JP4959903B2 - エロンガーゼ遺伝子およびその用途 - Google Patents

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Description

【０００１】
（発明の背景）
技術分野
本発明は、長鎖多価不飽和（長鎖多不飽和）脂肪酸の伸長に関与するいくつかの遺伝子（すなわち、「エロンガーゼ」）の同定およびその用途に関する。特に、該エロンガーゼ酵素は、１つの脂肪酸から別の脂肪酸への変換に利用される。例えば、エロンガーゼは、γリノレン酸（ＧＬＡ）からジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３ｎ−６）への変換およびステアリドン酸（ＳＴＡ，１８：４ｎ−３）から（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３）への変換を触媒する。エロンガーゼはまた、アラキドン酸（ＡＡ，２０：４ｎ−６）からアドレン酸（ＡＤＡ，２２：４ｎ−６）への変換、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５ｎ−３）からω３−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）への変換、およびαリノレン酸（ＡＬＡ，１８：３ｎ−３）から２０：３ｎ−３への変換を触媒する。ＤＧＬＡは、例えば、医薬組成物、栄養組成物、動物飼料および他の製品（例えば、化粧品）に添加されうるアラキドン酸（ＡＡ）のような他の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の産生に利用されうる。
【０００２】
背景的情報
過去に同定されているエロンガーゼは、それらが作用する基質の点で異なる。さらに、それらは動物および植物の両方に存在する。哺乳類において見出されるものは、飽和、一価不飽和および多価不飽和脂肪酸に作用する能力を有する。これに対して、植物において見出されるものは、飽和または一価不飽和脂肪酸に特異的である。したがって、植物において多価不飽和脂肪酸を生成させるためには、ＰＵＦＡ特異的エロンガーゼが要求される。
【０００３】
植物および動物の両方においては、該伸長過程は４工程メカニズムの結果であると考えられている（Ｌａｓｓｎｅｒら，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：２８１−２９２（１９９６））。ＣｏＡがアシル運搬体である。工程１は、マロニル−ＣｏＡと長鎖アシル−ＣｏＡとの縮合を含み、これは、二酸化炭素およびβ−ケトアシル−ＣｏＡを生成し、ここで、該アシル部分は２炭素原子伸長されている。後続の反応は、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、および伸長化アシル−ＣｏＡを与える第２の還元を含む。該初期縮合反応は基質特異的段階であるばかりでなく、律速段階でもある。
【０００４】
前記のとおり、エロンガーゼ、より詳しくは、ＰＵＦＡを基質として利用するエロンガーゼは、多数の重要な機能を有する長鎖多価不飽和脂肪酸の産生において決定的に重要である。例えば、ＰＵＦＡは細胞の細胞膜の重要な成分であり、この部位においては、それらはリン脂質の形態で見出される。それらはまた、哺乳類プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンへの前駆体として機能する。さらに、ＰＵＦＡは、発達中の乳児の脳の適切な発達のために、ならびに組織の形成および修復のために必要である。ＰＵＦＡの生物学的重要性を考慮して、それら、およびそれらの製造につながる中間体を効率的に製造するための試みがなされている。
【０００５】
ＰＵＦＡの生合成には、エロンガーゼ（ｅｌｏ）を含む多数の酵素が関与している（図１を参照されたい）。例えば、リノール酸（ＬＡ，１８：２−Δ９，１２または１８：２ｎ−６）は、オレイン酸（ＯＡ，１８：１−Δ９または１８：１ｎ−９）からΔ１２ デサチュラーゼにより産生される。ＧＬＡ（１８：３−Δ６，９，１２）は、リノール酸からΔ６−デサチュラーゼにより産生される。ＡＡ（２０：４−Δ５，８，１１，１４）は、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３−Δ８，１１，１４）からΔ５−デサチュラーゼにより産生される。前記のとおり、ＤＧＬＡはＧＬＡからエロンガーゼにより産生される。
【０００６】
動物はΔ９位より後を不飽和化することができず、したがって、オレイン酸をリノール酸に変換することができないことに注意する必要がある。同様に、αリノレン酸（ＡＬＡ，１８：３−Δ９，１２，１５または１８：３ｎ−３）は哺乳類により合成されることが不可能である。なぜなら、それは、Δ１５デサチュラーゼ活性を欠くからである。しかし、哺乳類および藻類においては、αリノレン酸は、Δ６−デサチュラーゼによりステアリドン酸（ＳＴＡ，１８：４−Δ６，９，１２，１５）に変換され（ＰＣＴ公開ＷＯ ９６／１３５９１を参照されたい；また、米国特許第５，５５２，３０６号を参照されたい）、ついで（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４−Δ８，１１，１４，１７または２０：４ｎ−３）へ伸長されうる。ついで、この多価不飽和脂肪酸（すなわち、２０：４−Δ８，１１，１４，１７）は、Δ５−デサチュラーゼによりエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５−Δ５，８，１１，１４，１７）に変換されうる。真菌および植物を含む他の真核生物は、炭素１２（ＰＣＴ公開ＷＯ ９４／１１５１６および米国特許第５，４４３，９７４号を参照されたい）および１５（ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１１２４５を参照されたい）を不飽和化する酵素を有する。したがって、動物の主要な多価不飽和脂肪酸は、食餌に由来し、および／または、リノール酸またはαリノレン酸の不飽和化および伸長に由来する。哺乳類がこれらの必須長鎖脂肪酸を産生し得ないことを考慮すれば、これらの脂肪酸を天然で産生する種から、ＰＵＦＡ生合成に関与する遺伝子を単離すること、および１以上のＰＵＦＡの商業的量の産生をもたらすように改変されうる微生物、植物または動物系においてこれらの遺伝子を発現させることに、多大な関心が持たれる。したがって、エロンガーゼ酵素、該酵素をコードする遺伝子およびこの酵素の組換え製造方法に対する明らかな要求が存在する。また、天然に存在するＰＵＦＡレベルを超えるＰＵＦＡレベルを含有する油および新規ＰＵＦＡにおいて強化された油に対する要求も存在する。そのような油は、エロンガーゼ遺伝子の単離および発現によらなければ製造できない。
【０００７】
前記の最も重要な長鎖ＰＵＦＡの１つはアラキドン酸（ＡＡ）である。ＡＡは糸状菌において見出され、肝臓および副腎を含む哺乳類組織からも精製されうる。前記のとおり、ＤＧＬＡからのＡＡ産生はΔ５−デサチュラーゼにより触媒され、γリノレン酸（ＧＬＡ）からのＤＧＬＡ産生はエロンガーゼにより触媒される。しかし、本発明以前は、長鎖ＰＵＦＡ、特にＡＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、アドレン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，２２：６ｎ−３）、ω３−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）またはω６−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−６）の産生経路における基質脂肪酸上で活性であるエロンガーゼは同定されていなかった。
【０００８】
該エロンガーゼ遺伝子に関するこの探索においては、２つの遺伝子に関心が持たれているようであった。特に、ホホバβ−ケトアシル−補酵素Ａシンターゼ（ＫＣＳ）またはホホバＫＣＳ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３７０８８）は、脂肪アシル−ＣｏＡ伸長経路の初期反応（すなわち、マロニル−ＣｏＡと長鎖アシル−ＣｏＡとの縮合）を触媒する（Ｌａｓｓｎｅｒら，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：２８１−２９２ （１９９６））。ホホバＫＣＳ基質優先性は、１８：０、２０：０、２０：１、１８：１、２２：１、２２：０および１６：０である。また、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エロンガーゼ（ＥＬＯ２）は、長鎖飽和および一価不飽和脂肪酸の変換を触媒して、高レベルの２２：０、２４：０、そしてまた１８：０、１８：１、２０：０、２０：１、２２：０、２２：１および２４：１を与える（Ｏｈら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２（２８）：１７３７６−１７３８４（１９９７）；ＥＬＯ２の配列を含むヌクレオチド配列に関しては米国特許第５，４８４，７２４号も参照されたい；実施例Ｖに記載されているグリコシル化抑制因子の配列の考察に関してはＰＣＴ公開ＷＯ ８８／０７５７７を参照されたい）。モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）における長鎖ＰＵＦＡ特異的エロンガーゼに関する探索は、これらの２つの遺伝子間で共有された相同性の検討に基づいて、およびＰＵＦＡ−エロンガーゼ活性に関する発現スクリーニングにより始まった。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、配列番号１（図６）に示すヌクレオチド配列の少なくとも約５０％に対応する又は相補的な単離されたヌクレオチド配列に関する。この単離された配列は配列番号１で表されうる。該配列は、多価不飽和脂肪酸または一価不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードする。特に、該配列は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の真菌に由来することが可能であり、特に、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）から単離されうる。
【００１０】
本発明はまた、前記ヌクレオチド配列にコードされる精製されたタンパク質、および前記ヌクレオチド配列にコードされる精製されたタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％のアミノ酸類似性を有し多価不飽和脂肪酸または一価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチドを含む。
【００１１】
さらに、本発明は、ａ）配列番号１（図６）により表されるヌクレオチド配列を単離し、ｂ）ｉｉ）プロモーターに作動的に結合したｉ）該単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築し、ｃ）該エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件下、該ベクターを宿主細胞内に導入する工程を含んでなる、エロンガーゼ酵素の製造方法を含む。該宿主細胞は真核細胞または原核細胞でありうる。
【００１２】
該原核細胞は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、シアノバクテリア細胞または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞でありうる。該真核細胞は、例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞でありうる。該真菌細胞は、例えば、サッカロミセス種（サッカロミセスの種、すなわち、サッカロミセス属に属する真菌種）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、リポミセス種（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ヤロウィア種（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、ノイロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）またはピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）でありうる。特に、該真菌細胞は、酵母細胞、例えばサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．）またはピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）でありうる。
【００１３】
本発明はまた、ｂ）プロモーターに作動的に結合したａ）配列番号１（図６）により表されるヌクレオチド配列を含んでなるベクター、およびこのベクターを含んでなる宿主細胞を含む。該宿主は原核細胞または真核細胞でありうる。原核細胞の適当な具体例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シアノバクテリアおよび枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞が含まれる。真核細胞の適当な具体例には、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞および真菌細胞が含まれる。該真菌細胞は、例えば、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、リポミセス種（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ヤロウィア種（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、ノイロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）およびピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）でありうる。特に、該真菌細胞は、例えば、酵母細胞、例えばサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．）およびピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）でありうる。
【００１４】
本発明は、前記ベクターを含んでなる植物細胞、植物または植物組織を含み、ここで、該ベクターのヌクレオチド配列の発現は、該植物細胞、植物または植物組織による一価不飽和脂肪酸および多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの脂肪酸の産生をもたらす。該多価不飽和脂肪酸は、例えば、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、２０：４ｎ−３およびアドレン酸（ＡＤＡ）でありうる。本発明はまた、該植物細胞、植物または植物組織により発現された１以上の植物油または脂肪酸を含む。さらに、本発明は、前記ベクターを含んでなるトランスジェニック植物を含み、ここで、該ベクターのヌクレオチド配列の発現は、該トランスジェニック植物の種子内での多価不飽和脂肪酸の産生をもたらす。
【００１５】
さらに、本発明は、プロモーターに作動的に結合したエロンガーゼをコードするＤＮＡ配列を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む。該ＤＮＡ配列は配列番号１（図６）により表されうる。本発明はまた、トランスジェニック非ヒトにより産生された流体（例えば、乳）を含み、ここで、該流体は、検出可能なレベルの少なくとも１つのエロンガーゼまたはその産物、例えばＤＧＬＡ、ω６−ドコサペンタエン酸、ＡＤＡおよび／または２０：４ｎ−３を含む（図１を参照されたい）。
【００１６】
さらに、本発明は、ａ）配列番号１（図６）により表されるヌクレオチド配列を単離し、ｂ）該単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築し、ｃ）該単離ヌクレオチド配列にコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件下、該ベクターを宿主細胞内に導入し、ｄ）発現したエロンガーゼ酵素を「基質」多価不飽和脂肪酸にさらして、該基質を「産物」多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含んでなる、多価不飽和脂肪酸の製造方法を含む。該基質多価不飽和脂肪酸は、例えば、γリノレン酸（ＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＴＡ）およびアラキドン酸（ＡＡ）よりなる群から選ばれうる。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３およびＡＤＡよりなる群から選ばれうる。該方法は更に、該産物多価不飽和脂肪酸を少なくとも１つのデサチュラーゼにさらして、該産物多価不飽和脂肪酸を「別（の）」多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含みうる。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３およびＡＤＡよりなる群から選ばれうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＡＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ω６−ドコサペンタエン酸よりなる群から選ばれうる。前記の少なくとも１つのデサチュラーゼは、ＡＡまたはＥＰＡの製造の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の製造の場合にはΔ４−デサチュラーゼである。該方法は更に、該別多価不飽和脂肪酸を、少なくとも１つのエロンガーゼおよび少なくとも１つの追加的なデサチュラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素にさらして、該別多価不飽和脂肪酸を「最終」多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含みうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ＡＡ、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
【００１７】
また、本発明は、前記方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、前記方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および前記方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる栄養組成物を含む。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３およびＡＤＡよりなる群から選ばれうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡまたはω６−ドコサペンタエン酸でありうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。該栄養組成物は、例えば、乳児用配合乳、食事補足物（食事サプリメント）または食事代替物であることが可能であり、ヒトまたは動物に投与することが可能であり、経腸的または非経口的に投与することが可能である。該栄養組成物は更に、ヤシ油、大豆油、カノラ油、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、グルコース、食用ラクトース、電気透析乳清、電気透析脱脂乳、乳清、大豆タンパク質、タンパク質水解物、ヒマワリ油、サフラワー油、トウモロコシ油およびアマ油よりなる群から選ばれる少なくとも１つの主要栄養素を含みうる。それはまた、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＢ複合体ビタミンよりなる群から選ばれる少なくとも１つのビタミン、ならびにカルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレンおよび鉄よりなる群から選ばれる少なくとも１つの無機質（ミネラル）を含みうる。
【００１８】
さらに、本発明は、１）前記方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、前記方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および前記方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸と、２）医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を含む。該組成物はヒトまたは動物に投与することができる。また、それは更に、ビタミン、無機質、塩、炭水化物、アミノ酸、遊離脂肪酸、保存剤、添加剤、抗ヒスタミン剤、増殖因子、抗生物質、希釈剤、リン脂質、抗酸化剤およびフェノール性化合物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含みうる。それは、経腸的、非経口的、局所的、直腸内、筋肉内、皮下、皮内または任意の他の適当な手段により投与することができる。
【００１９】
本発明はまた、前記方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、前記方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および前記方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる動物飼料を含む。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３およびＡＤＡでありうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡまたはω６−ドコサペンタエン酸でありうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
【００２０】
さらに、本発明はまた、前記方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、前記方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および前記方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる多価不飽和脂肪酸を含んでなる化粧品を含む。
【００２１】
また、本発明は、多価不飽和脂肪酸の不十分な摂取または産生により引き起こされる症状の予防および治療方法であって、予防または治療をもたらすのに十分な量の前記栄養組成物をその患者に投与することを含んでなる予防および治療方法を含む。
【００２２】
本発明はまた、配列番号２（図２２）に示すヌクレオチド配列の少なくとも約３５％に対応する又は相補的な単離されたヌクレオチド配列を含む。この配列は配列番号２により表されうる。該配列は、多価不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードする。また、この配列は、例えば、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の真菌に由来しうる。特に、それは、モルティエレラ・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）に由来しうる。
【００２３】
さらに、本発明は、前記ヌクレオチド配列にコードされる精製されたタンパク質、および該精製タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％のアミノ酸類似性を有し多価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチドを含む。
【００２４】
本発明はまた、前記のとおりのエロンガーゼ酵素の製造方法を含む。該ベクター内に挿入する配列は配列番号２（図２２）により表される。該宿主細胞は原核性または真核性でありうる。適当な具体例は前記のとおりである。
【００２５】
本発明はまた、ｂ）プロモーターに作動的に結合したａ）配列番号２（図２２）により表されるヌクレオチド配列を含んでなるベクター、およびこのベクターを含んでなる宿主細胞を含む。この場合も、該宿主細胞は真核性または原核性でありうる。適当な具体例は前記のとおりである。
【００２６】
本発明は、前記ベクターを含んでなる植物細胞、植物または植物組織を含み、ここで、該ベクターのヌクレオチド配列の発現は、該植物細胞、植物または植物組織による多価不飽和脂肪酸の産生をもたらす。該多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはＡＤＡでありうる。さらに、本発明は、該植物細胞、植物または植物組織により発現された１以上の植物油または脂肪酸を含む。
【００２７】
さらに、本発明は、前記ベクターを含んでなるトランスジェニック植物を含み、ここで、該ベクターのヌクレオチド配列（配列番号２）の発現は、該トランスジェニック植物の種子内での多価不飽和脂肪酸の産生をもたらす。
【００２８】
本発明はまた、プロモーターに作動的に結合したエロンガーゼをコードするＤＮＡ配列（配列番号２）を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む。本発明はまた、このトランスジェニック非ヒト哺乳動物により産生された流体（例えば、乳）を含み、ここで、該流体は、検出可能なレベルの少なくとも１つのエロンガーゼまたはその産物を含む。
【００２９】
本発明はまた、ａ）配列番号２（図２２）により表されるヌクレオチド配列を単離し、ｂ）該単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築し、ｃ）該単離ヌクレオチド配列にコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件下、該ベクターを宿主細胞内に導入し、ｄ）発現したエロンガーゼ酵素を基質多価不飽和脂肪酸にさらして、該基質を産物多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含んでなる、多価不飽和脂肪酸の製造方法を含む。該基質多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＧＬＡ、ＳＴＡまたはＡＡでありうる。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはω６−ドコサペンタエン酸でありうる。該方法は更に、発現したエロンガーゼ酵素を少なくとも１つのデサチュラーゼにさらして、該産物多価不飽和脂肪酸を別（の）多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含みうる。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはＡＤＡでありうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＡＡ、ＥＰＡ、ω６−ドコサペンタエン酸でありうる。前記の少なくとも１つのデサチュラーゼは、ＡＡまたはＥＰＡの製造の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の製造の場合にはΔ４−デサチュラーゼである。該方法は更に、該別多価不飽和脂肪酸を、少なくとも１つのエロンガーゼおよび少なくとも１つの追加的なデサチュラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素にさらして、該別多価不飽和脂肪酸を「最終」多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含みうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ドコサヘキサエン酸、ＡＡ、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
【００３０】
本発明はまた、配列番号２に関して記載された方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、配列番号２に関して記載された方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および配列番号２に関して記載された方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる栄養組成物を含む。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３およびＡＤＡよりなる群から選ばれうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡまたはω６−ドコサペンタエン酸よりなる群から選ばれうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸およびω３−ドコサペンタエン酸よりなる群から選ばれうる。該組成物のその他の特性は、投与、特徴づけ、成分などに関して前記したのと同じである。
【００３１】
本発明はまた、１）配列番号２に関して前記した方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、配列番号２に関して前記した方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および配列番号２に関して前記した方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸と、２）医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を含む。前記医薬組成物の特徴（例えば、投与、成分など）はこの組成物にも当てはまる。
【００３２】
本発明はまた、配列番号２に関して記載された方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、配列番号２に関して前記した方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および配列番号２に関して記載された方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる動物飼料を含む。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはＡＤＡでありうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡまたはω６−ドコサペンタエン酸でありうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
【００３３】
本発明はまた、配列番号２に関して前記した方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、配列番号２に関して前記した方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および配列番号２に関して前記した方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる多価不飽和脂肪酸を含んでなる化粧品を含む。
【００３４】
また、本発明は、多価不飽和脂肪酸の不十分な摂取または産生により引き起こされる症状の予防および治療方法であって、該予防または治療をもたらすのに十分な量の直前に記載した栄養組成物をその患者に投与することを含んでなる予防および治療方法を含む。
【００３５】
さらに、本発明は、配列番号３（図４３）に示すヌクレオチド配列の少なくとも約３５％に対応する又は相補的な単離されたヌクレオチド配列を含む。この配列は配列番号３により表されるものでありうる。該配列は、多価不飽和脂肪酸または一価不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードする。該配列は、哺乳類、例えばヒトに由来する。
【００３６】
本発明はまた、このヌクレオチド配列にコードされる精製されたタンパク質を含む。また、本発明は、この精製タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％のアミノ酸類似性を有し多価不飽和脂肪酸または一価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチドを含む。
【００３７】
さらに、本発明は、ａ）配列番号３（図４３）により表されるヌクレオチド配列を単離し、ｂ）ｉｉ）プロモーターに作動的に結合したｉ）該単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築し、ｃ）該エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件下、該ベクターを宿主細胞内に導入する工程を含んでなる、エロンガーゼ酵素の製造方法を含む。該宿主細胞は、配列番号１または２を使用する対応方法に関して前記したものと同じでありうる。
【００３８】
本発明はまた、ｂ）プロモーターに作動的に結合したａ）配列番号３（図４３）により表されるヌクレオチド配列を含んでなるベクター、およびこのベクターを含んでなる宿主細胞を含む。該宿主細胞は、前記のものと同じでありうる。
【００３９】
本発明はまた、配列番号３を含む前記ベクターを含んでなる植物細胞、植物または植物組織を含み、ここで、該ベクターのヌクレオチド配列の発現は、該植物細胞、植物または植物組織による一価不飽和脂肪酸および多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの脂肪酸の産生をもたらす。該多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはＡＤＡでありうる。本発明はまた、該植物細胞、植物または植物組織により発現された１以上の植物油または酸を含む。
【００４０】
さらに、本発明は、配列番号３を含むベクターを含んでなるトランスジェニック植物を含み、ここで、該ベクターのヌクレオチド配列の発現は、該トランスジェニック植物の種子内での多価不飽和脂肪酸の産生をもたらす。
【００４１】
さらに、本発明は、プロモーターに作動的に結合したエロンガーゼをコードするヒトＤＮＡ配列を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む。該ＤＮＡ配列は配列番号３（図４３）により表される。本発明はまた、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物により産生された流体を含み、ここで、該流体は、検出可能なレベルの少なくとも１つのエロンガーゼまたはその産物を含む。
【００４２】
本発明はまた、ａ）配列番号３（図４３）により表されるヌクレオチド配列を単離し、ｂ）該ヌクレオチド配列を含むベクターを構築し、ｃ）該単離ヌクレオチド配列にコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件下、該ベクターを宿主細胞内に導入し、ｄ）発現したエロンガーゼ酵素を基質多価不飽和脂肪酸にさらして、該基質を産物多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含んでなる、多価不飽和脂肪酸の製造方法を含む。該基質多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＧＬＡ、ＳＴＡまたはＡＡでありうる。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはＡＤＡでありうる。該方法は更に、該産物多価不飽和脂肪酸を少なくとも１つのデサチュラーゼにさらして、該産物多価不飽和脂肪酸を別（の）多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含みうる。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３およびＡＤＡでありうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＡＡ、ＥＰＡおよびω６−ドコサペンタエン酸でありうる。前記の少なくとも１つのデサチュラーゼは、ＡＡまたはＥＰＡの製造の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の製造の場合にはΔ４−デサチュラーゼである。該方法は更に、該別多価不飽和脂肪酸を、少なくとも１つのエロンガーゼおよび少なくとも１つの追加的なデサチュラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素にさらして、該別多価不飽和脂肪酸を最終多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含みうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸およびω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
【００４３】
本発明はまた、例えば、配列番号３に関して前記した方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、配列番号３に関して前記した方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および配列番号３に関して前記した方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸でありうる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる栄養組成物を含む。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはＡＤＡでありうる。該別多価不飽和脂肪酸は、ＡＡ、ＥＰＡまたはω６−ドコサペンタエン酸よりなる群から選ばれうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。該栄養組成物のその他の特性または特徴（例えば、投与、成分など）は、その他の栄養組成物に関して前記したものと同じである。
【００４４】
さらに、本発明はまた、１）配列番号３に関して前記した方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、配列番号３に関して前記した方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および配列番号３に関して前記した方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸と、２）医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を含む。該組成物のその他の特性（例えば、投与、追加的成分など）は、その他の医薬組成物に関して前記したものと同じである。
【００４５】
本発明はまた、配列番号３に関して前記した方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、配列番号３に関して前記した方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および配列番号３に関して前記した方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる動物飼料を含む。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはＡＤＡでありうる。該多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡまたはω６−ドコサペンタエン酸でありうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
【００４６】
また、本発明は、配列番号３に関して前記した方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、配列番号３に関して前記した方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および配列番号３に関して前記した方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる多価不飽和脂肪酸を含んでなる化粧品を含む。
【００４７】
多価不飽和脂肪酸の不十分な摂取または産生により引き起こされる症状の予防および治療方法は、該予防または治療をもたらすのに十分な量の配列番号３に関して前記した栄養組成物をその患者に投与することを含む。
【００４８】
さらに、本発明は、配列番号４（図４６）に示すヌクレオチド配列の少なくとも約３５％に対応する又は相補的な単離されたヌクレオチド配列を含む。該配列は配列番号４により表されうる。それは、多価不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードする。該配列はセノラブディティス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）属の線虫に由来する又はそれから単離されることが可能であり、特に、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）から単離されうる。
【００４９】
本発明は、前記ヌクレオチド配列にコードされる精製されたタンパク質を含む。また、本発明はまた、該精製タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％のアミノ酸類似性を有し多価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチドを含む。
【００５０】
さらに、本発明は、ａ）配列番号４（図４６）により表されるヌクレオチド配列を単離し、ｂ）ｉｉ）プロモーターに作動的に結合したｉ）該単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築し、ｃ）該エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件下、該ベクターを宿主細胞内に導入する工程を含んでなる、エロンガーゼ酵素の製造方法を含む。該宿主細胞の特性は、配列番号１、配列番号２および配列番号３に関して前記したものと同じである。
【００５１】
本発明はまた、ｂ）プロモーターに作動的に結合したａ）配列番号４（図４６）により表されるヌクレオチド配列を含んでなるベクター、およびこのベクターを含んでなる宿主細胞を含む。該宿主細胞は、配列番号１、配列番号２および配列番号３に関して前記した宿主細胞に関して前記したものと同じ特性を有する。
【００５２】
さらに、本発明は、配列番号４を含む前記ベクターを含んでなる植物細胞、植物または植物組織を含み、ここで、該ベクターのヌクレオチド配列の発現は、該植物細胞、植物または植物組織による多価不飽和脂肪酸の産生をもたらす。該多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはＡＤＡでありうる。本発明はまた、この植物細胞、植物または植物組織により発現された１以上の植物油または脂肪酸を含む。
【００５３】
本発明はまた、配列番号４に対応するヌクレオチド配列を含む前記ベクターを含んでなるトランスジェニック植物を含み、ここで、該ベクターのヌクレオチド配列の発現は、該トランスジェニック植物の種子内での多価不飽和脂肪酸の産生をもたらす。
【００５４】
さらに、本発明は、プロモーターに作動的に結合したエロンガーゼをコードするシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ＤＮＡ配列を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む。該ＤＮＡ配列は配列番号４（図４６）により表される。本発明はまた、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物により産生された流体を含み、ここで、該流体は、検出可能なレベルの少なくとも１つのエロンガーゼまたはその産物を含む。
【００５５】
本発明はまた、ａ）配列番号４（図４６）により表されるヌクレオチド配列を単離し、ｂ）該単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築し、ｃ）該単離ヌクレオチド配列にコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件下、該ベクターを宿主細胞内に導入し、ｄ）発現したエロンガーゼ酵素を基質多価不飽和脂肪酸にさらして、該基質を産物多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含んでなる、多価不飽和脂肪酸の製造方法を含む。該基質多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＧＬＡ、ＳＴＡまたはＡＡでありうる。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはＡＤＡでありうる。該方法は更に、発現されたエロンガーゼ酵素を少なくとも１つのデサチュラーゼにさらして、該産物多価不飽和脂肪酸を別（の）多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含みうる。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはＡＤＡでありうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＡＡ、ＥＰＡまたはω６−ドコサペンタエン酸でありうる。前記の少なくとも１つのデサチュラーゼは、ＡＡまたはＥＰＡの製造の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の製造の場合にはΔ４−デサチュラーゼである。該方法は更に、該別多価不飽和脂肪酸を、少なくとも１つのエロンガーゼおよび少なくとも１つの追加的なデサチュラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素にさらして、該別多価不飽和脂肪酸を最終多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含みうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
【００５６】
本発明はまた、例えば、配列番号４に関して前記した方法により製造された前記多価不飽和脂肪酸、配列番号４に関して前記した方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および配列番号４に関して前記した方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸でありうる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる栄養組成物を含む。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはＡＤＡでありうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡまたはω６−ドコサペンタエン酸でありうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。該組成物のその他の特徴は、前記栄養組成物に関して記載されているものと同じである。
【００５７】
さらに、本発明はまた、１）配列番号４に関して前記した方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、配列番号４に関して前記した方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および配列番号４に関して前記した方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸と、２）医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を含む。該組成物は、その他の医薬組成物に関して前記したものと同じ特性（例えば、投与、添加成分など）を有する。
【００５８】
本発明はまた、配列番号４に関して前記した方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、配列番号４に関して前記した方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および配列番号４に関して前記した方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる動物飼料を含む。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３またはＡＤＡでありうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡまたはω６−ドコサペンタエン酸でありうる。該多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
【００５９】
また、本発明は、配列番号４に関して前記した方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、配列番号４に関して前記した方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および配列番号４に関して前記した方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる多価不飽和脂肪酸を含んでなる化粧品を含む。
【００６０】
さらに、本発明は、多価不飽和脂肪酸の不十分な摂取または産生により引き起こされる症状の予防および治療方法であって、該治療または予防をもたらすのに十分な量の配列番号４に関して前記した栄養組成物をその患者に投与することを含んでなる方法を含む。
【００６１】
本発明はまた、配列番号５（図５４）を含むヌクレオチド配列の少なくとも約３５％に対応する又は相補的な単離されたヌクレオチド配列を含む。したがって、該配列は配列番号５により表されるものでありうる。該配列は、多価不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードしうる。それはまた、哺乳類、例えばマウスに由来しうる。本発明はまた、該ヌクレオチド配列にコードされる精製されたタンパク質、および該タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％のアミノ酸類似性を有し多価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチドを含む。
【００６２】
さらに、本発明はまた、前記のとおりのエロンガーゼ酵素の製造方法を含む。この場合、単離されたヌクレオチド配列は配列番号５または配列番号６を含む。使用する宿主細胞は前記のとおりでありうる。
【００６３】
本発明はまた、ｂ）プロモーターに作動的に結合したａ）配列番号５（図５４）を含むヌクレオチド配列（または配列番号６（図５８）を含むヌクレオチド配列）を含んでなるベクター、およびこのベクターを含んでなる宿主細胞を含む。この場合も、該宿主細胞は、本発明のその他のヌクレオチド配列を使用する関連方法に関して前記したとおりでありうる。
【００６４】
さらに、本発明は、配列番号５または６を含むベクターを含んでなる植物細胞、植物または植物組織を含み、ここで、該ベクターのヌクレオチド配列の発現は、該植物細胞、植物または植物組織による多価不飽和脂肪酸の産生をもたらす。該ベクターのヌクレオチド配列が配列番号５を含む場合には、該多価不飽和脂肪酸は、ＡＡ、ＡＤＡ、ＧＬＡおよびＳＴＡよりなる群から選ばれる。本発明はまた、該植物細胞、植物または植物組織により発現された１以上の植物油または酸を含む。
【００６５】
本発明はまた、前記ベクターを含んでなるトランスジェニック植物を含み、ここで、該ベクターのヌクレオチド配列の発現は、該トランスジェニック植物の種子内での多価不飽和脂肪酸の産生をもたらす。
【００６６】
さらに、本発明は、プロモーターに作動的に結合したエロンガーゼをコードするＤＮＡ配列を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含み、ここで、該ＤＮＡ配列は配列番号５（図５４）（または配列番号６（図５８））を含む。また、本発明は、このトランスジェニック非ヒト哺乳動物により産生された流体を含み、ここで、該流体は、検出可能なレベルの少なくとも１つのエロンガーゼまたはその産物を含む。
【００６７】
本発明はまた、単離されたヌクレオチド配列が配列番号５（図５４）を含むこと以外は前記方法に類似した、多価不飽和脂肪酸の製造方法を含む。該基質多価不飽和脂肪酸は、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＡ、ＡＤＡおよびＡＬＡよりなる群から選ばれうる。該産物多価不飽和脂肪酸は、それぞれＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸およびＳＴＡよりなる群から選ばれうる。該方法は更に、発現されたエロンガーゼ酵素を少なくとも１つのデサチュラーゼにさらして、該産物多価不飽和脂肪酸を別（の）多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含みうる。該産物多価不飽和脂肪酸は、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、ＡＤＡおよびω６−ドコサペンタエン酸よりなる群から選ばれうる。該別多価不飽和脂肪酸は、それぞれＡＡ、ＥＰＡ、ω６−ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選ばれうる。前記の少なくとも１つのデサチュラーゼは、ＡＡまたはＥＰＡの製造の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の製造の場合にはΔ４−デサチュラーゼであり、ドコサヘキサエン酸の製造の場合にはΔ１９−デサチュラーゼである。該方法は更に、該別多価不飽和脂肪酸を、少なくとも１つのエロンガーゼおよび少なくとも１つの追加的なデサチュラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素にさらして、該別多価不飽和脂肪酸を最終多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含みうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、ＡＤＡ、ω３−ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選ばれうる。
【００６８】
本発明はまた、前記方法により製造された前記多価不飽和脂肪酸、前記方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および前記方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる栄養組成物を含む。該産物多価不飽和脂肪酸は、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、ＡＤＡ、およびω６−ドコサペンタエン酸およびＳＴＡよりなる群から選ばれうる。該別多価不飽和脂肪酸は、ＡＡ、ＥＰＡ、ω６−ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選ばれる。該最終多価不飽和脂肪酸は、ＡＤＡ、ω３−ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選ばれる。該栄養組成物は、幼児用配合乳、食事補足物（食事サプリメント）および食事代替物よりなる群から選ばれうる。
【００６９】
本発明はまた、１）前記方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、前記方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および前記方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸と、２）医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を含む。
【００７０】
さらに、本発明は、前記方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、前記方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および前記方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる動物飼料を含む。該産物多価不飽和脂肪酸は、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸およびＳＴＡよりなる群から選ばれうる。該別多価不飽和脂肪酸は、ＡＡ、ＥＰＡ、ω６−ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選ばれうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、ＡＤＡ、ω３−ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選ばれうる。
【００７１】
本発明は、前記方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、前記方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および前記方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる多価不飽和脂肪酸を含んでなる化粧品を含む。
【００７２】
さらに、本発明は、多価不飽和脂肪酸の不十分な摂取または産生により引き起こされる症状の予防および治療方法であって、該予防または治療をもたらすのに十分な量の前記栄養組成物をその患者に投与することを含んでなる方法を含む。
【００７３】
本発明は、配列番号６（図５８）を含むヌクレオチド配列の少なくとも約３５％に対応する又は相補的な単離されたヌクレオチド配列に関する。該単離ヌクレオチド配列は配列番号６を含みうる。本発明はまた、該ヌクレオチド配列にコードされる精製されたタンパク質を含む。
【００７４】
さらに、本発明は、配列番号７（図７２）に示すヌクレオチド配列の少なくとも約３５％に対応する又は相補的な単離されたヌクレオチド配列に関する。この単離ヌクレオチド配列は配列番号７により表されうる。該配列は、多価不飽和脂肪酸または一価不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードする。特に、該配列は、スラウストチトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）（ヤブレツボカビ）属の真菌に由来することが可能であり、特に、スラウストチトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）から単離されうる。
【００７５】
本発明はまた、前記ヌクレオチド配列にコードされる精製されたタンパク質、および前記ヌクレオチド配列にコードされる精製されたタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％のアミノ酸類似性を有し多価不飽和脂肪酸または一価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチドを含む。
【００７６】
さらに、本発明は、ａ）配列番号７（図７２）により表されるヌクレオチド配列を単離し、ｂ）ｉｉ）プロモーターに作動的に結合したｉ）該単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築し、ｃ）該エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件下、該ベクターを宿主細胞内に導入する工程を含んでなる、エロンガーゼ酵素の製造方法を含む。該宿主細胞は真核細胞または原核細胞でありうる。
【００７７】
該原核細胞は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、シアノバクテリア細胞または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞でありうる。該真核細胞は、例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞でありうる。該真菌細胞は、例えば、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、リポミセス種（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ヤロウィア種（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、ノイロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）またはピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）でありうる。特に、該真菌細胞は、酵母細胞、例えばサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．）またはピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）でありうる。
【００７８】
本発明はまた、ｂ）プロモーターに作動的に結合したａ）配列番号７（図７２）により表されるヌクレオチド配列を含んでなるベクター、およびこのベクターを含んでなる宿主細胞を含む。該宿主は原核細胞または真核細胞でありうる。原核細胞の適当な具体例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シアノバクテリアおよび枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞が含まれる。真核細胞の適当な具体例には、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞および真菌細胞が含まれる。該真菌細胞は、例えば、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、リポミセス種（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ヤロウィア種（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、ノイロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）およびピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）でありうる。特に、該真菌細胞は、例えば、酵母細胞、例えばサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．）およびピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）でありうる。
【００７９】
本発明は、前記ベクターを含んでなる植物細胞、植物または植物組織を含み、ここで、該ベクターのヌクレオチド配列の発現は、該植物細胞、植物または植物組織による一価不飽和脂肪酸および多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの脂肪酸の産生をもたらす。該多価不飽和脂肪酸は、例えば、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、２０：４ｎ−３およびアドレン酸（ＡＤＡ）でありうる。本発明はまた、該植物細胞、植物または植物組織により発現された１以上の植物油または脂肪酸を含む。さらに、本発明は、前記ベクターを含んでなるトランスジェニック植物を含み、ここで、該ベクターのヌクレオチド配列の発現は、該トランスジェニック植物の種子内での多価不飽和脂肪酸の産生をもたらす。
【００８０】
さらに、本発明は、プロモーターに作動的に結合したエロンガーゼをコードするＤＮＡ配列を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む。該ＤＮＡ配列は配列番号７（図７２）により表されうる。本発明はまた、トランスジェニック非ヒトにより産生された流体（例えば、乳）を含み、ここで、該流体は、検出可能なレベルの少なくとも１つのエロンガーゼまたはその産物、例えばＤＧＬＡ、ω６−ドコサペンタエン酸、ＡＤＡおよび／または２０：４ｎ−３を含む（図１を参照されたい）。
【００８１】
さらに、本発明は、ａ）配列番号７（図７２）により表されるヌクレオチド配列を単離し、ｂ）該単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築し、ｃ）該単離ヌクレオチド配列にコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件下、該ベクターを宿主細胞内に導入し、ｄ）発現したエロンガーゼ酵素を「基質」多価不飽和脂肪酸にさらして、該基質を「産物」多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含んでなる、多価不飽和脂肪酸の製造方法を含む。該基質多価不飽和脂肪酸は、例えば、γリノレン酸（ＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＴＡ）およびアラキドン酸（ＡＡ）よりなる群から選ばれうる。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３およびＡＤＡよりなる群から選ばれうる。該方法は更に、該産物多価不飽和脂肪酸を少なくとも１つのデサチュラーゼにさらして、該産物多価不飽和脂肪酸を「別（の）」多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含みうる。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３およびＡＤＡよりなる群から選ばれうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＡＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ω６−ドコサペンタエン酸よりなる群から選ばれうる。前記の少なくとも１つのデサチュラーゼは、ＡＡまたはＥＰＡの製造の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の製造の場合にはΔ４−デサチュラーゼである。該方法は更に、該別多価不飽和脂肪酸を、少なくとも１つのエロンガーゼおよび少なくとも１つの追加的なデサチュラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素にさらして、該別多価不飽和脂肪酸を「最終」多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含みうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ＡＡ、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
【００８２】
また、本発明は、前記方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、前記方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および前記方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる栄養組成物を含む。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３およびＡＤＡよりなる群から選ばれうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡまたはω６−ドコサペンタエン酸でありうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。該栄養組成物は、例えば、乳児用配合乳、食事補足物（食事サプリメント）または食事代替物であることが可能であり、ヒトまたは動物に投与することが可能であり、経腸的または非経口的に投与することが可能である。該栄養組成物は更に、ヤシ油、大豆油、カノラ油、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、グルコース、食用ラクトース、電気透析乳清、電気透析脱脂乳、乳清、大豆タンパク質、タンパク質水解物、ヒマワリ油、サフラワー油、トウモロコシ油およびアマ油よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多量栄養素を含みうる。それはまた、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＢ複合体ビタミンよりなる群から選ばれる少なくとも１つのビタミン、ならびにカルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレンおよび鉄よりなる群から選ばれる少なくとも１つの無機質（ミネラル）を含みうる。
【００８３】
さらに、本発明は、１）前記方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、前記方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および前記方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸と、２）医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を含む。該組成物はヒトまたは動物に投与することができる。また、それは更に、ビタミン、無機質、塩、炭水化物、アミノ酸、遊離脂肪酸、保存剤、添加剤、抗ヒスタミン剤、増殖因子、抗生物質、希釈剤、リン脂質、抗酸化剤およびフェノール性化合物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含みうる。それは、経腸的、非経口的、局所的、直腸内、筋肉内、皮下、皮内または任意の他の適当な手段により投与することができる。
【００８４】
本発明はまた、前記方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、前記方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および前記方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる動物飼料を含む。該産物多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３およびＡＤＡでありうる。該別多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡまたはω６−ドコサペンタエン酸でありうる。該最終多価不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸またはω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
【００８５】
さらに、本発明はまた、前記方法により製造された産物多価不飽和脂肪酸、前記方法により製造された別（の）多価不飽和脂肪酸、および前記方法により製造された最終多価不飽和脂肪酸よりなる群から選ばれる多価不飽和脂肪酸を含んでなる化粧品を含む。
【００８６】
また、本発明は、多価不飽和脂肪酸の不十分な摂取または産生により引き起こされる症状の予防および治療方法であって、予防または治療をもたらすのに十分な量の前記栄養組成物をその患者に投与することを含んでなる方法を含む。
【００８７】
本明細書中に言及されているすべての米国特許および刊行物の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００８８】
（図面の簡単な記載）
図１は、種々の脂肪酸の生合成経路を表す。エロンガーゼ酵素（ｅｌｏ）の役割に注目すべきである。
【００８９】
図２は、ホホバＫＣＳおよびＥＬＯ２のアミノ酸配列間の類似性（％）および同一性（％）を表す。
【００９０】
図３は、図２のホホバＫＣＳ配列に相同なエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ２配列を表す（プライマー配列が下線で示されている）。
【００９１】
図４Ａは、ＭＡＥＬＯ ｃＤＮＡを含有するｐＲＡＥ−２の物理的地図を示す。図４Ｂは、酵母内でのエロンガーゼ酵素の製造に使用する構成的発現ベクターｐＲＡＥ−５の物理的地図を表す。
【００９２】
図５は、クローンｐＲＡＥ−５およびｐＲＡＥ−６のヌクレオチド配列の比較を表す。
【００９３】
図６は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）の完全なヌクレオチド配列を示す。
【００９４】
図７は、ＭＡＥＬＯ（図６を参照されたい）から翻訳されたモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼのアミノ酸配列を表す。
【００９５】
図８は、３つのエロンガーゼ、すなわち、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）および図７に示す翻訳されたＭＡＥＬＯ配列の間のアミノ酸配列アライメントを表す。
【００９６】
図９は、ヌクレオチド配列ＭＡＥＬＯとエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＥＬＯ２のヌクレオチド配列との比較を表す。
【００９７】
図１０Ａおよび１０Ｂは、パン酵母内で発現されたＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【００９８】
図１１は、ＡＡを製造するためにエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）由来のΔ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共に共発現した場合のＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【００９９】
図１２は、パン酵母内でのエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＥＬＯ２の過剰発現とＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を比較している。
【０１００】
図１３、１４および１５は、ＧｅｎＥＭＢＬデータベースにおけるシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ヌクレオチド配列由来のアミノ酸配列の、翻訳されたＭＡＥＬＯとの３つの別々の比較を表す。
【０１０１】
図１６は、該翻訳ＭＡＥＬＯおよびＧｅｎＥＭＢＬデータベースにおける２つの異なる哺乳類配列のアミノ酸翻訳間の比較を示す。
【０１０２】
図１７は、データーベース検索中に検出された、ＭＡＥＬＯ由来のアミノ酸配列と、翻訳されたＤＮＡ配列（公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ８８／０７５７７を参照されたい）の比較を示す。
【０１０３】
図１８は、エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）由来のΔ５−デサチュラーゼの完全なヌクレオチド配列を示す。
【０１０４】
図１９は、ＭＡＤ７０８プールの初期ＧＣ−ＦＡＭＥ分析を表す。ＤＧＬＡ（Ｃ２０：３ｎ−６）ピークの検出に注目すべきである。
【０１０５】
図２０は、ＧＬＡを基質として使用した場合の酵母における５つのＭＡＤ７０８クローンのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。すべてのクローンが明らかなエロンガーゼ活性を有している。
【０１０６】
図２１は、プラスミドｐＲＰＢ２のＤＮＡ配列分析を表す。該分析は９５７ｂｐ長のオープンリーディングフレームを示している。
【０１０７】
図２２は、プラスミドｐＲＰＢ２内に含有されているエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を示し、それはそのＧＬＡエロンガーゼ活性にちなんでＧＬＥＬＯと称される。
【０１０８】
図２３は、ＧＬＥＬＯ（図２２を参照されたい）から翻訳されたエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼのアミノ酸配列を表す。
【０１０９】
図２４は、ＧＬＡで補足された３３４（ｐＲＰＢ２）の誘導培養内でのｎ−６ ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【０１１０】
図２５は、２５μＭの他の脂肪酸基質で補足された３３４（ｐＲＰＢ２）の誘導培養内でのｎ−３およびｎ−６ ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【０１１１】
図２６Ａは、ＡＡを製造するためにエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共に共発現させ基質としてＧＬＡを使用した場合のＧＬＥＬＯのエロンガーゼ活性を示す。図２６Ｂは、ＥＰＡを製造するためにエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共に共発現させ基質としてＳＴＡを使用した場合のＧＬＥＬＯのエロンガーゼ活性を示す。
【０１１２】
図２７は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列（図２３を参照されたい）と翻訳されたＭＡＥＬＯ配列（図７を参照されたい）との比較を示す。
【０１１３】
図２８は、４つのエロンガーゼのアミノ酸配列、すなわち、ＧＬＥＬＯの翻訳されたアミノ酸配列（図２３を参照されたい）、ＭＡＥＬＯ（図７を参照されたい）、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）およびエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）の比較を表す。ヒスチジンボックスが下線で示されている。
【０１１４】
図２９は、翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定ヒトホモログＨＳ１配列とのアライメントを表す。
【０１１５】
図３０は、翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定ヒトホモログＨＳ２配列とのアライメントを表す。
【０１１６】
図３１は、翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定マウスホモログＭＭ２配列とのアライメントを表す。
【０１１７】
図３２は、翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定マウスホモログＡＩ２２５６３２配列とのアライメントを表す。
【０１１８】
図３３は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳されたヒトホモログＡＩ８１５９６０配列とのアライメントを表す。
【０１１９】
図３４は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定ヒトホモログＨＳ１配列とのアライメントを表す。
【０１２０】
図３５は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列とＡＣ００４０５０由来の翻訳された推定ヒトホモログ配列とのアライメントを表す。
【０１２１】
図３６は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定マウスホモログＭＭ２配列とのアライメントを表す。
【０１２２】
図３７は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定マウスホモログＡＩ２２５６３２配列とのアライメントを表す。
【０１２３】
図３８は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定マウスホモログＵ９７１０７とのアライメントを表す。
【０１２４】
図３９は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Ｕ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）ホモログ配列とのアライメントを表す。
【０１２５】
図４０は、翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Ｕ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）ホモログ配列とのアライメントを表す。
【０１２６】
図４１は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ホモログ配列ＤＭ１とのアライメントを表す。
【０１２７】
図４２は、翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ホモログ配列ＤＭ１とのアライメントを表す。
【０１２８】
図４３は、ヒトエロンガーゼＨＳＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を示す。
【０１２９】
図４４は、ヒトエロンガーゼＨＳＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を示す。
【０１３０】
図４５は、ＧＬＡまたはＡＡで補足された場合の３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）の誘導培養のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡなど）を示す。
【０１３１】
図４６は、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）エロンガーゼＣＥＥＬＯの完全なヌクレオチド配列を示す。
【０１３２】
図４７は、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）エロンガーゼＣＥＥＬＯの推定アミノ酸を表す。
【０１３３】
図４８は、ＧＬＡおよびＡＡで補足された場合の３３４（ｐＲＥＴ−２１）および３３４（ｐＲＥＴ−２２）の誘導培養のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【０１３４】
図４９は、推定ヒトエロンガーゼ遺伝子ＨＳ３の完全なヌクレオチド配列を表す。
【０１３５】
図５０は、推定ヒトエロンガーゼ酵素ＨＳ３の推定アミノ酸配列を示す。
【０１３６】
図５１は、ＧＬＡ、ＡＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、ＯＡまたはＡＬＡで補足された場合のパン酵母内で発現されたＨＳＥＬＯ１のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡなど）を表す。
【０１３７】
図５２は、２５ｍＭまたは１００ｍＭのＧＬＡ、ＡＡまたはＥＰＡで補足された場合のパン酵母内で発現されたＨＳＥＬＯ１のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡなど）を表す。
【０１３８】
図５３Ａ、５３Ｂおよび５３Ｃは、ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡで補足された場合あるいは基質が存在しない場合のパン酵母内で発現されたＨＳＥＬＯ１のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡなど）を表す。
【０１３９】
図５４は、マウスエロンガーゼＭＥＬＯ４の完全なヌクレオチド配列を表す。
【０１４０】
図５５は、マウスエロンガーゼＭＥＬＯ４の推定アミノ酸配列を表す。
【０１４１】
図５６は、ＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡで補足された場合のパン酵母内で発現されたＭＥＬＯ４のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【０１４２】
図５７Ａ、５７Ｂおよび５７Ｃは、ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡで補足された場合あるいは基質が存在しない場合のパン酵母内で発現されたＭＥＬＯ４のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【０１４３】
図５８は、マウスエロンガーゼＭＥＬＯ７の完全なヌクレオチド配列を表す。
【０１４４】
図５９は、マウスエロンガーゼＭＥＬＯ７の推定アミノ酸配列を表す。
【０１４５】
図６０は、ＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡで補足された場合のパン酵母内で発現されたＭＥＬＯ７のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡなど）を表す。
【０１４６】
図６１は、基質が存在しない場合およびＡＡまたはＧＬＡの添加を伴う場合の酵母内で発現されたシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）エロンガーゼの活性を示す。
【０１４７】
図６２は、５０μＭの種々の基質で補足された場合の３３４（ｐＲＥＴ２２）の誘導培養のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【０１４８】
図６３は、それぞれＡＡまたはＥＰＡを製造するために基質としてＧＬＡ（図６３Ａ）またはＳＴＡ（図６３Ｂ）を使用し、エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共に共発現させた場合のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【０１４９】
図６４は、４つのエロンガーゼ、ＨＳＥＬＯ１（図４４）、ＭＥＬＯ４（図５５）、ＧＬＥＬＯ（図２３）およびＣＥＥＬＯ（図４７）の間のアミノ酸配列アライメントを表す。
【０１５０】
図６５は、部分スラウストチトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）（ティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ））７０９１エロンガーゼ遺伝子のコンセンサスヌクレオチド配列を表す。
【０１５１】
図６６は、図６５のティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼ遺伝子の推定アミノ酸配列を表す。
【０１５２】
図６７は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ１からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【０１５３】
図６８は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ２からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【０１５４】
図６９は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ３からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【０１５５】
図７０は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ４からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【０１５６】
図７１は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ６からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【０１５７】
図７２は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ７からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【０１５８】
図７３は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ｄ１からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【０１５９】
図７４は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ１からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【０１６０】
図７５は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ２からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【０１６１】
図７６は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ３からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【０１６２】
図７７は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ４からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【０１６３】
図７８は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ６からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【０１６４】
図７９は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ７からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【０１６５】
図８０は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ｄ１からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【０１６６】
図８１は、ＧＬＡまたはＥＰＡで補足された場合のパン酵母内で発現したＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を表す。
【０１６７】
図８２は、７つのプラスミド、すなわち、ｐＲＡＴ−４−Ａ１（図７４）、ｐＲＡＴ−４−Ａ２（図７５）、ｐＲＡＴ−４−Ａ３（図７６）、ｐＲＡＴ−４−Ａ４（図７７）、ｐＲＡＴ−４−Ａ６（図７８）、ｐＲＡＴ−４−Ａ７（図７９）およびｐＲＡＴ−４−Ｄ１（図８０）からのＴＥＬＯ１エロンガーゼ間のアミノ酸配列アライメントを表す。
【０１６８】
図８３は、翻訳されたＴＥＬＯ１配列と翻訳されたＨＳＥＬＯ１配列とのアライメントを表す。
【０１６９】
図８４は、翻訳されたＴＥＬＯ１配列と翻訳されたＭＥＬＯ４配列とのアライメントを表す。
【０１７０】
図８５は、翻訳されたＴＥＬＯ１配列と翻訳されたＧＬＥＬＯ配列とのアライメントを表す。
【０１７１】
図８６は、翻訳されたＴＥＬＯ１配列と翻訳されたＣＥＥＬＯ配列とのアライメントを表す。
【０１７２】
図８７は、ＧＬＡ、ＡＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡで補足された場合またはいずれの基質でも補足されなかった場合のパン酵母内で発現されたＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を表す。
【０１７３】
図８８は、ＬＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＡまたはＥＰＡで補足された場合のパン酵母内で発現されたＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を表す。
【０１７４】
（発明の詳細な記載）
本発明は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）由来の２つのエロンガーゼｃＤＮＡのヌクレオチドおよび対応アミノ酸配列、ならびにヒト由来のエロンガーゼｃＤＮＡ、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）由来のエロンガーゼｃＤＮＡ、マウス由来の２つのエロンガーゼｃＤＮＡおよびスラウストチトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）由来のエロンガーゼｃＤＮＡのヌクレオチドおよび対応アミノ酸配列に関する。さらに、本発明はまた、ｃＤＮＡの及び該遺伝子にコードされるタンパク質の用途を含む。例えば、該遺伝子および対応酵素は、医薬組成物、栄養組成物、動物飼料、化粧品および他の重要な製品に添加されうるＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡのような多価不飽和脂肪酸および／または一価不飽和脂肪酸の製造に使用することができる。
【０１７５】
エロンガーゼ遺伝子およびそれにコードされる酵素
前記のとおり、エロンガーゼｃＤＮＡにコードされるエロンガーゼ酵素は、種々の多価不飽和脂肪酸、特に炭素数２０〜２４のＰＵＦＡの産生に必須である。本発明においては、単離されたエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼｃＤＮＡ（ＭＡＥＬＯ）のヌクレオチド配列を図６に示し、このヌクレオチド配列にコードされる対応する精製されたタンパク質または酵素のアミノ酸配列を図７に示す。さらに、単離されたＧＬＡエロンガーゼｃＤＮＡ（ＧＬＥＬＯ）のヌクレオチド配列を図２２に示し、このヌクレオチド配列にコードされる対応する精製されたタンパク質または酵素のアミノ酸配列を図２３に示す。単離されたヒト配列１（ＨＳＥＬＯ１）エロンガーゼのヌクレオチド配列を図４３に示し、このヌクレオチド配列にコードされる対応する精製されたタンパク質または酵素のアミノ酸配列を図４４に示す。さらに、単離されたシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）エロンガーゼｃＤＮＡ（ＣＥＥＬＯ１）のヌクレオチド配列を図４６に示し、このヌクレオチド配列にコードされる対応する精製されたタンパク質または酵素のアミノ酸配列を図４７に示す。さらに、単離されたマウスＰＵＦＡ伸長酵素（ＭＥＬＯ４）のヌクレオチド配列を図５４に示し、それにコードされる対応する精製されたタンパク質または酵素のアミノ酸配列を図５５に示す。さらに、第２の単離されたマウスＰＵＦＡ伸長酵素（ＭＥＬＯ７）のヌクレオチド配列を図５８に示し、それにコードされる対応する精製されたタンパク質または酵素のアミノ酸配列を図５９に示す。また、単離されたティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）エロンガーゼｃＤＮＡ（ＴＥＬＯ１）のヌクレオチド配列を図７２に示し、それにコードされる対応する精製されたタンパク質または酵素のアミノ酸配列を図７９に示す。
【０１７６】
例えば、本発明のｃＤＮＡにコードされる単離されたエロンガーゼのいくつかは、ＧＬＡをＤＧＬＡまで伸長させ、あるいはＳＴＡを２０：４ｎ−３まで伸長させ、あるいはＡＡをＡＤＡまで伸長させる。ついで、例えばΔ５−デサチュラーゼにより、ＤＧＬＡからアラキドン酸への産生、または２０：４ｎ−３からＥＰＡへの産生が触媒される。したがって、少なくとも１つのエロンガーゼｃＤＮＡおよびそれにコードされる酵素が無ければ、ＡＡ（またはＥＰＡ）もＤＧＬＡ（または２０：４ｎ−３）もＡＤＡ（またはω３−ドコサペンタエン酸）も合成されることは不可能である。
【０１７７】
本発明は、配列番号１（すなわち、本明細書に記載のＭＡＥＬＯ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図６を参照されたい））中のヌクレオチドの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％に対応する（すなわち、それに対する同一性を有する）または相補的な配列を有するヌクレオチド配列（および対応するコードされるタンパク質）をも含むことに、注目すべきである。さらに、本発明はまた、配列番号２（すなわち、本明細書に記載のＧＬＥＬＯ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図２２を参照されたい））中のヌクレオチドの少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％に対応する（すなわち、それに対する同一性を有する）または相補的な配列を有するヌクレオチド配列（および対応するコードされるタンパク質）を含む。さらに、本発明はまた、配列番号３（すなわち、本明細書に記載のヒト配列１（ＨＳＥＬＯ１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図４３を参照されたい））中のヌクレオチドの少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％に対応する（すなわち、それに対する同一性を有する）または相補的な配列を有するヌクレオチド配列（および対応するコードされるタンパク質）を含む。さらに、本発明はまた、配列番号４（すなわち、本明細書に記載のシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ｃＤＮＡ，ＣＥＥＬＯ１のヌクレオチド配列（図４６を参照されたい））中のヌクレオチドの少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％に対応する（すなわち、それに対する同一性を有する）または相補的な配列を有するヌクレオチド配列（および対応するコードされるタンパク質）を含む。さらに、本発明はまた、配列番号５または配列番号６（すなわち、本明細書に記載のマウスＰＵＦＡエロンガーゼＭＥＬＯ４およびＭＥＬＯ７のヌクレオチド配列（それぞれ図５４および５８を参照されたい））中のヌクレオチドの少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％に対応する（すなわち、それに対する同一性を有する）または相補的な配列を有するヌクレオチド配列（および対応するコードされるタンパク質）を含む。また、本発明は、配列番号７（すなわち、本明細書に記載のティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）エロンガーゼ遺伝子ＴＥＬＯ１のヌクレオチド配列（図７２を参照されたい））中のヌクレオチドの少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％に対応する（すなわち、それに対する同一性を有する）または相補的な配列を有するヌクレオチド配列（および対応するコードされるタンパク質）を含む。各場合に言及されている「最も好ましい」範囲は１０％の増加量で増加しうることに注目すべきである。例えば、特定の配列に関して、「少なくとも５５％」が、前記で列挙された最も好ましい範囲である場合には、そのような範囲は、もちろん、「少なくとも６５％の同一性」、「少なくとも７５％の同一性」、「少なくとも８５％の同一性」および「少なくとも９５％の同一性」をも含む。
【０１７８】
対応する又は相補的な配列は、非モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）に由来すること又は単離された元の配列が由来する起源以外の起源に由来することが可能である（例えば、真核生物（例えば、スラウストチトリウム種（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、スラウストチトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）およびスラウストチトリウム・ロゼウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ））、シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、シゾキトリウム・アグレガツム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ））、コニジオボルス種（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、コニジオボルス・ナノデス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｎａｎｏｄｅｓ））、エントモルフトラ種（Ｅｎｔｏｍｏｒｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）（例えば、エントモルフトラ・エキシタリス（Ｅｎｔｏｍｏｒｐｈｔｈｏｒａ ｅｘｉｔａｌｉｓ））、サプロレグニア種（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｓｐｐ．）（例えば、サプロレグニア・パラシチカ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）およびサプロレグニア・ジクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ））、レプトミツス種（Ｌｅｐｔｏｍｉｔｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、レプトミツス・ラクテウス（Ｌｅｐｔｏｍｉｔｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ））、エントモフトラ種（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ピチウム種（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｐ．）、ポルフィリジウム種（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ））、コニジオボルス種（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、フィトファソラ種（Ｐｈｙｔｏｐｈａｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、コイドスポリウム種（Ｃｏｉｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、ムコール種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．）（例えば、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）およびムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ））、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ロドトルラ種（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｓｐｐ．）、アンフィジニウム・カルテリ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｃａｒｔｅｒｉ）、チャエトセロス・カルシトランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）、クリコスファエラ・カルテラエ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ ｃａｒｔｅｒａｅ）、クリプテコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）、クリプトモナス・オバタ（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ ｏｖａｔａ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ゴンヤウラクス・ポリエドラ（Ｇｏｎｙａｕｌａｘ ｐｏｌｙｅｄｒａ）、ジムノジニウム種（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、ジムノジニウム・ネルソニ（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ ｎｅｌｓｏｎｉ）、ジロジニウム・コーニイ（Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｎ ｃｏｈｎｉｉ）、イソクリシス種（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐｐ．）（例えば、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）、ミクロアルガエ（Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）ＭＫ８８０５、ニツシア・フルスツルム（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｆｒｕｓｔｕｌｕｍ）、パブロバ種（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐｐ．）（例えば、パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ））、ファエオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、プロロセントルム・コルダツム（Ｐｒｏｒｏｃｅｎｔｒｕｍ ｃｏｒｄａｔｕｍ）、ロードモナス・レンズ（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ ｌｅｎｓ）およびサラッシオシラ・スードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ））、好冷細菌（例えば、ビブリオ種（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．）（例えば、ビブリオ・マリヌス（Ｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ）））、酵母（例えば、ディポダスコプシス・ユニヌクレアタ（Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ ｕｎｉｎｕｃｌｅａｔａ））、非哺乳類生物、例えば、ハエ（例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）またはセノラブディティス種（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｓｐｐ．）（例えば、セノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ））、または哺乳類（例えば、ヒトまたはマウス）。そのような配列はまた、アルピナ（ａｌｐｉｎａ）以外のモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属内の種、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ・イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、モルティエレラ・ハイグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）およびモルティエレラ・ラマンニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍａｎｎｉａｎａ）変種アングリスポラ（ａｎｇｕｌｉｓｕｐｏｒａ）に由来しうる。
【０１７９】
さらに、本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１（ＭＡＥＬＯ）、配列番号２（ＧＬＥＬＯ）、配列番号３（ＨＳＥＬＯ１）、配列番号４（ＣＥＥＬＯ１）、配列番号５（ＭＥＬＯ４）、配列番号６（ＭＥＬＯ７）および配列番号７（ＴＥＬＯ１））の断片および誘導体、ならびにそれらの７つの配列に対する前記相補性または対応／同一性を有する前記のとおりの非モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）または非哺乳類などに由来する対応配列の断片および誘導体を含む。前記配列の機能的等価体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）（すなわち、エロンガーゼ活性を有する配列）も本発明に含まれる。
【０１８０】
本発明の目的においては、「相補性」は、２つのＤＮＡセグメント間の関連性の度合と定義される。それは、適当な条件下で一方のＤＮＡセグメントのセンス鎖が他方のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖にハイブリダイズして二重らせんを形成する能力を測定することにより求められる。該二重らせんにおいては、一方の鎖内にアデニンが現れる場合にはいつでも、他方の鎖内にはチミンが現れる。同様に、一方の鎖内にグアニンが存在する場合にはいつでも、他方の鎖内にはシトシンが存在する。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連性が大きければ大きいほど、２つのＤＮＡセグメントの鎖間でハイブリッド二重らせんを形成する能力は大きくなる。
【０１８１】
２つのヌクレオチド配列間の「同一性」は、２つのＤＮＡセグメントの同じ鎖（センスまたはアンチセンスのいずれか）間での一致性、対応性または同等（等価）性の度合と定義される。同一性（％）が大きければ大きいほど、それらの鎖間の対応性、一致性または同等性は高くなる。
【０１８２】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、両方の配列における一連の同一の及び保存されたアミノ酸残基の存在と定義される。２つのアミノ酸配列間の類似性の度合が高ければ高いほど、それらの２つの配列の対応性、一致性または同等性は高くなる（２つのアミノ酸配列間の「同一性」は、両方の配列における一連の厳密に等しい又は不変のアミノ酸残基の存在と定義される）。
【０１８３】
「相補性」、「同一性」および「類似性」の定義は当業者によく知られている。
【０１８４】
本発明はまた、前記タンパク質（例えば、図７（ＭＡＥＬＯ）を参照されたい）のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似性を有し前記ヌクレオチド配列にコードされており多価不飽和および一価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチドを含む。さらに、本発明は、前記タンパク質（例えば、図２３（ＧＬＥＬＯ）を参照されたい）のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似性を有し前記ヌクレオチド配列にコードされており多価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチドを含む。さらに、本発明はまた、前記タンパク質（例えば、図４４（ＨＳＥＬＯ１）を参照されたい）のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似性を有し前記ヌクレオチド配列にコードされており多価不飽和および一価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチドを含む。さらに、本発明は、前記タンパク質（例えば、図４７（ＣＥＥＬＯ１）を参照されたい）のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似性を有し前記ヌクレオチド配列にコードされており多価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチドを含む。本発明はまた、前記タンパク質（例えば、図５５（ＭＥＬＯ４）および図５８（ＭＥＬＯ７）を参照されたい）のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似性を有し前記ヌクレオチド配列にコードされており多価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチドを含む。また、本発明は、前記タンパク質（例えば、図７９（ＴＥＬＯ１）を参照されたい）のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似性を有し前記ヌクレオチド配列にコードされており多価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチドを含む。
【０１８５】
本発明はまた、図６に示す配列番号１（ＭＡＥＬＯ）および／または図２２に示す配列番号２（ＧＬＥＬＯ）および／または図４３に示す配列番号３（ＨＳＥＬＯ１）および／または図４６に示す配列番号４（ＣＥＥＬＯ１）および／または図５４に示す配列番号５（ＭＥＬＯ４）および／または図５８に示す配列番号６（ＭＥＬＯ７）および／または図７２に示す配列番号７（ＴＥＬＯ１）により表されるヌクレオチド配列に対応する又は相補的であるヌクレオチオド配列を有する核酸に中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能でありＰＵＦＡエロンガーゼ活性をコードする単離されたヌクレオチド配列を含む。核酸分子が別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」であるのは、温度およびイオン強度の適当な条件下で該核酸分子の一本鎖形態が他方の核酸分子にアニールしうる場合である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。温度およびイオン強度の条件がハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。「ハイブリダイゼーション」には、２つの核酸が相補的配列を含有することが必要である。しかし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが生じうる。核酸をハイブリダイズさせるための適当なストリンジェンシーは、該核酸の長さ及び相補性の度合に左右される。そのような変数は当技術分野でよく知られている。より詳しくは、２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合が大きくなればなるほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度Ｔｍの値は大きくなる。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算するための式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲を参照されたい）。より短い核酸のハイブリダイゼーションの場合には、ミスマッチの位置が、より重要であり、該オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲を参照されたい）。
【０１８６】
エロンガーゼ酵素の製造
エロンガーゼをコードする遺伝子を単離したら、ついでそれを、ベクター、プラスミドまたは構築物を使用して、原核性または真核性宿主細胞内に導入することができる。
【０１８７】
該ベクター、例えば、バクテリオファージ、コスミドまたはプラスミドは、エロンガーゼをコードするヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列にコードされるエロンガーゼの発現を惹起し該宿主細胞内で機能的である任意のプロモーターとを含みうる。該プロモーターは、該ヌクレオチド配列に作動可能な様態で関連している又は作動的に結合している（プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、該プロモーターは該コード配列に「作動的に結合している」と称される）。適当なプロモーターには、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、酸性ホスファターゼ、Ｔ７、ＴＰ１、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメガロウイルス最初期、乳清酸性タンパク質、グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来するもの、ならびにガラクトースの存在下で活性化されるプロモーター、例えばＧＡＬ１およびＧＡＬ１０が含まれる。さらに、他のタンパク質、オリゴ糖、脂質などをコードするヌクレオチド配列および他の調節配列、例えばポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ−４０Ｔ−抗原、オボアルブミンまたはウシ成長ホルモンのポリＡシグナル）を該ベクター内に含有させることも可能である。該構築物内に存在する配列の選択は、所望の発現産物および宿主細胞の性質に左右される。
【０１８８】
前記のとおり、該ベクターを構築したら、ついでそれを、当業者に公知の方法、例えばトランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーションなどにより、選択した宿主細胞内に導入することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）。ついで該宿主細胞を、ＰＵＦＡの発現を可能にする適当な条件下で培養し、ついでそれを回収し精製する。
【０１８９】
また、２以上のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば、ＭＡＥＬＯ、ＧＬＥＬＯ、ＨＳＥＬＯ１、ＣＥＥＬＯ１および／またはＴＥＬＯ１）を含む１つの構築物またはベクターを使用する場合には、特有のトリグリセリドまたは油を設計することが可能であることに注目すべきである。ついでこのベクターを、１つの宿主細胞内に導入することができる。あるいは、該配列のそれぞれを、別々のベクター内に導入することができる。ついでこれらのベクターを、それぞれの２つの宿主細胞内に又は１つの宿主細胞内に導入することができる。
【０１９０】
適当な原核性宿主細胞の具体例には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような細菌、スピルリナ種（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｐｐ．）（すなわち、藍藻）のようなシアノバクテリアが含まれる。適当な真核性宿主細胞の具体例には、例えば、哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞、例えばサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、リポミセス種（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ヤロウィア（カンジダ）種（Ｙａｒｒｏｗｉａ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｓｐｐ．）のようなカンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）またはハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．）または糸状菌細胞のような真菌細胞、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）が含まれる。好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（パン酵母）細胞を使用する。
【０１９１】
宿主細胞内での発現は、一過性または安定した様態で達成されうる。一過性発現は、該宿主細胞内で機能的である発現シグナルを含有する導入された構築物であって該宿主細胞内で複製されずめったに組込まれない構築物から生じたり、あるいは該宿主細胞が増殖性でない場合に生じうる。一過性発現はまた、関心のある領域に作動的に結合した調節可能なプロモーターの活性を誘導することにより達成されうるが、そのような誘導系は、低い基礎レベルの発現を示すことが多い。安定発現は、宿主ゲノム内に組込まれうる又は宿主細胞内で自律的に複製されうる構築物の導入により達成されうる。関心のある遺伝子の安定発現は、該発現構築物上に位置する又は該発現構築物でトランスフェクトされた選択マーカーの使用およびそれに続く、該マーカーを発現する細胞に関する選択により選択されうる。安定発現が組込みから生じる場合には、該構築物の組込みの部位は、宿主ゲノム内でランダムに生じることが可能であり、あるいは宿主遺伝子座との組換えを標的化するのに十分な宿主ゲノムに対する相同性の領域を含有する構築物の使用により標的化されることが可能である。構築物を内在性遺伝子座に標的化する場合には、該転写および翻訳調節領域の全部または一部は該内在性遺伝子座により提供されうる。
【０１９２】
また、前記ヌクレオチド配列の一方または両方にコードされる関心のある酵素（すなわち、エロンガーゼ）を発現させるために、トランスジェニック哺乳動物を使用することができる。より詳しくは、前記構築物を作製したら、それを胚の前核内に挿入することができる。ついで該胚を雌レシピエント内に移植することができる。あるいは、核移植法を利用することも可能であろう（Ｓｃｈｎｉｅｋｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：２１３０−２１３３（１９９７））。ついで妊娠および出産を引き起こさせる（例えば、米国特許第５，７５０，１７６号および米国特許第５，７００，６７１号を参照されたい）。そして該子孫からの乳、組織または他の流体サンプルは、非トランスジェニック動物において通常見出されるレベルと比較して改変されたレベルのＰＵＦＡを含有するはずである。改変または増強したレベルのＰＵＦＡの産生および従ってそれらのゲノム内へのエロンガーゼ酵素をコードする遺伝子の組込みに関して、後続の世代をモニターすることができる。該宿主として使用する哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマおよびウシよりなる群から選択することができる。しかし、関心のある酵素をコードするＤＮＡを自分自身のゲノム内に組込む能力を有する任意の哺乳動物を使用することができる。
【０１９３】
エロンガーゼポリペプチドの発現のためには、機能的な転写および翻訳の開始および終結領域を、該エロンガーゼポリペプチドをコードするＤＮＡに作動的に結合させる。転写および翻訳の開始および終結領域は、発現されるＤＮＡ、所望の系内で発現しうることが知られている又は疑われる遺伝子、発現ベクター、科学合成を含む種々の非限定的起源、あるいは宿主細胞内の内在性遺伝子座に由来する。植物組織および／または植物部分の発現は、該組織または部分が初期に収穫されるもの（例えば、種子、葉、果実、花、根など）である場合には特に、ある程度の効率を示す。特異的調節配列（例えば、米国特許第５，４６３，１７４号、第４，９４３，６７４号、第５，１０６，７３９号、第５，１７５，０９５号、第５，４２０，０３４号、第５，１８８，９５８号および第５，５８９，３７９号に記載されているもの）を使用することにより、発現を該植物のその位置に標的化することができる。あるいは、該発現タンパク質は、該宿主植物から直接的に又は更なる修飾後に流体画分内に取り込まれうる産物を産生する酵素でありうる。エロンガーゼ遺伝子またはアンチセンスエロンガーゼ転写産物の発現は、植物部分および／または植物組織内で見出される特定のＰＵＦＡまたはその誘導体のレベルを改変しうる。該エロンガーゼポリペプチドコード領域を、単独で又は他の遺伝子と共に発現させて、より高い割合の所望のＰＵＦＡを含有する或いは人乳のＰＵＦＡ組成に、より厳密に類似したＰＵＦＡ組成を有する組織および／または植物部分を産生させることが可能である（Ｐｒｉｅｔｏら，ＰＣＴ公開ＷＯ ９５／２４４９４）。該終結領域は、該開始領域が得られた遺伝子または異なる遺伝子の３’領域に由来しうる。多数の終結領域は、同じ及び異なる属および種からの種々の宿主において満足しうるものであることが公知であり判明している。該終結領域は、通常、いずれかの特定の特性というよりも便宜上の観点から選択される。
【０１９４】
前記のとおり、植物（例えば、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（大豆）またはブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（カノラ））、植物細胞、植物組織、トウモロコシ、ジャガイモ、ヒマワリ、サフラワーまたはアマをそれぞれ宿主または宿主細胞として使用してエロンガーゼ酵素を発現させることも可能であり、そして今度はそれを多価不飽和脂肪酸の製造に使用することが可能である。より詳しくは、所望のＰＵＦＡを種子内で発現させることができる。種子油の単離方法は当技術分野で公知である。このように、ＰＵＦＡ源を提供することに加えて、エロンガーゼ遺伝子の発現および恐らくはデサチュラーゼ遺伝子の発現により種子油成分を操作して、栄養組成物、医薬組成物、動物飼料および化粧品に添加されうる種子油を提供することができる。この場合にも、プロモーターに作動的に結合したエロンガーゼをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを、該エロンガーゼ遺伝子の発現に十分な時間および条件下、植物組織または植物内に導入する。該ベクターはまた、他の酵素、例えばΔ４−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ９−デサチュラーゼ、Δ１０−デサチュラーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１３−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼおよび／またはΔ１９−デサチュラーゼをコードする１以上の遺伝子を含みうる。該植物組織または植物は、該酵素が作用する適切な基質（例えば、ＤＧＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＥＰＡ、２０：４ｎ−３など）を産生しうる。あるいは、そのような基質を産生する酵素をコードするベクターを、関心のある植物組織、植物細胞、植物または宿主細胞内に導入することができる。また、適当な酵素を発現する植物組織上に基質を噴霧することができる。これらの種々の技術を用いて、関心のある植物細胞、植物組織、植物または宿主細胞を使用してＰＵＦＡ（例えば、ＤＧＬＡ、ＡＡまたはＡＤＡのようなｎ−６不飽和脂肪酸、あるいはＥＰＡまたはＤＨＡのようなｎ−３脂肪酸）を製造することができる。また、本発明は、前記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、該ベクターのヌクレオチド配列が例えば該トランスジェニック植物の種子内で多価不飽和脂肪酸の産生をもたらすトランスジェニック植物も含むことに注目すべきである。
【０１９５】
宿主細胞により天然で又はトランスジェニック的に産生されうる基質、および後に宿主細胞内に導入されるベクター内に存在するＤＮＡ配列にコードされうる酵素を図１に示す。
【０１９６】
前記を考慮すると、本発明はまた、１）該エロンガーゼｃＤＮＡの所望のヌクレオチド配列を単離し、２）該ヌクレオチド配列を含むベクターを構築し、３）該エロンガーゼ酵素の産生に十分な時間および条件下、該ベクターを宿主細胞内に導入する工程を含んでなる、前記のエロンガーゼ酵素の１つの製造方法を含む。
【０１９７】
本発明はまた、前記のとおりに産生されたエロンガーゼに酸をさらして、該エロンガーゼにより該酸を多価不飽和脂肪酸に変換することを含んでなる、多価不飽和脂肪酸の製造方法を含む。例えば、エロンガーゼにＧＬＡをさらす場合には、それはＤＧＬＡに変換される。ついで、ＤＧＬＡをＡＡに変換するΔ５−デサチュラーゼにＤＧＬＡをさらすことが可能である。ついで、Δ１７−デサチュラーゼを使用することにより、ＡＡをＥＰＡに変換することが可能であり、今度はエロンガーゼおよびΔ４−デサチュラーゼを使用することにより、それをＤＨＡに変換することが可能である。あるいは、エロンガーゼを使用して１８：４ｎ−３を２０：４ｎ−３に変換し、それをΔ５−デサチュラーゼにさらしＥＰＡに変換することが可能である。また、エロンガーゼを使用して１８：３ｎ−３を２０：３ｎ−３に変換し、今度はΔ８−デサチュラーゼによりそれを２０：４ｎ−３に変換することが可能である。このように、エロンガーゼを使用して多価不飽和脂肪酸を製造し、今度はそれを特定の有益な目的に使用することができる（いくつかの生合成経路においてエロンガーゼ酵素が果たす多数の決定的に重要な役割の例示として、図１を参照されたい）。
【０１９８】
エロンガーゼ遺伝子およびそれにコードされる酵素の用途
前記のとおり、単離されたエロンガーゼｃＤＮＡおよびそれにコードされる対応するエロンガーゼ酵素（または精製されたポリペプチド）は、多数の用途を有する。例えば、多価不飽和脂肪酸、例えばＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、２０：４ｎ−３またはＥＰＡの製造において、各ｃＤＮＡおよび対応する酵素を間接的または直接的に使用することができる（「直接的」は、該酵素が酸を、組成物中で使用される別の酸に直接的に変換する場合（例えば、ＧＬＡからＤＧＬＡへの変換）を包含する意である）。「間接的」は、脂肪酸がエロンガーゼにより別の脂肪酸（すなわち、経路中間体）に変換され（例えば、ＧＬＡからＤＧＬＡへ）次いで後者の脂肪酸が非エロンガーゼ酵素の使用により別の脂肪酸に変換される（例えば、Δ５−デサチュラーゼによりＤＧＬＡからＡＡへ）場合を包含する意である。これらの多価不飽和脂肪酸（すなわち、エロンガーゼ酵素の活性により直接的または間接的に産生されたもの）は、例えば、栄養組成物、医薬組成物、化粧品および動物飼料に添加することが可能であり、それらはすべて、本発明に含まれる。これらの用途は後記で詳しく説明される。
【０１９９】
栄養組成物
本発明は栄養組成物を含む。本発明の目的におけるそのような組成物は、ヒトによる消費（経腸または非経口的消費を含む）のための任意の食物または調製物を含み、それは、体内に摂取されると、（ａ）組織を滋養または形成したり或いはエネルギーを供給するよう働き、および／または（ｂ）適当な栄養状態または代謝機能を維持し、回復させ、または支持する。
【０２００】
本発明の栄養組成物は、それぞれのエロンガーゼ遺伝子を使用して産生された少なくとも１つのエロンガーゼ酵素の使用により産生された少なくとも１つの油または酸を含み、固体または液体形態でありうる。さらに、該組成物は、食用多量栄養素、ビタミンおよび無機質（ミネラル）を個々の用途に望ましい量で含みうる。そのような成分の量は、該組成物が、ある種の代謝状態（例えば、代謝障害）を伴うような特定の要求を有する健常な乳児、小児または成人での使用を意図したものであるのか否かに応じて様々となろう。
【０２０１】
該組成物に添加されうる多量栄養素の具体例には、可食脂肪、炭水化物およびタンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような可食脂肪の具体例には、ヤシ油、大豆油、ならびにモノおよびジグリセリドが含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような炭水化物の具体例には、グルコース、食用ラクトース、水解デンプンが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明の栄養組成物中で使用しうるタンパク質の具体例には、大豆タンパク質、電気透析乳清、電気透析脱脂乳、乳清、またはこれらのタンパク質の水解物が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０２】
ビタミンおよび無機質に関しては、以下のものを本発明の栄養組成物に加えることができる。カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素およびビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、ＣおよびＢ複合体。他のそのようなビタミンおよび無機質も添加することができる。
【０２０３】
本発明の栄養組成物中で使用する成分は、半精製または精製されたものに由来するであろう。半精製または精製は、天然物質の精製により又は合成により製造された物質を意味する。
【０２０４】
本発明の栄養組成物の具体例には、乳児用配合乳、食事補足物、食事代替物および再水和組成物が含まれるが、これらに限定されるものではない。特に関心が持たれる栄養組成物には、乳児に対して経腸および非経口的補給に使用するもの、特殊乳児用配合乳、老人用の補足物（サプリメント）、および胃腸障害および／または吸収不良を伴う者に対する補足物（サプリメント）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０５】
また、本発明の栄養組成物は、食事の補足を要しない場合でさえも食品に添加することが可能である。例えば、該組成物は、マーガリン、加工バター、チーズ、ミルク（乳）、ヨーグルト、チョコレート、キャンディー、スナック、サラダ油、調理油、調理脂肪、肉、魚および飲料を含む（これらに限定されるものではない）任意のタイプの食品に添加することができる。
【０２０６】
本発明の好ましい実施形態においては、該栄養組成物は経腸栄養製品、より好ましくは、成人用または小児用経腸栄養製品である。この組成物は、慢性もしくは急性病態により特別な要求を有する又はストレスを感じている成人または小児に投与することができる。該組成物は、本発明に従い製造された多価不飽和脂肪酸に加えて、前記のとおりの多量栄養素、ビタミンおよび無機質（ミネラル）を含みうる。該多量栄養素は、人乳中に存在するのと同等の量で又はエネルギーベース（すなわち、毎カロリーベース）で存在しうる。
【０２０７】
液体または固体の経腸および非経口栄養製剤の製剤化方法は当技術分野でよく知られている（後記実施例も参照されたい）。
【０２０８】
例えば、該経腸製剤を滅菌し、ついで即時供給様態（ＲＴＦ；そのまま供給しうる様態）で使用したり、濃縮液または粉末として保存することができる。該粉末は、前記に示すとおりに調製した製剤を噴霧乾燥し該濃縮物の再水和によりそれを再構成させる（還元する）ことにより調製することができる。成人用および小児用栄養製剤は当技術分野でよく知られており、商業的に入手可能である（例えば、Ｒｏｓｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯｈｉｏからのＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）およびＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））。本発明に従い製造した油または脂肪酸は、これらのいずれの製剤にも添加することが可能である。
【０２０９】
本発明の栄養組成物のエネルギー密度は、液体形態の場合には、約０．６Ｋｃａｌ〜約３Ｋｃａｌ／ｍｌの範囲でありうる。固体または粉末形態の場合には、該栄養補足物は、約１．２〜９Ｋｃａｌ／ｇ以上、好ましくは約３〜７Ｋｃａｌ／ｇを含有しうる。一般に、液体製品の重量モル浸透圧濃度は７００ｍＯｓｍ未満、より好ましくは６６０ｍＯｓｍ未満であるべきである。
【０２１０】
該栄養製剤は、本発明に従い製造したＰＵＦＡに加えて、前記のとおりの多量栄養素、ビタミンおよび無機質（ミネラル）を含有しうる。これらの追加的成分の存在は、個体がこれらの成分の１日最小必要量を摂取するのを助ける。ＰＵＦＡの供給に加えて、亜鉛、銅、葉酸および抗酸化剤を該組成物に添加することも望ましいかもしれない。これらの物質は、ストレスにさらされた免疫系を増強し、したがって、該組成物の投与を受けた個体に更なる利点をもたらすと考えられる。医薬組成物も、これらの成分で補足されうる。
【０２１１】
より好ましい実施形態においては、該栄養組成物は、抗酸化剤および少なくとも１つのＰＵＦＡに加えて、炭水化物源を含み、この場合、少なくとも５重量％の該炭水化物は不消化オリゴ糖である。より好ましい実施形態においては、該栄養組成物は更に、タンパク質、タウリンおよびカルニチンを含む。
【０２１２】
前記のとおり、本発明に従い製造されたＰＵＦＡまたはその誘導体は、静脈内供給を受けている患者のために或いは栄養不良または他の症状または病態の予防または治療のために、食事代替物または補足物（サプリメント）、特に乳児用配合乳に添加することができる。背景知識として、人乳は、ＤＨＡとして約０．１５％〜約０．３６％、ＥＰＡとして約０．０３％〜約０．１３％、ＡＡとして約０．３０％〜約０．８８％、ＤＧＬＡとして約０．２２％〜約０．６７％、およびＧＬＡとして約０．２７％〜約１．０４％を含む脂肪酸プロフィールを有することに注目すべきである。したがって、本発明に従い製造されたＤＧＬＡ、ＡＡ、ＥＰＡおよび／またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような脂肪酸を使用して、例えば、乳児用配合乳の組成を改変して、人乳のＰＵＦＡ含量をより良く模倣したり、あるいは非人乳中に通常見出されるＰＵＦＡの存在を改変することが可能である。特に、薬理学的または食事補足物、特に母乳代替物または母乳補足物に使用する組成物は、好ましくは、ＡＡ、ＤＧＬＡおよびＧＬＡの１以上を含む。より好ましくは、該油混合物は、約０．３〜３０％ ＡＡ、約０．２〜３０％ ＤＧＬＡおよび／または約０．２〜約３０％ ＧＬＡを含む。
【０２１３】
トリグリセリドとして計算した場合に約２〜約３０重量％の脂肪酸を含む非経口的栄養組成物が、本発明に含まれる。その好ましい組成物は、該全ＰＵＦＡ組成物の約１〜約２５重量％をＧＬＡとして含有する（米国特許第５，１９６，１９８号）。所望により、他のビタミン、特に脂溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＬ−カルニチンを含有させることが可能である。所望により、αトコフェロールのような保存剤を約０．１重量％の量で加えることができる。
【０２１４】
また、ＡＡ、ＤＧＬＡおよびＧＬＡの比は、与えられた個々の最終用途に適合させることができる。母乳補足物または代替物として製剤化した場合には、ＡＡ、ＤＧＬＡおよびＧＬＡの１以上を含む組成物は、それぞれ約１：１９：３０〜６：１：０．２の比で提供されるであろう。例えば、動物の母乳は、好ましくは約１：１：１、１：２：１、１：１：４である中間比を含む約１：１９：３０〜６：１：０．２の範囲の様々なＡＡ：ＤＧＬＡ：ＧＬＡ比を取りうる。宿主細胞内で一緒に産生された場合には、該ＰＵＦＡ比を厳密に制御するために、ＧＬＡおよびＤＧＬＡのような前駆体基質からＡＡへの変換速度および変換率を調節することが可能である。例えば、約１：１９のＡＡ対ＤＧＬＡ比を得るために、ＤＧＬＡからＡＡへの５％〜１０％の変換率を用いることが可能であり、約６：１のＡＡ対ＤＧＬＡ比を得るために、約７５％〜８０％の変換率を用いることが可能である。したがって、細胞培養系内であるか宿主動物内であるかにかかわらず、ＰＵＦＡのレベルおよび比を調節するために、エロンガーゼ発現および他のデサチュラーゼの発現の時機、度合および特異性を調節することが可能である。ついで、本発明に従い製造されたＰＵＦＡ／酸（例えば、ＡＡおよびＤＧＬＡ）を、所望の濃度および比で他のＰＵＦＡ／酸（例えば、ＧＬＡ）と一緒にすることが可能である。
【０２１５】
さらに、本発明に従い製造されたＰＵＦＡまたはそれらを含有する宿主細胞を動物飼料補足物として使用して、動物の組織または乳の脂肪酸組成を、人間または動物の消費にとってより望ましいものに改変することが可能である。
【０２１６】
医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載の方法に従いエロンガーゼｃＤＮＡ（ＭＡＥＬＯ、ＧＬＥＬＯ、ＨＳＥＬＯ１、ＣＥＥＬＯ、ＭＥＬＯ４およびＭＥＬＯ７）の少なくとも１つを使用して製造された脂肪酸および／または得られた油の１以上を含んでなる医薬組成物を含む。より詳しくは、そのような医薬組成物は、該酸および／または油の１以上と、標準的な良く知られた無毒性の医薬上許容される担体、補助剤またはビヒクル、例えばリン酸緩衝食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤またはエマルション、例えば水／油エマルションとを含みうる。該組成物は液体または固体形態でありうる。例えば、該組成物は、錠剤、カプセル剤、不消化性の液体または固体、注射剤あるいは局所用軟膏またはクリームの形態でありうる。適当な流動性は、例えば、分散の場合の必要粒径の維持および界面活性剤の使用により維持することができる。また、等張化剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含有させることが望ましいかもしれない。そのような不活性希釈剤に加えて、該組成物はまた、補助剤、例えば湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤および芳香剤を含みうる。
【０２１７】
懸濁剤は、該活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウム メタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントゴムまたはこれらの物質の混合物を含みうる。
【０２１８】
錠剤およびカプセル剤のような固体剤形は、当技術分野でよく知られた技術を用いて製造することができる。例えば、本発明に従い製造されたＰＵＦＡを、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸のような崩壊剤ならびにステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤と組合されたラクトース、スクロースおよびコーンスターチのような通常の錠剤基剤で錠剤化することができる。カプセル剤は、これらの賦形剤を抗酸化剤および関連ＰＵＦＡと共にゼラチンカプセル内に封入することにより製造することができる。該抗酸化剤およびＰＵＦＡ成分は、前記指針に適合したものであるべきである。
【０２１９】
静脈内注射には、本発明に従い製造したＰＵＦＡまたはその誘導体を、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄｓ（商標）のような市販の製剤中に含有させることが可能である。典型的な正常成人血漿脂肪酸プロフィールは、６．６４〜９．４６％のＡＡ、１．４５〜３．１１％のＤＧＬＡおよび０．０２〜０．０８％のＧＬＡを含む。患者において正常な脂肪酸プロフィールを得るために、これらのＰＵＦＡまたはそれらの代謝前駆体を単独で又は他のＰＵＦＡと組合せて投与することができる。所望により、該製剤の個々の成分は、個々に、キット形態で、単一または複数の用途のために提供されうる。個々の脂肪酸の典型的な投与量は、１日０．１ｍｇ〜２０ｇ（１００ｇまで）、好ましくは、１日１０ｍｇ〜１、２、５または１０ｇである。
【０２２０】
本発明の医薬組成物の可能な投与経路には、例えば、経腸（例えば、経口および直腸内）および非経口経路が含まれる。例えば、液体製剤は、例えば、経口的または直腸内に投与することができる。さらに、噴霧剤または吸入剤を形成させるために、均一混合物を水中に完全に分散させ、生理的に許容される希釈剤、保存剤、バッファーまたはプロペラントと無菌条件下で混合することができる。
【０２２１】
投与経路は、もちろん、所望の効果に左右されるであろう。例えば、荒れた、乾燥した又は老化した皮膚の治療、損傷または火傷した皮膚の治療、あるいは何らかの疾患または症状により損なわれた皮膚または髪の治療に該組成物を使用する場合には、それは恐らく、局所的に適用されうるであろう。
【０２２２】
患者に投与する組成物の投与量は当業者により決定されることが可能であり、患者の体重、患者の年齢、患者の免疫状態などの種々の要因に左右される。
【０２２３】
形態に関しては、該組成物は、例えば、液剤、分散剤、懸濁剤、乳剤、または後に再構成される無菌粉末でありうる。
【０２２４】
本発明はまた、本明細書に記載の医薬組成物および／または栄養組成物の使用による種々の障害の治療を含む。特に、本発明の組成物は、血管形成術後の再発狭窄症を治療するために使用することができる。さらに、炎症、関節リウマチ、喘息および乾癬の症状も本発明の組成物で治療することができる。また、ＰＵＦＡはカルシウム代謝に関与している可能性があることを証拠が示しており、したがって、本発明の組成物は恐らく、骨粗鬆症および腎または尿路結石の治療または予防に使用されうるであろう。
【０２２５】
さらに、本発明の組成物は癌の治療にも使用されうる。悪性細胞は、改変した脂肪酸組成を有することが示されている。脂肪酸の添加は、それらの増殖を遅らせ、細胞死を引き起こし、化学療法剤に対するそれらの感受性を増加させることが示されている。さらに、本発明の組成物は、癌に関連した悪液質の治療にも有用でありうる。
【０２２６】
本発明の組成物は糖尿病の治療にも使用されうる（米国特許第４，８２６，８７７号およびＨｏｒｒｏｂｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ． Ｖｏｌ．５７（Ｓｕｐｐｌ．）７３２Ｓ−７３７Ｓを参照されたい）。改変した脂肪酸代謝および組成物が糖尿病の動物において示されている。
【０２２７】
さらに、エロンガーゼ酵素の使用により直接的または間接的に製造されたＰＵＦＡを含む本発明の組成物は、湿疹の治療、血圧の低下および数学的検査得点の改善にも使用されうる。さらに、本発明の組成物は、血小板凝固の抑制、血管拡張の誘導、コレステロールレベルの低下、血管壁平滑筋および線維組織の増殖の抑制（Ｂｒｅｎｎｅｒら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．８３，ｐ．８５−１０１，１９７６）、非ステロイド性抗炎症薬の胃腸出血および他の副作用の軽減または予防（米国特許第４，６６６，７０１号を参照されたい）、子宮内膜症および月経前症候群の予防または治療（米国特許第４，７５８，５９２号を参照されたい）ならびにウイルス感染症後の筋肉痛性脳脊髄炎および慢性疲労（米国特許第５，１１６，８７１号を参照されたい）に使用されうる。
【０２２８】
本発明の組成物の更なる用途には、エイズ、多発性硬化症および炎症性皮膚障害の治療における並びに全身的健康状態の維持のための用途が含まれる。
【０２２９】
さらに、本発明の組成物は美容目的に使用することができる。それを既存の化粧品組成物に添加して、混合物を形成させたり、あるいは単独の組成物として使用することができる。
【０２３０】
獣医学的用途
動物は、ヒトと同じ要求および症状の多くを経験するため、前記医薬組成物および栄養組成物は、ヒトだけでなく動物（すなわち、家畜または非家畜）に関しても使用されうることに注目すべきである。例えば、本発明の油または酸は、動物飼料補足物、動物飼料代替物、動物ビタミンまたは動物局所軟膏に使用されうる。
【０２３１】
本発明は、以下の非限定的な実施例を用いることにより例示されうる。
【０２３２】
実施例Ｉ
モルティエレラ・アルピナにおけるコドン使用頻度の決定
１０００個のランダムなｃＤＮＡクローンの５’末端をモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリーから配列決定した。クエリー（query）配列と同じタイプ（核酸またはタンパク質）の配列群との間の類似性に関して検索するためにＦａｓｔＡアルゴリズム（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、特にＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（ＧｅｎｅＢｉｏ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共にＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））を使用して、６個のリーディングフレームにおいて該配列を翻訳した。該クローンの多くは、公知遺伝子に対するタンパク質配列相同性に基づき、推定ハウスキーピング遺伝子として同定された。該データベース中の公知ハウスキーピング遺伝子とマッチした２１個のエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡ配列を選択した（後記表１を参照されたい）。これらの２１個の配列ならびに完全長エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５−（図１８を参照されたい）、Δ６−およびΔ１２−デサチュラーゼ配列に基づき、エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）のコドンの偏り（バイアス）の表（表２を参照されたい）を作成した。該エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡ配列にコードされる推定タンパク質と該公知タンパク質配列とのＦａｓｔＡアライメントは幾つかの領域では弱かったため、強い相同性の領域からのコドンのみを使用した。
【０２３３】
【表１】
Figure 0004959903
【０２３４】
【表２】
Figure 0004959903
【０２３５】
実施例ＩＩ
エム・アルピナからの完全長エロンガーゼ様ｃＤＮＡのクローニング
ホホバおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エロンガーゼ（ＥＬＯ２）からのβ−ケトアシル−補酵素Ａシンターゼ（ＫＣＳ）をアラインして、アミノ酸相同性の領域を決定した（図２を参照されたい）。該コドンバイアスを、それらの２つのエロンガーゼ間の相同アミノ酸に対応する配列の領域に適用し、この偏った配列に基づきプライマーを設計した（図３を参照されたい）。該ｃＤＮＡを、１．１Ｋｂの平均インサートサイズを有する約６×１０５個のクローンを含有するＭ１１エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリー（Ｋｎｕｔｚｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０−２９３６６（１９９８））から切り出した。切り出されたｃＤＮＡを内部プライマーＲＯ３３９（５’−ＴＴＧ ＧＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＧＡ ＣＣＡ ＣＣＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＴＧ−３’）およびベクターフォワードプライマーＲＯ３１７（５’−ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＧＡＣ ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＡＣ Ｇ−３’）で増幅した。３００ｎｇの切り出されたエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリー、５０ｐｍｏｌの各プライマー、１０μｌの１０×バッファー、１μｌの１０ｍＭ ＰＣＲヌクレオチド混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および１．０ＵのＴａｑポリメラーゼを含有する１００μｌの容積中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）内での加熱サイクル条件は以下のとおりであった。９４℃で２分間、ついで３０サイクルの９４℃で１分間、５８℃で２分間、および７２℃で３分間を３０サイクル。ＰＣＲの後、７２℃で７分間の追加的な伸長を行った。
【０２３６】
該ＰＣＲ増幅産物をゲル上で移動させ、約３６０ｂｐの増幅断片をゲル精製し、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、単離された断片を直接的に配列決定した。ＧＣＧの配列解析パッケージを使用して、得られた配列を公知配列と比較した。ＦａｓｔＡアルゴリズム（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，前掲）を使用して、ＧＣＧ解析プログラムにおいて、該配列を全６個のリーディングフレームにおいて翻訳した。タンパク質のＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（ＧｅｎｅＢｉｏ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｅｒｌａｎｄ）を検索した。この翻訳ｃＤＮＡ断片は、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）に対する該推定タンパク質配列の相同性（６３アミノ酸において４１．３％の同一性を有する）に基づき、推定エロンガーゼの一部として同定された。
【０２３７】
該推定エロンガーゼ配列に基づき新規プライマーを設計し、ベクターｐＺＬ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）配列を使用してエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリーを構築した。既に記載されている条件を用いて、完全長エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼｃＤＮＡを単離するために、付加されたＢａｍＨＩ制限部位（下線部）を有するプライマーＲＯ３５０（５’−ＣＡＴ ＣＴＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＧ ＣＣＧ ＣＡＡ ＴＣＴ ＴＧ−３’）およびベクターリバースプライマーＲＯ３５２（５’−ＡＣＧ ＣＧＴ ＡＣＧ ＴＡＡ ＡＧＣ ＴＴＧ−３’）を使用して、切り出されたエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリーを再びＰＣＲ増幅した。約１．５ＫｂのＰＣＲ増幅断片末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で埋めて平滑末端を作製し、ｐＣＲ平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローニングした。これは、２つのクローン、すなわち、ｐＲＡＥ−１およびｐＲＡＥ−２（図４Ａを参照されたい）を与えた（プラスミドＤＮＡ ｐＲＡＥ−２は、ブダペスト条約の条項に基づきＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に１９９８年８月２８日に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ ２０３１６６が付与されている）。これらのベクターからのエロンガーゼｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ断片として切り出し、ＥｃｏＲＩで消化されたｐＹＸ２４２（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ベクター内にクローニングした。クローンｐＲＡＥ−５およびｐＲＡＥ−６（図４Ｂを参照されたい）は、それぞれｐＲＡＥ−１およびｐＲＡＥ−２からのエロンガーゼｃＤＮＡを有する（プラスミドＤＮＡ ｐＲＡＥ−５は、ブダペスト条約の条項に基づきＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に１９９８年８月２８日に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ ２０３１６７が付与されている）。
【０２３８】
ｐＲＡＥ−５およびｐＲＡＥ−６の配列は、ｐＲＡＥ−５中のエロンガーゼ遺伝子の５’非翻訳領域がｐＲＡＥ−６中のものより１６ｂｐ短いことを示した（図５を参照されたい）。ｐＲＡＥ−２から、ＭＡＥＬＯと称される完全なエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼｃＤＮＡ配列を得た（図６を参照されたい）。図７は、ＭＡＥＬＯの翻訳から得られたアミノ酸配列である。既に記載されているとおりに、該翻訳ＭＡＥＬＯでＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（ＧｅｎｅＢｉｏ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を再び検索した。ＭＡＥＬＯは、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＮＳ１（ＥＬＯ２）に対しては３１７アミノ酸において４４．３％の同一性を有し、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＲ４（ＥＬＯ３）に対しては３１８アミノ酸において４４．７％の同一性を有する。それらの３つのエロンガーゼ間のＦａｓｔＡアライメントを図８に示す。ヌクレオチドレベルでは（図９を参照されたい）、ＭＡＥＬＯは、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＮＳ１（ＥＬＯ２）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ７８６２４）に対して５４９ｂｐの重複において５７．４％の同一性を有する。しかし、９５４ｂｐの完全ＭＡＥＬＯ遺伝子とエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＮＳ１（ＥＬＯ２）との同一性は３３．０％である。
【０２３９】
実施例ＩＩＩ
パン酵母内でのエム・アルピナエロンガーゼｃＤＮＡの発現
構築物ｐＲＡＥ−５およびｐＲＡＥ−６をエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，Ｇｅｎｅ，８３：５７−６４（１９８９）内に形質転換し、エロンガーゼ活性に関してスクリーニングした。ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にホホバＫＣＳ遺伝子を含有するプラスミドｐＣＧＮ７８７５（Ｃａｌｇｅｎｅ ＬＬＣ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ））を陽性対照として使用した。エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）においてはエロンガーゼ活性を検出するために使用した基質はＧＬＡであり、ホホバＫＣＳにおいてはオレイン酸（ＯＡ）であった。該陰性対照株は、ｐＹＸ２４２ベクターを含有するエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４であった。該培養を、個々の基質の存在下、選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．１３，ｐ．３−５（１９９２））中で２５℃で４０〜４８時間成長させた。ｐＹＥＳ２内にクローニングしたホホバＫＣＳ遺伝子の発現はＧＡＬ１プロモーターの制御下であり、ｐＹＸ２４２中のプロモーターは、構成的なＴＰ１である。したがって、該３３４（ｐＣＧＮ７８７５）および３３４（ｐＹＥＳ２）培養をガラクトースで誘導した。各細胞ペレットの脂質画分のＧＣ−ＦＡＭＥ分析を、既に記載されているとおりに行った（Ｋｎｕｔｚｏｎら，前掲）。
【０２４０】
種々の実験からのエロンガーゼ活性の結果を図１０Ａおよび１０Ｂに示す。ホホバＫＣＳは長鎖一価不飽和脂肪酸１８：１ｎ−９を２０：１ｎ−９に伸長させる。エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）とエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ２およびＥＬＯ３との間のアミノ酸相同性は、これらの遺伝子にコードされるタンパク質が、同様の基質特異性を有しうることを示唆した。エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼの活性、すなわち、長鎖一価不飽和および飽和脂肪酸の伸長（ＭＡＥＬＯ）は、１８：１ｎ−９から２０−１ｎ−９への変換において認められ、また、２４：０の合成においても認められる。対照株３３４（ｐＹＸ２４２）は、非常に僅かにしか検出されない又は全く検出されない量の２０：１および２４：０を有する（図１０Ａを参照されたい）。エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）はまた、少なくとも１つのＰＵＦＡに作用し、１８：３ｎ−６（ＧＬＡ）を２０：３ｎ−６（ＤＧＬＡ）に変換する。全脂質中の２０：３ｎ−６の割合（％）は、エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）ｃＤＮＡを有する株３３４（ｐＲＡＥ−５）および３３４（ｐＲＡＥ−６）においては、対照３３４（ｐＹＸ２４２）の場合より高い。産生した２０：３ｎ−６の割合（％）は３３４（ｐＹＸ２４２）では０．０９２％であったのに対して、３３４（ｐＲＡＥ−５）では０．３２４％、３３４（ｐＲＡＥ−６）では０．２６９％であった（図１０Ａおよび１０Ｂの括弧内に示されている）。脂肪酸プロフィールにおけるこの相違は、産生した２０：３ｎ−６の全量においても認められる。３３４（ｐＹＸ２４２）によっては僅か０．２２６μｇの２０：３ｎ−６が産生されたに過ぎなかったのに対して、３３４（ｐＲＡＥ−５）および３３４（ｐＲＡＥ−６）は２．５０４μｇの２０：３ｎ−６および１．００６μｇの２０：３ｎ−６を産生した。また、基質を加えない場合には、２０：３ｎ−６のレベルは検出不可能である。
【０２４１】
２０：３ｎ−６がエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）により産生されたら、Δ５−デサチュラーゼが、所望の発現系においてそれをＡＡに変換しうる。この仮定を試験するために。構築物ｐＲＡＥ−５およびｐＣＧＲ−４（Δ５−デサチュラーゼ含有プラスミド）をエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４内に同時形質転換し、ＡＡ産生に関してスクリーニングした。使用した基質は２５μＭ ＧＬＡ（１８：３ｎ−６）であった。エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）が酵母において活性である場合には、該基質はＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）に変換され、それはΔ５−デサチュラーゼによりＡＡ（２０：４ｎ−６）に変換されるであろう。図１１の結果は、ＡＡの産生、したがってエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）の活性を証明している。
【０２４２】
酵母において該エロンガーゼと共にΔ５−、Δ６−およびΔ１２−デサチュラーゼが発現されると、脂肪酸を外的に供給しなくても、ＡＡの産生（図１を参照されたい）が生じるはずである。
【０２４３】
実施例ＩＶ
パン酵母におけるエム・アルピナ エロンガーゼｃＤＮＡ ＭＡＥＬＯとエス・セレビシエ エロンガーゼＥＬＯ２との発現の比較
制限部位（下線部）ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを含むそれぞれプライマーＲＯ５１４（５’−ＧＧＣ ＴＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＣＴＣ ＧＴＴ ＡＣＴ ＣＡＡ ＴＡＴ Ｇ−３’）およびＲＯ５１５（５’−ＣＣＴ ＧＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＣＴ ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＧ−３’）を使用して、該酵母エロンガーゼをコードするＥＬＯ２遺伝子をエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムライブラリー（Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からクローニングした。該ＥＬＯ２遺伝子をベクターｐＹＸ２４２内にＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位においてクローニングし（ｐＲＥＬＯと称される）、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前掲）内に形質転換し、ＰＵＦＡエロンガーゼ活性に関してスクリーニングした。該ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を比較するために、該ベクタープラスミドを陰性対照として使用し、３３４（ｐＲＡＥ−５）を増殖させた。該培養は、既に記載されているとおりに成長させた。この場合、該培地中にはガラクトースは存在させず、基質として２５μＭ ＧＬＡを加えた。図１２に示されているとおり、３３４（ｐＲＡＥ−５）により産生（１８：３ｎ−６またはＧＬＡから伸長）された２０：３ｎ−６またはＤＧＬＡの量は、未改変ベクターｐＹＸ２４２を含有する陰性対照の約４倍であり、３３４（ｐＲＥＬＯ−１）および３３４（ｐＲＥＬＯ−２）は該陰性対照の僅か２倍であった。さらに、産生したＤＧＬＡが全脂質に対する割合（％）として表されている場合には（図１２の括弧内に示されている）、クローン３３４（ｐＲＥＬＯ−１）および３３４（ｐＲＥＬＯ−２）はそれぞれ０．１５３％および０．２％のＤＧＬＡを産生し、一方、３３４（ｐＹＸ２４２）は０．１８５％のＤＧＬＡを産生した。したがって、すべてのこれらの株は、比較しうる割合のＤＧＬＡを産生した。一方、株３３４（ｐＲＡＥ−５）は０．２７９％ ＤＧＬＡを産生した。これは３３４（ｐＹＸ２４２）（陰性対照）に対して５０．８％の増加である。これらのデータは、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エロンガーゼ遺伝子ＥＬＯ２が、酵母において過剰発現された場合でさえも、ＧＬＡをＤＧＬＡに効果的には伸長させないことを示している。対照３３４（ｐＹＸ２４２）の場合より大量にＤＧＬＡが産生されことにより示されるとおり、エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ＰＵＦＡエロンガーゼ活性は、この変換に特異的である。
【０２４４】
実施例Ｖ
ＭＡＥＬＯを使用する他の起源由来のエロンガーゼの同定
ＴＦａｓｔＡアルゴリズム（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，前掲）を用いて、クエリー（query）ペプチド配列と、６個の該リーディングフレームのそれぞれにおいて翻訳されたデータベースＤＮＡ配列との間の類似性に関して検索する。翻訳されたＭＡＥＬＯとのそれらのアミノ酸類似性の比較に基づき他の潜在的エロンガーゼ配列を同定するために、ＧＣＧからのＧｅｎＥＭＢＬデータベース（６／９８）と共に、ＧＣＧにおけるＴＦａｓｔＡ検索のためのクエリー（query）配列として、翻訳されたＭＡＥＬＯを使用した。例えば、図１３および１４においては、染色体ＩＩＩからの２つの異なるシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）配列の翻訳体とＭＡＥＬＯとの間の２つのアライメントが示されている。シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ６８７４９）はＧＮＳ１（ＥＬＯ２）との類似性を示すと注釈（アノテーション）されており、もう一方のシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６１９５４）はＧＮＳ１およびＳＵＲ４（ＥＬＯ３）の両方に類似していることが認められた。これらは、イントロンをゲノム配列から除去しエキソンを集合させ翻訳したスプライス化ＤＮＡ断片である。シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）由来の推定ＰＵＦＡエロンガーゼと翻訳ＭＡＥＬＯとの間のアミノ酸同一性の量は約３０％である。これは、脂肪酸代謝における共通の機能（例えば、ＰＵＦＡエロンガーゼ）を示すものであろう。図１５は、染色体ＩＩＩからの翻訳されたシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ００３１３４）のもう１つの例である。該ＤＮＡ配列は、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ２に対するＤＮＡ相同性を有することが確認された。このＤＮＡ配列およびそのアミノ酸翻訳の更なる研究により、翻訳されたＭＡＥＬＯに対する相同性が存在することが確認された。したがって、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）はＰＵＦＡエロンガーゼを含有する可能性がある。
【０２４５】
図１６は、それぞれマウスおよびヒト由来の翻訳ＤＮＡ配列と翻訳ＭＡＥＬＯとのアライメントを示す。マウス配列ＣＩＧ３０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ９７１０７）は褐色脂肪組織から単離され、「酵母ＳＵＲ４タンパク質に類似している」と報告された。図１６に示すとおり、該Ｕ９７１０７翻訳中のアミノ酸番号１３０〜１５２は、該翻訳ＭＡＥＬＯに対して高度の類似性を含有する。第４染色体からのヒト配列ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ００４０５０はＨＴＧＳ（Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からのものであった。この配列も関する注釈（アノテーション）は無かった。しかし、翻訳ＡＣ００４０５０は、翻訳ＭＡＥＬＯに対して１５０アミノ酸において２８．７％の同一性を有していた。この遺伝子断片は、翻訳ＭＡＥＬＯに対するそのアミノ酸類似性に基づけば、ヒトＰＵＦＡエロンガーゼの断片でありうる。
【０２４６】
図１７は、翻訳ＭＡＥＬＯと哺乳類配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｉ０５４６５、ＰＣＴ＃ ＷＯ ８８／０７５７７）とのアミノ酸アライメントを示し、これは、この配列の発現から誘導されたタンパク質がグリコシル化抑制因子であることを示している。それらの２つのタンパク質の間のアミノ酸同一性は、ＰＵＦＡエロンガーゼ活性のような関連した機能が存在しうることを示している。
【０２４７】
他の翻訳ＤＮＡ配列のこれらの具体例および翻訳ＭＡＥＬＯに対するそれらの相同性は、前記具体例のいずれかが潜在的にＰＵＦＡエロンガーゼでありうることを示している。これらの具体例は、考えられうる全てのエロンガーゼを含んでいるわけではない。しかし、データベース検索のためのクエリー（query）配列としてＭＡＥＬＯまたはそのアミノ酸翻訳体を使用することにより、ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を有する他の遺伝子を同定することが可能である。
【０２４８】
実施例ＶＩ
プラークハイブリダイゼーション法を用いるエム・アルピナｃＤＮＡライブラリースクリーニング
追加的なＰＵＦＡエロンガーゼ遺伝子をエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）から単離するために、通常のプラークハイブリダイゼーション法を用いて、ラムダベクター中に作製されたエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。該ＤＮＡプローブは、ＭＡＥＬＯヌクレオチド配列に基づき作製し、それを使用して、λＺｉｐｌｏｘベクター（Ｋｎｕｔｚｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０−２９３６６（１９９８））中に作製されたＭ７＋８ エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【０２４９】
該ライブラリーをスクリーニングするためのＤＮＡプローブを作製するために、ＭＡＥＬＯ ｃＤＮＡをＮｓｐＩおよびＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。約３００ｂｐの平均サイズを有する３つの小さなＤＮＡ断片を得、プローブとして使用した。断片化ＭＡＥＬＯ ｃＤＮＡの混合物を使用する根拠は、エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）中に存在する種々のＰＵＦＡエロンガーゼ間で保存されたアミノ酸配列中に共通の領域またはドメインが存在しうるという仮定に基づいていた。ＭＡＥＬＯ ＤＮＡプローブを使用して、標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）に従うプラークハイブリダイゼーション技術により、該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【０２５０】
簡単に説明すると、５０，０００個の一次クローンをプレーティングし、ナイロンメンブレンにトランスファーした。該メンブレンを変性させ、２０％ ホルムアミド、０．２％ ＰＶＰ、ＢＳＡ、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．１％ ＳＤＳおよび０．５Ｍ ＮａＣｌを含有するハイブリダイゼーションバッファー中、アルファ３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識ＭＡＥＬＯ ＤＮＡプローブで一晩ハイブリダイズさせた。該フィルターを０．５×ＳＳＣで３７℃で洗浄し、オートラジオグラフィーのためにＸ線フィルムにさらした。この方法を３回繰返した。繰返しハイブリダイズした４個のクローン（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４と称される）を拾い、７％ ＤＭＳＯを含有するＳＭバッファー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲）に懸濁させた。
【０２５１】
各候補体の最大のオープンリーディングフレームを酵母発現ベクターｐＹＸ２４２（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）内にサブクローニングした。ｃＤＮＡクローンＦ１およびＦ３をｐＸＹ２４２内にＥｃｏＲＩ部位においてサブクローニングし、一方、Ｆ２およびＦ４をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位においてサブクローニングした。各候補体を含有する組換えｐＸＹ２４２を、酵母内での発現のためにＳＣ３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前掲）内に形質転換した。該エロンガーゼ活性および基質特異性を測定するために、各ｃＤＮＡクローンを含有するＳＣ３３４を、実施例ＩＩＩに記載のとおりに２５μＭのＧＬＡ基質の存在下、ロイシンを欠く最少培地中で増殖させた。該脂肪酸分析は、Ｋｎｕｔｚｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０−２９３６６（１９９８））に記載されているとおりに行った。結果が示しているとおり、これらの４つのｃＤＮＡクローンはいずれも、ＧＬＡからＤＧＬＡへの変換における有意な活性を何ら示さなかった。したがって、該ハイブリダイゼーションアプローチは、追加的なＰＵＦＡの同定において不成功に終わったようであった。
【０２５２】
実施例ＶＩＩ
酵母におけるエム・アルピナの直接的ｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築
ＭＡＥＬＯ以外のＰＵＦＡエロンガーゼ遺伝子を同定するために、異なるアプローチを採用してエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。特に、パン酵母は、それぞれのデサチュラーゼおよびエロンガーゼを有さないことから長鎖ＰＵFＡを産生し得ないため、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の発現ｃＤＮＡライブラリーを構築することを試みた。エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるｃＤＮＡライブラリーの発現には、ＧＡＬ１プロモーターを含有するベクターｐＹＥＳ２（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を選択した。
【０２５３】
連結ＤＮＡ混合物の直接的なエレクトロポレーションによる形質転換効率は、精製されたスーパーコイルプラスミドＤＮＡの効率と比較して非常に低いため、ｃＤＮＡライブラリーを作製する通常の方法（すなわち、宿主細胞内へのｃＤＮＡ／ベクター連結ＤＮＡ混合物の形質転換）は酵母においては困難である。しかし、この方法の大きな利点は、該ライブラリーが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で中間体として作製される場合に生じる一次クローンの増幅の回避にある。スクリーニングされるコロニー数における制限のため、まず、ｃＤＮＡ／ベクター連結混合物を使用する種々のエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株における形質転換の効率を最適化することに決めた。最良の結果は、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＳＣ３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前掲）において連結ＤＮＡ １μｇ当たり４〜５×１０５個の形質転換体の収量と共に得られた。
【０２５４】
直接的なエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製するために、全ＲＮＡを該真菌から単離した。エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）真菌（ＡＴＣＣ ＃ ３２２２１）をコーンミール寒天（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）上に蒔いて培養し、室温で３〜４日間増殖させた。真菌の増殖が視覚的に認められたら、それを５０ｍｌのポテトデキストロースブロス中に播種し、非常にゆっくり室温で振とうして胞子を形成させた。胞子が視覚的に認められたら、該５０ｍｌ培養をポテトデキストロースの１リットル培養中に播種し、胞子を７２時間成長させた。滅菌ガーゼで濾過した後、後のＲＮＡ抽出のために該細胞を直ちに液体窒素中に凍結した。ホットフェノール／ＬｉＣｌ抽出法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲）を用いて、３６ｇの細胞ペレットから全ＲＮＡを調製した。該細胞ペレットを、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳおよび２００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）溶液中でホモジナイズした。フェノールおよびクロロホルムを該ホモジネートに加え、該水層を抽出した。該水層をフェノールおよびクロロホルムで、もう一度逆抽出した。ついで等容積の４Ｍ 塩化リチウムを加えた。該サンプルを氷上で３時間エタノール沈殿させ、遠心分離によりペレットを得た。該ＲＮＡペレットを７０％ エタノールで洗浄し、ＤＥＰＣ処理水に再懸濁させた。全ＲＮＡを分光光度法により定量し、２８Ｓおよび１８Ｓリボソームバンドの存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動により可視化した。３６グラムの細胞ペレットから約１５ｍｇの全ＲＮＡを得た。
【０２５５】
該ライブラリーは、標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）に従い構築した。オリゴｄＴセルロースアフィニティー精製を用いて、全ＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡを調製した。ＡＭＶ逆転写酵素を使用して、ＸｈｏＩ制限部位を含有するオリゴｄＴプライマーでメッセンジャーＲＮＡを逆転写した。第１鎖ｃＤＮＡの合成の後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼおよびＲＮアーゼＨを加えることにより第２鎖のｃＤＮＡを合成した。
【０２５６】
該ＥｃｏＲＩアダプターをＴ４ ＤＮＡリガーゼにより平滑末端化ｃＤＮＡ内に連結した。該ｃＤＮＡサンプルを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化し、ＸｈｏＩで消化し、カラムバッファーで希釈し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００カラムに通した。該ＤＮＡサンプルを高塩バッファーにより溶出した。４００〜５，０００ｂｐのＤＮＡを含有するサンプルをプールし、ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内への連結に使用した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、該ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＹＥＳ２ベクター内に連結した。酵母の直接形質転換には大量の該連結ＤＮＡ（２〜３μｇ）が要求されるため、大規模な連結反応を行った。
【０２５７】
ｃＤＮＡ／ｐＹＥＳ２連結混合物で直接的に酵母細胞を形質転換するために、ＬｉＡｃ ＴＲＡＦＯ法（Ｇｉｅｔｚら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，５：２５５−２６９，１９９５）を用いてコンピテントＳＣ３３４細胞を調製した。簡単に説明すると、該プレートからのＳＣ３３４の新鮮培養を５０ｍｌのＹＰＤ培地内に播種した。ＯＤ６００で１．０に達するまで、該培養を振とうしながら３０℃で成長させた。３０ｍｌのこの出発物を３００ｍｌのＹＰＤ液体培地内に播種し、該培養の細胞数が３〜５×１０６細胞／ｍｌに達するまで（約３〜４時間）、振とうしながらインキュベートした。該細胞を回収し、無菌水で洗浄した。該全細胞ペレットを１．５ｍｌの新鮮に調製された１×ＴＥ／ＬｉＡｃ（０．１Ｍ ＬｉＡｃ）に再懸濁した。これらの細胞を直ちに該形質転換に使用した。
【０２５８】
７５０μｌのコンピテントＳＣ３３４細胞を１５ｍｌのファルコンチューブ内に分注した。約２μｇのｃＤＮＡ／ｐＹＥＳ２連結ＤＮＡを担体ＤＮＡと共に該細胞に加え、穏やかに混合した。３ｍｌの無菌４０％ ＰＥＧ／ＬｉＡｃを該細胞に加え、穏やか且つ十分に混合した。該細胞を振とうしながら３０℃で３０分間インキュベートし、ついで４２℃で１５分間にわたり熱ショックを与えた。該細胞を冷却し、ペレット化し、５ｍｌの１×ＴＥに再懸濁した。１００μｌ アリコートの前記細胞を、ウラシルを欠く５０個の１５０ｍｍ 選択寒天プレート（Ａｕｓｕｂｅｌら，前掲）上にプレーティングし、３０℃で３日間にわたりインキュベートした。合計８×１０５個の一次クローンを得た。５個のコロニーを、ウラシルを欠く１ｍｌ 最少培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前掲）中にプールし、グリセロールを加えてストックを調製した。スクリーニング用に合計５，０００個のプールを作製した。
【０２５９】
実施例ＶＩＩＩ
酵母におけるＭＡＤ（エム・アルピナ直接）スクリーニング
該ライブラリー中のｃＤＮＡの平均サイズを測定することにより、該ライブラリーの質を分析した。該ライブラリーのスクリーニングは該ｃＤＮＡの発現に基づくものであったため、該ライブラリー中に存在するｃＤＮＡの平均サイズを測定することが重要であった。関心のある完全長ｃＤＮＡを単離するためには、最長ｃＤＮＡを含有する発現ライブラリーが最適な選択肢であろう。この目的のために、実施例ＶＩＩに記載のとおりに、ランダムに選択されたプールを選択寒天プレート上にプレーティングして、個々のコロニーを得た。４０個の異なる酵母コロニーをランダムに拾い、各コロニーを、ウラシルを欠く５ｍｌの選択液体培地（実施例ＶＩＩに記載のとおり）内に播種し、振とうしながら３０℃で２４時間にわたり成長させた。以下のとおりに適合させたビーズ・ビーティング（ｂｅａｄ ｂｅａｔｉｎｇ）法（Ｈｏｆｆｍａｎら，Ｇｅｎｅ ５７：２６７（１９８７））により、これらのコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０２６０】
５ｍｌの培養からのペレットを０．５ｍｌの１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ ＳＤＳ溶液中で細胞溶解した。等容積の無菌０．５ｍｍ ガラスビーズを加え、手動で３分間ボルテックスした。２００μｌのその同じバッファーを加え、該混合物を更に１分間ボルテックスした。該サンプルを高速で２分間遠心分離し、ついで細胞質抽出物を新たなチューブに移した。等容積のフェノール／ＣＨＣｌ３を該サンプルに加え、ボルテックスし、更に２分間遠心分離した。該水層を２回再抽出し、０．３Ｍ 酢酸ナトリウムおよび約２．５容積のエタノールで−２０℃で３０分間沈殿させた。該沈殿物を７０％ エタノールで洗浄し、水に再懸濁した。ＲＮＡおよび有りうるタンパク質混入物を除去するために、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを製造業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従い使用して、４０個の異なるサンプルから単離されたプラスミドＤＮＡを更に精製した。ついで該プラスミドＤＮＡサンプルをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで制限酵素処理して該ｃＤＮＡ断片を遊離させ、該消化物を１％ アガロースゲル上で分析した。結果は、該直接ライブラリーのｃＤＮＡの大多数が０．８Ｋｂ〜１．５Ｋｂの様々な長さであることを示した。
【０２６１】
該ライブラリーをスクリーニングするために、該グリセロールストックを融解し、約０．５ｍｌを、ウラシルを欠く５ｍｌの液体選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前掲）に加え、３０℃で２４時間成長させた。ついで該培養を、２％ ガラクトースおよび２５μＭ ＧＬＡ（該エロンガーゼ酵素の基質）と共にウラシルを欠く５０ｍｌの液体選択培地に２５℃で２４時間移し振とうした。各誘導培養の細胞ペレット中の脂質含量のＧＣ−ＦＡＭＥ分析を、既に記載されているとおり（Ｋｎｕｔｚｏｎら，前掲）に行った。ＭＡＥＬＯ（ロイシンを欠く選択培地中で増殖させたｐＸＹ２４２中のｐＲＡＥ−５）を、各バッチ実施における陽性対照として使用した。ＭＡＥＬＯは、一貫して、１．５％のＧＬＡをＤＧＬＡに変換することができた（実施例ＩＩＩを参照されたい）。
【０２６２】
実施例ＩＸ
潜在的ＰＵＦＡエロンガーゼをコードするｃＤＮＡの同定
実施例ＶＩＩＩに記載のとおりにＧＣ−ＦＡＭＥ分析により約７５０個のプールをスクリーニングし分析した後、５個のコロニーのプール１個（すなわち、ＭＡＤ７０８）は、ＧＬＡからＤＧＬＡへの変換における有意な酵素活性を有しているらしかった。この活性は、ＤＧＬＡ／ＧＬＡ比率に関してエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ活性（ＭＡＥＬＯ）より約５倍高いことが判明した（図１９）。該初期知見を確認するために、このプールを同一アッセイ条件下で再び試験した。該反復実験は、ＧＬＡからＤＧＬＡへの９．５％の変換を示し、この場合も、エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ活性（ＭＡＥＬＯ）より約５倍高かった。これらの結果は、該ＭＡＤ７０８プールが、基質としてのＧＬＡに特異的なエロンガーゼ候補を含有することを強く示した。ＭＡＤ７０８は５個の異なるクローンのプールであったため、このプールから、エロンガーゼ活性をコードする個々のｃＤＮＡクローンを単離することが必要であった。これを行うために、元のＭＡＤ７０８グリセロールストックを、ウラシルを欠く選択培地寒天プレート（Ａｕｓｕｂｅｌら，前掲）上にプレーティングした。３０個のコロニーを拾い、ＧＬＡの存在下、実施例ＶＩＩＩに既に記載されているとおり、２％ ガラクトースを含有しウラシルを欠く液体選択培地中で成長させた。ついで、各培養から得た細胞ペレットを、３３４（ｐＲＡＥ−５）（ｐＹＸ２４２中のＭＡＥＬＯ）の陽性対照と共に脂肪ＧＣ−ＦＡＭＥ分析（Ｋｎｕｔｚｏｎら，前掲）に付した。酵母におけるＭＡＤ７０８発現プールからの３０個のクローンからの脂肪酸分析が示すとおり、３０個中５個のクローンがＧＬＡからＤＧＬＡへの変換におけるエロンガーゼ活性を示した。該活性クローンＭＡＤ７０８−２、ＭＡＤ７０８−１０、ＭＡＤ７０８−１８、ＭＡＤ７０８−１９およびＭＡＤ７０８−３０の脂肪酸プロフィールを図２０に示す。この図に示すとおり、ＭＡＤ７０８−２、１０および３０は、最も大量のＤＧＬＡを産生し、それはＭＡＥＬＯ（ｐＲＡＥ−５）の約２５倍以上に相当した。これらの３つは、４１％〜４９％の範囲のＧＬＡをＤＧＬＡに変換した。他のクローンＭＡＤ７０８−１８およびＭＡＤ７０８−１９は、それぞれ８％および２１％のＧＬＡをＤＧＬＡに変換した。すべてのＭＡＤ７０８クローンは、ＭＡＥＬＯをコードするエロンガーゼの場合（３．４％）より高い割合のＧＬＡをＤＧＬＡに変換した。
【０２６３】
実施例Ｘ
エロンガーゼをコードするｃＤＮＡの特徴づけ
実施例ＶＩＩＩに記載のとおり、ビーズ・ビーティング法により、有意なＧＬＡ特異的エロンガーゼ活性を示すＳＣ３３４酵母クローン（ＭＡＤ７０８プール）からプラスミドＤＮＡを抽出した。該ｃＤＮＡインサートのサイズを測定するために、陽性エロンガーゼクローンから得た各プラスミドＤＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲを行った。フォワードプライマーＲＯ５４１（５’−ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＡＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＴＡＡ ＴＡＣ−３’）およびリバースプライマーＲＯ５４０（５’−ＧＴＧ ＡＡＴ ＧＴＡ ＡＧＣ ＧＴＧ ＡＣＡ ＴＡＡ−３’）はｐＹＥＳ２ベクターのマルチクローニング部位中に存在し、それらを使用して、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位内のｃＤＮＡインサートを増幅した。４μｌのプラスミドＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各プライマー、５μｌの１０×バッファー、１μｌの１０μＭ ＰＣＲヌクレオチド混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および０．５μｌのＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有する５０μｌの容積中で、ＰＣＲ反応を行った。該増幅は以下のとおりに行った：９４℃で２分間の変性、ついで９４℃で１分間、５５℃で２分間および７２℃で３分間の３０サイクル、ならびに該増幅の最後に７２℃で７分間の伸長。１％ アガロースゲル上でのＰＣＲ増幅産物の分析は、該エロンガーゼｃＤＮＡのサイズが約１．０〜１．２Ｋｂであることを示した。潜在的エロンガーゼｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡを、ｐＲＰＢ２、ｐＲＰＢ１０、ｐＲＰＢ１８、ｐＲＰＢ１９およびｐＲＰＢ３０と命名した。該ｃＤＮＡライブラリーはｐＹＥＳベクター中でＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位において作製されたため、前記プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化することにより、各プラスミド中に存在するｃＤＮＡのサイズを更に確認した。
【０２６４】
酵母から単離したプラスミドＤＮＡを、該ｃＤＮＡクローンの長期保存およびＤＮＡ配列決定のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で再増幅した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）細胞を、該製造業者のプロトコールに従い、ｐＲＰＢ組換えプラスミドで形質転換した。各プラスミドＤＮＡから得た形質転換体を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ中に播種し、振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を該製造業者のプロトコールに従い使用して、これらの培養からプラスミドＤＮＡを単離した。ついで該精製プラスミドＤＮＡを、５’および３’の両末端からの配列決定に使用した。該ＤＮＡ配列決定は、３７３Ａ Ｓｔｒｅｔｃｈ ＡＢＩ自動ＤＮＡシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を該製造業者のプロトコールに従い使用して行った。配列決定に使用したプライマーは、ｐＹＥＳベクターのマルチクローニング部位中に含有されたフォワードプライマーＲＯ５４１（５’−ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＡＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＴＡＡ ＴＡＣ−３’）およびリバースプライマーＲＯ５４０（５’−ＧＴＧ ＡＡＴ ＧＴＡ ＡＧＣ ＧＴＧ ＡＣＡ ＴＡＡ−３’）であった。得られたヌクレオチド配列を、分析のためにＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアプログラム（Ｇｎｅｎ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）に移した。該ＤＮＡ配列分析は、全５個のエロンガーゼｃＤＮＡが、３０１ヌクレオチドの共通の重複を有する同一ヌクレオチド配列を含有することを示した。各ＤＮＡ配列は、５’末端の開始位置に推定開始部位を、そして３’部位の末端にポリＡ尾部と共に終結コドンを含有する。該ＤＮＡ配列を更に確認するために、内部フォワードプライマーＲＯ７２８（５’−ＧＡＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＧＣ ＧＧＴ ＴＣＧ−３’）およびＲＯ７３０（５’−ＴＣＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＧＴ ＴＧＡ ＡＣＴ ＣＧ−３’）、ならびにリバースプライマーＲＯ７２９（５’−ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＴＴ ＧＡＣ ＣＴＣ ＧＡＡ Ｃ−３’）およびＲＯ７３１（５’−ＡＡＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＣＧ ＴＧ−３’）を該ｃＤＮＡ内で設計し、ｐＲＰＢ２の配列決定にそれらを使用した。なぜなら、この候補体は、最高のエロンガーゼ活性を有していたからである。該全ヌクレオチド配列をＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒプログラムにより分析し（図２１）、ｐＲＰＢ２中の全ｃＤＮＡ配列から推定された最長のオープンリーディングフレームは９５７ｂｐ長であるらしかった（図２２）。ついで該推定オープンリーディングフレームを対応アミノ酸配列に翻訳し、該推定配列を図２３に示す。エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）から同定されたｃＤＮＡ（ｐＲＰＢ２）にコードされるエロンガーゼは、翻訳ＭＡＥＬＯとほぼ同じサイズである３１８アミノ酸長のタンパク質であるらしい。この新規エロンガーゼｃＤＮＡを「ＧＬＥＬＯ」と命名し、それがコードするタンパク質を「ＧＬＡエロンガーゼ」と命名した。
【０２６５】
プラスミドＤＮＡ ｐＲＰＢ２は、ブダペスト条約の条項に基づきＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に１９９９年７月２２日に寄託されている。それにはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０２が付与されている。
【０２６６】
実施例ＸＩ
ＧＬＡエロンガーゼ（ＧＬＥＬＯ）の生化学的特徴づけ
Ａ．ＧＬＡエロンガーゼ活性の確認
ｐＲＰＢ２組換えプラスミドにコードされるＧＬＡエロンガーゼの活性を更に確認するために、ｐＲＰＢ２プラスミドを含有する酵母クローンＳＣ３３４について、エロンガーゼ活性のスクリーニングを繰返した。この実験を行ったのは、一貫した脂質抽出を確認するため及び４個の独立した実験を平均することによりＧＬＡエロンガーゼの活性を検出するためでもあった。ｐＲＰＢ２を含有するエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４グリセロールストックを、ウラシルを欠く最少培地寒天プレート上にプレーティングした。個々のコロニーをランダムに拾い、ウラシルを欠く最少培地中で成長させた（実施例ＶＩＩＩに記載のとおり）。それらの４個の独立した培養を一緒にし、５ｍｌ アリコートを、４個の別々の５０ｍｌ 培養のための播種物として使用した。ついで該培養をＧＬＡの存在下で成長させ、ｐＹＥＳ２を含有するエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４の陰性対照と共に脂肪酸分析に付した（実施例ＶＩＩＩに記載のとおり）。２５μＭ ＧＬＡの存在下の３３４（ｐＲＰＢ２）の４個の独立した培養からの平均エロンガーゼ活性を図２４に示す。３３４（ｐＲＰＢ２）のそれらの４個の独立したサンプルのそれぞれのＧＬＡエロンガーゼ活性は、６２％のＧＬＡからＤＧＬＡへの平均変換率に符合しているらしかった。
【０２６７】
Ｂ．ＧＬＡエロンガーゼのＧＬＥＬＯ基質特異性の測定
ＧＬＡエロンガーゼの基質特異性を分析するために、ＧＬＡ以外の種々の脂肪酸基質（例えば、ＳＡ（１８：０）、ＯＡ（１８：１）、ＬＡ（１８：２ｎ−６）、ＡＡ（２０：４ｎ−６）、ＡＤＡ（２２：４ｎ−６）、ＡＬＡ（１８：３ｎ−３）、ＳＴＡ（１８：４ｎ−３）およびＥＰＡ（２０：５ｎ−３））で３３４（ｐＲＰＢ２）の培養を試験した。同一アッセイ条件下、該エロンガーゼ酵素により利用された唯一の他の基質は、ｎ−３経路からの脂肪酸であるＳＴＡであった。ＧＬＡエロンガーゼは７３％のＳＴＡを２０：４ｎ−３に変換することができた（図２５）。これらの実験から、ＧＬＡエロンガーゼは、ＧＬＡおよびＳＴＡの両方に対する基質特異性を有すると結論づけることができ、このことは、それがｎ−６およびｎ−３の両方の経路に沿ったエロンガーゼ活性を有することを示している。
【０２６８】
Ｃ．酵母における真菌ＧＬＥＬＯおよびΔ５−デサチュラーゼ遺伝子の共発現
ＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）がＧＬＡエロンガーゼにより産生されたら、所望の共発現系においてΔ５−デサチュラーゼがそれをＡＡ（２０：４ｎ−６）に変換しうる。図１に示されているこのスキームは、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４をプラスミドｐＲＰＢ２およびｐＲＰＥ３１（ＥｃｏＲＩ部位においてクローニングされたΔ５−デサチュラーゼｃＤＮＡ（図１８）を含有する組換えプラスミドｐＹＸ２４２）で同時形質転換することにより試験されうる。該同時形質転換酵母培養を２５μＭ ＧＬＡで補足し、ＡＡの合成に関して分析した。エロンガーゼおよびΔ５−デサチュラーゼの両方の酵素が発現されれば、該ＧＬＡ基質はＤＧＬＡに変換され、ついでこれはＡＡに変換されるであろう。図２６Ａに示す結果は、ＧＬＡ基質に対するＧＬＡエロンガーゼおよびΔ５−デサチュラーゼの逐次的作用が、平均して２７％のＧＬＡをＡＡに変換したことを示している。したがって、ＧＬＡエロンガーゼは、ｎ−６ ＰＵＦＡ合成経路内の他の酵素と共に作用して所望の脂肪酸を産生する能力を有する。
【０２６９】
前記変換がｎ−３経路においても当てはまるか否かを判定するために、同様の共発現実験を２５μＭ ＳＴＡの存在下で行った。この場合も、両方の酵素が発現されれば、該ＳＴＡ基質は２０；４ｎ−３に変換され、ついでこれはΔ５−デサチュラーゼによりＥＰＡ（２０：５ｎ−３）に変換されるであろう。図２６Ｂは、ＥＰＡの産生（約４０％）が観察された結果を示す。この場合にも、ＧＬＡエロンガーゼは、それがｎ−３経路内のΔ５−デサチュラーゼと共に作用して所望の脂肪酸を産生する能力を示している。
【０２７０】
実施例ＸＩＩ
ＧＬＥＬＯと他の真菌エロンガーゼとの配列比較
ＧＬＥＬＯ配列を公知タンパク質配列と比較するために、ＧＣＧの配列解析パッケージ（実施例Ｉを参照されたい）を使用した。ＧＬＥＬＯオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を、まず、アミノ酸配列に翻訳し、それをクエリー（query）配列として使用して、ＦａｓｔＡアルゴリズム（実施例Ｉを参照されたい）を使用してＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（実施例Ｉを参照されたい）を検索した。アミノ酸配列類似性に基づけば、最良のマッチは、１８９アミノ酸の重複において３３．９％の同一性を有するエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＪＴ６（未知アノテーションを有するＥＳＴ）、２９５アミノ酸の重複において２５．８％の同一性を有するエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）、および３１３アミノ酸の重複において２５．２％の同一性を有するエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）で見出された。ＧＬＥＬＯとＭＡＥＬＯとのＦａｓｔＡアライメントは、２７５アミノ酸において３０．９％の同一性を示した（図２７）。ＧＣＧ Ｐｉｌｅｕｐプログラムは、進行的ペアワイズアライメントを用いて関連配列群からマルチプル（複数）配列アライメントを生成し（実施例Ｉを参照されたい）、前記のエロンガーゼで使用された。そのＰｉｌｅｕｐの結果は、それらのエロンガーゼ間には、下線で示された推定ヒスチジンボックス（Ｋｎｕｔｚｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７３：２９３６０−２９３６６，１９９８）（図２８）を含む多数の保存領域が存在することを示している。したがって、ＧＬＥＬＯはＭＡＥＬＯに対して類似性を有するが、それらがコードするエロンガーゼにおける相違は恐らく、それらの基質優先性（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）によるものであろう。ＧＬＡエロンガーゼは、エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼより高い割合のＧＬＡをＤＧＬＡに変換しうる。さらに、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＭＡＥＬＯ発現は、ＧＬＡからＤＧＬＡへの伸長に加えて、飽和および一価不飽和脂肪酸の伸長を示した（実施例ＩＩＩを参照されたい）。
【０２７１】
実施例ＸＩＩＩ
哺乳類におけるエム・アルピナＭＡＥＬＯホモログの同定
ＭＡＥＬＯ翻訳配列を使用して、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１００ Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ Ｒｄ．、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６００６４のＵｎｉｆｉｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｄａｔａｂａｓｅを検索した。このデータベースは、「クエリー（query）配列がタンパク質であるかＤＮＡであるかにかかわらず入手可能な配列データベースのすべてを探るために設計された一組の類似性検索プログラムである」Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を使用して検索した。特に、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用した（すなわち、６個のリーディングフレームにおいて翻訳されたヌクレオチドデータベースに対するタンパク質クエリー（query）検索）。Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｄａｔａｂａｓｅ中のコンティグ（ＣＣ）配列は、一定の配列相同性に基づき一緒にクラスター化され配列重複性に基づき集められたＥＳＴのＩｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱ（商標）データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，３１７４ Ｐｏｒｔｅｒ Ｄｒｉｖｅ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ ９４３０４）から及びパブリックドメインから誘導された発現配列タグ（ＥＳＴ）ｃＤＮＡ群を代表するコンセンサス配列である。このデータベースからの２つの配列、すなわち、ＣＣ０６７２８Ｒ１およびＣＣ１４８４５４８Ｔ１は、該翻訳ＭＡＥＬＯ配列に対して、それぞれ２４２アミノ酸の重複において２８％の同一性を、そして２６６アミノ酸の重複において２８．６％の同一性を有していた。それらの２つの誘導され編集された配列は、それぞれｈｓ１およびｈｓ２と称され、ＧＣＧの配列解析ソフトウェアパッケージ（実施例Ｉを参照されたい）にコピーされた。図２９および３０にそれぞれ示すとおり、該翻訳ＭＡＥＬＯ配列を、翻訳ＨＳ１（２４２アミノ酸において２８．５％の同一性）およびＨＳ２（２６６アミノ酸において２８．２％の同一性）ｃＤＮＡ配列に対して、ＦａｓｔＡアルゴリズムを使用してアラインさせた。ＨＳ１ ｃＤＮＡヌクレオチド配列はまた、Ｉ０５４６５ヌクレオチド配列（実施例Ｖを参照されたい）に対して８４４ｂｐにおいて８６．９％の同一性を示した。該翻訳ＨＳ２ ｃＤＮＡ配列は、アクセッション番号Ｗ７４８２４を有するＧｅｎＢａｎｋからのアミノ酸配列（公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９８３９４４８を参照されたい）に対して１００％の同一性を有していた。
【０２７２】
ＡＣ００４０５０（ＴＦａｓｔＡ検索において同定されたヒト配列；実施例Ｖを参照されたい）から翻訳された２８アミノ酸の配列（ＤＴＩＦＩＩＬＲＫＱＫＬＩＦＬＨＷＹＨＨＩＴＶＬＬＹＳＷ）と共にｔｂｌａｓｔを使用してデータベース検索を行うために、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を用いた。このアミノ酸配列はヒスチジンボックス（下線部）を含有し、これは、デサチュラーゼ（Ｋｎｕｔｚｏｎら，前掲）ならびに両方のＰＵＦＡエロンガーゼ、ＭAＥＬＯおよびＧＬＥＬＯの顕著なモチーフを有する（図２８を参照されたい）。実施例Ｖに既に示されている翻訳マウス配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ９７１０７）および翻訳シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４１０１１）は、この２８アミノ酸のクエリー（query）配列に対して最高のマッチを有していた。翻訳Ｕ４１０１１をクエリー（query）配列として使用して、ｔｂｌａｓｔｎで該ＮＣＢＩマウスＥＳＴデータベースを再び検索した。追加的なマウス配列が同定され（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１４０３３．１）、「脂肪酸伸長に関与していると推定される」と注釈された。より長い３つの配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡ５９１０３４，ＡＡ１８９５４９およびＡＡ８３９３４６）が、翻訳ＡＦ０１４０３３．１でのマウスＥＳＴデータベースのｔｂｌａｓｔｎ検索により同定され、ｍｍ２と称される１つの配列に合体された。翻訳ｍｍ２およびＭＡＥＬＯのＦａｓｔＡアライメント（実施例Ｉを参照されたい）を図３１に示す。もう１つの関連しているが同一ではないマウス配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＩ２２５６３２）も、ＡＦ０１４０３３．１でマウスＥＳＴデータベースのｔｂｌａｓｔｎ検索において同定された。翻訳ＡＩ２２５６３２とＭＡＥＬＯとのＦａｓｔＡアライメントを図３２に示す。翻訳ＭＡＥＬＯに対する翻訳ＭＭ２およびＡＩ２２５６３２の両方の同一性（％）は、それぞれ１９１および１１５アミノ酸の重複において３０．４％であった。これらの２つの翻訳マウス配列と翻訳ＭＡＥＬＯとのアミノ酸同一性のレベルは、それらがＰＵＦＡエロンガーゼの推定ホモログであることを証明している。
【０２７３】
実施例ＸＩＶ
哺乳類におけるエム・アルピナＧＬＥＬＯホモログの同定
６個のリーディングフレームのそれぞれにおいて翻訳されたデータベースＤＮＡ配列に対してタンパク質配列を比較するＴＦａｓｔＡアルゴリズムを、クエリー（query）配列としての翻訳ＧＬＥＬＯと共に使用した。他の潜在的エロンガーゼ配列を翻訳ＧＬＥＬＯに対するそれらのアミノ酸類似性に基づき同定するために、ＧＣＧからのＧｅｎＥＭＢＬデータベースを使用した。３つのヒト配列が、該ＧＬＥＬＯアミノ酸配列に対してマッチを有することが判明した。これらの配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号１）ＡＩ８１５９６０、２）ＡＬ０３４３７４および３）ＡＣ００４０５０を有する。ホモ・サピエン（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎ）ＥＳＴ配列であるＡＩ８１５９６０は、翻訳ＧＬＥＬＯに対して１４４アミノ酸の重複において４０．３％の同一性を有する（図３３を参照されたい）。第ＶＩ染色体由来のヒトゲノム配列ＡＬ０３４３７４の翻訳領域は、翻訳ＧＬＥＬＯに対して６０アミノ酸の重複において４６．７％の同一性を有する。ＡＬ０３４３７４におけるこの相同領域は、翻訳ＭＡＥＬＯに対する相同性を有することが示されたＨＳ１アミノ酸配列の一部であるらしかった（実施例ＸＩＩＩを参照されたい）。したがって、ＨＳ１配列は、ＭＡＥＬＯ（図２９を参照されたい）およびＧＬＥＬＯ（図３４を参照されたい）の両方に対して類似性を有する。第ＩＶ染色体由来のヒトゲノム配列ＡＣ００４０５０の翻訳領域は、翻訳ＧＬＥＬＯに対して８９アミノ酸の重複において３４．８％の同一性を有する（図３５を参照されたい）。ＧＬＥＬＯとこれらのヒト配列との間のアミノ酸同一性は、これらのヒト配列由来のタンパク質がＰＵＦＡエロンガーゼ活性のような関連機能を有しうることを示している。
【０２７４】
ＧＬＥＬＯに類似したマウスｃＤＮＡを同定するために、翻訳ＧＬＥＬＯをクエリー（query）配列として使用してＧｅｎＥＭＢＬデータベースでＴＦａｓｔＡ検索を行った。該ＴＦａｓｔＡ検索から、翻訳ＧＬＥＬＯに対して最高のマッチを有する以下の３つのマウス配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号１）ＡＦ１０４０３３、２）ＡＩ５９５２５８および３）Ｕ９７１０７）が同定された。ＡＦ１０４０３３は、「酵母ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）に対して相同性を有する推定脂肪酸エロンガーゼを有するＭＵＥＬタンパク質」と注釈されており、ＭＭ２配列の一部である。該ＭＭ２配列は初めはＡＦ１０４０３３マウス配列から誘導されたが、全ＭＭ２配列は最終的には、更なるマウスＥＳＴデータベース検索により得られ、また、翻訳ＭＡＥＬＯに対して相同性を有することが示された（実施例ＸＩＩＩおよび図３１を参照されたい）。ＦａｓｔＡを使用して、このＭＭ２アミノ酸配列を翻訳ＧＬＥＬＯ配列とアラインさせると、２１１アミノ酸の重複において３４．６％の同一性が見出され（図３６を参照されたい）、このことは、ＭＭ２もＧＬＥＬＯに対する相同性を有することを示している。ＡＩ５９５２５８は、酵母ＥＬＯ３エロンガーゼに対して５’の類似性を有するマウスｃＤＮＡクローンであり、マウスＥＳＴ ｃＤＮＡ ＡＩ２２５６３２の一部である。該ＡＩ２２５６３２マウス配列は、ＡＩ５９５２５８より長い配列であり、翻訳ＭＡＥＬＯに対する類似性を有することが示された（図３２を参照されたい）。また、ＡＩ２２５６３２を該翻訳ＧＬＥＬＯとアラインさせた。該ＦａｓｔＡアライメントを図３７に示す。１９９アミノ酸の重複において３５．３％の同一性が見出されている。第３の配列であるＵ９７１０７（マウス配列）は、「酵母ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）遺伝子に類似している」と注釈されていた。Ｕ９７１０７に対する翻訳ＧＬＥＬＯのＦａｓｔＡアライメントを図３８に示す。この場合には、２７９アミノ酸の重複において２３．７％の同一性が見出された。既に、Ｕ９７１０７の領域は、ＦａｓｔＡアライメントに基づきＭＡＥＬＯに対しても高度の相同性を有することが判明している（実施例Ｖおよび図１６を参照されたい）。
【０２７５】
前記検索は、ＭＡＥＬＯまたはＧＬＥＬＯをクエリー（query）配列として使用することにより、同じヒトおよびマウス配列が得られたことを明らかに示している。
【０２７６】
実施例ＸＶ
他のＰＵＦＡ産生生物におけるエム・アルピナＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯホモログの同定
Ａ）セノラブディティス・エレガンス：
シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の染色体配列から誘導された推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４１０１１）は、ＧＬＡエロンガーゼ（ＧＬＥＬＯ）およびエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）の両方に対するアミノ酸類似性を有するマウスＭＭ２推定ＰＵＦＡエロンガーゼ中に含有される部分配列を同定することができた。したがって、ＧＬＥＬＯまたはＭＡＥＬＯのシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ホモログは該線虫データベース中に存在しうると考えられる。ＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯ配列から誘導された推定アミノ酸配列をクエリー（query）配列として使用して、該線虫データベースを検索した。それぞれシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ゲノム配列決定プロジェクトまたはＥＳＴおよびそれらの対応ｃＤＮＡ配列から得られた推定タンパク質およびｃＤＮＡであるｗｏｒｍｐｅｐ１６（ｂｌａｓｔｐはアミノ酸クエリー（query）配列をヌクレオチド配列データベースに対して比較する）およびｗｏｒｍｐｅｐ １６ｃＤＮＡ（ｔｂｌａｓｔｎ）データベース上で、ＢＬＡＳＴ検索（実施例ＸＩＩＩ）を行った。これらの配列データはシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）配列決定グループにより得られ、Ｓａｎｇｅｒ ＣｅｎｔｒｅおよびＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒにより共同で行われ、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｗｏｒｍｐｅｐ／から入手可能である。少なくとも７個の推定シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）翻訳配列が、ＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯの両方の翻訳アミノ酸配列に対するそれらのアミノ酸配列相同性により同定された。該推定アミノ酸配列を含有するそれらのゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、Ｚ１９１５４、Ｕ６８７４９（２つの推定タンパク質（Ｆ５６Ｈ１１．４およびＦ５６Ｈ１１．３（ｗｏｒｍｐｅｐアクセッション番号））、Ｕ４１０１１、Ｕ６１９５４（２つの推定タンパク質（Ｆ４１Ｈ１０．７およびＦ４１Ｈ１０．８（ｗｏｒｍｐｅｐアクセッション番号））、およびＺ８１０５８として認定されている。下線付きのものは、翻訳ＭＡＥＬＯをクエリー（query）配列として使用するこれまでの検索において同定された（実施例Ｖを参照されたい）。一例として、翻訳Ｕ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）と翻訳ＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯとのＦａｓｔＡアミノ酸アライメントを図３９および４０に示す。翻訳Ｕ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）は、約２００アミノ酸の重複においてエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼおよびＧＬＡエロンガーゼに対して２５〜３０％の同一性を有する（図３９および４０を参照されたい）。全７個の翻訳推定シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ｃＤＮＡに関しては、翻訳ＧＬＥＬＯに対しては、ＦａｓｔＡアライメントは２００アミノ酸の重複において２５〜３０％の同一性であり、一方、翻訳ＭＡＥＬＯに対しては、該同一性は少なくとも１８８アミノ酸の重複において２６〜３４％であった。該アライメント類似性は、エロンガーゼ活性を有するシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）からの潜在的遺伝子を同定するために翻訳ＧＬＥＬＯまたはＭＡＥＬＯが使用されうることを示している。
【０２７７】
Ｂ）キイロショウジョウバエ：
ゲノム配列Ｕ４１０１１（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）からの翻訳推定ｃＤＮＡは、ＮＣＢＩ（実施例ＸＩＩＩを参照されたい）を介した「他のＥＳＴ」データベースのｂｌａｓｔｎ検索（これはヌクレオチドクエリー（query）配列をヌクレオチドデータベースに対して比較する）におけるキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＥＳＴ（アクセッション番号ＡＩ１３４１７３）に対してその最高マッチを有し、重複ＤＮＡ ＥＳＴ断片（アクセッション番号ＡＩ５１７２５５）との集合（アッセンブル）がなされた。それらの２つの重複配列から誘導された翻訳ＤＮＡ断片ＤＭ１を、ＧＣＧ（実施例Ｉを参照されたい）においてＦａｓｔＡを使用して翻訳ＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯとアラインさせた（図４１および４２を参照されたい）。該アライメントは、ＧＬＡエロンガーゼに対しては２０６アミノ酸の重複において２７．２％の同一性を、そしてエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼに対しては２３７アミノ酸の重複において３０％の同一性を示した。したがって、アミノ酸類似性に基づけば、該ＤＭ１は、ＰＵＦＡエロンガーゼ様活性を有するＧＬＥＬＯまたはＭＡＥＬＯの潜在的ホモログでありうる。さらに、データベース検索のためのクエリー（query）配列としてＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯのＤＮＡ配列を使用して、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）からのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を有するホモログが同定されうる。
【０２７８】
実施例ＸＶＩ
ヒトＰＵＦＡエロンガーゼホモログのクローニングおよび発現
多数の潜在的ＰＵＦＡエロンガーゼ配列を、翻訳ＧＬＥＬＯおよび／またはＭＡＬＯに対するそれらのアミノ酸類似性に基づき同定した。本実施例に示すとおり、これらの配列の潜在的エロンガーゼ活性を測定するために、ついで、該完全長タンパク質をコードするｃＤＮＡを同定し、クローニングし、発現させる。
【０２７９】
プライマーＲＯ７１９（５’−ＧＧＴ ＴＣＴ ＣＣＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＣＡＴ ＴＴＴ ＧＡＴ ＧＣＡ ＴＣ−３’）およびＲＯ７２０（５’−ＧＧＴ ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＣＴ ＴＴＧ ＡＣＴ ＴＣＡ ＡＴＣ ＣＴＴ ＣＣＧ−３’）を推定ＨＳ１配列に基づき設計し、それらを使用して、ヒト肝臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を増幅した。５μｌのヒト肝臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各プライマー、１μｌの１０ｍＭ ＰＣＲヌクレオチド混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、５μｌの１０×バッファーおよび１．０ＵのＡｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含有する５０μｌの容積中で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）における加熱サイクル条件は以下のとおりであった。９４℃で２分間、ついで９４℃で１分間、５８℃で２分間、および７２℃で３分間３０サイクル。ＰＣＲの後、７２℃で７分間の追加的な伸長サイクルを行った。
【０２８０】
該ＰＣＲ増幅産物をゲル上で泳動させ、約９６０ｂｐの増幅断片をゲル精製し、該断片の末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃｏｒｐ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で埋め、ｐＣＲ平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内に該製造業者のプロトコールに従いクローニングした。該新規プラスミドをｐＲＡＥ−５２と命名し、このクローン中の推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡを、ＡＢＩ ３７３Ａ Ｓｔｒｅｔｃｈ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。プラスミドｐＲＡＥ−５２中の推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡを図４３に示し、該翻訳配列を図４４に示す。
【０２８１】
ついでプラスミドｐＲＡＥ−５２からの推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡをＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲル精製し、ｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）内に連結した。該新規プラスミドをｐＲＡＥ−５８−Ａ１と命名した（プラスミド５８−Ａ１は、ブダペスト条約の条項に基づきＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に１９９９年８月１９日に寄託され、寄託番号ＰＴＡ−５６６が付与されている）。
【０２８２】
該構築物ｐＲＡＥ−５８−Ａ１をエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前掲）内に形質転換し、エロンガーゼ活性に関してスクリーニングした。該陰性対照株は、ｐＹＸ２４２ベクターを含有するエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４であった。該培養を、２５μＭのＧＬＡまたはＡＡの存在下、選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前掲）中で３０℃で２４時間成長させた。この研究においては、それぞれＤＧＬＡまたはアドレン酸（ＡＤＡ，２２：４ｎ−６）が、ヒトエロンガーゼ活性の推定産物であった。基質としてＧＬＡを使用した場合には、ヒトエロンガーゼｃＤＮＡを含有する酵母細胞は、対照細胞と比較して上昇したレベルのＤＧＬＡを含有していた（全脂肪酸に対してそれぞれ２．７５％対０．０９％）（図４５を参照されたい）。ＡＡを基質として使用した場合には、ヒトエロンガーゼｃＤＮＡを含有する酵母細胞は、対照細胞と比較して上昇したレベルのＡＤＡを含有していた（全脂肪酸に対してそれぞれ無検出対１．２１％）。したがって、該ヒトエロンガーゼは、炭素数１８および２０の両方の鎖長のＰＵＦＡをそれらのそれぞれの伸長脂肪酸に変換する。
【０２８３】
また、ヒトエロンガーゼｃＤＮＡを含有する酵母細胞は、該対照株に比べて上昇したレベルの一価不飽和脂肪酸（１８：１ｎ−７、２０−１ｎ−７、２０：１ｎ−９および１８：１ｎ−５を含む）を有していた。したがって、これらの結果は、同定されたヒトエロンガーゼがＰＵＦＡおよび一価不飽和脂肪酸を基質として利用しうることを示している。したがって、このヒト配列ＨＳＥＬＯ１およびそれがコードするタンパク質（ＨＳＥＬＯ１ｐ）は、基質特異性とは独立したエロンガーゼ活性を有する。
【０２８４】
前記の、本発明ではＨＳＥＬＯ１と称されるヒト伸長酵素の基質特異性を更に確認するために、組換え酵母株３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）を、ｎ−６脂肪酸ＧＬＡ、ＡＡ、またはｎ−３脂肪酸ＡＬＡ、ＳＴＡまたはＥＰＡを含有する最少培地中で増殖させた。これらの酵母培養の脂質プロフィールは、ＧＣおよびＧＣ−ＭＳにより調べたところ、それぞれＤＧＬＡ、ＡＤＡ、ω３−エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ，Ｃ２０：３ｎ−３）、ＥＴＡおよびＤＰＡの蓄積が存在することを示した（図５１）。これらの脂肪酸のレベルは、該ｐＲＡＥ−５８−Ａ１配列を含有する株においては全脂肪酸に対してそれぞれ７．２９％（ＤＧＬＡ）、６．２６％（ＡＤＡ）、６．１５％（ＥＴｒＡ）、１０．０６％（ＥＴＡ）および６．６６％（ＤＰＡ）であった。これらは、基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物へのそれぞれ７８．３％、４２．７％、３０．４％、７９．２％および７１．７％の変換に相当した。
【０２８５】
また、組換えＨＳＥＬＯ１配列を発現する酵母細胞は、該対照細胞と比較して、有意に上昇したレベルのＣ１８：１ｎ−７およびＣ２０：１ｎ−７を、そしてより低い度合ではあるがエイコセン酸（ＥＡ，Ｃ２０：１ｎ−９）を含有していた（図４５）。この知見は、該組換えＨＳＥＬＯ１タンパク質（ＨＳＥＬＯ１ｐ）が１６または１８炭素長の一価不飽和脂肪酸の伸長にも関与しうることを示唆した。この仮定を確認するために、組換え酵母株３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）に２５μＭの外因性ＯＡを基質として加えた。インキュベーション後、全脂肪酸に対して２．２５％のＥＡの蓄積は、発現されたＨＳＥＬＯ１酵素が一価不飽和脂肪酸を伸長させうることを示した（図５１）。しかし、組換えＨＳＥＬＯ１ｐによるＯＡからＥＡへの変換は僅か８．９％であり、この変換は、それぞれ２０．４％および５８．１％であるＣ１６：１ｎ−７（からＣ１８：１ｎ−７へ）またはＣ１８：１ｎ−７（からＣ２０：１ｎ−７へ）の内因性変換より有意に低かった。
【０２８６】
１８および２０炭素数の脂肪酸からそれぞれの伸長産物への変換に該基質濃度が影響を及ぼすか否かを判定するために、２つの異なる濃度のＧＬＡ、ＡＡおよびＥＰＡを調べた（図５２）。２５μＭの基質ＧＬＡ、ＡＡおよびＥＰＡを外因的に加えた場合、２炭素の伸長により産生された脂肪酸のレベルは、３３４（ｐＡＲＥ−５８−Ａ１）のライセート中の全脂肪酸に対してそれぞれ３．９５％（ＤＧＬＡ）、２．９１％（ＡＤＡ）および４．８２％（ＤＰＡ）であった。これらは、基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物へのそれぞれ６２．４％、２７．５％および７０．３％の変換に相当した。１００μＭの基質ＧＬＡ、ＡＡおよびＥＰＡを加えた場合には、２炭素の伸長により産生した脂肪酸のレベルは、３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）のライセート中の全脂肪酸に対してそれぞれ９．５６％（ＤＧＬＡ）、３．９０％（ＡＤＡ）および１１．５０％（ＤＰＡ）であった。これらは、該基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物へのそれぞれ３９．８％、１５．７％および４５．７％の変換に相当した。より大量の基質の添加は、より高い割合のそれらの２つの炭素伸長産物を与えたが、通算変換率は少なくとも３５％減少した。
【０２８７】
ＨＳＥＬＯ１ｐの基質特異性を更に確認するために、組換え酵母株３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）を、２５μＭの飽和、一価不飽和またはＰＵＦＡを含有する最少培地中で増殖させた。これらの種々の基質の脂質プロフィールは、ＨＳＥＬＯ１ｐがパルミチン酸（ＰＡ，Ｃ１６：０）、ステアリン酸（ＳＡ，Ｃ１８：０）、アラキン酸（ＡＲＡ，Ｃ２０：０）、ベヘン酸（ＢＡ，Ｃ２２：０）のような飽和脂肪酸の伸長に関与しないことを示した（図５３Ａ）。また、ＨＳＥＬＯ１ｐは、一価不飽和脂肪酸であるＯＡおよびＥＡの伸長にも関与していない。ＰＴＡを基質として加えた場合には、全脂肪酸の１２．７６％はＯＡであった。しかし、これは、ＰＴＡが添加されなかったサンプルと比較して、ＯＡのレベルの増加にはならなかった。なぜなら、ＯＡは、すべてのサンプルにおいて全脂肪酸の２５〜３１％であったからである。ＨＳＥＬＯ１ｐは、ｎ−６ ＰＵＦＡ ＬＡ、ＧＬＡおよびＡＡの伸長には関与するが、ＤＧＬＡまたはＡＤＡの伸長には関与しない（図５３Ｂ）。これらの酵母培養の脂質プロフィールから示されるとおり、それぞれＣ２０：２ｎ−６、ＤＧＬＡおよびＡＤＡの蓄積は存在するが、Ｃ２２：３ｎ−６またはＣ２４：４ｎ−６の蓄積は存在しない。これらの脂肪酸のレベルは、３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）のライセートの全脂肪酸のそれぞれ０．７４％（Ｃ２０：２ｎ−６）、２．４６％（ＤＧＬＡ）および２．１４％（ＡＤＡ）であった。これらは、該基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物へのそれぞれ１３．２％、５１．４％および２７．１％の変換に相当した。また、ＨＳＥＬＯ１ｐは、ｎ−３ ＰＵＦＡ ＡＬＡ、ＳＴＡおよびＥＰＡの伸長には関与するが、ＤＰＡの伸長には関与しない（図５３Ｃ）。これらの酵母培養の脂質プロフィールは、それぞれＥＴｒＡ、ＥＴＡおよびＤＰＡの蓄積は存在するが、Ｃ２４：５ｎ−３の蓄積は存在しないことを示した。これらの脂肪酸のレベルは、ｐＲＡＥ−５８−Ａ１配列を含有する株における全脂肪酸のそれぞれ１．０３％ （ＥＴｒＡ）、２．２４％（ＥＴＡ）および３．１９％（ＤＰＡ）であった。これらは、基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物へのそれぞれ２２．２％、６１．９％および３９．５％の変換に相当した。すべての結果は、酵母におけるヒト肝臓由来のＨＳＥＬＯ１の発現がｎ−６およびｎ−３脂肪酸経路における種々の長鎖ＰＵＦＡの伸長を引き起こすことを証明した。
【０２８８】
実施例ＸＶＩＩ
シー・エレガンスＰＵＦＡエロンガーゼのクローニング、発現および特徴づけ
いくつかの推定シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）エロンガーゼを、翻訳ＧＬＥＬＯおおびＭＡＥＬＯの両方に対するアミノ酸相同性により同定した。該ヒトｃＤＮＡ配列の場合と同様、それが実際にＰＵＦＡエロンガーゼであるか否かを判定するために、ｃＤＮＡのクローニングおよび酵母内での発現を用いた。制限酵素部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ（下線部）を有するそれぞれプライマーＲＯ７３８（５’−ＡＡＴ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＡＴ ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＴＴ ＣＡＡ Ｃ−３’）およびＲＯ７３９（５’−ＣＣＧ ＣＴＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＴＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＴＧＧ ＣＡＣ−３’）は、ゲノム配列Ｕ６８７４９（ｗｏｒｍｐｅｐ ｃＤＮＡアクセッション番号Ｆ５６Ｈ１１．４）に含有される推定ｃＤＮＡ配列に基づくものであった。２５０ｎｇの切り出されたシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ライブラリーｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、５０ｐｍｏｌの各プライマー、１０μｌの１０×反応バッファー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、１μｌの１０ｍＭ ＰＣＲヌクレオチド混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および２．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有する１００μｌの容積中で、ＰＣＲ増幅を行った。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）における加熱サイクル条件は以下のとおりであった：９５℃で５分間、ついでを９４℃で３０秒間、５５℃で２分間、および７２℃で２分間を２５サイクル。ＰＣＲの後、７２℃で７分間の追加的なサイクルを行った。
【０２８９】
該ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲルから精製し、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断し、Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔａｉｏｎキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を該製造業者のプロトコールに従い使用してｐＹＸ２４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで線状化されたもの）に連結し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内に形質転換した。該新規プラスミドは、ｐＲＥＴ−２１およびｐＲＥＴ−２２（該連結からの２つの別個のクローン）と称され、３７３Ａ Ｓｔｒｅｔｃｈ ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で配列決定され、それらのｃＤＮＡ配列は同一であった。該推定エロンガーゼを含有するプラスミドｐＲＥＴ−２２の８６７塩基のｃＤＮＡヌクレオチド配列を図４６に示し、２８８アミノ酸の翻訳配列を図４７に示す（プラスミドｐＲＥＴ−２２は、ブタペスト条約の条項に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に１９９９年８月１９日に寄託されており、寄託番号ＰＴＡ−５６５が付与されている）。
【０２９０】
プラスミドｐＲＥＴ−２１および−２２を、既に記載されているとおりに（実施例ＩＩＩを参照されたい）、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４内に形質転換し、得られた酵母培養（３３４（ｐＲＥＴ−２１）および３３４（ｐＲＥＴ−２２））を、５０μＭ ＧＬＡおよびＡＡの存在下、ロイシンを含有しない１００ｍｌの選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前掲）中で２０℃で４８時間成長させた。該細胞ペレットを集め、脂肪酸分析に付し、その結果を図４８に示す。ＧＬＡ伸長からの推定産物であるＤＧＬＡは、それらの２つのサンプル中の全脂質に対して平均１．７９％であり、これに対して、陰性対照（プラスミドｐＹＸ２４２を含有する３３４）に関しては０．１３％であることが判明し、このことは、ｐＲＥＴ−２１およびｐＲＥＴ−２２の両方にコードされる酵素がＧＬＡエロンガーゼ活性を有していたことを示している。３３４（ｐＲＥＴ−２１）および３３４（ｐＲＥＴ−２２）によるＧＬＡからＤＧＬＡへの変換率は、それぞれ１１．１％および１９．４％であり、平均して１５．２５％であった。興味深いことに、ＡＡの伸長もいずれの内因性脂肪酸の伸長も、ほとんど観察されなかった（図４８）。これらの結果は、この新たに同定されたシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ｃＤＮＡにコードされるエロンガーゼであるＣＥＥＬＯ１がＧＬＡからＤＧＬＡへと特異的に伸長させることを示しており、それがＧＬＡエロンガーゼのシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ホモログでありうることを示唆している。
【０２９１】
ＣＥＥＬＯ１のＧＬＡ伸長活性を更に確認するために、前記段落に記載の実験を繰返した。ただし、この場合には、別々に３３４（ｐＲＥＴ−２２）の培養にＧＬＡおよびＡＡを加えた。この場合もまた、ＧＬＡはＤＧＬＡへと３８．２％の変換率で伸長した。図６１に示すとおり、ＡＡの伸長活性は検出されなかった。この場合、該変換率は、これまでの結果に記載されているものの２倍であることがわかり（図４８を参照されたい）、該添加基質（ＡＡ）の不存在または該酵母の継代培養によるものでありうる。ＣＥＥＬＯ１は、内因性１６：１ｎ−７を１８：１ｎ−７に９．１２％の変換率で伸長させる更なる活性を有し、これに対して、対照培養３３４（ｐＹＸ２４２）では、同一条件下で３．９％である。したがって、該シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）伸長酵素は、Ｃ１８多価不飽和脂肪酸に対しては主要伸長活性を有し、Ｃ１６一価不飽和脂肪酸に対しては副次的活性を有する。
【０２９２】
さらに、ＣＥＥＬＯ１の基質特異性を更に確認するために、ＧＬＡ以外の５０μＭの各基質（例えば、ＳＡ（１８：０）、ＯＡ（１８：１）、ＬＡ（１８：２ｎ−６）、ＤＧＬＡ（２０：３ｎ−ｇ）、ＡＡ（２０：２ｎ−６）、ＡＤＡ（２２：４ｎ−６）、ＡＬＡ（１８：３ｎ−３）、ＰＡ（１８：０）、ＥＰＡ（２０：５ｎ−３）およびＳＴＡ（１８：４ｎ−２））を３３４（ｐＲＥＴ−２２）の培養に個々に加え、実施例ＸＶＩＩに記載のとおりに２０℃で４８時間培養した。ＳＴＡが、伸長された唯一の外因性添加基質であった。ＣＥＥＬＯ１は、取り込まれたＳＴＡの１３％をＥＴＡ（２０：４ｎ−３）に伸長させた（図６２を参照されたい）。
【０２９３】
実施例ＩＩＩおよびＸＩと平行して、外因的に添加されたＧＬＡまたはＳＴＡからそれぞれＡＡまたはＥＰＡが産生されうるか否かを判定するために、プラスミドｐＲＥＴ２２中のシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ＣＥＥＬＯ１遺伝子およびエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（ｐＣＧＲ−４；実施例ＩＩＩを参照されたい）を酵母内で共発現させた。ｐＲＥＴ２２およびｐＣＧＲ４の両方のプラスミドを含有する酵母培養を、５０μＭ ＧＬＡまたはＳＴＡの存在下、ロイシンおよびウラシルを欠く培地中で成長させた場合には、ＡＡおよびＥＰＡの最終産物への変換率は同一であるらしかった（２７％の変換）（図６３を参照されたい）。したがって、ＣＥＥＬＯ１およびΔ５デサチュラーゼの同時異種発現は、酵母内でＧＬＡおよびＳＴＡからそれぞれＡＡおよびＥＰＡへの生合成を引き起こす。
【０２９４】
実施例ＸＶＩＩＩ
ＡＣ００４０５０配列に基づく推定ヒトエロンガーゼｃＤＮＡの単離
ＡＣ００４０５０配列から完全長推定エロンガーゼｃＤＮＡを単離するために、プライマーＲＰ７３５（５’−ＣＣＴ ＣＣＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＡＱＡ ＣＡＣ ＴＡＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＴＴＣ−３’）およびＲＯ７３（５’−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧ−３’）を使用して、ヒト肝臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をＰＣＲ増幅した。Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）ｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を５μｌのヒト肝臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡおよび５０ｐｍｏｌの各プライマーと共に製造業者の指示に従い使用して、該ＰＣＲを行った。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）における加熱サイクル条件は以下のとおりであった：９４℃で２分間、ついで９４℃で１分間、５８℃で２分間、および７２℃で３分間を３０サイクル。ＰＣＲの後、７２℃で７分間の追加的な伸長サイクルを行った。
【０２９５】
該ＰＣＲ増幅産物をゲル上で泳動させ、約１Ｋｂの増幅断片をゲル精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造業者の指示に従い使用して該断片の末端を埋めた。該新規プラスミドをｐＲＡＥ−５９と命名し、ＨＳ３と称されるこのプラスミド中の推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡを、ＡＢＩ ３７３Ａ Ｓｔｒｅｔｃｈ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。該推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡ配列ＨＳ３を図４９に示し、該翻訳配列を図５０に示す。
【０２９６】
実施例ＸＩＸ
マウスＰＵＦＡ伸長酵素のクローニングおよび発現
マウスＥＳＴ配列ＡＩ２２５６３２（実施例ＸＩＩＩを参照されたい）と共にｂｌａｓｔｎを使用してデータベース検索を行うために、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用した。３つのマウスＥＳＴ配列を同定し（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＩ４２８１３０、ＡＩ５９５２５８およびＡＡ０６１０８９）、集合させて、ＭＥＬＯ４と称される推定完全長伸長酵素配列を得た。プライマーＲＯ８１９（５’−ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＧＡ ＡＧＧ ＣＣＴ ＴＴＧ−３’）およびＲＯ８２０（５’−ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＡＡ ＡＡＣ ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＴＣ−３’）を該推定完全長マウス伸長酵素配列に基づき設計し、それらを使用して、マウス脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を増幅した。既に記載されているとおりに（実施例ＸＶＩ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。該ＰＣＲ増幅産物をゲル上で泳動させ、約１，０００ｂｐの増幅断片をゲル精製し、該断片の末端をＮｃｏＩおよびＤｒａＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃｏｒｐ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で消化し、該断片をｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）内にクローニングした。該新規プラスミドをｐＲＡＥ−８４と命名し、このクローン中の推定ＰＵＦＡ伸長酵素ｃＤＮＡを、ＡＢＩ ３７３Ａ Ｓｔｒｅｔｃｈ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。プラスミドｐＲＡＥ−８４中の推定ＰＵＦＡ伸長酵素ｃＤＮＡ配列を図５４に示し、該翻訳配列を図５５に示す。
【０２９７】
該構築物ｐＲＡＥ−８４をエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前掲）内に形質転換し、エロンガーゼ活性に関してスクリーニングした。該陰性対照株は、ｐＹＸ２４２ベクターを含有するエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４であった。該培養を、２５μＭのＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡの存在下、選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前掲）中で３０℃で４２〜４８時間成長させた。これらの酵母培養の脂質プロフィールは、ＧＬＡがＤＧＬＡの予想産物へと伸長されないことを示した。しかし、それぞれＡＤＡ、ω６−テトラコサテトラエン酸（ＴＴＡ，Ｃ２４：４ｎ−６）、ＥＴＡ、ＤＰＡおよびω３−テトラコサペンタエン酸（ＴＰＡ，Ｃ２４：５ｎ−６）の蓄積は存在した（図５６）。ｎ−６脂肪酸基質であるＡＡはＡＤＡに変換され、ついでこれはＴＴＡに変換され、ｎ−３脂肪酸であるＥＰＡはＤＰＡに変換され、ついでこれはＴＰＡに変換された。これらの脂肪酸のレベルは、該ｐＲＡＥ−８４配列を含有する株においては全脂肪酸に対してそれぞれ０．６４％（ＡＤＡ）、１．０７％（ＴＴＡ）、１．４７％（ＤＰＡ）および７．０６％（ＴＰＡ）であった。これらは、該基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物へのそれぞれ１０．４％、６２．６％、３２．７％および８２．８％の変換に相当した。Ｃ２２基質であるＡＤＡおよびＥＰＡは全脂肪酸の２．４％（ＴＴＡ）および３．８２％（ＴＰＡ）へと伸長した。これらは、基質脂肪酸のそれぞれ９．２％および４３．９％の変換に相当した。酵母内でのＭＥＬＯ４の発現は、Ｃ２０およびＣ２２脂肪酸からそれぞれの伸長産物への変換を引き起こす。Ｃ２２脂肪酸からＣ２４脂肪酸への変換率は、外因的に添加された基質がＣ２０脂肪酸である場合には、より一層大きい。
【０２９８】
ＭＥＬＯ４タンパク質（ＭＥＬＯ４）の基質特異性を更に確認するために、組換え酵母株３３４（ｐＲＡＥ−８４）を、２５μＭの飽和、一価不飽和または多価不飽和脂肪酸を含有する最少培地中で増殖させた。これらの種々の基質の脂質プロフィールは、ＭＥＬＯ４ｐがＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡまたはＢＡのような飽和脂肪酸の伸長に関与しないことを示した（図５７Ａ）。また、ＭＥＬＯ４ｐは、一価不飽和脂肪酸であるＰＴＡ、ＯＡまたはＥＡの伸長にも関与しない。ＭＥＬＯ４ｐは、ｎ−６ ＰＵＦＡであるＡＡおよびＡＤＡの伸長には関与するが、ＬＡまたはＤＧＬＡの伸長には関与しない（図５７Ｂ）。これらの酵母培養の脂質プロフィールから示されるとおり、ＡＤＡおよびＴＴＡの蓄積は存在するが、Ｃ２０：２ｎ−６またはＣ２２：３ｎ−６の蓄積は存在しない。ＡＡを外的に加えた場合には、産物脂肪酸のレベルは０．５％（ＡＤＡ）および０．３９％（ＴＴＡ）であり、ＡＤＡを外的に加えた場合には、産物脂肪酸のレベルは、ｐＲＡＥ−８４配列を含有する株における全脂肪酸の１．３％（ＴＴＡ）であった。これらは、該基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物へのそれぞれ８．７％、４３．８％および７．３％の変換に相当した。また、ＭＥＬＯ４ｐは、ＧＬＡからＤＧＬＡへの伸長に関与する。ＧＬＡの存在下、ｐＲＡＥ−８４配列を含有する株の脂質プロフィールは、ＤＧＬＡの０．４３％を有し、これはＧＬＡからＤＧＬＡへの１４．７％の変換に相当した。ＭＥＬＯ４ｐはまた、ｎ−３ ＰＵＦＡであるＥＰＡおよびＤＰＡの伸長に関与する（図５３Ｃ）。これらの酵母培養の脂質プロフィールは、ＤＰＡおよびＴＰＡの蓄積が存在することを示した。ＥＰＡを加えた場合には、これらの脂肪酸のレベルは１．２１％（ＤＰＡ）および３．３８％（ＴＰＡ）であり、ＤＰＡを加えた場合には、産物脂肪酸のレベルは、ｐＲＡＥ−８４配列を含有する株における全脂肪酸の３．０９％（ＴＰＡ）であった。これらは、該基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物へのそれぞれ２４．０％、７３．６％および４６．４％の変換に相当した。ＭＥＬＯ４ｐはまた、ＳＴＡからＣ２２：４ｎ−３への伸長に関与する。ＳＴＡを加えた場合には、２炭素伸長により産生した脂肪酸のレベルは０．３％ ＥＴＡおよび０．２３％ Ｃ２２：４ｎ−３であった。これらは、基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物への１１．１％および４３．４％の変換に相当した。ＭＥＬＯ４ｐはまた、ＡＬＡの伸長に関与しているらしかった。しかし、２炭素伸長により産生した脂肪酸の少量（０．１６％のＥＴｒＡ）は有意でないかもしれない。すべての結果は、酵母におけるマウス脳由来のＭＥＬＯ４ｐの発現がｎ−６およびｎ−３脂肪酸経路におけるＣ２０およびＣ２２ 長鎖ＰＵＦＡの伸長を引き起こすことを証明した。
【０２９９】
実施例ＸＸ
マウスからのＨＳＥＬＯ１ホモログの同定、クローニングおよび発現
ＨＳＥＬＯ１配列と共にｂｌａｓｔｎを使用してデータベース検索を行うために、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用した。２つのヒトＥＳＴ配列を同定し（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＩ７８７９２５およびＡＩ７４６８３８）した。それぞれのｃＤＮＡクローン（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ． Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｃｌｏｎｅ ＩＤ’ｓ ２０７６８３１および２０６１８２）はＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を介して購入した。プライマーＲＯ８３３（５’−ＧＧＴ ＴＴＴ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＣＡＴ ＴＴＣ ＧＡＴ ＧＣＧ ＴＣＡ Ｃ−３’）およびＲＯ８３２（５’−ＣＧＡ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＣＡ ＣＡ−３’）を、それぞれ該推定マウス伸長酵素の５’配列および該ｃＤＮＡクローンベクターに基づいて設計した。プライマーＲＯ８３３およびＲＯ８３２を使用して、マウスｃＤＮＡクローン２０７６１８２を増幅した。既に記載されているとおりに（実施例ＸＶＩ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。該ＰＣＲ増幅産物の末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で埋め、該５’領域をＮｃｏＩで消化した。該修飾断片をゲル上で泳動させ、約２．４Ｋｐの増幅断片をゲル精製し、該断片をｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶ）中にクローニングした。該新規プラスミドをｐＲＡＥ−８７と命名し、このクローンＭＥＬＯ７中の推定ＰＵＦＡ伸長酵素ｃＤＮＡを、ＡＢＩ ３７３Ａ Ｓｔｒｅｔｃｈ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。プラスミドｐＲＡＥ−８７中の推定ＰＵＦＡ伸長酵素ｃＤＮＡ配列（ＭＥＬＯ７）を図５８に示し、該翻訳配列を図５９に示す。
【０３００】
該構築物ｐＲＡＥ−８７をエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前掲）内に形質転換し、エロンガーゼ活性に関してスクリーニングした。該陰性対照株は、ｐＹＸ２４２ベクターを含有するエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４であった。該培養を、２５μＭのＧＬＡ、ＡＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡまたはＡＤＡの存在下、選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前掲）中で３０℃で４２〜４８時間成長させた。ＭＥＬＯ７を発現する酵母培養の脂質プロフィールは、それぞれＤＧＬＡ、ＡＤＡおよびＥＴＡの蓄積が存在することを示した（図６０）。これらの脂肪酸のレベルは、該ｐＲＡＥ−８７配列を含有する株においては全脂肪酸に対してそれぞれ４．１％（ＤＧＬＡ）、６．３３％（ＡＤＡ）、３．４％（ＥＴＡ）および６．１８％（ＤＰＡ）であった。これらは、該基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物へのそれぞれ７８．７％、３６．０％、８１．０％および５７．４％の変換に相当した。ＭＥＬＯ７タンパク質（ＭＥＬＯ７）はＡＤＡの伸長には関与しなかった。ＭＥＬＯ７ｐはまた、ＥＰＡが添加基質であった場合に２炭素伸長により産生した脂肪酸ＤＰＡからの、およびＤＰＡが添加された場合のＴＰＡへの更なる伸長に関与するらしかった。しかし、該産物脂肪酸の少量（０．２７％および０．２５％のＴＰＡ）は有意でないかもしれない。また、該組換えＭＥＬＯ７配列を発現する酵母細胞は、該対照細胞と比較して、有意に上昇したレベルのＣ１８：１ｎ−７およびＣ２０：１ｎ−７を含有していた。すべての結果は、酵母におけるマウス胚由来のＭＥＬＯ７の発現がｎ−６およびｎ−３脂肪酸経路における種々の長鎖ＰＵＦＡの伸長を引き起こすこと、ならびにＭＥＬＯ７がＨＳＥＬＯ１のホモログであることを証明した。
【０３０１】
実施例ＸＸＩ
真菌ＰＵＦＡ伸長酵素のクローニングおよび発現
４つのエロンガーゼＨＳＥＬＯ１、ＭＥＬＯ４、ＧＬＥＬＯおよびＣＥＥＬＯの翻訳アミノ酸配列をアラインさせて、相同性の領域を同定した（図６４）。プライマーは、類似性を示す配列のブロック（下線部）に基づいて設計した。プライマーＲＯ８９５（５’−ＧＴＡ ＧＴＡ ＷＧＡ ＧＴＡ ＣＡＴ ＧＡＴ ＷＡＣ ＧＴＧ ＧＡＴ ＲＡＡ ＷＧＡ ＧＴＴ ＷＡＧ−３’）およびＲＯ８９８（５'−ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＣＡ Ｇ−３’）を使用して、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）７０９１（Ｔ７０９１）からｃＤＮＡを増幅した。１μｌのＴ７０９１ ｃＤＮＡ、０．２μＭ ｄＮＴＰ混合物、５０ｐＭの各プライマー、５μｌの１０×バッファー、１．５μｌの５０ｍＭ ＭｇＳＯ４および０．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌの容積中で、ＰＣＲを行った。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ９６００における加熱サイクル条件は以下のとおりであった。９４℃で３分間、ついで９５℃で４５秒間、５５℃で３０秒間および６８℃で２分間を３０サイクル。該ＰＣＲ増幅混合物をゲル上で泳動させ、約７５０ｂｐの増幅断片をゲル精製し、単離した断片をｐＣＲ平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。
【０３０２】
１２個のクローンを調製し、配列決定した。全１２個のクローンは同じ配列を有し、該コンセンサス配列をｃｌｄ６と命名した（図６５）。ｃｌｄ６の翻訳アミノ酸配列（図６６）は、ＨＳＥＬＯ１に対しては１９０アミノ酸において３４．７％の同一性を、ＭＥＬＯ４に対しては１８７アミノ酸において３５．８％の同一性を、ＧＬＥＬＯに対しては１６０アミノ酸において４５．６％の同一性を、そしてＣＥＥＬＯに対しては１５５アミノ酸において３２．９％の同一性を有していた。新規プライマーを、最初のＭｅｔにおけるｃｌｄ６の５’配列に基づき設計した。付加されたＮｃｏＩ部位（下線部）を有するＲＯ１１６０（５’−ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＣＧ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＴＧ−３’）およびベクタープライマーＲＯ８９９（５'−ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＣ−３’）を使用して、Ｔ７０９１ ｃＤＮＡを増幅した。該ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、前記のとおりに行った。該ＰＣＲ増幅産物をゲル上で泳動させ、約１．２Ｋｂの増幅断片をゲル精製し、該断片の末端をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃｏｒｐ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で消化し、該断片をｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）内にクローニングした。該新規プラスミドをｐＲＡＴ−４−Ａ１、ｐＲＡＴ−４−Ａ２、ｐＲＡＴ−４−Ａ３、ｐＲＡＴ−４−Ａ４、ｐＲＡＴ−４−Ａ６、ｐＲＡＴ−４−Ａ７およびｐＲＡＴ−４−Ｄ１と命名した（プラスミドＤＮＡ ｐＲＡＴ−４−Ａ７は、ブダペスト条約の条項に基づきＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に２００１年６月２９日に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４９０が付与されている）。これらのクローン中の推定ＰＵＦＡ伸長酵素ｃＤＮＡを、ＡＢＩ ３７３Ａ Ｓｔｒｅｔｃｈ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ１〜ｐＲＡＴ−４−Ｄ１中の推定ＰＵＦＡ伸長酵素ｃＤＮＡ配列を図６７〜７３に示し、該翻訳配列をそれぞれ図７４〜８０に示す。
【０３０３】
構築物ｐＲＡＴ−４−Ａ１〜ｐＲＡＴ−４−Ｄ１をエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前掲）内に形質転換し、エロンガーゼ活性に関してスクリーニングした。未改変ｐＹＸ２４２ベクターを含有するエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４を陰性対照として使用した。該培養を、２５μＭのＧＬＡまたはＥＰＡの存在下、選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前掲）中で２４℃で４８時間成長させた。この研究においては、それぞれＤＧＬＡまたはω−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ，２２：５ｎ−３）が、該エロンガーゼ活性の推定産物であった。これらの酵母培養の脂質プロフィールは、３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ３）以外のすべてのサンプルにおいてＧＬＡがＤＧＬＡに伸長されたことを示した（図８１）。これは、ｐＲＡＴ−４−Ａ３のｃＤＮＡ配列が、該翻訳酵素のトランケート化形態を与える該配列の５’末端のいくつかの終結配列を有することから予想されものであった（図７６）。３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ２）では該ＤＧＬＡレベルは非常に低かったが、このサンプルにおいては該ＧＬＡレベルは最低であった。したがって、該脂肪酸からその伸長形態への変換レベルは２８．４％と有意であった。予想外だったのは、該発現酵素間で明確な基質特異性が存在したことである。ＥＰＡを基質として加えた場合には、３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ１）および３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ２）の培養は非常に低レベルのＤＰＡを有していた。このことは、これらの培養中の発現酵素が１８炭素鎖長のＰＵＦＡの伸長を優先し、２０鎖長のＰＵＦＡであるＥＰＡについてはそうではなかったことを示している。３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ４）、３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ６）、３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ７）および３３４（ｐＲＡＴ−Ｄ１）の培養はすべて、存在する有意なレベルのＤＰＡを有し、このことは、これらの培養中の発現酵素が１８および２０の両方の炭素鎖長のＰＵＦＡからそれらのそれぞれの伸長脂肪酸への伸長に関与していたことを示している。
【０３０４】
該基質優先性が該翻訳配列（図８２）により指令されるのか否かを判定するために、６個の活性クローンのアミノ酸配列を比較した。ｐＲＡＴ−４−Ａ１およびｐＲＡＴ−４−Ａ２のｃＤＮＡ配列は、それらがそれぞれＹ３７７ＣおよびＶ３７１Ａに突然変異を有する点で他の配列とは異なっていた。これは、２０炭素鎖の伸長のための該酵素の決定的に重要な領域であるに違いない。その他の配列も、突然変異ｐＲＡＴ−４−Ａ４（Ｉ４７５Ｖ）、ｐＲＡＴ−４−Ａ６（Ｄ２６ＧおよびＶ４５８Ａ）およびｐＲＡＴ−４−Ｄ１（Ｋ１８２ＲおよびＥ２６９Ｖ）を有していた。しかし、これらの突然変異は２０炭素鎖の伸長をさまたげないらしい。該ｐＲＡＴ−４−Ａ７ ｃＤＮＡは、該コンセンサス配列と比較して、塩基７２６に単一のサイレント突然変異を有していた。
【０３０５】
コンセンサスＴＥＬＯ１配列の翻訳アミノ酸配列は、ＨＳＥＬＯ１に対して２６５アミノ酸において３４．０％の同一性（図８３）、ＭＥＬＯ４に対しては２６７アミノ酸において３４．１％の同一性（図８４）、ＧＬＥＬＯに対しては２４４アミノ酸において４３．４％の同一性（図８５）、そしてＣＥＥＬＯに対しては２３９アミノ酸において３４．３％の同一性（図８６）を有していた。
【０３０６】
また、該真菌エロンガーゼｃＤＮＡを含有する酵母細胞は、該対照株と比較して上昇したレベルの一価不飽和脂肪酸１８：１ｎ−７を有していた（図８１）。したがって、これらの結果は、同定された真菌エロンガーゼがＰＵＦＡおよび一価不飽和脂肪酸を基質として利用しうることを示した。したがって、これらの真菌配列ＴＥＬＯ１およびそれらがコードするタンパク質（ＴＥＬＯ１ｐ）は、基質特異性とは独立したエロンガーゼ活性を有する。
【０３０７】
本発明ではＴＥＬＯ１と称される前記の真菌伸長酵素の基質特異性を更に確認するために、組換え酵母株３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ４）、３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ６）、３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ７）および３３４（ｐＲＡＴ−４−Ｄ１）を、ｎ−６脂肪酸ＧＬＡ、ＡＡ、またはｎ−３脂肪酸ＳＴＡまたはＥＰＡを含有する或いは基質を含有しない最少培地内で増殖させた。これらの酵母培養の脂質プロフィールは、ＧＣおよびＧＣ−ＭＳにより調べたところ、それぞれＤＧＬＡ、ＡＤＡ、ＥＴＡ、ω３−ドコサテトリエン酸（ＤＴＡ，Ｃ２２：４ｎ−３）およびＤＰＡの蓄積が存在することを示した（図８７）。これらの脂肪酸のレベルは、ＴＥＬＯ１配列を含有する株においては全脂肪酸に対してそれぞれ３．８８〜５．４２％（ＤＧＬＡ）、０．１８〜０．７５％（ＡＤＡ）、２．２７〜４．０１％（ＥＴＡ）、０．１６％〜１．１０％（ＤＴＡ）および０．５４〜１．７４％（ＤＰＡ）であった。これらは、該基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物へのそれぞれ６４．０〜７７．２％、１．０〜５．０％、７９．３〜８９．６％、３．８〜３２．６％および３．４〜１３．３％の変換に相当した。
【０３０８】
また、組換えＴＥＬＯ１配列を発現する酵母細胞は、該対照細胞と比較して、有意に上昇したレベルのＣ１８：１ｎ−７、および減少したレベルのＣ１６：１ｎ−７を含有していた（図８７）。この知見は、該組換えＴＥＬＯ１タンパク質（ＴＥＬＯ１ｐ）が１６炭素長の一価不飽和脂肪酸の伸長にも関与しうることを示唆した。
【０３０９】
ＴＥＬＯ１ｐの基質特異性を更に確認するために、組換え酵母株３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ７）を、２５μＭの種々のＰＵＦＡを含有する最少培地中で増殖させた。これらの種々の基質の脂質プロフィールは、ＴＥＬＯ１ｐがｎ−６ ＰＵＦＡであるＬＡ、ＧＬＡおよびＡＡの伸長には関与するがＤＧＬＡの伸長には関与しないことを示した（図８８）。これらの脂肪酸のレベルは、３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ７）のライセート中の全脂肪酸に対してそれぞれ１．０７％（Ｃ２０：２ｎ−６）、５．８４％（ＤＧＬＡ）および０．７６％（ＡＤＡ）であった。これらは、該基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物へのそれぞれ２３．２％、７８．６％および３．５％の変換に相当した。ＴＥＬＯ１ｐは、ｎ−３ ＰＵＦＡであるＡＬＡ，ＳＴＡおよびＥＰＡの伸長にも関与する（図８８）。これらの酵母培養の脂肪酸プロフィールは、それぞれＥＴｒＡ、ＥＴＡおよびＤＰＡの蓄積が存在することを示した。これらの脂肪酸のレベルは、ＴＥＬＯ１配列を含有する株における全脂肪酸に対してそれぞれ２．７１％ ＥＴｒＡ、４．１９％（ＥＴＡ）および１．９９％（ＤＰＡ）であった。これらは、該基質脂肪酸から２炭素原子伸長した産物へのそれぞれ４３．３％、８５．３％および１１．５％の変換に相当した。また、ＳＴＡを基質として加えた場合には、該培養内にＤＴＡの蓄積が存在した。この脂肪酸のレベルは０．７４％であり、これは、基質ＳＴＡからの炭素鎖伸長産物であるＥＴＡへの１５．０％の変換に相当した。すべての結果は、酵母におけるＴ７０９１由来のＴＥＬＯ１の発現がｎ−６およびｎ−３脂肪酸経路における種々の長鎖ＰＵＦＡの伸長を引き起こすことを証明した。
【０３１０】
栄養組成物
「詳細な記載」に説明したＰＵＦＡは、種々の栄養補足物、乳児用配合乳、栄養代替物および他の栄養溶液において使用することができる。
【０３１１】
Ｉ．乳児用配合乳
Ａ．鉄含有Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）調整乳：
用法：牛乳に対するアレルギーまたは感受性を有する乳児、小児および成人用の飲料として。ラクトース（乳糖）を避けなければならない障害、乳酸欠乏症、ラクトース不耐性およびガラクトース血症を有する患者に対する供給。
【０３１２】
特徴：
・牛乳タンパク質アレルギーまたは感受性の症状を回避するための分離大豆タンパク質。
・ラクトースに関連した下痢を回避するためのラクトース非含有（無ラクトース）調整乳。
・浸透性下痢のリスクを軽減するための低い浸透圧（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）。・炭水化物の吸収を増強すること及び損傷した腸の吸収能を超えるリスクを軽減することを意図した二重の炭水化物（コーンシロップおよびスクロース）。
・鉄欠乏症の予防を助けるための１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸第一鉄として）。
・推奨されるレベルのビタミンおよび無機質。
・推奨されるレベルの必須脂肪酸を供給するための植物油。
・乳白色、乳様コンシステンシー（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）および心地よい香り。
【０３１３】
成分：（精進料理（Ｐａｒｅｖｅ））８５％ 水、４．９％ コーンシロップ。２．６％ 糖（スクロース）、２．１％ 大豆油、１．９％ 分離大豆タンパク質、１．４％ ヤシ油、０．１５％ クエン酸カルシウム、０．１１％ リン酸カルシウム三塩基酸、クエン酸カリウム、リン酸カリウム一塩基酸、塩化カリウム、モノおよびジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、リン酸カリウム二塩基酸、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−トコフェリル酢酸、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミタート、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０３１４】
Ｂ．下痢用のイソミル（登録商標）ＤＦ大豆調整乳：
用法：乳児および幼児における下痢の食事的管理のための短期間の供給。
【０３１５】
特徴：
・特に下痢の管理のための大豆繊維由来の添加食物繊維を含有する最初の乳児用配合乳。
・乳児における軽度〜重度の下痢中の緩い水様性便の持続期間を減少させることが臨床的に示されている。
・乳児の栄養要求性を満たす栄養的に完全である。
・添加Ｌ−メチオニンを含有する分離大豆タンパク質は、全必須アミノ酸に対する乳児の要求性を満たすか又はそれを超える。
・ラクトースに関連した下痢を回避するためのラクトース非含有調整乳。
・浸透性下痢のリスクを軽減するための低い浸透圧（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）。
・炭水化物の吸収を増強すること及び損傷した腸の吸収能を超えるリスクを軽減することを意図した二重の炭水化物（コーンシロップおよびスクロース）。
・Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓにより推奨された及びＩｎｆａｎｔ Ｆｏｒｍｕｌａ Ａｃｔにより要求されるビタミンおよび無機質のレベルを満たす又はそれを超える。
・鉄欠乏症の予防を助けるための１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸第一鉄として）。
・推奨されるレベルの必須脂肪酸を供給するための植物油。
【０３１６】
成分：（精進料理（Ｐａｒｅｖｅ））８６％ 水、４．８％ コーンシロップ。２．５％ 糖（スクロース）、２．１％ 大豆油、２．０％ 分離大豆タンパク質、１．４％ ヤシ油、０．７７％ 大豆繊維、０．１２％ クエン酸カルシウム、０．１１％ リン酸カルシウム三塩基酸、０．１０％ クエン酸カリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム一塩基酸、モノおよびジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、リン酸カリウム二塩基酸、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−トコフェリル酢酸、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミタート、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０３１７】
Ｃ．鉄を含有するＩｓｏｍｉｌ（登録商標）ＳＦスクロース非含有大豆調整乳：
用法：牛乳タンパク質に対するアレルギーもしくは感受性またはスクロースに対する不耐性を有する乳児、小児および成人用の飲料として。ラクトース（乳糖）およびスクロースを避けなければならない障害を有する患者に対する供給。
【０３１８】
特徴：
・牛乳タンパク質アレルギーまたは感受性の症状を回避するための分離大豆タンパク質。
・ラクトースに関連した下痢を回避するためのラクトース非含有調整乳（炭水化物スクロースはＰｏｌｙｃｏｓｅ（登録商標）Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓである）。
・スクロースに耐性不能な患者にはスクロース非含有。
・浸透性下痢のリスクを軽減するための低い浸透圧（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）。・鉄欠乏症の予防を助けるための１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸第一鉄として）。
・推奨されるレベルのビタミンおよび無機質。
・推奨されるレベルの必須脂肪酸を供給するための植物油。
・乳白色、乳様コンシステンシー（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）および心地よい香り。
【０３１９】
成分：（精進料理（Ｐａｒｅｖｅ））７５％ 水、１１．８％ コーンスターチ水解物、４．１％ 大豆油、４．１％ 分離大豆タンパク質、２．８％ ヤシ油、１．０％ 化工コーンスターチ、０．３８％ リン酸カルシウム三塩基酸、０．１７％ クエン酸カリウム、０．１３％ 塩化カリウム、モノおよびジグリセリド、大豆レシチン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、カラゲナン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−トコフェリル酢酸、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミタート、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０３２０】
Ｄ．鉄即時供給（Ｉｒｏｎ Ｒｅａｄｙ Ｔｏ Ｆｅｅｄ）Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）２０大豆調整乳（２０Ｃａｌ／ｆｌ ｏｚ）：
用法：大豆供給が望ましい場合。
【０３２１】
成分：（精進料理（Ｐａｒｅｖｅ））８５％ 水、４．９％ コーンシロップ、２．６％ 糖（スクロース）、２．１％ 大豆油、１．９％ 分離大豆タンパク質、１．４％ ヤシ油、０．１５％ クエン酸カルシウム、０．１１％ リン酸カルシウム三塩基酸、クエン酸カリウム、リン酸カリウム一塩基酸、塩化カリウム、モノおよびジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、リン酸カリウム二塩基酸、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−トコフェリル酢酸、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミタート、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０３２２】
Ｅ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）乳児用配合乳
用途：乳児用配合乳が必要な場合：１歳より前に断乳することを決定した場合、授乳に対する補足が必要な場合、または授乳を選ばなければ日常的な供給として。
【０３２３】
特徴：
・良好な成長のための適当な質および量のタンパク質、乳関連腸内出血のリスクを軽減する加熱変性。
・容易に吸収される必須リノール酸を供給する植物油（二重にホモジナイズされたもの）の混合物の脂肪。
・人乳と同様の比率のラクトースとしての炭水化物。
・発達中の器官に対するストレスを最小限に抑える低腎溶質負荷。
・粉末、濃縮液および即時供給形態。
【０３２４】
成分：（−Ｄ）水、脱脂乳、ラクトース、大豆油、モノおよびジグリセリド、大豆レシチン、アスコルビン酸、カラゲナン、塩化コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、α−トコフェリル酢酸、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミタート、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０３２５】
Ｆ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）ＮｅｏＣａｒｅ早産児用鉄含有調整乳：
用法：退院後の早産児の特別な栄養要求のために。追いつき（ｃａｔｃｈ−ｕｐ）成長を促進し発達を支持するのに必要とされる通常以上のカロリー、タンパク質、ビタミンおよび無機質を早産児に供給するために開発されたＳｉｍｉｌａｃ ＮｅｏＣａｒｅは栄養的に完全な調整乳である。
【０３２６】
特徴：
・カロリーおよびビタミンの補足の必要性を軽減する。標準的な正期産児用（ｔｅｒｍ）調整乳（２０Ｃａｌ／ｆｌ ｏｚ）より多量のカロリー（２２Ｃａｌ／ｆｌ ｏｚ）。
・早産児の特別な消化要求性を満たすのを助ける中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ油）を含有する高吸収性脂肪混合物。
・病院内で開始される栄養支持を拡張するための、より高レベル（１００カロリー当たり）のタンパク質、ビタミンおよび無機質。
・改善された骨無機質化のための、より多量のカルシウムおよびリン。
【０３２７】
成分：−Ｄコーンシロップ固体、脱脂乳、ラクトース、乳清タンパク質濃縮物、大豆油、高オレイン酸サフラワー油、分画ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、ヤシ油、クエン酸カリウム、リン酸カリウム三塩基酸、炭酸カルシウム、アスコルビン酸、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、塩化コリン、アスコルビルステアラート、Ｌ−カルニチン、α−トコフェリル酢酸、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、混合トコフェロール、クエン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩化チアミン塩酸塩、ビタミンＡパルミタート、βカロテン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０３２８】
Ｇ．即時使用型Ｓｉｍｉｌａｃナチュラルケア（Ｎａｔｕｒａｌ Ｃａｒｅ）低鉄人乳強化剤（２４Ｃａｌ／ｆｌ ｏｚ）
用法：人乳と混合されるよう又は低出生体重児に人乳と共に供給されるよう意図される。
【０３２９】
成分：−Ｄ水、脱脂乳、水解コーンスターチ、ラクトース、分画ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、乳清タンパク質濃縮物、大豆油、ヤシ油、リン酸カリウム三塩基酸、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、モノおよびジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、塩化コリン、ｍ−イノシトール、タウリン、ナイアシンアミド、Ｌ−カルニチン、α−トコフェリル酢酸、硫酸亜鉛、塩化カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二銅、リボフラビン、ビタミンＡパルミタート、塩化チアミン塩酸塩、、ピリドキシン塩酸塩、ビオチン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、ビタミンＤ３、亜セレン酸ナトリウムおよびシアノコバラミン。
【０３３０】
本発明の種々のＰＵＦＡは、前記の乳児用配合乳および当業者に公知の他の乳児調整乳の代わりに使用したり、それに添加することが可能である。
【０３３１】
ＩＩ．栄養製剤
Ａ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）
用法：ＥＮＳＵＲＥは、主として、食事と共に若しくは食間に使用される経口栄養補足物として又は適量での食事代替物として意図された低残渣（ｌｏｗ−ｒｅｓｉｄｕｅ）流動食である。ＥＮＳＵＲＥは、ラクトースおよびグルテンを含有せず、低コレステロール食を含む加工食における使用に適している。それは主として経口補足物であるが、それはチューブにより供給されうる。
【０３３２】
患者の条件：
・加工食を取っている患者用。
・栄養危機状態の高齢患者用。
・不随意的体重減少の患者用。
・病気または手術から回復中の患者用。
・低残渣食を要する患者用。
【０３３３】
成分：−Ｄ水、糖（スクロース）、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸カルシウムおよびナトリウム、高オレイン酸サフラワー油、分離大豆タンパク質、大豆油、カノラ油、クエン酸カリウム、リン酸カリウム三塩基酸、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム二塩基酸、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリル酢酸、ゲラン・ガム（Ｇｅｌｌａｎ Ｇｕｍ）、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄、ビタミンＡパルミタート、塩化チアミン塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム。
【０３３４】
Ｂ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＢＡＲＳ（バー）：
用法：ＥＮＳＵＲＥ ＢＡＲＳは、食間または食事と共に補足的に使用するための完全なバランス栄養である。それらは、他のスナックに代わる美味しい富栄養代替物を提供する。ＥＮＳＵＲＥ ＢＡＲＳは＜１ｇのラクトース／バーを含有し、チョコレートファッジブラウニーフレーバーはグルテンを含有しない（ハニーグラハムクランチフレーバーはグルテンを含有する）。
【０３３５】
患者の条件：
・通常以上のカロリー、タンパク質、ビタミンおよび無機質を要する患者用。
・十分なカロリーおよび栄養素を摂取しない者に特に有用である。
・噛み飲み込む能力を有する者用。
・ピーナッツアレルギーまたはいずれかの型のナッツアレルギーを有する者は使用しないこと。
【０３３６】
成分：ハニーグラハムクランチ − 高フルクトースコーンシロップ、分離大豆タンパク質、ブラウンシュガー、蜂蜜、マルトデキストリン（トウモロコシ）、クリスプ・ライス（Ｃｒｉｓｐ Ｒｉｃｅ）（精米、糖［スクロース］、塩［塩化ナトリウム］および麦芽）、エンバクフスマ、部分水素添加綿実油および大豆油、大豆多糖、グリセリン、乳清タンパク質濃縮物、ポリデキストロース、フルクトース、カゼイン酸カルシウム、ココア粉、人工フレーバー、カノラ油、高オレイン酸サフラワー油、脱脂乾燥乳、乳清粉末、大豆レシチンおよびトウモロコシ油。ナッツを加工する施設において製造される。
【０３３７】
ビタミンおよび無機質：リン酸カルシウム三塩基酸、リン酸カリウム二塩基酸、酸化マグネシウム、塩（塩化ナトリウム）、塩化カリウム、アスコルビン酸、オルトリン酸第二鉄、α−トコフェリル酢酸、ナイアシンアミド、酸化亜鉛、パントテン酸カルシウム、グルコン酸銅、硫酸マンガン、リボフラビン、βカロテン、ピリドキシン塩酸塩、チアミン一硝酸、葉酸、ビオチン、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０３３８】
タンパク質：ハニーグラハムクランチ − タンパク質源は、分離大豆タンパク質と乳タンパク質との混合物である。
分離大豆タンパク質 ７４％
乳タンパク質 ２６％。
【０３３９】
脂肪：ハニーグラハムクランチ − 脂肪源は、部分水素添加綿実および大豆、カノラ、高オレイン酸サフラワー油と大豆レシチンとの混合物である。
部分水素添加綿実および大豆油 ７６％
カノラ油 ８％
高オレイン酸サフラワー油 ８％
トウモロコシ油 ４％
大豆レシチン ４％。
【０３４０】
炭水化物：ハニーグラハムクランチ − 炭水化物源は、高フルクトースコーンシロップ、黒糖、マルトデキストリン、蜂蜜、クリスプ・ライス、グリセリン、大豆多糖およびエンバクフスマの組合せである。
高フルクトースコーンシロップ ２４％
黒糖 ２１％
マルトデキストリン １２％
蜂蜜 １１％
クリスプ・ライス ９％
グリセリン ９％
大豆多糖 ７％
エンバクフスマ ７％。
【０３４１】
Ｃ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮ：
用法：ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは、食事において追加的なカロリー、タンパク質、ビタミンおよび無機質を要する者のために意図された濃縮高タンパク質流動食である。それは、食事と共に若しくは食間に経口栄養補足物として又は適量での食事代替物として使用することができる。ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮはラクトースおよびグルテンを含有せず、一般的手術または臀部骨折から回復中の者および床擦れ（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｕｌｃｅｒ）の危険性のある患者による使用に適している。
【０３４２】
患者の条件：
追加的なカロリー、タンパク質、ビタミンおよび無機質を要する患者、例えば、一般的手術または臀部骨折から回復中の患者、床擦れ（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｕｌｃｅｒ）の危険性のある患者および低コレステロール食を取っている患者用。
【０３４３】
特徴：
・飽和脂肪が低い。
・供給当たり６ｇの全脂肪および＜５ｍｇのコレステロールを含有する。
・良好なタンパク質源、カルシウム源および他の必須ビタミンおよび無機質の源。
・低コレステロール食。
・ラクトースを含有せず、容易に消化される。
【０３４４】
成分：
バニラシュプレーム：−Ｄ水、糖（スクロース）、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸カルシウムおよびナトリウム、高オレイン酸サフラワー油、分離大豆タンパク質、大豆油、カノラ油、クエン酸カリウム、リン酸カリウム三塩基酸、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム二塩基酸、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリル酢酸、ゲラン・ガム（Ｇｅｌｌａｎ Ｇｕｍ）、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄、ビタミンＡパルミタート、塩化チアミン塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０３４５】
タンパク質：
タンパク質源は、２つの高生物価タンパク質であるカゼインと大豆との混合物である。
カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム ８５％
分離大豆タンパク質 １５％。
【０３４６】
脂肪：
脂肪源は、３つの油、すなわち、高オレイン酸サフラワー油、カノラ油および大豆油の混合物である。
高オレイン酸サフラワー油 ４０％
カノラ油 ３０％
大豆油 ３０％。
【０３４７】
ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮ中の脂肪レベルは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＨＡ）の指針を満足するものである。ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮ中の６グラムの脂肪は全カロリーの２４％に相当し、該脂肪の２．６％は飽和脂肪酸由来であり、７．９％は多価不飽和脂肪酸由来である。これらの値は、全カロリーの＜３０％脂肪由来、該カロリーの＜１０％が飽和脂肪酸由来、および全カロリーの＜１０％多価不飽和脂肪酸由来というＡＨＡ指針の範囲内である。
【０３４８】
炭水化物：
ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは、マルトデキストリンとスクロースとの組合せを含有する。穏やかな甘味およびフレーバーの多様性（バニラシュプレーム、チョコレートローヤル、野生液果およびバナナ）に加えて、ペカン、オウトウ、イチゴ、レモンおよびオレンジにおけるＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ Ｐａｃｓは、フレーバー疲労を予防するのを助け、患者のコンプライアンスを助ける。
【０３４９】
バニラおよび他の非チョコレートフレーバー：
スクロース ６０％
マルトデキストリン ４０％。
【０３５０】
チョコレート：
スクロース ７０％
マルトデキストリン ３０％。
【０３５１】
Ｄ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＬＩＧＨＴ
用法：ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴは、食事と共に又は食間に経口栄養補足物として使用するよう意図された低脂肪流動食である。ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴは、ラクトースおよびグルテンを含有せず、低コレステロール食を含む加工食中での使用に適している。
【０３５２】
患者の条件：
・ＥＮＳＵＲＥより５０％少ない脂肪および２０％少ないカロリーを含有する補足物において通常以上の栄養を要する正常体重または過剰体重の患者用。
・通常以上の栄養を要する正しく食べていない健康な男性用。
【０３５３】
特徴：
・脂肪および飽和脂肪が低い。
・供給当たり３ｇの全脂肪および＜５ｍｇのコレステロールを含有する。
・クリーム風味に富む。
・良好なタンパク質源、カルシウム源および他の必須ビタミンおよび無機質の源。
・低コレステロール食。
・ラクトースを含有せず、容易に消化される。
【０３５４】
成分：
フレンチバニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖（スクロース）、カゼイン酸カルシウム、高オレイン酸サフラワー油、カノラ油、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム二塩基酸、リン酸マグネシウム二塩基酸、天然および人工フレーバー、リン酸カルシウム三塩基酸、セルロースゲル、塩化コリン、大豆レシチン、カラゲナン、塩（塩化ナトリウム）、アスコルビン酸、セルロースガム、硫酸第一鉄、α−トコフェリル酢酸、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩化チアミン塩酸塩、ビタミンＡパルミタート、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、塩化クロム、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０３５５】
タンパク質：
タンパク質源はカゼイン酸カルシウムである。
カゼイン酸カルシウム １００％。
【０３５６】
脂肪：
脂肪源は、２つの油、すなわち、高オレイン酸サフラワー油とカノラ油との混合物である。
高オレイン酸サフラワー油 ７０％
カノラ油 ３０％。
【０３５７】
ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴ中の脂肪レベルは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＨＡ）の指針を満足するものである。ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴ中の３グラムの脂肪は全カロリーの１３．５％に相当し、該脂肪の１．４％は飽和脂肪酸由来であり、２．６％は多価不飽和脂肪酸由来である。これらの値は、全カロリーの＜３０％が脂肪由来、該カロリーの＜１０％が飽和脂肪酸由来、および全カロリーの＜１０％が多価不飽和脂肪酸由来というＡＨＡ指針の範囲内である。
【０３５８】
炭水化物：
ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴは、マルトデキストリンとスクロースとの組合せを含有する。チョコレートフレーバーはコーンシロップも含有する。穏やかな甘味およびフレーバーの多様性（フレンチバニラ、チョコレートシュプレーム、イチゴ・スワール（ｓｗｉｒｌ））に加えて、ペカン、オウトウ、イチゴ、レモンおよびオレンジにおけるＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ Ｐａｃｓは、フレーバー疲労を予防するのを助け、患者のコンプライアンスを助ける。
【０３５９】
バニラおよび他の非チョコレートフレーバー：
スクロース ５１％
マルトデキストリン ４９％。
【０３６０】
チョコレート：
スクロース ４７．０％
コーンシロップ ２６．５％
マルトデキストリン ２６．５％。
【０３６１】
ビタミンおよび無機質：
ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴの８−ｆｌ−ｏｚの供給は、２４種の主要ビタミンおよび無機質に関するＲＤＩの少なくとも２５％を与える。
【０３６２】
カフェイン：
チョコレートフレーバーは２．１ｍｇのカフェイン／８ｆｌ ｏｚを含有する。
【０３６３】
Ｅ．ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ（登録商標）
用法：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは、通常以上のカロリーおよび栄養素ならびに通常濃度のタンパク質を要する場合に使用される高カロリー低残渣（ｌｏｗ−ｒｅｓｉｄｕｅ）流動食である。それは、主として、食事と共に若しくは食間に使用される経口栄養補足物として又は適量での食事代替物として意図されている。ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは、ラクトースおよびグルテンを含有しない。それは主として経口補足物であるが、それはチューブにより供給されうる。
【０３６４】
患者の条件：
・一定容積中の通常以上のカロリーおよび栄養素ならびに通常濃度のタンパク質を要する患者用。
・体重を増加させること又は健康な体重を維持することを要する患者用。
【０３６５】
特徴：
・クリーム風味に富む。
・良好な必須ビタミンおよび無機質の源。
【０３６６】
成分：
バニラ：−Ｄ水、コーンシロップ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、トウモロコシ油、カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム、糖（スクロース）、分離大豆タンパク質、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、リン酸カルシウム三塩基酸、大豆レシチン、天然および人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリル酢酸、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩化チアミン塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、ビタミンＡパルミタート、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミンおよびビタミンＤ３。
【０３６７】
タンパク質：
タンパク質源は、２つの高生物価タンパク質、すなわちカゼインと大豆との混合物である。
カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム ８４％
分離大豆タンパク質 １６％。
【０３６８】
脂肪：
脂肪源はトウモロコシ油である。
トウモロコシ油 １００％。
【０３６９】
炭水化物：
ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは、マルトデキストリンとスクロースとの組合せを含有する。穏やかな甘味およびフレーバーの多様性（バニラ、イチゴ、コーヒー、バッファーペカンおよびエッグノック）に加えて、ペカン、オウトウ、イチゴ、レモンおよびオレンジにおけるＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ Ｐａｃｓは、フレーバー疲労を予防するのを助け、患者のコンプライアンスを助ける。
【０３７０】
バニラ、イチゴ、バターペカンおよびコーヒーフレーバー：
コーンシロップ ３９％
マルトデキストリン ３８％
スクロース ２３％。
【０３７１】
チョコレートおよびエッグノック：
コーンシロップ ３６％
マルトデキストリン ３４％
スクロース ３０％。
【０３７２】
ビタミンおよび無機質：
ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳの８−ｆｌ−ｏｚの供給は、２５種の主要ビタミンおよび無機質に関するＲＤＩの少なくとも１５％を与える。
【０３７３】
カフェイン：
チョコレートフレーバーは３．１ｍｇのカフェイン／８ｆｌ ｏｚを含有する。コーヒーフレーバーは微量のカフェインを含有する。
【０３７４】
Ｆ．ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ（登録商標）ＨＮ
用法：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ ＨＮは、より高いカロリーおよびタンパク質要求性または一定量の耐性を有する者のために意図された栄養的に完全な高カロリー、高窒素流動食である。それは、チューブによる経口補足または全栄養支持のために使用することができる。ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ ＨＮはラクトースおよびグルテンを含有しない。
【０３７５】
患者の条件：
・手術または損傷の後のように、増加したカロリーおよびタンパク質要求性を有する患者用。
・一定量の耐性および早期満腹を有する患者用。
【０３７６】
特徴：
・補足的または完全な栄養用。
・経口またはチューブによる供給用。
・１．５ＣａＶｍＬ。
・高窒素。
・カロリー的に密。
【０３７７】
成分：バニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム、トウモロコシ油、糖（スクロース）、分離大豆タンパク質、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、リン酸カルシウム三塩基酸、大豆レシチン、天然および人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、タウリン、Ｌ−カルニチン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリル酢酸、ナイアシンアミド、カラゲナン、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩化チアミン塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、ビタミンＡパルミタート、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミンおよびビタミンＤ３。
【０３７８】
Ｇ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲ
用法：ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲ（水で再構成（還元）される）は、主として、食事と共に又は食間に使用される経口栄養補足物として意図された低残渣流動食である。ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲはラクトースおよびグルテンを含有せず、低コレステロール食を含む加工食中での使用に適している。
【０３７９】
患者の条件：
・加工食を取っている患者用。
・栄養的危機状態にある高齢患者用。
・疾患／手術から回復中の患者用。
・低残渣食を要する患者用。
【０３８０】
特徴：
・混合が容易、簡便。
・飽和脂肪が低い。
・供給当たり９ｇの全脂肪および＜５ｍｇのコレステロールを含有する。
・低コレステロール食用。
・ラクトースを含有せず、容易に消化される。
【０３８１】
成分：
バニラ：−Ｄ水、コーンシロップ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、トウモロコシ油、カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム、分離大豆タンパク質、人工フレーバー、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、リン酸カルシウム三塩基酸、塩化カリウム、大豆レシチン、アスコルビン酸、塩化コリン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリル酢酸、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、塩化チアミン塩酸塩、硫酸第二銅、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、ビタミンＡパルミタート、葉酸、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０３８２】
タンパク質：
タンパク質源は、２つの高生物価タンパク質、すなわちカゼインと大豆との混合物である。
カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム ８４％
分離大豆タンパク質 １６％。
【０３８３】
脂肪：
脂肪源はトウモロコシ油である。
トウモロコシ油 １００％。
【０３８４】
炭水化物：
ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲは、コーンシロップ、マルトデキストリンおよびスクロースの組合せを含有する。ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲの穏やかな甘味に加えて、ペカン、オウトウ、イチゴ、レモンおよびオレンジにおけるＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ Ｐａｃｓは、フレーバー疲労を予防するのを助け、患者のコンプライアンスを助ける。
【０３８５】
バニラ：
コーンシロップ ３５％
マルトデキストリン ３５％
スクロース ３０％。
【０３８６】
Ｈ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＵＤＤＩＮＧ
用法：ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは、食事と共に又は食間に使用される非液体形態においてバランス栄養をもたらす栄養的に密な補足物である。それは、コンシステンシー加工食（例えば、軟らかい、ピューレされた又は完全な液体）に、または嚥下障害を有する者に適している。ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧはグルテンを含有しない。
【０３８７】
患者の条件：
コンシステンシー加工食（例えば、軟らかい、ピューレされた又は完全な液体）を取っている患者用。
・嚥下障害を有する患者用。
【０３８８】
特徴：
・濃厚かつクリーム質、良好な味。
・良好な必須ビタミンおよびミネラル源
・簡便であり、冷蔵を要しない。
・グルテンを含有しない。
【０３８９】
５ｏｚ当たりの栄養プロフィール：カロリー２５０、タンパク質１０．９％、全脂肪３４．９％、炭水化物５４．２％。
【０３９０】
成分：
バニラ：−Ｄ脱脂乳、水、糖（スクロース）、部分水素添加大豆油、化工食品用デンプン、硫酸マグネシウム、ナトリウム ステアロイル ラクチラート、リン酸ナトリウム二塩基酸、人工フレーバー、アスコルビン酸、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリル酢酸、塩化コリン、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、ＦＤ＆Ｃ イエロー＃５、クエン酸カリウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミタート、塩化チアミン塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、ＦＤ＆Ｃ イエロー＃６、葉酸、ビオチン、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０３９１】
タンパク質：
タンパク質源は脱脂乳である。
脱脂乳 １００％。
【０３９２】
脂肪：
脂肪源は水素添加大豆油である。
水素添加大豆油 １００％。
【０３９３】
炭水化物：
ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは、スクロースと化工食品用デンプンとの組合せを含有する。穏やかな甘味およびフレーバーの多様性（バニラ、チョコレート、バタースカッチおよびタピオカ）はフレーバー疲労を予防するのを助ける。該製品は、供給当たり９．２グラムのラクトースを含有する。
【０３９４】
バニラおよび他の非チョコレートフレーバー：
スクロース ５６％
ラクトース ２７％
化工食品用デンプン １７％。
【０３９５】
チョコレート：
スクロース ５８％
ラクトース ２６％
化工食品用デンプン １６％。
【０３９６】
Ｉ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲ：
用法：ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは、増加した食物繊維および栄養素から利益を受けうる者を意図した、繊維を含有する栄養的に完全な流動食である。ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは、低残渣食を要しない者に適している。それは経口またはチューブにより供給されることが可能であり、通常食に対する栄養補足物として、または適量での食事代替物として使用されうる。ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは、ラクトースおよびグルテンを含有し、低コレステロール食を含む加工食における使用に適している。
【０３９７】
患者の条件：
・増加した食物繊維および栄養素から利益を受けうる患者。
【０３９８】
特徴：
・新規に開発された製剤であり、飽和脂肪が低く、ビタミンおよび無機質がより高い。
・供給当たり６ｇの全脂肪および＜５ｍｇのコレステロールを含有する。
・濃厚、クリーム質の味。
・良好な繊維源。
・優れた必須ビタミンおよび無機質源。
・低コレステロール食用。
・ラクトースおよびグルテンを含有しない。
【０３９９】
成分：
バニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖（スクロース）、カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム、エンバク繊維、高オレイン酸サフラワー油、カノラ油、分離大豆タンパク質、トウモロコシ油、大豆繊維、リン酸カルシウム三塩基酸、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、セルロースゲル、大豆レシチン、リン酸カリウム二塩基酸、クエン酸ナトリウム、天然および人工フレーバー、塩化コリン、リン酸マグネシウム、アスコルビン酸、セルロースガム、塩化カリウム、カラゲナン、硫酸第一鉄、α−トコフェリル酢酸、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミタート、塩化チアミン塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０４００】
タンパク質：
タンパク質源は、２つの高生物価タンパク質、すなわちカゼインと大豆との混合物である。
カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム ８０％
分離大豆タンパク質 ２０％。
【０４０１】
脂肪：
脂肪源は、３つの油、すなわち、高オレイン酸サフラワー油、カノラ油およびトウモロコシ油の混合物である。
高オレイン酸サフラワー油 ４０％
カノラ油 ４０％
トウモロコシ油 ２０％
【０４０２】
ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲ中の脂肪レベルは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＨＡ）の指針を満足するものである。ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲ中の６グラムの脂肪は全カロリーの２２％に相当し、該脂肪の２．０１％は飽和脂肪酸由来であり、６．７％は多価不飽和脂肪酸由来である。これらの値は、全カロリーの＜３０％が脂肪由来、該カロリーの＜１０％が飽和脂肪酸由来、および全カロリーの＜１０％が多価不飽和脂肪酸由来というＡＨＡ指針の範囲内である。
【０４０３】
炭水化物：
ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは、マルトデキストリンとスクロースとの組合せを含有する。穏やかな甘味およびフレーバーの多様性（バニラ、チョコレートおよびバターペカン）に加えて、ペカン、オウトウ、イチゴ、レモンおよびオレンジにおけるＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ Ｐａｃｓは、フレーバー疲労を予防するのを助け、患者のコンプライアンスを助ける。
【０４０４】
バニラおよび他の非チョコレートフレーバー：
マルトデキストリン ６６％
スクロース ２５％
エンバク繊維 ７％
大豆繊維 ２％。
【０４０５】
チョコレート：
マルトデキストリン ５５％
スクロース ３６％
エンバク繊維 ７％
大豆繊維 ２％。
【０４０６】
繊維：
ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲにおいて使用する繊維混合物は、エンバク繊維および大豆多糖よりなる。この混合物は、８−ｆｌ．ｏｚ缶当たり約４グラムの全食物繊維を与える。不溶性繊維：可溶性繊維の比は９５：５である。
【０４０７】
前記および当業者に公知の種々の栄養補足物は、本発明に従い製造したＰＵＦＡで置換および／または補足することができる。
【０４０８】
Ｊ．Ｏｘｅｐａ（商標）栄養製品
Ｏｘｅｐａは、ＡＲＤＳまたはそのリスクを有する患者の食事処置を意図した、低炭水化物でありカロリー的に密な経腸栄養製品である。それは、抗レベルの抗酸化剤およびエイコサペンタエン酸（魚油由来のＥＰＡ）、γ−リノレン酸（ルリチシャ油由来のＧＬＡ）を含有する特許された油混合物を含む成分の特有の組合せを有する。
【０４０９】
カロリー分布：
カロリー密度は、エネルギー要求性を満たす容積を最小限に抑えるために１．５Ｃａｌ／ｍＬ（３５５Ｃａｌ／８ ｆｌ．ｏｚ）と高い。Ｏｘｅｐａ中のカロリーの分布を表ＩＶに示す。
【０４１０】
【表３】
Figure 0004959903
【０４１１】
脂肪：
・Ｏｘｅｐａは、８−ｆｌ ｏｚの供給（９３．７ｇ／Ｌ）当たり２２．２ｇの脂肪を含有する。
・脂肪源は、３１．８％のカノラ油、２５％の中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）、２０％のルリチシャ油、２０％の魚油および３．２％の大豆レシチンの油混合物である。Ｏｘｅｐａの典型的な脂肪酸プロフィールを表Ｖに示す。
・Ｏｘｅｐａは、表ＶＩに示すとおりのバランス量の多価不飽和、一価不飽和および飽和脂肪酸を提供する。
・中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）（該脂肪混合物の２５％）は、胆汁酸による乳化を伴わずに腸管により吸収されるため、胃を空にするのを助ける。
【０４１２】
Ｏｘｅｐａ（商標）栄養製品の種々の脂肪酸成分は、本発明に従い製造したＰＵＦＡで置換および／または補足することができる。
【０４１３】
【表４】
Figure 0004959903
【０４１４】
【表５】
表ＶＩ．Ｏｘｅｐａの脂肪プロフィール
脂肪由来の全カロリーに対する％ ５５．２
多価不飽和脂肪酸 ３１．４４ｇ／Ｌ
一価不飽和脂肪酸 ２５．５３ｇ／Ｌ
飽和脂肪酸 ３２．３８ｇ／Ｌ
ｎ−６：ｎ−３の比 １．７５：１
コレステロール ９．４９ｍｇ／８ ｆｌ ｏｚ
４０．１ｍｇ／Ｌ
【０４１５】
炭水化物：
・炭水化物含量は、８−ｆｌ−ｏｚの供給（１０５．５ｇ／Ｌ）当たり２５．０ｇである。
・炭水化物源は、共に容易に消化され吸収される４５％ マルトデキストリン（複合炭水化物）および５５％ スクロース（単糖）である。
・Ｏｘｅｐａの高脂肪および低炭水化物は、二酸化炭素（ＣＯ２）の生成を最小限に抑えるよう意図されている。高いＣＯ２レベルは、ベンチレータに依存する患者においては離乳を難しくする。低い炭水化物レベルは、ストレス誘発性高血糖を現している患者にも有用かもしれない。
・Ｏｘｅｐａはラクトースを含有しない
【０４１６】
食事炭水化物、タンパク質由来のアミノ酸、および脂肪のグリセロール部分は、体内でグルコースに変換されうる。この過程の全体にわたり、グルコース依存性組織（例えば、中枢神経系および赤血球）の炭水化物要求性が満たされる。しかし、炭水化物を含有しない食事は、ケトーシス、組織タンパク質の過剰異化、ならびに体液および電解質の喪失を招きうる。カロリー摂取が適切である場合には、これらの影響は、５０〜１００ｇの消化可能な炭水化物の毎日の摂取により予防することができる。エネルギー要求性が満たされている場合には、Ｏｘｅｐａにおける炭水化物レベルは、糖新生を最小限に抑えるのに十分である。
【０４１７】
タンパク質：
・Ｏｘｅｐａは、８−ｆｌ−ｏｚの供給（６２．５ｇ／Ｌ）当たり１４．８ｇのタンパク質を含有する。
・全カロリー／窒素比（１５０：１）は、ストレスを受けた患者の要求性を満たす。
・Ｏｘｅｐａは、呼吸における問題を突発させることなく除脂肪体重の維持および同化を促進するのに十分なタンパク質を提供する。高いタンパク質摂取は、呼吸不全の患者においては問題である。タンパク質はＣＯ２生成にはほとんど影響を及ぼさないが、高タンパク質食は換気駆動を増強するであろう。
・Ｏｘｅｐａのタンパク質源は、８６．８％がカゼイン酸ナトリウム、そして１３．２％がカゼイン酸カルシウムである。
・Ｏｘｅｐａにおけるタンパク質系のアミノ酸プロフィールは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓが定めた高品質タンパク質に関する基準を満たすか又はそれを凌ぐものである。
＊ Ｏｘｅｐａはグルテンを含有しない。
【０４１８】
解析プログラムのデフォルト設定
ＧＣＧプログラム
ＦａｓｔＡ検索
デフォルトパラメーター：
関心領域 開始時＝１ 終了時＝最終タンパク質または核酸
検索設定 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（タンパク質）またはＧｅｎＥＭＢＬ（核酸）のすべて
ワードサイズ ＝タンパク質には（２） 核酸には（６）
予想スコアは、Ｅ（ ）値が２．０に達するまでのスコアを列挙する。
ＴＦａｓｔＡ検索
デフォルトパラメーター：
関心領域 開始時＝１ 終了時＝最終核酸
検索設定 ＧｅｎＥＭＢＬのすべて
ワードサイズ ワードサイズ＝（２）
予想スコアは、Ｅ（ ）値が２．０に達するまでのスコアを列挙する。
パイルアップ
デフォルトパラメーター：
ギャップ生成ペナルティ ギャップウェイト＝５
ギャップ伸長ペナルティ ギャップ長ウェイト＝１２
プロット図 １ページプロット密度＝２．７
Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒプログラム
デフォルトパラメーター：
自動集合
ダーティデータアルゴリズム＝より遅いコンティグ集合であるが、配列間の、より厳密な比較である。
最小マッチ＝８５％
最小重複＝２０
ＢＬＡＳＴ２（ｂｌａｓｔｐ、ｔｂｌａｓｔｎ）
デフォルトパラメーター：Ｖ＝５０ ラムダ＝．３２９ Ｗ＝３
Ｂ＝５０ Ｋ＝０．１４０ Ｘ＝２２
Ｅ＝１０ Ｈ＝０．４２７
ｂｌａｓｔ ｎ
デフォルトパラメーター：Ｖ＝１００ ラムダ＝１．３７ Ｗ＝１１
Ｂ＝２５０ Ｋ＝０．１７１ Ｘ１＝２２
Ｅ＝１０ Ｈ＝１．３１ Ｘ２＝２５
ＢＬＡＳＴ ２ コマンドラインアーギュメント
・ｖ ヒット 示す最良スコアの数
・ｂ アライメント 示す最良アライメントの数
・ｅ 期待値（Ｅ） ［真の］デフォルト＝１０．０
・ｍ アライメントビューオプション：
０＝ペアワイズ、
１＝同一性を示すマスタスレーブ、
２＝マスタスレーブ、同一性無し、
３＝平坦なマスタスレーブ、同一性を示す、
４＝平坦なマスタスレーブ、同一性無し、
５＝マスタスレーブ、平滑末端および同一性無し
６＝平坦なマスタスレーブ、平滑末端および同一性無し、
［整数］
デフォルト＝０
・Ｆ フィルタークエリー（query）配列 （ｂｌａｓｔｎではＤＵＳＴ、その他ではＳＥＧ）［Ｔ／Ｆ］
デフォルト＝Ｔ
・Ｇ ギャップを開くためのコスト（ゼロはデフォルト挙動を引き起こす）［整数］
デフォルト＝０
・Ｅ ギャップを伸長させるためのコスト（ゼロはデフォルト挙動を引き起こす）［整数］
デフォルト＝０
・Ｘ ギャップ化アライメントに関するＸドロップオフ（ビット単位）（ゼロはデフォルト挙動を引き起こす）［整数］
デフォルト＝０
・Ｉ デフラインにおけるＧＩを示す ［Ｔ／Ｆ］
デフォルト＝Ｆ
・ｇ ヌクレオチドミスマッチに関するペナルティ（ｂｌａｓｔｎのみ）［整数］
デフォルト＝−３
・ｒ ヌクレオチドマッチに関するリウォード（ｂｌａｓｔｎのみ）［整数］
デフォルト＝１
・ｆ 伸長ヒットに関する閾値 ゼロならデフォルト［整数］
デフォルト＝０
・ｇ ギャップ化アライメントを実行（ｔｂｌａｓｔｘでは利用できない）［Ｔ／Ｆ］
デフォルト＝Ｔ
・ｑ 使用するクエリー（query）遺伝暗号 ［整数］
デフォルト＝１
・Ｄ ＤＢ遺伝暗号
［整数］
デフォルト＝１
・Ｊ クエリー（query）デフラインを信じる ［Ｔ／Ｆ］
デフォルト＝Ｆ
・Ｍ マトリックス ［ストリング］
デフォルト＝ＢＬＯＳＵＭ６２
・Ｗ ワードサイズ ゼロの場合はデフォルト［整数］
デフォルト＝０
・ｚ データベースの有効長（真のサイズに関してはゼロを使用）
デフォルト＝０
・ａ 使用するプロセッサーの数 ［整数］
デフォルト＝適合性のあるサイト（ＳｅｑＳｅｒｖｅｒ．ｃｏｎｆ）
ギャップオープン／ギャップ伸長コスト（−Ｇ／−Ｅ）パラメーターに関する許容およびデフォルト値：
【表６】
Figure 0004959903

【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、種々の脂肪酸の生合成経路を表す。エロンガーゼ酵素（ｅｌｏ）の役割に注目すべきである。
【図２】 図２は、ホホバＫＣＳおよびＥＬＯ２のアミノ酸配列間の類似性（％）および同一性（％）を表す。
【図３】 図３は、図２のホホバＫＣＳ配列に相同なエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ２配列を表す（プライマー配列が下線で示されている）。
【図４Ａ】 図４Ａは、ＭＡＥＬＯ ｃＤＮＡを含有するｐＲＡＥ−２の物理的地図を示す。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、酵母内でのエロンガーゼ酵素の製造に使用する構成的発現ベクターｐＲＡＥ−５の物理的地図を表す。
【図５】 図５は、クローンｐＲＡＥ−５およびｐＲＡＥ−６のヌクレオチド配列の比較を表す。
【図６】 図６は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）の完全なヌクレオチド配列を示す。
【図７】 図７は、ＭＡＥＬＯ（図６を参照されたい）から翻訳されたモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼのアミノ酸配列を表す。
【図８Ａ】 図８は、３つのエロンガーゼ、すなわち、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）および図７に示す翻訳されたＭＡＥＬＯ配列の間のアミノ酸配列アライメントを表す。
【図８Ｂ】 図８は、３つのエロンガーゼ、すなわち、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）および図７に示す翻訳されたＭＡＥＬＯ配列の間のアミノ酸配列アライメントを表す。
【図９Ａ】 図９は、ヌクレオチド配列ＭＡＥＬＯとエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＥＬＯ２のヌクレオチド配列との比較を表す。
【図９Ｂ】 図９は、ヌクレオチド配列ＭＡＥＬＯとエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＥＬＯ２のヌクレオチド配列との比較を表す。
【図１０Ａ】 図１０Ａおよび１０Ｂは、パン酵母内で発現されたＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【図１０Ｂ】 図１０Ａおよび１０Ｂは、パン酵母内で発現されたＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【図１１】 図１１は、ＡＡを製造するためにエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）由来のΔ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共に共発現した場合のＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図１２】 図１２は、パン酵母内でのエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＥＬＯ２の過剰発現とＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を比較している。
【図１３】 図１３、１４および１５は、ＧｅｎＥＭＢＬデータベースにおけるシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ヌクレオチド配列由来のアミノ酸配列の、翻訳されたＭＡＥＬＯとの３つの別々の比較を表す。
【図１４】 図１３、１４および１５は、ＧｅｎＥＭＢＬデータベースにおけるシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ヌクレオチド配列由来のアミノ酸配列の、翻訳されたＭＡＥＬＯとの３つの別々の比較を表す。
【図１５】 図１３、１４および１５は、ＧｅｎＥＭＢＬデータベースにおけるシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ヌクレオチド配列由来のアミノ酸配列の、翻訳されたＭＡＥＬＯとの３つの別々の比較を表す。
【図１６】 図１６は、該翻訳ＭＡＥＬＯおよびＧｅｎＥＭＢＬデータベースにおける２つの異なる哺乳類配列のアミノ酸翻訳間の比較を示す。
【図１７】 図１７は、データーベース検索中に検出された、ＭＡＥＬＯ由来のアミノ酸配列と、翻訳されたＤＮＡ配列（公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ８８／０７５７７を参照されたい）の比較を示す。
【図１８】 図１８は、エム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）由来のΔ５−デサチュラーゼの完全なヌクレオチド配列を示す。
【図１９】 図１９は、ＭＡＤ７０８プールの初期ＧＣ−ＦＡＭＥ分析を表す。ＤＧＬＡ（Ｃ２０：３ｎ−６）ピークの検出に注目すべきである。
【図２０】 図２０は、ＧＬＡを基質として使用した場合の酵母における５つのＭＡＤ７０８クローンのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。すべてのクローンが見掛け上のエロンガーゼ活性を有している。
【図２１】 図２１は、プラスミドｐＲＰＢ２のＤＮＡ配列分析を表す。該分析は９５７ｂｐ長のオープンリーディングフレームを示している。
【図２２】 図２２は、プラスミドｐＲＰＢ２内に含有されているエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を示し、それはそのＧＬＡエロンガーゼ活性にちなんでＧＬＥＬＯと称される。
【図２３】 図２３は、ＧＬＥＬＯ（図２２を参照されたい）から翻訳されたエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼのアミノ酸配列を表す。
【図２４】 図２４は、ＧＬＡで補足された３３４（ｐＲＰＢ２）の誘導培養内でのｎ−６ ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図２５Ａ】 図２５は、２５μＭの他の脂肪酸基質で補足された３３４（ｐＲＰＢ２）の誘導培養内でのｎ−３およびｎ−６ ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【図２５Ｂ】 図２５は、２５μＭの他の脂肪酸基質で補足された３３４（ｐＲＰＢ２）の誘導培養内でのｎ−３およびｎ−６ ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【図２６Ａ】 図２６Ａは、ＡＡを製造するためにエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共に共発現させ基質としてＧＬＡを使用した場合のＧＬＥＬＯのエロンガーゼ活性を示す。
【図２６Ｂ】 図２６Ｂは、ＡＡを製造するためにエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共に共発現させ基質としてＳＴＡを使用した場合のＧＬＥＬＯのエロンガーゼ活性を示す。
【図２７】 図２７は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列（図２３を参照されたい）と翻訳されたＭＡＥＬＯ配列（図７を参照されたい）との比較を示す。
【図２８Ａ】 図２８は、４つのエロンガーゼのアミノ酸配列、すなわち、ＧＬＥＬＯの翻訳されたアミノ酸配列（図２３を参照されたい）、ＭＡＥＬＯ（図７を参照されたい）、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）およびエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）の比較を表す。ヒスチジンボックスが下線で示されている。
【図２８Ｂ】 図２８は、４つのエロンガーゼのアミノ酸配列、すなわち、ＧＬＥＬＯの翻訳されたアミノ酸配列（図２３を参照されたい）、ＭＡＥＬＯ（図７を参照されたい）、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）およびエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）の比較を表す。ヒスチジンボックスが下線で示されている。
【図２９】 図２９は、翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定ヒトホモログＨＳ１配列とのアライメントを表す。
【図３０】 図３０は、翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定ヒトホモログＨＳ２配列とのアライメントを表す。
【図３１】 図３１は、翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定マウスホモログＭＭ２配列とのアライメントを表す。
【図３２】 図３２は、翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定マウスホモログＡＩ２２５６３２配列とのアライメントを表す。
【図３３】 図３３は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳されたヒトホモログＡＩ８１５９６０配列とのアライメントを表す。
【図３４】 図３４は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定ヒトホモログＨＳ１配列とのアライメントを表す。
【図３５】 図３５は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列とＡＣ００４０５０由来の翻訳された推定ヒトホモログ配列とのアライメントを表す。
【図３６】 図３６は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定マウスホモログＭＭ２配列とのアライメントを表す。
【図３７】 図３７は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定マウスホモログＡＩ２２５６３２配列とのアライメントを表す。
【図３８】 図３８は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定マウスホモログＵ９７１０７とのアライメントを表す。
【図３９】 図３９は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Ｕ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）ホモログ配列とのアライメントを表す。
【図４０】 図４０は、翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Ｕ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）ホモログ配列とのアライメントを表す。
【図４１】 図４１は、翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ホモログ配列ＤＭ１とのアライメントを表す。
【図４２】 図４２は、翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ホモログ配列ＤＭ１とのアライメントを表す。
【図４３】 図４３は、ヒトエロンガーゼＨＳＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を示す。
【図４４】 図４４は、ヒトエロンガーゼＨＳＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を示す。
【図４５】 図４５は、ＧＬＡまたはＡＡで補足された場合の３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）の誘導培養のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡなど）を示す。
【図４６】 図４６は、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）エロンガーゼＣＥＥＬＯの完全なヌクレオチド配列を示す。
【図４７】 図４７は、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）エロンガーゼＣＥＥＬＯの推定アミノ酸を表す。
【図４８】 図４８は、ＧＬＡおよびＡＡで補足された場合の３３４（ｐＲＥＴ−２１）および３３４（ｐＲＥＴ−２２）の誘導培養のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図４９】 図４９は、推定ヒトエロンガーゼ遺伝子ＨＳ３の完全なヌクレオチド配列を表す。
【図５０】 図５０は、推定ヒトエロンガーゼ酵素ＨＳ３の推定アミノ酸配列を示す。
【図５１】 図５１は、ＧＬＡ、ＡＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、ＯＡまたはＡＬＡで補足された場合のパン酵母内で発現されたＨＳＥＬＯ１のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡなど）を表す。
【図５２】 図５２は、２５ｍＭまたは１００ｍＭのＧＬＡ、ＡＡまたはＥＰＡで補足された場合のパン酵母内で発現されたＨＳＥＬＯ１のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡなど）を表す。
【図５３Ａ】 図５３Ａ、５３Ｂおよび５３Ｃは、ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡで補足された場合あるいは基質が存在しない場合のパン酵母内で発現されたＨＳＥＬＯ１のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡなど）を表す。
【図５３Ｂ】 図５３Ａ、５３Ｂおよび５３Ｃは、ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡで補足された場合あるいは基質が存在しない場合のパン酵母内で発現されたＨＳＥＬＯ１のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡなど）を表す。
【図５３Ｃ】 図５３Ａ、５３Ｂおよび５３Ｃは、ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡで補足された場合あるいは基質が存在しない場合のパン酵母内で発現されたＨＳＥＬＯ１のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡなど）を表す。
【図５４】 図５４は、マウスエロンガーゼＭＥＬＯ４の完全なヌクレオチド配列を表す。
【図５５】 図５５は、マウスエロンガーゼＭＥＬＯ４の推定アミノ酸配列を表す。
【図５６】 図５６は、ＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡで補足された場合のパン酵母内で発現されたＭＥＬＯ４のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【図５７Ａ】 図５７Ａ、５７Ｂおよび５７Ｃは、ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡで補足された場合あるいは基質が存在しない場合のパン酵母内で発現されたＭＥＬＯ４のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【図５７Ｂ】 図５７Ａ、５７Ｂおよび５７Ｃは、ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡで補足された場合あるいは基質が存在しない場合のパン酵母内で発現されたＭＥＬＯ４のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【図５７Ｃ】 図５７Ａ、５７Ｂおよび５７Ｃは、ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡで補足された場合あるいは基質が存在しない場合のパン酵母内で発現されたＭＥＬＯ４のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【図５８】 図５８は、マウスエロンガーゼＭＥＬＯ７の完全なヌクレオチド配列を表す。
【図５９】 図５９は、マウスエロンガーゼＭＥＬＯ７の推定アミノ酸配列を表す。
【図６０】 図６０は、ＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡで補足された場合のパン酵母内で発現されたＭＥＬＯ７のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡなど）を表す。
【図６１】 図６１は、基質が存在しない場合およびＡＡまたはＧＬＡの添加を伴う場合の酵母内で発現されたシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）エロンガーゼの活性を示す。
【図６２Ａ】 図６２は、５０μＭの種々の基質で補足された場合の３３４（ｐＲＥＴ２２）の誘導培養のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図６２Ｂ】 図６２は、５０μＭの種々の基質で補足された場合の３３４（ｐＲＥＴ２２）の誘導培養のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図６３Ａ】 図６３は、それぞれＡＡまたはＥＰＡを製造するために基質としてＧＬＡ（図６３Ａ）またはＳＴＡ（図６３Ｂ）を使用しエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共に共発現させた場合のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【図６３Ｂ】 図６３は、それぞれＡＡまたはＥＰＡを製造するために基質としてＧＬＡ（図６３Ａ）またはＳＴＡ（図６３Ｂ）を使用しエム・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共に共発現させた場合のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を表す。
【図６４Ａ】 図６４は、４つのエロンガーゼ、ＨＳＥＬＯ１（図４４）、ＭＥＬＯ４（図５５）、ＧＬＥＬＯ（図２３）およびＣＥＥＬＯ（図４７）の間のアミノ酸配列アライメントを表す。
【図６４Ｂ】 図６４は、４つのエロンガーゼ、ＨＳＥＬＯ１（図４４）、ＭＥＬＯ４（図５５）、ＧＬＥＬＯ（図２３）およびＣＥＥＬＯ（図４７）の間のアミノ酸配列アライメントを表す。
【図６５】 図６５は、部分スラウストチトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）（ティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ））７０９１エロンガーゼ遺伝子のコンセンサスヌクレオチド配列を表す。
【図６６】 図６６は、図６５のティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼ遺伝子の推定アミノ酸配列を表す。
【図６７】 図６７は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ１からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【図６８】 図６８は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ２からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【図６９】 図６９は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ３からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【図７０】 図７０は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ４からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【図７１】 図７１は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ６からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【図７２】 図７２は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ７からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【図７３】 図７３は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ｄ１からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全なヌクレオチド配列を表す。
【図７４】 図７４は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ１からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【図７５】 図７５は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ２からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【図７６】 図７６は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ３からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【図７７】 図７７は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ４からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【図７８】 図７８は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ６からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【図７９】 図７９は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ７からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【図８０】 図８０は、プラスミドｐＲＡＴ−４−Ｄ１からのティー・アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を表す。
【図８１Ａ】 図８１は、ＧＬＡまたはＥＰＡで補足された場合のパン酵母内で発現したＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を表す。
【図８１Ｂ】 図８１は、ＧＬＡまたはＥＰＡで補足された場合のパン酵母内で発現したＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を表す。
【図８２Ａ】 図８２は、７つのプラスミド、すなわち、ｐＲＡＴ−４−Ａ１（図７４）、ｐＲＡＴ−４−Ａ２（図７５）、ｐＲＡＴ−４−Ａ３（図７６）、ｐＲＡＴ−４−Ａ４（図７７）、ｐＲＡＴ−４−Ａ６（図７８）、ｐＲＡＴ−４−Ａ７（図７９）およびｐＲＡＴ−４−Ｄ１（図８０）からのＴＥＬＯ１エロンガーゼ間のアミノ酸配列アライメントを表す。
【図８２Ｂ】 図８２は、７つのプラスミド、すなわち、ｐＲＡＴ−４−Ａ１（図７４）、ｐＲＡＴ−４−Ａ２（図７５）、ｐＲＡＴ−４−Ａ３（図７６）、ｐＲＡＴ−４−Ａ４（図７７）、ｐＲＡＴ−４−Ａ６（図７８）、ｐＲＡＴ−４−Ａ７（図７９）およびｐＲＡＴ−４−Ｄ１（図８０）からのＴＥＬＯ１エロンガーゼ間のアミノ酸配列アライメントを表す。
【図８３】 図８３は、翻訳されたＴＥＬＯ１配列と翻訳されたＨＳＥＬＯ１配列とのアライメントを表す。
【図８４】 図８４は、翻訳されたＴＥＬＯ１配列と翻訳されたＭＥＬＯ４配列とのアライメントを表す。
【図８５】 図８５は、翻訳されたＴＥＬＯ１配列と翻訳されたＧＬＥＬＯ配列とのアライメントを表す。
【図８６】 図８６は、翻訳されたＴＥＬＯ１配列と翻訳されたＣＥＥＬＯ配列とのアライメントを表す。
【図８７Ａ】 図８７は、ＧＬＡ、ＡＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡで補足された場合またはいずれの基質でも補足されなかった場合のパン酵母内で発現されたＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を表す。
【図８７Ｂ】 図８７は、ＧＬＡ、ＡＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡで補足された場合またはいずれの基質でも補足されなかった場合のパン酵母内で発現されたＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を表す。
【図８８】 図８８は、ＬＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＡまたはＥＰＡで補足された場合のパン酵母内で発現されたＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を表す。

Claims (17)

  1. 配列番号７（図７２）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、該ヌクレオチド配列は、エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。）を包含する又は該ヌクレオチド配列に相補的な単離された核酸。
  2. 該配列が、多価不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードする、請求項１に記載の単離された核酸。
  3. 請求項１に記載のヌクレオチド配列にコードされる精製されたタンパク質。
  4. 請求項３に記載の精製されたタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸類似性を有し多価不飽和脂肪酸を伸長させる精製されたポリペプチド。
  5. ａ）配列番号７（図７２）を含むヌクレオチド配列を単離し、
    ｂ）ｉｉ）プロモーターに作動的に結合したｉ）該単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築し、
    ｃ）該エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件下、該ベクターを宿主細胞内に導入する工程を含んでなる、エロンガーゼ酵素の製造方法。
  6. ｂ）プロモーターに作動的に結合したａ）配列番号７（図７２）を含むヌクレオチド配列を含んでなるベクター。
  7. 請求項６に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
  8. 請求項６に記載のベクターを含んでなる植物細胞、植物または植物組織であって、該ベクターのヌクレオチド配列の発現が、該植物細胞、植物または植物組織による多価不飽和脂肪酸の産生をもたらすことを特徴とする植物細胞、植物または植物組織。
  9. 請求項６に記載のベクターを含んでなるトランスジェニック植物であって、該ベクターのヌクレオチド配列の発現が、該トランスジェニック植物の種子内での多価不飽和脂肪酸の産生をもたらすことを特徴とするトランスジェニック植物。
  10. ａ）配列番号７（図７２）を含むヌクレオチド配列を単離し、
    ｂ）該単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築し、
    ｃ）該単離ヌクレオチド配列にコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件下、該ベクターを宿主細胞内に導入し、
    ｄ）発現したエロンガーゼ酵素を基質多価不飽和脂肪酸にさらして、該基質を産物多価不飽和脂肪酸に変換する工程を含んでなる、多価不飽和脂肪酸の製造方法。
  11. 該基質多価不飽和脂肪酸が、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＡ、ＡＤＡおよびＡＬＡよりなる群から選ばれ、該産物多価不飽和脂肪酸が、それぞれＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸およびＳＴＡよりなる群から選ばれる、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 発現したエロンガーゼ酵素を少なくとも１つのデサチュラーゼにさらして、該産物多価不飽和脂肪酸を別の多価不飽和脂肪酸（「別多価不飽和脂肪酸」）に変換する工程を更に含む、請求項１０に記載の製造方法。
  13. 該産物多価不飽和脂肪酸が、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、ＡＤＡおよびω６−ドコサペンタエン酸よりなる群から選ばれ、該別多価不飽和脂肪酸が、それぞれＡＡ、ＥＰＡ、ω６−ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選ばれ、前記の少なくとも１つのデサチュラーゼが、ＡＡまたはＥＰＡの製造の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の製造の場合にはΔ４−デサチュラーゼであり、ドコサヘキサエン酸の製造の場合にはΔ１９−デサチュラーゼである、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 該別多価不飽和脂肪酸を、少なくとも１つのエロンガーゼおよび少なくとも１つの追加的なデサチュラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素にさらして、該別多価不飽和脂肪酸を最終多価不飽和脂肪酸に変換する工程を更に含む、請求項１２に記載の製造方法。
  15. 該最終多価不飽和脂肪酸が、ＡＤＡ、ω３−ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選ばれる、請求項１４に記載の製造方法。
  16. エロンガーゼ活性を有するポリペプチド（ここで、該ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７（図７２）よってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。）をコードするヌクレオチド配列を包含する又は相補的な単離された核酸。
  17. 前記ヌクレオチド配列が配列番号７である、請求項１６に記載の単離された核酸。
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