CZ358299A3 - Izolovaná nukleová kyselina - Google Patents

Abstract

Popisuje se D5-desaturázamastných kyselin schopnákatalyzovat přeměnu dihomo-gama-linolenové kyseliny na kyselinu arachidonovou. Dále se popisuje sekvence nuldeové kyseliny kódující D5-desaturázu, sekvence nukleové kyseliny, které s ní hybridizuji, konstrukce DNA obsahující gen D5-desaturázy a rekorrbinantní hostitelskýmikroorganizmus nebo zvíře exponující zvýšené množství D5-desaturázy. Dále se popisují způsoby desaturace mastné kyseliny v poloze D5aprodukce kyseliny arachidonové expresí zvýšeného množství D5- desalurázy. Ivfestné kyseliny a olgeje obsahující, které se desaturovalyD5-desaturázou, se produkují vrekombinantních hostitelskýchmikroorganizmech azvířatech. Popisují se také farmaceutické kompozice, kojenecké výživy nebo potravinové doplňky obsahující mastné kyseliny desaturované D5-desaturázou produkovanou rekorrbinantnímhostitelskýmmikroorganizmem nebo zvířetem.

Description

Vynález popisuje modulační stupně enzymatických komponentů vztahujících se nenasycených mastných kyselin s dlouhými v mikroorganizmu nebo ve zvířeti.

enzymů a/nebo produkci polyřetězci (PUFA)

Dosavadní stav techniky

Dvě hlavní skupiny poly-nenasycených mastných kyselin (PUFA) jsou ©3-mastné kyseliny, jejichž zástupcem je kyselina ikosapentaenová (EPA), a ωβ-mastné kyseliny, které představuje kyselina arachidonová (ARA). PUFA jsou důležitými komponenty plazmatické membrány buněk, kde se mohou vyskytyvot v takových formách, jako jsou fosfolipidy. PUFA jsou nezbytné pro správný vývoj, zvláště při vývoji mozku kojenců, tvoření a obnově tkáně. PUFA také slouží jako prekurzory jiných molekul, které jsou důležité pro člověka a zvířata, mezi něž patří prostacyklin, ikosanoidy, leukotrieny a prostaglandiny.

Čtyři nejduležitější PUFA s dlouhým řetězcem zahrnují kyselinu dokosahexaenovou (DHA) a EPA, která se primárně nachází v různých typech rybího tuku, dále je to kyselina gama-linolenová (GLA), která se nachází v semenech řady rostlin, které zahrnují prvosenku {Oenothera biennis), brutnák lékařský {Borago officinalis) a černý rybíz (Ribes nigrům), a kyselina stearidonová (SDA), která se nachází mořských olejích a v semenech rostlin. GLA a další důležité PUFA s dlouhým řetězcem, jako je kyselina arachidonová (ARA) se nachází ve vláknitých houbách. ARA se mohou izolovat z tkáně zvířat zahrnující játra a žlázy vylučující adrenalin. GLA, ARA, EPA a SDA jsou samotné nebo jako potravní prekurzory důležitých mastných kyselin s dlouhým řetězcem, které se podílejí na • · ·· · · ····« • · · · · · a ······ η ··· · · ··

Z. ······ a······ · · ·· syntéze prostaglandinu, léčbě onemocnění srdce a vývoji mozkové tkáně.

Poly-nenasycené mastné kyseliny mají řadu farmaceutických i léčebných využití, která zahrnují léčbu onemocnění srdce, zhoubného bujení a artritidy.

V případě DHA existuje pro komerční produkci řada zdrojů zahrnující různé mořské organizmy, oleje získané z mořských ryb žijících v chladných vodách a z frakcí vaječného žloutku.

V případě ARA se mohou pro komerční produkci použít mikroorganizmy zahrnující rod Mortierella, Entomophthora, Phytium a Porphyridium. Běžné zdroje SDA zahrnují rod Tríchodesma a Echium. Komerční zdroje GLA zahrnují prvosenku, černý rybíz a brutník lékařský. Existuje však několik nevýhod, které jsou spojeny s komerční produkcí PUFA z přirozených zdrojů. Přirozené zdroje PUFA, jako jsou zvířata a rostliny, vykazují vysoce heterogenní složení olejů. Oleje získané z těchto zdrojů se musí za účelem separace jednoho nebo více požadovaných PUFA nebo produkce oleje, který je obohacen jedním nebo více PUFA extenzivně čistit. Přirozené zdroje jsou také vystaveny neřízené fluktuaci dostupnosti. Zásoby ryb mohou být také oslabeny nadměrným rybolovem. Rybí olej má nepříjemnou chuť a zápach, jehož odstranění není ekonomicky výhodné a takový produkt pak nemusí být přijatelný jako potravní doplněk. Zvířecí oleje a určité rybí oleje se mohou hromadit v látkách znečišťujících prostředí. Zde se mohou hromadit zvířecí oleje a zvláště pak rybí oleje. Kolísání výtěžku z rybích a rostlinných zdrojů může ovlivňovat počasí a výskyt nemocí. Půda dostupná pro produkci alternativních plodin produkujících olej soutěží s expanzí lidské populace, což je spojeno s rostoucími potřebami produkce potravin na zbývající orné půdě. Plodiny, které produkují PUFA, jako je brutník lékařský, nebyly přizpůsobeny pěstování ve velkém a neprospívají dobře, jestliže se pěstují jako monokultura. Pěstování takových plodin není pak ve srovnání s lépe • · • · · « · ···· • · · · · · · ······ o ··· ·· ·· ·· ···· ··· ···· ·· ·· prospívajícími a lépe zavedenými kulturami ekonomické. Fermentace organizmů, jako ‘je Mortierella, ve velkém měřítku je také nákladná. Přirozené tkáně zvířat obsahují malé množství ARA a těžko se zpracovávají. Mikroorganizmy, jako je Porphyridium a Mortiellera se těžko kultivují v komerčním měřítku.

Potravinové doplňky a farmaceutické formulace obsahující PUFA mají stejné nevýhody jako zdroje PUFA. Doplňky, jako jsou kapsule s rybím olejem, mohou obsahovat malé množství určitých požadovaných komponent a tak jsou nutné aplikovat ve vysokých dávkách. Vysoké dávky vedou k trávení velkého množství nežádoucích komponent, které zahrnují znečišťující látky. Nepříjemná chuť a zápach doplňků je může činit nežádoucí a pro pacienta pak může být problém dodržovat léčební plán. Velká pozornost se musí věnovat podávání doplňků mastných kyselin. Nadměrný příjem může vést k supresi endogenních biosyntetických cest a k soutěžení s jinými nezbytnými mastnými kyselinami v různých lipidových frakcích in vivo, což vede k nežádoucím výsledkům. Například eskymáci jejichž strava obsahuje velké množství ω3 mastných kyselin mají zvýšenou tendenci zvracet (US patent č. 4,874,603).

Na biosyntéze PUFA se podílí řada enzymů. Kyselina linolenová (LA, 18:2 Δ9, 12) se vyrábí z kyseliny olejové (18:1 Δ°) pomocí Al2-desaturázy. Produkce ARA (20:4 Δ5, 8, 11, 14) z kyseliny dihomo-gama-linoleové (DGLA, 20:3 Δ8, 11, 14) se katalyzuje A5-desaturázou. U zvířat však nemůže dojít k desaturaci za pozicí Δ9 a proto nemohou převést kyselinu olejovou (18:1 Δ9) na kyselinu linolenovou (18:2 Δ912).

Zvířata nemohou syntetizovat kyselinu α-linolenovou (ALA, 18:3 Δ9, 12, 15) . Jiné eukaryonty zahrnující houby a rostliny mají enzymy, které způsobují desaturaci v polohách Δ12 a Δ15. Hlavní poly-nenasycené mastné kyseliny zvířat se proto získávají buď z potravin a/nebo desaturaci a elongací kyseliny linolenové (18:2 Δ9, 12) nebo ot-linolenové (18:3 Δ9, 12, 15).

Proto je takový zájem o možnost získání genetického materiálu, který se podílí na biosyntéze PUFA z druhů, jenž přirozeně produkují mastné kyseliny, a exprimovat izolovaný materiál který se muže v mikrobiálním manipulovat za nebo zvířecím systému, účelem produkce komerčního množství jednoho nebo více PUFA. Je nutné získat desaturázy mastných kyselin, geny je kódující a rekombinantní způsoby jejich produkce. Dále je nutné vytvořit ekonomické způsoby produkce specifických PUFA.

Relevantní literatura

Produkce gama-linolenové kyseliny pomocí Δβ-desaturázou se popisuje v dokumentu USPN 5,552,306. Produkce 8,11ikosadienové kyseliny za použití Afortierella alpina se popisuje v USPN 5,376,541. Produkce kyseliny dokosahexaenové pomocí dinoflagelat se popisuje v USPN 5,407,957. Klonování A6-palmitoylacylové proteinové desaturázy se popisuje v publikaci PCT WO 96/13591 a USPN 5,614,400. Klonování Δ6 desaturázy z brutníku lékařského se popisuje v publikaci PCT WO 96/21022. Klonování A9-desaturáz se popisuje ve zvěřejněné patentové přihlášce PCT WO 91/13972, EP 0 550.162 Al, EP 0 561 569 A2, EP 0 644 263 A2 a EP 0 736 598 Al a USPN 5, 057,419. Klonování Δ12 desaturáz z různých organizmů se popisuje v PCT publikaci WO 94/11516 a USPN 5,443,974. Klonování Δ15 desaturáz z různých organizmů se popisuje v PCT publikaci WO 93/11245.

Podstata vynálezu

Popisují se nové kompozice a metody vhodné pro přípravu poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem nebo PUFA. Kompozice zahrnují nukleové kyseliny kódující Δ5 • · • β · · ····* ···· · ········ ··· ·♦ »· ······ ······· · · · · desaturázu a/nebo polypeptidy vykazující aktivitu Δ5desaturázy, polypeptidy a sondy vhodné pro izolaci a detekci. Metody zahrnují kultivaci hostitelského oragnizmu nebo zvířete, které obsahuje a exprimuje jeden nebo více transgenů kódujících A5-desaturázu a/nebo polypeptid vykazující aktivitu Δδ-desaturázy. Exprese polypeptidů desaturázy vede k relativnímu zvýšení A5-desaturovaných PUFA nebo metabolických progenů, které z nich vznikají, což je výsledek změněné koncentrace enzymů a substrátů podílejících se na biosyntéze PUFA. Vynález nachází použití například pří produkci olejů obsahujících PUFA ve velkém měřítku. Tyto oleje například zahrnují ARA, EPA a/nebo DHA.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje sekvence nukleové kyseliny obsahující A5-desaturázu uvedenou na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO: 1), polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou a čištěný a izolovaný polypeptid uvedený na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO: 2) a izolovaná nukleová kyselina kódující polypeptid uvedený na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO:

2) . V jiném provedení vynálezu se popisuje sekvence izolované nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, kde uvedený polypeptid desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce molekuly. Nukleová kyselina se s výhodou získala z eukaryontní buňky, jako je buňka hub rodu Mortierella nebo rodu/druhu Mortierella alpina. Preferuje se také izolovaná nukleová kyselina obsahující sekvenci, která teplotně hybridi zuje s nukleotidovou sekvencí uvedenou na obrázku č. 3A až 3D a nukleová kyselina, která kóduje aminokyselinovou sekvenci označenou na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO: 2). Zvláště se pak preferuje nukleová kyselina kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO: 2), která se vybrala ze skupiny obsahující aminokyselinové zbytky 30 až 38, 41 až 44, 171 až 175, 203 až 212 a 387 až 394. V dalším provedení podle vynálezu se popisuje izolovaný a čištěný polypeptid, který desaturuje • · molekulu mastné kyseliny v poloze uhlíku 5 od karboxylového konce molekuly. Také se popisuje sekvence izolované nukleové kyseliny, která hybridizuje s nukleotidovou sekvencí označenou na obrázku č. 3A až 3D (SEQ ID NO: 1), sekvence izolované nukleové kyseliny, která vykazuje alespoň přibližně 50 % shodu se sekvencí na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO: 1).

Vynález dále zahrnuje konstrukci nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci označenou na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO: 1) spojenou s heterogenní nukleovou kyselinou, konstrukci nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO: 1) operativně spojenou s promotorem a konstrukci nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO: 1) operativně spojenou s promotorem, který je funkční v mikrobiální buňce.V preferovaném provedení vynálezu je mikrobiální buňkou buňka kvasinky a nukleotidové sekvence se získala z hub, jako je houba rodu Mortierella, zvláště houba druhu Mortietella alpína.

V jiném provedení vynálezu se popisuje konstrukce nukleové kyseliny, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, jenž kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO: 2), kde nukleotidové sekvence je operativně spojena s promotorem, který funguje v hostitelské buňce, a nukleotidové sekvence kóduje polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny. Vynález dále popisuje konstrukci nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje funkčně aktivní Δ5desaturázu, kde desaturáza zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která odpovídá nebo je komplementární s celou nebo s částí aminokyselinové sekvence uvedené na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO: 2), kde nukleotidové sekvence je operativně spojena s promotorem funkčním v hostitelské buňce.

Vynález dále zahrnuje hostitelskou buňku obsahující konstrukci nukleová kyseliny podle vynálezu. V preferovaném provedení vynálezu se popisuje rekombinantní hostitelská buňka, která obsahuje alespoň jednu kopii sekvence DNA, která kóduje funkčně aktivní desaturázu mastné kyseliny Mortierella. alpina vykazující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO: 2), kde buňka nebo její předek se transformoval vektorem obsahující uvedenou sekvenci DNA a kde sekvence DNA je operativně spojena s promotorem. Hostitelskou buňkou je buď eukaryont nebo buňka vybraná ze skupiny, která zahrnuje savčí buňku, hmyzí buňku, buňku hub a řas. Preferované savčí buňky zahrnují ptačí buňku, buňku hub, jako je kvasinka a buňku mořských řas. Preferované prokaryontní buňky zahrnují ty vybrané ze skupiny, která obsahuje bakterie, cyanobakterie, buňky které obsahují bakteriofága a/nebo virus. Sekvence DNA rekombinantní hostitelské buňky přednostně obsahuje promotor, který je funkční v hostitelské buňce.

Hostitelské buňky podle vynálezu, které obsahují sekvence DNA podle vynálezu jsou obohaceny mastnými kyselinami, jako jsou 20:3 mastné kyseliny. V preferovaném provedení vynálezu jsou hostiteslké buňky obohaceny 20:4 mastnými kyselinami, což se porovnává netransformovanou hostitelskou buňkou, která je zbavena sekvence uvedené DNA a/nebo je obohacena 20:5 mastnými kyselinami ve srovnání s netransformovanou hostitelskou buňkou, která neobsahuje uvedenou sekvenci preferovaném provedení vynálezu se popisuje hostitelská buňka, která obsahuje mastnou kyselinu vybranou ze skupiny zahrnující dihomo-y-linolenovou kyselinu, n-6ikosatrienovou kyselinu, 20:3 n-6 kyselinu a 20:3(8,11,14) kyselinu.

Vynález také zahrnuje způsob produkce kyseliny arachidonové v kultuře nikrobiálních buněk, kde způsob zahrnuje kultivaci mikrobiálních buněk, přičemž kultura

DNA. V jiném rekombinantní řas je buňka mořské řasy.

zahrnují ty cyanobakterie, zaharnuje velké množství buněk, které obsahují jednu nebo více nukleových kyselin kódujících polypeptid, jenž mění kyselinu dihomo-y-linolenovou na arachidonovou, kde nukleová kyselina je operativně spojená s promotorem za podmínek, kdy se exprimuje jedna nebo více nukleových kyselin, přičemž kyselina arachidonová se produkuje v kultuře mikrobiálních buněk.

V několika dalších preferovaných provedeních vynálezu je polypeptid enzymem, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny; nukleová kyselina se získala z Mortierelle sp. a substrát uvedeného polypeptidů se dodává exogenním způsobem.

V této metodě se používají buď eukaryontní nebo prokaryontní buňky. Preferované eukaryontní buňky jsou ty, které se vybraly ze skupiny obsahující savčí buňky, hmyzí buňky a buňky hub a řas. Preferované savčí buňky zahrnují ptačí buňky, preferovanou buňkou houby je kvasinka a preferovanou buňkou

Preferované prokaryontní buňky skupiny obsahující bakterie, obsahují bakteriofága a/nebo kyseliny obsahuj e vybrané ze buňky, které virus. Sekvence nukleové mikrobiální buňky přednostně funkční v hostitelské buňce.

polypeptid který je je možné kódující promotor, promotor

Uvedený indukovat například komponenty kultivační půdy. Preferovanými mikrobiálními buňkami, které se v těchto metodách používají, jsou kvasinkové buňky, jako jsou buňky Saccharomyces.

V jiném provedení vynálezu se popisuje rekombinantní kvasinková buňka, která přeměňuje více jak přibližně 5 % substrátu mastné kyseliny 20:3 na produkt mastné kyseliny 20:4.

Vynález také zahrnuje olej obsahující jednu nebo více PUFA. Množství uvedeného jednoho nebo více PUFA je přibližně 0,3 až 30 % arachidonové kyseliny (ARA), přibližně 0,2 až 30 % dihomo-y-linolenové kyseliny (DGLA) a přibližně 0,2 až 30 % kyseliny γ-linolenové (GLA). Preferovaným olejem podle vynálezu je ten, kde poměr ARA:DGLA:GLA je přibližně 1,0:19,0:30 až 6,0:1,0:0,2. Jiným preferovaným provedením podle vynálezu je farmaceutická kompozice obsahující oleje ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Dále se popisuje nutriční kompozice obsahující oleje podle vynálezu. Nutriční kompozice podle vynálezu se přednostně aplikují savčímu hostiteli parenterálně nebo vnitřně. Preferovanou kompozicí podle vynálezu je kojenecká výživa. V preferovaném provedení vynálezu je kojenecká výživa ve formě roztoku nebo v pevné formě.

Vynález dále také kyseliny, kde způsob způsob desaturace mastné kultivaci rekombinantní zahrnuj e zahrnuj e mikrobiální buňky podle vynálezu za podmínek vhodných pro expresi polypeptidů kódovaného nukleovou kyselinou, kde hostitelská buňka dále obsahuje substrát mastné kyseliny vhodný pro polypeptid. V preferovaném provedení vynálezu mastné kyseliny desaturované způsoby podle vynálezu zahrnují olej obsahující mastnou kyselinu.

Vynález dále zahrnuje čištěnou nukleotidovou a peptidovou sekvenci přítomnou v SEQ ID NO: 1 až 34. Vynález dále popisuje způsoby použití sekvencí přítomných v SEQ ID NO:1 až 34, jako sondy pro identifikaci příbuzných sekvencí, jako komponenty expresívních systémů a jako komponenty systémů použitelných pro produkci transgenního oleje.

Vynález dále popisuje způsoby získání biosystémů změněných poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem, které desaturují molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

Vynález dále popisuje výživu, potravinové doplňky nebo potravinové náhražky ve formě roztoku nebo v pevné formě, které obsahují mastné kyseliny s dlouhým řetězcem podle vynálezu. Tyto výživy se mohou aplikovat člověku nebo zvířeti.

Výživy nebo doplňky podle vynálezu mohou dále obsahovat alespoň jeden makronutrient vybraný ze skupiny obsahující olej kokosového ořechu, sojový olej, olej kanoly, mono- a diglyceridy, glukózu, poživatelnou laktózu, elektrodialyzovanou syrovátku, elektrodialyzované mléko s nízkým obsahem tuku, mléčnou syrovátku, sojový protein a jiné proteinové hydrolyzáty.

Výživy podle vynálezu mohou dále zahrnovat alespoň jeden vitamin vybraný ze skupiny zahrnující vitamin A, C, D, E a B komplex a alespoň jeden minerál vybraný ze skupiny obsahující vápník, hořčík, zinek, mangan, sodík, draslík, fosfor, meď, chlorid, jód, selen a železo.

Vynález dále popisuje způsob léčby pacienta, který trpí nedostatečným příjmem nebo produkcí poly-nenasycených mastných kyselin zahrnující aplikaci potravinové náhrady pacientovi podle vynálezu v množství, které je dostatečné pro léčbu pacienta.

Vynález se dále týká kosmetických a farmaceutických kompozic materiálu podle vynálezu.

Vynález dále popisuje izolovanou nukleotidovou sekvenci obsahující sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO;

13,

SEQ

ID

NO: 15,

SEQ

ID

NO:

17,

SEQ

ID

NO:

19,

SEQ

ID

NO

21,

SEQ

ID

NO: 22,

SEQ

ID

NO:

23,

SEQ

ID

NO:

24,

SEQ

ID

NO

25,

SEQ

ID

NO: 26 a

SEQ

ID

NO:

27.

Vynález dále popisuje izolovanou peptidovou sekvenci obsahující peptidovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 a SEQ ID NO: 34.

Vynález dále popisuje transgenní oleje ve farmaceuticky přijatelných nosičích. Vynález dále popisuje potravinové doplňky, kosmetická činidla a kojeneckou výživu obsahující transgenní oleje.

Vynález dále popisuje způsob získání uparvené biosyntézy poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem zahrnující: kultivaci mikrobů, které mají buňky obsahující transgen, jenž kóduje produkt exprese transgenu. Přičemž tento • · produkt desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce uvedené molekuly mastné kyseliny, kde transgen je operativně spojen se sekvencí řídící expresi za podmínek, při kterých je transgen exprimován, přičemž dochází ke změně biosyntézy poly-nenasycených mastných kyselin v buňkách.

Vynález dále zahrnuje použití řetězce poly-nenasycené mastné kyseliny vybrané ze skupiny obsahující ARA, DGLA a EPA.

Vynález dále popisuje farmaceutické kompozice obsahující alespoň jeden nutrient vybraný ze skupiny obsahující vitamin, minerál a sacharid, aminokyselinu, volnou mastnou kyselinu, fosfolipid a antioxidant a fenolovou sloučeninu.

Definice:

A5-desaturáza: Δδ-desaturáza je enzym, který zavádí dvojnou vazbu mezi pátý a šestý uhlík od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

Δβ-desaturáza: Δ6 desaturáza je enzym, který zavádí dvojnou vazbu mezi šestý a sedmý uhlík od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

A9-desaturáza: Δ9 desaturáza je enzym, který zavádí dvojnou vazbu mezi devátý a desátý uhlík od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

Al2-desaturáza: Δ12 desaturáza je enzym, který zavádí dvojnou vazbu mezi 12 a 13 uhlík od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

Mastné kyseliny: Mastné kyseliny je třída látek obsahujících dlouhý uhlovodíkový řetězec a terminální karboxylovou skupinu. Mastné kyseliny zahrnují:

Mastné kyseliny
12:0	Kys. laurová
16:0	Kys. palmitová
16:1	Kys. palmitolejová

·· ·· • * · · • « · · ··» ·* · » · • · · ·

18 : 0	Kys. stearová
18 :1	Kys. olejová	Δ9-18:1
18:2 Δ5,9	Kys. taxolejová	Δ5,9-18:2
18:2 Δ6,9	Kys. 6,9- oktadekadienová	Δ6,9-18:2
18:2	Kys. linolová	Δ9,12-18:2 (LA)
18:3 Δ6, 9, 12	Kys. gama-linolová	Δ6, 9, 12-18:3 (GLA)
18:3 Δ5,9,12	Kys. pinolenová	Δ5,9,12-18:3
18:3	Kys. alfa-linolenová	Δ9, 12,15-18:3 (ALA)
18:4	Kys. stearidonová	Δ6,9,12,15-18:4 (SDA)
20:0	Kys. arachidonová
20:1	Kys. ikoscenová
22:0	Kys. behehová
22:1	Kys. eruková
22:2	Kys. dokasadienová
20:4 ω6	Kys. arachidonová	Δ5,8,11,14-20:4(ARA)
20:3 ωβ	ωδ-ikosatrienová dihomo-gama- linolenová	Δ8,11,14-20:3(DGLA)
20:5 ω5	Ikosapentanová (timnodonová)	Δ5,8,11,14,17- 20:5(EPA)
20:3 ω3	<o3-ikosatrienová	Δ11,16,17-20:3
20:4 ω3	<a3-ikosatetraenová	Δ7,10,13,16,19-22:5 (fí>3DPA)
22:5 ω3	Dokosapentanová	Δ7,10,13,16,19-22:5 (C03DPA)
22;6 ω3	Dokasahexanová (cervonic acid)	Δ4,7,10,13,16,19- 22:6(DHA)
24:0	Lignocerová kys.

• ·

Vzhledem k těmto definicím vynález popisuje nové sekvence DNA, konstrukce DNA, metody a kompozice, které umožňují modifikace poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem například v mikrobiálních buňkách nebo ve zvířatech. Hostitelské buňky se manipulují za účelem exprese sense a antisense transkriptu DNA, která kóduje polypeptid(y), které katalyzují přeměnu DGLA na ARA. Substrát(y) exprimovaných enzymů se mohou produkovat v hostitelské buňce nebo se mohou dodávat exogenně. Aby se dosáhlo exprese, transformovaná DNA je operativně spojena s počátečním místem transkripce a translace a s terminačními regulačními oblastmi, které jsou v hostitelské buňce funkční. Konstrukce obsahující exprimovaný gen se mohou začlenit do genomu hostitelské buňky nebo se mohou v hostitelské buňce samostatně replikovat. V případě produkce ARA obecně používané expresivní kazety zahrnují kazetu, která poskytuje aktivitu Á5-desaturázy, zvláště v hostitelské buňce, které produkuje nebo může pohlcovat DGLA. Produkce nenasycené mastné kyseliny typu ωδ, jako je ARA, se upřednostňuje v hostitelském mikroorganizmu nebo ve zvířeti, které je v podstatě neobsahuje ALA. Hostitel se vybral nebo získal odstraněním nebo inhibicí aktivity desaturázy typu Δ15 nebo ťo6 (obrázek č. 2) . Endogenní aktivita desaturázy se může ovlivnit přípravou expresivní kazety pro antisense Δ15 nebo ω3 transkriptu porušením cílového genu Δ15- nebo ©3-desaturázy prostřednictvím inzerce, substituce a/nebo delece celé nebo části cílového genu nebo přidáním inhibitoru Δ15- nebo ©3desaturázy. Produkce LA se může také zvýšit přípravou expresivních kazet pro Δ9 a/nebo Al2-desaturáz, kde jsou limitující jejich enzymatické aktivity.

Mikrobiální produkce mastných kyselin

Mikrobiální produkce mastných kyselin má několik výhod oproti izolaci z přirozených zdrojů, jako jsou ryby nebo rostliny. Je známo, že řada mikrobů obsahuje velmi zjednodušené olejové kompozice ve srovnáni s kompozicemi, které obsahuji vyšší organizmy, čímž se zjednoduší čištění požadovaných komponentů. Mikrobiální produkce není předmětem fluktuací způsobených externími proměnnými, jako je počasí a dodávka potravin. Mikrobiálně produkovaný olej je v podstatě bez kontaminace látek znečišťujících prostředí. Navíc mikroby poskytují PUFA v určitých formách, které mohou mít specifické použití. Spirulina například může poskytovat PUFA převážně v první a třetí pozici triglyceridů. Z těchto poloh se s výhodou při štěpení pankreatickými lipázami uvolňují mastné kyseliny. Po požití triglyceridů získaných od Spirulina u lidí a zvířat jsou tyto PUFA uvolněny pankreatickými lipázami, jako volné mastné kyseliny a tak jsou přímo dostupné například pro vývoj mozku kojence. Navíc produkce mikrobiálního oleje se může manipulovat řízením podmínek kultivace, zvláště přípravou určitých substrátů pro mikrobiálně exprimované enzymy nebo přidáním látek, které potlačují požadované dráhy biosyntézy. Vedle těchto výhod produkce mastných kyselin z rekombinantních mikrobů poskytuje možnost změnit přirozeně se vyskytující profil mikrobiálních mastných kyselin tím, že poskytují v hostiteli novou syntetickou dráhu nebo potlačují nežádoucí průběhy, přičemž zvyšují množství požadovaného PUFA nebo jejich konjugovaných forem a potlačují množství nežádoucích PUFA.

Produkce mastných kyselin u zvířat

Proudkce mastných kyselin u zvířat má také několik výhod.

Exprese genů desaturázy ve zvířatech může ve tkáni zvířat produkovat značně zvýšené množství požadovaných PUFA, což činí jejich izolaci z těchto tkání ekonomickou. Jestliže se například PUFA exprimují do mléka zvířat, metody izolace PUFA z mléka jsou dobře zavedeny. Vedle možnosti získání zdroje pro čištění požadovaných PUFA, zvířecí mléko se může manipulovat • · • · · · prostřednictvím exprese genů desaturázy, buď samotné nebo v kombinaci s jinými lidskými geny za vzniku zvířecího mléka z obsahem PUFA, které v podstatě odpovídá lidskému mléku během různých stádií vývoje kojence. Zvířecí mléko upravené pro požití člověkem může sloužit jako kojenecká výživa v případech, kde není možné kojení nebo kojení není žádoucí nebo v případě podvýživy nebo onemocnění.

V závislosti na hostitelské buňce, na dostupnosti substrátu a požadovaném konečném produktu(ech) se jeví velký zájem o několik polypeptidů, zvláště pak desaturáz. Termín „desaturáza znamená polypeptid, který může desaturovat jednu nebo více mastných kyselin za účelem produkce mono- nebo polynenasycené mastné kyseliny nebo jejího prekurzoru. Zvláštní zájem se jeví o polypeptidy, které mohou katalyzovat přeměnu DGLA za vzniku ARA. Jsou to enzymy, které desaturují v poloze Δ5. Termín „polypeptid znamená libovolný řetězec aminokyselin bez ohledu na délku nebo post-translační úpravy například glykosylaci nebo fosforylaci. Jestliže se vybírá specifický polypeptid vykazující desaturační aktivitu, je nutné zvažovat optimální pH polypeptidu, zda polypeptid je enzym omezený rychlostí nebo jeho komponent, zda používaná desaturáza je podstatná pro syntézu požadovaných mastných kyselin a/nebo jestli polypeptidy vyžadují kofaktory. Exprimovaný polypeptid má přednostně parametry kompatibilní s biochemickým prostředím jeho polohy v hostitelské buňce. Polypeptid například může v hostitelské buňce soutěžit o substrát s jinými enzymy. Analyzuje se K_m a specifická aktivita polypeptidu, za účelem zjištění, zda tyto hodnoty jsou určujícím kritériem vhodnosti daného polypeptidu při modifikaci produkce PUFA v dané hostitelské buňce. Polypeptid používaný v určité situaci je ten, který je za daných podmínek funkční v hostitelské buňce, ale v jiném případě to může být polypeptid vykazující aktivitu desaturázy, který je schopný modifikovat relativní produkci požadovaných PUFA.

• · • · • ···· ···· • · · · · · · • · · · · ······ • · · · • · ····*·· ·· ··

V případě produkce ARA sekvence DNA kóduje polypeptid, který vykazuje aktivitu A5-desaturázy. V určitých případech se uvedená DNA může spojit s expresivní kazetou, která produkuje peptid vykazující aktivitu Δβ-desaturázy a hostitelská buňka se může zbavit jakékoli přítomné aktivity Al5-desaturázy. Toho se může dosáhnout přípravou transkripční kazety vhodné pro produkci pozitivní sekvence transkripčního produktu Δ15desaturázy tak, že se přeruší gen Al5-desaturázy nebo použitím hostitelské buňky, která přirozeně vykazuje nízkou aktivitu Δΐό-desaturázy nebo byla za tímto účelem mutována. Inhibice požadovaných desaturačních drah se může také dosáhnout použitím specifických inhibitorů desaturázy, jak se popisuje v publikaci US patent 4,778,630. Volba kombinace používaných kazet může záviset částečně na profilu PUFA v hostitelské buňce. V případě, že aktivita A5-desaturázy hostitelské buňky je limitující, nadměrná exprese samotné Δδ-desaturázy bude v obecném případě dostatečná pro zvýšení produkce ARA v přítomnosti vhodného substrátu, jako je DGLA. Produkce ARA se může také zvýšit přípravou expresívních kazet pro geny Δ9nebo Al2-desaturázy, kdy aktivity těchto desaturáz jsou limitující. Na obrázku č. 1 je zobrazeno schéma syntézy kyseliny arachidonové (20:4 ^5,8,11,14^ _z ]ζγ₃θΐί_ηγ paimitové (Cie)· Klíčový enzym v této dráze je Δδ-desaturáza, která přeměňuje DH-y-linolenovou kyselinu (DGLA, ikosatrienovou kyselinu) na ARA. Obrázek dále zobrazuje konverzi kyseliny alinolenové (ALA) na kyselinu stearidonovou pomocí Δβdesaturázy. Produkce PUFA vedle ARA zahrnující EPA a DHA je zobrazena na obrázku č. 2.

Zdroje polypeptidů vykazující desaturační aktivitu

Zdroje polypeptidů vykazující desaturační aktivitu a oligonukleotidů kódujících takové polypeptidy jsou organizmy, • · • · které produkují požadovanou poly-nenasycenou mastnou kyselinu.

Jako zdroj mi kroorgani zrny aktivity Á5-desaturázy se mohou použít mající schopnost produkovat ARA. Takové mikroorganizmy například zahrnují ty organizmy patřící k rodu Mortierella_r Conidiobolus, Pythium, Phytophathora,

Penicillium, Porphyridium, Coídosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula a Entomophthora. V rodu Porphyridium je zajímavé Porphyridium cruentum. V rodu Mortierella zvláštní zájem budí Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygriphila, Mortierella ramanniana, var.

Angulispora a Mortierella alpina. V rodu Mucor zvláštní zájem budí Mucor circinelloides a Mucor javanicus.

DNA kódující požadované desaturázy se mohou identifikovat různým způsobem. Zdroj požadované desaturázy, například knihovna genomové DNA nebo cDNA z Mortierella se mohou testovat detekovatelnými enzymaticky nebo chemicky syntetizovanými sondami, které se mohou připravit z DNA, RNA nebo z nukleotidů, které se přirozeně nevyskytují, nebo z jejich směsi. Sondy se mohu syntetizovat enzymaticky z DNA známých desaturáz a jsou vhodné pro metody hybridizace za normální nebo snížené přísnosti. Oligonukleotidové sondy se mohou také použít jako zdroje testování a mohou se zakládat na sekvencích známých desaturáz zahrnujících sekvence, které jsou mezi známými desaturázami konzervativní, nebo na sekvencích peptidů získaných z požadovaného čištěného proteinu. Oligonukleotidové sondy založené na aminokyselinových sekvencích se mohou degenerovat, aby se zdůraznila degenerace genetického kódu nebo se mohou přeskupit ve prospěch preferovaných kodonů zdrojového organizmu. Oligonukleotidy se mohou použít jako primery pro PCR z reverzně přepisované mRNA ze známého nebo pochybného zdroje. Produkt PCR může mít celou délku cDNA nebo se může použít za vzniku sondy, která slouží pro získání cDNA v celé délce. V jiném případě požadovaný protein se může celý sekvenovat a uskuteční se celková syntéza DNA kódující uvedený polypeptid.

Jestliže je to nutné, izoluje se genomová DNA nebo cDNA, kterou je možné sekvenovat známou metodou. V oboru je známo, že takové metody sekvenování jsou chybné. Proto se stalo rutinou vícenásobné sekvenování jedné oblasti a stále je nutné počítat s měřitelnou četností chyb ve výsledné dedukované sekvenci, zvláště pak v oblastech, které vykazují repetice, extenzivní sekundární strukturu nebo neobvyklé složení baží, jako jsou oblasti s vysokým obsahem GC. Když vzniknou rozpory, může se provést opětné sekvenování a mohou se použít speciální metody. Uvedené speciální metody mohu zahrnovat změnu podmínek sekvenování za použití: různých teplot, různých enzymů, proteinů, které mění schopnost oligonukleotidů tvořit struktury vyššího řádu, změněných nukleotidů, jako je ITP nebo metylovaný dGTO, různého složení gelu například přidání formamidu, různých primerů nebo primerů lokalizovaných v různé vzdálenosti od problematické oblasti nebo různých templátů, jako jsou jednořetězcové DNA. Může se také použít sekvenování mRNA.

Ve většině případů některé nebo všechny kódující sekvence polypeptidu vykazující desaturační aktivitu pocházejí z přirozeného zdroje. V některých situacích je nutné modifikovat celý nebo část kodonů například zesílit expresi použitím kodonů preferovaných hostitelem. Hostitelem preferované kodony se mohou stanovit z kodonů, které se vyskytují nej častěji v proteinech, jenž se exprimují v určitém druhu hostitele v největším množství. Kódující sekvence polypeptidu vykazující desaturační aktivitu se může syntetizovat celá nebo její část. Celá DNA nebo její části se mohou také syntetizovat tak, aby se odstranily libovolné destabilizující sekvence nebo oblasti sekundární struktury, které se budou vyskytovat v přepsané mRNA. Celá nebo části DNA se mohou také syntetizovat za účelem změny složení baží na ty, • · • · • · · · · « β • · · A • · ···· ····»·· které preferuje požadovaná buňka hostitele. Způsoby syntézy sekvencí a spojení sekvencí se uvádějí v literatuře. Za účelem získání mutací přirozeně se vyskytujících genů desaturázy, aby došlo k produkci polypeptidů, který vykazuje desaturační aktivitu in vivo s fyzikálními a kinetickými parametry, jenž více vyhovují funkci hostitelské buňky, se může použít mutageneze in vitro a selekce, místně řízená mutageneze nebo jiné způsoby. Buňka pak vykazuje delší poločas rozpadu požadovaných polynensaycených mastných kyselin a vyšší rychlost produkce.

shodné alpina.

Desaturáza organizmu Mortierella alpina

Ve středu zájmu je A5-desaturáza organizmu Mortierella alpina, která má 446 aminokyselin. Aminokyselinová sekvence je zobrazena na obrázku č. 3. Gen kódující A5-desaturázu organizmu Mortierella alpina se může exprimovat v transgenních mikroorganizmech nebo ve zvířatech tak, že se docílí silnější syntézy ARA z DGLA. Mohou se také použít jiné DNA, které jsou v podstatě identické s DNA A5-desaturázy organzimu Mortierella alpina nebo které kódují polypeptidy, jenž jsou v podstatě s polypeptidem A5-desaturáza organizmu Mortierella Termín „v podstatě shodné znamená aminokyselinovou sekvenci nebo sekvenci nukleové kyseliny vykazující za účelem zvýšené preference alespoň 60 %, 80 %, 90 % nebo 95 % homologii s aminokyselinovou sekvencí Á5-desaturázy organizmu Mortierella alpina nebo se sekvencí nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci. V případě polypeptidů je délka porovnávaných sekvencí obecně alespoň 16 aminokyselin, upřednostňuje se alespoň 20 aminokyselin, více se upřednostňuje 35 aminokyselin. V případě nukleových kyselin délka porovnávaných sekvencí je obecně alespoň 50 nukleotidů, upřednostňuje se alespoň 60 nukleotidů a více se upřednostňuje alespoň 75 nukleotidů a nejvíce se upřednostňuje 110 nukleotidů. V typickém případě se homologie měří za použití • · softwaru pro sekvenční analýzu, jako je například Sequence Analysis software od Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, lne., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715) a MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S.Bascom Avenue, Suitě 200, Campbell, California 95008) . Takový software páruje podobné sekvence, čímž přiřazuje různé stupně homologie různým substitucím, delecím a jiným modifikacím. Konzervativní substituce typicky zahrnují substituce v následující skupinách: glycin a alanin; valin a leucin; kyselina aspartová, kyselina glutamová, asparagin a glutamin; serin a threonin; lyzin a arginin; fenylalanin a tyrozin. Substituce se mohou také provést na základě konzervativní hydrofobicity nebo hydrofility (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982) nebo na základě schopnosti předpovídat podobnou sekundární strukturu polypeptidu (Chou and Fasman, Adv. Enzymol. 47:45-148,1978).

Další desaturázy

Vynález popisuje příbuzné desaturázy pocházející ze setjného nebo jiného organizmu. Takové příbuzné desaturázy zahrnují varianty popsané A5-desaturázy vyskytující se ve stejném nebo odlišném specie Mortierella stejně jako homology popsané A5-desaturázy z jiných specie. Vynález dále popisuje desaturázy, které, ačkoli nejsou v podstatě shodné s Δ5desaturázou Mortierella alpina, desaturují molekulu mastné kyseliny v poloze 5 uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny. Příbuzné desaturázy mohou být identické na základě své schopnosti fungovat stejným způsobem jako popsané desaturázy, které jsou stále schopny účinně přeměnit DGLA na ARA. Příbuzné desaturázy se mohu také identifikovat na základě prohledávání sekvenční databáze. Pomocí hybridizace se sondou odvozenou z popsané desaturázy s knihovnou zkonstruovanou ze zdrojového organizmu nebo pomocí RT-PCR z mRNA ze zdrojového • · organizmu a primerů založených na popsané desaturáze, se hledají sekvence homologní s popsanou desaturázou. Takové desaturázy zahrnují lidské desaturázy, Dictyostelium discoideum a Phaeodactylum tricornum.

Oblasti polypeptidů desaturázy, které jsou důležité pro desaturační aktivitu, se mohou stanovit rutinní mutagenezí, expresí výsledných mutantních polypeptidů a stanovením jejich aktivit. Mutanti mohou zahrnovat delece, inzerce a bodové mutace nebo jejich kombinace. Typická funkční analýza začíná deleční mutagenezí za účelem stanovení N- a C-terminálních omezení proteinu nezbytných pro funkci proeteinu. Pak se provedeou vnitřní delece, inzerce nebo bodové mutace za účelem stanovení oblastí nezbytných pro funkce uvedeného proteinu. Dále se mohou použít jiné metody, jako je kazetová mutageneze nebo celá syntéza. Deleční mutageneze se provede například použitím exonukleáz, přičemž se postupně odstraní kódující oblasti 5' a 3' konců. Pro provedení takových postupů jsou dostupné kity. Po deleci je kódující oblast doplněna ligaci oligonukleotidů obsahujících počáteční a terminační kodon. V jiném případě se oligonukleotidy kódující počáteční a konečný kodon začlení do kódující oblasti za použití různých metod zahrnující místně řízenou mutagenezí, mutagenní PCR nebo ligaci k DNA, která je štěpena v existujících restrikčních místech. Vnitřní delece se mohou podobně vytvořit řadou metod, které zahrnují použití existujících restrikčních míst v DNA, použití mutagenních primerů prostřednictvím místně řízené mutageneze nebo mutagenní PCR. Inzerce se provádějí za použití metod, jako je linkrem vyhledávané mutageneze, místně řízená mutageneze nebo mutagenní PCR. Bodové mutace se provádějí způsoby, jako je místně řízená mutageneze nebo mutagenní PCR.

Chemická mutageneze se může také používat při identifikaci oblastí polypeptidů desaturázy, které jsou důležité pro aktivitu. Mutovaná konstrukce se exprimuje a testuje se schopnost pozměněného proteinu fungovat jako desaturáza.

Taková analýza struktury-funkce může stanovit, které oblasti se mohou deletovat, v kterých oblastech se toleruje inzerce a které bodové mutace dávají vzniku mutantnímu proteinu, který funguje v podstatě stejným způsobem jako přirozená desaturáza. Vynález popisuje všechny takové mutantní proteiny a nukleotidové sekvence kódující tyto proteiny.

Exprese genů desaturázy

Po té, co se získala DNA kódující polypeptid desaturázy, umístí se do vektoru schopného replikovat se v hostitelské buňce nebo se pomnožit in vitro způsobem, jako je PCR nebo dlouhé PCR. Replikační vektory mohou zahrnovat plazmidy, fágy, viry, kozmidy a podobně. Požadované vektory zahrnují vektory použitelné při mutagenezi genu nebo při expresi genu v hostitelských buňkách. Metoda dlouhého PCR provádí in vitro propagaci velké konstrukce tak, že pozmění gen, aby došlo k mutagenezi nebo k přidání expresívních signálů. Může tak dojít k propagaci výsledných konstrukcí in vitro_r aniž se použije replikační vektor nebo hostitelská buňka.

Za účelem exprese polypeptidů desaturázy, funkční transkripční a translační iniciační a terminační oblasti jsou operativně spojeny s DNA kódující polypeptid desaturázy. Exprese oblasti kódující polypeptid může probíhat in vitro nebo v hostitelské buňce. Iniciační a terminační oblasti transkripce a translace se odvodily z různých zdrojů, které zahrnují exprimovanou DNA, geny, o kterých se ví nebo se předpokládá, že se budou v požadovaném systému exprimovat, expresívní vektory, chemickou syntézu nebo endogenní lokus v hostitelské buňce.

Exprese in vitro

Expresi in vitro lze provést například umístěním oblasti kódující polypeptid desaturázy do expresívního vektoru určeného pro použití in vitro a přidáním králičího lyzátu • · ·· · ·« ·· ·· • ♦ * · ··· · * * · · retikulocytů a kofaktorů. Je-li to nutné mohou se začlenit také značené aminokyseliny. Takové in vitro expresívní vektory mohou poskytovat některé nebo všechny expresívní signály nezbytné pro používaný systém. Tyto metody jsou dobře známy v oboru a komponenty systému jsou běžně dostupné. V reakční směsi se může přímo testovat přítomnost polypeptidů například stanovením jeho aktivity nebo syntetizovaný polypeptid se může čistit a pak testovat.

Exprese v hostitelské buňce

Exprese v hostitelské buňce může být dočasná nebo stabilní. K dočasné expresi dochází zavedením konstrukcí, které obsahují expresívní signály funkční v hostitelské buňce, ale uvedené konstrukce se nereplikují a řídce se v hostitelské buňce začleňují, nebo se hostitelská buňka nemnozí. Dočasné exprese lze také dosáhnout vyvoláním aktivity regulovatelného promotoru, který je operativně spojen s genem. Takové indukovatelné systémy často vykazují slabou expresi. Stabilní exprese se může dosáhnout zavedením konstrukce, která se může začlenit do hostitelského genomu nebo se může samostatně replikovat v hostitelské buňce. Stabilní exprese genu se může vybrat použitím selekčního markéru, který se nachází v expresívní konstrukci nebo se transfekuje společně s expresívní konstrukcí. Pak následuje selekce buněk exprimující markér. Stabilní exprese je výsledkem začlenění. K integraci konstrukcí může dojít v hostitelském genomu náhodně nebo se může cílit prostřednictvím použiti konstrukcí obsahujících oblasti homologie s hostitelským genomem, což je dostatečné pro rekombinaci s hostitelským lokusem. Jestliže jsou konstrukce cíleny do endogenního lokusu, pak endogenní lokus může poskytnout všechny nebo některé oblasti regulující transkripci nebo translaci.

Jestliže je nutné zesílení exprese polypeptidů desaturázy ve zdrojovém organizmu, může se použít několik metod. Do • · • · hostitelského organizmu se mohou zavést další geny kódující polypeptid desaturázy. Exprese z lokusu přirozené desaturázy se může také zesílit homologní rekombinací, například začleněním silnějšího promotoru do hostitelského genomu, odstraněním destabilizačních sekvencí buď z mRNA nebo z kódovaného proteinu delecí uvedené informace z hostitelského genomu nebo přidáním stabilizačních sekvencí k mRNA (USPN 4,910,141) .

Jestliže je nutné exprimovat více než jeden odlišný gen pak zavedené geny je možné pomnožit v hostitelské buňce za použití replíkačních vektorů nebo začleněním do hostitelského genomu. Jestliže se z odděleného replikačního vektoru exprimují dva nebo více genů, je nutné, aby každý vektor vykazoval odlišný způsob replikace. Každá zavedená konstrukce, ať už se začleňuje nebo ne, by měla mít odlišný způsob selekce a neměla by být homologní s jinými konstrukcemi, což je podmínkou stabilní exprese a předchází se tak znovu uspořádání elementů mezi konstrukcemi.

Správná volba regulačních oblastí, způsoby selekce a metoda propagace zavedené konstrukce se mohou stanovit experimentálně tak, že všechny zavedené geny se mohou exprimovat v síle, která je nutná pro syntézu požadovaných produktů.

V případě, že hostitelská buňka je kvasinka, pak poskytuje také transkripční a translační oblasti. Regulační oblasti iniciace transkripce se mohou získat z genů účastnících se glykolytické dráhy, jako je dehydrogenáza alkoholu, glycerylaldehyd-3-fosfátová dehydrogenáza (GPD), fosfogukoizomeráza, fosfoglyceratová kináza atd. nebo z regulovatelných genů, jako je kyselá fosfatáza, laktáza, metalothionin, glukamyláza atd. V určité situaci, v závislosti na skutečnosti, zda je nutná konstitutivní nebo indukovaná transkripce, v závislosti na účinnosti promotoru ve spojení s otevřeným čtecím rámcem, na schopnosti spojit silný promotor • · · · • · · *

s řídící oblastí z odlišného promotoru, který umožňuje indukovatelnou transkripci, na jednoduchosti konstrukce a podobně, je možné použít libovolnou z regulačních sekvencí. Velký zájem se soustřeďuje na promotory, které se aktivují v přítomnosti galaktózy. Promotory indukovatelné galaktózou (GAL1, GAL7 a GAL10) se mohu používat pro silnou a regulovanou expresi proteinu v kvasinkách (Lue et al·., Mol. Cell. Biol. Vol. 7, P. 3446, 1987); Johnston, Microbiol. Rev. Vol. 51, p. 458, 1987). Transkripce z promotorů GAL se aktivuje proteinem GAL4, který se váže na promotorovou oblast a aktivuje transkripci v případě, že je přítomna galaktóza. Při absenci galaktózy anatagonista GAL80 se váže na GAL4 a brání GAL4 aktivovat transkripci. Přidání galaktózy brání GAL80 inhibovat aktivaci pomocí GAL4.

Zjistilo se, že nukleotidové sekvence obklopující iniciační kodon translace ATG působí expresi v kvasinkových buňkách. Jestliže je to nutné, polypeptid je v kvasinkách exprimován velmi slabě. Nukleotidové sekvence exogenních genů se mohou modifikovat, aby zahrnovaly účinnou kvasinkovou sekvenci iniciující translaci, přičemž se získá optimální exprese genu. V případě exprese v Saccharomyces se může toto uskutečnit místně řízenou mutagenezí neúčinně exprimovaného genu tak, že proběhne fúze do rámce s endogenním genem Saccharomyces. Upřednostňuje se silně exprimovaný gen, jako je gen laktázy.

Terminační oblast se může získat z 3'oblasti genu, ze kterého se získala iniciační oblast nebo z odlišného genu. Je znám velký počet terminačních oblastí, které jsou použitelné v různých hostitelích stejného nebo odlišného rodu a druhu. Terminační oblast se obvykle vybrala podle toho, zda je výhodná nebo ne, spíše než na základě určité vlastnosti. Upřednostňuje se, aby se terminační oblast získala z kvasinkového genu, zvláště pak z Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida nebo Kluyveromyces. Je známo, že • ·

3'oblasti dvou savčích genů, γ interferonu a ct2 interferonu, fungují v kvasinkách.

Zavedení konstrukcí do hostitelských buněk

Konstrukce obsahující gen se může zavést do hostitelské buňky standardním způsobem. Tyto metody zahrnují transformaci, transfekcí, transdukci, zavedení, elektroporaci, libovolnou jinou metodu, fúzi protoplastů, lipofekci, konjugaci, infekci, balistické mikroinjekce, zaškrabávání nebo kterou se zavádí gen do hostitelské buňky. Používané metody transformace zahrnují transformaci acetátem litia (popisuje se v publikaci Methods in Enzymology, Vol. 194, P. 186-187, 1991). Je výhodné, aby manipulovaná hostitelská buňka, která pohlcuje sekvenci DNA nebo uvedenou konstrukci, se označila jako „transformovaná nebo „rekombinantní.

Hostitel bude obsahovat alespoň jednu kopii expresívní konstrukce.

závislosti amplifikuje

Může však obsahovat dvě kopie nebo více v na tom, zda gen se začleňuje do genomu , se nebo je přítomen na extrachromozomálním elementu, který vykazuje více kopií. Jestliže hostitelem je kvasinka, pak se mohou použít čtyři základní typy kvasinkových plazmidových vektorů: kvasinkové integrační plazmidy (YIp), kvasinkové replikační plazmidy (YRp), kvasinkové centromerní plazmidy (YCp) a kvasinkové epizomální plazmidy (YEp). YIp chybí počátek replikace kvasinek a musí se pomnožit jako integrované elementy v kvasinkovém genomu. YRp mají samostatně se replikující sekvenci získanou z chromozómů a propagují se se středním počtem kopií (20 až 40) jako samostatně se replikující nestabilní segregační plazmidy. YCp mají počátek replikace a centromerovou sekvenci a propagují se s malým počtem kopií (10 až 20) jako samostatně se replikující stabilní segregační plazmidy. Plazmidy YEp mají počátek replikace z kvasinkového plazmidu o velikosti 2 pm a propagují se s vysokým číslem kopií, jako samostatně, nepravidelně se • ·

replikující segregační plazmidy. Přítomnost plazmidů v kvasinkách se může zjistit selekcí na základě značení v plazmidů. Ve středu zájmu jsou kvasinkové vektory pYES2 (plazmid YEp je dostupný u firmy Invitrogen, propůjčuje prototropii uracilu a expresívní promotor GAL1 indukovatelný galaktózou), PRS425.pGl (plazmid YEp je možné získat od Dr. T.H.Chang, docent molekulární genetiky, Ohio State University, tento plazmid obsahuje konstitutivní promotor GPD a propůjčuje prototropii leucinu) a pYX424 (plazmid YEp má konstitutivní promotor TP1 a propůjčuje prototropii leucinu; Alber, T. and Kawasaki, G. (1982) . J. Mol. And Appl. Genetics 1: 419) .

Transformovaná hostitelská buňka se může identifikovat selekcí markéru, který je obsažen v zavedené konstrukcí.

V jiném případě oddělená markerová konstrukce se může zavést do hostitelské buňky dohromady s požadovanou konstrukcí.

V typickém případě se vybraly transformovaní hostitelé na základě jejich schopnosti růst na selekčním médiu. Selekční média mohou obsahovat antibiotikum a může jim chybět faktor, který je nezbytný pro růst netransformovaného hostitele. Takovým faktorem může být nutrient nebo růstový faktor. Takový zavedený gen markéru může propůjčovat rezistenci na antibiotika nebo kódovat podstatný růstový faktor nebo enzym a umožňuje růst na selekčním médiu, když se exprimuje v transformovaném hostiteli. Selekce transformovaného hostitele se může také vyskytnou v případě, že se může přímo nebo nepřímo detekovat exprimovaný markerový protein. Markeřový protein se může detekovat na základě jeho enzymatické aktivity, β-galaktozidáza může přeměnit substrát Xgal na zbarvený produkt a luciferáza může přeměnit luciferin na produkt emitující světlo. Markerový protein se může detekovat produkcí světla nebo změnou charakteristik. Zelený fluorescenční protein Aequorea víctorie fluoreskuje, jestliže se ozáří modrým světlem. K detekci markerového proteinu nebo molekulárního tag přítomného například v proteinu se mohou « · • · použit protilátky. Buňky exprimující markerový protein nebo tag se vyberou na základě vizuálního pozorování nebo způsobem, jako je FACS nebo panning za použití protilátek. Při výběru kvasinkových transformantů se může použít libovolný markér, který je funkční v kvasinkách. Zajímavým markérem je rezistence na kanamycin a aminoglykozid G418, stejně jako schopnost růstu na médiu, které neobsahuje uráčil, leucin nebo tryptofan.

Produkce PUFA zprostředkovaná Á5-desaturázou se může uskutečnit buď v prokaryontních nebo v eukaryontních buňkách hostitele. Prokaryontní buňky zahrnují Eschericia, Baccillus_r Lactobacíllus, cyanobakterie a podobně. Eukaryontní buňky zahrnují savčí buňky, jako jsou buňky zvířat v laktaci, ptačí buňky, jako jsou kuřecí buňky a jiné buňky odpovědné za genetickou manipulaci zahrnující buňky hmyzu, hub a řas. Buňky se mohou kultivovat nebo tvořit jako část nebo celý hostitelský organizmus zahrnující zvířata. Při produkci PUFA se také mohou spolu s buňkami, zvláště při transferu genu, buněčném cílení a selekci, použít viry a bakteriofágy. V preferovaném provedení vynálezu je hostitelem libovolný mikroorganizmus nebo zvíře, které produkuje DGLA a/nebo asimiluje DGLA, který se podává exogenně, a s výhodou produkuje velké množství DGLA. Příklady hostitelských zvířat zahrnují myši, krysy, kuřata, křepelky, krocany, hovězí, ovce, prasata, kozi, jaký atd., které jsou zodpovědné za genetickou manipulaci a klonování pro rychlý nárůst transgenní expresívní populace. U zvířat lze transgen A5-desaturázy upravit prostřednictvím modifikace regulačních oblastí genu tak, aby se exprimoval v cílových organelách, tkáních a tělních tekutinách. Velký zájem je o produkci PUFA v mléku hostujícího zvířete.

Exprese v kvasinkách »· ·· • 4 4 4 · ( « I • 4 ·*

Příklady hostujících mikroorganizmů zahrnují Sacharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis nbeo jiné kvasinky jako Candida, Kluyveromyces nebo jiné houby například vláknité houby, jako je Aspergillus, lleurospora, Penicillium atd.. Požadované charakteristiky hostujícího mikroorganizmu jsou následující: je dobře geneticky charakterizovaný, může se použít v případě silné exprese produktu za použití fermentace s ultravysokou hustotou a seznamu GRAS což znamená, že konečný produkt je člověku. Zajímavé je také použití kvasinek jako hostujícího organizmu podle vynálezu, zvláště pak pekařských kvasinek (S. cerevisiae) . Zvláště zajímavé kmeny jsou SC334 (Mat apep4-3 prbl-1122 ura3-52 leu2-3, 112 regl-501 gall; Gene 83:57-64,

1989, Hovland P. et al.), YTC34 (a ade2-101 his3A200 Llys2-801 se od Dr. T.H.Chang, docent molekulární State University) , YTC41 (a/α ura352/ura3=521ys2-801/lys2-801 ade2-101/ade2-101 trpl-Ál/trpl-ΔΙ his3Á200/his3Á2001eu2Al/leu2Al; získal se od Dr. T.H.Chang, docent molekulární genetiky, Ohio State University), BJ1995 (získal se z instituce Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkley, CA 94720) , INVSC1 (Mat a hiw3Al leu2 trpl-289 ura3-52; získaný od firmy Invitrogen, 1600Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008) a INVSC2 (Mat a his3A200ura3-167; získal se od firmy Invitrogen).

(obecně je bezpečný), vhodný pro aplikaci ura3-52; získal genetiky, Ohio

Exprese ve specie ptáků

Při produkci PUFA v ptačích specie a v ptačích buňkách, jako jsou kuřata, krocani, křepelky a kachny, se může provést transfer genu zavedením sekvence nukleové kyseliny kódující A5-desaturázu do buněk postupy, které jsou známé v oboru. Jestliže je nutné transgenní zvíře, mohou se připravit pluripotentní kmenové buňky embryí s vektorem, který nese transgen kódující Δδ-desaturázu a které se mohou vyvinout na

9 9 9 9··» 9 · * * 9 9 ♦ · * 9

9 9 9 9 9 9 »» * *

9 V * * * « • 9 9999 999 9999 99 9« dospělé zvíře (USPN 5,162,215; Ono et al. (1996) Comparatíve Biochemistry and Physiology A 113(3):287-292; WO 9612793; WO 9606160) . Ve většině případů se bude transgen modifikovat za účelem exprese velkého množství desaturázy, přičemž se zvýší produkce PUFA. Transgen se může modifikovat například transkrípční a/nebo translační regulační oblastí, která funguje v ptačích buňkách, jako jsou promotory, které řídí expresi v určitých tkáních a v částech vajec, jako je žloutek. Regulační oblasti genů je možné získat z různých zdrojů, jak je virus anemíe kuřete nebo virus ptačí leukózy nebo ptačí geny, jako je gen kuřecího ovalbuminu.

Exprese v hmyzích buňkách

Produkce PUFA v hmyzích buňkách se může provést z použití bakulovirových expresívních vektorů nesoucích transgen Δ5 desaturázy. Bakulovirové expresívní vektory jsou dostupné u několika komerčních zdrojů, jako je firma Clontech. Vynález popisuje metody produkce hybridních a transgenních kmenů řas , jako jsou mořské řasy, které obsahují a exprimují transgen desaturázy. Transgenní mořské řasy je možné připravit způsobem, který se popisuje v SPN 5,426,040. Stejně jako v jiných expresívních systémech načasování, rozsah exprese a aktivita transgenu desaturázyse může regulovat spojením sekvence kódující polypeptid s vhodnou transkrípční nebo translační regulační oblastí, která se zvolila pro dané určité použití. Zvláště zajímavá je promotorové oblast , která se může indukovat za předem vybraných podmínek růstu. Pro tyto účely lze použít zavedení mutací citlivých na teplotu a/nebo mutací jako odezvy na metabolity do sekvencí kódujících transgen desaturázy, jejích regulačních oblastí a/nebo genomu buněk, do kterých se zavede transgen.

Exprese v rostlinách « *

XI ··»····! ^X · · · · » • · · · · · ····*·· I

Produkci PUFA v rostlinách lze provést za použiti různých rostlinných transformačních systémů, jako je Agrobacterium tumefaciens, rostlinné viry, transformace částic do buněk a podobně. Vše se popisuje v dokumentu US přihláška sériové číslo 08/834,033 a 08/956,985 a v pokračování uvedené přihlášky.

Transformovaná hostitelská buňka se kultivuje z vhodných podmínek, které jsou upraveny pro dosažení požadovaného výsledku. V případě, že hostitelské buňky rostou v kultuře, podmínky se v typickém případě optimalizují, aby se dosáhlo produkce s nejvyšším nebo nejvíce ekonomickým výtěžkem PUFA, který se vztahuje na aktivitu desaturázy. Kultivační médium může v optimálním případě zahrnovat: zdroj uhlíku, zdroj dusíku, přidání substrátu, konečnou koncentraci přidaného substrátu, formu přidaného substrátu, aerobní a anaerobní podmínky kultivace, teplotu kultivace, indukční činidlo, indukční teplotu, fází růstu vhodnou pro indukci, fázi růstu vhodnou pro sebrání buněk, pH, hustotu a udržování selekce. Mikroorganizmy, jako jsou například kvasinky, se přednostně kultivují v selekčním kultivačním médiu, které zahrnuje kvasinkovou peptonovou půdu (YPD) a minimální kultivační médium (obsahující aminokyseliny, kvasinkovou dusíkatou bázi a síran amonný a postrádá komponenty vhodné pro selekci, například uráčil). Je nutné substráty, které se mají přidat nejdříve rozpustit v etanolu. Je-li to nezbytné, exprese polypeptidu se může vyvolat například přidáním galaktózy, čímž se vyvolá exprese řízená promotorem GAL.

Exprese ve zvířatech

Exprese v buňkách hostitelského zvířete může být dočasná nebo stabilní. Dočasná exprese se může provést metodami dobře známými v oboru například infekcí nebo lipofekcí a může se opakovat, aby se udržela požadovaná síla exprese zavedené konstrukce (Ebert, WO 94/05782). Stabilní exprese lze • · dosáhnout začleněním konstrukce do hostitelského genomu, což vede ke vzniku transgenního zvířete. Konstrukci je možné zavést například mikroinjekcí do pro-jádra oplodněného vajíčka nebo transfekcí , retrovirovou infekcí nebo jinými způsoby, kterými lze konstrukci zavést do vytvořené buněčné linie, která se může zavést do dospělého zvířete {US patent č. 4,873,191; US patent č. 5,530,177; US patent 5,565,362; US patent č. 5,366,894; Wilmut et al., (1997) Nátuře 385:810).

Rekombinantní vajíčka nebo embrya se přenesou do náhradní matky (US patent č. 4,873,191; US patent č. 5,530,177; US patent č. 5,565,362; US patent č. 5,366, 894; Wilmut et al., (1997) Nátuře 385:810) .

Po narození se transgenní zvířata identifikují například na základě přítomnosti zavedeného genu markéru, jako je barva srsti, pomocí PCR nebo Soutehernovým přenosem vzorků krve, tkáně nebo mléka, čímž se detekuje zavedená konstrukce, nebo imunologickými nebo enzymatickými testy, čímž se detekuje exprimovaný protein nebo produkované produkty (US patent č. 4,873,191; US patent č. 5,530,177; US patent č. 5,565,362; US patent č. 5,366,894; Wilmut et al., (1997) Nátuře 385:810). Výsledná transgenní zvířata mohou být celkově transgenní nebo mohou být mozaikové, které mají transgeny v podsadě jejich buněk. Nástup savčího klonování se uskutečňuje fúzováním nukleotidové buňky s enukleovaným vajíčkem. Pak následuje přenos do náhradní matky a je tak možné získat zvíře nebo buňku obsahující zavedenou konstrukci. Dříve než k tomu dojde je nezbytné, aby se transgen vyskytoval zárodečné linii zvířat, aby mohlo dojít k pomnožení (Wilmut et al., (1997)

Nátuře 385:810).

Exprese v hostitelském zvířeti ma určitou účinnost, zvláště, když zvířetem je domácí zvíře. V případě produkce PUFA v tekutinách, které je možné jednoduše získat hostitelského zvířete, jako je například mléko, transgen desaturázy je možné exprimovat v savčích buňkách ze samice hostitele a obsah PUFA se v hostitelských buňkách může měnit. Transgen desaturázy se může přizpůsobit pro expresi tak, že zůstává v savčích buňkách nebo se sekretuje do mléka, pak se produkt produkce PUFA nachází v mléce (WO 95/24488).Exprese se může cílit do savčí tkáně za použití specifických regulačních sekvencí, jako je bovin α-laktalbumin, a-kasein, β-kasein, γkasein, κ-kasein, β-laktoglobulin nebo syrovátkový kyselý protein a může také zahrnovat jeden nebo více intronů a/nebo signální sekvence sekrece (US patentč. 5,530,177, Rosen; US patent č. 5, 565,362 Clark et al.; US paetnt č. 5, 366, 894, Garner et al.; WO 95/23868).

Exprese transgenů desaturázy nebo antisense transkriptů desaturázy, které se tímto způsobem přizpůsobily, se mohou použít pro změnu množství specifických PUFA nebo jejich derivátů, které se nacházejí ve zvířecím mléce. Navíc transgen Δδ-desaturázy se může exprimovat buď samotný nebo spolu s jiným transgenem za účelem produkovat zvířecí mléko, které obsahuje vyšší složku PUFA nebo poměry a koncentrace PUFA, které odpovídají lidskému mateřskému mléku (Prieto et al., WO 95/24494) .

Čištění mastných kyselin

Mastné kyseliny desaturované v poloze Δ5 se mohou najít v hostitelském mikroorganizmu nebo ve zvířeti jako volné mastné kyseliny nebo ve spojení s formami, jako jsou acylglyceroly, fosfolipidy, sulfolipidy nebo glykolipidy a mohou se extrahovat z hostitelské buňky různými způsoby, které jsou dobře známy v oboru. Takové způsoby mohou zahrnovat extrakci organickými rozpouštědly, sonikaci, extrakci superkritických tekutin za použití například oxidu uhličitého. Dále se mohou použít fyzikální postupy, jako jsou tlak nebo jejich kombinace. Zvláště zajímavá je extrakce metanolem a chloroformem. Je-li to nutné, vodná vrstva se může okyselit, aby se protonizovaly negativně nabité části a tím se zvýšila

• · • · parcionizace požadovaných produktů v organické vrstvě. Po extrakci se mohou organická rozpouštědla odstranit odpařením v proudu dusíku. Když se izolují v konjugované formě, produkty se mohou enzymaticky nebo chemicky štěpit, aby se uvolnila volná mastná kyselina nebo méně komplexní konjugát. Ty mohou být předmětem další manipulace za vzniku požadovaného konečného produktu. Konjugované formy mastných kyselin se štěpí hydroxidem draselným.

V případě, že je nezbytné další čištění, mohou se použít standardní metody. Takové metody mohou zahrnovat extrakci, aplikaci močoviny, frakční krystalizací , hPLC, frakční destilaci, chromatografií na silikagelu, centrifugaci při vysokých rychlostech nebo destilaci nebo kombinace uvedených metod. Ochrana reakčních skupin, jako jsou kyselé nebo alkenylové skupiny, se může provést v libovolném kroku známých metod, například alkylace nebo jodizace. Metody obvykle zahrnují metylaci mastných kyselin za vzniku metylesterů. Podobně lze ochranou skupinu odstranit v libovolném kroku. Čištění frakcí obsahujících ARA, DHA a EPA lze provést aplikací močovinou a/nebo frakční destilací.

Použití mastných kyselin

Existuje řada využití mastných kyselin podle vynálezu. Sondy založené na DNA podle vynálezu se mohou použít ve způsobech izolace příbuzných molekul nebo ve způsobech pro detekci organizmů exprimujících desaturázy. Při použití jako sondy DNA nebo oligonukleotidy musí být detekovatelné. To je obvykle doprovázeno zachycením značení buď na vnitřním místě, například začleněním upraveného zbytku, nebo na 5' nebo 3'konec. Takové značení je možné detekovat přímo, může vázat druhou molekulu, která je detekovatelné značená nebo se může vázat na neznačenou druhou molekulu a detakovatelně značenou terciální molekulu. Tento proces prodlužovat, pokud je to praktické, aby se dosáhlo uspokojivého detekčního signálu bez • · * nežádoucí úrovně signálu pozadí. Sekundární, terciální e přemosťovací systémy mohou zahrnovat použití protilátek proti libovolné jiné molekule, zahrnující značení nebo jiné protilátky nebo mohou zahrnovat libovolné molekuly, které se vzájemně váží. Je to například systém biotinstreptavidin/avidin. Detakovatelné značení v typickém případě zahrnuje radioaktivní izotopy, molekuly, které chemicky nebo enzymaticky produkují nebo mění světlo, enzymy, které produkují detekovatelné reakční produkty, magnetické molekuly, fluorescenční molekuly nebo molekuly, které po navázání mění svou své fluorescenční nebo světlo-emitující charakteristiky. Příklady metod značení se popisují v publikaci USPN 5,011,770.

V jiném případě navázání cílových molekul se může detekovat přímo měřením změn teploty roztoku při navázání sondy prostřednictvím izotermální titrační kalorimetrie nebo potažením sondy nebo cíle na povrch a detekcí změny rozptylu světla z povrchu, ke které dochází navázáním cíle nebo sondy. To se může provést systémem BIAcore.

PUFA produkované rekombinantními způsoby se mohou použít v různých oblastech. Dodávání PUFA lidem a zvířatům v různých formách může vést ke zvýšenému množství PUFA ne pouze přidaným PUFA, ale také jejich metabolickými progeny.

V případě, že inherentní dráha A5-desaturázy není u jedince funkční, pak ošetření ARA nemusí vést pouze ke zvýšení množství ARA, ale také produktu downstream ARA, jako jsou prostaglandiny (obrázek č. 1). Pro komplexní regulační mechanizmy může být nezbytné kombinovat různé pUFA nebo přidat různé konjugáty PUFA za účelem předcházet, řídit nebo obcházet takové mechanizmy, kterými se u jednotlivce dosahuje požadovaného množství specifických PUFA.

Nutriční kompozice

Vynález také popisuje nutriční kompozice. Takové kompozice pro účely uvedeného vynálezu zahrnují libovolné potraviny nebo přípravky vhodné pro člověka. Mohou se aplikovat enterálně nebo parenterálně. Tyto přípravky po vstupu do těla (a) vyživují a staví tkáně nebo dodávají energii a/nebo (b) udržují, obnovují nebo podporují adekvátní nutriční statut nebo metabolickou funkci.

Nutriční kompozice podle vynálezu obsahuje alespoň olej nebo jednu kyselinu, které se produkují v souladu s vynálezem, a mohou se vyskytovat v pevné nebo kapalné formě. Navíc kompozice může zahrnovat poživatelné makronutrienty, vitaminy a minerály v množství, které jsou nutné pro určité použití. Množství takových složek kolísá v závislosti na skutečnosti, zda kompozice je určená pro použití normálními zdravými kojenci, dětmi nebo dospělými jedinci, kteří tyto doplňky vyžadují ze zvláštních důvodů, jako je například jistý metabolický stav (například metabolická porucha).

Příklady makronutrientů, které se mohou přidávat do kompozice zahrnují, ale nejsou omezeny na poživatelné tuky, sacharidy a proteiny. Příklady takových poživatelných tuků zahrnují, ale nejsou omezeny na kokosový olej, sojový olej a mono- a diglyceridy. Příklady takových sacharidů zahrnují, ale nejsou omezeny na glukózu, poživatelnou laktózu a hydrolyzovaný škrob. Dále se uvádějí příklady proteinů, které se mohou využít jako nutriční kompozice podle vynálezu. Jsou to například sojové proteiny, elektrodialyzovaná syrovátka, elaktordialyzované odtučněné mléko, mléčná syrovátka nebo hydrolyzáty těchto proteinů.

S ohledem na vitaminy a minerály do nutričních kompozic je možné přidat: vápník, fosfor, draslík, sodík, chlorid, hořčík, mangan, železo, měď, zinek, selen, jód a vitaminy A, E, D, C a komplex vitaminů B. Dále se mohou přidat jiné takové minerály a vitaminy.

Komponenty využívané v nutričních kompozicích podle vynálezu jsou semi-čištěného nebo čištěného původu. Termín • · · · · · • · · · • » · ) · · · • » · · · · • · • · · · „semi-čištěný nebo „čištěný znamená materiál, který se připravil čištěním přirozeného materiálu nebo syntézou.

Příklady nutričních kompozic podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na kojenecké výživy, potravinové doplňky a rehydratační kompozice. Nutriční kompozice zahrnují, ale nejsou omezeny na ty, které využívají enterální nebo parenterální doplňky pro kojence, speciální kojenecké výživy, doplňky pro staré lidi a doplňky pro lidi s gastrointestinálními problémy a/nebo s poruchami střebávání.

Nutriční kompozice

Typická nutriční kompozice podle vynálezu bude obsahovat požívatelné makronutrienty, vitaminy a minerály v množství, které je nutné pro různé použití. Množství takových látek kolísá v závislosti na skutečnosti, zda výživa je určena pro aplikaci normálním, zdravým jedincům, kteří jsou dočasně vystaveny stresu nebo jsou určeny subjektům, kteří mají specializované potřeby vzhledem k jistým chronockým nebo akutním stádiím onemocnění (například metabolické poruchy). Odborníkům je zřejmé, že komponenty, které se využívají v nutričních kompozicích podle vynálezu pocházejí ze semičištěného nebo čištěného zdroje. Termín „semi-čištěný nebo „čištěný znamená materiál, který se připravil čištěním přirozeného materiálu nebo syntézou. Tyto metody jsou dobře známy v oboru (Code of Federal Regulations for Food

Ingredients and Food Processing; Recommended Dietary Allowances, 10^th Ed., National Academy Press, Washington, D.C., 1989).

V preferovaném provedení vynálezu jsou nutriční přípravky enterálním nutričním produktem, upřednostňuje se enterální nutriční produkt určený pro děti a dospělé. Vynález popisuje nutriční přípravek, který je vhodný pro výživu dospělých, kteří jsou vystaveny stresu. Výživa obsahuje vedle PUFA podle • · · • · vynálezu, makronutrienty, vitaminy a minerály v množství, které poskytuje denní nutriční dávka pro dospělé jedince.

Makronutriční komponenty zahrnují poživatelné tuky, sacharidy a proteiny. Příklady poživatelných tuků jsou kokosový olej, sojový olej mono- a diglyceridy a oleje PUFA podle vynálezu. Příklady sacharidů jsou glukóza, poživatelná laktóza a hydrolyzovaný kukuřičný škrob. Typickým zdrojem proteinu je sojový protein, elektrodialyzovaná syrovátka nebo elektrodialyzované netučné mléko nebo mléčná syrovátka nebo hydrolyzáty uvedených proteinů. Mohou se použít jiné zdroje proteinů. Tyto makronutrienty se mohou přidat ve formě běžně přijatelných nutričních látek v množství, které odpovídá složení lidského mateřského mléka nebo energetickému základu, to znamená, že se uvedené množství vztahuje kalorický základ.

Metody tvoření kapalných a enterálních nutričních formulací jsou dobře známy v oboru a popisují se v příkladech provedení vynálezu.

Enterální formulace se může sterilizovat a následně používat ve formě „připravený pro konzumaci (RTF) nebo se mohou uchovávat v koncentrovaném roztoku nebo ve formě prášku. Prášek je možné připravit sušením enterálního přípravku roztřikem, který se připravuje podle shora uvedených metod. Přípravek se může rekonstituovat rehydratací koncentrátu. Kojenecké výživy a výživy pro dospělé jsou dobře známy v oboru a jsou běžně dostupné (např. Similac®, Ensure®, Jevity® a Alimentům® od firmy Ross Products Division, Abbott Laboratories). Olej nebo kyselina podle vynálezu se může přidat do libovolného přípravku v množství popsaném dále v textu.

Energetická hustota nutriční kompozice, když je v kapalné formě, se může v typickém případě pohybovat v rozmezí 0,6 kcal až 3,0 kcal na mililitr. V pevné nebo práškové formě může nutriční doplněk obsahovat přibližně 1,2 až více než 9 kcal na gram, upřednostňuje se 3 až 7 kcal na gram. V obecném případě • · osmolalita kapalného produktu může být nižší než 700 mOsm. Více se upřednostňuje hodnota nižší než 660 mOsm.

Výživa v typickém případě zahrnuje vedle PUFA podle vynálezu, vitaminy a minerály, což napomáhá přijímat požadovanou minimální denní dávku těchto substancí. Vedle shora uvedených PUFA může být nutné doplnit nutriční kompozici zinkem, mědí a kyselinou listovou a dalšími antioxidanty. Věří se, že uvedené látky také poskytují podporu stresovanému imunitnímu systému a tak přináší jedinci jistý benefit. Přítomnost zinku, mědi a kyseliny listové není nutná, aby se dosáhlo pozitivního účinku na imunitní supresi. Farmaceutická kompozice se může také doplnit uvedenými látkami.

Ve více preferovaném provedení nutriční kompozice obsahuje vedle antioxidantního systému a komponentů PUFA zdroj sacharidů, kde alespoň 5 hmotnostních procent uvedených sacharidů tvoří nestravitelný oligosacharid. Ve více preferovaném provedení vynálezu nuriční kompozice navíc obsahuje protein taurin a karnitin.

PUFA nebo jejich deriváty, které se připravují popsanými způsoby, se mohou použít jako potravinové náhrady nebo doplňky zvláště pak u kojenecké výživy u pacientů vyživovaných intravenózně nebo při prevenci nebo léčbě podvýživy. V typickém případě lidské mateřské mléko vykazuje profil mastných kyselin obsahující přibližně 0,15 % až 0,36 % DHA, přibližně 0,03 % až 0,13 % EPA, přibližně 0,30 až 0,88 % ARA, Přibližně 0,22% až 0,67 % DGLA a přibližně 0,27 až 1,04% GLA. Převládajícími triglyceridy v mateřském mléce jsou 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl s 2-palmitoylglyceridy, které jsou lépe absorbovány než 2-oleoyl nebo 2-lineoylglyceridy (USPN 4,876,107). Pak se mastné kyseliny, jako jsou ARA, DGLA, GLA a/nebo EPA připravované podle vynálezu, mohou použít při změně složení kojeneckých výživ, aby lépe napodobily složení PUFA v lidském mateřském mléce. Olejová kompozice vhodná pro použití ve farmakoligických nebo v potravinových doplňcích, • · · zvláště pak u náhražek mateřského mléka nebo jeho doplňků, bude přednostně obsahovat jednu nebo více ARA, DGLA a GLA. Více se upřednostňuje, aby olej obsahoval přibližně 0,3 až 30 % ARA, přibližně 0,2 až 30 % DGLA a přibližně 0,2 až 30 % GLA.

Koncentrace a poměry ARA, DGLA a GLA se mohou upravit pro určité konečné použití. Když se připravuje doplněk mateřského mléka nebo jeho náhražka, olejová kompozice, která obsahuje dvě nebo více látek ze skupiny zahrnující ARA, DGLA a GLA je v poměru přibližně 1:19:30 až 6:1:0,2. Například mateřské mléko u zvířat vykazuje poměr ARA: DGLA: DGL, který kolísá v rozmezí 1:19:30 až 6:1:0,2. Preferují se poměry 1:1:1, 1:2:1 a 1:1:4. Když se produkují PUFA v hostitelské buňce dohromady, je vhodné upravit rychlost a procenta přeměny prekurzorového substrátu, jako je GLA a DGLA na ARA, aby se tak přesně řídily poměry PUFA. 5 až 10 % rychlost konverze DGLA na ARA se může použít pro produkci poměru ARA : DGLA přibližně 1:9, zatímco rychlost konverze přibližně 75 až 80 % se může použít při produkci poměru ARA : DGLA 6:1. Proto se může použít jak v systému buněčné kultury nebo v hostitelském organizmu, regulace časování , rozsahu a specifity exprese desaturázy za účelem modulace množství a poměru PUFA. Oleje se mohou izolovat a rekombinovat v požadovaných koncentracích a v poměrech v závislosti na použitém expresívním systému, kterým je například buněčná kultura nebo zvíře exprimující olej(e) ve svém mléce. Množství olejů poskytující uvedené poměry PUFA se mohou stanovit následujícími standardními protokoly. PUFA nebo hostitelské buňky, které je obsahují, se mohu také použít jako doplňky krmivá pro zvířata, přičemž mění složení mastných kyselin v mléce nebo v tkáních na složení, které je přijatelnější pro aplikaci lidem nebo zvířatům.

V případě potravinového doplňku se mohou PUFA nebo jejich deriváty začlenit do potravinářských olejů, tuků nebo margarinů, které se tvoří tak, že při normálním použití recipient dostane požadované množství. PUFA se mohou také • * • ·

přidat do kojeneckých výživ , nutričních doplňků nebo jiných potravinářských produktů a mohu se použít jako protizánětlivé činidla nebo činidla, která snižují hladinu cholesterolu.

Farmaceutické kompozice

Vynález popisuje farmaceutickou kompozici obsahující jednu nebo více kyselin a/nebo výsledné oleje produkované podle zde popsaných metod. Taková farmaceutická kompozice může obsahovat jednu nebo více kyselin a/nebo olejů stejně jako standardní, netoxický farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans nebo vehikl, jako je například fyziologický roztok pufrovaný fosfátem, voda, etanol, polyoly, rostlinné oleje, smáčecí činidlo nebo emulze, jako je například emulze voda/olej. Kompozice může být ve formě kapaliny nebo pevné látky. Kompozice může být například ve formě tablet, kapsulí, poživatelné kapaliny nebo prášku, v injektovatelné formě nebo ve formě povrchově aplikované masti nebo krému.

Možné způsoby aplikace zahrnují například orální, rektální a parenterální aplikaci. Způsob aplikace bude samozřejmě záležet na požadovaném účinku. Jestliže se kompozice má použít pro léčbu drsné, suché nebo podrážděné kůže nebo při léčbě kůže nebo vlasů, které jsou ovlivněné onemocněním, může se aplikovat povrchově.

Dávka kompozice aplikovaná pacientovi může stanovit odborník v závislosti na různých faktorech, jako je hmotnost pacienta, stáří pacienta, stav imunitního systému.

S ohledem na formu kompozice může být například roztok, disperze, suspenze, emulze nebo sterilní prášek, který se pak může rekonstituovat.

Kompozice podle vynálezu se může dále využít pro kosmetické účely. Mohou se přidat do dříve existujících kosmetických přípravků. Vytvoří se směs, která se může použít jako změkčovací kompozice.

Farmaceutické kompozice se mohou používat pro aplikaci komponentu PUFA jednotlivci.V hodné farmaceutické kompozice mohou obsahovat fyziologicky přijatelné sterilní vodné nebo nevodné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze nebo sterilní prášky pro přípravu sterilních roztoků nebo disperzí. Příklady vhodných vodných nebo nevodných nosičů, ředidel, rozpouštědel nebo vehiklů zahrnují vodu, etanol, polyoly (propylenglykol, polyethylenglykol, glycerol a podobně), jejich vhodné směsi, rostlinné oleje (jako je olivový olej) a injektovatelné organické estery, jako je etyloleját. Vhodná těkavost se může udržovat v případě disperze například zachováním požadované velikosti částic a použitím povrchových činidel. Může být také nutné použít izotonní činidla například cukry, chlorid sodný a podobně. Vedle takových inertních ředidel kompozice také může zahrnovat adjuvans, jako je smáčecí činidla, emulgátory a suspendační činidla, sladidla, příchutě a aroma.

Suspenze vedle aktivních sloučenin mohou obsahovat suspendační činidla, jako je například etoxylovaný izostearylalkohol, polyoxyetylensorbitol a sorbitanestery, mikrokrystalická celulóza, metahydroxid hliníku, bentonit, agar-agar a tragakant nebo směsi uvedených látek a podobně.

Pevné dávkovači formy, jako jsou tablety a kapsule se mohou připravit za použití metod dobře známých v oboru. PUFA podle vynálezu mohou tvořit tablety spolu s běžnými tabletovými bázemi, jako je laktóza, sacharóza a kukuřičný škrob v kombinaci s s pojidlem, jako je akacia, kukuřičný škrob nebo želatina, dezintegrační činidla, jako je bramborový škrob nebo kyselina alginová a lubrikační prostředek, jako je kyselina sterová nebo sterát hořečnatý. Kapsule se mohou připravit začleněním těchto ekcipientů do želatinových kapsulí buď samotných nebo s antioxidanty a s komponenty PUFA. Množství antioxidantů a komponentů PUFA, které by se měly začlenit do farmaceutické kompozice by měly souhlasit se shora uvedeným průvodcem.

·· ♦♦ * 99 ·»

9 9 9 ·«·· · » · »> « · · · «> · ·♦ 9 9 · ···««.

• » » * 9 » » • 4 99 · · 999 9 999 99 99

Termín „léčit znamená buď předcházet nebo redukovat výskyt nežádoucích stavů. Například léčit supresi imunity znamená buď předcházet výskytu této suprese nebo redukce síly takové suprese. Termíny „pacient a „jedinec jsou zaměnitelné a oba tyto termíny znamenají zvíře. Termín „zvíře znamená libovolného teplokrevného savce, ale není omezen na psi, lidi, opice a bezocasé opice. Termín „přibližně znamená množství, které kolísá v daném rozmezí v závislosti na použití. Libovolné numerické číslo nebo rozmezí specifikované ve specifikacích by se mohlo upravovat podle shora uvedeného termínu.

Termín „dávka znamená množství nutriční nebo farmaceutické kompozice podávané pacientovi v jediné aplikaci a je navržena tak, aby se zavedlo účinné množství antioxidantů a strukturních triglyceridů. Odborníkům je zřejmé, že jediná dávka kapalného nutričního prášku by měla poskytnout shora uvedené množství antioxidantů a.PUFA. Dávka by měla zahrnovat objem , který typický dospělý jedinec je schopen konzumovat při jedné aplikaci. Toto množství může široce kolísat v závislosti na věku, hmotnosti, pohlaví nebo zdravotním satvu pacienta. Obecně platí, že jedna dávka kapalného nutričního produktu by měla obsahovat objem 100 až 600 ml, upřednostňuje se 125 až 500 ml a nejvíce se preferuje 125 až 300 ml.

PUFA podle vynálezu se mohou také přidat do potravin dokonce tehdy, jestliže doplňky nejsou nutné. Kompozice se například mohou přidat do libovolného typu potravin, které se neomezují na margariny, máslo, sýry, mléko, jogurt, čokoláda, bonbony, sušenky, salátové oleje, tuky vhodné pro tepelné zpracování, maso, ryby a nápoje.

Farmaceutické aplikace

V případě farmaceutického použití (v lidské a veterinární medicíně) se mohou kompozice obecně aplikovat orálně nebo libovolným jiným způsobem, při kterém může dojít k úspěšné

99

9 9 9

9 9 * 9 · ·

9999 • 9 absorbci. Το znamená například parenterálně (to je podkožně, do svalu nebo intravenózně), rektálně nebo vaginálně nebo povrchově, což může být například kožní mast nebo roztok. PUFA podle vynálezu se mohou aplikovat samostatně nebo v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ekcipientem. Jestliže jsou dostupné želatinové kapsule jsou preferovanou formou aplikace. Doplnění potravy, jak se popisuje shora v textu, se může také provádět orálním způsobem aplikace. Nesaturované kyseliny podle vynálezu se mohou aplikovat v konjugovaných formách nebo jako sole, estery, amidy nebo proléčiva mastných kyselin. Vynález popisuje libovolné farmaceuticky přijatelné sole. Zvláště se preferují sole sodíku, draslíku a litia. Dále se využívají N-alkylpolyhydroxaminové sole, jako je Nmetylglukamin, který se popisuje v publikaci WO 96/33155. Preferovanými estery jsou etylestery. Jako pevné sole se mohou estery aplikovat ve formě tablet. V případě intravenózní aplikace se mohou PUFA nebo jejich deriváty začlenit do běžných formulací, jako jsou Intralipidy. Profil mastných kyselin v plazmě normálního dospělého jedince je 6,64 až 9,46 ARA, 1,45 až 3,11 % DGLA a 0,02 až 0,08 % GLA. Tyto PUFA nebo jiné metabolické prekurzory se mohou aplikovat buď samotné nebo ve směsi s jinými PUFA, aby se dosáhlo u pacienta normálního profilu mastných kyselin. Jestliže je to nutné jednotlivé komponenty formulací mohou být dostupné ve formě kitů, které jsou vhodné pro jediné nebo vícenásobné použití. Typická dávka určité mastné kyseliny je 0,1 mg až 20 mg nebo dokonce 100 g denně a upřednostňuje se 10 mg až 1, 2, 5 nebo 10 g denně nebo molární ekvivalentní množství jejich derivátů. Vynález dále popisuje parenterální nutriční kompozice obsahující přibližně 2 až 30 hmotnostních procent mastných kyselin vypočítaných jako triglyceridy. Preferují se kompozice, které obsahují přibližně 1 až 25 hmotnostních procent celkové kompozice PUFA jak GLA (USPN 5,196,198). Do kompozice se mohou přidat jiné vitaminy a zvláště pak v tucích • · · · · · · • · · ··· ······· ·· ·· rozpustné vitaminy, jako je vitamin A, D, E a L-karnitin. Jestliže je to nutné mohou se přidat konzervační činidla, jako je například α-tokoferol, v typickém případě tvoří přibližně 0,1 hmotnostních procent.

Vhodné farmaceutické kompozice mohou obsahovat fyziologicky přijatelné sterilní vodné nebo nevodné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze a sterilní prášky vhodné pro rekonstituci na sterilní injektovatelné roztoky nebo disperze. Příklady vhodných vodných a nevodných nosičů, ředidel, rozpouštědel nebo vehiklů zahrnují vodu, etanol, polyoly (propyllenglyol, polyetylenglykol, glycerol a podobně), jejich vhodné směsi, rostlinné oleje (jako je olivový olej) a injektovatelné organické estery, jako je etyloleát. Vhodnou fluiditu lze udržovat v případě disperzí například zachováním požadované velikosti částic nebo použitím povrchově aktivních činidel. Může být také nutné zahrnout izotonická činidla, například cukry, chlorid sodný a podobně. Vedle takových inertních ředidel kompozice může také zahrnovat adjuvans, jako jsou smáčecí činidla, emulgační a suspendační činidla, sladidla, příchutě a parfemovací činidla.

Suspenze vedla aktivních látek mohou obsahovat suspendační činidla, jako je například etoxylované izostearylalkoholy, polyoxyetylensorbitol a sorbitanestery, mikrokrystalická celulóza, metahydroxid hlinitý, bentonít, agar-agar a tragakant nebo směsi uvedených látek a podobně.

Zvláště preferované kompozice obsahují estery diacetyltartarové kyseliny a mono- a diglyceridů rozpuštěné ve vodném médiu nebo v rozpouštědle. Estery diacetyltartarové kyseliny a mono- a diglyceridů mají hodnotu HLB přibližně 9 až 12 a jsou podstatně více hydrofilní, než existující antimikrobiální lipidy, které vykazují hodnoty HLB 2 až 4. Tyto existující hydrofóbní lipidy se nemohou tvořit ve formě vodných kompozic. Tyto lipidy se mohou rozpouštět ve vodném médiu v kombinaci s estery diacetyltartarové kyseliny a mono46 a diglyceridů. V souladu s tímto provedením vynálezu estery diacetyltartarové kyseliny a mono- a diglyceridů (například DATEM-C12:0) se taví s jinými aktivními antimikrobiálními lipidy (například 18:2 a 12:0 monoglyceriody) a mísí se za vzniku homogenní směsi. Homogenita umožňuje zvýšit antimikrobiální aktivitu. Směs se může zcela dispergovat ve vodě. To není možné bez přidání esterů diacetyltartarové kyseliny a mono- a diglyceridů. Dříve než se přidá voda se vše promíchá s dalšími monoglyceridy. Vodná kompozice se pak může míchat za sterilních podmínek s fyziologicky přijatelnými ředidly, konzervačními činidly, pufry nebo hnacími látkami , které jsou nutné pro vytvoření spreje nebo inhalační formy.

Vynález dále popisuje léčbu řady poruch pomocí mastných kyselin. Doplňování PUFA podle vynálezu se může použít při léčbě restenózy po angioplastice. Symptomy zánětů, revmatické artritidy a astma a lupénky se mohou léčit pomocí PUFA podle vynálezu. Důkazy ukazují, že PUFA se mohou podílet na metabolizmu vápníku, což naznačuje, že PUFA podle vynálezu se mohou použít při léčbě nebo prevenci osteoporózy a kamenů v ledvinách nebo v močovém ústrojí.

PUFA podle vynálezu se mohou použít při léčbě zhoubného bujení. Ukázalo se, že maligní buňky vykazují změnu ve složení mastných kyselin. Navíc mastné kyseliny zpomalují růst uvedených buněk a způsobují jejich úmrtí a zvyšují jejich citlivost k chemoterapeutickým činidlům. Ukázalo se, že GLA způsobuje re-expresi buněčných adhezivních molekul E-kaderinu v buňkách karcinomů, přičemž ztráta exprese uvedených molekul je spojena s agresivní tvorbou metastáz. Klinické testy intravénozní aplikace ve vodě rozpustných litných solí GLA pacientům se zhoubným bujení pankreasu ukazují podstatné zvýšení pacientů, kteří přežívají. Podávaní PUFA je také vhodné pro léčbu kachexie spojené s zhoubným bujením.

PUFA podle vynálezu se mohou také použít při léčbě cukrovky (USPN 4,826,877; Horrobin et al., Am. J. Clin. Nutr.

Vol. 57 (Suppl.), 732S-737S) . Změněný metabolizmus mastných kyselin a jejich složení se demonstruje u zvířat trpících cukrovkou. Tyto změny naznačují, že se podílí na komplikacích, které vznikají při dlouhodobém onemocnění cukrovkou. Tyto komplikace zahrnují retinopatii, neuropatii, nefropatii a poškození reprodukčního systému. Petrklíčový olej, který obsahuje GLA, je schopen bránit a napravit poškození nervů při dlouhodobě trvající cukrovce.

PUFA podle vynálezu se mohou používat při léčbě ekzémů, při redukci krevního tlaku. Nedostatečnost mastných kyselin se projevuje ekzémy a studie naznačují, že GLA pozitivně působí na ekzémy. GLA se také podílejí na snížení vysokého tlaku spojeného se stresem. Ukázalo se, že GLA a DGLA inhibují agregaci destiček, způsobují vazolidaci, snižují hladinu cholesterolu a inhibují proliferaci hladkého svalstva stěn cév a vláknité tkáně (Brenner et al., Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 83, p.85-101, 1976). Aplikace GLA nebo DGLA samotného nebo v kombinaci s EPA snižuje nebo brání krvácení v gastrointestinálním traktu a jiné vedlejší účinky, které jsou spojeny s aplikací nesteroidních protizánětlivých léčiv (USPN 4,666, 701). GLA a DGLA také předchází nebo léčí endometriózu a premenstruální syndrom (USPN 4,758,592) a léčí myalgickou encefalomyelitidu a chronickou únavu po virové infekci (USPN 5,116,871).

Další použití PUFA podle vynálezu zahrnuje použití při léčbě AIDS, roztroušené sklerózy, akutního respiračního syndromu, vysokého tlaku a zánětlivého onemocnění kůže. PUFA podle vynálezu se mohou také použít ve formulích určených pro celkové posílení a pro geriatrickou léčbu.

Veterinární aplikace

Je třeba poznamenat, že shora uvedené farmaceutické a výživné kompozice se mohou také aplikovat zvířatům, stejně jako lidem. Zvířata mohou mít stejné potřeby a stejné stavy jako lidé. Olej nebo kyseliny podle vynálezu se mohou používat jako doplňky krmení zvířat.

Přehled obrázků na výkresu

Obrázek č. 1 ukazuje možnou dráhu syntézy kyseliny arachidonové (20:4 Δ5, 8, 11, 14) a kyseliny stearadinové (18:4 Δ6, 9, 12, 15) z kyseliny palmitové (C_i6) z různých organizmů, které zahrnují řasy, Mortierella a lidi. Tyto PUFA mohou sloužit jako prekurzory jiných molekul důležitých pro člověka a jiná zvířata. Mezi uvedené molekuly patří prostacykliny, leukotrieny a prostaglandiny. Některé z nich jsou zde zobrazeny.

Obrázek č. 2 ukazuje možný způsob produkce PUFA vedle ARA, zahrnující EPA a DHA v případě různých organizmů.

Obrázek č. 3A až D ukazuje sekvenci DNA Δδ-desaturázy Mortierelle alpina a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci.

Obrázek č. 4 ukazuje dedukovanou aminokyselinovou sekvenci fragmentu PCR (uvádí se v příkladu č. 1).

Obrázek č. 5A a 5B ukazuje uspořádání proteinové sekvence A5-desaturázy s Δβ-desaturázami.

Obrázek č. 6A až 6B ukazuje účinek časování přidání substrátu relativně k indukci konverze substrátu za účelem produkce SC334 obsahující gen A5-desaturázy.

Obrázek č. 7A a 7B ukazující účinek koncentrace indukčního činidla na expresi A5-desaturázy v SC334.

Obrázek č. 8A a 8B ukazuje účinek teplotní indukce na aktivitu A5-desaturázy v SC334.

Obrázek č. 9A a 9B ukazuje účinek hostitelského kmene na konverzi substrátu na produkt v kmenech exprimujících gen Δ5desaturázy při teplotě 15 °C.

• · · • ·

Obrázek č. 10A a 10B ukazuje účinek hostitelského kmene na konverzi substrátu na produkt v kmenech exprimujících gen Δ5desaturázy při teplotě 30 °C.

Obrázek č. 11 ukazuje účinek hostitelského kmene exprimující cholinovou transferázu stejně jako gen Δ5desaturázy na konverzi substrátu na produkt.

Obrázek č. 12A a 12B ukazuje účinek složení média a teploty na konverzi substrátu produktu ve dvou hostitelských kmenech exprimujících gen A5-desaturázy.

Obrázek č. 13 ukazuje uspořádání proteinové sekvence Ma 29 a kontig 253538a.

Obrázek č. 14 ukazuje uspořádání proteinové sekvence Ma 524 a kontig 253538a.

Popis sekvencí:

SEQ ID NO: 1 ukazuje sekvenci DNA A5-desaturázy

Mortierella alpina.

SEQ ID NO: 2 ukazuje aminokyselinovou sekvenci Δ5desaturázy Mortierella alpina.

SEQ ID NO: 3 ukazuje dedukovanou aminokyselinovou sekvenci fragmentu PCR M. alpina (popisuje se v Příkladu 1).

SEQ ID NO: 4 až SEQ ID NO: 7 ukazuje dedukovanou aminokyselinové aminokyselinové sekvence různých Δβ-desaturáz.

SEQ ID NO: 8 a SEQ ID NO: 9 ukazuje sekvence PCR primeru Δβ-desaturáz.

SEQ ID NO: 10 ukazuje primer reverzní transkripce celkové

RNA.

SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12 ukazuje aminokyselinové motivy sekvence desaturázy.

SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 14 ukazuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci desaturázy Dictyostelium discoideum.

• · ····· ····· ··· ·· • · ···· ······· ··

SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 16 ukazují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci desaturázy Phaeodactylum tricornutum.

SEQ ID NO: 17 až 20 ukazuje nukleotidovou a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci klonu cDNA Schizochytrium.

SEQ ID NO: 21 až 2 7 ukazuje nukleotidovou sekvenci pro lidské desaturázy.

SEQ	ID NO: 28 až SEQ ID NO:	34 zobrazují	peptidové
sekvence	lidských desaturáz.
Příklady	provedení vynálezu
Příklad	1: Izolace nukleotidové	sekvence Δ5	desaturázy
	z organizmu Mortierella	alpina

Organizmus Mortierella alpina produkuje kyselinu arachidonovou (ARA, 20:4) z prekurzoru 20:3 pomocí Δ5 desaturázy. Nukleová sekvence kódující Δ5 desaturázu pocházející z Mortierella alpina se získala pomocí amplifikace PCR za použití prvního řetězce cDNA Mortierella alpina a degenerovaných oligonukleotidových primerů odpovídajících aminokyselinovým sekvencím, které jsou mezi A6-desaturázami z Synechocystis a Spirulina konzervativní. Postup je následuj ící:

Celková RNA se izolovala ze třídenní kultury organizmu Mortierella alpina produkující PUFA za použití protokolu podle publikace Hoge et al. (1982) Experimental Mycology 6: 225-232. RNA se používala pro přípravu dvouřetězcové cDNA za použití systému lambda-ZipLox od firmy BLR. Postupuje se podle instrukcí výrobce. Několik velikostí cDNA organizmu Mortierella alpina se zabalilo odděleně za vzniku knihoven z různými inzerty průměrné velikosti. Knihovna s úplnou délkou zahrnuje přibližně 3 x 10⁶ klonů, přičemž průměrná velikost inzertu je 1,77 kb. Knihovna vhodná pro sekvenování obsahuje přibližně 6 x 10⁵ klonů, přičemž průměrná velikost inzertu je

1,1 kb. 5 μς celkové RNA se reverzně přepsalo za použití Superscript RTázy firmy BLR a primeru Tsyn (5'CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3'), SEQ ID NO: 10.

Degenerované oligonukleotidy se navrhly tak, aby byly vhodné pro oblasti, které jsou mezi dvěmi sekvencemi Δβ-desaturázy cyanobakterií konzervativní. Použily se specifické primery D6DESAT-F3 (SEQ ID NO: 8) (5'CUACUACUACUACAYCAYACOTAYACOAAYAT-3' ) a D6DESAT-R3 (SEQ ID NO: 9) (5 '-CAUCAUCAUCAUOGGRAAOARRTGRTG-3 '), kde Y=C+T, R=A+G a O=I+C. Amplifikace PCR se provedla v objemu 25 μΐ a reakce zahrnuje templát získaný ze 40 ng celkové RNA, 2 pM každého primeru, 200 μΜ každého deoxyribonukleotidovéhc trifosfátu, 60 mM Tris-Cl, pH 8,5, 15 mM (NHJzSOo 2 mM MgCls· Vzorky se nejdříve denaturovaly při teplotě 95 °C po dobu 5 minut, pak se držely při teplotě 72 °C a přidalo se 0,2 jednotek Taq polymerázy. Podmínky PCR jsou následující: teplota 94 °C po dobu 1 minuty, teplota 45 °C po dobu 1,5 minuty, teplota 72 °C po dobu 2 minut. PCR proběhlo ve 35 cyklech. PCR za použití těchto primerů, prvního řetězce cDNA Mortierella alpína produkuje reakční produkt o velikosti 550 bp. Porovnáním dedukované aminokyselinové sekvence PCR fragmentu Mortierella alpina SEQ ID NO: 3 se objevily oblasti homologie s Δ6desaturáz (uvádí se na obrázku č. 5). Srovnávané oblasri vykazují pouze přibližně 28 % shody.

Produkt PCR se použil jako sonda pro izolaci klonů cDNA z knihovny Mortierella alpina. Nejdelší klon cDNA Ma29 se označil jako pCGN5521 a zcela se sekvenovaly oba řetězce. cDNA je obsažena ve vektoru pZLl jako inzert o velikosti 1 481 bp (Bethesda Research Laboratories ) a začíná s ATG, obsahuje otevřený čtecí rámec kódující 446 aminokyselin. Čtecí rámec obsahuje sekvenci dedukovanou z fragmnetu PCR. Zjistilo se, že sekvence inzertu cDNA obsahuje oblasti homologní s Δ6desaturázou (obrázek č. 5). Například se zjistilo, že tři ·· · · ····· • · · · · · · ······ • · · · · · · ·· ···· ···««·· ·· ·· konzervativní histidinové boxy (které se pozorovaly v desaturázách vázaných na membráně (Okuley et al., (1994) The Plant Cell 6: 147-158) jsou přítomny v sekvenci Mortierella v polohách aminokyselin 171 až 175, 207 až 212 a 387 až 391 (obrázek č. 3) , Zjistilo se, že aminokyselinový motiv HXXHH, který je typický pro třetí histidinový box z desaturázy organizmu Mortierella, je QXXHH, SEQ ID NO: 11 až 12. Překvapivě N-konec kódovaného proteinu vykazuje podstatnou homologii s proteiny cytochromu b5. Tak klón cDNA Mortierella reprezentuje fúzí mezi cytochromem b5 a desaturázou mastné kyseliny. Vzhledem k tomu, že cytochrom b5 funguje jako donor elektronů při navázání desaturáz na membránu, je možné, že Nterminální doména cytochromu b5 tohoto desaturázového proteinu se účastní jeho funkce. To může být výhodné při expresi desaturázy v heterogenních systémech při produkci PUFA.

Příklad 2: Exprese klonů desaturázy M. alpina v kvasinkách

Transformace kvasinek

Transformace kvasinek acetátem litia se provedla podle standardních protokolů (Methods in Enzymology, Vol. 194, p. 186-187, 1991). Kvasinky se kultivovaly v kultivačním médiu

YPD při teplotě 30 °C. Buňky se centrifugovaly, resuspendovaly se v TE a opět se centrifugovaly a resuspendovaly se v TE obsahujícím 100 mM acetát litný. Pak proběhla centrifugace a opět se buňky resuspendovaly v TE/acetát litný. Resuspendované kvasinky se inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 60 minut za stálého míchání. Přidala se nosičova DNA a do zkumavek se připravily alikvoty kultury kvasinek. Dále se do kumavek přidala transformující DNA a zkumavky se inkubovaly po dobu 30 minut při teplotě 30 °C. Přidal se roztok PEG (35 % (hmotnost/objem) PEG 4 000, 10 mM acetát litný, TE pH 7,5) a pak následuje inkubace po dobu 50 minut při teplotě 30 °C.

Uskutečnil se teplotní šok provedený při teplotě 42 °C po dobu 5 minut, buňky se centrifugovaly do peletu , promyly se TE,

opět se centrifugovaly a resuspendovaly se v TE. Resuspendované buňky se pak nanesly na plotny se selektivním médiem.

Exprese desaturázy v transformovaných kvasinkách

Klony cDNA z organizmu Mortierella alpina se testovaly, zda vykazují aktivitu desaturázy. Jako pozitivní kontrola se použila A5-desaturáza kanoly (získaná pomocí PCR použitím prvního řetězce cDNA ze semen Brassica napus kultivar 212/86 za použití primerů založených na publikované sekvenci (Arondel et al. Science 258: 1353-1355)). Gen Al5-desaturázy a gen z cDNA klonu Ma29 se začlenil do expresívního vektoru pYES2 (Invitrogen) za vzniku plazmidů pCGR-2 a pCGR-4. Tyto plazmidy se transfekovaly do kvasinek S. cerevisiae kmen 334 a exprimovaly se po indukci galaktózou v přítomnosti substrátů, které umožňují detekci specifické aktivity desaturázy.

cerevisiae kmen 334 obsahující Používané substráty, produkóvané produkty a indikované aktivity desaturázy byly: DGLA (konverze na ARA indikuje aktivitu Á5-desaturázy) , kyselina linolenová (konverze na ARA indikuje aktivitu Δβ-desaturázy, konverze na

Kontrolním kmenem byl S nezměněný vektor pYES2.

ALA indikuje aktivitu Al5-desaturázy), kyselina olejová (endogenní substrát připravený kvasinkami S. cerevisiae, konverze na kyselinu linolenovou indikuje aktivitu Δ12desaturázy, která kvasinkám S. cerevisiae chybí) nebo ARA (konverze na EPA indikuje aktivitu Al7-desaturázy). Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 1 dále v textu. Lipidové frakce se extrahovaly následujícím způsobem: kultury se kultivovaly po dobu 48 až 52 hodin při teplotě 15 °C. Buňky se centrifugovaly, pelet se promyl sterilní ddH₂O a znovu se centrifugací připravil pelet. Pelety se suspendovaly mícháním na vortexu v metanolu. Přidal se chloroform s tritridekanon (jako inertní standard). Směsi se inkubovaly alespoň jednu • · hodinu při teplotě místnosti nebo přes noc při teplotě 4 °C. Extrahovala se vrstva chloroformu a filtrovala se za použití Whatmanova filtru s jedním gramem nevodného síranu sodného za účelem odstranění partikul! a zbytku vody. Organická rozpouštědla se odpařila při teplotě 40 °C v proudu dusíku. Extrahované lipidy se pak derivatizovaly na metylestery mastných kyselin (FAME) a nalyzovaly se chromatografií (GC) přidáním 2 ml 0,5 N hydroxidu draselného v metanolu. Zkumavka se uzavřela. Vzorky se zahřály na teplotu 95 °C až 100 °C po dobu 30 minut a ochladily se na teplotu místnosti. Pak se přidaly přibližně 2 ml 14 % fluoridu boritého v metanolu a zahřátí se opakovalo. Po té, co se extrahovaná lipidová směs ochladila, přidaly se 2 ml vody a 1 ml hexanu za účelem extrakce FAME pro analýzu GC. Procenta konverze se vypočítala dělením produkovaného produktu součtem produkovaného produktu a přidaného substrátu a pak násobeno 100. Pro výpočet procenta konverze kyseliny olejové , kde se nepřidal žádný substrát, se celková produkovaná kyselina linolenová dělí součtem kyseliny olejové a produkované kyseliny linolenové násobeno 100.

Tabulka č. 1

Exprese desaturázy M. alpina v pekařských kvasinkách

klón	Typ enzymatické aktivity	% konverze substrátu
pCGR-2	Δ6	0 (18:2 až 18:3©6
Al5-desaturáza	Δ15	16,3 (18:2 až
kanoly		18:3ω3)
	Δ5	2,0 (20:3 až 18:3ω3)
	Δ17	2,8 (20:4 až 20:5ω3)
	Δ12	1,8 (18:1 až 18:2co6)

pCGR-4 (M. alpina Ma29)	Δ6	0
Δ15	0
Δ5	15, 3
Δ17	0, 3
Δ12	3, 3

Kontrolní klón Al5-desaturázy vykazuje 16,3 % konverzi substrátu. Klon pCGR-4 exprimující cDNA Ma29 přeměnil 15,3 % substrátu 20:3 na 20:4ω6, což indikuje, že gen kóduje Δ5desaturázu. Pozadí (nespecifická konverze substrátu) se v tomto případě pohybuje mezi 0 až 3 %. Dále se zjistilo, že substrát v různých koncentracích inhibuje aktivitu. Když se přidal substrát v koncentraci 100 μΜ, procento konverze kleslo ve srovnání s koncentrací substrátu 25 μΜ (uvedeno dále v textu). Navíc jestliže koncentrace substrátu DGLA kolísají v rozmezí přibližně 5 μΜ až 200 μΜ, pak procento konverze DGLA na ARA je v rozmezí přibližně 5 až 75 % s A5-desaturázou M. alpina.

Tyto data ukazují, že desaturázy s různými specifitami substrátu se mohu exprimovat v heterogenním systému a používají se za účelem produkce poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem.

Tabulka č. 2 reprezentuje zajímavé mastné kyseliny, jako procento celkových lipidů extrahovatelných z kvasinkového hostitele S.cerevisiae 334 s indikovaným plazmidem. V růstovém médiu není obsažena žádná glukóza. Afinitní plynová chromatografie se používala k separaci použila pro ověření identity produktu(ů) lipidů. GC/MS se Očekávaný produkt

Al5-desaturázy organizmu B. napus, což je a linolenová kyselina, se detekoval, kdyžse exogenně přidal její substrát kyselina linolenová do indukované kvasinkové kultury. Toto zjištění naznačuje, že ¹ exprese desaturázového genu • · • · v kvasinkách produkuje funkční enzym a detekovatelné množství produktu za současných růstových podmínek. Oba exogenně přidané substráty se pohltily kvasinkami, ačkoli do kvasinek se začlenilo o trochu méně PUFA s delšími řetězci, což je kyselina dihomo-y-linolenová (20:3), než kyseliny linolenové (18:2), když se přidaly ve volné formě, aby se indukovala kvasinková kultura. Kyselina arachidonová se v kvasinkách detekovala jako nové PUFA, když se přidala kyselina dihomo-ylinolenová jako substrát pro kvasinky S. cerevisiae 334 (pCGR4) . To ukazuje, že pCGR-4 (MA29) je Á5-desaturázou z M. alpina. Dosud se ve stavu tehniky nezmiňuje žádná izolace ani exprese A5-desaturázy v libovolném zdroji.

Φ « • φ • φ

3	M	1—>
O	O	co	1
			l·-1
4^	co	4^	CD

ff	I-1		P
I	co	CO	3
l·-1	• ·	• ·	P'
CO			O<

* f—¹ co kyselina ω ω ι—¹ ω

cd co p:

(Λ cd

co	3	3
3
	3	3
3	CD	CD
CD	3	31

P-	P-	l·—
3	3	H·
3	3	2 CU

i_, _H. _H.

p- 3 3

3 3

P

3 p 3 i— O CD

3 3	P P·	3 3	-a I	s	3 p-	O 3
	3	P	CD	1—i	1	3	CD
•	O	O	3	H-	(—1	O	PJ.
	P	£	3	£5	P-	3	O
	P-	o	P-	o	3	CD	<
	P	1	P	|—i	O	3	3'
	O	-<	O	Φ	I—1	O
•	3	1	3		CD	<
	O	3	0	O	3	3'
	<	P-	<	O
	3'	3 o	3'	&>'	< 3'

CD

O <

3'

PJ.

CD

CD

P

O cQ

CD

P' £

ω

3'

M CD 1—¹

P3 <

<

cn

P3

ÍDs

Ω

P φ ·

PCGR-4 (Δ5)	PCGR-2 (Δ15)	PYES2 (kontrolní)	Plazmid v kvasinkách (enzym)
67 1	60, 1 1 1 1	66, 9	18:2 začleněný
o	|-- Cá	o	ot-18: 3 produkovaný L.
o	o	O	γ-18 : 3 produkovaný
32, 3	50, 4	Cn CO 4^	20:3 začleněný
cn ·> 00	O	O	20:4 produkovaný I_
o CO	o -4	4^	18:1* přítomný i
o	O	o	18:2 produkovaný

s ui

3'

CD

P*

P3 <

Pl3'

P

3<

CD

3pi3 π

O

P

O o

CD

O

O

CD

O <

‘C'

O

P i—¹

PP

PP

3“

CD

X

P

O <

Ω

P

N <

Cfl

P3

CD

H

P

Ω<

ro cn

-j

• * · · · ·

• · · v • · » ♦ • · · · » · · · · » t « • · ♦ ·

Příklad 3: Optimalizace kultivačních podmínek

Tabulka 3A ukazuje účinek koncentrace substrátu exogenních volných mastných kyselin na pohlcení a konverzi produktu mastných kyselin v kvasinkách. Vyjadřuje se jako procento celkových extrahovaných kvasinkových lipidů. Ve všech případech malé množství exogenního substrátu (1 až 10 μΜ) vede k pohlcení malého množství substrátu mastných kyselin a ke tvoření produktu. Koncentrace volné mastné kyseliny v rozmezí 25 a 50 μΜ v kultivačním a indukčním médiu poskytuje nejvyšší procento tvořeného produktu mastných kyselin, zatímco koncentrace 100 μΜ a následující vysoké pohlcení se jeví tak, že snižuje nebo inhibuje desaturační aktivitu. Zpětná vazba inhibice substrátu s vysokou koncentrací mastných kyselin je zobrazena v tabulce č. 3, kde se porovnává rozmezí procent konverze substrátů mastných kyselin na jejich produkty. Ve všech případech koncentrace substrátu 100 μΜ v kultivačním médiu snižuje procento konverze na produkt. Účinek složení kompozice je také zřejmý v případě, že glukóza je přítomna v růstovém médiu A5-desaturázy, protože procento pohlcení substrátu se snížilo na 25 μΜ (tabulka č. 3A) . Jestliže v růstovém médiu je obsažena glukóza, procento konverze Δ5desaturázou se zvýšilo o 18 % a procento formovaného produktu zůstalo stejné.

Tabulka č. začleněných extraktu

3A: Účinek substrátů a přidaného produktu substrátu tvořeného na procento v kvasinkovém

Plazmid v kvasinkách	pCGR-2 (Δ15)	pCGR-4 (Δ5)
Substrát/produkt	18:2/a-18:3	20:3/20:4
1 μΜ sub.	ND	0,5/1,7
10 μΜ sub.	ND	3, 3/4

9 9 * * ·» • · · · · · κ · • » * ’ ‘ « • · «9 99 9 · • *· v

999999 99 9 ·

25 μΜ sub.	ND	5,1/6,1
25 μΜΟ sub.	36,6/7,20	9,3/5,40
50 μΜ sub.	53,1/6,50	ND
100 μΜ sub.	60,1/5,70	32,3/5,80

Tabulka č. 3B: Účinek koncentrace substrátu v kultivačním médiu na procento konverze substrátu mastných kyselin na produkt v kvasinkových extraktech.

Plazmid v kvasinkách	pCGR-2 (Δ15)	pCGR-4 (Δ5)
Substrát/produkt	18:2/a-18:3	20:3/20:4
1 μΜ sub.	ND	77, 3
10 μΜ sub.	ND	54, 8
25 μΜ sub.	ND	54, 2
25 μΜΟ sub.	16, 4	36,7
50 μΜ sub.	10, 90	ND
100 μΜ sub.	8,70	15,20

□ glukóza není obsažena v kultivačním médiu + kvasinková peptodnová půda (YPD) * 18:1 je endogenní kvasinkový lipid sub. Je koncentrace substrátu

ND neprovedlo se

Tabulka č. 4 ukazuje množství mastné kyseliny produkované rekombinantní desaturázou z indukovaných kvasinkových kultur v případě, že se použilo různé množství substrátu volných mastných kyselin. Stanovila se hmotnost mastných kyselin, protože celkové množství lipidů dramaticky kolísá, v případě, že se mění růstové podmínky, jako je přítomnost glukózy v kvasinkovém kultivačním a indukčním médiu. Aby bylo možné lépe stanovit podmínky, kdy rekombinantní desaturáza bude produkovat maximální produkt PUFA, testovalo se velké množství βο : :

• · · · · jednotlivých mastných kyselin. Nepřítomnost v kultivačním médiu redukuje množství arachidonové produkované A5-desaturázou. V případě A5-desaturázy celkových kvasinkových lipidů se v nepřítomnosti snížilo skoro o polovinu.

• · · · ······ • · · · ·····♦· ·· · · glukózy kyseliny množství glukózy

Tabulka č. 4: Mastná kyselina produkovaná z kvasinkových extraktů vyjádřená v pg.

Plazmid v kvasinkách	PCGR-4	pCGR-7
(enzym)	(Δ5)	(Δ12)
produkt	20:4	18:2*
1 μΜ sub.	8, 3	ND
10 μΜ sub.	19,2	ND
25 μΜ sub.	31,2	115,7
25 μΜΠ sub.	16, 8	3 90

□ glukóza není obsažena v kultivačním médiu * 18:1 substrátem je endogenní kvasinkový lipid sub. je koncentrace substrátu

ND neprovedlo se

Příklad 4: Distribuce PUFA v kvasinkových lipidových frakcích

Tabulka č. 5 ukazuje pohlcení volných mastných kyselin a jejich nových produktů vytvořených v kvasinkových lipidech, které jsou rozdělený do hlavních lipidových frakcích. Celkový lipidový extrakt se připravil způsobem popsaným shora v textu. Lipidový extrakt se separoval na TLC deskách a frakce se se identifikovaly porovnáním se standardy. Pruhy se posbíraly seškrábnutím a přidaly se vnitřní standardy. Frakce se pak ošetřily saponátem a metylovaly se, jak se uvádí shora v textu a podrobily se plynové chromatografií. Plynový chromatograf vypočítal množství mastné kyseliny porovnáním se standardem. Je zřejmé, že substráty jsou pro desaturázy přístupné ve fosfolipidové formě.

• ·

• · · I)

Tabulka č. 5. Distribuce mastných kyselin v různých kvasinkových lipidových frakcích vyjádřeno v μς

Frakce mastné kyseliny	f osfolipid	diglycerid	Volná mastná kyselina	triglycerid	Ester cholesterolu
SC(pCGR-4) Substrát 20:3	15,1	1,9	22, 9	12, 6	3, 3
SC(pCGR-4) Produkt 20:4	42, 6	0,9	6, 8	4,9	0,4

SC = S. cerevisiae (plazmid)

Příklad 5: Další optimalizace kultivace

Hodnotily se růstové a indukční podmínky optimálních aktivit desaturáz v organizmu Saccharomyces cerevisiae. Různé podmínky kutlivace, které se upravily, aby se dosáhlo optimální aktivity, jsou: i)indukční teplota, ii)koncentrace induktoru, iii) časování přidání substrátu, iv) koncentrace substrátu, v) zdroj cukru, vi)růstová fáze při idnukci. Tyto studie se usktutečnily za použití genu A5-desaturázy z organizmu Mortierella alpina (MA29). Navíce se stanovil účinek změny hostitelského kmene na expresi genu Δ5desaturázy.

Jak se popisuje shora v textu nej lepší rozmezí konverze substrátu na ARA seč pozorovalo při koncentraci substrátu 1 μΜ. Procentuální zastoupení ARA v celkových mastných kyselinách bylo nejvyšší při koncentraci substrátu 25 μΜ. Za účelem stanovení, zda je nutné modifikovat substrát na snadno dostupnou formu substrátu před tím, než se využívá desaturázou, se substrát přidal 15 hodin před indukcí nebo souhlasí s přidáním indukčního činidla (zobrazeno na obrázku č.6A). Jak je možné vidět na obrázku č. 6A, přidání substrátu • · ·

před indukcí nemá podstatný účinek na aktivitu A5-desaturázy. Ve skutečnosti přidání samotného substrátu s indukčním činidlem je trochu výhodnější pro expresi/aktivitu Δ5desaturázy stejně jako množství ARA v celkovém množství mastných kyselin je vyšší. Rozsah konverze substrátu naprodukt byl slabě nižší.

Účinek koncentrace indukčního činidla na expresi/aktivity A5-desaturázy organizmu Mortierella se testoval indukcí SC334/pCGR5 s 0,5 nebo 2 % (hmotnost/objem) galaktózy. Jak se uvádí na obrázku č. 7A a 7B exprese A5-desaturázy byla vyšší , když se pro indukci použilo 0,5 % galaktózy. Dáel rozsah konverze substrátu na produkt byl také lepší, když se SC334/pCGR5 indukoval 0,5 % galaktózou verzus 2% galaktózou.

Za účelem stanovení účinku teploty na aktivitu Δ5desaturázy se hostitelský kmen transformoval pCGR5(SC334/pCGR5) a kutivoval se a indukoval se při teplotě 15 °C, 25 °C, 30 °C a 37 °C. Množství ARA (20:4n6) se měřil analýzou mastných kyselin. Obrázek č. 8A znázorňuje množství 20:3n6 a 20:4n6, které se vyjádřilo jako procento celkových mastných kyselin. Obrázek č. 8B znázorňuje rozmezí konverze substrátu na produkt. Kultivace a indukce SC334/pCGR5 při teplotě 25 °C je nej lepší při expresi A5-desaturázy, což se prokázalo nejvyšším množstvím kyseliny arachidonové v celkovém množství mastných kyselin. Navíc nejvyšší rozmezí konverze substrátu na produkt se dosáhlo při teplotě 25 °C. Kuyltivace a indukce při teplotě 15 °C dává nejslabší expresi ARA, zatímco při teplotě 37 °C se dosahuje nejnižší konverze substrátu na produkt.

Účinek kmene kvasinek na expresi genu A5-desaturázy se studoval u pěti různých hostitelských kmenů, což jsou INVSC1, INVSC2, YTC34, YTC41 a SC334, při teplotě 15 °C a 30 °C. Pří teplotě 15 °C má kmen SC334 nejvyšší procento ARA v celkovém množství mastných kyselin, což naznačuje, že kmen SC334 i

• · • · · · vykazuje vyšší aktivitu A5-desaturázy. Rozsah konverze substrátu na produkt je však nejnižší u kmene SC334 a nejvýšší u kmene INVSC1 (obrázek č. 9A a B) . Při teplotě 30 °C se nejvýšší procento produktu (ARA) v celkovém množství mastných kyselin pozorovalo v INVSC2, ačkoli rozsah konverze substrátu na produkt u kmene INVSC2 je slabě nižší než u kmene INVSC1 (obrázek č. 10 A a B).

ARA, což je produkt A5-desaturázy, se uchovává ve fosfolipidové frakci (příklad 4). Proto množství ARA produkované v kvasinkách je omezeno množstvím, které je možné uchovávat ve fosfolipidové frakci. Jestliže ARA je možné uchovávat v jiných frakcích, jako jsou triglyceridová frakce, množství ARA produkované v kvasinkách se může zvýšit. Při testováni uvedené hypotézy gen A5-desaturázy se exprimoval v kvasinkách v hostitelském kmenu DBY746 (získaném z instituce Yeast Genentic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkeley, CA 94720; genotyp kmene DBY746 je Mata, his3-Ál, leu2-3, leu2112, ura3-32, trpl-289, gal) . Kvasinkový kmen DBY746 má endogenní gen cholinové transferázy. Přítomnost uvedeného enzymu ho může činit schopným přeměnit nadbytek fosfolipidů na fakci triglyceridů. Výsledky uvedené na obrázku č. 11 neukazuje vzrůst konverze substrátu na produkt, jak se pozorovalo u kmene SC334, který nenese gen cholinové transferázy.

Za účelem studia účinku kultivačního média na expresi Δ5desaturázy, se pCGR4/SC334 kultivoval ve čtyřech různých kultivačních mediích při dvou různých teplotách (15 °C a 30 °C) a ve dvou různých hostitelských kmenech (SC334 a INVSC1). Složení kultivačních médií je následující:

Médium A: mm-Ura + 2% galaktózy + 2 % glikózy

Médium B: mm-Ura + 20 % galaktóza + 2 % glukóza + 1M sorbitol (pH5,8)

Médium C: mm-Ura + 2 % galaktóza + 2% rafinóza • *

Médium D: mm-Ura + 2 % galaktóza + 2 % rafinóza + 1 M sorbitol (pH5,8)

Symbol mm znamená minimální médium.

Výsledky ukazují, že nejvyšší rozsah konverze substrátu na produkt při teplotě 15 °C u kmene SC334 se pozoroval v kultivačním médiu A. Nejvyšší rozsah konverze v případě Δ5desaturázy v kmeni SC334 byl při teplotě 30 °C v kultivačním médiu D. Nejvyšší rozsah konverze v případě A5-desaturázy v kmeni INVSC1 byl při teplotě 30 °C v kultivačním médiu D (obrázek č. 12A a 12B).

Tyto data ukazují, že DNA kódující desaturázu, která může měnit DGLA na ARA se může izolovat z organizmu Mortierella alpina a může se exprimovat v heterogenním systému a může se použít při produkci poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem. Jako příklad se uvádí produkce ARA z prekurzoru DGLA expresí A5-desaturázy v kvasinkách.

Příklad 6: Identifikace homologů s Δ5- a Δβ-desaturázami organizmu M. alpina.

Sekvence nukleové kyseliny, která kóduje putativní Δ5desaturázu, se identifikovala průzkumem TBLASTN databáze prostřednictvím NCBI, kde se jako dotaz použily aminokyseliny 100 až 446 Ma29. Zkrácená část sekvence Ma29 se použila za účelem zabránit vybrání homologii založených na oblasti cytochromu b5 aminokyselinová na N-koncí desaturázy. Dedukovaná sekvence z Díctyostelium discoideum (přístupové číslo #C25549) ukazuje velmi podstatnou homologii s Ma29 a menší, ale stále podstatnou, homologii s Ma524. Sekvence DNA je přítomna jako SEQ ID NO: 13. Aminokyselinová sekvence je přítomna jako SEQ ID NO: 14.

Příklad 7: Identifikace Δ5- a Δβ-homologů v jiných organizmech produkujících PUFA • · ·

Aby se našly desaturázy, které se podílejí na produkci PUFA, zkonstruovala se z celkové RNA izolované z Phaeodactylum tricornutum knihovna cDNA. Na plazmidu založená knihovna cDNA se zkonstruovala v pSPORTl (GIBCO-BRL) podle instrukcí výrobce za použití komerčně dostupného kitu (GIBCO-BRL). Náhodné klony cDNA se sekvenovaly a sekvence nukleových kyselin, které kódují Δ5- a Δβ-desaturázu se identifikovaly prostřednictvím průzkumu BLAST v databázi a porovnáním sekvencí Ma29 a Ma524.

Jeden klon se identifikoval z knihovny Phaeodactylum na základě homologie s Ma29 a s Ma 524. Tento klon se nazývá 144011-B12. Sekvence DNA je přítomna jako SEQ ID NO: 15. Aminokyselinová sekvence je přítomna jako SEQ ID NO: 16.

Příklad 8: Identifikace Δ5- a Δβ-homologů M. alpina v jiných organizmech produkujících PUFA

Aby se našly desaturázy, které se podílejí na produkci PUFA, zkonstruovala se z celkové RNA izolované z Phaeodactylum tricornutum knihovna cDNA. Na plazmidu založená knihovna cDNA se zkonstruovala v pSPORTl (GIBCO-BRL) podle instrukcí výrobce za použití komerčně dostupného kitu (GIBCO-BRL). Náhodné klony cDNA se sekvenovaly a sekvence nukleových kyselin, které kódují Δ5- a Δβ-desaturázu se identifikovaly prostřednictvím průzkumu BLAST v databázi a porovnáním sekvencí Ma29 a Ma524.

Jeden klon se identifikoval z knihovny Phaeodactylum na základě homologie s Ma29 a Ma 524. Tento klón se nazývá 144011-B12. Sekvence DNA je přítomna jako SEQ ID NO: 15. Aminokyselinová sekvence je přítomna jako SEQ ID NO: 16.

Aby se našly desaturázy, které se podílejí na produkci PUFA, zkonstruovala se z celkové RNA izolované ze specie Schizochytrium knihovna cDNA. Na plazmidu založená knihovna cDNA se zkonstruovala v pSPORTl (GIBCO-BRL) podle instrukcí výrobce za použití komerčně dostupného kitu (GIBCOBRL) . Náhodné klony cDNA se sekvenovaly a sekvence nukleových kyselin, které kódují Δ5- nebo Δβ-desaturázu se identifikovaly

prostřednictvím průzkumu BLAST v databázi a porovnáním sekvencí Ma29 a Ma524.

Jeden klon se identifikoval z knihovny Schizochytrium na základě homologie s Ma29 a Ma524. Tento klon se nazývá 81-23C7 . Tento klon obsahuje inzert o velikosti přibližně 1 kb. Z každého konce klonu se získala část sekvence za použití univerzálních forward a reverzních sekvenačních primerů. Sekvence DNA od forward primeru je přítomná jako SEQ ID NO: 17. Peptidová sekvence je přítomna jako SEQ ID NO: 18. Sekvence DNA z reverzního primeru je přítomna jako SEQ ID NO:

19. Aminokyselinová sekvence z reverzního primeru je přítomna jako SEQ ID NO: 20.

Příklad 9: Sekvence genu lidské desaturázy

Sekvence genu lidské desaturázy, které se potenciálně podílejí na biosyntéze poly-nenasycených mastných kyselin, se izolovaly na základě homologie mezi sekvencemi lidské cDNA a sekvencemi genu desaturázy organizmu Mortierella alpina. Našli se tři konzervativní histidinové boxy, o kterých se ví, že jsou mezi desaturázami navázanými na membráně konzervativní. Stejně jako u jiných desaturáz navázaných na membráně konečný motiv histidinového boxu HXXHH je QXXHH. Aminokyselinové sekvence putativních lidských desaturáz vykazovaly homologii s Δ5, Δ6, Δ9 a Δ12 desaturázami.

Sekvence cDNA A5-desaturázy M. alpina a Δβ-desaturázy se použily při průzkumu databáze LifeSeq instituce Incyte Pharmaceuticals, lne., Palo Alto. California 94304. Sekvence Δδ-desaturázy se rozdělily do dvou fragmentů: 1) aminokyselina č. 1 až 150, 2) aminokyselina č. 151 až 300 a 3) aminokyselina č. 301 až 446. Sekvence Á6-,desaturázy se rozdělila na tři fragmenty: 1) aminokyselina č. 1 až 150, 2) aminokyselina č. 151 až 300, 3) aminokyselina č. 301 až 457. Tyto polypeptidové fragmenty se zkoumaly proti databázi za použití algoritmu „tblastn. Tento algoritmus srovnává dotaz na sekvenci • · · proteinu s databází nukleotidových sekvencí dynamicky překládaných do všech šesti čtecích rámců (oba řetězce).

Polypeptidové fragmenty 2 a 3 Δ5- a Δβ-desaturázy vykazují homologie se sekvencemi CloneID jak se uvádí v tabulce č. 6. CloneID reprezentuje jednotlivé sekvence z databáze Incyte LifeSeq. Po té co se zveřejnily výsledky „tblastn informace klonech se hledaly za podmínek přísnost >/= 50 a skóre produktu je </=100 při různých číslech CloneID. „Cloně Information Results uvádějí informace zahrnující ClusterID, CloneID, Library, HitID, popis Hit. Číslo ClusterID ukazuje informace o klonu všech klonů, které patří do uvedeného ClusterID. Příkaz zařazení zařazuje všechny CloneID, které obsahují ClusterID. V případě zařazení GCG (Genetics Computer Group, University Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53704) se používají následující nastavení:

Velikost slova	7
Minimum překryvu	14
Přísnost	0, 8
Minimum shody	14
Maximum mezer	10
Významnost mezer	8
Významnost délky	2
Výsledky uspořádání	GCG

základě sekvenčních informací v CloneID. „Kontig je uspořádání sekvencí DNA založené na oblastech homologie mezi těmito sekvencemi. Na základě seřazených sekvencí do kontigu se vytvořila nová sekvence. Identifikoval se kontig obsahující CloneID a nejednoznačné místa sekvence se editovala na základě seřazení CloneID (SEQ ID NO: 21 až SEQ ID NO: 25) za vzniku nej lepší možné sekvence. Postup se opakoval v případě všech šesti CloneID uvedených v tabulce č. 6. Tímto způsobem vzniká pět jedinečných kontigů. Editované sekvence 5 kontigů se přenesly do softwarového programu Sequencher (Gene Codes

Corporation, Ann Arbor, Michigan 48 105). Sestavily se konsensus sekvence. Kontig 2511785 se překrývá s kontigem 3506132 a tento nový kontig se nazývá 2535 (SEQ iD NO: 27) . Kontigy z programu Sequencher se zkopírovaly v programu Sequence Analysis software package GCG.

Každý kontig se přeložil do všech šesti čtecích rámců v proteinových sekvencích. Sekvence Δ5(ΜΑ29) a Δ6(ΜΑ524) M. alpina se porovnaly s každým přeloženým kontigem za použití průzkumu FastA (průzkum podobnosti mezi dotazovanou sekvencí a skupinou sekvencí stejného typu (nukleová kyselina nebo protein) podle Pearson a Lipman). Homologie mezi těmito sekvencemi naznačuje otevřené čtecí rámce každého kontigu. Homologie mezi Δ5 a Δ6 M. alpina s kontigy 2535 a 3854933 se použily k vytvoření konečného kontigu nazvaného 25358a. Obrázek č. 13 je párování FastA konečného kontigu 253538a a MA29 a obrázek 14 je párování FastA konečného kontigu 25358a a MA524. Sekvence DNA různých kontigů jsou přítomny v sekvencích SEQ ID NO: 21 až SEQ ID NO: 27. Různé peptidové sekvence jsou zobrazeny v SEQ ID NO:28 až SEQ ID NO: 34.

Ačkoli otevřený čtecí rámec se vytvořil spojováním dvou kontigů, kontig 2535 ukazuje, že zde existuje na začátku kontigu jediná sekvence, která se s kontigem 3854933 nepáruje. Proto je možné, že tyto kontigy vznikly z nezávislé desaturázy jako lidské geny.

Kontig 253538a obsahuje otevřený čtecí rámec kódující 432 aminokyselin. Začíná Gin (CAG) a končí stop kodonem (TGA). Kontig 253538 se spojuje se sekvencemi Δ5 a Δ6 M. alpina, což naznačuje, že jde buď o libovolnou desaturázu nebo o jiné známé desaturázy, které vzájemně sdílí homologii. Tyto jednotlivé kontigy uvedené v tabulce 6 stejně jako intermediální kontig 2535 a konečný kontig 253538a se mohou využívat k izolaci celých genů lidských desaturáz.

Použití lidských desaturáz • · · · ····· • · · · · · * ······ • · · · · · · • · ·9·· »···»·» ·« »·

Tyto lidské sekvence se mohou exprimovat v kvasinkách a v rostlinách za využití postupů popsaných v příkladech.

V případě exprese v savčích buňkách a v transgenních zvířatech tyto geny mohou poskytovat odchylku kodonu. Tyto lidské sekvence se mohou také použít pro identifikaci příbuzných sekvencí desaturáz.

Tabulka č. 6

Sekce desaturáz	CloneiD z databáze LifeSeq	Klíčové slovo
151-300 Δ5	3808675	Desaturáza mastné kyseliny
301-446 Δ5	354535	Δ6
151-300 Δ6	3448789	Δ6
151-300 Δ6	1362863	Δ6
151-300 Δ6	2394760	Δ6
301-457 Δ6	3350263	Δ6

Příklad 10: Nutriční kompozice

PUFA z předchozích příkladů se mohou použít v různých nutričních doplňcích, kojeneckých výživách, nutričních susbtituentech a jiných nutričních roztocích.

I. Kojenecké výživy

A. Sojový výživa Isomil® obsahující železo

Použití: Používá se jako nápoj pro kojence, děti a dospělé s alergií nebo citlivostí na kravské mléko. Potrava pro pacienty s poruchami, kvůli, kterým nelze podávat laktózu: nedostatečnost laktázy, netolerance k laktóze a galaktosemie. Rysy:

• Obsahuje sojový proteinový izolát, aby se předešlo symptomům alergie nebo citlivosti na protein kravského mléka.

ΊΟ • Výživa neobsahuje laktózu, čímž se předejde průjmu spojeným s laktózou.

• Nízká osmolalita (240 mOsm/kg vody) redukuje nebezpečí osmotického průjmu.

• Duální sacharidy (z kukuřice a sacharóza) , které se používají pro zvýšení absorpce sacharidů a omezení nebezpečí překročení absorpční kapacity poškozených střev.

• 1,8 mg železa (ve formě síranu železnatého) na 100 kalorií pomáhá předcházet nedostatečnosti železa.

• Obsahuje doporučenou dávku vitaminů a minerálů.

• Obsahuje rostlinné oleje, které poskytují doporučené množství podstatných mastných kyselin.

• Výživa má mléčně bílou barvu, konzistenci podobnou mléku a příjemné aroma.

Složky: (Pareve,©) 85 % vody, 4,9 % kukuřičného sirupu, 2,6 % cukru (sacharóza), 2,1 % sojový proteinový izolát, 1,4 % kokosový olej, 0,15 % citrát vápenatý, 0,11 % tribazický fosforečnan vápenatý, citrát draselný, monobazický fosforečnan draselný, chlorid draselný, mono- a diglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, L-methíonin, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan draselný, chlorid sodný, cholinchlorid, taurine, síran železitý, m-inositol, alfatokoferylacetát, sulfát zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, jodid draselný, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

B. Sojová výživa Isomyl® DF, která se aplikuje v případě průjmu

Použití: Vhodná pro krátkodobou aplikaci v případě průjmů u kojenců a batolat.

Rysy:

« · · · · · • « • · · · • První kojenecká výživa, která obsahuje přidanou vlákninu ze sóji a která se aplikuje specificky během průjmů.

• Na základě klinické studie se prokázalo, že redukuje trvání kašovité, vodnaté stolice během středně těžkých a těžkých stavů průjmu u kojenců.

• Uspokojuje nutriční potřeby kojenců.

• Sojový proteinový izolát s přidaným L-methioninem uspokojuje nebo překračuje požadavky kojenců na všechny podstatné aminokyseliny.

• Přípravek neobsahuje laktózu, čímž se předchází průjmům spojeným s laktózou.

• Nízké osmolalita (240 mOsm/kg vody) redukuje nebezpečí osmotického průjmu.

• Duální sacharidy (kukuřičný sirup a sacharóza), které se používají pro zvýšení absorpce sacharidů a omezení nebezpečí překročení absorpční kapacity poškozených střev.

• Splňuje nebo překračuje množství vitaminů a minerálů doporučených Committee on Nutrition of the American Academy of Pediatrics.

• 1,8 mg železa (ve formě síranu železnatého) na 100 kalorií pomáhá předcházet nedostatečností železa.

• Obsahuje doporučenou dávku vitaminů a minerálů.

• Obsahuje rostlinné oleje, které poskytují doporučené množství podstatných mastných kyselin.

Složky: (Pareve,®) 86 % vody, 4,8 % kukuřičného sirupu, 2,5 % cukru (sacharóza), 2,0 % sojový proteinový izolát, 2,1 % sojového oleje, 1,4 % kokosový olej, 0,77 % vlákniny, 0,12 % citrát vápenatý, 0,11 % tribazický fosforečnan vápenatý, 0,11 % citrát draselný, monobazícký fosforečnan draselný, chlorid draselný, mono- a diglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, L-methionin, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan draselný, chlorid sodný, cholinchlorid, taurine, síran železitý, m-inositol, alfa-tokoferylacetát, síran • · • · · · · ···· • · · · ·«*-·«

-7 o · · · · * ········ /Z · · · · » · · ·* ···* ·»· ···· ·· »· zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, jodid draselný, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D3 a cyanokobalamin.

C. Sojová výživa Isomil® se železem bez sacharózy

Použití: Jako nápoj pro kojence, děti a dospělé s alergií nebo citlivostí na kravské mléko. Potrava pro pacienty s poruchami, kvůli, kterým nelze podávat laktózu: nedostatečnost laktázy, netolerance k laktóze a galaktosemie.

Rysy:

• Obsahuje sojový proteinový izolát, aby se předešlo symptomům alergie nebo citlivosti na protein kravského mléka.

• Výživa neobsahuje laktózu, čímž se předejde průjmu spojeným s laktózou (zdroj sacharidů je Polycose® Glucose Polymers).

• Neobsahuje sacharózu, čímž je vhodná pro pacienty, kteří netolerují sacharózu.

• Nízká osmolalita (180 mOsm/kg vody) redukuje nebezpečí osmotického průjmu.

• 1,8 mg železa (ve formě síranu železnatého) na 100 kalorií pomáhá předcházet nedostatečnosti železa.

• Obsahuje doporučenou dávku vitaminů a minerálů.

• Obsahuje rostlinné oleje, které poskytují doporučené množství podstatných mastných kyselin.

• Výživa má mléčně bílou barvu, konzistenci podobnou mléku a pří j emné aroma.

Složky: (Pareve) 75 % vody, 11,8 % hydrolyzovaného kukuřičného škrobu, 4,1 % sojového oleje, 4,1 % sojový proteinový izolát,

2,8 % kokosový olej, 1,0 % modifikovaného kukuřičného škrobu,

0,38 % tribazický fosforečnan vápenatý, 0,17 % citrát draselný, 0, 13 % chlorid draselný, mono- a diglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, L-methionin, chlorid • · « hořečnatý, uhličitan vápenatý, chlorid sodný, cholinchlorid, taurine, síran železitý, m-inosítol, alfa-tokoferylacetát, sulfát zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, jodid draselný, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

D. Sojová výživa Isomyl®20 se železem, 20 kalorií na 0,0284 1

Použití: v případě, že je nutná sojová výživa

Složky: (Pareve,©) 85 % vody, 4,9 % kukuřičného sirupu, 2,6 cukru (sacharóza), proteinový izolát, vápenatý, 0,11 %

2,1 % sojového oleje, 1,9 % sojový

1,4 % kokosový olej, 0,15 % citrát tribazický fosforečnan vápenatý, citrát draselný, monobazický fosforečnan draselný, chlorid draselný, mono- a diglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, L-methionin, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan draselný, chlorid sodný, cholinchlorid, taurine, síran železitý, m-inositol, alfa-tokoferylacetát, síran zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, jodid draselný, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

E. Kojenecká výživa Similac®

Použití: v případě, že je potřeba umělá kojenecká výživa: jestliže je nutné přerušit krmení mateřským mlékem před dosažením jednoho roku dítěte, jestliže je nutno doplnit kojení. Může se použít jako krmení, jestliže není možné krmení mateřským mlékem.

Rysy:

• · • Obsahuje protein vhodné kvality a množství zaručující dobrý růst. Protein je denaturován teplem, což redukuje nebezpečí krvácení v konečníku spojené s mlékem.

• Obsahuje tuk ze směsi rostlinných olejů (dvakrát homogenizováných), poskytuje kyselinu linolenovou, která je jednoduše absorbovatelná.

• Obsahuje sacharidy, jako je laktóza v poměru, který je podobný jako u lidského mléka.

• Nízký obsah renálních rozpuštěných látek, což minimalizuje stres vyvíjejících se orgánů.

• Existuje se ve formě prášku, koncentrovaného roztoku a ve formě vhodné pro přímé použití.

Složky: (© -D) voda, netučné mléko, laktóza, sojový olej, kokosový olej, mono- a díglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, cholinchlorid, taurine, m-inositol, alfatokoferylacetát, síran zinečnatý, niacinamid, síran železnatý, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, -riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D3 a cyanokobalamin.

F. Kojenecká výživa pro předčasně narozené děti se železem Similac®NeoCare

Použití: Vhodné pro předčasně narozené kojence, které vyžadují po propuštění z nemocnice speciální výživu. Similac NeoCare je nutričně kompletní výživa vyvinutá pro předčasně narozené kojence, která obsahuje další kalorie, protein, vitamíny a minerály potřebné pro vyvolání růstu a podporu vývoje.

Rysy:

• Redukuje potřebu kalorických a vitaminových doplňků. Ve srovnání 5 popsanou standardní výživou (20 kalorií na 0,0284 1) obsahuje více kalorií (22 kalorií na 0,0284 1).

• 9 · 9 * «9 ·· • · · · · 9 * · « » · • 9 · 9 » < * »

9 99 β 9 * · 9 » • · · t * · ·

99*9 99» «·9» «« 99 • Obsahuje vysoce absorbovatelnou směs tuků s triglyceridy se středně dlouhými řetězci (MCT olej), které pomáhají uspokojit speciální trávicí potřeby předčasně narozených koj enců.

• Na 100 kalorií obsahuje vyšší množství protein, vitaminů a minerálů, aby se zvýšila počáteční dávka nutrientů podávaná v nemocnici.

• Obsahuje více vápníku a fosforu, což umožňuje mineralizaci kostí.

Složky: © -D pevné částice kukuřičného sirupu, netučné mléko, laktóza, syrovátkový proteinový koncentrát, sojový olej, slunečnicový olej, frakcionovaný kokosový olej (triglyceridy se středně dlouhými řetězci), citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, uhličitan vápenatý, kyselina askorbová, chlorid hořečnatý, chlorid draselný, chlorid sodný, taurine, síran železitý, m-inositol, alfa-tokoferylacetát, síran zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, beta-karoten, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

G. Lidské mléko obohacené nízkým obsahem železa Similac Natural Care ve formě pro přímé použití, 24 kal. na 0,0284

Ί _L

Použití: Výrobek je určen pro smíchání s lidským mlékem nebo pro aplikaci, jako alternativa lidského mléka u kojenců s nízkou porodní hmotností.

Složky: : © -D voda, netučné mléko, hydrolyzovaný kukuřičný škrob, laktóza, syrovátkový proteinový koncentrát, sojový olej, slunečnicový olej, frakcionovaný kokosový olej (triglyceridy se středně dlouhými řetězci), kokosový olej, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, uhličitan vápenatý,mono- a digiyceridy, sojový lecitin,karagen, cholin

^{1 v} φ · · • · φ φ φ φ chlorid, taurine, m-inositol, alfa-tokoferylacetát, síran zinečnatý, L-karnitin, chlorid draselný, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran horečnatý, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Do těchto výživ je možné přidat PUFA podle vynálezu nebo je možné jimi nahradit některé složky uvedených výživ.

II. Výživy

A. ENSURE®

Použití: ENSURE je tekutá výživa obsahující malé množství zbytků připravená primárně jako orální nutriční doplněk, který se požívá s jídlem nebo mezi jednotlivými jídly nebo ve vhodném množství jako náhražka jídla. ENSURE neobsahuje laktózu a lepek a je vhodný pro použití při upravených dietách, jako jsou diety s nízkým obsahem cholesterolu. Ačkoli se primárně podává jako orální doplněk, může se aplikovat hadičkou.

Stav pacienta:

• Pacienti s upravenou dietou • Pacienti vysokého stáří se specifickými požadavky na potravu • Pacienti, kteří nedobrovolně ztrácí hmotnost • Pacienti po nemoci nebo po chirurgickém zákroku • Pacienti, kteří potřebují dietu s malým obsahem zbytků.

Složky: (5) -D voda, cukr (sacharóza), maltodextrin (kukuřičný), kaseinát vápenatý a sodný, slunečnicový olej, sojový proteinový izolát, sojový olej, kanolový olej, draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, citrát chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan hořečnatý, citrát sodný, umělé přísady, chlorid sodný, sojový lecitin, cholinchlorid, • · · * * • · ···· ·· · · · kyselina askorbová, karagen, síran zinečnatý, síran železnatý, alfa-tokoferylacetát, želatinová guma, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran hořečnatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thíaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, molybdát sodný, chlorid chrómu, biotin, jodid draselný, selenát sodný.

B. ENSURE®BARS

Použití: ENSURE BARS je celková, vyvážená výživa, která se používá jako doplněk mezi jednotlivými jídly nebo se podává s jídlem. Je lahodnou, nutričně bohatou alternativou jiných zákusků. ENSURE BAR obsahuje míně než 1 g laktózy v jedné tyčince (typ Chocolate Fudge Brownie neobsahuje lepek, typ Honey Graham Crunch obsahuje lepek).

Stav pacienta:

• Pacienti, kteří potřebují více kalorií, proteinů, vitaminu a minerálů.

• Zvláště vhodné pro lidi, kteří nepřijímají dostatek kalorií a nutrientů.

• Vhodné pro lidi, kteří jsou schopni žvýkat a polykat • Není vhodné pro lidi alergické na burské ořechy a jakoukoliv alergií na ořechy.

Složky:

Typ Honey Graham Crunch obsahuje kukuřičný sirup s vysokým obsahem fruktózy, sojový proteinový izolát, hnědý cukr, maltodextrin (kukuřičný), křupavá rýže (drcená rýže, cukr (sacharóza), sůl (chlorid sodný) a slad), ovesné otruby, částečně hydrogenované olej ze semen bavlníku a sojový olej, sojové polysacharidy, glycerin, syrovátkový proteinový koncentrát, polydextróza, fruktóza, kaseinát vápenatý, kakaový prášek, umělé příchutě, kanolový olej, slunečnicový olej, netučné sušené mléko, syrovátkový prášek, sojový lecitin, •· · · · ·· ·· • · ···· · « · « • · · · « # · • · · · · ······ • · · · · • · · · ······· ·· ·· kukuřičný olej. Tyto tyčinky se vyrábějí v továrnách, kde se zpracovávají ořechy.

Vitamíny a minerály:

Tribazický fosforečnan vápenatý, dibazický fosforečnan draselný, oxid hořečnatý, sůl (chlorid sodný), chlorid draselný, kyselina askorbová, fosforečnan železitý, alfatokoferylacetát, niacinamid, oxid zinečnatý, pantotenát vápenatý, glukonát mědňatý, síran manganatý, riboflavin, betakaroten, pyridoxinhydrochlorid, dusíčan thiaminu, kyselina folová, biotin, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, molybdenan sodný, fylochinon, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

Protein:

Typ Honey Graham Crunch : Zdroj proteinů je směs sojového proteinového izolátu a mléčných proteinů.

Sojový proteinový izolát 74 %

Mléčné proteiny 26 %

Tuk:

Typ Honey Graham Crunch : Zdroj tuku je směs částečně hydrogenovaného oleje sóji a semen bavlníku, slunečnicového a kukuřičného oleje a sojového lecitinu.

hydrogenovaného oleje sóji a oleje sóji a semen bavlníku slunečnicový olej olej kanoly kukuřičný olej sojový lecitin

Sacharidy:

Typ Honey Graham Crunch : kukuřičného sirupu s vysokým semen bavlníku hydrogenovaného 76 % %

% %

%

Zdroj sacharidů je kombinace obsahem fruktózy, hnědý cukr,

	79	• · · » • · · • · · · · ·
maltodextrin,	med,	křupavá	rýže,	glycerin,
polysacharidy a	ovesné	otruby.
kukuřičný sirup	s vysokým obsahem	fruktózy	24 %
hnědý cukr				21 %
maltodextrin				12 %
med				11 %
křupavá rýže				9 %
glycerin				9 %
sojový polysacharid			7 %
ovesné otruby				7 %

C. ENSURE® HIGH PROTEIN

Použití: ENSURE® HIGH PROTEIN je koncentrovaná výživa v kapalném stavu s vysokým obsahem proteinů určená pro lidi, kteří vyžadují nadbytečný přísun kalorií, proteinu, vitaminů a minerálů. Může se aplikovat orálně, jako nutriční doplněk mezí jednotlivými jídly nebo se podává s jídlem. V určitém množství může nahradit jídlo. ENSURE® HIGH PROTEIN neobsahuje laktózu ani lepek a je vhodný pro aplikaci lidem po operaci, po zlomeninách krčku a pacientům, kde je nebezpečí vředů.

Stav pacienta:

• Přípravek je vhodný pro pacienta, který potřebuje větší přísun kalorií, proteinu, vitamínů, minerálů, jako jsou pacienti po chirurgickém zákroku nebo fraktuře krčku, pacienti trpícími tlakovými vředy a pacienti, kde se aplikuje dieta s nízkým obsahem cholesterolu.

Rysy:

• Nízký obsah nasycených tuků • Obsahuje 6 g celkového tuku a méně než 5 mg cholesterolu na jedno balení • Bohatá a jemná chuť • Skvělý zdroj proteinů, vápníku a jiných podstatných vitamínů a minerálů

• · · • Vhodné při dietě s nízkým obsahem cholesterolu • Neobsahuje laktózu, snadno se tráví.

Složky:

Typ Vanilla Supreme: -©-D voda, cukr (sacharóza), maltodextrin (kukuřičný), kaseinát vápenatý a sodný, slunečnicový olej, sojový proteinový izolát, sojový olej, kanolový olej, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, citrát sodný, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan horečnatý, umělé přísady, chlorid sodný, sojový lecitin, cholinchlorid, kyselina askorbová, karagen, síran zinečnatý, síran železnatý, alfa-tokoferylacetát, želatinová guma, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, molybdát sodný, chlorid chrómu, biotin, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdroj proteinů je směs dvou vysoce biologicky hodnotných proteinů: kasein a sója.

Kaseinát sodný a vápenatý 85 %

Sojový proteinový izolát 15 %

Tuk:

Zdrojem tuku je směs tří olejů: slunečnicový olej, olej kanoly a sojový olej.

Slunečnicový olej 40 %

Olej kanoly 30 %

Sojový olej 30 %

Množství tuku v přípravku ENSURE® HIGH PROTEIN splňuje požadavky American Heart Association (AHA). 6 gramů tuku v přípravku ENSURE® HIGH PROTEIN reprezentuje 24 % celkového • » » · • · · · · · · • · • « · · množství kalorií, přičemž 2,6 % tuku pochází z nasycených mastných kyselin a 7,9 % je z poly-nenasycených mastných kyselin. Tyto hodnoty splňují požadavky AHA, což znamená méně jak 30 % kalorií pochází z tuku, méně než 10 % kalorií pochází ze saturovaných mastných kyselin a méně než 10 % kalorií pochází z polynenasycených mastných kyselin.

Sacharidy:

s Přípravek ENSURE® HIGH PROTEIN obsahuje kombinací maltodextrinu a sacharózy. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová, divokých bobulovin a banánu) plus VARI-FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková a jiné nečokoládové příchutě obsahují:

Sacharóza 60 %

Maltodextrin 40 %

Čokoládová příchuť obsahuje:

Sacharóza 70 %

Maltodextrin 30 %

D. ENSURE®LIGHT

Použití: Přípravek ENSURE LIGHT je výživa v kapalné formě obsahující malé množství tuků. Používá se jako orální nutriční doplněk podávaný mezi jednotlivými jídly nebo s jídly. Přípravek ENSURE LIGHT neobsahuje laktózu a lepek a je vhodný pro použití při upravené dietě, která zahrnuje diety s nízkým obsahem cholesterolu.

Stav pacientů:

• Je vhodný pro pacienty s normální hmotností a pacienty s nadváhou, které potřebují živiny navíc. Podává se ve formě • · · · · · · ·· ···· ··· ···· ·· ·· doplňku, který obsahuje o 50 % méně tuku a o 20 % méně kalorií, než obsahuje přípravek ENSURE.

• Pro zdravé dospělé jedince, kteří se nestravují správným způsobem a potřebují výživu navíc.

Rysy:

• Obsahuje malé množství tuků a nasycených tuků.

• Obsahuje 3 g celkového tuku a méně než 5 mg cholesterolu • Přípravek má bohatou jemnou chuť • Je to skvělý zdroj vápníku a jiných podstatných vitamínů a minerálů • Přípravek je vhodný pro dietu s nízkým obsahem cholesterolu • Přípravek neobsahuje laktózu a snadno se tráví.

Složení:

Typ French Vanilla: -®-D voda, cukr (sacharóza), maltodextrin (kukuřičný), kaseinát vápenatý a sodný, slunečnicový olej, sojový proteinový izolát, sojový olej, kanolový olej, chlorid hořečnatý, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, citrát sodný, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan hořečnatý, přirozené a umělé přísady, celulóza, gel, cholinchlorid, sojový lecitin, chlorid sodný, kyselina askorbová, karagen, celulózová guma, síran železnatý, alfatokoferylacetát , síran zinečnatý, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, molybdát sodný, chlorid chrómu, biotin, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdrojem proteinu je kaseinát vápenatý.

Kasinát vápenatý

100 • *

Tuk:

Zdrojem proteinu je směs dvou olejů: slunečnicového oleje a oleje kanoly.

Slunečnicový olej 70 %

Olej kanoly 30 %

Množství tuku v přípravku ENSURE LIGHT splňuje požadavky American Heart Association (AHA). 3 gramy tuku v přípravku

ENSURE LIGHT reprezentuje 13,5 % celkového množství kalorií, přičemž 1,4 % tuku je z nasycených mastných kyselina 2,6 % z poly-nenasycených mastných kyselin. Tyto hodnoty jsou v souladu s požadavky AHA, kdy méně než 30 % kalorií je z tuku a méně než 10 % kalorií pochází z nasycených mastných kyselin a méně než 10 % celkového množství kalorií pochází z polynenasycených mastných kyselin.

Sacharidy:

Přípravek ENSURE LIGHT obsahuje kombinace maltodextrinu a sacharózy. Čokoládová příchuť obsahuje také kukuřičný sirup. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová, jahodová) plus VARI-FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková a jiné nečokoládové příchutě obsahují: Sacharóza 51 %

Maltodextrin 49 %

Čokoládová příchuť obsahuje: Sacharóza Kukuřičný sirup Maltodextrin % 26,5 % 26,5 %

Vitamíny a minerály • ·

Jedno balení (0,2272 1) ENSURE LIGHT poskytuje alespoň 25 %

RDI pro 24 klíčových vitamínů a minerálů.

Kofein:

Čokoládová příchuť obsahuje 2,1 mg kofeinu na 0,2272 1.

E. ENSURE PLUS®

Použití: přípravek ENSURE PLUS je vysokokalorická výživa v kapalné formě s nízkým obsahem zbytků. Používá se tam, kde je třeba dodat navíc kalorie a nutrienty, ale normální koncentraci proteinů. Přípravek slouží primárně jako orální nutriční doplněk, který se použije mezi jednotlivým jídlem nebo v přijatelném množství jako náhražka jídla. Přípravek ENSURE PLUS neobsahuje laktózu ani lepek. Ačkoli se přípravek primárně aplikuje orálně, může se zavádět i hadičkou.

Stav pacienta:

• Přípravek je vhodný pro pacienty, kteří vyžadují v omezeném objemu navíc kalorie a nutrienty, ale normální koncentraci proteinů • Přípravek je vhodný pro pacienty, kteří potřebují dosáhnout a udržet normální hmotnost.

Rysy:

• Bohatá a lahodná chuť • Dobrý zdroj podstatných vitamínů a minerálů

Složení:

Typ Vanilla: - ©-D voda, kukuřičný sirup, maltodextrin (kukuřičný), cukr (sacharóza), kukuřičný olej, kaseinát vápenatý a sodný, slunečnicový olej, sojový proteinový izolát, chlorid hořečnatý, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, sojový lecitin, přirozené a umělé příchutě, citrát sodný, chlorid draselný, cholinchlorid, kyselina askorbová, • · · <1 karagen, síran zinečnatý, síran mědňatý, síran železitý, alfatokoferylacetát, síran zinečnatý, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, molybdát draselný, selenát sodný, cyanokobalamin.

sodný, chlorid chrómu, jodid fylochinon, vitamin D3 a

Protein:

Zdrojem proteinu jsou dva vysoce biologicky hodnotné proteiny:

Kasinát vápenatý a sodný Sojový proteinový izolát

Tuk:

Zdrojem tuku je kukuřičný olej

Kukuřičný olej 100 %

Sacharidy:

Přípravek ENSURE PLUS obsahuje kombinaci maltodextrinu a sacharózy. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová, jahodová-kávová, máslo burských oříšků a vaječný koňak) plus VARI-FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková, jahodová, kávová příchuť a příchuť másla burských oříšků obsahují:

Sacharóza 23 %

Maltodextrin 38 %

Kukuřičný sirup 39 %

Čokoládová příchuť a příchuť vaječného koňaku obsahují:

Sacharóza 30 %

Kukuřičný sirup 36 % • · ·

Maltodextrin 34 %

Vitamíny a minerály

Jedno balení (0,2272 1) ENSURE LIGHT poskytuje alespoň 15 %

RDI pro 25 klíčových vitamínů a minerálů.

Kofein:

Čokoládová příchuť obsahuje 3,1 mg kofeinu na 0,2272 1 a kávová příchuť obsahuje stopové množství kofeinu.

F. ENSURE PLUS®HN

Použití: Přípravek ENSURE PLUS HN je nutričně kompletní výživa v kapalinové formě s vysokým obsahem kalorií a dusíku vhodná pro lidi, které vyžadují přísun velkého množství kalorií a proteinu a mají omezenou toleranci na objem potravy. Mohou se aplikovat orálně nebo se zavádějí hadičkou. Přípravek neobsahuje laktózu ani lepek.

Stav pacienta:

• Vhodné pro pacienty se zvýšenou potřebou kalorií a proteinů, kteří jsou například po chirurgickém zákroku nebo poranění.

• Vhodné pro pacienty s omezenou tolerancí na objem a s časným pocitem sytosti.

Rys y :

• Přípravek je vhodný jako nutriční doplněk i jako celková výživa.

• Přípravek je vhodný pro orální aplikaci i pro zavádění hadičkou.

• 1,5 CaVml • Vysoký obsah dusíku.

• Vysoká hustota kalorií.

• ·

Složky:

Typ Vanila: -©-D voda, maltodextrin (kukuřičný), kukuřičný olej, kaseinát vápenatý a sodný, cukr (sacharóza), sojový proteinový izolát, chlorid hořečnatý, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, sojový lecitin, přirozené a umělé příchutě, citrát sodný, cholinchlorid, kyselina askorbová, taurin, L-karnitin, alfa-tokoferylacetát, vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, thíaminchioridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, palmitat vitaminu A, kyselina folová, biotin, molybdát sodný, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

síran zinečnatý, síran niacinamid, karagen, železitý, pantotenát

G. ENSURE® POWDER

Použití: Přípravek ENSURE POWDER (rozpuštěný ve vodě) je výživa v kapalinové formě s nízkým obsahem zbytků určená pro aplikaci primárně jako orální nutriční doplněk, který se používá mezi jednotlivými jídly nebo s nimi. Uvedený přípravek neobsahuje laktózu ani lepek a je vhodný při upravených dietách zahrnujících diety s nízkým obsahem cholesterolu.

Stav pacienta:

• Přípravek je vhodný pro pacienty se zvláštní dietou.

• Přípravek je vhodný pro staré pacienty, kde existuje nebezpečí spojené s výživou.

• Přípravek je vhodný pro pacienty, kteří se zotavují z nemoci nebo z chirurgického zákroku.

• Přípravek je vhodný pro pacienty, kteří potřebují dietu s nízkým obsahem zbytků.

Rysy:

• Přípravek je příjemný, snadno se rozmíchá.

• Obsahuje malé množství nasyceného tuku.

• · • ·

• V jednom balení přípravek obsahuje 9g celkového tuku a méně než 5 mg cholesterolu.

• Přípravek obsahuje vysoký obsah vitamínů a minerálů.

• Přípravek je vhodný při dietě s nízkým obsahem cholesterolu.

• Přípravek neobsahuje laktózu a snadno se tráví.

Složení: -© -D kukuřičný sirup, maltodextrin (kukuřičný), kukuřičný olej, kaseinát vápenatý a sodný, cukr (sacharóza), sojový proteinový izolát, umělé příchutě, chlorid hořečnatý, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, chlorid draselný, sojový lecitin, citrát sodný, cholinchlorid, kyselina askorbová, síran zinečnatý, síran železitý, taurin, L-karnitin, alfa-tokoferylacetát, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, palmitat vitaminu A, kyselina folová, biotin, molybdát sodný, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdroj proteinu je směs dvou vysoce biologicky hodnotných proteinů: kaseinu a sóji.

Kaseinát sodný a vápenatý 84 %

Sojový proteinový izolát 16 %

Tuk:

Zdrojem tuku je kukuřičný olej.

Kukuřičný olej 100 %

Sacharidy:

Přípravek ENSURE POWDER obsahuje kombinaci kukuřičného sirupu, maltodextrinu a sacharózy. Střední sladkost plus VARIFLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

« ·

Vanilková příchuť obsahuje:

Sacharóza 30 %

Maltodextrin 35 %

Kukuřičný sirup 35 %

H. ENSURE® PUDDING

Použití: Přípravek ENSURE PUDDING je nutriční doplněk s vysokou hustotou nutrientů poskytující vyváženou výživu v nekapalné formě. Používá se mezi jednotlivými jídly a spolu s nimi. Je vhodný pro výživu s upravenou konzistencí (například jemná, rozmělněná nebo zcela kapalná strava) nebo pro lidi s poruchami polykání. Uvedený přípravek neobsahuje lepek.

Stav pacienta:

• Přípravek je vhodný pro pacienty s dietou s upravenou konzistencí (například jemná, rozmělněná nebo zcela kapalná dieta).

• Vhodné pro pacienty s poruchami polykání.

Rys y:

• Bohatá a jemná, dobrá chuť.

• Dobrý zdroj podstatných vitamínů a minerálů. Nesmí se skladovat v chladničkách.

• Neobsahuje lepek.

Nutriční profil pro objem 0,142 ml: 250 kalorií, 10,9 % proteinů, celkový obsah tuků je 34,9 %, 54,2 % sacharidů.

Složení: : -<S>-D netučné mléko, voda, cukr (sacharóza), částečně hydrogenovaný sojový olej, upravený potravinářský škrob, síran hořečnatý, stearoyllaktylát sodný, dibazický fosforečnan sodný, umělé příchutě, kyselina askorbová, síran zinečnatý, síran železitý, alfa-tokoferylacetát, cholinchlorid, niacinamid, síran manganatý, pantotenát vápenatý, citrát draselný, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, FD&C žlutá #6, kyselina folová, biotin, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdrojem proteinu je netučné mléko.

Netučné mléko 100 %

Tuk:

Zdrojem tuku je hydrogenovaný sojový olej. Hydrogenovaný sojový olej 100 %

Sacharidy:

Přípravek ENSURE PUDDING obsahuje kombinaci sacharózy a upraveného potravinářského škrobu. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová, skotské a ságová pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková a jiné nečokoládové příchuti obsahují: Sacharóza 56

Laktóza 27

Upravený potravinářský škrob 17

Čokoládová příchuť

Sacharóza

Laktóza

Upravený potravinářský škrob

I. ENSURE® WITH FIBER

Použití: Přípravek ENSURE® WITH FIBER je nutričně úplná výživa v kapalné formě, obsahující vlákninu určená pro lidi, pro něž • ·

Q1 ·*····«··» · » » · · · ·· ··«· ··· ···· «· je výhodná aplikace diety s vyšším obsahem vlákniny a nutrientů. Uvedený výrobek je vhodný pro lidi, které nevyžadují dietu s nízkým obsahem zbytků. Může se aplikovat orálně nebo se zavádí trubičkou. Výrobek se může použít jako nutriční doplněk normální stravy nebo ve vhodném množství jako její náhrada. Výrobek neobsahuje laktózu ani lepek a je vhodný pro použití při upravených dietách, které zahrnují také dietu s nízkým obsahem cholesterolu.

Stav pacienta:

• Pacient, pro něhož je výhodná dieta s vyšším obsahem vlákniny a nutrientů.

Rysy:

• Nový progresivní výrobek s nízkým obsahem nasycených tuků, s vyšším obsahem vitamínů a minerálů • V jednom balení obsahuje 6 g celkového tuku a méně než 5 mg cholesterolu.

• Má bohatou a jemnou chuť.

• Dobrý zdroj vlákniny.

• Výborný zdroj podstatných vitamínů a minerálů.

• Vhodný pro dietu s nízkým obsahem cholesterolu.

• Neobsahuje laktózu ani lepek.

Složení:

Typ Vanilla: - ©-D voda, maltodextrin (kukuřičný), cukr (sacharóza), kukuřičný olej, kaseinát vápenatý a sodný, ovesná vláknina, slunečnicový olej, olej kanola, sojový proteinový izolát, kukuřičný olej, sojové vláknina, tribazický fosforečnan vápenatý, chlorid hořečnatý, citrát draselný, citrát draselný, celulózový gel, dibazický fosforečnan draselný, citrát sodný, přirozené a umělé příchutě, cholinchlorid, fosforečnan hořečnatý, kyselina askorbová,

* β celulózová guma, chlorid draselný, karagen, síran železitý, alfa-tokoferylacetát, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, biotin, molybdát sodný, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdrojem proteinu je směs dvou vysoce biologicky hodnotných proteinů: kaseinů a sóji.

Kaseinát sodný a vápenatý Sojový proteinový izolát	80 % 20 %
Tuk:
Zdroj tuku je směs tří olejů: slunečnicový olej, olej kanoly a
kukuřičný olej.
Slunenčnicový olej	40 %
Olej kanoly	40 %
Kukuřičný olej	20 %
Množství tuku v přípravku ENSURE	WITH FIBER splňuje
požadavky American Heart Association	(AHA). 6 gramů tuku
uvedeného výrobku reprezentuje 22 %	celkového množství

kalorií, 2,01 % je tuk pocházející z nasycených mastných kyselin a 6,7 % pochází z poly-nenasycených mastných kyselin. Tyto hodnoty jsou v souladu s požadavky AHA, kdy méně než 30 % celkového množství kalorií pochází z tuku, méně než 10 % kalorií pochází z nasycených mastných kyselin a méně než 10 % celkového množství kalorií pochází z poly-nenasycených mastných kyselin.

Sacharidy:

Přípravek ENSURE WITH FIBER obsahuje kombinaci maltodextrinu a sacharózy. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová a pekanové máslo) plus VARI-FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková a jiné nečokoládové příchutě

Sacharóza 25 %

Maltodextrin 66 %

Ovesná vláknina 7 %

Sojová vláknina 2 %

Čokoládová příchuť

Sacharóza 36 %

Maltodextrin 55 %

Ovesná vláknina 7 %

Sojová vláknina 2 %

Vláknina:

Směs vlákniny obsažené v přípravku ENSURE WITH FIBER obsahuje ovesnou vlákninu a sojový polysacharid. Výsledkem této směsi je, že jedno balení o objemu 0,22721 obsahuje přibližně 4 gramy celkové vlákniny. Poměr nerozpustné a rozpustné vlákniny je 95:5.

PUFA podle vynálezu mohou nahradit a/nebo doplnit různé nutriční doplňky popsané shora v textu.

J. Nutriční produkt Oxepa™

Oxepa je enterální nutriční produkt s nízkým obsahem cukrů s vysokou kalorickou hustotou vhodný pro aplikaci pacientům které trpí ARDS a nebo jsou v ohrožení ARDS. Výrobek má jedinečnou kombinaci ingrediencí zahrnující patentovanou směs olejů obsahující ikosapentanovou kyselinu (EPA z rybího oleje), kyselinu γ-linolenovou (GLA pocházející z oleje brutnáku lékařského) a zvýšené množství antioxidantů.

Rozdělení kalorií:

• Kalorická hustota je vysoká 1,5 kal/ml (355 kal/8 fl.oz.), což minimalizuje objem nutný pro uspokojení nároků na energii.

• Rozdělení kalorií v produktu Oxepa je zobrazeno v tabulce č.

7.

Tabulka č. 7: rozdělení kalorií v produktu Oxepa

	na 8 fl. oz.	na litr	% kal.
Kalorie	355	1 500	-
Tuk (g)	22,2	93,7	55, 2
Sacharidy (g)	25	105, 5	28, 1
Protein (g)	14,8	62, 5	16,7
Voda (g)	186	785	—

Tuk:

• Produkt Oxepa obsahuje 22,2 g tuku na jedno balení o objemu 8 fl. oz. (93,7 g/1).

• Zdroj tuku je směs olejů, která obsahuje 31,8 % oleje kanoly, 25 % triglyceridů se středně dlouhým řetězcem (MCT), 20 % oleje brutnáku lékařského, 20 % rybího oleje a 3,2 % sojového lecitinu. Typický profil mastných kyselin produktu Oxepa je uveden v tabulce č. 8.

• Produkt Oxepa poskytuje vyvážené množství poly-nenasycených, /· mono-nenasycených a nasycených mastných kyselin, jak se uvádí v tabulce č. 10.

• Triglyceridy se středně dlouhým řetězcem (MTC), které tvoří % směsi, umožňují vyprázdnění gastrického traktu , protože se absorbují ve střevním traktu, aniž se emulzifikují kyselinou žlučovou.

PUFA podle vynálezu mohou nahrazovat nebo doplňovat různé komponenty mastných kyselin nutričního produktu Oxepa.

	• · · ·	• · · · · ·
95	• * · • · ♦ · • ♦ » • · · · « · ·	• « » · · • · ··· ··« • ♦ ·

Tabulka č. 8: Typický profil mastných kyselin

	% z celkového množství mastných kyselin	g/8 fl. oz.	g/l*
Kyselina kapronová (6:0)	0,2	0, 04	0, 18
Kyselina kaprylová (8:0)	14,69	3,1	13, 07
Kyselina kaprová (10:0)	11,06	2,33	9, 87
Kyselina palmitová (16:0)	5, 59	1,18	4,98
Kyselina palmitolejová (16:ln-7)	1, 82	0,38	1,62
Kyselina stearová (18:0)	1, 84	0, 39	1, 64
Kyselina olejová (18:ln-9)	24,44	5, 16	21, 75
Kyselina linolová	16, 28	3,44	14, 49
Kyselina a-linolová (18:3n-3)	3, 47	0, 73	3, 09
Kyselina γ-linolová (18:3n-6)	4,82	1,02	4,29
Kyselina ikosapentanová (20:5n-3)	5, 11	1, 08	4,55
n-3- dokosapentanová (22:5n-3)	0, 55	0,12	0, 49
Kyselina dokosahexanová (22:6n-3)	2,27	0, 48	2, 02
Jiné kyseliny	7, 55	1,52	6, 72

*mastné kyseliny odpovídají přibližně 95 % celkového tuku

Tabulka č. 9: Profil tuk produktu Oxepa

% celkových kalorií z tuku	55,2
Polynenasycené mastné kyseliny	31,44 g/l
Mononenasycené mastné kyseliny	25,53 g/l

• · · · · · · · · · · • ·· · · · · · · ·· ·

Nasycené mastné kyseliny	32,38 g/1
Poměr n-6 ku n-3	1,75 : 1
cholesterol	9,49 mg/8 fl.oz. 40,1 mg/1

Sacharidy:

• Obsah sacharidů je 25,0 g na 8 fl.oz. (105,5 g/1).

• Zdroje sacharidů jsou 45 % maltodextrinu (komplexní sacharid) a 55 % sacharózy (jednoduchý cukr). Oba sacharidy se jednoduše tráví a absorbují.

• Produkt Oxepa obsahuje vysoký obsah tuku a nízký obsah sacahridů, což minimalizuje tvorbu oxidu uhličitého (C0₂) . Vysoký obsah oxidu uhličitého může komplikovat odstavení pacientů, kteří jsou závislí na umělém dýchání. Nízký obsah sacharidů je také vhodný pro pacienty, u kterých může dojít k hyperglykémii vyvolané stresem.

• Produkt Oxepa neobsahuje laktózu.

Sacharidy, aminokyseliny proteinů a glycerolové části tuků se mohou v těle přeměnit na glukózu. Prostřednictvím tohoto procesu se uspokojují požadavky na cukry tkáně závislé na glukóze (jako je centrální nervový systém nebo buňky krve). Avšak potrava bez sacharidů může způsobit ketózu, což je nadměrný katabolizmus tkáňových proteinů a ztrátu tělních tekutin a elektrolytů. Těmto účinkům se dá předcházet, jestliže se požije denně 50 až 100 g strávítelných sacharidů, v případě, že je’ adekvátní kalorický příjem. Množství sacharidů v produktu Oxepa je také dostatečný pro minimalizaci glukoneogeneze, jestliže je uspokojena potřeba energie.

Protein:

• Oxepa obsahuje 14,8 g proteinu na jedno balení o objemu 8 f1. oz. (62,5 g/1).

• Poměr celkového množství kalorií/obsahu dusíku (150:1) uspokojuje potřeby stresovaných pacintů.

• Oxepa poskytuje dostatek proteinu, aby způsobila anabolizmus a udržení nízké tělesné hmotnosti, aniž dojde respiračním problémům. Vysoký příjem proteinů se předpokládá u pacientů s respirační nedostatečností. Ačkoli proteiny mají malý účinek na produkci CO2, dieta s vysokým obsahem proteinů napomáhá dýchání.

• Jako zdroj proteinů v produktu Oxepa se využívá 86,8 % kaseinátu sodného a 13,2 % kaseinátu vápenatého.

• « a »

Sekvenční protokol (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1483 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetě
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 1:

GCTTCCTCCA	GTTCATCCTC	CATTTCGCCA	CCTGCATTCT	TTACGACCGT	TAAGCAÁGAT	60
GGGAACGGAC	CAAGGAAAAA	CCTTCACCTG	GGAAGAGCTG	GCGGCCCATA	ACACCAAGGA	120
CGACCTACTC	TTGGCCATCC	GCGGCAGGGT	GTACGATGTC	ACAAAGTTCT	TGAGCCGCCA	180
TCCTGGTGGA	GTGGACACTC	TCCTGCTCGG	AGCTGGCCGA	GATGTTACTC	CGGTCTTTGA	240
GATGTATCAC	GCGTTTGGGG	CTGCAGATGC	CATTATGAAG	AAGTACTATG	TCGGTACACT	300
GGTCTCGAAT	GAGCTGCCCA	TCTTCCCGGA	GCCAACGGTG	TTCCACAAAA	CCATCAAGAC	360
GAGAGTCGAG	GGCTACTTTA	CGGATCGGAA	CATTGATCCC	AAGAATAGAC	CAGAGATCTG	420
GGGACGATAC	GCTCTTATCT	TTGGATCCTT	GATCGCTTCC	TACTACGCGC	AGCTCTTTGT	480
GCCTTTCGTT	GTCGAACGCA	CATGGCTTCA	GGTGGTGTTT	GCAATCATCA	TGGGATTTGC	540
GTGCGCACAA	GTCGGACTCA	ACCCTCTTCA	TGATGCGTCT	CACTTTTCAG	TGACCCACAA	600
CCCCACTGTC	TGGAAGATTC	TGGGAGCCAC	GCACGACTTT	TTCAACGGAG	CATCGTACCT	660
GGTGTGGATG	TACCAACATA	TGCTCGGCCA	TCACCCCTAC	ACCAACATTG	CTGGAGCAGA	720
TCCCGACGTG	TCGACGTCTG	AGCCCGATGT	TCGTCGTATC	AAGCCCAACC	aaaagtggtt	780
TGTCAACCAC	ATCAACCAGC	ACATGTTTGT	TCCTTTCCTG	TACGGACTGC	TGGCGTTCAA	840
GGTGCGCATT	CAGGACATCA	ACATTTTGTA	CTTTGTCAAG	ACCAATGACG	CTATTCGTGT	900
CAATCCCATC	TCGACATGGC	ACACTGTGAT	GTTCTGGGGC	GGCAAGGCTT	TCTTTGTCTG	960
GTATCGCCTG	ATTGTTCCCC	TGCAGTATCT	GCCCCTGGGC	AAGGTGCTGC	TCTTGTTCAC	1020
GGTCGCGGAC	ATGGTGTCGT	CTTACTGGCT	GGCGCTGACC	TTCCAGGCGA	ACCACGTTGT	1080
TGAGGAAGTT	CAGTGGCCGT	TGCCTGACGA	GAACGGGATC	ATCCAAAAGG	ACTGGGCAGC	1140
TATGCAGGTC	GAC-ACTACGC	AGGATTACGC	ACACGATTCG	CACCTCTGGA	CCAGCATCAC	1200

TGGCAGCTTG AACTACCAGG CTGTGCACCA TCTGTTCCCC AACGTGTCGC AGCACCATTA 1260

TCCCGATATT	CTGGCCATCA	TCAAGAACAC	CTGCAGCGAG	TACAAGGTTC	CATACCTTGT	1320
CAAGGATACG	TTTTGGCAAG	CATTTGCTTC	ACATTTGGAG	CACTTGCGTG	TTCTTGGACT	13 80
CCGTCCCAAG	GAAGAGTAGA	AGAAAAAAAG	CGCCGAATGA	AGTATTGCCC	CCTTTTTCTC	1440
CAAGAATGGC	AAAAGGAGAT	CAAGTGGACA	TTCTCTATGA	AGA		1483

(2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 466 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(O	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH MOLEKULY: peptid
(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 2:

Met Gly Thr Asp Gin Gly Lys Thr Phe Thr Trp Glu Glu Leu Ala Ala 1 5 ¹⁰ . ¹⁵

His Asn Thr Lys Asp Asp Leu Leu Leu Ala Ile Arg Gly Arg Val Tyr

100

- » w «a, _Λ ·· .... ... .... ..

25 30

Asp Val Thr Lys Phe Leu Ser Arg His Pro Gly Gly Val Asp Thr Leu 35 40 45

Leu Leu Gly Ala Gly Arg Asp Val Thr Pro Val Phe Glu Met Tyr His 50 55 60

Ala Phe Gly Ala Ala Asp Ala Ile Met Lys Lys Tyr Tyr Val Gly Thr

70 75 80

Leu Val Ser Asn Glu Leu Pro Ile Phe Pro Glu Pro Thr Val Phe His

90 95

Lys Thr Ile Lys Thr Arg Val Glu Gly Tyr Phe Thr Asp Arg Asn Ile

Asp Pro Lys 115

100 105 110 Asn Arg Pro Glu Ile Trp Gly Arg Tyr Ala Leu Ile Phe 120 125

Gly Ser Leu Ile Ala Ser Tyr Tyr Ala Gin Leu Phe Val Pro Phe Val

130	135 140
Val Glu Arg 145	1 Thr!Trp Leu Gin Val Val Phe Ala Ile Ile Met Gly Phe (ISO 155 160
Ala Cys Ala	Gin Val Gly Leu Asn Pro Leu His Asp Ala Ser His Phe 165 170 175
Ser Val Thr	His.,Asn Pro Thr Val Trp Lys Ile Leu Gly Ala Thr His ISO 135 190

Asp Phe Phe Asn I.Gly Ala Ser Tyr Leu Val Trp Met Tyr Gin His Met

195	200 205
Leu Gly His 210	His Pro Tyr Thr Asn Ile Ala Gly Ala Asp Pro Asp Val 215 220
Ser Thr Ser	Glu Pro Asp Val Arg Arg Ile Lys Pro Asn Gin Lys Trp
225	230 235 240
Phe Val Asn	His Ile Asn Gin His Met Phe val Pro Phe Leu Tyr Gly 245 250 255
Leu Leu Ala i	1 Phe Lys Val Arg Ile Gin Asp Ile Asn Ile Leu Tyr Phe 2S0 25S 270
Val Lys Thr 275	Asn Asp Ala Ile Arg Val Asn Pro Ile Ser Thr Trp His 230 285
Thr Val Met 290	Phe ;Trp Gly Gly Lys Ala Phe Phe Val Trp' Tyr Arg Leu 295 300
Ile Val Pro 305	Leu Gin Tyr Leu Pro Leu Gly Lys Val Leu Leu Leu Phe 310 315 320
Thr Val Ala	Asp Met Val Ser Ser Tyr Trp Leu Ala Leu Thr Phe Gin 325 330 335
Ala Asn His	Val -Val Glu Glu Val Gin Trp Pro Leu Pro Asp Glu Asn 340 345 350

101

Gly Ile Ile Gin Lys Asp Trp Ala Ala Met Gin Val Glu Thr Thr Gin 355 360 365

Asp Tyr Ala His Asp Ser His Leu Trp Thr Ser Ile Thr Gly Ser Leu 370 375 380

Asn Tyr Gin Ala Val His His Leu Phe Pro Asn Val Ser Gin His His

385 390 395 400

Tyr Pro Asp Ile Leu Ala Ile Ile Lys Asn Thr Cys Ser Glu Tyr Lys

405 410 415

Val Pro Tyr Leu Val Lys Asp Thr Phe Trp Gin Ala Phe Ala Ser His 420 425 430

Leu Glu His Leu Arg Val Leu Gly Leu Arg Pro Lys Glu Glu 435 440 445

102 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 186 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

	(xi) Popis sekvence:	SEQ	ID	NO	: 3:
Leu 1	His His Thr Tyr Thr Asn Ile 5 . 1	Ala	Gly 10	Ala	Asp Pro Asp Val Ser 15
Thr	Ser Glu Pro Asp Val Arg Arg 20	Ile 25	Lys	Pro	Asn Gin Lys Trp Phe 30
Val	Asn His Ile Asn Gin His Met: 35 40	Phe	Val	Pro	Phe Leu Tyr Gly Leu 45
Leu	Ala Phe Lys Val Arg Ile Gin 50 55	Asp	Ile	Asn	Ile Leu Tyr Phe Val 60
Lys 65	Thr Asn Asp Ala Ile Arg Val 70 ’	Asn	Pro	Ile 75	Ser Thr Trp His Thr Θ0
Val	Meh Phe Trp Gly Gly Lys Ala 85	Phe	Phe 90	Val	Trp Tyr Arg Leu Ile 95
Val	Pro Leu Gin Tyr Leu Pro Leu 100	Gly 105	Lys	Val	Leu Leu Leu Phe Thr 110
Val	Ala Asp Met: Val Ser Ser Tyr 115 120	Trp	Leu	Ala	Leu Thr Phe Gin Ala 125
Asn	Tyr Val Val Glu Glu Val Gin 130 135	Trp	Pro	Leu	Pro Asp Glu Asn Gly 140
Ile 14S	Ile Gin Lys Asp Trp Ala Ala 150	Met	Gin	Val 155	Glu Thr Thr Gin Asp 160
Tyr	Ala His Asp Ser His Leu Trp 165	Thr	Ser 170	Ile	Thr Gly Ser Leu Asn 17S

Tyr Gin Xaa Val His His Leu Phe Pro His 180 185

103

(2)	Informace o SEQ ID NO: 4:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B)	DÉLKA: 457 aminokyselin TYP: aminokyselina
		(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

(xi)

Pop

>is

sek

ven

ce:

SE

Q I

D N

0:

4:

Met

Ala

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Arg

Thr

Phe

Thr

Arg

Ala

Glu

Val

Leu

1

5

10

15

Asn

Ala

Glu

Ala

Leu

Asn

Glu

Gly

Lys

Lys

Asp

Ala

Glu

Ala

Pro

Phe

20

25

30

Leu

Met

Ile

Ile

Asp

Asn

Lys

Val

Tyr

Asp

Val

Arg

Glu

Phe

Val

Pro

35

40

45

Asp

His

Pro

Gly

Gly

Ser

Val

Ile

Leu

Thr

His

Val

Gly

Lys

Asp

Gly

50

55

60

Thr

Asp

Val

Phe

Asp

Thr

Phe

His

Pro

Glu

Ala

Ala

Trp

Glu

Thr

Leu

55

70

75

30

Ala

Asn

Phe

Tyr

Val

Gly

Asp

Ile

Asp

Glu

Ser

Asp

Arg

Asp

Ile

Lys

85

90

95

Asn

Asp

Asp

Phe

Ala

Ala

Glu

Val

Arg

Lys

Leu

Arg

Thr

Leu

Phe

Gin

100

105

110

Ser

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Asp

Ser

Ser

Lys

Ala

Tyr

Tyr

Ala

Phe

Lys

Val

115

120

125

Ser

Phe

Asn

Leu

Cys

Ile

Trp

Gly

Leu

Ser

Thr

Val

Ile

Val

Ala

Lys

130

135

140

Trp

Gly

Gin

Thr

Ser

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Leu

Ser

Ala

Ala

Leu

Leu

145

150

155

ISO

Gly

Leu

Phe

Trp

Gin

Gin

Cys

Gly

Trp

Leu

Ala

His

Asp

Phe

Leu

His

165

170

175

His

Gin

Val

Phe

Gin

Asp

Arg

Phe

Trp

Gly

Asp

Leu

Phe

Gly

Ala

Phe

180

185

190

Leu

Gly

Gly

Val

Cys

Gin

Gly

Phe

Ser

Ser

Ser

Trp

Trp

Lys

Asp

Lys

195

200

205

His

Asn

Thr

His

His

Ala

Ala

Pro

Asn

Val

His

Val

Glu

Asp

Pro

Asp

210

215

220

Ile

Asp

Thr

His

Pro

Leu

Leu

Thr

Trp

Ser

Glu

His

Ala

Leu

Glu

Met

225

230

235

240

Phe Ser Asp Val Pro Asp Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg Phe

104

245

250

255

Met

Val

Leu

Asn

Gin

Thr

Trp

Phe Tyr

Phe

Pro Ile

Leu

Ser

Phe

Ala

260

2SS

270

Arg

Leu

Ser

Trp

Cys

Leu

Gin

Ser Ile

Leu

Phe Val

Leu

Pro

Asn

Gly

275

280

285

Gin

Ala

His

Lys

Pro

Ser

Gly

Ala Arg

Val

Pro Ile

Ser

Leu

Val

Glu

290

295

300

Gin

Leu

Ser

Leu

Ala

Met

His

Trp Thr

Trp

Tyr Leu

Ala

Thr

Met

Phe

305

310

315

320

Leu

Phe

Ile

Lys

Asp

Pro

Val

Asn Met

Leu

Val Tyr

Phe

Leu

Val

Ser

325

330

335

Gin

Ala

Val

Cys

Gly

Asn

Leu

Leu Ala

Ile

Val Phe

Ser

Leu

Asn

His

340

345

350

Asn

Gly

Met

Pro

Val

Ile

Ser

Lys Glu

Glu

Ala Val

Asp

Met

Asp

Phe

355

360

365

Phe

Thr

Lys

Gin

Ile

Ile

Thr

Gly Arg

Asp

Val His

Pro

Gly

Leu

Phe

370

375

380

Ala

Asn

Trp

Phe

Thr

Gly

Gly

Leu Asn

Tyr

Gin Ile

Glu

His

His

Leu

385

390

395

400

Phe

Pro

Ser

Met

Pro

Arg

His

Asn Phe

Ser

Lys Ile

Gin

Pro

Ala

Val

405

410

415

Glu

Thr

Leu

Cys

Lys

Lys

Tyr

Asn Val

Arg

Tyr His

Thr

Thr

Gly

Met

420

425

430

Ile

Glu

Gly

Thr

Ala

C-lu

Val

Phe Ser

Arg

Leu Asn

Glu

Val

Ser

Lys

435

440

445

Ala

Ala

Ser

Lys

Met

Gly

Lys

Ala Gin

450 455 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 446 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

(Xi

) P

opi

S S'

ekv.

ence:

SEQ

ID

NO:

5:

Met

Ala

Ala

Gin

Ile

Lys

Lys

Tyr

Ile

Thr

Ser

Asp

Glu

Leu

Lys

Asn

1

5

10

15

His

Asp

Lys

Pro

Gly

Asp

Leu

Trp

Ile

Ser

Ile

Gin

Gly

Lys

Ala

Tyr

20

25

30

Asp

Val

Ser

Asp

Trp

Val

Lys

Asp

His

Pro

Gly

Gly

Ser

Phe

Pro

Leu

35

40

45

105 • · · · · • · · · · · ·····

Lys Ser

Leu Ala

Gly Gin Glu Val 55

Thr

Asp

Ala

Phe 60

Val

Ala

Phe

His

50

Pro

Ala

Ser

Thr

Trp

Lys

Asn

Leu

Asp

Lys

Phe

Phe

Thr

Gly

Tyr

Tyr

55

70

75

80

Leu

Lys

Asp

Tyr

Ser

Val

Ser

Glu

Val

Ser

Lys

Val

Tyr

Arg

Lys

Leu

85

90

95

Val

Phe

Glu

Phe

Ser

Lys

Met

Gly

Leu

Tyr

Asp

Lys

Lys

Gly

His

Ile

100

105

110

Met

Phe

Ala

Thr

Leu

Cys

Phe

Ile

Ala

Met

Leu

Phe

Ala

Met

Ser

Val

115

120

125

Tyr

Gly

Val

Leu

Phe

Cys

Glu

Gly

Val

Leu

Val

His

Leu

Phe

Ser

Gly

130

135

140

Cys

Leu

Met

Gly

Phe

Leu

Trp

Ile

Gin

Ser

Gly

Trp

Ile

Gly

His

Asp

145

150

155

160

Ala

Gly

His

Tyr

Met

Val

Val

Ser

Asp

Ser

Arg

Leu

Asn

Lys

Phe

Met

155

1 i

170

175

Gly

Ile

Phe

Ala

Ala

Asn

Cys

Leu

Ser

Gly

Ile

Ser

Ile

Gly

Trp

Trp

180

185

190

Lys

Trp

Asn

His

Asn

Ala

His

His

Ile

Ala

Cys

Asn

Ser

Leu

Glu

Tyr

195

200

20S

Asp

Pro

Asp

Leu

Gin

Tyr

Ile

•i Pro

Phe

Leu

Val

Val

Ser

Ser

Lys

Phe

210

215

220

Phe

Gly

Ser

Leu

Thr

Ser

His

Phe

Tyr

Glu

Lys

Arg

Leu

Thr

Phe

Asp

225

230

235

240

Ser

Leu

Ser

Arg

Phe

Phe

Val

Ser.

Tyr

Gin

His

Trp

Thr

Phe

Tyr

Pro

245

250

255

Ile

Met

Cys

Ala

Ala

Arg

Leu

Asn

Met

Tyr

Val

Gin

Ser

Leu

Ile

Met

250

2S5

270

Leu

Leu

Thr

Lys

Arg

Asn

Val

Ser

Tyr

Arg

Ala

Gin

Glu

Leu

Leu

Gly

275

280

285

Cys

Leu

Val

Phe

Ser

Ile

Trp

Tyr

Pro

Leu

Leu

Val

Ser

Cys

Leu

Pro

290

295

300

Asn

Trp

Gly

Glu

Arg

Ile

Met

Phe

Val

Ile

Ala

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

305

310

315

320

Gly

Met

Gin

Gin

Val

Gin

Phe

Ser

Leu

Asn

His

Phe

Ser

Ser

Ser

Val

325

330

335

Tyr

Val

Gly

Lys

Pro

Lys

Gly

Asn

Asn

Trp

Phe

Glu

Lys

Gin

Thr

Asp

340

•

345

350

Gly

Thr

Leu

Asp

Ile

Ser

Cys

Pro·.

Pro

Trp

Met

Asp

Trp

Phe

His

Gly

355

360

365

Gly Leu Gin Phe Gin Ile Glu Kís His Leu Phe Pro Lys Met Pro Arg 370 375 3S0

106

Cys Asn Leu Arg Lys 38S	Ile 390	Ser	Pro	Tyr Val	Ile Glu Leu Cys Lys Lys
395	400
His Asn Leu Pro Tyr	Asn	Tyr	Ala	Ser Phe .	Ser Lys	Ala Asn Glu Met
405				410		415
Thr Leu Arg Thr Leu	Arg	Asn	Thr	Ala Leu	Gin Ala	Arg Asp Ile Thr
420				425		430
Lys Pro Leu Pro Lys	Asn	Leu	Val	Trp Glu	Ala Leu	His Thr
435			440			445
(2) Informace o	SEQ	ID	NO	: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA:	359 aminokysel	in
(B)	TYP	: aminokyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
(D)	TOPOLOGIE	: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY:	: peptid
(xi) Popis sekvence:	SEQ ID NO: 6
Met Leu Thr Ala Glu	Arg	Ile	Lys	Phe Thr	Gin Lys	Arg Gly Phe Arg
1 5				10		15
Arg Val Leu Asn Gin	Arg	Val	Asp	Ala Tyr	Phe Ala	Glu His Gly Leu
20				25	t	30
Thr Gin Arg Asp Asn	Pro	Ser	Met	Tyr Leu	Lys Thr	Leu Ile Ile Val
35			40		1	45
Leu Trp Leu Phe Ser	Ala·	Trp	Ala	Phe Val	Leu Phe	Ala Pro Val Ile
50		5 5			60
Phe Pro Val Arg Leu	Leu	Gly	Cys	Met Val	Leu Ala	Ile Ala Leu Ala
65	70				,75	30
Ala Phe Ser Phe Asn	Val	Gly	His	Asp Ala	Asn His	Asn Ala Tyr Ser
85				90		95
Ser Asn Pro His Ile	Asn	Arg	Val	Leu Gly·Met Thr	Tyr Asp Phe Val
100				105		110
Gly Leu Ser Ser Phe	Leu	Trp	Arg	Tyr Arg	His Asn	Tyr Leu His His
115			120			125
Thr Tyr Thr Asn Ile	Leu	Gly	His	Asp Val	Glu Ile	His Gly Asp Gly
130		135			; ' 140
Ala Val Arg Met Ser	Pro	Glu	Gin	Glu His	Val Gly	Ile Tyr Arg Phe
145	150				155	160
Gin Gin Phe Tyr Ile	Trp	Gly	Leu	Tyr Leu	Phe Ile	Pro Phe Tyr Trp
165				170		175
Phe Leu Tyr Asp Val	Tyr	Leu	Val	Leu Asn	Lys Gly	Lys Tyr His Asp
130				135	>	190

His Lys Ile Pro Pro Phe Gin Pro Leu Glu· Leu Ala Ser Leu Leu Gly • · • «· · · · · · · ·· « • · · · ·····

195

200

205

Ile

Lys 210

Leu

Leu

Trp

Leu

Gly Tyr 215

Val

Phe

Gly Leu 220

Pro

Leu

Ala

Leu

Gly 225

Phe

Ser

Ile

Pro

Glu 230

Val

Leu

Ile

Gly

Ala Ser 235

Val

Thr

Tyr

Met 240

Thr

Tyr

Gly

Ile

Val 245

Val

Cys

Thr

Ile

Phe 250

Me t Leu

Ala

His

Val 255

Leu

Glu

Ser

Thr

Glu 260

Phe

Leu

Thr

Pro

Asp 265

Gly

Glu Ser

Gly

Ala 270

Ile

Asp

Asp

Glu

Trp 275

Ala

Ile

Cys

Gin

Ile 280

Arg

Thr

Thr Ala

Asn 28S

Phe

Ala

Thr

Asn

Asn 290

Pro

Phe

Trp

Asn

Trp 295

Phe

Cys

Gly

Gly Leu 300

Asn

His

Gin

Val

Thr 303

His

His

Leu

Phe

Pro 310

Asn

Ile

Cys

His

Ile His 315

Tyr

Pro

Gin

Leu 320

Glu

Asn

Ile

Ile

Lys 325

Asp

Val

Cys

C-ln

Glu 330

Phe Gly

Val

Glu

Tyr 335

Lys

Val

Tyr

Pro

Thr 340

Phe

Lys

Ala

Ala

Ile 345

Ala

Ser Asn

Tyr

Arg 350

Trp

Leu

Glu

Al a

Met

Gly

Lys

Ala

Ser

355 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 365 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

	(xi) Popis sekvence:	SEQ	ID	NO	: 7:
Met 1	Thr Ser Thr Thr Ser Lys Val 5	Thr	Phe 10	Gly	Lys Ser Ile Gly Phe 15
Arg	Lys Glu Leu Asn Arg Arg Val 20	Asn 25	Ala	Tyr	Leu Glu Ala Glu Asn 30
Ile	Ser Pro Arg Asp Asn Pro Pro 35 40	Met	Tyr	Leu	Lys Thr Ala Ile Ile 45
Leu	Ala Trp Val Val Ser Ala Trp 50 55	Thr	Phe	Val	Val Phe Gly Pro Asp 60
Val 65	Leu Trp Met Lys Leu Leu Gly 70	Cys	Ile	Val 75	Leu Gly Phe Gly Val 80
Ser	Ala Val Gly Phe Asn Ile Ser 85	His	Asp 90	Gly	Asn His Gly Gly Tyr 95

• ·

108 • · · ·· ·· ·· • · · · · · · · · · · • · · · ····· • · · · · · · ······ * * * * · · · ·· ···» ··· ···· ·· ··

Ser Lys

Tyr Gin 100

Trp

Val Asn Tyr Leu Ser Gly Leu Thr His Asp

Ala

105

110

Ile

Gly

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Trp

Lys

Phe

Arg

His

Asn

Val

Leu

His

115

120

125

His

Thr

Tyr

Thr

Asn

Ile

Leu

Gly

His

Asp

Val

Glu

Ile

His

Gly

Asp

130

135

140

Glu.

Leu

Val

Arg

Met

S^2T

Pro

Ser

Met

Glu

Tyr

Arg

Trp

Tyr

His

Arg

145

ISO

155

160

Tyr

Gin

His

Trp

Phe

Ile

Trp

Phe

Val

Tyr

Pro

Phe

Ile

Pro

Tyr

Tyr

165

170

175

Trp

Ser

Ile

Ala

Asp

Val

Gin

Thr

Met

Leu

Phe

Lys

Arg

Gin

Tyr

His

ISO

135

190

Asp

His

Glu

Ile

Pro

Ser

Pro

Thr

Trp

Val

Asp

Ile

Ala

Thr

Leu

Leu

195

200

205

Ala

Phe

Lys

Ala

Phe

Gly

Val

Ala

Val

Phe

Leu

Ile

Ile

Pro

Ile

Ala

210

215

220

Val

Gly

Tyr

Ser

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

Ala

Ser

Ile

Val

Tyr

225

230

235

240

Met

Thr

His

Gly

Leu

Val

Ala

Cys

Val

Val

Phe

Met

Leu

Ala

His

Val

245

250

255

Ile

Glu

Pro

Ala

Glu

Phe

Leu

Asp

Pro

Asp

Asn

Leu

His

Ile

Asp

Asp

260

265

270

Glu

Trp

Ala

Ile

Ala

Gin

Val

Lys

Thr

Thr

Val

Asp

Phe

Ala

Pro

Asn

275

2S0

285

Asn.

Thr

Ile

Ile

Asn

Trp

Tyr

Val

Gly

Gly

Leu

Asn

Tyr

Gin

Thr

Val

230

295

300

His

His

Leu

Phe

Pro

His

Ile

Cys

His

Ile

His

Tyr

Pro

Lys

Ile

Ala

305

310

315

320

Pro

Ile

Leu

Ala

Glu

Val

Cys

Glu

Glu

Phe

Gly

Val

Asn

Tyr

Ala

Val

325

330

335

His

Gin

Thr

Phe

Phe

Gly

Ala

Leu

Ala

Ala

Asn

Tyr

Ser

Trp

Leu

Lys

340

345

350

Lys

Met

Ser

Ile

Asn

Pro

Glu

Thr

Lys

Ala

Ile

Glu

Gin

355

360

365

109 (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „syntetický oligonukleotid (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 21 (C) Jiné informace: /počet = 1 /poznámka^ „N=inozin nebo cytozin (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 27 (C) Jiné informace: /počet = 2 /poznámka= „N=inozin nebo cytozin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

CUACUACUA UACAYCAYAC NTAYACNAAY AT 32 (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „syntetický oligonukleotid (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature

110 (B) Pozice: 13 (D) Jiné informace: /počet = 1 /poznámka= „N=inozín nebo cytozin (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 19 (D) Jiné informace: /počet = 2 /poznámka= „N=inozin nebo cytozin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:

CAUCAUCAUC AUNGGRAANA RRTGRTG 2 7

(2)	Informace o SEQ ID NO: 10:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 35 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
	(ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
	(xi) Popis	sekvence: SEQ ID NO: 10:
CCAAGCTTCT GCAGGAGCTC ψψτΤΤΤΤΤΤΤ TTTTT
(2)	Informace o	SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 5 aminokyselin
(B)	TYP: aminokyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevatní
(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

111

His Xaa Xaa His His

5 (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevatní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

Gin Xaa Xaa His His

5 (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 746 nukleových kyselin (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

CGTATGTCAC TCCATTCCAA ACTCGTTCAT GGTATCATAA ATATCAACAC ATTTACGCTC SO CACTCCTCTA TGGTATTTAC ACACTCAAAT ATCGTACTCA AGATTGGGAA GCTTTTGTAA 120 AGGATGGTAA AAATGGTGCA ATTCGTGTTA GTGTCGCCAC AAATTTCGAT AAGGCCGCTT 180 ACGTCATTGG TAAATTGTCT TTTGTTTTCT TCCGTTTCAT CCTTCCACTC CGTTATCATA 240 GCTTTACAGA TTTAATTTGT TATTTCCTCA TTGCTGAATT CGTCTTTGGT TC-GTATCTCA 3 00 CAATTAATTT CCAAGTTAGT CATGTCGCTG AAGATCTCAA ATTCTTTGCT ACCCCTGAAA 3 60 GACCAGATGA ACCATCTCAA ATCAATGAAG ATTGGGCAAT CCTTCAACTT AAAACTACTC 4 20 AAGATTATGG TCATGGTTCA CTCCTTTGTA CCTTTTTTAG TGGTTCTTTA AATCATCAAG 480 TTGTTCATCA TTTATTCCCA TCAATTGCTC AAGATTTCTA CCCACAACTT GTACCAATTG 540 TAAAAGAAGT TTGTAAAGAA CATAACATTA CTTACCACAT TAAACCAAAC TTCACTGAAG 600 CTATTATGTC ACACATTAAT TACCTTTACA AAATGGGTAA TGATCCAGAT TATGTTAAAA 660 AACCATTAGC CTCAAAAGAT GATTAAATGA AATAACTTAA AAACCAATTA TTTAČTTTTG 720 ACAAACAGTA ATATTAATAA ATACAA 74 6

112

(2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 227 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevatní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH MOLEKULY: peptid
(Xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 14:

Tyr

Val Thr

Pro

Phe

Gin

Thr

Arg

Ser

Trp

Tyr

His

Lys

Tyr

Gin

1

5

10

15

His

Ile. Tyr

Ala

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly

Ile

Tyr

Thr

Leu

Lys

Tyr

20

25

30

Arg

Thr Gin

Asp

Trp

Glu

Ala

Phe

Val

Lys

Asp

Gly

Lys

Asn

Gly

35

40

45

Ala

Ile Arg

Val

Ser

Val

Ala

Thr

Asn

Phe

Asp

Lys

Ala

Ala

Tyr

50

55

60

Val

Ile Gly

Lys

Leu

Ser

Phe

Val

Phe

Phe

Arg

Phe

Ile

Leu

Pro

6 5

70

75

Leu

Arg Tyr

His

Ser

Phe

Thr

Asp

Leu

Ile

Cys

Tyr

Phe

Leu

Ile

80

85

90

Ala

Glu Phe

Val

Phe

Gly

Trp

Tyr

Leu

Thr

Ile

Asn

Phe

Gin

Val

95

100

105

Ser

His Val

Ala

Glu

Asp

Leu

Lys

Phe

Phe

Ala

Thr

Pro

Glu

Arg

110

115

120

Pro

Asp Glu

Pro

Ser

Gin

Ile

Asn

Glu

Asp

Trp

Ala

Ile

Leu

Gin

125

130

135

Leu

Lys Thr

Thr

Gin

Asp

Tyr

Gly

His

Gly

Ser

Leu

Leu

Cys

Thr

1

140

145

ISO

Phe

Phe‘Ser

Gly

Ser

Leu

Asn

His

Gin

Val

Val

His

His

Leu

Phe

i

155

ISO

165

Pro

Ser ' Ile

Ala

Gin

Asp

Phe

Tyr

Pro

Gin

Leu

Val

Pro

Ile

Val

170

175

180

Lys

Glu Val

Cys

Lys

Glu

His

Asn

Ile

Thr

Tyr

His

Ile

Lys

Pro

185

190

195

Asn

PheiThr

Glu

Ala

Ile

Met

Ser

His

Ile

Asn

Tyr

Leu

Tyr

Lys

200

205

210

Mec

Gly·Asn

Asp

Pro

Asp

Tyr

Val

Lys

Lys

Pro

Leu

Ala

Ser

Lys

•'i.

215

220

225

Asp Asp' Xaa (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 494 nukleových kyselin
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevatní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH MOLEKULY: nukleová kyselina
(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 15:

• ·

113

TTTTGGAAGG NTCCAAGTTN ACCACGGANT NGGCAAGTTN ACGGGGCGGA AANCGGTTTT 60 CCCCCCAAGC CTTTTGTCGA CTGGTTCTGT GGTGGCTTCC AGTACCAAGT CGACCACCAC 120 TTATTCCCCA GCCTGCCCCG ACACAATCTG GCCAAGACAC ACGCACTGGT CGAATCGTTC 180 TGCAAGGAGT GGGGTGTCCA GTACCACGAA GCCGACCTCG TGGACGGGAC CATGGAAGTC 240 TTGCACCATT TGGGCAGCGT GGCCGGCGAA TTCGTCGTGG ATTTTGTACG CGACGGACCC 300 GCCATGTAAT CGTCGTTCGT GACGATGCAA GGGTTCACGC ACATCTACAC ACACTCACTC 360 ACACAACTAG TGTAACTCGT ATAGAATTCG GTGTCGACCT GGACCTTGTT TGACTGGTTG 420 GGGATAGQGT AGGTAGGCGG ACGCGTGGGT CGNCCCCGGG AATTCTGTGA CCGGTACCTG 480 GCCCGCGTNA AAGT 494 (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 87 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevatní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

Phe Trp Lys Xaa Pro Ser Xaa Pro Arg Xaa Xaa Gin Val Xaa Gly ! 5 10 ¹⁵

Ala Glu Xaa Gly Phe Pro Pra Lys Pro Phe Val Asp Trp Phe Cys

25 30

Gly Gly Phe Gin Tvr Gin Val Asp His His Leu Phe Pro Ser Leu

40 45

Pro Arg His Asn Leu Ala Lys Thr His Ala Leu Val Glu Ser Phe ^{55 60}

CVS Lys Glu Trp Gly Val Glr. Tyr His Glu Ala Asp Leu Val Asp

20 75

Gly Thr Met Glu Val Leu His His Leu Gly Ser Val Ala Gly Glu

20 75

Phe Val Val Asp Phe Val Arg Asp Gly Pro Ala Met ³⁵ (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 520 nukleových kyselin
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevatní
(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii) DRUH MOLEKULY: nukleová kyselina
xi) Popis	sekvence: SEQ ID NO: 17:

GGATGGAGTT CGTCTGGATC GCTGTGCGCT ACGCGACGTG GTTTAAGCGT CATGGGTGCG S0 CTTGGGTACA CGCCGGGGCA GTCGTTGGGC ATGTACTTGT GCGCCTTTGG TCTCGGCTGC 120 ATTTACATTT TTCTGCAGTT CGCCGTAAGT CACACCCATT TGCCCGTGAG CAACCCGGAG 130 GATCAGCTGC ATTGGCTCGA GTACGCGCGG ACCACACTGT GAACATCAGC ACCAAGTCGT 24 0 GGTTTGTCAC ATGGTGGATG TCGAACCTCA ACTTTCAGAT CGAGCACCAC CTTTTCCCCA 300 CGGCGCCCCA GTTCCGTŤTC AAGGAGATCA GCCCGCGCGT CGAGGCCCTC TTCAAGCGCC 360 ACGGTCTCCC TTACTACGAC ATGCCCTACA CGAGCGCCGT CTCCACCACC TTTGCCAACC 420 TCTACTCCGT CGGCCATTCC GTCGGCGACG CCAAGCGCGA CTAGCCTCTT TTCCTAGACC 480 TTAATTCCCC ACCCCACCCC ATGTTCTGTC TTCCTCCCGC 520

114 • ·

(2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 153 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevatní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

Met

Glu

Phe

Val

Trp

Ile

Ala

Val

Arg

Tyr

Ala

Thr

Trp

Phe

Lys

1

5.

10

15

Arg

His

Gly

Cys

Ala

Trp

Val

His

Ala

Gly

Ala

Val

Val

Gly

His

20

25

30

Val

Leu

Val

Arg

Leu

Trp

Ser

Arg

Leu

His

Leu

His

Phe

Ser

Ala

3.5

40

45

Val

Arg

Arg

Lys

Ser

His

Pro

Phe

Ala

Arg

Glu

Gin

Pro

Gly

Gly

50

55

60

Ser

Ala

Ala

Leu

Ala

Arg

Val

Arg

Ala

Asp

His

Thr

Val

Asn

Ile

55

70

75

Ser

Thr

Lys

Ser

Trp

Phe

Val

Thr

Trp

Trp

Met

Ser

Asn

Leu

Asn

80

85

90

Phe

Gin

Ile

Glu

His

His

Leu

Phe

Pro

Thr

Ala

Pro

Gin

Phe

Arg

95

100

105

Phe

Lys

Glu

Ile

Ser

Pro

Arg

Val

Glu

Ala

Leu

Phe

Lys

Arg

His

110

115

120

Gly

Leu

Pro

Tyr

Tyr

Asp

Met

Pro

Tyr

Thr

Ser

Ala

Val

Ser

Thr

125

130

135

Thr

Phe

Ala

Asn

Leu

Tyr

Ser

Val

Gly

His

Ser

Val

Gly

Asp

Ala

140

145

150

Lys

Arg

Asp

(2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 429 nukleových kyselin
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevatní
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH MOLEKULY: nukleová kyselina
(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 19:

• «

115

ACGCGTCCGC

GCTCCCGCAC

GCTGATGGGT

TCAGGGTCGC

TTGGCTTGAC

TTACTGGAAA

AGATCTCAAC

CCACGCGTCC

ATGACGTACC

CAGTCTTCAC

TGCGGCTGGG

GACCGGTTGT

AACCAGCACA

ACCTTGCCAT

GCCGCGAGCA

GCGTGGTCGA

CCCTCGCGCT

TAATGCATGA

GCGAGTTCTT

GCAAACACCA

TGGTGGCCTT

ACTCATCAAG

GATTGTTGTT

CGCTCTCGGC

GATGGGCCAT

TTACGGCGTT

CGCAGCGCCA

CAACGAGCGC

GAAGGCTACT

CTCTTCGTGC

ATTGTCGTCA

GGGTCGTTCA

GGTTGTGGCA

AACCGGCTCG

GTCGTGC3CA

TTGACCCCTC

TTTCCTTTTG

GCGGCATCTC

CTGGTGTCíjT

TGAGCGGTGA

AGCACGATGT

AGGTCCGACC so

120

180

240

300

360

420 (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 125 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevatní (D) TOPOLOGIE: lineární

		(i	i)	DRUH MOLEKULY:	peptid
		(xi)	Popis sekvence:	SEQ ID NO: 20:
Arg	Val	Arg	Pro	Arg Val Arg Arg Glu	Gin Leu	Ile	Lys	Glu	Gly
1				S	10				15
Tyr	Phe	Asp	Pro	Ser Leu Pro His Met	Thr Tyr	Arg	Val	Val	Glu
				20	25				30
Ile	Val	Val	Leu	Phe Val Leu Ser Phe	Trp Leu	Met	C-ly	Gin	Ser
				3S	40				45
Sar	Pro	Leu	Ala	Leu Ala Leu Gly Ile	Val Val	Ser	Gly	Ile	Ser
				50.	55				60
Gin	Gly	Arg	Cys	Gly Trp Val Met His	Glu Met	Gly	His	Gly	Ser
				65	70				75
Phe	Thr	Gly	Val	Ile Trp Leu Asp Asp	Arg Leu	Cys	Glu	Phe	Phe
				65	70				75
Tyr	Gly	Val	Gly	Cys Gly Met Ser Gly	His Tyr	Trp	Lys	Asn	Gin
				80	85				90

His

Ser

Lys

His

His

Ala

Ala

Pro

Asn Arg

Leu

Glu

His

Asp

Val

95

100

105

Asp

Leu

Asn

Thr

Leu

Pro

Leu

Val

Ala Phe

Asn

Glu

Arg

Val

Val

110

115

120

Arg

Lys

Val

Arg

Pro

125

(2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1219 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (editovaný kontig 2692004)

116 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

GCACGCCGAC	CGGCGCCGGG	AGATCCTGGC	AAAGTATCCA	GAGATAAAGT	CCTTGATGAA	60
ACCTGATCCC	AATTTGATAT	GGATTATAAT	TATGATGGTT	CTCACCCAGT	TGGGTGCATT	120
TTACATAGTA	AAAGACTTGG	ACTGGAAATG	GGTCATATTT	GGGGCCTATG	CGTTTGGCAG	180
TTGCATTAAC	CACTCAATGA	CTCTGGCTAT	TCATGAGATT	GCCCACAATG	CTGCCTTTGG	240
CAACTGCAAA	GCAATGTGGA	ATCGCTGGTT	TGGAATGTTT	GCTAATCTTC	CTATTGGGAT	300
TCCATATTCA	ATTTCCTTTA	AGAGGTATCA	CATGGATCAT	CATCGGTACC	TTGGAGCTGA	360
TGGCGTCGAT	GTAGATATTC	CTACCGATTT	TGAGGGCTGG	TTCTTCTGTA	CCGCTTTCAG	420
AAAGTTTATA	TGGGTTATTC	TTCAGCCTCT	CTTTTATGCC	TTTCGACCTC	TGTTCATCAA	480
CCCCAAACCA	ATTACGTATC	TGGAAGTTAT	CAATACCGTG	GCACAGGTCA	CTTTTGACAT	540
tttaatttat	TACTTTTTGG	GAATTAAATC	CTTAGTCTAC	ATGTTGGCAG	CATCTTTACT	600
TGGCCTGGGT	TTGCACCCAA	TTTCTGGACA	TTTTATAGCT	GAGCATTACA	TGTTCTTAAA	660
GGGTCATGAA	ACTTACTCAT	ATTATGGGCC	TCTGAATTTA	CTTACCTTCA	ATGTGGGTTA	720
TCATAATGAA	CATCATGATT	TCCCCAACAT	TCCTGGAAAA	AGTCTTCCAC	TGGTGAGGAA	780
AATAGCAGCT	GAATACTATG	ACAACCTCCC	TCACTACAAT	TCCTGGATAA	AAGTACTGTA	340
TGATTTTGTG	ATGGATGATA	CAATAAGTCC	CTACTCAAGA	ATGAAGAGGC	ACCAAAAAGG	900
AGAGATGGTG	CTGGAGTAAA	TATCATTAGT	GCCAAAGGGA	TTCTTCTCCA	AAACTTTAGA	960
TGATAAAATG	GAATTTTTGC	ATTATTAAAC	TTGAGACCAG	TGATGCTCAG	AAGCTCCCCT	1020
GGCACAATTT	CAGAGTAAGA	GCTCGGTGAT	ACCAAGAAGT	GAATCTGGCT	TTTAAACAGT	1080
CAGCCTGACT	CTGTACTGCT	CAGTTTCACT	CACAGGAAAC	TTGTGACTTG	TC-TATTATCG	1140
TCATTGAGGA	TGTTTCACTC	ATGTCTGTCA	TTTTATAAGC	ATATCATTTA	AAAAGCTTCT	1200

AAAAAGCTAT TTCGCCAGG

1219

117 (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 655 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina kontig 2153526) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

; editovaný

T7ACCTTCTA	CGTCCGCTTC	TTCCTCACTT	ATGTGCCACT	ATTGGGGCTG	AAAGCTTCCT	60
GGGCCTTTTC	TTCATAGTCA	GGTTCCTGGA	AAGCAACTGG	TTTGTGTGGG	TGACACAGAT	120
GAACCATATT	CCCATGCACA	TTGATCA7GA	CCGGAACATG	GACTGGGTTT	CCACCCAGCT	130
CCAGGCCACA	TGCAATGTCC	ACAAGTCTGC	CTTCAATGAC	TGGTTCAGTG	GACACCTCAA	240
CTTCCAGATT	GAGCACCATC	TTTTTCCCAC	GATGCCTCC-A	CACAATTACC	ACAAAGTGGC	300
TCCCCTGGTG	CAGTCCTTGT i	GTGCCAAGCA	TGGCATAGAG	TACCAC-TCCA	AGCCCCTGCT	360
GTCAC-CCTTC	gccgacatcaJ f	TCCACTCACT	AAAGGAGTCA	GC-GCAGCTCT	GGCTAGATGC	420
CTATCTTCAC	CAATAACAAC	AGCCACCCTG	CGCAGTCTGG	AAGAAGAGGA	GGAAGACTCT	430
GGAGCCAAGG	CAGAGGGGAG	CTTGAGGGAC	AATGCCACTA	TAGTTTAATA	CTCAGAGGGG	540
GTTGGGTTTG	GGGACATAAAi GCCTCTGACT	CAAACTCCTC	C C 'T^^Z^AT G*T	TCTAGCCACA	600
GTTCTAAGAC	1 C CAAAGTGGG ·'	GGGTGGACAC	AGAAGTCCCT	AGGAGGGAAG	GAGCT	655

118

• · · • * (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 304 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (ii) DRUH kontig 3506132) (xi) Popis sekvence: SEQ ID

GTCTTTTACT TTGGCAATGG CTGGATTCCT ACCCTCATCA

TCTCAGGCCC AAGCTGGATG GCTGCAACAT GATTATGGCC

CCCAAGTGGA ACCACCTTGT CCACAAATTC GTCATTGGCC

AACTGGTGGA ATCATCGCCA CTTCCAGCAC CACGCCAAGC

CCCGATGTGA ACATGCTGCA CGTGTTTGTT CTGGGCGAAT

AAGA

NO: 23:

(editovaný

CGGCCTTTGT	CCTTGCTACC	so
ACCTGTCTGT	CTACAGAAAA	- 120
AČTTAAAGGG	TGCCTCTGCC	íao
CTAACATCTT	CCACAAGGAT	240
GGCAGCCCAT	CGAGTACGGC	300

04 (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 918 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (editovaný kontig 3854933) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

CAGGGACCTA	CCCCGCGCTA	CTTCACCTGG	GACGAGGTGG	CCCAGCGCTC	AGGGTGCGAG	60
GAGCGGTGGC	TAGTGATCGA	CCGTAAGGTG	TACAACATCA	GCGAGTTCAC	CCGCCGGCAT	120
CCAGGGGGCT	CCCGGGTCAT	CAGCCACTAC	GCCGGGCAGG	ATGCCACGGA	TCCCTTTGTG	ISO
GCCTTCCACA	TCAACAAGGG	CCTTGTGAAG	AAGTATATGA	ACTCTCTCCT	GATTGGAGAA	240
CTGTCTCCAG	AGCAGCCCAG	CTTTGAGCCC	ACCAAGAATA	AAGAGCTGAC	AGATGAGTTC	300
CGGGAGCTGC	GGGCCACAGT	GGAGCGGATG	GGGCTCATGA	AGGCCAACCA	TGTCTTCTTC	360
CTGCTGTACC	TGCTGCACAT	CTTGCTGCTG	GATGGTGCAG	CCTGGCTCAC	CCTTTGGGTC	420
TTTGGGACGT	CCTTTTTGCC	CTTCCTCCTC (	TGTGCGGTGC	TGCTCAGTGC	AGTTCAGGCC	430
CAGGCTGGCT	GGCTGCAGCA	tgactttggg! 1	CACCTGTCGG	TCTTCAGCAC	CTCAAAGTGG	540

119	GGGCCCCCGC	• · · • · · • · · • · · · · · CAGTTGGTGG	• • · • 600
AACCATCTGC	TACATCATTT TGTGATTGGC CACCTGAAGG
AACCACATGC	ACTTCCAGCA CCATGCCAAG CCCAACTGCT	TCCGCAAAGA	CCCAGACATC	660
AACATGCATC	CCTTCTTCTT TGCCTTGGGG» AAGATCCTCT	CTGTGGAGCT	TGGGAAACAG	720
AAGAAAAAAT	ATATGCCGTA CAACCACCAGÍ CACARATACT . i	TCTTCCTAAT	TGGGCCCCCA	730
GCCTTGCTGC	CTCTCTACTT CCAGTGCTAT1 ATTTTCTATT	TTGTTATCCA	GCGAAAGAAG	840
TGGGTGGACT	TGGCCTGGAT CAGCAAACAG GAATACGATG	AAGC GGGG CG*	TCCATTGTCC	900
ACCGCAAATG	CTTCTAAA			918

(2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1686 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE; jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (editovaný kontig 2511785) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

GCCACTTAAA	GGGTGCCTCT	GCCAACTGGT	GGAATCATCG	CCACTTCCAG	CACCACGCCA	60
AGCCTAACAT	CTTCCACAAG	GATCCCGATG	,TGAACATGCT	GCACGTGTTT	GTTCTGGGCG	120
AATGGCAGCC	CATCGAGTAC	GGCAAGAAGA	AGCTGAAATA	CCTGCCCTAC	AATCACCAGC	180
ACGAATACTT	CTTCCTGATT	GGGCCGCCGC	TGCTCATCCC	CATGTATTTC	CAGTACCAGA	240
TCATCATGAC	CATGATCGTC	CATAAGAACT	GGGTGGACCT	GGCCTGGGCC	GTCAGCTACT	300

120 ·· ·

ACATCCGGTT	CTTCATCACC	TACATCCCTT	TCTACGGCAT	CCTGGGAGCC	ctccttttcc	350
TCAACTTCAT	CAGGTTCCTG	GAGAGCCACT	GGTTTGTGTG	GGTGACACAG	ATGAATCACA	420
TCGTCATGGA	GATTGACCAG	GAGGCCTACC	GTGACTGGTT	CAGTAGCCAG	CTGACAGCCA	430
CCTGCAACGT	GGAGCAGTCC	TTCTTCAACG	ACTGGTTCAG	TGGACACCTT	AACTTCCAGA	540
TTGAGCACCA	CCTCTTCCCC	ACCATGCCCC	GC-CACAACTT	ACACAAGATC	GCCCCGCTGG	600
TGAAGTCTCT	ATGTGCCAAG	CATGGCATTG	AATACCAGGA	GAAGCCGCTA	CTGAGGGCCC	650
TGCTGGACAT	CATCAGGTCC	CTGAAGAAGT	CTGGGAAGCT	GTGGCTGGAC	GCCTACCTTC	720
ACAAATGAAG	CCACAGCCCC	CGGGACACCG	TGGGGAAGGG	GTGCAGGTGG	GGTGATGGCC	730
AGAGGAATGA	TGGGCTTTTG	TTCTGAGGGG	TGTCCGAGAG	GCTGGTGTAT	GCACTGCTCA	840
CGGACCCCAT	GTTGGATCTT	TCTCCCTTTC	TCCTCTCCTT	TTTCTCTTCA	CATCTCCCCC	900
ATAGCACCCT	GCCCTCATGG	GACCTGCCCT	CCGTCAGCCG	TCAGCCATCA	GCCATGGCCC	960
TCCCAGTGCC	TCCTAGCCCC	TTCTTCCAAG	GAGCAGAGAG	GTGGCCACCG	GGGGTGGCTC	1020
TGTCCTACCT	CCACTCTCTG	CCCCTAAAGA	TGGGAGGAGA	CCAGCGGTCC	ATGGGTCTGG	1080
CCTGTGAGTC	TCCCCTTGCA	GCCTGGTCAC	TAGGCATCAC	CCCCGCTTTG	GTTCTTCAGA	1140
TGCTCTTGGG	GTTCATAGGG	GCAGGTCCTA	GTCGGGCAGG	GCCCCTGACC	CTCCCGGCCT	1200
GGCTTCACTC	TCCCTGACGG	CTGCCATTGG	TCCACCCTTT	CATAGAGAGG	CCTGCTTTGT	1260
TACAAAGCTC	GGGTCTCGCT	CCTGCAGCTC	GGTTAAGTAC	CCGAGGCCTC	TCTTAAGATG	1320
TCCAGGGCCC	CAGGCCCGCG	GGCACAGCCA	GCCCAAACCT	TGGGCCCTGG	AAGAGTCCTC	1330
CACCCCATCA	CTAGAGTGCT	CTGACCCTGG	GCTTTCACGG	GCCCCATTCC	ACCGCCTCCC	1440
CAACTTGAGC	CTGTGACCTT	GGGACCAAAG	GGGGAGTCCC	TCGTCTCTTG	TGACTCAGCA	1500
GAGGCAGTGG	CCACGTTCAG	GGAGGGG C CG		AGGCTCAGCC	CACCCTCCAG	1560
CTTTTCCTCA	GGGTGTCCTG	AGGTCCAAGA	TTCTGGAGCA	ATCTGACCCT	TCTCCAAAGG	1620
CTCTGTTATC	AGCTGGGCAG	TGCCAGCCAA	TCCCTGGCCA	TTTGGCCCCA	GGGGACGTGG	1630
GCCCTG						1686

(2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1843 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (n) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (editovaný kontig 2535)

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

GTCTTTTACT	TTGGCAATGG	CTGGATTCCT	ACCCTCATCA	CGGCCTTTGT	CCTTGCTACC	60
TCTCAGGCCC	AAGCTGGATG	GCTGCAACAT	GATTATGGCC	ACCTGTCTGT	CTACAGAAAA	120
CCCAAGTGGA	ACCACCTTGT	CCACAAATTC	GTCATTGGCC	ACTTAAAGGG	TGCCTCTGCC	180
AACTGGTGGA	ATCATCGCCA	CTTCCAGCAC	CACGCCAAGC	CTAACATCTT	CCACAAGGAT	240
CCCGATGTGA	ACATGCTGCA	CGTGTTTGTT	CTGGGCGAAT	GGCAGCCCAT	CGAGTACGGC	300
AAGAAGAAGC	TGAAATACCT	GCCCTACAAT	CACCAGCACG	AATACTTCTT	CCTGATTGGG	360
CCC-CCGCTGC	TCATCCCCAT	GTATTTCCAG	TACCAGATCA	TCATGACCAT	GATCGTCCAT	420
AAGAACTGGG	TGGACCTGGC	CTGGGCCGTC	AGCTACTACA	TCCGGTTCTT	CATCACCTAC	430
ATCCCTTTCT	ACGGCATCCT	GGGAGCCCTC	cttttcctca	ACTTCATCAG	GTTCCTGGAG	540
AGCCACTGGT	TTGTGTGGGT	CACACAGATG	AATCACATCG	TCATGGAGAT	TGACCAGGAG	SOO
GCCTACCGTG	ACTGGTTCAG	TAGCCAGCTG	ACAGCCACCT	GCAACGTGGA	GCAGTCCTTC	S60
TTCAACGACT	GGTTCAGTGG	ACACCTTAAC	TTCCAGATTG	AGCACCACCT	CTTCCCCACC	720
ATGCCCCGGC	ACAACTTACA	CAAGATCGCC	CCGCTGGTGA	AGTCTCTATG	TGCCAAGCAT	780
GGCATTGAAT	ACCAGGAGAA	GCCGCTACTG	AGGGCCCTGC	TGGACATCAT	CAGGTCCCTG	840
AAGAAGTCTG	GGAAGCTGTG	GCTGGACGCC	TACCTTCACA	AATGAAGCCA	CAGCCCCCGG	900
GACACCGTGG	GGAAGGGGTG	CAGGTGGGGT	GATGGCCAGA	GGAATGATGG	GCTTTTGTTC	960
TGAGGGGTGT	CCGAGAGGCT	GGTGTATGCA	CTGCTCACGG	ACCCCATGTT	GGATCTTTCT	1020
CCCTTTCTCC	TCTCCTTTTT	CTCTTCACAT	CTCCCCCATA	GCACCCTGCC	CTCATGGGAC	1080
CTGCCCTCCC	TCAGCCGTCA	GCCATCAGCC	ATGGCCCTCC	CAGTGCCTCC	TAGCCCCTTC	1140
TTCCAAGGAG	CAGAGAGGTG	GCCACCGGGG	GTGGCTCTGT	CCTACCTCCA	CTCTCTGCCC	1200
CTAAAGATGG	GAGGAGACCA	GCGGTCCATG	GGTCTGGCCT	GTGAGTCTCC	CCTTGCAGCC	1260
TGGTCACTAG	GCATCACCCC	CGCTTTGGTT	CTTCAGATGC	TCTTGGGGTT	CATAGGGGCA	1320
GGTCCTAGTC	GGGCAGGGCC	CCTGACCCTC	CCGGCCTGGC	TTCACTCTCC	CTGACGGCTG	1380
CCATTGGTCC	ACCCTTTCAT	AGAGAGGCCT	GCTTTGTTAC	AAAGCTCGGG	TCTCCCTCCT	1440
GCAGCTCGGT	TAAGTACCCG	AGGCCTCTCT	TAAGATGTCC	AGGGCCCCAG	GCCCGCGGGC	1500
ACAGCCAGCC	CAAACCTTGG	GCCCTGGAAG	AGTCCTCCAC	CCCATCACTA	GAGTGCTCTG	1560
ACCCTGGGCT	TTCACGGGCC	CCATTCCACC	GCCTCCCCAA	CTTGAGCCTG	TGACCTTGGG	1620
ACCAAAGGGG	GAGTCCCTCG	TCTCTTGTGA	CTCAGCAGAG	GCAGTGGCCA	CGTTCAGGGA	1680
GGGGCCGGCT	GGCCTGGAGG	CTCAGCCCAC	CCTCCAGCTT	TTCCTCAGGG	TGTCCTGAGG	1740
TCCAAGATTC	TGGAGCAATC	TGACCCTTCT	CCAAAGGCTC.	TGTTATCAGC	TGGGCAGTGC	1800

CAGCCAATCC CTGGCCATTT GGCCCCAGGG GACGTGGGCC CTG

1843 » «

122 (2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2257 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ϋ) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (editovaný kontig 253538a)

(xi) Popis	sekvence	: SEQ ID	NO: 27:
CAGGGACCTA	CCCCGCGCTA	CTTCACCTGG	GACGAGGTGG	CCCAGCGCTC	AGGGTGCGAG	60
GAGCGGTGGC	TAGTGATCGA	CCGTAAGGTG	TACAACATCA	GCGAGTTCAC	CCGCCGGCAT	120
CCAGGGGGCT	CCCGGGTCAT	CAGCCACTAC	GCCGGGCAGG	ATGCCACGGA	TCCCTTTGTG	180
GCCTTCCACA	TCAACAAGGG	CCTTGTGAAG	AAGTATATGA	ACTCTCTCCT	GATTGGAGAA	240
CTGTCTCCAG	AGCAGCCCAG	CTTTGAGCCC	ACCAAGAATA	AAGAGCTGAC	AGATGAGTTC	300
CGGGAGCTGC	GGGCCACAGT	GGAGCGGATG	GGGCTCATGA	AGGCCAACCA	TGTCTTCTTC	360
CTGCTGTACC	TGCTGCACAT	CTTGCTGCTG	CATCGTGCAG 1	CCTGGCTCAC	CCTTTGGGTC	420
TTTGGGACGT	CCTTTTTGCC	CTTCCTCCTC	! TGTGCGGTGC	TGCTCAGTGC	AGTTCAGCAG	430
GCCCAAGCTG	GATGGGTGCA	ACATGATTAT	GGCCACCTGT	CTGTCTACAG	AAAACCCAAG	540
TGGAACCACC	TTGTCCACAA	ATTCGTCATT	GGCGACTTAA • J,	AGGGTGCCTC	TGCCAACTGG	600
TGGAATCATC	GCCACTTCCA	GCACCACGCC	AAGCCTAACA	TCTTCCACAA	GGATCCCGAT	660
GTGAACATGC	TGCACGTGTT	TGTTCTGGGC	GAAÓGGCAGC 1	CCATCGAGTA	CGGCAAGAAG	720
AAGCTGAAAT	ACCTGCCCTA	CAATCACCAG	CACGAATACT	TCTTCCTGAT	TGGGCCGCCG	7S0
CTGCTCATCC	CCATGTATTT	CCAGTACCAG	ATCATCATGA	CCATGATCGT	CGATAAGAAC	840
TGGGTGGACC	TGGCCTGGGC	CGTCAGCTAC	TACATCCGGT	TCTTCATCAC	CTACATCCCT	900
TTCTACGGCA	TCCTGGGAGC	CCTCCTTTTC	CTCAACTTCA	TCAGGTTCCT	GGAGAGCCAC	960
TGGTTTGTGT	GGGTCACACA	GATGAATCAC	ATCGTCATGG	AGATTGACCA	GGAGGCCTAC	1020
CGTGACTGGT	TCAGTAGCCA	GCTGACAGCC	ACCTGCAACG	TGGAGCAGTC	CTTCTTCAAC	1080
GACTGGTTCA	GTGGACACCT	TAACTTCCAG	ATTGAGCACC	ACCTCTTCCC	CACCATGCCC	1140
CGGCACAACT	TACACAAGAT	CGCCCCGCTG’ GTGAAGTCTC	TATGTGCCAA	GCATGGCATT	1200
GAATACCAGG	AGAAGCCGCT	ACTGAGGGCC	CTGGTGGACA	TCATCAGGTC	CCTGAAGAAG	1260
TCTGGGAAGC	TGTGGCTGGA	CGCCTACCTT	CACAAATGAA	GCCACAGCCC	CCGGGACACC	1320
GTGGGGAAGG	GGTGCAGGTG	GGGTGATGGC	CAGAGGAATG	ATGGGCTTTT	GTTCTGAGGG	1330
GTGTCCGAGA	GGCTGGTGTA	TGCACTGCTC	ACGGACCCCA	TGTTGGATCT	TTCTCCCTTT	1440
CTCCTCTCCT	TTTTCTCTTC	ACATCTCCCC	CATAGCACCC	TGCCCTCATG	GGACCTGCCC	1500

TCCCTCAGCC GTCAGCCATC AGCCATGGCC CTCCCAGTGC CTCCTAGCCC CTTCTTCCAA 1560 • ·· 99 ·

9 9 · ** *

123

GGAGCAGAGA	GGTGGCCACC	GGGGGTGGCT	CTGTCCTACC	TCCACTCTCT	GCCCCTAAAG	1620
ATGGGAGGAG	ACCAGCGGTC	CATGGGTCTG	GCCTGTGAGT	CTCGCCTTGC	AGCCTGGTCA	1630
CTAGGCATCA	CCCCCGCTTT	GGTTCTTCAG	ATGCTCTTGG	GGTTCATAGG	GGCAGGTCCT	1740
AGTCGGGCAG	GGCCCCTGAC	CCTCCCGGCC	TGGCTTCACT	CTCCCTGAČG	GCTGCCATTG	iaoo
GTCCACCCTT	TCATAGAGAG	GCCTGCTTTG	TTACAAAGCT	cgggtGtccc	TCCTGCAGCT	1860
CGGTTAAGTA	CCCGAGGCCT	CTCTTAAGAT	GTCCAGGGCC	CCAGGCCCGC	GGGCACAGCC	1920
AGCCCAAACC	TTGGGCCCTG	GAAGAGTCCT	CCACCCCATC	ACTAGAGTGC	TCTGACCCTG	1980
GGCTTTCACG	GGCCCCATTC	CACCGCCTCC	CCAACTTGAG	CCTGTGACCT	TGGGACCAAA	2040
GGGGGAGTCC	CTCGTCTCTT	GTGACTCAGC	AGAGGCAGTG	GCCACGTTCA	GGGAGGGGCC	2100
GGCTGGCCTG	GAC-GCTCAGC	CCACCCTCCA	GCTTTTCCTC	AGGGTGTCCT	GAGGTCCAAG	2160
ATTCTGGAGC	AATCTGACCC	TTCTCCAAAG	GCTCTGTTAT	CAGCTGGGCA	GTGCCAGCCA	2220
ATCCCTGGCC	ATTTGGCCCC	AGGGGACGTG	GGCCCTG			2257

(2) Informace ο SEQ ID NO: 28:

(i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 411 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontign

2692004)

	(xi	-) Popis sekvence:	SEQ	ID	NO: 28:
His 1	Ala Asp	Arg Arg Arg Glu Ile Leu 5	Ala 10	Lys	Tyr-Pro Glu Ile 15
Lys	Ser Leu	Met Lys Pro Asp Pro Asn 20	Leu 25	Ile	Trp. Ile Ile Ile 30
Met	Met Val	Leu Thr Gin Leu Gly Ala 35	Phe 40	Tyr	Ile Val Lys Asp 45
Leu	Asp Trp	Lys Trp Val Ile Phe Gly 50	Ala 55	Tyr	Ala, Phe Gly Ser í 6 0
Cys	Ile Asn.	His Ser Met Thr Leu Ala 6 5	Ilě 70	His	Glu Ile Ala His 75
Asn	Ala Ala	Phe Gly Asn Cys Lys Ala 80	Met 85	Trp	Asn Arg Trp Phe sc
Gly	Met Phe	Ala Asn Leu Pro Ile Gly 95	Ile 100	Pro	Tyr Ser Ile Ser 105
Phe	Lys Arg	Tyr His Met Asp His His 110	Arg 115	Tyr	LeuGly Ala Asp 120
Gly	Val Asp	Val Asp Ile Pro Thr Asp 125	Phe 130	Glu	Gly Trp Phe Phe 135
Cys	Thr Ala	Phe Arg Lys Phe Ile Trp 140	Val 145	Ile	Leu ,Gln Pro Leu 150
Phe	Tyr Ala	Phe Arg Pro Leu Phe Ile 155	Asn 160	Pro	Lys 'Pro Ile Thr 165
Tyr	Leu Glu	Val Ile Asn Thr Val Ala 170	Gin 175	Val	Thr Phe Asp Ile 180
Leu	Ile Tyr	Tyr Phe Leu Gly Ile Lys 185	Ser 190	Leu	Val Tyr Met Leu 195

124 • · • · · a · « • · · · · • · ··· · · ·

Ala

Ala

Ser

Leu

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

His

Pro

Ile

Ser

Gly

His

200

205

210

Phe

Ile

Ala

Glu

His

Tyr

Met

Phe

Leu

Lys

Gly

His

Glu

Thr

Tyr

215

220

225

Ser

Tyr

Tyr

Gly

Pro

Leu

Asn

Leu

Leu

Thr

Phe

Asn

Val

Gly

Tyr

230

235

240

His

Asn.

Glu

His

His

Asp

Phe

Pro

Asn

Ile

Pro

Gly

Lys

Ser

Leu

245

250

2S5

Pro

Leu

Val

Arg

Lys

Ile

Ala

Ala

Glu

Tyr

Tyr

Asp

Asn

Leu

Pro

260

265

270

His

Tyr

Asn

Ser

Trp

Ile

Lys

Val

Leu

Tyr

Asp

Phe

Val

Met

Asp

275

230

285

Asp

Thr

Ile

Ser

Pro

Tyr

Ser

Arg

Met

Lys

Arg

His

Gin

Lys

Gly

230

295

300

Glu

Met

Val

Leu

Glu

Xaa

Ile

Ser

Leu

Val

Pro

Lys

Gly

Phe

Phe

305

310

315

Ser

Lys

Thr

Leu

Asp

Asp

Lys

Met

Glu

Phe

Leu

His

Tyr

Xaa

Thr

320

325

330

Xaa

Asp

Gin

Xaa

Cys

Ser

Glu

Ala

Pro

Leu

Ala

Gin

Phe

Gin

Ser

335

340

345

Lys

Ser

Ser

Val

Ile

Pro

Arg

Ser

Glu

Ser

Gly

Phe

Xaa

Thr

Val

350

355

360

Ser

Leu

Thr

Leu

Tyr

Cys

Ser

Val

Ser

Leu

Thr

Gly

Asn

Leu

Xaa

365

370

375

Leu

Val

Tyr

Tyr

Arg

His

Xaa

Gly

Cys

Phe

Thr

His

Val

Cys

His

380

335

390

Phe

Ile

Ser

Ile

Ser

Phe

Lys

Lys

Leu

Leu

Lys

Ser

Tyr

Phe

Ala

400

405

410

Arg

(2)

Informace o SEQ ID NO: 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(ii)

2153526) (A) DÉLKA: 218 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontigu (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:

Tyr

Leu

Leu Arg

Pro

Leu

Leu

Pro

His

Leu

Cys

Ala

Thr

Ile

Gly

1

5

10

15

Ala

Glu

Ser Phe

Leu

Gly

Leu

Phe

Phe

Ile

Val

Arg

Phe

Leu

Glu

20

25

30

Ser

Asn

Trp Phe

Val

Trp

Val

Thr

Gin

Met

Asn

His

Ile

Pro

Met

35

40

45

His

Ile

Asp His

Asp

Arg

Asn

Met

Asp

Trp

Val

Ser

Thr

Gin

Leu

50

55

60

Gin

Ala

Thr Cys

Asn

Val

His

Lys

Ser

Ala

Phe

Asn

Asp

Trp

Phe

6 5

70

75

Ser

Gly

His Leu

Asn

Phe

Gin

Ile

Glu

His

His

Leu

Phe

Pro

Thr

80

35

90

Met

Pro

Arg His

Asn

Tyr

His

Lys

Val

Ala

Pro

Leu

Val

Gin

Ser

95

100

105

Leu

Cys

Ala Lys

His

Gly

Ile

Glu

Tyr

Gin

Ser

Lys

Pro

Leu

Leu

110

115

120

Ser

Ala

Phe Ala

Asp

Ile

Ile

His

Ser

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Gin

125

130

135

Leu

Trp

Leu Asp

Ala

Tyr

Leu

His

Gin

Xaa

Gin

Gin

Pro

Pro

Cys

·> λ d

145

150

• « · «

125

Pro	Val	Trp	Lys	Lys 155	Arg	Arg
Gly	Ala	Xaa	Gly	Thr 170	Met	Pro
Leu	Gly	Leu	Gly	Thr 135	Xaa	Ser
Ile	Phe	Xaa	Pro	Gin 200	Phe	Xaa
Glu	Val	Pro	Arg	Arg 215	Glu	Gly

Lys	Thr	Leu	Glu	Pro	Arg	Gin	Arg
	ISO					165
Leu	Xaa	Phe	Asn	Thr	Gin	Arg	Gly
		175					130
Leu	Xaa	Leu	Lya	Leu	Leu	Pro	Phe
		190					195
Asp	Pro	Lys	Trp	Gly	Val	Asp	Thr
		205					210
Ala

(2)

Informace o	SEQ ID NO: 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 71 aminokyselin
(B)	TYP: aminokyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH	MOLEKULY: aminokyselina

(překlad kontigu

3506132) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 30:

I

Val

Pjte

Tyr

Phe

Gly

Asn

Gly

Trp

Ile

Pro

Thr

Leu

Ile

Thr

Ala

1

5

10

15

Phe

Val

Leu

Ala

Thr

Ser

Gin

Ala

Gin

Ala

Gly

Trp

Leu

Gin

His

20

25

30

Asp

Tyr

Gly

His

Leu

Ser

Val

Tyr

Arg

Lys

Pro

Lys

Trp

Asn

His

35

40

45

Leu

v&l

His

Lys

Phe

Val

Ile

Gly

His

Leu

Lys

Gly

Ala

Ser

Ala

50

SS

SO

Asn

Ti-p

Trp

Asn

His

Arg

His

Phe

Gin

His

His

Ala

Lys

Pro

Asn

• l • f

SS

70

75

Leu

Gly

Glu

Trp

Gin

Pro

Ile

Glu

Tyr

Gly

Lys

Xaa

80

85

(2) Informace o SEQ ID NO: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 306 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová • ·

126 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontigu 3854933)

	(xi)	i Popis	sekvence	: SEQ	ID '	NO:	31:
Gin 1	Gly Pro	Thr Pro 5	Arg Tyr Phe	Thr Trp 10	Asp	Glu	Val Ala Gin 15
Arg	Ser Gly	Cys Glu 20	Glu Arg Trp	Leu Val 25	Ile	Asp	Arg Lys Val 30
Tyr	Asn Ile	Ser Glu 35	Phe Thr Arg	Arg His 40	Pro	Gly Gly Ser Arg 45
Val	Ile Ser	His Tyr 50	Ala Gly Gin	Asp Ala 5 5	Thr	Asp	Pro Phe Val 60
Ala	Phe His	Ile Asn 65	Lys Gly Leu	Val Lys 70	Lys	Tyr	Met Asn Ser 75
Leu	Leu Ile	Gly Glu 80	Leu Ser Pro	Glu. Gin 85	Pro	Ser	Phe Glu Pro 90
Thr	Lys Asn	Lys Glu 95	Leu Thr Asp	Glu Phe 100	Arg	Glu	Leu Arg Ala 105
Thr	Val Glu	Arg Met 110	Gly Leu Met	Lys Ala 115	Asn	His	Val phe Phe 120
Leu	Leu Tyr	Leu Leu 125	His Ile Leu	Leu Leu 130	Asp	Gly	Ala Ala Trp 135
Leu	Thr Leu	Trp Val 140	Phe Gly Thr	Ser Phe 145	Leu	Pro	Phe Leu Leu 150
Cys	Ala Val	Leu Leu 155	Ser Ala Val	Gin Ala 160	Gin	Ala	Gly Trp Leu 165
Gin	His Asp	Phe Gly 170	His Leu Ser	Val Phe 175	Ser	Thr	Ser Lys Trp 180
Asn	His Leu	Leu His 135	His Phe Val	Ile Gly 190	His	Leu	Lys Gly Ala 195
Pro	Ala Ser	Trp Trp 200	Asn His Met	His Phe 205	Gin	His	His Ala Lys 210
Pro	Asn Cys	Phe Arg 215	Lys Asp Pro	Asp Ile 220	Asn	Met	His Pro Phe 225
Phe	Phe Ala	Leu Gly 230	Lys Ile Leu	Ser Val 235	Glu	Leu	Gly Lys Gin 240
Lys	Lys Lys	Tyr Met 245	Pro Tyr Asn	His Gin 250	His	Xaa	Tyr Phe Phe 255
Leu	Ile Gly	Pro Pro 260	Ala Leu Leu	Pro Leu 265	Tyr	Phe	Gin Trp Tyr 270
Ile	Phe Tyr	Phe Val 275	Ile Gin Arg	Lys Lys 280	Trp	Val	Asp Leu Ala , 285
Trp Thr	Ile Ser Ala Asn	Lys Gin 290 Ala Ser 305	Glu Tyr Asp Lys	Glu Ala 295	Gly	Leu	Pro Leu Ser 300

• ·

127 • · · «

(2) Informace o SEQ ID NO: 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 566 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontigu 2511785)

	(xi:	) Popis	sekvence	: SEQ	ID	NO:	32:
His Leu 1	Lys	Gly Ala 5	Ser Ala Asn	Trp Trp 10	Asn	His	Arg His Phe 15
Gin His	His	Ala Lys 20	Pro Asn. Ile	Phe His 25	Lys	Asp	Pro Asp Val 30
Asn Met	Leu	His Val 35	Phe Val Leu	Gly Glu 40	Trp	Gin	Pro Ile Glu 45
Tyr Gly	Lys	Lys Lys 50	Leu Lys Tyr	Leu Pro 55	Tyr	Asn	His Gin His 60
Glu Tyr	Phe	Phe Leu 55	Ile Gly Pro	Pro Leu 70	Leu	Ile	Pro Met Tyr ' 75
Phe Gin	Tyr	Gin Ile 80	Ile Met Thr	Met Ile 85	Val	His	Lys -Asn Trp 90
Val Asp	Leu	Ala Trp 95	Ala Val Ser	Tyr Tyr 100	Ile	Arg	Phe Phe Ile 105
Thr Tyr	Ile	Pro Phe 110	Tyr Gly Ile	Leu Gly 115	Ala	Leu	Leu Phe Leu 120
Asn Phe	Ile	Arg Phe 125	Leu Glu Ser	His Trp 130	Phe	Val	Trp Val Thr 135
Gin Met	Asn	His Ile 140	Val Met Glu	Ile Asp 145	Gin	Glu	Ala Tyr Arg 150
Asp Trp	Phe	Ser Ser 155	Gin Leu Thr	Ala Thr ISO	Cys	Asn	Val 'Glu Gin 155
Ser Phe	Phe	Asn Asp 170	Trp Phe Ser	Gly His 175	Leu	Asn	Phe Gin Ile 180
Glu His	His	Leu Phe 185	Pro Thr Met	Pro Arg 190	His	Asn	Leu His Lys 195
Ile Ala	Pro	Leu Val 200	Lys Ser Leu	Cys Ala 205	Lys	His	Gly Ile Glu 210

• * • ·

128 • · · · · · • · · ·

Tyr Gin Glu

Lys

Pro 215

Leu Leu

Arg Ala Leu Leu Asp 220

Ile

Ile

Arg 225

Ser

Leu

Lys

Lys

Ser

Gly

Lys

Leu

Trp

Leu

Asp

Ala

Tyr

Leu

His

230

235

240

Lys

Xaa

Ser

His

Ser

Pro

Arg

Asp

Thr

Val

Gly

Lys

Gly

Cys

Arg

245

250

255

Trp

Gly

Asp

Gly

Gin

Arg

Asn

Asp

Gly

Leu

Leu

Phe

Xaa

Gly

Val

260

265

270

Ser

Glu

Arg

Leu

Val

Tyr

Ala

Leu

Leu

Thr

Asp

Pro

Met

Leu

Asp

275

280

285

Leu

Ser

Pro

Phe

Leu

Leu

Ser

Phe

Phe

Ser

Ser

His

Leu

Pro

His

290

295

300

Ser

Thr

Leu

Pro

Ser

Trp

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu

Ser

Arg

Gin

Pro

305

310

31S

Ser

Ala

Met

Ala

Leu

Pro

Val

Pro

Pro

Ser

Pro

Phe

Phe

Gin

Gly

320

325

330

Ala

Glu

Arg

Trp

Pro

Pro

Gly

Val

Ala

Leu

Ser

Tyr

Leu

His

Ser

335

340

345

Leu

Pro

Leu

Lys

Met

Gly

Gly

Asp

Gin

Arg

SsiT

Met

Gly

Leu

Ala

350

355

360

Cys

Glu

Ser

Pro

Leu

Ala

Ala

Trp

Ser

Leu

Gly

Ile

Thr

Pro

Ala

365

370

375

Leu

Val

Leu

Gin

Met

Leu

Leu

Gly

Phe

Ile

Gly

Ala

Gly

Pro

Ser

380

385

390

Arg

Ala

Gly

Pro

Leu

Thr

Leu

Pro

Ala

Trp

Leu

His

Ser

Pro

Xaa

400

405

410

Arg

Leu

Pro

Leu

Val

His

Pro

Phe

Ile

Glu

Arg

Pro

Ala

Leu

Leu

415

420

425

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Pro

Pro

Ala

Ala

Arg

Leu

Ser

Thr

Arg

Gly

430

435

440

Leu

Ser

Xaa

Asp

Val

Gin

Gly

Pro

Arg

Pro

Ala

Gly

Thr

Ala

Ser

445

450

45S

Pro

Asn

Leu

Gly

Pro

Trp

Lys

Ser

Pro

Pro

Pro

His

His

Xaa

Ser

460

465

470

Ala

Leu

Thr

Leu

Gly

Phe

His

Gly

Pro

His

Ser

Thr

Ala

Ser

Pro

475

480

485

Thr

Xaa

Ala

Cys

Asp

Leu

Gly

Thr

Lys

Gly

Gly

Val

Pro

Arg

Leu

490

495

500

Leu

Xaa

Leu

Ser

Arg

Gly

Ser

Gly

His

Val

Gin

Gly Gly

Ala

Gly

505

510

51S

Trp

Pro

Gly

Gly

Ser

Ala

His

Tra

Pro

Ala

Phe

Pro

Gin

Gly

Val

520

525

530

Leu

Arg

Ser

Lys

Ile

Leu

Glu

Gin

Ser

Asp

Pro

Ser

Pro

Lys

Ala

53S

540

545

Leu

Leu

Ser

Ala

Gly

Gin

Cys

Gin.

Pro

Ile

Pro

Gly His

Leu

Ala

550

555

560

Pro

Gly

Asp

Val

Gly

Pro

Xaa

565

Informace o	SEQ ID NO: 33:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 619 aminokyselin
(B)	TYP: aminokyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární

• ·

(ii) DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontigu 2535)

(	;xi)	Popis	sekvence: SEQ ID Ϊ	10:	33:
Val	Phe	Tyr Phe	Gly Asn Gly Trp Ile Pro	Thr	Leu Ile Thr Ala
1			5 10		15
Phe	Val	Leu Ala	Thr Ser Gin Ala Gin Ala	Gly	Trp Leu Gin His
			20 25		30
Asp	Tyr	Gly His	Leu Ser Val Tyr Arg Lys	Pro	Lys Trp Asn His
			35 40		45
Leu	Val	His Lys	Phe Val Ile Gly His Leu	Lys	Gly Ala Ser Ala
			50 55		60
Asn	Trp	Trp Asn	His Arg His Phe Gin His	His	Ala Lys Pro Asn
			65 70		75
Ile	Phe	His Lys	Asp Pro Asp Val Asn Met	Leu	His Val Phe Val
			80 85		90
Leu	Gly	Glu Trp	Gin Pro Ile Glu Tyr Gly	Lys	Lys Lys Leu Lys
			95 100		105
Tyr	Leu	Pro Tyr	Asn His Gin His Glu Tyr	Phe	Phe Leu Ile Gly
			110 115		120
Pro	Pro	Leu Leu	Ile Pro Met Tyr Phe Gin	Tyr	Gin Ile Ile Met
			125 130		135
Thr	Met	Ile Val	His Lys Asn Trp Val Asp	Leu	Ala Trp Ala Val
			140 145		150
Ser	Tyr	Tyr Ile	Arg Phe Phe Ile Thr Tyr	Ile	Pro Phe Tyr Gly
			155 160		165
Ile	Leu	Gly Ala	Leu Leu Phe Leu Asn Phe	Ile	Arg Phe Leu Glu
		P	170 175		130
Ser	His	Trp Phe	Val Trp Val Thr Gin Met	Asn	His Ile Val Met
		1	18S 190		195
Glu	Ile	Ásp Gin	Glu Ala Tyr Arg Asp Trp	Phe	Ser Ser Gin Leu
			200 205		210
Thr	Ala	Thr Cys	Asn Val Glu Gin Ser Phe	Phe	Asn Asp Trp Phe
			215 220		225
Ser	Gly	Hrs Leu	Asn Phe Gin Ile Glu His	His	Leu Phe Pro Thr
			230 23S		240
Met	Pro	Arg His	Asn Leu His Lys Ile Ala	Pro	Leu Val Lys Ser
		-	245 250		255
Leu	Cys	Ala Lys	His Gly Ile Glu Tyr Gin	Glu	Lys Pro Leu Leu
			260 265		270
Arg	Ala	Leu Leu	Asp Ile Ile Arg Ser Leu	Lys	Lys Ser Gly Lys
		>	275 280		285
Leu	Trp	Leu Asp	Ala Tyr Leu His Lys Xaa	Ser	His Ser Pro Arg
			290 295		300
Asp	Thr	Val Gly	Lys Gly Cys Arg Trp Gly	Asp	Gly Gin Arg Asn
			305 310		315
Asp	Gly	Leu Leu	Phe Xaa Gly Val Ser Glu	Arg	Leu Val Tyr Ala
			320 325		330
Leu	Leu	Thr Asp	Pro Met Leu Asp Leu Ser	Pro	Phe Leu Leu Ser
			335 340		345
Phe	Phe	Ser Ser	His Leu Pro His Ser Thr	Leu	Pro Ser Trp Asp
			350 355		360
Leu	Pro	S er Leu	Ser Arg Gin Pro Ser Ala	Met	Ala Leu Pro Val
			365 370		375
Pro	Pro	Sér Pro	Phe Phe Gin Gly Ala Glu	Arg	Trp Pro Pro Gly
			380 385		390
Val	Ala	Leu Ser	Tyr Leu His Ser Leu Pro	Leu	Lys Met Gly Gly
			400 405		410
Asp	Gin	Arg Ser	Met Gly Leu Ala Cys Glu	Ser	Pro Leu Ala Ala
			415 420		425

• ·

130 • · · · · · * · · · * «···· • · 9 9 • · · · ··««··· · » 9 ·

Trp

Ser

Leu

Gly

Ile .Thr

Pro

Ala

Leu

Val

Leu

Gin

Met

Leu

Leu

430

435

440

Gly

Phe

Ile

Gly

Ala .Gly

Pro

Ser

Arg

Ala

Gly

Pro

Leu

Thr

Leu

445

450

455

Pro

Ala

Trp

Leu

His .Ser

Pro

Xaa

Arg

Leu

Pro

Leu

Val

His

Pro

460 ·

465

470

Phe

Ile

Glu

Arg

Pro Ala

Leu

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Pro

Pro

475

480

485

Ala

Ala

Arg

Leu

Ser Thr

Arg

Gly

Leu

Ser

Xaa

Asp

Val

Gin

Gly

490

495

500

Pro

Arg

Pro

Ala

Gly Thr

Ala

Ser

Pro

Asn

Leu

Gly

Pro

Trp

Lys

505

510

515

Ser

Pro

Pro

Pro

His His

Xaa

Ser

Ala

Leu

Thr

Leu

Gly

Phe

His

520

525

530

Gly

Pro

His

Ser

Thr Ala

Ser

Pro

Thr

Xaa

Ala

Cys

Asp

Leu

Gly

535

540

545

Thr

Lys

Gly

Gly

Val Pro

Arg

Leu

Leu

Xaa

Leu

Ser

Arg

Gly

Ser

S50

555

560

Gly

His

Val

Gin

Gly :-Gly

Ala

Gly

Trp

Pro

Gly

Gly

Ser

Ala

His

565'

570

575

Pro

Pro

Ala

Phe

Pro Gin

Gly

Val

Leu

Arg

Ser

Lys

Ile

Leu

Glu

580

585

590

Gin

Ser

Asp

Pro

Ser tpro

Lys

Ala

Leu

Leu

Ser

Ala

Gly

Gin

Cys

5 95

600

605

Gin

Pro

Ile

Pro

Gly 'His

Leu

Ala

Pro

Gly

Asp

Val

Gly

Pro

Xaa

610

615

620

(2) Informace o SEQ ID NO: 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 757 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontigu 253538a)

	(Xi)	Popis	sekvence:	SEQ ID NO: 34:
Gin 1	Gly Pro Thr	Pro Arg 5	Tyr Phe Thr	Trp Asp Glu Val Ala Gin 10 15
Arg	Ser Gly Cys	Glu Glu 20 ,	Arg Trp Leu	Val Ile Asp Arg Lys Val 25 30
Tyr	Asn Ile Ser	Glu.' Phe 35	Thr Arg Arg	His Pro Gly Gly Ser Arg 40 45
Val	Ile Ser His	Tyr Ala 50	Gly Gin Asp	Ala Thr Asp Pro Phe Val 55 6 0
Ala	Phe His Ile	Asn Lys 65	Gly Leu Val	Lys Lys Tyr Met Asn Ser 70 75
Leu	Leu Ile Gly	Glu Leu 8o;	Ser Pro Glu	Gin Pro Ser Phe Glu Pro 85 90
Thr	Lys Asn Lys	Glu· Leu 95	Thr Asp Glu	Phe Arg Glu Leu Arg Ala 100 105
Thr	Val Glu Arg	Met Gly 110 ·,	Leu Met Lys	Ala Asn His Val Phe Phe 115 120
Leu	Leu Tyr Leu	Leu His 125 '	Ile Leu Leu	Leu Asp Gly Ala Ala Trp 130 135
Leu	Thr Leu Trp	Val Phe 140	Gly Thr Ser	Phe Leu Pro Phe Leu Leu 145 150
Cys	Ala Val Leu	Leu ''Ser 155	Ala Val Gin	Gin Ala Gin Ala Gly Trp 160 165
Leu	Gin His Asp	•Tyr Gly	His Leu Ser	Val Tyr Arg Lys Pro Lys

131

170

175

íao

Trp

Asn

His

Leu

Val

His

Lys

Phe

Val

Ile

Gly

His

Leu

Lys

Gly

135

190

195

Ala

Ser

Ala

Asn

Trp

Trp

Asn

His

Arg

His

Phe

Gin

His

His

Ala

200

205

210

Lys

Pro

Asn

Ile

Phe

His

Lys

Asp

Pro

Asp

Val

Asn

Met

Leu

His

215

220

225

Val

Phe

Val

Leu

Gly

Glu

Trp

Gin

Pro

Ile

Glu

Tyr

Gly

Lys

Lys

230

235

240

Lys

Leu

Lys

Tyr

Leu

Pro

Tyr

Asn

His

Gin

His

Glu

Tyr

Phe

Phe

245

250

2S5

Leu

Ile

Gly

Pro,

Pro

Leu

Leu

Ile

Pro

Met

Tyr

Phe

Gin

Tyr

Gin

260

265

270

Ile

Ile

Met

Thr

Met

Ile

Val

His

Lys

Asn

Trp

Val

Asp

Leu

Ala

275

280

285

Trp

Ala

Val

Ser

Tyr

Tyr

Ile

Arg

Phe

Phe

Ile

Thr

Tyr

Ile

Pro

290

295

300

Phe

Tyr

Gly

Ile

Leu

Gly

Ala

Leu

Leu

Phe

Leu

Asn

Phe

Ile

Arg

305

310

315

Phe

Leu

Glu

Ser

His

Trp

Phe

Val

Trp

Val

Thr

Gin

Met

Asn

His

320

325

330

Ile

Val

Met

Glu

Ile

Asp

Gin

Glu

Ala

Tyr

Arg

Asp

Trp

Phe

Ser

335

340

345

Ser

Gin

Leu

Thr

Ala

Thr

Cys

Asn

Val

Glu

Gin

Ser

Phe

Phe

Asn

350

355

360

Asp

Trp

Phe

Ser

Gly

His

Leu

Asn

Phe

Gin

Ile

Glu

His

His

Leu

365

370

375

Phe

Pro

Thr

Met

Pro

Arg

His

Asn

Leu

His

Lys

Ile

Ala

Pro

Leu

380

385

390

Val

Lys

Ser

Leu

Cys

Ala

Lys

His

Gly

Ile

Glu

Tyr

Gin

Glu

Lys

400

405

410

Pro

Leu

Leu

Arg

Ala

Leu

Leu

Asp

Ile

Ile

Arg

Ser

Leu

Lys

Lys

415

420

425

Ser

Gly

Lys

Leu

Trp

Leu

Asp

Ala

Tyr

Leu

His

Lys

Xaa

Ser

His

430

435

440

Ser

Pro

Arg

Asp

Thr

Val

Gly

Lys

Gly

Cys

Arg

Trp

Gly

Asp

Gly

445

450

455

Gin

Arg

Asn.

Asp

Gly

Leu

Leu

Phe

Xaa

Gly

Val

Ser

Glu

Arg

Leu

460

465

470

Val

Tyr

Ala

Leu

Leu

Thr

Asp

Pro

Met

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

Phe

475

430

485

Leu

Leu

Ser

Phe

Phe

Ser

Ser

His

Leu

Pro

His

Ser

Thr

Leu

Pro

490

495

500

Ser

Trp

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu

Ser

Arg

Gin

Pro

Ser

Ala

Met

Ala

SOS

510

515

Leu

Pro

Val

Pro

Pro

Ser

Pro

Phe

Phe

Gin

Gly

Ala

Glu

Arg

Trp

520

525

530

Pro

Pro

Gly

Val

Ala

Leu

Ser

Tyr

Leu

His

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

535

540

545

Met

Gly

Gly

Asp

Gin

Arg

Ser

Met

Gly

Leu

Ala

Cys

Glu

Ser

Pro

550

555

560

Leu

Ala

Ala

Trp

Ser

Leu

Gly

Ile

Thr

Pro

Ala

Leu

Val

Leu

Gin

S6S

570

575

Met

Leu

Leu

Gly

Phe

Ile

Gly

Ala

Gly

Pro

Ser

Arg

Ala

Gly

Pro

580

585

590

Leu

Thr

Leu

Pro

Ala

Trp

Leu

His

Ser

Pro

Xaa

Arg

Leu

Pro

Leu

595

600

605

Val

His

Pro

Phe

Ile

Glu

Arg

Pro

Ala

Leu

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

610

615

620

Leu

Pro

Pro

Ala

Ala

Arg

Leu

Ser

Thr

Arg

Gly

Leu

Ser

Xaa

Asp

625

630

635

Val

Gin

Gly

Pro

Arg

Pro

Ala

Gly

Thr

Ala

Ser

Pro

Asn

Leu

Gly

132

9* ·99

640

645

650

Pro

Trp

Lys

Ser

Pro

Pro

Pro

His His

Xaa

Ser

Ala

Leu

Thr

Leu

655

660

665

Gly

Phe

His

Gly

Pro

His

Ser

Thr Ala

Ser

Pro

Thr

Xaa

Ala

Cys

670

675.

680

Asp

Leu

Gly

Thr

Lys

Gly

Gly

Val Pro

Arg

Leu

Leu

Xaa

Leu

Ser

685

690

695

Arg

Gly

Ser

Gly

His

Val

Gin

Gly Gly

Ala

Gly

Trp

Pro

Gly

Gly

700

705

710

Ser

Ala

His

Pro

Pro

Ala

Phe

Pro Gin

Gly

Val

Leu

Arg

Ser

Lys

715

720

725

Ile

Leu

Glu

Gin

Ser

Asp

Pro

Ser Pro

Lys

Ala

Leu

Leu

Ser

Ala

730

735

740

Gly

Gin

Cys

Gin

Pro

Ile

Pro

Gly His

Leu

Ala

Pro

Gly

Asp

Val

745

750

755

Gly

Pro

Xaa

P!/ ^prť «Ύ· • JI· ·

133 \

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1.

   Polypeptid kódovaný uvedenou nukleovou kyselinou podle nároku 1.

   Čištěný a izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2.

   Izolovanou nukleovou kyselinu kódující polypeptid SEQ ID NO: 2.

   Izolovanou nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce uvedené molekuly mastné kyseliny.

   Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 5, kde uvedená nukleotidové sekvence se získala z eukaryontní buňky. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 6, kde uvedenou eukaryontní buňkou je buňka hub.

   Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 7, kde uvedená buňka hub je rodu Mortierella.

   Izolovaná nukleové kyselina podle nároku 8, kde uvedená buňka Mortierella je druh Mortierella alpina.

   Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 5, kde uvedená nukleotidové sekvence hybridizuje s nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 1.

   Nukleová kyselina podle nároku 10, kde uvedená nukleotidové sekvence kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2.

   Nukleová kyselina podle nároku 11, kde uvedená aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 2 se vybrala ze skupiny zahrnující aminokyselinové zbytky 30 až 38, 41 až

   44, 171 až 175, 203 až 212 a 387 až 394.

   134 « ·· * · · · · » ·· · • · · · ····· • · · · · « · ······ • · » · · · »

   13. Izolovaný nebo čištěný polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce uvedené molekuly mastné kyseliny.

   14 . Izolovaná nukleová kyselina obsahuj ící nukleotidovou sekvenci, která je v podstatě identická se sekvencí alespoň 50 nukleotidů v SEQ ID : NO: 1. 15. Sekvence izolované nukleové kyseliny, která vykazuje alespoň přibližně 50 % shodu se SEQ ID NO: 1. 16. Konstrukce nukleové kyseliny obsahuj ící nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO 1 spojenou s heterogenní nukleovou kyselinou. 17. Konstrukce nukleové kyseliny obsahuj ící nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 operativně spojenou

   s promotorem.

   18. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 17, kde uvedený promotor je funkční v mikrobiální buňce.

   19. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 18, kde uvedenou mikrobiální buňkou je buňka kvasinek.

   20. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 17, kde uvedená nukleotidová sekvence je odvozená z hub.

   21. Nukleová kyselina podle nároku 19, kde uvedená houba je z rodu Mortierella.

   22. Nukleová kyselina podle nároku 20, uvedená houba je z druhu Mortierella alpina.

   23. Konstrukce nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, jenž odpovídá nebo je komplementární s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 2, přičemž uvedená nukleotidová sekvence je operativně spojena s promotorem, který je funkční v hostitelské buňce, kde uvedená nukleotidová sekvence kóduje polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

   135

   24. Konstrukce nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující funkčně aktivní Δδ-desaturázu, přičemž uvedená desaturáza má aminokyselinovou sekvenci, která odpovídá celé nebo části aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2 nebo je s ní komplementární, přičemž uvedená nukleotidová sekvence je operativně spojena s promotorem funkčním v hostitelské buňce.

   25. Rekombinantní buňka kvasinek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje nukleovou konstrukci podle nároku 23 nebo 24.

   26. Rekombinantní buňka kvasinek podle nároku 25, vyznačující se tím, že je buňkou

   Saccharomyces.

   27. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu kopii nukleotidové sekvence, která kóduje polypeptid, který přeměňuje kyselinu dihomo-γlinolenovou na kyselinu arachidonovou, kde uvedená mikrobiální buňka nebo předek uvedené mikrobiální buňky se transformoval vektorem obsahujícím uvedenou nukleotidovou sekvenci a kde uvedená nukleotidová sekvence je operativně spojena s promotorem funkčním v uvedené hostitelské buňce.

   28. Mikrobiální buňka podle nároku 27, vyznačuj ící se tím, že je hostitelskou buňkou vybranou ze skupiny zahrnující buňku hub a řas.

   29. Mikrobiální buňka podle nároku 28, v y z n a č u j i c i se tím, ž e uvedená buňka hub je buňka kvasinek a uvedená buňka řas je buňka mořských řas. 30. Mikrobiální buňka podle nároku 27, v y z n a č u j í c i

   setím, ž. e je ve srovnání s hostitelskou buňkou, která neobsahuje uvedenou nukleotidovou sekvenci, obohacená mastnými kyselinami 20:3.

   31. Mikrobiální buňka podle nároku 27, vyznačující se tím, ž e ve srovnání s hostitelskou buňkou, která

   32.

   33.

   34 .

   35.

   136 neobsahuje uvedenou sekvenci DNA, je obohacená mastnými kyselinami 20:4 nebo ω-3 20:4.

   Mikrobiální buňka podle nároku 27, vyznačující se tím, ž e ve srovnání s hostitelskou buňkou, která neobsahuje uvedenou sekvenci DNA, je obohacena mastnými kyselinami 20:5.

   Mikrobiální buňka podle nároku 27, vyznačuj ící setím, že ve srovnání s netransformovanou mikrobiální buňkou vykazuje změněné množství 20:3 (8, 11, 14) mastné kyseliny.

   Způsob produkce kyseliny arachidonové v kultuře mikrobiálních buněk, vyznačující se tím, ž e zahrnuje: kultivaci kultury mikrobiálních buněk, která má velké množství mikrobiálních buněk, kde uvedené mikrobiální buňky nebo jejich předci se transformovaly vektorem obsahujícím jednu nebo více nukleových kyselin, které mají nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, jenž přeměňuje kyselinu dihomo-y-linolenovou na kyselinu arachidonovou, přičemž jedna nebo více nukleových kyselin jsou operativně spojeny s promotorem za podmínek, kdy se exprimuje jedna nebo více nukleových kyselin a v uvedené mikrobiální buněčné kultuře se produkuje kyselina arachidonové.

   Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že uvedený polypeptid je enzym, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce molekuly uvedené mastné kyseliny.

   36.

   Způsob podle nároku 34, vyzná č u j í c í se t í m, že uvedená nukleotidová sekvence se získala z druhu rodu Mortierella Způsob podle nároku 34, vyzná č u j í c í se t i m, že uvedená kyselina dihomo-y-1inolenová se

   dodává exogenně.

   37.

   137

   38. Způsob se t buňky. podle nároku 34, vyznačuj ící buňky jsou kvasinkové í m, že uvedené mikrobiální 39. Způsob podle nároku 38, vyznačuj ící se t i m, že uvedené kvasinkové buňky j sou z druhu

   Saccharomyces.

   40. Způsob podle nároku 34, vyzná č u j i c i se tím, že lze vyvolat uvedené podmínky. 41. Rekombinantní buňka kvasinek, vyzná č u j í c i se tím, že přeměňuje více jak přibližně 5 % mastné

   kyseliny 20:3 na mastnou kyselinu 20:4.

   42. Sonda tvořená nukleovou kyselinou, vyznačuj ící se tím, že obsahuje nukleotidovou reprezentovanou SEQ ID NO: 1. sekvenci 43. Hostitelská buňka, vyznačující se t í m, že

   obsahuje konstrukci nukleové kyseliny podle nároku 23 nebo 24 .

   44. Hostitelská buňka, jenž obsahuje vektor zahrnující nukleovou kyselinu, která kóduje desaturázu mastné kyseliny získanou z Mortierella alpina, vyznačující se tím, že uvedená desaturáza mastné kyseliny obsahuje aminokyselinovou sekvenci reprezentovanou SEQ ID NO: 2, přičemž uvedená nukleová kyselina je operativně spojena s promotorem.

   45. Hostitelská buňka podle nároku 44, vyznačuj ící se tím, že uvedená hostitelská buňka je eukaryontní buňka.

   46. Hostitelská buňka podle nároku 45, vyznačuj ící se tím, že uvedená eukaryontní buňka se vybrala ze skupiny zahrnující savčí buňku, rostlinnou buňku, buňku hub, ptačí buňku a buňku řas.

   47. Hostitelská buňka podle nároku 45, vyznačuj ící se tím, že obsahuje kyselinu dihomo-gamalinolenovou.

   138

   48.

   49.

   50.

   51.

   52.

   53.

   54.

   dihomo-γ-1 i no 1 enové, ž e zahrnuje kultivaci podle nároku 37 za polypeptidu kódovaného

   Hostitelská buňka podle nároku 45, vyznačuj ící se tím, že obsahuje EPA.

   Hostitelská buňka podle nároku 44, vyznačuj ící se tím, že uvedený promotor se dodává exogenně. Způsob desaturace kyseliny vyznačující se tím, rekombinantní mikrobiální buňky podmínek vhodných pro expresi uvedenou nukleovou kyselinou, přičemž uvedená hostitelská buňka dále obsahuje substrát mastné kyseliny vhodný pro uvedený polypeptid.

   Mastná kyselina desaturovaná způsobem podle nároku 50.

   Olej, vyznačující se tím, že obsahuje mastnou kyselinu podle nároku 51.

   Způsob získání upravené biosyntézy poly-nenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje kuktivace mikroba vykazujícího buňky, které obsahují transgen kódující transgenní expresívní produkt desaturující molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce uvedené molekuly mastné kyseliny, přičemž uvedený transgen je operativně spojen se sekvencí řídící expresi za podmínek, kdy se exprimuje uvedený transgen, čímž v uvedených buňkách dochází ke změně biosyntézy poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem.

   Způsob získání upravené biosyntézy poly-nenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje kuktivace mikroba vykazujícího buňky, které obsahují transgen získaný z houby nebo řasy kódující transgenní expresívní produkt desaturující molekulu mastné kyseliny v poloze pátého uhlíku od karboxylového konce uvedené molekuly mastné kyseliny, přičemž uvedený transgen je operativně spojen se sekvencí řídící expresi za podmínek, kdy se exprimuje uvedený

   • · * • · • 9 · · • · · • · · · • * · · 139 • · • · · • · · · • · • · · * · · · • · transgen, čímž v uvedených buňkách dochází ke změně biosyntézy poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým

   řetězcem.

   55. Způsob podle nároku 53 nebo 54, vyznačující se tím, že uvedené poly-nenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem se vybraly ze skupiny zahrnujícíc ARA, DGLA a EPA.

   56. Mikrobiální olej nebo jeho frakce, vyznačující se tím, že se produkuje způsobem podle nároku 53 nebo 54.

   57. Způsob léčby nebo prevence podvýživy vyznačuj ící se tím, že obsahuje aplikaci uvedeného mikrobiálního oleje podle nároku 56 pacientovi, který potřebuje uvedenou léčbu nebo prevenci, v dostatečném množství, aby došlo k uvedené léčbě nebo prevenci.

   58. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje uvedený mikrobiální olej nebo frakci

   podle nároku 56 a farmaceuticky přijatelný nosič. 59. Farmaceutická kompozice podle nároku 58, vyznačuj i c i se tím, že je v pevné nebo kapalné formě. 60. Farmaceutická kompozice podle nároku 59, vyznačuj í c i se tím, že je ve formě kaspulí nebo tablet. 61. Farmaceutická kompozice podle nároku 58, vyznačuj i c í se tím, že dále obsahuje

   alespoň jeden nutrient vybraný ze skupiny zahrnující vitamin, minerál, sacharid, cukr, aminokyselinu, volnou mastnou kyselinu, fosfolipid, antioxidant a fenolovou sloučeninu.

   62. Výživový přípravek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje uvedený mikrobiální olej nebo jeho frakci podle nároku 56.

   » · · ·

   140

   65,

   66,

   Výživový přípravek podle nároku 62, vyznačující setím, že se vybral ze skupiny zahrnující kojeneckou výživu, potravinový doplněk a potravinovou náhradu.

   Výživový přípravek podle nároku 63, vyznačuj ící se tím, že uvedená kojenecká výživa, potravinový doplněk a potravinová náhrada je v kapalné nebo pevné formě.

   Kojenecká výživa, vyznačující se tím, že obsahuje uvedený mikrobiální olej nebo jeho frakci podle nároku 56.

   Kojenecká výživa podle nároku 65, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje alespoň jeden makronutrient vybraný ze skupiny zahrnující kokosový olej, sojový olej, olej kanoly, mono- a diglycerídy, glukózu, poživatelnou laktózu, elektrodialyzovanou syrovátku, elektrodialyzované netučné mléko, mléčnou syrovátku, sojový protein a jiné proteinové hydrolyzáty.

   Kojenecká výživa podle nároku 66, se tím, že dále vyznačuj i c i obsahuje alespoň jeden vitamin vybraný ze skupiny zahrnující vitaminy A, C, D, E a B komplex a alespoň jeden minerál vybraný ze skupiny zahrnující vápník, hořčík, zinek, mangan, sodík, draslík, fosfor, měď, chlorid, jodid, selen a železo.

   Potravinový doplněk, vyznačuj ící se tím, že obsahuje mikrobiální olej nebo jeho frakci podle nároku 56.

   Potravinový doplněk podle nároku 68, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje alespoň jeden makronutrient vybraný ze skupiny zahrnující kokosový olej, sojový olej, olej kanoly, mono- a diglycerídy, glukózu, poživatelnou laktózu, elektrodialyzovanou syrovátku, elektrodialyzované netučné mléko, mléčnou syrovátku, sojový protein a jiné proteinové hydrolyzáty.

   69.

   • · · ·

   141 • · ·

   70. Potravinový doplněk podle nároku 69, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje alespoň jeden vitamin vybraný ze skupiny zahrnující vitaminy A, C, D, E a B komplex a alespoň jeden minerál vybraný ze skupiny obsahující vápník, hořčík, zinek, mangan, sodík, draslík, fosfor, měď, chlorid, jód, selen a železo.

   71. Potravinový doplněk podle nároku 68 nebo 70, vyznačující se tím, že se aplikuje člověku nebo zvířeti.

   72. Potravinová náhrada, vyznačuj ící se tím, že obsahuje uvedený mikrobiální olej nebo jeho frakci podle nároku 56.

   73. Potravinová náhrada podle nároku 72, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje alespoň jeden makronutrient vybraný ze skupiny zahrnující kokosový olej, sojový olej, olej kanoly, mono- a diglyceridy, glukózu, poživatelnou laktózu, elektrodialyzovanou syrovátku, elektrodialyzované netučné mléko, mléčnou syrovátku, sojový protein a jiné proteinové hydrolyzáty.

   74. Potravinová náhrada podle nároku 73, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje alespoň jeden vitamin vybraný ze skupiny zahrnující vitaminy A, C, D, E a B komplex a alespoň jeden minerál vybraný ze skupiny obsahující vápník, hořčík, zinek, mangan, sodík, draslík, fosfor, měď, chlorid, jód, selen a železo.

   75. Potravinová náhrada podle nároku 72 nebo 74, vyznačující se tím, že se aplikuje člověku nebo zvířeti.

   76. Způsob léčby pacienta trpícího stavem způsobeným nedostatečným příjmem nebo produkcí poly-nenasycených mastných kyselin, vyznačující se tím, že se uvedenému pacintovi aplikuje uvedená potravinová náhrada podle nároku 72 nebo uvedený potravinový doplněk

   142 • · · · • · · • · * · · · • · • · · · podle nároku 68 v množství, které je dostatečné, aby došlo k uvedené léčbě.

   Způsob podle nároku 72, vyznačující se tím, že uvedená potravinová náhrada nebo uvedený potravinový doplněk se aplikuje enterálně nebo parenterálně.

   Kosmetický přípravek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje uvedený mikrobiální olej nebo jeho frakci podle nároku 56.

   Kosmetický přípravek podle nároku 78, vyznačuj ící se tím, ž e se aplikuje povrchově. Farmaceutická kompozice podle nároku 58, vyznačuj ící se tím, ž e se aplikuj e

   člověku nebo zvířeti.

   Zvířecí krmivo, vyznač u j í c í se tím, ž e obsahuje uvedený mikrobiální olej nebo jeho frakci podle nároku 56 • Způsob podle nároku 54, v y z n a č u j ící

   se tím, že uvedená houba je druh rodu Mortierella. Způsob podle nároku 82, vyznačující se tím, že uvedená houba je Mortierella alpina. Izolovaná nukleotidová sekvence vybraná ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 15.

   Izolovaná nukleotidová sekvence vybraná ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 19.

   Izolovaná nukleotidová sekvence obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 27.

   Izolovaná peptidová sekvence obsahující peptidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ

   143 • ·· ·· Φ· • φ φ φ · · · • φ φφφφ • φ · φφφ φφφ φ · φ · • Φ φ φ ΦΦ φ ΦΦ ΦΦ

   ID ΝΟ: 29, SEQ ID ΝΟ: 30, SEQ ID ΝΟ: 31, SEQ ID ΝΟ: 32,

   SEQ ID ΝΟ: 33 a SEQ ID NO: 34.

   88.

   Čištěné polypeptidy produkované z nukleotidových sekvencí podle nároků 84 až 86.