CZ358499A3 - Způsoby a kompozice pro syntézu poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem v rostlinách - Google Patents

Abstract

Popisují se kompozice a způsoby přípravy polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcemv rostlinách, v rostlinných částech av rostlinných buňkách, v takových jakojsou listy, kořeny, plodý a semena. Sekvence a konstrukce kódující desaturázy mastných kyselin zahrnující D5-, D6- aDl2-desaturázy se používají k vytvoření transgenních rostlin, rostlinných částí a buněk, které obsahují a exprimujíjeden nebo více transgenů kódujícíchjednu nebo více desaturáz. Exprese desaturáz s různými substrátovými specifitami v rostlinném systému umožňuje produkci polynenasycenýchmastných kyselin s dlouhým řetězcem, jakoje kyselina dokosahexaenová, ikosapentaenová, alinolenová, gamalinolenová, arachidová a podobně, ve velkém měřítku. Taková exprese umožňuje v rostlinách, v rostlinných částech a v tkáních změnit profil mastných kyselin. Manipulace profilů mastných kyselin umožňuje produkci komerčního množství nových rostlinných olejů a produktů.

Description

Vynález enzymatických nenasycených popisuje modulační stupně enzymů a/nebo komponentů schopných změnit produkci polymastných kyselin s dlouhými řetězci (PUFA) v hostitelské rostlině. Příkladem použití vynálezu je produkce PUFA v rostlinách.

Dosavadní stav techniky

Dvě hlavní skupiny poly-nenasycených mastných kyselin (PUFA) jsou o3-mastné kyseliny, jejichž zástupcem je kyselina arachidonová, a ωβ-mastné kyseliny, které představuje kyselina ikosapentaenová. PUFA jsou důležitými komponenty plazmatické membrány buněk, kde se mohou vyskytovat v takových formách, jako jsou fosfolipidy. PUFA také slouží jako prekurzory jiných molekul, které jsou důležité pro člověka a zvířata, mezi něž patří prostacyklin, ikosanoidy, leukotrieny a prostaglandiny. PUFA jsou nezbytné pro správný vývoj, zvláště při vývoji mozku kojenců, tvoření a obnově tkáně.

Čtyři nejdůležitější PUFA s dlouhým řetězcem' zahrnují kyselinu dokosahexaenovou (DBA) a íkosapentaenovou (EPA), která se primárně nachází v různých typech rybího tuku, dále je to kyselina gama-linolenová (GLA), která se nachází v semenech řady rostlin, které zahrnují prvosenku (Oenothera biennis), brutnák lékařský (Borago officinalís) a černý rybíz (Ribes nigrům), a kyselina stearidonová (SDA), která se nachází mořských olejích a v semenech rostlin. GLA a další důležité PUFA s dlouhým řetězcem, jako je arachidonová (ARA) se nachází ve vláknitých houbách kyselina ARA se • · • · mohou izolovat z tkáně zvířat zahrnující játra a žlázy vylučující adrenalin.

V případě DHA existuje pro komerční produkci řada zdrojů zahrnující různé mořské organizmy, oleje získané z mořských ryb žijících v chladných vodách a z frakcí vaječného žloutku. V případě ARA se mohou pro komerční produkci použít mikroorganizmy zahrnující rod Mortierella, Entomophthora, Phytium a Porphyridium. Běžné zdroje SDA zahrnují rod Trichodesma a Echium. Komerční zdroje GLA zahrnují prvosenku, černý rybíz a brutník lékařský. Existuje však několik nevýhod, které jsou spojeny s komerční produkcí PUFA z přirozených zdrojů. Přirozené zdroje PUFA, jako jsou zvířata a rostliny, vykazují vysoce heterogenní složení olejů. Oleje získané z těchto zdrojů se musí za účelem separace jednoho nebo více požadovaných PUFA extenzívně čistit nebo vzniká olej, který je obohacen jedním nebo více PUFA. Přirozené zdroje jsou také vystaveny neřízené fluktuaci dostupnosti. Zásoby ryb mohou být také oslabeny nadměrným rybolovem. Rybí olej má nepříjemnou chuť a zápach, jehož odstranění není ekonomicky výhodné a takový produkt pak nemusí být přijatelný jako potravní doplněk. Zvířecí oleje a zvláště pak rybí oleje mohou hromadit látky znečišťující prostředí. Kolísání výtěžku z rybích a rostlinných zdrojů může ovlivňovat počasí a výskyt nemocí. Půda dostupná pro produkci alternativních plodin produkujících olej soutěží s expanzí lidské populace, což je spojeno s rostoucími potřebami produkce potravin na zbývající orné půdě. Plodiny, které produkují PUFA, jako je brutník lékařský, nebyly přizpůsobeny pěstování ve velkém a neprospívají dobře, jestliže se pěstují jako monokultura. Pěstování takových plodin není pak ve srovnání s lépe prospívajícími a lépe zavedenými kulturami ekonomické. Fermentace organizmů, jako je Mortierella, ve velkém měřítku je také nákladná. Přirozené tkáně zvířat obsahují malé množství ARA a těžko se • · • · · · • · zpracovávají. Mikroorganizmy, jako je Porphyridium a Mortiellera se těžko kultivují v komerčním měřítku.

Potravinové doplňky a farmaceutické formulace obsahující PUFA mají stejné nevýhody jako zdroje PUFA. Potravinové doplňky, jako jsou kapsule s rybím olejem, mohou obsahovat malé množství určitých požadovaných komponentů a tak je nutné je aplikovat ve vysokých dávkách. Vysoké dávky vedou k trávení velkého množství nežádoucích komponentů, které zahrnují znečišťující látky. Velká pozornost se musí věnovat podávání doplňků mastných kyselin. Nadměrný příjem může vést k supresi endogenních bíosyntetických cest a k soutěžení s jinými nezbytnými mastnými kyselinami v různých lipidových frakcích in vivo, což vede k nežádoucím výsledkům. Například eskymáci jejichž strava obsahuje velké množství ω3 mastných kyselin mají zvýšenou tendenci krvácet (US patent č. 4,874,603). Nepříjemná chuť a zápach doplňků je může činit nežádoucí a pro pacienta pak může být problém dodržovat léčební plán.

Na biosyntéze PUFA se podílí řada enzymů. Kyselina linolenová (LA, 18:2 Δ9, 12) se vyrábí z kyseliny olejové (18:1 Δ9) pomocí A12-desaturázy. GLA (18:3 Δ6, 9, 12) se vyrábí z kyseliny línolenové (LA, 18:1 Δ9, 12) pomocí Δ6desaturázy. Produkce ARA (20:4 Δ5, 8, 11, 14) z kyseliny dihomo-gama-linoleové (DGLA, 20:3 Δ8, 11, 14) se katalyzuje A5-desaturázou. U zvířat však nemůže dojít k desaturaci za pozicí Δ9 a proto nemohou převést kyselinu olejovou (18:1 Δ9) na kyselinu linolencvou (18:2 Δ912). Savci nemohou syntetizovat kyselinu α-linolenovou (ALA, 18:3 Δ9, 12, 15). Jiné eukaryonty zahrnující houby a rostliny mají enzymy, které způsobují desaturaci v polohách Δ21 a Δ15. Hlavní polynenasycené mastné kyseliny zvířat se proto získávají buď z potravin a/nebo desaturaci a elongací kyseliny linolenové (18:2 Δ9, 12) nebo a-linolenové (18:3 Δ9, 12, 15).

• · • · • · · · .· · .· ·*· ·· .....

· ··«. «..I ······· ,, .... ,. ,,

Uvažuje se, že polynenasycené mastné kyseliny se mohou použít ve výživě, ve farmacii a v průmyslu nebo pro jiné účely. Nákladné získávaní polynenasycených mastných kyselin z přirozených zdrojů a chemickou syntézou není dostatečné pro komerční potřeby. Proto je takový zájem o možnost získání genetického materiálu, který se podílí na biosyntéze PUFA z druhů, jenž přirozeně produkují mastné kyseliny, a o expresi izolovaného materiálu samotného nebo v kombinaci s heterogenním systémem, který se může manipulovat za účelem produkce komerčního množství PUFA.

Produkce gama-linoienové kyseliny pomocí Δβ-desaturázy se popisuje v dokumentu USPN 5,552,306 a USPN 5,614,393. Produkce 8,11-ikosadienové kyseliny za použití Mortierella alpina se popisuje v USPN 5,376,541. Produkce kyseliny dokosahexaenové pomocí dinoflagelat se popisuje v USPN 5,407,957. Klonování Δ6 desaturázy z brutníku lékařského se popisuje v publikaci PCT WO 96/21022. Klonování A9-desaturáz se popisuje ve zveřejněné patentové přihlášce PCT WO 91/13972, EP 0 550 162 Al, EP 0 561 569 A2, EP 0 644 263 A2 a EP 0 736 598 Al a USPN 5,057,419. Klonování A12-desaturáz z různých organizmů se popisuje v PCT publikaci WO 94/11516 a USPN 5,443,974. Klonování Δ15desaturáz z různých organizmů se popisuje v PCT publikaci WO 93/11245. Klonování A6-palmítoylacylové proteinové desaturázy z Thumbergia alata a její exprese v mikroorganizmu E. coli se popisuje v publikaci USPN 5,614,400. Exprese sojové stearylACP-desaturázy v transgenních embryích sóji za použiti promotoru 35S se popisuje v dokumentu USPN 5,443,974.

Podstata vynálezu

Popisují se nové kompozice a metody vhodné pro přípravu poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem a desaturáz v rostlinách a v rostlinných buňkách. Metody zahrnují kultivaci hostitelské rostlinné buňky transformovanou • · · · expresívní kazetou, která je funkční v hostitelské rostlinné buňce. Expresívní kazeta, která obsahuje iniciační regulační oblast transkripce a translace a je spojená do čtecího rámce s 5'koncem sekvence DNA kódující polypeptid desaturázy, je schopna upravit produkci PUFA. Regulace exprese polypeptidů desaturázy poskytuje relativní zvýšení požadovaných desaturovaných PUFA, jako výsledek změněných koncentrací enzymů a substrátů, které jsou zahrnuty v biosyntéze PUFA. Zvláštní zájem se věnuje selektivnímu řízení produkce PUFA v rostlinné tkáni a/nebo v částech rostlin, jako jsou listy, kořeny, plody a semena. Vynález nachází použití například při produkci GLA, ARA, EPA a DHA ve velkém měřítku.

Vynález dále popisuje izolovanou nukleotidovou sekvenci nebo sekvenci polypeptidů, která je podstatně příbuzná nebo homologní s s nukleotidovými nebo polypeptidovýmí sekvencemi uvedenými v SEQ ID NO: 1 až SEQ ID NO: 52. Vynález dále popisuje způsoby použití sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 1 až SEQ ID NO: 40 jako sond za účelem identifikace příbuzných sekvencí, jako komponentů expresívních systémů a jako komponentů systémů použitelných pří produkci transgenního oleje.

Vynález dále popisuje výživy, potravinářské doplňky nebo potravinářské doplňky ve formě kapaliny nebo pevné látky, které obsahují mastné kyseliny s dlouhým řetězcem podle vynálezu. Tyto výživy a doplňky jsou vhodné pro aplikaci lidem a zvířatům.

Výživy a doplňky podle vynálezu dále obsahují alespoň jeden makronutrient vybraný ze skupiny zahrnující, kokosový olej, sojový olej, olej kanoly, mono- a diglyceridy, glukózu, poživatelnou laktózu, elektrodialyzovanou syrovátku, elektrodialyzované netučné mléko, mléčnou syrovátku, sojový protein a jiné proteinové hydrolyzáty.

Výživy podle vynálezu mohou dále obsahovat alespoň jeden vitamin vybraný ze skupiny zahrnující vitaminy A, C, D, E a B i

komplex; a alespoň jeden minerál vybraný ze skupiny zahrnující vápník, hořčík, zinek, mangan, sodík, draslík, fosfor, měď, chlorid, jodid, selen a železo.

Vynález dále popisuje' způsob léčby pacienta, který trpí nedostatečným příjmem nebo produkcí poly-nenasycených mastných kyselin zahrnující aplikaci potravinové náhrady pacientovi podle vynálezu v množství, které je dostatečné pro léčbu pacienta.

Vynález dále popisuje kosmetické a farmaceutické kompozice materiálů podle vynálezu.

Vynález dále zahrnuje transgenní oleje na farmaceuticky přijatelných nosičích. Vynález se dále popisuje nutriční doplňky, kosmetická činidla a kojenecké výživy obsahující transgenní oleje.

Vynález dále zahrnuje způsob dosažení upravené biosyntézy polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem, která zahrnuje: kultivaci mikroba, který má buňky obsahující transgen, jenž kóduje produkt exprimovaný transgenem. Tento produkt desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze uhlíku 5,5 nebo 12 od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny, kde transgen je operativně spojen se sekvencí řídící expresi za podmínek, kdy dochází k expresi transgenu, přičemž se v buňkách změní biosyntéza polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem.

Vynález dále popisuje farmaceutické kompozice obsahující alespoň jeden nutrient vybraný ze skupiny zahrnující vitamin, minerál, sacharidy, cukr, aminokyselinu, volnou mastnou kyselinu, fosfolipid, antioxidant a fenolovou sloučeninu.

Definice:

Δδ-desaturáza: A5-desaturáza je enzym, který zavádí dvojnou vazbu mezi pátý a šestý uhlík od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

Δδ-desaturáza: Δ6 desaturáza je enzym, který zavádí dvojnou vazbu mezí šestý a sedmý uhlík od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

A9-desaturáza: Δ9 desaturáza je enzym, který zavádí dvojnou vazbu mezi devátý a desátý uhlík od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

A12-desaturáza: Δ12 desaturáza je enzym, který zavádí dvojnou vazbu mezi 12 a 13 uhlík od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

Mastné kyseliny: Mastné kyseliny je třída látek obsahující dlouhý uhlovodíkový řetězec a terminální karboxylovou skupinu. Mastné kyseliny zahrnují

Mastné kyseliny
12 : 0	Kys. laurová
16:0	Kys. palmitová
16:1	Kys. palmitolejová
18:0	Kys. stearová
18:1	Kys. olejová	Δ9-18:!
18:2 Δ5,9	Kys. taxolejová	Δ5,9-18:2
18:2 Δ6,9	Kys. 6,9- oktadekadienová	Δ6,9-18:2
18:2	Kys. linolová	Δ9,12-18:2 (LA)
18:3 Δ6, 9, 12	Kys. gama-linolová	Δ6, 9, 12-18:3 (GLA)
18:3 Δ5,9,12	Kys. pinolenová	Δ5,9,12-18:3
18 : 3	Kys. alfa-linolenová	Δ9, 12,15-18:3 (ALA)
18:4	Kys. stearidonová	Δ6,9,12,15-18:4 (SDA)
20:0	Kys. arachidonová
20:1	Kys. ikoscenová
22:0	Kys. behehová
22:1	Kys. eruková
22:2	Kys. dokasadíenová

« · • * • · · ♦ · « ' • · · · · · * * · · · · « · ·«·« · · »»

20:4 ω6	Kys. arachidonová	Δ5,8,11,14-20:4(ARA)
20:3 ωβ	ωβ-i kosatrienová dihomo-gama- linolenová	Δ8,11,14-20:3(DGLA)
20:5 ω5	Ikosapentanová (timnodonová)	Δ5,8,11,14,17- 20:5(EPA)
20:3 ω3	ω3-ikosatrienová	Δ11,16,17-20:3
20:4 ω3	Ců3-ikosatetraenová	Δ7,10,13,16,19-22:5 (co3DPA)
22 : 5 α>3	Dokosapentanová	Δ7,10,13,16,19-22:5 (o3DPA)
22:6 ω3	Dokasahexanová (kervonová kyselina)	Δ4,7,10,13,16,19- 22:6(DHA)
24 : 0	Lígnocerová kys.

Vzhledem k těmto definicím vynález popisuje nové sekvence DNA, konstrukce DNA, metody a kompozice, které umožňují modifikace obsahu poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem v rostlinných buňkách. Rostlinné buňky se transformují expresívní kazetou obsahující DNA kódující polypeptid schopný zvýšit množství jednoho nebo více PUFA v rostlinné buňce. Je nutné, aby se připravila integrační konstrukce, která umožňuje integraci expresívní kazety do genomu hostitelské buňky. Hostitelské buňky se manipulují za účelem exprese sense a antisense DNA, která kóduje polypeptid(y) , jenž vykazují desaturační aktivitu. Term! „desaturáza znamená polypeptid, který může desaturovat jednu nebo více masných kyselin za vzniku mono- nebo poly-nenasycených mastných kyselin nebo jejich prekurzorů. Termín „polypeptid znamená libovolný řetězec aminokyselin bez ohledu na délku nebo post-translační úpravu, například giykosylace nebo fosforylace. Substrát(y) exprimovaných enzymů se mohou produkovat v hostitelské buňce nebo se mohou dodávat exogenně.

• · • ·

Aby se v hostitelské buňce dosáhlo exprese, transformovaná DNA je operativně spojena s počátečním místem transkripce a translace a s terminačnímí regulačními oblastmi, které jsou v hostitelské buňce funkční. Konstrukce obsahující exprimovaný gen se mohou začlenit do genomu hostitelské buňky nebo se mohou v hostitelské buňce samostatně replikovat. V případě produkce kyseliny linolenové (LA) obecně používané expresívní kazety zahrnují kazetu, která poskytuje aktivitu Δ12desaturázy, zvláště v hostitelské buňce, které produkuje nebo může pohlcovat kyselinu olejovou. Obecně používané expresívní kazety vhodné pro produkci ALA zahrnují kazetu, která vykazuje Δ15 nebo ω3 desaturační aktivitu, zvláště v hostitelské buňce, která produkuje nebo pohlcuje LA. Obecně používané expresívní kazety vhodné pro produkci GLA nebo SDA zahrnují kazetu, která vykazuje Δ6 desaturační aktivitu, zvláště v hostitelské buňce, která produkuje nebo pohlcuje LA nebo ALA.. Produkce polynenasycené mastné kyseliny typu ω6, jako je LA nebo GLA, se upřednostňuje v rostlině, která je schopna produkovat ALA inhibici aktivity desaturázy typu Δ15 nebo ω3.

Hostitel vhodný pro produkci ALA se může odstranit, redukovat nebo získat inhibici aktivity desaturázy typu Δ15 nebo ω3 (obrázek č. 2). Toho lze dosáhnout přípravou expresívní kazety antisense Δ15 nebo ω3 transkriptů, porušením genu Δ15- nebo co3-desaturázy. Podobně produkce LA nebo ALA je zvýhodněna v rostlině, která vykazuje aktivitu Á6-desaturázy tím, že poskytuje expresívní kazetu nesmyslného Δ6 transkriptů tím, že se poruší gen A6-desaturázy.

Produkce kyseliny olejové se upřednostňuje v rostlinách, které vykazují aktivitu Δ12 desaturázy. Připraví se expresívní kazeta pro přípravou expresívní kazety antisense Δ12 transkriptů nebo porušením genu A12-desaturázy. Při produkci ARA obecně používaná expresívní kazeta poskytuje aktivitu Δ5 • · · · • · • «

desaturázy , zvláště v hostitelské buňce, která produkuje nebo pohlcuje DGLA. Produkce nenasycené mastné kyseliny typu ω6, jako je ARA, se upřednostňuje v rostlinách schopných produkovat ALA na základě inhibice aktivity desaturázy typu Δ15 nebo ω3. To je doprovázeno přípravou expresívní kazety pro nesmyslný transkript Δ15 nebo ω3 nebo porušením genu desaturázy Δ15 nebo ω3.

Produkce mastných kyselin v transgenních rostlinách

Produkce mastných kyselin v transgenní rostlině má několik výhod oproti izolaci z přirozených zdrojů, jako jsou ryby nebo rostliny. Produkce mastných kyselin v rekombinantních rostlinách poskytuje schopnost změnit přirozený profil mastných kyselin rostlin tím, že poskytuje nové dráhy syntézy v hostiteli, čímž dochází ke zvýšení množství požadované 'PUFA nebo jejích konjugovaných forem a ke snížení množství nežádoucích PUFA. Při produkci mastných kyselin v transgenních rostlinách také dochází k tomu, že exprese genů desaturázy probíhá v určitých tkáních a/nebo v částech rostlin, což způsobuje, že v těchto tkáních a/nebo v částech rostlin lze dosáhnout značně zvýšeného množství požadovaných PUFA, čímž získání PUFA s uvedených tkání se stává ekonomické. Požadovaná PUFA se může například exprimovat v semenech. Metody izolace olejů semen jsou v oboru dobře známy. Mimo poskytnutí zdroje požadovaných PUFA pro čištění, komponenty olejů semen se mohou manipulovat prostřednictvím exprese genů desaturázy, buď samotných nebo v kombinaci s jinými geny, jako jsou geny elongázy, přičemž vznikají oleje semen, které se mohou přidat do zvířecího mléka a/nebo do syntetického nebo semisyntetického mléka. Tak se mohou použít jako kojenecká výživa v případě, že kojení není možné nebo není žádoucí nebo v případě podvýživy nebo onemocnění kojenců i dospělých.

V případě produkce PUFAv závislosti na hostitelské buňce, na dostupnosti substrátu a na požadovaném konečném • · • · · · • · produktu(ech), na několika polypeptidech, zvláště desaturázách, je žádoucí použít polypeptidy, které katalyzují přeměnu kyseliny stearové na olejovou, LA na GLA, ALA na SDA, kyseliny olejové na LA, nebo LA na ALA. Tyto polypeptidy zahrnují enzymy, které desaturují v pozicích Δ6, Δ9, Δ12, Δ15 nebo ω3. Jestliže se vybírá specifický polypeptid vykazující desaturační aktivitu, je nutné zvažovat optimální pH polypeptidu, zda polypeptid je enzym omezený rychlostí nebo jeho komponent, zda používaná desaturáza je podstatná pro syntézu požadovaných mastných kyselin a/nebo jestli polypeptidy vyžadují ko-faktory. Exprimovaný polypeptid má přednostně parametry kompatibilní s biochemickým prostředím jeho polohy v hostitelské buňce. Polypeptid například může v hostitelské buňce soutěžit o substrát s jinými enzymy. Analyzuje se K_m a specifická aktivita polypeptidu, za účelem zjištění, zda tyto hodnoty jsou určujícím kritériem vhodnosti daného polypeptidu při modifikaci produkce PUFA v dané hostitelské buňce. Polypeptid používaný v určité situaci je ten, který je za daných podmínek funkční v hostitelské buňce, ale v jiném případě to může být polypeptid vykazující aktivitu desaturázy, který je schopný modifikovat relativní produkci požadovaných PUFA. Na obrázku č. 1 je zobrazeno schéma syntézy kyseliny arachidonové (20:4 ₂ ky_seij__ny palmitové (C16). Klíčový enzym v této dráze je A5-desaturáza, která přeměňuje kyselinu DH-y-linolenovou (DGLA, kyselina íkosatrienová) na ARA. Dále se zde ukazuje přeměna kyseliny alinolenové (ALA) na kyselinu stearidonovou pomocí Δ6desaturázy. Produkce dalších PUFA vedle ARA zahrnujících EPA a DHA je zobrazena na obr. č. 2. Klíčovým enzymem při syntéze kyseliny arachidonové (20:4 δ⁵'^8,11'¹⁴) z kyseliny stearové (C18) je Δβ-desaturáza, která přeměňuje kyselinu linolenovou na kyselinu γ-linolenovou. Dále se zde ukazuje přeměna kyseliny alinolenové (ALA) na kyselinu stearidonovou pomocí Δ6• · • · · · • · desaturázy. Při produkci ARA se používá sekvence DNA kódující polypeptid vykazující aktivitu Á5-desaturázy. V určitých příkladech může se tato DNA spojit s expresívní kazetou, která poskytuje desaturázy. antisense používaných produkci polypeptidu, který má aktivitu Δ6Transkripční kazeta může poskytovat produkci produkt. Volba profilu PUFA sekvencí pro A15-transkripční kazet závisí částečně na v hostitelské buňce. V případě, že aktivita Δδ-desaturázy je omezující, pak nadměrná exprese samotné A5-desaturázy je dostačující ke zvýšení produkce ARA.

Zdroje polypeptidů vykazující desaturační aktivitu

Zdroje polypeptidů vykazující desaturační aktivitu a oligonukleotidů kódujících takové polypeptidy jsou organizmy, které produkují požadovanou poly-nenasycenou mastnou kyselinu. Mikroorganizmy, které mají schopnost produkovat ARA se mohou použít jako zdroje genů A5-desaturázy. Mikroorganizmy, které mají schopnost produkovat GLA nebo SDA se mohou použít jako zdroje genů Δ6- a/nebo A12-desaturázy. Takové mikroorganizmy například zahrnují ty organizmy patřící k rodu Mortierella, Conidiobolus, Pythlum, Phytophathora,

Porphyridium, Coidosporium, Mucor, Fusarium,

Rhodotorula a Entomophthora. V rodu Porphyridium je zajímavé Porphyridium cruentum. V rodu Mortierella zvláštní zájem budí Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella ramanniana, var. angulispora a Mortierella alpina. V rodu Mucor zvláštní zájem budí Mucor circinelloides a Mucor javanicus.

DNA kódující požadované desaturázy se mohou identifikovat různým způsobem. Zdroj požadované desaturázy, například knihovna genomové DNA nebo cDNA z Mortierella, se mohou testovat detekovatelnými, enzymaticky nebo chemicky syntetizovanými sondami, které se mohou připravit z DNA, RNA

Penicillium, Aspergillus, • · • · nebo z nukleotidů, které se přirozeně nevyskytují, nebo ze směsi uvedených látek. Sondy se mohu syntetizovat enzymaticky z DNA známých desaturáz a jsou vhodné pro metody hybridizace za normální nebo snížené přísnosti. Oligonukleotidové sondy se mohou také použít jako zdroje testování a mohou se zakládat na sekvencích známých desaturáz zahrnujících sekvence, které jsou mezi známými desaturázami konzervativní, nebo na sekvencích peptidů získaných z požadovaného čištěného proteinu. Oligonukleotidové sondy založené na aminokyselinových sekvencích se mohou degenerovat, aby se zdůraznila degenerace genetického kódu nebo se mohou přeskupit ve prospěch preferovaných kodonů zdrojového organizmu. Oligonukleotidy se mohou použít jako primery pro PCR z reverzně přepisované mRNA ze známého nebo pochybného zdroje. Produkt PCR může mít celou délku cDNA nebo se může použít za vzniku sondy, která slouží pro získání cDNA v celé délce. V jiném případě požadovaný protein se může celý sekvenovat a uskuteční se celková syntéza DNA kódující uvedený polypeptid.

Jestliže je to nutné, izoluje se genomová DNA nebo cDNA, kterou je možné sekvenovat známými metodami. V oboru je známo, že takové metody sekvenování jsou chybné. Proto se stalo rutinou vícenásobné sekvenování jedné oblasti a stále je nutné počítat s měřitelnou četností chyb ve výsledné dedukované sekvenci, zvláště pak v oblastech, které vykazují repetice, extenzivní sekundární strukturu nebo neobvyklé složení baží, jako jsou oblasti s vysokým obsahem GC. Když vzniknou rozpory, může se provést opětné sekvenování a mohou se použít speciální metody. Uvedené speciální metody mohu zahrnovat změnu podmínek sekvenování za použití: různých teplot, různých enzymů, proteinů, které mění schopnost oligonukleotidů tvořit struktury vyššího řádu, změněných nukleotidů, jako je ITP nebo metylovaný dGTP, různého složení gelu například přidání formamidu, různých primerů nebo primerů lokalizovaných v různé vzdálenosti od problematické oblasti nebo různých templářů, • · • · jako jsou j ednořetězcové DNA. Může se také použít sekvenování mRNA.

Ve většině případů některé nebo všechny kódující sekvence polypeptidu vykazující desaturační aktivitu pocházejí z přirozeného zdroje. V některých situacích je nutné modifikovat celý nebo část kodonů například zesílit expresi použitím kodonů preferovaných hostitelem. Hostitelem preferované kodony se mohou stanovit z kodonů, které se vyskytují nejčastějí v proteinech, jenž se exprimují v určitém druhu hostitele v největším množství. Kódující sekvence polypeptidu vykazující desaturační aktivitu se může syntetizovat celá nebo její část. Celá DNA nebo její části se mohou také syntetizovat tak, aby se odstranily libovolné destabilizující sekvence nebo oblasti sekundární struktury, které se budou vyskytovat v přepsané mRNA. Celá nebo části DNA se mohou také syntetizovat za účelem změny složení baží na ty, které preferuje požadovaná buňka hostitele. Způsoby syntézy sekvencí a spojení sekvencí se uvádějí v literatuře. Za účelem získání mutací přirozeně se vyskytujících genů desaturázy, aby došlo k produkci polypeptidu, který vykazuje desaturační aktivitu in vivo s fyzikálními a kinetickými parametry, jenž více vyhovují funkci hostitelské buňky, se může použít mutageneze in vitro a selekce, místně řízená mutageneze nebo jiné způsoby požadovaných

Buňka pak vykazuje delší poločas rozpadu polynenasycených mastných kyselin a vyšší rychlost produkce.

Požadovaná cDNA mé méně než 60 % A+T, upřednostňuje se méně než 50 % A+T. V lokalizovaném měřítku v okně dvaceti párů baží se upřednostňuje, aby se zde nenacházely oblasti cDNA, které obsahují více jak 75 % A+T. V okně o 60 párech baží ae upřednostňuje, aby se zde nenacházely oblasti cDNA obsahující více jak 60 A+T, přičemž více se upřednostňuje, aby se zde nenacházely oblasti obsahující více než 55 % A+T.

Desaturáza organizmu Mortierella alpina • · * · • · • ·

Ve středu zájmu je Δ5-, Δ6- a A12-desaturáza organizmu

Mortierella alpina. A5-desaturáza ma

446 aminokyselin.

Aminokyselinová sekvence je zobrazena na obrázku č. 7. Gen kódující A5-desaturázu organizmu Mortierella alpina se může exprimovat v transgenních mikroorganizmech tak, že se docílí silnější syntézy ARA z DGLA. Mohou se také použít jiné DNA, které jsou v podstatě identické s DNA Á5-desaturázy organzimu Mortierella alpína nebo které kódují polypeptidy, jenž jsou v podstatě shodné s polypeptidem A5-desaturáza organizmu Mortierella alpina. Δβ-desaturáza organizmu Mortierella alpina má 457 aminokyselin a její předpokládaná molekulová hmotnost je 51 800. Aminokyselinová sekvence je zobrazena na obrázku č. 3. Gen kódující Δβ-desaturázu organizmu Mortierella alpina se může exprimovat v transgenních rostlinnách nebo ve zvířatech tak, že se docílí silnější syntézy GLA z kyseliny linolenové a kyseliny staearidonové (SDA) z ALA. Mohou se také použít jiné DNA, které jsou v podstatě identické s DNA Δβ-desaturázy organzimu Mortierella alpina nebo které kódují polypeptidy, jenž jsou v podstatě shodné s polypeptidem Δβ-desaturáza organizmu Mortierella alpina. A12-desaturáza organizmu Mortierella alpína má aminokyselinovou sekvenci zobrazenou na obrázku č

Mortierella

5. Gen kódující A12-desaturázu organizmu alpina se může exprimovat v transgenních rostlinnách tak, že se docílí silnější syntézy LA z kyseliny olejové. Mohou se také použít jiné DNA, které jsou v podstatě identické s DNA A12-desaturázy organzimu Mortierella alpina nebo které kódují polypeptidy, jenž jsou v podstatě shodné s polypeptidem A12-desaturáza organizmu Mortierella alpina

Termín „v podstatě shodné znamená aminokyselinovou sekvenci nebo sekvenci nukleové kyseliny vykazující za účelem zvýšené preference alespoň 60 %, 80 %, 90 % nebo 95 % homologii s aminokyselinovou sekvencí A5-desaturázy organizmu

Mortierella alpina nebo se sekvencí nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci. V případě polypeptidů je délka porovnávaných upřednostňuj e sekvencí obecně alespoň 16 aminokyselin, se alespoň 20 aminokyselin, více se upřednostňuje 35 aminokyselin. V případě nukleových kyselin délka porovnávaných sekvencí je obecně alespoň 50 nukleotidů, upřednostňuje se alespoň 60 nukleotidů a více se upřednostňuje alespoň 75 nukleotidů a nejvíce se upřednostňuje 110 nukleotidů. V typickém případě se homologie měří za použití softwaru pro sekvenční analýzu, jako je například Sequence Analysis software od Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, lne., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715) a MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S.Bascom Avenue, Suitě 200, Campbell, California 95008). Takový software páruje podobné sekvence, čímž přiřazuje různé stupně homologie různým substitucím, delecím a jiným modifikacím. Konzervativní substituce typicky zahrnují substituce v následující skupinách: glycín a alanin; valin, izoleucin a leucin; kyselina aspartová, kyselina a glutamin; serin a threonin; lyzin a a tyrozin. Substituce se mohou také provést na základě konzervativní hydrofobicity nebo hydrofílity (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982) nebo na základě schopnosti předpovídat podobnou sekundární strukturu polypeptidu (Chou and Fasman, Adv. Enzymol. 47:45-148,1978).

glutamová, asparagin arginin; fenylalanin

Další desaturázy

Vynález popisuje příbuzné desaturázy pocházející ze stejného nebo jiného organizmu. Takové příbuzné desaturázy zahrnují varianty popsané Δ5-, Δ6- nebo A12-desaturázy vyskytující se ve stejném nebo odlišném specie Mortierella stejně jako homology popsané A5-desaturázy z jiných specie a • · • · * · vývojově příbuzné proteiny, které vykazují desaturační aktivitu. Vynález dále popisuje desaturázy, které, ačkoli nejsou v podstatě shodné s A5-desaturázou Mortierella alpína, desaturují molekulu mastné kyseliny v poloze 5., 6. nebo 12.

uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny. Příbuzné desaturázy se mohou identifikovat na základě své schopnosti fungovat stejným způsobem jako popsané desaturázy, které jsou stále schopny účinně přeměnit DGLA na ARA, LA na GLA, ALA na SDA nebo olejovou kyselinu na LA. Příbuzné desaturázy se mohu také identifikovat na základě prohledávání sekvenčních databází. Pomocí hybridizace se sondou odvozenou z popsané desaturázy s knihovnou zkonstruovanou ze zdrojového organizmu nebo pomocí RT-PCR z mRNA ze zdrojového organizmu a primerů založených na popsané desaturáze, se hledají sekvence homologní s popsanou desaturázou. Takové desaturázy zahrnují lidské desaturázy, Dictyostelium discoideum a Phaeodactylum tricornum.

Oblasti polypeptidu desaturázy, které jsou důležité pro desaturační aktivitu, se mohou stanovit rutinní mutagenezí, expresí výsledných mutantních polypeptidů a stanovením jejich aktivit. Mutanti mohou zahrnovat delece, inzerce a bodové mutace nebo jejich kombinace. Typická funkční analýza začíná deleční mutagenezí za účelem stanovení N- a C-terminálních omezení proteinu nezbytných pro funkci proteinu. Pak se provedou vnitřní delece, inzerce nebo bodové mutace za účelem stanovení oblastí nezbytných pro funkce uvedeného proteinu. Dále se mohou použít jiné metody, jako je kazetová mutageneze nebo celková syntéza. Deleční mutageneze se provede například použitím exonukleáz, přičemž se postupně odstraní kódující oblasti 5' a 3' konců. Za účelem provedení takových postupů jsou dostupné kity. Po deleci je kódující oblast doplněna ligací oligonukleotidů obsahujících počáteční a terminační kodon. V jiném případě se oligonukleotidy kódující počáteční a konečný kodon začlení do kódující oblastí za použití různých • · · · · ·· · • » · · * · t

• · · · · · · ·· · · · · ·« ·· metod zahrnující místně řízenou mutagenezí, mutagenní PCR nebo ligaci k DNA, která je štěpena v existujících restrikčních místech. Vnitřní delece se mohou podobně vytvořit řadou metod, které zahrnují použití existujících restrikčních míst v DNA, použití mutagenních primerů prostřednictvím místně řízené mutageneze nebo mutagenní PCR nebo ligaci do DNA štěpené v existujích restrikčních místech. Vnitřní delece se mohou podobně provádět pomocí různých metod zahrnující použití existujících restrikčních míst v DNA použitím mutagenních primerů prostřednictvím místně řízené mutageneze nebo mutagenním PCR. Začlenění se provádí za použití metod, jako je linkrem vyhledávaná mutageneze, místně řízená mutageneze nebo mutagenní PCR. Bodové mutace se provádějí způsoby, jako je místně řízená mutageneze nebo mutagenní PCR.

Chemická mutageneze se může také používat při identifikaci oblastí polypeptidů desaturázy, které jsou důležité v případě aktivity. Mutovaná konstrukce se exprimuje a testuje se schopnost pozměněného proteinu fungovat jako desaturáza. Taková analýza struktury-funkce může stanovit, které oblasti se mohou deletovat, v kterých oblastech se toleruje inzerce a které bodové mutace dávají vzniku mutantnímu proteinu, který funguje v podstatě stejným způsobem jako přirozená desaturáza. Vynález popisuje všechny takové mutantní proteiny a nukleotidové sekvence kódující tyto proteiny.

Exprese genů desaturázy

Po té, co se získala DNA kódující polypeptid desaturázy, umístí se do vektoru schopného se replikovat v hostitelské buňce nebo se pomnožit in vitro způsobem, jako je PCR nebo dlouhé PCR. Replikační vektory mohou zahrnovat plazmidy, fágy, viry, kozmidy a podobně. Požadované vektory zahrnují vektory použitelné pří mutagenezí genu nebo při expresi genu v hostitelských buňkách. Metoda dlouhého PCR provádí in vitro propagaci velké konstrukce tak, že pozmění gen, aby došlo • « « « • « • · · · · «· · • « · · · · · • · « * · · · • · · · · · ·· ·· k mutagenezi nebo k přidání expresívních signálů. Může tak dojít k propagaci výsledných konstrukcí in vitro, aniž se použije replikační vektor nebo hostitelská buňka.

Za účelem exprese polypeptidu desaturázy, funkční transkripční a translační iniciační a terminační oblasti jsou operativně spojeny s DNA kódující polypeptid desaturázy. Iniciační a terminační oblasti transkripce a translace se odvodily z různých zdrojů, které zahrnují exprimovanou DNA, geny, o kterých se ví nebo se předpokládá, že se budou v požadovaném systému exprimovat, expresívní vektory, chemickou syntézu nebo endogenní lokus v hostitelské buňce. Exprese v rostlinné tkáni a/nebo v rostlinné části vykazuje určitou účinnost, zvláště, když tkáň nebo část rostliny je možné jednoduše sklidit. Takovou částí rostliny jsou semena, listy, plody, květy, kořeny atd.. Expresi je možné cílit do takové oblasti rostliny použitím specifických regulačních sekvencí, jako se popisují v dokumentech USPN 5,463,174, USPN 4,943,674, USPN 5,106,739, USPN 5,175,095, USPN 5,420,034, USPN 5,188,958 a USPN 5,589,379. V jiném případě exprimovaným proteinem může být enzym, který produkuje produkt, který se může začlenit přímo nebo po dalších úpravách do kapalné frakce z hostitelské rostliny. V tomto případě exprese genů desaturáz nebo nesmyslné transkripty desaturáz mohou změnit množství specifických PUFA nebo jejich derivátů, které se nacházejí v rostlinných částech a/nebo v rostlinných tkáních. Kódující oblast polypeptidu Á5-desaturázy se exprimuje buď samotná nebo s jinými geny, přičemž vznikají tkáně a/nebo části rostlinobsahujicí vyšší podíly požadovaných PUFA nebo ve kterých složení PUFA je blíže zastoupení zastoupení PUFA v lidském mléce (Príeto et al., přihláška PCT WO 95/24494). Terminační oblast se může získat z 3'oblasti genu, ze kterého se získala iniciační oblast nebo z odlišného genu. Je znám velký počet terminačních oblastí, které jsou použitelné v různých hostitelích stejného nebo odlišného rodu a druhu.

• · • c • · • · • · ♦ · · · · · fr · · • · · · · · · · ·· fr · ···» · . · · ···· ··· ·· ···· ·· ··

Terminační oblast se obvykle vybrala podle toho, zda je výhodná nebo ne, spíše než na základě určité vlastnosti.

Volba hostitelské buňky je zčásti ovlivněna profilem žádaných PUFA v transgenní buňce a přirozeným profilem hostitelské buňky. Při produkcí kyseliny linolenové z kyseliny olejové použití sekvence DNA kóduje polypeptid, který vukazuje aktivitu Á12-desaturázy. Při produkci GLA z kyseliny linolenové použitá sekvence DNA kóduje polypeptid, který vykazuje aktivitu Δβ-desaturázy. Při použití hostitelské buňky, která exprimuje aktivitu A12-desaturázy a nevykazuje aktivtu A15-desaturázy nebo jí byla tato aktivita odstraněna, se může použít expresívní kazeta, která poskytuje nadměrnou expresi Δβ-desaturázy, což je obecně dostatečné, aby se zvýšila produkce GLA v transgenní buňce. V případě, že hostitel exprimuje aktivitu A9-desaturázy, pak exprese Δ12- a Δβ-desaturázy může způsobit zvýšenou produkci GLA. V určitých případech, kdy exprese aktivity Δβ-desaturázyse spojí s expresí aktivity A12-desaturázy, je nutné, aby hostitelská buňka přirozeně vykazovala nízkou aktivitu A15-desaturázy nebo se mutovala, aby vykazovala tuto nízkou aktivitu Δ15desaturázy. V jiném případě hostitelská buňka vhodná pro expresi Δβ-desaturázy může vykazovat vysokou aktivitu Δ12desaturázy nebo se může za tímto účelem mutovat.

Exprese v hostitelské buňce může být dočasná nebo stabilní. K dočasné expresi dochází zavedením konstrukcí, které obsahují expresívní signály funkční v hostitelské buňce, ale uvedené konstrukce se nereplikují a řídce se v hostitelské buňce začleňují, nebo se hostitelská buňka nemnozí. Dočasné exprese lze také dosáhnout vyvoláním aktivity regulovatelného promotoru, který je operativně spojen s genem. Takové indukovatelné systémy často vykazují slabou expresi. Stabilní exprese se může dosáhnout zavedením konstrukce, která se může začlenit do hostitelského genomu nebo se může samostatně » · * » · • · v « v « replikovat v hostitelské buňce. Stabilní exprese genu se může vybrat použitím selekčního markéru, který se nachází konstrukci konstrukcí. markér. Když v expresívní s expresívní exprimuj ící začlenění konstrukce, k v hostitelském genomu prostřednictvím použití homologie s hostitelským se muže začleněním odstraněním nebo se transfekuje společně

Pak následuje selekce buněk je stabilní exprese výsledkem integraci konstrukcí může dojít náhodně nebo se může cílit konstrukcí obsahujících oblasti genomem, což je dostatečné pro rekombinaci s hostitelským lokusem. Jestliže jsou konstrukce cíleny do endogenního lokusu, pak endogenní lokus může poskytnout všechny nebo některé oblasti regulující transkripci nebo translaci.

Jestliže je nutné zesílení exprese polypeptidů desaturázy ve zdrojovém organizmu, může se použít několik metod. Do hostitelského organizmu se mohou zavést další geny kódující polypeptid desaturázy. Exprese z lokusu přirozené desaturázy také zesílit homologní rekombinaci, například silnějšího promotoru do hostitelského genomu, destabilizačních sekvencí buď z mRNA nebo z kódovaného proteinu delecí uvedené informace z hostitelského genomu nebo přidáním stabilizačních sekvencí k mRNA (USPN 4,910,141 a USPN 5,500,365).

Jestliže je nutné exprimovat více než jeden odlišný gen pak zavedené geny je možné pomnožit v hostitelské buňce za použití replikačních vektorů nebo začleněním do hostitelského genomu. Jestliže se z odděleného replikačního vektoru exprimují dva nebo více genů, je nutné, aby každý vektor vykazoval odlišný způsob replikace. Každá zavedená konstrukce, ať už se začleňuje nebo ne, by měla mít odlišný způsob selekce a neměla by být homologní s jinými konstrukcemi, což je podmínkou stabilní exprese a předchází se tak znovu uspořádání elementů mezi konstrukcemi. Správná volba regulačních oblastí, způsoby selekce a metoda propagace zavedené konstrukce se t · mohou stanovit experimentálně tak, že všechny zavedené geny se pro syntézu nutná transdukci, zavedení, elektroporaci, libovolnou jinou metodu, mohou exprimovat v síle, která je požadovaných produktů

Konstrukce obsahující gen se může zavést do hostitelské buňky standardním způsobem. Tyto metody zahrnují transformaci, fúzi protoplastů, lipofekci, transfekci, konjugaci, infekci, balistické mikroinjekce, zaškrabávání nebo kterou se zavádí gen do hostitelské buňky (USPN 4,743,548, USPN 4,795,855, USPN 5,068,193, USPN 5, 188,958, USPN

5,463,174, USPN 5,565,346 a USPN 5,565,347). Je výhodné, aby manipulovaná hostitelská buňka, která pohlcuje sekvencí DNA nebo uvedenou konstrukci, se označila jako „transformovaná nebo „rekombinantní. Hostitel bude obsahovat alespoň jednu kopii expresívní konstrukce. Může však obsahovat dvě kopie nebo více kopií v závislosti na tom, zda gen se začleňuje do genomu, amplifikuje se nebo je přítomen na extrachromozomálním elementu, který vykazuje více kopií.

Transformovaná hostitelská buňka se může identifikovat selekcí markéru, který je obsažen v zavedené konstrukci.

V jiném případě oddělená markerová konstrukce se může zavést do hostitelské buňky dohromady s požadovanou konstrukcí.

V typickém případě se vybraly transformovaní hostitelé na základě jejich schopnosti růst na selekčním médiu. Selekční média mohou obsahovat antibiotikum a může jim chybět faktor, který je nezbytný pro růst netransformovaného hostitele. Takovým faktorem může být nutrient nebo růstový faktor. Takový zavedený gen markéru může propůjčovat rezistenci na antibiotika nebo kódovat podstatný růstový faktor nebo enzym a umožňuje růst na selekčním médiu, když se exprimuje v transformované hostitelské buňce. Středem zájmu je rezistence na kanamycin a na aminoglykosid G418 (popisuje se v dokumentu USPN 5,034,322). Selekce transformovaného hostitele se může také vyskytnout v případě, že se může přímo » · · · 9 • * · · • · 9 « • 9 9 9 9· nebo nepřímo detekovat exprimovaný markerový protein. Markerový protein se může exprimovat samotný nebo jako fúze s jiným proteinem. Markerový protein se může detekovat na základě jeho enzymatické aktivity. β-galaktozidáza může přeměnit substrát X-gal na zbarvený produkt a luciferáza může přeměnit luciferin na produkt emitující světlo. Markerový protein se může detekovat produkcí světla nebo změnou charakteristik. Zelený fluorescenční protein Aeguorea victorie fluoreskuje, jestliže markerového proteinu například v proteinu se ozáří modrým světlem. K detekci nebo molekulárního tag přítomného Buňky se mohou použít protilátky, exprimující markerový .protein nebo tag se vyberou na základě vizuálního pozorování nebo způsobem, jako je FACS nebo panning za použití protilátek.

PUFA produkované za použití metod a kompozic se mohou najít v hostitelské rostlinné tkáni a/nebo v části rostliny jako volné mastné kyseliny nebo ve spojení s formami, jako jsou acylglyceroly, fosfolípidy, sulfolipidy nebo glykolipidy a mohou se extrahovat z hostitelské buňky různými způsoby, které jsou dobře známy v oboru. Takové způsoby mohou zahrnovat extrakci organickými rozpouštědly, sonikací, extrakci superkritickými tekutinami za použití například oxidu uhličitého. Dále se mohou použít fyzikální postupy, jako je tlak nebo kombinace obou způsobů. Zvláště zajímavá je extrakce hexanem, metanolem a chloroformem. Je-li to nutné, vodná vrstva se může okyselit, aby se protonizovaly negativně nabité části a tím se zvýšila parcionizace požadovaných produktů v organické vrstvě. Po extrakci se mohou organická rozpouštědla odstranit odpařením v proudu dusíku. Když se izolují v konjugovaných formách, produkty se mohou enzymaticky nebo chemicky štěpit, aby se uvolnila volná mastná kyselina nebo méně komplexní konjugát. Ty mohou být předmětem další manipulace za vzniku požadovaného konečného produktu.

tt a a a a a a • · · a · · · · • · · · β · · • a · « · · a • * a a a a a a ··

Konjugované formy mastných kyselin se štěpí hydroxidem draselným.

Čištění mastných kyselin

V případě, že je nezbytné další čištění, mohou se použít standardní metody. Takové metody mohou zahrnovat extrakci, aplikaci močoviny, frakční krystalizaci, HPLC, frakční destilaci, chromatografii na silikagelu, centrifugaci při vysokých rychlostech nebo destilaci nebo kombinace uvedených metod. Ochrana reakčních skupin, jako jsou kyselé nebo alkenylové skupiny, se může provést v libovolném kroku známých metod, například alkylace nebo jodizace. Používané metody obvykle zahrnují metylací mastných kyselin za vzniku metylesterů. Podobně lze ochranou skupinu odstranit v libovolném kroku. Čištění frakcí obsahujících ARA, DHA a EPA lze provést aplikací močovinou a/nebo frakční destilací.

Použití mastných kyselin

Existuje řada využití mastných kyselin podle vynálezu. Sondy založené na DNA podle vynálezu se mohou použít ve způsobech izolace příbuzných molekul nebo ve způsobech pro detekci organizmů exprimujících desaturázy. Při použití jako sondy DNA nebo oligonukleotidy musí být detekovatelné. To je obvykle doprovázeno zachycením značení buď na vnitřním místě, například začleněním upraveného zbytku, nebo na 5' nebo 3'konec. Takové značení je možné detekovat přímo, může vázat druhou molekulu, která je detekovatelně značená nebo se může vázat na neznačenou druhou molekulu a detakovatelně značenou terciální molekulu. Tento proces se může prodlužovat, pokud je to praktické, aby se dosáhlo uspokojivého detekčního signálu bez nežádoucí úrovně signálu pozadí. Sekundární, terciální e přemosťovací systémy mohou zahrnovat použití protilátek proti libovolné jiné molekule, zahrnující značení nebo jiné protilátky nebo mohou zahrnovat libovolné molekuly, které se

9999

99 99 99 ** ··»· ·»«· .· ’“· . ' ί . : :: i * ···· · · « · ·*·* ··· 99 9999 99 ·· vzájemně váží. Je to například systém biotinstreptavidin/avidin. Detakovatelné značení v typickém případě zahrnuje radioaktivní izotopy, molekuly, které chemicky nebo enzymaticky produkují nebo mění světlo, enzymy, které produkují detekovatelné reakční produkty, magnetické molekuly, fluorescenční molekuly nebo molekuly, které po navázání mění svou své fluorescenční nebo světlo-emitující charakteristiky. Příklady metod značení se popisují v publikaci USPN 5,011,770. V jiném případě navázání cílových molekul se může detekovat přímo měřením změn teploty roztoku při navázání sondy prostřednictvím izotermální titrační kalorimetrie nebo potažením sondy nebo cíle na povrch a detekcí změny rozptylu světla z povrchu, ke které dochází navázáním cíle nebo sondy. To se může provést systémem BIAcore.

PUFA podle vynálezu produkované rekombinantními způsoby se mohou použít v různých oblastech. Aplikace PUFA lidem a zvířatům v různých formách může vést ke zvýšenému množství PUFA ne pouze přidaným PUFA, ale také jejich metabolickými progeny.

Jestliže například inherentní dráha Δβ-desaturázy není u jednotlivce funkční, léčba pomocí GLA může vést ne pouze k ke zvýšenému množství GLA, ale také dalších produktů v dráze, jako je ARA a prostaglandiny (obrázek č. 1). Komplexní regulační mechanizmy mohou způsobit, že je nutné kombinovat různé PUFA nebo přidat různé konjugáty PUFA za účelem předejít, řídit nebo obejít takové mechanizmy, přičemž se u jedince dosáhne požadovaného množství specifického PUFA.

PUFA nebo jejich deriváty vyrobené popsanou metodou se mohou použít jako potravinové doplňky, zvláště v kojeneckých výživách, jsou vhodné pro pacienty intravenózní výživou nebo pří prevenci nebo léčbě podvýživy. Zvláště mastné kyseliny, jako je EPA se mohou používat při úpravách složení kojeneckých výživ, aby se lépe replikovalo složení PUFA lidského mateřského mléka. Převládajícími triglyceridy v mateřském

·· ·· e ř ·

O · ·· mléce jsou 1,3-di-oleoyl-2-palmitoyl- s 2-palmitoylglyceridy, které jsou lépe absorbovány než 2-oleoyl- nebo 2lineoylglyceridy (USPN 4,876,107). V typickém případě lidské mateřské mléko vykazuje profil mastných kyselin obsahující přibližně 0,15 % až 0,36 % DHA, přibližně 0,03 % až 0,13 % EPA, přibližně 0,30 až 0,88 % ARA, Přibližně 0,22% až 0,67 %

DGLA a přibližně 0,27 až 1,04% GLA.Preferovaný poměr GLA:DGLA:ARA v kojeneckých výživách je přibližně od 1:1:4 až přibližně 1:1:1. Množství olejů, které poskytují tyto poměry PUFA se mohou stanovit bez experimentů. PUFA nebo hostitelské buňky, které je obsahují se mohou také použít jako potravinové doplňky pro zvířata, aby se změnila tkáň zvířat nebo složení mastných kyselin v mléce, tak aby se více přiblížily těm, které jsou nutné pro aplikaci lidem nebo zvířatům.

Výživové přípravky

Vynález popisuje také výživové přípravky. Typický výživový přípravek podle vynálezu zahrnují libovolné potraviny nebo přípravky vhodné pro člověka. Mohou se aplikovat enterálně nebo parenterálně. Tyto přípravky po vstupu do těla (a) vyživují a staví tkáně nebo dodávají energii a/nebo (b) udržují, obnovují nebo podporují adekvátní nutriční statut nebo metabolickou funkci.

Nutriční kompozice podle vynálezu obsahuje alespoň jeden olej nebo jednu kyselinu, které se produkují v souladu s vynálezem, a mohou se vyskytovat v pevné nebo kapalné formě. Navíc kompozice může zahrnovat poživatelné makronutrienty, vitaminy a minerály v množství, které jsou nutné pro určité použití. Množství takových složek kolísá v závislosti na skutečnosti, zda kompozice je určená pro ' použití normálními zdravými kojenci, dětmi nebo dospělými jedinci, kteří tyto doplňky vyžadují ze zvláštních důvodů, jako je například jistý metabolický stav (například metabolická porucha).

• · ·

Příklady makronutrientů, které se mohou přidávat do kompozice zahrnují, ale nejsou omezeny na poživatelné tuky, sacharidy a proteiny. Příklady takových poživatelných tuků zahrnují, ale nejsou omezeny na kokosový olej, sojový olej a mono- a diglyceridy. Příklady takových sacharidů zahrnují, ale nejsou omezeny na glukózu, poživatelnou laktózu a hydrolyzovaný škrob. Dále se uvádějí příklady proteinů, které se mohou využít jako nutriční kompozice podle vynálezu. Jsou to například sojové proteiny, elektrodialyzovaná syrovátka, elektrodialyzované odtučněné mléko, mléčná syrovátka nebo hydrolyzáty těchto proteinů.

S ohledem na vitaminy a minerály do nutričních kompozic je možné přidat: vápník, fosfor, draslík, sodík, chlorid, hořčík, mangan, železo, měď, zinek, selen, jód a vitaminy A, E, D, C a komplex vitaminů B. Dále se mohou přidat jiné takové minerály a vitaminy.

Komponenty využívané v nutričních kompozicích podle vynálezu jsou semi-čištěného nebo čištěného původu. Termín „semi-čištěný nebo „čištěný znamená materiál, který se připravil čištěním přirozeného materiálu nebo syntézou.

Příklady nutričních kompozic podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na kojenecké výživy, potravinové doplňky a rehydratační kompozice. Nutriční kompozice zahrnují, ale nejsou omezeny na ty, které využívají enterální nebo parenterální doplňky pro kojence, speciální kojenecké výživy, doplňky pro staré lidi doplňky pro lidi s gastrointestinálními problémy a/nebo s poruchami střebávání,

Výživové přípravky

Typický výživový přípravek podle vynálezu bude obsahovat poživatelné makronutrienty, vitaminy a minerály v množství, které je nutné pro určité použití. Množství takových látek kolísá v závislosti na skutečnosti, zda výživa je určena pro aplikaci normálním, zdravým jedincům, kteří jsou dočasně • · vystaveny stresu nebo jsou určeny subjektům, kteří mají specializované potřeby vzhledem k jistým chronickým nebo akutním sťádiím onemocnění (například metabolické poruchy). Odborníkům je zřejmé, že komponenty, které se využívají v nutričních kompozicích podle vynálezu pocházejí ze semičištěného nebo čištěného zdroje. Termín „semi-čištěný nebo „čištěný znamená materiál, který se připravil čištěním přirozeného materiálu nebo syntézou. Tyto metody jsou dobře známy v oboru (Code of Federal Regulations for Food

Ingredíents and Food Processing; Recommended Dietary Allowances, 10^th Ed., National Academy Press, Washington, D.C., 1989).

V preferovaném provedení vynálezu jsou nutriční přípravky enterálním nutričním produktem, upřednostňuje se enterální nutriční produkt určený pro děti nebo dospělé. Vynález popisuje nutriční přípravek, který je vhodný pro výživu dospělých, kteří jsou vystaveni stresu. Výživa obsahuje vedle PUFA podle vynálezu, makronutrienty, vitaminy a minerály v množství, které poskytuje denní nutriční dávka pro dospělé j edince.

Makronutriční komponenty zahrnují poživatelné tuky, sacharidy a proteiny. Příklady poživatelných tuků jsou kokosový olej, sojový olej mono- a diglyceridy a oleje PUFA podle vynálezu. Příklady sacharidů jsou glukóza, poživatelné laktóza a hydrolyzovaný kukuřičný škrob. Typickým zdrojem proteinu je sojový protein, elektrodialyzované syrovátka nebo elektrodialyzované netučné mléko nebo mléčná syrovátka nebo hydrolyzáty uvedených proteinů. Mohou se použit jiné zdroje proteinů. Tyto makronutrienty se mohou přidat ve formě běžně přijatelných nutričních látek v množství, které odpovídá složení lidského mateřského mléka nebo energetickému základu, to znamená, že se uvedené množství vztahuje kalorický základ.

• · ···· ·· ·· ·· · · ··♦ ···· ···· ·*··*·· · · · * · j : · * • ···· ·»»<

···· ··· «· ···· ·· ·«

Metody tvoření kapalných a enterálních výživných příprajsouvků dobře známy v oboru a popisují se v příkladech provedení vynálezu.

Enterální formulace se může sterilizovat a následně používat ve formě „vhodný pro přímou konzumaci (RTF) nebo se mohou uchovávat v koncentrovaném roztoku nebo ve formě prášku. Prášek je možné připravit sušením enterálního přípravku roztřikem, který se připravuje podle shora uvedených metod. Přípravek se může rekonstituovat rehydratací koncentrátu. Kojenecké výživy a výživy pro dospělé jsou dobře známy v oboru a jsou běžně dostupné (např. Similac®, Ensure®, Jevity® a Alimentům® od firmy Ross Products Division, Abbott Laboratories). Olej nebo kyselina podle vynálezu se může přidat do libovolného přípravku v množství popsaném dále v textu.

Energetická hustota výživového přípravku, když je v kapalné formě, se může v typickém případě pohybovat v rozmezí 0,6 kcal až 3,0 kcal na mililitr. V pevné nebo práškové formě může nutriční doplněk obsahovat přibližně 1,2 až více než 9 kcal na gram, upřednostňuje se 3 až 7 kcal na gram. V obecném případě osmolalita kapalného produktu může být nižší než 700 mOsm. Více se upřednostňuje hodnota nižší než 660 mOsm.

Výživjyý přípravek v typickém případě zahrnuje vedle PUFA podle vynálezu, vitaminy a minerály, což napomáhá přijímat požadovanou minimální denní dávku těchto substancí. Vedle shora.uvedených PUFA může být nutné doplnit nutriční kompozici zinkem, mědí a kyselinou listovou a dalšími antioxidanty. Věří se, že uvedené látky také poskytují podporu stresovanému imunitnímu systému a tak přináší jedinci jistý benefit. Přítomnost zinku, mědi a kyseliny listové není nutná, aby se dosáhlo pozitivního účinku na imunitní supresi. Farmaceutická kompozice se může také doplnit uvedenými látkami.

• 9 • ·

9 9 9 9 9 9 · * · * 9«»· · · · · ···· ·· 9 9 9 9 9 * 999 9 · 9 · · · « * 9999 9 9 · 9 ······· ·· 9999 99 99

Ve více preferovaném provedení nutriční kompozice obsahuje vedle antioxidantního systému a komponentů PUFA zdroj sacharidů, kde alespoň 5 hmotnostních procent uvedených sacharidů tvoří nestravitelný oligosacharid. Ve více preferovaném provedení vynálezu nutriční kompozice navíc obsahuje protein taurin a karnitin.

PUFA nebo jejich deriváty, které se připravují popsanými způsoby, se mohou použít jako potravinové náhrady nebo doplňky zvláště pak u kojenecké výživy u pacientů vyživovaných intravenózně nebo při prevenci nebo léčbě podvýživy. V typickém případě lidské mateřské mléko vykazuje profil mastných kyselin obsahující přibližně 0,15 % až 0,36 % DHA, přibližně 0,03 % až 0,13 % EPA, přibližně 0,30 až 0,88 % ARA, Přibližně 0,22% až 0,67 % DGLA a přibližně 0,27 až 1,04% GLA. Převládajícími triglyceridy v mateřském mléce jsou 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl s 2-palmitoylglyceridy, které jsou lépe absorbovány než 2-oleoyl nebo 2-lineoylglycerídy (USPN 4,876,107). Pak se mastné kyseliny, jako jsou ARA, DGLA, GLA a/nebo EPA připravované podle vynálezu, mohou použít při změně složení kojeneckých výživ, aby lépe napodobily zastoupení PUFA v lidském mateřském mléce. Olejová kompozice vhodná pro použití ve farmakologických nebo v potravinových doplňcích, zvláště pak u náhražek mateřského mléka nebo jeho doplňků, bude přednostně obsahovat jednu nebo více ARA, DGLA a GLA. Více se upřednostňuje, aby olej obsahoval přibližně 0,3 až 30 % ARA, přibližně 0,2 až 30 % DGLA a přibližně 0,2 až 30 % GLA.

Koncentrace a poměry ARA, DGLA a GLA se mohou upravit pro určité konečné použití. Když se připravuje doplněk mateřského mléka nebo jeho náhražka, olejová kompozice, která obsahuje dvě nebo více látek ze skupiny zahrnující ARA, DGLA a GLA je v poměru přibližně 1:19:30 až 6:1:0,2. Například mateřské mléko u zvířat vykazuje poměr ARA: DGLA: DGL, který kolísá v rozmezí 1:19:30 až 6:1:0,2. Preferují se poměry 1:1:1, 1:2:1 ·· ···· · · * · ·· · * • · · ···· ···· .····..;; .· · ; ϊ ; :

• ···· ···♦ ······· ·· ···· ·· «· a 1:1:4. Když se produkují PUFA v hostitelské buňce dohromady, je vhodné upravit rychlost a procenta přeměny prekurzorového substrátu, jako je GLA a DGLA na ARA, aby se tak přesně řídily poměry PUFA. 5 až 10 % rychlost konverze DGLA na ARA se může použít pro produkci poměru ARA : DGLA přibližně 1:19, zatímco rychlost konverze přibližně 75 až 80 % se může použít při produkci poměru ARA : DGLA 6:1. Proto se může použít jak v systému buněčné kultury nebo v hostitelském organizmu, regulace časování, rozsahu a specifity exprese desaturázy za účelem modulace množství a poměru PUFA. Oleje se mohou izolovat a rekombinovat v požadovaných koncentracích a v poměrech v závislosti na použitém expresívním systému, kterým je například buněčná kultura nebo zvíře exprimující olej (e) ve svém mléce. Množství olejů poskytující uvedené poměry PUFA se mohou stanovit následujícími standardními protokoly. PUFA nebo hostitelské buňky, které je obsahují, se mohu také použít jako doplňky krmivá pro zvířata, přičemž mění složení mastných kyselin v mléce nebo v tkáních na složení, které je přijatelnější pro aplikaci lidem nebo zvířatům.

V případě potravinového doplňku se mohou PUFA nebo jejich deriváty začlenit do potravinářských olejů, tuků nebo margarinů, které se tvoří tak, že při normálním použití recipient dostane požadované množství. PUFA se mohou také přidat do kojeneckých výživ, nutričních doplňků nebo jiných potravinářských produktů a mohu se použít jako protizánětlivé činidla nebo činidla, která snižují hladinu cholesterolu.

Farmaceutické kompozice

Vynález popisuje farmaceutickou kompozici obsahující jednu nebo více kyselin a/nebo výsledné oleje produkované podle zde popsaných metod. Taková farmaceutická kompozice může obsahovat jednu nebo více kyselin a/nebo olejů stejně jako standardní, netoxický farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans nebo vehikl, jako je například fyziologický roztok pufrovaný fosfátem, voda, etanol, polyoly, rostlinné oleje, smáčecí činidlo nebo emulze, jako je například emulze voda/olej. Kompozice může být v kapalné nebo pevné formě. Kompozice může být například ve formě tablet, kapsulí, poživatelné kapaliny nebo prášku, v injektovatelné formě nebo ve formě povrchově aplikované masti nebo krému.

Možné způsoby aplikace zahrnují například orální, rektální a parenterální aplikaci. Způsob aplikace bude samozřejmě záležet na požadovaném účinku. Jestliže se kompozice má použít pro léčbu drsné, suché nebo podrážděné kůže nebo při léčbě poraněné nebo popálené kůže nebo při ošetření kůže nebo vlasů, které jsou poškozeny nemocí, může se aplikovat povrchově.

Dávku kompozice aplikovaná pacientovi může stanovit odborník v závislosti na různých faktorech, jako je hmotnost pacienta, věk pacienta a stav imunitního systému atd..

S ohledem na formu kompozice může být například roztok, disperze, suspenze, emulze nebo sterilní prášek, který se pak může rekonstituovat.

Kompozice podle vynálezu se může dále kosmetické účely. Mohou se přidat do dříve kosmetických přípravků. Vytvoří se směs, která se může použít jako změkčovací kompozice.

Farmaceutické kompozice se mohou používat pro aplikaci komponentu PUFA jednotlivci. V hodné farmaceutické kompozice mohou obsahovat fyziologicky přijatelné sterilní vodné nebo nevodné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze nebo sterilní prášky pro přípravu sterilních roztoků nebo disperzí. Příklady vhodných vodných nebo nevodných nosičů, ředidel, rozpouštědel nebo vehíklů zahrnují vodu, etanol, polyoly (propylenglykol, polyethylenglykol, glycerol a podobně), jejich vhodné směsi, rostlinné oleje (jako je olivový olej) a injektovatelné organické estery, jako je etyloleját. Vhodná těkavost se může udržovat v případě disperze například zachováním požadované velikosti částic a použitím povrchových činidel. Může být také využít pro existuj ících • * nutné použít izotonická činidla například cukry, chlorid sodný a podobně. Vedle takových inertních ředidel kompozice také může zahrnovat adjuvans, jako je smáčecí činidla, emulgátory a suspendační činidla, sladidla, příchutě a aroma.

Suspenze vedle aktivních sloučenin mohou obsahovat suspendační činidla, jako je například etoxylovaný izostearylalkohol, polyoxyetylensorbitol a sorbitanestery, mikrokrystalická celulóza, metahydroxid hliníku, bentonit, agar-agar a tragakant nebo směsi uvedených látek a podobně.

Pevné dávkovači formy, jako jsou tablety a kapsule se mohou připravit za použití metod dobře známých v oboru. PUFA podle vynálezu mohou tvořit tablety spolu s běžnými tabletovými bázemi, jako je laktóza, sacharóza a kukuřičný škrob v kombinaci s pojidlem, jako je arabská guma, kukuřičný škrob nebo želatina, dezintegrační činidla, jako je bramborový škrob nebo kyselina alginová a lubrikační prostředek, jako je kyselina stearová nebo stearát hořečnatý. Kapsule se mohou připravit začleněním těchto ekcipientů do želatinových kapsuli buď samotných nebo s antioxidanty a s komponenty PUFA. Množství antioxidantů a komponentů PUFA, které by se měly začlenit do farmaceutické kompozice by měly souhlasit se shora uvedeným průvodcem.

Termín „léčit znamená buď předcházet nebo redukovat výskyt nežádoucích stavů. Například léčit utlumení imunity znamená buď předcházet výskytu této suprese nebo redukovat stupeň takové suprese. Termíny „pacient a zaměnitelné a oba tyto termíny znamenají zvíře znamená libovolného teplokrevného savce, ale není omezen na psi, lidí, opice a bezocasé opice. Termín „přibližně znamená množství, které kolísá v daném rozmezí v závislosti na použití. Libovolné numerické číslo nebo rozmezí specifikované ve specifikacích by se mohlo upravovat podle shora uvedeného termínu.

.jedinec jsou Termín „zvíře • ·

Termín „dávka znamená množství nutriční nebo farmaceutické kompozice podávané pacientovi v jediné aplikaci a je navržena tak, aby se zavedlo účinné množství antioxidantů a strukturních triglyceridů. Odborníkům je zřejmé, že jediná dávka kapalného nutričního prášku by měla poskytnout shora uvedené množství antioxidantů a PUFA. Dávka by měla zahrnovat objem, který je schopen konzumovat typický dospělý jedinec při jedné aplikaci. Toto množství může široce kolísat v závislosti na věku, hmotnosti, pohlaví nebo zdravotním stavu pacienta. Obecně platí, že jedna dávka kapalného nutričního produktu by měla obsahovat objem 100 až 600 ml, upřednostňuje se 125 až 500 ml a nejvíce se preferuje 125 až 300 ml.

PUFA podle vynálezu se mohou také přidat do potravin dokonce tehdy, jestliže potravinové doplňky nejsou nutné. Kompozice se například mohou přidat do libovolného typu potravin, které se neomezují na margariny, upravená másla, sýry, mléko, jogurt, čokoláda, bonbony, sušenky, salátové oleje, tuky vhodné pro tepelné zpracování, maso, ryby a nápoje.

Farmaceutické aplikace

V případě farmaceutického použití (v lidské a veterinární medicíně) se mohou kompozice obecně aplikovat orálně nebo libovolným jiným způsobem, při kterém může dojít k úspěšné absorpci. To znamená například parenterálně (to je podkožně, do svalu nebo intravenózně), rektálně nebo vaginálně nebo povrchově, což může být například kožní mast nebo roztok. PUFA podle vynálezu se mohou aplikovat samostatně nebo v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ekcipientem. Jestliže jsou dostupné želatinové kapsule, stávají se preferovanou formou orální aplikace. Doplnění potravy, jak se popisuje shora v textu, se může také provádět orálním způsobem aplikace. Nesaturované kyseliny podle vynálezu se mohou aplikovat v konjugovaných formách nebo jako sole, estery, • « • · jako jsou normálního amidy nebo pro-formy léčiv mastných kyselin. Vynález popisuje libovolné farmaceuticky přijatelné sole. Zvláště se preferují sole sodíku, draslíku a litia. Dále se využívají Nalkylpolyhydroxaminové sole, jako je N-metylglukamin, který se popisuje v publikaci WO 96/33155. Preferovanými estery jsou etylestery. Jako pevné sole se mohou estery aplikovat ve formě tablet. V případě intravenózní aplikace se mohou PUFA nebo jejich deriváty začlenit do běžných formulací,

Intralipidy. Profil mastných kyselin v plazmě dospělého jedince je 6,64 až 9,46 % ARA, 1,45 až 3,11 % DGLA a 0,02 až 0,08 % GLA. Tyto PUFA nebo jiné metabolické prekurzory se mohou aplikovat buď samotné nebo ve směsi s jinými PUFA, aby se dosáhlo u pacienta normálního profilu mastných kyselin. Jestliže je to nutné jednotlivé komponenty formulací mohou být dostupné ve formě kitů, které jsou vhodné pro jediné nebo vícenásobné použití. Typická dávka určité mastné kyseliny je 0,1 mg až 20 mg nebo dokonce 100 g denně a upřednostňuje se 10 mg až 1, 2, 5 nebo 10 g denně nebo molární ekvivalentní množství jejich derivátů. Vynález dále popisuje parenterální nutriční kompozice obsahující přibližně 2 až 30 hmotnostních procent mastných kyselin vypočítaných jako triglyceridy. Preferují se kompozice, které obsahují přibližně 1 až 25 hmotnostních procent celkové kompozice PUFA jak GLA (USPN 5,196,198) . Do kompozice se mohou přidat jiné vitamíny a zvláště pak v tucích rozpustné vitaminy, jako je vitamin A, D, E a L-karnitin. Jestliže je to nutné mohou se přidat konzervační činidla, jako je například α-tokoferol, v typickém případě tvoří přibližně 0,1 hmotnostních procent.

Vhodné farmaceutické kompozice mohou obsahovat fyziologicky přijatelné sterilní vodné nebo nevodné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze a sterilní prášky vhodné pro rekonstituci na sterilní injektovatelné roztoky nebo disperze. Příklady vhodných a nevodných nosičů, ředidel, rozpouštědel nebo vehiklů zahrnují vodu, etanol, polyoly (propylenglyol, • · ·· ·· · · • J · · « * t • · · · « « · • · · · · ·«·· ······ · · · · ·· < « >· polyetylenglykol, glycerol a podobně), jejich vhodné směsi, rostlinné oleje (jako je olivový olej) a injektovatelné organické estery, jako je etyloleát. Vhodnou fluiditu lze udržovat v případě disperzí například zachováním požadované velikosti částic nebo použitím povrchově aktivních činidel. Může být také nutné zahrnout izotonická činidla, například cukry, chlorid sodný a podobně. Vedle takových inertních ředidel kompozice může také zahrnovat adjuvans, jako jsou smáčecí činidla, emulgační a suspendační činidla, sladidla, příchutě a aroma.

Suspenze vedla aktivních látek mohou obsahovat suspendační činidla, jako je například etoxylované izostearylalkoholy, polyoxyetylensorbitol a sorbitanestery, mikrokrystalická celulóza, metahydroxid hlinitý, bentonit, agar-agar a tragakant nebo směsi uvedených látek a podobně.

Zvláště preferované kompozice obsahují estery diacetyltartarové kyseliny a mono- a diglyceridů rozpuštěné ve vodném médiu nebo v rozpouštědle. Estery diacetyltartarové kyseliny a mono- a diglyceridů mají hodnotu HLB přibližně 9 až 12 a jsou podstatně více hydrofilní, než existující antimikrobiální lipidy, které vykazují hodnoty HLB 2 až 4. Tyto existující hydrofóbní lipidy se nemohou tvořit ve formě vodných kompozic. Tyto lipidy se mohou rozpouštět ve vodném médiu v kombinaci s estery diacetyltartarové kyseliny a monoa diglyceridů. V souladu s tímto provedením vynálezu estery diacetyltartarové kyseliny a mono- a diglyceridů (například DATEM-C12:0) se taví s jinými aktivními antimikrobiálními lipidy (například 18:2 a 12:0 monoglyceriody) a mísí se za vzniku homogenní směsi. Homogenita umožňuje zvýšit antimikrobiální aktivitu. Směs se může zcela dispergovat ve vodě. To není možné bez přidání esterů diacetyltartarové kyseliny a mono- a diglyceridů. Dříve než se přidá voda se vše promíchá s dalšími monoglyceridy. Vodná kompozice se pak může míchat za sterilních podmínek s fyziologicky přijatelnými • · · · ředidly, konzervačními činidly, pufry nebo hnacími látkami, které jsou nutné pro vytvoření spreje nebo inhalační formy.

Vynález dále popisuje léčbu řady poruch pomocí mastných kyselin. Doplňování PUFA podle vynálezu se může použít při léčbě restenózy po angioplastice. Pomocí PUFA podle vynálezu lupénky se mohou léčit symptomy zánětů, revmatické artritidy a astma. Důkazy ukazují, že PUFA se mohou podílet na metabolizmu vápníku, což naznačuje, že PUFA podle vynálezu se mohou použít při léčbě nebo prevenci osteoporózy a kamenů v ledvinách nebo v močovém ústrojí.

PUFA podle vynálezu se mohou použít při léčbě zhoubného bujení. Ukázalo se, že maligní buňky vykazují změnu ve složení mastných kyselin. Navíc mastné kyseliny zpomalují růst uvedených buněk a způsobují jejich úmrtí a zvyšují jejich citlivost k chemoterapeutickým činidlům. Dále se popisuje, že GLA způsobuje re-expresi buněčných adhezivních molekul Ekaderinu v buňkách karcinomů, přičemž ztráta exprese uvedených molekul je spojena s agresivní tvorbou metastáz. Klinické testy intravénozní aplikace ve vodě rozpustných litných solí GLA pacientům se zhoubným bujení pankreasu ukazují podstatné zvýšení pacientů, kteří přežívají. Podávaní PUFA je také vhodné pro léčbu kachexie spojené se zhoubným bujením.

PUFA podle vynálezu se mohou také použít při léčbě cukrovky (USPN 4,826, 877; Horrobin et al. , Am. J. Clin. Nutr. Vol. 57 (Suppl.), 732S-737S). Změněný metabolizmus mastných kyselin a jejich složení se demonstruje u zvířat trpících cukrovkou. Tyto změny naznačují, že se podílí na komplikacích, které vznikají při dlouhodobém onemocnění cukrovkou. Tyto komplikace zahrnují retinopatii, neuropatii, nefropatii a poškození reprodukčního systému. Petrklíčový olej, který obsahuje GLA, je schopen bránit a napravit poškození nervů při dlouhodobě trvající cukrovce.

PUFA podle vynálezu se mohou používat při léčbě ekzémů, při redukci krevního tlaku. Nedostatečnost mastných kyselin se ··

projevuje ekzémy a studie naznačují, že GLA pozitivně působí na ekzémy. GLA se také podílejí na snížení vysokého tlaku spojeného se stresem. Ukázalo se, že GLA a DGLA inhibují agregaci destiček, způsobují vazodilaci, snižují hladinu cholesterolu a inhibují proliferaci hladkého svalstva stěn cév a vláknité tkáně (Brenner et al. , Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 83, p.85-101, 1976). Aplikace GLA nebo DGLA samotného nebo v kombinaci s EPA snižuje nebo brání krvácení v gastrointestinálním traktu a jiným vedlejším účinkům, které jsou spojeny s aplikací nesteroidních protizánětlivých léčiv (USPN 4,666,701). GLA a DGLA také předchází nebo léčí endometriózu a premenstruální syndrom (USPN 4,758,592) a léčí myalgickou encefalomyelitidu a chronickou únavu po vírové infekci (USPN 5,116,871).

Další použití PUFA podle vynálezu zahrnuje použití při léčbě AIDS, roztroušené sklerózy, akutního respiračního syndromu, vysokého tlaku a zánětlivého onemocnění kůže. PUFA podle vynálezu se mohou také použít ve formulích určených pro celkové posílení a pro geriatrickou léčbu.

Veterinární aplikace

Je třeba poznamenat, že shora uvedené farmaceutické a výživné kompozice se mohou také aplikovat zvířatům, stejně jako lidem. Zvířata mohou mít stejné potřeby a stejné stavy jako lidé. Olej nebo kyseliny podle vynálezu se mohou používat jako doplňky nebo náhrady při krmení zvířat.

Přehled obrázků na výkresu

Obrázek č. 1 ukazuje možnou dráhu syntézy kyseliny arachidonové (20:4 Δ5, 8, 11, 14) a kyseliny stearadinové (18:4 Δ6, 9, 12, 15) z kyseliny palmitové (Ci₆) z různých organizmů, které zahrnují řasy, Mortierella a lidi. Tyto PUFA mohou sloužit jako prekurzory jiných molekul důležitých pro • · • · · · · • · » · « člověka a jiná zvířata. Mezi uvedené molekuly patří prostacykliny, leukotrieny a prostaglandiny. Některé z nich jsou zde zobrazeny.

Obrázek č. 2 ukazuje možnou dráhu produkce PUFA vedle ARA, zahrnující EPA a DHA v případě různých organizmů.

Obrázek č. 3A až E ukazuje sekvenci DNA (SEQ ID NO: 1) Δβdesaturázy Mortierelle alpina a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.

Obrázek č. 4 ukazuje uspořádání části aminokyselinové sekvence Δβ-desaturázy Mortierella alpina s jinými příbuznými sekvencemi (SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11, 12 a 13).

Obrázek č. 5A až D ukazuje sekvenci DNA Al2-desaturázy (SEQ ID NO: 3) a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID

NO: 4) :

Obrázek č. 6 ukazuje dedukovanou aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 14) fragmentu PCR (uvedeno v příkladu 1).

Obrázek č. 7A až D zobrazuje sekvenci DNA A5-desaturázy (SEQ ID NO: 5) Mortierella alpina.

Obrázek č. 8 zobrazuje uspořádání proteinové sekvence Δ5desaturázy (SEQ ID NO: 6) s Δβ-desaturázou a příbuzné sekvence (SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18) .

Obrázek č. 9 ukazuje uspořádání proteinové sekvence Ma 29 a kontig 253538a.

Obrázek č. 10 ukazuje uspořádání proteinové sekvence Ma 524 a kontig 253538a.

Popis sekvencí:

SEQ ID NO: 1 ukazuje sekvenci DNA Δβ-desaturázy

Mortierella alpina.

SEQ ID NO: 2 ukazuje aminokyselinovou sekvenci Δβdesaturázy Mortierella alpina.

SEQ ID NO: 3 ukazuje sekvenci DNA A12-desaturázy

Mortierella alpina.

• ·

SEQ ID NO: 4 ukazuje aminokyselinovou sekvenci Δ12desaturázy Mortierella alpina.

SEQ ID NO: 5 ukazuje DNA sekvenci A5-desaturázy

Mortierella alpina.

SEQ ID NO: 7 až SEQ ID NO: 13 ukazují aminokyselinové sekvence, které jsou příbuzné Δβ-desaturázy Mortierella alpina.

SEQ ID NO: 14 aminokyselinovou sekvenci PCR fragmentu uvedeného v příkladu 1.

SEQ ID NO: 15 až SEQ ID NO: 18 ukazují aminokyselinové sekvence, které jsou příbuzné Δ5- a Δβ-desaturázy Mortierella alpina.

SEQ ID NO: 19 až SEQ ID NO: 30 zobrazují sekvence primerů

PCR.

SEQ ID NO: 31 až SEQ ID NO: 37 zobrazují lidské nukleotidové sekvence

SEQ ID NO: 38 až SEQ ID NO: 44 zobrazují lidské peptidové sekvence.

SEQ ID NO: 45 až SEQ ID NO: 46 zobrazují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci desaturázy Dictyostelium discoideum.

SEQ ID NO: 47 až SEQ ID NO: 50 ukazují nukleotidovou a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci klonu cDNA

Schizochytrium.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Izolace nukleotidové sekvence Δ5 desaturázy z organizmu Mortierella alpina

Organizmus Mortierella alpina produkuje kyselinu arachidonovou (ARA, 20:4) z prekurzoru 20:3 pomocí Δ5desaturázy. Nukleotidové sekvence kódující A5-desaturázu pocházející z Mortierella alpina se získala pomocí amplifikace PCR za použití prvního řetězce cDNA Mortierella alpina a • · • · »· · · • · · · • · · « degenerovaných oligonukleotidových primerů odpovídájících aminokyselinovým sekvencím, které jsou mezi Δβ-desaturázami z Synechocystis a Spirulina konzervativní. Postup je následuj ící:

Celková RNA se izolovala ze třídenní kultury organizmu Mortierella alpina produkující PUFA za použití protokolu podle publikace Hoge et al. (1982) Experimental Mycology 6: 225-232. RNA se používala pro přípravu dvouřetězcové cDNA za použití systému lambda-ZipLox od firmy BLR. Postupuje se podle instrukcí výrobce. Několik velikostí cDNA organizmu Mortierella alpina se zabalilo odděleně za vzniku knihoven z různými inzerty průměrné velikosti. Knihovna s úplnou délkou zahrnuje přibližně 3 x 10^s klonů, přičemž průměrná velikost inzertu je 1,77 kb. Knihovna vhodná pro sekvenování obsahuje přibližně 6 x 10⁵ klonů, přičemž průměrná velikost inzertu je 1,1 kb.

za použití

Tsyn 5'NO: 19).

pg

Superscript celkové RNA se reverzně přepsalo RTázy firmy BLR a primerů CAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEQ ID

Degenerované oligonukleotidy se navrhly tak, aby byly vhodné pro oblasti, které jsou mezi dvěmi sekvencemi Δβ-desaturázy cyanobakterií konzervativní. Použily se specifické primery D6DESAT-F3 (SEQ ID NO: 20) (5'-CUACUACUACUACAYCAYACOTAYACOAAYAT-3') a

D6DESAT-R3 (SEQ ID NO: 21) (5'-CAUCAUCAUCAUOGGRAAOARRTGRTG-3') , kde Y=C+T, R=A+G a O=I+C. Amplifikace PCR se provedla v objemu 25 μΐ a reakce zahrnuje templát získaný ze 40 ng celkové RNA, 2 pM každého primerů, 200 μΜ každého deoxyribonukleotidového trifosfátu, 60 mM Tris-Cl, pH 8,5, 15 mM (NH^SO,}, 2 mM MgCl₂. Vzorky se nejdříve denaturovaly při teplotě 95 °C po dobu 5 minut, pak se držely při teplotě 72 °C a přidalo se 0,2 jednotek Taq polymerázy. Podmínky PCR jsou následující: teplota 94 °C po dobu 1 minuty, teplota 45 °C po dobu 1,5 • · minuty, teplota 72 °C po dobu 2 minut. PCR proběhlo ve 35 cyklech. PCR prvního řetězce cDNA Mortierella alpina za použití těchto primerů produkuje reakční produkt o velikosti 550 bp. Porovnáním dedukované aminokyselinové sekvence PCR fragmentu Mortierella alpina se objevily oblasti homologie s . Srovnávané oblasti shody. Dedukovaná

A6-desaturázou (uvádí se na obrázku č. 4 vykazují pouze přibližně 28 % aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 14.

Produkt PCR se použil jako sonda pro izolaci odpovídajících klonů cDNA z knihovny Mortierella alpina. Nejdelší klon cDNA Ma29 se označil jako pCGN5521 a jeho oba řetězce se zcela sekvenovaly. cDNA je obsažena ve vektoru pZLl jako inzert o velikosti 1 481 bp (Bethesda Research

Laboratories ) a začíná s ATG, dále obsahuje otevřený čtecí rámec kódující 446 aminokyselin. Čtecí rámec obsahuje sekvenci dedukovanou z fragmentu PCR. Zjistilo se, že sekvence inzertu cDNA obsahuje oblasti homologní s A6-desaturázou (obrázek č. 8) . Například se zjistilo, že tři konzervativní histidinové boxy (které se pozorovaly v desaturázách vázaných na membráně (Okuley et al., (1994) The Plant Cell 6: 147-158) jsou přítomny v sekvenci Mortierella v polohách aminokyselin 171 až 175, 207 až 212 a 387 až 391 (obrázek č. 5A až 5D). Zjistilo se, že aminokyselinový motiv HXXHH, který je typický pro třetí histídínový box z desaturázy organizmu Mortierella, je QXXHH. Překvapivě N-konec kódovaného proteinu vykazuje podstatnou homologii s proteiny cytochromu b5. Tak klon cDNA Mortierella reprezentuje fúzi mezi cytochromem b5 a desaturázou mastné kyseliny. Vzhledem k tomu, že cytochrom b5 funguje jako donor elektronů při navázání desaturáz na membránu, je možné, že Nterminální doména cytochromu b5 tohoto desaturázového proteinu se účastní na jeho funkci. To může být výhodné při expresi desaturázy v heterogenních systémech při produkci PUFA.

• · • ·

Příklad č. 2: Izolace nukleotidové sekvence Δβ-desaturázy z organizmu Mortierella alpina

Náhodným sekvenováním klonů z knihovny cDNA organizmu M. alpina vhodné pro sekvenování popsané v příkladu 1 se získala sekvence nukleové kyseliny z parciálního klonu cDNA Ma524, která kóduje Δβ-desaturázu mastné kyseliny. Plazmidy obsahující cDNA se vystřihly následujícím způsobem:

gg fágu se kombinovalo se 100 μΐ kultury E. coliDHlOB(ZIP), která se kultivovala na kultivačním médiu ECLB s 10 μς/τηΐ kanamycinu, 0,2 % maltózy a 10 mM MgSO4. Kultivace proběhla při teplotě 37 °C po dobu 15 minut. Přidalo se 0,9 ml SOC a 100 μΐ bakterií se bezprostředně naneslo na každou plotnu obsahující 10 ECLB + 50 μς Pen. Doba 45 minut vhodná pro vzpamatování kultury nebyla nutná. Plotny se inkubovaly přes noc při teplotě 37 °C. Kolonie se vypíchly do kultivačního média ECLB + 50 μς Pen a inkubovaly se přes noc. Z této kultury se připravily zásobní roztoky s glycerolem a provedla se mini izolace DNA. Alikvót kultury používaný jako mini izolaci se uchovával jako zásobní roztok s glycerolem. Nanesení kultury na plotny s kultivačním médiem ECLB + 50 μς Pen/ml vedlo k tvorbě více kolonií a větší část kolonií obsahuje inzerty ve srovnání s plotnami, které obsahují 100 μg/ml Pen.

Náhodně se vypíchly kolonie a za použití sady pro mini izolaci a izolovala se plazmídová DNA. Z 5'konce inzertu cDNA se získala sekvence DNA a porovnala se z databází instituce National Center for Biotechnology Information (NCBI) za použití algoritmu BLASTX. Ma524 se identifikoval jako putativní Δβ-desaturáza založená na homologii sekvence DNA s dříve identifikovanými Δβ-desaturázami.

Z knihovny organizmu M. alpina se izoloval klon cDNA v plné délce. Četnost výskytu tohoto klonu se jeví být a málo (2x) menší ve srovnání s Ma29. Ma524 vykazuje podstatnou homologii s částí kosmídu Caenorhabditid elegans, WO6D2.4, • · fúzního proteinu cytochrom b5/desaturázy ze slunečnic a se dvěma Δβ-desaturázami pocházejících ze Synechocystis a Spirulina.

Navíc Ma524 vykazuje homologii s aminokyselinovou sekvencí Δβ-desaturázy brutnáka lékařského (PCT WO 96/21022). Ma524 tak kóduje Δβ-desaturázu, která je příbuzná Δβ-desaturáze brutnáku lékařského a řas.

Je však nutné poznamenat, že ačkoli aminokyselinové sekvence Ma524 a Δβ-desaturázy obsahuje oblasti homologie, složení baží cDNA je podstatně odlišné. Například se ukázalo, že cDNA brutnáku lékařského obsahuje 60 % A+T, některé oblasti obsahují 70 % A+T, zatímco Ma524 vykazuje průměrně 44% A+T, přičemž žádná oblast nepřesahuje 60

To může způsobit u zvířat, která expresi cDNA v mikroorganizmech nebo upřednostňují odlišné složení baží. Je známo, že k slabé expresi rekombinantních genů může dojít, když hostitel preferuje složení baží odlišné od složení zavedeného genu. Mechanizmy takové slabé exprese zahrnují sníženou stabilitu, skrytá místa sestřihu a/nebo translaci mRNA a podobně.

Příklad 3: Identifikace Δβ-desaturáz homologních s Δ6desaturázou organizmu Mortierella alpina

Pomocí algortímu BLASTX databáze „Expressed Sequence Tag („EST) prostřednictvím NCBI za použití aminokyselinové sekvence Ma524 se identifikovaly sekvence nukleové kyseliny, které kódují putativní Δβ-desaturázy. Několik sekvencí vykazuje podstatnou homologii. Zvláště dedukovaná aminokyselinová sekvence dvou sekvencí Arabidopsis thaliana (číslo uložení F13728 a T42806) vykazují homologii s dvěma různými oblastmi dedukované aminokyselinové sekvence Ma524. Vytvořily se následující primery:

ATTS4723-FOR (komplementární s F13728), SEQ ID NO: 22

5' CUACUACUACUAGGAGTCCTCTACGGTGTTTTG a • · ·· ·« ·· » · · · · · .· : · · ? ·· · : T42806-REV (komplementární s T42806) SEQ ID NO: 23

5' CAUCAUCAUCAUCAUATGATGCTCAAGCTGAAACTG.

Pět mikrogramů celkové RNA izolovaných z Arabidopsis thaliana se reverzně přepsala za použití Superscript Rtázy firmy BRL a primerů TSyn (5'CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3' ) a označila se jako SEQ ID NO: 24. PCR se provedla v objemu 50 μΐ, kde je obsaženo: templát získaný z 25 ng celkové RNA, 2 pM každého primerů, 200 μΜ deoxyribonukleotidového trifosfátu, 60 mM Tris-Cl, pH8,5, 15 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgC12, 0,2 jednotek Taq polymerázy. Podmínky v zařízení „termocycler byly následující: 94 °C pod obu 30 vteřin, 50 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C pod dobu 30 vteřin. PCR pokračovalo v 35 cyklech, pak následovalo další prodloužení při teplotě 72 °C po dobu 7 minut. Výsledkem PCR je fragment o přibližné velikosti 750 párů baží, který se subklónoval, označil se jako 12-5 a sekvenoval se. Každý konec tohoto fragmentu se vytvořil tak, aby odpovídal EST Arabidopsis, ze kterého se vytvořily primery PCR. Tato sekvence se pojmenovala 12-5. Dedukovaná aminokyselinová sekvence 12-5 se porovnávala se sekvencí Ma524 a EST z člověka (W28140), myši (W53753) a C.elegans (R05219) (obrázek č. 4). Na základě homologíe tyto sekvence reprezentují polypeptidy desaturázy. Geny se pak mohou vložit do expresívních vektorů a mohou se exprimovat v hostitelských buňkách a může se stanovit jejich specifická aktivita A6-desaturázy nebo jiné desaturázy způsobem popsaným dále v textu.

Příklad 4: Izolace nukleotidové sekvence Á12-desaturázy z organizmu Mortierella alpina

Na základě hromadění mastných kyselin se zdá pravděpodobné, že organizmus Mortierella alpina vykazuje desaturázu typu ωβ. ωβ-desaturáza je odpovědná za produkci kyseliny linolenové (18:2) z kyseliny olejové (18:1). Kyselina

	46	• · «··« ·· • · «· · • » · · · • · · · • » · ···· ·«· *·	·· ·· »· • · · · · * 0 • · · - « · • · · · 4 » € • * · · · « ···· ·· ··
linolenová	(18:2)	je	substrát	pro A6-desaturázy. Tento
experiment	se navrhl,	aby se	stanovilo, zda	organizmus
Mortierella	alpina	má	polypeptid	Δ12-desaturázy.	Jestli ano,

pak se stanovila odpovídající nukleotídová sekvence.

Náhodná kolonie z knihovny vhodné pro sekvenování organizmu M. alpina Ma648 se sekvenovala a identifikovala jako putativní desaturáza založená na homologii DNA sekvence s předem identifikovanými desaturázami, jak se popisuje v případě Ma524 (příklad č. 2) . Dedukovaná aminokyselinová sekvence z 5'konce cDNA Ma648 vykazuje podstatnou homologii s mikrozomální ω6(Δ12) desaturázou sóji (číslo uložení #L43921) stejně jako s 12-hydroxylázou oleátu fazole (číslo uložení #U22378). Jestliže se porovnávala s dalšími sekvencemi desaturáz mastných kyselin ωβ(Δ12) a ω3(Δ15) pozorovala se také jistá homologie.

Příklad 5: Izolace nukleotidové sekvence reduktázy cytochromu b5 z Mortierella alpina.

Nukleová sekvence kódující reduktázu cytochromu b5 z Mortierella alpina se získala následujícím způsobem. Knihovna cDNA se zkonstruovala na základě celkové RNA izolované z Mortierella alpina, jak se popisuje v příkladu 1. Sekvence DNA se získala z 5'a 3' konce jednoho z klonů M12-27. Průzkum ve veřejných databankách s dotaz em na dedukovanou aminokyselinovou sekvenci 3'-konce M12-27 (obrázek č. 5) vykázala podstatnou homologii se známými sekvencemi reduktáz cytochromu b5. Oblast obsahující více jak 49 aminokyselin klonu Mortierella vykazuje 55 % shody (73 % homologie) s reduktázou cytochromu b5 z prasete (uvedeno na obrázku č. 4) .

Příklad 6: Exprese klonů desaturázy M. alpina v pekařských kvasinkách litia se provedla podle Enzymology, Vol. 194, p.

Transformace kvasinek

Transformace kvasinek acetátem standardních protokolů (Methods in

186-187, 1991). Kvasinky se kultivovaly v kultivačním médiu

YPD při teplotě 30 °C. Buňky se centrifugovaly, resuspendovaly se v TE a opět se centrifugovaly a resuspendovaly se v TE obsahujícím 100 mM acetát litný. Pak proběhla centrifugace a opět se buňky resuspendovaly v TE/acetát litný. Resuspendované kvasinky se inkubovaly při teplotě 30 °C po dobu 60 minut za stálého míchání. Přidala se DNA sloužící jako nosič a do zkumavek se připravily alikvoty kultury kvasinek. Dále se do zkumavek přidala transformující DNA a zkumavky se inkubovaly po dobu 30 minut při teplotě 30 °C. Přidal se roztok PEG (35 % (hmotnost/objem) PEG 4 000, 100 mM acetát litný, TE pH 7,5) a pak následuje inkubace po dobu 50 minut při teplotě 30 °C.

Uskutečnil se teplotní šok provedený při teplotě 42 °C po dobu 5 minut, buňky se centrifugovaly do peletu, promyly se TE, opět se centrifugovaly a resuspendovaly se v TE. Resuspendované buňky se pak nanesly na plotny se selektivním médiem.

Exprese desaturázy v transformovaných kvasinkách

Klony cDNA z organizmu Mortierella alpina se testovaly, zda vykazují v pekařských kvasinkách aktivitu desaturázy. Jako pozitivní kontrola se použila Á15-desaturáza kanoly (získaná pomocí PCR použitím prvního řetězce cDNA ze semen Brassica napus kultivar 212/86 za použití primerů založených na publikované sekvenci (Arondel et al. Science 258: 1353-1355)). Gen Al5-desaturázy a gen z cDNA klonů Ma29 se začlenil do expresívního vektoru pYES2 (Invitrogen) za vzniku plazmidů pCGR-2 a pCGR-4. Tyto plazmidy se transfekovaly do kvasinek S. cerevisíae kmen 334 a exprimovaly se po indukci galaktózou v přítomnosti substrátů, které umožňují detekci specifické • φ ··» · > · # 1 • · »· aktivity desaturázy. Kontrolním kmenem byl S. cerevisiae kmen 334 obsahující nezměněný vektor pYES2. Používané substráty, produkované produkty a indikované aktivity desaturázy byly: DGLA (konverze na ARA indikuje aktivitu Á5~desaturázy), kyselina linolenová (konverze na GLA indikuje aktivitu Δ6desaturázy, konverze na ALA indikuje aktivitu A15-desaturázy), kyselina olejová (endogenní substrát připravený kvasinkami S. cerevisiae, konverze na kyselinu linolenovou indikuje aktivitu A12-desaturázy, která kvasinkám S. cerevisiae chybí) nebo ARA (konverze na EPA indikuje aktivitu A17-desaturázy). Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 1 dále v textu. Lipidové frakce se extrahovaly následujícím způsobem:

Kultury se kultivovaly po dobu 48 až 52 hodin při teplotě 15 °C. Buňky se centrifugovaly, pelet se promyl sterilní ddH₂O a znovu se centrifugací připravil pelet. Pelety se suspendovaly mícháním na vortexu v metanolu. Přidal se chloroform s tritridekanon (jako inertní standard). Směsi se inkubovaly alespoň jednu hodinu při teplotě místnosti nebo přes noc při teplotě 4 °C. Extrahovala se vrstva chloroformu a filtrovala se za použití Whatmanova filtru s jedním gramem nevodného síranu sodného za účelem odstranění partikulí a zbytku vody. Organická rozpouštědla se odpařila při teplotě 40 °C v proudu dusíku. Extrahované lipidy se pak derivatizovaly na metylestery mastných kyselin (FAME) a analyzovaly se chromatografií (GC) přidáním 2 ml 0,5 N hydroxidu draselného v metanolu. Zkumavka se uzavřela. Vzorky se zahřály na teplotu 95 °C až 100 °C po dobu 30 minut a ochladily se na teplotu místnosti. Pak se přidaly přibližně 2 ml 14 % fluoridu boritého v metanolu a zahřátí se opakovalo. Po té, co se extrahovaná lipidová směs ochladila, přidaly se 2 ml vody a 1 ml hexanu za účelem extrakce FAME pro analýzu GC. Procenta konverze se vypočítala dělením produkovaného produktu součtem produkovaného produktu a přidaného substrátu a pak násobeno 100. Pro výpočet procenta konverze kyseliny olejové, kam se • · ·* produkovaná kyselina kyseliny olejové a nepřidal žádný substrát, linolenová dělí součtem linolenové násobeno 100.

se celková produkované

Tabulka č. 1

Exprese desaturázy M. alpína v pekařských kvasinkách

Klón	enzymatická aktivita	% konverze substrátu
pCGR-2 A15-desaturáza kanoly	Δ6	0 (18:2 až 18:3ω6
Δ15	16,3 (18:2 až 18:3ω3)
Δ5	2,0 (20:3 až 18:3ω3)
Δ17	2,8 (20:4 až 20:5ω3)
Δ12	1,8 (18:1 až 18:2ωβ)
pCGR-4 (M. alpina podobný Δ6, Ma29)	Δ6	0
Δ15	0
Δ5	15,3
Δ17	0, 3
Δ12	3,3
PCGR-7 (M. alpína podobný Δ12, Ma648j	Δ6	0
Δ15	3,8
Δ5	2,2
Δ17	0
Δ12	63,4

Kontrolní klón A15-desaturázy vykazuje 16,3 % konverzi substrátu. Klón pCGR-4 exprimující cDNA Ma29 přeměnil 15,3 % 20:3 substrátu na 20:4w6, což indikuje, že gen kóduje Δ5desaturázu. Pozadí (nespecifická konverze substrátu) se v tomto případě pohybuje mezi 0 až 3 %. Klón pCGR-5 exprimující cDNA Ma524 přeměnil 6% substrátu na GLA, což indikuje, že gen kóduje Δβ-desaturázu. Klón pCGR-7 exprimující

I μΜ, procento konverze

I ···· • · ·# • · · * • · · • » · · • « » ·» ···· cDNA Ma648 přeměnil 63,4% substrátu na LA, což indikuje, že gen kóduje A12-desaturázu.

Dále se zjistilo, že substrát v různých koncentracích inhíbuje aktivitu. Když se přidal substrát v koncentraci 100 kleslo ve srovnání s koncentrací substrátu 25 μΜ (uvedeno dále v textu). Tyto data ukazují, že desaturázy s různými specifitami substrátu se mohu exprimovat v heterogenním systému a používají se za účelem produkce polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem.

Tabulka č. 2 reprezentuje zajímavé mastné kyseliny, jako procento celkových lipidů extrahovatelných z kvasinkového hostitele S.cerevisiae 334 s indikovaným plazmidem. V růstovém médiu není obsažena žádná glukóza. Afinitní plynová chromatografie se používala k separaci lipidů. GC/MS se použila pro ověření identity produktu(ů). Očekávaný produkt Á15-desaturázy organizmu B. napas, což je ct-linolenová kyselina, se detekoval, když se exogenně přidal její substrát kyselina linolenová do indukované kvasinkové kultury. Toto zjištění naznačuje, že exprese desaturázového genu v kvasinkách produkuje funkční enzym a detekovatelné množství produktu za současných růstových podmínek. Oba exogenně přidané substráty se pohltily kvasinkami, ačkoli do kvasinek se začlenilo o trochu méně PUFA s delšími řetězci, což je kyselina díhomo-y-linolenová (20:3) spíše než kyseliny linolenové (18:2), když se přidaly ve volné formě, aby se indukovala kvasinková kultura. Kyselina γ-linolenová se v kvasinkách detekovala jako nové PUFA, když během indukce a exprese v S. cerevisiae 334 (pCGR-5) byla přítomna kyselina Přítomnost uvedené PUFA ukazuje aktivitu Δ6linolenová desaturázy

Kyselina linolenová se lipidech pocházejících z pCGR-5 (MA524). identifikovala v extrahovaných z exprese S. cerevisiae 334 (pCGR-7), cDNA MA648 z M. alpina se klasifikuje jako A12-desaturáza.

·· · · ·· ·· • ·· · · ·· · • · · « » · # • · · · < · » · « • · ·· '>1

G d

>

O

Xi

G oj Ό ·· O co G t—I CL,

Ol

*.

Ol kyselina vyjádřená jako procento celkových lipidů extrahovaných z kvasinek 'Γ>Ί

G £

*	o
τ—1	4J
• .	Ή
CO	>G
rd	CX

'1>Ί

G d

>

O

	Xi
	G
	Ό
• ·	O
o	G
C\1	CX

Ίο c

>o

G

O co i ·· >O o d Ol N

CO co >,

G d > o Xi G Ό O

I H ř- CX

	c
	d
	>
	o
CO	x;
•»	G
co	Ό

o

G

CX '2 c

>o c

<D

OJ i—l

.. >o oo O r—1 N

Λ

O d

G

<T5		Ό	Ή
	d	•H	o
i—I	C	£	d
G	4-1	N	>
n	CO	rd	Xi
d	d	1-1
E-i	2	Oj	>

sr sr co

LO) cn co co

Ή

C

I-1 o

G

OJ -P ω c ω o >-< xí co o

LO) i—

LOJ o

co

Ol

I —Cř LO) O rG o <

CX ~ co o

LO)

O)

OJ

CO co

3*

I cř —

O LO) o <

Oj — cr

Ol rΟΊ cn o

xT

Ol co

LO)

I & --o CO O < CX

Γιο) χτ co

L0) co rI — & oi O r-J o < 0-1 — n

o o

xí c

•H d

o >

x;

d

G ♦H o

>

o c

o

	CO							r-H
	>, Xi				>	'Π3	'CCS	O c	'(3
4->					0	>	>		>
d	'<0			'Γ0	G	0	0		o
G	c			>	(U	L-l	c		G
4-1	4J			o	1-1	Q)	o		O
ω	CZ)			G	0	i—1		1	Ό
n	fÚ		>	(U	G	0	•H	o	•H
G	g		0	i—1	-r_|	c	G	£	-G
CZ)			•ΓΊ	0	i—I	♦H	ni	o	U
			tu	G	1	i—1	tu	-C	d
2	c		i—l	-H	a		4-1	-H	G
i	c		o	i—1			co	Ό	d
	(U				d	n3
O	Cn	0	d	d	G	c	fO	d	d
o	o	u	G	G	•i—1	H	G	G	c
v—l	Ό	«—1	•H	-H	i—!		-H	Ή	•H
	G	G	i—I	i—I	tu	(V	1-ί	i—1	i—1
(1)	<U	Ό	tu	tu	d	CZ)	tu	tu	(U
d		d	d	co	ί>Ί		d	d	d
	tu	4-1	Σ>1		Xi		Í>T		^*Ί
0	ΤΊ		Xi	Xi			Xi	x;	Xi
1-1		Xi			co	CO
d	i—l				• ·
Ό		>υ	ϊ—l	Ol	00	co		O)
•H	CO	Ή	• ·	• .	t—1	t“d
>G	f~d	I—)	co	co	1		co	o	o
Oj	*		:—1	i—1	a	o	i-H	OJ	Ol

• · · · • · « ·

Příklad 7: Exprese A5-desaturázy v rostlinách

Exprese v listech

Tento experiment se navrhla tak, aby se stanovilo, zda listy, kde se exprimuje Ma29 (což se stanovilo northernovou analýzou), budou schopny přeměnit exogenně aplikovanou DGLA (20:3) na ARA (20:4).

cDNA desaturázy Ma29 se modifikovala pomocí PCR tak, že se zavedlo restrikční místo vhodné pro klonování. Oblast kódující desaturázu se začlenila do kazety d35. Expresi řídí dvojitý promotor 35S vhodný zvláště pro expresi v listech rostliny Brassica (pCGN5525) podle standardních protokolů (USPN 5,424,200 a USPN 5,106,739). Transgenní rostliny Brassica obsahující pCGN525 se vytvořily podle následujících standarních protokolů (USPN 5,188,958 a USPN 5,463,174).

V prvním experimentu se použily tři rostliny: kontrolní LPOO4-1 a dvě transgenní 5525-23 a 5525-29. LP004 je odrůda rostliny Brassica s nízkým obsahem kyseliny linolenové. Listy z každé rostliny se použily pro jedno ze tří ošetření:.voda, GLA nebo DGLA. GLA a DGLA se získaly jako sole sodíku od firmy NuChek Prep a rozpustily se ve vodě v koncentraci 1 mg/ml. Alikvoty se držely v atmosféře dusíku a skladovaly se při teplotě -70°C. Listy se ošetřily kápnutím 50 μΐ uvedené látky. Kapka se jemně prstem v gumové rukavici rozetřela po celém povrchu listu. Aplikace se provedla přibližně 30 minut před koncem světelného cyklu, aby se minimalizovala foto-oxidace aplikovaných mastných kyselin. Po 6 dnech od ošetření se jeden list z každé skupiny rozdělil na polovinu podle středního žebra. Jedna polovina se promyla vodou, aby se odstranila nezačleněná mastná kyselina. Vzorky listů se lyofilizovaly přes noc a složení mastných kyselin se stanovilo plynovou chromatografií (GC) . Tyto výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 3 .

í

Tabulka č. 3:

Analýza mastných kyselin v listech z transgenních rostlin Ma29 Brassica

o o CM

ž?

o

O

10Ό

o

Ι0Ό

10Ό

0

0.02

9

10Ό

O O

0.02 1_

0.01

10Ό

0.01

10Ό

9

10Ό

:00

os

in

«η

in

Os

cn

9

Os

Os

cn

CM

SO

9

Os

9

£

o

O

o

ΜΊ

Tř

m

0

9

V)

v>

V)

<n

m

SO

20

o

O

9

9

9

9

9

9

9

9

9

d

d

d

d

9

d

d

£ w*

5?

o

o

o

o

o

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

ΓΌ

CM

Os

m

Os

vn

Os

v>

CM

C*

CM

cn

Os

9

9

£

in

Os

CM

CM

SO

'd

CN

SO

0

SO

C*

v>

1

00

Os

£

id

Os

o

sd

»d

cd

so

sd

sd

sd

CM

id

id

cd

'd*

Tf

-'t

ι/Ί

•’Τ

Tf

OJD cn

00

cn

CM

CM

SO

CM

9

r-

Os

m

CM

5?

O

O

O

O

9

<—

so

C-

VI

tT

cn

9

9

9

9

9

9

00

9

9

CM

CM

CM

9

9

9

9

9

9*

CM

SO

SO

SO

9

m

Os

CM

SO

OO

CM

V>

SO

C*

O

S?

c-

00

C-

Os

ΙΛ

00

CM

Os

SO

SO

CM

SO

σ.

9

9

00

so

SO

sd

sd

d

Tt

«d

»d

sd

«d

ví

id

ΓΏ

cd

sd

sd

>

00

o

r-

SO

so

cn

CM

SO

CM

cn

vs

CM

SO

00

c-

9

.·

s?

o

o

00

00

00

c*

00

00

00

00

c*

00

Ox

Os

00

00

SO

c*

00

ó

d

9

9

9

d

9

d

9

9

9

9

9

9

9

O

9

£

*r

wn

r*

so

l/S

Os

SO

CM

r*

00

ΠΊ

cn

9

óó

ž?

v>

iq

1.2

CM

CM

C*1

CM

C*S

cn

v>

1.2

rn

CH

ir>

so

sq

c-

SO

m

r-

CM

00

9

CM

SO

v>

Tt

00

9

00

^r

£

ΟΊ

<n

o

*—

9

»*

Cd

*-*

cn

OS

CM

»n

Os

m

cn

TT

00

cm

(d

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

»—1

(d

CM

cď

CM

(d

CM

9

cn

r-

r*

CM

9

r-

Tf

00

«η

CM

9

9

Os

9

9

so

SO

cn

c**>

*-

O^

cn

cn

SO

Γ*·

CM

CM

ch

SO

TT

SO

00

00

oo

cm

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM*

CM*

CM*

CM

CM

fd

cd

CM

CM

00

OS

Os

00

os

Os

9

r^·

Os

Os

tj-

m

tT

r-

r-

£

o

O

O

9

w—

9

9

9

9

9

9

CM

CM

9

9

so

o

o

o

9’

9’

O

9*

9

9

0

O

9

0

9

0

O

0

0

9

m

o

Γ*Ί

CM

Os

9

9

00

9

CM

CM

vs

r-

SO

r-*

SO

cn

9

O\

o

—-

Os

r-

00

c-

c-

—<

SO

Os

rr

SO

9

CM

so

CM

m

Tj-

cd

cd

CM

CM

CM

cd

cd

cd

CM

CM

CM

cd

cd

cd

w*

J

cn

”T

m

so

r-

00

Os

9

CM

cn

v>

sO

r-

00

Os

9

VI

cn

cn

cn

cn

cn

cn

rt

TT

'T

ι/Ί

Ή

0

o >Π

ω

< J

-P (1) β

Vod

GLA

DG1

σ

LO

Ή

C >

O >u fC o

λ;

o a

I ro >υ

Π3 x:

I-1 g

X)

Π3

H

00

c*

ir>

c*

en

r-

Tj-

©

en

r*

en

©

©

00

00

i?

—4

CM

CM

CM

RR

CM

»R

CM

CM

RR

CM

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

υ

O

00

SO

Os

00

©

Os

c*

SO

en

00

Tf

en

sO

F*

Os

CM

Os

r-

co co

£

en

en

CM

CM

en

00

en

en

en

en

m

en

en

Tf

V»

en

en

CM

o

Ó

ó

©

©

*cí

©

©

ó

©

©

©

©

©

O

©

©

©

CQ

SO

vn

«Ο

Ό

©

00

Os

©

Os

tj·

O

o

CM

CM

en

σι CM CO

£

o

o

©

en

CM

©

CM

CM

CM

CM

en

CM

en

CM

CM (S

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

s

m

CM

m

Ό

Os

CM

•o

en

CM

CM

Os

sr>

c*

c

£

o

O

©

©

©

©

©

**

©

©

©

©

©

©

©

©

©

st li

CM cm

©

©

ó

©

©

rn

©

O

O

O

O

©

ó

ó

©

ó

o

CM

o

CM

O\

(M

c*

Tf

ΜΊ

rr

o

en

en

r>

c*

SO

SO

en

o

£

CM

OO

CM

OO

OO

SO

CM

©

SO

Os

Os

RR

CM

CM

SO

so

_

w

*ci

en

SO

en

CM

oo

<n

x: υ

CM

Ή

í“4

Os

©

SO

00

c*

00

©

©

,

en

c*

c*

Os

Os

r-

r^·

C 0

22:1

S?

0Ό

©

0Ό

0Ό

0Ό

0Ό

00

O

©

©

0Ό

0.0

0Ό

0Ό

0Ό

0Ό

0Ό

0Ό

tm

ω

s

C

R.

CM

00

«η

©

©

©

RR

©

en

c*

^R

©

rR

o

o

©

—*

R*

·—

CM

RR

«Μ

*R

©

»-R

CM

x

CM CM

o

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

O

©

©

©

X

N

ΙΛ

x;

ž?

o

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

υ

cm

tu

X

CO Ή

Os

SO

*r>

Ό

RR

c-

t*.

c*

00

00

SO

SO

r*

o

Tt

C*

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

Os

R*

00

i—1

© CM

o'

©

©

ó

©

©

O

o

©

©

ó

©

O

©

©

©

—

©

>

c

en

Os

O

sej

©

-H

5?

o

O

©

O

©

©

©

©

©

©

©

©

CM

Os

SO

F-

en

CM

sel

cm

©

©

©

©

©

©

rý

^r

CM

RR

CM

RR

rR

CM

sO

wR

RR

S?

o

©

©

©

O

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

r

CM

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

υ

'>Ί

c X w

SPL

en

Tj-

tr>

so

c*

00

©

©

r,

CM

en

T}-

SO

c*

00

Os

©

en

en

ΠΊ

en

en

Γ*Ί

en

'’ί

tJ·

tj-

cd

£

Ή c

<d

ω

N

>M

Voda

-a

nalý

Oset

GLA

DG

Listy ošetřené GLA obsahovaly 1,56 až 2,4 hmotnostních procent GLA. Analýza mastných kyselin ukazuje, že složení lipidů v listech kontrolních a transgenních rostlin je v podstatě stejné. Listy kontrolních rostlin ošetřené DGLA obsahovaly 1,2 až 1,9 hmotnostních procent DGLA a množství ARA, které tvoří hodnotu pozadí (0,26 až 0,27 hmotnostních procent). Transgenní listy obsahovaly pouze 0,2 až 0,7 hmotnostních % DGLA, ale množství ARA se zvýšilo (0,74 až 1,1 hmotnostních procent), což ukazuje, že DGLA v těchto listech se přeměnila na ARA.

Exprese v semenech

Důvodem uvedeného experimentu je stanovení, zda konstrukce umožni pro semena ze se terminačního zavedla kodonu obsahující promotor napinu specifický expresi v semenech.

cDNA Ma29 se upravila pomocí PCR tak, upstream a downstream startovacího a klónovací místa Xhol za použití následujících primerů:

Madxho-forward:

5'-CUACUACUACUACTCGAGCAAGATGGGAACGGACCAAGG (SEQ ID NO:25) Madxho-reverzní:

5'-CAUCAUCAUCAUCTCGAGCTACTCTTCCTTGGACGGAG (SEQ ID NO: 26). Produkt PCR se sub-klónoval do pAMPl (GIBCOBRL) za použití systému ClonAmp (GOBCOBRL), přičemž vnikl pCGN5522. Sekvence Á5-desaturázy se ověřila sekvenováním obou řetězců.

V případě specifické exprese v semenech se kódující oblast Ma29 odštěpila od pCGN5522, jako fragment Xhol a začlenila do místa Sáli expresívní kazety napinu pCGN3223, za vzniku pCGN5528. Fragment restrikního enzymu Hind III pCGN5528 obsahující 5' regulační oblast napinu, kódující oblast Ma29 a 3'regulační oblast napinu se začlenila do restrikčního místa HindlII pCGN1557 za vzniku pCGN5531. Dvě kopií transkrípční jednotky napinu se začlenily jako tandem. Tato tandemová konstrukce umožňuje silnou expresi desaturáz v genetickém

I loku. PCGN5531 se začlenil do rostliny Brassica napus LP004 pomocí transformace zprostředkované mikroorganizmem Agrobacterium.

Složení mastných kyselin souboru dvaceti dozrálých semen T2 se analyzovalo pomocí GC. Tabulka č. 4 ukazuje výsledky získané v nezávislých transformovaných liniích, které se srovnávají se semeny netransformovaných rostlin LP004. Transgenní semena obsahující pCGN5531 obsahují dvě mastné kyseliny, které se nevyskytují v semenech kontrolních rostlin. Tyto kyseliny se identifikovaly na základě porovnání jejich eluce vzhledem ke kyselině olejové a linolenové jako kyselina taxoleová (5,9 až 18:2) a kyselina pinolenová (5,9, 12-18:3). Jsou to očekávané produkty působení Á5-desaturázy na kyselinu olejovou a linolenovou. V semenech transgenních rostlin se nepozorovaly jiné rozdíly ve složení mastných kyselin.

i lí~>

CN

H

C <D g

CL) co

C · -rd N¹ CU . rc >u co rO Ή <~| d) >N Ό O fO i—I

E-ι ω

24:0 %	0.42	o* 04 ©	0.30	0.26	0.31	o	0.21
		ΟΊ		04	O	o	«Ο
	o	O	O	©			©
6i	©	©	©	©			©‘
o	cn		o*	Os	o	•^r	so
A)	s©	Tf	Tt	rf			m
04	©	©'	©	©	©	©	©
CN	cn		o	•O	04	&
ťS	o	o		O	O		©
04	©	o		©	©		©
	o		00			__1
o žS	TJ-	o	**
04		**
o	Os		m		00	so	co
d žS	O	Os	o	o	OS	os	00
64	«Μ	©			©	©	©
ο*ϊ	<O)	00	o	rr	<n	Os	Os
06	SO	cn	cn	cn	ττ	cn	co
						·—
m
66
	—	m	o*	00	04	ΟΊ	wo
CN	o	m	04	cn	m	cn	Tf
	©	O	O	o	©	o	ó
Os
<o
<n e				o-	00	00	wo
*n		ΟΊ	Os	1/Ί	os	Os
OO	00*	,—1	O*	O-	00	00*	©
		04					04
CN	o	O*				ΟΊ	SO
	O	<r>	Ol	•^·	©	co
66			’Τ	*©	wS	wS
eíx
Os
vÝ
		m	00		04
		ΟΊ	·—*	SO	00	m	Ό
00	69	oí	so	cn	cn		oí
	SO	s©	so	SO	SO	SO
o	ir>	m	O*	o*	00		00
66	O	04	cn	rf	04	m	uo
	ΟΊ	oS	ΓΊ	ΟΊ	cn	cn	04
	V“>	vs		cn	o*	o*	CO
SO o''	·“<	——	·—«		F-«		i—-
o	©	©	©	©	©	©
©	SO	so	00	00	SO
O	00	04	o*	o-	Os	Os	00
	c6		co	cn	cn	rn	co
	_-
	o
	tl
	c
	o
					©	SO	00
	rř		04	so		F—	04
	O					M	μ
	O	ΠΊ	m	m	m	cn	co
	cl	ΜΊ	i/S	IO>	ά	Ά	Ό
		sn	<O	Ol	ΜΙ	v->	wo

• · • · • ·

S rostlinami se provedla northernova analýza, aby se určily ty rostliny, které exprimují Ma29. Vyvíjející se embrya se izolovala přibližně 25 dní po antezi nebo, když se indukoval promotor napinu, a ponořila se do roztoku obsahujícího GLA nebo DGLA, jak se popisuje v příkladu 7. Analýza mastných kyselin v embryích se provedla pomocí GC. Podle protokolu upraveného pro listy, který se popisuje v příkladu 7, se stanovila síla konverze DGLA na ARA. Množství ARA začleněného do triglyceridů endogenní acetyltransferázou rostliny Brassica se pak hodnotilo analýzou GC, jako v příkladu 7.

Příklad 8: Exprese Δβ-desaturázy M. alpina v rostlině Brasica napus.

cDNA Ma524 se upravila pomocí PCR tak, aby se začlenily klónovací místa za použití následujících primerů:

Ma524PCR-l (SEQ ID NO: 27)

5'-CUACUACUACUATCTAGACTCGAGACCTATGGCTGCTGCTCCAGTGTG

Ma524PCR-2 (SEQ ID NO: 28)

5'-CAUCAUCAUCAUAGGCCTCGAGTTACTGCGCCTTACCCAT .

Tyto primery umožňují amplifikaci celé kódující oblasti a přidaných restrikčních míst Xbal a Xhol 5'-konce a Xhol a Stul restrikčních míst 3'-konce. Produkty PCR se subklónovaly do pAMPl (GIBCOBRL) za použití systému ClonAmp (GIBCOBRL) za vzniku pCGN5535 a sekvence Δβ-desaturázy se ověřila sekvenováním obou jejích řetězců.

V případě exprese, která specificky probíhá v semenech, se kódující oblast Ma524 odštěpila od pCGN5535 jako fragment restrikčního enzymu Xhol a začlenila se do restrikčího místa Sáli expresívní kazety napinu pCGN3223 za vzniku pCGN5536. Fragment pCGN5536 restrikčního enzymu Notl obsahující 5'regulační oblast napinu, kódující oblast Ma524 a 3'regulační oblast napinu se začlenila do restrikčního místa Notl pCGN1557 za vzniku pCGN5538. PCGN5538 , se zavedl do rostliny Brassica « * • ·

Δβ-desaturáza stearidonovou napus kultivaru LP004 pomocí transformace zprostředkované mikroorganizmem Agrobacterium.

Z 6 nezávislých transformantů rostoucích ve skleníku se sesbírala dozrálá semena T2. Složení mastných kyselin jednotlivých semen se analyzovalo plynovou chromotaografií (GC) . Tabulka č. 5 uvádí výsledky semen kontrolního kultivaru LP004 a šestí linií 5538. Všechny linie 5538 mimo #8 produkovaly semena obsahující GLA. Přítomnost GLA vyloučené v semenech se očekávala v inbredních semenech T2. Mimo GLA, M. alpina je schopna produkovat kyselinu (18:4) a jiné mastné kyseliny, které pravděpodobně jsou 6,9-18:2.

Shora uvedené výsledky ukazují, že v heterogenním systému se mohou exprimovat desaturázy, které jsou specifické ke třem odlišným substrátům a používají se při produkci nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem. Jako příklad se uvádí produkce ARA (20:4) z prekurzoru 20:3 (DGLA), produkce GLA (18:3) ze substrátu 18:2 a konverze substrátu 18:1 na 18:2, který je prekurzorem GLA.

i d·

CM

O xf

CM

CM

CM χΓ

CM

ΙΩ fO

Ti

O

Ή

CO to

T3

L cq

C •rd 1—| P co o D

ZZ

O

Ή c

C

Φ

ÍT co

C rc

H +J

N c

Φ e

φ co c

-H <—I CD CO 5% λ;

c υ

'Ll c

LO +J

CO • fO >U g <C (C λ; n i—I 'Li

Ή

Ό fC fC C

Η <

O

ČM

CM

O

CM xf

CO ód co σ» co ód

CM <30

CM ód

CD ód o

ód co o

ÓD

0.

ω

b-

CM

CN

Xf

CD

P

co

CO

xf

co

O

CM

00

CN

CO

(D

CN

o

o

CM

CM

CM

CN

CN

CM

T—

CM

Τ-

O

cd

cd

cd

Ó

Ó

Ó

cd

d

ó

Ó

cd

Ο

00

ID

σ>

xf

T—

t—

σ>

00

CO

co

03

CO

to

CO

5

P

in

O

co

cd

ID

ID

Ν’

ID

CO

co

CO

co

ó

co

co

CO

o

o

O

cd

O

d

Ó

cd

d

o

o

o

d

CN

CM

CN

CM

CM

CM

CO

co

co

CM

CM

CM

CN

CN

CM

o

O

o

o

O

o

o

o

O

o

o

o

o

o

o

o

d

cd

ó

cd

cd

cd

o

o

cd

o

o

d

ó

ó

o

d

CD

p

co

P

03

co

Ν’

T“

03

co

co

co

r-

σ>

P

CD

o

ID

o

co

(O

b-

CD

xf

XT

Xf

ID

Ν’

Ν’

Xf

d

cd

cd

cd

d

Ó

cd

cd

o

o

ó

Ó

d

d

n·

CO

oo

P

CM

CN

to

co

03

ID

00

Ν’

0)

oo

CM

co

xf

CN

cp

co

co

CO

N;

co

y—

T~

o

O

xg

τ-

x-

v-

X“

x~

Τ-

γ-

x-

y—

y—

y—

*-

x-

Ο

o

o

o

o

Ο

Ο

o

o

co

o

CD

CO

co

o

CO

CO

CO

Ν’

co

cd

O

O

O

o

xf

b-

ID

CM

CN

ID

χΤ

Τ-

03

CN

to

m

CM

p

cp

xf

iq

p

N;

o

Ο

Xf

p

o

T“

y—

X-

y—

y—

v-

*“

y—

T“

Τ-

T-“

o

▼—

O

Τ-

o

o

Τ-

O

o

<30

xf

Ο

b-

Ν’

Ν’

co

Ο

o

Ο

o

xf

o

σ>

5—

b-

co

cd

d

o

o

P

P

cd

ó

r<

cd

5“

b^

CD

00

CD

ID

CM

CO

b-

CD

co

co

co

p

ΙΩ

Ν’

CM

o>

co

CN

00

Xf

03

CN

p

xf

CD

CM

co

σ>

00

v-

03

cd

xf

P

Xf

ID

td

CO

P

ó

d

T-

00

T-

V“

χ-

Τ-

χ~

Τ-

Τ-

X“

T—

X“

CM

V“

x“

o

o

O

Ο

o

Ο

Ο

O

o

P

CD

O

b*

00

P

cp

cp

p

CD

N;

CM

y—

y—

cd

T—

x-

σ>

Ol

ID

ID

P

co

CO

co

CM

Xf

CO

N*

in

Xf—

<30

Ν’

ID

CN

CM

03

XT

o

p

o

y—

oo

co

CD

ID

P

CN

cd

Ó

cd

CM

y—

CN

CN

cd

CO

od

ID

s

cd

ID

b-

P

P

P

P

r-

b.

P

CD

CD

CD

CD

CD

CD

oo

03

co

P

co

b-

P

00

CD

xf

O>

oo

Ν’

Xf

b-

o

ID

CM

XT

CM

Ν’

b-

ID

XT

xf

CM

00

m

Ν’

CM

cd

cd

cd

cd

cd

co

cd

cd

cd

cd

cd

cd

cd

cd

cd

co

O)

CM

co

oo

co

b-

CD

CM

CM

xf

co

CN

b-

CM

CN

x-

cd

T“

X-

τ-

cd

CM

CM

o

o

CN

CM

O

o

o

cd

ó

d

Ó

ο

d

d

d

d

co

CN

CM

CM

CM

xf

co

Ν’

Ν’

P

co

o

νη

CM

o

CM

Ν'

O

o

CD

cp

P

00

p

p

co

Ν’

xf

Ν’

xf

xf

xf

xf

xf

xf

xf

N

N2

•N

xf

τ- ι

CM

CO 1

Ύ

ID 1

co 1

b- 1

σ> 1

o T—

y_

CM

co

to 1

«?

P

Ί .......tXf ¹ o

o

o.

co <o

ID 'ί

CM

Μ^-

CM

CM

CM

C\]

X β

β υ

Ή

C0

C0 β

β

CQ β

•Η

I—I 4-1 ω Ο β χ

υ

Ή β

β φ

σ>

Μ β

ω β

χ

Ν β

ω ε

φ ω

β •Η ι—1 φ

Μ

Υ

X

X υ

'5*1 β

X X ω • β >υ ε β β

X Ν ι—I β χ

X β β β

Η <

Ο

CM

CM

Ο

CM

Tf cq co π

cn co čo

CM όο

CM óo

Ol co' o

čó

CD o

<b

0.

ω

tn

τ—

co

N“

tn

CD

CN

b-

Ν-

CD

CO

D>

τ-

τ-

o

τ-

τ-

τ-

τ-

τ-

Τ-

τ-

τ-

τ-

Ο)

Ο

o

Ο

Ο

o

Ο

o

Ο

Ο

Ó

Ο

Ο

Ο

Ο

σ>

CO

CM

tn

CD

Ν’

h-

r-

co

r-

CD

CM

τΤ

co

CO

co

O

CM

co

co

O

CO

co

co

CN

CO

CO

CO

co

ó

o

O

o

ó

O

ó

d

o

O

O

ó

d

CN

CM

CM

CN

CM

CN

CN

CN

CM

CO

CM

CM

CN

O

O

O

o

O

O

O

o

o

o

O

O

o

o

O

Ó

O

Ó

o

Ó

O

O

ó

d

ó

Ó

d

o

d

Ó

00

CM

m

O)

tn

N-

00

c-

b*

OO

tn

CD

tn

00

*<r

tn

tn

o

Tf

’Ν'

Ν'

Ί-

C0

Μ-

Ν'

M-

ó

o

o

Ó

o

O

ó

Ο

O

ó

O

Ó

d

ó

Tř

oo

CM

CM

CN

tn

CD

CO

00

CO

OO

cn

σ>

τ*

t-j

CM

t-

T-

T

o

τ—

T-

τ—

o

o

Ol

σ>

τ-

Τ-

T“

τ-

τ-

τ-

τ—

d

ó

Ο

o

Ο

00

O

O

CO

Ο

Ο

Ν’

tn

τ-

o

CN

CO

-Ν’

CN

CM

CN

Ο

O

O

O

O

d

O

o

tn

n-

N-

CO

cn

co

O)

Ol

CO

τ—

CD

τ-

cq

cg

a>

co

O

Ol

co

O)

co

cn

O>

τ—

XJ-

d

ó

o

d

Ó

o

xr

o

r-

Tf

o

tn

tn

σ>

co

r^·

o

tn

CM

r-

oo

o

o

co

o>

σ>

o

o

l<

r<

i<

o

co

D>

CD

co

T-

Γ'-

σ>

T“

co

ΤΠ*

CN

CM

tn

CN

σ>

CO

N-

h*

Ν-

00

σ>

CO

tn

O>

σ>

co

Tt

T-

N-

00

cq

O

co

έο

co

o

ó

CD

σ>

σ>

V“

00

CM

CN

TJ-

00

τ-

τ-

T-

CM

o

Τ-

o

σ>

co

Ο

tn

Ο

CO

Tf

CD

O

00

Ο

CN

CD

CD

CM

σ>

r^

CD

00

co

CM

τ-

τ—

T-

τ—

ó

d

O

ci

r-

CD

00

ΟΝ

CM

τ—

CN

σ>

N-

00

co

CM

tn

τ—

00

r-

CD

CD

tn

Tt

cg

O)

τ-

O

5

co

Tf

h*

V

D)

ó

oi

O

f<

l<

r<

bl

l<

fL

tn

CM

h-

co

N-

CD

CD

h-

<0

CD

co

CD

CD

CD

CO

tn

tn

CO

M-

CN

<n

tn

oo

CO

oo

co

co

tn

tn

CM

tg

'Ν’

co

CM

σ>

CD

T-J

cg

co

co

co

co

CO

co

co

co

CO

CN

CO

co

co

CN

co

O)

τ-

τ—

τ-

tn

τ—

σ>

CN

tT

h-

Tf

CN

CM

Τ-

ΟΝ

CM

CN

ΟΝ

CN

CM

τ-

CN

CM

CN

CM

co

O

o

Ο

O

d

Ó

O

o

O

Ο

ci

d

O

O

ó

σ>

co

CD

CM

T-

N-

CO

CD

tn

00

tn

h-

tn

CD

tn

r*

N-

CN

co

p

cq

ιη

CD

CD

p

cq

co

O”

Tf

+

ΤΓ

NT

Tf

’Ν'

-Ν’

Tf

M·'

tn

00 1

Ol 1

o tj-

τ—

CM 1

CO 1

Ύ

tn »

<?

r- I

00

Ol 1

o τ-

T—

CN 1

CO

ι

Ύ

00

00

co

co

tn

tn

tn

tn

Μ^- ó

O)

CM

O

CM

O tn •Mo

CM co i

4.61 0.22 3.07 63.62 0.3 16.46 7.67 • · ·

I 'Ν’

CN

M*

CM

CM

CM

Tabulka č. 5:

Analýza mastných kyselin semen z transgenních rostlin Br_assí_{ca Ma}524

CM

CM

O

CM

5;

<30 co óo co co

CO

CM

CM čo

CO

O co o

cd

OL ω

4fc θ'* o*»

IO

b-

θ’

CO

03

cn

b-

b-

cn

co

xr

CO

co

M-

b-

Τ-

τ—

τ*

CM

τ-

T—

T-

τ-

τ-

τ-

τ-

τ-

τ-

T—

Ο

ό

ο

ό

O

Ο

d

d

Ο

Ο

Ο

Ο

Ο

Ο

d

CM

b-

χΤ

1O

b-

b-

σ>

CO

co

CM

CO

CO

o

tn

co

•χτ

co

ό

CO

CO

CM

CM

o

CM

CO

co

co

CM

CM

o

ο

ό

O

o

d

o

O

d

o

d

d

o

co

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CN

CM

CM

CM

o

Ο

ο

Ο

O

O

O

o

O

O

o

O

o

o

o

O

Ó

ό

ό

Ó

d

O

d

d

O

d

O

d

o

o

V“

CO

CM

CO

IO

CM

O)

cn

co

00

tn

’Ν'

cn

tr

tn

Xt

Ó

Τ

ΙΟ

1O

IO

CO

xT

xt

O

xT

V

Μ-

M

v

O

d

Ο

O

O

O

O

d

O

d

Ó

O

o

o

b-

Χί

00

CO

T“

co

cn

XT

tn

T“

b-

v

co

o

o

T”

Ο

CM

vL

v—

O

CM

X“

CM

o

V“

T-

τ-

o

Τ-

Τ”

τ-

Ύ—

v—

*-

τ—

τ—

τ-

τ-

τ-

τ-

Ο

τ—

CM

CO

cn

o

CO

CO

Ο

co

Ο

o

Ο

χτ

CM

Ο

to

CM

d

CM

xr

CM

O

Ο

Ο

ο

ó

O

O

O

O

o

o

co

b-

03

co

xr

CM

•M

v—

τ-

cn

CN

CM

cn

CM

xr

ο

cn

ΙΟ

co

co

IO

O

co

Ο

o

T“

CM

o

cq

τ-

ο

ο

c\i

T—

V

d

T~

Ο

<η

CO

V“

r*-

xr

O

CO

CO

b-

τ-

CO

cn

o

co

<ο

<ο

Ο

co

o

co

00

tn

Ο

τ—

τ—

cn

b-

τ-

b-’

ό

td

cri

00

d

CO

CN

CM

d

o

Τ-

T—

τ—

co

Ο

CO

χτ

03

co

tn

b-

CM

tn

XT

5f—

cn

M-

τ-

co

CM

ο

ο

N-

co

τ—

tri

<n

CM

to

CM

Ο

CM

Ó

co

co

<d

xr

xr

T—

cri

CM

cd

τ-

cri

d

CM

τ—

CM

CM

*“

*“

O

ιη

ΙΟ

co

xr

co

b-

00

00

cn

tn

Ο

o

v—

CO

ο

CM

00

to

O

00

co

CM

to

o

O

co

o

CM

o

T“

d

d

d

d

CM

d

o

d

CM

o

b-

cn

co

cq

CO

CM

v—

b-

tn

cn

to

o

cn

co

cn

CM

b-

xr

xT

CM

xř

b-

co

co

co

CN

M-

tn

co

tri

CO

CO

IO

co

CO

(O

CM

xf

03

o

R

co

co

(Ο

to

CO

co

co

co

CO

b-

co

co

co

ΙΟ

ΙΟ

CO

xT

CM

CO

tn

CD

T~

•>í

CO

b-

Μ-

b-

cn

00

00

o

03

co

b-

co

o

CO

CO

cd

o-

T—

CM

CO

CM

cd

<\i

to

CM

CO

co’

CO

co

CO

co

cn

cn

00

co

CO

xr

CM

tn

co

CM

co

Τ'-

T-

τ—

CM

Τ-

CM

Τ-

CM

CM

CM

d

τ-

CM

CM

CM

CN

CM

CM

CM

Ο

ο

Ο

o

Ó

O

Ο

d

d

O

ó

O

d

d

cn

CM

CO

to

CO

co

co

tn

b-

O)

CO

03

tn

cn

CM

co

CM

CO

00

xr

co

tn

Tj-

b-

tn

cq

Xf

co

tn

ο-

tri

xr

xr

id

xf

xf

xf

xf

xf

xr

xt

xl-

Ύ

ΙΟ 1

«?

r*- 1

co 1

cn

o 1

τ- ι

CM 1

co t

Ύ

to 1

9

r- 1

CO 1

t

J co

4.68 0.2 3.05 64.03 1.93 11.03 11.41 1.02 0.01 1.15 0.39 0.02 0.21 0.15 • «

ΓΌ

LO

Μ^-

CM

O

CM

ČM

CM

	O
CM	<\i CM
LO
KS
s
	O
<O	CM
υ
Ή
CQ
co	ÓÓ
L
cq	co
	ód
C	T“
Ή
rH
+J	ro
cn O	O) co
ti	ód T“
X	CM
U	ód
Ή	r
c
c
<D	CM
σ>	ód
ω	r—
c	05
σ	cd
L
4->	▼—
	ód
IM
c
ω	o
e	ód
(V
w
£	<-
-H	cd
l-1
<D
co	p
44	cd ▼—

to

ř*·

o>

co

t—

σ>

05

CO

to

co

co

co

00

τ-

t—

τ-

T“

CM

CM

τ-

T—

CM

co

τ-

o

Ο

c>

Ο

o

Ó

cd

Ο

b

b

b

b

Ο

b

b

CO

00

CM

tn

to

co

CO

T—

Oi

CO

T—

CM

co

M

M

O

rf

M

•M-

to

05

Xf

to

to

CM

Ó

ó

ó

ó

b

cd

O

O

O

b

o

b

b

o

CM

CM

CM

CM

co

τ-

CM

CM

to

t'-

CM

CM

CM

CM

O

o

O

O

o

Ο

O

O

o

o

o

o

o

o

cd

ó

Ó

Ó

b

cd

O

O

b

o

b

b

o

b

co

CM

CO

tf)

in

T-

to

lO

m

CM

to

co

rf

rf

m

w

co

tn

to

M

to

CM

to

M-

cd

cd

b

o

b

cd

o

O

o

r—

b

b

b

o

05

lO

to

N-

to

O)

co

T-

to

T

CM

CM

σ>

O)

o

p

o

t—

O

05

M;

05

T-.

cd

ó

τ-

τ-

τ-

o

τ-

b

τ-

τ-

τ-

tO

o

o

o

Ο

o

Ο

Ο

o

Ο

o

Ο

Ο

Ο

CM

cd

h-

Tf

r-

co

to

N-

co

co

CM

CM

CM

co

CM

O

p

M;

co

o

o

o

co

co

co

τ-

τ-

t—

CM

τ-

b

b

b

τ-

T-

T~

co

Ο

Ο

O

o

Ο

CM

o

o

Ο

τ-

co

O

O

o

Ο

o

l<

Ó

b

b

b

b

CM

CO

r--

to

1O

*f

co

m

co

T™

to

τ—

o

b-

CO

co

σ>

co

M;

rf

co

to

co

o

05

to

p

CM

CM

cd

có

CM

M

cd

b

CŇ

b

b

00

b

τ—

b

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

to

CM

CM

τ-

CM

CM

O

o

O

o

O

o

O

o

o

o

Ο

o

o

p

r-

rr

C9

CO

CO

00

p

CO

CO

CM

CM

00

CO

CM

p

p

00

•M*

cd

N-

σ>

rf

O

rj·

r<

rf

CM

cd

cd

CM

b

co

lO

T—

!<

od

cd

í<

co

co

CO

co

co

CO

to

to

to

CO

co

CO

T“

rf

T-

rf

00

05

lO

00

σ>

ř*

p

oo

cd

T—

1^.

p

cd

σ>

O)

to

V“

cd

CD

cd

o

rf

cd

cd

rf

cd

CO

cd

cd

cd

cd

cd

CM

co

co

lO

to

co

CM

00

co

rf

05

τ’-

cd

CM

CM

CM

co

cd

CM

CM

co

co

cd

r“

CM

cm

ó

cd

cd

o

O

cd

cd

cd

O

cd

o

b-

lO

τ-

co

V-

00

CM

rr

io

co

CM

rf

h-

co

p

05

Ο)

h-

p

p

p

p

co

to

to

rf

p

p

rf

rf

rf

rf

M·

rf

td

od

lO

rf

''f

o

CM

CO

m

00

σ>

O

CM

CO

τ-

T-

1

1

1

1

1

1

1

t

t—

O

1

1

ι

00

1

T“

CO to (O

IO

CO co lO in

CM h~ O T

O

CO

CO

O θ’ to o

CM CM O O O O to m O o o

CO ΙΟ «-:

4.69 0.19 3.22 64.62 0 23.16 0 1.35

4.58 0.2 3.4 68.75 0 20.17 0.01 0.02

LD c

lO	44 ω
•	σ
>u	£	—I
re		D- ω
44	N
1—1	'>1
£	l—1
	£
£	C
Η

• · • · ·

CM

CM

CM

CM

Analýza mastných kyselin semen z transgenních rostlin Brassica Ma524

CM

CM

O

CM ’Μ’

CO

CO ód w

σ>

cq ód

CM co

CM ód o>

co“ o

ód co o

co

Q_ w

o	CO o	CO τ- Ο
σ»	CO	m
τ-	CO	o
Ο	O	ó
CM	CM	CM
O	O	o
O	O	ó
	CO	to
in		5T
ó	O	O
ττ	CM	co
CM	v	t^
*“	V
r·»	O	o
o o τ—	to	co
CM	CO	T-
	Τ-
to	Ο	τ-
b-		Ο
c\i		ó
τ-	to	to
Ο	to	CO
θ’	r-	CT)
T—	CM	τ-
m	O	Ο
o ó m	σ>	b-
in		to
co	co	00
b-	co	to
o	00	Ό-
	CM	co
	cd	CM
CM	CM	O
o	O
m	00	CM
in	iq	IO
o·	M-	V
co	O)	O

I I

I • · • « • · • *

Příklad 9: Exprese A12-desaturázy M. alpina v rostlině

Brassica napus cDNA Ma648 se upravila pomocí PCR tak, aby se začlenily klónovací místa za použití následujících primerů:

Ma648PCR (SEQ ID NO: 29)

5'-CUACUACUACUAGGATCCATGGCACCTCCCAACACT

Ma648PCR-rev (SEQ ID NO: 30)

5'-CAUCAUCAUCAUGGTACCTCGAGTTACTTCTTGAAAAAGAC

Tyto primery umožňují amplifikací celé kódující oblasti a přidaných restrikčních míst BamHÍ 5'-konce a KpnI a Xhol restrikčních míst 3'-konce. Produkt PCR se sub-klónoval do pAMPl (GIBCOBRL) za použití systému ClonAmp (GIBCOBRL), přičemž vznikl pCGN5540. Sekvence A12-desaturázy se ověřila sekvenováním obou jejích řetězců.

V případě exprese, která specificky probíhá v semenech, se kódující oblast Ma648 odštěpila od pCGN5540, jako fragment restrikčních enzymů BamHÍ/Xhol a začlenila se mezi restrikční místa BglII a Xhol expresívní kazety napinu pCGN3223 za vzniku pCGN5542. Fragment pCGN5541 restrikčního enzymu Asp718 obsahující 5'regulační oblast napinu, kódující oblast Ma648 a 3'regulační oblast napinu se začlenila do restrikčního místa Asp718 pCGN5138 za vzniku pCGN5542. pCGN5542 se zavedl do dvou kultivarů rostliny Brassica napus pomocí transformace zprostředkované mikroorganizmem Agrobacterium. Použily se běžně dostupný kultivar kanoly SP30021 a malé množství kyseliny linolenové.

Z 19 nezávislých LP30108 z netransformovaných kontrol sesbírala dozrálá semena T2 rostoucích

Předpokládá

LP30108 obsahující transformantů a ve skleníku se se, že v těchto semenech se vylučuje transgen Á12-desaturázy. Složení mastných kyselin skupiny dvaceti semen se analyzovalo plynovou chromatografií. Tabulka č. 6 uvádí výsledky. Všechny transformované linie obsahovaly zvýšené množství produktu Δ12desaturázy 18:2. V těchto rostlinách se zjistilo nepodstatné • » · · » · · 4 » · ♦ « • * · 1 » · · <

zvýšení množství 18:3. Rostliny #11 a 16 vykazují v sebraných semenech nejvyšší akumulaci 18:2. Za účelem zkoumání vylučování množství 18:2 v semenech T2 a za účelem identifikace jednotlivých rostlin, které se vybraly pro vytvoření další generace, se provedla analýza poloviny semen. Semena se nechala klíčit přes noc, ve tmě, při teplotě 30 °C na filtračním papíře nasáklém vodou. Vnější děložní lístky se použily pro analýzu plynovou chromatografií a zbytek rostliny se kultivoval v půdě. Výsledky některých těchto analýz se uvádějí v tabulce č. 7. Jednotlivá semena T2 obsahující Δ12desaturázu M. alpina akumulovala až 60

18:2

Vzorek

97xxlll6#59 je příkladem rostliny s nulovým vylučováním. Dokonce i u rostlin, které akumulují nejvyšší množství 18:2, se množství 18:3 zvýšilo velmi málo. Tyto a jiné vybrané rostliny T2 se nechaly růst ve skleníku a na poli, aby se vytvořily semena T3.

Z dvaceti nezávislých transformantů SP30021 a netransformovaných kontrolních rostlin rostoucích ve skleníku se sebrala zralá inbrední semena T2. Očekávalo se, že v těchto semenech se vylučuje transgen A12-desaturázy. Složení mastných kyselin skupiny dvaceti semen se analyzovalo plynovou chromatografií. Data jsou uvedena v tabulce č. 8. Všechny transformované linie obsahovaly zvýšené množství produktu Δ12desaturázy 18:2. Stejně jako v linii LP30108 s nízkým obsahem kyseliny linolenové, množství 18:3 se podstatně nezvýšilo. Semena #4 a 12 vykazují ve shromážděných semenech nejvyšší akumulaci 18:2. Za účelem zkoumání vylučování množství 18:2 v semenech T2 a za účelem identifikace jednotlivých rostlin, které se vybraly pro vytvoření další generace, se provedla analýza poloviny semen. Semena se nechala klíčit přes noc, ve tmě, při teplotě 30 °C na filtračním papíře nasáklém vodou. Vnější děložní lístky se použily pro analýzu GC a zbytek rostliny se kultivoval v půdě. Výsledky některých těchto

I analýz se uvádějí v tabulce č. 9. Vzorky 97xxll57 #88 a #18 jsou vzorky s nulovým vylučováním v případě 5542-SP30021-4 respektive 5542-SP30021-12. Tyto a jiné individuálně vybrané rostliny T2 se kultivovaly ve skleníku a na poli, přičemž vznikly semena T3.

I

CM

CM

Tj-	co	o>	CM	CO	00		m
	co	xf	CO	co	m	ó	CM
O	o	o	O	o	o		o

CM ·<CO CO O Ó

CM

O v- cm m b- to b- to ř o 6 ó co co co

Tabulka

CM

Ó

CM o

o

CM co oo

CM co o

co co

V o

co co χ- ro O ™ o o

CM

Ó co

O

CO

CM

Tf bó ó

v—	o>	os	CO	CO	CM	x—	O)
h-	O)	r~		tn	ó	r-	CM
ó	ó	ó	ó	ó		ó	o

	to	tn	tn	CM	CO	T—	O)
co	h*	co	co	co	t—	b-	co
o	O	o	o	o		ó	ó

co	co	00	tn	CM		CO
co	h-	tn	in	b-	ó
o	o	o	o	ó		Ó

co	tn	co	co	05
c~		co	xf	CM
xf	co		CM
co	co	CO	en	os
to	T“	T-	co	00
co*	Iří	co	CM	X“
co	Φ	Φ	co	CO

σ> X— bco co co ó ó ó χ- r- rσ> o °° o o co co ó

m o>

o co 't r~ co cm co

IO Ifi 10 ^2 CO ó o ó 6 o

co	CM	co	co	to
co	CO	to	cm'	05
	CM	CM		CM
co	CO	S	cn	CO
co	O)	CJ5	05
T“	β	o*	co	CO
co	co	co	co	CO

't ó

»O ó

xf	CM	co	oo	xf	co
b-	O	cq	co	CM	CM
CM	xf	xf	co	co	co
		co			CM
X“	os	co	IO	cn	o
CM	o	ó	ó	05	a
CO	co	co	co	IO	IO

o 00

O CM CM

05 co CM

co CM

co co co CM

V X“ CM

tn o b-' CM

in co σ> CM

05 CM CO CM

05 tn co CM

M* σ> LO CM

’Μ’ CM

o> co

co b- CO CM

b- tn 00 CM

τ— co có CM

CM

tn

tn

co

CO

co

o·

co

Xf

▼“

τΤ

co

co

CM

v-

t—

o

r~

cq

CO

o

xf

o

in

O

co

CO

05

X

CM

CM

x-

T—

T-

CM

CM

CM

co

CM

ό

v-

CO	o>	CM	O>
	CM	O	X“	CM
ó	ó		o	O
	r-	05	l·-
O	▼“	05	xf	to
h-‘	tri	xf	xf

5~	r-	o>		oo
CO	V”	τ-		x—
o	Ó	Ο	ó	ó
tn	CO	CM		00
o				co
co	tri

CM	IO	Xf	co	CM	CO
O	CO	6		CM	CM
	O		ó	Ó	O
to	cn	b-	co	CD	r^.
T—	CM	05	05	CM	T—
	co	CO	CÓ

CO T“

CO r·

co

co

co

co

CO

co

T— t—

X“

x—

T—

Q

OO

00

co

co

co

oo

00

co

00

oó

oo

00

00

00

có

00

1—1

O

O

o

o

o

o

o

o

o

O

o

o

o

o

o

o

v*

Τ-

Τ-

X“

v-

x—

o

O

o

o

o

o

o

o

o

Ο

o

Ο

o

O

o

O

C

co

co

co

co

co

co

co

co

co

CO

co

CO

co

co

CO

CO

ω

0.

a.

Q_

0.

0.

0.

0.

0.

0.

0.

Ol

0.

Q.

0.

CL

0.

s

_1

-J

_l

—1

—1

_1

-J

-J

—1

_l

-J

_1

□

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

1 CM

*M·

•M“

-Μ-

M*

M*

Μ-

M*

M*

Μ

M

M*

*M·

to

to

to

to

IO

to

to

to

to

to

IO

to

to

to

LO

to

IO

to

to

to

to

IO

to

to

to

to

to

to

to

IO

to

to

Al

to

CM

O

00

CM

00

co

Μ-

r-

00

CO

v

o

CM

IO

CM

CU

CM

CM

to

00

CO

co

oo

CO

CO

T“

CO

to

co >o

00 05 o ><

00 05 O X

co 05 o X

00 05 o X

00 05 o x— X

00 05 o χ— X

00 05 O χ— X

00 05 o X

(0 X- ><

«5 x— T— χ

CO V v- χ

CO T~ χ— X

(O χ

<0 χ

CO x~ X

<0 T“ χ

X b-

X b-

X b-

X b-

X b-

X b-

X b-

X b-

X b-

X b-

X b-

X b-

X b-

X b-

X r~-

X

05

05

05

05

05

05

05

05

05

05

05

05

05

05

05

σ>

ΟΊ kO tO >υ

Tabulka

CN

Ο

CN

O

CN

O

O

CN

CO eo

CM »

<30

T~

O <30 <b

T~

O <£>

Q š

OT

Q.

W

Q

UJ _i

O >

O

T—		to	T“	<n
f-	Ν’	c~		co
Ó	o	o		o
<O	to	oo		O)
<O	CN	co	CO	Ν’
O	o	o	co	O
	eo	to	co	NT
OJ	eo	00	00	IO
ó	Ó	ó	o	X“
co	co	co	Ν’	CN
T	to	to	σ»	<o
Ó	ó	ó	o	ó
to	io	co	uo	co
O)	co	CN	eo	CN
CO	CN	co	N	CN
CM	r>-	co	co	co
σ>	u>	eo	T	o
to	eo	IO	00	co
	to		IA	CN
Ν'	oo	l''-		to
CO	T~	c-	σ>	IO
oó	ó	co	rJ	co
CN	co	CN
03	CN		r~	cp
O	o>	CO	co	T~
Ύ—	T“	T-	CN
co	CO	CO	r-	CN
ó	Τ-	CN	co	d
	Ο	O	o
co	co	CN	CN	CD
CN	v—	Ν’	co	<o
N·	O	N-	rJ	co

V	T—	r-	T—	Τ'-
v-	T-	T“	T“	T-
CO	co	có	00	CO
O	o	o	O	O
V“				τ-
O	O	o	O	Ο
CO	CO	co	co	co
CL	O.	Q_	Q.	Q_
_J	—1	_J	-1	_l
CM	CM	CM	CM	CM
s	’Μ’ m	5	m	m
uo	uo	<o	m	uo
co		o		cn
00	co	co	O)	uo

CO CO CD CO co δ δ i δ s

0> 0) O) O) O)

CM

CM

CM

O

CM

O

CM

O

Ó

CM

CO

CO σ' o

r~

CM ód co o

Ó3

O co

t'- co o	’Μ’ ó	CO co o	M V ó
x—	T“	co	C·.
O	O		o o
		o
w	CD		co
x—	V“	05	x—
x—	v	o
CM	00	m
r-	CO	r--.
o	ó	ci	o
05	CM	m	b-
h-	V“	CM	oo
X-	<\i	CM	X“
	CO	co	05
«5	CM	o	«5
cd	cd	od	CM
co	co		CM
co		co	U5
CD	in	r-	Τ-
ó	CM	05	Ο
IC5	m	co	CO
CO	T-	00	IÍ5
CM	00	r--	O
CM		CM	CM
M	00	«5	CM
Τ-	τ-	X“	CM
Ο	Ο	ó	O
CM	CO	r-	χ—
M·’	cp	r-	co
	Μ2	m·	+

Tabulka

oo t oo o x— o co CL _J	O> τ- ι co o X“ O CO CL —1	O CM 1 CO O x— O co Q. _l	2 c o ,M co o Τ-
CM	CM	CM	Ο
5	s	s	CO 0.
m	1X5	in	-J

• ·

CM

CM

b-

CO

o

IA

00

M;

co

m

(D

CM

NT

b-

CD

CO

CO

CO

cd

<o

<o

M

o

co

co

co

m-

« o

co

co

CO

O

O

o

ó

ó

ó

ó

ó

o

o

o

o

o

o

t—I rTabulka

CM

O

CM

O

CM

O

O

CM

CO

CM óó o

co o

<b

O)

M-

T~

r—

co

x—

CO

CM

CD

M

O

M-

m

CM

o

▼·

Ó

τ-

τ-

τ-

τ-

τ-

τ-

O

τ-

•r·

Ó

ó

o

Ο

Ó

Ο

ó

Ο

ó

Ο

Ο

Ο

Ó

Ο

Ó

CM

CO

CO

M

CN

co

σ>

T~

CM

CD

O)

CM

b-

3

M

T-

O

T“

o

T”

σ>

o

O

O>

O

t—

O

q

CO

T

v

T“

V“

ó

▼“·

V”

O

τ-

V“

Τ-

T“

ci

m

CM

CO

MT

CM

b-

CM

Tf

ο

in

Ο

03

co

co

CO

b-

CO

b-

o

00

CO

co

b-

CO

w>

b-

CO

CO

co

o

O

Ó

Ó

o

o

o

o

ó

O

o

ó

O

o

o

co

CO

b-

IA

M

b-

CM

T“

CM

T

m-

CO

M*

00

o

M*

T—

q

T“

O

co

CM

b*

CD

M*

q

M^

t—

co

CM

CM

CM

t—

CM

CN

CM

CM

v*

CN

CM

CM

CM

CM

M1

CO

V

b-

co

CN

IA

t-

b-

O>

m

CO

CO

CM

CO

IA

IO

O

ΙΛ

▼ζ

0»

CO

M

«Ο

CM

o>

co

b-

b*

IA

b-

có

O

CM

σί

CO

CO

CO

iri

b

IO

CM

M*

»A

<0

M1

5T

co

M1

M1

IO

co

M1

KA

M

CO

t—

Μ-

CO

CO

CO

q

V

CD

CM

CO

σ»

CM

M-

^r-

ia

ΙΑ

CN

O)

co

CM

<0

O

CO

lA

σ>

b-

CO

Ó

T“

00

CO

<3>

σ>

CO

b-‘

M

co

r<

CO

LA

co

CM

uo

M

M

M-

M

N

M

CO

M*

M

M

CO

CO

co

b-

M

σ>

CD

CN

00

lA

b-

00

CD

CO

Ν’

b-

O)

q

b-

o

q

5—

CO

b-

b-

b-

CO

q

cp

co

o

t—

q

CN

T—

CM

CN

t—

CM

▼—

T“

CM

CN

CM

m

b*

00

tf)

M

CO

co

co

CO

m

<n

00

LO

cb

co

00

Τ-

Τ-

ν-

V

CM

Τ-

τ-

Τ-

o

O

Ο

Ó

O

o

Ο

Ó

Ο

O

o

Ο

O

ci

Ο

Ο

cq

CO

co

co

IO

b-

co

co

M

co

co

CO

IO

co

00

Μ

M*

q

q

co

X

q

M;

q

q

M;

q

M;

M;

M

O

M

M2

M*

M-

M-

Μ

M·

M·'

IO

o

CM

co

M·

lA

CO

m

T

m

b-

CO

CT>

T—

V“

*-

T—

00

CD

co

CD

oó

CO

oo

oó

oó

có

oó

00

có

oó

oó

00

o

O

O

O

O

o

o

O

O

O

O

o

o

o

O

o

Ί-

Τ-

V

Τ-

ν-

Τ-

Τ-

Τ-

Τ-

V“

Τ-

o

o

Ο

Ο

O

o

Ο

Ο

Ο

Ο

o

Ο

Ο

o

O

Ο

co

co

CD

CD

CO

CD

CO

CO

CO

CD

CD

CO

CO

co

CO

CO

CL

0.

0.

Q_

Q.

CL

0.

CL

CL

Q.

0.

Q.

CL

CL

CL

CL

—1

_J

_J

_J

_J

-J

_l

_J

-J

_)

_J

_J

_J

_J

—1

CM

CM

CN

CN

CM

CN

CM

CM

CM

CN

CN

CM

CM

CM

< CM

1 CM

IO

S

•Ν’ IO

5

M· m

Tř in

Μ ΙΩ

M· LO

5

IO

rr to

Μ* in

M* m

Μ- ΙΑ

Μ- ΙΑ

Μ- ΙΑ

m

m

W

CO

in

to

ΙΌ

m

to

to

to

in

m

IA

IA

IA

• ·

CM

CM

O ó

CM

CN

ΓCO

CO o

óo o

<o

CM

CO

co

p

to

σ>

co

to

co

o*

co

co

tO

CM

CM

X

co

X

o

co

co

co

co

co

co

co

co

co

CO

co

Ó

©

ó

d

o

o

ó

o

ó

o

o

d

Ó

o

Ο-

CO

i—

CO

00

to

to

co

co

T—

co

co

O“

Χ-

x—

X“

X“

x-

v

x—

X“

CM

x-

^r-

O

O

O

ó

O

d

d

d

d

d

d

Ó

d

d

d

xf

CO

co

co

M

θ’

σ>

O)

xr

Γ—

v

co

co

x—

CM

p

cn

CM

O

T

p

o>

o

o

o

T-

T-

x—

T—

X“

ó

x—

v

X

X-

o

x—

T“

X“

x-

X

γ-

CM

p

co

γ-

CM

cn

CM

co

CM

CM

CM

X

cn

t-

ιο

cn

o

co

ιο

CO

io

co

co

co

co

co

IO

in

O

o

o

o

o

O

ó

o

ó

o

o

ci

ó

o

co

Γ-

CO

X

x—

CO

00

00

00

CM

to

IO

co

co

cn

q

ΙΟ

O

O

XJ·

to

p

x—

O*

co

CM

co

T—

CM

00

CM

X—

O

X“

x—

x—

T—

CM

T~

v-

CM

CO

co

CM

co

o>

CM

CO

IO

7“

CM

1—

co

Γ-

00

©

o

Υ-

T-

co

«Ο

p

b-

iq

X

CM

T“

CM

σ>

cd

b-'

ΙΟ

CM

Γ-’

cd

ai

o

<o

T“

f-‘

x‘

co

co

co

co

CO

co

co

x

X

CO

CO

<o

b-

γ-

CD

co

x—

b-

σ>

σ>

cn

co

Tf

Μ-

CM

co

CM

o

γο

CM

cn

00

p

to

00

v

X“

Ο-

CO

p

O

co

M

X

co

CO

x-

CM

d

cn

co

κό

co

CM

θ’

X

θ’

co

X

θ’

o-

co

co

co

co

co

θ’

θ’

i—

X“

x—

X

CO

CM

CO

cn

σ>

cn

θ’

O)

b-

ιο

T“

p

CO

q

r-

p

p

p

p

r—

b-

o

b-

o;

p

CM

X—

T“

T“

x—

X-

x—

▼—

T-

x—

CM

x-

X“

X—

r-

co

CM

tO

Η-

ή-

co

b-

cn

co

co

co

ιο

co

co

X

x—

CM

X“

χ-

χ-

x—

X“

Τ-

τ-

τ-

x—

Τ-

d

d

O

d

ο

ο

O

d

o

Ο

ο

ó

Ο

d

Ο

b-

co

CM

b-

to

CM

co

co

co

θ’

b-

IO

b-

CM

IO

p

co

LO

p

x—

p

p

M;

q

b-

p

p

P

CO

CM

o-

Ό-

M·

Μ2

θ’

X

O*

xr

X

X2

co >υ

Tabulka

Q

HH c

(D ε

o

t—

CM

co

M*

IO

l

CM 1

CO |

Ύ

p

<?

b-

op

cn

t—

TJ-

X“

x—

x—

X“

x—

x—

T“

t—

T—

T“

x—

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

o

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

o

O

O

co

CO

CO

co

CO

CO

CO

CO

CO

co

co

CO

co

CO

CO

CL

0.

O.

0.

0.

a.

a

0.

0.

0.

CL

a

a

a

a

w

W

ω

ω

ω

ω

co

OT

w

ω

ω

ω

ω

ω

ω

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

o-

X

X

Ο-

θ’

’ί

X

X

X

X

M;

M·

’Μ'

to

IO

to

IO

ΚΟ

ιο

to

IO

IO

IO

IO

to

IO

to

to

to

IO

to

in

to

to

to

in

m

io

IO

IO

to

to

to

• · · ·

ΓΜ

CM

CM

O

CSI m

ΓO

CM

O

O

CM

CO

CM eo co o

co <6 o

<b

ΟΟ >υ

Tabulka

O

H £

(1)

00	CO		b-	CM	o>
co	CO	co	co	co	co
d	Ó	ó	ó	ó	ó
	t—·		co	co	v*
’Γ-		τ-		τ-	τ-
ó	Ó	ο	o	Ο	Ο
CM	cn	cn	^-	CM	o
Γ	CM	T-	CM	t—	xt
			T“	v	5T*
b-		CO	CO		CM
co	co	o	co	io	CO
ó	d		ó	ó	O
V“	Ό;	CM	co	co	xt
io	T	O	co	in	O
o	T—		ó	V“	CM
▼—			v	V“	*“
<M	CO	CO	b-	o>	O
CO	σ>		co	co	m
oó	CM	ÍCÍ	co	©	cm’
co		co	co	’Τ	CM
CO	lO	b*	b-	co	T“
	CO		co	cri	O
CM	ó		co	co	CO
Ό*	m		’φ		o
T~	b-	co	co	xj·	b-
o>		co		cp	xr
		yt·			T-
	σ>	b-	co	b-	▼—
	v-	V“			CM
d	o	O	d	d	d
co	co	θ’	Y“	co	co
CO	T“	CM		xt	co
TT	v				xf
CO	b-	CO	o>	o
X-	▼j·	^J·	^-	CM
	T“	v—	▼—
CM	CM	CM	CM	CM
O	O	O	o	O
O	O	O	o	O
CO	CO	CO	co	co
CL	0.	0.	0.	0.	v /<<
w	w	ω	w	ω	SX o
CM	CM	CM	CM	CM	o
Ό-					co
o	o	ιο	m	io	0.
tn	IO	»O	u>	in	ω

»··· * 9 rσ>

>ϋ

Tabulka

CM

CM

CM

O

CM

O

CM

O

O

CM

CO <30

CM «

óó o

óo co o

<b

Cl,

UJ >u

I-1 ^*Ί υ

CO

CM

co

CM

Μ-

XJ·

b-

ID

10

CM

00

to

CO

co

CM

O

ó

CM

CO

co

IO

0

co

o

Ó

o

O

d

d

d

O

d

d

d

co

co

CM

CM

CD

b-

b-

CO

co

00

co

T“

CM

CM

CM

O

CM

CO

CD

CM

<0

CM

0

ó

O

O

O

O

d

d

d

O

d

d

d

IO

03

03

03

O)

co

CM

τ-

to

00

03

CO

CD

b-

V“

co

03

p

ΟΝ

CM

p

Ó

o

O

Ó

d

d

O

co

b-

h-

eo

co

03

CM

CO

00

10

00

xj·

o

CO

’Μ’

oo

to

co

ID

10

co

co

to

Ó

Ó

Ó

d

ó

d

d

d

d

d

d

d

b-

co

r-

CD

03

co

CO

b-

CM

to

CM

00

p

co

b-;

CO

co

co

CM

CM

00

CM

0

r^-

r*

co

co

v-

03

CM

T—

CM

CM

d

d

co

T“

T-

T—

b-

eo

T

t—

Oi

CM

CM

<O

00

CM

co

σ»

00

Γ-

IO

IO

0

O

00

co

V

o

o

IO

03

o>

O>

03

CD

03

O>

00

IO

IO

IO

V

’ί

Ό

CM

cd

00

co

CO

M-

CM

co

co

CM

to

CO

CM

CM

Γ-

t^

b-

CO

CD

co

0

b-

co

p

’Μ’

cd

οο

T—

Ó

d

!<

00

03

d

03

r<

T”

co

CM

CM

CO

CO

co

CM

CM

CM

co

CM

CM

CO

10

co

co

b-

O>

CM

CO

CO

b-

CM

00

CM

co

co

M·

M-

o

CO

03

Γ-

Y—

iq

CM

T-

T“

CM

Y”

CO

CM

CM

v·

V“

CO

CD

to

03

00

IO

ID

r*·

CM

r-

IO

τ-

v

τ-

d

τ-

ó

o

Ο

O

o

d

d

Ο

d

d

d

Ο

io

ID

co

3·

10

Ό-

ID

10

ID

p

CO

b-

03

O

to

0

O

CD

b-

<0

T“

co

co

CM

Μ

co

^ř

CO

co

TT

co

Ύ

5

5

Ύ

5

Ύ

5

Ύ

T“

V

V“

T—

▼—

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

0.

CL

CL

Ol

CL

Q.

Q_

CL

CL

Q-

CL

CL

CL

ω

ω

ω

ω

co

ω

ω

ω

W

W

W

ω

W

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

Μ-

Μ-

'M-

’ϋ-

’Φ

tT

tO

to

to

to

to

IO

to

to

ID

IO

to

to

IO

to

IO

lO

to

to

tO

to

to

ID

ID

IO

to

IO

CO

O

O

CM

co

O

CD

b-

O

co

co

r^·

00

CD

to

CO

to

00

CO

CD

co

00

00

CD

CD

co

00

00

f^.

00

co

co

Γ-

Γ-

CD

Γ-

<D

ID

ID

to

IO

to

to

ID

ID

ΙΟ

ΙΟ

ID

ΙΟ

T—

t—

X-

V-

V“

y-

T-

τ—

T“

T-

T-

><

X

t— X

V“ X

X

X

T“ X

T- X

X

X

τ-· X

T- X

t— X

>< b-

X b-

X b-

X h-

8

B

X b*

X b-

X b-

X r-

X

X Γ-

X b-

03

03

03

CD

03

03

CD

03

O)

O)

CD

03

03

«φ • · « · * · •«·« «· • ·

LO cn >u

Tabulka

22:0

0.48

5 o

co CM O

5 ó

to co o

co co d

co d

b- M- d

CM o

r- o

CO CM d

o> d

co d

CM

tn

CM

M·

M-

co

b-

tn

co

co

N-

co

▼“

O

co

CM

Ó

CM

CM

CM

τ-

X—

CM

CM

CM

CM

CM

o

O

Ó

ó

Ó

ο

d

O

Ó

O

d

o

CM

m

IO

Γ-

to

CM

CD

co

CO

V

T”

00

O

co

x-;

M;

CM

CM

CO

o

CO

00

CO

T“

co

CM

v

x—

x—

v

v

O

b-

m

Μ-

b-

to

CM

co

tn

h*

CD

CM

Μ-

O

tn

co

CO

IO

o

00

m

CO

o

tn

tn

tn

b-

CM

d

o

Ó

o

Ó

d

d

ó

o

o

d

CO

CM

co

CO

O)

CD

co

Γ-

CM

CM

tn

00

tn

CM

X“

tn

t—

CO

CM

ΟΟ

CM

CM

o

tn

v

d

ai

X-

T-

CM

00

M·'

CD

T~

CM

CM

o

*”

X“

▼-

V“

Cl

<0

r»

co

V

IO

co

co

CM

co

CO

co

ώ

Τζ

CM

O)

m

O

M1

co

b;

Ift

m

co

T“

CO

CM

o

ó

IO

ai

co

od

00

cd

CM

m

U>

IO

IO

•a

M·

M1

CM

co

CO

00

co

co

X“

tn

co

CM

tn

co

co

Ό-

00

cd

n

b-

X“

CO

X“

co

CM

CM

CD

tn

M-

CD

CM

o

ai

ó

O

CM

CD

CO

CO

CM

v-’

CM

co

CM

co

CO

CO

CM

CO

CO

co

CO

CO

tn

o

3

co

M-

b*

co

CM

co

co

CO

tn

CO

00

co

in

tq

to

co

tn

CO

b-

v

*”

CM

T~

CM

c\i

T“

T“

τ-

co

co

CD

v-

a>

a>

tn

co

h-

co

co

CO

O

Ο

o

o

O

τ-

o

o

o

O

τ-

O

o

ó

O

Ο

d

d

ó

o

d

Ο

d

o

'M'

CO

IO

tn

χ_

O)

co

T“

σ>

co

co

00

CM

co

co

CO

M

CD

CM

00

O)

O

co

co

v

CM

CO

co

co

CO

CM

co

CM

CM

CO

co

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

•

v |

1

1

▼J“

x—

v—

Χγ

▼”

t—

T“

T—

Q

r—

X—

X—

xr—

h-l

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

O

o

O

O

O

O

O

o

O

O

O

o

o

O

o

O

O

O

O

O

o

O

O

O

o

o

co

co

co

co

CO

CO

CO

co

CO

CO

CO

co

co

<D

CL

CL

Q.

CL

Q_

0L

0.

CL

CL

CL

Q_

CL

CL

£

ω

ω

ω

ω

ω

ω

w

W

ω

W

CO

ω

ω

bd

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

1 CM

CM

•M*

M*

M

Μ-

M“

Μ-

M-

Μ-

xr

M-

M“

to

LO

IO

to

to

in

m

tn

tn

tn

tn

tn

tn

to

tn

IO

to

to

tn

IO

m

tn

tn

tn

tn

tn

πΊ

CD

tn

O

to

x—

CO

o

tn

N-

co

co

co

Ct-I ω

CO

to

M

CO

X“

tn

CM

tn

tn

>o

1-1

b.

b-

b.

b-

b-

b-

Γ-

r-

b-

N.

b*

►>1

IO

LO

m

to

to

tn

IO

ιο

tn

tn

tn

tn

tn

υ

v

v

5“

t—

x—

V“

χ—

V“

T

t—

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

T X

T— χ

T“ χ

Q

X b-

X b*

X r-

X b*

X b-

X r-

X b-

X b-

X h*

X

X r-

X

X b-

1—1

0>

CD

CD

CD

σ>

o>

CD

CD

σ>

O)

a>

O)

CD

·· · ·*··

9999

99

9 9 9 · « · « 9 ···'*♦ • · · 9 fi 9

9 9 * »» · ·· 9999 99 99

Příklad 10: Současná exprese Δ6- a A12-desaturáz v rostlině Brassica napus

Za účelem exprimovat Δ6- a A12-desaturázy ze stejné T-DNA se připravila konstrukce pro specifickou expresi v semenech.

Fragment restrikčního enzymu Notl pCGN5536 obsahující 5regulační oblast napinu, regulační oblast Ma524 a 3regulační oblast napinu se začlenil do restrikčního místa Notl pCGN5542 za vzniku pCGN5544. Expresívní moduly se orientovaly takovým způsobem, že směr transkripce Ma524 a Ma648 a markéru nptll je stejný.

PCGN5544 se zavedl do kultivaru rostliny Brassica napus LP30108 transformací zprostředkovanou mikroorganizmem Agrobacteríum.

Z šesnácti nezávislých transformantů LP30021 a netransformovaných kontrolních rostlin rostoucích ve skleníku se sebrala zralá inbrední semena T2. Očekávalo se, že v těchto semenech se vylučují transgeny Δ6- a A12-desaturázy. Složení mastných kyselin skupiny dvaceti semen se analyzovalo plynovou chromoatografií. Data jsou uvedena v tabulce č. 10. Všechny transformované linie (5544-LP30108-3) ve srovnání s kontrolou vykazují změnu složení oleje. Ve všech třech liniích (-3, -4, -11) vzniká GLA. Dvě linie ze tří (bez GLA) (-4, -11) vykazují zvýšené množství 18:2, což indikuje expresi A12-desaturázy. Množství GLA v rostlinách obsahujících zdvojenou konstrukci Δ6 + Δ12 (pCGN5544) bylo vyšší než množství v rosltinnách obsahujících pCGN5538 (samotné Δ6). Množství Δ^6,9 18:2 se velmi snížilo v rostlinách obsahujících Δ6 + Δ12 ve srovnání s rostlinami, které obsahují samotný Δ6. Kombinace Δ6- a Δ12desaturáz na jedné T-DNA vede k akumulaci více GLA a méně vedlejších produktů, než při expresi samotné Δβ-desaturázy. Za účelem zkoumání vylučování množství GLA v semenech T2 a za účelem identifikace jednotlivých rostlin, které se pro vytvoření další generace, se provedla analýza poloviny semen.

• ·

Semena se nechala klíčit přes noc, ve tmě, při teplotě 30 °C na filtračním papíře nasáklém vodou. Vnější děložní lístky se použily pro analýzu plynovou chromatografií a zbytek rostliny se kultivoval v půdě. Výsledky některých těchto analýz se uvádějí v tabulce č. 11. Jak se očekávalo v případě populace T2, v jednotlivých semenech se vylučuje určité množství GLA a 18:2. V jednotlivých semenech se zjistil až 60 % obsah mastných kyselin. Vybraly se jednotlivé rostliny, které se nechaly růst ve skleníku a na poli, přičemž dochází k produkci semen T3.

Dobrým zdrojem GLA zahrnující Brassica, sóju, exprimující konstrukce podle

Typické maximálně 25 obsahují až v tabulce č.

zdroje, jako % GLA. Naopak 30 % GLA.

obsahují až mohou být transgenní rostliny slunečnice, kukuřici a světlici a vynálezu.

je brutník lékařský, produkují rostliny uvedené v tabulce č. 19

Dále, jednotlivá semena uvedená 60 % GLA.

CM

CM

O

CM

O

O

CM

X—

CM

xr

CO

co

b-

xT

IO

CM

b-

CD

CO

CM

b-

xr

•v

V

ó

xT

IO

co

o

v

θ’

M-

IO

xř

O

co

O

o

Ó

O

ó

ó

o

o

o

ó

o

d

O

o

co

CO

oo

CM

M-

r-

IO

co

b-

a>

CM

co

co

χη

CD

CD

p

v-'

O

o

5>

χη

a>

o

σ>

co

O

o

CD

O

τ-

o

x—

o

T

o

o

x—

τ—

ci

oo

CM

co

CM

00

ν-

co

co

xT

CO

b-

co

b-

00

CO

CD

CD

b-

b-

CD

h-

α

co

ó

CD

co

b-

b-

co

CD

b-

co

Ó

Ó

Ó

Ó

Ó

ó

ó

Ó

ó

ó

o

o

d

o

O

Γo !-) >υ

Tabulka yfeo cd oó

CM

T- U3 ca -r<

CM

CD Ί w °1

V <0 <

«Ρ*

x—

to

τ-

τ-

CM

p

co

CM

co

h-

CD

h-

r-

xT

CD

Τ-

CM

Ο

Ο

CM

o

co

O

o

co

CO

in

h-

CM

x—

CO

Ο

d

O

ó

O

d

Ó

ó

ó

d

o

O

d

d

O

to

co

co

CD

x—

X—

ř*.

CO

CM

co

co

co

v-

to

b-

p

n»

CD

T-

xr

p

IO

CM

v

p

M;

p

p

’Γ“

co

T“

CM

X—

X—

CM

CM

T“

x—

v-

r-

CO

CM

CM

00

51-

CO

CO

CM

IO

CM

00

CO

CO

IO

σ>

CM

o

O

σ>

CM

CO

o

T“

o

co

p

p

O

co

o

O

4

CM

00

o

o

to

O

uí

CM

χ-

CM

T“

x-

V

CM

CM

co

co

T

CO

CM

CM τΟ) <3 cm o> «i <©

T- <1 oo o

CD

oo

xT

co

xr

Μ-

xT

o>

l·-

p

CO

xr

co

o

O)

τ—

p

xr

CD

CM

tO

χτ

00

co

o

CM

p

m

d

co

CM

4

CD

cd

CM

CD

v-

d

CM

co

oo

uS

χ—

CO

co

co

CM

xT

CM

CM

m

xT

xr

co

CM

CM

co

CD

CM

o

o

O

O

O

o

O

o

o

ν-

CO

CM

o

O

u>

O

τ-

5-

o

τ-

o

ο

o

o

Ο

CD

D)

00

r*-

in

v

O)

co

CM

τ-

CM

co

T-

σ>

CD

CM

IO

CD

CM

v

CM

p

OO

Ο)

M

00

CD

00

σ>

CO

CD

xr

v-

CD

í<

’Μ2

O

CD

CD

d

cd

χτ

CO

CD

χτ

xr

cd

CO

xT

co

xr

CM

CM

xr

v

co

τ-

to

N.

CD

00

CM

CD

CD

Μ-

m

CM

CD

oo

CD

Tj*

Ο

χ~

p

h-.

CM

▼“

CO

p

h*

CD

co

CM

CM

CM

xr

χ—

CM

x—

x—

CM

CM

Η

▼—

CM

CM

CM

Csi

57-

CM

r-.

O)

CM

xT

00

CO

00

CM

00

CD

CM

CM

00

CD

O)

χ“

d

CM

τ-

τ-

CM

CM

O

τ-

O

CM

τ-

τ-

CM

o

d

d

Ο

Ο

O

d

Ο

O

Ó

Ο

Ο

d

’ΧΤ

o

CD

O)

P

b-

V“

oo

o>

M*

co

h-

p

p

CM

p

P

p

p

p

p

h*

p

p

oo

’Τ

xr

v

xr

xr

xr

xr

'M2

xr

xr

xr

o

5^

CM

co

xr

IO

CD

F·

o

’Γ“

CM

CD

γ-

IO

h-

y—

V

X“

▼“

T—

x—

CM

oó

00

CD

ιο

oo

CO

oó

CD

00

00

00

00

00

00

00

oó

O

O

O

o

o

o

o

O

o

o

o

o

o

o

o

O

ν-

V“

▼“

Τ-

τ'

Τ-

τ-

T™

τ-

Ο

O

o

Ο

o

Ο

Ο

O

o

o

o

Ο

o

o

o

O

CO

co

CD

co

CD

CO

CO

CD

co

co

co

CO

co

co

co

co

0.

CL

X

0.

X

CL

CL

X

Q.

CL

0.

0.

0.

0.

CL

CL

-J

-J

X

_J

X

-J

-J

X

—1

—I

G

xr

xr

4

V

4

xr

xr

4

4

4

4

4

4

4

( xr

(

xr

xr

v

xr

M-

xr

xr

•M·

4

’Τ

xr

xr

xr

LO

IO

IO

<n

IO

ID

to

LO

to

to

to

to

to

to

IO

IO

m

m

IO

io

CO

LO

to

IO

to

to

to

IO

to

to

to

IO

• ·

CM

CM

O

CM

O

Ó

CM oC7i γO c—I >U

Tabulka o<50 οο <50

CM

T- m cn'~ <3

CM O>

óo co 5?

T- <

oo o

<50 o?

co

M

M

O

CM

CO b~ cn co o;

CM

CM co bbl co in

CM σ>

oo cd c

o

V

O

CO

o.

o co >υ

Tabulka o

CM

O

Ó

CM

Xj

CM co

CM

OJ

CM

CO

CM »

oo o

éo co o

<b

Fl ω

>u

I-1 λ:

>1 υ

b~ OJ d

CO oo d

CD CD O

(O b- o

ID CO O

CO CD Ó

in ca d

OJ oo d

oo 00 d

00 co o

co 00 d

r*- o

m 00 o

00 OO O

xt OO d

CM

00

in

T~

CO

co

CD

w

co

co

co

CO

00

xf

co

in

σ>

co

h-

σ>

00

CO

co

oj

o

oo

co

OJ

b-

OJ

d

d

▼—

d

Ó

d

d

O

d

d

T“

d

d

d

d

d

XT

co

co

co

ID

co

xT

CM

oo

OJ

CD

oo

CD

co

OJ

co

00

CM

v-

o

CM

ID

O

O

w

oo

o

ID

ΙΟ

cq

o

d

CM

*“

v-

d

d

T“

x—

χ-

τ

CM

oo

CM

h-.

F-

b-

in

CO

CM

CM

ιό

cg

τη

CM

M;

00

CO

CM

x—

T

o

X“

X“

t—

x-

X“

x-

V

x-

X-

X“

x—

eq	p	co	00	CD	co	io	OJ
eo	d	CM		T“	*;	io
	to	00	co	CO	φ	00	icj
		T		io	ID	T	T

CM	OJ	CO	CM	χ—	F-	ID	00
00	00	OJ		co	b*	Τζ	iq
d	|č	CM	OJ	IO	00	O	to
to		IO	T	io	IO	(0	IO

v—	r-	ID	co	CO	CM	ID	co
^2	o	O	p	T~	Ν'	ID	OJ
CM	ID	CD	ib	CO	r<	CM	d
	T-	t-	CM	t-	t-	CM	CM

00	F-	<D	ID h*	CD	Ν'	CD
co	xr	O	N; T-	CD	CD	r-
ID	C\i	CM	5—	ID	ID	σ>
CO	CM		CM	t—	t—	T“

x— co ΤΟ O τη

O O O

CO	OJ	to	X—	CM	Ό	co	IO	CO	OJ	00	x—
Τ-	o	o	o	o	o	o	o	co	o	o	CM
Ο	d	©	d	©	o	d	d	o	d	d	d

co

cd

b-

CD

ID

5^

00

T“

00

co

D)

D)

00

co

oo

00

N;

00

ID

co

τ’-

h-

D>

r-

T

ř*.

CM

cq

co

co

CD

4

b-

00

cd

<O

r<

d

CD

CM

d

CN

▼-

T“

T-

t—

CM

*”

*”

00

h-

CD

CM

r^-

CO

CD

N-

CD

h-

to

X*·

t—

CO

CD

^7

CO

V“

CM

CO

h-

ř^

r*

cq

p

p

X

ID

o>

cp

d

v—

T“

t—

T~

M-

d

ID

CD

CM

ID

CD

T“

ID

OJ

co

ID

CD

CD

τ-

CN

d

CO

t-

CM

O

O

o

τ-

o

χ-

CM

τ-

O

Ο

O

O

d

d

O

O

o

Ο

o

Ο

O

Ο

d

d

CO

CD

ID

ID

ID

CD

co

co

CM

CO

CN

CD

ID

CO

*“

00

O

v-

N-

co

CD

in

CM

CD

ID

CM

CD

oo

00

CD

l<

co

CO

M2

T

IÓ

!<

CD

M1

ID

O

o

O

O

o

o

O

O

o

O

o

o

o

O

O

O

CN

CM

CM

CN

CM

CM

CN

CM

CM

CM

CM

CM

CN

CM

CM

00

oó

oó

00

00

00

oó

oó

oó

oó

oó

oó

00

oó

oó

00

O

O

O

O

o

O

O

O

O

O

O

o

o

O

O

O

T“

τ-

τ-

τ-

τ-

τ-

O

O

O

O

Ο

o

O

O

O

Ο

Ο

o

Ο

Ο

O

O

co

co

CO

CO

co

CO

co

co

co

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

Q_

Q_

0.

0.

0.

□.

Q_

0.

D_

CL

CL

0.

CL

CL

CL

0.

-J

—1

_l

_l

-J

_l

_l

_í

_j

_í

_l

xr

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

1

1

n· ID

ID

ID

Xt ID

N* ID

M- in

s

s

’Ν’ ID

s

s

5

s

5

5

ID

ID

ID

ID

ID

ID

IO

ID

ID

ID

ID

ID

m

IO

IO

ID

ID

ID

CD

r-

00

OJ

O

v-

CN

CO

Ν’

IO

co

00

CD

CD

CD

CD

CD

CD

co

h-

N-

N-

h-

co	co	co	co	co	co	co	co
co	co	co	co	co	co	co	co
co	co	co	co	co	co	co	co
t— ><	><	v- ><	X	X	><	t— χ	X
>< r*.	><	2 b-	>< r*	X r-	>< b~	X	X hw
CD	OJ	OJ	σ>	CD	OJ	CD	CD

co	co	co	co	co	co	co	co
co	co	co	co	co	co	co	co
co	co	co	co	co	co	co	co
><	><	><	T— X	X	X	X	X
><	* N-		X h-	X	X r^·	X N-	X b-
OJ	OJ	OJ	CD	OJ	OJ	OJ	OJ

• · • · • · co >υ

Tabulka o

CM

O

O

CM •Móo

CM _

3ód <o

CO

CM cn

CM <30 cn co“ cm oo o

co

CD o

cb

Q t—( c

CD ε

CL co >o g

I-1

5b u

o l-l

3

3

CM

co

b-

b-

cn

CM

h-

Ν’

CO

3

tO

CO

cn

CO

CO

00

00

cn

ID

σ>

co

00

cn

CN

00

t—

cn

t—

3“

o

o

o

O

o

o

O

ó

3

Ó

ó

3-

3—

co

CO

CD

oo

00

b~

cn

3

CO

co

CO

w

co

cn

iq

N

OO

CD

CD

b-

<n

cn

ID

u>

ID

CD

n·

Ν’

IO

co

n

o

to

N

O

O

O

o

o

Ó

ó

Ó

Ó

ó

ó

ó

ó

o

ó

ó

CM

cn

b-

co

O

co

cn

CM

00

N*

ID

co

n

00

oo

b-

b-

oo

o

CM

N

co

CO

n

o

co

m

o

co

N*

O

o

o

T~

ó

o

Ó

ó

cd

ó

O

ó

o

o

CO

CM

b-

CM

CM

b-

cn

co

CM

3“

r-

CN

CM

cn

co

to

co

T—

3

CM

CM

ID

CM

<n

CM

T~

N

h*

CN

b-

N

co

Ν’

CM

T-

T-

CM

T-

r·

CM

3“

T~‘

V“

T-

3-

v’

Ί-·

T-1

σ>

σ>

00

co

τ-

3·

3“

3“

b-

CM

b-

r-

h-

IO

V“

co

NT

eo

nt

K

N-

ο

o

co

co

co

b;

n

3

co

CO,

n;

ia

o

cd

o>

3

ó

id

cd

CM*

O

oí

CN

O

3—

co

N

IO

CN

3

3·

«0

n

CO

CO

CN

co

o

co

CO

<n

n

cn

3

m

n

cn

cn

b-

CN

CN

CN

oo

N*

r*-

00

00

(O

n;

o

cb

co

h-

ó

b-

co

3—

ó

r^

CN

CO

o

n·

cd

o

V“

CM

CO

oo

5T

co

3

cb

Ν’

CO

ó

CN

oo

co

CN

CN

CM

CN

CM

CO

CM

N

co

CO

CN

o m cm co o CM Ó

to CN CN CN	co N2 CN	CD co cn y~	h* CN 3—	cq cd	co CN od co	to V oo CN	Ν’ cn ó co
CO	N	<n	cn	b-	CN	N	co
cq	N;	T-'	cn			iq
3—				T-		V	ν-
00	to	ID	00	3—	to	to	τ-
o	o	O	o	Ó	o	o	ο
cd	ó	Ó	o’		ó	cd
00	to	cn	CN	CO	cq	co	00
cq	o	CM	cq	CO	cd	CN	cq
Ν’	N2	cb	Ν’	tri		cd	N

O	o	o	O	o	o	o	O
CN	CM	CN	CN	CM	CN	CN	CN
CO	CO	od	od	CO	od	od	od
O	O	o	O	O	o	o	o
▼—	Τ-	3—	3—		X““
O	Ο	o	O	o	o	o	o
co	co	co	co	co	co	co	co
0.	Q.	0.	0.	0.	0.	CL	Q_
-I	J	-4	_l	_J		-J
Ν’	Ν’	Ň	Ν’	Ν’		1 N
Ν’	Ν’	Ν’	N	Ν’	3T	N
to	to	to	tO	to	to	IO	IO
tO	IO	IO	to	to	to	to	IO
O	v-	CN	CO	Ν’	to	CD	h*
00	00	00	00	00	co	co	00

CN	co	cn	Ν’	M-	xt	5T*	IO	to
N	CN	CN	CO	Xt	xf	OO	O	CN
oo		id	CN	<b	l<	cn	cd	O
co	CN	Ν’	CN	co	CM	CN	co	CO
N	CN	co	σ>	τ-	T*	V“	CN
cq	CN	CN	N;	Ο	CM.	iq	N	cq
		*”				3—
σ>	t—	CO	to		CM			3-
o			3—	Ó		3		T“
ó	cd	o	cd		O	O	O	cd

N	CM	CD	00		co	00	O)	co
Ν’	CO	cq	cq	iq	co	iq	CD	ID
	cb	cb	Ν’	cd	cb	cd	cb	cb

o	IO	IO	to	IO	IO	IO	IO	IO
CN	3“	3—		t—	3—	T“	3-	3-
oo	od	od	od	oo	od	oo	od	od
o	o	o	O	O	O	o	o	o
	3”			τ-
o	O	o	o	Ο	o	o	o	o
co	co	co	co	CO	n	co	co	co
0.	0.	0.	0.	0.	CL	Q_	Ol	Q.
-J	—í	_J		_i	_j	-1	□	_J
N	Ν’	Ν’	Ň	N	Xt	N	Ν’	1
N IO	Ν’ ΙΟ	5	Ν’ IO	3	xf ID	N IO	N to	Ν’ ΙΟ
IO	IO	ID	io	IO	ID	IO	IO	IO
oo	co	b-	oo	cn	O		CO	Ν’
oo	3-	T—			CM	CN	CN	CN

CO	co	co	co	CO	co	co	CO	CO
CO	co	co	co	co	co	co	co	co
CO	co	co	co	co	co	co	co	co
3“ X		X	X	X	T— X	X	X	3— X
>< r-	X b-	X r~-	X b-	X r^.	X	X r-	X b-
cn	cn	<n	<n	cn	cn	σ>	cn	cn

co b- CM T— X	CD CM X	CO h- CN 3 X	co h- CN 3— X	co b- CM T— X	CD b- CM X	co b~ CM X	co N. CN 3“ X
X b-	X b-	X	X b*	X b-	X b-	X b-	X N.
<n	cn	<n	σ>	cn	<n	cn	σ>

C\1 co >u

Tabulka o

CM

O

O

CM

M co

CM ~ < tn l'^- co ód <o <,CM «

cd

CM x— ai «I

CM tt>

CO

ΡΜ dd oo o

ód co o

co c

0)

CL ω

>o

I-1 >1

U

Q

in		h-	co	r-	O)	Tf
co	σ>	CD	co	CM	OJ	T“	05
ó	o	O	o		Ó		cd
1^	σ>	w	co	CM	r-	a>	Ti-
co	m	(O	m	O	co	co	to
ó	ó	o	o	o	o	o	O
CO		o>	f'·	CM	M-	CM	tn
σ»	co	M-	o	O	ó	o	cd
cd	o	o		Ó		cd
00	05	co		CO		CM
τη	co	o		co	CM		o
		Ή		CM		CM	X“

	co	co	05	v- ř*e	co
ΙΛ	cd	τ-	tf>	CO	o>
σ!	co	ΓΟ	o>	O	o	id
		CO	co	co		co

h*	▼—			co	co	co
r^-	O)	V“	o	co	co	tn
cd		co	σ>	co	ó	ó
CM	CM		CM	M-	co	tn

tn o tri x—	tn tn cd CM	r- 0 co CM	r^ CM CM	M- CO tri 'M-	M- 0 co	00 CD CO CO	00 co co CM
co	σ>	<p	M-	r*.	CD	CO	CO
O	tn	r·	tn	CM		CM	M;
CM					T“		T“
CM	'M*	t—			CM	CM	T—
CM	τ-		ν-		τ-	T“	τ-
O	Ο	O	Ο	Ó	Ο	Ó	Ο
	ΙΌ	h-	CM	tn	CD	M*	CO
	h*.	cp	00	CO	tn	r-	00
t	cd	cd	cd	cd	cd	cd	cd
tn	tn	10	tn	to	tn	tn	tn
▼7		T-		T—	T-	τ—	T—
co	co	co	oó	00	00	co	oó
0	0	0	0	O	O	0	O
7”	ν-		Τ-			τ-
O	Ο	0	Ο	O	O	Ο	O
co	CO	co	co	CO	CO	CO	CO
Q_	Q_	CL	CL	CL	Ol	CL	0.
	□	_1	_l	_j	-1	_1	-J
	M-	4	4	M		•M-	tj-
’Μ’		M-	M	M“	M*		M*
ΙΌ	tn	tn	to	tn	tn	tn	tn
in	tn	to	to	tn	tn	m	tn
m	CO	ř-	00	0	0	T“	CM
CM	CM	CM	CM	CM	co	CO	co

co	¢0	co	00	co	co	co	00
í^.	r-	l·-	h·.	r-	r-	h-	h-
CM	CM	CM	CM	CM	CM	CM	CM
X	X	X	t— X	X“ X	X“ X	X	X
X r-	X t''-	x r-	X r*.	X	X r-	X	X
cd	05	05	CD	05	05	05	CD

• « • · · *

Příklad 11: Současná exprese Δ5- a Δβ-desaturáz M. alpina v rostlině Brassica napiš

Aby došlo v transgenní kanolek produkci kyseliny arachidonové (ARA), musí se do rostliny vnést aktivity obou desaturáz Δ5 a Δ6. Za účelem uskutečnit downstream charakterizaci a šlechtění, je výhodné mít obě aktivity na jedné T-DNA. Následující příklad ukazuje současnou expresi Δ5a Δβ-desaturáz.

Fragment restrikčního enzymu Asp718 pCGN5528 obsahující 5'regulační oblast napínu, regulační oblast Ma29 a 3'regulační oblast napinu se začlenil do restrikčního místa Asp718 pCGN5138 za vzniku pCGN5545. Fragment restrikčního enzymu Notl pCGN5536 obsahující 5'regulační oblast napinu, regulační oblast Ma524 a 3'regulační oblast napinu se začlenil do restrikčního místa Notl pCGN5545 za vzniku pCGN5546. Expresívní moduly se orientovaly takovým způsobem, že směr transkripce Ma524 a Ma648 a markéru nptll je stejný.

PCGN5546 se zavedl do kultivaru rostliny Brassica napus LP30108 transformací zprostředkovanou mikroorganizmem Agrobacterium.

Z třiceti nezávislých transformantů LP30108 a netransformovaných kontrolních rostlin rostoucích ve skleníku se sebrala zralá inbrední semena T2. Složení mastných kyselin skupiny dvaceti semen se analyzovalo plynovou chromatografií. Data jsou uvedena v tabulce č. 12. Všechny transformované linie vykazují expresi obou desaturáz. Jako důkaz je přítomnost Δ⁵'⁹ 18:2 (jak je možné vidět v rostlinách obsahujících pCGN5531) a Δ⁶'⁹ 18:2 a GLA (jak je možné vidět v rostlinách obsahujících pCGN5538).

o

CN

O d

CN

Νέο

CN a>

CN CN

CN

CN CN

co CN

co CN T“

Ν’ CN

00 CN

σ> τ-

UO cq

IO cp X“

CO CN τ—

CN

to

CN co v-

co

co CN

N

io

00

co

oo

h-

r*-

Ο

IO

CO

l·-

OO

r*-

τ-

co

CN

00

r-

OO

o

co

ó

O)

co

d

<D

O

l-'-

co

0)

d

o

d

d

d

d

ó

o

Ó

d

o

ó

Ó

m

CN

N

CD

Ν’

CN

co

Ν’

CN

CN

N

IO

IO

CD

CO

00

co

τ-

τ-

co

CO

IO

Ν’

CN

CN

o

O

o

CN

co

IO

d

o

ο

Ο

d

O

d

ó

O

d

d

d

d

o

Ó

00

T“

cp

CN

co

CN

m

Ν’

i^-

N

τ-

h-

N-

CD

Ν’

cp

N;

τ-

N

cp

co

N;

U0

CN

CO

r~

ip

uo

CO

T“

T“

T—

CN

V“

T~

T“

mastných kyselin skupin s dvaceti semeny z rostlin 5546-LP30108

CN čó σ» co

ΓΜ čo σ>

co

CM čó o

čó (O o

čó

o>

IO

<0

T·

00

eo

co

O)

CM

r*.

co

05

Ο»

CO

CM

T

CN

T

co

00

CM

N-

CM

cp

o>

Ο»

10

o>

o*

CM

CO

CN

có

CM

Ο»

CÓ

d

ai

có

IO

T

ri

σ>

co

co

N-

co

CM

r-

co

h-

CN

m

CN

CN

Ν’

r-

to

co

co

CN

05

CN

O)

co

o

CD

05

CD

Ν’

Ν’

00

r-

IO

T-

CD

Ν’

co

cd

d

T“

N

CN

05

05

od

co

co

ai

T“

v—

CN

τ-

τ—

T~

eo w o « có T— oo co

CM IO IO o> © d

co	CM	CM	Τ-	CN	K	σ>
	Τ-	CM	Ο	o	CN	IO
©	Ο	O	d	O	O	©

co

co

3

co

CM

00

IO 05

co

T“ T

CM

CO

IO

ř*

CO

(O

K.

3

c-

N-

05

CM

CM

O

cp

CM

co

IO

N·

CM

©

©

T

CM

τ—

T“

CM

CN

N-

05

oo

cq

05

10

CN

ΙΟ

p

oo

05

05

UO

CO

r-t

O

00

Ν’

ó

CN

Ν’

σ>

h*

od

(0

CD

05

CN

CD

T“

tn

CO

od

o

CD

τ-

có

co’

co

có

CD

CD

UO

CO

Ν’

co

CD

r-

Ο

CD

CD

(O

CD

CO

CD

CD

0O

CN

uo

cq

τ-

Ν’

σ>

CN

CO

UO

CN

CD

r-

CN

Ν’

CO

CN

CN

uo

CN

ο

CN

Ν'

00

τ-

iq

00

CO

τ-

co

CO

h-

CN

CN

CN

CN

CN

CN

CN

ΟΝ

CN

ΟΝ

T·

CN

CN

co

•Ν-

UO

Ν-

IO

Ν’

CO

b-

m

Ν’

CD

co

CO

r-

co

Τ-

τ—

Τ-

τ-

τ-

CN

τ-

τ-

t—

τ-

τ-

CN

CN

o

Ο

O

Ο

Ο

Ο

Ο

Ο

Ο

O

Ο

O

Ο

O

O

ó

00

τ-

cn

Ν’

CN

UO

Ν’

Ν’

00

00

IO

IO

00

Ν’

cq

CO

oo

cp

CN

CN

IO

O

r-

CN

có

CN

CN

05

N.

Tj-

o

3

N

n·’

Ν’

CÓ

Ν’

Ν1

Ν'

Ν’

N

CÓ

Ν’

Ν’

N1

ro fO

N

I—I '5*1

1-1

Ό rc fC C

H <

C

d)

O

τ-

CN

CO

Ν’

uo

CD

i

CN |

CO

y

CO

9

r^-

oo

O)

τ—

T-

τ—

T-

v—

T-

oo

oo

00

oo

00

oo

00

oó

oó

00

00

00

00

00

00

00

o

o

o

o

O

o

o

o

o

O

o

o

o

o

o

o

τ-

τ-

τ-

τ-

τ-

τ-

τ-

τ-

Ο

o

O

Ο

Ο

o

o

Ο

o

Ο

Ο

Ο

o

o

o

Ο

co

CO

CO

co

co

co

co

O

co

co

co

CO

co

CO

fO

CO

CL

Q_

Q_

0.

CL

0.

Q.

0.

CL

CL

CL

CL

CL

CL

0.

CL

_J

_J

_l

_1

-J

_J

_J

-J

_J

—l

_j

_l

_J

_J

—1

có

CD

CD

CD

CD

có

CD

(O

CD

CD

có

CD

có

CD

ώ

có

Ν’

Ν’

Ν’

Ν’

N*

Ν’

Ν’

T

N*

Ν'

Ν’

Ν’

Ν’

Ν’

T

Ν’

uo

UO

CO

CO

CO

CO

UO

m

IO

UO

UO

CO

IO

IO

m

IO

uo

CO

CO

co

CO

uo

UO

IO

UO

IO

IO

UO

IO

UO

m

UO

O

CN

O

Ó

CN <30

CN

O>

CN

CO

co

CN

co

r—

CO

σ>

Γ-

oo

CO

CO

co

co

CN

CN

o

CN

o

CN

τ—

οο

T~

τ—

CM

CN

CM

t-

T“

Τ-

V

CN

05

co

Γ-

oo

Ι»

CN

tO

00

CN

co

1^

CO

CO

O)

CO

r-

Γ-

oo

Ι-

OO

σ>

τ—

00

cn

CO

00

co

O

O

d

Ο

o

Ο

O

o

O

d

o

d

ó

co

03

co

O)

00

co

Γ-

co

03

CN

CO

03

co

Ν’

O

Ν’

co

CN

co

τ-

o

03

Τ-

CN

'M*

Τ-

Τ-

O

d

d

d

d

d

Ο

d

Ο

d

ó

Ο

Ο

co

Γ-

Ν’

oo

r-

r-

to

O

1—

CO

h*

Ν’

CD

CN

τ’-

ΓΟ

CN

00

p

p

o

p

p

to

CO

CO

CN

CN

CN

<-

h

G

csi

CN

co

t

τ-’

mastných kyselin skupin s dvaceti semeny z rostlin 5546-LP30108

CO oo co o>

(O co n cn

CN cn «I

CN co p

CO

CM ěo o>

»o

CM oo o

<30 co o

co

CN

CO

CD

co

Γ—

CN

T

co

τ-

V·

to

co

CO

T-

O>

r-

co

00

co

co

ΟΙ

CM

co

CN

Ο»

CO

cd

r—

MŤ

id

cd

id

id

cd

IO

CN

Tt

CN

co

cn

to

Tj-

CM

CM

CO

O

CO

CM

CO

o

o

00

to

co

CM

to

co

O

d

T»·'

d

í<

r<

1-

cd

cd

od

CD

ó

CD

CN

T“

T—

co

CN

Ο»

co	IO	co	CD	r·	co		io	00	σ>	00
co	co	CN	CO	Τ-	co	CN	e	Ι-	p	CN
d	d	o	O	Ο	d		o	Ο	o	d	©

σ> o CM

CO

CD

to ID T—

co co

5

co 03 ©

CN CO V

(D CD CM

ΙΛ O

’Ρ· T“

ř*. o

ID O

CO 00 O

CO

00

to

Tt

CM

a>

P

CN

h-

CM

to

h*

h*

CD

T“

o

τ—

Τ-

T—

CN

^·

O

τ—

D>

v

IO

o

CD

CM

Ο

CO

CO

r<

CO

in

d

to

r<

CD

CD

to

CD

CO

CD

CD

(O

CD

CO

CD

to

'M'

to

'M*

to

V

00

to

00

co

▼-

00

to

OO

T—

CO

r-

T—

Ν’

co

T—

r—

r-

00

co

to

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CN

CN

cd

CN

CM

τ—

CM

CM

co

to

CD

co

o*

CN

CO

CM

CN

to

CM

CM

σ>

CM

co

CO

d

’ζΤ

CN

CO

r*

CN

Τ-

•MT

o

O

o

d

O

d

O

d

d

O

Ο

d

d

CD

CD

r-

CO

CM

T“

OO

CN

CM

CO

CD

D>

’Μ’

σ>

O

h*

O

tO

σ>

CN

p

M*

OO

00

CM

σ>

tri

to

’ΤΤ

to

V

to

d

cd

to

cd

d d x n i—I ^s2i G rH 42 d d G H <

Q

I—I

G (1)

h*

00

cn

o

T“

CN

co

Ν’

CO

co

r-

OO

σ>

O

V” I

|

x—

CN

CN

CN

CN

Ol

CN

CN

cy

CM

CO

00

oo

00

00

00

00

CO

00

có

oo

có

00

1 CD

1 00

o

o

o

O

O

O

O

O

O

o

o

o

O

O

τ-

τ-

τ-

τ-

T“

τ—

τ-

Ο

o

Ο

Ο

Ο

o

o

o

o

Ο

o

o

o

o

CO

CO

CO

co

n

co

co

co

co

co

co

co

CO

co

OL

0.

0.

0.

0.

0.

0.

Q_

0.

□.

0.

CL

CL

Q_

_l I

I

_J

-1

_l

-1

_l

_l

_l

_l

_l

-J

_J

CD

(O

CD

co

co

có

có

có

1 CD

1 CD

có

CD

1 CD

1 CD

to

c&

»n

Ν’ CO

Ν’ CO

Ν’ CO

5

5

M· to

M* IO

s

<r to

to

TT IO

IO

CO

to

CO

IO

CO

co

IO

to

to

cn

to

to

to

• * ··· ···· «·«· ···· · · · · * · · · ♦ ········· · · · · · ···· ^w ······· ·····# ·· t*

Příklad 11: Současná exprese Δ5-, Δ6- a A12-desaturáz M. alpina v rostlině Brassica napiš

Za účelem optimální produkce kyseliny arachidonové (ARA) v transgenní kanole je nutné, aby v rostlině mimo aktivity Δ5 byly přítomny také aktivity desaturáz Δ6 a Δ12. Za účelem uskutečnit downstream charakterizaci a šlechtění, je výhodné mít všechny aktivity na jedné T-DNA. Následující příklad ukazuje současnou expresi Δ5-, Δ6- a A12-desaturáz.

Fragment restrikčního enzymu HindlII pCGN5528 obsahující 5'regulační oblast napínu, regulační oblast Ma29 a 3'regulační oblast napinu se začlenil do restrikčního místa HindlII pCGN5544 za vzniku pCGN5547. Expresívní moduly se orientovaly takovým způsobem, že směr transkripce Ma29, Ma524 a Ma648 a markéru nptll je stejný.

pCGN5547 se zavedl do kultivaru rostliny Brassica napus LP30108 transformací zprostředkovanou mikroorganizmem Agrobacterium.

Z třiceti nezávislých transformantů LP30108 a netransformovaných kontrolních rostlin rostoucích ve skleníku se sebrala zralá inbrední semena T2. Složení mastných kyselin skupiny dvaceti semen se analyzovalo plynovou chromatografií. Data jsou uvedena v tabulce č. 13. 27 z transformovaných linií vykazuje podstatnou akumulaci GLA a pozorovaná obecná množství GLA jsou vyšší než množství v rostlinách 5546, které neobsahují A12-desaturázu. A12-desaturáza se jeví být aktivní ve většině linií, což dokazuje skutečnost, že ve většině rostlin chybí detekovatelné množství Δ6,9 18:2 a hodnotítelné množství 18:2. Malé množství Δ5,9 18:2 je možné spatřit v rostlinách 5547, ačkoli uvedená množství jsou obecně menší než se pozorovalo v rostlinách 5546. To způsobila přítomnost A12-desaturázy, která účinně převádí 18:1 na 18:2, dříve než dojde k desaturaci v pozici Δ5.

CM ňi

CM

CM

CM

O

CM

O

O

CM

CO

CM

Tabulka č. 13

Analýza mastných kyselin skupin s dvaceti semeny z rostlin 5547-LP30108 cn co

QO (O o

cd

M β» CM

CM

CM

ČÓ o>

co*

CM »

CM

CO v o>

oo

ΤΟ co

ΤΟ <b o

CM

0

CM O d

0 d

0 ó

O

O

0

0

0

0

0

0

τ- Ο d

0

0

co

co

co

CM

CM

O

0

0

0

0

0

CM

0

0

0

0

0

0

O

0

0

0

d

d

d

d

d

d

CM

m

CM

CO

00

CO

CM

co

σ>

co

0

xf

x—

T—

0

V

q

q

▼“

q

O

τ-

0

σ>

p

co

T—

V“

Η'

x—

t-

Ά

Ά

d

t—

d

CM

00

CO

00

00

CM

o>

cn

co

CM

Xt

co

CO

CO

00

H·

r-

b-

co

co

oo

co

O>

CO

co

co

co

q

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

r-

co

0

CM

co

00

10

CM

CM

co

h-

co

co

00

0

0

O

τ-

CM

xt

CM

CM

CM

co

CM

d

0

CO

d

d

d

Ο

d

d

d

d

d

d

d

d

d

xf

3

<0

<0

xt

b-

cn

co

m

xt

co

Xt

co

C0

r-

cp

co

q

q

q

3

r~

xf

V“

co

0

xf

q

CM

t-

t—

τ-

CM

T—

CM

csi

5

eo

10

CD

0

CM

T“

|T-

00

(O

10

10

3

00

T“

00

10

co

CM

O

σ>

to

A

to

d

co

d

0

€0

IA

T-

3

CM

CO

ID

ΙΟ

O

T-

CM

T“

V“

τ-

CM

T-

CO

CM

r-

10

v

IO

CM

b-

CM

Ο)

Xt

co

co

co

co

00

xf

co

q

ν-

CM

00

τ-

CO

r-

00

0)

O

CM

CO

cn

b·

t-

έο

d

Ο

d

cn

CM

CM

0>

CM

co

CM

co

co

CM

0

co

co

co

CM

CO

CO

CM

0

0

0

τ-

V*

O

CM

0

0

0

0

0

0

O

Ο

0

O

q

O

o

o'

d

Τ-

(O

co

CM

ID

CO

CM

CO

0

co

co

f-

<0

O

Xt

Ο

Τ-

0

τ-

CM

τ-

τ-

CM

CM

10

τ-

d

Ο

d

Ο

O*

Ο

Ο

d

d

O

d

d

Ο

CM

r*-

t—

0)

σ>

co

00

co

t—

Xf

C0

CM

b-

0>

x-;

m

CO

to

xf

T

co

IO

xf

0)

CM

T“

10

q

xf

T~

d

d

xr

σ>

CM

Xf

t—

<0

xf

CM

b^

CO

10

in

to

co

3

xf

Xf

CM

co

co

cn

co

σ>

co

co

to

CM

co

CM

CO

co

C0

co

CM

CM

0

CM

q

0

10

05

t—

CO

co

co

CM

Oi

CM

CM

CM

CM

T“

CM

CM

CM

CO

CM

CM

CM

CM

CM

co

co

CM

10

xt

IO

to

xf

r~

b-

co

O>

t0

d

V

Τ-

τ-

τ-

τ-

X“

X“

τ-

X—

Yt“

τ-

τ-

CM

0

Ο

ο

Ο

Ο

0

0

Ο

d

d

Ο

Ο

d

d

00

«

oo

10

σ>

T“

b-

co

co

co

b*

CO

b-

b-

co

xf

χξ

co

q

V“

CM

xf

Xf

CM

<0

00

q

q

iri

xf

xf

xt

Xt

Xf

xf

xf

xt

Χί-

xt

Xt

Xt

0

Τ-

0

0

O

O

0

O

0

0

0

ο

0

0

0

d

Ο

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

0

v

CM

co

xt

10

a

CM

co a

7

0

<?

b-

00

cn

T—

t—

co

00

co

00

co

co

oó

co

co

có

CO

ώ

CO

00

co

0

O

0

0

0

0

0

0

0

0

O

o

0

0

0

V“

v-

Y-

Y“

v“

τ-

τ-

τ-

O

O

0

0

0

0

O

0

0

0

O

Ο

Ο

Ο

0

CO

CO

co

co

co

co

CO

CO

co

co

CO

co

CO

co

co

CL

CL

CL

CL

CL

CL

CL

CL

CL

CL

CL

0.

CL

0.

o.

-J |

□

_J

_1

_J

—1

_J

-I

-I

-J

—1

_t

_l

_1

b-

b-

b-

b-

b-

b.

b-

b-

b-

b-

b-

ti

b-

b-

b-

xt

M·

xt

xt

xt

M“

xt

Xt

xt

Xf

Xt

xt

Xt

m

10

in

10

0

0

10

10

to

to

to

10

m

10

10

to

10

10

LO

0

to

10

to

to

10

10

m

10

10

10

• · · · • · · · • · « · • · « · co oo

CO o

i—1 o

co

Cb

I rx ld lT)

H i—i 4-) w

o

N ω

£ ω

ω

CM

CM

CM

CM

CM ď

CM

O

O

CM

X (30

CM

CO lO

CO

O « CM

CM

CM co <1.

CM od

	P	in
	<1) υ	o,
	fd	CM
	>	S
	TS ω	v- 03
	3 -H CL	CO
	3	o
	42	co
	w
	3
	•H	co
	i—1 OJ	V“
	ω	o
	✓O	CO
	42
	47	o
	0	CN
	'p*n	X“
CO	3
C-1	•P CO
	fO
>υ	£	Q h—1
(ΰ	3
42	N
t—1	'£>1	ω g
3	I-i
X	fO	y;
rO	3
Η
	• · · 4	4 · ♦ ·
	• « · ·	4
	• « · ·	•
	• · · ·	• »
	· · ·	• 4

* · « « · • · · · • ·

O

o

o

o o

O

o

O

o

o

o

o

O

o

o

O

CM O

o

o

o

o

o

O

o

o

o

o

o

o

o

o

O

d

CO

co

co

03

co

co

x-

co

co

5

<33

1^.

ř-

co

CM

10

LO

CM

CM

τη

CM

CM

x

T“

<33

cq

X“

CM

*”

x—

*“

d

x-

*“

CM

CO

co

X

00

co

M·

co

co

co

oo

h·

co

r-

00

¢0

o

O

σ>

co

O)

00

oo

oo

p

00

O)

<33

o>

O

ci

x—

d

o

O

d

d

d

ó

d

d

d

O

o

co

CM

co

LO

CM

co

o

00

co

co

τ-

CM

CM

CM

o

o

τ-

h-

x—

CM

Ο

o

ó

d

ó

d

O

d

Ο

d

d

o

O

X

CM

CM

▼—

LO

co

03

w

(33

CM

T

X

O

CM

b-

cq

CD

cq

h-·

T~

cq

O

O

O)

O)

cq

F-

CM

CM

CM

T—

CM

CM

CM

10

O

IO

CM

IO

<o

O

10

10

(0

Λ

CO

R

t

t-

co

IO

co

o

03

cq

rq

03

σ>

O

T“

CM

©

©

oo

o

oo

ci

O

rí

CM

τ—

CM

CM

τ-

LO

CO

I-

S-

O)

O)

03

oo

X

10

co

Ο)

03

co

CM

CM

r*·

i—

00

LO

X“

O

co

o

o

LO

00

o

X

X“

CM

xt

co

CM

d

d

00

d

co

d

CO

d

CM

CM

CM

CM

CM

CO

CM

CM

co

co

CM

CM

CO

CM

O

O

o

O

O

Φ

o

o

o

o

O

o

O

o

o

O

O

O

v·

Τ-

ι-

IO

o

v

o

o

o

«Ο

o

CM

10

τ-

O

Ο

ρ

CM

O

cq

O

o

Ο

O

©

O

o

o

O

03

CM

co

T-

CO

h*

CO

X

oo

X

o>

LO

co

co

<q

CM

cq

CO

co

co

p

X

co

X

r-~

’ί

cq

to

x

r<

x—

d

co

LO

X“

00

(33

d

d

CM

CM

LO

co

co

V

io

'Μ’

LO

XT

CO

x-

CM

LO

IO

CM

CM

r-

co

X-

h*

X“

r—

CM

T-

CM

co

co

X

O)

--

CM

CO

r—

σ>

CO

h*

t—

h-

CM

CO

CM

03

00

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

co

CO

o>

CM

CM

h-

00

CO

r-

r-~

CM

00

r-

Γ-

'ΐ-

τ-

X“

T~

τ-

CM

τ-

v—

Τ-

Ο

O

ó

Ο

ó

Ó

O

d

d

Ο

d

Ο

d

Ο

d

co

LO

CO

co

CM

00

LO

co

<33

X

X

O)

co

CM

h*

cq

cq

cq

CM

cq

lO

o

o

CM

cq

cq

o

CO

c0

LO

x-

Μ-’

M-

X

X

x-

Μ1

x-

o

o

o

o

O

o

O

o

o

o

o

O

o

o

o

o

ó

o

d

O

ó

O

d

d

o

o

O

d

o

d

co

h-

00

O)

O

CM

co

x-

IO

co

r*

00

03

o

1

1

T 1

I

CM

CM

CM

CM

CM

O)

CM

CM

CM

CM

co

oo

00

co

co

00

co

00

oo

ώ

oo

oo

00

oó

oó

có

o

o

o

o

O

O

O

o

o

o

o

o

o

o

o

τ-

V“

V“

τ-

τ-

Τ-

o

o

Ο

O

O

o

o

Ο

Ο

Ο

o

O

o

O

o

co

co

CO

co

co

co

co

CO

co

CO

co

co

co

co

co

Q_

0.

0.

0.

0.

0.

CL

o.

0.

0.

0.

0.

0.

£L

0-

□ |

_]

_I

_l

□

—I

_l

_J

_l

_l

_1

_l

—J

—1

-J

ri

ri

rl

rl

rl

rl

ri

rl

ti

ht

1 r-

1

M“ m

LO

LO

’Μ’ LO

'M’ LO

s

3

M (O

χ- ιό

X 10

X IO

^r LO

LO

M“ LO

LO

LO

LO

LO

LO

LO

LO

LO

in

to

to

IO

LO

Lf)

LO

LO

• ··· ·· »·>» *» ·* ·* ·· β » 9 9 9 · 9 9 9 9

9 99 9 9 · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

Příklad 13: Stereospecifická distribuce Δβ-desaturovaných olejů.

Tento experiment se navrhl za účelem zkoumání stereospecifické distribuce Δβ-desaturovaných olejů v semenech exprimujících pCGN5538 (Ma524 cDNA). Použily se tři vzorky semen:

1) semena netransformovaných rostlin B. napus kultivar LP004 (kontrola)

2) Semena T2 vylučující pCGN5538-LP004-19

3) Semena T2 vylučující pCGN5538-LP004-29

Při analýze se použil následující protokol:

1. Extrakce oleje ze semen

Padesát semen se umístilo do zkumavky o rozměrech 12 x 32 mm a drtila se skleněnou tyčinkou. Přidalo se 1,25 ml hexanu a směs se míchala na vortexu. Semena se extrahovala přes noc na míchačce. Extrakt se filtroval přes filtr zachycený na stříkačce o objemu 1 ml s velikostí pórů 0,2 mikronů. Extrakt se sušil v atmosféře dusíku. Výsledný olej se použil ke štěpení a derivatizaci celého olejového vzorku.

2. Štěpení

A. Štěpení kapalného oleje

Zásobní roztok lipázy (z Rhizopus arrhizus, Sigma, L4384) se naředil na přibližnou koncentraci 600 000 jednotek/ml za účelem dosáhnout 50 % štěpení TAG. Zásobní roztok lipázy se udržoval při teplotě 4 °C a umístil se na led. Množství reakčních činidel se může upravit podle množství oleje, který se bude štěpit.

Následující množství reakčních činidel je založeno na množství oleje, které se bude štěpit.- V tomto případě jsou to 2 mg. Do zkumavky se šroubujícím uzávěrem o rozměrech 12 x 32 cm se přidalo: 2 mg oleje, 200 μΐ 0,1 M tris HCl pH7, 40 μΐ 2,2 % (hmotnost/objem) CaCl2x2H₂O a 100 μΐ 0,05 % (hmotnost/objem) žlučových solí. Materiál se míchal na vortexu a sonifikoval • · » · se, až se dosáhlo disperze oleje. Přidalo se 20 μΐ ředěné lipázy a směs se míchala na vortexu nepřerušovaně po dobu 1 minuty při teplotě místnosti. Vznikla bílá sraženina. Reakce se zastavila přidáním 100 μΐ 6M HCl a směs se zamíchala na vortexu. Přidalo se 500 μΐ CHC1₃:CH₃OH (2:1)a směs se zamíchala na vortexu a držela se na ledu , zatímco probíhalo štěpení. Vzorky se znovu zamíchaly a centrifugovaly se za vzniku ostrého rozhraní vrstev. Spodní vrstva obsahující produkt štěpení se odstranila pasterovou pipetou a umístila se do zkumavky s víčkem o rozměrech 12 x 32 mm. Materiál se pak znovu extrahoval 300 μΐ CHCi₃, míchal se na vortexu, centr!fugoval se a kombinoval se s dalšími spodními vrstvami.

Produkty štěpení se uchovávaly na ledu, jak jen to bylo možné.

Separace na HPLC se uskutečnila co nejdříve po štěpení, aby se minimalizovala migrace acylu.

B. Štěpení tuhého tuku

Postupuje se podle protokolu popsaného shora v textu pro štěpení kapalných olejů s tou výjimkou, že k 2 mg pevného tuku se přidalo 20 μΐ 11:0 metylesteru.

3. Separace na HPLC

Objem produktů štěpení se zmenšil sušením chloroformem na objem přibližně 200 μΐ. Každý vzorek se pak přenesl do zkumavky o rozměru 8 x 40 mm a 30 μΐ se zavedlo injekcí pro analýzu na HPLC.

Systém vysokovýkonné kapalné chromatografie je vybaven výparným detektorem rozptylu světla Varex ELSD IIA s teplotou v trubici 105 °C a s proudem dusíku 40 ml/min, automatickým dávkovačem vzorků Waters 712 Wisp, třemi moduly zavádění rozpouštědla Beckman 114M, řídící jednotkou Beckman 421A, pneumaticky ovládaným děličem toku Rheodyne a mikro-děličem frakcí Gilson. Chromatografická kolona má rozměry 220 x 4,6 mm • « a obsahuje normální fázovou křemičitou náplň o velikosti 5 mikronů od firmy Brownlee.

Použila se tato tři rozpouštědla:

A= hexan : toluen 1:1

B= toluen : etylacetát 3:1

C= 5 % kyselina mravenčí v etylacetátu

Profil gradientu byl následující:

Čas (min)	funkce	hodnota	Doba trvání
Tok 0	2 ml/min
0% B	10
0% C	2
2 % C	25		6 min.
14 % C	2		1 min.
15	Konec programu

Chromtaografická standardní směs se připravila v rozpouštědla hexan:toluen v poměru 1:1 a obsahuje :

0,2 mg/ml triglyceridu 16:0 mg/ml 16:0 volnou mastnou kyselinu

0,2 mg/ml 16:0 smíšené izoméry (1,2-diacylglycerol a 1,3diacylglycerol)

0,2 mg/ml 3-monoacylglyecrol 16:0

0,2 mg/ml 2-monoacylglycerol 16:0

V případě každého vzorku se automaticky shromáždily frakce obsahující 2-mag pík metodou řízenou časovanými relátky. Časová prodleva se používá k synchronizaci detektoru s kolektorovým emitorem. Shromáždily se 2-mag píky a frakce se nechaly odpařit při teplotě místnosti přes noc.

Výsledky s kompozicí sn-2 se opírají o minimalizaci migrace acylu. To, že se na chromatografickém záznamu objevily 1-monoacetylglyceroiové a /nebo 3-monoacylglycerolové píky znamená, že došlo k migraci acylu.

• · • · • · · · · ···· ···· ··· ·· ···· ·· ··

4. Derivatizace

Za účelem derivatizovat celý olej se do zkumavky s víčkem o rozměrech 12 x 32 mm navážil 1 mg extrahovaného oleje. Přidal se 1 ml toluenu. Vzorek se míchal na vortexu a za účelem derivatizace se vzal alikvot o objemu 50 μΐ. Aby se vysušily 2-mag vzorky, přidalo se 50 μΐ toluenu. Do obou frakcí se přidalo 105 μΐ H₂SO₄/CH₃OH @ 8,7 6 hmotnostních procent.

Zkumavka se dobře uzavřela a vzorek se ozářil světlem po dobu 1 hodiny při teplotě 95 °C. Vzorek se nechal ochladit a přidalo se 500 μΐ 10 % (hmotnost/objem) a 60 μΐ heptanu.

5. Analýza GLC

Plynová chromatografie se provedla na přístroji Hewlett

Packard model 6890,	který je vybaven rozděleným/nerozděleným
kapilárním vstupem,	detektorem FID, sériovým automatickým
dávkovačem vzorků	6890 a integrátorem 3392A Alpha Omega.
Nastavení kapilární	kolony je následující:
A. Supelco Omegawax	250, délka 30 m, vnitřní průměr 0,25 mm,
tloušťka filmu 0,	25 μπι.
Vstup pro injektáž:	260 °C
Detektor	270 °C
Počáteční teplota	170 °C
Počáteční čas	1,5 min.
Rychlost	30 deg/min.
Konečná teplota	245 °C
Konečný čas	6,5 min.
Injektovatelný objem	1,5 μΐ
Tlak v hlavě kolony	0,175 Mpa
Dělící poměr	30
Plynový nosič	He
Přídavný plyn	n2
FID plyn	H + vzduch

• · • · • · · · · · · · ·· · • ♦ · · · ······

P! -) ♦ ···· ···· yO ······· ······ · · * ·

Procentové složení metylesterů mastných kyselin se stanoví jako molová procenta. Když délka uhlíkatého řetězce je menší než 12, je nutné pro korekci výpočtu použít teoretické nebo empirické faktory.

6. Výpočet

Vypočítalo se průměrné rozdělení každé acylové skupiny v každé pozici sn-1 a sn-3.

Průměrné složení sn-1 a sn-3 = (3W0 složení - MAG složení)/2

WO je celý olej

MAG je monoacylglycerol

Výsledky uvedené analýzy jsou uvedeny v tabulce č. 14. GLA a Δ⁶'⁹ 18:2 jsou pravidelně rozděleny mezi polohy sn-2 a sn1,3. Tato analýza nemůže rozpoznat mezi mastnými kyselinami v polohách sn-1 a sn-3.

« · • · • · ·

* Vypočteno z raag a ze složeni celého oleje pro každý analyzovaný vzorek		K o 3 0» HS □ Φ' U) H O Nt fD 3 H' ω 2 i—1 ω 3 OJ	Složení celého oleje	5538-29		h o 3 a o· 01 h> 0 N< Φ 3 H' 05 3 w 05 3 ' tu *	1 složeni celého oleje	5538-19 J		T3 o 3 ω< n 3 O 0) H 0 N< Φ 3 H- ω 3 Η» 05 3 CJ ' *	Složení celého oleje	Složení sn2	% 3 F* O ♦
' Složení sn2	složení sn2 1
6.82	4.96	1.24	7.34	5.44 J _1	1.65	5.88	4.33	1.23		16:0
0.35	0.32	© k) **4		0.36	033 | _1	© k> *4	0.23	0.20	0.15		16:1
4.82	3.73	1.56		4.08	4.09	4.12 i 1		4.80 1	3.32 I	© cl		18:0
54.21 1	54.92	56.35		57.66	57.51	57.21 i 1		71.55	69.29 !	64.77		18:1
4.31	4.99	6.35		3.99	4.53	5.61		0.27	0.18 i _i	00Ό		ta* op 'sO
9.24	12.11	17.85	8.58 ! 1	10.57 1	14.55 i 1	13.04	18.51 ! _1	29.45 -1		18:2
14.00	13.66	12.99	13.52 1	13.16	12.45 j _1	t o © CL	0.00	900		5 £ o\ JO ta* u
0.85	©	1.60	980	1.03	1.38	1.02	1.35	2.01		op cl
0.56	oco	0.38	0.59	0.50	0.32	60Ό	900	00Ό		18:4
1.42	66Ό	0.14	1.39	1.07	0.43	1.26	16Ό	0.21		20:0
	1.47	III	0.40	r~	1.07	001	1.47	1.17	0.57		20:1

Tabulka

Ω<

t—¹

Příklad 14: Složení mastných kyselin v transgenních rostlinách

U Δ5 a Δ6 transgenních rostlin se analyzova obsah mastných kyselin.

Při extrakci olejů se použil následující protokol:

1. V případě každého vzorku se odvážilo dvakrát 400 mg semen.

2. Semena se rozdrtila tloučkem v misce. Tlouček a miska se dvakrát promyly 3 ml (2:1) (objem/objem) CHC1₃: CH₃OH/MeOH.

Do skleněné zkumavky o objemu 20 ml se přidalo 6 ml (2:1) směsi (olej extrahovaný ve 12 ml, celkem 2:1).

3. Vzorky se míchaly na vortexu a umístily se do orbitální míchačky po dobu 2 hodin , přičemž se náhodně zamíchaly na vortexu.

4. Do každého vzorku se přidalo 5 ml 1M NaCl. Vzorek se zamíchal na vortexu a pak se centrifugoval při 2 000 ot/min. po dobu 5 minut. Za použití pasterovy pipety se odebrala spodní fáze.

5. Horní fáze se znovu extrahovala dalšími 5 ml. Vzorek se promíchal na vortexu a centrifugoval se při 2 000 ot./min. po dobu 5 min. Za použití pasterovy pipety se odebrala spodní fáze.

6. Za použití chlazení, při kterém dochází k odpařování, se v atmosféře dusíku odpařil CHC1₃:CH₃OH/MeOH. Zkumavka obsahující extrahovaný olej se zatavila v atmosféře dusíku. V případě každého vzorku se extrahovalo přibližně 120 až 160 mg oleje.

Za účelem provedení analýzy GC-Ms se metylestery mastných kyselin rozpustily ve vhodném objemu hexanu a analyzovaly se za použití plynového chromatografu Hewlett-Packard 5890 Serie II Plus (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) vybaveném křemičitou kapilární kolonou Omegawax 320 o rozměrech 30 m x 0,32 mm (vnitřní průměr) (Supelco, Bellefonte, PA) a hmotnostním selektivním detektorem Hewlett-Packard 5972 Series.

spekter se provedla na základě spektry uvedených v databázi

Interpretace hmotnostních porovnání s hmotnostními ·· · · · · · · • · · · · ·· · « · · · « · · chemických struktur NIST/EPA/NIH za použití MS Chem. Station (#G1036A) (Hewlett Packard).

Transgenní linie 5531-6 se analyzovaly ve dvou kopiích (A,B) a porovnávaly se s kontrolní linií LP004-6. Výsledné profily mastných kyselin se uvádí v tabulce č. 15.

Transgenní linie 5538-19 se analyzovaly ve dvou kopiích (A,B) a porovnávaly se s kontrolní linií LP004-6. Výsledné profily mastných kyselin se uvádí v tabulce č. 16.

• · · · • · ♦ · · · ·· ···» «· » «

Tabulka č. 15: Profil mastných kyselin

	KONTROL.	KONTROL.	TRANSGEN	TRANSGEN!
	LP004-6A	LP004-6B	5531-6A	5531-6B
	LRL-2043	LRL-2044	LRL-2042	LRL-2045
	001f0102.d	001f0103.d	OOlfOlOl.d	001f0104.d
02:0
03:0
04:0		0.053		0.061
04:1
05:0 isomer
05:0
06:0	4.107	4.034	4.257	4.224
06:1	0.181	0.173	0.200	0.199
06:2	0.061	0.065	0.081	0.060
07:0
06:3	0.244	0.246	0.155	0.151
06:4
08:0	2.608	2.714	3.368	3.417
C18:lw9	65.489	66.454	59.529	59.073
C18:lw7	2.297	2.185	2.388	2.393
Cl 8:2 5,9			6.144	6.269
C18:2w6	19.828	18.667	18.872	19.059
C18.-3 5,9,12			0.469	0.496
C18:3w6		0.060
O8:3w3	1.587	1.578	1.428	1.418
C18:4w6
C18:4w3
C20:0	0.962	0.998	1.009	1.022
C20:lwll	1.336	1.335	1.058	1.065
C20:lw9
C20:lw7			0.076	0.080
C20:2w6	0.073	0.073		0.052
C20:3w6

• *

	KONTROL.	KONTROL.	TRANSGEN.	transgen;
	LP004-6A	LP004-6B	5531-6A	5531-6B
	LRL-2043	LRL-2044	LRL-2042	LRL-2045
	001f0102.d	001f0103.d	OOlfOlOl.d	001f0104.d
C20:4w6
C20:3w3
C20:4w3
C20:5w3
C22:0(1.000)	0.542	0.558	0.463	0.467
C22:lwll		0.038
C22:lw9
C22:lw7		0.034
C21:5
C23:0		0.029
C22:4w6
C22:5w6
C22:5w3
C24:0	0.373	0.391	0.280	0.283
C22:6w3	0.314	0.317	0.223	0.212
C24:lw9
Celkem	100.00	100.00	100.00	100.00

• · · ·

Tabulka č. 16: Profil mastných kyselin

	5538-19A	5538-19B	LP004-6A	LP004-6B
	TRANSGEN.	TRANSGEN T	KONTROL.	KONTROL.
	LRL-2166	LRL-2167	LRL-2168	LRL-2169
C6:0	0.004	0.005
C8.0	0.007	0.007	0.004	0.005
00:0	0.012	0.012	0.008	0.008
02:0	0.020	0.020	0.011	0.012
03:0
04:0	0.099	0.108	0.050	0.050
C14:lw5
05:0	0.059	0.068	0.017	0.019
06:0	5.272	5.294	4.049	4.057
06:1	0.350	0.417	0.197	0.208
06:2	0.199	0.187	0.076	0.077
07:0	0.092	0.089	0.078	0.077
06:3	0.149	0.149	0.192	0.198
06:4		0.010
08:0	3.815	3.771	2.585	2.638
08:1	57.562	57.051	68.506	68.352
08:2 (6,9)	4.246	4.022
C18:2w6	10.900	11.589	19.098	19.122
C18:2w3	0.020	0.008	0.008	0.009
C18:3w6	12.565	12.595	0.013	0.015
C18:3w3	1.084	1.137	1.501	1.542
08:4	0.017	0.013	0.011	0.008
08:4	0.028	0.024
C20:0	1.138	1.104	0.937	0.943
C20:l	1.115	1.085	1.330	1.327
C20:2w6	0.150	0.143	0.068	0.071
C20:3w6	0.026	0.025	0.014	0.012
C20:4w6
C20:3w3

100

	5538-19A	5538-19B	LP004-6A	LP004-6B
	TRANSGEN.	TRANSGEN.	KONTROL.	KONTROL.
	LRL-2166	LRL-2167	LRL-2168	LRL-2169
C20:4w3
C20:5w3
C22:0	0.506	0.484	0.535	0.539
C22:l	0.017	0.020	0.032	0.032
C21:5		0.040	0.030	0.031
C22:4w6	0.038	0.064	0.015	0.014
C22:5w6
C22:5w3	0.023	0.018	0.021	0.017
C24:0	0.352	0.321	0.353	0.362
C22:6w3	0.009
C24:lw9	0.129	0.121	0.260	0.255
TOTAL	100.00	100.00	100.00	100.00

• ·

101 • ·· · « · * · • · * » fc * · • · · · · ♦ 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9

Příklad 15: Kombinovaná exprese Δ6- a ΔΙΖ-desaturáz v rostlině B. napus, které se dosáhlo křížením

Křížily se rostliny obsahující buď Δ6- nebo Δ12desaturázu. U jednotlivých polovin semen F1 se analyzovalo složení mastných kyselin plynovou chromatografií. Data s každého takového křížení jsou uvedena v tabulce č. 17. Rodičovské rostliny, které se účastnily křížení, jsou 5538LP004-25-2-25 (exprimuje Δβ-desaturázu) a 5542-SP30021-10-16 (exprimuje Á12-desaturázu). Provedlo se reciproční křížení a výsledky pro 25 jednotlivých semen F1 jsou uvedeny dále v tabulce. Křížení se popisuje tak, že pohlaví prvního rodiče se označuje jako ženské. Obě skupiny křížení dávají přibližně stejné výsledky. V porovnání s rodičovskými rostlinami množství Δ⁵'⁹ 18:2 se snížilo a množství GLA se zvýšilo. U většiny semen F1 došlo ke zvýšení množství Δ⁹'¹² 18:2. Je nutné poznamenat, že tato semena jsou F1 a obsahují tedy pouze jednu sadu každé desaturázy. V další generaci a při selekci homozygotních rostlin pro každou desaturázu může být obsah GLA F2 dokonce vyšší.

V některých situacích je výhodné kombinování vlastností provést křížením na jedné T-DNA. Zvláště, jestliže oba geny řídí stejný promotor (jako je to například v případě napinu), pak v případě tichého promotoru může být tento přístup výhodný ve srovnání s řešením, kdy se do jedné konstrukce začlení více cDNA.

V některých případech je však výhodné kombinovat více cDNA do jedné T-DNA. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 17.

• · · · « · · * • » · « • · · ·

Οι

ΟΙ

οι

Οι

Ol

οι

ΟΙ

cn

cn

cn

cn

Ol

Ol

cn

cn

cn

Ol

Οι Α

ΟΙ Α

2

2

2

2

οι Α

2

2

Ol A

2

cn A

Ol A

2

cn

cn A.

cn A

ιο

ΙΟ

ΙΟ

ΙΟ

ΙΟ

ΙΟ

ΙΟ

ΙΟ

IO

ro

IO

IO

ro

ro

ro

N)

to

ώ

ώ

00

ώ

ώ

in

ώ

ώ

ώ

in

in

in

in

ώ

ώ

CO

in

Τ3

Τ3

υ

Ό

Ό

0

Ό

-σ

TJ

T3

Ό

o

Ό

Ό

“0

0

Ό

co

co

03

co

03

co

03

03

co

co

co

co

co

CO

co

Ca)

co

ο

ο

ο

ο

C3

ο

Ο

ο

o

o

o

o

o

o

o

O

O

ο

ο

ο

ο

Ο

ο

Ο

ο

o

o

o

o

o

o

o

O

o

ΙΟ

ΙΟ

ΙΟ

ΙΟ

ΙΟ

ΙΟ

Μ

ΙΟ

IO

IO

IO

IO

IO

ro

K)

to

_κ

_k

_k

—k

—k

—k

—k

-J-k

—k

—k

_k

_k

—k

_k

—k

—k

_k

*k

_k

—k

2i

_Lk

—,k

«k

1

1

1

1

ο

Ο

Ο

ο

Ο

ο

Ο

ο

o

o

o

o

o

o

O

o

o

_χ

2k

Α

_k

2k

_k

_k

—k

_k

—k

cn

σι

03

03

Ο)

α>

03

cn

03

cn

CD

03

CD

O)

cn

cn

CD

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

οι

οι

Οι

οι

ΟΙ

Οι

ΟΙ

οι

Ol

cn

cn

Ol

cn

cn

cn

cn

Ol

οι

ΟΙ

Ol

cn

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

οι

Ol

cn

cn

cn

Ol

cn

cn

cn

cn

co

03

co

co

03

co

οο

co

co

ω

co

co

co

c*>

Ca)

co

co

00

οο

00

οο

00

00

οο

00

00

oo

00

oo

00

00

00

oo

00

Γ~

Γ~

Γ-

Γ“

Γ~

Γ

Γ

Γ~

Γ-

r-

r~

r~

r-

Γ

Γ“

Γ

Γ

Ό

Ό

Ό

Ό

Τ3

Ό

Ό

0

Ό

Ό

TJ

0

Ό

“D

Ό

TJ

TJ

ο

ο

ο

ο

ο

Ο

ο

o

o

o

o

O

o

o

o

o

o

ο

ο

ο

ο

ο

Ο

ο

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

Α

Α

Α

Α

Α

Α

Α

A

A

A

A

A

A

-řk

ÍA.

A

A

ΙΟ

ίό

ΙΟ

ιό

ιό

ιό

ιό

IO

ro

IO

IO

ro

10

ro

rb

ro

řó

οι

Οι

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

οι

Ol

οι

cn

cn

cn

Ol

cn

cn

cn

cn

ΙΟ

ιό

ΙΟ

ιό

ιό

ιό

ιό

IO

tO

IO

ιό

ro

10

ro

rb

IO

IO

ΙΟ

ΐό

ιό

ΙΟ

ιό

ιό

ιό

ro

IO

ιό

ιό

ro

10

ro

rb

ro

ro

ΟΙ

Οι

tn

ΟΙ

Οι

ΟΙ

οι

Ol

cn

Ol

Ol

U

Ol

Ol

cn

cn

cn

’’***

——

'—

Α

Α

Α

Α

03

ω

CO

A

co

c*>

A

co

ό

Α

ό

_k

00

<1

ČO

A

č>

<»

ČO

_k

ČO

-χ

-ο

ίο

οι

Ο)

Α

Α

A

-1

cn

A

co

00

u

co

A

ο

ο

Ο

ο

ο

Ο

Ο

o

o

o

o

p

o

o

o

o

O

ό

ό

ο

ο

ό

ό

ό

ó

ó

ó

ó

ó

o

ó

ó

ó

O

οι

σι

σι

οο

σ>

-4

σι

O)

03

cn

-4

O)

-M

<n

03

•o

ΙΟ

Α

_k

_k

_χ

—χ

-k

_k

_k

_k

_A

_k

_k

ΙΟ

Αι

CO

Α

ČO

Ο)

<1

OJ

in

-*·

CO

OJ

čn

čn

ČO

oo

Ol

Α

Α

co

σ>

CO

03

Ol

co

co

co

co

00

cn

cn

(O

ΙΟ

CO

03

03

03

03

CO

co

co

co

co

o

Ca)

co

CO

<Ο

οι

03

Οι

Α

Α

CO

A

—k

o

co

IO

cn

_k

A

in

03

ό

Α

Α

<Ο

Ó

<1

<1

ro

Ol

ó

A

O

Α

σ>

σ>

CO

Α

Ό

cn

Ol

A

~4

_k

_k

σ>

—A·

A

CO

(D

M σ

o>

ό ω

oo ό

οο .Μ ο ο ο ο ο ο Α 0> 0>

ο ο ο ο ο ο

Ο Ο» Μ Α ο ο ο ο ο CO ΟΙ Μ ΟΙ ΟΙ ο ο ο ο Α σ>

to

Ca>

co

co

Ca)

co

co

co

co

co

ro

co

ro

to

Ca)

Ca)

co

00

M

co

^k

—A

co

A

co

co

IO

P°

o

co

ro

—λ

cn

OJ

ČO

00

o

in

ro

čn

co

ČO

A

A

ó

óo

ČO

A

00

CO

OJ

co

00

IO

IO

co

co

co

A

OJ

00

00

cn

K>

-i.

—λ

«α

_k

—x

K)

IO

M

KS

K)

M

M

•M

po

09

^1

cn

co

IO

-o

K>

K)

ro

CO

Φ

CO

00

ω

00

(O

e

O

io

io

po

co

O

O

00

(Λ

o

A

co

co

-M

čo

o

O)

Ca)

A

co

cn

.cn

cn

co

co

A

Ol

co

cn

£

ČO

O)

čn

IO

'_k

_k

čo

to

čn

čo

to

co

čn

io

u>

IO

A

K)

α

-o

00

cn

IO

-M

cn

co

co

čn

IO

co

o

O

o

o

o

o

_k

_k

_k

_k

_k

_k

_k

Lk

čo

čn

Ča)

óo

čo

O

ČO

čo

‘ v

čo

Čn

Lk

o

ó

ro

N)

OJ

OJ

M

co

-1

Ό

co

00

co

IO

A

IO

_k

A

to

O

o

O

O

o

O

O

o

o

o

o

o

o

o

o

O

o

ČO

ŮJ

<1

in

óo

čn

in

čn

čn

<1

P

'~-J

čn

čn

óo

<1

in

co

OJ

_k

o

00

00

00

00

A

cn

•o

^1

IO

CO

Ό

_k

—k

_k

_k

_k

_k

_k

_X

_k

ro

to

ro

M

io

io

čo

Ča)

io

io

io

io

io

io

io

ro

io

cn

o

—k

00

co

oo

A

CO

OJ

-o

cn

03

cn

00

•o

IO

oo

ο» <0 κ>

CO

ΙΟ οο ω

co

ΙΟ

Α

ΙΟ ο

ΙΟ ο

Η

QJ σ

C ι->

&>

ο<

<1 ο

ΓΌ

Η

OJ σ

c

Η-¹

X

0) ο<

σι

οι

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

cn

οι

οι

ΟΙ

οι

σι

σι

σι

σι

σι

σι Λη

σι

οι

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

σι

ΟΙ

οι

οι

οι

σι

σι

σι

σι

σι ►v

UI (ti

00

ω

00

ω

00

οο

οο

00

οο

οο

ω

Ca>

οο

Oi

00

οο

00

00

οο

ρ

οο

οο

οο

00

00

00

00

00

Iv 1

1

Γ

r1-

γ-

Γ*

Γ-

Γ~

Γ”

Γ”

Γ“

Γ~

ι Ι-

ι Γ*

I Γ*

ι r_

ω

Γ“

ϋ

U

Ό

-ο

Τ3

Τ3

υ

0

TJ

Ό

Ό

-α

-ο

Ό

*Ό

Ό

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

Ο

ο

ο

ο

ο

O

oo

O

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

Ο

ο

ο

ο

ο

O

O

4b

Α

Α

Α

Α

Α

Α

Α

Α

Α

Α

Α

Α

-N.

O NO

1

Ν>

Ν5

Ν5

ΝΟ

Ν0

ΝΟ

Ν0

Ν)

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

Μ

NJ

hO

Ni tftl

σι |

Οι

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

Οι

Οι

ρ

Οι

οι

ΟΙ

σι

ΟΙ

σι

1

1

Μ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

NJ

ΝΟ

ΝΟ

Ni

Ν0

N0

O

NO t

Ni

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

Ni

ΝΟ

NO

1

NO σι

σι

Οι

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

Ol

Ol

ΟΙ

Οι

οι

ΟΙ

σι

ΟΙ

σι

σ>

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

σι

οι

ΟΙ

ΟΙ

οι

οι

οι

οι

οι

ΟΙ

ΟΙ

σι

ΟΙ

σι

σι

οι

ΟΙ

οι

ΟΙ

οι

οι

οι

θ’

ΟΙ

ΟΙ

σι

ΟΙ

σι

Α

Α

Α

Α

Α

Α

Α

Α

Α

Α

Α

JL

NÍ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

Μ

Ni

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

Ni

Μ

NO

ώ

ώ

ώ

ώ

ώ

ώ

ώ

Č0

ώ

ώ

ώ

ώ

ώ

ώ

0

Ό

TJ

Ό

Ό

Ό

Ό

Ο

Ό

Ό

Ό

Ό

0

0

οο

ω

ω

ΟΟ

ω

CJ

00

Oi

00

00

οο

00

οο

00

ο

ο

ο

Ο

ο

Ο

Ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

o

ο

ο

ο

Ο

ο

Ο

Ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

o

Ν)

Ν5

Ν5

Ni

Ni

NÍ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

ΝΟ

Ν0

ΝΟ

NO

-J*

γχ

_χ

—X

-J-X

—χ

—χ

—χ

—χ

—χ

_i

2b

_χ

_χ

li

li

—X

L.

1χ

li

li

Ο

ρ

ο

ρ

ο

Ο

ο

ρ

ο

ο

Ο

Ο

Ο

o

_χ

_χ

li

_i

li

_χ

li

li

li

'χ

li

σ>

05

oj

05

σ>

05

σι

σι

05

oj

σ>

σ>

05

OJ

**

ω

ω

OJ

Oi

Α

00

Α

Α

οο

οο

4b

4b

οο

Οι

οι

Α

οι

Ο

to

ω

Li

ΝΟ

čo

σι

ρ

Oi

O

NO

4φ

ω

00

CJ

Oi

Α

Oi

00

οο

05

Οι

όι

<o

CO

00

ο

ο

ο

Ο

ο

Ο

ο

ο

ο

Ο

ρ

ρ

ρ

o

p

ο

ό

ο

Ο

ό

ό

ό

ό

ό

Ó

ό

ό

ό

ó

p

Ni

ω

ω

Α

Α

Α

οι

Α

Α

ΟΙ

Α

οο

Α

4b

00

ΝΟ

ΝΟ

νο

-X

_i

ΝΟ

ΝΟ

Μ

_i

_Α

_i

Ni

Ni

4b

ώ

ΟΙ

00

—*

ΝΟ

ΟΙ

ti

ω

Α

σ>

(Ο

CD

00

O

ho

“*

ω

οι

to

00

ΟΙ

to

οι

ο

Α

05

00

CD

00

4b

Α

ω

ω

οο

οο

οο

οο

οο

οο

Α

οο

Oi

οο

00

σ>

σι

to

<ο

Α

Μ

oj

ρ

Α

Ο

00

ρ

05

p

OO

σι

nj

ΟΙ

li

00

<1

Α

ω

Α

ΝΟ

05

ίο

NJ

in

00

•M

οο

oj

Α

Ni

00

ΟΙ

οο

Α

00

ΟΙ

ΟΙ

σ>

A

00

4b

00

o

O

O

o

O

O

O

o

o

O O

o

o

O

O

O

00 >1

NJ

NJ

NO

NO

NJ

NO

NJ

NJ

NO

N5

NJ

NO

NO

NO

A

00

to

00

CO

CD

CO

oo

05

p

00

CO

00

-4

p

<o

Ó

00

ói

Lx

NJ

ó

co

-J

00

O

A

05

ČO

00

C5

A

—*

NJ

•M

CO

Ol

oi

CO

—X

00

00

00

00

A

NO

NI

Ni

NI

NI

-X

NI

NI

«b

o

wb

co

p

CJ

NJ

O

NI

CO

O

CO

NI

O

CO

Cd

co

A

00

00

05

O>

o

00

(O

cn

CO

in

-t -

in

_b

NO

CO

cn

A

*NI

00

cn

A

A

o 00

NJ bi

NJ 05

NO A A

ω co oi

co A NJ

ČO Ol

co A -sl

NJ 05 CO

NJ CO NJ

NJ 2

NJ ČO NO

CO Ó 05

co ČO 05

NJ 05 -J

O 05

o ČO NJ

o

p

O

o

o

O

O

O

O

O

O

O

O

co

Ol

Ol

O

O

bi

00

05

<1

Ol

<1

05

00

05

Ó

•Ό

CO

A

čoo

ČO

Ol

05

Ol

Ol

CJ

Ol

00

oi

Ol

NJ

O

o

O

O

o

O

o

o

O

o

O

O

o

O

O

ČO

ČO

ČO

<1

<1

ČO

Ó)

00

O

čoo

<1

<1

ČO

<1

_x

00

co

A

co

00

ČO

oo

05

CO

oo

NJ

oi

O

__x

_i

_x

_i

_i

_i

_i

_i

_x

—X

_i

A

co

co

NJ

co

N5

NO

A

Č>0

ČO

NO

ó

A

-.J

A

Ol

CO

05

NJ

Č0

M

A

NO

00

NJ

00

c>

o

Π) ι—( σ ο» οο ό

e σ» co

MÍ οο νο '>

5° ro »

Μ t>

σ>

Ιο οο

co «χ

Ν)

Α

ΝΟ

Ο

Ó

ΝΟ

Ο

-ο ι—¹ ο ω • »· · «

• · ·

cn

ΟΙ

Οι

ΟΙ

οι

ΟΙ

οι

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

οι

ΟΙ

ΟΙ

οι

ΟΙ

ΟΙ

2

Οι tk

2

2

2

2

2

οι 03

ΟΙ 03

ΟΙ 03

οι 03

ΟΙ 03

ΟΙ 03

ΟΙ 03

ΟΙ 03

ΟΙ 03

ΟΙ 03

Μ 1

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

00

00

00

οο

00

00

00

οο

00

ρ

ω

C0

ώ

Ó)

ώ

ώ

Č0

Γ-

Γ-

Γ-

Γ-

Γ-

Γ-

Γ-

Γ-

Γ-

Γ-

Ό

0

Ό

Ό

Ό

“0

TJ

Ό

Ό

Ό

Ό

Ό

Ό

Ό

Ό

Ό

Ό

ω

ω

ω

03

03

οο

03

ο

ο

Ο

ο

ο

ο

Ο

ο

Ο

Ο

ο

ο

ο

Ο

Ο

ο

Ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

Ο

ο

Ο

Ο

ο

ο

ο

Ο

Ο

ο

ο

-tk

-tk

tk

-tk

tk

tk

tk

-tk

-tk

tk

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

t ΙΌ

ΙΌ

1 ΙΌ

1 ΙΌ

1 ΙΌ

ΙΌ

1 ΙΌ

1 ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

I

1

I

I

I

I

2

σι

Οι

ΟΙ

σι

03

ΟΙ

Οι

ΟΙ

ΟΙ

Οι

Ο

ο

Ο

Ο

_k σ

Ο

ο

ΙΌ «

ΙΌ I

1 ΙΌ 1

1 ΙΌ 1

1 ΙΌ 1

ΙΌ 1

1 ΙΌ 1

ΙΌ 1

1 ΙΌ 1

1 ΙΌ 1

*

1

1

I

1

I

I

IQ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

03

03

03

03

03

σ>

03

σι

ΟΙ

σι

ΟΙ

Οι

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

οι ΟΙ ω οο

ΟΙ οι ω 00

οι ΟΙ ω οο

οι οι 03 00

οι οι 03 οο

σι σι οο 00

Οι οι 03 οο

σι σι •U ΙΌ I

Οΐ 2 ΙΌ I

σι σι ΙΌ I

ΟΙ οι tk ΙΌ I

οι ΟΙ tk ΙΌ

Οΐ tn tk ΙΌ 1

ΟΙ οι -tk ΙΌ 1

ΟΙ οι •tk ΙΌ

Οΐ ΟΙ -tk ΙΌ 1

ΟΙ ΟΙ -tk ΙΌ I

1 Γ~

1 γ~

1 r“·

1 Γ~

1 ί—

I Γ“

I Ι-

ω

ω

ω

ω

ώ

ω

ω

ώ

ω

ω

Ό

ϋ

“0

0

0

“0

ΤΟ

“0

“0

Τ5

Ό

Ό

Ό

Ό

Ό

Ό

Ό

ο

Ο

ο

ο

ο

ο

Ο

οο

00

ΟΟ

03

03

03

03

03

03

03

ο

Ο

ο

ο

ο

ο

Ο

ο

ο

ο

Ο

Ο

ο

ο

Ο

ο

ο

U

Α

Jk

•ίκ

jk

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

Ο

ο

ο

I ΙΌ

Μ

Ν>

ΙΌ

I ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

«χ

«χ

-k

- X

—k

ΟΙ I

σι

cn

σι

ΟΙ I

σι

σι 1

1

_L

I

1

I _k

1 -k

I

ΙΌ

Μ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

Ο

ρ

ο

Ο

ο

ρ

Ο

Ο

Ο

Ο

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΓΌ

ΙΌ

_k

\

1 .X

ΟΙ

σι

σι

σι

ΟΙ

σι

ΟΙ

σ>

ο

σ>

03

σ>

03

03

03

03

03

χ-ζ

*****

’**’**

k>M*

U

ω

-U

tk

fx

οο

03

tk

U

03

ω

03

03

03

Ο

ίο

ο

’ο

Ο

’ο

_χ

ό

CO

’ο

ό

CO

00

(Ο

03

jk

(Ο

Μ

ω

-Q

—X

σι

tk

ΙΌ

οο

00

03

Ο)

00

—I

ΟΙ

CO

(D

Η σ

Η ω σ 2 I—' χ· £U

Ω<

I—¹ -J σ>

ό

Ο

Ο

Ο

ο

Ο

ρ

Ο

Ο

Ο

O

O

O

O

p

O

o

p

ό

Ο

ο

Č3

ο

d

Ο

Ο

d

O

O

d

d

d

d

o

o

00

03

ΟΙ

03

-Μ

Μ

03

tk

03

-tk

tk

4k

oi

Ol

to

tk

to

-χ.

-χ.

-ο.

ΙΌ

_χ

ΙΌ

ΙΌ

_k

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

_k

-X

ΙΌ

IQ

ΟΙ

Α

’ρ

Ο

σι

ΙΌ

_χ

00

03

ΙΌ

Ó1

O

K

CD

cn

1

-4,

-tk

-χ

00

•Ό

03

-tk

co

ΙΌ

03

03

CO

-x

-q

03

03

03

00

03

03

-tk

-tk

03

tk

03

ω

03

03

οι

—X

—k

00

~4

Ο

ΙΌ

o

CO

O

tk

74

03

A

00

o

-tk

Α

00

03

ο

Ο

03

Ol

ΙΌ

CO

<1

ΙΌ

«k

po

<0

O

C0

03

-Ό

00

03

IQ

03

J

οο

ΙΌ

ΙΌ

CO

tk

03

σι

ΙΌ

σι

ο .Μ ο

►tk ο ο ο dob ΟΙ (Λ Α Ο ο

Ο -X ο>

ο

03

CO

03

co

03

03

03

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

03

co

N)

ΙΌ

03

po

O

—*

03

03

O

O

CO

00

CO

-Ό

O

CO

po

CO

03

ΙΌ

03

03

tk

d

03

Ai

d

σι

_x

tn

03

σι

00

co

Ol

00

03

tk

03

co

co

σι

03

ro

«X

K>

ro

K3

a

IQ

|Q

P

co

co

w

cn

Ol

cn

00

<0

-M

0>

O

-M

cn

O

co

d

co

C0

tk

čn

0>

0>

*4

tn

Č0

co

co

<0

K3

-M

~kl

A

tn

σ>

0>

00

-X

co

ΟΒ

-*ι α>

«ο

CJl tk 00

Ol ΙΌ 00

03 tk Ol

p čo -U

pí Ol

Ol 03 00

03 ΙΌ

ΙΌ tk 03

03

ΙΌ 03 CO

IQ cn C*J

ΙΌ '2

ΙΌ A co

co 00 co

ΙΌ 03 00

ΙΌ ¢30 p

ΙΌ 03 03

o

O

O

o

o

O

O

O

o

ρ

o

o

O

O

ρ

co

CO

CO

00

čo

ČO

tk

03

O

tn

A

A

Č33

Ól

co

00

CO

co

03

-x

ΙΌ

-Ό

<33

co

χ.

M

cn

CO

03

οο

o

o

O

p

o

O

O

C3

O

o

o

O

O

o

03

03

00

00

03

03

o

ά>

A

ČO

00

ο

o

ó>

00

bo

čo

03

00

ΙΌ

co

03

CO

co

ΙΌ

03

03

σ>

ČO

oo

03

co

_X

-k

-k

_X

_X

—k

_X

—λ

—k

«X

_k

_k

ΙΌ

03

—x

IQ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

7-x

03

ΙΌ

ώ

ΙΌ

03

CO

ώ

ω

tk

00

ΙΌ

03

00

00

00

CO

03

CO

03

cn

CO

03

co

00

03

03

οο ο

·>

co

ΙΌ

ΙΌ ο

ό

ΙΌ ο

• · · ·φ ·

105 *· *· »♦ φφ * Φ · ♦ 9 9 · s i • · · · · Φ Φ * » · ♦ «·ΦΦ··Φ? Φ3 ► · · · ť » Φ * « ► φγ »ř» φφ ···< φφ r·

Příklad 16: Exprese desaturáz M. alpina v sóje

Desaturázy M. alpina se mohou použít při řízení produkce GLA a jiných PUFA v sóje za použití následujících expresívních konstrukcí. Existují dva způsoby, jak se může exogenní DNA začlenit do genomu sóji. Je to infekce mikroorganizmem Agrobacterium a vstřelování částic. Transformace pomocí vstřelování částic se popisuje v patentu US č. 5,503,998. Rostliny se mohou vybrat za použití markéru rezistence na glyfosfosát (4,971,908). Transformace sóji za použití mikroorganizmu Agrobacterium je dobře známa v oboru.

Za účelem specifické exprese v semenech se cDNA umístila tak, aby ji řídila 5'regulační oblast genu zásobního proteinu konglycininu alfa-typ beta Glycin max. Specifická oblast, kterou lze použít, tvoří nukleotidy 78-92 gi 169928 (Doyle, J.J., Schuler, M.A., Godette, W.D., Zenger, V., Beachy, R. N., and Slightom. J.L., 1986 J. Biol. Chem. 261 (20), 9228-9238).

Použitelná 3'regulační oblast pochází z genu ribolóza-1,5bifosfátkarboxyláza hrachu/malá podjednotka oxygenázy (rbcS). Použitelné specifické sekvence jsou nukleotidy 1 až 645 gi 169145 (Hunt, A.G. 1988 DNA 7: 329-336).

Protože semena sóji obsahují více 18:2 a endogenní aktivity Á12-desaturázy než účinek A12-desaturázy Mortierella při dosažení optimálního množství GLA se může testovat následujícím způsobem. Konstrukce obsahující cDNA Δβ-desaturázy se může použít, aby se zjistilo, zda Δ⁶'⁹ 18:2 se produkuje spolu s GLA. Konstrukce obsahující A12-desaturázu se může použít za účelem zjištění, zda se v sóje může zvýšit množství 18:2. Konstrukce obsahující Δ6- a A12-desaturázy se může použít při produkci optimálního množství GLA. V jiném případě rostliny obsahující každou z desaturáz se mohou křížit, jestliže je nezbytné kombinovat mozna více rostlina Brassica, geny.

I

106 • · · · · ·· ···· · · ·*

Podobnou konstrukci lze připravit tak, aby se exprimovala samotná A5-desaturáza nebo v kombinaci s Δ12- a/nebo s Δ6desaturázami.

Příklad 17: Sekvence genu lidské desaturázy

Na základě homologíe mezi sekvencemi lidské cDNA a sekvencemi genu desaturázy Mortierella alpina se izolovala lidské desaturázy potencionálně sekvence genu v biosyntéze polynenasycených mastných kyselin zahrnutá s dlouhým řetězcem. Našly se tři konzervované histidinové boxy, o kterých se ví, že jsou konzervativní mezi desaturázami vázanými na membrány. Stejně jako u jiných desaturáz výzaných na membránu konečný motiv histidinového boxu HXXHH je QXXHH. Aminokyselinová sekvence putativních lidských desaturáz vykazuje homologii s Δ5, Δ6 a A12-desaturázami.

cDNA sekvence Δ5- a A6-desaturáz se použily pro průzkum databáze LifeSeq instituce Incyte Pharmaceuticals, lne., Palo Alto, California 94304. Sekvence A5-desaturázy se rozdělila do fragmentů 1) aminokyselina č. 1 až 150, 2) aminokyselina č. 151 až 300 a 3) aminokyselina č. 301 až 457. Tyto polypeptidové fragmenty se zkoumaly proti databázi za použití algoritmu „rblastn. Tento algoritmus obsahuje dotaz na sekvenci proteinu pro nukleotidovou sekvenční detabázi dynamicky překládanou do všech šesti čtecích rámců (obou řetězců).

Polypeptidové fragmenty 2 a 3 Δ5- a Δβ-desaturáz organizmu M. alpina vykazuje homologii se sekvencemi CloneID, jak je uvedeno v tabulce č. 18. CloneID reprezentuje jednotlivé sekvence z databáze Incyte LifeSeq. Po té co se zveřejnily výsledky „tblastn informace klonech se hledaly za podmínek přísnost >/= 50 a skóre produktu je </=100 při různých číslech CloneID. „Cloně Information Results uvádějí informace zahrnující ClusterID, CloneID, Library, HitID, popis Hit.

• «

107

Číslo ClusterID ukazuje informace o všech klonech, které patří do uvedeného ClusterID. Příkaz zařazení zařazuje všechny CloneID, které obsahují ClusterID. V případě zařazení GCG (Genetics Computer Group,

University Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53704) se používají následující nastavení:

0,8

Velikost slova Minimální překryv Přísnost

Minimum shody Maximum mezer Významnost mezer Významnost délky

Výsledky uspořádání GCG vykazují kontig vytvořený na základě sekvenčních informací v CloneID. „Kontig je uspořádání sekvencí DNA založené na oblastech homologie mezi těmito sekvencemi. Na základě seřazených sekvencí do kontigu se vytvořila nová sekvence. Identifikoval se kontig obsahující CloneID a nejednoznačné místa sekvence se editovala na základě seřazení CloneID (SEQ ID NO: 31 až SEQ ID NO: 35) za vzniku nejlepší možné sekvence. Postup se opakoval v případě všech šesti CloneID uvedených v tabulce č. 18. Tímto způsobem vzniká pět jedinečných kontigů. Editované sekvence 5 kontigu se přenesly do softwarového programu Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan 48 105). Sestavily se konsensus sekvence. Kontig 2511785 se překrývá s kontigem 3506132 a tento nový kontig se nazývá 2535 (SEQ ID NO: 37) . Kontigy z programu Sequencher se zkopírovaly v programu Sequence Analysis software package GCG.

Každý kontig se přeložil do všech šesti čtecích rámců v proteinových sekvencích. Sekvence Δ5(ΜΑ29) a Δ6(ΜΑ524) M. alpína se porovnaly s každým přeloženým kontigem za použití průzkumu FastA (průzkum podobnosti mezi dotazovanou sekvencí a • *

108 (nukleová kyselina nebo Homologie mezi těmito skupinou sekvencí stejného typu protein) podle Pearson a Lipman) sekvencemi naznačuje otevřené čtecí rámce každého kontigu. Homologie mezí Δ5 a Δβ M. alpina s kontigy 2535 a 3854933 se použily k vytvoření konečného kontigu nazvaného 25358a. Obrázek č. 9 je párování FastA konečného kontigu 253538a a MA29 a obrázek 10 je párování FastA konečného kontigu ,25358a a MA524. Sekvence DNA různých kontigu jsou přítomny v sekvencích SEQ ID NO: 31 až SEQ ID NO: 37. Různé peptidové sekvence jsou zobrazeny v SEQ ID NO:38 až SEQ ID NO: 44.

Ačkoli otevřený čtecí rámec se vytvořil spojováním dvou kontígů, kontig 2535 ukazuje, že zde existuje na začátku kontigu jediná sekvence, která se s kontigem 3854933 nepáruje. Proto je možné, že tyto kontigy vznikly z nezávislé desaturázy jako lidské geny.

Kontig 253538a obsahuje otevřený čtecí rámec kódující 432 aminokyselin. Začíná Gin (CAG) a končí stop kodonem (TGA). Kontig 253538 se spojuje se sekvencemi Δ5 a Δ6 M. alpina, což naznačuje, že jde buď o libovolnou desaturázu nebo o jiné známé desaturázy, které vzájemně sdílí homologii. jednotlivé kontigy uvedené v tabulce 18 stejně intermediální kontig 2535 a konečný kontig 253538a se mohou využívat k izolaci celých genů lidských desaturáz.

Tyto jako

Použití lidských desaturáz

Tyto lidské sekvence se mohou exprimovat v kvasinkách a v rostlinách za využití postupů popsaných v příkladech. V případě exprese v savčích buňkách a v transgenních zvířatech tyto geny mohou poskytovat odchylku kodonu. Tyto lidské sekvence se mohou také použít pro identifikaci příbuzných sekvencí desaturáz.

Tabulka č. 18

Sekce desaturáz

CloneID z databáze

Klíčové slovo

• · • ·

109 ······· ·· ···· ·· · ·

	LifeSeq
151-300 Δ5	3808675	Desaturáza mastné kyseliny
301-446 Δ5	354535	Δ6
151-300 Δ6	3448789	Δ6
151-300 Δ6	1362863	Δ6
151-300 Δ6	2394760	Δ6
301-457 Δ6	3350263	Δ6

Příklad 18: Identifikace homologů Δ5- a Δβ-desaturáz

Sekvence nukleové kyseliny, která kóduje putativní Δ5desaturázu se identifikovala prostřednictvím průzkumu TBLASTIN exprimované sekvence tag databází prostřednictvím NCBI, kde se jako dotaz použijí aminokyseliny 100 až 446 klonu Ma29. Aby se zabránilo vzniku homologii založených na části cytochromu b5 na N-konci desaturázy, použila se zkrácená část sekvence Ma29. Dedukovaná aminokyselinová sekvence odvozená z Dictyostelium discoídeum (číslo uložení #C25549) ukazuje velmi podstatnou homologii s Ma29. Také vykazuje menší, ale stále podstatnou homologii s Ma524. Sekvence DNA se prezentuje jako SEQ ID NO: 45. Aminokyselinová sekvence se prezentovala jako SEQ ID NO: 4 6.

Příklad 19: Identifikace Δ5- a Δβ-homologů organizmu M. alpina v jiných organizmech produkujících PUFA.

Aby se našly desaturázy, které se podílejí na produkci PUFA, z celkové RNA izolované z Phaeodactylum tricornutum se zkonstruovala se cDNA knihovna. cDNA knihovna založená na plazmidu se zkonstruovala v pSPORTl (GIBCO-BRL) podle instrukci výrobce za použití běžně dostupné sady (GIBCO-BRL). Náhodné klony cDNA e sekvenovaly a sekvence nukleové kyseliny, které kódují putativní Δ5- nebo Δβ-desaturázu se identifikovaly průzkumem BLAST databází a porovnáním sekvencí • · • ·

110

Ma29 a Ma524. Z knihovny Phaeodactylum se identifikoval jeden klón s homologii k Ma29 a Ma524, nazval se 144-011-B12. Sekvence DNA je přítomna jako SEQ ID NO:47. Aminokyselinová sekvence je přítomna jako SEQ ID NO: 48.

Příklad 20: Identifikace Δ5- a Δβ-homologů organizmu M. alpina v jiných organizmech produkujících PUFA.

Aby se našly desaturázy, které se podílejí na produkci PUFA, z celkové RNA izolované z Schizochytrium sp. se zkonstruovala se cDNA knihovna. cDNA knihovna založená na plazmidu se zkonstruovala v pSPORTl (GIBCO-BRL) podle instrukcí výrobce za použití běžně dostupné sady (GIBCO-BRL). Náhodné klony cDNA e sekvenovaly a sekvence nukleové kyseliny, které kódují putativní Δ5- nebo Δβ-desaturázu se identifikovaly průzkumem BLAST databázi a porovnáním sekvencí Ma29 a Ma524.

Z knihovny Schizochytrium se identifikoval jeden klón s homologii k Ma29 a Ma524, nazval se 81-23-C7. Tento klón obsahuje inzert o velikosti přibližně 1 kb. Z každého konce klonu se získala částečná sekvence za použití univerzálních forward a reverzních sekvenačních primerů. Sekvence DNA z forward primerů je přítomna jako SEQ ID NO:49. Peptidové sekvence je přítomna jako SEQ ID NO: 50. Sekvence DNA z reverzního primerů je přítomna jako SEQ ID NO: 51.. Aminokyselinová sekvence z reverzního primerů je přítomna jako SEQ ID NO: 52.

Příklad 21: Výživné přípravky

PUFA, které se popisují v předchozích příkladech, se mohou použít v různých potravních doplňcích, v kojeneckých výživách, výživných náhradách atd..

I. Kojenecké výživy

A. Sojový výživa Isomil® obsahující železo ·· ···· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · · * · · ni .· ···..: : .: :: :

• ···· ···· ······· · · · 9 9 · · 9 9 9

Použití: Používá se jako nápoj pro kojence, děti a dospělé s alergií nebo citlivostí na kravské mléko. Potrava pro pacienty s poruchami, kvůli, kterým nelze podávat laktózu: nedostatečnost laktázy, netolerance k laktóze a galaktosemie. Rysy:

• Obsahuje sojový proteinový izolát, aby se předešlo symptomům alergie nebo citlivosti na protein kravského mléka.

• Výživa neobsahuje laktózu, čímž se předejde průjmu spojeným s laktózou.

• Nízká osmolalita (240 mOsm/kg vody) redukuje nebezpečí osmotického průjmu.

• Duální sacharidy (z kukuřice a sacharóza), které se používají pro zvýšení absorpce sacharidů a omezení nebezpečí překročení absorpční kapacity poškozených střev.

• 1,8 mg železa (ve formě síranu železnatého) na 100 kalorií pomáhá předcházet nedostatečnosti železa.

• Obsahuje doporučenou dávku vitaminů a minerálů.

• Obsahuje rostlinné oleje, které poskytují doporučené množství podstatných mastných kyselin.

• Výživa má mléčně bílou barvu, konzistenci podobnou mléku a příjemné aroma.

Složky: (Pareve, ) 85 % vody, 4,9 % kukuřičného sirupu, 2,6 % cukru (sacharóza), 2,1 % sojový proteinový izolát, 1,4 % kokosový olej, 0,15 % citrát vápenatý, 0,11 % tribazický fosforečnan vápenatý, citrát draselný, monobazický fosforečnan draselný, chlorid draselný, mono- a diglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, L-methionin, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan draselný, chlorid sodný, cholinchlorid, taurine, síran železitý, m-inositol, alfatokoferylacetát, sulfát zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, «

0 0 0

0 0 0

0 0 0

112 kyselina folová, jodid draselný, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

B. Sojová výživa Isomyl® DF, která se aplikuje v případě průjmu

Použití: Vhodná pro krátkodobou aplikaci v případě průjmů u kojenců a batolat.

Rysy:

• První kojenecká výživa, která obsahuje přidanou vlákninu ze sóji a která se aplikuje specificky během průjmů.

• Na základě klinické studie se prokázalo, že redukuje trvání kašovité, vodnaté stolice během středně těžkých a těžkých stavů průjmu u kojenců.

• Uspokojuje nutriční potřeby kojenců.

• Sojový proteinový izolát s přidaným L-methioninem uspokojuje nebo překračuje požadavky kojenců na všechny podstatné aminokyseliny.

• Přípravek neobsahuje laktózu, čímž se předchází průjmům spojeným s laktózou.

• Nízká osmolalita (240 mOsm/kg vody) redukuje nebezpečí osmotického průjmu.

• Duální sacharidy (kukuřičný sirup a sacharóza), které se používají pro zvýšení absorpce sacharidů a omezení nebezpečí překročení absorpční kapacity poškozených střev.

• Splňuje nebo překračuje množství vitaminů a minerálů doporučených institucí Committee on Nutrition of the American Academy of Pediatrics.

• 1,8 mg železa (ve formě síranu železnatého) na 100 kalorií pomáhá předcházet nedostatečnosti železa.

• Obsahuje rostlinné oleje, které poskytují doporučené množství podstatných mastných kyselin.

Složky: (Pareve, ) 86 % vody, 4,8 % kukuřičného sirupu, 2,5 % cukru (sacharóza), 2,0 % sojový proteinový izolát, 2,1 % ·

113 sojového oleje, 1,4 % kokosový olej, 0,77 % sojové vlákniny,

0,12 % vápenatý, draselný, lecitin, citrát vápenatý, 0,11

0, 10 citrát draselný, chlorid draselný, monotribazický fosforečnan monobazický fosforečnan a diglyceridy, sojový karagen, kyselina askorbová, L-methionin, chlorid horečnatý, dibazický fosforečnan draselný, chlorid sodný, cholinchlorid, taurine, síran železitý, m-inositol, alfatokof erylacetát , síran zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, jodid draselný, fylochinon, biotin, selenít sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

C. Sojová výživa Isomil® SF se železem bez sacharózy

Použití: Jako nápoj pro kojence, dětí a dospělé s alergií nebo citlivostí na kravské mléko. Potrava pro pacienty s poruchami, kvůli, kterým nelze podávat laktózu: nedostatečnost laktázy, netolerance k laktóze a sacharózu.

Rysy:

• Obsahuje sojový proteinový izolát, aby se předešlo symptomům alergie nebo citlivosti na protein kravského mléka.

• Výživa neobsahuje laktózu, čímž se předejde průjmu spojeným s laktózou (zdroj sacharidů je Polycose® Glucose Polymers).

• Neobsahuje sacharózu, čímž je vhodná pro pacienty, kteří netolerují sacharózu.

• Nízká osmolaiita (180 mOsm/kg vody) redukuje nebezpečí osmotického průjmu.

• 1,8 mg železa (ve formě síranu železnatého) na 100 kalorií pomáhá předcházet nedostatečnosti železa.

• Obsahuje doporučenou dávku vitaminů a minerálů.

• Obsahuje rostlinné oleje, které poskytují doporučené množství podstatných mastných kyselin.

114 • Výživa má mléčně bílou barvu, konzistenci podobnou mléku a příjemné aroma.

Složky: (Pareve) 75 % vody, 11,8 % hydrolyzovaného kukuřičného škrobu, 4,1 % sojového oleje, 4,1 % sojový proteinový izolát, 2,8 % kokosový olej, 1,0 % modifikovaného kukuřičného škrobu,

0,38 tribazický fosforečnan vápenatý, 0,17 citrát draselný, 0,13 % chlorid draselný, mono- a diglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, L-methionin, chlorid hořečnatý, uhličitan vápenatý, chlorid sodný, cholinchlorid, taurine, síran železitý, m-inositol, alfa-tokoferylacetát, sulfát zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, jodid draselný, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

D. Sojová výživa Isomyl®20 se železem, (pro přímou konzumaci) 20 kalorií na 0,0284 1

Použití: v případě, že je nutná sojová výživa

Složky: (Pareve, ) 85 % vody, 4,9 % kukuřičného sirupu, 2,6 % cukru (sacharóza), proteinový izolát, vápenatý, 0,11 %

2,1 % sojového oleje, 1,9 % sojový

1,4 % kokosový- olej, 0,15 % citrát tribazický fosforečnan vápenatý, citrát draselný, monobazický fosforečnan draselný, chlorid draselný, mono- a diglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, L-methionin, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan draselný, chlorid sodný, cholinchlorid, taurine, síran železitý, m-inositol, alfa-tokoferylacetát, síran zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, jodid draselný, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

	115	•» ···« ♦ * ·· ·· * · • · ' ···· · ft * · • · · » · · · ·»·· • · · · ·*»·
E. Kojenecká	výživa Similac®
Použití: v	případě, že je potřeba	umělá kojenecká výživa:
jestliže je	nutné přerušit krmení	mateřským mlékem před

dosažením jednoho roku dítěte nebo jestliže je nutné doplnit kojení. Může se použít jako krmení, jestliže není možné krmení mateřským mlékem.

Rysy:

• Obsahuje protein vhodné kvality a množství zaručující dobrý růst. Protein je denaturován teplem, což redukuje nebezpečí krvácení v konečníku spojené s podáváním mléka.

• Obsahuje tuk ze směsi rostlinných olejů (dvakrát homogenizovaných), poskytuje kyselinu linolenovou, která je jednoduše absorbovatelná.

• Obsahuje sacharidy, jako je laktóza v poměru, který je podobný jako u lidského mléka.

• Nízký obsah renálních rozpuštěných látek, což minimalizuje stres vyvíjejících se orgánů.

• Existuje se ve formě prášku, koncentrovaného roztoku a ve formě vhodné pro přímé použití.

Složky: ( -D) voda, netučné mléko, laktóza, sojový olej, kokosový olej, mono- a diglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, cholinchlorid, tauríne, m-inosítol, alfatokoferylacetát, síran zinečnatý, niacinamid, síran železnatý, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitamínu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavín, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D3 a cyanokobalamin.

F. Kojenecká výživa pro předčasně narozené děti se železem Simílac®NeoCare

Použití: Vhodné pro předčasně narozené kojence, které vyžadují po propuštění z nemocnice speciální výživu. Similac NeoCare je nutričně kompletní výživa vyvinutá pro předčasně narozené

116 φφ φφφφ φφ φφ • · ^Λ φ · φ φ φφ· φ · φφ • φ * »· φφφφ kojence, která obsahuje další kalorie, protein, vitaminy a minerály potřebné pro vyvolání růstu a podporu vývoje.

Rysy:

• Redukuje potřebu kalorických a vitaminových doplňků. Ve srovnání s popsanou standardní výživou (20 kalorií na 0,0284 1) obsahuje více kalorií (22 kalorií na 0,0284 1).

• Obsahuje vysoce absorbovatelnou směs tuků s triglyceridy se středně dlouhými řetězci (MCT olej), které pomáhají uspokojit speciální trávicí potřeby předčasně narozených kojenců.

• Na 100 kalorií obsahuje vyšší množství proteinu, vitaminů a minerálů, aby se zvýšila počáteční dávka nutrientů podávaná v nemocnici.

• Obsahuje více vápníku a fosforu, což umožňuje mineralizaci kostí.

Složky: -D pevné částice kukuřičného sirupu, netučné mléko, laktóza, syrovátkový proteinový koncentrát, sojový olej, slunečnicový olej, frakcionovaný kokosový olej (triglyceridy se středně dlouhými řetězci), citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, uhličitan vápenatý, kyselina askorbová, chlorid hořečnatý, chlorid draselný, chlorid sodný, taurine, síran železitý, m-inositol, alfa-tokoferylacetát, síran zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, beta-karoten, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

G. Lidské mléko obohacené nízkým obsahem železa Similac Natural Care ve formě pro přímé použití, 24 kal. na 0,0284 1

Použití: Výrobek je určen pro smíchání s lidským mlékem nebo pro aplikaci, jako alternativa lidského mléka u kojenců s nízkou porodní hmotností.

• · • · · · • · ·

117

Složky: : -D voda, netučné mléko, hydrolyzovaný kukuřičný škrob, laktóza, syrovátkový proteinový koncentrát, sojový olej, slunečnicový olej, frakcionovaný kokosový olej (triglyceridy se středně dlouhými řetězci), kokosový olej, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, uhličitan vápenatý,mono- a diglyceridy, sojový lecitin,karagen, cholin chlorid, taurine, m-inositol, alfa-tokoferylacetát, síran zinečnatý, L-karnitin, chlorid draselný, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

Do těchto výživ je možné přidat PUFA podle vynálezu nebo je možné jimi nahradit některé složky uvedených výživ.

II. Výživné přípravky

A. ENSURE®

Použití: ENSURE je tekutá výživa obsahující malé množství zbytků připravená primárně jako orální nutriční doplněk, který se požívá s jídlem nebo mezi jednotlivými jídly nebo ve vhodném množství jako náhražka jídla. ENSURE neobsahuje laktózu a lepek a je vhodný pro použití při upravených dietách, jako jsou diety s nízkým obsahem cholesterolu. Ačkoli se primárně podává jako orální doplněk, může se aplikovat hadičkou.

Stav pacienta:

• Pacienti s upravenou dietou • Pacienti vysokého stáří se specifickými požadavky na potravu • Pacienti, kteří nedobrovolně ztrácí hmotnost • Pacienti po nemoci nebo po chirurgickém zákroku • Pacienti, kteří potřebují dietu s malým obsahem zbytků.

• · • · · · • *

118

Složky: -D voda, cukr (sacharóza), maltodextrin (kukuřičný), kaseinát vápenatý a sodný, slunečnicový olej, sojový proteinový izolát, sojový olej, kanolový olej, draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, citrát citrát sodný, umělé dibazický fosforečnan hořečnatý, chlorid hořečnatý, přísady, chlorid sodný, sojový lecitin, cholinchlorid, kyselina askorbová, karagen, síran zinečnatý, síran železnatý, alfa-tokoferylacetát, želatinová guma, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran hořečnatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, molybdát sodný, chlorid chrómu, biotin, jodid draselný, selenát sodný.

B. ENSURE®BARS

Použití: ENSURE BARS je celková, vyvážená výživa, která se používá jako doplněk mezi jednotlivými jídly nebo se podává s jídlem. Je lahodnou, nutričně bohatou alternativou jiných zákusků. ENSURE BAR obsahuje méně než 1 g laktózy v jedné tyčince (typ Chocolate Fudge Browníe neobsahuje lepek, typ Honey Graham Crunch obsahuje lepek).

Stav pacienta:

• Pacienti, kteří potřebují více kalorií, proteinů, vitaminů a minerálů.

• Zvláště vhodné pro lidi, kteří nepřijímají dostatek kalorií a nutrientů.

• Vhodné pro lidi, kteří jsou schopni žvýkat a polykat • Není vhodné pro lidi alergické na burské ořechy a jakoukoliv alergií na ořechy.

Složky:

Typ Honey Graham Crunch obsahuje kukuřičný sirup s vysokým obsahem fruktózy, sojový proteinový izolát, hnědý cukr, maltodextrin (kukuřičný), křupavá rýže (drcená rýže, cukr (sacharóza), sůl (chlorid sodný) a slad), ovesné otruby, • ·

119 částečně hydrogenované olej ze semen bavlníku a sojový olej, sojové polysacharidy, glycerin, syrovátkový proteinový koncentrát, polydextróza, fruktóza, kaseinát vápenatý, kakaový prášek, umělé příchutě, kanolový olej, slunečnicový olej, netučné sušené mléko, syrovátkový prášek, sojový lecitin, kukuřičný olej. Tyto tyčinky se vyrábějí v továrnách, kde se zpracovávají ořechy.

Vitamíny a minerály:

Tribazický fosforečnan vápenatý, dibazický fosforečnan draselný, oxid hořečnatý, sůl (chlorid sodný) , chlorid draselný, kyselina askorbová, fosforečnan železitý, alfatokoferylacetát, niacinamid, oxid zinečnatý, pantotenát vápenatý, glukonát mědňatý, síran manganatý, riboflavin, betakaroten, pyridoxinhydrochlorid, dusičan thiaminu, kyselina folová, biotin, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, molybdenan sodný, fylochinon, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

Protein:

Typ Honey Graham Crunch : Zdroj proteinů je směs sojového proteinového izolátu a mléčných proteinů.

Sojový proteinový izolát 74 %

Mléčné proteiny 26 %

Tuk:

Typ Honey Graham Crunch : Zdroj tuku je směs částečně hydrogenovaného oleje sóji a semen bavlníku, slunečnicového a kukuřičného oleje a sojového lecitinu.

Částečně hydrogenovaný olej sóji a semen bavlníku76 % slunečnicový olej 8 % olej kanoly 8 % kukuřičný olej 4 % sojový lecitin 4 % • · • ·

120

Sacharidy:

Typ Honey Graham Crunch : Zdroj sacharidů je kombinace kukuřičného sirupu s vysokým obsahem fruktózy, hnědý cukr, maltodextrin, med, křupavá rýže, glycerin, sojové polysacharidy a ovesné otruby.

kukuřičný sirup s vysokým obsahem fruktózy 24 % hnědý cukr 21 % maltodextrin 12 % med 11 % křupavá rýže 9 % glycerin 9 % sojový polysacharid 7 % ovesné otruby 7 %

C. ENSURE® HIGH PROTEIN

Použití: ENSURE® HIGH PROTEIN je koncentrovaná výživa v kapalném stavu s vysokým obsahem proteinů určená pro lidi, kteří vyžadují nadbytečný přísun kalorií, proteinu, vitaminů a minerálů. Může se aplikovat orálně, jako nutriční doplněk mezi jednotlivými jídly nebo se podává s jídlem. V určitém množství může nahradit jídlo. ENSURE® HIGH PROTEIN neobsahuje laktózu ani lepek a je vhodný pro aplikaci lidem po operaci, po zlomeninách krčku a pacientům, kde je nebezpečí vředů.

Stav pacienta:

• Přípravek je vhodný pro pacienta, který potřebuje větší přísun kalorií, proteinu, vitamínů, minerálů, jako jsou pacienti po chirurgickém zákroku nebo fraktuře krčku, pacienti trpícími tlakovými vředy a pacienti, kde se aplikuje dieta s nízkým obsahem cholesterolu.

Rysy:

• Nízký obsah nasycených tuků • Obsahuje 6 g celkového tuku a méně než 5 mg cholesterolu na jedno balení

9

121 • Bohatá a jemná chuť • Skvělý zdroj proteinů, vápníku a jiných podstatných vitamínů a minerálů • Vhodné při dietě s nízkým obsahem cholesterolu • Neobsahuje laktózu, snadno se tráví.

Složky:

Typ Vanilla Supreme: - -D voda, cukr (sacharóza), maltodextrin (kukuřičný), kaseinát vápenatý a sodný, slunečnicový olej, sojový proteinový izolát, sojový olej, kanolový olej, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, citrát sodný, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan hořečnatý, umělé přísady, chlorid sodný, sojový lecitin, cholinchlorid, kyselina askorbová, karagen, síran zinečnatý, síran železnatý, alfa-tokoferylacetát, želatinová guma, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, molybdát sodný, chlorid chrómu, biotin, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdroj proteinů je směs proteinů: kasein a sója. Kaseinát sodný a vápenatý Sojový proteinový izolát dvou vysoce biologicky hodnotných

Tuk:

Zdrojem tuku je směs tří olejů: slunečnicový olej, olej kanoly a sojový olej.

Slunečnicový olej 40 %

Olej kanoly 30 %

Sojový olej 30 %

122

Množství tuku v přípravku ENSURE® HIGH PROTEIN splňuje požadavky American Heart Association (AHA). 6 gramů tuku v přípravku ENSURE® HIGH PROTEIN reprezentuje 24 % celkového množství kalorií, přičemž 2,6 % tuku pochází z nasycených mastných kyselin a 7,9 % je z poly-nenasycených mastných kyselin. Tyto hodnoty splňují požadavky AHA, což znamená méně jak 30 % kalorií pochází z tuku, méně než 10 % kalorií pochází ze saturovaných mastných kyselin a méně než 10 % kalorií pochází z polynenasycených mastných kyselin.

Sacharidy:

Přípravek ENSURE® HIGH PROTEIN obsahuje kombinaci maltodextrinu a sacharózy. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová, divokých bobulovin a banánu) plus VARI-FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková a jiné nečokoládové příchutě obsahují:

Sacharóza 60 %

Maltodextrin 40 %

Čokoládová příchuť obsahuje:

Sacharóza 70 %

Maltodextrin 30 %

D. ENSURE®LIGHT

Použití: Přípravek ENSURE LIGHT je výživa v kapalné formě obsahující malé množství tuků. Používá se jako orální nutriční doplněk podávaný mezi jednotlivými jídly nebo s jídly. Přípravek ENSURE LIGHT neobsahuje laktózu a lepek a je vhodný pro použití při upravené dietě, která zahrnuje diety s nízkým obsahem cholesterolu.

Stav pacientů:

• · • · • Je vhodný pro pacienty s normální hmotností a pacienty s nadváhou, které potřebují živiny navíc. Podává se ve formě doplňku, který obsahuje o 50 % méně tuku a o 20 % méně kalorií, než obsahuje přípravek ENSURE.

• Pro zdravé dospělé jedince, kteří se nestravují správným způsobem a potřebují výživu navíc.

Rysy:

• Obsahuje malé množství tuků a nasycených tuků.

• Obsahuje 3 g celkového tuku a méně než 5 mg cholesterolu • Přípravek má bohatou jemnou chuť • Je to skvělý zdroj vápníku a jiných podstatných vitamínů a minerálů • Přípravek je vhodný pro dietu s nízkým obsahem cholesterolu • Přípravek neobsahuje laktózu a snadno se tráví.

Složení:

Typ French Vanilla: - -D voda, cukr (sacharóza), maltodextrin (kukuřičný), kaseinát vápenatý a sodný, slunečnicový olej, sojový proteinový izolát, sojový olej, kanolový olej, chlorid hořečnatý, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, citrát sodný, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan hořečnatý, přirozené a umělé přísady, celulóza, gel, cholinchlorid, sojový lecitin, chlorid sodný, kyselina askorbová, karagen, celulózová guma, síran železnatý, alfatokoferylacetát,síran zinečnatý, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, molybdát sodný, chlorid chrómu, biotin, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

• · • ·

124

Zdrojem proteinu Kaseinát vápenatý je kaseinát vápenatý.

100 %

Tuk:

Zdrojem proteinu je směs dvou olejů: slunečnicového oleje a oleje kanoly.

Slunečnicový olej 70 %

Olej kanoly 30 %

Množství tuku v přípravku ENSURE LIGHT splňuje požadavky American Heart Association (AHA). 3 gramy tuku v přípravku

ENSURE LIGHT reprezentuje 13,5 % celkového množství kalorií, přičemž 1,4 % tuku je z nasycených mastných kyselina 2,6 % z poly-nenasycených mastných kyselin. Tyto hodnoty jsou v souladu s požadavky AHA, kdy méně než 30 % kalorií je z tuku a méně než 10 % kalorií pochází z nasycených mastných kyselin a méně než 10 % celkového množství kalorií pochází z polynenasycených mastných kyselin.

Sacharidy:

Přípravek ENSURE LIGHT obsahuje kombinace maltodextrinu a sacharózy. Čokoládová příchuť obsahuje také kukuřičný sirup. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová, jahodová) plus VARI-FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková a jiné nečokoládové příchutě obsahují: Sacharóza 51 %

Maltodextrin 49 %

Čokoládová příchuť obsahuje: Sacharóza Kukuřičný sirup Maltodextrin % 26,5 % 26,5 % • · • ·

125

Vitamíny a minerály

Jedno balení (0,2272 1) ENSURE LIGHT poskytuje alespoň 25 %

RDI pro 24 klíčových vitamínů a minerálů.

Kofein:

Čokoládová příchuť obsahuje 2,1 mg kofeinu na 0,2272 1.

E. ENSURE PLUS®

Použití: přípravek ENSURE PLUS je vysokokalorická výživa v kapalné formě s nízkým obsahem zbytků. Používá se tam, kde je třeba dodat navíc kalorie a nutrienty, ale normální koncentraci proteinů. Přípravek slouží primárně jako orální nutriční doplněk, který se použije mezi jednotlivým jídlem nebo v přijatelném množství jako náhražka jídla. Přípravek ENSURE PLUS neobsahuje laktózu ani lepek. Ačkoli se přípravek primárně aplikuje orálně, může se zavádět i hadičkou.

Stav pacienta:

• Přípravek je vhodný pro pacienty, kteří vyžadují v omezeném objemu navíc kalorie a nutrienty, ale normální koncentraci proteinu • Přípravek je vhodný pro pacienty, kteří potřebují dosáhnout a udržet normální hmotnost.

Rysy:

• Bohatá a lahodná chuť • Dobrý zdroj podstatných vitamínů a minerálů

Složení:

Typ Vanilla: - -D voda, kukuřičný sirup, maltodextrin (kukuřičný), cukr (sacharóza), kukuřičný olej, kaseinát vápenatý a sodný, slunečnicový olej, sojový proteinový izolát, chlorid hořečnatý, citrát draselný, tribazický fosforečnan

126 vápenatý, sojový lecitin, přirozené a umělé příchutě, citrát sodný, chlorid draselný, cholinchlorid, kyselina askorbová, karagen, síran zinečnatý, síran mědňatý, síran železitý, alfatokoferylacetát, síran zinečnatý, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, molybdát sodný, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdrojem proteinu jsou proteiny: kasein a sója Kaseinát vápenatý a sodný Sojový proteinový izolát dva vysoce biologicky hodnotné %

%

Tuk:

Zdrojem tuku je kukuřičný olej

Kukuřičný olej 100 %

Sacharidy:

Přípravek ENSURE PLUS obsahuje kombinaci maltodextrinu a sacharózy. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová, jahodová-kávová, máslo burských oříšků a vaječný koňak) plus VARI-FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková, jahodová, kávová příchuť a příchuť másla burských oříšků obsahují:

Sacharóza 23 %

Maltodextrin 38 %

Kukuřičný sirup 39 %

Čokoládová příchuť a příchuť vaječného koňaku obsahují:

• · • · · · · • · · ·

127

Sacharóza Kukuřičný sirup Maltodextrin • · · « 9 · ······ · · · < · · %

% %

Vitamíny a minerály

Jedno balení (0,2272 1) ENSURE LIGHT poskytuje alespoň 15 %

RDI pro 25 klíčových vitamínů a minerálů.

Kofein:

Čokoládová příchuť obsahuje 3,1 mg kofeinu na 0,2272 1 a kávová příchuť obsahuje stopové množství kofeinu.

F. ENSURE PLUS®HN

Použití: Přípravek ENSURE PLUS HN je nutričně kompletní výživa v kapalinové formě s vysokým obsahem kalorií a dusíku vhodná pro lidi, které vyžadují přísun velkého množství kalorií a proteinu a mají omezenou toleranci na objem potravy. Mohou se aplikovat orálně nebo se zavádějí hadičkou. Přípravek neobsahuje laktózu ani lepek.

Stav pacienta:

• Vhodné pro pacienty se zvýšenou potřebou kalorií a proteinů, kteří jsou například po chirurgickém zákroku nebo poranění.

• Vhodné pro pacienty s omezenou tolerancí na objem a s časným pocitem sytosti.

Rysy:

• Přípravek je vhodný jako nutriční doplněk i jako celková výživa.

• Přípravek je vhodný pro orální aplikaci i pro zavádění hadičkou.

• 1,5 CaVml • Vysoký obsah dusíku.

128 • · · · · ···· ··»··· ·· » « · · · · ··

Vysoká hustota kalorií.

Složky:

Typ Vanila:

-D voda, maltodextrin (kukuřičný), kukuřičný olej, kaseinát vápenatý a sodný, cukr (sacharóza), sojový proteinový izolát, chlorid hořečnatý, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, sojový lecitin, přirozené a cholinchlorid, kyselina síran zinečnatý, síran niacinamid, karagen, železitý, pantotenát umělé příchutě, citrát sodný, askorbová, taurin, L-karnitin, alfa-tokoferylacetát, vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, palmitat vitaminu A, kyselina folová, biotin, molybdát sodný, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

G. ENSURE® POWDER

Použití: Přípravek ENSURE POWDER (rozpuštěný ve vodě) je výživa v kapalinové formě s nízkým obsahem zbytků určená pro aplikaci primárně jako orální nutriční doplněk, který se používá mezi jednotlivými jídly nebo s nimi. Uvedený přípravek neobsahuje laktózu ani lepek a je vhodný při upravených dietách zahrnujících diety s nízkým obsahem cholesterolu.

Stav pacienta:

• Přípravek je vhodný pro pacienty se zvláštní dietou.

• Přípravek je vhodný pro staré pacienty, kde existuje nebezpečí spojené s výživou.

• Přípravek je vhodný pro pacienty, kteří se zotavují z nemoci nebo z chirurgického zákroku.

• Přípravek je vhodný pro pacienty, kteří potřebují dietu s nízkým obsahem zbytků.

Rysy:

»· ·· ·« ·· • < · · » * * · • · · · · · » • ·

129 * · · · · ·»»·»· ·· ·«»· • Přípravek je příjemný, snadno se rozmíchá.

• Obsahuje malé množství nasyceného tuku.

• V jednom balení přípravek obsahuje 9g celkového tuku a méně než 5 mg cholesterolu.

• Přípravek obsahuje vysoký obsah vitamínů a minerálů.

• Přípravek je vhodný při dietě s nízkým obsahem cholesterolu.

• Přípravek neobsahuje laktózu a snadno se tráví.

Složení: - -D kukuřičný sirup, maltodextrin (kukuřičný), kukuřičný olej, kaseinát vápenatý a sodný, cukr (sacharóza), sojový proteinový izolát, umělé příchutě, chlorid hořečnatý, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, chlorid draselný, sojový lecitin, citrát sodný, cholinchlorid, kyselina askorbová, síran zinečnatý, síran železitý, taurin, L-karnitin, alfa-tokoferylacetát, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, palmitat vitaminu A, kyselina folová, biotin, molybdát sodný, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdroj proteinu je směs dvou vysoce biologicky hodnotných proteinů: kaseinu a sóji.

Kaseinát sodný a vápenatý 84 %

Sojový proteinový izolát 16 %

Tuk:

Zdrojem tuku je kukuřičný olej.

Kukuřičný olej 100 %

Sacharidy:

Přípravek ENSURE POWDER obsahuje kombinaci kukuřičného sirupu, maltodextrinu a sacharózy. Střední sladkost plus VARI-

130	···· * « í • · · · * ·	·· ·( « · · · · • * · · * · · «
FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně,	j ahody,	citrón a
pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.
Vanilková příchuť obsahuje:
Sacharóza	30 %
Maltodextrin	35 %
Kukuřičný sirup	35 %
H. ENSURE® PUDDING
Použití: Přípravek ENSURE PUDDING je	nutriční	doplněk
s vysokou hustotou nutrientů poskytující	vyváženou výživu

v nekapalné formě. Používá se mezi jednotlivými jídly a spolu s nimi. Je vhodný pro výživu s upravenou konzistencí (například jemná, rozmělněná nebo zcela kapalná strava) nebo pro lidi s poruchami polykání. Uvedený přípravek neobsahuje lepek.

Stav pacienta:

• Přípravek je vhodný pro pacienty s dietou s upravenou konzistencí (například jemná, rozmělněná nebo zcela kapalná dieta).

• Vhodné pro pacienty s poruchami polykání.

Rysy:

• Bohatá a jemná, dobrá chuť.

• Dobrý zdroj podstatných vitamínů a minerálů. Nesmí se skladovat v chladničkách.

• Neobsahuje lepek.

Nutriční profil pro objem 0,142 ml: 250 kalorií, 10,9 % proteinů, celkový obsah tuků je 34,9 %, 54,2 % sacharidů.

Složení: : - -D netučné mléko, voda, cukr (sacharóza), částečně hydrogenovaný sojový olej, upravený potravinářský • ·

131 škrob, síran horečnatý, stearoyllaktylát sodný, dibazický fosforečnan sodný, umělé příchutě, kyselina askorbová, síran zinečnatý, síran železitý, alfa-tokoferylacetát, cholinchlorid, niacinamid, síran manganatý, pantotenát vápenatý, citrát draselný, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, FD&C žlutá #6, kyselina folová, biotin, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdrojem proteinu je netučné mléko.

Netučné mléko 100 %

Tuk:

Zdrojem tuku je hydrogenovaný sojový olej.

Hydrogenovaný sojový olej 100 %

Sacharidy:

Přípravek ENSURE PUDDING obsahuje kombinaci sacharózy a upraveného potravinářského škrobu. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová, skotské a ságová pomáhá předcházet nepříznivé chuti. Produkt obsahuje 9,2 gramů laktózy na každé balení.

Vanilková a jiné nečokoládové Sacharóza

Laktóza

Upravený potravinářský škrob

Čokoládová příchuť

Sacharóza

Laktóza

Upravený potravinářský škrob příchuti obsahují:

% %

% %

% %

«· · · ·· ·· • · · · · ·· · • · · · · · ·

132

I. ENSURE® WITH FIBER

Použití: Přípravek ENSURE® WITH FIBER je nutričně úplná výživa v kapalné formě, obsahující vlákninu určená pro lidi, pro něž je výhodná aplikace diety s vyšším obsahem vlákniny a nutrientů. Uvedený výrobek je vhodný pro lidi, které nevyžadují dietu s nízkým obsahem zbytků. Může se aplikovat orálně nebo se zavádí trubičkou. Výrobek se může použít jako nutriční doplněk normální stravy nebo ve vhodném množství jako její náhrada. Výrobek neobsahuje laktózu ani lepek a je vhodný pro použití při upravených dietách, které zahrnují také dietu s nízkým obsahem cholesterolu.

Stav pacienta:

• Pacient, pro něhož je výhodná dieta s vyšším obsahem vlákniny a nutrientů.

Rysy:

• Nový progresivní výrobek s nízkým obsahem nasycených tuků, s vyšším obsahem vitamínů a minerálů • V jednom balení obsahuje 6 g celkového tuku a méně než 5 mg cholesterolu.

• Má bohatou a jemnou chuť.

• Dobrý zdroj vlákniny.

• Výborný zdroj podstatných vitamínů a minerálů.

• Vhodný pro dietu s nízkým obsahem cholesterolu.

• Neobsahuje laktózu ani lepek.

Složení:

Typ Vanilla: - -D voda, maltodextrin (kukuřičný), cukr (sacharóza), kukuřičný olej, kaseinát vápenatý a sodný, ovesná vláknina, slunečnicový olej, olej kanola, sojový proteinový izolát, kukuřičný olej, sojová vláknina, tribazický fosforečnan vápenatý, chlorid hořečnatý, citrát draselný, • · • · · ·

	133	• ·	• · · · · · ·
citrát draselný,	celulózový gel,	dibazický	fosforečnan
draselný, citrát	sodný,	přirozené	a umělé	příchutě,
cholinchlorid, fosforečnan	hořečnatý,	kyselina	askorbová,

celulózová guma, chlorid draselný, karagen, síran železitý, alfa-tokoferylacetát, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, biotin, molybdát sodný, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdrojem proteinu je směs dvou vysoce biologicky hodnotných proteinů: kaseinů a sóji.

Kaseinát sodný a vápenatý Sojový proteinový izolát	80 % 20 %
Tuk:
Zdroj tuku je směs tří olejů: slunečnicový olej,	olej kanoly a
kukuřičný olej.
Slunenčnicový olej	40 %
Olej kanoly	40 %
Kukuřičný olej	20 %
Množství tuku v přípravku ENSURE WITH	FIBER splňuje
požadavky American Heart Association (AHA).	6 gramů tuku
uvedeného výrobku reprezentuje 22 % celkového množství

kalorií, 2,01 % je tuk pocházející z nasycených mastných kyselin a 6,7 % pochází z poly-nenasycených mastných kyselin. Tyto hodnoty jsou v souladu s požadavky AHA, kdy méně než 30 % celkového množství kalorií pochází z tuku, méně než 10 % kalorií pochází z nasycených mastných kyselin a méně než 10 % celkového množství kalorií pochází z poly-nenasycených mastných kyselin.

• · • · • · ♦ « · · · · • · · 4 · · ·

134

Sacharidy:

Přípravek ENSURE WITH FIBER obsahuje kombinaci maltodextrinu a sacharózy. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová a pekanové máslo) plus VARI-FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková a jiné nečokoládové příchutě

Sacharóza 25 %

Maltodextrin 66 %

Ovesná vláknina 7 %

Sojová vláknina 2 %

Čokoládová příchuť

Sacharóza 36 %

Maltodextrin 55 %

Ovesná vláknina 7 %

Sojová vláknina 2 %

Vláknina:

Směs vlákniny obsažené v přípravku ENSURE WITH FIBER obsahuje ovesnou vlákninu a sojový polysacharid. Výsledkem této směsi je, že jedno balení o objemu 0,22721 obsahuje přibližně 4 gramy celkové vlákniny. Poměr nerozpustné a rozpustné vlákniny je 95:5.

PUFA podle vynálezu mohou nahradit a/nebo doplnit různé nutriční doplňky popsané shora v textu.

J. Výživný produkt Oxepa™

Oxepa je enterální nutriční produkt s nízkým obsahem cukrů s vysokou kalorickou hustotou vhodný pro aplikaci pacientům které trpí ARDS a nebo jsou v ohrožení ARDS. Výrobek má jedinečnou kombinaci ingrediencí zahrnující patentovanou směs olejů obsahující ikosapentanovou kyselinu (EPA z rybího • · • ·

135 • · · · · · «· · · · · ·· ·· oleje), kyselinu γ-linolenovou (GLA pocházející z oleje brutnáku lékařského) a zvýšené množství antioxidantů.

Rozdělení kalorií:

• Kalorická hustota je vysoká 1,5 kal/ml (355 kal/8 fl.oz.), což minimalizuje objem nutný pro uspokojení nároků na energii.

• Rozdělení kalorií v produktu Oxepa je zobrazeno v tabulce č.

.

Tabulka č. 7: Rozdělení kalorií v produktu Oxepa

	na 8 fl. oz.	na litr	% kal.
Kalorie	355	1 500	-
Tuk (g)	22,2	93,7	55,2
Sacharidy (g)	25	105,5	28,1
Protein (g)	14,8	62,5	16,7
Voda (g)	186	785	—

Tuk:

• Produkt Oxepa obsahuje 22,2 g tuku na jedno balení o objemu 8 fl. oz. (93,7 g/l).

• Zdroj tuku je směs olejů, která obsahuje 31,8 % oleje kanoly, 25 % triglyceridů se středně dlouhým řetězcem (MOT), 20 % oleje brutnáku lékařského, 20 % rybího oleje a 3,2 % sojového lecitinu. Typický profil mastných kyselin produktu Oxepa je uveden v tabulce č. 8.

• Produkt Oxepa poskytuje vyvážené množství poly-nenasycených, mono-nenasycených a nasycených mastných kyselin, jak se uvádí v tabulce č. 10.

• Triglyceridy se středně dlouhým řetězcem (MTC), které tvoří % směsi, umožňují vyprázdnění gastrického traktu , protože se absorbují ve střevním traktu, aniž se emulzifikují kyselinou žlučovou.

136 • · · · · · ·· ·· ·· ··· · · · · · ···· · · · · • ···· ··· • · · · · ···· ····«·· ·· »··· «· ··

PUFA podle vynálezu mohou nahrazovat nebo doplňovat různé komponenty mastných kyselin nutričního produktu Oxepa.

Tabulka č. 8: Typický profil mastných kyselin

	% z celkového množství mastných kyselin	g/8 fl. oz.*	g/1*
Kyselina kapronová (6:0)	0,2	0, 04	0,18
Kyselina kaprylová (8:0)	14,69	3,1	13, 07
Kyselina kaprová (10:0)	11,06	2,33	9,87
Kyselina palmitová (16:0)	5,59	1,18	4,98
Kyselina palmitolejová (16:ln-7)	1,82	0,38	1, 62
Kyselina stearová (18:0)	1,84	0,39	1,64
Kyselina olejová (18:ln-9)	24,44	5,16	21,75
Kyselina linolová	16, 28	3,44	14,49
Kyselina a-linolová (18:3n-3)	3,47	0,73	3,09
Kyselina γ-linolová (18:3n-6)	4,82	1,02	4,29
Kyselina ikosapentanová (20:5n-3)	5,11	1,08	4,55
n-3- dokosapentanová (22:5n-3)	0,55	0,12	0,49
Kyselina Dokosahexanová (22:6n-3)	2,27	0,48	2,02
Jiné kyseliny	7,55	1,52	6, 72

*mastné kyseliny odpovídají přibližně 95 % celkového tuku

Tabulka č. 9: Profil tuk produktu Oxepa • · • ·

% celkových kalorií z tuku	55,2
Polynenasycené mastné kyseliny	31,44 g/1
Mononenasycené mastné kyseliny	25,53 g/1
Nasycené mastné kyseliny	32,38 g/1
Poměr n-6 ku n-3	1,75 : 1
Cholesterol	9,49 mg/8 fl.oz. 40,1 mg/1

Sacharidy:

• Obsah sacharidů je 25,0 g na 8 fl.oz. (105,5 g/1).

• Zdroje sacharidů jsou 45 % maltodextrinu (komplexní sacharid) a 55 % sacharózy (jednoduchý cukr). Oba sacharidy se jednoduše tráví a absorbují.

• Produkt Oxepa obsahuje vysoký obsah tuku a nízký obsah sacharidů, což minimalizuje tvorbu oxidu uhličitého (C0₂) . Vysoký obsah oxidu uhličitého může komplikovat odstavení pacientů, kteří jsou závislí na umělém dýchání. Nízký obsah sacharidů je také vhodný pro pacienty, u kterých může dojít k hyperglykémii vyvolané stresem.

• Produkt Oxepa neobsahuje laktózu.

Sacharidy, aminokyseliny proteinů a glycerolové části tuků se mohou v těle přeměnit na glukózu. Prostřednictvím tohoto procesu se uspokojují požadavky na cukry tkáně závislé na glukóze (jako je centrální nervový systém nebo buňky krve). Avšak potrava bez sacharidů může způsobit ketózu, což je nadměrný katabolizmus tkáňových proteinů a ztrátu tělních tekutin a elektrolytů. Těmto účinkům se dá předcházet, jestliže se požije denně 50 až 100 g stravitelných sacharidů, v případě, že je adekvátní kalorický příjem. Množství sacharidů v produktu Oxepa je také dostatečný pro minimalizaci glukoneogeneze, jestliže je uspokojena potřeba energie.

Protein:

• · · « ·« • · « ···· ··· ··«· · · · · · »

138 .· • Oxepa obsahuje 14,8 g proteinu na jedno balení o objemu 8 fl. oz. (62,5 g/1).

• Poměr celkového množství kalorií/obsahu dusíku (150:1) uspokojuje potřeby stresovaných pacientů.

• Oxepa poskytuje dostatek proteinu, aby způsobila anabolizmus a udržení nízké tělesné hmotnosti, aniž dojde respiračním problémům. Vysoký příjem proteinů se předpokládá u pacientů s respirační nedostatečností. Ačkoli proteiny mají malý účinek na produkci C02, dieta s vysokým obsahem proteinů napomáhá dýchání.

• Jako zdroj proteinů v produktu Oxepa se využívá 86,8 % kaseinátu sodného a 13,2 % kaseinátu vápenatého.

• Jak se uvádí v tabulce 11, profil aminokyselin proteinového systému v produktu Oxepa vyhovuje standardům v případě proteinů vysoké kvality, které vytvořila instituce National Academy of Sciences.

• Produkt Oxepa neobsahuje lepek.

• · • · «··· « v ·· • · · ···· · ···· · · · ·

139 · ···. ·

Sekvenční protokol (2) Informace o SEQ ID NO: <5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: :	1617 párů	baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH	MOLEKULY	: DNA (genomová)
(xi)	i Popis	; sekvence: SEQ ID	NO: 1 :
CGACACTCCT	TCCTTCTTCT	CACCCGTCCT	AGTCCCCTTC	AACCCCCCTC	TTTGACAAAG	60
ACAACAAACC	ATGGCTGCTG	CTCCCAGTGT	GAGGACGTTT	ACTCGGGCCG	AGGTTTTGAA	120
TGCCGAGGCT	CTGAATGAGG	GCAAGAAGGA	TGCCGAGGCA	CCCTTCTTGA	TGATCATCGA	180
CAACAAGGTG	TACGATGTCC	GCGAGTTCGT	CCCTGATCAT	CCCGGTGGAA	GTGTGATTCT	240
CACGCACGTT	GGCAAGGACG	GCACTGACGT	CTTTGACACT	TTTCACCCCG	AGGCTGCTTG	300
GGAGACTCTT	GCCAACTTTT	ACGTTGGTGA	TATTGACGAG	AGCGACCGCG	ATATCAAGAA	360
TGATGACTTT	GCGGCCGAGG	TCCGCAAGCT	GCGTACCTTG	TTCCAGTCTC	TTGGTTACTA	420
CGATTCTTCC	AAGGCATACT	ACGCCTTCAA	GGTCTCGTTC	AACCTCTGCA	TCTGGGGTTT	480
GTCGACGGTC	ATTGTGGCCA	AGTGGGGCCA	GACCTCGACC	CTCGCCAACG	TGCTCTCGGC	540
TGCGCTTTTG	GGTCTGTTCT	GGCAGCAGTG	CGGATGGTTG	GCTCACGACT	TTTTGCATCA	600
CCAGGTCTTC	CAGGACCGTT	TCTGGGGTGA	TCTTTTCGGC	GCCTTCTTGG	GAGGTGTCTG	660
CCAGGGCTTC	TCGTCCTCGT	GGTGGAAGGA	CAAGCACAAC	ACTCACCACG	CCGCCCCCAA	720
CGTCCACGGC	GAGGATCCCG	ACATTGACAC	CCACCCTCTG	TTGACCTGGA	GTGAGCATGC	780
GTTGGAGATG	TTCTCGGATG	TCCCAGATGA	GGAGCTGACC	CGCATGTGGT	CGCGTTTCAT	840
GGTCCTGAAC	CAGACCTGGT	TTTACTTCCC	CATTCTCTCG	TTTGCCCGTC	TCTCCTGGTG	900
CCTCCAGTCC	attctctttg	TGCTGCCTAA	CGGTCAGGCC	CACAAGCCCT	CGGGCGCGCG	960
TGTGCCCATC	TCGTTGGTCG	AGCAGCTGTC	GCTTGCGATG	CACTGGACCT	GGTACCTCGC	1.020
CACCATGTTC	CTGTTCATCA	AGGATCCCGT	CAACATGCTG	GTGTACTTTT	TGGTGTCGCA	1080
GGCGGTGTGC	GGAAACTTGT	TGGCGATCGT	GTTCTCGCTC	AACCACAACG	GTATGCCTGT	1140
GATCTCGAAG	GAGGAGGCGG	TCGATATGGA	TTTCTTCACG	AAGCAGATCA	TCACGGGTCG	1200
TGATGTČCAC	CCGGGTCTAT	TTGCCAACTG	GTTCACGGGT	GGATTGAACT	ATCAGATCGA	1260
GCACCACTTG	TTCCCTTCGA	TGCCTCGCCA	CAACTTTTCA	AAGATCCAGC	CTGCTGTCGA	1320
GACCCTGTGC	AAAAAGTACA	ATGTCCGATA	CCACACCACC	GGTATGATCG	AGGGAACTGC	1380
AGAGGTCTTT	AGCCGTCTGA	ACGAGGTCTC	CAAGGCTGCC	TCCAAGATGG	GTAAGGCGCA	1440

• ·

GTAAAAAAAA AAACAAGGAC GTTTTTTTTC GCCAGTGCCT GTGCCTGTGC CTGCTTCCCT 1500 TGTCAAGTCG AGCGTTTCTG GAAAGGATCG TTCAGTGCAG TATCATCATT CTCCTTTTAC 1560 CCCCCGCTCA TATCTCATTC ATTTCTCTTA TTAAACAACT TGTTCCCCCC TTCACCG 1617 (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 457 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní

(D)

TOPOLOGIE: lineární

(li)

DRUH MOLEKULY:

peptid

(xi)

Popis sekvence

: SEQ ID NO:

2:

Met

Ala

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Arg

Thr

Phe

Thr

Arg

Ala

Glu

Val

Leu

1

5

10

15

Asn

Ala

Glu

Ala

Leu

Asn

Glu

Gly

Lys

Lys

Asp

Ala

Glu

Ala

Pro

Phe

20

25

30

Leu

Met

Ile

Ile

Asp

Asn

Lys

Val

Tyr

Asp

Val

Arg

Glu

Phe

Val

Pro

35

40

45

Asp

His

Pro

Gly

Gly

Ser

Val

Ile

Leu

Thr

His

Val

Gly

Lys

Asp

Gly

50

55

60

Thr

Asp

Val

Phe

Asp

Thr

Phe

His

Pro

Glu

Ala

Ala

Trp

Glu

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Asn

Phe

Tyr

Val

Gly

Asp

Ile

Asp

Glu

Ser

Asp

Arg

Asp

Ile

Lys

85

90

95

Asn

Asp

Asp

Phe

Ala

Ala

Glu

Val

Arg

Lys

Leu

Arg

Thr

Leu

Phe

Gin

100

105

110

Ser

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Asp

Ser

Ser

Lys

Ala

Tyr

Tyr

Ala

Phe

Lys

Val

115

120

125

Ser

Phe

Asn

Leu

Cys

Ile

Trp

Gly

Leu

Ser

Thr

Val

Ile

Val

Ala

Lys

130

135

140

Trp

Gly

Gin

Thr

Ser

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Leu

Ser

Ala

Ala

Leu

Leu

145

150

155

160

Gly

Leu

Phe

Trp

Gin

Gin

Cys

Gly

Trp

Leu

Ala

His

Asp

Phe

Leu

His

165

170

175

His

Gin

Val

Phe

Gin

Asp

Arg

Phe

Trp

Gly

Asp

Leu

Phe

Gly

Ala

Phe

180

185

190

Leu

Gly

Gly

Val

Cys

Gin

Gly

Phe

Ser

Ser

Ser

Trp

Trp

Lys

Asp

Lys

195

200

205

His

Asn

Thr

His

His

Ala

Ala

Pro

Asn

Val

His

Gly

Glu

Asp

Pro

Asp

210

215

220

Ile

Asp

Thr

His

Pro

Leu

Leu

Thr

Trp

Ser

Glu

His

Ala

Leu

i Glu

. Met

225

230

235

240

Phe

Ser

Asp

Val

Pro

Asp

Glu

Glu

Leu

Thr

Arg

Met

Trp

Ser

Arg

Phe

245

250

255

• ·

I · · « · « · • · · ·

Met Val

Leu

Asn 260

Gin Thr

141

Pro

• Ile

• Leu

• Ser 270

• · • · Phe

• • · · · Ala

Trp

Phe

Tyr 265

Phe

Arg Leu

Ser 275

Trp

Cys Leu

Gin

Ser 280

Ile

Leu

Phe

Val

Leu 285

Pro

Asn

Gly

Gin Ala 290

His

Lys

Pro Ser

Gly 295

Ala

Arg

Val

Pro

Ile 300

Ser

Leu

Val

Glu

Gin Leu 305

Ser

Leu

Ala Met 310

His

Trp

Thr

Trp

Tyr 315

Leu

Ala

Thr

Met

Phe 320

Leu Phe

Ile

Lys

Asp Pro 325

Val

Asn

Met

Leu 330

Val

Tyr

Phe

Leu

Val 335

Ser

Gin Ala

Val

Cys 340

Gly Asn

Leu

Leu

Ala 345

Ile

Val

Phe

Ser

Leu 350

Asn

His

Asn Gly

Met 355

Pro

Val Ile

Ser

Lys 360

Glu

Glu

Ala

Val

Asp 365

Met

Asp

Phe

Phe Thr 370

Lys

Gin

Ile Ile

Thr 375

Gly

Arg

Asp

Val

His 380

Pro

Gly

Leu

Phe

Ala Asn 385

Trp

Phe

Thr Gly 390

Gly

Leu

Asn

Tyr

Gin 395

Ile

Glu

His

His

Leu 400

Phe Pro

Ser

Met

Pro Arg 405

His

Asn

Phe

Ser 410

Lys

Ile

Gin

Pro

Ala 415

Val

Glu Thr

Leu

Cys 420

Lys Lys

Tyr

Asn

Val 425

Arg

Tyr

His

Thr

Thr 430

Gly

Met

Ile Glu

Gly

Thr

Ala Glu

Val

Phe

Ser

Arg

Leu

Asn

Glu

Val

Ser

Lys

445 • · · ·

435

Ala Ala Ser 450

Lys Met Gly Lys 455

440

Ala Gin

2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(ii) (xi)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1488 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární DRUH MOLEKULY: DNA (genomová)

Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

GTCCCCTGTC	GCTGTCGGCA	CACCCCATCC	TCCCTCGCTC	CCTCTGCGTT	TGTCCTTGGC	60
CCACCGTCTC	TCCTCCACCC	TCCGAGACGA	CTGCAACTGT	AATCAGGAAC	CGACAAATAC	120
ACGATTTCTT	TTTACTCAGC	ACCAACTCAA	AATCCTCAAC	CGCAACCCTT	TTTCAGGATG	180
GCACCTCCCA	ACACTATCGA	TGCCGGTTTG	ACCCAGCGTC	ATATCAGCAC	CTCGGCCCCA	240
AACTCGGCCA	AGCCTGCCTT	CGAGCGCAAC	TACCAGCTCC	CCGAGTTCAC	CATCAAGGAG	300
ATCCGAGAGT	GCATCCCTGC	CCACTGCTTT	GAGCGCTCCG	GTCTCCGTGG	TCTCTGCCAC	360
GTTGCCATCG	ATCTGACTTG	GGCGTCGCTC	TTGTTCCTGG	CTGCGACCCA	GATCGACAAG	420

TTTGAGAATC CCTTGATCCG CTATTTGGCC TGGCCTGTTT ACTGGATCAT GCAGGGTATT 480 • · · · • · • ·

GTCTGCACCG	GTGTCTGGGT	142	• · · • · · · « •	• · * · • · · • · · · • · · · · · CTCGACCTCC	• · • · • · • · 540
GCTGGCTCAC	GAGTGTGGTC	ATCAGTCCTT
AAGACCCTCA	ACAACACAGT	TGGTTGGATC	TTGCACTCGA	TGCTCTTGGT	CCCCTACCAC	600
TCCTGGAGAA	TCTCGCACTC	GAAGCACCAC	AAGGCCACTG	GCCATATGAC	CAAGGACCAG	660
GTCTTTGTGC	CCAAGACCCG	CTCCCAGGTT	GGCTTGCCTC	CCAAGGAGAA	CGCTGCTGCT	720
GCCGTTCAGG	AGGAGGACAT	GTCCGTGCAC	CTGGATGAGG	AGGCTCCCAT	TGTGACTTTG	780
TTCTGGATGG	TGATCCAGTT	CTTGTTCGGA	TGGCCCGCGT	ACCTGATTAT	GAACGCCTCT	840
GGCCAAGACT	ACGGCCGCTG	GACCTCGCAC	TTCCACACGT	ACTCGCCCAT	CTTTGAGCCC	900
CGCAACTTTT	TCGACATTAT	TATCTCGGAC	CTCGGTGTGT	TGGCTGCCCT	CGGTGCCCTG	960
ATCTATGCCT	CCATGCAGTT	GTCGCTCTTG	ACCGTCACCA	AGTACTATAT	TGTCCCCTAC	1020
CTCTTTGTCA	ACTTTTGGTT	GGTCCTGATC	ACCTTCTTGC	AGCACACCGA	TCCCAAGCTG	1080
CCCCATTACC	GCGAGGGTGC	CTGGAATTTC	CAGCGTGGAG	CTCTTTGCAC	CGTTGACCGC	1140
TCGTTTGGCA	AGTTCTTGGA	CCATATGTTC	CACGGCATTG	TCCACACCCA	TGTGGCCCAT	1200
CACTTGTTCT	CGCAAATGCC	GTTCTACCAT	GCTGAGGAAG	CTACCTATCA	TCTCAAGAAA	1260
CTGCTGGGAG	AGTACTATGT	GTACGACCCA	TCCCCGATCG	TCGTTGCGGT	CTGGAGGTCG	1320
TTCCGTGAGT	GCCGATTCGT	GGAGGATCAG	GGAGACGTGG	TCTTTTTCAA	GAAGTAAAAA	1380
AAAAGACAAT	GGACCACACA	CAACCTTGTC	TCTACAGACC	TACGTATCAT	GTAGCCATAC	1440
CACTTCATAA	AAGAACATGA	GCTCTAGAGG	CGTGTCATTC	GCGCCTCC		1488

(2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 399 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

xi)

Popis

sekvence:

SEQ

ID

NO

: 4:

Met 1

Ala

Pro

Pro

Asn 5

Thr

Ile

Asp

Ala

Gly 10

Leu

Thr

Gin

Arg

His 15

Ile

Ser

Thr

Ser

Ala 20

Pro

Asn

Ser

Ala

Lys 25

Pro

Ala

Phe

Glu

Arg 30

Asn

Tyr

Gin

Leu

Pro 35

Glu

Phe

Thr

Ile

Lys 40

Glu

Ile

Arg

Glu

Cys 45

Ile

Pro

Ala

His

Cys 50

Phe

Glu

Arg

Ser

Gly 55

Leu

Arg

Gly

Leu

Cys 60

His

Val

Ala

Ile

Asp 65

Leu

Thr

Trp

Ala

Ser 70

Leu

Leu

Phe

Leu

Ala 75

Ala

Thr

Gin

Ile

Asp 80

Lys

Phe

Glu

Asn

Pro 85

Leu

Ile

Arg

Tyr

Leu 90

Ala

Trp

Pro

Val

Tyr 95

Trp

Ile

Met

Gin

Gly 100

Ile

Val

Cys

Thr

Gly 105

Val

Trp

Val

Leu

Ala 110

His

Glu

• · ···· ···· ···· · · · · · · ·

143 • ··· ···· • · ···· · · ··

Cys Gly His Gin Ser Phe 115

Gly Trp Ile Leu His Ser 130

Ile Ser His Ser Lys His 145 150

Gin Val Phe Val Pro Lys 165

Glu Asn Ala Ala Ala Ala 180

Asp Glu Glu Ala Pro Ile 195

Leu Phe Gly Trp Pro Ala 210

Tyr Gly Arg Trp Thr Ser 225 230

Pro Arg Asn Phe Phe Asp 245

Ala Leu Gly Ala Leu Ile 260

Val Thr Lys Tyr Tyr Ile 275

Val Leu Ile Thr Phe Leu 290

Arg Glu Gly Ala Trp Asn 305 310

Arg Ser Phe Gly Lys Phe 325

Thr His Val Ala His His 340

Glu Glu Ala Thr Tyr His 355

Tyr Asp Pro Ser Pro Ile 370

Cys Arg Phe Val Glu Asp 385 390

Ser Thr Ser Lys Thr Leu 120

Met Leu Leu Val Pro Tyr 135 140

His Lys Ala Thr Gly His 155

Thr Arg Ser Gin Val Gly 170

Val Gin Glu Glu Asp Met 185

Val Thr Leu Phe Trp Met 200

Tyr Leu Ile Met Asn Ala 215 220

His Phe His Thr Tyr Ser 235

Ile Ile Ile Ser Asp Leu 250

Tyr Ala Ser Met Gin Leu 265

Val Pro Tyr Leu Phe Val 280

Gin His Thr Asp Pro Lys 295 300

Phe Gin Arg Gly Ala Leu 315

Leu Asp His Met Phe His 330

Leu Phe Ser Gin Met Pro 345

Leu Lys Lys Leu Leu Gly 360

Val Val Ala Val Trp Arg 375 380

Gin Gly Asp Val Val Phe 395

Asn Asn Thr Val 125

His Ser Trp Arg

Met Thr Lys Asp 160

Leu Pro Pro Lys 175

Ser Val His Leu 190

Val Ile Gin Phe 205

Ser Gly Gin Asp

Pro Ile Phe Glu 240

Gly Val Leu Ala 255

Ser Leu Leu Thr 270

Asn Phe Trp Leu 285

Leu Pro His Tyr

Cys Thr Val Asp 320

Gly Ile Val His 335

Phe Tyr His Ala 350

Glu Tyr Tyr Val 365

Ser Phe Arg Glu

Phe Lys Lys

144 • ·

2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1483 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5: GCTTCCTCCA GTTCATCCTC CATTTCGCCA CCTGCATTCT TTACGACCGT	TAAGCAAGAT	60
GGGAACGGAC	CAAGGAAAAA	CCTTCACCTG	GGAAGAGCTG	GCGGCCCATA	ACACCAAGGA	120
CGACCTACTC	TTGGCCATCC	GCGGCAGGGT	GTACGATGTC	ACAAAGTTCT	TGAGCCGCCA	180
TCCTGGTGGA	GTGGACACTC	TCCTGCTCGG	AGCTGGCCGA	GATGTTACTC	CGGTCTTTGA	240
GATGTATCAC	GCGTTTGGGG	CTGCAGATGC	CATTATGAAG	AAGTACTATG	TCGGTACACT	300
GGTCTCGAAT	GAGCTGCCCA	TCTTCCCGGA	GCCAACGGTG	TTCCACAAAA	CCATCAAGAC	360
GAGAGTCGAG	GGCTACTTTA	CGGATCGGAA	CATTGATCCC	AAGAATAGAC	CAGAGATCTG	420
GGGACGATAC	GCTCTTATCT	TTGGATCCTT	GATCGCTTCC	TACTACGCGC	AGCTCTTTGT	480
GCCTTTCGTT	GTCGAACGCA	CATGGCTTCA	GGTGGTGTTT	GCAATCATCA	TGGGATTTGC	540
GTGCGCACAA	GTCGGACTCA	ACCCTCTTCA	TGATGCGTCT	CACTTTTCAG	TGACCCACAA	600
CCCCACTGTC	TGGAAGATTC	TGGGAGCCAC	GCACGACTTT	TTCAACGGAG	CATCGTACCT	660
GGTGTGGATG	TACCAACATA	TGCTCGGCCA	TCACCCCTAC	ACCAACATTG	CTGGAGCAGA	720
TCCCGACGTG	TCGACGTCTG	AGCCCGATGT	TCGTCGTATC	AAGCCCAACC	AAAAGTGGTT	780
TGTCAACCAC	ATCAACCAGC	ACATGTTTGT	TCCTTTCCTG	TACGGACTGC	TGGCGTTCAA	840
GGTGCGCATT	CAGGACATCA	ACATTTTGTA	CTTTGTCAAG	ACCAATGACG	CTATTCGTGT	900
CAATCCCATC	TCGACATGGC	ACACTGTGAT	GTTCTGGGGC	GGCAAGGCTT	TCTTTGTCTG	960
GTATCGCCTG	ATTGTTCCCC	TGCAGTATCT	GCCCCTGGGC	AAGGTGCTGC	TCTTGTTCAC	1020
GGTCGCGGAC	ATGGTGTCGT	CTTACTGGCT	GGCGCTGACC	TTCCAGGCGA	ACCACGTTGT	1080
TGAGGAAGTT	CAGTGGCCGT	TGCCTGACGA	GAACGGGATC	ATCCAAAAGG	ACTGGGCAGC	1140
TATGCAGGTC	GAGACTACGC	AGGATTACGC	ACACGATTCG	CACCTCTGGA	CCAGCATCAC	1200
TGGCAGCTTG	AACTACCAGG	CTGTGCACCA	TCTGTTCCCC	AACGTGTCGC	AGCACCATTA	1260
TCCCGATATT	CTGGCCATCA	TCAAGAACAC	CTGCAGCGAG	TACAAGGTTC	CATACCTTGT	1320
CAAGGATACG	TTTTGGCAAG	CATTTGCTTC	ACATTTGGAG	CACTTGCGTG	TTCTTGGACT	1380
CCGTCCCAAG	GAAGAGTAGA	AGAAAAAAAG	CGCCGAATGA	AGTATTGCCC	CCTTTTTCTC	1440

CAAGAATGGC AAAAGGAGAT CAAGTGGACA TTCTCTATGA AGA

1483 • ·· · · · · * • · · · · · ·

145 • ···· ··· ··· ··· ·· ···· ·· ·· (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 446 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid

xi)

Pop

'ÍS

sek'

vence:

SEQ

ID

NO

: 6

•

Met

Gly

Thr

Asp

Gin

Gly

Lys

Thr

Phe

Thr

Trp

Glu

Glu

Leu

Ala

Ala

1

5

10

15

His

Asn

Thr

Lys

Asp

Asp

Leu

Leu

Leu

Ala

Ile

Arg

Gly

Arg

Val

Tyr

20

25

30

Asp

Val

Thr

Lys

Phe

Leu

Ser

Arg

His

Pro

Gly

Gly

Val

Asp

Thr

Leu

35

40

45

Leu

Leu

Gly

Ala

Gly

Arg

Asp

Val

Thr

Pro

Val

Phe

Glu

Met

Tyr

His

50

55

60

Ala

Phe

Gly

Ala

Ala

Asp

Ala

Ile

Met

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Val

Gly

Thr

65

70

75

80

Leu

Val

Ser

Asn

Glu

Leu

Pro

Ile

Phe

Pro

Glu

Pro

Thr

Val

Phe

His

85

90

95

Lys

Thr

Ile

Lys

Thr

Arg

Val

Glu

Gly

Tyr

Phe

Thr

Asp

Arg

Asn

Ile

100

105

110

Asp

Pro

Lys

Asn

Arg

Pro

Glu

Ile

Trp

Gly

Arg

Tyr

Ala

Leu

Ile

Phe

115

120

125

Gly

Ser

Leu

Ile

Ala

Ser

Tyr

Tyr

Ala

Gin

Leu

Phe

Val

Pro

Phe

Val

130

135

140

Val

Glu

Arg

Thr

Trp

Leu

Gin

Val

Val

Phe

Ala

Ile

Ile

Met

Gly

Phe

145

150

155

160

Ala

Cys

Ala

Gin

Val 165

Gly

Leu

Asn

Pro

Leu 170

His

Asp

Ala

Ser

His 175

Phe

Ser

Val

Thr

His 180

Asn

Pro

Thr

Val

Trp 185

Lys

Ile

Leu

Gly

Ala 190

Thr

His

Asp

Phe

Phe 195

Asn

Gly

Ala

Ser

Tyr 200

Leu

Val

Trp

Met

Tyr 205

Gin

His

Met

Leu

Gly 210

His

His

Pro

Tyr

Thr 215

Asn

Ile

Ala

Gly

Ala 220

Asp

Pro

Asp

Val

Ser 225

Thr

Ser

Glu

Pro

Asp 230

Val

Arg

Arg

Ile

Lys 235

Pro

Asn

Gin

Lys

Trp 240

9

9 9 9

Phe

Val

Asn

14 6

Phe 250

Val

• 9 • · • • •

9 9 9 9 • · · •

• • • • 9 Leu

* 9 ' 9 9 • • 9 9 9 9' Tyr 255

9 9 • 9 Gly

His

Ile Asn Gin His Met 245

Pro

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Lys

Val

Arg

Ile

Gin

Asp

Ile

Asn

Ile

Leu

Tyr

Phe

260

265

270

Val

Lys

Thr

Asn

Asp

Ala

Ile

Arg

Val

Asn

Pro

Ile

Ser

Thr

Trp

His

275

280

285

Thr

Val

Met

Phe

Trp

Gly

Gly

Lys

Ala

Phe

Phe

Val

Trp

Tyr

Arg

Leu

290

295

300

Ile

Val

Pro

Leu

Gin

Tyr

Leu

Pro

Leu

Gly

Lys

Val

Leu

Leu

Leu

Phe

305

310

315

320

Thr

Val

Ala

Asp

Met

Val

Ser

Ser

Tyr

Trp

Leu

Ala

Leu

Thr

Phe

Gin

325

330

335

Ala

Asn

His

Val

Val

Glu

Glu

Val

Gin

Trp

Pro

Leu

Pro

Asp

Glu

Asn

340

345

350

Gly

Ile

Ile

Gin

Lys

Asp

Trp

Ala

Ala

Met

Gin

Val

Glu

Thr

Thr

Gin

355

360

365

Asp

Tyr

Ala

His

Asp

Ser

His

Leu

Trp

Thr

Ser

Ile

Thr

Gly

Ser

Leu

370

375

380

Asn

Tyr

Gin

Ala

Val

His

His

Leu

Phe

Pro

Asn

Val

Ser

Gin

His

His

385

390

395

400

Tyr

Pro

Asp

Ile

Leu

Ala

Ile

Ile

Lys

Asn

Thr

Cys

Ser

Glu

Tyr

Lys

405

410

415

Val

Pro

Tyr

Leu

Val

Lys

Asp

Thr

Phe

Trp

Gin

Ala

Phe

Ala

Ser

His

420

425

430

Leu

Glu

His

Leu

Arg

Val

Leu

Gly

Leu

Arg

Pro

Lys

Glu

Glu

« 9

435 440 445

2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 355 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETEZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

147 • » · · * · • r * · · · · ···« * · · · • · ·«·· ·· · ·

Glu Val Arg Lys Leu Arg 1 5

Ser Ser Lys Ala Tyr Tyr 20

Trp Gly Leu Ser Thr Val 35

Leu Ala Asn Val Leu Ser 50

Cys Gly Trp Leu Ala His 65 70

Arg Phe Trp Gly Asp Leu 85

Gly Phe Ser Ser Ser Trp 100

Ala Pro Asn Val His Gly 115

Leu Thr Trp Ser Glu His 130

Glu Glu Leu Thr Arg Met 145 150

Trp Phe Tyr Phe Pro Xle 165

Gin Ser Ile Leu Phe Val 180

Gly Ala Arg Val Pro Ile 195

His Trp Thr Trp Tyr Leu 210

Val Asn Met Leu Val Tyr 225 230

Leu Leu Ala Ile Val Phe 245

Ser Lys Glu Glu Ala Val 260

Thr Leu Phe Gin Ser Leu 10

Ala Phe Lys Val Ser Phe 25

Ile Val Ala Lys Trp Gly 40

Ala Ala Leu Leu Gly Leu 55 60

Asp Phe Leu His His Gin 75

Phe Gly Ala Phe Leu Gly 90

Trp Lys Asp Lys His Asn 105

Glu Asp Pro Asp Ile Asp 120

Ala Leu Glu Met Phe Ser 135 140

Trp Ser Arg Phe Met Val 155

Leu Ser Phe Ala Arg Leu 170

Leu Pro Asn Gly Gin Ala 185

Ser Leu Val Glu Gin Leu 200

Ala Thr Met Phe Leu Phe 215 220

Phe Leu Val Ser Gin Ala 235

Ser Leu Asn His Asn Gly 250

Asp Met Asp Phe Phe Thr 265

Gly Tyr Tyr Asp 15

Asn Leu Cys Ile 30

Gin Thr Ser Thr 45

Phe Trp Gin Gin

Val Phe Gin Asp 80

Gly Val Cys Gin 95

Thr His His Ala 110

Thr His Pro Leu 125

Asp Val Pro Asp

Leu Asn Gin Thr 160

Ser Trp Cys Leu 175

His Lys Pro Ser 190

Ser Leu Ala Met 205

Ile Lys Asp Pro

Val Cys Gly Asn 240

Met Pro Val Ile 255

Lys Gin Ile Ile 270

Thr Gly Arg Asp Val His Pro Gly Leu Phe Ala Asn Trp Phe Thr Gly 275 280 285 • · • · • * * · • · • * • · · · · · ·

14

8

«

• · · «

• ·

• · • · • « · * · ·

Gly

Leu 290

Asn

Tyr

Gin

Ile

Glu 295

His

His

Leu

Phe

Pro 300

Ser

Met

Pro

Arg

His 305

Asn

Phe

Ser

Lys

Ile 310

Gin

Pro

Ala

Val

Glu 315

Thr

Leu

Cys

Lys

Lys 320

Tyr

Asn

Val

Arg

Tyr 325

His

Thr

Thr

Gly

Met 330

Ile

Glu

Gly

Thr

Ala 335

Glu

Val

Phe

Ser

Arg 340

Leu

Asn

Glu

Val

Ser 345

Lys

Ala

Ala

Ser

Lys 350

Met

Gly

I» · « · c ·

Lys Ala Gin 355

2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 104 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(Xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Val 1

Thr

Leu Tyr Thr 5

Leu Ala

Phe Val Ala Ala Asn Ser Leu Gly Val

10

15

Leu

Tyr

Gly

Val

Leu

Ala

Cys

Pro

Ser

Val

Xaa

Pro

His

Gin

Ile

Ala

20

25

30

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Leu

Leu

Trp

Ile

Gin

Ser

Ala

Tyr

Ile

Gly

Xaa

35

40

45

Asp

Ser

Gly

His

Tyr

Val

Ile

Met

Ser

Asn

Lys

Ser

Asn

Asn

Xaa

Phe

50

55

60

Ala

Gin

Leu

Leu

Ser

Gly

Asn

Cys

Leu

Thr

Gly

Ile

Ile

Ala

Trp

Trp

65

70

75

80

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Ala

His

His

Leu

Ala

Cys

Asn

Ser

Leu

Asp

Tyr

90 95

Gly Pro Asn Leu Gin His Ile Pro 100 • · · · • · • · (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

149

	(A)	DÉLKA: 252 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

Gly Val 1

Leu

Tyr

Gly 5

Val

Leu

Ala

Cys

Thr 10

Ser Val

Phe Ala

His 15

Gin

Ile

Ala

Ala

Ala

Leu

Leu

Gly

Leu

Leu

Trp

Ile

Gin

Ser

Ala

Tyr

Ile

20

25

30

Gly

His

Asp

Ser

Gly

His

Tyr

Val

Ile

Met

Ser

Asn

Lys

Ser

Tyr

Asn

35

40

45

Arg

Phe

Ala

Gin

Leu

Leu

Ser

Gly

Asn

Cys

Leu

Thr

Gly

Ile

Ser

Ile

50

55

60

Ala

Trp

Trp

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Ala

His

His

Leu

Ala

Cys

Asn

Ser

65

70

75

80

Leu

Asp

Tyr

Asp

Pro

Asp

Leu

Gin

His

Ile

Pro

Val

Phe

Ala

Val

Ser

85

90

95

Thr

Lys

Phe

Phe

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Arg

Phe

Tyr

Asp

Arg

Lys

Leu

100

105

110

Thr

Phe

Gly

Pro

Val

Ala

Arg

Phe

Leu

Val

Ser

Tyr

Gin

His

Phe

Thr

115

120

125

Tyr

Tyr

Pro

Val

Asn

Cys

Phe

Gly

Arg

Ile

Asn

Leu

Phe

Ile

Gin

Thr

130

135

140

Phe

Leu

Leu

Leu

Phe

Ser

Lys

Arg

Glu

Val

Pro

Asp

Arg

Ala

Leu

Asn

145

150

155

160

Phe

Ala

Gly

Ile

Leu

Val

Phe

Trp

Thr

Trp

Phe

Pro

Leu

Leu

Val

Ser

165

170

175

Cys

Leu

Pro

Asn

Trp

Pro

Glu

Arg

Phe

Phe

Phe

Val

Phe

Thr

Ser

Phe

180

185

190

Thr

Val

Thr

Ala

Leu

Gin

His

Ile

Gin

Phe

Thr

Leu

Asn

His

Phe

Ala

195

200

205

Ala.

Asp

Val

Tyr

Val

Gly

Pro

Pro

Thr

Gly

Ser

Asp

Trp

Phe

Glu

Lys

210

215

220

Gin

Ala

Ala

Gly

Thr

Ile

Asp

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Tyr

Met

Asp

Trp

225 230 235 240

Phe Phe Gly Gly Leu Gin Phe Gin Leu Glu His His 245 250 • · ··· · • · « « · · · * « « * «· · * « · (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

150

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 125 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii (xi	) )	DRUH MOLEKULY:	peptid : SEQ I	D NO:	10 :
Popis	sekvence
Gly	Xaa	Xaa Asn	Phe Ala Gly	Ile Leu	Val Phe	Trp	Thr	Trp	Phe	Pro
1			5		10				15
Leu	Leu	Val Ser	Cys Leu Pro	Asn Trp	Pro Glu	Arg	Phe	Xaa	Phe	Val
		20		25				30
Phe	Thr	Gly Phe	Thr Val Thr	Ala Leu	Gin His	Ile	Gin	Phe	Thr	Leu
		35		40			45
Asn	His	Phe Ala	Ala Asp Val	Tyr Val	Gly Pro	Pro	Thr	Gly	Ser	Asp
	50		55			60
Trp	Phe	Glu Lys	Gin Ala Ala	Gly Thr	Ile Asp	Ile	Ser	Cys	Arg	Ser
65			70		75					80
Tyr	Met	Asp Trp	Phe Phe Cys	Gly Leu	Gin Phe	Gin	Leu	Glu	His	His
			85		90				95
Leu	Phe	Pro Arg	Leu Pro Arg	Cys His	Leu Arg	Lys	Val	Ser	Pro	Val
		100		105				110
Gly	Gin	Arg Gly	Phe Gin Arg	Lys Xaa	Asn Leu	Ser	Xaa
		115		120			125

(2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 131 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

·· 0··0

Pro 1

Ala

Thr

Glu

Val 5

Gly

Gly

151 Leu

Ala

Trp 10

♦ 1 Met

• · ·· • · · I ·

• · • e • · • · • τ Phe

( · • • 0000 Tyr 15

0 • • 0 0 • Val

Ile

Thr

Arg

Phe

Phe

Leu

Thr

Tyr

Val

Pro

Leu

Leu

Gly

Leu

Lys

Ala

Phe

Leu

20

25

30

Gly

Leu

Phe

Phe

Ile

Val

Arg

Phe

Leu

Glu

Ser

Asn

Trp

Phe

Val

Trp

35

40

45

Val

Thr

Gin

Met

Asn

His

Ile

Pro

Met

His

Ile

Asp

His

Asp

Arg

Asn

50

55

60

Met

Asp

Trp

Val

Ser

Thr

Gin

Leu

Gin

Ala

Thr

Cys

Asn

Val

His

Lys

65

70

75

80

Ser

Ala

Phe

Asn

Asp

Trp

Phe

Ser

Gly

His

Leu

Asn

Phe

Gin

Ile

Glu

85

90

95

His

His

Leu

Phe

Pro

Thr

Met

Pro

Arg

His

Asn

Tyr

His

Xaa

Val

Ala

100

105

110

Pro

Leu

Val

Gin

Ser

Leu

Cys

Ala

Lys

His

Gly

Ile

Glu

Tyr

Gin

Ser

115

120

125

Lys

Pro

Leu

130

Informace

o SEQ

ID NO:

12:

(i)

CHARAKTERISTIKA

SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 87 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ií)	DRUH	MOLEKULY: peptid
xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

Cys 1

Ser

Pro

Lys

Ser 5

Ser

Pro

Thr

Arg

Asn 10

Met

Thr

Pro

Ser

Pro 15

Phe

Ile

Asp

Trp

Leu 20

Trp

Gly

Gly

Leu

Asn 25

Tyr

Gin

Ile

Glu

His 30

His

Leu

Phe

Pro

Thr 35

Met

Pro

Arg

Cys

Asn 40

Leu

Asn

Arg

Cys

Met 45

Lys

Tyr

Val

Lys

Glu 50

Trp

Cys

Ala

Glu

Asn 55

Asn

Leu

Pro

Tyr

Leu 60

Val

Asp

Asp

Tyr

Phe 65

Val

Gly

Tyr

Asn

Leu 70

Asn

Leu

Gin

Gin

Leu 75

Lys

Asn

Met

Ala

Glu 80

Leu Val Gin Ala Lys Ala Ala 85

9

9 9 9

9 • ·

152 (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 143 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

xi)	Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	: 13:
Arg His 1	Glu Ala	Ala Arg Gly 5	Gly	Thr	Arg 10	Leu Ala Tyr Met Leu Val· 15
Cys Met	Gin Trp 20	Thr Asp Leu	Leu	Trp 25	Ala	Ala Ser Phe Tyr Ser Arg 30
Phe Phe	Leu Ser 35	Tyr Ser Pro	Phe 40	Tyr	Gly	Ala Thr Gly Thr Leu Leu 45
Leu Phe 50	Val Ala	Val Arg Val 55	Leu	Glu	Ser	His Trp Phe Val Trp Ile 60
Thr Gin 65	Met Asn	His Ile Pro 70	Lys	Glu	Ile	Gly His Glu Lys His Arg 75 80
Asp Trp	Ala Ser	Ser Gin Leu 85	Ala	Ala	Thr 90	Cys Asn Val Glu Pro Ser 95
Leu Phe	Ile Asp 100	Trp Phe Ser	Gly	His 105	Leu	Asn Phe Gin Ile Glu His 110
His Leu	Phe Pro 115	Thr Met Thr	Arg 120	His	Asn	Tyr Arg Xaa Val Ala Pro 125
Leu Val 130	Lys Ala	Phe Cys Ala 135	Lys	His	Gly	Leu His Tyr Glu Val 140

(2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 186 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(Xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

• · • · • · • · · · · • · · · • ·

153

• •

•

•

• ·

• ·

Leu

His

His

Thr

Tyr

Thr

Asn

Ile

Ala

Gly

Ala

Asp

Pro

Asp

Val

Ser

1

5

10

15

Thr

Ser

Glu

Pro

Asp

Val

Arg

Arg

Ile

Lys

Pro

Asn

Gin

Lys

Trp

Phe

20

25

30

Val

Asn

His

Ile

Asn

Gin

His

Met

Phe

Val

Pro

Phe

Leu

Tyr

Gly

Leu

35

40

45

Leu

Ala

Phe

Lys

Val

Arg

Ile

Gin

Asp

Ile

Asn

Ile

Leu

Tyr

Phe

Val

50

55

60

Lys

Thr

Asn

Asp

Ala

Ile

Arg

Val

Asn

Pro

Ile

Ser

Thr

Trp

His

Thr

65

70

75

80

Val

Met

Phe

Trp

Gly

Gly

Lys

Ala

Phe

Phe

Val

Trp

Tyr

Arg

Leu

Ile

Val Pro Leu Gin Tyr Leu Pro Leu Gly Lys Val Leu Leu Leu Phe Thr 100 105 110

Val Ala Asp Met Val Ser Ser Tyr Trp Leu Ala Leu Thr Phe Gin Ala 115 120 125

Asn Tyr Val Val Glu Glu Val Gin Trp Pro Leu Pro Asp Glu Asn Gly 130 135 140

Ile

Ile

Gin

Lys

Asp

Trp

Ala

Ala

Met

Gin

Val

Glu

Thr

Thr

Gin

Asp

145

150

155

160

Tyr

Ala

His

Asp

Ser

His

Leu

Trp

Thr

Ser

Ile

Thr

Gly

Ser

Leu

Asn

165

170

175

Tyr

Gin

Xaa

Val

His

His

Leu

Phe

Pro

His

180

185

(2) Informace o SEQ ID NO: 15:

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 5 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

His Xaa Xaa His His • · • · (2)

154

Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 446 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

Met 1

Ala

Ala Gin

Ile Lys 5

Lys

Tyr

Ile Thr Ser Asp Glu Leu Lys Asn

10

15

His

Asp

Lys

Pro

Gly

Asp

Leu

Trp

Ile

Ser

Ile

Gin

Gly

Lys

Ala

Tyr

20

25

30

Asp

Val

Ser

Asp

Trp

Val

Lys

Asp

His

Pro

Gly

Gly

Ser

Phe

Pro

Leu

35

40

45

Lys

Ser

Leu

Ala

Gly

Gin

Glu

Val

Thr

Asp

Ala

Phe

Val

Ala

Phe

His

50

55

60

Pro

Ala

Ser

Thr

Trp

Lys

Asn

Leu

Asp

Lys

Phe

Phe

Thr

Gly

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Leu

Lys

Asp

Tyr

Ser

Val

Ser

Glu

Val

Ser

Lys

Val

Tyr

Arg

Lys

Leu

85

90

95

• ·

155

Val Phe Glu Phe Ser Lys Met Gly Leu Tyr Asp Lys Lys Gly His Ile 100 105 110

Met Phe Ala Thr Leu Cys Phe Ile Ala Met Leu Phe Ala Met Ser Val 115 120 125

Tyr Gly Val Leu Phe Cys Glu Gly Val Leu Val His Leu Phe Ser Gly 130 135 140

Cys Leu Met Gly Phe Leu Trp Ile Gin Ser Gly Trp Ile Gly His Asp

145 150 155 160

Ala Gly His Tyr Met Val Val Ser Asp Ser Arg Leu Asn Lys Phe Met

165 170 175

Gly Ile Phe Ala Ala Asn Cys Leu Ser Gly Ile Ser Ile Gly Trp Trp 180 185 190

Lys Trp Asn His Asn Ala His His Ile Ala Cys Asn Ser Leu Glu Tyr 195 200 205

Asp Pro Asp Leu Gin Tyr Ile Pro Phe Leu Val Val Ser Ser Lys Phe 210 215 220

Phe Gly Ser Leu Thr Ser His Phe Tyr Glu Lys Arg Leu Thr Phe Asp

225 230 235 240

Ser Leu Ser Arg Phe Phe Val Ser Tyr Gin His Trp Thr Phe Tyr Pro

245 250 ' 255

Ile Met Cys Ala Ala Arg Leu Asn Met Tyr Val Gin Ser Leu Ile Met 260 265 270

Leu Leu Thr Lys Arg Asn Val Ser Tyr Arg Ala Gin Glu Leu Leu Gly 275 280 285

Cys Leu Val Phe Ser Ile Trp Tyr Pro Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro 290 295 300

Asn Trp Gly Glu Arg Ile Met Phe Val Ile Ala Ser Leu Ser Val Thr

305 310 315 320

Gly Met Gin Gin Val Gin Phe Ser Leu Asn His Phe Ser Ser Ser Val

325 330 335

Tyr Val Gly Lys Pro Lys Gly Asn Asn Trp Phe Glu Lys Gin Thr Asp 340 345 350

Gly Thr Leu Asp Ile Ser Cys Pro Pro Trp Met Asp Trp Phe His Gly 355 360 365

Gly Leu Gin Phe Gin Ile Glu His His Leu Phe Pro Lys Met Pro Arg 370 375 380

Cys Asn Leu Arg Lys Ile Ser Pro Tyr Val Ile Glu Leu Cys Lys Lys

385 390 395 400

His Asn Leu Pro Tyr Asn Tyr Ala Ser Phe Ser Lys Ala Asn Glu Met

405 410 415

Thr Leu

Lys Pro

156

• · • · • • «

• · · · • · · •

• • •

• · • · • ·

• • •

• · • · • · • ·

Arg

Thr

Leu

Arg

Asn Thr

Ala

Leu

Gin

Ala

Arg

Asp

Ile

Thr

420

425

430

Leu

Pro

Lys

Asn

Leu Val

Trp

Glu

Ala

Leu

His

Thr

435

440

445

(2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 359 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

Met Leu Thr 1

Ala

Glu 5

Arg

Ile

Lys

Phe Thr 10

Gin Lys

Arg

Gly Phe Arg 15

Arg

Val

Leu

Asn

Gin

Arg

Val

Asp

Ala

Tyr

Phe

Ala

Glu

His

Gly

Leu

20

25

30

Thr

Gin

Arg

Asp

Asn

Pro

Ser

Met

Tyr

Leu

Lys

Thr

Leu

Ile

Ile

Val

35

40

45

Leu

Trp

Leu

Phe

Ser

Ala

Trp

Ala

Phe

Val

Leu

Phe

Ala

Pro

Val

Ile

50

55

60

Phe

Pro

Val

Arg

Leu

Leu

Gly

Cys

Met

Val

Leu

Ala

Ile

Ala

Leu

Ala

65

70

75

80

Ala

Phe

Ser

Phe

Asn

Val

Gly

His

Asp

Ala

Asn

His

Asn

Ala

Tyr

Ser

85

90

95

Ser

Asn

Pro

His

Ile

Asn

Arg

Val

Leu

Gly

Met

Thr

Tyr

Asp

Phe

Val

100

105

110

Gly

Leu

Ser

Ser

Phe

Leu

Trp

Arg

Tyr

Arg

His

Asn

Tyr

Leu

His

His

115

120

125

Thr

Tyr

Thr

Asn

Ile

Leu

Gly

His

Asp

Val

Glu

Ile

His

Gly

Asp

Gly

130

135

140

Ala

Val

Arg

Met

Ser

Pro

Glu

Gin

Glu

His

Val

Gly

Ile

Tyr

Arg

Phe

145

150

155

160

Gin

Gin

Phe

Tyr

Ile

Trp

Gly

Leu

Tyr

Leu

Phe

Ile

Pro

Phe

Tyr

Trp

165

170

175

Phe

Leu

Tyr

Asp

Val

Tyr

Leu

Val

Leu

Asn

Lys

Gly

Lys

Tyr

His

Asp

180

185

190

His

Lys

Ile

Pro

Pro

Phe

Gin

Pro

Leu

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

Leu

Gly

195 200 205

Ile Lys Leu Leu Trp Leu Gly Tyr Val Phe Gly Leu Pro Leu Ala Leu 210 215 220 • · • · · · • · · · • · · 9 • ·

Gly 225

Phe

Ser

Ile

157

Ala 235

• • Ser Val

• Thr

• · • · Tyr

9 9 9 9 9 Met 240

Pro

Glu Val 230

Leu

Ile

Gly

Thr

Tyr

Gly

Ile

Val 245

Val Cys

Thr

Ile

Phe 250

Met

Leu Ala

His

Val 255

Leu

Glu

Ser

Thr

Glu 260

Phe

Leu Thr

Pro

Asp 265

Gly

Glu

Ser Gly

Ala 270

Ile

Asp

Asp

Glu

Trp

Ala

Ile

Cys Gin

Ile

Arg

Thr

Thr

Ala Asn

Phe

Ala

Thr

275 280 285

Asn

Asn 2 90

Pro

Phe

Trp

Asn

Trp 295

Phe

Cys

Gly

Gly

Leu 300

Asn

His

Gin

Val

Thr 305

His

His

Leu

Phe

Pro 310

Asn

Ile

Cys

His

Ile 315

His

Tyr

Pro

Gin

Leu 320

Glu

Asn

Ile

Ile

Lys 325

Asp

Val

Cys

Gin

Glu 330

Phe

Gly

Val

Glu

Tyr 335

Lys

Val

Tyr

Pro

Thr 340

Phe

Lys

Ala

Ala

Ile 345

Ala

Ser

Asn

Tyr

Arg 350

Trp

Leu

Glu

Ala

Met

Gly

Lys

Ala

Ser

355 (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 365 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(Xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

Met 1

Thr

Ser

Thr

Thr 5

Ser

Lys

Val

Thr

Phe 10

Gly

Lys

Ser

Ile

Gly 15

Phe

Arg

Lys

Glu

Leu 20

Asn

Arg

Arg

val

Asn 25

Ala

Tyr

Leu

Glu

Ala 30

Glu

Asn

Ile

Ser

Pro 35

Arg

Asp

Asn

Pro

Pro 40

Met

Tyr

Leu

Lys

Thr 45

Ala

Ile

Ile

Leu

Ala 50

Třp

Val

Val

Ser

Ala 55

Trp

Thr

Phe

Val

Val 60

Phe

Gly

Pro

Asp

Val 65

Leu

Trp

Met

Lys

Leu 70

Leu

Gly

Cys

Ile

Val 75

Leu

Gly

Phe

Gly

Val 80

Ser

Ala

Val

Gly

Phe 85

Asn

Ile

Ser

His

Asp 90

Gly

Asn

His

Gly

Gly 95

Tyr

158

Ser

Lys

Tyr Gin Trp Val Asn Tyr Leu Ser Gly Leu Thr His Asp

Ala

100

105

110

Ile

Gly

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Trp

Lys

Phe

Arg

His

Asn

Val

Leu

His

115

120

125

His

Thr

Tyr

Thr

Asn

Ile

Leu

Gly

His

Asp

Val

Glu

Ile

His

Gly

Asp

130

135

140

Glu

Leu

Val

Arg

Met

Ser

Pro

Ser

Met

Glu

Tyr

Arg

Trp

Tyr

His

Arg

145

150

155

160

Tyr

Gin

His

Trp

Phe

Ile

Trp

Phe

Val

Tyr

Pro

Phe

Ile

Pro

Tyr

Tyr

165

170

175

Trp

Ser

Ile

Ala

Asp

Val

Gin

Thr

Met

Leu

Phe

Lys

Arg

Gin

Tyr

His

180

185

190

Asp

His

Glu

Ile

Pro

Ser

Pro

Thr

Trp

Val

Asp

Ile

Ala

Thr

Leu

Leu

195

200

205

Ala

Phe

Lys

Ala

Phe

Gly

Val

Ala

Val

Phe

Leu

Ile

Ile

Pro

Ile

Ala

210

215

220

Val

Gly

Tyr

Ser

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

Ala

Ser

Ile

Val

Tyr

225

230

235

240

Met

Thr

His

Gly

Leu

Val

Ala

Cys

Val

Val

Phe

Met

Leu

Ala

His

Val

245

250

255

Ile

Glu

Pro

Ala

Glu

Phe

Leu

Asp

Pro

Asp

Asn

Leu

His

Ile

Asp

Asp

260

265

270

Glu

Trp

Ala

Ile

Ala

Gin

Val

Lys

Thr

Thr

Val

Asp

Phe

Ala

Pro

Asn

275

280

285

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Trp

Tyr

Val

Gly

Gly

Leu

Asn

Tyr

Gin

Thr

Val

290

295

300

His

His

Leu

Phe

Pro

His

Ile

Cys

His

Ile

His

Tyr

Pro

Lys

Ile

Ala

305

310

315

320

Pro

Ile

Leu

Ala

Glu

Val

Cys

Glu

Glu

Phe

Gly

Val

Asn

Tyr

Ala

Val

325

330

335

His

Gin

Thr

Phe

Phe

Gly

Ala

Leu

Ala

Ala

Asn

Tyr

Ser

Trp

Leu

Lys

340

345

350

Lys

Met

Ser

Ile

Asn

Pro

Glu

Thr

Lys

Ala

Ile

Glu

Gin

355 360 365

2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina • · • · ·« ···« · · · * ···· · · · · · · · (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

CCAAGCTTCT GCAGGAGCTC TTTTTTTTTT TTTT 35 (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (iii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

	(A) POPIS: (desc = „syntetický	oligonukleotid
ix)	ZNAKY: (A) Název/klíč: mise feature (B) Pozice: 21 (C) Jiné informace: / počet= 1 /poznámka=	„N=inozin	nebo
ix)	cytozin ZNAKY: (A) Název/klíč: mise feature (B) Pozice: 27 (C) Jiné informace: / počet= 2 /poznámka=	„N=inozin	nebo
Xi)	cytozin Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

CUACUACUAC UACAYCAYAC NTAYACNAAY AT 32 (2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

160

(ii)	DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(A) POPIS: (desc = „syntetický	oligonukleofid
(ix)	ZNAKY: (A) Název/klíč: mise feature (B) Pozice: 13 (C) Jiné informace: / počet= 1 /poznámka=	„N=inozin	nebo
(ix)	cytozin ZNAKY: (A) Název/klíč: mise feature (B) Pozice: 19 (C) Jiné informace: / počet= 2 /poznámka=	„N=inozin	nebo
(Xi)	cytozin Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

CAUCAUCAUC AUNGGRAANA RRTGRTG 27 (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 33 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 22:

CUACUACUAC UAGGAGTCCT CTACGGTGTT TTG 33 (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová • · • · · ···· ···· ···· · · · · · · *

161 · ···· ···

(ii) (xi)	(D) TOPOLOGIE: lineární
DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:
CAUCAUCAUC	AUATGATGCT CAAGCTGAAA CTG
(2) Informace o SEQ ID NO: 24:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH MOLEKULY: peptid
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

Gin Xaa Xaa His His

5 (2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 39 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 25:

CUACUACUAC UACTCGAGCA AGATGGGAAC GGACCAAGG 39 (2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová • · ·«·· · '. ·· ·· · · ··· ···· » · · ♦ • · · · ·· · ···«

162 · · · · · ··«· ··»···· ·· ···· «· ·· (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

CAUCAUCAUC AUCTCGAGCT ACTCTTCCTT GGGACGGAG 39 (2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 47 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 27:

CUACUACUAC UATCTAGACT CGAGACCATG GCTGCTGCTC CAGTGTG 47 (2) Informace o SEQ ID NO: 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:

CAUCAUCAUC AUAGGCCTCG AGTTACTGCG CCTTACCCAT 40 (2) Informace o SEQ ID NO: 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 37párů	baží
(B)	TYP: nukleová	kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:	j ednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární
DRUH	MOLEKULY: jiná	nukleová kyselina

163 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:

CUACUACUA CUAGGATCCA TGGCACCTCC CAACACT

(2)	Inf oj	rmace o SEQ ID NO: 30:
	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 42 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární
	(ií)	DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
	(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 30:
CAUCAUCAU	CAUGGTACCT CGAGTTACTT CTTGAAAAAG AC
(2)	Informace o SEQ ID NO: 31:
	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 1219 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární
	(ii)	DRUH MOLEKULY: jiné nukleové kyseliny kontig 2692004)
	(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:

(editovaný

GCACGCCGAC	CGGCGCCGGG	AGATCCTGGC	AAAGTATCCA	GAGATAAAGT	CCTTGATGAA	60
ACCTGATCGC	AATTTGATAT	GGATTATAAT	TATGATGGTT	CTCACCCAGT	TGGGTGCATT	120
TTACATAGTA	AAAGACTTGG	ACTGGAAATG	GGTCATATTT	GGGGCCTATG	CGTTTGGCAG	180
TTGCATTAAC	CACTCAATGA	CTCTGGCTAT	TCATGAGATT	GCCCACAATG	CTGCCTTTGG	240
CAACTGCAAA	GCAATGTGGA	ATCGCTGGTT	TGGAATGTTT	GCTAATCTTC	CTATTGGGAT	300
TCCATATTCA	ATTTCCTTTA	AGAGGTATCA	CATGGATCAT	CATCGGTACC	TTGGAGCTGA	360
TGGCGTCGAT	GTAGATATTC	CTACCGATTT	TGAGGGCTGG	TTCTTCTGTA	CCGCTTTCAG	420

AAAGTTTATA TGGGTTATTC TTCAGCCTCT CTTTTATGCC TTTCGACCTC TGTTCATCAA 480 • · • « • · • · · ·

	164	•	• · · · '
CCCCAAACCA	ATTACGTATC	TGGAAGTTAT	CAATACCGTG	GCACAGGTCA	CTTTTGACAT	540
TTTAATTTAT	TACTTTTTGG	GAATTAAATC	CTTAGTCTAC	ATGTTGGCAG	CATCTTTACT	600
TGGCCTGGGT	TTGCACCCAA	TTTCTGGACA	TTTTATAGCT	GAGCATTACA	TGTTCTTAAA	660
GGGTCATGAA	ACTTACTCAT	ATTATGGGCC	TCTGAATTTA	CTTACCTTCA	ATGTGGGTTA	720
TCATAATGAA	CATCATGATT	TCCCCAACAT	TCCTGGAAAA	AGTCTTCCAC	TGGTGAGGAA	780
AATAGCAGCT	GAATACTATG	ACAACCTCCC	TCACTACAAT	TCCTGGATAA	AAGTACTGTA	840
TGATTTTGTG	ATGGATGATA	CAATAAGTCC	CTACTCAAGA	ATGAAGAGGC	ACCAAAAAGG	900
AGAGATGGTG	CTGGAGTAAA	TATCATTAGT	GCCAAAGGGA	TTCTTCTCCA	AAACTTTAGA	960
TGATAAAATG	GAATTTTTGC	ATTATTAAAC	TTGAGACCAG	TGATGCTCAG	AAGCTCCCCT	1020
GGCACAATTT	CAGAGTAAGA	GCTCGGTGAT	ACCAAGAAGT	GAATCTGGCT	TTTAAACAGT	1080
CAGCCTGACT	CTGTACTGCT	CAGTTTCACT	CACAGGAAAC	TTGTGACTTG	TGTATTATCG	1140
TCATTGAGGA AAAAAGCTAT	TGTTTCACTC TTCGCCAGG	ATGTCTGTCA	TTTTATAAGC	ATATCATTTA	AAAAGCTTCT	1200 1219

(2) Informace o SEQ ID NO: 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 655	párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE:	lineární
(li)	DRUH	MOLEKULY:	jiná nukleová kyselina
	kontig 2153526)
xi)	Popis	sekvence:	SEQ ID NO: 32:

(editovaný

TTACCTTCTA	CGTCCGCTTC	TTCCTCACTT	ATGTGCCACT	ATTGGGGCTG	AAAGCTTCCT	60
GGGCCTTTTC	TTCATAGTCA	GGTTCCTGGA	AAGCAACTGG	TTTGTGTGGG	TGACACAGAT	120
GAACCATATT	CCCATGCACA	TTGATCATGA	CCGGAACATG	GACTGGGTTT	CCACCCAGCT	180
CCAGGCCAGA	TGCAATGTCC	ACAAGTCTGC	CTTCAATGAC	TGGTTCAGTG	GACACCTCAň	240
CTTCCAGATT	GAGCACCATC	TTTTTCCCAC	GATGCCTCGA	CACAATTACC	ACAAAGTGGC	300
TCCCCTGGTG	CAGTCCTTGT	GTGCCAAGCA	TGGCATAGAG	TACCAGTCCA	AGCCCCTGCT	360
GTCAGCCTTC	GCCGACATCA	TCCACTCACT	AAAGGAGTCA	GGGCAGCTCT	GGCTAGATGC	420
CTATCTTCAC	CAATAACAAC	AGCCACCCTG	CCCAGTCTGG	AAGAAGAGGA	GGAAGACTCT	480
GGAGCCAAGG	CAGAGGGGAG	CTTGAGGGAC	AATGCCACTA	TAGTTTAATA	CTCAGAGGGG	540
GTTGGGTTTG	GGGACATAAA	GCCTCTGACT	CAAACTCCTC	CCTTTTATCT	TCTAGCCACA	600

GTTCTAAGAC CCAAAGTGGG GGGTGGACAC AGAAGTCCCT AGGAGGGAAG GAGCT

655 • ♦ · · • · • · · · · • · · · ·

165 (2) Informace o SEQ ID NO: 33:

(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 304	párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY:	jiná nukleová kyselina
	kontig 2153526)
(xi)	Popis	sekvence:	SEQ ID NO: 33:

(editovaný

GTCTTTTACT	TTGGCAATGG	CTGGATTCCT	ACCCTCATCA	CGGCCTTTGT	CCTTGCTACC	60
TCTCAGGCCC	AAGCTGGATG	GCTGCAACAT	GATTATGGCC	ACCTGTCTGT	CTACAGAAAA	120
CCCAAGTGGA	ACCACCTTGT	CCACAAATTC	GTCATTGGCC	ACTTAAAGGG	TGCCTCTGCC	180
AACTGGTGGA	ATCATCGCCA	CTTCCAGCAC	CACGCCAAGC	CTAACATCTT	CCACAAGGAT	240
CCCGATGTGA	ACATGCTGCA	CGTGTTTGTT	CTGGGCGAAT	GGCAGCCCAT	CGAGTACGGC	300

AAGA 304 (2)

Informace o SEQ ID NO: 34:

i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 918 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

(editovaný kontig 3854933) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 34:

CAGGGACCTA	CCCCGCGCTA	CTTCACCTGG	GACGAGGTGG	CCCAGCGCTC	AGGGTGCGAG	60
GAGCGGTGGC	TAGTGATCGA	CCGTAAGGTG	TACAACATCA	GCGAGTTCAC	CCGCCGGCAT-	120
CCAGGGGGCT	CCCGGGTCAT	CAGCCACTAC	GCCGGGCAGG	ATGCCACGGA	TCCCTTTGTG	180
GCCTTCCACA	TCAACAAGGG	CCTTGTGAAG	AAGTATATGA	ACTCTCTCCT	GATTGGAGAA	240
CTGTCTCCAG	AGCAGCCCAG	CTTTGAGCCC	ACCAAGAATA	AAGAGCTGAC	AGATGAGTTC	300
CGGGAGCTGC	GGGCCACAGT	GGAGCGGATG	GGGCTCATGA	AGGCCAACCA	TGTCTTCTTC	360
CTGCTGTACC	TGCTGCACAT	CTTGCTGCTG	GATGGTGCAG	CCTGGCTCAC	CCTTTGGGTC	420
TTTGGGACGT	CCTTTTTGCC	CTTCCTCCTC	TGTGCGGTGC	TGCTCAGTGC	AGTTCAGGCC	480

CAGGCTGGCT GGCTGCAGCA TGACTTTGGG CACCTGTCGG TCTTCAGCAC CTCAAAGTGG 540 • ·

AACCATCTGC	TACATCATTT	TGTGATTGGC	166 CACCTGAAGG	• •	• · · · · · • · · # • · · · · · CAGTTGGTGG	« * · • · 600
GGGCCCCCGC
AACCACATGC	ACTTCCAGCA	CCATGCCAAG	CCCAACTGCT	TCCGCAAAGA	CCCAGACATC	660
AACATGCATC	CCTTCTTCTT	TGCCTTGGGG	AAGATCCTCT	CTGTGGAGCT	TGGGAAACAG	720
AAGAAAAAAT	ATATGCCGTA	CAACCACCAG	CACARATACT	TCTTCCTAAT	TGGGCCCCCA	780
GCCTTGCTGC	CTCTCTACTT	CCAGTGGTAT	ATTTTCTATT	TTGTTATCCA	GCGAAAGAAG	840
TGGGTGGACT	TGGCCTGGAT	CAGCAAACAG	GAATACGATG	AAGCCGGGCT	TCCATTGTCC	900
ACCGCAAATG	CTTCTAAA					918

2)

Informace o SEQ ID NO: 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1686 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (ii) (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina kontig 3854933) (editovaný

(Xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO:	: 35:
GCCACTTAAA	GGGTGCCTCT	GCCAACTGGT	GGAATCATCG	CCACTTCCAG	CACCACGCCA	60
AGCCTAACAT	CTTCCACAAG	GATCCCGATG	TGAACATGCT	GCACGTGTTT	GTTCTGGGCG	120
AATGGCAGCC	CATCGAGTAC	GGCAAGAAGA	AGCTGAAATA	CCTGCCCTAC	AATCACCAGC	180
ACGAATACTT	CTTCCTGATT	GGGCCGCCGC	TGCTCATCCC	CATGTATTTC	CAGTACCAGA	240
TCATCATGAC	CATGATCGTC	CATAAGAACT	GGGTGGACCT	GGCCTGGGCC	GTCAGCTACT	300
ACATCCGGTT	CTTCATCACC	TACATCCCTT	TCTACGGCAT	CCTGGGAGCC	CTCCTTTTCC	360
TCAACTTCAT	CAGGTTCCTG	GAGAGCCACT	GGTTTGTGTG	GGTCACACAG	ATGAATCACA	420
TCGTCATGGA	GATTGACCAG	GAGGCCTACC	GTGACTGGTT	CAGTAGCCAG	CTGACAGCCA	480
CCTGCAACGT	GGAGCAGTCC	TTCTTCAACG	ACTGGTTCAG	TGGACACCTT	AACTTCCAGA	540
TTGAGCACCA	CCTCTTCCCC	ACCATGCCCC	GGCACAACTT	ACACAAGATC	GCCCCGCTGG	600
TGAAGTCTCT	ATGTGCCAAG	CATGGCATTG	AATACCAGGA	GAAGCCGCTA	CTGAGGGCCC	660
TGCTGGACAT	CATCAGGTCC	CTGAAGAAGT	CTGGGAAGCT	GTGGCTGGAC	GCCTACCTTC	720
ACAAATGAAG	CCACAGCCCC	CGGGACACCG	TGGGGAAGGG	GTGCAGGTGG	GGTGATGGCC	780
AGAGGAATGA	TGGGCTTTTG	TTCTGAGGGG	TGTCCGAGAG	GCTGGTGTAT	GCACTGCTCA	840
CGGACCCCAT	GTTGGATCTT	TCTCCCTTTC	TCCTCTCCTT	TTTCTCTTCA	CATCTCCCCC	900

ATAGCACCCT GCCCTCATGG GACCTGCCCT CCCTCAGCCG TCAGCCATCA GCCATGGCCC 960 • ♦ · ·

TCCCAGTGCC	TCCTAGCCCC	TTCTTCCAAG	167 GAGCAGAGAG	• · * • · · • •	• · · · • · · · • · · · • · · · · · « GGGGTGGCTC	• · • « • · • · 1020
GTGGCCACCG
TGTCCTACCT	CCACTCTCTG	CCCCTAAAGA	TGGGAGGAGA	CCAGCGGTCC	ATGGGTCTGG	1080
CCTGTGAGTC	TCCCCTTGCA	GCCTGGTCAC	TAGGCATCAC	CCCCGCTTTG	GTTCTTCAGA	1140
TGCTCTTGGG	GTTCATAGGG	GCAGGTCCTA	GTCGGGCAGG	GCCCCTGACC	CTCCCGGCCT	1200
GGCTTCACTC	TCCCTGACGG	CTGCCATTGG	TCCACCCTTT	CATAGAGAGG	CCTGCTTTGT	1260
TACAAAGCTC	GGGTCTCCCT	CCTGCAGCTC	GGTTAAGTAC	CCGAGGCCTC	TCTTAAGATG	1320
TCCAGGGCCC	CAGGCCCGCG	GGCACAGCCA	GCCCAAACCT	TGGGCCCTGG	AAGAGTCCTC	1380
CACCCCATCA	CTAGAGTGCT	CTGACCCTGG	GCTTTCACGG	GCCCCATTCC	ACCGCCTCCC	1440
CAACTTGAGC	CTGTGACCTT	GGGACCAAAG	GGGGAGTCCC	TCGTCTCTTG	TGACTCAGCA	1500
GAGGCAGTGG	CCACGTTCAG	GGAGGGGCCG	GCTGGCCTGG	AGGCTCAGCC	CACCCTCCAG	1560
CTTTTCCTCA	GGGTGTCCTG	AGGTCCAAGA	TTCTGGAGCA	ATCTGACCCT	TCTCCAAAGG	1620
CTCTGTTATC	AGCTGGGCAG	TGCCAGCCAA	TCCCTGGCCA	TTTGGCCCCA	GGGGACGTGG	1680
GCCCTG						1686

(2) Informace o SEQ ID NO: 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1843 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (kontig 2535) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 36:

GTCTTTTACT	TTGGCAATGG	CTGGATTCCT	ACCCTCATCA	CGGCCTTTGT	CCTTGCTACC	60
TCTCAGGCCC	AAGCTGGATG	GCTGCAACAT	GATTATGGCC	ACCTGTCTGT	CTACAGAAAA	120
CCCAAGTGGA	ACCACCTTGT	CCACAAATTC	GTCATTGGCC	ACTTAAAGGG	TGCCTCTGCC	180
AACTGGTGGA	ATCATCGCCA	CTTCCAGCAC	CACGCCAAGC	CTAACATCTT	CCACAAGGAT	240
CCCGATGTGA	ACATGCTGCA	CGTGTTTGTT	CTGGGCGAAT	GGCAGCCCAT	CGAGTACGGC	300
AAGAAGAAGC	TGAAATACCT	GCCCTACAAT	CACCAGCACG	AATACTTCTT	CCTGATTGGG	360
CCGCCGCTGC	TCATCCCCAT	GTATTTCCAG	TACCAGATCA	TCATGACCAT	GATCGTCCAT	420
AAGAACTGGG	TGGACCTGGC	CTGGGCCGTC	AGCTACTACA	TCCGGTTCTT	CATCACCTAC	480
ATCCCTTTČT	ACGGCATCCT	GGGAGCCCTC	CTTTTCCTCA	ACTTCATCAG	GTTCCTGGAG	540
AGCCACTGGT	TTGTGTGGGT	CACACAGATG	AATCACATCG	TCATGGAGAT	TGACCAGGAG	600
GCCTACCGTG	ACTGGTTCAG	TAGCCAGCTG	ACAGCCACCT	GCAACGTGGA	GCAGTCCTTC	660
TTCAACGACT	GGTTCAGTGG	ACACCTTAAC	TTCCAGATTG	AGCACCACCT	CTTCCCCACC	720

• ·

168

ATGCCCCGGC	ACAACTTACA	CAAGATCGCC	CCGCTGGTGA	AGTCTCTATG	TGCCAAGCAT	780
GGCATTGAAT	ACCAGGAGAA	GCCGCTACTG	AGGGCCCTGC	TGGACATCAT	CAGGTCCCTG	840
AAGAAGTCTG	GGAAGCTGTG	GCTGGACGCC	TACCTTCACA	AATGAAGCCA	CAGCCCCCGG	900
GACACCGTGG	GGAAGGGGTG	CAGGTGGGGT	GATGGCCAGA	GGAATGATGG	GCTTTTGTTC	960
TGAGGGGTGT	CCGAGAGGCT	GGTGTATGCA	CTGCTCACGG	ACCCCATGTT	GGATCTTTCT	1020
CCCTTTCTCC	TCTCCTTTTT	CTCTTCACAT	CTCCCCCATA	GCACCCTGCC	CTCATGGGAC	1080
CTGCCCTCCC	TCAGCCGTCA	GCCATCAGCC	ATGGCCCTCC	CAGTGCCTCC	TAGCCCCTTC	1140
TTCCAAGGAG	CAGAGAGGTG	GCCACCGGGG	GTGGCTCTGT	CCTACCTCCA	CTCTCTGCCC	1200
CTAAAGATGG	GAGGAGACCA	GCGGTCCATG	GGTCTGGCCT	GTGAGTCTCC	CCTTGCAGCC	1260
TGGTCACTAG	GCATCACCCC	CGCTTTGGTT	CTTCAGATGC	TCTTGGGGTT	CATAGGGGCA	1320
GGTCCTAGTC	GGGCAGGGCC	CCTGACCCTC	CCGGCCTGGC	TTCACTCTCC	CTGACGGCTG	1380
CCATTGGTCC	ACCCTTTCAT	AGAGAGGCCT	GCTTTGTTAC	AAAGCTCGGG	TCTCCCTCCT	1440
GCAGCTCGGT	TAAGTACCCG	AGGCCTCTCT	TAAGATGTCC	AGGGCCCCAG	GCCCGCGGGC	1500
ACAGCCAGCC	CAAACCTTGG	GCCCTGGAAG	AGTCCTCCAC	CCCATCACTA	GAGTGCTCTG	1560
ACCCTGGGCT	TTCACGGGCC	CCATTCCACC	GCCTCCCCAA	CTTGAGCCTG	TGACCTTGGG	1620
ACCAAAGGGG	GAGTCCCTCG	TCTCTTGTGA	CTCAGCAGAG	GCAGTGGCCA	CGTTCAGGGA	1680
GGGGCCGGCT	GGCCTGGAGG	CTCAGCCCAC	CCTCCAGCTT	TTCCTCAGGG	TGTCCTGAGG	1740
TCCAAGATTC	TGGAGCAATC	TGACCCTTCT	CCAAAGGCTC	TGTTATCAGC	TGGGCAGTGC	1800
CAGCCAATCC	CTGGCCATTT	GGCCCCAGGG	GACGTGGGCC	CTG		1843
Informace o SEQ	ID NO: 37:

(i) (xi)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2257 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (editovaný kontig 253538a)

Popis sekvence: SEQ ID NO: 37:

CAGGGACCTA	CCCCGCGCTA	CTTCACCTGG	GACGAGGTGG	CCCAGCGCTC	AGGGTGCGAG	60
GAGCGGTGGC	TAGTGATCGA	CCGTAAGGTG	TACAACATCA	GCGAGTTCAC	CCGCCGGCAT	120
CCAGGGGGČT	CCCGGGTCAT	CAGCCACTAC	GCCGGGCAGG	ATGCCACGGA	TCCCTTTGTG	180
GCCTTCCACA	TCAACAAGGG	CCTTGTGAAG	AAGTATATGA	ACTCTCTCCT	GATTGGAGAA	240
CTGTCTCCAG	AGCAGCCCAG	CTTTGAGCCC	ACCAAGAATA	AAGAGCTGAC	AGATGAGTTC	300

CGGGAGCTGC GGGCCACAGT GGAGCGGATG GGGCTCATGA AGGCCAACCA TGTCTTCTTC 360

CTGCTGTACC

TTTGGGACGT

GCCCAAGCTG

TGGAACCACC

TGGAATCATC

GTGAACATGC

AAGCTGAAAT

CTGCTCATCC

TGGGTGGACC

TTCTACGGCA

TGGTTTGTGT

CGTGACTGGT

GACTGGTTCA

CGGCACAACT

GAATACCAGG

TCTGGGAAGC

GTGGGGAAGG

GTGTCCGAGA

CTCCTCTCCT

TCCCTCAGCC

GGAGCAGAGA

ATGGGAGGAG

CTAGGCATCA

AGTCGGGCAG

GTCCACCCTT

CGGTTAAGTA

AGCCCAAACC

GGCTTTCACG

GGGGGAGTCC

GGCTGGCCTG

ATTCTGGAGC

TGCTGCACAT

CCTTTTTGCC

GATGGCTGCA

TTGTCCACAA

GCCACTTCCA

TGCACGTGTT

ACCTGCCCTA

CCATGTATTT

TGGCCTGGGC

TCCTGGGAGC

GGGTCACACA

TCAGTAGCCA

GTGGACACCT

TACACAAGAT

AGAAGCCGCT

TGTGGCTGGA

GGTGCAGGTG

GGCTGGTGTA

TTTTCTCTTC

GTCAGCCATC

GGTGGCCACC

ACCAGCGGTC

CCCCCGCTTT

GGCCCCTGAC

TCATAGAGAG

CCCGAGGCCT

TTGGGCCCTG

GGCCCCATTC

CTCGTCTCTT

GAGGCTCAGC

AATCTGACCC

CTTGCTGCTG

CTTCCTCCTC

ACATGATTAT

ATTCGTCATT

GCACCACGCC

TGTTCTGGGC

CAATCACCAG

CCAGTACCAG

CGTCAGCTAC

CCTCCTTTTC

GATGAATCAC

GCTGACAGCC

TAACTTCCAG

CGCCCCGCTG

ACTGAGGGCC

CGCCTACCTT

GGGTGATGGC

TGCACTGCTC

ACATCTCCCC

AGCCATGGCC

GGGGGTGGCT

CATGGGTCTG

GGTTCTTCAG

CCTCCCGGCC

GCCTGCTTTG

CTCTTAAGAT

GAAGAGTCCT

CACCGCCTCC

GTGACTCAGC

CCACCCTCCA

TTCTCCAAAG

169

GATGGTGCAG

TGTGCGGTGC

GGCCACCTGT

GGCCACTTAA

AAGCCTAACA

GAATGGCAGC

CACGAATACT

ATCATCATGA

TACATCCGGT

CTCAACTTCA

ATCGTCATGG

ACCTGCAACG

ATTGAGCACC

GTGAAGTCTC

CTGCTGGACA

CACAAATGAA

CAGAGGAATG

ACGGACCCCA

CATAGCACCC

CTCCCAGTGC

CTGTCCTACC

GCCTGTGAGT

ATGCTCTTGG

TGGCTTCACT

TTACAAAGCT

GTCCAGGGCC

CCACCCCATC

CCAACTTGAG

AGAGGCAGTG

GCTTTTCCTC

GCTCTGTTAT

CCTGGCTCAC

TGCTCAGTGC

CTGTCTACAG

AGGGTGCCTC

TCTTCCACAA

CCATCGAGTA

TCTTCCTGAT

CCATGATCGT

TCTTCATCAC

TCAGGTTCCT

AGATTGACCA

TGGAGCAGTC

ACCTCTTCCC

TATGTGCCAA

TCATCAGGTC

GCCACAGCCC

ATGGGCTTTT

TGTTGGATCT

TGCCCTCATG

CTCCTAGCCC

TCCACTCTCT

CTCCCCTTGC

GGTTCATAGG

CTCCCTGACG

CGGGTCTCCC

CCAGGCCCGC

ACTAGAGTGC

CCTGTGACCT

GCCACGTTCA

AGGGTGTCCT

CAGCTGGGCA • ** ·· • · · «

CCTTTGGGTC

AGTTCAGCAG

AAAACCCAAG

TGCCAACTGG

GGATCCCGAT

CGGCAAGAAG

TGGGCCGCCG

CCATAAGAAC

CTACATCCCT

GGAGAGCCAC

GGAGGCCTAC

CTTCTTCAAC

CACCATGCCC

GCATGGCATT

CCTGAAGAAG

CCGGGACACC

GTTCTGAGGG

TTCTCCCTTT

GGACCTGCCC

CTTCTTCCAA

GCCCCTAAAG

AGCCTGGTCA

GGCAGGTCCT

GCTGCCATTG

TCCTGCAGCT

GGGCACAGCC

TCTGACCCTG

TGGGACCAAA

GGGAGGGGCC

GAGGTCCAAG

GTGCCAGCCA • · · · • * » 9 » · · · * • · · · • · · ·

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

ATCCCTGGCC ATTTGGCCCC AGGGGACGTG GGCCCTG

2257 • · ··*· · · ♦» ·« »· • · t · · · · *·«· • · · · · · · · «· · • »··· >«···· • · · · · ♦ · · · ······· ·« « 4 · · · · *·

170 (2) Informace o SEQ ID NO: 38:

i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 411	aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE:	lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY:	aminokyselina	(translace kontigu
	2692004)
xi)	Popis	sekvence:	SEQ ID NO: 38:

His

Ala

Asp

Arg

Arg

Arg

Glu

Ile

Leu

Ala

Lys

Tyr

Pro

Glu

Ile

1

5

10

15

Lys

Ser

Leu

Met

Lys

Pro

Asp

Pro

Asn

Leu

Ile

Trp

Ile

Ile

Ile

20

25

30

Met

Met

Val

Leu

Thr

Gin

Leu

Gly

Ala

Phe

Tyr

Ile

Val

Lys

Asp

35

40

45

Leu

Asp

Trp

Lys

Trp

Val

Ile

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Phe

Gly

Ser

50

55

60

Cys

Ile

Asn

His

Ser

Met

Thr

Leu

Ala

Ile

His

Glu

Ile

Ala

His

65

70

75

Asn

Ala

Ala

Phe

Gly

Asn

Cys

Lys

Ala

Met

Trp

Asn

Arg

Trp

Phe

80

85

90

Gly

Met

Phe

Ala

Asn

Leu

Pro

Ile

Gly

Ile

Pro

Tyr

Ser

Ile

Ser

95

100

105

Phe

Lys

Arg

Tyr

His

Met

Asp

His

His

Arg

Tyr

Leu

Gly

Ala

Asp

110

115

120

Gly

Val

Asp

Val

Asp

Ile

Pro

Thr

Asp

Phe

Glu

Gly

Trp

Phe

Phe

125

130

135

Cys

Thr

Ala

Phe

Arg

Lys

Phe

Ile

Trp

Val

Ile

Leu

Gin

Pro

Leu

140

145

150

Phe

Tyr

Ala

Phe

Arg

Pro

Leu

Phe

Ile

Asn

Pro

Lys

Pro

Ile

Thr

155

160

165

Tyr

Leu

Glu

Val

Ile

Asn

Thr

Val

Ala

Gin

Val

Thr

Phe

Asp

Ile

170

175

180

Leu

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Leu

Gly

Ile

Lys

Ser

Leu

Val

Tyr

Met

Leu

185

190

195

Ala

Ala

Ser

Leu

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

His

Pro

Ile

Ser

Gly

His

200

205

210

Phe

Ile

Ala

Glu

His

Tyr

Met

Phe

Leu

Lys

Gly

His

Glu

Thr

Tyr

215

220

225

Ser

Tyr

Tyr

Gly

Pro

Leu

Asn

Leu

Leu

Thr

Phe

Asn

Val

Gly

Tyr

230

235

240

His

Asn

Glu

His

His

Asp

Phe

Pro

Asn

Ile

Pro

Gly

Lys

Ser

Leu

245

250

255

Pro

Leu

Val

Arg

Lys

Ile

Ala

Ala

Glu

Tyr

Tyr

Asp

Asn

Leu

Pro

260

265

270

His

Tyr

Asn

Ser

Trp

Ile

Lys

Val

Leu

Tyr

Asp

Phe

Val

Met

Asp

275

280

285

Asp

Thr

Ile

Sér

Pro

Tyr

Ser

Arg

Met

Lys

Arg

His

Gin

Lys

Gly

290

295

300

Glu

Met

Val

Leu

Glu

★ ★ ★

Ile

Ser

Leu

Val

Pro

Lys

Gly

Phe

Phe

305

310

315

Ser

Lys

Thr

Leu

Asp

Asp

Lys

Met

Glu

Phe

Leu

His

Tyr

★ ★ ★

Thr

320

325

330

* ★ ★

Asp

Gin

* * *

Cys

Ser

Glu

Ala

Pro

Leu

Ala

Gin

Phe

Gin

Ser

335

340

345

Lys

Ser

Ser

Val

Ile

Pro

Arg

Ser

Glu

Ser

Gly

Phe

★ ★ ★

Thr

Val

350

355

360

• · · » · ·

171

Ser

Leu

Thr

Leu

Tyr 365

Cys

Ser Val

Ser

Leu 370

Thr

Gly

Asn Leu

★ ★ ★ 375

Leu

Val

Tyr

Tyr

Arg

His

★ ★ ★

Gly

Cys

Phe

Thr

His

Val

Cys

His

380

385

390

Phe

Ile

Ser

Ile

Ser

Phe

Lys

Lys

Leu

Leu

Lys

Ser

Tyr

Phe

Ala

400

405

410

Arg

(2) Informace o SEQ ID NO: 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 218 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní

(11)	(D) TOPOLOGIE: DRUH MOLEKULY:	lineární aminokyselina	(translace kontigu
(xi)	2153526) Popis sekvence:	SEQ ID NO: 39:

Tyr

Leu

Leu

Arg

Pro

Leu

Leu

Pro

His

Leu

Cys

Ala

Thr

Ile

Gly

1

5

10

15

Ala

Glu

Ser

Phe

Leu

Gly

Leu

Phe

Phe

Ile

Val

Arg

Phe

Leu

Glu

20

25

30

Ser

Asn

Trp

Phe

Val

Trp

Val

Thr

Gin

Met

Asn

His

Ile

Pro

Met

35

40

45

His

Ile

Asp

His

Asp

Arg

Asn

Met

Asp

Trp

Val

Ser

Thr

Gin

Leu

50

55

60

Gin

Ala

Thr

Cys

Asn

Val

His

Lys

Ser

Ala

Phe

Asn

Asp

Trp

Phe

65

70

75

Ser

Gly

His

Leu

Asn

Phe

Gin

Ile

Glu

His

His

Leu

Phe

Pro

Thr

80

85

90

Met

Pro

Arg

His

Asn

Tyr

His

Lys

Val

Ala

Pro

Leu

Val

Gin

Ser

95

100

105

Leu

Cys

Ala

Lys

His

Gly

Ile

Glu

Tyr

Gin

Ser

Lys

Pro

Leu

Leu

110

115

120

Ser

Ala

Phe

Ala

Asp

Ile

Ile

His

Ser

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Gin

125

130

135

Leu

Trp

Leu

Asp

Ala

Tyr

Leu

His

Gin

+ ★ ★

Gin

Gin

Pro

Pro

Cys

140

145

150

Pro

Val

Trp

Lys

Lys

Arg

Arg

Lys

Thr

Leu

Glu

Pro

Arg

Gin

Arg

155

160

165

Gly

Ala

★ ★ ★

Gly

Thr

Met

Pro

Leu

★ ★ *

Phe

Asn

Thr

Gin

Arg

Gly

170

175

180

Leu

Gly

Leu

Gly

Thr

★ ★ *

Ser

Leu

* * *

Leu

Lys

Leu

Leu

Pro

Phe

185

190

195

Ile

Phe

★ ★ ★

Pro

Gin

Phe

★ ★ ★

Asp

Pro

Lys

Trp

Gly

Val

Asp

Thr

200

205

210

Glu

Val

Pro

Arg

Arg

Glu

Gly

Ala

215

172 (2) Informace o SEQ ID NO: 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 71 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: (translace kontigu 3506132) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 40:

Val

Phe

Tyr

Phe

Gly

Asn

Gly

Trp

Ile

Pro

Thr

Leu

Ile

Thr

1

5

10

Phe

Val

Leu

Ala

Thr

Ser

Gin

Ala

Gin

Ala

Gly

Trp

Leu

Gin

20

25

Asp

Tyr

Gly

His

Leu

Ser

Val

Tyr

Arg

Lys

Pro

Lys

Trp

Asn

35

40

Leu

Val

His

Lys

Phe

Val

Ile

Gly

His

Leu

Lys

Gly

Ala

Ser

50

55

Asn

Trp

Trp

Asn

His

Arg

His

Phe

Gin

His

His

Ala

Lys

Pro

65

70

Leu

Gly

Glu

Trp

Gin

Pro

Ile

Glu

Tyr

Gly

Lys

Xxx

80

85

Ala

His

His

Ala

Asn

2)

Informace o SEQ ID NO: 41:

(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 306	aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY:	aminokyselina	(tra
	3854933)
(xii)	Popis	sekvence:	SEQ ID NO: 41:

kontigu

Gin 1 Arg

Gly Pro

Thr Cys

Pro Arg 5 Glu Glu 20

Tyr Arg

Phe Trp

Thr Leu

Trp 10 Val 25

Asp Glu Ile Asp

Val Arg

Ala Lys

Gin 15 Val 30

Ser

Gly

Tyr

Asn

Ile

Ser

Glu Phe

Thr

Arg

Arg

His

Pro Gly

Gly

Ser

Arg

35

40

45

Val

Ile

Ser

His

Tyr Ala

Gly

Gin

Asp

Ala

Thr Asp

Pro

Phe

Val

50

55

60

Ala

Phe

His

Ile

Asn Lys

Gly

Leu

Val

Lys

Lys Tyr

Met

Asn

Ser

65

70

75

Leu

Leu

Ile

Gly

Glu Leu

Ser

Pro

Glu

Gin

Pro Ser

Phe

Glu

Pro

80

85

90

Thr

Lys

Asn

Lys

Glu Leu

Thr

Asp

Glu

Phe

Arg Glu

Leu

Arg

Ala

95

100

105

Thr

Val

Glu

Arg

Met Gly

Leu

Met

Lys

Ala

Asn His

Val

Phe

Phe

-

110

115

120

Leu

Leu

Tyr

Leu

Leu His

Ile

Leu

Leu

Leu

Asp Gly

Ala

Ala

Trp

125

130

135

Leu

Thr

Leu

Trp

Val Phe

Gly

Thr

Ser

Phe

Leu Pro

Phe

Leu

Leu

140

145

150

-

- ·.

m a

Val

Gin

Ala

Gin Ala

Gly

Trp

Leu

«* ···· ··

2)

173

Gin	His	Asp	Phe	155 Gly	His	Leu	Ser	Val
Asn	His	Leu	Leu	170 His	His	Phe	Val	Ile
Pro	Ala	Ser	Trp	185 Trp	Asn	His	Met	His
Pro	Asn	Cys	Phe	200 Arg	Lys	Asp	Pro	Asp
Phe	Phe	Ala	Leu	215 Gly	Lys	Ile	Leu	Ser
Lys	Lys	Lys	Tyr	230 Met	Pro	Tyr	Asn	His
Leu	Ile	Gly	Pro	245 Pro	Ala	Leu	Leu	Pro
Ile	Phe	Tyr	Phe	260 Val	Ile	Gin	Arg	Lys
Trp	Ile	Ser	Lys	275 Gin	Glu	Tyr	Asp	Glu
Thr	Ala	Asn	Ala	290 Ser 305	Lys

Informace ο

SEQ ID NO :

»> » » · · ··«· ···’ · 0 · 0 β- 0 β • » · 9 * ·· # 4 « • 0 0* «««· ··*♦ · · ··»♦ · ♦ 99

160 165

Phe Ser Thr Ser Lys Trp
175 Gly His 190	Leu His	Lys Gly His Ala	180 Ala 195 Lys 210
Phe 205	Gin
Ile	Asn	Met	His	Pro	Phe
220					225
Val	Glu	Leu	Gly	Lys	Gin
235					240
Gin	His	Xxx	Tyr	Phe	Phe
250					255
Leu	Tyr	Phe	Gin	Trp	Tyr
265					270
Lys	Trp	Val	Asp	Leu	Ala
280					285
Ala	Gly	Leu	Pro	Leu	Ser
295					300

i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 566	aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE:	lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY:	aminokyselina	(trans
	2511785)
xi)	Popis	sekvence:	SEQ ID NO: 42:

kontigu

His

Leu

Lys

Gly

Ala

Ser

Ala

Asn

Trp

Trp

Asn

His

Arg

His

Phe

1

5

10

15

Gin

His

His

Ala

Lys

Pro

Asn

Ile

Phe

His

Lys

Asp

Pro

Asp

Val

20

25

30

Asn

Met

Leu

His

Val

Phe

Val

Leu

Gly

Glu

Trp

Gin

Pro

Ile

Glu

35

40

45

Tyr

Gly

Lys

Lys

Lys

Leu

Lys

Tyr

Leu

Pro

Tyr

Asn

His

Gin

His

50

55

60

Glu

Tyr

Phe

Phe

Leu

Ile

Gly

Pro

Pro

Leu

Leu

Ile

Pro

Met

Tyr

65

70

75

Phe

Gin

Tyr

Gin

Ile

Ile

Met

Thr

Met

Ile

Val

His

Lys

Asn

Trp

80

85

90

Val

Asp

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

Ser

Tyr

Tyr

Ile

Arg

Phe

Phe

Ile

95

100

105

Thr

Tyr

Ile

Pro

Phe

Tyr

Gly

Ile

Leu

Gly

Ala

Leu

Leu

Phe

Leu

110

115

120

Asn

Phe

Ile

Arg

Phe

Leu

Glu

Ser

His

Trp

Phe

Val

Trp

Val

Thr

125

130

135

·» ····

Gin	Met	Asn	His	Ile 140	Val	Met	Glu	Ile
Asp	Trp	Phe	Ser	Ser 155	Gin	Leu	Thr	Ala
Ser	Phe'	Phe	Asn	Asp 170	Trp	Phe	Ser	Gly
Glu	His	His	Leu	Phe 185	Pro	Thr	Met	Pro
Ile	Ala	Pro	Leu	Val 200	Lys	Ser	Leu	Cys
Tyr	Gin	Glu	Lys	Pro 215	Leu	Leu	Arg	Ala
Ser	Leu	Lys	Lys	Ser 230	Gly	Lys	Leu	Trp
Lys	★ ★ ★	Ser	His	Ser 245	Pro	Arg	Asp	Thr
Trp	Gly	Asp	Gly	Gin 260	Arg	Asn	Asp	Gly
Ser	Glu	Arg	Leu	Val 275	Tyr	Ala	Leu	Leu
Leu	Ser	Pro	Phe	Leu 290	Leu	Ser	Phe	Phe
Ser	Thr	Leu	Pro	Ser 305	Trp	Asp	Leu	Pro
Ser	Ala	Met	Ala	Leu 320	Pro	Val	Pro	Pro
Ala	Glu	Arg	Trp	Pro 335	Pro	Gly	Val	Ala
Leu	Pro	Leu	Lys	Met 350	Gly	Gly	Asp	Gin
Cys	Glu	Ser	Pro	Leu 365	Ala	Ala	Trp	Ser
Leu	Val	Leu	Gin	Met 380	Leu	Leu	Gly	Phe
Arg	Ala	Gly	Pro	Leu 400	Thr	Leu	Pro	Ala
Arg	Leu	Pro	Leu	Val 415	His	Pro	Phe	Ile
Gin	Ser	Ser	Gly	Leu 430	Pro	Pro	Ala	Ala
Leu	Ser	★ * ★	Asp	Val 445	Gin	Gly	Pro	Arg
Pro	Asn	Leu	Gly	Pro 460	Trp	Lys	Ser	Pro
Ala	Leu	Thr	Leu	Gly 475	Phe	His	Gly	Pro
Thr	★ ★ ★	Ala	Cys	Asp 490	Leu	Gly	Thr	Lys
Leu	+ ★ ir	Leu	Ser	Arg 505	Gly	Ser	Gly	His
Trp	Pro	Gly	Gly	Ser 520	Ala	His	Pro	Pro
Leu	Arg	Ser	Lys	Ile 535	Leu	Glu	Gin	Ser
Leu Pro	Leu Gly	Ser Asp	Ala Val	Gly 550 Gly 565	Gin Pro	Cys Xxx	Gin	Pro

• ··· · e · » • ···· ··« * · · * « ······· » · ····

Gin	Glu	Ala	Tyr Arg 150
Cys	Asn	Val	Glu	Gin 165
Leu	Asn	Phe	Gin	Ile 180
His	Asn	Leu	His	Lys 195
Lys	His	Gly	Ile	Glu 210
Leu	Asp	Ile	Ile	Arg 225
Asp	Ala	Tyr	Leu	His 240
Gly	Lys	Gly	Cys	Arg 255
Leu	Phe	* * *	Gly	Val 270
Asp	Pro	Met	Leu	Asp 285
Ser	His	Leu	Pro	His 300
Leu	Ser	Arg	Gin	Pro 315
Pro	Phe	Phe	Gin	Gly 330
Ser	Tyr	Leu	His	Ser 345
Ser	Met	Gly	Leu	Ala 360
Gly	Ile	Thr	Pro	Ala 375
Gly	Ala	Gly	Pro	Ser 390
Leu	His	Ser	Pro	★ 410
Arg	Pro	Ala	Leu	Leu 425
Leu	Ser	Thr.	,Arg	Gly 440
Ala	Gly	Thr	Ala	Ser 455
Pro	His	His	* * ♦	Ser 470
Ser	Thr	Ala	Ser	Pro 485
Gly	Val	Pro	Arg	Leu 500
Gin	Gly	Gly	Ala	Gly 515
Phe	Pro	Gin	Gly	Val 530
Pro	Ser	Pro	Lys	Ala 545
Pro	Gly	His	Leu	Ala 560

• · • · • ·

175 (2) Informace o SEQ ID NO: 43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 619 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní

	(D)	TOPOLOGIE:	lineární
(ii) (xi)	DRUH MOLEKULY: 2535) Popis sekvence:	aminokyselina (trans SEQ ID NO: 43:
Val Phe 1	Tyr Phe	Gly Asn Gly Trp 5	Ile Pro Thr Leu Ile Thr Ala 10 15
Phe Val	Leu Ala	Thr Ser Gin Ala 20	Gin Ala Gly Trp Leu Gin His 25 30
Asp Tyr	Gly His	Leu Ser Val Tyr 35	Arg Lys Pro Lys Trp Asn His 40 45
Leu Val	His Lys	Phe Val Ile Gly 50	His Leu Lys Gly Ala Ser Ala 55 60
Asn Trp	Trp Asn	His Arg His Phe 65	Gin His His Ala Lys Pro Asn 70 75
Ile Phe	His Lys	Asp Pro Asp Val 8Ó	Asn Met Leu His Val Phe Val 85 90
Leu Gly	Glu Trp	Gin Pro Ile Glu 95	Tyr Gly Lys Lys Lys Leu Lys 100 105
Tyr Leu	Pro Tyr	Asn His Gin His 110	Glu Tyr Phe Phe Leu Ile Gly 115 120
Pro Pro	Leu Leu	Ile Pro Met Tyr 125	Phe Gin Tyr Gin Ile Ile Met 130 135
Thr Met	Ile Val	His Lys Asn Trp 140	Val Asp Leu Ala Trp Ala Val 145 150
Ser Tyr	Tyr Ile	Arg Phe Phe Ile 155	Thr Tyr Ile Pro Phe Tyr Gly 160 165
Ile Leu	Gly Ala	Leu Leu Phe Leu 170	Asn Phe Ile Arg Phe Leu Glu 175 180
Ser His	Trp Phe	Val Trp Val Thr 185	Gin Met Asn His Ile Val Met 190 195
Glu Ile	Asp Gin	Glu Ala Tyr Arg 200	Asp Trp Phe Ser Ser Gin Leu 205 210
Thr Ala	Thr Cys	Asn Val Glu Gin 215	Ser Phe Phe Asn Asp Trp Phe 220 225
Ser Gly	His Leu	Asn Phe Gin Ile 230	Glu His His Leu Phe Pro Thr 235 240
Met Pro	Arg His	Asn Leu His Lys 245	Ile Ala Pro Leu Val Lys Ser 250 255
Leu Cys	Ala Lys	His Gly Ile Glu 260	Tyr Gin Glu Lys Pro Leu Leu 265 270
Arg Ala	Leu Leu	Asp Ile Ile Arg 275	Ser Leu Lys Lys Ser Gly Lys 280 285
Leu Trp	Leu Asp	Ala Tyr Leu His 290	Lys *** Ser His Ser Pro Arg 295 300
Asp Thr	Val Gly	Lys Gly Cys Arg 305	Trp Gly Asp Gly Gin Arg Asn 310 315
Asp Gly	Leu Leu	Phe *** Gly Val 320	Ser Glu Arg Leu Val Tyr Ala 325 330
Leu Leu	Thr Asp	Pro Met Leu Asp 335	Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ser 340 345
Phe Phe	Ser Ser	His Leu Pro His 350	Ser Thr Leu Pro Ser Trp Asp 355 360
Leu Pro	Ser Leu	Ser Arg Gin Pro	Ser Ala Met Ala Leu Pro Val ττη 375

kontigu ·· · · ·· · · • · · · · · · ·«·· • · · · · · · ···« • · · · ·· ·· ··

Pro Pro Ser Pro Phe

Phe Gin

Gly Ala Glu Arg Trp 385

Pro

Pro

Gly 390

380

Val

Ala

Leu

Ser

Tyr

Leu

His

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Met

Gly

Gly

400

405

410

Asp

Gin'

Arg

Ser

Met

Gly

Leu

Ala

Cys

Glu

Ser

Pro

Leu

Ala

Ala

415

420

425

Trp

Ser

Leu

Gly

Ile

Thr

Pro

Ala

Leu

Val

Leu

Gin

Met

Leu

Leu

430

435

440

Gly

Phe

Ile

Gly

Ala

Gly

Pro

Ser

Arg

Ala

Gly

Pro

Leu

Thr

Leu

445

450

455

Pro

Ala

Trp

Leu

His

Ser

Pro

* * ★

Arg

Leu

Pro

Leu

Val

His

Pro

460

465

470

Phe

Ile

Glu

Arg

Pro

Ala

Leu

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Pro

Pro

475

480

485

Ala

Ala

Arg

Leu

Ser

Thr

Arg

Gly

Leu

Ser

★ ★ ★

Asp

Val

Gin

Gly

490

495

500

Pro

Arg

Pro

Ala

Gly

Thr

Ala

Ser

Pro

Asn

Leu

Gly

Pro

Trp

Lys

505

510

515

Ser

Pro

Pro

Pro

His

His

* * *

Ser

Ala

Leu

Thr

Leu

Gly

Phe

His

520

525

530

Gly

Pro

His

Ser

Thr

Ala

Ser

Pro

Thr

* ★ ★

Ala

Cys

Asp

Leu

Gly

535

540

545

Thr

Lys

Gly

Gly

Val

Pro

Arg

Leu

Leu

★ 4r 1r

Leu

Ser

Arg

Gly

Ser

550

555

560

Gly

His

Val

Gin

Gly

Gly

Ala

Gly

Trp

Pro

Gly

Gly

Ser

Ala

His

565

570

575

Pro

Pro

Ala

Phe

Pro

Gin

Gly

Val

Leu

Arg

Ser

Lys

Ile

Leu

Glu

580

585

590

Gin

Ser

Asp

Pro

Ser

Pro

Lys

Ala

Leu

Leu

Ser

Ala

Gly

Gin

Cys

595

600

605

Gin

Pro

Ile

Pro

Gly

His

Leu

Ala

Pro

Gly

Asp

Val

Gly

Pro

Xxx

610

615

620

2) Informace o SEQ ID NO: 44:

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

DÉLKA: 757 aminokyselin TYP: aminokyselina DRUH ŘETĚZCE: není relevantní TOPOLOGIE: lineární aminokyselina (translace kontigu (A) (B) (C) (D)

DRUH MOLEKULY: 253538a)

(x

i)

F

Opi

S SI

ekvence: S

KQ

ID

NO:

44:

Gin

Gly

Pro

Thr

Pro

Arg

Tyr

Phe

Thr

Trp

Asp

Glu

Val

Ala

Gin

1

5

10

15

Arg

Ser

Gly

Cys

Glu

Glu

Arg

Trp

Leu

Val

Ile

Asp

Arg

Lys

Val

20

25

30

Tyr

Asn

Ile

Ser

Glu

Phe

Thr

Arg

Arg

His

Pro

Gly

Gly

Ser

Arg

35

40

45

Val

Ile

Ser

His

Tyr

Ala

Gly

Gin

Asp

Ala

Thr

Asp

Pro

Phe

Val

50

55

60

Ala

Phe

His

Ile

Asn

Lys

Gly

Leu

Val

Lys

Lys

Tyr

Met

Asn

Ser

65

70

75

Leu

Leu

Ile

Gly

Glu

Leu

Ser

Pro

Glu

Gin

Pro

Ser

Phe

Glu

Pro

80

85

90

Thr

Lys

Asn

Lys

Glu

Leu

Thr

Asp

Glu

Phe

Arg

Glu

Leu

Arg

Ala

95

100

105

Thr

Val

Glu

Arg

Met

Gly

Leu

Met

Lys

Ala

Asn

His

Val

Phe

Phe

110

115

120

Leu

Leu

Tyr

Leu

Leu

His

Ile

Leu

Leu

Leu

Asp

Gly

Ala

Ala

Trp

125

130

135

• · · · • · • * · · · · • · ···· «# * ·

Leu

Thr'Leu Trp

Val 140

Phe

Gly

Thr Ser

Phe 145

Leu

Pro

Phe

Leu

Leu 150

Cys

Ala

Val

Leu

Leu

Ser

Ala

Val

Gin

Gin

Ala

Gin

Ala

Gly

Trp

155

160

165

Leu

Gin

His

Asp

Tyr

Gly

His

Leu

Ser

Val

Tyr

Arg

Lys

Pro

Lys

170

175

180

Trp

Asn

His

Leu

Val

His

Lys

Phe

Val

Ile

Gly

His

Leu

Lys

Gly

185

190

195

Ala

Ser

Ala

Asn

Trp

Trp

Asn

His

Arg

His

Phe

Gin

His

His

Ala

200

205

210

Lys

Pro

Asn

Ile

Phe

His

Lys

Asp

Pro

Asp

Val

Asn

Met

Leu

His

215

220

225

Val

Phe

Val

Leu

Gly

Glu

Trp

Gin

Pro

Ile

Glu

Tyr

Gly

Lys

Lys

230

235

240

Lys

Leu

Lys

Tyr

Leu

Pro

Tyr

Asn

His

Gin

His

Glu

Tyr

Phe

Phe

245

250

255

Leu

Ile

Gly

Pro

Pro

Leu

Leu

Ile

Pro

Met

Tyr

Phe

Gin

Tyr

Gin

260

265

270

Ile

Ile

Met

Thr

Met

Ile

Val

His

Lys

Asn

Trp

Val

Asp

Leu

Ala

275

280

285

Trp

Ala

Val

Ser

Tyr

Tyr

Ile

Arg

Phe

Phe

Ile

Thr

Tyr

Ile

Pro

290

295

300

Phe

Tyr

Gly

Ile

Leu

Gly

Ala

Leu

Leu

Phe

Leu

Asn

Phe

Ile

Arg

305

310

315

Phe

Leu

Glu

Ser

His

Trp

Phe

Val

Trp

Val

Thr

Gin

Met

Asn

His

320

325

330

Ile

Val

Met

Glu

Ile

Asp

Gin

Glu

Ala

Tyr

Arg

Asp

Trp

Phe

Ser

335

340

345

Ser

Gin

Leu

Thr

Ala

Thr

Cys

Asn

Val

Glu

Gin

Ser

Phe

Phe

Asn

350

355

360

Asp

Trp

Phe

Ser

Gly

His

Leu

Asn

Phe

Gin

Ile

Glu

His

His

Leu

365

370

375

Phe

Pro

Thr

Met

Pro

Arg

His

Asn

Leu

His

Lys

Ile

Ala

Pro

Leu

380

385

390

Val

Lys

Ser

Leu

Cys

Ala

Lys

His

Gly

Ile

Glu

Tyr

Gin

Glu

Lys

400

405

410

Pro

Leu

Leu

Arg

Ala

Leu

Leu

Asp

Ile

Ile

Arg

Ser

Leu

Lys

Lys

415

420

425

Ser

Gly

Lys

Leu

Trp

Leu

Asp

Ala

Tyr

Leu

His

Lys

★ ★ ★

Ser

His

430

435

440

Ser

Pro

Arg

Asp

Thr

Val

Gly

Lys

Gly

Cys

Arg

Trp

Gly

Asp

Gly

445

450

455

Gin

Arg

Asn

Asp

Gly

Leu

Leu

Phe

ie -k -ie

Gly

Val

Ser

Glu

Arg

Leu

460

465

470

Val

Tyr

Ala

Leu

Leu

Thr

Asp

Pro

Met

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

Phe

475

480

485

Leu

Leu

Ser

Phe

Phe

Ser

Ser

His

Leu

Pro

His

Ser

Thr

Leu

Pro

490

495

500

Ser

Trp

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu

Ser

Arg

Gin

Pro

Ser

Ala

Met

Ala

505

510

515

Leu

Pro

Val

Pro

Pro

Ser

Pro

Phe

Phe

Gin

Gly

Ala

Glu

Arg

Trp

520

525

530

Pro

Pro

Gly

Val

Ala

Leu

Ser

Tyr

Leu

His

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

535

540

545

Met

Gly

Gly

Asp

Gin

Arg

Ser

Met

Gly

Leu

Ala

Cys

Glu

Ser

Pro

550

555

560

Leu

Ala

Ala

Trp

Ser

Leu

Gly

Ile

Thr

Pro

Ala

Leu

Val

Leu

Gin

565

570

575

Met

Leu

Leu

Gly

Phe

Ile

Gly

Ala

Gly

Pro

Ser

Arg

Ala

Gly

Pro

580

585

590

Leu

Thr

Leu

Pro

Ala

Trp

Leu

His

Ser

Pro

★ O

Arg

Leu

Pro

Leu

595

600

605

Val

His

Fto

Phe

Ile

Glu

Arg

Pro

Ala

Leu

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

610

615

620

Leu

Pro

Pro

Ala

Ala

Arg

Leu

Ser

Thr

Arg

Gly

Leu

Ser

+ ★ -k

Asp

625

630

635

Val

Gin

Gly

Pro

Arg

Pro

Ala

Gly

Thr

Ala

Ser

Pro

Asn

Leu

Gly

640

645

650

Pro

Trp

Lys

Ser

Pro

Pro

Pro

His

His

★ * ★

Ser

Ala

Leu

Thr

Leu

655

660

665

··· · · · · ··· *··» · · · * ·· • ·

178

•

•

• ·

Gly

Phe

His

Gly

Pro

His

Ser

Thr

Ala

Ser

Pro

Thr

Ala

Cys

670

675

680

Asp

Leu

Gly

Thr

Lys

Gly

Gly

Val

Pro

Arg

Leu

Leu

★ ★ ★

Leu

Ser

685

690

695

Arg

Gly

Ser

Gly

His

Val

Gin

Gly

Gly

Ala

Gly

Trp

Pro

Gly

Gly

700

705

710

Ser

Ala

His

Pro

Pro

Ala

Phe

Pro

Gin

Gly

Val

Leu

Arg

.Ser

Lys

715

720

725

Ile

Leu

Glu

Gin

Ser

Asp

Pro

Ser

Pro

Lys

Ala

Leu

Leu

Ser

Ala

730

735

740

Gly

Gin

Cys

Gin

Pro

Ile

Pro

Gly

His

Leu

Ala

Pro

Gly

Asp

Val

745

750

755

Gly

Pro

Xxx

(2) Informace o SEQ ID NO: 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 746 nukleové kyseliny
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY: nukleová kyselina
xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 45:

CGTATGTCAC TCCATTCCAA ACTCGTTCAT GGTATCATAA ATATCAACAC ATTTACGCTC 60 CACTCCTCTA TGGTATTTAC ACACTCAAAT ATCGTACTCA AGATTGGGAA GCTTTTGTAA 120 AGGATGGTAA AAATGGTGCA ATTCGTGTTA GTGTCGCCAC AAATTTCGAT AAGGCCGCTT 180 ACGTCATTGG TAAATTGTCT TTTGTTTTCT TCCGTTTCAT CCTTCCACTC CGTTATCATA 240 GCTTTACAGA TTTAATTTGT TATTTCCTCA TTGCTGAATT CGTCTTTGGT TGGTATCTCA 300 CAATTAATTT CCAAGTTAGT CATGTCGCTG AAGATCTCAA ATTCTTTGCT ACCCCTGAAA 360 GACCAGATGA ACCATCTCAA ATCAATGAAG ATTGGGCAAT CCTTCAACTT AAAACTACTC 420 AAGATTATGG TCATGGTTCA CTCCTTTGTA CCTTTTTTAG TGGTTCTTTA AATCATCAAG 480 TTGTTCATCA TTTATTCCCA TCAATTGCTC AAGATTTCTA CCCACAACTT GTACCAATTG 540 TAAAAGAAGT TTGTAAAGAA CATAACATTA CTTACCACAT TAAACCAAAC TTCACTGAAG 600 CTATTATGTC ACACATTAAT TACCTTTACA AAATGGGTAA TGATCCAGAT TATGTTAAAA 660 AACCATTAGC CTCAAAAGAT GATTAAATGA AATAACTTAA AAACCAATTA TTTACTTTTG 720 ACAAACAGTA ATATTAATAA ATACAA 746 (2) Informace o SEQ ID NO: 46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 227 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 46:

• ·

Tyr Val 1	Thr	Pro	Phe Gin Thr Arg Ser Trp Tyr His	Lys Tyr Gin 15
5	10
His Ile '	Tyr	Ala	Pro Leu	Leu Tyr Gly Ile Tyr Thr	Leu Lys Tyr
			20	25	30
Arg Thr	Gin	Asp	Trp Glu	Ala Phe Val Lys Asp Gly	Lys Asn Gly
			35	40	45
Ala Ile	Arg	Val	Ser Val	Ala Thr Asn Phe Asp Lys	Ala Ala Tyr
			50	55	60
Val Ile	Gly	Lys	Leu Ser	Phe Val Phe Phe Arg Phe	Ile Leu Pro
			65	70	75
Leu Arg	Tyr	His	Ser Phe	Thr Asp Leu Ile Cys Tyr	Phe Leu Ile
			80	85	90
Ala Glu	Phe	Val	Phe Gly	Trp Tyr Leu Thr Ile Asn	Phe Gin Val
			95	100	105
Ser His	Val	Ala	Glu Asp	Leu Lys Phe Phe Ala Thr	Pro Glu Arg
			110	115	120
Pro Asp	Glu	Pro	Ser Gin	Ile Asn Glu Asp Trp Ala	Ile Leu Gin
			125	130	135
Leu Lys	Thr	Thr	Gin Asp	Tyr Gly His Gly Ser Leu	Leu Cys Thr
			140	145	150
Phe Phe	Ser	Gly	Ser Leu	Asn His Gin Val Val His	His Leu Phe
			155 .	160	165
Pro Ser	Ile	Ala	Gin.Asp	Phe Tyr Pro Gin Leu Val	Pro Ile Val
			170	175	180
Lys Glu	Val	Cys	Lys Glu	His Asn Ile Thr Tyr His	Ile Lys Pro
			185	190	195
Asn Phe	Thr	Glu	Ala Ile	Met Ser His Ile Asn Tyr	Leu Tyr Lys
			200	205	210
Met Gly	Asn	Asp	Pro Asp	Tyr Val Lys Lys Pro Leu	Ala Ser Lys
			215	220	225
Asp Asp	* * *

(2) Informace o SEQ ID NO: 47:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 494 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(0)	DRUH ŘETĚZCE: není relevant
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: nukleová kyselina
xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 47:

TTTTGGAAGG NTCCAAGTTN ACCACGGANT NGGCAAGTTN ACGGGGCGGA AANCGGTTTT 60 CCCCCCAAGC CTTTTGTCGA CTGGTTCTGT GGTGGCTTCC AGTACCAAGT CGACCACCAC 120 TTATTCCCCA GCCTGCCCCG ACACAATCTG GCCAAGACAC ACGCACTGGT CGAATCGTTC 180 TGCAAGGAGT GGGGTGTCCA GTACCACGAA GCCGACCTCG TGGACGGGAC CATGGAAGTC 240 TTGCACCATT TGGGCAGCGT GGCCGGCGAA TTCGTCGTGG ATTTTGTACG CGACGGACCC 300 GCCATGTAAT CGTCGTTCGT GACGATGCAA GGGTTCACGC ACATCTACAC ACACTCACTC 360 ACACAACTAG TGTAACTCGT ATAGAATTCG GTGTCGACCT GGACCTTGTT TGACTGGTTG 420 GGGATAGGGT AGGTAGGCGG ACGCGTGGGT CGNCCCCGGG AATTCTGTGA CCGGTACCTG 480 GCCCGCGTNA AAGT 404 ··· «*·· ··· • · · * · * « · ··

180 · .... ...

(2) Informace o SEQ ID NO: 48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 87 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
li)	DRUH	MOLEKULY: peptid
xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 48:

Phe 1

Trp Lys

Xxx

Pro Ser Xxx 5

Pro Arg Xxx Xxx Gin Val Xxx Gly

10

15

Ala

Glu

Xxx

Gly

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Phe

Val

Asp

Trp

Phe

Cys

20

25

30

Gly

Gly

Phe

Gin

Tyr

Gin

Val

Asp

His

His

Leu

Phe

Pro

Ser

Leu

35

40

45

Pro

Arg

His

Asn

Leu

Ala

Lys

Thr

His

Ala

Leu

Val

Glu

Ser

Phe

50

55

60

Cys

Lys

Glu

Trp

Gly

Val

Gin

Tyr

His

Glu

Ala

Asp

Leu

Val

Asp

65

70

75

Gly

Thr

Met

Glu

Val

Leu

His

His

Leu

Gly

Ser

Val

Ala

Gly

Glu

65

70

75

Phe

Val

Val

Asp

Phe

Val

Arg

Asp

Gly

Pro

Ala

Met

80

85

(2) Informace o SEQ ID NO: 49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 520 nukleových kyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 49:

GGATGGAGTT CGTCTGGATC GCTGTGCGCT ACGCGACGTG GTTTAAGCGT CATGGGTGCG 60 CTTGGGTACA CGCCGGGGCA GTCGTTGGGC ATGTACTTGT GCGCCTTTGG TCTCGGCTGC 120 ATTTACATTT TTCTGCAGTT CGCCGTAAGT CACACCCATT TGCCCGTGAG CAACCCGGAG 180 GATCAGCTGC ATTGGCTCGA GTACGCGCGG ACCACACTGT GAACATCAGC ACCAAGTCGT 240 GGTTTGTCAC ATGGTGGATG TCGAACCTCA ACTTTCAGAT CGAGCACCAC CTTTTCCCCA 300 CGGCGCCCCA GTTCCGTTTC AAGGAGATCA GCCCGCGCGT CGAGGCCCTC TTCAAGCGCC 360 ACGGTCTCCC TTACTACGAC ATGCCCTACA CGAGCGCCGT CTCCACCACC TTTGCCAACC 420 TCTACTCCGT CGGCCATTCC GTCGGCGACG CCAAGCGCGA CTAGCCTCTT TTCCTAGACC 480 TTAATTCCCC ACCCCACCCC ATGTTCTGTC TTCCTCCCGC 520 • «

181

2) Informace o SEQ ID NO: 50:

(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A) DÉLKA: 153	aminokyselin
	(B) TYP: aminokyselina
	(C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: peptid
(xi)	Popis sekvence:	SEQ ID NO: 50:
Met Glu Phe	Val Trp Ile Ala Val	Arg Tyr Ala Thr Trp Phe Lys
1	5	10 15
Arg His Gly	Cys Ala Trp Val His	Ala Gly Ala Val Val Gly His
	20	25 30
Val Leu Val	Arg Leu Trp Ser Arg	Leu His Leu His Phe Ser Ala
-	35	40 45
Val Arg Arg	Lys Ser His Pro Phe	Ala Arg Glu Gin Pro Gly Gly
	50	55 60
Ser Ala Ala	Leu Ala Arg Val Arg	Ala Asp His Thr Val Asn Ile
	65	70 75
Ser Thr Lys	Ser Trp Phe Val Thr	Trp Trp Met Ser Asn Leu Asn
	80	85 90
Phe Gin Ile	Glu His His Leu Phe	Pro Thr Ala Pro Gin Phe Arg
	95	100 105
Phe Lys Glu	Ile Ser Pro Arg Val	Glu Ala Leu Phe Lys Arg His
	110	115 120
Gly Leu Pro	Tyr Tyr Asp Met Pro	Tyr Thr Ser Ala Val Ser Thr
	125	130 135
Thr Phe Ala	Asn Leu Tyr Ser Val	Gly His Ser Val Gly Asp Ala
	140	145 150

Lys Arg Asp

2) Informace o SEQ ID NO: 51:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 429 nukleových kyselin
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: nukleová kyselina
(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 51:

ACGCGTCCGC CCACGCGTCC GCCGCGAGCA ACTCATCAAG GAAGGCTACT TTGACCCCTC 60 GCTCCCGCAC ATGACGTACC GCGTGGTCGA GATTGTTGTT CTCTTCGTGC TTTCCTTTTG 120 GCTGATGGGT CAGTCTTCAC CCCTCGCGCT CGCTCTCGGC ATTGTCGTCA GCGGCATCTC 180 TCAGGGTCGC TGCGGCTGGG TAATGCATGA GATGGGCCAT GGGTCGTTCA CTGGTGTCAT 240 TTGGCTTGAC GACCGGTTGT GCGAGTTCTT TTACGGCGTT GGTTGTGGCA TGAGCGGTCA 300 TTACTGGAAA AACCAGCACA GCAAACACCA CGCAGCGCCA AACCGGCTCG AGCACGATGT 360 AGATCTCAAC ACCTTGCCAT TGGTGGCCTT CAACGAGCGC GTCGTGCGCA AGGTCCGACC 420

9 99 9 9 • · · ···· » * · * • · · · ·· · * a · ·

182 • · • · * « • ·

Informace o SEQ ID NO: 52:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 125 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 52:

Arg Val Arg

Pro Arg

Val Arg Arg Glu Gin Leu Ile

Lys

Glu Gly

1

5

10

15

Tyr

Phe

Asp

Pro

Ser

Leu

Pro

His

Met

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Glu

20

25

30

Ile

Val

Val

Leu

Phe

Val

Leu

Ser

Phe

Trp

Leu

Met

Gly

Gin

Ser

35

40

45

Ser

Pro

Leu

Ala

Leu

Ala

Leu

Gly

Ile

Val

Val

Ser

Gly

Ile

Ser

50

55

60

Gin

Gly

Arg

Cys

Gly

Trp

Val

Met

His

Glu

Met

Gly

His

Gly

Ser

65

70

75

Phe

Thr

Gly

Val

Ile

Trp

Leu

Asp

Asp

Arg

Leu

Cys

Glu

Phe

Phe

65

70

75

Tyr

Gly

Vai

Gly

Cys

Gly

Met

Ser

Gly

His

Tyr

Trp

Lys

Asn

Gin

80

85

90

His

Ser

Lys

His

His

Ala

Ala

Pro

Asn

Arg

Leu

Glu

His

Asp

Val

95

100

105

Asp

Leu

Asn

Thr

Leu

Pro

Leu

Val

Ala

Phe

Asn

Glu

Arg

Val

Val

110

115

120

Arg

Lys

Val

Arg

Pro

125

• · · ·

Claims (17)

1. Konstrukce nukleové kyseliny obsahující jednu nebo více nukleotidových sekvencí uvedených v SEQ ID NO: vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5, kde uvedená jedna nebo více nukleotidových sekvencí je spojena s heterogenní nukleotidovou sekvencí.

2. Konstrukce nukleové kyseliny obsahující jednu nebo více nukleotidových sekvencí uvedených v SEQ ID NO: vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5, kde uvedená jedna nebo více nukleotidových sekvencí je operativně spojena se sekvencí, která řídí expresi a je funkční v rostlinné buňce.

3. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 2, kde uvedená nukleotidová sekvence vykazuje průměrný obsah A+T menší než přibližně 60 %.

4. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 2, kde uvedená nukleotidová sekvence se získala z hub.

5. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 4, kde uvedenou houbou je rod Mortierella.

6. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 5, kde uvedenou houbou je druh alpina.

7. Konstrukce nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2, přičemž uvedená nukleotidová sekvence je operativně spojena se sekvencí, která řídí transkripci nebo expresi a je funkční v rostlinné buňce, kde uvedená nukleotidová sekvence kóduje funkčně aktivní polypeptid, jenž desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze 6-tého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

8. Konstrukce nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující

184 aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 4, kde uvedená nukleotidová sekvence je operativně spojená se sekvencí, která řídí transkripci a expresi a je funkční v rostlinné buňce, kde uvedená nukleotidová sekvence kóduje funkčně aktivní polypeptid, jenž desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze dvanáctého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

9. Konstrukce nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 6, kde uvedená nukleotidová sekvence je operativně spojena se sekvencí řídící transkripci a expresi a je funkční v rostlinné buňce, přičemž uvedená nukleotidová sekvence kóduje funkčně aktivní polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce uvedené molekuly mastné kyseliny.

10. Konstrukce nukleové kyseliny obsahující alespoň jednu nukleotidovou sekvenci, která kóduje funkčně aktivní desaturázu, jenž má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 6, přičemž uvedená nukleotidová sekvence je operativně spojená s promotorem, který je funkční v rostlinné buňce.

11. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 10, kde uvedená rostlinná buňka je buňka semene.

12. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 11, kde uvedená rostlinná buňka je embryonální buňka.

13. Rekombinantní rostlinná buňka, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu kopii sekvence DNA, která kóduje alespoň jednu funkčně aktivní desaturázu mastné kyseliny Mortierella alpina, což vede k produkci polynenasycené mastné kyseliny, přičemž aminokyselinová sekvence uvedené desaturázy mastné kyseliny je uvedena v SEQ ID NO: vybrané ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 2, • 9

185

SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 6, přičemž uvedená buňka se transformovala vektorem, jenž obsahuje uvedenou sekvenci DNA a kde uvedená sekvence DNA je operativně spojená se

sekvencí řídící expresi. 14. Rekombinantní rostlinná buňka podle nároku 13, vyznačuj ící se tím, ž e polynenasycená mastná kyselina se vybrala ze skupiny zahrnující LA, ARA, GLA, DGLA, SDA a EPA. 15. Rekombinantní rostlinná buňka podle nároku 13, vyznačuj ící se tím, ž e je obohacena

mastnou kyselinou vybranou ze skupiny obsahující 18:1, 18:2, 18:3 a 18:4.

16. Rekombinantní rostlinná buňka podle nároku 15, vyznačující se t 1 m, že se vybrala ze skupiny zahrnující Brassica , sóju, světlící, kukuřici, len a slunečnici. 17. Rekombinantní rostlinná buňka podle nároku 16,

vyznačující se tím, že uvedená sekvence řídící expresi je pro uvedenou rostlinou buňku endogenní.

18. Jeden nebo více rostlinných olejů, vyznačující se tím, že jsou exprimovány rekombinantní rostlinnou buňkou podle nároku 16.

19. Způsob získání změněné biosyntézy polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem, vyznačující se tím, že zahrnuje pěstování rostliny mající buňky, které obsahují transgen kódující produkt exprese transgenu, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny, kde uvedený transgen je operativně spojen se sekvencí řídící expresi za podmínek, kdy se uvedený transgen exprimuje, čímž se v uvedených buňkách mění biosyntéza polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem.

20. Způsob získání změněné biosyntézy polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem, vyznačující se • · • · • ·

186 tím, že zahrnuje kroky pěstování rostliny mající buňky, které obsahují jeden nebo více transgenů získaných z hub nebo řas, které kódují produkt exprese transgenů desaturující molekulu mastné kyseliny v poloze pátého, šestého nebo dvanáctého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny, kde uvedený jeden nebo více transgenů je operativně spojen se sekvencí řídící expresi za podmínek, kdy se jeden nebo více uvedených transgenů exprimuje, čímž se mění v uvedených buňkách biosyntéza polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem.

21. Způsob podle nároků 19 nebo 20, vyznačující se tím, že polynenasycená mastná kyselina se vybrala ze skupiny zahrnující LA, ARA, GLA, DGLA, SDA a EPA.

Rostlinný olej nebo jeho frakce, vyzná č u j ící setím, že se produkuj 1 způsobem ; podél nároků 19 nebo 20. Způsob léčby a prevence podvýživy, vyzná č u j ící se tím, že zahrnuj e aplikaci uvedeného rostlinného oleje podle nároku 22 pacientovi, který potřebuje uvedenou léčbu nebo prevenci, v množství, jenž je dostatečné, aby způsobilo uvedenou léčbu nebo

prevenci.

24. Farmaceutická kompozice, v y z n a č u j í cl se tím, že obsahuje uvedený rostlinný olej nebo frakci podle nároku : 22 a farmaceuticky přijatelný nosič. 25. Farmaceutická kompozice podle nároku 24, v y z n a č u j í c í s e t í m, že je v kapalné nebo pevné formě. 26. Farmaceutická kompozice podle nároku 25, v y z n a č u jící se tí m, že' je ve formě kapsulí nebo tablet. 27. Farmaceutická kompozice podle nároku 24, v y z n a č u jící se tím, ž e dále obsahuj e

187 «· ··«· · · • · · · · « · · · · · alespoň jeden nutrient vybraný ze skupiny zahrnující vitamin, minerál, sacharid, aminokyselinu, volnou mastnou kyselinu, fosfolipid, antioxidant a fenolovou sloučeninu.

28. Výživový přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje uvedený rostlinný olej nebo jeho frakci podle nároku 22.

29. Výživový přípravek podle vyznačující se tím, že skupiny obsahující kojeneckou výživu, potravinový doplněk a potravinovou náhradu.

nároku 28, se vybral ze

30. Výživový přípravek podle nároku vyznačující se tím, že se kojenecká výživa, potravinový doplněk a náhrada je v kapalné nebo pevné formě.

31. Kojenecká výživa, vyznačuj ící obsahuje uvedený rostlinný olej nebo jeho frakci podle nároku 22.

32. Kojenecká výživa podle nároku 31, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jeden makronutrient vybraný ze skupiny zahrnující kokosový olej, sojový olej, olej kanoly, mono- a diglyceridy, glukózu, poživatelnou laktózu, elektrodialyzovatelnou syrovátku, elektrodialyzované netučné mléko, mléčnou syrovátku, sojový protein a jiné proteinové hydrolyzáty.

29, uvedená potravinová se tím, podle z e ze nároku 32, dále obsahuje skupiny obsahující

33. Kojenecká výživa vyznačující se tím, alespoň jeden vitamin vybraný vitaminy A, C, D, E a B komplex a alespoň jeden minerál ze skupiny zahrnující vápník, hořčík, zinek, mangan, sodík, draslík, fosfor, měď, chlorid, jodid, selen a železo.

34. Potravinový doplněk, vyznačující se tím, ž e obsahuje uvedený rostlinný olej nebo jeho frakci podle nároku 22.

• ·

188

35. Potravinový doplněk podle vyznačující se tím, že nároku 34, dále obsahuje alespoň jeden makronutríent vybraný ze skupiny zahrnující kokosový olej, sojový olej, olej kanoly, mono- a diglyceridy, glukózu, poživatelnou laktózu, elektrodialyzovatelnou syrovátku, elektrodialyzovatelné netučné mléko, mléčnou syrovátku, sojový protein a jiné proteinové hydrolyzáty.

36. Potravinový doplněk podle nároku 35, dále obsahuje vyznačující se tím, alespoň jeden vitamin vybraný vitaminy A, C, D, E a P komplex a alespoň jeden minerál ze skupiny zahrnující vápník, hořčík, zinek, mangan, sodík, draslík, fosfor, měď, chlorid, jód, selen a železo.

ze skupiny obsahující

37. Potravinový podle doplněk vyznačující se tím, nebo zvířeti.

38. Potravinová náhrada, nároku 34 nebo 36, ž e se aplikuje člověku vyznačující se tím, ž e obsahuje uvedený rostlinný olej nebo jeho frakci podle nároku 22.

Potravinová náhrada podle vyznačující se tím, že alespoň jeden makronutríent vybraný ze kokosový olej, sojový olej, olej diglyceridy, glukózu, poživatelnou elektrodialyzovatelnou syrovátku, elektrodialyzovatelné netučné mléko, mléčnou syrovátku, sojový protein a jiné proteinové hydrolyzáty.

nároku 38, dále obsahuje skupiny zahrnující mono- a laktózu, kanoly,

40. Potravinová náhrada podle nároku 39, dále obsahuje skupiny obsahující z e ze vyznačující se tím, alespoň jeden vitamin vybraný vitaminy A, C, D, E a P komplex a alespoň jeden minerál ze skupiny zahrnující vápník, hořčík, zinek, mangan, sodík, draslík, fosfor, měď, chlorid, jód, selen a železo.

• ·

189

Potravinová náhrada podle nároku 38 nebo 40, vyznačující se tím, že se aplikuje člověku nebo zvířeti.

Způsob léčby pacienta, který trpí stavem způsobeným nedostatečným příjmem nebo produkcí polynenasycených mastných kyselin, vyznačující se tím, že se uvedenému pacientovi aplikuje uvedená potravinová náhrada podle nároku 38 nebo uvedený potravinový doplněk podle nároku 34 v množství fostatečném, aby způsobil uvedenou léčbu.

Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že se uvedená potravinová náhrada nebo uvedený potravinový doplněk aplikuje enterálně nebo parenterálně.

Kosmetický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje uvedený rostlinný olej nebo jeho frakci podle nároku 22.

Kosmetický přípravek vyznačující se povrchově.

Farmaceutická kompozice podle t 1 m, nároku

44, že se aplikuje nároku 24, se aplikuje podle ž e vyznačující se tím, člověku nebo zvířeti.

Krmení pro zvířata, vyznačující se tím, že obsahuje rostlinný olej nebo jeho frakci podle nároku 22. Izolovaná nukleotidová sekvence obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 38 až SEQ ID NO: 44, kde uvedená nukleotidová sekvence se exprimuje v rostlinné buňce.