisierung unter Verwendung von alpha-³²P-dCTP (Amersham, Braunschweig, Deutschland). Die Hybridi sierung wurde nach Zugabe der markierten DNA-Sonde im gleichen Puffer bei 68°C über Nacht durchgeführt. Die Waschschritte wurden zweimal für 15 min unter Verwendung von 2 × SSC und zweimal für 30 min unter Verwendung von 1 × SSC, 1% SDS, bei 68°C durch geführt. Die Exposition der verschlossenen Filter wurde bei -70°C für einen Zeitraum von 1 bis 14 T durchgeführt.

Zur Untersuchung des Vorliegens oder der relativen Menge an von dieser mRNA translatiertem Protein können Standardtechniken, wie ein Western-Blot, eingesetzt werden (siehe beispielsweise Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Bei diesem Verfahren werden die zellulären Gesamt- Proteine extrahiert, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Matrix, wie Nitrozellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, der spezifisch an das gewünschte Protein bindet, inkubiert. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszenten oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen lässt. Das Vorliegen und die Menge der beobachteten Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gewünschten, in der Zelle vorliegenden mutierten Proteins an.

Beispiel 16 Analyse der Auswirkung der rekombinanten Proteine auf die Produktion des gewünschten Produktes

Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen, Pilzen, Algen, Ciliaten oder auf die Produktion einer gewünschten Ver bindung (wie einer Fettsäure) kann bestinnt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen oder die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Kompo nenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d. h. von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese Analyse techniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P. A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materi als, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J. A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22): 12935-12940, und Browse et.at. (1986) Analytic Biochemistry 152: 141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research", Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) u. d. T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.

Zusätzlich zur Messung des Endproduktes der Fermentation ist es auch möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu ana lysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamteffizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (z. B. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen), Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion üblicher Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P. M. Rhodes und P. F. Stanbury, Hrsgb., IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.

Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie- Massenspektrometrie; TAG, Triacylglycerin; TLC, Dünnschicht chromatographie).

Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäure produkten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literatur stellen darin (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromato graphie-Massenspektrometrie-Verfahren, Lipide 33: 343-353).

Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2% Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten Öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester werden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC-Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d. h. Sigma), definiert werden.

Bei Fettsäuren, für die keine Standards verfügbar sind, muss die Identität über Derivatisierung und anschließende GC-MS-Analyse gezeigt werden. Beispielsweise muss die Lokalisierung von Fett säuren mit Dreifachbindung über GC-MS nach Derivatisierung mit 4,4-Dimethoxyoxazolin-Derivaten (Christie, 1998, siehe oben) gezeigt werden.

Expressionskonstrukte in heterologen mikrobiellen Systemen Stämme, Wachstumsbedingungen und Plasmide

Der Escherichia coli-Stamm XL1 Blue MRF' kan (Stratagene) wurde zur Subklonierung der neuen Desaturase pPDesaturase1 aus Physcomitrella patens verwendet. Für die funktionelle Expression dieses Gens verwendeten wir den Saccharomyces cerevisiae-Stamm INVSc 1 (Invitrogen Co.). E. coli wurde in Luria-Bertini-Brühe (LB, Duchefa, Haarlem, Niederlande) bei 37°C kultiviert. Wenn nötig, wurde Ampicillin (100 mg/Liter) zugegeben, und 1,5% Agar (Gew./Vol.) wurde für feste LB-Medien hinzugefügt. S. cerevisiae wurde bei 30°C entweder in YPG-Medium oder in komplettem Minimalmedium ohne Uracil (CMdum; siehe in: Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Albright, L. B., Coen, D. M., und Varki, A. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) mit entweder 2% (Gew./Vol.) Raffinose oder Glucose kultiviert. Für feste Medien wurden 2% (Gew./Vol.) Bacto™-Agar (Difco) hinzugefügt. Die zur Klonierung und Expression verwendeten Plasmide sind pUC18 (Pharmacia) und pYES2 (Invitrogen Co.).

Beispiel 17 Klonierung und Expression PUFA-spezifischer Desaturasen aus Phaeodactylum tricornutum

Für die Expression in Hefe wurden die Phaeodactylum tricornutum -cDNA-Klone aus Seq ID NO: 1, 3, 5 oder 11 bzw. die Sequenzen aus SEQ ID NO: 7 oder 9 bzw andere gewünschte Sequenzen zuerst so modifiziert, dass lediglich die Codierregion mittels Polymerase Kettenreaktion unter Zuhilfenahme zweier Oligonukleotide ampli fiziert werden. Dabei wurde darauf geachtet, dass eine Konsensu sequenz vor dem Startcodon zur effizienten Translation ein gehalten wurde. Entweder wurde hierzu die Basenfolge ATA oder AAA gewählt und vor das ATG in die Sequenz eingefügt (Kozak, M. (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes, Cell 44, 283-292). Vor diesem Konsensustriplett wurde zusätzlich eine Restriktionsschnittstelle eingeführt, die kompatibel sein muss zur Schnittstelle des Zielvektors, in den das Fragment kloniert werden soll und mit dessen Hilfe die Genexpression in Mikroorganismen oder Pflanzen erfolgen soll.

Die PCR-Reaktion wurde mit Plasmid-DNA als Matrize in einem Thermocycler (Biometra) mit der Pfu-DNA-(Stratagene)Polymerase und dem folgenden Temperaturprogramm durchgeführt: 3 min bei 96°C, gefolgt von 30 Zyklen mit 30 s bei 96°C, 30 s bei 55°C und 2 min bei 72°C, 1 Zyklus mit 10 min bei 72°C und Stop bei 4°C. Die Anlagerungstemperatur wurde je nach gewählten Oligonukleotiden variiert. Pro Kilobasenpaare DNA ist von einer Synthesezeit von etwa einer Minute auszugehen. Weitere Parameter, die Einfluss auf die PCR haben wie z. B. Mg-Ionen, Salz, DNA Polymerase etc., sind dem Fachmann auf dem Gebiet geläufig und können nach Bedarf variiert werden.

Die korrekte Größe des amplifizierten DNA-Fragments wurde mittels Agarose-TBE-Gelelektrophorese bestätigt. Die amplifizierte DNA wurde aus dem Gel mit dem QIAquick-Gelextraktionskit (QIAGEN) extrahiert und in die SmaI-Restriktionsstelle des dephosphory lierten Vektors pUC18 unter Verwendung des Sure Clone Ligations Kit (Pharmacia) ligiert, wobei die pUC-Derivate erhalten wurden. Nach der Transformation von E. coli XL1 Blue MRF' kan wurde eine DNA-Minipräparation (Riggs; M. G., & McLachlan, A. (1986) A simplified screening procedure for large numbers of plasmid mini preparation. BioTechniques 4, 310-313) an ampicillinresistenten Transformanden durchgeführt, und positive Klone mittels BamHI- Restriktionsanalyse identifiziert. Die Sequenz des klonierten PCR-Produktes wurde mittels Resequenzierung unter Verwendung des ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt) bestätigt.

Δ5 Acyl Lipid desaturase, Pt_des5

Das PCR-Fragment (1428 bp) wurde mithilfe des Sure Clone Kit (Pharmacia) in pUC 18 kloniert, das inserierte Fragment SacI/XhoI verdaut und das Fragment mit Hilfe entsprechender Restriktions schnittstellen in pYES2 oder pYES6 inseriert.

Δ6 Acyl Lipid desaturase, Pt_des6

Das PCR-Fragment (1451 bp) wurde mithilfe des Sure Clone Kit (Pharmacia) in pUC 18 kloniert, das inserierte Fragment BamHI/XhoI verdaut und das Fragment mit Hilfe entsprechender Restriktionsschnittstellen in pYES2 oder pYES6 inseriert.

Δ12 Acyl Lipid desaturase, Pt_des12

Δ12 Acyl Lipid desaturase, Pt_des12.2

Das PCR Fragment (1505 bp) wurde mit Hilfe des Sure Clone Kit (Pharmacia) in pUC 18 kloniert, das inserierte Fragment BamHI/XhoI verdaut und das Fragment mit Hilfe entsprechender Restriktionsschnittstellen in pYES2 oder pYES6 inseriert.

Die Plasmid-DNA wurde mit Restriktionsenzym/en passend zur eingeführten Schnittstelle der Primersequenz gespalten und das erhaltene Fragment in die kompatiblen Restriktionsstellen des dephosphorylierten Hefe-E. coli-Shuttlevektors pYES2 oder pYES6 ligiert, wobei pYES-Derivate erhalten werden. Nach der Transformation von E. coli und DNA-Minipräparation aus den Transformanden wurde die Orientierung des DNA-Fragments im Vektor durch geeignete Restriktionsspaltung oder Sequenzierung überprüft. Ein Klon wurde für die DNA-Maxipräpäration mit dem Nucleobond® AX 500 Plasmid-DNA-Extraktionskit (Macherey-Nagel, Düringen) angezogen.

Saccharomyces cerevisiae INVSc1 wurde mit den pYES-Derivaten und pYES Leervektor mittels eines PEG/Lithiumacetat-Protokolls transformiert (Ausubel et al., 1995). Nach der Selektion auf CMdum-Agarplatten mit 2% Glucose wurden pYES-Derivate- Transformanden und eine pYES2-Transformande zur weiteren Anzucht und funktionellen Expression ausgewählt. Bei pYES6-Derivaten wurde Blasticidin als Antimetabolit verwendet. Im Fall von Coexpressionen auf Basis von pYES2 und pYES6 wurde auf Minimal medium mit Blasticidin selektiert.

Funktionelle Expression einer Desaturaseaktivität in Hefe Vorkultur

20 ml CMdum-Flüssigmedium ohne Uracil, aber mit 2% (Gew./Vol.) Raffinose wurden mit den transgenen Hefeklonen (pYES2) angeimpft und 3 Tage bei 30°C, 200 rpm gezüchtet, bis eine optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) von 1,5 bis 2 erreicht wurde. Wurde als Vektor pYES6 verwendet, so wurde zusätzlich auf Blasticidin als Anti metabolit selektioniert.

Hauptkultur

Für die Expression wurden 20 ml CMdum-Flüssigmedium ohne Uracil, aber mit 2% Raffinose und 1% (Vol./Vol.) Tergitol NP-40 mit Fettsäuresubstraten auf eine Endkonzentration von 0,003% (Gew./Vol.) angereichert. Die Medien wurden mit den Vorkulturen auf eine OD₆₀₀ von 0,05 angeimpft. Die Expression wurde bei einer OD₆₀₀ von 0,2 mit 2% (Gew./Vol.) Galaktose für 16 Std. induziert, wonach die Kulturen eine OD₆₀₀ von 0,8-1, 2 geerntet wurden.

Fettsäureanalyse

Die Gesamt-Fettsäuren wurden aus Hefekulturen extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert. Davon wurden Zellen von 5 ml Kultur mittels Zentrifugation (1000 × g, 10 min, 4°C) geerntet und einmal mit 100 mM NaHCO₃, pH 8,0, gewaschen, um restliches Medium und Fettsäuren zu entfernen. Zur Herstellung des Fett säuremethylester (FAMES oder Singular FAME) wurden die Zell sedimente mit 1 M methanolischer H₂SO₄ und 2% (Vol./Vol.) Dimethoxypropan für 1 Std. bei 80°C behandelt. Die FAMES wurden zweimal mit 2 ml Petrolether extrahiert, einmal mit 100 mM NaHCO₃, pH 8,0, und einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und mit Na₂SO₄ getrocknet. Das organische Lösungsmittel wurde unter einem Argonstrom verdampft, und die FAMES wurden in 50 mikrol Petrol ether gelöst. Die Proben wurden auf einer ZEBRON-ZB-Wax-Kapillar säule (30 m, 0,32 mm, 0,25 mikro m; Phenomenex) in einem Hewlett Packard-6850-Gaschromatograph mit einem Flammenionisations detektor aufgetrennt. Die Ofentemperatur wurde von 70°C (1 min halten) bis 200°C mit einer Rate von 20°C/min, dann auf 250°C (5 min halten) mit einer Rate von 5°C/min und schließlich auf 260°C mit einer Rate von 5°C/min programmiert. Stickstoff wurde als Trägergas verwendet (4,5 ml/min bei 70°C). Die Fettsäuren wurden durch Vergleich mit Retentionszeiten von FAME-Standards (SIGMA) identifiziert.

Expressionsanalyse

Die Verhältnisse der zugegebenen und aufgenommenen Fettsäure substrate wurden ermittelt und so Quantität und Qualität der Desaturasereaktion gemäß Tabelle 6, Tabelle 7 und Tabelle 8 erfasst.

Ergebnis der Expression einer Phaeodactylum tricornutum Δ-6-Acyl Lipid Desaturase in Hefe:

Tabelle 6

Die Angaben stellen Mol-% entsprechender cis-Fettsäuren dar.

Ergebnis der Expression einer Phaeodactylum tricornutum Δ-5-Acyl Lipid Desaturase in Hefe:

Tabelle 7

Die Angaben stellen Mol-% Fettsäuren von cis-Fettsäuren dar.

Aus weiteren Fütterungsversuchen wurde gefunden, dass C18 : 1Δ9 in der Anwesenheit von C18 : 2Δ9,11 oder C18 : 3Δ9,12,15 oder C20 : 1Δ8 Fettsäuren nicht desaturiert wurde, während in Anwesenheit von C20 : 1Δ11, C20 : 2Δ11,14 und C20 : 3Δ8,11,14 auch C18 : 1 desaturiert wird. Ebenfalls keine Desaturierung erfolgte in Anwesenheit von C20 : 3Δ8,11,14.

Bei Nutzung des Protease-defizienten Hefestammes C13BYS86 (Kunze I. et al., Biochemica et Biophysica Acta (1999) 1410: 287-298) für die Expression der Δ-5-Desaturase aus Phaeodactylum tricornutum auf Vollmedium mit Blasticidin wurde gefunden, dass C20 : 4Δ8,11,14,17 als Substrat der Δ-5-Desaturase mit 20% Umsatzrate ebenso gut umgesetzt wurde wie C20 : 3Δ8,11,14. Alternativ können auch die Auxotrophiemarker leu2, ura3 oder his für Genexpression genutzt werden.

In einem weiteren Coexpressionsexperiment von Δ-5 Desaturase aus Phaeodactylum und Δ-6 Elongase aus Physcomitrella wurde der Stamm UTL7A (Warnecke et al., J. Biol. Chem. (1999) 274 (19): 13048-13059) benutzt, wobei die Δ-5 Desaturase ca. 10% C20 : 3Δ8,11,14 zu C20: 4Δ5,8,11,14 umsetzte.

Weitere Fütterungsexperimente mit verschiedensten anderen Fettsäuren allein oder in Kombination (z. B. Linolsäure, 20 : 3Δ-5,11,14-Fettsäure, alpha- oder gamma-Linolensäure, Stearidon säure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure etc.) können zur detaillierteren Bestätigung der Substratspezifität und -selektivität dieser Desaturasen durchgeführt werden.

Tabelle 8

Ergebnis der Coxpression einer Phaeodactylum tri cornutum Δ-5-Acyl Lipid-Desaturase und einer Δ-6 Elongase aus Moos in Hefe auf Basis der Expressions vektoren pYes2 und pYes6

Aus den Substratumsetzungen geht hervor, dass die verwendete Δ-5-Desaturase aus Phaeodactylum und die Δ-6-Elongase aus Physcomitrella patens bzgl. der Substrataktivität und ins besondere der Substratspezifität geeignet sind, um Arachidon säure bzw. Eicosapentaensäure mithilfe erfindungsgemäßer Sequenzen zu produzieren.

Die Fragmentierungsmuster und Massenspektren von DMOX-Derivaten von Standards als auch den Peakfraktionen per GC identifizierter Fettsäuren der in Tabelle 6, 7 und 8 aufgeführten, zeigen vergleichsweise identische Ergebnisse, wodurch die jeweilige Position der Doppelbindung über die bloße GC-Detektion hinaus abgesichert wurde.

Beispiel 18 Reinigung des gewünschten Produktes aus transformierten Organismen

Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus Pflanzenmaterial oder Pilzen, Algen, Ciliaten, tierischen Zellen oder aus dem Überstand der vorstehend beschriebenen Kulturen kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte Produkt nicht aus den Zellen sezerniert, können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch Standardtechniken, wie mechanische Kraft oder Ultraschallbehandlung, lysiert werden. Organe von Pflanzen können mechanisch von anderem Gewebe oder anderen Organen getrennt werden. Nach der Homogenisation werden die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, welche die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung aufbewahrt. Wird das Produkt aus gewünschten Zellen sezerniert, werden die Zellen durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstands fraktion wird zur weiteren Reinigung aufbewahrt.

Die Überstandsfraktion aus jedem Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurück gehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht, oder die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die Probe hingegen nicht. Diese Chromatographieschritte können wenn nötig wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromato graphieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl geeigneter Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung für ein bestimmtes zu reinigendes Molekül bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.

Im Fachgebiet ist ein breites Spektrum an Reinigungsverfahren bekannt, und das vorstehende Reinigungsverfahren soll nicht beschränkend sein. Diese Reinigungsverfahren sind zum Bei spiel beschrieben in Bailey, J. E., & Ollis, D. F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986).

Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Standardtechniken des Fachgebiets bestimmt werden. Dazu ge hören Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektro skopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, insbesondere Dünnschichtchromatographie und Flammenionisations detektion (IATROSCAN, Iatron, Tokio, Japan), NIRS, Enzymtest oder mikrobiologisch. Eine Übersicht über diese Analyseverfahren siehe in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A:, et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.

Äquivalente

Der Fachmann erkennt oder kann viele Äquivalente der hier beschriebenen erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen, indem er lediglich Routineexperimente verwendet. Diese Äquivalente sollen von den Patentansprüchen umfasst sein.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Expressionskassette mit einer Struktur ausgewählt aus der Gruppe:

a) L1 - Promotor - Strukturgen - L2,
b) L1 - Promotor - Strukturgen - L2 - L1 - Promotor - Struk turgen - L2,
c) L1 - Promotor - Strukturgen - L2 - L1 - Promotor - Struk turgen - L2 - L1 - Promotor - Strukturgen - L2,

wobei L1, L2, Promotor und Strukturgen die folgende Bedeutung hat:
L1 = SEQ ID NO: 32 oder eine äquivalente Restriktionsschnitt stellen enthaltende Sequenz,
L2 = unabhängig voneinander SEQ ID NO: 33, 34 oder 35 oder äquivalente Restriktionsschnittstellen enthaltende Se quenzen,
Promotor = pflanzlicher Promotor
Strukturgen = eine in Pflanzen exprimierbare Nukleinsäuresequenz.

2. Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei das Strukturgen ein Biosynthesegen ist.

3. Expressionskassette nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Struk turgen ein Biosynthesegen des Lipid- oder Fettsäurestoffwech sels ist.

4. Expressionskassette nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Strukturgen ein pflanzliches Gen ist.

5. Expressionskassette nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei das Gen eine Nukleinsäuresequenz ist, die für Proteine ausgewählt aus der Gruppe:
Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]- Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl- Transferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxy lase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coen zym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure- Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure- Elongase(n), kodiert.

6. Expressionskassette nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei das Gen eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe ist:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dar gestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erhalten werden,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäure sequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.

7. Verwendung von Expressionskassetten gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 in einem Verfahren zur Herstellung von Fettsäureestern mit einem erhöhtem Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen dadurch gekennzeichnet, daß man die Expressionskassette in einen Fettsäureester pro duzierenden Organismus einbringt, anzieht und die in dem Or ganismus enthaltenen Fettsäureester isoliert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die durch das Verfahren hergestellten Fettsäureester mehrfach ungesättigte C₁₈-, C₂₀- oder C₂₂-Fettsäuremoleküle mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäureester enthalten.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die C₁₈-, C₂₀- oder C₂₂-Fettsäuremoleküle aus dem Organismus in Form eines Öls, Lipids isoliert werden.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 9, wobei der Organismus eine transgene Pflanze ist.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 10, wobei die Fettsäure ester C₁₈-, C₂₀- oder C₂₂-Fettsäuren mit drei, vier oder fünf Doppelbindungen im Fettsäureester enthalten.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 11, dadurch gekenn zeichnet, daß man die in den Fettsäureestern enthaltenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren freisetzt.

13. Vektor enthaltend eine Expressionskassette gemäß den Ansprü chen 1 bis 6.

14. Organismus enthaltend mindestens eine Expressionskassette ge mäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 13.

15. Organismus nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem Organismus um eine Pflanze handelt.

16. Transgene Pflanze enthaltend eine funktionelle oder nicht funktionelle Nukleinsäuresequenz in einer Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 6.

17. Verwendung einer Expressionskassette gemäß den Ansprü chen 1 bis 6 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.