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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf eine für
das Enzym Delta-12-Desaturase
(Δ12-Desaturase) kodierende
Nukleinsäuresequenz,
auf das zugehörige
Polypeptid und auf Verwendungen sowohl der Nukleinsäuresequenz
selbst als auch des zugehörigen
Polypeptids.
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Enzyme aus der Gruppe der Δ12-Desaturasen
katalysieren einen wichtigen Schritt zur Synthese der für Menschen
essentiellen Linolsäure,
die allen Eukarioten als wichtiges Strukturelement der Zellmembran dient
und mit den aus ihr entstehenden Eicosanoiden viele lebenswichtige
Prozesse im Organismus steuert. Ferner ist Linolsäure, die
der Mensch aufgrund des Fehlens des Enzyms Δ12-Desaturase nicht selbst herstellen
kann, der Ausgangspunkt für
die Synthese weiterer essentieller Fettsäuren, z.B. Arachidonsäure (AA,
Eicosatetraensäure
ETA), Eicosapentaensäure
(EPA) und Docosahexaensäure
(DHA).
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In 1 ist
ein allgemeines Schema der Biosynthese von mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
(Poly Unsaturated Fatty Acids, PUFAs) und den beteiligten Enzymen
in Eukaryoten dargestellt. Die Umwandlung von Stearinsäure (18
Kohlenstoffe: 0 Doppelbindungen) zu Ölsäure (18:1, Δ9) wird durch eine Δ9-Desaturase katalysiert. Ölsäure wird
durch eine Δ12-Desaturase
in Linolsäure
(18:2, Δ9,12;
kurz LA) umgewandelt, die wiederum durch eine Δ6-Desaturase in γ-Linolensäure (18:3, Δ6,9,12; kurz GLA), bzw. durch
eine Δ15-Desaturase in α-Linolensäure (18:3
, Δ9,12,15;
kurz ALA) umgewandelt wird. Die Verlängerung der Fettsäuren wird durch
Elongasen katalysiert, wodurch z. B. aus γ-Linolensäure Dihomo-γ-Linolensäure (20:3 , Δ8,11,15;
kurz DGLA) gebildet wird, die wiederum durch eine Δ5-Desaturase
zu Arachidonsäure
(20:4 Δ5,8,11,15;
kurz ARA) umgewandelt wird, einem direkten Vorläufer der physiologisch wirksamen
Eicosanoide, wie z. B. Prostaglandine, Thromboxane, Leukotriene.
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Die Familie der PUFAs oder Omega-Fettsäuren (ω-Fettsäuren, bei ω- Zählweise
vom Methyl-Ende her), zu denen die aufgeführten Fettsäuren zählen, beeinflussen generell
die Innenflächen
der Blut- und Lymphgefäße, die
Funktion der weißen
Blutkörperchen,
die Blutgerinnung und Entzündungs-
und Immunreaktionen. Bei einer Mangelernährung mit diesen essentiellen
Fettsäuren
kann es zu Störungen
der entsprechenden physiologischen Prozesse kommen. Die Deutsche
Gesellschaft für
Ernährung
empfiehlt eine tägliche
Zufuhr von mindestens 12,5 g Linolsäure, die nur bei sehr ausgewogener
Ernährung
aufgenommen werden. Daher werden Nahrungszusatz-Präparate angeboten
und Grundnahrungsmittel, z.B. Brot, mit essentiellen Fettsäuren angereichert.
Durch diese Maßnahmen
soll eine Hilfestellung zur besseren Beherrschung des Risikofaktors
Herz-Kreislauf-Erkankungen
geleistet werden.
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Da Vertebraten keine Doppelbindungen
hinter Position 9, bei Δ-Zählweise
vom Carboxy-Ende her, in Fettsäuren
einfügen
können,
sind ungesättigte
Fettsäuren
wie LA und ALA oder die sie katalysierenden Enzyme Δ12- und Δ15-Desaturasen
essentielle Nährstoffe,
deren Bedarf hauptsächlich
aus pflanzlichen und tierischen Quellen gedeckt werden müssen. Die
meisten PUFAs in Menschen und Tieren stammen entweder direkt aus
der Ernährung
wie Fischen und bestimmten Pflanzen (Olive, Nachtkerze, Borretsch)
oder entstehen durch die Umsetzung der durch die Ernährung zugeführten essentiellen
Fettsäuren
durch Desaturasen und Elongasen. Deshalb sind die Organismen, in
denen diese natürlicherweise
vorkommen, von großem
kommerziellen Interesse. Zum Forschungsprogramm der Pharma- und
Nahrungsmittelindustrie gehört
daher die ständige
Suche nach neuen Quellen, insbesondere nach entsprechenden Mikroorganismen. Über die
direkte Gewinnung von PUFAs aus solchen Organismen hinaus ist durch
die heutigen Möglichkeiten
der Gentechnologie aber die Kenntnis der in ihnen wirksamen Gene
der PUFA-Biosynthese von besonderem Interesse. Durch die gezielte,
funktionelle Expression der Gene in Wirtspflanzen wie Sojabohne
oder Mais kann eine kommerzielle Produktion von PUFAs in solchen
besser zugänglichen
Systemen erreicht werden. Aus diesem Grund besteht ein Bedarf an
Genen für
Desaturasen und Elongasen der PUFA-Biosynthese, sowie für die Gewinnung
von PUFAs durch ökonomische
Methoden mit Hilfe dieser Gene.
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Die Wirkungsweise von Desaturasen
im Fettstoffwechsel ist ausreichend bekannt. Es liegt daher eine ganze
Reihe von Veröffentlichungen über die
Bereitstellung solcher Enzyme, ihrer Aminosäuresequenzen und der für sie kodierenden
Gene vor. Beispielsweise ist aus der WO 9411516 „Genes for microsomal delta-12
fatty acid desaturases and related enzymes from plants" (1994) eine
sehr umfangreiche Darlegung der Erkenntnisse zum Fettstoffwechsel
bekannt. Hier werden Δ-12-Desaturasen
aus Pflanzen, z.B. Sojabohne, Ölsaat
Brassica spezies, Arabidopsis thaliana und Mais, beschrieben. In
einem Expressionsverfahren wird der Einsatz von „Gen-Chimären"
zur Transformation von Pflanzen, d.h. die Manipulation des Wirtsgenoms
durch Einbau fremder Gene mittels Vektoren, zur vermehrten Produktion
essentieller Fettsäuren
offenbart. Eine Delta-12-Desaturase, für die eine Nukleinsäuresequenz
aus der gemeinen Haselnuss kodiert, ist aus der
EP 0794250 bekannt. Die WO 0020602 „Delta
6 and delta 12 desaturases and modified fatty acid biosynthesis
and products produced therefrom" (2000) beansprucht Δ-6- und Δ-12-Desaturasen,
Nukleinsäuresequenzen,
die für
solche Proteine kodieren, DNA-Strukturen, die solche Gene enthalten
und Mikroorganismen, die erhöhte
Mengen solcher Desaturasen exprimieren. Es handelt sich bei den
Desaturasen bevorzugt um Isolationen aus dem ölhaltigen Pilz Mortierella
alpina. In der
DE 10044468 „New nucleic
acid encoding delta-6- desaturase,
useful for producing ciliates and plants that overproduce unsaturated
fatty acids, derived from Tetrahymena" (2001) wird eine γ-Linolensäure aus
Linolsäure
katalysierende Δ-6-Desaturase,
gewonnen aus dem Ciliaten Tetrahymena thermophila, beschrieben.
Hierbei handelt es sich um ein wärmeliebendes
Wimperntierchen, das sein Aktivitätsmaximum bei höheren Temperaturen
hat.
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Die kommerzielle Herstellung von
essentiellen Fettsäuren
aus natürlichen
Quellen ist jedoch mit einigen Nachteilen verbunden. Sowohl deren
Qualität
als auch die Quantität
schwanken und sie weisen teilweise eine heterogene Zusammensetzung
auf, wodurch Reinigungsschritte notwendig werden. Dagegen hat sich
gezeigt, dass die Ausbeute bei einigen Mikroorganismen im Vergleich
zu höheren
Pflanzen deutlich besser ist. Aus diesem Grunde bietet die Herstellung
von essentiellen Fettsäuren
durch Mikroorganismen eine vielversprechende Alternative zu anderen
PUFA-Quellen. Das Fettsäurespektrum
vieler Mikroorganismen ist oft recht einfach im Vergleich zu höheren Organismen,
was große
Vorteile bei der Reinigung bietet. Darüber hinaus ist die fermentative
Herstellung nicht von externen Faktoren wie Wetter, Nahrungsangebot
etc. abhängig.
Außerdem
sind auf diese Weise hergestellte PUFAs weitgehend frei von Kontaminationen
die z. B. auf Umweltverschmutzung zurückzuführen sind. Ein weiterer Vorteil
ist, dass durch fermentative Prozesse gewonnene PUFAs im Gegensatz
zu solchen aus natürlichen
Quellen keinen Schwankungen in der Verfügbarkeit unterliegen.
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Desweiteren entstammen alle in den
oben zitierten Druckschriften genannten und auch alle weiteren, derzeit
bekannten Organismen zur Fettsäureproduktion
aus gemäßigten Klimazonen.
Somit benötigen
alle geeigneten Organismen zur Produktion essentieller Fettsäuren ihren
natürlichen
klimatischen Umgebungsbedingungen entsprechende Prozessbedingungen,
insbesondere deutlich erhöhte
Prozesstemperaturen. Folglich sind stets Einrichtungen zur Temperaturbeaufschlagung,
insbesondere aufwändige
Zuchtreaktoren zur Produktion erforderlich.
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Aus der Veröffentlichung I „Zahllose
Geheimnisse der Natur" von K. Eske (vgl. BioLOG, 3.Ausgabe, Februar
2000, Seiten 2/3, abrufbar unter http://www.Bioregio.org/biolog-3.pdf,
Stand 04.06.2002) ist es bekannt, kälteangepasste Enzyme aus Bakterien,
die in Tiefseeregionen vorkommen, zu isolieren. Neben dem Vorteil,
dass kälteangepasste
Enzyme zur Expression keine erhöhten
Temperaturen benötigen,
ergibt sich bei den entsprechenden Organismen aus den Tiefseeregionen
ein großes
Vorkommenspotential, da 80% des die Erdoberfläche bedeckenden Wassers eine
Temperatur unter 5 °C
aufweist. Mikroorganismen aus kalten Regionen haben einen besonders
hohen Anteil an PUFAs, die ein Erstarren der Zellwände bei
niedrigen Temperaturen verhindern. Die Temperatur des Aktivitätsmaximums
dieser Organismen und ihrer funktionellen Bestandteile liegt deutlich
unter dem anderer Organismen aus temperierten und tropischen Breiten.
Durch den Einsatz von kälteangepassten
Mikroorganismen, auch in gentechnisch modifizierter Form, ist damit
eine Produktion unter niedrigen Temperaturen mit einem gegenüber den
herkömmlichen
Gewinnungsverfahren mit nicht kälteangepassten
Organismen deutlich geringerem Energieeinsatz entscheidend wirtschaftlicher
als bei deren sonst üblichen
Aktivitätstemperaturen.
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Vor dem Hintergrund dieser bedeutenden
Erkenntnisse ist es daher die Aufgabe für die vorliegende Erfindung,
zur wirtschaftlichen Produktion essentieller Fettsäuren auf
Basis eines Enzyms Delta-12-Desaturase einen kälteangepassten Organismus zu
finden, der eine Nukleinsäuresequenz
aufweist, die für
ein kälteangepasstes
Enzym Delta-12-Desaturase bei tiefen Prozesstemperaturen kodiert.
Die Lösung
hierfür
ist dem Anspruch 1 zu entnehmen. Vorteilhafte Weiterbildungen und
Anwendungen, die sich auch auf das zur beanspruchten Nukleinsäuresequenz
zugehörige
Polypeptid beziehen, sind den unter- und nebengeordneten Ansprüchen zu
entnehmen.
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Mit der erfindungsgemäßen Lösung werden
die an die Erfindung gestellten Anforderungen optimal erfüllt. Zum
einen weist der die beanspruchte Nukleinsäuresequenz aufweisende Organismus
ein Delta-12-Desaturase-Enzym
auf, das zur Katalyse eines wichtigen Schritts zur Produktion von
essentiellen Fettsäuren
besonders geeignet ist, zum anderen entstammt der Organismus der
antarktischen See, sodass dieses Enzym zusätzlich auch noch kälteangepasst
ist und zu seiner Aktivität
keine Wärmezufuhr
benötigt
wird. Die Kenntnis eines solchen Gens ist von elementarer Wichtigkeit,
da dieses für
ein kälteangepasstes Δ12-Desaturase-Enzym
kodiert, das besonders für
die Pflanzenzucht in gemäßigten und
kälteren
Breiten interessant ist. Die mikrobielle Fettsäuresynthese erzielt somit mit
der schnell wachsenden Kieselalge mit ihrem kälteangepassten Enzym unter
niedrigen Temperaturen hohe Erträge.
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Durchgeführte Sequenzanalysen bestätigen, dass
die erfindungsgemäß beanspruchte
Nukleinsäuresequenz
für ein Δ12-Desaturase-Enzym
kodiert. Durch die heutigen entwickelten Methoden der automatisierten
Sequenzierung von Nukleinsäureabschnitten
ist es möglich
geworden, in überschaubaren
Zeiträumen
gezielt Gene mit gewünschten
Eigenschaften aus aussichtsreichen Organismen zu isolieren. Umfangreiche öffentliche
Datenbanken mit bereits bestimmten, bekannten Funktionen zugeordneten
Sequenzen dienen der schnelleren Verifizierung der Ergebnisse der
mühsamen
Suche. Zur Bereitstellung des für
die Sequenzierung aufbereiteten Grundmaterials dient eine Reihe
von an sich bekannten Arbeitsschritten:
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1) Isolation und Kultivierung
des Organismus Fragilariopsis cylindrus
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Isolation : Während einer Antarktisfahrt
mit dem deutschen Forschungseisbrecher „Polarstern" in die Weddell-See
wurde die Kieselalge aus dem Meereis isoliert. Die Artbestimmung
erfolgte in einfacher Weise durch die Typisierung der Struktur der
Schale (vergleiche hierzu die Veröffentlichung II von Medlin & Priddle : „Polar
marine diatoms", 2nd edition, British Antarctic
Survey, Cambridge 1990).
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Kultivierung : Die Kieselalge wurde
bei 0°C
in einem nährsalzangereicherten
Medium 2 × f/2
bei 10μmol
Photonen m–2s–1 mit
24h Licht, gehältert
(vergleiche hierzu die Veröffentlichung
III von Guillard & Ryther:
"Studies of marine plancton diatoms, I.Cyclotella nana (Husted)
and Detonula confervacea (Cleve)", 1962, Can. J. Microbiol. 8, 229:239).
Für eine
gesteigerte Expression der für
die Kälteanpassung
der Art verantwortlichen Gene wurden die Algen in der Mitte der
exponentiellen Wachstumsphase auf -2°C abgekühlt. Dies entspricht dem Gefrierpunkt
von Meerwasser. Nach 5 Tagen wurden die Boten-RNA (mRNA, messenger RNA)
aus den Algen isoliert. Die mRNA repräsentieren alle gerade aktiven
Gene, also auch diejenigen, die für die Kälteanpassung verantwortlich
sind.
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2) Isolation der mRNA
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Die gesamte RNA wurde mit dem RNAeasy
Plant Mini Kit (Firma Qiagen) isoliert. Aus ca. 100 μg RNA konnte
mit Hilfe des Oligotex mRNA Midi Kit (Firma Qiagen) ca. 800 ng RNA
für die
cDNA-Synthese isoliert werden.
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3) Herstellung und Screening
einer cDNA-Bank
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Die cDNA-Bank wurde auf der Basis
der mRNA mit dem SMART cDNA-Library Construction Kit (Firma Clontech)
hergestellt:
- A) Von der mRNA wurde dazu mit
Hilfe von Oligonukleotiden und CDS III/3' Primern der erste cDNA-Strang synthetisiert.
- B) Anschließend
wurde die Doppelstrangsynthese mit Hilfe der LD-PCR (long distance
polymerase chain reaction) im Eppendorf-Thermocycler unter folgendem
Programm realisiert:
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C)
1. 5 min Denaturierung bei
95°C, anschließend 20
Zyklen von 6 min bei 68°C
und 2 min bei 95°C.
2.
Nach einem SFiI-Verdau (mit Restriktionsenzym aus Streptomyces fimbriatus)
der cDNa wurde sie in CHROMA Spin-400 Säulen der Größe nach fraktioniert, so dass
nur cDNAs der Länge > 400bp (Basenpaare) für die Klonierung
zum Einsatz kamen.
3. Diese cDNAs wurden über Nacht bei 16°C in TripIEX2
Vektoren ligiert, die von λ-Phagen
aufgenommen werden konnten. Der Titer dieser cDNA-Bank lag bei 2.7 × 109 pfu/ml (plaque forming units).
4.
Ein Blau-Weiß-Screening
mit IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactosid) und X-Gal (X-Galactosid)
zeigte eine Rekombinationseffizienz von 70%.
5. Diese cDNA-Bank
wurde mit Hilfe einer Digoxygenin markierten Δ-12-Desaturase aus Phaeodactylum tricornutum
gescreent.
6. Die Hybridisierung erfolge über Nacht bei 50°C
7.
Die Stringenzwäsche
wurde in 2 × SSC/0,5 × SDS durchgeführt.
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4) Sequenzanalyse
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Positive Phagen-Plaques wurden vom
5'-Ende mit λ-Primern
vom Qiagen-Sequencing-Service
sequenziert. Die Sequenzen wurden in der Genbank bei NCBI (National
Center for Biotechnology Information) mit der BLASTX-Option auf
ihre Homologien zu vorhandenen Sequenzen untersucht (25.02.2002).
Die Vergleichsergebnisse wiesen Scorewerte zwischen 50 und 80 auf.
Eine von 20 positiven Phagen-Plaques konnte zweifelsfrei als Δ-12-Desaturase
identifiziert werden.
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In 2 ist
das Ergebnis einer phylogenetischen Analyse dargestellt. Danach
gruppiert die Desaturase aus Fragilariopsis cylindrus mit signifikantem
bootstrap support (97% bzw. 99%) mit anderen Δ-12-Desaturasen. Es handelt
sich daher bei dem kälteangepassten
Enzym, das von der beanspruchten Nukleinsäuresequenz nach der Erfindung
aus der Diatomee Fragilariopsis cylindrus kodiert wird, mit an Sicherheit
grenzender Wahrscheinlichkeit ebenfalls um eine Δ-12-Desaturase.
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