JP4087460B2 - 植物における長鎖多不飽和脂肪酸の合成のための方法および組成物 - Google Patents

植物における長鎖多不飽和脂肪酸の合成のための方法および組成物 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、1997年４月11日付け米国特許出願第08/834,655号の一部継続出願であり、1997年４月11日付け米国特許出願第08/833,610号、1997年４月11日付け米国特許出願第08/834,033号、および1997年10月24日付け米国特許出願第08/956,985号の一部継続出願であり、その開示内容は本明細書中に参考として組み込まれる。
序論
発明の分野
本発明は、宿主植物における長鎖多不飽和脂肪酸（PUFAS）の産生量を変えることができる酵素および／または酵素成分のレベルのモジュレーションに関する。本発明は、植物におけるPUFASの産生により例示する。
背景
多不飽和脂肪酸（PUFA）の２つの主要ファミリーは、アラキドン酸などのω３脂肪酸およびエイコサペンタエン酸などのω６脂肪酸である。PUFAは細胞の形質膜の重要な成分であり、それは該形質膜においてリン脂質のような形態で見出されうる。また、PUFAは、プロスタサイクリン、ロイコトリエン、およびプロスタグランジンなどのヒトおよび動物において重要な他の分子の前駆体として機能する。PUFAは、適切な発達、特に乳幼児の脳の発達、ならびに組織の形成および修復に必要である。
重要な４つの主要長鎖PUFAには、種々のタイプの魚油中に主として見出されるドコサヘキサエン酸（DHA）およびエイコサペンタン酸（EPA）、メマツヨイグサ（Oenothera biennis）、ルリチシャ（Borago officinalis）およびクロフサスグリ（Ribes nigrum）などの多数の植物の種子中に見出されるγ-リノレン酸（GLA）、ならびに海洋油および植物種子中に見出されるステアリドン酸（SDA）が含まれる。GLAおよびもう１つの重要な長鎖PUFAであるアラキドン酸（ARA）は共に、糸状菌中で見出される。ARAは、肝臓、副腎などの動物組織から精製することができる。
DHAに関しては、種々の海洋生物、冷水海洋魚から得た油および卵黄画分などの多数の商業的製造起源が存在する。ARAに関しては、Mortierella属、Entomophthora属、Phytium属およびPorphyridium属を含む微生物を、商業的製造に使用することができる。SDAの商業的起源には、Trichodesma属およびEchium属が含まれる。GLAの商業的起源には、メマツヨイグサ、クロフサスグリおよびルリチシャが含まれる。しかしながら、天然起源からPUFAを商業的に製造することに関連したいくつかの欠点がある。動物、植物などのPUFAの天然起源は、非常に不均一な油組成を有する傾向にある。したがって、これらの起源から得た油は、１以上の所望のPUFAを分離したり又は１以上のPUFAに富む油を製造するためには、徹底的な精製を要する可能性がある。また、天然起源は、入手可能性において、制御できない変動にさらされる。魚類のストック（stocks）は、自然変異を受けたり、あるいは乱獲により枯渇する可能性がある。魚油は不快な風味および香りを有し、それは、所望の製品から経済的に分離することが不可能な場合があり、そのような製品を食物補充剤として許容できなくする場合がある。動物油、および特に魚油は、環境汚染物質を蓄積する可能性がある。天候および疾患が、魚および植物の両方の起源からの収量の変動を引き起こす可能性がある。代替油産生作物の生産のための利用可能な農耕地は、人口の一定の増加と、それに関連した、残りの耕地上の食物生産に対する需要の増加とからの競合にさらされる。PUFAを産生する作物（例えば、ルリチシャ）は、商業的栽培に順応化されておらず、単一栽培においては十分に得られない可能性がある。したがって、そのような作物の栽培は、より有益かつ定評ある作物の栽培が可能な場合には、経済的な競争力を有さない。また、Mortierellaなどの生物の大規模発酵は非常に高くつく。天然動物組織は、少量のARAしか含有せず、加工が困難である。Porphyridium、Mortierellaなどの微生物は、商業的規模で培養することが困難である。
PUFAを含有する食物補充剤および医薬製剤は、PUFA源の欠点を保有している可能性がある。魚油カプセルなどの補充剤は、特定の所望の成分を低レベルでしか含有していないことがあり、したがって大用量を要する。高用量は、汚染物を含む望ましくない成分の高レベル摂取につながる。過剰添加は、内因性生合成経路の阻害を引き起こし、in vivoにおける種々の脂質画分中の他の必要な脂肪酸との競合を引き起こし、望ましくない結果を招く可能性があるため、脂肪酸補充剤を与える際には注意しなければならない。例えば、ω３脂肪酸に富む食物を摂取するエスキモー人は、高い出血傾向を有する（米国特許第4,874,603号）。該補充剤の不快な風味および香りは、そのような投与計画を望ましくないものにすることがあり、患者による応諾を妨げる可能性がある。
PUFAの生合成には多数の酵素が関与している。リノール酸（LA，18:2 Δ９，12）は、Δ12-デサチュラーゼによりオレイン酸（18:1 Δ９）から産生される。GLA（18:3 Δ６，９，12）は、Δ6-デサチュラーゼによりリノール酸（LA，18:2 Δ９，12）から産生される。DGLA（20:3 Δ８，11，14）からのARA（20:4 Δ５，８，11，14）の産生は、Δ5-デサチュラーゼにより触媒される。しかしながら、動物は、Δ９位を超えて不飽和化することができないため、オレイン酸（18:1 Δ９）をリノール酸（18:2 Δ９，12）に変換することができない。同様に、哺乳類は、α-リノレン酸（ALA，18:3 Δ９，12，15）を合成することができない。真菌および植物を含む他の真核生物は、Δ21およびΔ15位で不飽和化する酵素を有する。したがって、動物の主要な多不飽和脂肪酸は、食物に由来するか、および／または、リノール酸（18:2 Δ９，12）もしくは∝-リノレン酸（18:3 Δ９，12，15）の不飽和化および伸長に由来する。
多不飽和脂肪酸は、栄養学的、薬学的、産業的な目的や、他の目的において有用であると考えられる。天然起源から得た、および化学合成による多不飽和脂肪酸の供給の拡大では、商業的な需要には十分ではない。したがって、これらの脂肪酸を天然で産生する種から、PUFAの生合成に関与する遺伝物質を得ること、および商業的量の１以上のPUFASを産生するよう操作することができる異種系において該単離物を単独でまたは組み合わせで発現させることに、関心が持たれている。
Δ6-デサチュラーゼによるγ-リノレン酸の製造は、米国特許第5,552,306号および米国特許第5,614,393号に記載されている。Mortierella alpinaを使用する8,11-エイコサジエン酸の製造は、米国特許第5,376,541号に開示されている。双鞭毛藻類によるドコサヘキサエン酸の製造は、米国特許第5,407,957号に記載されている。ルリチシャからのΔ6-デサチュラーゼのクローニングは、PCT公開WO 96/21022に記載されている。Δ9-デサチュラーゼのクローニングは、公開されている特許出願PCT WO 91/13972、EP 0 550 162 A1、EP 0 561 569 A2、EP 0 644 263 A2およびEP 0 736 598 A1および米国特許第5,057,419号に記載されている。種々の生物からのΔ12-デサチュラーゼのクローニングは、PCT公開WO 94/11516および米国特許第5,443,974号に記載されている。種々の生物からのΔ15-デサチュラーゼのクローニングは、PCT公開WO 93/11245に記載されている。Thumbergia alataからのΔ６パルミトイル-アシル輸送タンパク質デサチュラーゼおよび大腸菌中でのその発現は、米国特許第5,614,400号に記載されている。35Sプロモーターを用いたトランスジェニック大豆胚における大豆ステアリル-ACPデサチュラーゼの発現は、米国特許第5,443,974号に開示されている。
発明の概要
植物および植物細胞における多不飽和長鎖脂肪酸およびデサチュラーゼの製造のための新規組成物および方法を提供する。該方法は、宿主植物細胞内で機能する発現カセットで形質転換した目的の宿主植物細胞を増殖することを含み、該発現カセットは、PUFAの産生をモジュレートすることができるデサチュラーゼポリペプチドをコードするDNA配列にリーディングフレーム5'で結合した転写および翻訳開始制御領域を含んでなる。該デサチュラーゼポリペプチドの発現は、PUFA生合成に関与する酵素の濃度の変化の結果として、宿主植物細胞の該PUFAのプロフィールの変化をもたらす。特に興味深いのは、植物組織および／または葉、根、果実および種子などの植物部位におけるPUFA産生の選択的制御である。本発明は、例えばDHA、EPA、ARAおよびGLAの大量生産、および食用植物組織および／または植物部位の脂肪酸プロフィールの修正に有用である。
本発明はさらに、配列番号１〜配列番号52に記載のヌクレオチドおよびペプチド配列に実質的に関連するまたは相同である精製されたヌクレオチド配列またはポリペプチド配列をさらに含む。本発明はさらに、発現系の成分として及びトランスジェニック油の製造に有用な系の成分として関連配列を同定するためのプローブとして、配列番号１〜40に記載の配列を使用する方法に関する。
本発明はさらに、本発明の長鎖脂肪酸を含む液体または固体の形態である、配合物または食物補充剤に関する。これらの配合物および補充剤は、ヒトまたは動物に投与することができる。
本発明の配合物および補充剤は、ヤシ油、大豆油、カノラ油、モノおよびジグリセリド、グルコース、食用ラクトース、電気透析されたホエー、電気透析された脱脂乳、乳ホエー、大豆タンパク質ならびに他のタンパク質加水分解物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多量栄養素を更に含むことが可能である。
本発明の配合物は、ビタミンA、C、D、EおよびB複合体よりなる群から選ばれる少なくとも１つのビタミンと、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレンおよび鉄よりなる群から選ばれる少なくとも１つのミネラルとを更に含むことが可能である。
本発明はさらに、多不飽和脂肪酸の不十分な摂取または産生により引き起こされる状態を有する患者の治療方法であって、該患者の治療を行なうのに十分な量の本発明の食物代用物を該患者に投与することを含んでなる方法に関する。
本発明はさらに、本発明の物質の化粧用および医薬組成物に関する。
本発明はさらに、製薬上許容される担体中のトランスジェニック油に関する。本発明はさらに、トランスジェニック油を含有する栄養補充剤、化粧剤および乳幼児用配合物に関する。
本発明はさらに、脂肪酸分子を該脂肪酸分子のカルボキシル末端から5、5または12番目の炭素において不飽和化するトランスジーン発現産物をコードするトランスジーンを含有する細胞を有する微生物を増殖させる工程を含んでなる、改変された長鎖多不飽和脂肪酸生合成を得るための方法であって、該トランスジーンが発現されて該細胞内の長鎖多不飽和脂肪酸の生合成が改変される条件下、該トランスジーンが、機能しうる形で発現制御配列に連結されていることを特徴とする方法に関する。
本発明はさらに、ビタミン、ミネラル、炭水化物、糖、アミノ酸、遊離脂肪酸、リン脂質、抗酸化剤およびフェノール化合物からなる群より選択される少なくとも１つの栄養素を含む、医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、藻類、Mortierellaおよびヒトを含む種々の生物に由来するパルミチン酸（C16）からアラキドン酸（20:4 Δ５，８，11，14）およびステアリドン酸（18:4 Δ６，９，12，15）の合成のための可能な経路を示す。これらのPUFAは、ヒトおよび他の動物に重要な他の分子（プロスタサイクリン、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンを含み、それらのいくつかが示されている）の前駆体として機能することが可能である。
図２は、種々の生物からまとめた、ARAに加えてEPAおよびDHAを含むPUFAの産生のための可能な経路を示す。
図3A〜Eは、Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼのDNA配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
図４は、Mortierella alpinaΔ6-デサチュラーゼアミノ酸と、他のΔ６デサチュラーゼおよび関連配列（配列番号７、８、９、10、11、12および13）とのアライソメントを示す。
図５A〜Dは、Mortierella alpina Δ12-デサチュラーゼのDNA配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
図６は、PCR断片の推定アミノ酸配列（配列番号14）を示す（実施例１を参照されたい）。
図７A〜Dは、Mortierella alpina Δ5-デサチュラーゼのDNA配列（配列番号５）を示す。図８は、Mortierella alpinaΔ5-デサチュラーゼのタンパク質配列（配列番号６）と、Δ６デサチュラーゼおよび関連配列（配列番号15、16、17、18）とのアラインメントを示す。図９は、Ma29のタンパク質配列およびコンティグ253538aとのアライメントを示す。図10は、Ma524のタンパク質配列およびコンティグ253538aとのアライメントを示す。
配列表の簡単な説明
配列番号１は、Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼのDNA配列を示す。
配列番号２は、Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、Mortierella alpina Δ12-デサチュラーゼのDNA配列を示す。
配列番号４は、Mortierella alpina Δ12-デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、Mortierella alpina Δ5-デサチュラーゼのDNA配列を示す。
配列番号６は、Mortierella alpina Δ5-デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７〜13は、Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼに関連するアミノ酸配列を示す。
配列番号14は、実施例１のPCR断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号15〜18は、Mortierella alpina Δ５およびΔ６デサチュラーゼに関連するアミノ酸配列を示す。
配列番号19〜30は、PCRプライマー配列を示す。
配列番号31〜37は、ヒトヌクレオチド配列を示す。
配列番号38〜44は、ヒトペプチド配列を示す。
配列番号45および配列番号46は、Dictyostelium discoideiumデサチュラーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
配列番号47〜50は、Schizochytrium cDNAクローンのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。
好適な実施の形態の説明
本発明の完全な理解を保証するために、以下の定義を記載する。
Δ5-デサチュラーゼ：Δ５デサチュラーゼは、脂肪酸分子のカルボキシル末端から５番目の炭素（炭素５）と６番目の炭素（炭素６）との間に二重結合を導入する酵素である。
Δ6-デサチュラーゼ：Δ６デサチュラーゼは、脂肪酸分子のカルボキシル末端から６番目の炭素（炭素６）と７番目の炭素（炭素７）との間に二重結合を導入する酵素である。
Δ9-デサチュラーゼ：Δ９デサチュラーゼは、脂肪酸分子のカルボキシル末端から９番目の炭素（炭素９）と10番目の炭素（炭素10）との間に二重結合を導入する酵素である。
Δ12-デサチュラーゼ：Δ12デサチュラーゼは、脂肪酸分子のカルボキシル末端から12番目の炭素（炭素12）と13番目の炭素（炭素13）との間に二重結合を導入する酵素である。
脂肪酸：脂肪酸は、長い炭化水素鎖および末端カルボキシル基を含有する化合物のクラスである。脂肪酸には、以下のものが含まれる。
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これらの定義を考慮した上で、本発明は、植物細胞の多不飽和長鎖脂肪酸含量の改変を可能にする新規DNA配列、DNA構築物、方法および組成物を提供する。植物細胞内において１以上のPUFAの量を増加させることができるポリペプチドをコードするDNAを含む発現カセットで、植物細胞を形質転換する。望ましくは、宿主細胞のゲノムに該発現カセットを組み込む組込みを与えられた構築物を調製し得る。デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするセンスまたはアンチセンスDNAを発現するよう、宿主細胞を操作する。「デサチュラーゼ」は、１以上の脂肪酸を不飽和化して関心のあるモノ-もしくは多-不飽和脂肪酸またはその前駆体を与えうるポリペプチドを意味する。「ポリペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）とは無関係に、アミノ酸の任意の鎖を意味する。発現される酵素の基質は、宿主細胞により産生されるか、あるいは外因的に供給されることが可能である。
宿主細胞内において発現を達成するために、該形質転換DNAを、該宿主細胞内で機能的である転写および翻訳の開始および終結調節領域に、機能しうる形で連結する。発現される遺伝子を含む構築物は、宿主細胞のゲノム内への組込みを引き起こすことが可能であり、あるいは宿主細胞内で自律複製することが可能である。リノール酸（LA）の産生の場合、一般に使用する発現カセットには、特にオレイン酸を産生し又は取込みうる宿主細胞内でΔ12-デサチュラーゼ活性を与えるカセットが含まれる。ALAの産生の場合、一般に使用する発現カセットには、特にLAを産生し又は取込みうる宿主細胞内でΔ15-もしくはω3-デサチュラーゼ活性を与えるカセットが含まれる。GLAまたはSDAの産生の場合、一般に使用する発現カセットには、特にLAまたはALAをそれぞれ産生し又は取込みうる宿主細胞内でΔ6-デサチュラーゼ活性を与えるカセットが含まれる。LAやGLAなどのω６型不飽和脂肪酸の産生は、Δ15またはω３型デサチュラーゼの活性を阻害することによりALAを産生することができる植物において行われるのが好ましい。これは、アンチセンスΔ15またはω３転写産物のための発現カセットを付与することにより、またはΔ15-またはω3-デサチュラーゼ遺伝子を破壊することにより、達成される。同様に、LAやALAの産生は、Δ６デサチュラーゼ活性を有する植物内において、アンチセンスΔ６転写産物のための発現カセットを付与することにより、またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子を破壊することにより、行われるのが好ましい。同様に、オレイン酸の産生は、Δ12デサチュラーゼ活性を有する植物内において、アンチセンスΔ12転写産物のための発現カセットを付与することにより、またはΔ12-デサチュラーゼ遺伝子を破壊することにより、行われるのが好ましい。ARAの産生の場合、一般に使用する発現カセットは、特にDGLAを産生し又は取込みうる宿主細胞内でΔ5-デサチュラーゼ活性を与える。ARAなどのω６型不飽和脂肪酸の産生は、Δ15またはω３型デサチュラーゼの活性を阻害することによりALAを産生することができる植物において行われるのが好ましい。これは、アンチセンスΔ15またはω３転写産物のための発現カセットを付与することにより、またはΔ15-またはω3-デサチュラーゼ遺伝子を破壊することにより、達成される。
トランスジェニック植物による脂肪酸の製造
トランスジェニック植物によるPUFAの製造は、魚または植物などの天然起源からの精製より優れたいくつかの利点を有する。組換え植物からの脂肪酸の製造は、宿主内に新たな合成経路を付与することにより、あるいは望ましくない経路を抑制し、それにより望ましいPUFAまたはそのコンジュゲート化形態のレベルを増加させ、望ましくないPUFAのレベルを減少させることにより、天然に生じる植物的脂肪酸プロフィールを改変することが可能となる。また、トランスジェニック植物における脂肪酸の産生は、特定の組織および／または植物部位におけるデサチュラーゼ遺伝子の発現が、これらの組織および／または部位における所望のPUFAレベルの大幅な増加を達成することができることを意味し、これらの組織からより経済的に回収することができるという利点を提供する。例えば、所望のPUFAは種子の中で発現することができ、種子油を単離する方法が確立されている。所望のPUFAを精製するための起源を与えることに加えて、種子油成分を、デサチュラーゼ遺伝子（単独でまたは伸長酵素（elongase）などの他の遺伝子とともに）の発現を介して操作し、特定のPUFAプロフィールを有する種子油を濃縮した形で提供することができる。次に、母乳による授乳が不可能または望ましくない場合、あるいは大人および幼児の両方が栄養失調であるか病気である場合、この濃縮した種子油を動物のミルクおよび／または合成もしくは半合成ミルクに加えて乳幼児用配合物として使用することができる。
PUFAの製造には、宿主細胞、基質の利用可能性、および所望の最終産物に応じて、いくつかのポリペプチド、特にデサチュラーゼが、ステアリン酸からオレイン酸へ、LAからGLAへ、ALAからSDAへ、オレイン酸からLAへ、またはLAからALAへの変換を触媒するポリペプチドを含め、関心が持たれる。これらには、Δ６、Δ９、Δ12、Δ15またはω３位置で不飽和化する酵素が含まれる。デサチュラーゼ活性を有する特定のポリペプチドの選択のための考慮事項には、該ポリペプチドの最適pH、該ポリペプチドが律速酵素またはその成分であるか否か、使用するデサチュラーゼが所望の多不飽和脂肪酸および／または該ポリペプチドにより要求される補因子の合成に必須であるか否かが含まれる。発現されるポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞におけるその位置の生化学的環境に適合したパラメーターを有する。例えば、該ポリペプチドは、基質に関して宿主細胞内の他の酵素と競合する必要があるかもしれない。したがって、所定の宿主細胞内でのPUFA産生を改変するための所定のポリペプチドの適合性の決定の際には、問題のポリペプチドのKmおよび比活性の分析を考慮する。したがって、ある特定の状況において使用するポリペプチドは、意図される宿主細胞内に存在する条件下で機能しうるものであるが、その他の点では、所望のPUFAの相対的産生を改変しうる所望の特性を有するデサチュラーゼ活性を有する任意のポリペプチドであることが可能である。パルミチン酸（C16）からのアラキドン酸（20:4 Δ５、８、11、14）の合成スキームを、図１に示す。この経路における鍵酵素は、DH-γ-リノレン酸（DGLA、エイコサトリエン酸）をARAに変換するΔ5-デサチュラーゼである。また、Δ6-デサチュラーゼによるα-リノレン酸（ALA）からステアリドン酸への変換が示されている。ARAに加えてEPAおよびDHAを含むPUFAの産生を、図２に示す。ステアリン酸（C18）からのアラキドン酸（20:4 Δ５、８、11、14）の合成における鍵酵素は、リノール酸をγリノレン酸に変換するΔ6-デサチュラーゼである。Δ6-デサチュラーゼによるα-リノレン酸（ALA）のステアリドン酸（stearidonic acid）への変換も示されている。ARAの製造では、使用されるDNA配列は、Δ5-デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。特定の場合、これは、Δ6-デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドの産生を与える発現カセットと、および任意で、Δ15転写産物に対するアンチセンス配列の産生を与える転写カセットとに、結合することができる。使用されるカセットの組み合わせの選択は、一部には、宿主細胞のPUFAプロフィールに依存する。宿主細胞のΔ5-デサチュラーゼ活性が制限されている場合は、Δ5-デサチュラーゼの過剰発現だけで、ARA産生を増強するのに十分であろう。
デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドの起源
デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの起源は、所望の多不飽和脂肪酸を産生する生物である。一例として、ARAを産生する能力を有する微生物を、Δ5-デサチュラーゼ遺伝子の起源として使用することができる（GLAまたはSDAがΔ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ12-デサチュラーゼ遺伝子の起源として使用することができる微生物）。そのような微生物には、例えば、Mortierella、Conidiobolus、Pythium、Phytophathora、Penicillium、Porphyridium、Coidosporium、Mucor、Fusarium、Aspergillus、RhodotorulaおよびEntomophthora属に属する微生物が含まれる。Porphyridium属のなかで特に関心が持たれるのは、Porphyridium cruentumである。Mortierella属のなかで特に関心が持たれるのは、Mortierella elongata、Mortierella exigua、Mortierella hygrophila、Mortierella ramanniana、var. angulisporaおよびMortierella alpinaである。Mucor属のなかで特に関心が持たれるのは、Mucor circinelloidesおよびMucor javanicusである。
所望のデサチュラーゼをコードするDNAは、種々の方法で同定することができる。一例として、所望のデサチュラーゼの起源、例えば、Mortierella由来のゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを、酵素的または化学的に合成された検出可能なプローブ（これは、DNA、RNAまたは非天然に存在するヌクレオチドまたはそれらの混合物から作製することができる）でスクリーニングする。通常の又は減少したストリンジェンシーのハイブリダイゼーション法のためには、プローブを、公知のデサチュラーゼのDNAから酵素的に合成することができる。また、オリゴヌクレオチドプローブは、起源をスクリーニングするために使用することが可能であり、公知デサチュラーゼ間で保存された配列を含む公知デサチュラーゼの配列、または所望の精製タンパク質から得たペプチド配列に基づくことが可能である。アミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブは、遺伝暗号の縮重を含むように縮重していることが可能であり、あるいは起源生物の好ましいコドンを優先するよう偏っていることが可能である。また、オリゴヌクレオチドは、公知の又は疑わしい起源からの逆転写mRNAからのPCRのためのプライマーとして使用することができ、該PCR産物は、完全長cDNAであることが可能であり、あるいは所望の完全長cDNAを得るためのプローブを作製するために使用することが可能である。別法として、所望のタンパク質を、完全に配列決定し、そのポリペプチドをコードするDNAの全合成を行なうことができる。
所望のゲノムまたはcDNAを単離したら、それを公知方法により配列決定することができる。当技術分野においては、そのような方法は過誤を受けやすいと認識されており、そのため同一領域の多重配列決定が常套手段となっているが、それでもなお、反復ドメイン、広範な二次構造または異常な塩基組成を有する領域（例えば、高いGC塩基含量を有する領域）においては特に、得られる推定配列内の無視できない過誤率を招くと予想される。相違が生じる場合には、再び配列決定を行なうことができ、特別な方法を用いることができる。特別な方法には、異なる温度；異なる酵素；より高次の構造を形成するオリゴヌクレオチドの能力を改変するタンパク質；改変ヌクレオチド、例えばITPまたはメチル化dGTP；異なるゲル組成、例えば、ホルムアルデヒドの添加；異なるプライマーまたは問題の領域から異なる距離に位置するプライマー；または異なる鋳型、例えば一本鎖DNAを用いることによる配列決定条件の改変を含めることができる。また、mRNAの配列決定を用いることができる。
通例、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドのコード配列の一部または全部は、天然由来である。しかしながら、場合によっては、例えば、宿主に好ましいコドンを用いることにより発現を増強するために、コドンの全部または一部を改変することが望ましい。宿主に好ましいコドンは、関心のある特定の宿主種において最大量で発現されるタンパク質における最高頻度のコドンから決定することができる。したがって、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドのコード配列の全部または一部を合成することができる。また、転写されるmRNA中に存在する任意の不安定化配列または二次構造の領域を除去するよう、該DNAの全部または一部を合成することができる。また、塩基組成を、所望の宿主細胞において更に好ましいものに改変するために、該DNAの全部または一部を合成することができる。配列を合成し配列を合体させるための方法は、文献において十分に確立されている。所望の多不飽和脂肪酸のより長い半減期またはより高い産生速度などの宿主細胞における機能に関するより望ましい物理的および速度論的パラメーターを有するin vivoデサチュラーゼ活性を有するポリペプチドが産生されるように天然に存在するデサチュラーゼ遺伝子の突然変異を得るために、in vitro突然変異誘発および選択、部位特異的突然変異誘発または他の手段を用いることができる。
望ましいcDNAは、60％未満のA+T組成、好ましくは50％未満のA+T組成を有する。20塩基対のスライディングウィンドウの局在化スケールでは、75％未満のA+T組成を有するcDNAの局所化領域がないことが好ましく、60塩基対のウィンドウでは、60％を超えるA+T組成を有するcDNAの局在化領域がないことが好ましく、55％を超えるA+T組成を有するcDNAの局在化領域がないことがより好ましい。
Mortierella alpinaデサチュラーゼ
特に関心が持たれるのは、Mortierella alpinaのΔ5-デサチュラーゼ、Δ6-デサチュラーゼおよびΔ12-デサチュラーゼである。Δ5-デサチュラーゼは446アミノ酸を有し、このアミノ酸配列は図７に示される。DGLAからARAのより著しい合成を達成するために、Mortierella alpinaのΔ5-デサチュラーゼをコードする遺伝子をトランスジェニック微生物内で発現させることができる。また、Mortierella alpina Δ5-デサチュラーゼDNAと配列が実質的に同一であるか、またはMortierella alpina Δ5-デサチュラーゼポリペプチドと配列が実質的に同一であるポリペプチドをコードする他のDNAを使用することもできる。Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼは、457アミノ酸および51.8kDの推定分子量を有し、そのアミノ酸配列は、図３に示される。リノール酸からGLA、またはALAからステアリドン酸（SDA）の、より著しい合成を達成するために、Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼをコードする遺伝子をトランスジェニック植物または動物内で発現させることができる。また、Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼDNAと配列が実質的に同一であるか、またはMortierella alpina Δ6-デサチュラーゼポリペプチドと配列が実質的に同一であるポリペプチドをコードする他のDNAを使用することもできる。
Mortierella alpina Δ12-デサチュラーゼは、図５に示されたアミノ酸配列を有する。オレイン酸からLAのより著しい合成を達成するために、Mortierella alpina Δ12-デサチュラーゼをコードする遺伝子をトランスジェニック植物内で発現させることができる。また、Mortierella alpina Δ12-デサチュラーゼDNAと実質的に同一であるか、またはMortierella alpina Δ12-デサチュラーゼポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドをコードする他のDNAを使用することもできる。
配列が実質的に同一は、Mortierella alpina Δ5-デサチュラーゼのアミノ酸配列または該アミノ酸配列をコードする核酸配列に対して少なくとも60％、80％、90％または95％（この順序で好ましさが増加する）の相同性を示すアミノ酸配列または核酸配列を意味する。ポリペプチドの場合には、比較配列の長さは、一般には少なくとも16アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸、最も好ましくは35アミノ酸である。核酸の場合には、比較配列の長さは、一般には少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチド、最も好ましくは110ヌクレオチドである。相同性は、典型的には、配列分析ソフトウェア、例えばGenetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign（DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715）およびMacVector（Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, California 95008）のSequence Analysisソフトウェアパッケージを使用して測定する。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失および他の修飾に対する相同性の度合を当てはめることにより同様の配列同士を突き合わせる。保存的置換には、典型的には、以下の基の範囲内での置換が含まれる：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リシンおよびアルギニン；およびフェニルアラニンおよびチロシン。また、置換は、保存された疎水性または親水性に基づいて（KyteおよびDoolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982）あるいは同様のポリペプチド二次構造をとる能力に基づいて（ChouおよびFasman, Adv. Enzymol. 47:45-148, 1978）行なうことが可能である。
他のデサチュラーゼ
本発明には、同じまたは他の生物に由来する関連デサチュラーゼが含まれる。そのような関連デサチュラーゼには、Mortierellの同じまたは異なる種内の天然に存在する開示されているΔ5-、Δ6-およびΔ12-デサチュラーゼ変異体、ならびに他の種に由来する開示されているΔ5-デサチュラーゼの相同体、およびデサチュラーゼ活性を有する進化上関連するタンパク質が含まれる。また、Mortierella alpinaΔ5-デサチュラーゼと実質的に同一ではないが、脂肪酸分子のカルボキシル末端からそれぞれ５番目、６番目または12番目の炭素において脂肪酸分子を不飽和化するデサチュラーゼも含まれる。関連デサチュラーゼは、開示されているデサチュラーゼと実質的に同様に機能するそれらの能力（すなわち、依然としてDGLAをARAに、LAをGLAに、またはオレイン酸をLAに有効に変換する能力）により同定することができる。また、開示されているデサチュラーゼに基づくプローブを、起源生物から構築されたライブラリーにハイブリダイズさせることにより、あるいは起源生物に由来するmRNAおよび開示されているデサチュラーゼに基づくプライマーを使用するRT-PCRにより、開示されているデサチュラーゼに相同な配列に関して配列データベースをスクリーニングすることによっても関連デサチュラーゼを同定することができる。そのようなデサチュラーゼには、ヒト、Dictyostelium discoideiumおよびPhaeodactylum tricornumに由来するものが含まれる。
デサチュラーゼ活性に重要なデサチュラーゼポリペプチドの領域は、通常の突然変異誘発、生じる突然変異ポリペプチドの発現、およびそれらの活性の測定により決定することができる。突然変異体には、欠失、挿入および点突然変異またはそれらの組合せを含めることができる。典型的な機能分析は、欠失突然変異誘発から開始して、機能に必要なタンパク質のNおよびC末端境界を決定し、ついで内部欠失、挿入または点突然変異体を作製して、機能に必要な領域を更に決定する。また、カセット突然変異誘発または全合成などの他の技術を用いることもできる。例えば、5'または3'コード領域を順次除去するためにエキソヌクレアーゼを使用することにより、欠失突然変異誘発を行なう。そのような技術のためのキットが入手可能である。欠失後、開始または停止コドンを含有するオリゴヌクレオチドを、それぞれ5'または3'の欠失の後に該欠失コード領域に連結することにより、該コード領域は完成する。別法として、開始または停止コドンをコードするオリゴヌクレオチドを、部位特異的突然変異誘発、突然変異PCRなどの種々の方法により、あるいは既存の制限部位で消化されたDNAに対する連結により、該コード領域に挿入する。内部欠失は、部位特異的突然変異誘発または突然変異原性PCRを介した突然変異原性プライマーの使用による、DNA内の既存の制限部位の使用などの種々の方法により、同様に作製することができる。挿入は、リンカースキャニング突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発または突然変異原性PCRなどの方法により作製する。点突然変異は、部位特異的突然変異誘発または突然変異原性PCRなどの技術により作製する。
また、活性に重要なデサチュラーゼポリペプチドの領域を同定するために、化学突然変異誘発を用いることができる。突然変異構築物を発現させ、得られた改変タンパク質がデサチュラーゼとして機能する能力をアッセイする。そのような構造−機能分析により、どの領域を欠失させることが可能か、どの領域が挿入を許容するか、およびどの点突然変異が、該突然変異タンパク質が天然デサチュラーゼと実質的に同様に機能するのを可能にするのかを判定することができる。そのようなすべての突然変異タンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
デサチュラーゼ遺伝子の発現
デサチュラーゼポリペプチドをコードするDNAが得られたら、それを宿主細胞内で複製可能なベクター内に配置し、あるいはそのようなPCRまたはロング（long）PCRなどの技術によりin vitroで増殖させる。複製ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルス、コスミドなどを含めることができる。望ましいベクターには、関心のある遺伝子の突然変異誘発に又は宿主細胞内での関心のある遺伝子の発現に有用なものが含まれる。ロングPCRの技術は、大きな構築物のin vitro増殖を可能にし、その結果、関心のある遺伝子に対する修飾、例えば、突然変異誘発または発現シグナルの付加、および得られた構築物の増殖を、複製ベクターまたは宿主細胞を使用することなく、完全にin vitroで行なうことができる。
デサチュラーゼポリペプチドの発現のために、機能的な転写および翻訳の開始および終結領域を、デサチュラーゼポリペプチドをコードするDNAに、機能しうる形で連結させる。転写および翻訳の開始および終結領域は、発現させるDNA、所望の系内での発現が可能であることが公知の又は疑わしい遺伝子、発現ベクター、化学合成などの種々の非排他的起源に由来するか、または宿主細胞内の内因性遺伝子座に由来する。植物組織および／または植物部位における発現は、特に、該組織または部位が簡単に収穫できるもの、例えば種子、葉、果実、花、根などである場合、一定の効率を示す。発現は、特定の制御配列（例えば米国特許第5,463,174号、米国特許第4,943,674号、米国特許第5,106,739号、米国特許第5,175,095号、米国特許第5,420,034号、米国特許第5,188,958号および米国特許第5,589,397号のものなど）を用いて植物内のその位置にターゲッティングすることができる。あるいは、発現されるタンパク質は、宿主植物からの液体画分の中に直接もしくはさらなる修飾により取りこまれうる産物を生成する酵素であることができる。本件では、デサチュラーゼ遺伝子の発現、またはアンチセンスデサチュラーゼの転写により、植物部位および／または植物組織内に見られる特定のPUFA、またはその誘導体のレベルを改変することができる。Δ5-デサチュラーゼポリペプチドのコード領域は、より高い割合の所望のPUFAを含む組織および／または植物部位を生成するために、単独でもしくは他の遺伝子とともに発現する。または、この場合PUFA組成はヒト母乳のそれに非常に似通っている（Prietoら、PCT公開WO95/24494）。終結領域は、開始領域が由来する起源から得られた遺伝子の3'側領域から得られたものでもよいし、異なる遺伝子から得られたものであってもよい。多くの終結領域が知られており、同じまたは異なる属および種からの種々の宿主において申し分ないものであることが分かっている。終結領域は通常、任意の特定の特性によるというよりは、簡便さの問題で選択される。
宿主細胞の選択は、トランスジェニック細胞の所望のPUFAプロフィール、および宿主細胞の天然プロフィールにより部分的に影響を受ける。１例として、オレイン酸からリノール酸を製造する場合、使用するDNA配列はΔ12デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、リノール酸からGLAを製造する場合、使用するDNA配列はΔ6-デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。Δ12デサチュラーゼ活性を発現し且つΔ15デサチュラーゼ活性が欠如または枯渇している宿主細胞の使用は、Δ６デサチュラーゼのみを過剰発現する発現カセットとともに使用することができ、この使用はトランスジェニック細胞内でのGLAの産生を増加させるのに十分である。宿主細胞がΔ９デサチュラーゼ活性を発現する場合、Δ12-およびΔ6-デサチュラーゼ両方を発現させることにより、GLA産生を増強させることができる。特にΔ6-デサチュラーゼ活性の発現がΔ12デサチュラーゼ活性の発現と組み合わさった場合、宿主細胞は低Δ15デサチュラーゼ活性を天然に有するかまたはそのように突然変異させられることが望ましい。あるいは、Δ6-デサチュラーゼ発現のための宿主細胞は、高Δ12デサチュラーゼ活性を天然に有するかまたはそのように突然変異させられてもよい。
宿主細胞内での発現は、一過性または安定に達成することができる。一過性発現は、宿主細胞内で機能的である発現シグナルを含有する導入された構築物（しかしながら、この構築物は複製されず、めったに宿主細胞内に組込まれないか又は該宿主細胞は増殖性でない）から生じることが可能である。また、関心のある遺伝子に機能しうる形で連結された調節可能なプロモーターの活性を導入することにより、一過性発現を達成することができる（ただし、そのような誘導系は、低い基底レベルの発現を示すことが多い）。安定発現は、宿主ゲノム内に組込まれうる又は宿主細胞内で自律複製する構築物の導入により達成することができる。関心のある遺伝子の安定発現は、該発現構築物上に位置するか又は該発現構築物でトランスフェクトされた選択マーカーの使用により選択し、ついで該マーカーを発現する細胞に関して選択することができる。安定発現が組込みから生じる場合には、構築物の組込みは、宿主ゲノム内でランダムに生じることが可能であり、あるいは宿主遺伝子座との組換えを標的化するのに十分な程度に宿主ゲノムに相同な領域を含有する構築物の使用により標的化されることが可能である。構築物を内因性遺伝子座に標的化する場合には、該転写および翻訳調節領域の全部または一部は、該内因性遺伝子座により付与されることが可能である。
起源植物内でのデサチュラーゼポリペプチドの発現の増加が望ましい場合には、いくつかの方法を用いることができる。デサチュラーゼポリペプチドをコードする追加的遺伝子を、宿主生物内に導入することができる。また、天然デサチュラーゼ遺伝子座からの発現は、例えば、より強力なプロモーターを宿主ゲノム内に挿入して発現の増強を引き起こすことにより、あるいは不安定化配列を、その情報を該宿主ゲノムから欠失させて該mRNAまたは該コード化タンパク質から除去することにより、あるいは該mRNAに安定化配列を付加することにより、相同組換えを介して増加させることができる（米国特許第5,500,365号を参照のこと）。
異なる２以上の遺伝子、適当な調節領域および発現方法を発現させることが望ましい場合には、導入された遺伝子を、複製ベクターの使用により又は宿主ゲノム内への組込みにより、宿主細胞内で増殖させることができる。別々の複製ベクターから２以上の遺伝子を発現させる場合には、各ベクターが、異なる複製手段を有することが望ましい。安定発現を維持し、構築物間の要素の再構築を妨げるために、導入された各構築物は、組込まれているか否かにかかわらず、異なる選択手段を有すべきであり、その他の構築物に対する相同性を欠くべきである。調節領域、選択手段および導入構築物の増殖方法の賢明な選択は、すべての導入遺伝子が必要なレベルで発現されて所望の産物の合成がもたらされるよう、実験的に決定することができる。
関心のある遺伝子を含む構築物は、標準的な技術により宿主細胞内に導入することができる。これらの技術には、トランスフェクション、感染、ボリスチック（bolistic）衝撃、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、擦り取り、または関心のある遺伝子を宿主細胞内に導入する他の任意の方法が含まれる（米国特許第4,743,548号、米国特許第4,795,855号、米国特許第5,068,193号、米国特許第5,188,958号、米国特許第5,463,174号、米国特許第5,565,346号および米国特許第5,565,347号を参照のこと）。便宜上、DNA配列または構築物を取込ませる任意の方法により操作されている宿主細胞を、本発明では、「形質転換（された）」または「組換え（体）」と称することにする。対象宿主は、少なくとも１コピーの発現構築物を有し、また、該遺伝子がゲノム内に組込まれるか、増幅されるか、または多コピー数を有する染色体外要素上に存在するかに応じて、２以上のコピーを有することが可能である。
形質転換された宿主細胞は、導入した構築物上に含まれるマーカーに関する選択により同定することができる。あるいは、多数の形質転換技術が宿主細胞内に多数のDNA分子を導入するため、分離したマーカー構築物を所望の構築物と共に導入することができる。典型的には、形質転換された宿主は、それが選択培地上で増殖する能力に関して選択される。選択培地は、抗生物質を含んでいたり、あるいは未形質転換宿主の増殖に必要な因子（例えば、栄養因子または増殖因子）を欠いていてもよい。そのための導入マーカー遺伝子は、抗生物質耐性を付与し、あるいは必須の増殖因子または酵素をコードし、形質転換宿主内で発現された場合に選択培地上での増殖を可能にしうる。望ましくは、カナマイシンにおよびアミノグリコシドG418に対する耐性に関心が持たれる（米国特許第5,034,322号を参照のこと）。また、形質転換宿主の選択は、発現されたマーカータンパク質が直接的または間接的に検出可能な場合に行なうことができる。該マーカータンパク質は、単独で又は別のタンパク質との融合体として発現させることができる。該マーカータンパク質は、その酵素活性により検出することができ、例えば、βガラクトシダーゼは基質X-galを着色産物に変換することが可能であり、ルシフェラーゼはルシフェリンを発光性産物に変換することが可能である。該マーカータンパク質は、その光生成または修飾特性により検出することができ、例えば、発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）のグリーン蛍光タンパク質は、青色光が照射されると蛍光を発する。該マーカータンパク質または分子タグ（例えば、関心のあるタンパク質上のもの）を検出するために、抗体を使用することができる。該マーカータンパク質またはタグを発現する細胞は、例えば、視覚的に、またはFACSまたは抗体を使用するパンニングなどの技術により選択することができる。
本発明の方法および組成物を用いて産生されるPUFAは、遊離脂肪酸として又はアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質または糖脂質などの複合形態で、宿主植物の組織および／または植物部位おいて見出されることがあり、当技術分野で良く知られている種々の手段により宿主細胞から抽出することができる。そのような手段には、有機溶媒での抽出、音波処理、例えば二酸化炭素を使用する超臨界流体抽出、および圧搾などの物理的手段、またはそれらの組合せを含めることができる。特に関心が持たれるのは、ヘキサンまたはメタノールおよびクロロホルムでの抽出である。所望により、負に荷電した部分をプロトン化し、それにより有機層中への所望の産物の分配を増加させるために、水層を酸性化することができる。抽出後、窒素気流下での蒸発により有機層を除去することができる。該産物がコンジュゲート化形態で単離される場合には、該遊離脂肪酸または関心のあるそれほど複雑でないコンジュゲートを放出するために、該産物を酵素的または化学的に切断することができ、ついで所望の最終産物を得るために更なる操作に付すことができる。望ましくは、コンジュゲート化形態の脂肪酸を水酸化カリウムで切断する。
脂肪酸の精製
更なる精製が必要な場合には、標準的な方法を用いることができる。そのような方法には、抽出、尿素での処理、分別晶出、HPLC、分別蒸留、シリカゲルクロマトグラフィー、高速遠心分離もしくは蒸留、またはこれらの技術の組合せを含めることができる。酸またはアルケニル基などの反応性基の保護を、公知技術、例えばアルキル化またはヨウ素化により、任意の工程で行なうことができる。用いる方法には、メチルエステルを得るための脂肪酸のメチル化が含まれる。同様に、任意の工程で保護基を除去することができる。望ましくは、ARA、DHAおよびEPAを含有する画分の精製は、尿素での処理および／または分別蒸留により行われる。
脂肪酸の用途
本発明の脂肪酸には、いくつかの用途がある。本発明のDNAに基づくプローブは、関連分子の単離方法またはデサチュラーゼを発現する生物の検出方法において有用である。該DNAまたはオリゴヌクレオチドは、プローブとして使用される場合には、検出可能である必要がある。これは、通常、例えば修飾された残基の取込みにより内部部位に又は5'もしくは3'末端に標識を付けることにより達成される。そのような標識は、直接検出することができるものであってもよく、あるいは検出可能なように標識された二次分子に結合することが可能であり、あるいは未標識二次分子および検出可能なように標識された三次分子に結合することが可能であり、この方法は、許容できないレベルのバックグラウンドシグナルを伴うことなく満足に検出可能なシグナルを得るのに実用的である限り、拡張適用することができる。二次、三次または架橋系には、他の任意の分子（標識または他の抗体を含む）に対する抗体の使用を含めることが可能であり、あるいは互いに結合する任意の分子、例えば、ビオチン-ストレプトアビジン/アビジン系を含めることが可能である。典型的には、検出可能な標識には、放射性同位体、化学的または酵素的に光を生成または改変する分子、検出可能な反応産物を与える酵素、磁性分子、蛍光分子または結合に際して変化する蛍光または光放出特性を有する分子が含まれる。標識方法の具体例は、米国特許第5,011,770号に記載されている。あるいは、標的分子の結合は、標的に対するプローブの結合の際の溶解熱の変化を等温滴定熱量測定により測定することにより、あるいは表面上の該プローブまたは標的をコートしそれぞれ標的またはプローブの結合により生じる表面からの光の散乱の変化を検出することにより（例えば、BIAcore系で行なうことができる）、直接検出することができる。
組換え手段により産生する本発明のPUFAは、多種多様な領域において有用である。ヒトまたは動物を種々の形態のPUFAで補うと、添加したPUFAのレベルだけでなく、それらの下流代謝産物のレベルも増加しうる。例えば、固有のΔ6-デサチュラーゼ経路が個体において機能不全である場合、GLAによる治療は、GLAのレベルだけでなく、ARAやプロスタグランジンなどの下流産物（図１を参照されたい）のレベルも増加させうる。複合的な調節メカニズムは、種々のPUFAを組合せること又はPUFAの種々のコンジュゲートを加えることが、そのようなメカニズムを阻害、制御または抑制して個体において所望のレベルの特異的PUFAを得るために望ましいものとしうる。
開示している方法により製造したPUFAまたはその誘導体は、食物代用物または補充剤（特に、乳幼児用配合物）として、あるいは静脈内栄養補給を受けている患者のために、あるいは栄養失調を予防または治療するために使用することができる。EPAなどの特定の脂肪酸は、ヒトの母乳のPUFA組成をより良く再現するように乳幼児用配合物の組成を改変するために使用することができる。ヒトの母乳中の優勢なトリグリセリドは、1,3-ジ-オレオイル-2-パルミトイルであると報告されており、2-パルミトイルグリセリドは2-オレオイルまたは2-リネオイルグリセリドより良く吸収されると報告されている（米国特許第4,876,107号）。典型的には、ヒトの母乳は、DHAとして約0.15％〜約0.36％、EPAとして約0.03％〜約0.13％、ARAとして約0.30％〜約0.88％、DGLAとして約0.22％〜約0.67％、およびGLAを約0.27％〜約1.04を含む脂肪酸プロフィールを有する。乳幼児用配合物のGLA：DGLA：ARAの好適な比は、それぞれ約１：１：４〜約１：１：１である。これらのPUFA比を与える油の量は、当業者により過度の実験を行うことなく決定することができる。また、動物の組織または乳の脂肪酸組成をヒトまたは動物の消費に一層好ましいものに改変するために、PUFAまたはそれを含有する宿主細胞を動物用食物補充剤として使用することができる。
栄養組成物
本発明はまた、栄養組成物を含む。そのような組成物は、本発明の目的においては、体内に摂取されると、（a）組織を養育もしくは構成し又はエネルギーを供給するよう機能し、および／または、（b）適当な栄養状態または代謝機能を維持し、回復し又は支持する、ヒトが消費する任意の食物または調製物（経腸的または非経口的消費のためのものを含む）を含む。
本発明の栄養組成物は、本発明に従い製造された少なくとも１つの油または酸を含み、固体または液体のいずれの形態であってもよい。また、該組成物は、個々の用途に望ましい量の食用の多量栄養素、ビタミンおよびミネラルを含むことが可能である。そのような成分の量は、該組成物が、特別な必要性、例えば、ある代謝状態（例えば、代謝障害）に伴う必要性を有する健常な乳幼児、小児または成人への使用が意図されるか否かに応じて異なるであろう。
該組成物に加えることができる多量栄養素には、例えば、食用脂肪、炭水化物およびタンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような食用脂肪には、例えば、ヤシ油、大豆油ならびにモノおよびジグリセリドが含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような炭水化物には、例えば、グルコース、食用ラクトースおよび加水分解デンプン（hydrolyzed search）が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明の栄養組成物中で使用することができるタンパク質には、例えば、大豆タンパク質、電気透析されたホエー、電気透析された脱脂乳、乳ホエー、またはこれらのタンパク質の加水分解物が含まれるが、これらに限定されるものではない。
ビタミンおよびミネラルに関しては、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素ならびにビタミンA、E、D、CおよびB複合体を、本発明の栄養組成物に加えることができる。また、そのような他のビタミンおよびミネラルも加えることができる。
本発明の栄養組成物中で使用する成分は、半精製物または精製物に由来する。半精製（物）または精製（物）は、天然物の精製により又は合成により調製された物質を意味する。
本発明の栄養組成物には、例えば、乳幼児用配合物、食物補充剤および再水和組成物が含まれるが、これらに限定されるものではない。特に関心が持たれる栄養組成物には、乳幼児に対する経腸的および非経口的な補充に使用するもの、専門的（specialist）乳幼児用配合物、中高年者に対する補充剤、および胃腸障害および／または吸収不良の者に対する補充剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
栄養組成物
本発明の典型的な栄養組成物は、個々の用途に望ましい量の食用の多量栄養素、ビタミンおよびミネラルを含有する。そのような成分の量は、該配合物が、一時的にストレスにさらされた健常な個体への使用が意図されるのか、または或る慢性もしくは急性病態（例えば、代謝障害）による特別な必要性を有する被験者への使用が意図されるのかに応じて異なるであろう。本発明の栄養配合物に使用する成分は半精製物または精製物に由来する、と当業者には理解されるであろう。半精製（物）または精製（物）は、天然物の精製により又は合成により調製された物質を意味する。これらの技術は当技術分野で良く知られている（例えば、Code of Federal Regulations for Food Ingredients and Food Processing;Recommended Dietary Allowance, 第10版, National Academy Press, Washington, D.C., 1989を参照されたい）。
好ましい実施形態では、本発明の栄養配合物は、経腸栄養製品、より好ましくは、成人または小児用の経腸栄養製品である。したがって、本発明の更にもう１つの態様では、ストレスを受けている栄養補給される成人または子供に適した栄養配合物を提供する。該配合物は、本発明のPUFAに加えて、成人の１日栄養必要量を与えるよう意図された量の多量栄養素、ビタミンおよびミネラルを含む。
該多量栄養素成分には、食用脂肪、炭水化物およびタンパク質が含まれる。代表的な食用脂肪としては、ヤシ油、大豆油、およびモノおよびジグリセリド、および本発明のPUFA油が挙げられる。代表的な炭水化物には、グルコース、食用ラクトースおよび加水分解コーンスターチが挙げられる。典型的なタンパク質源は、大豆タンパク質、電気透析されたホエーまたは電気透析された脱脂乳または乳ホエー、またはこれらのタンパク質の加水分解物であるが、他のタンパク質源も入手可能であり、使用することができる。これらの多量栄養素は、ヒトの母乳中に存在するものと同等の量またはエネルギー基準、すなわち毎カロリー基準（per calorie basis）の一般に許容される栄養化合物の形態で加える。
液状経腸栄養配合物を製剤化するための方法は、当技術分野で良く知られており、実施例に詳細に記載されている。
該経腸配合物を滅菌し、ついで、そのまま摂取できる状態（ready-to-feed（RTF））で使用したり、あるいは濃縮液または粉末として保存することができる。該粉末は、前記のとおりに調製した経腸配合物を噴霧乾燥することにより調製することができ、該配合物は、該濃縮物を再水和させることにより再構成することができる。成人および乳幼児用の栄養配合物は、当技術分野で良く知られており、商業的に入手可能である（例えば、Ross Products Division, Abbott LaboratoriesのSimilac▲Ｒ▼、Ensure▲Ｒ▼、Jevity▲Ｒ▼およびAlimentum▲Ｒ▼）。本発明の油または酸は、後記の量で、これらの配合物のいずれかに加えることができる。
液体形態の該栄養組成物のエネルギー密度は、典型的には、約0.6Kca〜3Kcal/mlとなることが可能である。固体または粉末形態の場合には、該栄養補充剤は、約1.2〜9Kcal/gm以上、好ましくは3〜7Kcal/グラムを含有することが可能である。一般には、液状産物の浸透圧重量モル濃度は、700mOsm未満、より好ましくは660mOsm未満となるべきである。
該栄養配合物は、典型的には、本発明のPUFAに加えて、ビタミンおよびミネラルを含み、これらの物質の最少１日必要量を個体が摂取するのを補助するように意図されている。また、前記のPUFAに加えて、抗酸化剤の他に亜鉛、銅および葉酸を該栄養組成物に補充することが望ましいかもしれない。これらの物質はまた、ストレスを受けた免疫系に追加刺激を与え、それにより該個体に更なる利点を与えると考えられる。免疫抑制に対する有益な効果を得るためには、亜鉛、銅または葉酸の存在は任意であり、必ずしも要求されるものではない。同様に、医薬組成物にも、これらの同じ物質を補充することができる。
より好ましい実施形態では、該栄養剤は、抗酸化系およびPUFA成分に加えて、炭水化物源を含有し、該炭水化物の少なくとも５重量％は、消化不良性オリゴ糖である。より一層好ましい実施形態では、該栄養組成物は更に、タンパク質、タウリンおよびカルニチンを含有する。
開示している方法により製造したPUFAまたはその誘導体は、代用食または補充剤（特に、乳幼児用配合物）として、あるいは静脈内栄養補給を受けている患者のために、あるいは栄養失調を予防または治療するために使用することができる。典型的には、ヒトの母乳は、DHAとして約0.15％〜約0.36％、EPAとして約0.03％〜約0.13％、ARAとして約0.30％〜約0.88％、DGLAとして約0.22％〜約0.67％、およびGLAを約0.27％〜約1.04を含む脂肪酸プロフィールを有する。さらに、ヒトの母乳中の優勢なトリグリセリドは、1,3-ジ-オレオイル-2-パルミトイルであると報告されており、2-パルミトイルグリセリドは2-オレオイルまたは2-リネオイルグリセリドより良く吸収されると報告されている（米国特許第4,876,107号）。したがって、本発明により製造されるARA、DGLA、GLAおよび／またはEPAなどの脂肪酸は、ヒトの母乳のPUFA組成をより良く再現するように乳幼児用配合物の組成を改変するために使用することができる。特に、薬理学的または食用補充剤（特に、母乳代替物または補充剤）中に使用するための油組成物は、好ましくは、１以上のARA、DGLAおよびGLAを含む。より好ましくは、該油は、約0.3〜30％のARA、約0.2〜30％のDGLAおよび約0.2〜約30％のGLAを含む。
濃度に加えて、ARA、DGLAおよびGLAの比率は、与えられた個々の最終用途に適合させることができる。ARA、DGLAおよびGLAの２以上を含有する油組成物は、母乳補充剤または代用物として製剤化される場合、それぞれ約１：19：30〜約６：１：0.2の比で提供される。例えば、動物の母乳のARA：DGLA：DGLの比は、好ましくは約１：１：１、１：２：１、１：１：４の中間比を含む１：19：30〜６：１：0.2の範囲の様々な比となりうる。宿主細胞内で一緒に産生される場合には、PUFAの比を厳密に制御するために、GLAおよびDGLAなどの前駆体基質からARAへの変換の比率および割合を調節することができる。例えば、ARA対DGLAの比約１：19を得るためには、DGLAからARAへの変換比率５％〜10％を用い、一方、ARA対DGLAの比約６：１を得るためには、変換比率約75％〜80％を用いることができる。したがって、細胞培養系中であるか又は宿主動物中であるかにかかわらず、PUFAのレベルおよび比率をモジュレートするために、記載されているデサチュラーゼの発現の時期、程度および特異性の調節を行なうことができる。また、用いる発現系（例えば、細胞培養、または乳中に油を発現する動物）に応じて、該油を単離し、所望の濃度および比で組換えることができる。これらのPUFA比を与える油の量は、標準的なプロトコールに従い測定することができる。また、動物の組織または乳の脂肪酸組成をヒトまたは動物の消費に一層好ましいものに改変するために、PUFAまたはそれを含有する宿主細胞を動物用食物補充剤として使用することができる。
食物補充のためには、精製されたPUFAまたはその誘導体を、通常用途において摂取者が所望の量を摂取するように製剤化された調理用油、脂肪またはマーガリン中に加えることができる。また、該PUFAは、乳幼児用配合物、栄養補充剤または他の食品中に加えることができ、抗炎症剤およびコレステロール低下剤として有用かもしれない。
医薬組成物
本発明は、本明細書に記載した方法によって製造された１種またはそれ以上の酸及び／または生成される油を含む医薬組成物も包含する。より具体的には、このような医薬組成物は、１種またはそれ以上の酸及び／または油とともに、標準的な周知の無毒の医薬上許容される担体、補助剤、あるいは例えばリン酸緩衝食塩水、水、メタノール、ポリオール、植物性油、湿潤剤または水／油エマルジョン等のエマルジョンのようなビヒクルを含むものとすることができる。組成物は、液体あるいは固体の形態とすることができる。例えば、前記組成物は、錠剤、カプセル剤、経口摂取可能な液剤または粉末剤、注射可能なもの、あるいは局所塗布用の軟膏またはクリームの剤形とすることができる。
可能な投与経路としては、例えば、経口、経直腸または非経口経路が含まれる。もちろん、投与経路は所望の効果に依存する。例えば、前記組成物が肌荒れ、乾燥皮膚、もしくは老化した皮膚の治療のため、損傷もしくは熱傷を受けた皮膚の治療のため、あるいは疾患に罹患したもしくは症状を有する皮膚もしくは頭髪の治療に用いられる場合には、前記組成物は局所的に適用されることになる。
患者に投与される前記組成物の用量は、当業者が決定することができ、例えば患者の体重、患者の年齢、患者の免疫状態等の種々の因子によって変わる。
前記組成物は、その形態については、例えば溶液、分散物、懸濁液、エマルジョン、または後に再構成される滅菌粉末とすることができる。
さらに本発明の組成物は化粧品の用途にも用いることができる。前記組成物は、既存の化粧品組成物に加えて混合物を形成してもよく、あるいは単独の組成物として用いてもよい。
医薬組成物は、PUFA成分を個体に投与するために用いることができる。適当な医薬組成物は、生理学上許容される滅菌された水性または非水性溶液、分散物、懸濁物またはエマルジョン及び摂取用の滅菌溶液または分散物に再構成するための滅菌粉末を含むものとすることができる。適当な水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、適当なそれらの混合物、植物油（例えばオリーブ油）及び例えばオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。適当な流動性は、例えば分散物の場合には必要な粒径を維持し、また界面活性剤を使用することによって維持され得る。また糖、塩化ナトリウム等のような等張剤を含めることが望ましい場合もある。前記組成物は、このような不活性希釈剤の他に、例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、着香剤及び芳香剤のような補助剤を含んでもよい。
懸濁物は、その活性成分に加えて、懸濁化剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカントまたはこれらの物質の混合物等を含むものとすることができる。
錠剤及びカプセル剤のような固体剤形は、当分野において周知の技術を用いて調製することができる。例えば、本発明のPUFAは、例えばラクトース、ショ糖、及びコーンスターチのような従来の錠剤基剤を、例えばアラビアゴム、コンスターチまたはゼラチンのような結合剤、例えばポテトスターチまたはアルギン酸のような崩壊剤、及び例えばステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムのような滑剤と組み合わせたものにより錠剤化することができる。カプセル剤は、これらの賦形剤を酸化防止剤及びPUFA成分とともにゼラチンカプセルに封入することにより調製することができる。医薬製剤に混和されるべき酸化防止剤及びPUFA成分の量は、上記の指針の範囲内に収まるようにすべきである。
本明細書において使用される用語「治療」は、望ましくない状態の発症を防止しあるいは低減することをいう。例えば、免疫抑制を治療するということは、この抑制の発生を防止することか、あるいはこのような抑制の程度を小さくすることをいう。用語「患者」及び「個体」は互換可能に用いられ、両者ともに動物を示す。本明細書において用いる用語「動物」は、限定するものではないが、イヌ、ヒト、サル、及び類人猿を含む任意の温血動物をいう。本明細書において用いられる用語「約」は、使用の事情により記載した範囲または数値から合理的な量だけ変化する量をいう。本明細書において特定された数値または範囲はいずれも用語「約」によって変化し得るものと考えるべきである。
「用量」及び「服用量」は、互換可能に用いられ、単回の設定において患者に摂取され、有効量の抗酸化剤及び構造化トリグリセリドが供給されるように設定された栄養組成物または医薬組成物の量をいう。当業者には明らかなように、液体栄養粉末の単回用量または服用量は、上記の量の抗酸化剤及びPUFAを与えるものとする。用量または服用量は、通常の成人が一度に消費できる量であるべきである。この量は、患者の年齢、体重、性別または医学的条件によって大きく変化し得る。しかし、一般的指針のように液体栄養剤の単回服用量または投与量は、100〜600ml、より好ましくは125〜500ml、最も好ましくは125〜300mlの量を包含するものと考えるべきである。
本発明のPUFAは食餌の補充が不要な場合でも食品に加えることができる。例えば、前記組成物を、限定するものではないが、マーガリン、加工バター、チーズ、ミルク、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック類、サラダオイル、調理用の油脂、肉類、魚、及び飲料を含む任意の種類の食品に加えることができる。
医薬的用途
医薬的使用（ヒトに対するまたは獣医学上の使用）のためには、前記組成物は一般に経口投与されるが、前記組成物がうまく吸収される任意の経路、例えば非経口（即ち皮下、筋肉内、または静脈内）、経直腸、経膣または例えば皮膚用軟膏またはローションのように局所的経路によっても投与することができる。本発明のPUFAは、単独で、あるいは医薬上許容される担体または賦形剤とともに投合与することができる。ゼラチンカプセルは、それが使用可能な場合、好ましい経口投与用の剤形である。上記のような食物補充剤も、投与の経口経路を与え得る。本発明の不飽和酸は、コンジュゲート形態で、あるいは脂肪酸の塩、エステル、アミドまたはプロドラッグとして投与することができる。任意の医薬上許容される塩は本発明に包含され、特に好ましいのはナトリウム、カリウムまたはリチウム塩である。PCT公開WO96/33155に記載される例えばN-メチルグルカミンのようなN-アルキルポリヒドロキサミン塩も包含される。好適なエステルはエチルエステルである。固形の塩として、PUFAは錠剤の剤形で投与することもできる。静脈内投与のため、PUFAまたはその誘導体を、例えばIntralipidのような市販の配合物に含めることができる。典型的な正常な成人の血漿脂肪酸プロフィールは、6.64〜9.46％のARA、1.45〜3.ll％のDGLA、及び0.02〜0.08％のGLAを含む。これらのPUFAまたはそれらの代謝前駆体を、単独で、または他のPUFAと混合して投与することにより患者の正常な脂肪酸プロフィールを得ることができる。必要な場合は、１種類または複数の用途のために、配合物の個々の成分をキットの形態で個別に提供することができる。特定の脂肪酸の典型的な用量は、一日当たり0.1mg〜20g、あるいは100g、好ましくは一日当たり10mgから必要に応じて１、２、５または10gであり、その誘導体形態の場合はそのモル等量である。トリグリセリドに換算して約２〜約30重量%の脂肪酸を含む非経口栄養組成物が本発明に包含され、GLAとして約１〜約25重量%の全PUFA組成を有する組成物が好ましい（米国特許第5,196,198号）。その他のビタミン、特に例えばビタミンA、D、E及びL-カルニチンのような脂溶性ビタミンを所望に応じて含めることができる。必要な場合は、例えばαトコフェロールのような保存剤を、典型的には約0.1重量%加えることができる。
適当な医薬組成物は、生理学的に許容される滅菌された水性または非水性溶液、分散物、懸濁物またはエマルジョン、及び滅菌された注射可能な溶液または分散物に再構成するための滅菌粉末を含み得る。適当な水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリオール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、それらの適当な混合物、植物油（例えばオリーブ油）及び例えばオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが含まれる。適当な流動性は、例えば分散物の場合は必要な粒径を維持することにより、また界面活性剤を使用することにより維持することができる。また、例えば糖、塩化ナトリウム等のような等張剤を含めることも望ましい場合がある。このような不活性希釈剤の他に、前記組成物は、例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁物、甘味料、着香剤、及び芳香剤のような補助剤も含むものとすることができる。
懸濁物は、活性化合物に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカントまたはこれらの物質の混合物等のような懸濁化剤を含むものとすることができる。
特に好適な医薬組成物は、水性媒体または溶媒に溶解されたモノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルを含む。モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルは、約９〜12のHLB値を有し、２〜４のHLB値を有する既存の抗菌剤脂質より有意に高い親水性を有する。これらの既存の疎水性脂質は、水性組成物に製剤化することができない。本明細書に開示するように、これらの脂質はモノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルとともに水性媒体中に可溶化することができる。この態様では、モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（例えばDATEM-C12:0）を、他の活性抗菌脂質（例えば18:2及び12:0モノグリセリド）に溶解し、混合し均質な混合物を得る。この均質性により抗菌活性を高めることができる。この混合物は、水に完全に分散することができる。これは、モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルの添加、及び水に導入する前に他のモノグリセリドと予備混合することなしには不可能である。次いでこの水溶性組成物を、生理学上許容される希釈剤、保存剤、バッファー、またはスプレーまたは吸入剤を形成するために必要とされ得る噴霧剤と無菌状態で混合することができる。
また本発明は、脂肪酸による多くの疾患の治療を包含する。本発明のPUFAの補充を、血管形成術後の再狭窄を治療するために使用することができる。炎症、リウマチ性関節炎、及び喘息及び感染の症状を本発明のPUFAで治療することができる。PUFAがカルシウム代謝に関与し得ることが証明されており、これは本発明のPUFAを骨盤症や腎及び尿道結石の治療に使用することができることを示唆している。
本発明のPUFAは癌の治療に用いることができる。悪性細胞は変化した脂肪酸組成を有することが示されており、脂肪酸を加えることによりその増殖を遅延させて細胞死をもたらし、またそれらの化学療法剤に対する感受性を高められることが分かってきた。GLAは癌細胞上でのE-カドヘリン細胞接着分子の再発現を引き起こすことが分かった。このE-カドヘリン細胞接着分子の欠損は、進行性の転移と関係する。GLAの水溶性リチウム塩の膵臓癌患者への静脈内投与の臨床試験の結果、統計的に有意な患者の生存率の上昇が見られた。PUFAの補充は、癌にともなうカヘキシーの治療にも有用であり得る。
本発明のPUFAは、糖尿病の治療のためにも用いることができる（米国特許第4,826,877号; Horrobinら, Am. J. Clin. Nutr. Vol. 57（Suppl.）, 732S-737S）。脂肪酸代謝及び組成の変化が、糖尿病の動物において示されている。これらの変化は、網膜症、神経障害、腎障害及び生殖系の障害を含む糖尿病によって生じる長期の合併症のいくつかに関与することが示唆されている。サクラソウ油はGLAを含み、糖尿病による神経障害を予防し、逆転させることが示されている。
本発明のPUFAは、湿疹の治療、血圧の低下、及び数学的スコアの改善のために用いることができる。必須脂肪酸の欠乏は湿疹に関与することが示唆されており、研究の結果、GLAによる治療が湿疹に有効であることが判った。GLAはストレスに伴う血圧の上昇を低下させること、及び算術試験の成績を改善することも判った。GLA及びDGLAは血小板凝集を阻害し、血管拡張を引き起こし、コレステロール濃度を低下させ、また血管壁平滑筋及び繊維組織の増殖を阻害することが判っている（Brennerら, Adv. Exp. Med, Biol, Vol.83, p.85-101, 1976）。GLAまたはDGLAを単独で、あるいはEPAと組み合わせて投与することにより非ステロイド抗炎症剤によって生ずる消化管の出血及びその他の副作用が低下または防止されることが判っている（米国特許第4,666,701号）。GLA及びDGLAが、子宮内膜症及び月経前症候群を予防または治療し（米国特許第4,758,592号）、筋痛性脳脊髄炎及びウイルス感染の後の慢性疲労を治療する（米国特許第5,116,871号）ことも判っている。
本発明のPUFAのさらに別の使用としては、AIDS、多発性硬化症、急性呼吸症候群、高血圧症及び炎症性皮膚疾患の治療における使用が挙げられる。また本発明のPUFAは一般的健康並びに老人治療のための配合物に用いることもできる。
獣医学上の用途
上記の医薬及び栄養組成物は、ヒトでの使用のみならず動物についても用いることができ、これは動物もヒトと同様の多くの必要性及び症状を示すからである。例えば、本発明の油または酸を動物用食餌補充剤において、または動物用食餌代用物物に用いることができる。
以下の実施例は、例示として示すものであり、限定を意図するものではない。
実施例
実施例１ Mortierella alpinaからのΔ5-デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
実施例２ Mortierella alpinaからのΔ6-デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
実施例３ Mortierella alpinaΔデサチュラーゼに相同なΔ６デサチュラーゼの同定
実施例４ Mortierella alpinaからのD-12デサチュラーゼ核酸配列の単離
実施例５ Mortierella alpinaからのチトクロームb5還元酵素のヌクレオチド配列の単離
実施例６ パン酵母におけるM. alpinaデサチュラーゼクローンの発現
実施例７ Ma29トランスジェニックナタネ（Brassica）植物からの葉の脂肪酸分析
実施例８ Brassica napusにおけるM. alpinaΔ６デサチュラーゼの発現
実施例９ Brassica napusにおけるM. alpinaΔ12デサチュラーゼの発現
実施例10 Brassica napusにおけるM. alpinaΔ６およびΔ12デサチュラーゼの同時発現
実施例11 Brassica napusにおけるM. alpinaΔ５およびΔ６デサチュラーゼの同時発現
実施例12 Brassica napusにおけるM. alpinaΔ５、Δ６およびΔ12デサチュラーゼの同時発現
実施例13 Δ６デサチュラーゼ油の立体特異性の分布
実施例14 トランスジェニック植物の脂肪酸組成
実施例15 交雑により達成される、B. napusにおけるΔ６およびΔ12デサチュラーゼの組み合わせ発現
実施例16 大豆におけるM. alpinaデサチュラーゼの発現
実施例17 ヒトデサチュラーゼ遺伝子の配列
実施例１
Mortierella alpinaからのΔ5-デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
Mortierella alpinaは、Δ5-デサチュラーゼにより前駆体20:3からアラキドン酸（ARA、20:4）を生成する。Mortierella alpinaを起源とするΔ5-デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列は、M. alpina第１鎖cDNA及びSynechocystia及びSpirulinaを起源とするΔ6-デサチュラーゼ間で保存されたアミノ酸配列に対応する縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR増幅により得た。使用した手順は以下の通りである。
Hogeら、（1982）Experimental Mycology 6:225-232のプロトコルを用いて、３日目のMortierella alpinaのPUFA産生培地から全RNAを単離した。このRNAを用い、BRLのlambda-ZipLox systemをその使用説明書に従って使用して二本鎖cDNAを調製した。M. alpina cDNAの幾つかのサイズの分画を個別にパッケージして、異なるインサートの平均サイズを有するライブラリー群を作製した。「完全長」ライブラリーは、平均インサートサイズが1.77kbの約３×106個のクローンを含む。「シークエンシング級」ライブラリーは、平均インサートサイズが1.1kbの約６×105個のクローンを含む。
５μgの全RNAを、BRL Superscript RTase及びプライマーTSyn（5'-CAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3'）（配列番号19）を用いて逆転写した。縮重オリゴヌクレオチドを、二種の青緑色細菌Δ6-デサチュラーゼ配列の間で保存された領域に対して設計した。使用した具体的なプライマーは、D6DESAT-F3（配列番号20）（5'-CUACUACUACUACAYCAYACOTAYACOAAYAT-3'）及びD6DESAT-R3（配列番号21）（5'-CAUCAUCAUCAUOGGRAAOARRTGRTG-3'）であり、ここでY=C+T、R=A+G、及び0=I+Cである。40ngの全RNAに由来するテンプレート、２pMの各プライマー、200μMの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、60mMのTris-Cl, pH8.5、15mMの（NH4）2SO4、２mMのMgCl2を含む25μl容量中でPCR増幅を行った。サンプルを95度（全ての温度は摂氏である）で５分間の最初の変性処理にかけた後、72度に保持し、0.2UのTaqポリメラーゼを添加した。PCR熱サイクル条件は、94度で１分間、45度で1.5分間、72度で２分間とした。PCRは35サイクル行った。M. alpinaの第１鎖cDNAに対してこれらのプライマーを用いたPCRにより550bpの反応生成物が生成された。M. alpinaのPCR断片の推定アミノ酸配列の比較により、Δ6-デサチュラーゼと相同な領域が判明した（図４参照）。しかし、比較した領域では、配列同一性は約28%に過ぎなかった。この推定アミノ酸は配列番号14に示される。
このPCR産物をプローブとして用いて、M. alpinaライブラリーから対応するcDNAクローンを単離した。最も長いcDNAクローンMa29をpCGN5521と命名し、両鎖について完全に配列決定した。このcDNAは、ベクターpZL1（Bethesda Research Laboratories）に最初のATGから始まる1481bpのインサートとして含まれ、446個のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含む。このリーディングフレームはPCR断片から推定された配列を含む。このcDNAインサートの配列は、Δ6-デサチュラーゼに相同な領域を含んでいることが判った（図８参照）。例えば、３つの保存的な「ヒスチジンボックス」（他の膜結合デサチュラーゼにおいて観察されている（Okuleyら,（1994）The Plant Cell 6：147-158））がMortierella配列のアミノ酸位置171〜175、207〜212及び387〜391に存在していることが判った（図5A〜5D参照）。しかし、Mortierellaデサチュラーゼの第３のヒスチジンボックスについて典型的な"HXXHH"アミノ酸モチーフは、QXXHHであることが判った。コードされたタンパク質のアミノ末端はチトクロームb5タンパク質に有意な相同性を示した。従って、Mortierella cDNAクローンは、チトクロームb5と脂肪酸デサチュラーゼとの融合物を示すものであると考えられる。チトクロームb5は膜結合デサチュラーゼ酵素に対する電子供与体として機能していると考えられることから、このデサチュラーゼタンパク質のN末端チトクロームb5ドメインは、その機能に関与している可能性がある。このことは、PUFA産生のための異種系においてデサチュラーゼを発現する場合に有益であり得る。
実施例２
Mortierella alpinaからのΔ６デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
実施例１に記載したM. alpina cDNAシークエンシング級ライブラリーからのクローンのランダムな配列決定により、Mortierella alpina由来のΔ６脂肪酸デサチュラーゼをコードする部分的なcDNAクローン、Ma524由来の核酸配列を得た。cDNA含有プラスミドは以下のように切り出した。
ECLB+カナマイシン（10μg/ml）、0.2％マルトース、および10mM MgSO4中で培養して37℃にて15分間インキュベートした大腸菌DH10B（ZIP）100μlをファージ5μlに加えた。SOC（0.9ml）を加え、直ちに細菌（100μl）を10個のECLB+50μg Penプレートの各々に載せた。45分間の回復時間は必要としなかった。これらのプレートを一晩37℃にてインキュベートした。コロニーを取り出してECLB+50μg Pen培地中に入れ、一晩培養して、グリセロールストックおよびminiprep DNAを作製するために使用した。ECLB+50μg Pen/ml上に載せると、100μg/ml Penに載せたときよりも、より多くのコロニーができ、インサートを含むコロニーの割合が増えた。
ランダムにコロニーを取り出し、Qiagen miniprepキットを用いてプラスミドDNAを精製した。cDNAインサートの5'末端からDNA配列を得て、BLASTアルゴリズムを用いてデータベースと比較した。Ma524は、以前同定されたΔ６デサチュラーゼと相同なDNA配列に基づいて推定Δ６デサチュラーゼとして同定された。M. alpinaライブラリーから全長cDNAクローンを単離した。このクローンの発生量はMa29よりもわずかに（２×）少ないと思われる。Ma524はCaenorhabditis elegansコスミド、WO6D2.4、ヒマワリ由来のチトクロームd5/デサチュラーゼ融合タンパク質、および公共データバンクの２つのΔ６デサチュラーゼ（SynechocystisおよびSpirulina由来のもの）の一部に有意な相同性を示す。
さらに、Ma524はルリチシャΔ6-デサチュラーゼの配列（PCT公開WO96/21022）に有意な相同性を示す。したがって、Ma524はルリチシャおよび藻のΔ6-デサチュラーゼに関連するΔ6-デサチュラーゼをコードすると思われる。Ma524およびルリチシャΔ６のアミノ酸配列は類似しているが、cDNAの塩基組成はずいぶん異なる。ルリチシャcDNAは全塩基組成の60％がA+Tであり、幾つかの部分ではA+Tが70％を超えるが、Ma524の平均A+T塩基組成は44％であり、60％を超える領域はない。これは、異なる塩基組成を好む微生物または動物におけるcDNAの発現を示唆するものであるかもしれない。組換え遺伝子の発現の乏しい発現は、宿主が、導入遺伝子とは非常に異なる塩基組成を有する場合に起こり得る。このような乏しい発現のための推測されるメカニズムは、mRNAの安定性または翻訳可能性の低下を含む。
実施例３
Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼに相同なΔ6-デサチュラーゼの同定
Ma524アミノ酸配列を用いて、NCBIによるestデータベースのBLASTX検索により、推定Δ6-デサチュラーゼをコードする核酸配列を同定した。幾つかの配列は、有意な相同性を示した。特に、２つのArabidopsis thaliana配列の推定アミノ酸配列（受託番号F13728およびT42806）は、Ma524の推定アミノ酸配列の２つの異なる領域に対して相同性を示した。以下のPCRプライマーを設計した：ATTS4723-FOR（F13728に相補的）5'-CUACUACUACUAGGAGTCCTCTACGGTGTTTTG（配列番号22）およびT42806-REV（T42806に相同的）5'-CAUCAUCAUCAUATGATGCTCAAGCTGAAACTG（配列番号23）。BRL Superscript RTアーゼおよびプライマーTSyn 5'-CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号24）を用いて、Arabidopsis thalianaの発生長角果から単離した全長RNA5μgを逆転写した。25ngの全長RNAから得たテンプレート、各々2pMのプライマー、各々200μMのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、60mM Tris-Cl, pH8.5, 15mM（NH4）2SO4、2mM MgCl2, 0.2U Taqポリメラーゼを含む50ul容量中で、PCRを行った。サイクル条件は以下の通りであった：94℃にて30秒、50℃にて30秒、72℃にて30秒。PCRを35サイクル続けたあと、72℃にて７分間さらに伸長を行った。PCRにより約750塩基対からなる断片が得られ、つぎにこれをサブクローン化して12-5と名づけ、配列決定した。この断片の各端部は、そのPCRプライマーが得られたArabidopsis estに対応する。これは、12-5と呼ばれる配列である。12-5の推定アミノ酸配列を、Ma524のもの、およびヒト（W28140）、マウス（W53753）、およびC. elegans（R05219）からのestと比較する（図４）。相同性に基づき、これらの配列はデサチュラーゼポリペプチドを表わす。この全長遺伝子は、該est配列に基づくプローブを用いてクローン化することができる。つぎに、この遺伝子を発現ベクターの中に配置して宿主細胞中で発現させることができ、これらの特定のΔ6-または他のデサチュラーゼ活性を以下のように決定することができる。
実施例４
Mortierella alpinaからのΔ-12デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
それが蓄積する脂肪酸に基づき、Mortierella alpinaはω6-型デサチュラーゼを有する。ω６デサチュラーゼはオレイン酸（18:1）からのリノール酸（18:2）の生成に関与する。リノール酸（18:2）は、Δ６デサチュラーゼのための基質である。この実験は、Mortierella alpinaがΔ12-デサチュラーゼポリペプチドを有するかどうかを決定し、もし有するのであれば、対応するヌクレオチド配列を同定するするために設計される。M. alpinaシークエンシング級ライブラリーからランダムに選んだコロニー、Ma648を配列決定し、以前に同定されたデサチュラーゼと相同なDNA配列に基づいて推定デサチュラーゼとして同定した（Ma524について記載のとおり（実施例２を参照のこと））。Ma648 cDNAの5'末端から得たこの推定アミノ酸配列は、大豆ミクロソームω６（Δ12）デサチュラーゼ（受託番号L43921）およびピマの実のオレイン酸12-ヒドロキシラーゼ（受託番号U22378）に対して有意な相同性を示す。さらに、種々の他のω６（Δ12）およびω３（Δ15）脂肪酸デサチュラーゼ配列に対する相同性を観察する。
実施例５
Mortierella alpinaからのチトクロームb5還元酵素ヌクレオチド配列の単離
Mortierella alpinaからチトクロームb5還元酵素をコードする核酸配列を以下のようにして得た。実施例１に記載したように、Mortierella alpinaから単離した全長RNAに基づいてcDNAライブラリーを構築した。これらのクローンのうちの１つ、M12-27の5'末端および3'末端からDNA配列を得た。M12-27の3'末端の推定アミノ酸配列を用いて公共データバンクの検索を行ったところ（図５を参照のこと）、既知のチトクロームb5還元酵素の配列に対して有意な相同性を示した。特に、49アミノ酸領域にわたり、Mortierellaクローンは、ブタ由来のチトクロームb5還元酵素と55％の同一性（73％の相同性）を共有する（図４参照）。
実施例６
パン酵母におけるM. alpinaデサチュラーゼクローンの発現
酵母の形質転換
酵母の酢酸リチウム形質転換は、標準的なプロトコル（Methods in Enzymology, Vol. 194, p. 186-187, 1991）に従って行った。概略を述べると、まず酵母をYPDにおいて30℃で増殖させた。細胞を遠心分離により沈殿させ、TEに再懸濁し、再度遠心分離により沈殿させ、100mMの酢酸リチウムを含むTEに再懸濁し、再度遠心分離により沈殿させ、さらにTE/酢酸リチウムに再懸濁した。再懸濁した酵母を、30℃で60分間震盪培養した。キャリアDNAを加え、酵母を試験管に一定分量に分けた。形質転換DNAを加え、試験管を30℃で30分間インキュベートした。PEG溶液（35%（w/v）PEG4000、100mM酢酸リチウム、TE pH7.5）を加え、その後30℃で50分間インキュベートした。42℃で５分間の熱ショックを行い、細胞をペレット化し、TEで洗浄し、再度ペレット化しTEに再懸濁した。次に再懸濁された細胞を選択培地上にプレート化した。
形質転換された酵母におけるデサチュラーゼの発現
Mortierella alpinaを起源とするcDNAクローンをパン酵母におけるデサチュラーゼ活性についてスクリーニングした。アブラナΔ15-デサチュラーゼ（刊行物に記載された配列（ArondelらScience258:1353-1355）に基づくプライマーを用いて、Brassica napus品種212/88種子からの第１鎖cDNAを用いたPCRにより得られたもの）を陽性対照として用いた。Δ15-デサチュラーゼ遺伝子とcDNAクローンMa29からの遺伝子を発現ベクターpYES2（Invitrogen）に挿入し、プラスミドpCGR-2及びpCGR-4をそれぞれ得た。これらのプラスミドをS. cerevisiae酵母株334にトランスフェクトし、特異的デサチュラーゼ活性の検出を可能にする基質の存在下で、ガラクトースによる誘導の後に発現させた。対照株は変更していないpYES2ベクターを含むS. cerevisiae株334とした。使用した基質、産生された生成物、及び示されたデサチュラーゼ活性は、DGLA（ARAへの変換がΔ5-デサチュラーゼ活性を示す）、リノレン酸（GLAの変換がΔ6-デサチュラーゼ活性を示し、ALAの変換がΔ15-デサチュラーゼ活性を示す）、オレイン酸（S. cerevisiaeによって生成される内在基質、リノレン酸への変換がΔ12-デサチュラーゼ活性を示し、S. cerevisiaeはこれを欠いている）、またはARA（EPAへの変換がΔ17-デサチュラーゼ活性を示す）であった。結果を以下の表１に示す。脂質分画は以下のように抽出した。培養物を15℃で48〜52時間増殖させた。細胞を遠心分離によりペレット化し、滅菌ddH2Oで一回洗浄し、再度ペレット化した。このペレットをメタノールとともに攪拌し、クロロホルムを（内部標準としての）トリトリデカノインとともに加えた。混合物を室温で１時間以上、あるいは４℃で一晩インキュベートした。クロロホルム層を抽出し、１gの無水硫酸ナトリウムとともににWhatmanフィルターを通して濾過し、粒子及び残留水を除去した。窒素流下40℃で有機溶媒を蒸発させた。次に抽出された脂質を、２mlのメタノール中の0.5N水酸化カリウムを密閉管に加えることにより、ガスクロマトグラフィー分析（GC）用の脂肪酸メチルエステル（FAME）に誘導化した。サンプルを30分間95〜100℃に加熱し、室温まで冷却した。約２mlのメタノール中の14%三フッ化ホウ素を加え、加熱処理を繰り返した。抽出された脂質混合物を冷却した後、２mlの水及び１mlのヘキサンを加え、GCによる分析用のFAMEを抽出した。パーセントへの変換は、産生された生成物を、（産生された生成物及び加えた基質の）合計で除し、100を乗ずることによって計算した。オレイン酸パーセント変換を計算するためには、基質が加えられないので、生成されたリノレン酸の総量を、（産生されたオレイン酸とリノレン酸の）合計で除し100を乗ずる。
Figure 0004087460
Δ15-デサチュラーゼ対照クローンは16.3%の基質の変換を示した。Ma29 cDNAを発現するpCGR-4クローンは、15.3%の20:3基質を20:4w6に変換し、これは該遺伝子がΔ5-デサチュラーゼをコードすることを示す。バックグラウンド（基質の非特異的変換）は、これらの場合では０〜３%であった。Ma524 cDNAを発現するpCGR-5クローンは、６％の基質のGLAへの変換を示し、これは、該遺伝子がΔ6-デサチュラーゼをコードすることを示している。Ma648 cDNAを発現するpCGR-7クローンは、63.4％の基質のLAへの変換を示し、これは、該遺伝子がΔ12-デサチュラーゼをコードすることを示している。また、我々は異なる濃度の基質を用いることによって活性の基質阻害を見出した。基質を100μMまで加えた場合、基質を25μMまで加えた場合と比較して生成物へのパーセント変換が低下した（下記参照）。これらのデータは、異種系において異なる基質特異性を有するデサチュラーゼが発現され得、PUFAを生成するのに用いることができるということを示している。
表２に、表示したプラスミドによって酵母宿主S. cerevisiae 334から抽出された脂質の総量のパーセントとして対象の脂肪酸を示す。増殖培地にはグルコースは存在していなかった。アフィニティーガスクロマトグラフィーを用いて各脂質を分離した。GC/MSを用いて生成物の種類を確認した。B. napusΔ15-デサチュラーゼについて予測される生成物であるα-リノレン酸は、その基質であるリノール酸を誘導酵母培地に外部から加えたときに検出された。この知見は、デサチュラーゼ遺伝子の酵母での発現によって、その場合の増殖条件下で機能的酵素及び検出可能な量の生成物が産生することができることを示している。この外部から添加された両基質は酵母に取り込まれるが、何れかを誘導酵母培地に遊離形態で加えると、より長い鎖のPUFA、ジホモ-γ-リノレン酸（20:3）が酵母に組込まれる量はリノール酸（18:2）より僅かに少ない。S. cerevisiae 334（pCGR-5）の誘導および発現の際にリノール酸が存在する場合は、γ-リノレン酸が検出された。このPUFAの存在は、pCGR-5（MA524）からのΔ６デサチュラーゼ活性を示す。リノール酸（S. cerevisiae 334（pCGR-7）の発現から抽出された脂質において同定された）は、M. alpinaを起源とするcDNA MA648をΔ12-デサチュラーゼとして分類する。
Figure 0004087460
実施例７
植物におけるΔ５デサチュラーゼの発現
葉における発現
この実験は、（ノーザンによる決定で）Ma29を発現する葉が外因的に適用されたDGLA（20：3）をARA（20：4）に変換することができるかどうかを決定するために設計された。
Ma29デサチュラーゼcDNAをPCRにより改変し、クローン化に都合のよい制限部位を導入した。デサチュラーゼ・コーディング領域は、アブラナ属植物（Brassica）の葉における発現のための二重35Sプロモーターの制御の下でd35カセット（pCGN5525）に、標準プロトコル（USPN 5,424,200及びUSPN 5,106,739を参照）に従って挿入されている。pCGN5525を含むトランスジェニックアブラナ属植物を標準プロトコルに従って産生させた（USPN 5,188,958及びUSPN 5,463,174を参照）。
最初の実験においては、3種類の植物を用いた：対照LPOO4−1、並びに2種類のトランスジェニック体、5525−23及び5525−29。LP004は低リノレン・アブラナ属変種である。各々の葉を3種類の処理のうちの1つのために選択した：水、GLA又はDGLA。GLA及びDGLAはナトリウム塩としてNuChek Prepから購入し、1mg／mlで水に溶解した。一定分量をN2の下で覆い、−70℃で保存した。50μlの液滴を上面に適用し、手袋を着用した指で穏やかに広げて全面を覆うことにより葉を試験した。塗布は、塗布した脂肪酸のあらゆる光酸化を最小限に止めるため、光サイクルの最後の約30分前に行った。処理の6日後に、各々の処理から1枚の葉を回収し、中央脈を経て半分に切断した。半分の一方は水で洗浄し、取り込まれない脂肪酸の除去を試みた。葉のサンプルを一晩凍結乾燥し、脂肪酸の組成をガスクロマトグラフィー（GC）で決定した。それらの結果を表3に示す。
Figure 0004087460
Figure 0004087460
GLAで処理した葉は1.56〜2.4重量％のGLAを含んでいた。脂肪酸分析では、対照とトランスジェニック葉との脂質組成が本質的に同じであることが示された。DGLAで処理した対照植物の葉は1.2−1.9重量％のDGLA及びバックグランド量のARA（.26−.27重量％）を含んでいた。トランスジェニック葉は僅かに.2−.7重量％のDGLAを含むだけであったが、ARAの量は増加しており（.74−1.1重量％）、これらの葉においてDGLAがARAに変換されたことが示された。
種子における発現
この実験の目的は、種子特異的ナピン（napin）プロモーターを含む構築体が種子において発現可能であるかどうかを決定することであった。
Ma29 cDNAを、以下のプライマー：
Figure 0004087460
を用いてPCRによって改変し、それぞれ、開始及び終止コドンの上流及び下流にXhoIクローニング部位を導入した。
このPCR産物をpAMP1（GIBCOBRL）にCloneAmpシステム（GIBCOBRL）を用いてサブクローン化してpCGN5522を作製し、両鎖の配列決定を行うことによりΔ5デサチュラーゼ配列を確認した。
種子特異的発現のため、Ma29コーディング領域をpCGN5522からXhoI断片として切り出し、ナピン発現カセットpCGN3223のSalI部位に挿入してpCGN5528を作製した。ナピン5’調節領域、Ma29コーディング領域、及びナピン3’調節領域を含むpCGN5528のHindIII断片をpCGN1557のHindIII部位に挿入し、pCGN5531を作製した。2コピーのナピン転写単位を縦列状態で（in tandem）挿入した。この縦列構築体は、遺伝子座当たりデサチュラーゼを高発現させることができる。pCGN5531をアブラナ（Brassica napus）cv.LP004にアグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介形質転換により導入した。
成熟T2種子の20種子のプールの脂肪酸組成をGCで分析した。表4は、独立した形質転換系で得られた結果を非形質転換LP004種子と比較して示す。pCGN5531を含むトランスジェニック種子は対照種子には存在しない2種類の脂肪酸を含み、これらはオレイン酸及びリノール酸に対するそれらの溶出に基づいて仮にタキソール酸（taxoleic acid）（5,9-18：2）及びピノレン酸（pinolenic acid）（5,9,12−18：3）と同定された。これらは、オレイン酸及びリノール酸のΔ5不飽和化の予想産物である。これらのトランスジェニック種子では、他の脂肪酸組成に違いは認められなかった。
Figure 0004087460
Ma29を発現するものを同定するため、ノーザン分析を植物に対して行なう。開花の約25日後又はナピンプロモーターが誘発されたときに発生胚を単離し、実施例7に記載されるようにGLA又はDGLAを含む溶液に浮かべる。次に、実施例7において葉に適用したプロトコルに従い、胚の脂肪酸分析をGCにより行ってDGLAからARAへの変換量を決定する。その後、内在性アブラナ属アシルトランスフェラーゼによってトリグリセリドに取り込まれたARAの量を実施例7と同様にGCで評価する。
実施例8
アブラナ（Brassica napus）におけるM．アルピナ（M. alpina）
Δ6デサチュラーゼの発現
以下のプライマー：
Figure 0004087460
を用いてMa524 cDNAをPCRにより改変し、クローニング部位を導入した。
これらのプライマーは全コーディング領域の増幅を可能にし、XbaI及びXhoI部位を5’末端に、並びにXhoI及びStuI部位を3’末端に追加した。そのPCR産物をCloneAmpシステム（GIBCOBRL）を用いてpAMP1（GIBCOBRL）にサブクローン化してpCGN5535を作製し、両鎖の配列決定を行うことによりΔ6デサチュラーゼ配列を確認した。
種子特異的発現のため、Ma524コーディング領域をXhoI断片としてpCGN5535から切り出し、ナピン発現カセットpCGN3223のSalI部位に挿入してpCGN5536を作製した。ナピン5’調節領域、Ma524コーディング領域、及びナピン3’調節領域を含むpCGN5536のNotI断片をpCGN1557のNotI部位に挿入し、pCGN5538を作製した。pCGN5538をアグロバクテリウム仲介形質転換によりアブラナ（Brassica napus）cv.LP004に導入した。
成熟するT2種子を、温室内の6つの独立した形質転換結果物から集めた。単一の種子の脂肪酸組成をGCにより分析した。表5は対照LP004種子及び6つの5538系統の結果を示す。＃8を除く全ての5538系統はGLAを含む種子を産生した。T2自家受粉種子集団について予想されるように、GLAの存在はこれらの種子において遺伝形質分離（segregate）した。GLAに加えて、M．アルピナΔ6デサチュラーゼは18：4（ステアリドン酸（stearidonic acid））及び6,9−18：2であるものと思われる他の脂肪酸を産生することが可能である。
上述の結果は、3種類の異なる基質特異性を有するデサチュラーゼを異種系において発現させ、多不飽和長鎖脂肪酸の産生に用いることができることを示す。前駆体20：3（DGLA）からのARA（20：4）の産生、18：2基質からのGLA（18：3）の産生、及びGLAの前駆体である18：2への18：1基質の変換が例証された。
Figure 0004087460
Figure 0004087460
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実施例9
アブラナ（Brassica napus）におけるM．アルピナΔ12デサチュラーゼの発現
以下のプライマー：
Figure 0004087460
これらのプライマーは全コーディング領域の増幅を可能にし、BamHI部位を5’末端に、並びにKpnI及びXhoI部位を3’末端に追加した。そのPCR産物をCloneAmpシステム（GIBCOBRL）を用いてpAMP1（GIBCOBRL）にサブクローン化してpCGN5540を作製し、両鎖の配列決定を行うことによりΔ12デサチュラーゼ配列を確認した。
種子特異的発現のため、Ma648コーディング領域をBamHI／XhoI断片としてpCGN5540から切り出し、ナピン発現カセットpCGN3223のBglII及びXhoI部位の間に挿入してpCGN5542を作製した。ナピン5’調節領域、Ma648コーディング領域、及びナピン3’調節領域を含むpCGN5541のAsp718断片をpCGN5138のAsp718部位に挿入し、pCGN5542を作製した。pCGN5542をアグロバクテリウム仲介形質転換によりアブラナ（Brassica napus）の2種類の変種に導入した。市販のアブラナ変種SP30021、及び低リノレン系統LP30108を用いた。
成熟自家受粉T2種子を、温室内で成長させた19の独立したLP30108形質転換結果物及び非形質転換対照から集めた。これらの種子はΔ12デサチュラーゼ導入遺伝子について遺伝形質分離することが予想される。20種子のプールの脂肪酸組成をGCにより分析した。それらの結果を表6に示す。全ての形質転換系統は、Δ12デサチュラーゼの産生物である増加した量の18：2を含有していた。18：3の量はこれらの植物においては大きく増加してはいなかった。結果物＃11及び16はプールした種子において18：2の最大蓄積を示した。これらのT2種子における18：2の量の遺伝形質分離を調べて、後代に引き継がれる個々の植物を同定するため、半種子（half-seed）分析を行った。種子を一晩、暗所において、30度で、水に浸した濾紙上で発芽させた。外子葉をGC分析のために切除し、残りの実生は土壌に植えた。これらの分析のうちの幾つかの結果を表7に示す。M．アルピナΔ12デサチュラーゼを含む個々のT2種子は最高60％の18：2をこれらの種子中に蓄積していた。サンプル97xx1116＃59は遺伝形質分離のない（null segregant）例である。最高の18：2蓄積体においても、18：3の濃度はわずかに増加しただけであった。これらの、及び他の個別に選択されたT2植物を温室内及び野外で成長させ、T3種子を産生させた。
成熟自家受粉T2種子を、温室内で成長させた20個の独立したSP30021形質転換結果物及び非形質転換対照から集めた。これらの種子はΔ12デサチュラーゼ導入遺伝子について遺伝形質分離することが予想される。20種子のプールの脂肪酸組成をGCにより分析した。そのデータは表8に提示されている。全ての形質転換系統は、Δ12デサチュラーゼの産生物である増加した量の18：2を含有していた。低リノレンLP30108系統と同様に、18：3の量は大きく増加してはいなかった。結果物＃4及び12はプールした種子において18：2の最大蓄積を示した。これらのT2種子における18：2の量の遺伝形質分離を調べて、後代に引き継がれる個々の植物を同定するため、半種子分析を行った。種子を一晩、暗所において、30度で、水に浸した濾紙上で発芽させた。外子葉をGC分析のために切除し、残りの実生は土壌に植えた。これらの分析のうちの幾つかの結果を表9に示す。サンプル97xx1157#88及び#18はそれぞれ、5542−SP30021−4及び5542-SP30021−12について遺伝形質分離のないの無偏出の例である。これらの、及び他の個別に選択されたT2植物を温室内及び野外で成長させ、T3種子を産生させた。
Figure 0004087460
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実施例10
アブラナ（Brassica napus）におけるM．アルピナΔ6及びΔ12デサチュラーゼの同時発現
M．アルピナΔ6及びΔ12デサチュラーゼを同じT−DNAから発現させるため、以下の種子特異的発現のための構築体を作製した。
ナピン5’調節領域、Ma524コーディング領域、及びナピン3’調節領域を含むpCGN5536のNotI断片をpCGN5542のNotI部位に挿入し、pCGN5544を作製した。発現モジュールは、Ma524及びMa648及びnptIIマーカーからの転写の方向が同じになるように配向した。
pCGN5544をアグロバクテリウム仲介形質転換によりアブラナ（Brassica napus）cv.LP30108に導入した。成熟自家受粉T2種子を、温室内で成長させた16個の独立したLP30108形質転換結果物及び非形質転換対照から集めた。これらの種子はΔ6＋Δ12デサチュラーゼ導入遺伝子について遺伝形質分離することが予想される。20種子のプールの脂肪酸組成をGCにより分析した。それらの結果が表10に提示されている。系統のうちの1つ（5544−LP30108−3）を除く全ての形質転換系統が、対照と比較して油組成の変化を示す。GLAは系統のうちの3つ（−3、−4、−11）を除く全てにおいて産生された；GLAを含まないこれら3つのうちの2つ（−4、−11）は18：2の増加を示し、これはΔ12デサチュラーゼの発現を示すものである。群としては、二重Δ6＋Δ12構築体（pCGN5544）を含む植物において観察されるGLAの量は、pCGN5538（Δ6単独）を含む植物よりも高かった。加えて、Δ6,918：2の量は、Δ6単独と比較して、Δ12＋Δ6を含む植物において大きく低下していた。したがって、1つのT−DNA上でのΔ6及びΔ12デサチュラーゼの組み合わせは、Δ6デサチュラーゼ単独の発現よりも多くのGLA及び少ない副生物の蓄積につながる。これらのT2種子におけるGLA量の遺伝形質分離を調べて、後代に引き継がれる個々の植物を同定するため、半種子分析を行った。種子を一晩、暗所において、30度で、水に浸した濾紙上で発芽させた。外子葉をGC分析のために切除し、残りの実生は土壌に植えた。これらの分析のうちの幾つかの結果を表11に示す。T2集団について予想されるように、GLA及び18：2の量は個々の種子において遺伝形質分離している。全脂肪酸のうちの60％以下のGLA含量が個々の種子において観察された。個々の結果物を選択し、T3種子を産生させるために温室内及び野外で成長させた。
本発明の構築体を発現する、アブラナ属植物、ダイズ、ベニバナ、トウモロコシ、アマ及びヒマワリを含むトランスジェニック植物がGLAの良好な供給源であり得る。
ルリチシャのようなGLAの典型的な供給源が産生するGLAは、最大でも25％である。対照的に、表10における植物は最高30％のGLAを含む。さらに、表11に示される個々の種子は最高60％のGLAを含む。
Figure 0004087460
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実施例11
アブラナ（Brassica napus）におけるM．アルピナΔ5及びΔ6デサチュラーゼの同時発現
トランスジェニックアブラナの油中にアラカドン酸（arachadonic acid）（ARA）を産生させるため、Δ5及びΔ6デサチュラーゼ活性を導入する必要がある。下流の特徴付け及び繁殖を容易にするため、両活性を単一のT−DNAによってコードさせることが有利であり得る。以下の例はΔ5及びΔ6デサチュラーゼの同時発現を説明する。
ナピン5’調節領域、Ma29コーディング領域、及びナピン3’調節領域を含むpCGN5528のAsp718断片をpCGN5138のAsp718部位に挿入し、pCGN5545を作製した。ナピン5’調節領域、Ma524コーディング領域、及びナピン3’調節領域を含むpCGN5536のNotI断片をpCGN5545のNotI部位に挿入し、pCGN5546を作製した。発現モジュールは、Ma524及びMa29及びnptIIマーカーからの転写の方向が同じになるように配向した。
pCGN5546をアグロバクテリウム仲介形質転換によりアブラナ（Brassica napus）cv.LP30108に導入した。成熟自家受粉T2種子を、温室内で成長させた30個の独立したLP30108形質転換結果物から集めた。20種子のプールの脂肪酸組成をGCにより分析した。それらの結果を表12に示す。Δ5,918：2（pCGN5531植物に見られる）及びΔ6,918：2及びGLA（pCGN5538植物に見られる）の存在によって立証されるように、全ての系統が両デサチュラーゼの発現を示す。
Figure 0004087460
Figure 0004087460
実施例12
アブラナ（Brassica napus）におけるM．アルピナΔ5、Δ6及びΔ12デサチュラーゼの同時発現
トランスジェニックアブラナの油中におけるARAの最適な産生を達成するためには、Δ5活性に加えてΔ6及びΔ12デサチュラーゼ活性の両者が存在する必要があり得る。下流の特徴付け及び繁殖を容易にするため、これらの活性の全てを単一のT−DNAによってコードさせることが有利であり得る。以下の例はΔ5、Δ6及びΔ12デサチュラーゼの同時発現を説明する。
ナピン5’調節領域、Ma29コーディング領域、及びナピン3’調節領域を含むpCGN5528のHindIII断片をpCGN5544のHindIII部位に挿入し、pCGN5547を作製した。発現モジュールは、Ma29，Ma524，Ma648及びnptIIマーカーからの転写の方向が同じになるように配向した。
pCGN5547をアグロバクテリウム仲介形質転換によりアブラナ（Brassica napus）cv.LP30108に導入した。成熟自家受粉T2種子を、温室内で成長させた30個の独立したLP30108形質転換結果物から集めた。20種子のプールの脂肪酸組成をGCにより分析した。それらの結果を表13に示す。27の系統がかなりの量のGLAの蓄積を示し、一般には、観察されたGLAの量は、Δ12デサチュラーゼを含まない5546植物において見られるものよりも高かった。大部分の植物において、検出可能なΔ6,9 18：2の量及び高い18：2の量が欠如していることによって立証されるように、このΔ12デサチュラーゼはほとんどの系統において活性であるものと思われる。その濃度は一般には5546植物において観察されるものを下回るものの、少量のΔ5,9 18：2が5547植物において見られる。これは、Δ5位置で不飽和化可能となる前に18：1を18：2に効率的に変換するΔ12デサチュラーゼの存在によるものである可能性がある。
Figure 0004087460
Figure 0004087460
実施例13
Δ6−不飽和化油の立体特異的分布
この実験は、pCGN5538（Ma524 cDNA）を発現する種子におけるΔ6−不飽和化油の立体特異的分布を調べるために設計された。3種類の種子サンプルを用いた：
1）非形質転換アブラナ（B. napus）cv.LP004種子（対照）
2）pCGN5538−LP004−19の、遺伝形質分離するT2種子
3）pCGN5538−LP004−29の、遺伝形質分離するT2種子
以下のプロトコルを分析に用いた：
1．種子油の抽出
50個の種子を12×32ｍｍバイアルに入れ、ガラス棒で粉砕した。1.25ｍＬのヘキサンを添加し、その混合物を渦巻き巻き攪拌した。振盪器で種子を一晩抽出した。次に、この抽出物を、1ccシリンジに装着した0.2ミクロンフィルターを通して濾過した。その後、この抽出物を窒素の下で乾燥させた。生じた油を全油サンプルの消化及び誘導体化に用いた。
２．消化
A．液体油消化
TAGの50％消化を得るため、貯蔵リパーゼ（Rhizopus arrhizus由来、Sigma、L4384）を約600,000単位／ｍＬに希釈した。この貯蔵リパーゼを4℃に維持し、氷上に置く。試薬の量は消化しようとする油の量に従って調整することができる。
以下の量は2.0mgの抽出油サンプルに基づくものである。12×32ｍｍスクリューキャップバイアルに以下のものを加えた：2.0mgの油、200μLの0.1MトリスＨＣｌ pH7、40μLの2.2w／v％ＣａＣｌ2 2H2O、及び100μLの0.05w／v％胆汁酸塩。これらの物質を渦巻き攪拌及び超音波処理して油中に分散させた。20μLの希釈リパーゼを添加し、その混合物を室温で1.0分間連続的に渦巻き攪拌した。白色沈殿が形成された。反応を100μLの6M ＨＣｌ及び渦巻き攪拌で停止させた。500μLのＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ（2：1）を添加し、その混合物を渦巻き攪拌して、残りの消化を行う間氷上に保持した。サンプルを再度渦巻き攪拌し、簡単に遠心分離して層を明確した。消化産物を含む下層をパスツールピペットで取り出し、12×32ｍｍクリンプキャップ・バイアルに入れた。次に、この物質を300μLのＣＨＣｌ3で再抽出し、渦巻き攪拌し、遠心分離して、下層と合わせた。できる限り多い量の氷の上に消化産物を保持した。消化の後できるだけ早くHPLC分離を行ってアシル移動（acyl migration）を最小化した。
B．固形脂肪消化
20μlの11：0メチルエステルを2.0mgの固形脂肪に添加することを除いて、上述の液体油消化の手順に従った。
3．HPLC分離
消化産物をクロロホルム中で約200μLまで乾燥させた。次に、各々のサンプルを8×40mmシェルバイアル（shell vial）内のインサートに移し、30μLをHPLC分析のために注入した。
この高速液体クロマトグラフィー・システムは、管温度が105℃で窒素ガス流が40mL／分であるVarex ELSD IIA蒸発光散乱検出器；Waters 712 Wispオートサンプラー、3つのBeckman 114M Solvent Delivery Module；Beckman 421Aコントローラー、Rheodyne気体作動流（pneumatically actuated stream）型スプリッター；及びGilsonマイクロ・フラクショネーターを備えていた。クロマトグラフィーカラムは、Brownleeによる220×4.6mm、5ミクロン正常相シリカ・カートリッジである。
用いた3種類の溶媒は：
A＝ヘキサン：トルエン 1：1
B＝トルエン：酢酸エチル 3：1
C＝酢酸エチル中5％のギ酸
であった。
勾配プロフィールは以下の通りであった：
Figure 0004087460
クロマトグラフィー標準混合液は、ヘキサン：トルエン1：1中に以下のものを含めて調製する：
0.2mg／mLトリグリセリド16：0
2.0mg／mL 16：0遊離脂肪酸
0.2mg／mLジ16：0混合異性体（1，2−ジアシルグリセロール及び1，3−ジアシルグリセロール）
0.2mg／mL 3−モノアシルグリセロール16：0
0.2mg／mL 2−モノアシルグリセロール16：0
各々のサンプルについて、2−magピークを含む画分をコントロールド・タイムド・イベンツ・リレー（controlled timed events relays）の方法により自動的に集める。検出器をコレクターのエミッターと同期させるのに時間遅延を用いる。2−magピークを集め、それらの画分を室温で一晩蒸発させる。
sn−2組成の結果はアシル移動の最小化に依存する。クロマトグラフィーにおける1−モノアシルグリセロール及び／又は3−モノアシルグリセロールピークの出現は、アシル移動が生じていることを意味する。
4．誘導体化
全油を誘導体化するため、1.0mgの抽出油全体を秤量して12×32ｍｍクリンプキャップ・バイアルに入れた。その後、1mLのトルエンを添加した。次に、このサンプルを渦巻き攪拌し、誘導体化のために50μLアリコートを取り出した。乾燥した2−magサンプルに50μLのトルエンを添加した。全油及び2−mag画分に105μLの8.76重量％Ｈ2ＳＯ4／ＣＨ3ＯＨを添加する。キャップをきつく締め、サンプルを95℃で1時間還流させた。サンプルを冷却し、500μLの水中10w／v％のＮａＣｌ及び60μLのヘプタンを添加した。有機層を取り出し、12×32mmクリンプキャップ・バイアルに挿入した。
5．GLC分析
スプリット／スプリットレス・キャピラリー導入口、FID検出器、6890シリーズ・オートサンプラー及び3392A Alpha Omegaインテグレーターを備えるHewlett Packardモデル6890 GCを、キャピラリーカラムに対して以下のように設定する：
A. Supelco Omegawax 250、30m長、0.25mm内径、0.25μm膜厚
注入口： 260℃
検出器： 270℃
初期温度： 170℃
初期時間： 1.5分
速度： 30度／分
最終温度： 245℃
最終時間： 6.5分
注入容量： 1.5μL
ヘッド圧： 25psi
スプリット比： 30
キャリアガス： Ｈｅ
補給（make up）ガス：Ｎ2
FIDガス： Ｈ＋空気
脂肪酸メチルエステルの組成パーセントをモルパーセントとして算出する。12未満の炭素鎖長については、理論的又は経験的レスポンス・ファクターを面積パーセントの算出において用いることが望ましい。
6．計算
各sn−1及びsn−3位の各アシル基の平均分布を算出した。
平均sn−1及びsn−3組成＝（3ＷＯ組成−MAG組成）／2
WO＝全油
MAG＝モノアシルグリセロール
この分析の結果が表14に提示されている。GLA及びΔ6,918：2はsn−２及びsn−1，3位の間で均等に分布する。この分析は、sn−１対sn−3位の脂肪酸を区別することができない。
Figure 0004087460
実施例14
トランスジェニック植物の脂肪酸組成
Δ5及びΔ6トランスジェニック植物をそれらの脂肪酸含量について分析した。以下のプロトコルを油の抽出に用いた：
1．約400mgの種子を、各々のサンプルについて2回秤量した。
2．これらの種子の乳鉢及び乳棒で粉砕した。この乳鉢及び乳棒を3mlの（2：1）（v：v）ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ／ＭｅＯＨで2回すすいだ。さらに6ml（2：1）を20mlガラスバイアルに加えた（油を合計12ml 2：1中に抽出）。
3．サンプルを渦巻き攪拌し、オービタル・シェーカー上に時折攪拌しながら2時間置いた。
4．5mlの1M ＮａＣｌを各サンプルに添加した。サンプルを渦巻き攪拌した後、遠心機において200rmpで5分間回転させた。パスツールピペットを用いて下相を抜き出した。
5．上相をさらに5mlで再抽出した。サンプルを渦巻き攪拌した後、遠心機において2000rpmで５分間回転させた。パスツールピペットを用いて下相を抜き出し、前の下相に添加した。
6．ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ／ＭｅＯＨを、窒素下で、気化冷却（evaporative cooling）を用いて蒸発させた。抽出油を収容するバイアルを窒素の下で密封した。各々のサンプルについて120mg−160mgの油を抽出した。
GC−MS分析のため、脂肪酸メチルエステルを適切な容量のヘキサンに溶解し、30m×0.32mm内径、Omegawax 320溶融シリカキャピラリーカラム（Supelco、Bellefonte、PA）及びHewlett−Packard 5972シリーズ質量選択検出器（mass selective detector）を備えるHewlett−Packard 5890 Series II Plusガスクロマトグラフィー（Hewlett Packard、Palo Alto、CA）を用いて分析した。質量スペクトルを、MS Chem Station（＃G1036A）（Hewlett Packard）を用いてNIST／EPA／NIH Chemical Structure Databaseにおける質量スペクトルと比較することにより解釈した。
トランスジェニック系統5531−6を2回（A、B）分析し、対照系統LP004−6と比較した。脂肪酸プロフィールの結果を表15に示す。
トランスジェニック系統5538−19を2回（A、B）分析し、対照系統LP004−6と比較した。脂肪酸プロフィールの結果を表16に示す。
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
実施例15
交雑により達成される、アブラナ（b．napus）における
Δ6及びΔ12デサチュラーゼの組み合わせ発現
Δ6又はΔ12デサチュラーゼのいずれかを含む植物を交雑させ、個々のF1半種子を脂肪酸組成についてGCにより分析した。そのような交雑種の1つからのデータを表17に示す。この交雑のための親は5538−LP004−25−2−25（Δ6発現体）及び5542−SP30021−10−16（Δ12発現体）であった。正逆交雑（reciprocal crosses）を作製した。各々の25個の独立F1種子の結果を表に示す。交雑種は示される最初の親が雌性であるように記述される。交雑種の組の両者からほぼ同じ結果が得られた。親と比較すると、Δ6,918：2は減少し、GLAは増加した。その上、Δ9,1218：2の量もほとんどのF1において増加する。これらはF1種子であり、各々のデサチュラーゼの1組のみを含むことに注意されたい。先の世代及び各デサチュラーゼについてホモ接合である結果物（event）の選択においては、得られるF2 GLA量はさらに高いものであり得る。
交雑による組み合わせ形質は、ある状況において1つのT−DNA上で形質を組み合わせるのに好ましいものであり得る。特に、両遺伝子が同じプロモーター（この場合にはナピン）で駆動される場合には、プロモーターの静止化を発動することが複数のcDNAを1つの構築体に配することよりもこのアプローチに好ましいものであり得る。
あるいは、幾つかの場合においては、1つのT−DNA上で複数のcDNAを組み合わせることが選り抜きの方法であり得る。これらの結果を表17に示す。
Figure 0004087460
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実施例16
ダイズにおけるM．アルピナ・デサチュラーゼの発現
M．アルピナ・デサチュラーゼは、以下の発現構築体を用いることにより、ダイズにおいてGLA及び他のPUFAの産生を駆動させるのに用いることができる。アグロバクテリウム感染又は粒子銃が外来性DNAをダイズゲノムに挿入することができる2つの手段である。粒子銃形質転換は米国特許第5,503,998号に開示されている。植物はグリフォセート耐性マーカー（4,971,908）を用いて選択することができる。ダイズのアグロバクテリウム形質転換は当業者にとって確立されたものである。
種子特異的発現のため、デサチュラーゼcDNAのコーディング領域を、Glycine max α型βコングリシニン貯蔵タンパク質遺伝子の5’調節領域の制御下に置く。用いることができるこの特定の領域はgi 169928（Doyle, J.J., Schuler, M.A., Godette, W.D., Zenger, V., Beachy, R.N., and Slightom, J.L., 1986 J. Biol. Chem. 261（20）, 9228-9238）のヌクレオチド78−921である。用いることができる3’調節領域はエンドウマメリブロース1，5ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット（rbcS）遺伝子に由来するものである。用いられる特定の配列は、gi 169145（Hunt, A.G. 1988 DNA 7：329-336）のヌクレオチド1−645である。
ダイズ種子はアブラナ属よりも多くの18：2、及び、おそらくは多くの内在性Δ12デサチュラーゼ活性を有するため、最適GLA量の達成に対するMortierellaΔ12デサチュラーゼの効果を以下のように試験することができる。Δ6 cDNAを含む構築体は、Δ6,918：2がGLAと共に産生されるかどうかを調べるのに用いることができる。Δ12デサチュラーゼを含む構築体は、ダイズにおいて18：2の量を増加させることが可能かどうかを調べるのに用いることができる。Δ6及びΔ12デサチュラーゼの両者を含む構築体は、最適量のGLAを産生させるのに用いることができる。その代わりに、必要であれば、単一のデサチュラーゼの各々を含む植物を交雑させてそれらの遺伝子を組み合わせることができる。
Δ5デサチュラーゼを単独で、又はΔ12及び／又はΔ6デサチュラーゼと組み合わせて発現させるために、類似の構築体を作製することができる。
実施例17
ヒトデサチュラーゼ遺伝子配列
長鎖多不飽和脂肪酸生合成に関与している可能性のあるヒトデサチュラーゼ遺伝子配列を、ヒトcDNA配列とMortierella alpinaのデサチュラーゼ遺伝子配列との相同性に基づいて単離した。膜結合デサチュラーゼに保存されていることが知られている３種の保存「ヒスチジンボックス」が認められた。他のいくつかの膜結合デサチュラーゼのように、最終HXXHHヒスチジンボックスモチーフがQXXHHであることが判った。推定上のヒトデサチュラーゼのアミノ酸配列は、M. alpinaΔ５、Δ６、Δ９、及びΔ12デサチュラーゼとの相同性を示した。
M. alpinaΔ5-デサチュラーゼ及びΔ６デサチュラーゼcDNA配列を用いて、Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, California 94304のLifeSeqデータベースをサーチした。Δ５デサチュラーゼ配列は、断片１）アミノ酸番号１〜150、２）アミノ酸番号151〜300、及び３）アミノ酸番号301〜446に分けられた。Δ６デサチュラーゼ配列は、３つの断片、１）アミノ酸番号１〜150、２）アミノ酸番号151〜300、及び３）アミノ酸番号301〜457に分けられた。これらのポリペプチド断片について、"tblastn"アルゴリズムを用いてデータベースを検索した。このアルゴリズムは、タンパク質のクエリー配列を、（両鎖の）６種の全てのリーディングフレームに動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースと比較するアルゴリズムである。
M. alpinaΔ５及びΔ６のポリペプチド断片２及び３は、表18に概要を示したCloneID配列と相同性を有する。このCloneIDはIncyte LifeSeqデータベースからの個々の配列を示す。"tblastn"の結果を検討した後、異なるCloneID番号について、>=50の厳密性（Stringency）、及び<=100の積スコア（Productscore）のデフォルトの設定でクローン情報（Clone Information）を検索した。クローン情報結果（Clone Infomation Results）は、ClusterID、CloneID、Library、HitID、Hit Descriptionを含む情報を表示する。選択時に、ClusterID番号はそのClusterIDに属する全てのクローンのクローン情報を表示する。Assembleコマンドにより、そのClusterIDを含む全てのCloneIDが集められる。以下のデフォルト設定は、GCG（Genetic Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53705）Assemblyのために用いられたものである。
ワードサイズ（Word Size）：７
最少重複（Minimum Overlap）：14
厳密性（Stringency）：0.8
最少同一性（Minimum Identity）：14
最大ギャップ（Maximum Gap）：10
ギャップ重み（Gap Weight）：８
長さ重み（Length Weight）：２
GCG Assembly Resultsは、CloneID内の配列情報に基づいて生成されたコンティグを表示した。コンティグはこれらの配列間の相同な領域に基づくDNA配列のアライメントである。コンティグ内においてアライメントされたDNA配列に基づいて新たな配列（コンセンサス配列）を生成した。CloneIDを含むコンティグが同定され、コンセンサス配列の曖昧な部位はCloneIDのアライメント（配列番号31〜配列番号35参照）に基づいて編集し、最も可能性の高い配列を生成した。この手順を表18に挙げた６種の全てのCloneIDについて繰り返した。これにより５種のユニークなコンティグが生成された。５種のコンティグの編集されたコンセンサス配列を、Sequencherソフトウェアプログラム（Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan 48 105）にインポートした。これらのコンセンサス配列を組み立てた。コンティグ2511785はコンティグ3506132と重複しており、この新たなコンティグは2535（配列番号37）と称する。Sequencherプログラムからのコンティグを、GCGのSequence Analysisソフトウェアパッケージにコピーした。
６種の全てのリーディングフレームにおいて各コンティグをタンパク質配列に翻訳した。M. alpinaΔ５（MA29）及びΔ６（MA524）配列を、FastAサーチ（クエリー配列及び同じ種類（核酸またはタンパク質）の配列群との間の類似性についてのPearson and Lipmanサーチ）を用いて、翻訳された各コンティグと比較した。これらの配列間の相同性は、各コンティグのオープンリーディングフレームを示唆するものである。コンティグ2535及び3854933に対するM. alpinaΔ５及びΔ６の間の相同性を利用して、253538aと称する最終コンティグを形成した。図９は、最終コンティグ253538aとMA29とのFastAマッチであり、図10は、最終コンティグ253538aとMA524とのFastAマッチである。種々のコンティグのDNA配列を配列番号31〜配列番号37に示す。種々のペプチドの配列を配列番号38〜配列番号44に示す。
２つのコンティグを合わせることによりオープンリーディングフレームが生成されるが、コンティグ2535はこのコンティグの最初の部分にコンティグ3854933と一致しないユニークな配列が存在することを示している。従って、これらのコンティグがヒト遺伝子のような独立したデサチュラーゼから生成されたものである可能性がある。
コンティグ253538aは、432個のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームはGln（CAG）から始まり、終止コドン（TGA）で終わる。コンティグ253538aはM. alpinaΔ５及びΔ６配列の双方とアライメントされ、これはこのコンティグが前記デサチュラーゼの何れかで有り得るとともに、互いに相同性を共有する他の公知のデサチュラーゼであり得ることを示唆している。表18に挙げた個々のコンティグ並びに中間コンティグ2535及び最終コンティグ253538aを利用してヒトデサチュラーゼの完全な遺伝子を単離することができる。
ヒトデサチュラーゼの使用
これらのヒト配列は、先の実施例で説明した手順を用いて酵母及び植物で発現することができる。哺乳動物細胞及びトランスジェニック動物での発現については、これらの遺伝子は優位コドンバイアスを与え得る。さらに、これらの配列は、他の生物由来の関連デサチュラーゼ遺伝子を単離するために用いることもできる。
Figure 0004087460
実施例18
M. alpinaΔ５及びΔ６デサチュラーゼの相同体の同定
推定上のΔ５デサチュラーゼをコードする核酸配列を、Ma29のアミノ酸100-446をクエリーとして用いたNCBIによる発現した配列タグのデータベースのTBLASTNサーチにより同定した。Ma29配列の切断された一部分を用いて、デサチュラーゼのN末端におけるチトクロームb5部分に基づく相同性を選択することを回避した。Dictyosterium discoideum（受託番号C25549）からのestの推定アミノ酸配列はMa29に対して非常に有意な相同性を示し、そしてMa524に対してもそれより低い程度であるが依然として有意な相同性を示す。このDNA配列を配列番号45として示す。アミノ酸配列を配列番号46として示す。
実施例19
他のPUFA産生生物におけるM. alpinaΔ５及びΔ６相同体の同定
PUFAの産生に関与するデサチュラーゼを得るために、Phaeodactylum tricornutum種から単離された全RNAからcDNAライブラリーを構築した。プラスミドベースのcDNAライブラリーを、市販のキット（GIBCO-BRL）をその使用説明書に従って用いて、pSPORT1（GIBCO-BRL）中に構築した。無作為なcDNAクローンを配列決定し、推定されるΔ５またはΔ６デサチュラーゼをコードする核酸配列を、データベースのBLASTサーチ及びMa29及びMa524配列との比較によって同定した。
Ma29及びMa524と相同性を有する１種のクローンがPhaeodactylumライブラリーから同定された。これを144-011-B12と称する。このDNA配列を配列番号47として示す。アミノ酸配列を配列番号48として示す。
実施例20
他のPUFA産生生物におけるM. alpinaΔ５及びΔ６相同体の同定
PUFAの産生に関与するデサチュラーゼを得るために、Schizochytrium種から単離された全RNAからcDNAライブラリーを構築した。プラスミドベースのcDNAライブラリーを、市販のキット（GIBCO-BRL）をその使用説明書に従って用いて、pSPORT1（GIBCO-BRL）中に構築した。無作為なcDNAクローンを配列決定し、推定されるΔ５またはΔ６デサチュラーゼをコードする核酸配列を、データベースのBLASTサーチ及びMa29及びMa524配列との比較によって同定した。
Ma29及びMa524と相同性を有する１種のクローンがSchizochytriumライブラリーから同定された。これを81-23-C7と称する。このクローンは約1kbのインサートを含む。ユニバーサルフォワード及びリバースシークエンシングプライマーを用いてクローンの各末端から部分配列を得た。フォワードプライマーから得たDNA配列を配列番号49として示す。そのペプチド配列を配列番号50として示す。リバースプライマーから得たDNA配列を配列番号51として示す。リバーズプライマーから得られたアミノ酸配列を配列番号52として示す。
実施例21
栄養組成物
上記実施例のPUFAは、様々な栄養補助剤、乳幼児用配合物、栄養代用物やその他の栄養液に用いることが出来る。
Ｉ 乳幼児用配合物
A．Isomil▲Ｒ▼鉄分含有大豆配合物
用法：牛乳にアレルギーや不耐症を持つ乳幼児、小児、成人の飲用。ラクトースを避けなければならない障害（ラクターゼ欠損症、ラクトース不耐症、ガラクトース血症）の患者の食餌
特徴：
・大豆タンパク質単離物により牛乳由来タンパク質へのアレルギー、過敏症の症状を防ぐ
・ラクトース非含有の組成がラクトース性の下痢を防ぐ
・低いオスモル濃度（240 mOsm/kg水）が浸透圧性の下痢の危険を抑える
・２種の炭水化物（コーンシロップ、ショ糖）が炭水化物の吸収を促進するように設計されており、弱った腸の吸収力を超過する危険を抑える
・100カロリーあたり1.8mgの鉄分（硫酸第一鉄として）が鉄分欠乏症を防ぐ
・推奨量のビタミン、ミネラル
・植物油により推奨量の脂肪酸を供給
・乳白色、牛乳と同程度のコンシステンシー、心地よい香り
成分：（Pareve▲Ｕ▼）85%水、4.9%コーンシロップ、2.6%糖（ショ糖）、2.1%大豆油、1.9%大豆タンパク質単離物、1.4%ココナッツオイル、0.15%クエン酸カルシウム、0.11%リン酸カルシウム三塩基、クエン酸カリウム、リン酸カリウム一塩基、塩化カリウム、モノグリセリド、ジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、L-メチオニン、塩化マグネシウム、リン酸カリウム二塩基、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、m-イノシトール、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、L-カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
B．Isomil▲Ｒ▼DF整腸用大豆配合物
用法：乳幼児の下痢時食餌管理における短期間の食餌
特徴：
・第一乳幼児用配合物は特に整腸用に添加された大豆繊維由来の食物繊維を含む
・乳幼児の中程度から重度の下痢において、ゆるく水っぽい便の期間を短縮することが臨床的に示されている
・乳幼児の栄養学的要求を完全に満たしている
・大豆タンパク質単離物と添加L-メチオニンは乳幼児の必要とする全ての必須アミノ酸量に合致またはそれを上回っている
・ラクトース非含有の配合がラクトース性下痢を防ぐ
・低いオスモル濃度（240 mOsm/kg水）が浸透圧性の下痢の危険を抑える
・２種の炭水化物（コーンシロップ、ショ糖）が炭水化物の吸収を促進するように設計されており、弱った腸の吸収力を超過する危険を抑えている
・アメリカ小児科学会栄養学委員会の推薦値、乳幼児調合乳法の要求値を満たすかまたは上回るビタミンとミネラルのレベル
・100カロリーあたり1.8mgの鉄分（硫酸第一鉄として）が鉄分欠乏症を防ぐ
・植物油により推奨量の脂肪酸を供給
成分：（Pareve▲Ｕ▼）86%水、4.8%コーンシロップ、2.5%糖（ショ糖）、2.1%大豆油、2.0%大豆タンパク質単離物、1.4%ココナッツオイル、0.77%大豆繊維、0.12%クエン酸カルシウム、0.11%リン酸カルシウム三塩基、0.10%クエン酸カリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム一塩基、モノグリセリド、ジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、L-メチオニン、硫酸カリウム二塩基、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、m-イノシトール、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、L-カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
C．Isomil▲Ｒ▼SF鉄分含有ショ糖非含有大豆配合物
用法：牛乳のタンパク質に対するアレルギーや過敏症またはショ糖への不耐症を持つ乳幼児、小児、成人の飲用。ラクトース、ショ糖を避けなければならない疾患を有する患者の食餌。
特徴：
・大豆タンパク質単離物により牛乳由来タンパク質へのアレルギー、過敏症の症状を防ぐ
・ラクトース非含有の配合がラクトース性の下痢を防ぐ（炭水化物はPolycose▲Ｒ▼グルコースポリマー）
・ショ糖不耐性患者のためにショ糖非含有
・低いオスモル濃度（180 mOsm/kg水）が浸透圧性の下痢の危険を抑える
・100カロリーあたり1.8mgの鉄分（硫酸第一鉄として）が鉄分欠乏症を防ぐ
・推薦量のビタミン、ミネラル
・植物油により推奨量の脂肪酸を供給する
・乳白色、牛乳と同程度のコンシステンシー濃度、心地よい香り
成分：（Pareve▲Ｕ▼）75%水、ll.8%加水分解コーンスターチ、4.1%大豆油、4.1%大豆タンパク質単離物、2.8%ココナッツオイル、1.0%改質コーンスターチ、0.38%リン酸カルシウム三塩基、0.17%クエン酸カリウム、0.13%塩化カリウム、モノグリセリド、ジグリセリド、大豆レシチン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、L-メチオニン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、カラゲナン、タウリン、硫酸第一鉄、m-イノシトール、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、L-カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
D．Isomil▲Ｒ▼20鉄分含有大豆配合物、そのまま摂取可能、20 Cal/fl oz
用法：大豆食餌が望ましい場合
成分：（Pareve▲Ｕ▼）85%水、4.9%コーンシロップ、2.6%糖（ショ糖）、2.1%大豆油、1.9%大豆タンパク質単離物、1.4%ココナッツオイル、0.15%クエン酸カルシウム、0.11%リン酸カルシウム三塩基、クエン酸カリウム、リン酸カリウム一塩基、塩化カリウム、モノグリセリド、ジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、L-メチオニン、塩化マグネシウム、硫酸カリウム二塩基、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、m-イノシトール、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、L-カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
E．Similac▲Ｒ▼乳幼児用配合物
用法：乳幼児用配合物が必要なとき：一歳児になる前に母乳を中止する決定がなされたとき、母乳の補助が必要なとき、あるいは母乳を使用していない場合に通常の食餌として
特徴：
・良好な成長に適した質、量のタンパク質、熱変性され乳性腸失血の危険を低減する
・植物油混合物（二回ホモゲナイズしたもの）由来の脂肪が、容易に吸収される必須のリノール酸を供給する
・ラクトースとしての炭水化物中の比率が母乳におけるものと類似する
・低腎溶質負荷が発達中の器官の負担を最小化する
・粉末、濃縮液体、及びそのまま摂取できるものの三種の形態
成分：（▲Ｕ▼-D）水、脱脂乳、ラクトース、大豆油、ココナッツオイル、モノグリセリド、ジグリセリド、大豆レシチン、アスコルビン酸、カラゲナン、塩化コリン、タウリン、m-イノシトール、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
F．Similac▲Ｒ▼NeoCare鉄分含有未熟児配合物
用法：退院後の未熟児の特別な栄養要求用。Similac NeoCareは、未熟児の成長を追いつかせ、発達を支持するために必要なカロリー、タンパク質、ビタミン、及びミネラル分を追加した、栄養学的に完全な配合物である。
特徴：
・カロリーとビタミンの補助の必要性を低減する。標準期間配合物（20 Cal/fl oz）よりも多いカロリー（22 Cal/fl oz）
・中鎖トリグリセリド（MCTオイル）を配合した高吸収性混合脂肪が未熟児の特別な消化の要求に答えるのを助ける
・100カロリーあたりのより高いレベルのタンパク質、ビタミン、及びミネラルが、入院時に始められた栄養学的支持を延長する
・骨の石化改良のためのより多くのカルシウムとリン酸
成分：▲Ｕ▼-D 固形コーンシロップ、脱脂乳、ラクトース、乳清タンパク質濃縮物、大豆油、高オレイン酸ベニバナ油、分画化ココナッツオイル（中鎖トリグリセリド）、ココナッツオイル、クエン酸カリウム、リン酸カルシウム三塩基、炭酸カルシウム、アスコルビン酸、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、タウリン、硫酸第一鉄、m-イノシトール、塩化コリン、パルミチン酸アスコルビル、L-カルニチン、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、混合トコフェロール、クエン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩化チアミン塩酸塩、パルミチン酸ビタミンA、βカロテン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
G．Similac Natural Care低鉄分母乳増強剤、そのまま使用可能、24 Cal/fl oz
用法：母乳混合用あるいは低出生体重児に母乳に代替して給餌するために設計
成分：▲Ｕ▼-D 水分、脱脂乳、加水分解コーンスターチ、ラクトース、分画化ココナッツオイル（中鎖トリグリセリド）、乳清タンパク質濃縮物、大豆油、ココナッツオイル、リン酸カルシウム三塩基、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、モノグリセリド、ジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、塩化コリン、m-イノシトール、タウリン、ナイアシンアミド、L-カルニチン、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、塩化カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二銅、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、ビオチン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビタミンD3、亜セレン酸ナトリウム、及びシアノコバラミン
本発明の種々のPUFAは、上記の乳幼児用配合物及び当業者に知られるその他の乳幼児用配合物に代替し及び／またはそれらに添加し得る。
II 栄養配合物
A．ENSURE▲Ｒ▼
用法：ENSUREは低残渣液体食品で、主として、食事と共に、もしくは食間に使用される経口栄養補助剤として、あるいは適量で食事の代替物として使用されるように設計されたものである。ENSUREはラクトース、グルテンを含まず、低コレストロールダイエットを含む調整食餌療法での使用に適している。主として経口補助剤であるが、チューブでの給餌も可能である。
患者の条件：
・調整食餌療法を行っている患者
・栄養的に問題のある年配の患者
・不本意な減量状態にある患者
・病気や手術から回復途上にある患者
・低残渣食餌療法を要する患者
成分：
▲Ｕ▼-D 水分、糖（ショ糖）、マルトデキストリン（コーン）、カゼイン酸カルシウム、カゼイン酸ナトリウム、高オレイン酸ベニバナ油、大豆タンパク質単離物、大豆油、キャノーラ油、クエン酸カリウム、リン酸カルシウム三塩基、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム二塩基、人工香料、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α-トコフェリル、ゲランガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム
B．ENSURE▲Ｒ▼BARS
用法：ENSURE BARSは食事と共にまたは食間に補助的に使用するための完全でバランスの取れた栄養剤である。おいしく、栄養に富む、他のスナック類の代替物を供給する。ENSURE BARSが含むラクトースはバー一本当たり1g未満であり、チョコレートファッジブラウニーフレーバーはグルテンを含まない（ハニーグラハムクランチフレーバーはグルテンを含む）。
患者の条件：
・カロリー、タンパク質、ビタミン、及びミネラルを余分に必要とする患者。
・十分なカロリー、栄養分を摂取していない人に特に有用。
・咀嚼、嚥下が可能な人
・ピーナッツアレルギー、または豆類に対する何らかのアレルギーを持つ人には使用不可
成分：
ハニーグラハムクランチ--高フルクトースコーンシロップ、大豆タンパク質単離物、ブラウンシュガー、蜂蜜、マルトデキストリン（コーン）、クリスプライス（粉状米、糖分[ショ糖]、塩[塩化ナトリウム]、麦芽）、オートブラン、部分的に水素化された綿実油と大豆油、大豆多糖類、グリセリン、乳清タンパク質濃縮物、ポリデキストロース、フルクトース、カゼイン酸カルシウム、ココアパウダー、人工香料、キャノーラ油、高オレイン酸ベニバナ油、脱脂粉乳、乳清粉末、大豆レシチン、コーンオイル。豆類を加工処理する設備で生産される。
ビタミン及びミネラル：
リン酸カルシウム三塩基、リン酸カリウム二塩基、酸化マグネシウム、塩（塩化ナトリウム）、塩化カリウム、アスコルビン酸、オルトリン酸第二鉄、酢酸α-トコフェリル、ナイアシンアミド、酸化亜鉛、パントテン酸カルシウム、グルコン酸銅、硫酸マグネシウム、リボフラビン、βカロチン、塩酸ピリドキシン、一硝酸チアミン、葉酸、ビオチン、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
タンパク質：
ハニーグラハムクランチ-タンパク質源は大豆タンパク質単離物と牛乳タンパク質の混合物である。
大豆タンパク質単離物 74%
牛乳タンパク質 26%
脂肪：
ハニーグラハムクランチ-脂肪源は、部分的に水素化された綿実油と大豆油、キャノーラ油、高オレイン酸ベニバナ油、コーン油、大豆レシチンの混合物である。
部分的に水素化された綿実油と大豆油 76%
キャノーラ油 8%
高オレイン酸ベニバナ油 8%
コーン油 4%
大豆レシチン 4%
炭水化物：
ハニーグラハムクランチ-炭水化物源は、高フルクトースシロップ、ブラウンシュガー、マルトデキストリン、蜂蜜、クリスプライス、グリセリン、大豆多糖類、及びオートブランの組合せである。
高フルクトースシロップ 24%
ブラウンシュガー 21%
マルトデキストリン 12%
蜂蜜 11%
クリスプライス 9%
グリセリン 9%
大豆多糖類 7%
オートブラン 7%
C．ENSURE▲Ｒ▼ HIGH PROTEIN
用法：ENSURE HIGH PROTEINは、食餌療法としてカロリー、タンパク質、ビタミン、ミネラルを余分に摂取しなければならない人のために設計された濃縮高タンパク液体食品である。食事と共にまたは食間に経口栄養補助剤として用いることができ、適量で食事代替物としても使用できる。ENSURE HIGH PROTEINはラクトース、グルテンを含まず、一般的な手術や腰部骨折から回復途上にある人々や圧迫潰瘍の危険がある患者に適している。
患者の条件
・一般的な手術や腰部骨折から回復途上にある人々や圧迫潰瘍の危険がある患者、低コレステロール食餌療法を行っている患者のように、カロリー、タンパク質、ビタミン、ミネラルを余分に摂取しなければならない患者
特徴
・低飽和脂肪
・服用量あたり含有全脂肪６g、5mg未満のコレステロール
・豊かでクリーミーな味わい
・タンパク質、カルシウム、その他の必須ビタミン、ミネラルの優秀な供給源
・低コレステロール食餌療法用
・ラクトース非含有、消化しやすい
成分：
バニラシュプリーム：▲Ｕ▼-D 水分、糖（ショ糖）、マルトデキストリン（コーン）、カゼイン酸カルシウム、カゼイン酸ナトリウム、高オレイン酸ベニバナ油、大豆タンパク質単離物、大豆油、キャノーラ油、クエン酸カリウム、リン酸カルシウム三塩基、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム二塩基、人工香料、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α-トコフェリル、ゲランガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
タンパク質：
タンパク質源は２種の高生物価タンパク質、カゼインと大豆の混合物である。
カゼイン酸ナトリウム、カゼイン酸カルシウム 85%
大豆タンパク質単離物 15%
脂肪：
脂肪源は３種の油、高オレイン酸ベニバナ油、キャノーラ油、大豆油の混合物である。
高オレイン酸ベニバナ油 40%
キャノーラ油 30%
大豆油 30%
ENSURE HIGH PROTEINの脂肪レベルは、アメリカ心臓学会（AHA）のガイドラインに合致している。ENSURE HIGH PROTEIN中の６gの脂肪は全カロリー中の24%を占め、脂肪中の2.6%は飽和脂肪酸、7.9%は多不飽和脂肪酸からのものである。これらの数値は、脂肪由来は全カロリーの30%以下、飽和脂肪酸由来は10%未満、多不飽和脂肪酸由来は10%以下というAHAガイドラインの範囲内である。
炭水化物：
ENSURE HIGH PROTEINはマルトデキストリン及びショ糖の組合せを含む。マイルドな甘さとフレーバーの種類（バニラシュプリーム、チョコレートロワイヤル、ワイルドベリー、バナナ）、それに加えて、ピーカン、チェリー、イチゴ、レモン、オレンジのVARI-FLAVORSO▲Ｒ▼フレーバーパックは風味への飽きを防ぎ、患者の服用承諾を助ける。
バニラ及びその他のチョコレート以外のフレーバー
ショ糖 60%
マルトデキストリン 40%
チョコレート
ショ糖 70%
マルトデキストリン 30%
D．ENSURE▲Ｒ▼LIGHT
用法：ENSURE LIGHTは、食事と共にまたは食間に経口栄養補助剤として用いるように設計された低脂肪液体食品である。ENSURE LIGHTはラクトース、グルテンを含まず、低コレステロール食餌療法を含む調整食餌療法における使用に適している。
患者の条件：
・適正または過剰体重の患者で、ENSUREと比して50%減の脂肪、20%減のカロリーを含む栄養補助剤の余分な栄養を必要とする患者
・適正な食事を取っていない余分な栄養が必要な健康な成人
特徴：
・低脂肪、低飽和脂肪
・服用量あたり３ｇの全脂肪、５mg未満のコレステロール
・豊かでクリーミーな味わい
・カルシウムやその他の必須ビタミン、ミネラルの優秀な供給源
・低コレステロール食餌療法用
・ラクトース非含有、消化しやすい
成分：
フレンチバニラ：▲Ｕ▼-D 水、マルトデキストリン（コーン）、糖（ショ糖）、カゼイン酸カルシウム、高オレイン酸ベニバナ油、キャノーラ油、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム二塩基、リン酸マグネシウム二塩基、天然香料、人工香料、リン酸カルシウム三塩基、セルロースゲル、塩化コリン、大豆レシチン、カラゲナン、塩（塩化ナトリウム）、アスコルビン酸、セルロースガム、硫酸第一鉄、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩化チアミン塩酸塩、パルミチン酸ビタミンA、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩化クロム、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
タンパク質：
タンパク質源はカゼイン酸カルシウムである。
カゼイン酸カルシウム 100%
脂肪
脂肪源は高オレイン酸ベニバナ油、キャノーラ油の２種のオイルの混合物である。
高オレイン酸ベニバナ油 70%
キャノーラ油 30%
ENSURE LIGHTの脂肪レベルは、アメリカ心臓学会（AHA）のガイドラインに合致している。ENSURE LIGHTの３ｇの脂肪は全カロリー中の13.5%を占め、脂肪中の1.4%は飽和脂肪酸、2.6%は多不飽和脂肪酸からのものである。これらの数値は、脂肪由来は全カロリーの30%以下、飽和脂肪酸由来は10%未満、多不飽和脂肪酸由来は10%以下というAHAガイドラインの範囲内である。
炭水化物
ENSURE LIGHTはマルトデキストリンとショ糖の組合せを含む。チョコレートフレーバーはコーンシロップも含む。マイルドな甘さとフレーバーの種類（フレンチバニラ、チョコレートシュプリーム、ストロベリースワール）、それに加えてピーカン、チェリー、イチゴ、レモン、オレンジのVARI-FLAVORS▲Ｒ▼フレーバーパックは、風味への飽きを防ぎ、患者の服用承諾を助ける。
バニラ及びチョコレート以外のフレーバー
ショ糖 51%
マルトデキストリン 49%
チョコレート
ショ糖 47.0%
コーンシロップ 26.5%
マルトデキストリン 26.5%
ビタミン及びミネラル
ENSURE LIGHTの8-fl-ozの服用量で、24の重要ビタミンとミネラルのRDIの少なくとも25%が供給される。
カフェイン
チョコレートフレーバーは8-fl-ozあたり2.1mgのカフェインを含む。
E．ENSURE PLUS▲Ｒ▼
用法：ENSURE PLUSは高カロリー、低残渣の液体食品で、カロリーと栄養は余分に必要だが通常濃度のタンパク質が必要である場合に使用する。主として、食事と共に、もしくは食間に使用する経口栄養補助剤として、あるいは適量で食事の代替物として設計されたものである。ENSURE PLUSはラクトース、グルテンを含まない。主として経口栄養補助剤であるが、チューブでの給餌も可能である。
患者の条件：
・制限容量内で、余分なカロリーと栄養分を必要とし、タンパク質は通常濃度要している患者用
・健康的な体重を獲得または維持する必要のある患者用
特徴
・豊かでクリーミーな味わい
・必須なビタミン、ミネラルの良好な供給源
成分
バニラ：▲Ｕ▼-D 水、コーンシロップ、マルトデキストリン（コーン）、コーン油、カゼイン酸ナトリウム、カゼイン酸カルシウム、糖（ショ糖）、大豆タンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、リン酸カルシウム三塩基、大豆レシチン、天然香料、人工香料、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α-トコフェリル、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンA、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン、及びビタミンD3
タンパク質
タンパク質源は２種の高生物価タンパク質、カゼインと大豆の混合物である。
カゼイン酸ナトリウム、カゼイン酸カルシウム 84%
大豆タンパク質単離物 16%
脂肪
脂肪源はコーンオイルである。
コーンオイル 100%
炭水化物
ENSURE PLUSはマルトデキストリンとショ糖の組合せを含む。マイルドな甘さとフレーバーの種類（バニラ、チョコレート、イチゴ、コーヒー、バターピーカン、エッグノッグ）、それに加えてピーカン、チェリー、イチゴ、レモン、オレンジのVARI-FLAVORS▲Ｒ▼フレーバーパックは、風味への飽きを防ぎ、患者の服用承諾を助ける。
バニラ、イチコ、バターピーカン、コーヒーフレーバー
コーンシロップ 39%
マルトデキストリン 38%
ショ糖 23%
チョコレート、エッグノッグフレーバー
コーンシロップ 36%
マルトデキストリン 34%
ショ糖 30%
ビタミン及びミネラル
ENSURE PLUS 8-fl-oz服用量で、25の重要ビタミンとミネラルのRDIの少なくとも15%が供給される。
カフェイン
チョコレートフレーバーは8-fl-ozあたり3.1mgのカフェインを含む。コーヒーフレーバーはごく微量のカフェインを含む。
F．ENSURE PLUS▲Ｒ▼HN
用法：ENSURE PLUS HNは栄養学的に完全な高カロリー、高窒素の液体食品であり、より高いカロリーやタンパク質を必要としているか、あるいは制限量の摂取しかできない人のために設計されたものである。経口栄養補助剤や、チューブによる総合栄養支持剤に用い得る。ENSURE PLUS HNはラクトース、グルテンを含まない。
患者の条件：
・手術、外傷などの後の、高いカロリー、タンパク質を必要としている患者
・制限量しか摂取できない患者や初期飽満の患者
特徴
・補助または総合栄養剤
・経口またはチューブでの摂取用
・1.5 CaVmL
・高窒素
・高カロリー密度
成分
バニラ：▲Ｕ▼-D 水、マルトデキストリン（コーン）、カゼイン酸ナトリウム、カゼイン酸カルシウム、コーン油、糖（ショ糖）、大豆タンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、リン酸カルシウム三塩基、大豆レシチン、天然香料、人工香料、クエン酸ナトリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、タウリン、L-カルニチン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α-トコフェリル、ナイアシンアミド、カラゲナン、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンA、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン、及びビタミンD3
G．ENSURE▲Ｒ▼ POWDER
用法：ENSURE POWDER（水により再構成する）は、低残渣の液体食品で、主として、食事と共に、もしくは食間に使用する経口栄養補助剤として設計されたものである。ENSURE POWDERはラクトース、グルテンを含まず、低コレステロール食餌療法を含む調整食餌療法での使用に適している。
患者の条件：
・調整食餌療法中の患者
・栄養的危険のある年配の患者
・病気または手術から回復途上の患者
・低残渣食餌療法を要する患者
特徴
・手軽で簡単に混ぜられる
・低飽和脂肪
・服用量あたり全脂肪量９ｇ、５mg未満のコレステロール
・高ビタミン、高ミネラル
・低コレステロール食餌療法用
・ラクトース非含有、消化しやすい
成分：▲Ｕ▼-D コーンシロップ、マルトデキストリン（コーン）、糖（ショ糖）、コーン油、カゼイン酸ナトリウム、カゼイン酸カルシウム、大豆タンパク質単離物、人工香料、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、リン酸カルシウム三塩基、塩化カリウム、大豆レシチン、アスコルビン酸、塩化コリン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α-トコフェリル、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、塩化チアミン塩酸塩、硫酸第二銅、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンA、葉酸、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
タンパク質
タンパク質源は２種の高生物価タンパク質、カゼイン及び大豆の混合物である。
カゼイン酸ナトリウム、カゼイン酸カルシウム 84%
大豆タンパク質単離物 16%
脂肪
脂肪源はコーンオイルである。
コーンオイル 100%
炭水化物
ENSURE POWDERは、コーンシロップ、マルトデキストリンとショ糖の組合せを含む。ENSURE POWDERのマイルドな甘さに加えてピーカン、チェリー、イチゴ、レモン、オレンジのVARI-FLAVORS▲Ｒ▼フレーバーパックは風味への飽きを防ぎ、患者の服用承諾を助ける。
バニラ
コーンシロップ 35%
マルトデキストリン 35%
ショ糖 30%
H．ENSURE▲Ｒ▼PUDDING
用法：ENSURE PUDDINGは、非液体形態のバランスのとれた栄養を与える高栄養密度補助剤で、食事と共にまたは食間に使用される。コンシステンシー調整食餌療法（例えば、ソフト、ピューレ、あるいは完全な液体）または嚥下障害を持つ患者に適している。ENSURE PUDDINGはグルテンを含まない。
患者の条件：
・コンシステンシー調整食餌療法（例えばソフト、ピューレ、あるいは完全な液体）中の患者
・嚥下障害を持つ患者
特徴
・豊かでクリーミーな味わい、美味
・必須なビタミン、ミネラルの良好な供給源、冷蔵不要で便利
・グルテン非含有
5 oz当たりの栄養組成：カロリー 250、タンパク質 10.9%、全脂肪 34.9%、炭水化物 54.2%
成分：
バニラ：▲Ｕ▼-D 脱脂乳、水分、糖（ショ糖）、部分的に水素化された大豆油、改質食用スターチ、硫酸マグネシウム、ナトリウムステアロイルラクチレート、リン酸ナトリウム二塩基、人工香料、アスコルビン酸、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α-トコフェリル、塩化コリン、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、FD&C黄色５号、クエン酸カリウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、FD&C黄色６号、葉酸ビオチン、フィロキノン、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
タンパク質
タンパク質源は脱脂乳である。
脱脂乳 100%
脂肪
脂肪源は水素化された大豆油である。
水素化された大豆油 100%
炭水化物
ENSURE PUDDINGは、ショ糖と改変食用スターチの組合せを含む。マイルドな甘さとフレーバーの種類（バニラ、チョコレート、バタースコッチ、タピオカ）は風味への飽きを防ぐ。製品は服用量あたり9.2ｇのラクトースを含む。
バニラ及びその他のチョコレート以外のフレーバー
ショ糖 56%
ラクトース 27%
修飾食用スターチ 17%
チョコレート
ショ糖 58%
ラクトース 26%
修飾食用スターチ 16%
I．ENSURE▲Ｒ▼ WITH FIBER
用法：ENSURE WITH FIBERは、栄養学的に完全な繊維含有液体食品で、高食物繊維及び栄養分が有用な人用に設計されたものである。ENSURE WITH FIBERは低残渣食餌療法が必要でない人に適している。経口でもチューブでも給餌でき、日々の食餌療法のための栄養補助剤として、または適量で食事の代替としても用いることができる。ENSURE WITH FIBERはラクトース、グルテンを含まず、低コレステロール食餌療法を含む調整食餌療法での使用に適している。
患者の条件
・高食物繊維及び栄養分から利益を受ける患者
特徴
・新規な進歩した組成-低飽和脂肪でより高い食物繊維と栄養分
・服用量あたり全脂肪６ｇ、５mg未満のコレステロール
・豊かでクリーミーな味わい
・食物繊維の良好な供給源
・必須ビタミン、ミネラルの優秀な供給源
・低コレステロール食餌療法用
・ラクトース、グルテン非含有
成分
バニラ：▲Ｕ▼-D 水、マルトデキストリン（コーン）、糖（ショ糖）、カゼイン酸ナトリウム、カゼイン酸カルシウム、オート麦繊維、高オレイン酸ベニバナ油、キャノーラ油、大豆タンパク質単離物、コーン油、大豆繊維、リン酸カルシウム三塩基、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、セルロースゲル、大豆レシチン、リン酸カリウム二塩基、クエン酸ナトリウム、天然香料、人工香料、塩化コリン、リン酸マグネシウム、アスコルビン酸、セルロースガム、塩化カリウム、カラゲナン、硫酸第一鉄、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
タンパク質
タンパク質源は２種の高生物価タンパク質、カゼイン及び大豆の混合物である。
カゼイン酸ナトリウム、カゼイン酸カルシウム 80%
大豆タンパク質単離物 20%
脂肪
脂肪源は３種のオイル、高オレイン酸ベニバナ油、キャノーラ油、コーン油の混合である。
高オレイン酸ベニバナ油 40%
キャノーラ油 40%
コーン油 20%
ENSURE WITH FIBERの脂肪レベルは、アメリカ心臓学会（AHA）のガイドラインに合致する。ENSURE WITH FIBERの６ｇの脂肪は全カロリー中の22%を占め、脂肪中の2.01%は飽和脂肪酸、6.7%は多不飽和脂肪酸からのものである。これらの数値は、脂肪由来は全カロリーの30%以下、飽和脂肪酸由来は10%未満、多不飽和脂肪酸由来は10%以下とするAHAガイドラインの範囲内である。
炭水化物
ENSURE WITH FIBERは、マルトデキストリンとショ糖の組合せを含む。マイルドな甘さとフレーバーの種類（バニラ、チョコレート、バターピーカン）、それに加えてピーカン、チェリー、イチゴ、レモン、オレンジのVARI-FLAVORS▲Ｒ▼フレーバーパックは、風味への飽きを防ぎ、患者の服用承諾を助ける。
バニラ及びその他のチョコレート以外のフレーバー
マルトデキストリン 66%
ショ糖 25%
オート麦繊維 7%
大豆繊維 2%
チョコレート
マルトデキストリン 55%
ショ糖 36%
オート麦繊維 7%
大豆繊維 2%
繊維
ENSURE WITH FIBERで用いられている繊維混合物は、オート麦繊維と大豆多糖類からなる。この混合物は、8-fl-oz一缶あたり４ｇの総食物繊維量を含む。不溶性対水溶性繊維の比率は、95:5である。
上記及びその他の当業者に知られる種々の栄養補助剤は、本発明のPUFAにより代替され、及び／または補助され得る。
J．OxepaTM栄養剤
Oxepaは低炭水化物、高カロリー密度腸吸収性栄養剤であり、ARDSの患者ないしその危険性がある患者の食餌管理のために設計されたものである。エイコサペンタエン酸（魚油由来EPA）、γ-リノレン酸（ルリヂサ油由来GLA）、及び高レベルの抗酸化剤からなる特許取得済オイル混合物を含む、ユニークな成分の組合せを有する。
カロリー分布：
・カロリー密度は、エネルギー要求に合致する容量を最小にするために、1.5Cal/mL（355 Cal/8fl oz）と高くなっている。
・Oxepaのカロリー分布を表７に示す。
Figure 0004087460
脂肪：
・Oxepaは、8-fl oz服用量当たり22.2ｇの脂肪を含む（93.7g/L）。
・脂肪源は、31.8%のキャノーラ油、25%の中鎖トリグリセリド（MCT）、20%のルリヂサ油、20%の魚油、3.2%の大豆レシチンの油混合物である。Oxepaの典型的な脂肪酸組成を表８に示す。
・Oxepaは表10に示すように、バランスの取れた量の、多不飽和脂肪酸、単不飽和脂肪酸、及び飽和脂肪酸を与える。
・中鎖トリグリセリド（MCT、脂肪混合物の25%）は、胆汁酸による乳化なしに腸管で吸収されるので胃を空にする助けになる。
OxepaTM栄養剤の種々の脂肪酸組成は、本発明のPUFAにより代替及び／または補助され得る。
Figure 0004087460
Figure 0004087460
炭水化物
・8-fl-oz服用量当たり25.0ｇの炭水化物を含む（105.5g/L）。
・炭水化物源は、45%マルトデキストリン（複合炭水化物）と55%ショ糖（単純糖）で、双方とも消化、吸収しやすい。
・Oxepaの高脂肪、低炭水化物含量は、二酸化炭素（CO2）生産を最低限にするために設計されたものである。高い二酸化炭素レベルは、人口呼吸器依存患者の自立を困難なものにする。低レベルの炭水化物は、ストレス性高血糖症を起こした患者にも有効であり得る。
・Oxepaはラクトースを含まない。
食物炭水化物、タンパク質由来のアミノ酸、脂肪のグリセロール部分は体内でブドウ糖に変換される。この過程を通じて、グルコース依存性組織（中枢神経系や赤血球等）の炭水化物要求が満たされる。これに対し、炭水化物なしの食餌はケトーシス、組織タンパク質の過剰な異化、及び液体、電解質の不足をを引き起こす。これらの作用は、カロリー摂取量が適当ならば毎日50〜100ｇの可消化炭水化物を摂取することで防ぎ得る。Oxepaの炭水化物レベルは、エネルギー要求が満たされている場合には、糖新生を最小にするのにも充分である。
タンパク質：
・Oxepaは、8-fl-oz服用量当たり14.8gのタンパク質を含む（62.5g/L）。
・全カロリー対窒素の比率（150:1）は、ストレス下にある患者の要求に合致する。
・Oxepaは同化を促進し、呼吸の問題を促進することなく少ない体重を維持するのに充分なタンパク質を供給する。呼吸障害のある患者にとって、高タンパク質摂取は懸念事項である。タンパク質はCO2生産にほとんど影響しないものの、高タンパク質の食餌は呼吸器系の運動を増加させる。
・Oxepaのタンパク質源はカゼイン酸ナトリウム86.8%、カゼイン酸カルシウム13.2%である。
・表11に示したように、Oxepaにおけるタンパク質系のアミノ酸プロフィールは、National Academy of Sciencesにより設定された高品質タンパク質の標準に合致するかまたはこれを超えるものである。
・Oxepaは、グルテンを含まない。
本明細書で挙げた全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する技術的分野の当業者の技術の水準を示している。全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物及び特許出願が具体的かつ個々に引用により示されているのと同様に、引用により本明細書の一部とする。
本発明についての記載は以上であるが、添付の請求の範囲の概念あるいは範囲から逸脱することなく多くの変更及び改変を加え得ることは当業者に明らかであろう。
配列表
配列番号:1
配列の長さ: 1617 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: DNA（ゲノム）
配列
Figure 0004087460
配列番号:2
配列の長さ: 457 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:3
配列の長さ: 1488 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: DNA（ゲノム）
配列
Figure 0004087460
配列番号:4
配列の長さ: 399 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:5
配列の長さ: 1483 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: DNA（ゲノム）
配列
Figure 0004087460
配列番号:6
配列の長さ: 446 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数:無関係
トポロジー:直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:7
配列の長さ: 355 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:8
配列の長さ: 104 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
配列番号:9
配列の長さ: 252 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
配列番号:10
配列の長さ: 125 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
配列番号:11
配列の長さ: 131 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
配列番号:12
配列の長さ: 87 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
配列番号:13
配列の長さ: 143 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
配列番号:14
配列の長さ: 186 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
配列番号:15
配列の長さ: 5 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
配列番号:16
配列の長さ: 446 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:17
配列の長さ: 359 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:18
配列の長さ: 365 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:19
配列の長さ: 35 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸
配列
Figure 0004087460
配列番号:20
配列の長さ: 32 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸（合成オリゴヌクレオチド）
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置: 21
他の情報: N=イノシンまたはシトシン
配列の特徴
特徴を表す記号: misc_feature
存在位置: 27
他の情報: N=イノシンまたはシトシン
配列
Figure 0004087460
配列番号:21
配列の長さ: 27 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸（合成オリゴヌクレオチド）
配列の特徴
特徴を表す記号: misc_feature
存在位置: 13
他の情報: N=イノシンまたはシトシン
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置: 19
他の情報: N=イノシンまたはシトシン
配列
Figure 0004087460
配列番号:22
配列の長さ: 33 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸
配列
Figure 0004087460
配列番号:23
配列の長さ: 33 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸
配列
Figure 0004087460
配列番号:24
配列の長さ: 5 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
Figure 0004087460
配列番号:25
配列の長さ: 39 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸
配列
Figure 0004087460
配列番号:26
配列の長さ: 39 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸
配列
Figure 0004087460
配列番号:27
配列の長さ: 47 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸
配列
Figure 0004087460
配列番号:28
配列の長さ: 40 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸
配列
Figure 0004087460
配列番号:29
配列の長さ: 37 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸
Figure 0004087460
配列番号:30
配列の長さ: 42 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸
Figure 0004087460
配列番号:31
配列の長さ: 1219 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸（編集されたコンティグ2692004）
配列
Figure 0004087460
配列番号:32
配列の長さ: 655 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸（編集されたコンティグ2153526）
配列
Figure 0004087460
配列番号:33
配列の長さ: 304 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸（編集されたコンティグ3506132）
配列
Figure 0004087460
配列番号:34
配列の長さ: 918 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸（編集されたコンティグ3854933）
配列
Figure 0004087460
配列番号:35
配列の長さ: 1686 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸（編集されたコンティグ2511785）
配列
Figure 0004087460
配列番号:36
配列の長さ: 1843 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸（コンティグ2535）
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:37
配列の長さ: 2257 塩基対
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 他の核酸（編集されたコンティグ253538a）
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:38
配列の長さ: 411 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: アミノ酸（コンティグ2692004の翻訳）
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:39
配列の長さ: 218 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: アミノ酸（コンティグ2153526の翻訳）
配列
Figure 0004087460
配列番号:40
配列の長さ: 71 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: アミノ酸（コンティグ3506132の翻訳）
配列
Figure 0004087460
配列番号:41
配列の長さ: 306 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: アミノ酸（コンティグ3854933の翻訳）
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:42
配列の長さ: 566 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: アミノ酸（コンティグ2511785の翻訳）
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:43
配列の長さ: 619 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: アミノ酸（コンティグ2535の翻訳）
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:44
配列の長さ: 757 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: アミノ酸（コンティグ253538aの翻訳）
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号:45
配列の長さ: 746 核酸
配列の型: 核酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 核酸
配列
Figure 0004087460
配列番号:46
配列の長さ: 227 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
Figure 0004087460
配列番号47
配列の長さ: 494 核酸
配列の型: 核酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 核酸
配列
Figure 0004087460
配列番号:48
配列の長さ: 87 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
配列番号:49
配列の長さ: 520 核酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 核酸
配列
Figure 0004087460
配列番号:50
配列の長さ: 153 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460
配列番号:51
配列の長さ: 429 核酸
配列の型: 核酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 核酸
配列
Figure 0004087460
配列番号:52
配列の長さ: 125 アミノ酸
配列の型: アミノ酸
鎖の数: 無関係
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
Figure 0004087460

Claims (15)

  1. ポリペプチドをコードする核酸配列と機能しうる形で連結された植物細胞で機能する発現制御配列を含む核酸構築物であって、該ポリペプチドが、以下：
    （ａ）脂肪酸分子を該脂肪酸のカルボキシ末端から５番目の炭素で不飽和化することができ、配列番号６に示す４４６個のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｂ）脂肪酸分子を該脂肪酸のカルボキシ末端から６番目の炭素で不飽和化することができ、配列番号２に示す４５７個のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；および
    （ｃ）脂肪酸分子を該脂肪酸のカルボキシ末端から１２番目の炭素で不飽和化することができ、配列番号４に示す３９９個のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    から選択されるものである、上記核酸構築物。
  2. ポリペプチドが配列番号６に示す４４６個のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の構築物。
  3. ポリペプチドが配列番号６に示す４４６個のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の構築物。
  4. 発現制御配列が種子細胞において機能する、請求項１、２または３に記載の構築物。
  5. 多不飽和脂肪酸の産生をもたらす少なくとも１つの機能的活性Mortierella alpina脂肪酸デサチュラーゼをコードする少なくとも１コピーのDNA配列を含む組換え植物細胞であって、該脂肪酸デサチュラーゼは配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群より選択される配列番号に示すアミノ酸配列を有し、該細胞は該DNA配列を含むベクターで形質転換され、該DNA配列は発現制御配列と機能しうる形で連結されている、上記の組換え植物細胞。
  6. アブラナ属、大豆、ベニバナ、トウモロコシ、亜麻およびヒマワリからなる群より選択される、請求項５に記載の植物細胞。
  7. 18:1、18:2、18:3および18:4からなる群より選択される脂肪酸に富んでいる、請求項５または６記載の植物細胞。
  8. 請求項５〜７のいずれか１項に記載の細胞を含むトランスジェニック植物。
  9. 請求項８に記載の植物またはその種子から油を回収することを含む、植物油の製造方法。
  10. 脂肪酸を、以下：
    油および製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物；
    栄養配合物；
    乳幼児用配合物；
    食物補充剤；
    食物代用物；
    化粧品；および
    動物用食餌；
    の群より選択される製品に製剤化することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. 乳幼児用配合物、食物補充剤または食物代用物が液体または固体の形態である、請求項10に記載の方法。
  12. 栄養配合物、乳幼児用配合物、食物補充剤または食物代用物が、ヤシ油、大豆油、カノラ油、モノおよびジグリセリド、グルコース、食用ラクトース、電気透析されたホエー、電気透析された脱脂乳、乳ホエー、大豆タンパク質ならびに他のタンパク質加水分解物からなる群より選択される少なくとも１つの多量栄養素を含む、請求項10または11に記載の方法。
  13. 栄養配合物、乳幼児用配合物、食物補充剤または食物代用物が、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＢ複合体からなる群より選択される少なくとも１つのビタミン、ならびにカルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレンおよび鉄からなる群より選択される少なくとも１つのミネラルを含む、請求項12に記載の方法。
  14. 脂肪酸の製造のための請求項８に記載の植物の使用。
  15. 油および製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物；
    栄養配合物；
    乳幼児用配合物；
    食物補充剤；
    食物代用物；
    化粧品；および
    動物用食餌；
    の群より選択される、脂肪酸を含む製品の製造のための請求項14に記載の使用。
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