CZ358399A3 - Způsoby a kompozice pro syntézu poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhými řetězci - Google Patents

Abstract

Popisují se desaturázymastných kyselin schopné katalyzovaí přeměnu kyseliny olejové na kyselinu linolenovou, kyseliny linolenové na kyselinu gama-linolenovou nebo kyseliny alfalinolenové na kyselinu stearidonovou. Dále se popisuje sekvence nukleové kyseliny kódující desaturázy, sekvence nukleové kyseliny, které s nimi hybridizují, konstrukce DNA obsahující gen desaturázy a rekombinantní hostitelský mikroorganizmus nebo zvíře exprimující zvýšené množství desaturázy. Vynález se týká způsobů desaturace mastné kyseliny a produkce desaturované mastné kyseliny expresí zvýšeného množství desaturázy. Mastné kyseliny a olejeje obsahující, které se desaturovaly desaturázou, se produkují v rekombinantních hostitelských mikroorganizmech nebo zvířatech. Popisují se také farmaceutické kompozice, kojenecké výživy nebo potravinové doplňky obsahující mastné kyseliny desaturované desaturázou produkovanou rekombinantnímhostitelských mikroorganizmem nebo Způsoby a kompozice pro syntézu poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem.

Description

Způsoby a kompozice pro syntézu poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem.

Oblast techniky

Vynález popisuje modulační stupně komponentů vztahujících se mastných kyselin s dlouhými enzymatických nenasycených v mikroorganizmu nebo ve zvířeti.

enzymů a/nebo produkci polyřetězci 'PUFA)

Dosavadní stav techniky

Dvě hlavní skupiny poly-nenasycených mastných kyselin (PUFA) jsou co3-mastné kyseliny, jejichž zástupcem je kyselina ikosapentaenová (EPA), a co6-mastné kyseliny, které představuje kyselina arachidonová (ARA). PUFA jsou důležitými komponenty plazmatické membrány buněk, kde se mohou vyskytovat v takových formách, jako jsou fosfolípidy. PUFA jsou nezbytné pro správný vývoj, zvláště při vývoji mozku kojenců, tvoření a obnově tkáně. PUFA také slouží jako prekurzory jiných molekul, které jsou důležité pro člověka a zvířata, mezi něž patří prostacyklin, ikosanoidy, leukotrieny a prostaglandiny.

Čtyři nejdůležitější PUFA s dlouhým řetězcem zahrnují kyselinu dokosahexaenovou (DHA) a EPA, která se primárně nachází v různých typech rybího tuku, dále je to kyselina gana-linolenová (GLA), která se nachází v semenech řady rostlin, které zahrnují prvosenku {Oenothera biennis), brutnák lékařský (Borago officinahs) a černý rybíz (Ribes nigrům), a kyselina stearidonová (SDA), která se nachází mořských olejích a v semenech rostlin. GLA a další důležité PUFA s dlouhým řetězcem, jako je kyselina arachidonová (ARA) se nachází ve vláknitých houbách. ARA se mohou izolovat z tkáně zvířat zahrnující játra a žlázy vylučující adrenalin. GLA, ARA, EPA a SDA jsou samotné nebo jako potravní prekurzory důležitých mastných kyselin s dlouhým řetězcem, které se podílejí na mikroorganizmy zahrnující Phytium a Porphyridium.

syntéze prostaglandinu, léčbě onemocnění srdce a vývoji mozkové tkáně.

V případě DHA existuje pro komerční produkci řada zdrojů zahrnující různé mořské organizmy, oleje získané z mořských ryb žijících v chladných vodách a z frakcí vaječného žloutku. V případě ARA se mohou pro komerční produkci použít rod Mortierella, Entomophthora, Běžné zdroje SDA zahrnují rod

Trichodesma a Echium. Komerční zdroje GLA zahrnují prvosenku, černý rybíz a brutník lékařský. Existuje však několik nevýhod, které jsou spojeny s komerční produkcí PUFA z přirozených zdrojů. Přirozené zdroje PUFA, jako jsou zvířata a rostliny, vykazují vysoce heterogenní složení olejů. Oleje získané z těchto zdrojů se musí za účelem separace jednoho nebo více požadovaných PUFA nebo produkce oleje, který je obohacen jedním nebo více PUFA extenzivně čistit. Přirozené zdroje jsou také vystaveny neřízené fluktuaci dostupnosti. Zásoby ryb mohou být také oslabeny nadměrným rybolovem. Rybí olej má nepříjemnou chuť a zápach, jehož odstranění není ekonomicky výhodné a takový produkt pak nemusí být přijatelný jako potravní doplněk. Zvířecí oleje a určité rybí oleje se mohou hromadit v látkách znečišťujících prostředí. Zde se mohou hromadit zvířecí oleje a zvláště pak rybí oleje. Kolísání výtěžku z rybích a rostlinných zdrojů může ovlivňovat počasí a výskyt nemocí. Půda dostupná pro produkci alternativních plodin produkujících olej soutěží s expanzí lidské populace, což je spojeno s rostoucími potřebami produkce potravin na zbývající orné půdě. Plodiny, které produkují PUFA, jako je brutník lékařský, nebyly přizpůsobeny pěstování ve velkém a neprospívají dobře, jestliže se pěstují jako monokultura.

plodin není pak ve srovnání s lépe lépe zavedenými kulturami ekonomické.

Fermentace organizmů, jako je Mortierella, ve velkém měřítku je také nákladná. Přirozené tkáně zvířat obsahují malé

Pěstování takových prospívajícími a • · ·

množství ARA a těžko se zpracovávají. Mikroorganizmy,· jako je Porphyridium a Mortieilera se těžko kultivují v komerčním měřítku.

Potravinové doplňky a farmaceutické formulace obsahující PUFA mají scejné nevýhody jako zdroje PUFA. Doplňky, jako jsou kapsule s rybím olejem, mohou obsahovat malé množství určitých požadovaných komponent a tak jsou nutné aplikovat ve vysokých dávkách. Vysoké dávky vedou k trávení velkého množství nežádoucích komponentů, které zahrnují znečišťující látky. Nepříjemná chuť a zápach doplňků je může činit nežádoucí a pro pacienta pak může být problém dodržovat léčební plán. Velká pozornost se musí věnovat podávání doplňků mastných kyselin. Nadměrný příjem může vést k supresi endogenních biosyntetických cest a k soutěžení s jinými nezbytnými mastnými kyselinami v různých lipidových frakcích in vivo, což vede k nežádoucím výsledkům. Například eskymáci jejichž strava obsahuje velké množství ω3 mastných kyselin mají zvýšenou tendenci zvracet (US patent č. 4,874,603).

Na biosyntéze PUFA se podílí řada enzymů. Kyselina linolenová (LA, 18:2 Δ9, 12) se vyrábí z kyseliny olejové (18:1 Δ°) pomocí Á12-desaturázy. Produkce ARA (20:4 Δ5, 8, 11, 14) z kyseliny dihomo-gama-linoleové (DGLA, 20:3 Δ8, 11, 14) se katalyzuje A5-desaturázou. U zvířat však nemůže dojít k desaturaci za pozicí Δ9 a proto nemohou převést kyselinu olejovou (18:1 Δ9) na kyselinu linolenovou (18:2 Δ912). Zvířata nemohou syntetizovat kyselinu cc-li no lenovou (ALA, 18:3 Δ9, 12, 15). Jiné eukaryonty zahrnující houby a rostliny mají enzymy, které způsobují desaturaci v polohách Δ12 a Δ15. Hlavní poly-nenasycené mastné kyseliny zvířat se proto získávají buď z potravin a/nebo desaturaci a elongací kyseliny linolenové (18:2 Δ9, 12) nebo a-linolenové (18:3 Δ9, 12, 15). Proto je takový zájem o možnost získání genetického materiálu, který se podílí na biosyntéze PUFA z druhů, jenž přirozeně • 9 • · produkují mastné kyseliny, a exprimovat izolovaný materiál v mikrobiálním nebo zvířecím systému, který se může účelem produkce komerčního množství jednoho Je nutné získat desaturázy mastných kyselin, geny je kódující a rekombinantní způsoby jejich produkce. Dále je nutné vytvořit ekonomické způsoby produkce specifických PUFA.

manipulovat za nebo více PUFA

Relevantní literatura

Produkce gama-linolenové kyseliny pomocí Δδ-desaturázou se popisuje v dokumentu USPN 5,552,306. Produkce 8,11ikosadienové kyseliny za použití Mortierella alpina se popisuje v USPN 5,376,541. Produkce kyseliny dokosahexaenové pomocí dinoflagelat se popisuje v USPN 5,407,957. Klonování Δδ-palmitoylacylové proteinové desaturázy se popisuje v publikaci PCT WO 96/13591 a USPN 5,614,400. Klonování Δ6 desaturázy z brutníku lékařského se popisuje v publikaci PCT WO 96/21022. Klonování A9-desaturáz se popisuje ve zveřejněné patentové přihlášce PCT WO 91/13972, EP 0 550 162 Al, EP 0 561 569 A2, EP 0 644 263 A2 a EP 0 736 598 Al a USPN 5,057,419. Klonování Δ12 desaturáz z různýcn organizmů se popisuje v PCT publikaci WO 94/11516 a USPN 5,443,974. Klonování Δ15 desaturáz z různých organizmů se popisuje v PCT publikaci WO 93/11245.

Podstata vynálezu

Popisují se nové kompozice a metody vhodné pro přípravu poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem nebo PUFA. Kompozice zahrnují nukleové kyseliny kódující Δ6- a Δ12desaturázu a/nebo polypeptidy vykazující aktivitu Δ6- a Δ12desaturázy, polypeptidy a sondy vhodné pro izolaci a detekci. Metody zahrnují kultivaci hostitelského oragnizmu nebo • « konstrukcí eliminace koncentrací v biosyntéze zvířete, které exprimuje zavedený gen nebo geny kódující alespoň jednu desaturázu, zvláště Δ6-, Δ9-, Δ12- nebo Δ15desaturázu. Způsoby také zahrnují použití nesmyslných nebo porušení genů, za účelem snížení nebo síly exprese požadovaných desaturáz. Regulace exprese polypeptidu(ů) desaturázy poskytuje relativní zvýšení požadovaných desaturovaných PUFA, jako výsledek změněných enzymů a substrátů, které jsou zahrnuty PUFA. Vynález nachází použití například při produkci GLA, DGLA, ARA, EPA, DHA a SDA ve velkém měřítku.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje sekvence nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 1) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO:3), polypeptid kódovaný nukleotidovou sekvencí podle obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 1) nebo obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 3) a čištěný a izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 2) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 4) . V jiném provedení vynálezu se popisuje izolovaná nukleová kyselina, která kóduje polypeptid s aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 2) nebo na obrázku č. 5Ά až

D (SEQ ID NO: 4; .

Vynález popisuje izolovanou nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid, jenž desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze šestého nebo dvanáctého uhlíku od karboxylového konce, kde uvedená nukleotidová sekvence obsahuje průměrný obsah A/T menší než přibližně 60 %. V preferovaném provedení se izolovaná nukleová kyselina získala z hub, jako jsou houby rodu Mortierella. Více se preferují houby rodu Mortierella alpína.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvencí uvedenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 1) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO:3). Vynález dále obsahuje izolovaný a čištěný polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze šestého nebo dvanáctého uhlíku od karboxylového konce, kde polypeptid je eukaryontní polypeptid nebo se získal z eukaryontního polypeptidů, přičemž preferovaný eukaryontní polypeptid se získal z hub.

V jiném provedení vynálezu se popisuje izolovaná nukleová kyselina, kde nukleotidová sekvence je uvedena na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 1) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 3) . Vynález dále popisuje čištěný a izolovaný polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze šestého nebo dvanáctého uhlíku od karboxylového konce, kde polypeptid je eukaryontní polypeptid nebo se získal z eukaryontního polypeptidů, přičemž preferovaný eukaryontní polypeptid se získal z hub.

Vynález dále zahrnuje nukleovou kyselinu, která hybrídizuje s nukleotidovou sekvencí uvedenou na obrázku č. 3A až 3E (SEQ ID NO: 1) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 3) . Preferuje se izolovaná nukleová kyselina, která má nukleotidovou sekvenci vykazující alespoň přibližně 50 % shodu se sekvencí na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 1) nebo 5A až D (SEQ ID NO: 3) . Vynález dále zahrnuje izolovanou nukleovou kyselinu s nukleotidovou sekvencí, která vykazuje alespoň přibližně 50 % homologii se sekvencí na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 1) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 3) . V preferovaném provedení nukleová kyselina podle vynálezu zahrnuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obrázku č. 3A až D (SEQ ID NO: 2), která se vybrala ze skupiny zahrnující aminokyselinové zbytky 50 až 53, 39 až 43, 172 až 176, 204 až 213 a 390 až 402.

Vynález dále zahrnuje konstrukci nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci označenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 1) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 3) spojenou s heterogenní nukleovou kyselinou. V jiném provedení vynálezu se popisuje konstrukce nukleové kyseliny obsahující

nukleotidovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 1) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 3) operativně spojenou s expresívní kontrolní sekvencí, která je funkční v hostitelské buňce. Hostitelská buňka je buď eukaryont nebo prokaryont. Preferované eukaryontní hostitelské buňky jsou ty, které se vybraly ze skupiny zahrnující savčí buňku, hmyzí buňku, buňku hub a buňku řas. Preferované savčí buňky zahrnují ptačí buňku, preferovanou buňkou hub je kvasinka a preferovaná buňka řas je buňka mořských řas. Preferované prokaryontní buňky zahrnují ty vybrané ze skupiny, která obsahuje bakterie, cyanobakterie, buňky které obsahují bakteríofága a/nebo virus. Sekvence DNA rekombinantní hostitelské buňky přednostně obsahuje promotor, který je funkční v hostitelské buňce. Uvedený promotor je indukovatelný. Ve více preferovaném provedení vynálezu je mikrobiální buňkou buňka hub rodu Mortierella, více se preferuje houba sp. Mortierella alpina.

V jiném provedení vynálezu se popisuje konstrukce nukleové kyseliny, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, jenž kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 2) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 4), kde nukleotidové sekvence je operativně spojena se sekvencí řídící expresi, která funguje v mikrobiální buňce, kde nukleotidové sekvence kóduje funkční aktivní polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze šestého nebo dvanáctého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny. Vynález dále popisuje konstrukci nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvencí, která kóduje funkčně aktivní Δβ-desaturázu, kde desaturáza zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která odpovídá nebo je komplementární s celou nebo s částí aminokyselinové sekvence uvedené na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 2), kde nukleotidové sekvence je operativně spojena s sekvencí řídící transkripci funkční v hostitelské buňce.

• ο • · ♦

Vynález dále zahrnuje konstrukci nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci označenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 1) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 3) spojenou s heterogenní nukleovou kyselinou. V jiném provedení vynálezu se popisuje konstrukce nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 1) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 3) operativně spojenou s expresívní kontrolní sekvencí, která je funkční v hostitelské buňce. Hostitelská buňka je buď eukaryont nebo prokaryont. Preferované eukaryontní hostitelské buňky jsou ty, které se vybraly ze skupiny zahrnující savčí buňku, hmyzí buňku, buňku hub a buňku řas. Preferované savčí buňky zahrnují ptačí buňku, preferovanou buňkou hub je kvasinka a preferovaná buňka řas je buňka mořských řas. Preferované prokaryontní buňky zahrnují ty vybrané ze skupiny, která obsahuje bakterie, cyanobakterie, buňky které obsahují bakteriofága a/nebo virus. Sekvence DNA rekombinantní hostitelské buňky přednostně obsahuje promotor, který je funkční v hostitelské buňce. Uvedený promotor je indukovatelný. Ve více preferovaném provedení vynálezu je mikrobiální buňkou buňka hub rodu Mortierella, více se preferuje houba sp. Mortierella alpina.

V jiném provedení vynálezu se popisuje konstrukce nukleové kyseliny, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, jenž kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 2) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 4), kde nukleotidová sekvence je operativně spojena se sekvencí řídící expresi, která funguje v mikrobiální buňce, kde nukleotidová sekvence kóduje funkční aktivní polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze šestého nebo dvanáctého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny. Vynález dále popisuje konstrukcí nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje funkčně aktivní Δβ-desaturázu, kde desaturáza zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která odpovídá * · nebo je komplementární s celou nebo s částí aminokyselinové sekvence uvedené na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 2) , kde nukleotidová sekvence je operativně spojena s sekvencí řídící transkripci funkční v hostitelské buňce.

Vynález dále zahrnuje konstrukci nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci označenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 1) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 3) spojenou s heterogenní nukleovou kyselinou. V jiném provedení vynálezu se popisuje konstrukce nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 1) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 3) operativně spojenou s expresivní kontrolní sekvencí, která je funkční v hostitelské buňce. Hostitelská buňka je buď eukaryont nebo prokaryont. Preferované eukaryontní hostitelské buňky jsou ty, které se vybraly ze skupiny zahrnující savčí buňku, hmyzí buňku, buňku hub a buňku řas. Preferované savčí buňky zahrnují ptačí buňku, preferovanou buňkou hub je kvasinka a preferovaná buňka řas je buňka mořských řas. Preferované prokaryontní buňky zahrnují ty vybrané ze skupiny, která obsahuje bakterie, cyanobakterie, buňky které obsahují bakteriofága a/nebo virus. Sekvence DNA rekombinantní hostitelské buňky přednostně obsahuje promotor, který je funkční v hostitelské buňce. Uvedený promotor je indukovatelný. Ve více preferovaném provedení vynálezu je mikrobiální buňkou buňka hub rodu Mortierella, více se preferuje houba sp. Mortierella alpina.

V jiném provedení vynálezu se popisuje konstrukce nukleové kyseliny, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, jenž kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 2) nebo na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 4), kde nukleotidová sekvence je operativně spojena se sekvencí řídící expresi, která funguje v mikrobiální buňce, kde nukleotidová sekvence kóduje funkční aktivní polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze šestého nebo dvanáctého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny. Vynález dále popisuje konstrukci nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje funkčně aktivní Á6-desaturázu, kde desaturáza zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která odpovídá nebo je komplementární s celou nebo s částí aminokyselinové sekvence uvedené na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 2), kde nukleotidová sekvence je operativně spojena s sekvencí řídící transkripci funkční v hostitelské buňce.

Vynález dále zahrnuje konstrukci nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje funkční, aktivní A12-desaturázu, která má aminokyselinovou sekvencí, která odpovídá nebo je komplementární s celou nebo s částí aminokyselinové sekvence uvedené na obrázku č. 5A až D (SEQ ID NO: 4), kde nukleotidová sekvence je operativně spojena s sekvencí řídící transkripci funkční v hostitelské buňce. Hostitelská buňka je buď eukaryont nebo prokaryont. Preferované eukaryontní hostitelské buňky jsou ty, které se vybraly ze skupiny zahrnující savčí buňku, hmyzí buňku, buňku hub a buňku řas. Preferované savčí buňky zahrnují ptačí buňku, preferovanou buňkou hub je kvasinka a preferovaná buňka řas je buňka mořských řas. Preferované prokaryontní buňky zahrnují ty vybrané ze skupiny, která obsahuje bakterie, cyanobakteríe, buňky které obsahují bakteriofága a/nebo virus. Sekvence DNA rekombinantní hostitelské buňky přednostně obsahuje promotor, který je funkční v hostitelské buňce. Uvedený promotor je indukovatelný. Ve více preferovaném provedení vynálezu je mikrobiální buňkou buňka kvasinek, jako je buňka Saccharomyces.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje rekombinantní hostitelská buňka, která obsahuje alespoň jednu kopii nukleové kyseliny, která kóduje funkčně aktivní desaturázu mastné kyseliny Mortierella alpína vykazující • · · aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 3A až E (SEQ ID NO: 2), kde buňka nebo její rodičovská buňka se transformoval vektorem obsahující uvedenou sekvenci DNA a kde sekvence DNA je operativně spojena se sekvencí řídící expresi.

V preferovaném provedení vynálezu je buňkou mikrobiální buňka obohacena 18:2 mastnými kyselinami, zvláště pak mikrobiální buňka z rodu vybraného ze skupiny obsahující prokaryontní a eukaryontní buňku. V jiném provedení vynálezu mikrobiální buňka podle vynálezu zahrnuje sekvenci řídící expresi, která je pro mikrobiální buňku endogenní.

Vynález také zahrnuje způsob produkce kyseliny GLA v kultuře mikrobiálních buněk, kde způsob zahrnuje kultivaci hostitelských buněk, přičemž kultura zahrnuje velké množství buněk, které obsahují jednu nebo více nukleových kyselin kódujících polypeptid, jenž mění LA na GLA, kde jedna nebo více nukleových kyselin je operativně spojeno se sekvencí řídící expresi za podmínek, kdy se exprímuje uvedená jedna kyselin, přičemž GLA

V několika dalších provedeních vynálezu se používá polypeptid, který je funkčně aktivním enzymem, jenž desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze šestého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny; jedna nebo více nukleových kyselin se získalo z Mortíerelle alpina a substrát uvedeného polypeptidů se dodává exogenním způsobem. Hostitelské buňky jsou mikrobiální buňky. Mikrobiálními buňkami jsou buňky kvasinek, jako jsou buňky Sacharomyces. Kultivační podmínky jsou indukovatelné.

Vynález také zahrnuje olej obsahující jednu nebo více PUFA. Množství uvedeného jednoho nebo více PUFA je přibližně 0,3 až 30 % arachidonové kyseliny (ARA), přibližně 0,2 až 30 % dihomo-y-linolenové kyseliny (DGLA) a přibližně 0,2 až 30 % kyseliny γ-linolenové (GLA). Preferovaným olejem podle vynálezu je ten, kde poměr ARA:DGLA:GLA je přibližně 1,0:19,0:30 až 6,0:1,0:0,2. Jiným preferovaným provedením podle vynálezu je nebo více nukleových v hostitelské buňce.

se produkuje preferovaných farmaceutická kompozice obsahující oleje ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Dále se popisuje nutriční kompozice obsahující oleje podle vynálezu. Nutriční kompozice podle vynálezu se přednostně aplikují savčímu hostiteli parenterálně nebo vnitřně. Preferovanou kompozicí podle vynálezu je kojenecká výživa. V preferovaném provedení vynálezu je kojenecká výživa ve formě roztoku nebo v pevné formě. Tato výživa se vyskytuje jako potravinový doplněk a olej je ve formě kapsulí. Olej podle vynálezu nemusí obsahovat žádné určité komponenty jiných olejů získaných mikrobiální buňky, jako je kvasinková buňka.

Vynález dále také zahrnuje způsob desaturace mastné kyseliny. Preferované provedení způsobu zahrnuje kultivaci rekombinantní mikrobiální buňky podle vynálezu za podmínek vhodných pro expresi polypeptidů kódovaného uvedenou nukleovou kyselinou, kde hostitelská buňka dále obsahuje substrát mastné kyseliny vhodný pro polypeptid. V preferovaném provedení vynálezu mastné kyseliny desaturované způsoby podle vynálezu a zahrnují olej obsahující mastnou kyselinu produkovanou podle vynálezu.

Vynález dále zahrnuje peptidovou sekvenci, která čištěnou nukleotidovou je v podstatě příbuzná nebo nebo homologní s nukleotidovou peptidovou sekvencí přítomnou v SEQ ID NO: 1 až 40. Vynález dále popisuje způsoby použití sekvencí přítomných v SEQ ID NO:1 až 40, jako sondy pro identifikaci příbuzných sekvencí, jako komponenty expresívních systémů a jako komponenty systémů použitelných pro produkci transgenního oleje.

Vynález dále popisuje výživu, potravinové doplňky nebo potravinové náhražky ve formě roztoku nebo v pevné formě, které obsahují mastné kyseliny s dlouhým řetězcem podle vynálezu. Tyto výživy se mohou aplikovat člověku nebo zvířeti.

Výživy nebo doplňky podle vynálezu mohou dále obsahovat alespoň jeden makronutrient vybraný ze skupiny obsahující olej • · mono- a laktózu, elektrodialyzované mléko kokosového ořechu, sojový olej, olej kanoly, diglyceridy, glukózu, poživatelnou elektrodíalyzovanou syrovátku, s nízkým obsahem tuku, mléčnou syrovátku, sojový protein a jiné proteinové hydrolyzáty.

Výživy podle vynálezu mohou dále zahrnovat alespoň jeden vitamin vybraný ze skupiny zahrnující vitamin Ά, C, D, E a B komplex a alespoň jeden minerál vybraný ze skupiny obsahující vápník, hořčík, zinek, mangan, sodík, draslík, fosfor, měď, chlorid, jód, selen a železo.

Vynález dále popisuje způsob léčby pacienta, který trpí nedostatečným příjmem nebo produkcí poly-nenasycených mastných kyselin zahrnující aplikaci potravinové náhrady pacientovi podle vynálezu v množství, které je dostatečné pro léčbu pacienta.

Vynález dále popisuje kosmetické a farmaceutické kompozice materiálů podle vynálezu.

Vynález dále zahrnuje transgenní oleje na farmaceuticky přijatelných nosičích. Vynález se dále popisuje nutriční doplňky, kosmetická činidla a kojenecké výživy obsahující transgenní oleje.

Vynález dále zahrnuje způsob získání změněné biosyntézy polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem, která zahrnuje: kultivaci mikroba, který má buňky obsahující transgen, jenž kóduje produkt exprimovaný transgenem. Tento produkt desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze uhlíku 6 nebo 12 od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny, kde transgen je operativně spojen se sekvencí řídící expresi, přičemž se v buňkách změní biosyntéza polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem.

Vynález dále popisuje farmaceutické kompozice obsahující alespoň jeden nutrient vybraný ze skupiny zahrnující vitamin, minerál, sacharidy, cukr, aminokyselinu, volnou mastnou kyselinu, fosfolípid, antioxidant a fenolovou sloučeninu.

Definice :

A5-desaturáza: A5-desaturáza je enzym, který zavádí dvojnou vazbu mezi pátý a šestý uhlík od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

Δδ-desaturáza: Δ6 desaturáza je enzym, který zavádí dvojnou vazbu mezi šestý a sedmý uhlík od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

A9-desaturáza: Δ9 desaturáza je enzym, který zavádí dvojnou vazbu mezi devátý a desátý uhlík od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

A12-desaturáza: Δ12 desaturáza je enzym, který zavádí dvojnou vazbu mezi 12 a 13 uhlík od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

Mastné kyseliny: Mastné kyseliny je třída látek obsahující dlouhý uhlovodíkový řetězec a terminální karboxylovou skupinu. Mastné kyseliny zahrnují:

Mastné kyseliny
12:0	Kys. laurová
16:0	Kys. palmitová
16:1	Kys. palmitolejová
18 : 0	Kys. stearová
18 : 1	Kys. olejová	Δ9-18:1
18:2 Δ5,9	Kys. taxolejová	Δ5,9-18:2
18:2 Δ6,9	Kys. 6,9- oktadekadienová	Δ6,9-18:2
18:2	Kys. linolová	Δ9,12-18:2 (LA)
18:3 Δ6, 9, 12	Kys. gama-linolová	Δ6, 9, 12-18:3 (GLA)
18:3 Δ5,9,12	Kys. pinolenová	Δ5,9,12-18:3
18:3	Kys. alfa-linolenová	Δ9, 12,15-18:3 (ALA)
18 : 4	Kys. stearidonová	Δ6,9,12,15-18:4

• ·

		(SDA)
20:0	Kys. arachidonová
20 : 1	Kys. ikoscenová
22 : 0	Kys. behehová
22:1	Kys. eruková
22 : 2	Kys. dokasadienová
20:4 ω6	Kys. arachidonová	Δ5,8,11,14-20:4(ARA)
20:3 ω6	co6-ikosatrienová dihomo-gama- linolenová	Δ8,11,14-20:3(DGLA)
20:5 ω5	Ikosapentanová (timnodonová)	Δ5,8,11,14,17- 20:5(EPA)
20:3 ω3	o>3-ikosatrienová	Δ11,16,17-20:3
20:4 ω3	co3-ikosatetraenová	Δ7,10,13,16,19-22:5 (cú3DPA)
22:5 ω3	Dokosapentanová	Δ7, 10,13,16,19-22:5 (o3DPA)
22:6 ω3	Dokasahexanová (cervoníc acid)	Δ4,7,10,13,16,19- 22:6(DHA)
24 : 0	Lignocerová kys.

Vzhledem k těmto definicím vynález popisuje nové sekvence DNA, konstrukce DNA, metody a kompozice, které umožňují modifikace poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem například v mikrobiálních buňkách nebo ve zvířatech. Hostitelské buňky se manipulují za účelem exprese sense a antisense transkriptu DNA, která kóduje polypeptid(y), jenž katalyzují desaturaci mastné kyseliny. Substrát(y) exprimovaných enzymů se mohou produkovat v hostitelské buňce nebo se mohou dodávat exogenně. Aby se dosáhlo exprese, transformovaná DNA je operativně spojena s počátečním místem transkripce a translace a s terminačními regulačními oblastmi, které jsou v hostitelské buňce funkční. Konstrukce obsahující • · exprimovaný gen se mohou začlenit do genomu hostitelské buňky nebo se mohou v hostitelské buňce samostatně replikovat. V případě produkce kyseliny linolenové (LA) obecně používané expresivní kazety zahrnují kazetu, která poskytuje aktivitu Á12-desaturázy, zvláště v hostitelské buňce, které produkuje nebo může pohlcovat kyselinu olejovou (US patent č. 5,443,974). Produkce LA se může také zvýšit tím, že se připraví expresivní kazeta pro Á9-desaturázu, kde je limitující enzymatická aktivita. V případě produkce ALA obecně užívané expresivní kazety zahrnují kazetu, která vykazuje aktivitu Δ15 nebo ©3-desaturázy, zvláště v hostitelské buňce, která produkuje nebo může pohlcovat LA. V případě produkce GLA nebo SDA obecně používané expresivní kazety zahrnují kazetu, která vykazuje aktivitu Δδ-desaturázy, zvláště v hostitelské buňce, jenž produkuje nebo může pohltit LA nebo ALA.

Produkce poly-nenasycené mastné kyseliny typu ©6, jako je LA nebo GLA, se upřednostňuje v hostitelském mikroorganizmu nebo ve zvířeti, které není schopno produkovat ALA.

Hostitel vhodný pro produkci ALA se může odstranit, redukovat nebo získat inhibicí aktivity desaturázy typu Δ15 nebo ω3 (obrázek č. 2). Toho lze dosáhnout standardním výběrem.

Endogenní aktivita desaturázy se může ovlivnit přípravou expresivní kazety pro přípravou expresivní kazety antisense Δ15 nebo ©3 transkriptu, porušením cílového genu Δ15- nebo ©3desaturázy prostřednictvím inzerce, substituce, delece celé nebo části cílového genu nebo přidáním inhibitoru Δ15- nebo ©3-desaturázy. Podobně produkce LA nebo ALA je zvýhodněna v mikroorganizmu nebo ve zvířeti, které vykazuje aktivity Δ6desaturázy tím, že poskytuje expresivní kazetu nesmyslného Δ6 transkriptu tím, že se poruší gen Δδ-desaturázy nebo použitím inhibitoru Δβ-desaturázy.

• · · * • · ·

Mikrobiální produkce mastných kyselin

Mikrobiální produkce mastných kyselin má několik výhod oproti izolaci z přirozených zdrojů, jako jsou ryby nebo rostliny. Je známo, že řada mikrobů obsahuje velmi zjednodušené olejové kompozice ve srovnání s kompozicemi, které obsahují vyšší organizmy, čímž se zjednoduší čištění požadovaných komponentů. Mikrobiální produkce není předmětem fluktuací způsobených externími proměnnými, jako je počasí a dodávka potravin. Mikrobiálně produkovaný olej je v podstatě bez kontaminace látek znečišťujících prostředí. Navíc mikroby poskytují PUFA v určitých formách, které mohou mít specifické použití. Spirulina například může poskytovat PUFA převážně v první a třetí pozici triglyceridů. Z těchto poloh se s výhodou při štěpení pankreatickými lipázami uvolňují mastné kyseliny. Po požití triglyceridů získaných od Spirulina u lidí a zvířat jsou tyto PUFA uvolněny pankreatickými lipázami, jako volné mastné kyseliny a tak jsou přímo dostupné například pro vývoj mozku kojence. Navíc produkce mikrobiálního oleje se může manipulovat řízením podmínek kultivace, zvláště přípravou určitých substrátů pro mikrobiálně exprímované enzymy nebo přidáním látek, které potlačují požadované dráhy biosyntézy. Vedle těchto výhod produkce mastných kyselin z rekombinantních mikrobů poskytuje možnost změnit přirozeně se vyskytující profil mikrobiálních mastných kyselin tím, že poskytují v hostiteli novou syntetickou dráhu nebo potlačují nežádoucí průběhy, přičemž zvyšují množství požadovaného PUFA nebo jejich konjugovaných forem a potlačují množství nežádoucích PUFA.

Produkce mastných kyselin u zvířat

Produkce mastných kyselin u zvířat má také několik výhod.

Exprese genů desaturázy ve zvířatech může ve tkáni zvířat produkovat značně zvýšené množství požadovaných PUFA, což činí

Ií jejich izolaci z těchto tkání ekonomickou. Jestliže se například PUFA exprimují do mléka zvířat, metody izolace PUFA z mléka jsou dobře zavedeny. Vedle možnosti získání zdroje pro čištění požadovaných PUFA, zvířecí mléko se může manipulovat prostřednictvím exprese genů desaturázy, buď samotné nebo v kombinaci s jinými lidskými geny za vzniku zvířecího mléka z obsahem PUFA, které v podstatě odpovídá lidskému mléku během různých stádií vývoje kojence. Zvířecí mléko upravené pro požití člověkem může sloužit jako kojenecká výživa v případech, kde není možné kojení nebo kojení není žádoucí nebo v případě podvýživy nebo onemocnění.

V závislosti na hostitelské buňce, na dostupnosti substrátu a požadovaném konečném produktu(ech) se jeví velký zájem o několik polypeptidu, zvláště pak desaturáz. Termín „desaturáza znamená polypeptid, který může desaturovat jednu nebo více mastných kyselin za účelem produkce mono- nebo polynenasycené mastné kyseliny nebo jejího prekurzoru. Zvláštní zájem se jeví o polypeptidy, které mohou katalyzovat přeměnu kyseliny stearové na kyselinu olejovou, kyseliny olejové na LA, LA na ALA, LA na GLA nebo ALA na SDA. Jsou to enzymy, které desaturují v polohách Δ9, Δ12, (ω6) , Δ15, (ω3) nebo Δ6. Termín „polypeptid znamená libovolný řetězec aminokyselin bez ohledu na délku nebo post-translační úpravy například glykosylaci nebo fosforylaci. Jestliže se vybírá specifický polypeptid vykazující desaturační aktivitu, je nutné zvažovat optimální pH polypeptidu, zda polypeptid je enzym omezený rychlostí nebo jeho komponent, zda používaná desaturáza je podstatná pro syntézu požadovaných mastných kyselin a/nebo jestli polypeptidy vyžadují ko-faktory. Exprimovaný polypeptid má přednostně parametry kompatibilní s biochemickým prostředím jeho polohy v hostitelské buňce. Polypeptid například může v hostitelské buňce soutěžit o substrát s jinými enzymy. Analyzuje se K_m a specifická aktivita polypeptidu, za účelem zjištění, zda tyto hodnoty jsou určujícím kritériem vhodnosti • * daného polypeptidů při modifikaci produkce PUFA v dané hostitelské buňce. Polypeptid používaný v určité situaci je ten, který je za daných podmínek funkční v hostitelské buňce, ale v jiném případě to může být polypeptid vykazující aktivitu desaturázy, který je schopný modifikovat relativní produkci požadovaných PUFA.

V případě produkce kyseliny linolenové sekvence DNA kóduje polypeptid, který vykazuje aktivitu A12-desaturázy.

V případech produkce GLA z kyseliny linolenové uvedená sekvence DNA kóduje polypeptid s aktivitou A6-desaturázy.

V určitých případech exprese aktivity A6-desaturázy se může spojit s expresí aktivity A12-desaturázy a z hostitelské buňky lze odstranit aktivitu A15-desaturázy například tím, že se připraví transkripční kazeta pro produkci antisense sekvencí pro transkripční produkt A15-desaturázy tím, že se poškodí gen A15-desaturázy nebo použitím hostitelské buňky, která přirozeně vykazuje nízkou aktivitu A15-desaturázy nebo se za tímto účelem mutovala. Inhibice požadovaných desaturačních drah se může také dosáhnout použitím specifických inhibitorů desaturázy, jak se popisuje v publikaci US patent 4,778,630. Také hostitelská buňka pro expresi Al2-desaturázy může vykazovat vysokou aktivitu A12-desaturázy nebo se může za tímto účelem mutovat. Volba kombinace používaných kazet může záviset částečně na profilu PUFA a/nebo profilu desaturáz v hostitelské buňce. V případě, že hostitelská buňka exprimuje aktivitu A12-desaturázy a chybí ji nebo se odstranila aktivita A15-desaturázy, pak nadměrná exprese samotné A6-desaturázy je v obecném případě dostatečná, aby se produkovala zvýšená produkce GLA. V případě, že aktivitu A9-desaturázy, pak desaturázy a A6-desaturázy může produkovat zvýšenou produkci GLA.

hostitelská buňka exprimuje exprese A12-desaturázyA1220

V případě, že buňka nevykazuje aktivitu A9-desaturázy nebo tato aktivita je limitující, může se použít expresivní kazeta Á9-desaturázy. Na obrázku č. 2 je zobrazeno schéma syntézy kyseliny arachidonové (20:4 Δ⁵'⁸'¹¹'¹⁴) _z py_Se]_p_ny stearové (18:0) . Klíčový enzym v této dráze je Δβ-desaturáza, která přeměňuje kyselinu linolenovou na kyselinu γ-linolenovou Dále se zde ukazuje přeměna kyseliny α-linolenové (ALA) na kyselinu stearidonovou pomocí Δβ-desaturázy.

Zdroje polypeptidů vykazující desaturační aktivitu

Zdroje polypeptidů vykazující desaturační aktivitu a oligonukleotidů kódujících takové polypeptidy jsou organizmy, které produkují požadovanou poly-nenasycenou mastnou kyselinu. Příklady mikroorganizmů, které máji schopnost produkovat GLA nebo ARA se mohou použit jako zdroje aktivity Δ6- nebo Δ12desaturázy. Takové mikroorganizmy například zahrnují ty organizmy patřící k rodu Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophathora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula a Entomophthora. V rodu Porphyridium je zajímavé Porphyridium cruentum. V rodu Mortierella zvláštní zájem budí Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella ramanniana, var. angulispora a Mortierella alpina. V rodu Mucor zvláštní zájem budí Mucor circinelloídes a Mucor j avanicus.

DNA kódující požadované desaturázy se mohou identifikovat různým způsobem. Zdroj požadované desaturázy, například knihovna genomové DNA nebo cDNA z Mortierella se mohou testovat detekovatelnými enzymaticky nebo chemicky syntetizovanými sondami, které se mohou připravit z DNA, RNA nebo z nukleotidů, které se přirozeně nevyskytují, nebo ze směsi uvedených látek. Sondy se mohu syntetizovat enzymaticky z DNA známých desaturáz a jsou vhodné pro metody hybridizace fr * • · fr » fr · · • · · « · « za normální nebo snížené přísnosti. Oligonukleotidové sondy se mohou také použít jako zdroje testování a mohou se zakládat na sekvencích známých desaturáz zahrnujících sekvence, které jsou mezi známými desaturázami konzervativní, nebo na sekvencích peptidů získaných z požadovaného čištěného

Oligonukleotidové sondy založené proteinu. aminokyselinových na sekvencích se mohou degenerovat, aby se zdůraznila degenerace genetického kódu nebo se mohou přeskupit ve prospěch preferovaných kodonů zdrojového organizmu. Oligonukleotidy se mohou použít jako primery pro PCR z reverzně přepisované rnRNA ze známého nebo pochybného zdroje. Produkt PCR může mít celou délku cDNA nebo se může použít za vzniku sondy, která slouží pro získání cDNA v celé délce. V jiném případě požadovaný protein se může celý sekvenovat a uskuteční se celková syntéza DNA kódující uvedený polypeptid.

Jestliže je to nutné, izoluje se genomová DNA nebo cDNA, kterou je možné sekvenovat známými metodami. V oboru je známo, že takové metody sekvenování jsou chybné. Proto se stalo rutinou vícenásobné sekvenování jedné oblasti a stále je nutné počítat s měřitelnou četností chyb ve výsledné dedukované sekvenci, zvláště pak v oblastech, které vykazují repetice, extenzivní sekundární strukturu nebo neobvyklé složení baží, jako jsou oblasti s vysokým obsahem GC. Když vzniknou rozpory, může se provést opětné sekvenování a mohou se použít speciální metody. Uvedené speciální metody mohu zahrnovat změnu podmínek sekvenování za použití: různých teplot, různých enzymů, proteinů, které mění schopnost oligonukleotidů tvořit struktury vyššího řádu, změněných nukleotidů, jako je ITP nebo metylovaný dGTP, různého složení gelu například přidání formamidu, různých primerů nebo primerů lokalizovaných v různé vzdálenosti od problematické oblasti nebo různých templátů, jako jsou jednořetězcové DNA. Může se také použít sekvenování rnRNA.

4 4 4 44« »»·

Ve většině případů některé nebo všechny kódující sekvence polypeptidu vykazující desaturační aktivitu pocházejí z přirozeného zdroje. V některých situacích je nutné modifikovat celý nebo část kodonů například zesílit expresi použitím kodonů preferované kodony preferovaných hostitelem. Hostitelem se mohou stanovit z kodonů, které se vyskytují nejcastěji v proteinech, jenž se exprimují v určitém druhu hostitele v největším množství. Kódující sekvence polypeptidu vykazující desaturační aktivitu se může syntetizovat celá nebo její část. Celá DNA nebo její části se mohou také syntetizovat tak, aby se odstranily libovolné destabilizující sekvence nebo oblasti sekundární struktury, které se budou vyskytovat v přepsané mRNA. Celá nebo části DNA se mohou také syntetizovat za účelem změny složení baží na ty, které preferuje požadovaná buňka hostitele. Způsoby syntézy sekvencí a spojení sekvencí se uvádějí v literatuře. Za účelem získání mutací přirozeně se vyskytujících genů desaturázy, aby došlo k produkci polypeptidu, který vykazuje desaturační aktivitu in vivo s fyzikálními a kinetickými parametry, jenž více vyhovují funkci hostitelské buňky, se může použít mutageneze in vitro a selekce, místně řízená mutageneze nebo pak vykazuje delší poločas rozpadu

Buňka jiné způsoby, požadovaných polynensaycených mastných kyselin vyssi rychlost produkce.

Desaturáza organizmu Mortierella alpina

Ve středu zájmu je Δδ-desaturáza organizmu Mortierella alpina, která má 457 aminokyselin její předpokládaná molekulová hmotnost je 51 800. Aminokyselinová sekvence je zobrazena na obrázku č. 3. Gen kódující A6-desaturázu organizmu Mortierella alpína se může exprimovat v transgenních mikroorganizmech nebo ve zvířatech tak, že se docílí silnější syntézy GLA z kyseliny linolenové a kyseliny staearídonové z ALA. Mohou se také použít jiné DNA, které jsou v podstatě • · identické s DNA Δβ-desaturázy organzimu Mortierella alpina nebo které kódují polypeptidy, jenž jsou v podstatě shodné s polypeptidem Δβ-desaturáza organizmu Mortierella alpína. Termín „v podstatě shodné znamená aminokyselinovou sekvenci nebo sekvenci nukleové kyseliny vykazující za účelem zvýšené preference alespoň 60 %, 80 %, 90 % nebo 95 % homologii s aminokyselinovou sekvencí Δβ-desaturázy organizmu Mortierella alpína nebo se sekvencí nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci. V případě polypeptidů je délka porovnávaných sekvencí obecně alespoň 16 aminokyselin, upřednostňuje se alespoň 20 aminokyselin, více se upřednostňuje 35 aminokyselin. V případě nukleových kyselin délka porovnávaných sekvencí je obecně alespoň 50 nukleotidů, upřednostňuje se alespoň 60 nukleotidů a více se upřednostňuje alespoň 75 nukleotidů a nejvíce se upřednostňuje 110 nukleotidů. V typickém případě se homologie měří za použití softwaru pro sekvenční analýzu, jako je například Sequence Analysis software od Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, lne., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715) a MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S.Bascom Avenue, Suitě 200, Campbell, California 95008). Takový software páruje podobné sekvence, čímž přiřazuje různé stupně homologie různým substitucím, delecím a jiným modifikacím. Konzervativní substituce typicky zahrnují substituce v následující skupinách: glycin a alanin; valin, izoleucin a leucin; kyselina aspartová, kyselina glutamová, asparagin a glutamin; serin a threonin; lyzin a arginin; fenylalanin a tyrozin. Substituce se mohou také provést na základě konzervativní hydrofobicity nebo hydrofility (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982) nebo na základě schopnosti předpovídat podobnou sekundární strukturu polypeptidu (Chou and Fasman, Adv. Enzymol. 47:45-148,1978).

• ·

Další desaturázy

Vynález popisuje příbuzné desaturázy pocházející ze stejného nebo jiného organizmu. Takové příbuzné desaturázy zahrnují varianty popsané Δ6- nebo A12-desaturázy vyskytující se ve stejném nebo odlišném specie Mortierella stejně jako homology popsané Δ6- nebo A12-desaturázy z jiných specie. Vynález dále popisuje desaturázy, které, ačkoli nejsou v podstatě shodné s Δβ-nebo Á12-desaturázou Mortierella alpina, desaturují molekulu mastné kyseliny v poloze 6 a 12 uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny. Příbuzné desaturázy se mohou identifikovat na základě své schopnosti fungovat stejným způsobem jako popsané desaturázy, které jsou stále schopny účinně přeměnit LA na GLA, ALA na SDA a olejovou kyselinu na LA. Příbuzné desaturázy se mohu také identifikovat na základě prohledávání sekvenční databáze. Pomocí hybridizace se sondou odvozenou z popsané desaturázy s knihovnou zkonstruovanou ze zdrojového organizmu nebo pomocí RT-PCR z mRNA ze zdrojového organizmu a primerů založených na popsané desaturáze, se hledají sekvence homologní s popsanou desaturázou. Takové desaturázy zahrnují lidské desaturázy, Dictyostelium discoideum a Phaeodactylum tricornum.

Oblasti polypeptidu desaturázy, které jsou důležité pro desaturační aktivitu, se mohou stanovit rutinní mutagenezí, expresí výsledných mutantních polypeptidů a stanovením jejich aktivit. Mutanti mohou zahrnovat delece, inzerce a bodové mutace nebo jejich kombinace. Typická funkční analýza začíná deleční mutagenezí za účelem stanovení N- a C-terminálních omezení proteinu nezbytných pro funkci proteinu. Pak se provedou vnitřní delece, inzerce nebo bodové mutace za účelem stanovení oblastí nezbytných pro funkce uvedeného proteinu. Dále se mohou použít jiné metody, jako je kazetová mutageneze nebo celková syntéza. Deleční mutageneze se provede například použitím exonukleáz, přičemž se postupně odstraní kódující • · • · • · <· · · • · • · · oblasti 5' a 3' konců. Pro provedení takových postupů jsou dostupné kity. Po deleci je kódující oblast doplněna ligací oligonukleotidů obsahujících počáteční a terminační kodon. V jiném případě se oligonukleotidy kódující počáteční a konečný kodon začlení do kódující oblasti za použití různých metod zahrnující místně řízenou mutagenezi, mutagenní PCR nebo ligaci k DNA, která je štěpena v existujících restrikčních místech. Vnitřní delece se mohou podobně vytvořit řadou metod, které zahrnují použití existujících restrikčních míst v DNA, použití mutagenních primerů prostřednictvím místně řízené mutageneze nebo mutagenní PCR nebo ligací do DNA štěpené v existujích restrikčních místech. Vnitřní delece se mohou podobně provádět pomocí různých metod zahrnující použití existujících restrikčních míst v DNA použitím mutagenních primerů prostřednictvím místně řízené mutageneze nebo mutagenním PCR. Začlenění se provádí za použití metod, jako je linkrem vyhledávaná mutageneze, místně řízená mutageneze nebo mutagenní PCR. Bodové mutace se provádějí způsoby, jako je místně řízená mutageneze nebo mutagenní PCR.

Chemická mutageneze se může také používat při identifikaci oblastí polypeptidů desaturázy, které jsou důležité v případě aktivity. Mutovaná konstrukce se exprimuje a testuje se schopnost pozměněného proteinu fungovat jako desaturáza. Taková analýza struktury-funkce může stanovit, které oblasti se mohou deletovat, v kterých oblastech se toleruje inzerce a které bodové mutace dávají vzniku mutantnímu proteinu, který funguje v podstatě stejným způsobem jako přirozená desaturáza. Vynález popisuje všechny takové mutantní proteiny a nukleotidové sekvence kódující tyto proteiny.

Exprese genů desa.turázy

Po té, co se získala DNA kódující polypeptid desaturázy, umístí se do vektoru schopného se replikovat v hostitelské buňce nebo se pomnožit in vitro způsobem, jako je PCR nebo • · · dlouhé PCR. Replikační vektory mohou zahrnovat plazmidy, fágy, viry, kozmidy a podobně. Požadované vektory zahrnují vektory použitelné při mutagenezi genu nebo při expresi genu v hostitelských buňkách. Metoda dlouhého PCR provádí in vitro propagaci velké konstrukce tak, že pozmění gen, aby došlo k mutagenezi nebo k přidání expresívních signálů. Může tak dojít k propagaci výsledných konstrukcí in vitro, aniž se použije replikační vektor nebo hostitelská buňka.

Za účelem exprese polypeptidů desaturázy, funkční transkripční a translační iniciační a terminační oblasti jsou operativně spojeny s DNA kódující polypeptid desaturázy. Exprese oblasti kódující polypeptid může probíhat in vitro nebo v hostitelské buňce. Iniciační a terminační oblasti transkripce a translace se odvodily z různých zdrojů, které zahrnují exprimovanou DNA, geny, o kterých se ví nebo se předpokládá, že se budou v požadovaném systému exprimovat, expresívní vektory, chemickou syntézu nebo endogenní lokus v hostitelské buňce.

Exprese in vitro

Expresi in vitro lze provést například umístěním oblasti kódující polypeptid desaturázy do expresívního vektoru určeného pro použití in vitro a přidáním králičího lyzátu retikulocytů a kofaktorů. Je-li to nutné mohou se začlenit také značené aminokyseliny. Takové in vitro expresívní vektory mohou poskytovat některé nebo všechny expresívní signály nezbytné pro používaný systém. Tyto metody jsou dobře známy v oboru a komponenty systému jsou běžně dostupné. V reakční směsi se může přímo testovat přítomnost polypeptidů například stanovením jeho aktivity nebo syntetizovaný polypeptid se může čistit a pak testovat.

Exprese v hostitelské buňce • ·

Exprese v hostitelské buňce může být dočasná nebo stabilní. K dočasně expresi dochází zavedením konstrukcí, které obsahují expresívní signály funkční v hostitelské buňce, ale uvedené konstrukce se nereplikují a řídce se v hostitelské buňce začleňují, nebo se hostitelská buňka nemnozí. Dočasné exprese lze také dosáhnout vyvoláním aktivity regulovatelného promotoru, který je operativně spojen s genem. Takové indukovatelné systémy často vykazují slabou expresi. Stabilní exprese se může dosáhnout zavedením konstrukce, která se může začlenit do hostitelského genomu nebo se může samostatně replikovat v hostitelské buňce. Stabilní exprese genu se může vybrat použitím selekčního markéru, který se nachází v expresívní ' konstrukci nebo se transfekuje společně s expresívní konstrukcí. Pak následuje selekce buněk exprimující markér. Stabilní exprese je výsledkem začlenění konstrukce. K integraci konstrukcí může dojít v hostitelském genomu náhodně nebo se může cílit prostřednictvím použití konstrukcí obsahujících oblasti homologie s hostitelským genomem, což je dostatečné pro rekombinaci s hostitelským lokusem. Jestliže jsou konstrukce cíleny do endogenního lokusu, pak endogenní lokus může poskytnout všechny nebo některé oblasti regulující transkripci nebo translací.

Jestliže je nutné zesílení exprese polypeptidu desaturázy ve zdrojovém organizmu, může se použít několik metod. Do hostitelského organizmu se mohou zavést další geny kódující polypeptid desaturázy. Exprese z lokusu přirozené desaturázy se může také zesílit homologní rekombinaci, například začleněním silnějšího promotoru do hostitelského genomu, odstraněním destabilizačních sekvencí buď z mRNA nebo z kódovaného proteinu delecí uvedené informace z hostitelského genomu nebo přidáním stabilizačních sekvencí k mRNA (USPN 4,910,141).

Jestliže je nutné exprimovat více než jeden odlišný gen pak zavedené geny je možné pomnožit v hostitelské buňce za

• · · · · • · ··· ··· • · • · ♦ · * · použití replikačních vektorů nebo začleněním do hostitelského genomu. Jestliže se z odděleného replikačního vektoru exprimují dva nebo více genů, je nutné, aby každý vektor vykazoval odlišný způsob replikace. Každá zavedená konstrukce, ať už se začleňuje nebo ne, by měla mít odlišný způsob selekce a neměla by být homologní s jinými konstrukcemi, což je podmínkou stabilní exprese a předchází se tak znovu uspořádání elementů mezi konstrukcemi. Správná volba regulačních oblastí, způsoby selekce a metoda propagace zavedené konstrukce se mohou stanovit experimentálně tak, že všechny zavedené geny se mohou exprimovat v síle, která je nutná pro syntézu požadovaných produktů.

V případě, že hostitelská buňka je kvasinka, pak poskytuje také transkripční a translační oblasti. Regulační oblasti iniciace transkripce se mohou získat z genů účastnících se glykolytické dráhy, jako je dehydrogenáza alkoholu, glycerylaldehyd-3-fosfátová dehydrogenáza (GPD), fosfogukoízomeráza, fosfoglyceratová kináza atd. nebo z regulovatelných genů, jako je kyselá fosfatáza, laktáza, metalothionin, glukamyláza atd.. V určité situaci, v závislosti na skutečnosti, zda je nutná konstitutivní nebo indukovaná transkripce, v závislosti na účinnosti promotoru ve spojení s otevřeným čtecím rámcem, na schopnosti spojit silný promotor s řídící oblastí z odlišného promotoru, který umožňuje indukovatelnou transkripci, na jednoduchosti konstrukce a podobně, je možné použít libovolnou z regulačních sekvencí. Velký zájem se soustřeďuje na promotory, které se aktivují v přítomnosti galaktózy. Promotory indukovatelné galaktózou (GAL1, GAL7 a GAL10) se mohu používat pro silnou a regulovanou expresi proteinu v kvasinkách (Lue et al., Mol. Cell. Biol. Vol. 7, P. 3446, 1987); Johnston, Microbiol. Rev. Vol. 51, p. 458, 1987). Transkripce z promotorů GAL se aktivuje proteinem GAL4, který se váže na promotorovou oblast a aktivuje transkripci v případě, že je přítomna galaktóza.

< ·

	29	• * · » 9 · · • · · • · · • « ·	« · · · · < · • · · · » · · · • « · · · • · · · ······ • · · «
Při absenci galaktózy	anatagonista	GAL80 se	váže na GAL 4 a
brání GAL4 aktivovat	transkripci .	Přidání	galaktózy brání
GAL80 inhibovat aktivaci pomocí GAL4

Zjistilo se, že nukleotidové sekvence obklopující iniciační kodon translace ATG působí expresi v kvasinkových buňkách. Jestliže je to nutné, polypeptid je v kvasinkách exprimován velmi slabě. Nukleotidové sekvence exogenních genů se mohou modifikovat, aby zahrnovaly účinnou kvasinkovou sekvenci iniciující translaci, přičemž se získá optimální exprese genu. V případě exprese v Saccharomyces se může toto uskutečnit místně řízenou mutagenezí neúčinně exprimovaného genu tak, že proběhne fúze do rámce s endogenním genem Saccharomyces. Upřednostňuje se silně exprimovaný gen, jako je gen laktázy.

Terminační oblast se může získat z 3'oblasti genu, ze kterého se získala iniciační oblast nebo z odlišného genu. Je znám velký počet terminačních oblastí, které jsou použitelné v různých hostitelích stejného nebo odlišného rodu a druhu. Terminační oblast se obvykle vybrala podle toho, zda je výhodná nebo ne, spíše než na základě určité vlastnosti. Upřednostňuje se, aby se terminační oblast získala z kvasinkového genu, zvláště pak z Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida nebo Kluyveromyces. Je známo, že 3'oblasti dvou savčích genů, γ interferonu a a.2 interferonu, fungují v kvasinkách.

Zavedení konstrukcí do hostitelských buněk

Konstrukce obsahující gen se může zavést do hostitelské buňky standardním způsobem. Tyto metody zahrnují transformaci, transfekci, transdukci, zavedení, elektroporaci, libovolnou jinou metodu, fúzi protoplastů, lipofekci, konjugaci, infekci, balistické mikroinjekce, zaškrabávání nebo kterou se zavádí gen do hostitelské buňky. Používané metody transformace zahrnují transformaci acetátem litia (popisuje se • » « · · · · 1 v publikaci Methods in Enzymology, Vol. 194, P. 186-187, 1991). Je výhodné, aby manipulovaná hostitelská buňka, která pohlcuje sekvenci DNA nebo uvedenou konstrukci, se označila jako „transformovaná nebo „rekombinantní.

Hostitel bude obsahovat alespoň jednu kopii expresivní konstrukce. Může však obsahovat dvě kopie nebo více v závislosti na tom, zda gen se začleňuje do genomu, amplifikuje se nebo je přítomen na extrachromozomálním elementu, který vykazuje více kopií. Jestliže hostitelem je kvasinka, pak se mohou použít čtyři základní typy kvasinkových plazmidových integrační plazmidy (YIp), kvasinkové (YRp), kvasinkové centromérní plazmidy vektorů: kvasinkové replikační plazmidy (YCp) a kvasinkové epizomální plazmidy (YEp). YIp chybí počátek replikace kvasinek a musí se pomnožit jako integrované elementy v kvasinkovém genomu. YRp mají samostatně se replikuj ící v kvasinkách replikující sekvenci získanou z chromozómů a propagují se se středním počtem kopií (20 až 40), jako samostatně se replikující nestabilní segregační plazmidy. YCp mají počátek replikace a centromerovou sekvenci a propagují se s malým počtem kopií (10 až 20) jako samostatně se replikující stabilní segregační plazmidy. Plazmidy YEp mají počátek replikace z kvasinkového plazmidu o velikosti 2 pm a propagují se s vysokým číslem kopií, jako samostatně, nepravidelně se segregační plazmidy. Přítomnost plazmidů se může zjistit selekcí na základě značení v plazmidu. Ve středu zájmu jsou kvasinkové vektory pYES2 (plazmid YEp je dostupný u firmy Invitrogen, propůjčuje prototropíi uracilu a expresivní promotor GAL1 indukovatelný galaktózou) , PRS425-pGl (plazmid YEp je možné získat od Dr. T.H.Chang, docent molekulární genetiky, Ohio State University, tento plazmid obsahuje konstitutivní promotor GPD a propůjčuje prototropíi leucinu) a pYX424 (plazmid YEp má konstitutivní promotor TPl a propůjčuje prototropii leucinu; Alber, T. and Kawasaki, G. (1982). J. Mol. And Appl. Genetics 1: 419).

Transformovaná hostitelská buňka se může identifikovat selekcí markéru, který je obsažen v zavedené konstrukci.

V jiném případě oddělená markerová konstrukce se může zavést do hostitelské buňky dohromady s požadovanou konstrukcí.

V typickém případě se vybraly transformovaní hostitelé na základě jejich schopnosti růst na selekčním médiu. Selekční média mohou obsahovat antibiotikum a může jim chybět faktor, který je nezbytný pro růst netransformovaného hostitele. Takovým faktorem může být nutrient nebo růstový faktor. Takový zavedený gen markéru může propůjčovat rezistenci na antibiotika nebo kódovat podstatný růstový faktor nebo enzym a umožňuje růst na selekčním médiu, když se exprimuje v transformovaném hostiteli. Selekce transformovaného hostitele se může také vyskytnou v případě, že se může přímo nebo nepřímo detekovat exprimovaný markerový protein. Markerový protein se může exprimovat samotný nebo jako fúze s jiným proteinem. Markerový protein se může detekovat na základě jeho enzymatické aktivity. β-galaktozidáza může přeměnit substrát X-gal na zbarvený produkt a luciferáza může přeměnit luciferin na produkt emitující světlo. Markerový protein se může detekovat produkcí světla nebo změnou charakteristik. Zelený fluorescenční protein ňequorea victorie se ozáří modrým světlem. K detekci nebo molekulárního tag přítomného fluoreskuje, jestliže markerového proteinu například v proteinu

Buňky se mohou použít protilátky, exprimující markerový protein nebo tag se vyberou na základě vizuálního pozorování nebo způsobem, jako je FACS nebo panníng za použití protilátek. Při výběru kvasinkových transformantů se může použít libovolný markér, který je funkční v kvasinkách. Zajímavým markérem je rezistence na kanamycin a aminoglykozid G418, stejně jako schopnost růstu na médiu, které neobsahuje uráčil, leucín nebo tryptofan.

Produkce PUFA zprostředkovaná Δ6- a Δ12-desaturázou se může uskutečnit buď v prokaryontních nebo v eukaryontních buňkách hostitele. Prokaryontní buňky zahrnují Eschericia, Bacillus, Lactobacillus, cyanobakterie a podobně. Eukaryontní buňky zahrnují savčí buňky, jako jsou buňky zvířat v laktaci, ptačí buňky, jako jsou kuřecí buňky a jiné buňky odpovědné za genetickou manipulaci zahrnující buňky hmyzu, hub a řas. Buňky se mohou kultivovat nebo tvořit jako část nebo celý hostitelský organizmus zahrnující zvířata. Při produkci PUFA se také mohou spolu s buňkami, zvláště při transferu genu, buněčném cílení a selekci, použít viry a bakteriofágy. V preferovaném provedení vynálezu je hostitelem libovolný mikroorganizmus nebo zvíře, které produkuje a/nebo asimiluje exogenně podávaný substrát(y) pro Δ6- a/nebo A12-desaturázu a s výhodou produkuje velké množství jednoho nebo více substrátů. Příklady hostitelských zvířat zahrnují myši, krysy, kuřata, křepelky, krocany, hovězí, ovce, prasata, kozí, jaký atd., které jsou zodpovědné za genetickou manipulaci a klonování pro rychlý nárůst transgenní expresivní populace. U zvířat lze transgen(y) desaturázy upravit prostřednictvím modifikace regulačních oblastí genu tak, aby se exprimoval v cílových organelách, tkáních a tělních tekutinách. Velký zájem je o produkci PUFA v mléku hostujícího zvířete.

Exprese v kvasinkách

Příklady hostujících mikroorganizmů zahrnují Sacharomyces cerevísiae, Saccharomyces carlsbergensis nbeo jiné kvasinky jako Candida, Kluyveromyces nebo jiné houby například vláknité houby, jako je Aspergillus, Neurospora, Penicillium atd.. Požadované charakteristiky hostujícího mikroorganizmu jsou následující: je dobře geneticky charakterizovaný, může se použít v případě silné exprese produktu za použití fermentace s ultravysokou hustotou a je na seznamu GRAS (obecně je bezpečný), což znamená, že konečný produkt je vhodný pro aplikaci člověku. Zajímavé je také použití kvasinek jako hostujícího organizmu podle vynálezu, zvláště pak pekařských « · · • · · • · kvasinek (S. cerevisiae) . Zvláště zajímavé kmeny jsou SC334 (Mat apep4-3 prbl-1122 ura3-52 leu2-3, 112 regl-501 gall; Gene 83:57-64, 1989, Hovland P. et al. ) , YTC34 (a ade2-101 his3Á200 Llys2-801 ura3-52; získal se od Dr. T.H.Chang, docent molekulární genetiky, Ohio State University), YTC41 (a/α ura352/ura3=521ys2-80l/lys2-801 ade2-101/ade2-101 trpl-ΔΙ/trpl-ΔΙ his3A200/his3A2001eu2Al/leu2Al; získal se od Dr. T.H.Chang, docent molekulární genetiky, Ohio State University), BJ1995 (získal se z instituce Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkley, CA 94720), INVSC1 (Mat a hiw3Al leu2 trpl-289 ura3-52; získaný od firmy Invitrogen, 1600Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008) a INVSC2 (Mat a his3A200ura3-167; získal se od firmy Invitrogen).

Exprese ve specie ptáků

Při produkci PUFA v ptačích specie a v ptačích buňkách, jako jsou kuřata, krocani, křepelky a kachny, se může provést transfer genu zavedením sekvence nukleové kyseliny kódující Δ6- a/nebo A12-desaturázu do buněk postupy, které jsou známé v oboru. Jestliže je nutné transgenní zvíře, mohou se připravit pluripotentní kmenové buňky embryí s vektorem, který nese transgen kódující desaturázu a které se mohou vyvinout na dospělé zvíře (USPN 5,162,215; Ono et al. (1996) Comparative Biochemistry and Physidlogy A 113(3):287-292; WO 9612793; WO 9606160). Ve většině případů se bude transgen modifikovat za účelem exprese velkého množství desaturázy, přičemž se zvýší produkce PUFA. Transgen se může modifikovat například transkripční a/nebo translační regulační oblastí, která funguje v ptačích buňkách, jako jsou promotory, které řídí expresi v určitých tkáních a v částech vajec, jako je žloutek. Regulační oblasti genů je možné získat z různých zdrojů, jak je virus anemie kuřete nebo virus ptačí leukózy nebo ptačí geny, jako je gen kuřecího ovalbuminu.

• ·

Exprese v hmyzích buňkách

Produkce PUFA v hmyzích buňkách se může provést za použití bakulovirových expresívních vektorů nesoucích jeden nebo více transgenů desaturázy. Bakulovirové expresivní vektory jsou dostupné u několika komerčních zdrojů, jako je firma Clontech. Vynález popisuje metody produkce hybridních a transgenních kmenů řas, jako jsou mořské řasy, které obsahují a exprimují transgen desaturázy. Transgenní mořské řasy je možné připravit způsobem, který se popisuje v USPN 5,426,040. Stejně jako v jiných expresívních systémech načasování, rozsah exprese a aktivita transgenů desaturázy se může regulovat spojením sekvence kódující polypeptid s vhodnou transkripční nebo translační regulační oblastí, která se zvolila pro dané určité použití. Zvláště zajímavá je promotorové oblast , která se může indukovat za předem vybraných podmínek růstu. Pro tyto účely lze použít zavedení mutací citlivých na teplotu a/nebo mutací jako odezvy na metabolity do sekvencí kódujících transgen desaturázy, jejích regulačních oblastí a/nebo genomu buněk, do kterých se zavede transgen.

Transformovaná hostitelská buňka se kultivuje za vhodných podmínek, které se upravily, aby se dosáhlo požadovaného konečného výsledku. V případě hostitelských buněk kultivovaných v kultuře se v typickém případě optimalizují podmínky, aby došlo k produkci největšího a nejekonomičtějšího výtěžku PUFA, který se vztahuje k vybrané aktivitě desaturázy. Při kultivaci je možné optimalizovat: zdroj uhlíku, zdroj dusíku, přidání substrátu, konečná koncentrace přidaného substrátu, formu přidaného substrátu, aerobní nebo anaerobní růst, teplotu kultivace, indukční činidlo, indukční teplotu , růstovou fázi při indukci, růstovou fází pří sklizni, pH, hustotu a udržování výběru. Mikroorganizmy, které jsou středem zájmu, jako jsou kvasinky přednostně rostou na selekčním médiu. Pro kultivaci kvasinek je vhodné komplexní médium, jako

je peptonová půda (YPD) nebo definované kultivační médium, jako je minimální médium (obsahuje aminokyseliny, kvasinkovou dusíkatou bázi a síran amonný a chybí však selekční komponent, například uráčil). Substrát se před přidáním rozpustí v etanolu. Jestliže je to nezbytné, exprese poloypeptidu je možné exprimovat například přidáním galaktózy, čímž se indukuje exprese z promotoru GAL.

Exprese v rostlinách

Produkcí PUFA v rostlinách lze provést za použití různých rostlinných transformačních systémů, jako je Agrobacterium tumefaciens, rostlinné viry, transformace částic do buněk a podobně. Vše se popisuje v dokumentu US přihláška sériové číslo 08/834,033 a 08/956,985 a v pokračování uvedené přihlášky.

Exprese ve zvířatech

Exprese v buňkách hostitelského zvířete může být dočasná nebo stabilní. Dočasná exprese se může provést metodami dobře známými v oboru například infekcí nebo lipofekcí a může se opakovat, aby se udržela požadovaná síla exprese zavedené konstrukce (Ebert, WO 94/05782). Stabilní exprese lze dosáhnout začleněním konstrukce do hostitelského genomu, což vede ke vzniku transgenního zvířete. Konstrukci je možné zavést například mikroinjekcí do pro-jádra oplodněného vajíčka nebo transfekcí, retrovirovou infekcí nebo jinými způsoby, kterými lze konstrukci zavést do vytvořené buněčné linie, která se může zavést do dospělého zvířete (US patent č. 4,873,191; US patent č. 5,530,177; US patent 5,565,362; US patent č. 5,366,894; Wilmut et al., (1997) Nátuře 385:810). Rekombinantní vajíčka nebo embrya se přenesou do náhradní matky (US patent č. 4,873,191; US patent č. 5,530,177; US patent č. 5,565,362; US patent č. 5,366,894; Wilmut et al., (1997) Nátuře 385:810).

• · » · « ·

Po narození se transgenní zvířata identifikují například na základě přítomnosti zavedeného genu markéru, jako je barva srsti, pomocí PCR nebo Southernovým přenosem vzorků krve, tkáně nebo mléka, čímž se detekuje zavedená konstrukce, nebo imunologickými nebo enzymatickými testy, čímž se detekuje exprimovaný protein nebo produkované produkty (US patent č. 4,873,191; US patent č. 5,530,177; US patent č. 5,565,362; US patent č. 5,366,894; Wilmut et al., (1997) Nátuře 385:810). Výsledná transgenní zvířata mohou být celkově transgenní nebo mohou být mozaikové, které mají transgeny v určité sadě jejich buněk. Nástup savčího klonování se uskutečňuje fúzováním nukleotidové buňky s enukleovaným vajíčkem. Pak následuje přenos do náhradní matky a je tak možné získat zvíře nebo buňku obsahující zavedenou konstrukci. Dříve než k tomu dojde je nezbytné, aby se transgen vyskytoval v zárodečné linii zvířat, aby mohlo dojít k pomnožení (Wilmut et al. , (1997)

Nátuře 385:810).

Exprese v hostitelském zvířeti ma určitou účinnost, zvláště, když zvířetem je domácí zvíře. V případě produkce PUFA v tekutinách, které je možné jednoduše získat hostitelského zvířete, jako je například mléko, transgen desaturázy je možné exprimovat v savčích buňkách ze samice hostitele a obsah PUFA se v hostitelských buňkách může měnit. Transgen desaturázy se může přizpůsobit pro expresi tak, že zůstává v savčích buňkách nebo se sekretuje do mléka, pak se produkt produkce PUFA nachází v mléce (WO 95/24488).Exprese se může cílit do savčí tkáně za použití specifických regulačních sekvencí, jako je bovin α-laktalbumin, a-kasein, β-kasein, γkasein, κ-kasein, β-laktoglobulin nebo syrovátkový kyselý protein a může také zahrnovat jeden nebo více intronů a/nebo signální sekvence sekrece (US patentč. 5,530,177, Rosen; US patent č. 5,565,362 Clark et al.; US patent č. 5,366,894, Garner et al.; WO 95/23868).

• ·

Exprese transgenů desaturázy nebo antisense transkriptů desaturázy, které se tímto způsobem přizpůsobily, se mohou použít pro změnu množství specifických PUFA nebo jejich derivátů, které se nacházejí ve zvířecím mléce. Navíc transgen(y) desaturázy se může exprimovat buď samotný nebo spolu s jiným transgenem za účelem produkovat zvířecí mléko, které obsahuje vyšší složku PUFA nebo poměry a koncentrace PUFA, které odpovídají lidskému mateřskému mléku (Prieto et al., WO 95/24494).

jako jsou acylglyceroly, glykolipidy a mohou se nebo jejich metanolem a

Čištění mastných kyselin

Desaturované mastné kyseliny se mohou najít v hostitelském mikroorganizmu nebo ve zvířeti jako volné mastné kyseliny nebo ve spojení s formami, fosfolipidy, sulfolipidy nebo extrahovat z hostitelské buňky různými způsoby, které jsou dobře známy v oboru. Takové způsoby mohou zahrnovat extrakci organickými rozpouštědly, sonikací, extrakci superkritických tekutin za použití například oxidu uhličitého. Dále se mohou použít fyzikální postupy, jako jsou tlak kombinace. Zvláště zajímavá je extrakce chloroformem. Je-lí to nutné, vodná vrstva se může okyselit, aby se protonizovaly negativně nabité části a tím se zvýšila parcionizace požadovaných produktů v organické vrstvě. Po extrakci se mohou organická rozpouštědla odstranit odpařením v proudu dusíku. Když se izolují v konjugovaných formách, produkty se mohou enzymaticky nebo chemicky štěpit, aby se uvolnila volná mastná kyselina nebo méně komplexní konjugát. Ty mohou být předmětem další manipulace za vzniku požadovaného konečného produktu. Konjugované formy mastných kyselin se štěpí hydroxidem draselným.

V případě, že je nezbytné další čištění, mohou se použít standardní metody. Takové metody mohou zahrnovat extrakci, aplikaci močoviny, frakční krystalizaci, HPLC, frakční

» · destilaci, chromatografii na silikagelu, centrifugací při vysokých rychlostech nebo destilaci nebo kombinace uvedených metod. Ochrana reakčních skupin, jako jsou kyselé nebo alkenylové skupiny, se může provést v libovolném kroku známých metod, například alkylace nebo jodizace. Metody obvykle zahrnují metylaci mastných kyselin za vzniku metylesterů. Podobně lze ochranou skupinu odstranit v libovolném kroku. Čištění frakcí obsahujících GLA, SDA, ARA, DHA a EPA lze provést aplikací močovinou a/nebo frakční destilací.

Použití mastných kyselin

Existuje řada využití mastných kyselin podle vynálezu. Sondy založené na DNA podle vynálezu se mohou použít ve způsobech izolace příbuzných molekul nebo ve způsobech pro detekci organizmů exprimujících desaturázy. Při použití jako sondy DNA nebo oligonukleotidy musí být detekovatelné. To je obvykle doprovázeno zachycením značení buď na vnitřním místě, například začleněním upraveného zbytku, nebo na 5' nebo 3'konec. Takové značení je možné detekovat přímo, může vázat druhou molekulu, která je detekovatelné značená nebo se může vázat na neznačenou druhou molekulu a detakovatelně značenou terciální molekulu. Tento proces se může prodlužovat, pokud je to praktické, aby se dosáhlo uspokojivého detekčního signálu bez nežádoucí úrovně signálu pozadí. Sekundární, terciální e přemosťovací systémy mohou zahrnovat použití protilátek proti libovolné jiné molekule, zahrnující značení nebo jiné protilátky nebo mohou zahrnovat libovolné molekuly, které se vzájemně váží. Je to například systém biotinstreptavidin/avidin. Detakovatelně značení v typickém případě zahrnuje radioaktivní izotopy, molekuly, které chemicky nebo enzymaticky produkují nebo mění světlo, enzymy, které produkují detekovatelné reakční produkty, magnetické molekuly, fluorescenční molekuly nebo molekuly, které po navázání mění svou své fluorescenční nebo světlo-emitující charakteristiky.

přímo merenim prostřednictvím

Příklady metod značení se popisují v publikaci USPN 5,011,770. V jiném případě navázání cílových molekul se může detekovat změn teploty roztoku při navázání sondy izotermální titrační kalorimetrie nebo potažením sondy nebo cíle na povrch a detekcí změny rozptylu světla z povrchu, ke které dochází navázáním cíle nebo sondy. To se může provést systémem BIAcore.

PUFA produkované rekombinantními způsoby se mohou použít v různých oblastech. Aplikace PUFA lidem a zvířatům v různých formách může vést ke zvýšenému množství PUFA ne pouze přidaným PUFA, ale také jejich metabolickými progeny.

Nutriční kompozice

Vynález také popisuje nutriční kompozice. Takové kompozice pro účely uvedeného vynálezu zahrnují libovolné potraviny nebo přípravky vhodné pro člověka. Mohou se aplikovat enterálně nebo parenterálně. Tyto přípravky po vstupu do těla (a) vyživují a staví tkáně nebo dodávají energii a/nebo (b) udržují, obnovují nebo podporují adekvátní nutriční statut nebo metabolickou funkci.

Nutriční kompozice podle vynálezu obsahuje alespoň olej nebo jednu kyselinu, které se produkují v souladu s vynálezem, a mohou se vyskytovat v pevné nebo kapalné formě. Navíc kompozice může zahrnovat poživatelné makronutrienty, vitamíny a minerály v množství, které jsou nutné pro určité použití. Množství takových složek kolísá v závislosti na skutečnosti, zda kompozice je určená pro použití kojenci, dětmi nebo dospělými jedinci, vyžadují ze zvláštních důvodů, jako metabolický stav (například metabolická porucha).

Příklady makronutrientů, které se mohou přidávat do kompozice zahrnují, ale nejsou omezeny na poživatelné tuky, sacharidy a proteiny. Příklady takových poživatelných tuků zahrnují, ale nejsou omezeny na kokosový olej, sojový olej a normálními zdravými kteří tyto doplňky je například jistý mono- a diglyceridy. Příklady takových sacharidů zahrnují, ale nejsou omezeny na glukózu, poživatelnou laktózu a hydrolyzovaný škrob. Dále se uvádějí příklady proteinů, které se mohou využít jako nutriční kompozice podle vynálezu. Jsou to například sojové proteiny, elektrodialyzovaná syrovátka, elektrodialyzované odtučněné mléko, mléčná syrovátka nebo hydrolyzáty těchto proteinů.

S ohledem na vitaminy a minerály do nutričních kompozic je možné přidat: vápník, fosfor, draslík, sodík, chlorid, hořčík, mangan, železo, měď, zinek, selen, jód a vitaminy A, E, D, C a komplex vitaminů B. Dále se mohou přidat jiné takové minerály a vitaminy.

Komponenty využívané v nutričních kompozicích podle vynálezu jsou semi-čištěného nebo čištěného původu. Termín „semi-čištěný nebo „čištěný znamená materiál, který se připravil čištěním přirozeného materiálu nebo syntézou.

Příklady nutričních kompozic podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na kojenecké výživy, potravinové doplňky a rehydratační kompozice. Nutriční kompozice zahrnují, ale nejsou omezeny na ty, které využívají enterální nebo parenterální doplňky pro kojence, speciální kojenecké výživy, doplňky pro staré lidi a doplňky p-ro lidi s gastrointestinálními problémy a/nebo s poruchami střebávání.

Nutriční kompozice

Typická nutriční kompozice podle vynálezu bude obsahovat poživatelné makronutrienty, vitaminy a minerály v množství, které je nutné pro určité použití. Množství takových látek kolísá v závislosti na skutečnosti, zda výživa je určena pro aplikaci normálním, zdravým jedincům, kteří jsou dočasně vystaveny stresu nebo jsou určeny subjektům, kteří mají specializované potřeby vzhledem k jistým chronickým nebo akutním stádiím onemocnění (například metabolické poruchy). Odborníkům je zřejmé, že komponenty, které se využívají • * v nutričních kompozicích podle vynálezu pocházejí ze semičištěného nebo čištěného zdroje. Termín „semi-čištěný nebo „čištěný znamená materiál, který se připravil čištěním přirozeného materiálu nebo syntézou. Tyto metody jsou dobře známy v oboru (Code of Federal Regulations for Food Ingredients and Food Processing; Recommended Dietary Allowances, 10^th Ed., National Academy Press, Washington, D.C., 1989).

V preferovaném provedení vynálezu jsou nutriční přípravky enterálním nutričním produktem, upřednostňuje se enterální nutriční produkt určený pro děti nebo dospělé. Vynález popisuje nutriční přípravek, který je vhodný pro výživu dospělých, kteří jsou vystaveni stresu. Výživa obsahuje vedle PUFA podle vynálezu, makronutrienty, vitaminy a minerály v množství, které poskytuje denní nutriční dávka pro dospělé j edince.

Makronutriční komponenty zahrnují poživatelné tuky, sacharidy a proteiny. Příklady poživatelných tuků jsou kokosový olej, sojový olej mono- a diglyceridy a oleje PUFA podle vynálezu. Příklady sacharidů jsou glukóza, poživatelná laktóza a hydrolyzovaný kukuřičný škrob. Typickým zdrojem proteinu je sojový protein, elektrodialyzovaná syrovátka nebo elektrodialyzované netučné mléko nebo mléčná syrovátka nebo hydrolyzáty uvedených proteinů. Mohou se použít jiné zdroje proteinů. Tyto makronutrienty se mohou přidat ve formě běžně přijatelných nutričních látek v množství, které odpovídá složení lidského mateřského mléka nebo energetickému základu, to znamená, že se uvedené množství vztahuje kalorický základ.

Metody tvoření kapalných a enterálních nutričních formulací jsou dobře známy v oboru a popisují se v příkladech provedení vynálezu.

Enterální formulace se může sterilizovat a následně používat ve formě „vhodný pro přímou konzumaci (RTF) nebo se mohou uchovávat v koncentrovaném roztoku nebo ve formě prášku.

• ·

Prášek je možné připravit sušením enterálního přípravku roztřikem, který se připravuje podle shora uvedených metod. Přípravek se může rekonstituovat rehydratací koncentrátu. Kojenecké výživy a výživy pro dospělé jsou dobře známy v oboru a jsou běžně dostupné (např. Similac®, Ensure®, Jevity® a Alimentům® od firmy Ross Products Division, Abbott Laboratories). Olej nebo kyselina podle vynálezu se může přidat do libovolného přípravku v množství popsaném dále v textu.

Energetická hustota nutriční kompozice, když je v kapalné formě, se může v typickém případě pohybovat v rozmezí 0,6 kcal až 3,0 kcal na mililitr. V pevné nebo práškové formě může nutriční doplněk obsahovat přibližně 1,2 až více než 9 kcal na gram, upřednostňuje se 3 až 7 kcal na gram. V obecném případě osmolalita kapalného produktu může být nižší než 700 mOsm. Více se upřednostňuje hodnota nižší než 660 mOsm.

Výživa v typickém případě zahrnuje vedle PUFA podle vynálezu, vitaminy a minerály, což napomáhá přijímat požadovanou minimální denní dávku těchto substancí. Vedle shora uvedených PUFA může být nutné doplnit nutriční kompozici zinkem, mědí a kyselinou listovou a dalšími antioxidanty. Věří se, že uvedené látky také poskytují podporu stresovanému imunitnímu systému a tak přináší jedinci jistý benefit. Přítomnost zinku, mědi a kyseliny listové není nutná, aby se dosáhlo pozitivního účinku na imunitní supresi. Farmaceutická kompozice se může také doplnit uvedenými látkami.

Ve více preferovaném provedení nutriční 'kompozice obsahuje vedle antioxidantního systému a komponentů PUFA zdroj sacharidů, kde alespoň 5 hmotnostních procent uvedených sacharidů tvoří nestravitelný oligosacharid. Ve více preferovaném provedení vynálezu nutriční kompozice navíc obsahuje protein taurin a karnitin.

PUFA nebo jejich deriváty, které se připravují popsanými způsoby, se mohou použít jako potravinové náhrady nebo doplňky • · « zvláště pak u kojenecké výživy u pacientů vyživovaných intravenózně nebo při prevenci nebo léčbě podvýživy. V typickém případě lidské mateřské mléko vykazuje profil mastných kyselin obsahující přibližně 0,15 % až 0,36 % DHA, přibližně 0,03 % až 0,13 % EPA, přibližně 0,30 až 0,88 % ARA, Přibližně 0,22% až 0,67 % DGLA a přibližně 0,27 až 1,04% GLA. Převládajícími triglyceridy v mateřském mléce jsou 1,3-dioieoyl-2-palmitoyl absorbovány než 4,876,107) s 2-palmitoylglyceridy, které jsou lépe

2-oleoyl nebo 2-lineoylglyceridy (USPN Pak se mastné kyseliny, jako jsou ARA, DGLA, GLA a/nebo EPA připravované podle vynálezu, mohou použít při změně složení kojeneckých výživ, aby lépe napodobily složení PUFA v lidském mateřském mléce. Olejová kompozice vhodná pro použití ve farmakologických nebo v potravinových doplňcích, zvláště pak u náhražek mateřského mléka nebo jeho doplňků, bude přednostně obsahovat jednu nebo více ARA, DGLA a GLA. Více se upřednostňuje, aby olej obsahoval přibližně 0,3 až 30 % ARA, přibližně 0,2 až 30 % DGLA a přibližně 0,2 až 30 % GLA.

Koncentrace a poměry ARA, DGLA a GLA se mohou upravit pro určité konečné použití. Když se připravuje doplněk mateřského mléka nebo jeho náhražka, olejová kompozice, která obsahuje dvě nebo více látek ze skupiny zahrnující ARA, DGLA a GLA je v poměru přibližně 1:19:30 až 6:1:0,2.

mléko u zvířat vykazuje poměr ARA: DGLA:

v rozmezí 1:19:30 až 6:1:0,2. Preferují se poměry 1:1:1, 1:2:1 a 1:1:4. Když se produkují PUFA v hostitelské buňce dohromady, je vhodné upravit rychlost a procenta přeměny prekurzorového substrátu, jako je GLA a DGLA na ARA, aby se tak přesně řídily poměry PUFA. 5 až 10 % rychlost konverze DGLA na ARA se může použít pro produkcí poměru ARA : DGLA přibližně 1:9, zatímco rychlost konverze přibližně 75 až 80 % se může použít při

DGLA 6:1. Proto se může použít jak nebo v hostitelském

Například mateřské DGL, který kolísá produkci poměru ARA v systému buněčné kultury organizmu, regulace časování , rozsahu a specifity exprese desaturázy za • · ··· · · « · · c ·« · ··« · · « - * · účelem modulace množství a poměru PUFA. Oleje se mohou izolovat a rekombinovat v požadovaných koncentracích a v poměrech v závislosti na použitém expresívním systému, kterým je například buněčná kultura nebo zvíře exprimující olej(e) ve svém mléce. Množství olejů poskytující uvedené poměry PUFA se mohou stanovit následujícími standardními protokoly. PUFA nebo hostitelské buňky, které je obsahují, se mohu také použít jako doplňky krmivá pro zvířata, přičemž mění složení mastných kyselin v mléce nebo v tkáních na složení, které je přijatelnější pro aplikaci lidem nebo zvířatům.

V případě potravinového doplňku se mohou PUFA nebo jejich deriváty začlenit do potravinářských olejů, tuků nebo margarinů, které se tvoří tak, že při normálním použití recipient dostane požadované množství. PUFA se mohou také přidat do kojeneckých výživ, nutričních doplňků nebo jiných potravinářských produktů a mohu se použít jako protizánětlivé činidla nebo činidla, která snižují hladinu cholesterolu.

Farmaceutické kompozice

Vynález popisuje farmaceutickou kompozici obsahující jednu nebo více kyselin a/nebo výsledné oleje produkované podle zde popsaných metod. Taková farmaceutická kompozice může obsahovat jednu nebo více kyselin a/nebo olejů stejně jako standardní, netoxický farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans nebo vehikl, jako je například fyziologický roztok pufrovaný fosfátem, voda, etanol, polyoly, rostlinné oleje, smáčecí činidlo nebo emulze, jako je například emulze voda/olej. Kompozice může být ve formě kapaliny nebo pevné látky. Kompozice může být například ve formě tablet, kapsulí, poživatelné kapaliny nebo prášku, v injektovatelné formě nebo ve formě povrchově aplikované masti nebo krému.

Možné způsoby aplikace zahrnují například orální, rektální a parenterální aplikaci. Způsob aplikace bude samozřejmě záležet na požadovaném účinku. Jestliže se kompozice má použít pro léčbu drsné, suché nebo podrážděné kůže nebo při léčbě kůže nebo vlasů, které jsou ovlivněné onemocněním, může se aplikovat povrchově.

Dávka kompozice aplikovaná pacientovi může stanovit odborník v závislosti na různých faktorech, jako je hmotnost pacienta, stáří pacienta, stav imunitního systému.

S ohledem na formu kompozice může být například roztok, disperze, suspenze, emulze nebo sterilní prášek, který se pak může rekonstituovat.

Kompozice podle vynálezu se může dále využít pro kosmetické účely. Mohou se přidat do dříve existujících kosmetických přípravků. Vytvoří se směs, která se může použít jako změkčovací kompozice.

Farmaceutické kompozice se mohou používat pro aplikaci komponentu PUFA jednotlivci. V hodné farmaceutické kompozice mohou obsahovat fyziologicky přijatelné sterilní vodné nebo nevodné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze nebo sterilní prášky pro přípravu sterilních roztoků nebo disperzí. Příklady vhodných vodných nebo nevodných nosičů, ředidel, rozpouštědel nebo vehiklů zahrnují vodu, etanol, polyoly (propylenglykol, polyethylenglykol, glycerol a podobně), jejich vhodné směsi, rostlinné oleje (jako je olivový olej) a injektovatelné organické estery, jako je etyloleját. Vhodná těkavost se může udržovat v případě disperze například zachováním požadované velikosti částic a použitím povrchových činidel. Může být také nutné použít izotonická činidla například cukry, chlorid sodný a podobně. Vedle takových inertních ředidel kompozice také může zahrnovat adjuvans, jako je smáčecí činidla, emulgátory a suspendační činidla, sladidla, příchutě a aroma.

Suspenze vedle aktivních sloučenin mohou obsahovat suspendační činidla, jako je například etoxylovaný izostearylalkohol, polyoxyetylensorbitol a sorbitanestery, mikrokrystalická celulóza, metahydroxid hliníku, bentonit, agar-agar a tragakant nebo směsi uvedených látek a podobně.

* « 9 « ·

4/- 9 9 9 9 9 ···«*> ···

O ···»· ··

999 99 999 9999 99 99

Pevné dávkovači formy, jako jsou tablety a kapsule se mohou připravit za použití metod dobře známých v oboru. PUFA podle vynálezu mohou tvořit tablety spolu s běžnými tabletovými bázemi, jako je laktóza, sacharóza a kukuřičný škrob v kombinaci s pojidlem, jako je akacia, kukuřičný škrob nebo želatina, dezintegračni činidla, jako je bramborový škrob nebo kyselina alginová a lubrikační prostředek, jako je kyselina sterová nebo sterát hořečnatý. Kapsule se mohou připravit začleněním těchto ekcipientů do želatinových kapsulí buď samotných nebo s antioxidanty a s komponenty PUFA. Množství antioxídantů a komponentů PUFA, které by se měly začlenit do farmaceutické kompozice by měly souhlasit se shora uvedeným průvodcem.

Termín „léčit znamená buď předcházet nebo redukovat výskyt nežádoucích stavů. Například léčit supresi imunity znamená buď předcházet výskytu této suprese nebo redukovat sílu takové suprese. Termíny „pacient a „jedinec jsou zaměnitelné a oba tyto termíny znamenají zvíře. Termín „zvíře znamená libovolného teplokrevného savce, ale není omezen na psi, lidi, opice a bezocasé opice. Termín „přibližně znamená množství, které kolísá v daném rozmezí v závislosti na použití. Libovolné numerické číslo nebo rozmezí specifikované ve specifikacích by se mohlo upravovat podle shora uvedeného termínu.

Termín „dávka znamená množství nutriční nebo farmaceutické kompozice podávané pacientovi v jediné aplikaci a je navržena tak, aby se zavedlo účinné množství antioxídantů a strukturních triglyceridů. Odborníkům je zřejmé, že jediná dávka kapalného nutričního prášku by měla poskytnout shora uvedené množství antioxidantů a PUFA. Dávka by měla zahrnovat objem, který je schopen konzumovat typický dospělý jedinec při jedné aplikaci. Toto množství může široce kolísat v závislosti na věku, hmotnosti, pohlaví nebo zdravotním stavu pacienta. Obecně platí, že jedna dávka kapalného nutričního produktu by • · ·» · ·· ·» • · ···« *··» • · · · · - * · • · » · · · ··*·»· • · · · * · » · ·»»··«» Ib· fc · měla obsahovat objem 100 až 600 ml, upřednostňuje se 125 až 500 ml a nejvíce se preferuje 125 až 300 ml.

PUFA podle vynálezu se mohou také přidat do potravin dokonce tehdy, jestliže potravinové doplňky nejsou nutné. Kompozice se například mohou přidat do libovolného typu potravin, které se neomezují na margariny, upravená másla, sýry, mléko, jogurt, čokoláda, bonbony, sušenky, salátové oleje, tuky vhodné pro tepelné zpracování, maso, ryby a nápoj e.

Farmaceutické aplikace

V případě farmaceutického použití (v lidské a veterinární medicíně) se mohou kompozice obecně aplikovat orálně nebo libovolným jiným způsobem, při kterém může dojít k úspěšné absorbci. To znamená například parenterálně (to je podkožně, do svalu nebo intravenózně), rektálně nebo vaginálně nebo povrchově, což může být například kožní mast nebo roztok. PUFA podle vynálezu se mohou aplikovat samostatně nebo v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ekcipientem. Jestliže jsou dostupné želatinové kapsule, stávají se preferovanou formou orální aplikace. Doplnění potravy, jak se popisuje shora v textu, se může také provádět orálním způsobem aplikace. Nesaturované kyseliny podle vynálezu se mohou aplikovat v konjugovaných formách nebo jako sole, estery, amidy nebo pro-formy léčiv mastných kyselin. Vynález popisuje libovolné farmaceuticky přijatelné sole. Zvláště se preferují sole sodíku, draslíku a litia. Dále se využívají Nalkylpolyhydroxaminové sole, jako je N-metylglukamin, který se popisuje v publikaci WO 96/33155. Preferovanými estery jsou etylestery. Jako pevné sole se mohou estery aplikovat ve formě tablet. V případě intravenózní aplikace se mohou PUFA nebo jejich deriváty začlenit do běžných formulací, jako jsou Intralipidy. Profil mastných kyselin v plazmě normálního dospělého jedince je 6,64 až 9,46 % ARA, 1,45 až 3,11 % DGLA a ·· • * « *· ·· · ··· ·· ··· ····

0,02 až 0,08 % GLA. Tyto PUFA nebo jiné metabolické prekurzory se mohou aplikovat buď samotné nebo ve směsi s jinými PUFA, aby se dosáhlo u pacienta normálního profilu mastných kyselin. Jestliže je to nutné jednotlivé komponenty formulací mohou být dostupné ve formě kitů, které jsou vhodné pro jediné nebo vícenásobné použití. Typická dávka určité mastné kyseliny je 0,1 mg až 20 mg nebo dokonce 100 g denně a upřednostňuje se 10 mg až 1, 2, 5 nebo 10 g denně nebo molární ekvivalentní množství jejich derivátů. Vynález dále popisuje parenterální nutriční kompozice obsahující přibližně 2 až 30 hmotnostních procent mastných kyselin vypočítaných jako triglyceridy. Preferují se kompozice, které obsahují přibližně 1 až 25 hmotnostních procent celkové kompozice PUFA jak GLA (USPN 5,196,198) . Do kompozice se mohou přidat jiné vitaminy a zvláště pak v tucích rozpustné vitaminy, jako je vitamín A, D, se přidat

E a L-karnitin. Jestliže je to nutné mohou konzervační činidla, jako je například α-tokoferol, v typickém případě tvoří přibližně 0,1 hmotnostních procent.

Vhodné farmaceutické kompozice mohou obsahovat fyziologicky přijatelné sterilní vodné nebo nevodné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze a sterilní prášky vhodné pro rekonstituci na sterilní injektovatelné roztoky nebo disperze. Příklady vhodných a nevodných nosičů, ředidel, rozpouštědel nebo vehiklů zahrnují vodu, etanol, polyoly (propylenglyol, polyetylenglykol, glycerol a podobně), jejich vhodné směsi, jako je olivový olej) a injektovatelné jako je etyloleát. Vhodnou fluiditu lze udržovat v případě disperzí například zachováním požadované velikostí částic nebo použitím povrchově aktivních činidel. Může být také nutné zahrnout izotonická činidla, například cukry, chlorid sodný a podobně. Vedle takových inertních ředidel kompozice může také zahrnovat adjuvans, jako jsou smáčecí činidla, emulgační a suspendační činidla, sladidla, příchutě a parfemovací činidla.

rostlinné oleje organické estery, • · • ·

Suspenze vedla aktivních látek mohou obsahovat suspendační činidla, jako je například etoxylované izostearylalkoholy, polyoxyetylensorbitol a sorbitanestery, mikrokrystalická celulóza, metahydroxid hlinitý, bentonit, agar-agar a tragakant nebo směsi uvedených látek a podobně.

Zvláště preferované kompozice obsahují estery diacetyltartarové kyseliny a mono- a diglyceridů rozpuštěné ve vodném médiu nebo v rozpouštědle. Estery diacetyltartarové kyseliny a mono- a diglyceridů mají hodnotu HLB přibližně 9 až 12 a jsou podstatně více hydrofilní, než existující antimikrobiální lipidy, které vykazují hodnoty HLB 2 až 4. Tyto existující hydrofobní lipidy se nemohou tvořit ve formě vodných kompozic. Tyto lipidy se mohou rozpouštět ve vodném médiu v kombinaci s estery diacetyltartarové kyseliny a monoa diglyceridů. V souladu s tímto provedením vynálezu estery diacetyltartarové kyseliny a mono- a diglyceridů (například DATEM-C12:0) se taví s jinými aktivními antimikrobiálními lipidy (například 18:2 a 12:0 monoglyceriody) a mísí se za vzniku homogenní směsi. Homogenita umožňuje zvýšit antimikrobíální aktivitu. Směs se může zcela dispergovat ve vodě. To není možné bez přidání esterů diacetyltartarové kyseliny a mono- a diglyceridů. Dříve než se přidá voda se vše promíchá s dalšími monoglyceridy. Vodná kompozice se pak může míchat za sterilních podmínek s fyziologicky přijatelnými ředidly, konzervačními činidly, pufry nebo hnacími látkami, které jsou nutné pro vytvoření spreje nebo inhalační formy.

Vynález dále popisuje léčbu řady poruch pomocí mastných kyselin. Doplňování PUFA podle vynálezu se může použít při léčbě restenózy po angioplastice. Symptomy zánětů, revmatické artritidy a astma a lupénky se mohou léčit pomocí PUFA podle vynálezu. Důkazy ukazují, že PUFA se mohou podílet na metabolizmu vápníku, což naznačuje, že PUFA podle vynálezu se mohou použít při léčbě nebo prevenci osteoporózy a kamenů v ledvinách nebo v močovém ústrojí.

• · mastných kyselin, uvedených buněk a

PUFA podle vynálezu se mohou použít při léčbě zhoubného bujení. Ukázalo se, že maligní buňky vykazují změnu ve složení Navíc mastné kyseliny zpomalují růst způsobují jejich úmrtí a zvyšují jejich citlivost k chemoterapeutíckým činidlům. Dále se popisuje, že GLA způsobuje re-expresi buněčných adhezivních molekul Ekaderinu v buňkách karcinomů, přičemž ztráta exprese uvedených molekul je spojena s agresivní tvorbou metastáz. Klinické testy intravénozní aplikace ve vodě rozpustných litných solí GLA pacientům se zhoubným bujení pankreasu ukazují podstatné zvýšení pacientů, kteří přežívají. Podávaní PUFA je také vhodné pro léčbu kachexie spojené se zhoubným bujením.

PUFA podle vynálezu se mohou také použít při léčbě cukrovky (USPN 4,826,877; Horrobin et al., Am. J. Clin. Nutr. Vol. 57 (Suppl.), 732S-737S). Změněný metabolizmus mastných kyselin a jejich složení se demonstruje u zvířat trpících cukrovkou. Tyto změny naznačují, že se podílí na komplikacích, které vznikají při dlouhodobém onemocnění cukrovkou. Tyto komplikace zahrnují retinopatii, neuropatii, nefropatii a poškození reprodukčního systému. Petrklíčový olej, který obsahuje GLA, je schopen bránit a napravit poškození nervů při dlouhodobě trvající cukrovce.

PUFA podle vynálezu se mohou používat pří léčbě ekzémů, při redukci krevního tlaku. Nedostatečnost mastných kyselin se projevuje ekzémy a studie naznačují, že GLA pozitivně působí na ekzémy. GLA se také podílejí na snížení vysokého tlaku spojeného se stresem. Ukázalo se, že GLA a DGLA inhibují agregaci destiček, způsobují vazodilaci, snižují hladinu cholesterolu a inhibují prolíferaci hladkého svalstva stěn cév a vláknité tkáně (Brenner et al., Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 83, p.85-101, 1976). Aplikace GLA nebo DGLA samotného nebo v kombinaci s EPA snižuje nebo brání krvácení v gastrointestinálním traktu a jiným vedlejším účinkům, které jsou spojeny s aplikací nesteroidních proti zánětlívých léčiv • · • · · (USPN 4,666,701). GLA a DGLA také předchází nebo léčí endometriózu a premenstruální syndrom (USPN 4,758,592) a léčí myalgickou encefalomyelitidu a chronickou únavu po virové infekci (USPN 5,116,871).

Další použití PUFA podle vynálezu zahrnuje použití při léčbě AIDS, roztroušené sklerózy, akutního respiračního syndromu, vysokého tlaku a zánětlivého onemocnění kůže. PUFA podle vynálezu se mohou také použít ve formulích určených pro celkové posílení a pro geriatrickou léčbu.

Veterinární aplikace

Je třeba poznamenat, že shora uvedené farmaceutické a výživné kompozice se mohou také aplikovat zvířatům, stejně jako lidem. Zvířata mohou mít stejné potřeby a stejné stavy jako lidé. Olej nebo kyseliny podle vynálezu se mohou používat jako doplňky krmení zvířat.

Přehled obrázků na výkresu

Obrázek č. 1 ukazuje možnou dráhu syntézy kyseliny arachidonové (20:4 Δ5, 8, 11, 14) a kyseliny stearadinové (18:4 Δ6, 9, 12, 15) z kyseliny palmitové (C₁₆) z různých organizmů, které zahrnují řasy, Mortierella a lidi. Tyto PUFA mohou sloužit jako prekurzory jiných molekul důležitých pro člověka a jiná zvířata. Mezi uvedené molekuly patří prostacykliny, leukotrieny a prostaglandiny. Některé z nich jsou zde zobrazeny.

Obrázek č. 2 ukazuje možnou dráhu produkce PUFA vedle ARA, zahrnující EPA a DHA v případě různých organizmů.

Obrázek č. 3A až E ukazuje sekvenci DNA A6-desaturázy Mortierelle alpina a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci:

Obrázek č. 3A až E (SEQ ID NO 1 cDNA A6DESATURAZY).

Obrázek č. 3A až E (SEQ ID NO 2 aminokyselina A6DESATURAZY).

Obrázek č. 4 ukazuje uspořádání části aminokyselinové sekvence Δβ-desaturázy Mortierella alpina s jinými příbuznými sekvencemi.

Obrázek č. 5A až D ukazuje sekvenci DNA A12-desaturázy a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci:

Obrázek č. 5A až D (SEQ ID NO 3 cDNA Δ12 DESATURÁZY)

Obrázek	č. 5A	až	D (SEQ ID NO	4 aminokyselina	Δ12
DESATURÁZY).
Obrázek	č. 6A	až	6B ukazuje	účinek různé	exprese
konstrukcí na	expresi	GLA	. v kvasince.
Obrázek	č . 7 A a	7B	ukazuje účinek	hostitelského	kmene	na
produkci GLA.
Obrázek	č. 8A a	8B	ukazuje účinek	hostitelského	kmene	na
produkci GLA	v S. cerevísiae kmene SC334

Obrázek č. 9 ukazuje uspořádání proteinové sekvence Ma 29 a kontig 253538a.

Obrázek č. 10 ukazuje uspořádání proteinové sekvence Ma 524 a kontig 253538a.

Popis sekvencí:

SEQ ID NO: 1 ukazuje sekvenci DNA Δβ-desaturázy

Mortierella alpina.

SEQ ID NO: 2 ukazuje proteinovou sekvenci Δβ-desaturázy Mortierella alpina.

SEQ ID NO: 3 ukazuje sekvenci DNA A12-desaturázy

Mortierella alpina.

SEQ ID NO: 4 ukazuje proteinovou sekvenci Al2-desaturázy Mortierella alpina.

SEQ ID NO: 5 až 11 ukazuje různé sekvence desaturáz.

SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12 ukazuje aminokyselinové motivy sekvence desaturázy.

SEQ ID NO: 13 až 18 ukazuje sekvence různých PCR primerů.

SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 20 ukazuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci desaturázy Dictyostelium discoideum.

SEQ ID NO: 21 a SEQ ID NO: 22 ukazují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvencí desaturázy Phaeodactylum tricornutum.

SEQ ID NO: 23 až 26 ukazuje nukleotidovou a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci klonu cDNA Schizochytrium.

SEQ ID NO: 27 až 33 ukazuje nukleotidovou sekvenci pro lidské desaturázy.

SEQ ID NO: 34 až SEQ ID NO: 40 zobrazují peptidové sekvence lidských desaturáz.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Konstrukce knihovny cDNA z organizmu Mortierella alpina

Z tří denní kultury Mortierella alpina produkující PUFA se izolovala celková RNA za použití protokolu podle publikace Hoge et al. (1982) Experimental Mycology 6: 225-232. RNA se používá při přípravě dvouřetězcové cDNA za použití systému lambda-ZipLox od firmy BLR, přičemž se postupuje podle instrukcí výrobce. Odděleně se zabalí několik frakcí cDNA M. alpina o různých velikostech, což vede ke vzniku knihoven s různými inzerty s průměrnou velikostí. Knihovna s inzertem v plné délce obsahuje přibližně 3 x 10⁶ klonů s průměrnou velikostí inzertu 1,77 kb. Knihovna vhodná pro sekvenování obsahuje přibližně 6 velikosti 1,1 kb.

x 10⁵ klonů s inzertem o průměrné

Příklad č. 2: Izolace nukleotidové sekvence Á6-desaturázy z organizmu Mortierella alpina

Náhodným sekvenováním klonů z knihovny cDNA organizmu M. alpina vhodné pro sekvenování popsané v příkladu 1 se získala sekvence nukleové kyseliny z parciálního klonu cDNA Ma524, • · která kóduje Δβ-desaturázu mastné kyseliny.Plazmidy obsahující cDNA se vystřihly následujícím způsobem:

pg fágu se kombinovalo se 100 μΐ kultury E. coliDHlOB(ZIP), která se kultivovala na kultivačním médiu ECLB s 10 pg/ml kanamycinu, 0,2 % maltózy a 10 mM MgSO4 a inkubovala se při teplotě 37 °C po dobu 15 minut. Přidalo se 0,9 ml SOC a 100 μΐ bakterií se bezprostředně naneslo na každou plotnu obsahující 10 ECLB + 50 pg Pen. Doba 45 minut pro zpamatování se kultury nebyla nutná. Plotny se inkubovaly přes noc při teplotě 37 °C. Kolonie se vypíchly do kultivačního média ECLB + 50 pg Pen a inkubovaly se přes noc. Z této kultury se připravily zásobní roztoky s giycerolem a provedla se mini izolace DNA. Alikvót kultury používaný jako mini izolaci se uchovával jako zásobní roztok s giycerolem. Nanesení kultury na plotny s kultivačním médiem ECLB + 50 pg Pen/ml vedlo k tvorbě více kolonií a větší část kolonií obsahuje inzerty ve srovnání s plotnami, které obsahují 100 pg/ml Pen.

Náhodně se vypíchly kolonie a za použití sady pro mini izolaci se izolovala plazmidová DNA. Z 5'konce inzertu cDNA se získala sekvence DNA a porovnala se z databází instituce National Center for Biotechnology použití algoritmu BLASTX. Ma524 putativní desaturáza založená na s dříve identifikovanými desaturázami.

Z knihovny organizmu M. alpina se izoloval klon cDNA v plné délce a označil se jako pCGN5532. CDNA se vyskytuje ve formě inzertu o velikosti 1 617 bp ve vektoru pZLl (BRL) a

Information (NCBI) za se identifikoval jako homologii sekvence

DNA začíná ATG, aminokyselin. Je známo, rámečky konzervativní obsahuje otevřený čtecí rámec kódující 457 že tři konzervativní „histidinové u desaturáz vázaných na membránu (Okuley, et al. (1994) The Plant Cell 6: 147-158) jsou přítomny v polohách aminokyselin 172 až 176, 209 až 213 a 359 až 399 (zobrazeno na obrázku č. 3) . Stejně jako u jiných Δ655 • · · desaturáz vázaných na membráně konečný motiv histidinového rámce HXXHH je QXXHH. Aminokyselinová sekvence Ma524 vykazuje podstatnou homologii s částí kozmidu Caenorhabd.itis elegans WO6D2.4, s fúzním proteinem cytochom b5/desaturáza ze slunečnice a s Δβ-desaturázami z Synechocystis a Spirulina. Navíc Ma524 vykazuje homologii s aminokyselinovou sekvencí Δ6desaturázy brutnáka lékařského (PCT WO 96/21022). Ma524 tak kóduje Δβ-desaturázu, která je příbuzná Δβ-desaturáze brutnáku lékařského a řas. Peptidové sekvence jsou uvedeny jako SEQ ID NO: 5 až 11.

Zjistilo se, že N-konec kódovaného proteinu vykazuje podstatnou homologii s proteiny cytochromu b5. Klón cDNA Mortierella se reprezentuje fúzi mezi cytochromem b5 a desaturázou mastné kyseliny. Protože se věří, že cytochrom b5 funguje v případě enzymů desaturáz vázaných na membráně jako donor elektronů, je možné, že N-terminální oblast cytochromu b5 tohoto proteinu desaturázy se podílí na uvedené funkci. To může být výhodné, když se desaturáza exprimuje v heterogenních systémech za účelem produkce PUFA. Je však nutné poznamenat, že ačkoli aminokyselinové sekvence Ma524 a Δβ-desaturázy obsahuje oblasti homologie, složení baží cDNA je podstatně odlišné. Například se ukázalo, že cDNA brutnáku lékařského obsahuje 60 % A/T, některé oblasti obsahují 70 % A/T, zatímco Ma524 vykazuje průměrně 44% A/T, přičemž žádná oblast nepřesahuje 60 %. To může způsobit expresi cDNA v mikroorganizmech nebo u zvířat, která upřednostňují odlišné složení baží. Je známo, že k slabé expresi rekombinantních genů může dojít, když hostitel preferuje složení baží odlišné od složení zavedeného genu. Mechanizmy takové slabé exprese zahrnují sníženou stabilitu, skrytá místa sestřihu a/nebo translaci mRNA a podobně.

Příklad 3: Identifikace Δβ-desaturáz homologních s Δ6desaturázou organizmu Mortierella alpina • · • ·

Pomocí algortimu BLASTX databáze „Expressed Sequence Tag („EST) prostřednictvím NCBI za použití aminokyselinové sekvence Ma524 se identifikovaly sekvence nukleové kyseliny, které kódují putativní Á6-desaturázy. Několik sekvencí vykazuje podstatnou homologii. Zvláště dedukovaná aminokyselinová sekvence dvou sekvencí Arabidopsís thaliana (číslo uložení F13728 a T42806) vykazují homologii s dvěma různými oblastmi dedukované aminokyselinové sekvence Ma524. Vytvořily se následující primery:

ATTS4723-FOR (komplementární s F13728) SEQ ID NO: 13

5' CUACUACUACUAGGAGTCCTCTACGGTGTTTTG a

T42806-REV (komplementární s T42806) SEQ ID NO: 14

5' CAUCAUCAUCAUCAUATGATGCTCAAGCTGAAACTG.

Pět míkrogramů celkové RNA izolovaných z Arabidopsís thaliana se reverzně přepsala za použití Superscript Rtázy firmy BRL a primeru TSyn (5'CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3' ) a ozančila se jako SEQ ID NO: 12. PCR se provedlo v objemu 50 μΐ, kde je obsaženo: templát získaný z 25 ng celkové RNA, 2 pM každého primeru, 200 μΜ deoxyribonukleotidového trifosfátu, 60 mM Tris-Cl, pH8,5, 15 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgC12, 0,2 jednotek Taq polymerázy. Podmínky v zařízení „termocycler byly následující: 94 °C pod obu 30 vteřin, 50 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C pod dobu 30 vteřin. PCR pokračovalo v 35 cyklech, pak následovalo další prodloužení při teplotě 72 °C po dobu 7 minut. Výsledkem PCR je fragment o přibližné velikosti 750 párů baží, který se subklónoval , označil se jako 12-5 a sekvenoval se. Každý konec tohoto fragmentu se vytvořil tak, aby odpovídal EST Arabidopsís, ze kterého se vytvořily primery PCR. Putativní aminokyselinová sekvence 12-5 se porovnávala se sekvencí Ma524 a EST z člověka (W28140), myši (W53753) a C.elegans (R05219) (obrázek č. 4). Paterny homologie s Δβ-desaturázou organizmu Mortirella indikují, že tyto sekvence reprezentují putativní polypeptidy desaturázy. Na základě těchto experimentů je

pravděpodobné, že geny v plné délce je možné klonovat za použití sond založených na sekvencích EST. Následuje klonování, kdy geny se pak mohou vložit do expresívních vektorů a mohou se exprimovat v hostiteslkých buňkách a může se stanovit jejich specifická aktivita Δβ-desaturázy nebo jiné desaturázy způsobem popsaným dále v textu.

Příklad 4: Izolace nukleotidové sekvence A12-desaturázy z organizmu Mortierella alpina

Na základě hromadění mastných kyselin se zdá pravděpodobné, že organizmus Mortierella alpina má desaturázu typu ωβ. ωβdesaturáza je odpovědná za produkci kyseliny linolenové (18:2) z kyseliny olejové (18:1). Kyselina linolenová (18:2) je substrát pro Δβ-desaturázy. Tento experiment se navrhl, aby se stanovilo, zda organizmus Mortierella alpina má polypeptid Á12-desaturázy. Jestli ano, pak se stanovila odpovídající nukleotidová sekvence.

Náhodná kolonie z knihovny vhodné pro sekvenování organizmu M. alpina Ma648 se sekvenovala a identifikovala jako putativní desaturáza založená na homologii DNA sekvence s předem identifikovanými desaturázami, jak se popisuje v případě Ma524 (příklad č. 2). Nukleotidová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 13. Peptidová sekvence je uvedená v SEQ ID NO: 4. Dedukovaná aminokyselinová sekvence z 5'konce cDNA Ma648 vykazuje podstatnou homologii s mikrozomální ωβ(Δ12) desaturázou sóji (číslo uložení #L43921) stejně jako s 12hydroxylázou oleátu fazole (číslo uložení #U22378). Jestliže se porovnávala s dalšími sekvencemi desaturáz mastných kyselin ωβ(Δ12) a ω3(Δ15) pozorovala se také jistá homologie.

Příklad 5: Exprese klonů desaturázy M. alpina v pekařských kvasinkách

Transformace kvasinek «·· · · ···· • · ·· · * · ······ • · · * · · · ··· · · ······· · · ··

Transformace kvasinek acetátem litia se provedla podle standardních protokolů (Methods in Enzymology, Vol. 194, p. 186-187, 1991). Kvasinky se kultivovaly v kultivačním médiu

YPD při teplotě 30 °C. Buňky se centrifugovaly, resuspendovaly se v TE a opět se centrifugovaly a resuspendovaly se v TE obsahujícím 100 mM acetát litný. Pak proběhla centrifugace a opět se buňky resuspendovaly v TE/acetát litný. Resuspendované kvasinky se inkubovaly při teplotě 30 °C po dobu 60 minut za stálého míchání. Přidala se DNA sloužící jako nosič a do zkumavek se připravily alikvoty kultury kvasinek. Dále se do zkumavek přidala transformující DNA a zkumavky se inkubovaly po dobu 30 minut při teplotě 30 °C. Přidal se roztok PEG (35 % (hmotnost/objem) PEG 4 000, 100 mM acetát litný, TE pH 7,5) a pak následuje inkubace po dobu 50 minut při teplotě 30 °C.

Uskutečnil se teplotní šok provedený při teplotě 42 °C po dobu 5 minut, buňky se centrifugovaly do peletu, promyly se TE, opět se centrifugovaly a resuspendovaly se v TE. Resuspendované buňky se pak nanesly na plotny se selektivním médiem.

Exprese desaturázy v transformovaných kvasinkách

Klony cDNA z organizmu Mortierella alpina se testovaly, zda vykazují v pekařských kvasinkách aktivitu desaturázy. Jako pozitivní kontrola se použila A15-desaturáza kanoly (získaná pomocí PCR použitím prvního řetězce cDNA ze semen Brassica napus kultivar 212/86 za použití primerů založených na publikované sekvenci (Arondel et al. Science 258: 1353-1355)).

Gen Á15-desaturázy a gen z cDNA klonů Ma524 a Ma648 se začlenil do expresívního vektoru pYES2 (Invitrogen) za vzniku plazmidů pCGR-2, pCGR-5 a pCGR-7. Tyto plazmídy se transfekovaly do kvasinek S. cerevisiae kmen 334 a exprimovaly se po indukci galaktózou v přítomnosti substrátů, které umožňují detekci specifické aktivity desaturázy. Kontrolním kmenem byl S. cerevisiae kmen 334 obsahující nezměněný vektor pYES2. Používané substráty, produkované produkty a indikované na ARA indikuje (konverze na GLA konverze na ALA indikuje aktivity desaturázy byly: DGLA (konverze aktivitu Á5-desaturázy), kyselina linolenová indikuje aktivitu Δβ-desaturázy, aktivitu A15-desaturázy) , kyselina olejová (endogenní substrát připravený kvasinkami S. cerevisiae, konverze na kyselinu linolenovou indikuje aktivitu A12-desaturázy, která kvasinkám S. cerevisiae chybí) nebo ARA (konverze na EPA indikuje aktivitu A17-desaturázy).

Kultury se kultivovaly po dobu 48 až 52 hodin při teplotě 15 °C. Buňky se centrifugovaly, pelet se promyl sterilní ddH₂O a znovu se centrifugací připravil pelet. Pelety se suspendovaly mícháním na vortexu v metanolu. Přidal se chloroform s tritridekanon (jako inertní standard). Směsi se inkubovaly alespoň jednu hodinu při teplotě místnosti nebo přes noc při teplotě 4 °C. Extrahovala se vrstva chloroformu a filtrovala se za použití Whatmancva filtru s jedním gramem nevodného síranu sodného za účelem odstranění partikul! a zbytku vody. Organická rozpouštědla se odpařila při teplotě 40 °C v proudu dusíku. Extrahované lipidy se pak derivátizovaly na metylestery mastných kyselin (FAME) a analyzovaly se chromatografií (GC) přidáním 2 ml 0,5 N hydroxidu draselného v metanolu. Zkumavka se uzavřela. Vzorky se zahřály na teplotu 95 °C až 100 °C po dobu 30 minut a ochladily se na teplotu místnosti. Pak se přidaly přibližně 2 ml 14 % fluoridu boritého v metanolu a zahřátí se opakovalo. Po té, co se extrahovaná lipidová směs ochladila, přidaly se 2 ml vody a 1 ml hexanu za účelem extrakce FAME pro analýzu GC. Procenta konverze se vypočítala dělením produkovaného produktu součtem produkovaného produktu a přidaného substrátu a pak násobeno 100. Pro výpočet procenta konverze kyseliny olejové, kde se nepřidal žádný substrát, linolenová dělí součtem se celková produkovaná kyselina kyseliny olejové a produkované • ·

kyseliny linolenové násobeno 100. Výsledky aktivity desaturázy jsou uvedeny v tabulce č. 1 dále v textu.

Tabulka č. 1

Exprese desaturázy M. alpina v pekařských kvasinkách

Klon	enzymatická aktivita	% konverze substrátu
pCGR-2 A15-desaturáza kanoly	Δ6	0 (18:2 až 18:3ω6
Δ15	16,3 (18:2 až 18 : 3co3)
Δ5	2,0 (20:3 až 18:3ω3)
Δ17	2,8 (20:4 až 20:5ω3)
Δ12	1,8 (18:1 až 18:2ω6)
pCGR-5 (M. alpina Ma524)	Δ6	6, 0
Δ15	0
Δ5	2,1
Δ17	0
Δ12	3,3
PCGR-7 (M. alpina Ma648)	Δ6	0
Δ15	3,8
Δ5	2,2
Δ17	0
Δ12	63,4

Kontrolní klon A15-desaturázy vykazuje 16,3 % konverzí substrátu. Klon pCGR-5 exprimující cDNA Ma524 přeměnil 6 % substrátu na GLA, což indikuje, že gen kóduje Δβ-desaturázu. Pozadí (nespecifická konverze substrátu) se v tomto případě pohybuje mezi 0 až 3 %. Dále se zjistilo, že substrát v různých koncentracích inhibuje aktivitu. Když se přidal substrát v koncentraci 100 μΜ, procento konverze kleslo ve srovnání s koncentrací substrátu 25 μΜ (uvedeno dále v textu).

• ·

Navíc jestliže koncentrace substrátu kolísají v rozmezí přibližně 5 μΜ až 200 μΜ, pak procento konverze je v rozmezí přibližně 5 až 75 % a vyšší. Tyto data ukazují, že desaturázy s různými specifitamí substrátu se mohu exprimovat v heterogenním systému a používají se za účelem produkce polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem.

Tabulka č. 2 reprezentuje zajímavé mastné kyseliny, jako procento celkových lipidů extrahovatelných z kvasinkového hostitele S.cerevisiae 334 s indikovaným plazmidem. V růstovém médiu není obsažena žádná glukóza. Afinitní plynová chromatografie se používala k separaci použila pro ověření identity produktu(ů). A15-desaturázy organizmu B. napus, což lipidů. GC/MS se Očekávaný produkt je a linolenová kyselina, se detekoval, když se exogenně přidal její substrát kyselina linolenová do indukované kvasinkové kultury. Toto zjištění naznačuje, že exprese desaturázového genu v kvasinkách produkuje funkční enzym a detekovatelné množství produktu za současných růstových podmínek. Oba exogenně přidané substráty se pohltily kvasinkami, ačkoli do kvasinek se začlenilo o trochu méně PUFA s delšími řetězci, což je kyselina dihomo-y-linolenová (20:3) spíše než kyseliny línolenové (18:2), když se přidaly ve volné formě, aby se indukovala kvasinková kultura. Kyselina γ-linolenová se v kvasinkách detekovala jako nové PUFA, když během indukce a exprese v S. cerevisiae 334 (pCGR-5). byla přítomna kyselina To ukazuje, že PUFA vykazují aktivitu Δ6z pCGR-5 (MA524). Kyselina linolenová se identifikovala v extrahovaných lipidech pocházejících z exprese S. cerevisiae 334 (pCGR-7), cDNA MA648 z M. alpina se klasifikuje jako A12-desaturáza linolenová. desaturázy • ·

kyselina vyjádřená jako procento celkových lipidů extrahovaných z kvasinek

18:2 produkovaný	O	O	O	12,2
18 : 1* přítomný		o	'tr C\J	r-H r-
20:4 produkovaný	o	o	o	o
20:3 začleněný	58,4	50,4	'PT	45,7
γ-18 : 3 produkovaný	o	o	0 ‘ t	o
ct-18 : 3 produkovaný	O	Γ LD	o	O
18 : 2 začleněný	6 6,9	60, 1	CM CO	co LO
Plazmid v kvasinkách (enzym)	pYES2 (kontrolní)	pCGR-2 (Δ15)	pCGR-5 (Δ6)	PCGR-7 (Δ12)

P>

'CO

O

X cd

X

CD

O

O

I-1 o

CD

O ’—t cO

Ό

-H >P d

X
u
X
c
•H
CD
rO
>
X
>
O							Ό
c							>
-1—1							o
1-1							2
Φ							Φ
ω							1-1
				'f0 >	'05	'CO	o £	'(0
				0	>	>	•H	>
'CO			'C0	c	0	o	i—H	O
£			>	Φ	G	a	I	a
4J			0	l—1	Φ	o	ř-	O
ω		Ό	c	0	Γ—(	Ό	1	Ό
05		>	o	0	O	•1—f	O	-i—|
£		0	1—1	•H	G	G	£	X
			o	i—1	•H	05	O	G
Μ—1		ω	c	1	i—1	Φ	x	CO
£		1-1	Ή	a	1	-G	•G	P
£		0	i—I			ω	Ό	CO
Φ				CO	05
cn	ω	co	05	a	£	05	fO	f0
o	u	c	G	-H	•H	G	2	2
Ό	f—1	-H	♦H	1—1	i—1	•G	-G	-G
£	2	1—1	i—l	o	Φ	i—1	|—1	i—1
Φ	X	(1)	Φ	CD	co	Φ	Φ	Φ
	f0	ω	ω		>1	ω	ω	ω
φ	X	5>ί	5>ί	X		κ>Ί	>1
Ό		Λί	Λί				Λί
				cn	co
i—1				• ·
	>o	τ—1	ΟχΙ	co	CO	’χΓ	CO
co	Ή	«·	»·	i—)	t—f	* ·	• ·	• ·
v—1	1-1	CO	CO	1	I	co	O	o
*	X	r-*	t—1	a	>-	τ—i	Oxl	(N

• ·

Příklad 6: Optimalizace kultivačních podmínek

Tabulka 3A ukazuje účinek koncentrace substrátu exogenních volných mastných kyselin na pohlcení a konverzi produktu mastných kyselin v kvasinkách. Vyjadřuje se jako procento celkových extrahovaných kvasinkových lipidů. Ve všech případech malé množství exogenního substrátu (1 až 10 μΜ) vede k pohlcení malého množství substrátu mastných kyselin a ke tvoření produktu. Koncentrace volné mastné kyseliny v rozmezí 25 a 50 μΜ v kultivačním a indukčním médiu poskytuje nejvyšší procento tvořeného produktu mastných kyselin, zatímco koncentrace 100 μΜ a následující vysoké pohlcení se jeví tak, že snižuje nebo inhibuje desaturační aktivitu. Množství substrátu mastných kyselin vhodných pro kvasinky exprimující A12-desaturázu je za stejných kultivačních podmínek podobné, protože substrát, což je kyselina olejová, je endogenní kvasinková mastná kyselina. Použití kyseliny a-linolenové, jako přídavného substrátu pro pCGR-5 (Δ6) se produkuje očekávaný produkt kyselina stearidonová (Tabulka

3) .

V tabulce č. 3B se dobře ilustrovala zpětná vazba inhibice substrátu s vysokou koncentrací mastných kyselin, kde se porovnává rozmezí procent konverze substrátů mastných kyselin na jejich produkty. Ve všech případech koncentrace substrátu 100 μΜ v kultivačním médiu snižuje procento konverze na produkt. Pohlcení kyseliny α-linolenové je srovnatelné s jinými PUFA přidanými ve volné formě, zatímco procento přeměny Á6-desaturázou 3,8 až 17,5 % na produkt kyselinu stearidonovou je nejnižší ze všech testovaných substrátů (tabulka č. 3B). Účinek

Kultivačního média, jako je YPD (bohaté kultivační médium), proti minimálnímu kultivačnímu médiu obsahujícíc glukózu na rychlost konverze A12-desaturázy je dramatický.

V případě, že se pro kultivaci a indukci exprese Δ12desaturázy v kvasinkách, nejen, že poklesla rychlost konverze • · kyseliny olejové na linolenovou (tabulka č. 3B) , ale procento tvořené kyseliny linolenové také pokleslo o 11 % (tabulka č.

3A) . Účinek složení kultivačního média je také patrný v případě, že glukóza je přítomna v kultivačním médiu Δ6desaturázy, protože procento pohlcení substrátu se snížilo na koncentraci 25 μΜ (tabulka č. 3A) . Rychlost konverze však zůstává stejná a procento tvořeného produktu se snížilo s poklesem procenta glukózy.

Tabulka č. začleněných extraktu

3A: Účinek substrátů a přidaného produktu substrátu tvořeného na procento v kvasinkovém

Plazmid v	pCGR-2	PcGR-5	pCGR-5	pCGR-7
kvasince	(Δ15)	(Δ6)	(Δ6)	(Δ12)
Substrát/ produkt	18:2/a- 18 : 3	18 : 2/γ- 18 : 3	a- 18 :3/18:4	18:1*/18:2
1 μΜ sub.	ND	0,9/0,7	ND	ND
10 μΜ sub.	ND	4,2/2,4	10,4/2,2	ND
25 μΜ sub.	ND	11/3,7	18,2/2,7	ND
2 5 μΜΟ sub.	36,6/7,20	25,1/10,30	ND	6,6/15,80
50 μΜ sub.	53,1/6,50	ND	36,2/3	10,8/13+
100 μΜ sub.	60,1/5,70	62,4/40	47,7/1,9	10/24,8

Tabulka č. 3B: Účinek koncentrace substrátu v kultivačním médiu na procento konverze substrátu mastných kyselin na produkt v kvasinkových extraktech.

Plazmid v kvasinkách	pCGR-2 (Δ15)	pCGR-5 (Δ6)	pCGR-5 (Δ6)	pCGR-7 (Δ12)
Substrát —>produkt	18:2/a-18:3	18:2/γ—18:3	o-18 : 3/18 : 4	18:1*/18:2

1 μΜ sub.	ND	43,8	ND	ND
10 μΜ sub.	ND	36, 4	17,5	ND
25 μΜ sub.	ND	25,2	12,9	ND
25 μΜΰ sub.	16, 4D	29, ID	ND	70,50
50 μΜ sub.	10, 9D	ND	7,7	54, 6 +
100 μΜ sub.	8,7D	60	3,8	71,3

□ glukóza není obsažena v kultivačním médiu + kvasinková peptodnová půda (YPD) * 18:1 je endogenní kvasinkový lipid sub. je koncentrace substrátu ND neprovedlo se

Tabulka č. 4 ukazuje množství mastné kyseliny produkované rekombinantní desaturázou z indukovaných kvasinkových kultur v případě, že se použilo různé množství substrátu volných mastných kyselin. Stanovila se hmotnost mastných kyselin, protože celkové množství lipidů dramaticky kolísá, v případě, že se mění růstové podmínky, jako je přítomnost glukózy v kvasinkovém kultivačním a indukčním médiu. Aby bylo možné lépe stanovit podmínky, kdy rekombinantní desaturáza bude produkovat maximální produkt PUFA, testovalo se velké množství jednotlivých mastných kyselin. Nepřítomnost glukózy v kultivačním médiu redukuje množství linolenové kyseliny produkované A12-desaturázou. V případě A12-desaturázy množství celkových kvasinkových lipidů se v nepřítomnosti glukózy snížilo skoro o polovinu. Naopak, jestliže je v kvasinkovém růstovém médiu vhodném pro A6-desaturázu přítomna glukóza poklesla produkce kyseliny γ-linolenové skoro o polovinu, zatímco celkové množství produkovaných kvasinkových lipidů se přítomností/absencí glukózu nemění. Je možné, že glukóza slouží jako modulátor aktivity A6-desaturázy.

Tabulka č. 4: Mastná kyselina produkovaná z kvasinkových extraktů vyjádřená v pg.

Plazmid v kvasinkách (enzym)	pCGR-5 (Δ6)	pCGR-5 (Δ6)	pCGR-7 (Δ6)
produkt	γ-18 : 3	18 : 4	18:2*
1 μΜ sub.	1,9	ND	ND
10 μΜ sub.	5,3	4,4	ND
25 μΜ sub.	10,3	8,7	115,7
25 pMC sub.	29,6	ND	39Π

□ glukóza není obsažena v kultivačním médiu * 18:1 substrátem je endogenní kvasinkový lipid sub. je koncentrace substrátu

ND neprovedlo se

Příklad 7: Distribuce PUFA v kvasinkových lipidových frakcích

Tabulka č. 5 ukazuje pohlcení volných mastných kyselin a jejich nových produktů vytvořených v kvasinkových lipidech, které jsou rozdělený do hlavních lipidových frakcích. Celkový lipidový extrakt se připravil způsobem popsaným shora v textu. Lipidový extrakt se separoval na TLC deskách a frakce se identifikovaly porovnáním se standardy. Pruhy se posbíraly seškrábnutím a přidaly se vnitřní standardy. Frakce se pak ošetřily saponátem a metylovaly se, jak se uvádí shora v textu a podrobily se plynové chromatografii. Plynový chromatograf vypočítal množství mastné kyseliny porovnáním se standardem. Fosfolipidová frakce obsahuje nejvyšší množství substrátu a produktu PUFA vhodného pro aktivitu Δ6 -desaturázy. Je zřejmé, že substráty jsou pro desaturázy přijatelné ve fosfolipidové formě.

Tabulka č. 5. Distribuce mastných kyselin v různých kvasinkových lipidových frakcích vyjádřeno v pg » ·

Frakce mastné kyseliny	fosfolipid	diglycerid	Volná mastná kyselina	triglycerid	Ester cholesterolu
SC(pCGR-5) Substrát 18 : 2	166, 1	6,2	15	18,2	15, 6
SC(pCGR-5) Produkt γ- 18 : 3	61,7	1, 6	4,2	5, 9	1,2

SC = S. cerevisiae (plazmid)

Příklad 8: Další optimalizace kultivace a koexprese Δ6- a Δ12desaturáz

Hodnotily se růstové a indukční podmínky optimálních aktivit desaturáz v organizmu Saccharomyces cerevisiae. Vyvinul se kmen Saccharomyces cerevisiae (SC334)schopný produkovat kyselinu γ-linolenovou (GLA), aby se odhadla možnost produkce PUFA v kvasinkách. Geny Δ6- a A12-desaturáz z organizmu M. alpina se ko-exprimovaly v SC334. Exprese Δ12desaturáz přeměnila kyselinu olejovou (přítomnou v kvasinkách) na kyselinu linolenovou. Kyselina linolenová se používala jako substrát Δβ-desaturázy při produkci GLA. Produkované množství GLA je v rozmezí 5 až 8 % celkových mastných kyselin produkovaných v kulturách SC334 a rychlost konverze kyseliny linolenové na kyselinu γ-linolenovou je v rozmezí 30 až 50 %. Optimalizovala se teplotní indukce a také se stanovil účinek změny hostitelského kmene a upstream promotorové sekvence na expresi genů Δ6- a A12-desaturázy (MA524 a MA648)

Konstrukce plazmídů

Klonování pCGR5 stejně jako pCGR7 se popisuje shora v textu. Aby se zkonstruoval pCGR9a a pCGR9b geny Δ6- a Δ12desaturázy se amplifikovaly za použití následujícíc sady primerů. Primery pRDSl a 3 mají restrikční místa Xhol a primery pRDS2 a 4 mají restrikční místa Xbal (označená tučným písmem) . Tyto sekvence primerů se prezentují jako SEQ ID NO: 15 až 18.

I. amplifikační primery Δβ-desaturázy

a. pRDSl TAC CAA GTC GAG AAA ATG GCT GCT GCT CCC AGT GTG AGG

b. pRDS2 AAC TGA TCT AGA TTA CTG CGC CTT ACC CAT CTT GGA GGC

II. amplifikační primery A12-desaturázy

a. pRDS3 TAC CAA CTC GAG AAA ATG GCA CCT CCC AAC ACT ATC GAT

b. pRDS4 AAC TGA TCT AGA TTA CTT GAA AAA GAC CAC GTC TCC

Konstrukce pCGR5 a pCGR7 se používaly jako templátová DNA při amplifikaci genů Δ6- a A12-desaturázy. Amplifikované produkty se štěpily restrikčními enzymy Xbal a Xhol za vzniku koherentních konců. PCR amplifikovaná Δβ-desaturáza s konci Xhol-Xbal klonovaná do pCGR7se také štěpila restrikčními enzymy Xhol-Xbal. Tento postup umístil Δβ-desaturázu za Δ12desaturázu, přičemž exprese se řídí indukovatelným protmotorem GAL1. Tato konstrukce se označila pCGR9a. Podobně jako konstrukce pCGR9b také A12-desaturáza s konci Xhol-Xbal se klonovala do restrikčních míst Xhol-Xbal pCGR5. V pCGR9b Δ12desaturáza byla za genem Δβ-desaturázy daleko od promotoru GAL.

Aby vznikla konstrukce pCGRIO, se vektor pRS425, který obsahuje konstitutivní promotor glyceraldehyd-3fosfátdehydrogenázy (GPD), štěpil restrikčním enzymem BamHI a pCGR5 se štěpil restrikčními enzymy BamHI-XhoI, přičemž se uvolňuje gen Δβ-desaturázy. Tento fragment Δβ-desaturázy a pRS425 štěpený BamHI se vyplnil za použití Klenow polymerázy za vzniku tupých konců. Oba fragmenty se ligovaly a vznikl pCGRIOa a pCGRIOb obsahující gen Δβ-desaturázy v sense a antísense orientaci. Aby se vytvořila konstrukce pCGRll a pCGR12, z pCGR5 a pCGR7 se izolovaly geny Δ6- a Δ12desaturázyza použití dvojího štěpení restrikčními enzymy EcoRI-Xhol. EcoRI-Xhol fragmenty Δ6- a A12-desaturázy se klonovaly do vektoru pYX242 štěpeného restrikčními enzymy EcoRI-Xhol. Vektor pYX242 má promotor TP1 (kvasinkový gen), který umožňuje konstitutivní expresi.

Transformace a exprese v kvasinkách

Do různých hostitelských kmenů Saccharomyces cerevisiae se zavedly různé kombinace pCGR5, pCGR7, pCGR9a, pCGR9b, pCGRlOa, pCGRll a pCGRl2. Transformace se provedla podle protokolu PEG/LiAc (Methods in Enzymology Vol. 194 (1991): 186-187).

Trans formanty se vybraly anesením na plotny, které obsahují syntetické médium, kterému chybí vhodná aminokyselina. pCGR5, pCGR7, pCGR9a a pCGR9b se mohou izolovat na selekčním médiu, které neobsahuje uráčil. Konstrukce pCGRIO, pCGRll a pCGR12 se mohou izolovat na selekčním médiu, jenž neobsahuje leucin. Kultivace kultur a analýza mastných kyselin se uskutečnila podle, jak se popisuje v příkladu 5 shora v textu.

Produkce GLA

Produkce GLA vyžaduje expresi dvou enzymů (Δ6- a Δ12desaturázy), která není přítomna v kvasinkách. Aby se dosáhlo exprese těchto enzymů v optimální síle, začlenily se následující konstrukce nebo jejich kombinace do různých hostitelských kmenů:

1) pCGR9a/SC334

2) pCGR9b/SC334

3) pCGRlOa a pCGR7/SC334

4) pCGRll a pCGR7/SC334

5) pCGR12 a pCGR5/SC334

6) pCGRlOa a pCGR7/DBY746

7) pCGRlOa a pCGR7/DBY746 ·· • · »· * ·

Konstrukce pCGR9 obsahuje oba geny Δ6- a A12-desaturázy, které řídí indukovatelný promotor GAL. Hostitelské buňky SC334 transformované touto konstrukcí nevykazují žádnou akumulaci celkových mastných kyselin (Obrázek č. 6A a B, dráha 1). Avšak, když geny Δ6- a' A12-desaturázy jsou jednotlivě řízeny promotorem GAL, kontrolní konstrukce jsou schopny exprimovat Δ6- a A12-desaturázu, což je zřejmé z přeměny jejich substrátu na produkty. Gen A12-desaturázy v pCGR9a se exprimuje, což je patrné z konverze 18:1ω9 až 18:2ω6 v pCGR9a/SC334, zatímco gen Δβ-desaturázy není exprimován/není aktivní, protože 18:2ω6 se nemění na 18:3ω6 (obrázek č. 6A a B, dráha 1).

Konstrukce pCGR9b také zahrnuje geny obou desaturáz, které jsou řízeny promotorem GAL, ale ve srovnání s pCGR9a to je v opačném pořadí. V tomto případě v kulturách pCGR9b/SC334 je možné detekovat velmi malé množství GLA (<1%). Exprese Δ12desaturázy je také velmi slabá, což je zřejmé z nízkého procentického zastoupení 18:2ω6 v celkových mastných kyselinách (Obrázek č. 6A a B, dráha 1).

Za účelem testování, zda exprese obou enzymů je řízena nezávislými promotory zesiluje produkci GLA, gen Δβ-desaturázy se klonoval do vektoru pRS425. Konstrukce pCGRIOa obsahujegen a exprese je řízena

PCGRlOb obsahuje gen Δ6a slouží jako negativní

Δβ-desaturázy ve správné orientaci, konstitutivním promotorem GPD. desaturázy v opačné orientaci kontrola. Buňky pCGR10a/SC334 ve srovnání s pCGR9a produkovaly podstatně vyšší množství GLA (5% celkových mastných kyselin, obrázek č. 6, dráha 3) . Geny Δ6- a A12-desaturázy se exprimovaly ve velkém množství, protože přeměna 18:1ω9—>18:2ω6 byla 65%, zatímco konverze 18: 2ω6-»18: 3ω6 (Δβ-desaturázy) byla 30 % (obrázek č. 6, dráha 3). Jak se očekávalo negativní kontrola pCGR10b/SC334 nevykazuje produkci žádné GLA.

• · • · ·

Aby se dosáhlo optimalizace produkce GLA, geny Δ6- a Δ12desaturázy se zavedly do vektoru pYX242 za vzniku pCGRll a pCGR12. Vektor pYX242 umožňuje konstitutivní expresi promotorem TPl (Alber, T. and Kawasaki, G (1982) . J. Mol. And Appl. Genetics 1: 419) . Zavedením pCGRll a pCGR7 do SC334 vedlo k produkci 8 % GLA s celkových mastných kyselin SC334.

Rychlost konverze 18:1ω9—>18:2ω6 a 18:2ω6—>18:3ω6 bylo přibližně 50 % a 44 % (obrázek č. 6A a B, dráha 4). Přítomnost pCGR12 a pCGR5 v SC334 vedlo k 6?6 % GLA v celkových mastných kyselinách s rychlostí konverze přibližně 50 % v případě

18:1ω9 na 18:2ω6 a 18:2ω6 na 18:3ω6 (obrázek č. 6A a B, dráha 5) . Tak ačkoli množství GLA v celkových mastných kyselinách je vyšší v kombinaci konstrukcí pCGRll/pCGR7, rychlost konverze substrátu na produkt byla lepší pro kombinaci pCGR12/pCGR5.

Za účelem stanovení, zda hostitelský kmen zvýší produkci GLA, pCGRIOa a pCGR7 se zavedly do hostitelského kmene BJ1995 a DBY746 (který se získal z instituce Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkeley, CA 94720. Genotyp kme,ne DBY746 je Mata, his3-Al, leu2-3, leu2-112, ura3-32, trpl-289, gal) . Výsledky se uvádějí na obrázku č. 7. Změna hostitelského kmene na BJ1995 neprokázala produkci GAL, protože množství GLA bylo pouze 1,31 % celkových mastných kyselin a rychlost konverze 18:1ω9 na 18:2ωβ byla přibližně 17 % v kmeni BJ1995. V kmeni DBY746 se nepozorovala žádná produkce GLA a konverze 18:1ω9 na 18:2ω6 byla velmi nízká (u kontrolního kmene byla nižší než 1 %), což naznažuje, že kofaktor nutný pro expresi A12-desaturázy nemusí být v DB746 přítomen (obrázek č. 7, dráha 2) .

Za účelem stanovení vlivu teploty na produkci GLA, se kultury SC334 obsahující pCGRIOa a pCGR7 kultivovaly při teplotě 15 °C a 30 °C. Největší množství GLA se zjistilo v kulturách kultivovaných a indukovaných pří teplotě 15 °C, ve srovnání s kulturami rostoucími při teplotě 30 °C (4,23% • · verzus 1,68 %) . To bylo způsobeno nižší rychlostí konverze 18:2ω6 na 18:3ω6 při teplotě 30 °C (11,6 % verzus 29 % při teplotě 15 °C) , navzdory vyšší konverze 18:1ω9 na 18:2ωβ (65% verzus 60% při teplotě 30 °C (obrázek č. 8) . Tyto výsledky naznačují, že Δ12- a Δβ-desaturázy mohou vykazovat různé optimální teploty exprese.

Z různých v experimentech testovaných parametrů nejpodstatnější vliv na expresy desaturázy měly teplota kultivace, kvasinkový hostitelský kmen a komponenty kultivačního média, zatímco načasování přidání substrátu a koncentrace indukčního činidla podstatně neovlivňuje expresi desaturázy.

Tyto data ukazují, že dvě DNA kódující desaturázy, které mohou přeměnit LA na GLA nebo kyselinu olejovou na LA se mohou izolovat z organizmu Mortierella alpina a mohou se exprimovat buď jednotlivě nebo v kombinaci v heterogenním systému a používat se k produkci poly-nenasycených mastných kyselin z dlouhým řetězcem. Příkladem je produkce GLA z kyseliny olejové tím, že se v kvasinkách exprimuje Δ12- a Δ6desaturáza.

Příklad 9: Identifikace homologů s Δ5- a Δδ-desaturázou organizmu M. alpina

Sekvence nukleové kyseliny, která kóduje putativní Δ5desaturázu se identifikovala prostřednictvím průzkumu TBLASTIN exprimované sekvence tag databází prostřednictvím NCBI, kde se jako dotaz použijí aminokyseliny 100 až 446 klonu Ma29. Aby se zabránilo vzniku homologií založených na části cytochromu b5 na N-konci desaturázy, použila se zkrácená část sekvence Ma29. Dedukovaná aminokyselinová sekvence odvozená z Dictyostelium discoideum (číslo uložení #C25549) ukazuje velmi podstatnou homologii s Ma29. Také vykazuje menší, ale stále podstatnou homologii s Ma524. Sekvence DNA se prezentuje jako SEQ ID NO:

• · • «

19. Aminokyselinová sekvence se prezentovala jako SEQ ID NO:

20.

Příklad 10: Identifikace Δ5- a Δβ-homologů organizmu M. alpina v jiných organizmech produkujících PUFA.

Aby se našly desaturázy, které se podílejí na produkci PUFA, z celkové RNA izolované z Phaeodactylum tricornutum se zkonstruovala se cDNA knihovna. cDNA knihovna založená na plazmidu se zkonstruovala v pSPORTl (GIBCO-BRL) podle instrukcí výrobce za použití běžně dostupné sady (GIBCO-BRL). Náhodné klony cDNA e sekvenovaly a sekvence nukleové kyseliny, které kódují putativní Δ5- nebo Δβ-desaturázu se identifikovaly průzkumem BLAST databází a porovnáním sekvencí Ma29 a Ma524. Z knihovny Phaeodactylum se identifikoval jeden klon s homologii k Ma29 a Ma524, nazval se 144-011-B12. Sekvence DNA je přítomna jako SEQ ID NO:21. Aminokyselinová sekvence je přítomna jako SEQ ID NO: 22.

Příklad 11: Identifikace Δ5- a Δβ-homologů organizmu M. alpina v jiných organizmech produkujících PUFA.

Aby se našly desaturázy, které se podílejí na produkci PUFA, z celkové RNA izolované z Schizochytrium sp. se zkonstruovala se cDNA knihovna. cDNA knihovna založená na plazmidu se zkonstruovala v pSPORTl (GIBCO-BRL) podle instrukcí výrobce za použití běžně dostupné sady (GIBCO-BRL). Náhodné klony cDNA e sekvenovaly a sekvence nukleové kyseliny, které kódují putativní Δ5- nebo Δβ-desaturázu se identifikovaly průzkumem BLAST databází a porovnáním sekvencí Ma29 a Ma524.

Z knihovny Schizochytrium se identifikoval jeden klón s homologii k Ma29 a Ma524, nazval se 81-23-C7. Tento klón obsahuje inzert o velikosti přibližně 1 kb. Z každého konce klonu se získala částečná sekvence za použití univerzálních forward a reverzních sekvenačních primerů. Sekvence DNA • · · · · · • · · · · • · · · · • · ··· ··· z forward primeru je přítomna jako SEQ ID NO:23. Peptidová sekvence je přítomna jako SEQ ID NO: 24. Sekvence DNA z reverzního primeru je přítomna jako SEQ ID NO: 24. Sekvence DNA z reverzního primeru je přítomna jako SEQ ID NO:25. Aminokyselinová sekvence z reverzního primeru je přítomna jako SEQ ID NO: 26.

Příklad 12: Sekvence genu lidské desaturázy

Na základě homologie mezi sekvencemi lidské cDNA a sekvencemi genu desaturázy Mortierella alpina se sekvence genu lidské desaturázy potencionálně v biosyntéze polynenasycených mastných kyselin izolovala zahrnutá s dlouhým řetězcem. kterých

Našly se tři konzervované histidinové boxy, se vi, jsou konzervativní mezi desaturázami vázanými na membrány. Stejně jako u jiných desaturáz výzaných na membránu konečný motiv histidinového boxu HXXHH je QXXHH. Aminokyselinová sekvence putativních lidských desaturáz vykazuje homologii s Δ5, Δ6 a A12-desaturázami.

cDNA sekvence Δ5- a Δβ-desaturáz se použily pro průzkum databáze LifeSeq instituce Incyte Pharmaceuticals, lne., Palo Alto, California 94304. Sekvence A5-desaturázy se rozdělila do fragmentů 1) aminokyselina č. 1 až 150, 2) aminokyselina č. 151 až 300 a 3) aminokyselina č. 301 až 446. Sekvence Δβdesaturázy se rozdělila do tří fragmentů 1) aminokyselina č. 1 až 150, 2) aminokyselina č. 151 až 300 a 3) aminokyselina č. 301 až 457. Tyto polypeptidové fragmenty se zkoumaly proti databázi za použití algoritmu „tblastn dotaz na sekvenci proteinu detabázi dynamicky překládanou do všech šesti čtecích rámců (obou řetězců).

Polypeptidové fragmenty 2 a 3 Δ5- a Δβ-desaturáz organizmu M. alpina vykazuje homologii se sekvencemi CloneID, jak je uvedeno v tabulce č. 6. CloneID reprezentuje jednotlivé ze obsahuj e sekvenční

Tento algoritmus pro nukleotidovou sekvence z databáze Incyte LifeSeq. Po té co se zveřejnily • · výsledky „tblastn informace klonech se hledaly za podmínek přísnost >/= 50 a skóre produktu je </=100 při různých číslech CloneiD. „Cloně Information Results uvádějí informace zahrnující ClusterID, CloneiD, Library, HitID, popis Hit. Číslo ClusterID ukazuje informace o všech klonech, které patří do uvedeného ClusterID. Příkaz zařazení zařazuje všechny CloneiD, které obsahují ClusterID. V případě zařazení GCG (Genetics Computer Group, University Wísconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53704) se používají následující nastavení:

Velikost slova	7
Minimum překryvu	14
Přísnost	0,8
Minimum shody	14
Maximum mezer	10
Významnost mezer	8
Významnost délky	2
Výsledky uspořádání	GCG

základě sekvenčních informací v CloneiD. „Kontig je uspořádání sekvencí DNA založené na oblastech homologie mezi těmito sekvencemi. Na základě seřazených sekvencí do kontigu se vytvořila nová sekvence. Identifikoval se kontig obsahující CloneiD a nejednoznačné místa sekvence se editovala na základě seřazení CloneiD (SEQ ID NO:27 až SEQ ID NO: 32) za vzniku nej lepší možné sekvence. Postup se opakoval v případě všech šesti CloneiD uvedených v tabulce č. 6. Tímto způsobem vzniká pět jedinečných kontigů. Editované sekvence 5 kontigů se programu

Michigan konsensus sekvence. Kontig 2511785 se překrývá s kontigem 3506132 a tento nový kontig se nazývá 2535 (SEQ ID NO: 33) . Kontigy z programu Sequencher se zkopírovaly v programu Sequence Analysis software package GCG.

Sequencher (Gene Codes 48 105) . Sestavily se přenesly do softwarového Corporation, Ann Arbor,

Každý kontig se přeložil do všech šesti čtecích rámců v proteinových sekvencích. Sekvence Δ5(ΜΑ29) a Δ6(ΜΑ524) M. alpina se porovnaly s každým přeloženým kontigem za použití průzkumu FastA (průzkum podobnosti mezi dotazovanou sekvencí a skupinou sekvencí stejného typu (nukleová kyselina nebo protein) podle Pearson a Lipman). Homologie mezi těmito sekvencemi naznačuje otevřené čtecí rámce každého kontigu. Homologie mezi Δ5 a Δ6 M. alpina s kontigy 2535 a 3854933 se použily k vytvoření konečného kontigu nazvaného 25358a. Obrázek č. 13 je párování FastA konečného kontigu 253538a a MA29 a obrázek 14 je párování FastA konečného kontigu 25358a a MA524. Sekvence DNA různých kontigů jsou přítomny v sekvencích SEQ ID NO:2ý až SEQ ID NO: 33. Různé peptidové sekvence jsou zobrazeny v SEQ ID NO:34 až SEQ ID NO: 40.

Ačkoli otevřený čtecí rámec se vytvořil spojováním dvou kontigů, kontig 2535 ukazuje, že zde existuje na začátku kontigu jediná sekvence, která se s kontigem 3854933 nepáruje. Proto je možné, že tyto kontigy vznikly z nezávislé desaturázy jako lidské geny.

Kontig 253538a obsahuje otevřený čtecí rámec kódující 432 aminokyselin. Začíná Gin (CAG) a končí stop kodonem (TGA). Kontig 253538 se spojuje se sekvencemi Δ5 a Δ6 M. alpina, což naznačuje, že jde buď o libovolnou desaturázu nebo o jiné známé desaturázy, které vzájemně sdílí homologii. Tyto jednotlivé kontigy uvedené v oabulce 18 stejně jako intermediální kontig 2535 a konečný kontig 253538a se mohou využívat k izolaci celých genů lidských desaturáz.

Použití lidských desaturáz

Tyto lidské sekvence se mohou exprimovat v kvasinkách a v rostlinách za využití postupů popsaných v příkladech. V případě exprese v savčích buňkách a v transgenních zvířatech tyto geny mohou poskytovat odchylku kodonu. Tyto lidské • · sekvence se mohou také použít pro identifikaci příbuzných sekvencí desaturáz.

Tabulka č. 6

Sekce desaturáz	CloneID z databáze LifeSeq	Klíčové slovo
151-300 Δ5	3808675	Desaturáza mastné kyseliny
301-446 Δ5	354535	Δ6
151-300 Δ6	3448789	Δ6
151-300 Δ6	1362863	Δ6
151-300 Δ6	2394760	Δ6
301-457 Δ6	3350263	Δ6

Příklad 13:

I. Kojenecké výživy

A. Sojový výživa Isomil® obsahující železo

Použití: Používá se jako nápoj pro kojence, děti a dospělé s alergií nebo citlivostí na kravské mléko. Potrava pro pacienty s poruchami, kvůli, kterým nelze podávat laktózu: nedostatečnost laktázy, netolerance k laktóze a galaktosemie. Rysy:

• Obsahuje sojový proteinový izolát, aby se předešlo symptomům alergie nebo citlivosti na protein kravského mléka.

• Výživa neobsahuje laktózu, čímž se předejde průjmu spojeným s laktózou.

• Nízká osmolalíta (240 mOsm/kg vody) redukuje nebezpečí osmotického průjmu.

• Duální sacharidy (z kukuřice a sacharóza), které se používají pro zvýšení absorpce sacharidů a omezení nebezpečí překročení absorpční kapacity poškozených střev.

• » • · « » · · · · · ♦ · · • v · · · * · · · η o ,·»»· *····«»· ' ····· · · ««· · ♦ ···»··· · · ·· • 1,8 mg železa (ve formě síranu železnatého) na 100 kalorií pomáhá předcházet nedostatečnosti železa.

• Obsahuje doporučenou dávku vitaminů a minerálů.

• Obsahuje rostlinné oleje, které poskytují doporučené množství podstatných mastných kyselin.

• Výživa má mléčně bílou barvu, konzistenci podobnou mléku a příjemné aroma.

Složky: (Pareve, ) 85 % vody, 4,9 % kukuřičného sirupu, 2,6 % cukru (sacharóza), 2,1 % sojový proteinový izolát, 1,4 % kokosový olej, 0,15 % citrát vápenatý, 0,11 % tribazický fosforečnan vápenatý, citrát draselný, monobazický fosforečnan draselný, chlorid draselný, mono- a diglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, L-methionin, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan draselný, chlorid sodný, cholinchlorid, taurine, síran železitý, m-inositol, alfatokoferylacetát, sulfát zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, jodid draselný, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

B. Sojová výživa Isomyl® DF, která se aplikuje v případě průjmu

Použití: Vhodná pro krátkodobou aplikaci v případě průjmů u kojenců a batolat.

Rysy:

• První kojenecká výživa, která obsahuje přidanou vlákninu ze sóji a která se aplikuje specificky během průjmů.

• Na základě klinické studie se prokázalo, že redukuje trvání kašovité, vodnaté stolice během středně těžkých a těžkých stavů průjmu u kojenců.

• Uspokojuje nutriční potřeby kojenců.

• Sojový proteinový izolát s přidaným L-methioninem uspokojuje nebo překračuje požadavky kojenců na všechny podstatné aminokyseliny.

• Přípravek neobsahuje laktózu, čímž se předchází průjmům spojeným s laktózou.

• Nízká osmolalita (240 mOsm/kg vody) redukuje nebezpečí osmotického průjmu.

• Duální sacharidy (kukuřičný sirup a sacharóza), které se používají pro zvýšení absorpce sacharidů a omezení nebezpečí překročení absorpční kapacity poškozených střev.

• Splňuje nebo překračuje množství vitaminů a minerálů doporučených Committee on Nutrition of the American Academy of Pediatrics.

• 1,8 mg železa (ve formě síranu železnatého) na 100 kalorií pomáhá předcházet nedostatečnosti železa.

• Obsahuje rostlinné oleje, které poskytují doporučené množství podstatných mastných kyselin.

Složky: (Pareve, ) 86 % vody, 4,8 % kukuřičného sirupu, 2,5 % cukru (sacharóza), 2,0 % sojový proteinový izolát, 2,1 % sojového oleje, 1,4 % kokosový olej, 0,77 % sojové vlákniny, vápenatý, 0,11 i ϊ tribazický fosforečnan citrát draselný, monobazický fosforečnan

0,12 % vápenatý, draselný, lecitin, citrát

0,10 chlorid draselný, mono- a diglyceridy, sojový karagen, kyselina askorbová, L-methionin, chlorid hořečnatý, díbazícký fosforečnan draselný, chlorid sodný, cholinchlorid, taurine, síran železitý, m-inositol, alfatokoferylacetát, síran zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, jodid draselný, fylochinon, biotín, selenit sodný, vitamin D3 a cyanokobalamin.

C. Sojová výživa Isomil® SF se železem bez sacharózy

Použití: Jako nápoj pro kojence, děti a dospělé s alergií nebo citlivostí na kravské mléko. Potrava pro pacienty s poruchami, kvůli, kterým nelze podávat laktózu: nedostatečnost laktázy, netolerance k laktóze a sacharózu.

Rysy:

• Obsahuje sojový proteinový izolát, aby se předešlo symptomům alergie nebo citlivosti na protein kravského mléka.

• Výživa neobsahuje laktózu, čímž se předejde průjmu spojeným s laktózou (zdroj sacharidů je Polycose® Glucose Polymers).

• Neobsahuje sacharózu, čímž je vhodná pro pacienty, kteří netolerují sacharózu.

• Nízká osmolalita (180 mOsm/kg vody) redukuje nebezpečí osmotického průjmu.

• 1,8 mg železa (ve formě síranu železnatého) na 100 kalorií pomáhá předcházet nedostatečnosti železa.

• Obsahuje doporučenou dávku vitaminů a minerálů.

• Obsahuje rostlinné oleje, které poskytují doporučené množství podstatných mastných kyselin.

• Výživa má mléčně bílou barvu, konzistenci podobnou mléku a příjemné aroma.

Složky: (Pareve) 75 % vody, 11,8 % hydrolyzovaného kukuřičného škrobu, 4,1 % sojového oleje, 4,1 % sojový proteinový izolát, 2,8 % kokosový olej, 1,0 % modifikovaného kukuřičného škrobu, 0,38 % tribazický fosforečnan vápenatý, 0,17 % citrát draselný, 0,13 % chlorid draselný, mono- a diglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, L-methionin, chlorid hořečnatý, uhličitan vápenatý, chlorid sodný, cholinchlorid, taurine, síran železitý, m-inositol, alfa-tokoferylacetát, sulfát zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, jodid draselný, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

« ·

D. Sojová výživa Isomyl®20 se železem, (pro přímou konzumaci) 20 kalorií na 0,0284 1

Použití: v případě, že je nutná sojová výživa

Složky: (Pareve, ) 85 % vody, 4,9 % kukuřičného sirupu, 2,6 % cukru (sacharóza), proteinový izolát, vápenatý, 0,11 %

2,1 % sojového oleje, 1,9 % sojový

1,4 % kokosový olej, 0,15 % citrát tribazický fosforečnan vápenatý, citrát draselný, monobazický fosforečnan draselný, chlorid draselný, mono- a diglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, L-methionin, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan draselný, chlorid sodný, cholinchlorid, taurine, síran železitý, m-inositol, alfa-tokoferylacetát, síran zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, jodid draselný, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

E. Kojenecká výživa Similac®

Použití: v případě, že je potřeba umělá kojenecká výživa: jestliže je nutné přerušit krmení mateřským mlékem před dosažením jednoho roku dítěte, jestliže je nutno doplnit kojení. Může se použít jako krmení, jestliže není možné krmení mateřským mlékem.

Rysy:

• Obsahuje protein vhodné kvality a množství zaručující dobrý růst. Protein je denaturován teplem, což redukuje nebezpečí krvácení v konečníku spojené s podáváním mléka.

• Obsahuje tuk ze směsi rostlinných olejů (dvakrát homogenizovaných), poskytuje kyselinu linolenovou, která je jednoduše absorbovatelná.

• Obsahuje sacharidy, jako je laktóza v poměru, který je podobný jako u lidského mléka.

• Nízký obsah renálních rozpuštěných látek, což minimalizuje stres vyvíjejících se orgánů.

• Existuje se ve formě prášku, koncentrovaného roztoku a ve formě vhodné pro přímé použití.

Složky: ( -D) voda, netučné mléko, laktóza, sojový olej, kokosový olej, mono- a diglyceridy, sojový lecitin, karagen, kyselina askorbová, cholínchloríd, taurine, m-inositol, alfatokoferylacetát, síran zinečnatý, niacinamid, síran železnatý, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, ríboflavín, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D₃ a cyanokobalamin.

F. Kojenecká výživa pro předčasně narozené děti se železem Similac®NeoCare

Použití: Vhodné pro předčasně narozené kojence, které vyžadují po propuštění z nemocnice speciální výživu. Similac NeoCare je nutričně kompletní výživa vyvinutá pro předčasně narozené kojence, která obsahuje další kalorie, protein, vitaminy a minerály potřebné pro vyvolání růstu a podporu vývoje.

Rysy:

• Redukuje potřebu kalorických a vitaminových doplňků. Ve srovnání s popsanou standardní výživou (20 kalorií na 0,0284 1) obsahuje více kalorií (22 kalorii na 0,0284 1) .

• Obsahuje vysoce absorbovatelnou směs tuků s triglyceridy se středně dlouhými řetězci (MCT olej), které pomáhají uspokojit speciální trávicí potřeby předčasně narozených koj enců.

• Na 100 kalorií obsahuje vyšší množství proteinu, vitaminů a minerálů, aby se zvýšila počáteční dávka nutrientů podávaná v nemocnici.

• Obsahuje více vápníku a fosforu, což umožňuje mineralizaci kostí.

Složky: -D pevné částice kukuřičného sirupu, netučné mléko, laktóza, syrovátkový proteinový koncentrát, sojový olej, slunečnicový olej, frakcionovaný kokosový olej (triglyceridy se středně dlouhými řetězci), citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, uhličitan vápenatý, kyselina askorbová, chlorid hořečnatý, chlorid draselný, chlorid sodný, taurine, síran železitý, m-inositol, alfa-tokoferylacetát, síran zinečnatý, L-karnitin, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, riboflavin, beta-karoten, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D3 a cyanokobalamin.

G. Lidské mléko obohacené nízkým obsahem železa Similac Natural Care ve formě pro přímé použití, 24 kal. na 0,0284 1

Použití: Výrobek je určen pro smíchání s lidským mlékem nebo pro aplikaci, jako alternativa lidského mléka u kojenců s nízkou porodní hmotností.

Složky: : -D voda, netučné mléko, hydrolyzovaný kukuřičný škrob, laktóza, syrovátkový proteinový koncentrát, sojový olej, slunečnicový olej, frakcionovaný kokosový olej (triglyceridy se středně dlouhými řetězci), kokosový olej, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, uhličitan vápenatý,mono- a diglyceridy, sojový lecitin,karagen, cholin chlorid, taurine, m-inositol, alfa-tokoferylacetát, síran zinečnatý, L-karnitin, chlorid draselný, pantotenát vápenatý, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, kyselina folová, síran hořečnatý, fylochinon, biotin, selenit sodný, vitamin D3 a cyanokobalamin.

• ·

Do těchto výživ je možné přidat PUFA podle vynálezu nebo je možné jimi nahradit některé složky uvedených výživ.

II. Výživy

A. ENSURE®

Použití: ENSURE je tekutá výživa obsahující malé množství zbytků připravená primárně jako orální nutriční doplněk, který se požívá s jídlem nebo mezi jednotlivými jídly nebo ve vhodném množství jako náhražka jídla. ENSURE neobsahuje laktózu a lepek a je vhodný pro použití při upravených dietách, jako jsou diety s nízkým obsahem cholesterolu. Ačkoli se primárně podává jako orální doplněk, může se aplikovat hadičkou.

Stav pacienta:

• Pacienti s upravenou dietou • Pacienti vysokého stáří se specifickými požadavky na potravu • Pacienti, kteří nedobrovolně ztrácí hmotnost • Pacienti po nemoci nebo po chirurgickém zákroku • Pacienti, kteří potřebují dietu s malým obsahem zbytků.

Složky: -D voda, cukr (sacharóza), maltodextrin (kukuřičný), kaseinát vápenatý a sodný, slunečnicový olej, sojový proteinový izolát, sojový olej, kanolový olej, draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, citrát citrát sodný, umělé dibazický fosforečnan horečnatý, chlorid horečnatý, přísady, chlorid sodný, sojový lecitin, cholinchlorid, kyselina askorbová, karagen, síran zinečnatý, síran železnatý, alfa-tokoferylacetát, želatinová guma, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran horečnatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, molybdát sodný, chlorid chrómu, biotin, jodid draselný, selenát sodný.

B. ENSURE®BARS

Použití: ENSURE BARS je celková, vyvážená výživa, která se používá jako doplněk mezi jednotlivými jídly nebo se podává s jídlem. Je lahodnou, nutričně bohatou alternativou jiných zákusků. ENSURE BAR obsahuje méně než 1 g laktózy v jedné tyčince (typ Chocolate Fudge Brownie neobsahuje lepek, typ Honey Graham Crunch obsahuje lepek).

Stav pacienta:

• Pacienti, kteří potřebují více kalorií, proteinů, vitaminů a minerálů.

• Zvláště vhodné pro lidi, kteří nepřijímají dostatek kalorií a nutrientů.

• Vhodné pro lidi, kteří jsou schopni žvýkat a polykat • Není vhodné pro lidi alergické na burské ořechy a jakoukoliv alergií na ořechy.

Složky:

Typ Honey Graham Crunch obsahuje kukuřičný sirup s vysokým obsahem fruktózy, sojový proteinový izolát, hnědý cukr, maltodextrin (kukuřičný), křupavá rýže (drcená rýže, cukr (sacharóza), sůl (chlorid sodný) a slad), ovesné otruby, částečně hydrogenované olej ze semen bavlníku a sojový olej, sojové polysacharidy, glycerin, syrovátkový proteinový koncentrát, polydextróza, fruktóza, kaseinát vápenatý, kakaový prášek, umělé příchutě, kanolový olej, slunečnicový olej, netučné sušené mléko, syrovátkový prášek, sojový lecitin, kukuřičný olej. Tyto tyčinky se vyrábějí v továrnách, kde se zpracovávají ořechy.

Vitamíny a minerály:

Tribazický fosforečnan vápenatý, dibazický fosforečnan draselný, oxid hořečnatý, sůl (chlorid sodný), chlorid draselný, kyselina askorbová, fosforečnan železitý, alfatokoferylacetát, niacinamid, oxid zinečnatý, pantotenát

vápenatý, glukonát mědňatý, síran manganatý, riboflavin, betakaroten, pyridoxinhydrochlorid, dusičan thiaminu, kyselina folová, biotin, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, molybdenan sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Typ Honey Graham Crunch : Zdroj proteinů proteinového izolátu a mléčných proteinů. Sojový proteinový izolát

Mléčné proteiny

Tuk:

: Zdroj tuku je směs částečně a semen bavlníku, slunečnicového a lecitinu.

sóji a semen bavlníku76 %

Typ Honey Graham Crunch hydrogenovaného oleje sóji kukuřičného oleje a sojového Částečně hydrogenovaný olej slunečnicový olej olej kanoly kukuřičný olej sojový lecitin je směs sojového %

%

Sacharidy:
Typ Honey Graham Crunch : Zdroj sacharidů	je kombinace
kukuřičného sirupu s vysokým obsanem fruktózy,	hnědý cukr,
maltodextrin, med, křupavá rýže, glycerin, sojové
polysacharidy a ovesné otruby. kukuřičný sirup s vysokým obsahem fruktózy	24 %
hnědý cukr	21 %
maltodextrin	12 %
med	11 %
křupavá rýže	9 %
glycerin	9 %
sojový polysacharid	7 %
ovesné otruby	7 %

C. ENSURE® HIGH PROTEIN

Použití: ENSURE® HIGH PROTEIN je koncentrovaná výživa v kapalném stavu s vysokým obsahem proteinů určená pro lidi, kteří vyžadují nadbytečný přísun kalorií, proteinu, vitamínů a minerálů. Může se aplikovat orálně, jako nutriční doplněk mezi jednotlivými jídly nebo se podává s jídlem. V určitém množství může nahradit jídlo. ENSURE® HIGH PROTEIN neobsahuje laktózu ani lepek a je vhodný pro aplikaci lidem po operaci, po zlomeninách krčku a pacientům, kde je nebezpečí vředů.

Stav pacienta:

• Přípravek je vhodný pro pacienta, který potřebuje větší přísun kalorií, proteinu, vitamínů, minerálů, jako jsou pacienti po chirurgickém zákroku nebo fraktuře krčku, pacienti trpícími tlakovými vředy a pacienti, kde se aplikuje dieta s nízkým obsahem cholesterolu.

Rysy:

• Nízký obsah nasycených tuků • Obsahuje 6 g celkového tuku a méně než 5 mg cholesterolu na jedno balení • Bohatá a jemná chuť • Skvělý zdroj proteinů, vápníku a jiných podstatných vitamínů a minerálů • Vhodné při dietě s nízkým obsahem cholesterolu • Neobsahuje laktózu, snadno se tráví.

Složky:

Typ Vanilla Supreme: - -D voda, cukr (sacharóza), maltodextrin (kukuřičný), kaseinát vápenatý a sodný, slunečnicový olej, sojový proteinový izolát, sojový olej, kanolový olej, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, citrát sodný, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan hořečnatý, umělé

• · « «

• · přísady, chlorid sodný, sojový lecitin, cholinchlorid, kyselina askorbová, karagen, síran zinečnatý, síran železnatý, alfa-tokoferylacetát, želatinová guma, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, molybdát sodný, chlorid chrómu, biotin, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdroj proteinů je směs dvou vysoce biologicky hodnotných proteinů: kasein a sója.

Kaseinát sodný a vápenatý 85 %

Sojový proteinový izolát 15 %

Tuk:

Zdrojem tuku je směs tří olejů: slunečnicový olej, olej kanoly a sojový olej.

Slunečnicový olej 40 %

Olej kanoly 30 %

Sojový olej 30 %

Množství tuku v přípravku ENSURE® HIGH PROTEIN splňuje požadavky American Heart Association (AHA). 6 gramů tuku v přípravku ENSURE® HIGH PROTEIN reprezentuje 24 % celkového množství kalorií, přičemž 2,6 % tuku pochází z nasycených mastných kyselin a 7,9 % je z poly-nenasycených mastných kyselin. Tyto hodnoty splňují požadavky AHA, což znamená méně jak 30 % kalorií pochází z tuku, méně než 10 % kalorií pochází ze saturovaných mastných kyselin a méně než 10 % kalorií pochází z polynenasycených mastných kyselin.

Sacharidy:

Přípravek ENSURE® HIGH PROTEIN obsahuje kombinaci maltodextřinu a sacharózy. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová, divokých bobulovin a banánu) plus VARI-FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková a jiné nečokoládové příchutě obsahují:

Sacharóza 60 %

Maltodextrin 40 %

Čokoládová příchuť obsahuje:

Sacharóza 70 %

Maltodextrin 30 %

D. ENSURE®LIGHT

Použití: Přípravek ENSURE LIGHT je výživa v kapalné formě obsahující malé množství tuků. Používá se jako orální nutriční doplněk podávaný mezi jednotlivými jídly nebo s jídly. Přípravek ENSURE LIGHT neobsahuje laktózu a lepek a je vhodný pro použití při upravené dietě, která zahrnuje diety s nízkým obsahem cholesterolu.

Stav pacientů:

• Je vhodný pro pacienty s normální hmotností a pacienty s nadváhou, které potřebují živiny navíc. Podává se ve formě doplňku, který obsahuje o 50 % méně tuku a o 20 % méně kalorií, než obsahuje přípravek ENSURE.

• Pro zdravé dospělé jedince, kteří se nestravují správným způsobem a potřebují výživu navíc.

Rysy:

• Obsahuje malé množství tuků a nasycených tuků.

• Obsahuje 3 g celkového tuku a méně než 5 mg cholesterolu • Přípravek má bohatou jemnou chuť • · • Je to skvělý zdroj vápníku a jiných podstatných vitamínů a minerálů • Přípravek je vhodný pro dietu s nízkým obsahem cholesterolu • Přípravek neobsahuje laktózu a snadno se tráví.

Složení:

Typ French Vanilla: - -D voda, cukr (sacharóza), maltodextrin (kukuřičný), kaseinát vápenatý a sodný, slunečnicový olej, sojový proteinový izolát, sojový olej, kanolový olej, chlorid hořečnatý, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, citrát sodný, chlorid hořečnatý, dibazický fosforečnan hořečnatý, přirozené a umělé přísady, celulóza, gel, cholinchlorid, sojový lecitin, chlorid sodný, kyselina askorbová, karagen, celulózová guma, síran železnatý, alfatokoferylacetát,síran zinečnatý, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thíaminchioridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, molybdát sodný, chlorid chrómu, biotin, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdrojem proteinu je kaseinát vápenatý. Kaseinát vápenatý

100

Tuk:

Zdrojem proteinu je směs dvou olejů: slunečnicového oleje a oleje kanoly.

Slunečnicový olej 70 %

Olej kanoly 30 %

Množství tuku v přípravku ENSURE LIGHT splňuje požadavky

American Heart Association (AHA). 3 gramy tuku v přípravku

ENSURE LIGHT reprezentuje 13,5 % celkového množství kalorií, přičemž 1,4 % tuku je z nasycených mastných kyselina 2,6 % • · · z poly-nenasycených mastných kyselin. Tyto hodnoty jsou v souladu s požadavky AHA, kdy méně než 30 % kalorií je z tuku a méně než 10 % kalorií pochází z nasycených mastných kyselin a méně než 10 % celkového množství kalorií pochází z polynenasycených mastných kyselin.

Sacharidy:

Přípravek ENSURE LIGHT obsahuje kombinace maltodextřinu a sacharózy. Čokoládová příchuť obsahuje také kukuřičný sirup. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová, jahodová) plus VARI-FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková a jiné nečokoládové příchutě obsahují:

Sacharóza 51 %

Maltodextrin 49 %

Čokoládová příchuť obsahuje:

Sacharóza 47 %

Kukuřičný sirup 26,5 %

Maltodextrin 26,5 %

Vitamíny a minerály

Jedno balení (0,2272 1) ENSURE LIGHT poskytuje alespoň 25 %

RDI pro 24 klíčových vitamínů a minerálů.

Kofein:

Čokoládová příchuť obsahuje 2,1 mg kofeinu na 0,2272 1.

E. ENSURE PLUS®

Použití: přípravek ENSURE PLUS je vysokokalorická výživa v kapalné formě s nízkým obsahem zbytků. Používá se tam, kde je třeba dodat navíc kalorie a nutrienty, ale normální

0)? ···· · »··»»·«·

-7 4-. ···*· ·· • · · *· ····♦·· ·· · · koncentraci proteinů. Přípravek) slouží primárně jako orální nutriční doplněk, který se použije mezi jednotlivým jídlem nebo v přijatelném množství jako náhražka jídla. Přípravek ENSURE PLUS neobsahuje laktózu ani lepek. Ačkoli se přípravek primárně aplikuje orálně, může se zavádět i hadičkou.

Stav pacienta:

• Přípravek je vhodný pro pacienty, kteří vyžadují v omezeném objemu navíc kalorie a nutrienty, ale normální koncentraci proteinu • Přípravek je vhodný pro pacienty, kteří potřebují dosáhnout a udržet normální hmotnost.

Rysy:

• Bohatá a lahodná chuť • Dobrý zdroj podstatných vitamínů a minerálů

Složení:

Typ Vanilla: - -D voda, kukuřičný sirup, maltodextrin (kukuřičný), cukr (sacharóza), kukuřičný olej, kaseinát vápenatý a sodný, slunečnicový olej, sojový proteinový izolát, chlorid hořečnatý, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, sojový lecitin, přirozené a umělé příchutě, citrát sodný, chlorid draselný, cholinchlorid, kyselina askorbová, karagen, síran zinečnatý, síran mědňatý, síran železitý, alfatokoferylacetát, síran zinečnatý, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, molybdát sodný, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

• ·

Zdrojem proteinu jsou dva vysoce biologicky hodnotné proteiny: kasein a sója

Kaseinát vápenatý a sodný 84 %

Sojový proteinový izolát 16 %

Tuk:

Zdrojem tuku je kukuřičný olej

Kukuřičný olej 100 %

Sacharidy:

Přípravek ENSURE PLUS obsahuje kombinaci maltodextrinu a sacharózy. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová, jahodová-kávová, máslo burských oříšků a vaječný koňak) plus VARI-FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková, jahodová, kávová oříšků obsahují:

Sacharóza Maltodextrin Kukuřičný sirup

Čokoládová příchuť a příchuť Sacharóza Kukuřičný sirup Maltodextrin příchuť a příchuť másla burských %

% %

vaječného koňaku obsahují:

% %

%

Vitamíny a minerály

Jedno balení (0,2272 1) ENSURE LIGHT poskytuje alespoň 15 %

RDI pro 25 klíčových vitamínů a minerálů.

Kofein:

Čokoládová příchuť obsahuje 3,1 mg kofeinu na 0,2272 1 a kávová příchuť obsahuje stopové množství kofeinu.

• *

F. ENSURE PLUS®HN

Použití: Přípravek ENSURE PLUS HN je nutričně kompletní výživa v kapalinové formě s vysokým obsahem kalorií a dusíku vhodná pro lidi, které vyžadují přísun velkého množství kalorií a proteinu a mají omezenou toleranci na objem potravy. Mohou se aplikovat orálně nebo se zavádějí hadičkou. Přípravek neobsahuje laktózu ani lepek.

Stav pacienta:

• Vhodné pro pacienty se zvýšenou potřebou kalorií a proteinů, kteří jsou například po chirurgickém zákroku nebo poranění.

• Vhodné pro pacienty s omezenou tolerancí na objem a s časným pocitem sytosti.

Rysy:

• Přípravek je vhodný jako nutriční doplněk i jako celková výživa.

• Přípravek je vhodný pro orální aplikaci i pro zavádění hadičkou.

• 1,5 CaVml • Vysoký obsah dusíku.

• Vysoká hustota kalorii.

Složky:

Typ Vanila: - -D voda, maltodextrin (kukuřičný), kukuřičný olej, kaseinát vápenatý a sodný, cukr (sacharóza), sojový proteinový izolát, chlorid hořečnatý, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, sojový lecitin, přirozené a umělé příchutě, citrát sodný, cholinchlorid, kyselina askorbová, taurin, L-karnitin, alfa-tokoferylacetát, síran zinečnatý, síran niacinamid, karagen, železitý, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, « *φ · ΦΦ φ φ ΦΦ φ φ φ φ < φ φ φ * * φ «ΦΦ φ · · ' * φ π η Φ · * φ · Φ < φ* * ΦΦ * y ο ΦΦ·»» φφ φφφ φφ <φ« φφφ« φ· »φ thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, palmitat vitaminu A, kyselina folová, biotin, molybdát sodný, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

G. ENSURE® POWDER

Použití: Přípravek ENSURE POWDER (rozpuštěný ve vodě) je výživa v kapalinové formě s nízkým obsahem zbytků určená pro aplikaci primárně jako orální nutriční doplněk, který se používá mezí jednotlivými jídly nebo s nimi. Uvedený přípravek neobsahuje laktózu ani lepek a je vhodný při upravených dietách zahrnujících diety s nízkým obsahem cholesterolu.

Stav pacienta:

• Přípravek je vhodný pro pacienty se zvláštní dietou.

• Přípravek je vhodný pro staré pacienty, kde existuje nebezpečí spojené s výživou.

• Přípravek je vhodný pro pacienty, kteří se zotavují z nemoci nebo z chirurgického zákroku.

• Přípravek je vhodný pro pacienty, kteří potřebují dietu s nízkým obsahem zbytků.

Rysy:

• Přípravek je příjemný, snadno se rozmíchá.

• Obsahuje malé množství nasyceného tuku.

• V jednom balení přípravek obsahuje 9g celkového tuku a méně než 5 mg cholesterolu.

• Přípravek obsahuje vysoký obsah vitamínů a minerálů.

• Přípravek je vhodný při dietě s nízkým obsahem cholesterolu.

• Přípravek neobsahuje laktózu a snadno se tráví.

Složení: - -D kukuřičný sirup, maltodextrin (kukuřičný), kukuřičný olej, kaseinát vápenatý a sodný, cukr (sacharóza), «· > • · * 9999 sojový proteinový izolát, umělé příchutě, chlorid hořečnatý, citrát draselný, tribazický fosforečnan vápenatý, chlorid draselný, sojový lecitin, citrát sodný, cholinchlorid, kyselina askorbová, síran zinečnatý, síran železitý, taurin, L-karnitin, alfa-tokoferylacetát, niacinamid, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, palmitat vitaminu A, kyselina folová, biotin, molybdát sodný, chlorid chrómu, jodid draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdroj proteinu je směs dvou vysoce biologicky hodnotných proteinů: kaseinu a sóji.

Kaseinát sodný a vápenatý 84 %

Sojový proteinový izolát 16 %

Tuk:

Zdrojem tuku je kukuřičný olej.

Kukuřičný olej 100 %

Sacharidy:

Přípravek ENSURE POWDER obsahuje kombinaci kukuřičného sirupu, maltodextrinu a sacharózy. Střední sladkost plus VARIFLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chutí.

Vanilková příchuť obsahuje:

Sacharóza 30 %

Maltodextrin 35 %

Kukuřičný sirup 35 %

H. ENSURE® PUDDING • · · · · • · · · · · · ·

Použití: Přípravek ENSURE PUDDING je nutriční doplněk s vysokou hustotou nutrientů poskytující vyváženou výživu v nekapalné formě. Používá se mezi jednotlivými jídly a spolu s nimi. Je vhodný pro výživu s upravenou konzistencí (například jemná, rozmělněná nebo zcela kapalná strava) nebo pro lidí s poruchami polykání. Uvedený přípravek neobsahuje lepek.

Stav pacienta:

• Přípravek je vhodný pro pacienty s dietou s upravenou konzistencí (například jemná, rozmělněná nebo zcela kapalná dieta) .

• Vhodné pro pacienty s poruchami polykání.

Rysy:

• Bohatá a jemná, dobrá chuť.

• Dobrý zdroj podstatných vitamínů a minerálů. Nesmí se skladovat v chladničkách.

• Neobsahuje lepek.

Nutriční	profil pro objem	0,142 ml:	250	kalorií, 10,9 %
proteinů,	celkový obsah tuků	je 34,9 %,	54,2	% sacharidů.
Složení:	: - -D netučné	mléko, voda,	cukr (sacharóza),
částečně	hydrogenovaný sojový olej,	upravený potravinářský

škrob, síran hořečnatý, stearoyllaktylát sodný, dibazický fosforečnan sodný, umělé příchutě, kyselina askorbová, síran zinečnatý, síran železitý, alfa-tokoferylacetát, cholinchlorid, niacinamid, síran manganatý, pantotenát vápenatý, citrát draselný, síran mědňatý, palmitát vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, FD&C žlutá #6, kyselina folová, biotín, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

« · • ·· · · ·······

Protein :

Zdrojem proteinu je netučné mléko.

Netučné mléko 100 %

Tuk:

Zdrojem tuku je hydrogenovaný sojový olej. Hydrogenovaný sojový olej 100 %

Sacharidy:

Přípravek ENSURE PUDDING obsahuje kombinaci sacharózy a upraveného potravinářského škrobu. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová, skotské a ságová pomáhá předcházet nepříznivé chuti. Produkt obsahuje 9,2 gramů laktózy na každé balení.

Vanilková a jiné nečokoládové Sacharóza

Laktóza

Upravený potravinářský škrob

Čokoládová příchuť

Sacharóza

Laktóza

Upravený potravinářský škrob příchuti obsahují:

% %

% %

% %

I. ENSURE® WITH FIBER

Použití: Přípravek ENSURE® WITH FIBER je nutričně úplná výživa v kapalné formě, obsahující vlákninu určená pro lidi, pro něž je výhodná aplikace diety s vyšším obsahem vlákniny a nutrientů. Uvedený výrobek je vhodný pro lidi, které nevyžadují dietu s nízkým obsahem zbytků. Může se aplikovat orálně nebo se zavádí trubičkou. Výrobek se může použít jako nutriční doplněk normální stravy nebo ve vhodném množství jako její náhrada. Výrobek neobsahuje laktózu ani lepek a je vhodný • · · pro použití při upravených dietách, které zahrnují také dietu s nízkým obsahem cholesterolu.

Stav pacienta:

• Pacient, pro něhož je výhodná dieta s vyšším obsahem vlákniny a nutrientů.

Rysy:

• Nový progresivní výrobek s nízkým obsahem nasycených tuků, s vyšším obsahem vitamínů a minerálů • V jednom balení obsahuje 6 g celkového tuku a méně než 5 mg cholesterolu.

• Má bohatou a jemnou chuť.

• Dobrý zdroj vlákniny.

• Výborný zdroj podstatných vitamínů a minerálů.

• Vhodný pro dietu s nízkým obsahem cholesterolu.

• Neobsahuje laktózu ani lepek.

Složení:

Typ Vanilla: - -D voda, maltodextrin (kukuřičný), cukr (sacharóza), kukuřičný olej, kaseinát vápenatý a sodný, ovesná vláknina, slunečnicový olej, olej kanola, sojový proteinový izolát, kukuřičný olej, sojová vláknina, tribazický fosforečnan vápenatý, chlorid hořečnatý, citrát draselný, citrát draselný, celulózový gel, dibazický fosforečnan draselný, citrát sodný, přirozené a umělé příchutě, cholinchlorid, fosforečnan hořečnatý, kyselina askorbová, celulózová guma, chlorid draselný, karagen, síran železitý, alfa-tokoferylacetát, pantotenát vápenatý, síran manganatý, síran mědňatý, palmitat vitaminu A, thiaminchloridhydrochlorid, pyridoxinhydrochlorid, riboflavin, kyselina folová, biotin, molybdát sodný, chlorid chrómu, jodid • ·

100 draselný, selenát sodný, fylochinon, vitamin D3 a cyanokobalamin.

Protein:

Zdrojem proteinu je směs dvou vysoce biologicky hodnotných proteinů: kaseinů a sóji.

Kaseinát sodný a vápenatý Sojový proteinový izolát	80 % 20 %
Tuk:
Zdroj tuku je směs tří olejů: slunečnicový olej,	olej kanoly a
kukuřičný olej.
Slunenčnícový olej	40 %
Olej kanoly	40 %
Kukuřičný olej	20 %
Množství tuku v přípravku ENSURE WITH	FIBER splňuje
požadavky American Heart Association (AHA).	6 gramů tuku
uvedeného výrobku reprezentuje 22 % celkového množství

kalorií, 2,01 % je tuk pocházející z nasycených mastných kyselin a 6,7 % pochází z poly-nenasycených mastných kyselin. Tyto hodnoty jsou v souladu s požadavky AHA, kdy méně než 30 % celkového množství kalorií pochází z tuku, méně než 10 % kalorií pochází z nasycených mastných kyselin a méně než 10 % celkového množství kalorií pochází z poly-nenasycených mastných kyselin.

Sacharidy:

Přípravek ENSURE WITH FIBER obsahuje kombinaci maltodextřinu a sacharózy. Střední sladkost a různé příchutě (vanilková, čokoládová a pekanové máslo) plus VARI-FLAVORSO® Flavor Pacs v ořechu pekan, višně, jahody, citrón a pomeranč, pomáhá předcházet nepříznivé chuti.

Vanilková a jiné nečokoládové příchutě • ·

101

Sacharóza

Maltodextrin

Ovesná vláknina Sojová vláknina %

% %

%

Čokoládová příchuť

Sacharóza 36 %

Maltodextrin 55 %

Ovesná vláknina 7 %

Sojová vláknina 2 %

Vláknina:

Směs vlákniny obsažené v přípravku ENSURE WITH FIBER obsahuje ovesnou vlákninu a sojový polysacharid. Výsledkem této směsi je, že jedno balení o objemu 0,22721 obsahuje přibližně 4 gramy celkové vlákniny. Poměr nerozpustné a rozpustné vlákniny je 95:5.

PUFA podle vynálezu mohou nahradit a/nebo doplnit různé nutriční doplňky popsané shora v textu.

J. Nutriční produkt Oxepa™

Oxepa je enterální nutriční produkt s nízkým obsahem cukrů s vysokou kalorickou hustotou vhodný pro aplikaci pacientům které trpí ARDS a nebo jsou v ohrožení ARDS. Výrobek má jedinečnou kombinaci ingrediencí zahrnující patentovanou směs olejů obsahující ikosapentanovou kyselinu (EPA z rybího oleje), kyselinu γ-linolenovou (GLA pocházející z oleje brutnáku lékařského) a zvýšené množství antioxidantů.

Rozdělení kalorií:

• Kalorická hustota je vysoká 1,5 kal/ml (355 kal/8 fl.oz.), což minimalizuje objem nutný pro uspokojení nároků na energii.

102 • Rozdělení kalorií v produktu Oxepa je zobrazeno v tabulce č.

.

Tabulka č. 7: rozdělení kalorií v produktu Oxepa

	na 8 f1. oz.	na litr	% kal.
Kalorie	355	1 500	-
Tuk (g)	22,2	93,7	55,2
Sacharidy (g)	25	105,5	28,1
Protein (g)	14,8	62,5	16, 7
Voda (g)	186	785	—

Tuk:

• Produkt Oxepa obsahuje 22,2 g tuku na jedno balení o objemu fl. oz. (93,7 g/1).

• Zdroj tuku je směs olejů, která obsahuje 31,8 % oleje kanoly, 25 % triglyceridů se středně dlouhým řetězcem (MCT), 20 % oleje brutnáku lékařského, 20 % rybího oleje a 3,2 % sojového lecitinu. Typický profil mastných kyselin produktu Oxepa je uveden v tabulce č. 8.

• Produkt Oxepa poskytuje vyvážené množství poly-nenasycených, mono-nenasycených a nasycených mastných kyselin, jak se uvádí v tabulce č. 10.

• Triglyceridy se středně dlouhým řetězcem (MTC), které tvoří % směsi, umožňují vyprázdnění gastrického traktu , protože se absorbují ve střevním traktu, aniž se emulzifikují kyselinou žlučovou.

PUFA podle vynálezu mohou nahrazovat nebo doplňovat různé komponenty mastných kyselin nutričního produktu Oxepa.

Tabulka č. 8: Typický profil mastných kyselin

	% z celkového množství mastných kyselin	g/8 fl. oz.*	g/1*
Kyselina	0,2	0,04	0,18

103

kapronová (6:0)
Kyselina kaprylová (8:0)	14, 69	3,1	13,07
Kyselina kaprová (10:0)	11,06	2,33	9, 87
Kyselina palmitová (16:0)	5,59	1, 18	4, 98
Kyselina palmitolej ová (16:ln-7)	1, 82	0,38	1, 62
Kyselina stearová (18:0)	1, 84	0,39	1, 64
Kyselina olej ová (18:ln-9)	24,44	5,16	21,75
Kyselina linolová	16,28	3,44	14,49
Kyselina a-linolová (18:3n-3)	3, 47	0,73	3,09
Kyselina γ-linolová (18:3n-6)	4, 82	1,02	4,29
Kyselina ikosapentanová (20:5n-3)	5,11	1,08	4,55
n-3- dokosapentanová (22:5n-3)	0,55	0,12	0,49
Kyselina dokosahexanová (22:6n-3)	2,27	0,48	2,02
Jiné kyseliny	7,55	1,52	6,72

*mastné kyseliny odpovídají přibližně 95 % celkového tuku

Tabulka č. 9: Profil tuk produktu Oxepa

% celkových kalorií z tuku	55,2
Polynenasycené mastné kyseliny	31,44 g/1
Mononenasycené mastné kyseliny	25,53 g/1
Nasycené mastné kyseliny	32,38 g/1
Poměr n-6 ku n-3	1,75 : 1
cholesterol	9,49 mg/8 fl.oz. 40,1 mg/1

• ·

104 ··: ··;

··· ·· ······· ·· · ·

Sacharidy:

• Obsah sacharidů je 25,0 g na 8 fl.oz. (105,5 g/1).

• Zdroje sacharidů jsou 45 % maltodextrinu (komplexní sacharid) a 55 % sacharózy (jednoduchý cukr). Oba sacharidy se jednoduše tráví a absorbují.

• Produkt Oxepa obsahuje vysoký obsah tuku a nízký obsah sacharidů, což minimalizuje tvorbu oxidu uhličitého (CO2) Vysoký obsah oxidu uhličitého může komplikovat odstavení pacientů, kteří jsou závislí na umělém dýchání. Nízký obsah sacharidů je také vhodný pro pacienty, u kterých může dojít k hyperglykémíi vyvolané stresem.

• Produkt Oxepa neobsahuje laktózu.

Sacharidy, aminokyseliny proteinů a glycerolové části tuků se mohou v těle přeměnit na glukózu. Prostřednictvím tohoto procesu se uspokojují požadavky na cukry tkáně závislé na glukóze (jako je centrální nervový systém nebo buňky krve). Avšak potrava bez sacharidů může způsobit ketózu, což je nadměrný katabolizmus tkáňových proteinů a ztrátu tělních tekutin a elektrolytů. Těmto účinkům se dá předcházet, jestliže se požije denně 50 až 100 g stravitelných sacharidů, v případě, že je adekvátní kalorický příjem. Množství sacharidů v produktu Oxepa je také dostatečný pro minimalizaci glukoneogeneze, jestliže je uspokojena potřeba energie.

Protein:

• Oxepa obsahuje 14,8 g proteinu na jedno balení o objemu 8 f1. oz. (62,5 g/1).

• Poměr celkového množství kalorií/obsahu dusíku (150:1) uspokojuje potřeby stresovaných pacientů.

• Oxepa poskytuje dostatek proteinu, aby způsobila anabolizmus a udržení nízké tělesné hmotnosti, aniž dojde respiračním problémům. Vysoký příjem proteinů se předpokládá u pacientů

105 s respirační nedostatečností. Ačkoli proteiny mají malý účinek na produkci C02, dieta s vysokým obsahem proteinů napomáhá dýchání.

• Jako zdroj proteinů v produktu Oxepa se využívá 86,8 % kaseinátu sodného a 13,2 % kaseinátu vápenatého.

• Jak se uvádí v tabulce 11, profil aminokyselin proteinového systému v produktu Oxepa vyhovuje standardům v případě proteinů vysoké kvality, které vytvořila instituce National Academy of Sciences.

• Produkt Oxepa neobsahuje lepek.

• ·

106

Sekvenční protokol (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1617 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
XI)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 1:

CGACACTCCT	TCCTTCTTCT	CACCCGTCCT	AGTCCCCTTC	AACCCCCCTC	TTTGACAAAG	60
ACAACAAACC	ATGGCTGCTG	CTCCCAGTGT	GAGGACGTTT	ACTCGGGCCG	AGGTTTTGAA	120
TGCCGAGGCT	CTGAATGAGG	GCAAGAAGGA	TGCCGAGGCA	CCCTTCTTGA	TGATCATCGA	180
CAACAAGGTG	TACGATGTCC	GCGAGTTCGT	CCCTGATCAT	CCCGGTGGAA	GTGTGATTCT	240
CACGCACGTT	GGCAAGGACG	GCACTGACGT	CTTTGACACT	TTTCACCCCG	AGGCTGCTTG	300
GGAGACTCTT	GCCAACTTTT	ACGTTGGTGA	TATTGACGAG	AGCGACCGCG	ATATCAAGAA	360
TGATGACTTT	GCGGCCGAGG	TCCGCAAGCT	GCGTACCTTG	TTCCAGTCTC	TTGGTTACTA	420
CGATTCTTCC	AAGGCATACT	ACGCCTTCAA	GGTCTCGTTC	AACCTCTGCA	TCTGGGGTTT	480
GTCGACGGTC	ATTGTGGCCA	AGTGGGGCCA	GACCTCGACC	CTCGCCAACG	TGCTCTCGGC	540
TGCGCTTTTG	GGTCTGTTCT	GGCAGCAGTG	CGGATGGTTG	GCTCACGACT	TTTTGCATCA	600
CCAGGTCTTC	CAGGACCGTT	TCTGGGGTGA	TCTTTTCGGC	GCCTTCTTGG	GAGGTGTCTG	660
CCAGGGCTTC	TCGTCCTCGT	GGTGGAAGGA	CAAGCACAAC	ACTCACCACG	CCGCCCCCAA	720
CGTCCACGGC	GAGGATCCCG	ACATTGACAC	CCACCCTCTG	TTGACCTGGA	GTGAGCATGC	780
GTTGGAGATG	TTCTCGGATG	TCCCAGATGA	GGAGCTGACC	CGCATGTGGT	CGCGTTTCAT	840
GGTCCTGAAC	CAGACCTGGT	TTTACTTCCC	CATTCTCTCG	TTTGCCCGTC	TCTCCTGGTG	900
CCTCCAGTCC	ATTCTCTTTG	TGCTGCCTAA	CGGTCAGGCC	CACAAGCCCT	CGGGCGCGCG	960
TGTGCCCATC	TCGTTGGTCG	AGCAGCTGTC	GCTTGCGATG	CACTGGACCT	GGTACCTCGC	1020
CACCATGTTC	CTGTTCATCA	AGGATCCCGT	CAACATGCTG	GTGTACTTTT	TGGTGTCGCA	1080
GGCGGTGTGC	GGAAACTTGT	TGGCGATCGT	GTTCTCGCTC	AACCACAACG	GTATGCCTGT	1140
GATCTCGAAG	GAGGAGGCGG	TCGATATGGA	TTTCTTCACG	AAGCAGATCA	TCACGGGTCG	1200
TGATGTCCAC	CCGGGTCTAT	TTGCCAACTG	GTTCACGGGT	GGATTGAACT	ATCAGATCGA	1260
GCACCACTTG	TTCCCTTCGA	TGCCTCGCCA	CAACTTTTCA	AAGATCCAGC	CTGCTGTCGA	1320

• ·

	107	« · • • • • · ·	• « · · · · • · · · • · · · · • · * · • · ·······	• • • · · • ·
GACCCTGTGC	AAAAAGTACA	ATGTCCGATA	CCACACCACC	GGTATGATCG	AGGGAACTGC	1380
AGAGGTCTTT	AGCCGTCTGA	ACGAGGTCTC	CAAGGCTGCC	TCCAAGATGG	GTAAGGCGCA	1440
GTAAAAAAAA	AAACAAGGAC	GTTTTTTTTC	GCCAGTGCCT	GTGCCTGTGC	CTGCTTCCCT	1500
TGTCAAGTCG	AGCGTTTCTG	GAAAGGATCG	TTCAGTGCAG	TATCATCATT	CTCCTTTTAC	1560
CCCCCGCTCA	TATCTCATTC	ATTTCTCTTA	TTAAACAACT	TGTTCCCCCC	TTCACCG	1617

(2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 457 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

	(xi)	Popis	sekvence:	SEQ ID NO:	2 :
Met 1	Ala Ala	Ala Pro 5	Ser Val Arg	Thr Phe Thr Arg 10	Ala Glu Val Leu 15
Asn	Ala Glu	Ala Leu 20	Asn Glu Gly	Lys Lys Asp Ala 25	Glu Ala Pro Phe 30
Leu	Met Ile 35	Ile Asp	Asn Lys Val 40	Tyr Asp Val Arg	Glu Phe Val Pro 45
Asp	His Pro 50	Gly Gly	Ser Val Ile 55	Leu Thr His Val 60	Gly Lys Asp Gly
Thr 65	Asp Val	Phe Asp	Thr Phe His 70	Pro Glu Ala Ala 75	Trp Glu Thr Leu 80
Ala	Asn Phe	Tyr Val 85	Gly Asp Ile	Asp Glu Ser Asp 90	Arg Asp Ile Lys 95
Asn	Asp Asp	Phe Ala 100	Ala Glu Val	Arg Lys Leu Arg 105	Thr Leu Phe Gin 110
Ser	Leu Gly 115	Tyr Tyr	Asp Ser Ser 120	Lys Ala Tyr Tyr	Ala Phe Lys Val 125
Ser	Phe Asn 130	Leu Cys	Ile Trp Gly 135	Leu Ser Thr Val 140	Ile Val Ala Lys
Trp 145	Gly Gin	Thr Ser. Thr Leu Ala (150	Asn Val Leu Ser 155	Ala Ala Leu Leu 160

Gly Leu Phe Trp Gin Gin Cys- Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His 165 170 175

• · ·

His Gin Val

Leu Gly Gly 195

His Asn Thr 210

Ile Asp Thr 225

Phe Ser Asp

Met Val Leu

Arg Leu Ser 275

Gin Ala His 290

Gin Leu Ser 305

Leu Phe Ile

Gin Ala Val

Asn Gly Met 355

Phe Thr Lys 370

Ala Asn Trp 385

Phe Pro Ser

Glu Thr Leu

Ile Glu Gly 435

Ala Ala Ser 450

108

Phe Gin Asp Arg Phe Trp Gly Asp Leu Phe Gly Ala Phe 180 185 190

Val Cys Gin Gly Phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys 200 205

His His Ala Ala Pro Asn Val His Gly Glu Asp Pro Asp 215 220

His Pro Leu Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu Met 230 235 240

Val Pro Asp Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg Phe 245 250 255

Asn Gin Thr Trp Phe Tyr Phe Pro Ile Leu Ser Phe Ala 260 265 270

Trp Cys Leu Gin Ser Ile Leu Phe Val Leu Pro Asn Gly 280 285

Lys Pro Ser Gly Ala Arg Val Pro Ile Ser Leu Val Glu 295 300

Leu Ala Met His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met Phe 310 315 320

Lys Asp Pro Val Asn Met Leu Val Tyr Phe Leu Val Ser 325 330 335

Cys Gly Asn Leu Leu Ala Ile Val Phe Ser Leu Asn His 340 345 350

Pro Val Ile Ser Lys Glu Glu Ala Val Asp Met Asp Phe 360 365

Gin Ile Ile Thr Gly Arg Asp Val His Pro Gly Leu Phe 375 380

Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gin Ile Glu His His Leu 390 395 400

Met Pro Arg His Asn Phe Ser Lys Ile Gin Pro Ala Val 405 410 415

Cys Lys Lys Tyr Asn Val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met 420 425 430

Thr Ala Glu Val Phe Ser Arg Leu Asn Glu Val Ser Lys 440 445

Lys Met Gly Lys Ala Gin 455 • · • ·

109 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1488 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetě
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 3:

GTCCCCTGTC GCTGTCGGCA CACCCCATCC TCCCTCGCTC CCTCTGCGTT TGTCCTTGGC 60

CCACCGTCTC TCCTCCACCC TCCGAGACGA CTGCAACTGT AATCAGGAAC CGACAAATAC 120

ACGATTTCTT TTTACTCAGC ACCAACTCAA AATCCTCAAC CGCAACCCTT TTTCAGGATG 190

GCACCTCCCA ACACTATCGA TGCCGGTTTG ACCCAGCGTC ATATCAGCAC CTCGGCCCCA 240

AACTCGGCCA AGCCTGCCTT CGAGCGCAAC TACCAGCTCC CCGAGTTCAC CATCAAGGAG 300

ATCCGAGAGT GCATCCCTGC CCACTGCTTT GAGCGCTCCG GTCTCCGTGG TCTCTGCCAC 360

GTTGCCATCG ATCTGACTTG GGCGTCGCTC TTGTTCCTGG CTGCGACCCA GATCGACAAG 420

TTTGAGAATC CCTTGATCCG CTATTTGGCC TGGCCTGTTT ACTGGATCAT GCAGGGTATT 480

GTCTGCACCG GTGTCTGGGT GCTGGCTCAC GAGTGTGGTC ATCAGTCCTT CTCGACCTCC 540

AAGACCCTCA ACAACACAGT TGGTTGGATC TTGCACTCGA TGCTCTTGGT CCCCTACCAC 600

TCCTGGAGAA TCTCGCACTC GAAGCACCAC AAGGCCACTG GCCATATGAC CAAGGACCAG 660

GTCTTTGTGC CCAAGACCCG CTCCCAGGTT GGCTTGCCTC CCAAGGAGAA CGCTGCTGCT 720

GCCGTTCAGG AGGAGGACAT GTCCGTGCAC CTGGATGAGG AGGCTCCCAT TGTGACTTTG 780

TTCTGGATGG TGATCCAGTT CTTGTTCGGA TGGCCCGCGT ACCTGATTAT GAACGCCTCT 840

110

GGCCAAGACT CGCAACTTTT	ACGGCCGCTG GACCTCGCAC TTCCACACGT ACTCGCCCAT TCGACATTAT TATCTCGGAC CTCGGTGTGT TGGCTGCCCT
ATCTATGCCT	CCATGCAGTT GTCGCTCTTG ACCGTCACCA AGTACTATAT
CTCTTTGTCA	ACTTTTGGTT GGTCCTGATC ACCTTCTTGC AGCACACCGA
CCCCATTACC	GCGAGGGTGC CTGGAATTTC CAGCGTGGAG CTCTTTGCAC
TCGTTTGGCA	AGTTCTTGGA CCATATGTTC CACGGCATTG TCCACACCCA
CACTTGTTCT	CGCAAATGCC GTTCTACCAT GCTGAGGAAG CTACCTATCA
CTGCTGGGAG	AGTACTATGT GTACGACCCA TCCCCGATCG TCGTTGCGGT
TTCCGTGAGT	GCCGATTCGT GGAGGATCAG GGAGACGTGG TCTTTTTCAA
AAAAGACAAT	GGACCACACA CAACCTTGTC TCTACAGACC TACGTATCAT
CACTTCATAA	AAGAACATGA GCTCTAGAGG CGTGTCATTC GCGCCTCC
(2) Informace o SEQ ID NO: 4:
(i	.) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

• · · · • · · « · * · · »	« • ·
CTTTGAGCCC	900
CGGTGCCCTG	960
TGTCCCCTAC	1020
TCCCAAGCTG	1080
CGTTGACCGC	1140
TGTGGCCCAT	1200
TCTCAAGAAA	1260
CTGGAGGTCG	1320
GAAGTAAAAA	1380
GTAGCCATAC	1440
	1488

(A) DÉLKA: 399 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

(xi)	Popis	sekvence:	SEQ ID NO: '	4:
Met Ala 1	Pro Pro	Asn Thr Ile 5	Asp Ala Gly Leu 10	Thr Gin Arg His Ile 15
Ser Thr	Ser Ala 20	Pro Asn Ser	Ala Lys Pro Ala 25	Phe Glu Arg Asn Tyr 30.
Gin Leu	Pro Glu 35	Phe Thr Ile	Lys Glu Ile Arg 40	Glu Cys Ile Pro Ala 45
His Cys 50	Phe Glu	Arg Ser Gly 55	Leu Arg Gly Leu	Cys His Val Ala Xle 60
Asp Leu 65	Thr Trp	Ala Ser Leu 70	Leu Phe Leu Ala 75	Ala Thr Gin Ile Asp 80
Lys Phe	Glu Asn	Pro Leu Ile 85	Arg Tyr Leu Ala 90	Trp Pro Val Tyr Trp 95
Ile Met	Gin Gly 100	Ile Val Cys	Thr Gly Val Trp 105	Val Leu Ala His Glu 110
Cys Gly	His Gin 115	Ser Phe Ser	Thr Ser Lys Thr 120	Leu Asn Asn Thr Val 125
Gly Trp 130	Ile Leu	His Ser Met 135	Leu Leu Val Pro	Tyr His Ser Trp Arg 140
Ile Ser 145	His Ser	Lys His His 150	Lys Ala Thr Gly 155	His Met Thr Lys Asp 160

• · · · 0 0 ·· ·· ··· · ··· 0 · 00 0 ··· · 00*··

Gin

Val

Phe

Val

Pro 165

Lys

Thr

Arg

Ser Gin Val 170

Gly Leu

Pro

Pro 175

Lys

Glu

Asn

Ala

Ala

Ala

Ala

Val

Gin

Glu

Glu

Asp

Met

Ser

Val

His

Leu

180

185

190

Asp

Glu

Glu

Ala

Pro

Ile

Val

Thr

Leu

Phe

Trp

Met

Val

Ile

Gin

Phe

195

200

205

Leu

Phe

Gly

Trp

Pro

Ala

Tyr

Leu

Ile

Met

Asn

Ala

Ser

Gly

Gin

Asp

210

215

220

Tyr

Gly

Arg

Trp

Thr

Ser

His

Phe

His

Thr

Tyr

Ser

Pro

Ile

Phe

Glu

225

230

235

240

Pro

Arg

Asn

Phe

Phe

Asp

Ile

Ile

Ile

Ser

Asp

Leu

Gly

Val

Leu

Ala

245

250

255

Ala

Leu

Gly

Ala

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ser

Met

Gin

Leu

Ser

Leu

Leu

Thr

260

265

270

Val

Thr

Lys

Tyr

Tyr

Ile

Val

Pro

Tyr

Leu

Phe

Val

Asn

Phe

Trp

Leu

275

280

285

Val

Leu

Ile

Thr

Phe

Leu

Gin

His

Thr

Asp

Pro

Lys

Leu

Pro

His

Tyr

290

295

300

Arg

Glu

Gly

Ala

Trp

Asn

Phe

Gin

Arg

Gly

Ala

Leu

Cys

Thr

Val

Asp

305

310

315

320

Arg

Ser

Phe

Gly

Lys

Phe

Leu

Asp

His

Met

Phe

His

Gly

Ile

Val

His

325

330

335

Thr

His

Val

Ala

His

His

Leu

Phe

Ser

Gin

Met

Pro

Phe

Tyr

His

Ala

340

345

350

Glu

Glu

Ala

Thr

Tyr

His

Leu

Lys

Lys

Leu

Leu

Gly

Glu

Tyr

Tyr

Val

355

360

365

Tyr

Asp

Pro

Ser

Pro

Ile

Val

Val

Ala

Val

Trp

Arg

Ser

Phe

Arg

Glu

370

375

380

Cys

Arg

Phe

Val

Glu

Asp

Gin

Gly

Asp

Val

Val

Phe

Phe

Lys

Lys

385

390

395

2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 355 aminokyselin
(B)	TYP: aminokyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

112

• · · · · · * ··· · · ·· · • · · * · · • * · ·» · ···

;iu Val Arg Lys Leu Arg Thr Leu Phe Gin Ser Leu Gly Tyr Tyr Asp
	5	10	15
!er Ser Lys Ala Tyr Tyr Ala Phe Lys Val Ser Phe 20 25	Asn Leu Cys Ile 30
Trp Gly Leu 35	Ser Thr	Val Ile Val Ala Lys Trp Gly 40	Gin Thr Ser Thr 45
Leu Ala Asn 50	Val Leu	Ser Ala Ala Leu Leu Gly Leu 55 60	Phe Trp Gin Gin
Cys Gly Trp 65	Leu Ala	His Asp Phe Leu His His Gin 70 75	Val Phe Gin Asp 80
Arg Phe Trp	Gly Asp 85	Leu Phe Gly Ala Phe Leu Gly 90	Gly Val Cys Gin 95
Gly Phe Ser	Ser Ser 100	Trp Trp Lys Asp Lys His Asn 105	Thr His His Ala 110
Ala Pro Asn 115	Val His	Gly Glu Asp Pro Asp Ile Asp 120	Thr His Pro Leu 125
Leu Thr Trp 130	Ser Glu	His Ala Leu Glu Met Phe Ser 135 140	Asp Val Pro Asp
Glu Glu Leu 145	Thr Arg	Met Trp Ser Arg Phe Met Val 150 155	Leu Asn Gin Thr 160
Trp Phe Tyr	Phe Pro 165	Ile Leu Ser Phe Ala Arg Leu 170	Ser Trp Cys Leu 175
Gin Ser Ile	Leu Phe 180	Val Leu Pro Asn Gly Gin Ala 185	His Lys Pro Ser 190
Gly Ala Arg 195	Val Pro	Ile Ser Leu Val Glu Gin Leu 200	Ser Leu Ala Met 205
His Trp Thr 210	Trp Tyr	Leu Ala Thr Met Phe Leu Phe 215 220	Ile Lys Asp Pro
Val Asn Met 225	Leu Val	Tyr Phe Leu Val Ser Gin Ala 230 235	Val Cys Gly Asn 240
Leu Leu Ala	Ile Val 245	Phe Ser Leu Asn His Asn Gly 250	Met Pro Val Ile 255
Ser Lys Glu	Glu Ala 260	Val Asp Met Asp Phe Phe Thr 265	Lys Gin Ile Ile 270
Thr Gly Arg 275	Asp Val	His Pro Gly Leu Phe Ala Asn 280	Trp Phe Thr Gly 285
Gly Leu Asn 290	Tyr Gin	Ile Glu His His Leu Phe Pro 295 300	Ser Met Pro Arg
His Asn Phe 305	Ser Lys	Ile Gin Pro Ala Val Glu Thr 310 315	Leu Cys Lys Lys 320
Tyr Asn Val	Arg Tyr 325	His Thr Thr Gly Met Ile Glu 330	Gly Thr Ala Glu 335
Val Phe Ser	Arg Leu	Asn Glu Val Ser Lys Ala Ala	Ser Lys Met Gly

340 345 350

Lys Ala Gin 355

113 ·· · · 9 · ·999 ·· · · · * · 9 • · · · · * ·····« • · · · · » ·· ·♦····· _a» ,, (2) Informace ο SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 104 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (íí) DRUH MOLEKULY: peptid

(xi

) p

opi

s s

ekv

enc

e:

SEQ

ID

NO

: 6

Val

Thr

Leu

Tyr

Thr

Leu

Ala

Phe

Val

Ala

Ala

Asn

Ser

Leu

Gly

Val

1

5

10

15

Leu

Tyr

Gly

Val

Leu

Ala

Cys

Pro

Ser

Val

Xaa

Pro

His

Gin

Ile

Ala

20

25

30

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Leu

Leu

Trp

Ile

Gin

Ser

Ala

Tyr

Ile

Gly

Xaa

35

40

45

Asp

Ser

Gly

His

Tyr

Val

Ile

Met

Ser

Asn

Lys

Ser

Asn

Asn

Xaa

Phe

50

55

60

Ala

Gin

Leu

Leu

Ser

Gly

Asn

Cys

Leu

Thr

Gly

Ile

Ile

Ala

Trp

Trp

65

70

75

80

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Ala

His

His

Leu

Ala

Cys

Asn

Ser

Leu

Asp

Tyr

85

90

95

Gly

Pro

Asn

Leu

Gin

His

Ile

Pro

100 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA	.: 252 aminokyselin
(B)	TYP:	aminokyselina
(C)	DRUH	ŘETĚZCE: není relevantní
(D)	TOPOLOGIE: lineární

(íi) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

114

Gly Val Leu Tyr Gly Val Leu Ala 1 5

Ile Ala Ala Ala Leu Leu Gly Leu 20

Gly His Asp Ser Gly His Tyr Val 35 40

Arg Phe Ala Gin Leu Leu Ser Gly 50 55

Ala Trp Trp Lys Trp Thr His Asn 65 70

Leu Asp Tyr Asp Pro Asp Leu Gin 85

Thr Lys Phe Phe Ser Ser Leu Thr 100

Thr Phe Gly Pro Val Ala Arg Phe 115 120

Tyr Tyr Pro Val Asn Cys Phe Gly 130 135

Phe Leu Leu Leu Phe Ser Lys Arg 145 150

Phe Ala Gly Ile Leu Val Phe Trp 165

Cys Leu Pro Asn Trp Pro Glu Arg 180

Thr Val Thr Ala Leu Gin His Ile 195 200

Ala Asp Val Tyr Val Gly Pro Pro 210 215

Gin Ala Ala Gly Thr Ile Asp Ile 225 230

Phe Phe Gly Gly Leu Gin Phe Gin 245

Cys Thr Ser Val Phe Ala His Gin 10 15

Leu Trp Ile Gin Ser Ala Tyr Ile 25 30

Ile Met Ser Asn Lys Ser Tyr Asn 45

Asn Cys Leu Thr Gly Ile Ser Ile 60

Ala His His Leu Ala Cys Asn Ser 75 80

His Ile Pro Val Phe Ala Val Ser 90 95

Ser Arg Phe Tyr Asp Arg Lys Leu 105 110

Leu Val Ser Tyr Gin His Phe Thr 125

Arg Ile Asn Leu Phe Ile Gin Thr 140

Glu Val Pro Asp Arg Ala Leu Asn 155 160

Thr Trp Phe Pro Leu Leu Val Ser 170 175

Phe Phe Phe Val Phe Thr Ser Phe 185 190

Gin Phe Thr Leu Asn His Phe Ala 205

Thr Gly Ser Asp Trp Phe Glu Lys 220

Ser Cys Arg Ser Tyr Met Asp Trp 235 240

Leu Glu His His 250

115 (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 125 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Gly 1

Xaa

Xaa

Asn

Phe 5

Ala

Gly

Ile

Leu

Val 10

Phe Trp

Thr

Trp

Phe 15

Pro

Leu

Leu

Val

Ser

Cys

Leu

Pro

Asn

Trp

Pro

Glu

Arg

Phe

Xaa

Phe

Val

20

25

30

Phe

Thr

Gly

Phe

Thr

Val

Thr

Ala

Leu

Gin

His

Ile

Gin

Phe

Thr

Leu

35

40

45

Asn

His

Phe

Ala

Ala

Asp

Val

Tyr

Val

Gly

Pro

Pro

Thr

Gly

Ser

Asp

50

55

60

Trp

Phe

Glu

Lys

Gin

Ala

Ala

Gly

Thr

Ile

Asp

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

65

70

75

80

Tyr

Met

Asp

Trp

Phe

Phe

Cys

Gly

Leu

Gin

Phe

Gin

Leu

Glu

His

His

85

90

95

Leu

Phe

Pro

Arg

Leu

Pro

Arg

Cys

His

Leu

Arg

Lys

Val

Ser

Pro

Val

100

105

110

Gly

Gin

Arg

Gly

Phe

Gin

Arg

Lys

Xaa

Asn

Leu

Ser

Xaa

115

120

125

9

999 ··

9

116 • · * (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 131 aminokyselin

	(B	) TYP: aminokyselina
	(C	) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D	) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(Xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 9:

Pro Ala Thr Glu Val Gly Gly Leu Ala Trp Met Ile Thr Phe Tyr Val

5 10 15

Arg Phe Phe Leu Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Leu Lys Ala Phe Leu

25 30

Gly Leu Phe Phe Ile Val Arg Phe Leu Glu Ser Asn Trp Phe Val Trp 35 40 45

Val Thr Gin Met Asn His Ile Pro Met His Ile Asp His Asp Arg Asn 50 55 60

Met Asp Trp Val Ser Thr Gin Leu Gin Ala Thr Cys Asn Val His.Lys 65 70 75 80

Ser Ala Phe Asn Asp Trp Phe Ser Gly His Leu Asn Phe Gin Ile Glu 85 90 95

His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Tyr His Xaa Val Ala 100 105 110

Pro Leu Val Gin Ser Leu Cys Ala Lys His Gly Ile Glu Tyr Gin Ser 115 120 125

Lys Pro Leu 130 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 87 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina • · · ·

117 (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

(xi)

Popis

sekvence:

SEQ ID NO: '

10 :

Cys 1

Ser

Pro

Lys

Ser 5

Ser

Pro

Thr

Arg

Asn 10

Met

Thr

Pro

Ser

Pro 15

Phe

Ile

Asp

Trp

Leu 20

Trp

Gly

Gly

Leu

Asn 25

Tyr

Gin

Ile

Glu

His 30

His

Leu

Phe

Pro

Thr 35

Met

Pro

Arg

Cys

Asn 40

Leu

Asn

Arg

Cys

Met 45

Lys

Tyr

Val

Lys

Glu 50

Trp

Cys

Ala

Glu

Asn 55

Asn

Leu

Pro

Tyr

Leu 60

Val

Asp

Asp

Tyr

Phe 65

Val

Gly

Tyr

Asn

Leu 70

Asn

Leu

Gin

Gin

Leu 75

Lys

Asn

Met

Ala

Glu 80

Leu

Val

Gin

Ala

Lys 85

Ala

Ala

Informace o

SEQ ID NO:

11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 143 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevatní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

(xi

) p

opi

S S

ekv

enc

e:

SEQ

ID

NO

: i:

1:

Arg

His

Glu

Ala

Ala

Arg

Gly

Gly

Thr

Arg

Leu

Ala

Tyr

Met

Leu

Val

1

5

10

15

Cys

Met

Gin

Trp

Thr

Asp

Leu

Leu

Trp

Ala

Ala

Ser

Phe

Tyr

Ser

Arg

20

25

30

Phe

Phe

Leu

Ser

Tyr

Ser

Pro

Phe

Tyr

Gly

Ala

Thr

Gly

Thr

Leu

Leu

35

40

45

Leu

Phe

Val

Ala

Val

Arg

Val

Leu

Glu

Ser

His

Trp

Phe

Val

Trp

Ile

50

55

60

Thr

Gin

Met

Asn

His

Ile

Pro

Lys

Glu

Ile

Gly

His

Glu

Lys

His

Arg

65

70

75

80

Asp

Trp

Ala

Ser

Ser

Gin

Leu

Ala

Ala

Thr

Cys

Asn

Val

Glu

Pro

Ser

85

90

95

Leu

Phe

Ile

Asp

Trp

Phe

Ser

Gly

His

Leu

Asn

Phe

Gin

Ile

Glu

His

100

105

110

118

His

Leu Phe 115

Pro

Thr Met

Thr

Arg His Asn Tyr Arg 120

Xaa Val Ala Pro 125

Leu

Val

Lys

Ala

Phe

Cys

Ala

Lys

His

Gly

Leu His

Tyr

Glu

Val

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

CCAAGCTTCT GCAGGAGCTC τττΤΤΤΤΤΤΤ TTTTT 35 (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 nukleových kyselin (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

CUACUACUAC UAGGAGTCCT CTACGGTGTT TTG 33 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 33 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární

« · ·

119 (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14':

CAUCAUCAUC AUATGATGCT CAAGCTGAAA CTG 33 (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina .(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

TACCAACTCG AGAAAATTGGC TGCTGCTCCC AGTGTGAGG 39 (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

AACTGATCTA GATTACTGCG CCTTACCCAT CTTGGAGGC 39 (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

120 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

TACCAACTCG AGAAAATGGC ACCTCCCAAC ACTATCGAT 39 (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 39 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 18:

AACTGATCTA GATTACTTCT TGAAAAAGAC CACGTCTCC 39 (2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 746 nukleových kyselin (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevatní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

CGTATGTCAC TCCATTCCAA ACTCGTTCAT GGTATCATAA ATATCAACAC ATTTACGCTC 60 CACTCCTCTA TGGTATTTAC ACACTCAAAT ATCGTACTCA AGATTGGGAA GCTTTTGTAA 120 AGGATGGTAA AAATGGTGCA ATTCGTGTTA GTGTCGCCAC AAATTTCGAT AAGGCCGCTT 180 ACGTCATTGG T.AAATTGTCT TTTGTTTTCT TCCGTTTCAT CCTTCCACTC CGTTATCATA 240 GCTTTACAGA TTTAATTTGT TATTTCCTCA TTGCTGAATT CGTCTTTGGT TGGTATCTCA 300 CAATTAATTT CCAAGTTAGT CATGTCGCTG AAGATCTCAA ATTCTTTGCT ACCCCTGAAA 360 GACCAGATGA ACCATCTCAA ATCAATGAAG ATTGGGCAAT CCTTCAACTT AAAACTACTC 420 AAGATTATGG TCATGGTTCA CTCCTTTGTA CCTTTTTTAG TGGTTCTTTA AATCATCAAG 480 TTGTTCATCA TTTATTCCCA TCAATTGCTC AAGATTTCTA CCCACAACTT GTACCAATTG 540 TAAAAGAAGT TTGTAAAGAA CATAACATTA CTTACCACAT TAAACCAAAC TTCACTGAAG 600 CTATTATGTC ACACATTAAT TACCTTTACA AAATGGGTAA TGATCCAGAT TATGTTAAAA 660 AACCATTAGC CTCAAAAGAT GATTAAATGA AATAACTTAA AAACCAATTA TTTACTTTTG 720

ACAAACAGTA ATATTAATAA ATACAA

746

121 • · · (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 227 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevatní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

Tyr

Val

Thr

Pro

Phe

Gin

Thr

Arg

Ser

Trp

Tyr

His

Lys

Tyr

Gin

1

5

10

15

His

Ile

Tyr

Ala

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly

Ile

Tyr

Thr

Leu

Lys

Tyr

20

25

30

Arg

Thr

Gin

Asp

Trp

Glu

Ala

Phe

Val

Lys

Asp

Gly

Lys

Asn

Gly

35

40

45

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Val

Ala

Thr

Asn

Phe

Asp

Lys

Ala

Ala

Tyr

50

55

60

Val

Ile

Gly

Lys

Leu

Ser

Phe

Val

Phe

Phe

Arg

Phe

Ile

Leu

Pro

65

70

75

Leu

Arg

Tyr

His

Ser

Phe

Thr

Asp

Leu

Ile

Cys

Tyr

Phe

Leu

Ile

80

85

90

Ala

Glu

Phe

Val

Phe

Gly

Trp

Tyr

Leu

Thr

Ile

Asn

Phe

Gin

Val

95

100

105

Ser

His

Val

Ala

Glu

Asp

Leu

Lys

Phe

Phe

Ala

Thr

Pro

Glu

Arg

110

115

120

Pro

Asp

Glu

Pro

Ser

Gin

Ile

Asn

Glu

Asp

Trp

Ala

Ile

Leu

Gin

125

130

135

Leu

Lys

Thr

Thr

Gin

Asp

Tyr

Gly

His

Gly

Ser

Leu

Leu

Cys

Thr

140

145

150

Phe

Phe

Ser

Gly

Ser

Leu

Asn

His

Gin

Val

Val

His

His

Leu

Phe

155

160

165

Pro

Ser

Ile

Ala

Gin

Asp

Phe

Tyr

Pro

Gin

Leu

Val

Pro

Ile

Val

170

175

180

Lys

Glu

Val

Cys

Lys

Glu

His

Asn

Ile

Thr

Tyr

His

Ile

Lys

Pro

185

190

195

Asn

Phe

Thr

Glu

Ala

Ile

Met

Ser

His

Ile

Asn

Tyr

Leu

Tyr

Lys

200

205

210

Met

Gly

Asn

Asp

Pro

Asp

Tyr

Val

Lys

Lys

Pro

Leu

Ala

Ser

Lys

215

220

225

Asp

Asp

* * *

(2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 nukleových kyselin (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní

122

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

TTTTGGAAGG NTCCAAGTTN ACCACGGANT NGGCAAGTTN ACGGGGCGGA AANCGGTTTT 60

CCCCCCAAGC CTTTTGTCGA CTGGTTCTGT GGTGGCTTCC AGTACCAAGT CGACCACCAC 120

TTATTCCCCA GCCTGCCCCG ACACAATCTG GCCAAGACAC ACGCACTGGT CGAATCGTTC 180

TGCAAGGAGT GGGGTGTCCA GTACCACGAA GCCGACCTCG TGGACGGGAC CATGGAAGTC 240

TTGCACCATT TGGGCAGCGT GGCCGGCGAA TTCGTCGTGG ATTTTGTACG CGACGGACCC 300

GCCATGTAAT CGTCGTTCGT GACGATGCAA GGGTTCACGC.ACATCTACAC ACACTCACTC 360 ACACAACTAG TGTAACTCGT ATAGAATTCG GTGTCGACCT GGACCTTGTT TGACTGGTTG 420 GGGATAGGGT AGGTAGGCGG ACGCGTGGGT CGNCCCCGGG AATTCTGTGA CCGGTACCTG 480 GCCCGCGTNA AAGT ⁴⁹⁴ (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 87 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

	(Xi)	1 Popis	sekvence	: SEQ	ID	NO:	22:
Phe	Trp	Lys Xxx	Pro Ser Xxx	Pro Arg	Xxx	Xxx	Gin Val Xxx Gly
1			5		10		15
Ala	Glu	Xxx Gly	Phe Pro Pro	Lys Pro	Phe	Val	Asp Trp Phe Cys
			20		25		30
Gly	Gly	Phe Gin	Tyr Gin Val	Asp His	His	Leu	Phe Pro Ser Leu
			35		40		45
Pro	Arg	His Asn	Leu Ala Lys	Thr His	Ala	Leu	Val Glu Ser Phe
			50		55		60
Cys	Lys	Glu Trp	Gly Val Gin	Tyr His	Glu	Ala	Asp Leu Val Asp
			65		70		75
Gly	Thr	Met Glu	Val Leu His	His Leu	Gly	Ser	Val Ala Gly Glu
			65		70		75
Phe	Val	Val Asp	Phe Val Arg	Asp Gly	Pro	Ala	Met
			80		85

(2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 520 nukleových kyselin (B) TYP: aminokyselina

(C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

GGATGGAGTT CGTCTGGATC GCTGTGCGCT ACGCGACGTG GTTTAAGCGT CATGGGTGCG 60 CTTGGGTACA CGCCGGGGCA GTCGTTGGGC ATGTACTTGT GCGCCTTTGG TCTCGGCTGC 120 ATTTACATTT TTCTGCAGTT CGCCGTAAGT CACACCCATT TGCCCGTGAG CAACCCGGAG 180 GATCAGCTGC ATTGGCTCGA GTACGCGCGG ACCACACTGT GAACATCAGC ACCAAGTCGT 240 GGTTTGTCAC ATGGTGGATG TCGAACCTCA ACTTTCAGAT CGAGCACCAC CTTTTCCCCA 300 CGGCGCCCCA GTTCCGTTTC AAGGAGATCA GCCCGCGCGT CGAGGCCCTC TTCAAGCGCC 360 ACGGTCTCCC TTACTACGAC ATGCCCTACA CGAGCGCCGT CTCCACCACC TTTGCCAACC 420 TCTACTCCGT CGGCCATTCC GTCGGCGACG CCAAGCGCGA CTAGCCTCTT TTCCTAGACC 480 TTAATTCCCC ACCCCACCCC ATGTTCTGTC TTCCTCCCGC 520 (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 153 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

(	xi)	Popis	sekvence	: SEQ	ID	NO:	24 :
Met 1	Glu	Phe Val	Trp Ile Ala 5	Val Arg	Tyr 10	Ala	Thr Trp Phe Lys 15
Arg	His	Gly Cys	Ala Trp Val 20	His Ala	Gly 25	Ala	Val Val Gly His 30
Val	Leu	Val Arg	Leu Trp Ser 35	Arg Leu	His 40	Leu	His Phe Ser Ala 45
Val	Arg	Arg Lys	Ser His Pro 50	Phe Ala	Arg 55	Glu	Gin Pro Gly Gly 60
Ser	Ala	Ala Leu	Ala Arg Val 65	Arg Ala	Asp 70	His	Thr Val Asn Ile 75
Ser	Thr	Lys Ser	Trp Phe Val 80	Thr Trp	Trp 85	Met	Ser Asn Leu Asn 90
Phe	Gin	Ile Glu	His His Leu 95	Phe Pro	Thr 100	Ala	Pro Gin Phe Arg 105
Phe	Lys	Glu Ile	Ser Pro Arg 110	Val Glu	Ala 115	Leu	Phe Lys Arg His 120
Gly	Leu	Pro Tyr	Tyr Asp Met 125	Pro Tyr	Thr 130	Ser	Ala Val Ser Thr 135
Thr	Phe	Ala Asn	Leu Tyr Ser 140	Val Gly	His 145	Ser	Val Gly Asp Ala 150

Lys Arg Asp » ·

124

2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 420 nukleových kyselin (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

ACGCGTCCGC CCACGCGTCC GCCGCGAGCA ACTCATCAAG GAAGGCTACT TTGACCCCTC 60 GCTCCCGCAC ATGACGTACC GCGTGGTCGA GATTGTTGTT CTCTTCGTGC TTTCCTTTTG 120 GCTGATGGGT CAGTCTTCAC CCCTCGCGCT CGCTCTCGGC ATTGTCGTCA GCGGCATCTC 180 TCAGGGTCGC TGCGGCTGGG TAATGCATGA GATGGGCCAT GGGTCGTTCA CTGGTGTCAT 240 TTGGCTTGAC GACCGGTTGT GCGAGTTCTT TTACGGCGTT GGTTGTGGCA TGAGCGGTCA 300 TTACTGGAAA AACCAGCACA GCAAACACCA CGCAGCGCCA AACCGGCTCG AGCACGATGT 360 AGATCTCAAC ACCTTGCCAT TGGTGGCCTT CAACGAGCGC GTCGTGCGCA AGGTCCGACC 420

2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 125 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ I

NO: 26:

Arg 1	Val	Arg	Pro	Arg 5
Tyr	Phe	Asp	Pro	Ser 20
Ile	Val	Val	Leu	Phe 35
Ser	Pro	Leu	Ala	Leu 50
Gin	Gly	Arg	Cys	Gly 65
Phe	Thr	Gly	Val	Ile 65
Tyr	Gly	Val	Gly	Cys 80
His	Ser	Lys	His	His 95
Asp	Leu	Asn	Thr	Leu 110
Arg	Lys	Val	Arg	Pro 125

Val	Arg	Arg	Glu	Gin 10
Leu	Pro	His	Met	Thr 25
Val	Leu	Ser	Phe	Trp 40
Ala	Leu	Gly	Ile	Val 55
Trp	Val	Met	His	Glu 70
Trp	Leu	Asp	Asp	Arg 70
Gly	Met	Ser	Gly	His 85
Ala	Ala	Pro	Asn	Arg 100
Pro	Leu	Val	Ala	Phe 115

Leu	Ile	Lys	Glu	Gly 15
Tyr	Arg	Val	Val	Glu 30
Leu	Met	Gly	Gin	Ser 45
Val	Ser	Gly	Xle	Ser 60
Met	Gly	His	Gly	Ser 75
Leu	Cys	Glu	Phe	Phe 75
Tyr	Trp	Lys	Asn	Gin 90
Leu	Glu	His	Asp	Val 105
Asn	Glu	Arg	Val	Val 120

« ·

125 (2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1219 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (editovaný kontig 2692004)

(xi) Popis ,	sekvence: AGATCCTGGC	SEQ ID AAAGTATCCA	NO: 27:
GCACGCCGAC	CGGCGCCGGG	GAGATAAAGT	CCTTGATGAA	60
ACCTGATCCC	AATTTGATAT	GGATTATAAT	TATGATGGTT	CTCACCCAGT	TGGGTGCATT	120
TTACATAGTA	AAAGACTTGG	ACTGGAAATG	GGTCATATTT	GGGGCCTATG	CGTTTGGCAG	180
TTGCATTAAC	CACTCAATGA	CTCTGGCTAT	TCATGAGATT	GCCCACAATG	CTGCCTTTGG	240
CAACTGCAAA	GCAATGTGGA	ATCGCTGGTT	TGGAATGTTT	GCTAATCTTC	CTATTGGGAT	300
TCCATATTCA	ATTTCCTTTA	AGAGGTATCA	CATGGATCAT	CATCGGTACC	TTGGAGCTGA	360
TGGCGTCGAT	GTAGATATTC	CTACCGATTT	TGAGGGCTGG	TTCTTCTGTA	CCGCTTTCAG	420
AAAGTTTATA	TGGGTTATTC	TTCAGCCTCT	CTTTTATGCC	TTTCGACCTC	TGTTCATCAA	480
CCCCAAACCA	ATTACGTATC	TGGAAGTTAT	CAATACCGTG	GCACAGGTCA	CTTTTGACAT	540
TTTAATTTAT	TACTTTTTGG	GAATTAAATC	CTTAGTCTAC	ATGTTGGCAG	CATCTTTACT	600
TGGCCTGGGT	TTGCACCCAA	TTTCTGGACA	TTTTATAGCT	GAGCATTACA	TGTTCTTAAA	660
GGGTCATGAA	ACTTACTCAT	ATTATGGGCC	TCTGAATTTA	CTTACCTTCA	ATGTGGGTTA	720
TCATAATGAA	CATCATGATT	TCCCCAACAT	TCCTGGAAAA	AGTCTTCCAC	TGGTGAGGAA	780
AATAGCAGCT	GAATACTATG	ACAACCTCCC	TCACTACAAT	TCCTGGATAA	AAGTACTGTA	840
TGATTTTGTG	ATGGATGATA	CAATAAGTCC	CTACTCAAGA	ATGAAGAGGC	ACCAAAAAGG	900
AGAGATGGTG	CTGGAGTAAA	TATCATTAGT	GCCAAAGGGA	TTCTTCTCCA	AAACTTTAGA	960
TGATAAAATG	GAATTTTTGC	ATTATTAAAC	TTGAGACCAG	TGATGCTCAG	AAGCTCCCCT	1020
GGCACAATTT	CAGAGTAAGA	GCTCGGTGAT	ACCAAGAAGT	GAATCTGGCT	TTTAAACAGT	1080
CAGCCTGACT	CTGTACTGCT	CAGTTTCACT	CACAGGAAAC	TTGTGACTTG	TGTATTATCG	1140
TCATTGAGGA	TGTTTCACTC	ATGTCTGTCA	TTTTATAAGC	ATATCATTTA	AAAAGCTTCT	1200

AAAAAGCTAT TTCGCCAGG

1219 • · • ·

126 (2) Informace o SEQ ID NO: 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 65 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (editovaný kontig 2153526) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:

TTACCTTCTA	CGTCCGCTTC	TTCCTCACTT	ATGTGCCACT	ATTGGGGCTG	AAAGCTTCCT	60
GGGCCTTTTC	TTCATAGTCA	GGTTCCTGGA	AAGCAACTGG	TTTGTGTGGG	TGACACAGAT	120
GAACCATATT	CCCATGCACA	TTGATCATGA	CCGGAACATG	GACTGGGTTT	CCACCCAGCT	180
CCAGGCCACA	TGCAATGTCC	ACAAGTCTGC	CTTCAATGAC	TGGTTCAGTG	GACACCTCAA	240
CTTCCAGATT	GAGCACCATC	TTTTTCCCAC	GATGCCTCGA	CACAATTACC	ACAAAGTGGC	300
TCCCCTGGTG	CAGTCCTTGT	GTGCCAAGCA	TGGCATAGAG	TACCAGTCCA	AGCCCCTGCT	360
GTCAGCCTTC	GCCGACATCA	TCCACTCACT	AAAGGAGTCA	GGGCAGCTCT	GGCTAGATGC	420
CTATCTTCAC	CAATAACAAC	AGCCACCCTG	CCCAGTCTGG	AAGAAGAGGA	GGAAGACTCT	480
GGAGCCAAGG	CAGAGGGGAG	CTTGAGGGAC	AATGCCACTA	TAGTTTAATA	CTCAGAGGGG	540
GTTGGGTTTG	GGGACATAAA	GCCTCTGACT	CAAACTCCTC	CCTTTTATCT	TCTAGCCACA	600

GTTCTAAGAC CCAAAGTGGG GGGTGGACAC AGAAGTCCCT AGGAGGGAAG GAGCT

655

127 * · (2) Informace o SEQ ID NO: 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 304 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina kontig 3506132) (editovaný (xi

Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:

GTCTTTTACT	TTGGCAATGG	CTGGATTCCT	ACCCTCATCA	CGGCCTTTGT	CCTTGCTACC	60
TCTCAGGCCC	AAGCTGGATG	GCTGCAACAT	GATTATGGCC	ACCTGTCTGT	CTACAGAAAA	120
CCCAAGTGGA	ACCACCTTGT	CCACAAATTC	GTCATTGGCC	ACTTAAAGGG	TGCCTCTGCC	180
AACTGGTGGA	ATCATCGCCA	CTTCCAGCAC	CACGCCAAGC	CTAACATCTT	CCACAAGGAT	240
CCCGATGTGA	ACATGCTGCA	CGTGTTTGTT	CTGGGCGAAT	GGCAGCCCAT	CGAGTACGGC	300

AAGA ³⁰⁴ (2) Informace o SEQ ID NO: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 918 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
kontig 3854933)
(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 30:

' editovaný

128

CAGGGACCTA	CCCCGCGCTA	CTTCACCTGG	GACGAGGTGG	CCCAGCGCTC	AGGGTGCGAG	60
GAGCGGTGGC	TAGTGATCGA	CCGTAAGGTG	TACAACATCA	GCGAGTTCAC	CCGCCGGCAT	120
CCAGGGGGCT	CCCGGGTCAT	CAGCCACTAC	GCCGGGCAGG	ATGCCACGGA	TCCCTTTGTG	180
GCCTTCCACA	TCAACAAGGG	CCTTGTGAAG	AAGTATATGA	ACTCTCTCCT	GATTGGAGAA	240
CTGTCTCCAG	AGCAGCCCAG	CTTTGAGCCC	ACCAAGAATA	AAGAGCTGAC	AGATGAGTTC	300
CGGGAGCTGC	GGGCCACAGT	GGAGCGGATG	GGGCTCATGA	AGGCCAACCA	TGTCTTCTTC	360
CTGCTGTACC	TGCTGCACAT	CTTGCTGCTG	GATGGTGCAG	CCTGGCTCAC	CCTTTGGGTC	420
TTTGGGACGT	CCTTTTTGCC	CTTCCTCCTC	TGTGCGGTGC	TGCTCAGTGC	AGTTCAGGCC	480
CAGGCTGGCT	GGCTGCAGCA	TGACTTTGGG	CACCTGTCGG	TCTTCAGCAC	CTCAAAGTGG	540
AACCATCTGC	TACATCATTT	TGTGATTGGC	CACCTGAAGG	GGGCCCCCGC	CAGTTGGTGG	600
AACCACATGC	ACTTCCAGCA	CCATGCCAAG	CCCAACTGCT	TCCGCAAAGA	CCCAGACATC	660
AACATGCATC	CCTTCTTCTT	TGCCTTGGGG	AAGATCCTCT	CTGTGGAGCT	TGGGAAACAG	720
AAGAAAAAAT	ATATGCCGTA	CAACCACCAG	CACARATACT	TCTTCCTAAT	TGGGCCCCCA	780
GCCTTGCTGC	CTCTCTACTT	CCAGTGGTAT	ATTTTCTATT	TTGTTATCCA	GCGAAAGAAG	840
TGGGTGGACT	TGGCCTGGAT	CAGCAAACAG	GAATACGATG	AAGCCGGGCT	TCCATTGTCC	900
ACCGCAAATG	CTTCTAAA					918

(2) Informace o SEQ ID NO: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1686 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (editovaný kontig 2511785) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:

• »

	129	• · • · • · • · ·	• • · • • ·
GCCACTTAAA	GGGTGCCTCT	GCCAACTGGT	GGAATCATCG	CCACTTCCAG	CACCACGCCA	60
AGCCTAACAT	CTTCCACAAG	GATCCCGATG	TGAACATGCT	GCACGTGTTT	GTTCTGGGCG	120
AATGGCAGCC	CATCGAGTAC	GGCAAGAAGA	AGCTGAAATA	CCTGCCCTAC	AATCACCAGC	180
ACGAATACTT	CTTCCTGATT	GGGCCGCCGC	TGCTCATCCC	CATGTATTTC	CAGTACCAGA	240
TCATCATGAC	CATGATCGTC	CATAAGAACT	GGGTGGACCT	GGCCTGGGCC	GTCAGCTACT	300
ACATCCGGTT	CTTCATCACC	TACATCCCTT	TCTACGGCAT	CCTGGGAGCC	CTCCTTTTCC	360
TCAACTTCAT	CAGGTTCCTG	GAGAGCCACT	GGTTTGTGTG	GGTCACACAG	ATGAATCACA	420
TCGTCATGGA	GATTGACCAG	GAGGCCTACC	GTGACTGGTT	CAGTAGCCAG	CTGACAGCCA	480
CCTGCAACGT	GGAGCAGTCC	TTCTTCAACG	ACTGGTTCAG	TGGACACCTT	AACTTCCAGA	540
TTGAGCACCA	CCTCTTCCCC	ACCATGCCCC	GGCACAACTT	ACACAAGATC	GCCCCGCTGG	600
TGAAGTCTCT	ATGTGCCAAG	CATGGCATTG	AATACCAGGA	GAAGCCGCTA	CTGAGGGCCC	660
TGCTGGACAT	CATCAGGTCC	CTGAAGAAGT	CTGGGAAGCT	GTGGCTGGAC	GCCTACCTTC	720
ACAAATGAAG	CCACAGCCCC	CGGGACACCG	TGGGGAAGGG	GTGCAGGTGG	GGTGATGGCC	780
AGAGGAATGA	TGGGCTTTTG	TTCTGAGGGG	TGTCCGAGAG	GCTGGTGTAT	GCACTGCTCA	840
CGGACCCCAT	GTTGGATCTT	TCTCCCTTTC	TCCTCTCCTT	TTTCTCTTCA	CATCTCCCCC	900
ATAGCACCCT	GCCCTCATGG	GACCTGCCCT	CCCTCAGCCG	TCAGCCATCA	GCCATGGCCC	960
TCCCAGTGCC	TCCTAGCCCC	TTCTTCCAAG	GAGCAGAGAG	GTGGCCACCG	GGGGTGGCTC	1020
TGTCCTACCT	CCACTCTCTG	CCCCTAAAGA	TGGGAGGAGA	CCAGCGGTCC	ATGGGTCTGG	1080
CCTGTGAGTC	TCCCCTTGCA	GCCTGGTCAC	TAGGCATCAC	CCCCGCTTTG	GTTCTTCAGA	1140
TGCTCTTGGG	GTTCATAGGG	GCAGGTCCTA	GTCGGGCAGG	GCCCCTGACC	CTCCCGGCCT	1200
GGCTTCACTC	TCCCTGACGG	CTGCCATTGG	TCCACCCTTT	CATAGAGAGG	CCTGCTTTGT	1260
TACAAAGCTC	GGGTCTCCCT	CCTGCAGCTC	GGTTAAGTAC	CCGAGGCCTC	TCTTAAGATG	1320
TCCAGGGCCC	CAGGCCCGCG	GGCACAGCCA	GCCCAAACCT	TGGGCCCTGG	AAGAGTCCTC	1380
CACCCCATCA	CTAGAGTGCT	CTGACCCTGG	GCTTTCACGG	GCCCCATTCC	ACCGCCTCCC	1440
CAACTTGAGC	CTGTGACCTT	GGGACCAAAG	GGGGAGTCCC	TCGTCTCTTG	TGACTCAGCA	1500
GAGGCAGTGG	CCACGTTCAG	GGAGGGGCCG	GCTGGCCTGG	AGGCTCAGCC	CACCCTCCAG	1560
CTTTTCCTCA	GGGTGTCCTG	AGGTCCAAGA	TTCTGGAGCA	ATCTGACCCT	TCTCCAAAGG	1620
CTCTGTTATC	AGCTGGGCAG	TGCCAGCCAA	TCCCTGGCCA	TTTGGCCCCA	GGGGACGTGG	1680

GCCCTG

1686

130 • · (2) Informace o SEQ ID NO: 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1843 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (kontig 2535) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 32:

GTCTTTTACT	TTGGCAATGG	CTGGATTCCT	ACCCTCATCA	CGGCCTTTGT	CCTTGCTACC	60
TCTCAGGCCC	AAGCTGGATG	GCTGCAACAT	GATTATGGCC	ACCTGTCTGT	CTACAGAAAA	120
CCCAAGTGGA	ACCACCTTGT	CCACAAATTC	GTCATTGGCC	ACTTAAAGGG	TGCCTCTGCC	180
AACTGGTGGA	ATCATCGCCA	CTTCCAGCAC	CACGCCAAGC	CTAACATCTT	CCACAAGGAT	240
CCCGATGTGA	ACATGCTGCA	CGTGTTTGTT	CTGGGCGAAT	GGCAGCCCAT	CGAGTACGGC	300
AAGAAGAAGC	TGAAATACCT	GCCCTACAAT	CACCAGCACG	AATACTTCTT	CCTGATTGGG	360
CCGCCGCTGC	TCATCCCCAT	GTATTTCCAG	TACCAGATCA	TCATGACCAT	GATCGTCCAT	420
AAGAACTGGG	TGGACCTGGC	CTGGGCCGTC	AGCTACTACA	TCCGGTTCTT	CATCACCTAC	480
ATCCCTTTCT	ACGGCATCCT	GGGAGCCCTC	CTTTTCCTCA	ACTTCATCAG	GTTCCTGGAG	540
AGCCACTGGT	TTGTGTGGGT	CACACAGATG	AATCACATCG	TCATGGAGAT	TGACCAGGAG	600
GCCTACCGTG	ACTGGTTCAG	TAGCCAGCTG	ACAGCCACCT	GCAACGTGGA	GCAGTCCTTC	660
TTCAACGACT	GGTTCAGTGG	ACACCTTAAC	TTCCAGATTG	AGCACCACCT	CTTCCCCACC	720
ATGCCCCGGC	ACAACTTACA	CAAGATCGCC	CCGCTGGTGA	AGTCTCTATG	TGCCAAGCAT	780
GGCATTGAAT	ACCAGGAGAA	GCCGCTACTG	AGGGCCCTGC	TGGACATCAT	CAGGTCCCTG	840
AAGAAGTCTG	GGAAGCTGTG	GCTGGACGCC	TACCTTCACA	AATGAAGCCA	CAGCCCCCGG	900
GACACCGTGG	GGAAGGGGTG	CAGGTGGGGT	GATGGCCAGA	GGAATGATGG	GCTTTTGTTC	960
TGAGGGGTGT	CCGAGAGGCT	GGTGTATGCA	CTGCTCACGG	ACCCCATGTT	GGATCTTTCT	1020
CCCTTTCTCC	TCTCCTTTTT	CTCTTCACAT	CTCCCCCATA	GCACCCTGCC	CTCATGGGAC	1080
CTGCCCTCCC	TCAGCCGTCA	GCCATCAGCC	ATGGCCCTCC	CAGTGCCTCC	TAGCCCCTTC	1140
TTCCAAGGAG	CAGAGAGGTG	GCCACCGGGG	GTGGCTCTGT	CCTACCTCCA	CTCTCTGCCC	1200
CTAAAGATGG	GAGGAGACCA	GCGGTCCATG	GGTCTGGCCT	GTGAGTCTCC	CCTTGCAGCC	1260
TGGTCACTAG	GCATCACCCC	CGCTTTGGTT	CTTCAGATGC	TCTTGGGGTT	CATAGGGGCA	1320
GGTCCTAGTC	GGGCAGGGCC	CCTGACCCTC	CCGGCCTGGC	TTCACTCTCC	CTGACGGCTG	1380
CCATTGGTCC	ACCCTTTCAT	AGAGAGGCCT	GCTTTGTTAC	AAAGCTCGGG	TCTCCCTCCT	1440
GCAGCTCGGT	TAAGTACCCG	AGGCCTCTCT	TAAGATGTCC	AGGGCCCCAG	GCCCGCGGGC	1500

• · ··· · · » » · • · · * · · • · * ··« ··· • » · · ·«»·»·» ·· · »

1560

1620

1680

1740

1800

1843

ACAGCCAGCC CAAACCTTGG GCCCTGGAAG AGTCCTCCAC CCCATCACTA GAGTGCTCTG ACCCTGGGCT TTCACGGGCC CCATTCCACC GCCTCCCCAA CTTGAGCCTG TGACCTTGGG accaaagggg gagtccctcg tctcttgtga ctcagcagag gcagtggcca CGTTCAGGGA GGGGCCGGCT GGCCTGGAGG CTCAGCCCAC CCTCCAGCTT TTCCTCAGGG TGTCCTGAGG

TCCAAGATTC TGGAGCAATC TGACCCTTCT CCAAAGGCTC TGTTATCAGC TGGGCAGTGC

CAGCCAATCC CTGGCCATTT GGCCCCAGGG GACGTGGGCC CTG (2) Informace o SEQ ID NO: 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2257 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (editovaný kontig 253538a)

(xi) Popis	sekvence	: SEQ ID	NO: 33:
CAGGGACCTA	CCCCGCGCTA	CTTCACCTGG	GACGAGGTGG	CCCAGCGCTC	AGGGTGCGAG	60
GAGCGGTGGC	TAGTGATCGA	CCGTAAGGTG	TACAACATCA	GCGAGTTCAC	CCGCCGGCAT	120
CCAGGGGGCT	CCCGGGTCAT	CAGCCACTAC	GCCGGGCAGG	ATGCCACGGA	TCCCTTTGTG	180
GCCTTCCACA	TCAACAAGGG	CCTTGTGAAG	AAGTATATGA	ACTCTCTCCT	GATTGGAGAA	240
CTGTCTCCAG	AGCAGCCCAG	CTTTGAGCCC	ACCAAGAATA	AAGAGCTGAC	AGATGAGTTC	300
CGGGAGCTGC	GGGCCACAGT	GGAGCGGATG	GGGCTCATGA	AGGCCAACCA	TGTCTTCTTC	360
CTGCTGTACC	TGCTGCACAT	CTTGCTGCTG	GATGGTGCAG	CCTGGCTCAC	CCTTTGGGTC	420
TTTGGGACGT	CCTTTTTGCC	CTTCCTCCTC	TGTGCGGTGC	TGCTCAGTGC	AGTTCAGCAG	480
GCCCAAGCTG	GATGGCTGCA	ACATGATTAT	GGCCACCTGT	CTGTCTACAG	AAAACCCAAG	540
TGGAACCACC	TTGTCCACAA	ATTCGTCATT	GGCCACTTAA	AGGGTGCCTC	TGCCAACTGG	600
TGGAATCATC	GCCACTTCCA	GCACCACGCC	AAGCCTAACA	TCTTCCACAA	GGATCCCGAT	660
GTGAACATGC	TGCACGTGTT	TGTTCTGGGC	GAATGGCAGC	CCATCGAGTA	CGGCAAGAAG	720
AAGCTGAAAT	ACCTGCCCTA	CAATCACCAG	CACGAATACT	TCTTCCTGAT	TGGGCCGCCG	780
CTGCTCATCC	CCATGTATTT	CCAGTACCAG	ATCATCATGA	CCATGATCGT	CCATAAGAAC	840
TGGGTGGACC	TGGCCTGGGC	CGTCAGCTAC	TACATCCGGT	TCTTCATCAC	CTACATCCCT	900
TTCTACGGCA	TCCTGGGAGC	CCTCCTTTTC	CTCAACTTCA	TCAGGTTCCT	GGAGAGCCAC	960
TGGTTTGTGT	GGGTCACACA	GATGAATCAC	ATCGTCATGG	AGATTGACCA	GGAGGCCTAC	1020
CGTGACTGGT	TCAGTAGCCA	GCTGACAGCC	ACCTGCAACG	TGGAGCAGTC	CTTCTTCAAC	1080
GACTGGTTCA	GTGGACACCT	TAACTTCCAG	ATTGAGCACC	ACCTCTTCCC	CACCATGCCC	1140
CGGCACAACT	TACACAAGAT	CGCCCCGCTG	GTGAAGTCTC	TATGTGCCAA	GCATGGCATT	1200

132

GAATACCAGG	AGAAGCCGCT	ACTGAGGGCC	CTGCTGGACA	TCATCAGGTC	CCTGAAGAAG	1260
TCTGGGAAGC	TGTGGCTGGA	CGCCTACCTT	CACAAATGAA	GCCACAGCCC	CCGGGACACC	1320
.GTGGGGAAGG	GGTGCAGGTG	GGGTGATGGC	CAGAGGAATG	ATGGGCTTTT	GTTCTGAGGG	1380
GTGTCCGAGA	GGCTGGTGTA	TGCACTGCTC	ACGGACCCCA	TGTTGGATCT	TTCTCCCTTT	1440
CTCCTCTCCT	TTTTCTCTTC	ACATCTCCCC	CATAGCACCC	TGCCCTCATG	GGACCTGCCC	1500
TCCCTCAGCC	GTCAGCCATC	AGCCATGGCC	CTCCCAGTGC	CTCCTAGCCC	CTTCTTCCAA	1560
GGAGCAGAGA	GGTGGCCACC	GGGGGTGGCT	CTGTCCTACC	TCCACTCTCT	GCCCCTAAAG	1620
ATGGGAGGAG	ACCAGCGGTC	CATGGGTCTG	GCCTGTGAGT	CTCCCCTTGC	AGCCTGGTCA	1680
CTAGGCATCA	CCCCCGCTTT	GGTTCTTCAG	ATGCTCTTGG	GGTTCATAGG	GGCAGGTCCT	1740
AGTCGGGCAG	GGCCCCTGAC	CCTCCCGGCC	TGGCTTCACT	CTCCCTGACG	GCTGCCATTG	1800
GTCCACCCTT	TCATAGAGAG	GCCTGCTTTG	TTACAAAGCT	CGGGTCTCCC	TCCTGCAGCT	1860
CGGTTAAGTA	CCCGAGGCCT	CTCTTAAGAT	GTCCAGGGCC	CCAGGCCCGC	GGGCACAGCC	1920
AGCCCAAACC	TTGGGCCCTG	GAAGAGTCCT	CCACCCCATC	ACTAGAGTGC	TCTGACCCTG	1980
GGCTTTCACG	GGCCCCATTC	CACCGCCTCC	CCAACTTGAG	CCTGTGACCT	TGGGACCAAA	2040
GGGGGAGTCC	CTCGTCTCTT	GTGACTCAGC	AGAGGCAGTG	GCCACGTTCA	GGGAGGGGCC	2100
GGCTGGCCTG	GAGGCTCAGC	CCACCCTCCA	GCTTTTCCTC	AGGGTGTCCT	GAGGTCCAAG	2160
ATTCTGGAGC	AATCTGACCC	TTCTCCAAAG	GCTCTGTTAT	CAGCTGGGCA	GTGCCAGCCA	2220
ATCCCTGGCC	ATTTGGCCCC	AGGGGACGTG	GGCCCTG			2257

(2) Informace o SEQ ID NO: 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 411 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (O) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární ín) DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontigu 2692004) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 34:

• · • ·

133

His

Ala

Asp

Arg Arg Arg

Glu

Ile

Leu

Ala

Lys

Tyr

Pro

Glu

Ile

1

5

10

15

Lys

Ser

Leu

Met

Lys

Pro

Asp

Pro

Asn

Leu

Ile

Trp

Ile

Ile

Ile

20

25

30

Met

Met

Val

Leu

Thr

Gin

Leu

Gly

Ala

Phe

Tyr

Ile

Val

Lys

Asp

35

40

45

Leu

Asp

Trp

Lys

Trp

Val

Ile

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Phe

Gly

Ser

50

55

60

Cys

Ile

Asn

His

Ser

Met

Thr

Leu

Ala

Ile

His

Glu

Ile

Ala

His

65

70

75

Asn

Ala

Ala

Phe

Gly

Asn

Cys

Lys

Ala

Met

Trp

Asn

Arg

Trp

Phe

80

85

90

Gly

Met

Phe

Ala

Asn

Leu

Pro

Ile

Gly

Ile

Pro

Tyr

Ser

Ile

Ser

95

100

105

Phe

Lys

Arg

Tyr

His

Met

Asp

His

His

Arg

Tyr

Leu

Gly

Ala

Asp

110

115

120

Gly

Val

Asp

Val

Asp

Ile

Pro

Thr

Asp

Phe

Glu

Gly

Trp

Phe

Phe

125

130

135

Cys

Thr

Ala

Phe

Arg

Lys

Phe

Ile

Trp

Val

Ile

Leu

Gin

Pro

Leu

140

145

150

Phe

Tyr

Ala

Phe

Arg

Pro

Leu

Phe

Ile

Asn

Pro

Lys

Pro

Ile

Thr

155

160

165

Tyr

Leu

Glu

Val

Ile

Asn

Thr

Val

Ala

Gin

Val

Thr

Phe

Asp

Ile

170

175

180

Leu

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Leu

Gly

Ile

Lys

Ser

Leu

Val

Tyr

Met

Leu

185

190

195

Ala

Ala

Ser

Leu

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

His

Pro

Ile

Ser

Gly

His

200

205

210

Phe

Ile

Ala

Glu

His

Tyr

Met

Phe

Leu

Lys

Gly

His

Glu

Thr

Tyr

215

220

225

Ser

Tyr

Tyr

Gly

Pro

Leu

Asn

Leu

Leu

Thr

Phe

Asn

Val

Gly

Tyr

230

235

240

His

Asn

Glu

His

His

Asp

Phe

Pro

Asn

Ile

Pro

Gly

Lys

Ser

Leu

245

250

255

Pro

Leu

Val

Arg

Lys

Ile

Ala

Ala

Glu

Tyr

Tyr

Asp

Asn

Leu

Pro

260

265

270

His

Tyr

Asn

Ser

Trp

Ile

Lys

Val

Leu

Tyr

Asp

Phe

Val

Met

Asp

275

280

285

Asp

Thr

Ile

Ser

Pro

Tyr

Ser

Arg

Met

Lys

Arg

His

Gin

Lys

Gly

290

295

300

Glu

Met

Val

Leu

Glu

★ * ★

Ile

Ser

Leu

Val

Pro

Lys

Gly

Phe

Phe

305

310

315

Ser

Lys

Thr

Leu

Asp

Asp

Lys

Met

Glu

Phe

Leu

His

Tyr

★ * *

Thr

320

325

330

★ * ★

Asp

Gin

* ★ ★

Cys

Ser

Glu

Ala

Pro

Leu

Ala

Gin

Phe

Gin

Ser

335

340

345

Lys

Ser

Ser

Val

Ile

Pro

Arg

Ser

Glu

Ser

Gly

Phe

* * *

Thr

Val

350

355

360

Ser

Leu

Thr

Leu

Tyr

Cys

Ser

Val

Ser

Leu

Thr

Gly

Asn

Leu

* * *

365

370

375

Leu

Val

Tyr

Tyr

Arg

His

★ ★ ★

Gly

Cys

Phe

Thr

His

Val

Cys

His

380

385

390

Phe

Ile

Ser

Ile

Ser

Phe

Lys

Lys

Leu

Leu

Lys

Ser

Tyr

Phe

Ala

400

405

410

Arg ·· • 0 (2) Informace o SEQ ID NO: 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 218 aminokyselin
(B)	TYP: aminokyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontigu

2153526)

	(xi)	Popis	sekvence:	SEQ ID NO:	35:
Tyr 1	Leu Leu	Arg Pro 5	Leu Leu Pro	His Leu Cys Ala 10	Thr Ile Gly 15
Ala	Glu Ser	Phe Leu 20	Gly Leu Phe	Phe Ile Val Arg 25	Phe Leu Glu 30
Ser	Asn Trp	Phe Val 35	Trp Val Thr	Gin Met Asn His 40	Ile Pro Met 45
His	Ile Asp	His Asp 50	Arg Asn Met	Asp Trp Val Ser 55	Thr Gin Leu 60
Gin	Ala Thr	Cys Asn 65	Val His Lys	Ser Ala Phe Asn 70	Asp Trp Phe 75
Ser	Gly His	Leu Asn 80	Phe Gin Ile	Glu His His Leu 85	Phe Pro Thr 90
Met	Pro Arg	His Asn 95	Tyr His Lys	Val Ala Pro Leu 100	Val Gin Ser 105
Leu	Cys Ala	Lys His 110	Gly Ile Glu	Tyr Gin Ser Lys 115	Pro Leu Leu 120
Ser	Ala Phe	Ala Asp 125	Ile Ile His	Ser Leu Lys Glu 130	Ser Gly Gin 135
Leu	Trp Leu	Asp Ala 140	Tyr Leu His	Gin *★* Gin Gin 145	Pro Pro Cys 150
Pro	Val Trp	Lys Lys 155	Arg Arg Lys	Thr Leu Glu Pro 160	Arg Gin Arg 165
Gly	Ala ***	Gly Thr 170	Met Pro Leu	*** Phe Asn Thr 175	Gin Arg Gly 180
Leu	Gly Leu	Gly Thr 185	*** Ser Ley	*** Leu Lys Leu 190	Leu Pro Phe 195
Ile Glu	Phe *** Val Pro	Pro Gin 200 Arg Arg 215	Phe ★** Asp Glu Gly Ala	Pro Lys Trp Gly 205	Val Asp Thr 210

• ·

• · ·	• 4 · · · ·
	• · ·	• · · · ·
135	• · · • · · · · ·	• · ··· ··· • · ·

(2) Informace o SEQ ID NO: 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 86 aminokyselin
(B)	TYP: aminokyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontigu 3506132)

	(xi)	Popis	sekvence:	SEQ ID NO: 2	56:
Val Phe	Tyr Phe	Gly Asn	Gly Trp Ile	Pro Thr Leu Ile	Thr Ala
1		5		10	15
Phe Val	Leu Ala	Thr Ser	Gin Ala Gin	Ala Gly Trp Leu	Gin His
		20		25	30
Asp Tyr	Gly His	Leu Ser	Val Tyr Arg	Lys Pro Lys Trp	Asn His
		35		40	45
Leu Val	His Lys	Phe Val	Ile Gly His	Leu Lys Gly Ala	Ser Ala
		50		55	60
Asn Trp	Trp Asn	His Arg	His Phe Gin	His His Ala Lys	Pro Asn
		65		70	75
Leu Gly	Glu Trp	Gin Pro	Ile Glu Tyr	Gly Lys Xxx
		80		85
(2)	Informace o	SEQ ID NO: 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 306 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontigu 3854933) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 37:

Gin Gly Pro Thr Pro Arg Tyr Phe Thr Trp Asp Glu Val Ala Gin 1 5 10

Arg Ser Gly Cys Glu Glu Arg Trp Leu Val Ile Asp Arg Lys Val 20 25 30

Tvr Asn Ile Ser Glu Phe Thr Arg Arg His Pro Gly Gly Ser Arg 35 40 45 y_ai_ χχθ ser His Tvr Ala Gly Gin Asp Ala Thr Asp Pro Phe Val 50 55 60

Ala Phe His Ile Asn Lys Gly Leu Val Lys Lys Tyr Met Asn Ser 65 70 75

Leu Leu Ile Gly Glu Leu Ser Pro Glu Gin Pro Ser Phe Glu Pro • ·

80

85

90

Thr

Lys

Asn

Lys

Glu

Leu

Thr

Asp

Glu

Phe

Arg

Glu

Leu

Arg

Ala

95

100

105

Thr

Val

Glu

Arg

Met

Gly

Leu

Met

Lys

Ala

Asn

His

Val

Phe

Phe

110

115

120

Leu

Leu

Tyr

Leu

Leu

His

Ile

Leu

Leu

Leu

Asp

Gly

Ala

Ala

Trp

125

130

135

Leu

Thr

Leu

Trp

Val

Phe

Gly

Thr

Ser

Phe

Leu

Pro

Phe

Leu

Leu

140

145

150

Cys

Ala

Val

Leu

Leu

Ser

Ala

Val

Gin

Ala

Gin

Ala

Gly

Trp

Leu

155

160

165

Gin

His

Asp

Phe

Gly

His

Leu

Ser

Val

Phe

Ser

Thr

Ser

Lys

Trp

170

175

180

Asn

His

Leu

Leu

His

His

Phe

Val

Ile

Gly

His

Leu

Lys

Gly

Ala

185

190

195

Pro

Ala

Ser

Trp

Trp

Asn

His

Met

His

Phe

Gin

His

His

Ala

Lys

200

205

210

Pro

Asn

Cys

Phe

Arg

Lys

Asp

Pro

Asp

Ile

Asn

Met

His

Pro

Phe

215

220

225

Phe

Phe

Ala

Leu

Gly

Lys

Xle

Leu

Ser

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Gin

230

235

240

Lys

Lys

Lys

Tyr

Met

Pro

Tyr

Asn

His

Gin

His

Xxx

Tyr

Phe

Phe

245

250

255

Leu

Ile

Gly

Pro

Pro

Ala

Leu

Leu

Pro

Leu

Tyr

Phe

Gin

Trp

Tyr

260

265

270

ile

Phe

Tyr

Phe

Val

Ile

Gin

Arg

Lys

Lys

Trp

Val

Asp

Leu

Ala

275

280

285

Trp

Ile

Ser

Lys

Gin

Glu

Tyr

Asp

Glu

Ala

Gly

Leu

Pro

Leu

Ser

290

295

300

Thr

Ala

Asn

Ala

Ser

Lys

305

(2) Informace o SEQ ID NO: 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 566 aminokyselin (E) TYP: aminokyselina (F) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (G) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontigu 2511785) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 38:

His Leu Lys Gly Ala Ser Ala Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe 1 5 10 15

Gin His His Ala Lys Pro Asn Ile Phe His Lys Asp Pro Asp Val

25 30

Asn Met Leu His Val Phe Val Leu Gly Glu Trp Gin Pro Ile Glu

40 45

Tyr Gly Lys Lys Lys Leu Lys Tyr Leu Pro Tyr Asn His Gin His

55 60

Glu Tvr Phe Phe Leu Ile Gly Pro Pro Leu Leu Ile Pro Met Tyr

70 75

Phe Gin Tyr Gin Ile Ile Met Thr Met Ile Val His Lys Asn Trp

85 90

Val Asp Leu Ala Trp Ala Val Ser Tyr Tyr Ile Arg Phe Phe Ile

100 105

Ile Pro Phe Tyr Gly Tle Leu Gly Ala Leu Leu Phe Leu

110 115 120

Asn Phe Ile Arg Phe Leu Glu Ser His Trp Phe Val Trp Val Thr

125 130 135

Gin Met Asn His Ile Val Met Glu Ile Asp Gin Glu Ala Tyr Arg

140 145 150

137

Asp

Trp Phe

Ser

Ser Gin Leu Thr Ala Thr Cys Asn Val Glu

Gin 165

155

160

Ser

Phe

Phe

Asn

Asp

Trp

Phe

Ser

Gly

His

Leu

Asn

Phe

Gin

Ile

170

175

180

Glu

His

His

Leu

Phe

Pro

Thr

Met

Pro

Arg

His

Asn

Leu

His

Lys

185

190

195

Ile

Ala

Pro

Leu

Val

Lys

Ser

Leu

Cys

Ala

Lys

His

Gly

Ile

Glu

200

205

210

Tyr

Gin

Glu

Lys

Pro

Leu

Leu

Arg

Ala

Leu

Leu

Asp

Ile

Ile

Arg

215

220

225

Ser

Leu

Lys

Lys

Ser

Gly

Lys

Leu

Trp

Leu

Asp

Ala

Tyr

Leu

His

230

235

240

Lys

* ★ ★

Ser

His

Ser

Pro

Arg

Asp

Thr

Val

Gly

Lys

Gly

Cys

Arg

245

250

255

Trp

Gly

Asp

Gly

Gin

Arg

Asn

Asp

Gly

Leu

Leu

Phe

ir * *

Gly

Val

260

265

270

Ser

Glu

Arg

Leu

Val

Tyr

Ala

Leu

Leu

Thr

Asp

Pro

Met

Leu

Asp

275

280

285

Leu

Ser

Pro

Phe

Leu

Leu

Ser

Phe

Phe

Ser

Ser

His

Leu

Pro

His

290

295

300

Ser

Thr

Leu

Pro

Ser

Trp

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu

Ser

Arg

Gin

Pro

305

310

315

Ser

Ala

Met

Ala

Leu

Pro

Val

Pro

Pro

Ser

Pro

Phe

Phe

Gin

Gly

320

325

330

Ala

Glu

Arg

Trp

Pro

Pro

Gly

Val

Ala

Leu

Ser

Tyr

Leu

His

Ser

335

340

345

Leu

Pro

Leu

Lys

Met

Gly

Gly

Asp

Gin

Arg

Ser

Met

Gly

Leu

Ala

350

355

360

Cys

Glu

Ser

Pro

Leu

Ala

Ala

Trp

Ser

Leu

Gly

Ile

Thr

Pro

Ala

365

370

375

Leu

Val

Leu

Gin

Met

Leu

Leu

Gly

Phe

Ile

Gly

Ala

Gly

Pro

Ser

380

385

390

Arg

Ala

Gly

Pro

Leu

Thr

Leu

Pro

Ala

Trp

Leu

His

Ser

Pro

♦ * *

400

405

410

Arg

Leu

Pro

Leu

Val

His

Pro

Phe

Ile

Glu

Arg

Pro

Ala

Leu

Leu

415

420

425

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Pro

Pro

Ala

Ala

Arg

Leu

Ser

Thr

Arg

Gly

430

435

440

Leu

Ser

★ * 1e

Asp

Val

Gin

Gly

Pro

Arg

Pro

Ala

Gly

Thr

Ala

Ser

445

450

455

Pro

Asn

Leu

Gly

Pro

Trp

Lys

Ser

Pro

Pro

Pro

His

His

* * *

Ser

460

465

470

Ala

Leu

Thr

Leu

Gly

Phe

His

Gly

Pro

His

Ser

Thr

Ala

Ser

Pro

475

480

485

Thr

★ ★ jt

Ala

Cys

Asp

Leu

Gly

Thr

Lys

Gly

Gly

Val

Pro

Arg

Leu

490

495

500

Leu

* * *

Leu

Ser

Arg

Gly

Ser

Gly

His

Val

Gin

Gly

Gly

Ala

Gly

505

510

515

Trp

Pro

Gly

Gly

Ser

Ala

His

Pro

Pro

Ala

Phe

Pro

Gin

Gly

Val

520

525

530

Leu

Arg

Ser

Lys

Ile

Leu

Glu

Gin

Ser

Asp

Pro

Ser

Pro

Lys

Ala

535

540

545

Leu

Leu

Ser

Ala

Gly

Gin

Cys

Gin

Pro

Ile

Pro

Gly

His

Leu

Ala

550

555

560

Pro

Gly

Asp

Val

Gly

Pro

Xxx

565

(2) Informace o SEQ ID NO: 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 619 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetě zcová (D) TOPOLOGIE: lineární • · (ii) DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontigu 2535

	(xi	) Popis S1	ekvence: í	3EQ	ID	NO:	39:
Val 1	Phe	Tyr Phe Gly 5	Asn Gly Trp	Ile	Pro 10	Thr	Leu Ile Thr Ala 15
Phe	Val	Leu Ala Thr 20	Ser Gin Ala	Gin	Ala 25	Gly	Trp Leu Gin His 30
Asp	Tyr	Gly His Leu 35	Ser Val Tyr	Arg	Lys 40	Pro	Lys Trp Asn His 45
Leu	Val	His Lys Phe 50	Val Ile Gly	His	Leu 55	Lys	Gly Ala Ser Ala 60
Asn	Trp	Trp Asn His 65	Arg His Phe	Gin	His 70	His	Ala Lys Pro Asn 75
Ile	Phe	His Lys Asp 80	Pro Asp Val	Asn	Met 85	Leu	His Val Phe Val 90
Leu	Gly	Glu Trp Gin 95	Pro Ile Glu	Tyr	Gly 100	Lys	Lys Lys Leu Lys 105
Tyr	Leu	Pro Tyr Asn 110	His Gin His	Glu	Tyr 115	Phe	Phe Leu Ile Gly 120
Pro	Pro	Leu Leu Ile 125	Pro Met Tyr	Phe	Gin 130	Tyr	Gin Ile Ile Met 135
Thr	Met	Ile Val His 140	Lys Asn Trp	Val	Asp 145	Leu	Ala Trp Ala Val 150
Ser	Tyr	Tyr Ile Arg 155	Phe Phe Ile	Thr	Tyr 160	Ile	Pro Phe Tyr Gly 165
Ile	Leu	Gly Ala Leu 170	Leu Phe Leu	Asn	Phe 175	Ile	Arg Phe Leu Glu 180
Ser	His	Trp Phe Val 185	Trp Val Thr	Gin	Met 190	Asn	His Ile Val Met 195
Glu	Ile	Asp Gin Glu 200	Ala Tyr Arg	Asp	Trp 205	Phe	Ser Ser Gin Leu 210
Thr	Ala	Thr Cys Asn 215	Val Glu Gin	Ser	Phe 220	Phe	Asn Asp Trp Phe 225
Ser	Gly	His Leu Asn 230	Phe Gin Ile	Glu	His 235	His	Leu Phe Pro Thr 240
Met	Pro	Arg His Asn 245	Leu His Lys	Ile	Ala 250	Pro	Leu Val Lys Ser 255
Leu	Cys	Ala Lys His 260	Gly Ile Glu	Tyr	Gin 265	Glu	Lys Pro Leu Leu 270
Arg	Ala	Leu Leu Asp 275	Ile Ile Arg	Ser	Leu 280	Lys	Lys Ser Gly Lys 285
Leu	Trp	Leu Asp Ala 290	Tyr Leu His	Lys	★ ★ ★ 295	Ser	His Ser Pro Arg 300
Asp	Thr	Val Gly Lys 305	Gly Cys Arg	Trp	Gly 310	Asp	Gly Gin Arg Asn 315
Asp	Gly	Leu Leu Phe 320	*** Gly Val	Ser	Glu 325	Arg	Leu Val Tyr Ala 330
Leu	Leu	Thr Asp Pro 335	Met Leu Asp	Leu	Ser 340	Pro	Phe Leu Leu Ser 345
Phe	Phe	Ser Ser His 350	Leu Pro His	Ser	Thr 355	Leu	Pro Ser Trp Asp 360
Leu	Pro	Ser Leu Ser 365	Arg Gin Pro	Ser	Ala 370	Met	Ala Leu Pro Val 375
Pro	Pro	Ser Pro Phe 380	Phe Gin Gly	Ala	Glu 385	Arg	Trp Pro Pro Gly 390
Val	Ala	Leu Ser Tyr 400	Leu His Ser	Leu	Pro 405	Leu	Lys Met Gly Gly 410
Asp	Gin	Arg Ser Met 415	Gly Leu Ala	Cys	Glu 420	Ser	Pro Leu Ala Ala 425
Trp	Ser	Leu Gly Ile 430	Thr Pro Ala	Leu	Val 435	Leu	Gin Met Leu Leu 440
Gly	Phe	Ile Gly Ala 445	Gly Pro Ser	Arg	Ala 450	Gly	Pro Leu Thr Leu 455

« · • ·

139

Pro Ala

Trp Leu His 460

Ser

Pro

★ ★ ★

Arg

Leu 4 65

Pro Leu Val His

Pro 470

Phe

Ile

Glu

Arg

Pro

Ala

Leu

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Pro

Pro

475

480

485

Ala

Ala

Arg

Leu

Ser

Thr

Arg

Gly

Leu

Ser

* * *

Asp

Val

Gin

Gly

490

495

500

Pro

Arg

Pro

Ala

Gly

Thr

Ala

Ser

Pro

Asn

Leu

Gly

Pro

Trp

Lys

505

510

515

Ser

Pro

Pro

Pro

His

His

***

Ser

Ala

Leu

Thr

Leu

Gly

Phe

His

520

525

530

Gly

Pro

His

Ser

Thr

Ala

Ser

Pro

Thr

★ **

Ala

Cys

Asp

Leu

Gly

535

540

545

Thr

Lys

Gly

Gly

Val

Pro

Arg

Leu

Leu

★ ★ ★

Leu

Ser

Arg

Gly

Ser

550

555

560

Gly

His

Val

Gin

Gly

Gly

Ala

Gly

Trp

Pro

Gly

Gly

Ser

Ala

His

565

570

575

Pro

Pro

Ala

Phe

Pro

Gin

Gly

Val

Leu

Arg

Ser

Lys

Ile

Leu

Glu

580

585

590

Gin

Ser

Asp

Pro

Ser

Pro

Lys

Ala

Leu

Leu

Ser

Ala

Gly

Gin

Cys

595

600

605

Gin

Pro

Ile

Pro

Gly

His

Leu

Ala

Pro

Gly

Asp

Val

Gly

Pro

Xxx

610

615

620

(2) Informace o SEQ ID NO: 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA	: 757 aminokyselin
(B)	TYP:	aminokyselina
(C)	DRUH	ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) DRUH MOLEKULY: aminokyselina (překlad kontigu 253538a) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 40:

Gin

Gly

Pro

Thr

Pro

Arg

Tyr

Phe

Thr

Trp

Asp

Glu

Val

Ala

Gin

1

5

10

15

Arg

Ser

Gly

Cys

Glu

Glu

Arg

Trp

Leu

Val

Ile

Asp

Arg

Lys

Val

20

25

30

Tyr

Asn

Ile

Ser

Glu

Phe

Thr

Arg

Arg

His

Pro

Gly

Gly

Ser

Arg

35

40

45

Val

Ile

Ser

His

Tyr

Ala

Gly

Gin

Asp

Ala

Thr

Asp

Pro

Phe

Val

50

55

60

Ala

Phe

His

Ile

Asn

Lys

Gly

Leu

Val

Lys

Lys

Tyr

Met

Asn

Ser

65

70

75

Leu

Leu

Ile

Gly

Glu

Leu

Ser

Pro

Glu

Gin

Pro

Ser

Phe

Glu

Pro

80

85

90

Thr

Lys

Asn

Lys

Glu

Leu

Thr

Asp

Glu

Phe

Arg

Glu

Leu

Arg

Ala

95

100

105

Thr

Val

Glu

Arg

Met

Gly

Leu

Met

Lys

Ala

Asn

His

Val

Phe

Phe

110

115

120

Leu

Leu

Tyr

Leu

Leu

His

Ile

Leu

Leu

Leu

Asp

Gly

Ala

Ala

Trp

125

130

135

Leu

Thr

Leu

Trp

Val

Phe

Gly

Thr

Ser

Phe

Leu

Pro

Phe

Leu

Leu

140

145

150

Cys

Ala

Val

Leu

Leu

Ser

Ala

Val

Gin

Gin

Ala

Gin

Ala

Gly

Trp

155

160

165

Leu

Gin

His

Asp

Tyr

Gly

His

Leu

Ser

Val

Tyr

Arg

Lys

Pro

Lys

170

175

180

Trp

Asn

His

Leu

Val

His

Lys

Phe

Val

Ile

Gly

His

Leu

Lys

Gly

185

190

195

Ala

Ser

Ala

Asn

Trp

Trp

Asn

His

Arg

His

Phe

Gin

His

His

Ala

200

205

210

140 • · »

Lys

Pro

Asn

Ile

Phe 215

His

Lys Asp Pro

Asp 220

Val

Asn Met

Leu

His 225

Val

Phe

Val

Leu

Gly

Glu

Trp

Gin

Pro

Ile

Glu

Tyr

Gly

Lys

Lys

230

235

240

Lys

Leu

Lys

Tyr

Leu

Pro

Tyr

Asn

His

Gin

His

Glu

Tyr

Phe

Phe

245

250

255

Leu

Ile

Gly

Pro

Pro

Leu

Leu

Ile

Pro

Met

Tyr

Phe

Gin

Tyr

Gin

260

265

270

Ile

Ile

Met

Thr

Met

Ile

Val

His

Lys

Asn

Trp

Val

Asp

Leu

Ala

275

280

285

Trp

Ala

Val

Ser

Tyr

Tyr

Ile

Arg

Phe

Phe

Ile

Thr

Tyr

Ile

Pro

290

295

300

Phe

Tyr

Gly

Ile

Leu

Gly

Ala

Leu

Leu

Phe

Leu

Asn

Phe

Ile

Arg

305

310

315

Phe

Leu

Glu

Ser

His

Trp

Phe

Val

Trp

Val

Thr

Gin

Met

Asn

His

320

325

330

Ile

Val

Met

Glu

Ile

Asp

Gin

Glu

Ala

Tyr

Arg

Asp

Trp

Phe

Ser

335

340

345

Ser

Gin

Leu

Thr

Ala

Thr

Cys

Asn

Val

Glu

Gin

Ser

Phe

Phe

Asn

350

355

360

Asp

Trp

Phe

Ser

Gly

His

Leu

Asn

Phe

Gin

Ile

Glu

His

His

Leu

365

370

375

Phe

Pro

Thr

Met

Pro

Arg

His

Asn

Leu

His

Lys

Ile

Ala

Pro

Leu

380

385

390

Val

Lys

Ser

Leu

Cys

Ala

Lys

His

Gly

Ile

Glu

Tyr

Gin

Glu

Lys

400

405

410

Pro

Leu

Leu

Arg

Ala

Leu

Leu

Asp

Ile

Ile

Arg

Ser

Leu

Lys

Lys

415

420

425

Ser

Gly

Lys

Leu

Trp

Leu

Asp

Ala

Tyr

Leu

His

Lys

★ i ★

Ser

His

430

435

440

Ser

Pro

Arg

Asp

Thr

Val

Gly

Lys

Gly

Cys

Arg

Trp

Gly

Asp

Gly

445

450

455

Gin

Arg

Asn

Asp

Gly

Leu

Leu

Phe

* * *

Gly

Val

Ser

Glu

Arg

Leu

460

4 65

470

Val

Tyr

Ala

Leu

Leu

Thr

Asp

Pro

Met

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

Phe

475

480

485

Leu

Leu

Ser

Phe

Phe

Ser

Ser

His

Leu

Pro

His

Ser

Thr

Leu

Pro

490

495

500

Ser

Trp

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu

Ser

Arg

Gin

Pro

Ser

Ala

Met

Ala

505

510

515

Leu

Pro

Val

Pro

Pro

Ser

Pro

Phe

Phe

Gin

Gly

Ala

Glu

Arg

Trp

520

525

530

Pro

Pro

Gly

Val

Ala

Leu

Ser

Tyr

Leu

His

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

535

540

545

Met

Gly

Gly

Asp

Gin

Arg

Ser

Met

Gly

Leu

Ala

Cys

Glu

Ser

Pro

550

555

560

Leu

Ala

Ala

Trp

Ser

Leu

Gly

Ile

Thr

Pro

Ala

Leu

Val

Leu

Gin

565

570

575

Met

Leu

Leu

Gly

Phe

Ile

Gly

Ala

Gly

Pro

Ser

Arg

Ala

Gly

Pro

580

585

590

Leu

Thr

Leu

Pro

Ala

Trp

Leu

His

Ser

Pro

* * *

Arg

Leu

Pro

Leu

595

600

605

Val

His

Pro

Phe

Ile

Glu

Arg

Pro

Ala

Leu

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

610

615

620

Leu

Pro

Pro

Ala

Ala

Arg

Leu

Ser

Thr

Arg

Gly

Leu

Ser

* * *

Asp

625

630

635

Val

Gin

Gly

Fro

Arg

Pro

Ala

Gly

Thr

Ala

Ser

Pro

Asn

Leu

Gly

640

645

650

Pro

Trp

Lys

Ser

Pro

Pro

Pro

His

His

★ ★ ♦

Ser

Ala

Leu

Thr

Leu

655

660

665

Gly

Phe

His

Gly

Pro

His

Ser

Thr

Ala

Ser

Pro

Thr

***

Ala

Cys

670

675

680

Asp

Leu

Gly

Thr

Lys

Gly

Gly

Val

Pro

Arg

Leu

Leu

★ * *

Leu

Ser

685

690

695

Arg

Gly

Ser

Gly

His

Val

Gin

Gly

Gly

Ala

Gly

Trp

Pro

Gly

Gly

700

705

710

• · ·

141

Ser Ala

His

Pro

Pro 715

Ala

Phe

Pro Gin Gly Val 720

Leu

Arg

Ser

Lys 725

Ile

Leu

Glu

Gin

Ser

Asp

Pro

Ser

Pro

Lys

Ala

Leu

Leu

Ser

Ala

730

735

740

Gly

Gin

Cys

Gin

Pro

Ile

Pro

Gly

His

Leu

Ala

Pro

Gly

Asp

Val

745

750

755

Gly Pro Xxx

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   142

   1. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 3.
2. 2. Polypeptid kódovaný nukleovou sekvencí podle nároku 1.
3. 3. Čištěný a izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 4.
4. 4. Izolovaná nukleová kyselina kódující polypeptid s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 4.
5. 5. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze šestého nebo dvanáctého uhlíku od karboxylového konce uvedeného polypeptidů, kde uvedená nukleotidová sekvence má průměrný obsah A/T menší než přibližně 60 %.

   6. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 5, kde uvedená nukleová kyselina se získala z hub. 7 . Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 6, kde uvedenou houbou je rod Mortierella. 8 . Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 7, kde uvedená houba je druh Mortierella alpina. 9. Izolovaná nukleová kyselina , kde nukleotidová sekvence

   uvedené nukleové kyseliny je uvedena v SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 3.
6. 10. Izolovaný nebo čištěný polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze šestého nebo dvanáctého uhlíku od karboxylového konce uvedeného polypeptidů, který je eukaryontním polypeptidem nebo se získal z eukaryontního polypeptidů.
7. 11. Izolovaný a čištěný eukaryontní polypeptid podle nároku 10, který se získal z hub.

   • ·

   143
8. 12. Nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci hub, která je v podstatě shodná se sekvencí alespoň 50-ti nukleotidů v SEQ ID NO: 1 nebo v SEQ ID NO: 3 nebo je komplementární se sekvencí alespoň 50-ti nukleotidů v SEQ ID NO: 1 nebo v SEQ ID NO: 3.
9. 13. Izolovaná nukleová kyselina s nukleotidovou sekvencí vykazující alespoň přibližně 50 % homologii se SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 3.
10. 14. Izolovaná nukleová kyselina s nukleotidovou sekvencí vykazující alespoň přibližně 50 % homologii se sekvencí kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 4.
11. 15. Nukleová kyselina podle nároku 14, kde uvedená aminokyselinová sekvence obsažená v SEQ ID NO 2 se vybrala ze skupiny obsahující aminokyselinové zbytky 50 až 53, 39 až 43, 172 až 176, 204 až 213 a 390 až 402.
12. 16. Konstrukce nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 3 spojenou s heterogenní nukleovou kyselinou.
13. 17. Konstrukce nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 3 operativně spojenou se sekvencí řídící expresi, která je funkční v minkrobiální buňce.

    18 . Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 17, kde uvedenou mikrobiální buňkou je buňka kvasinek. 19. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 17, kde uvedená nukleotidové sekvence je odvozená z hub. 20 . Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 19, kde uvedená houba je z rodu Mortierella. 21. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 20, kde uvedená

    houba je z druhu Mortierella alpina.

    22. Konstrukce nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci hub, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, jenž odpovídá nebo je

    144 komplementární s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 4, přičemž uvedená nukleová kyselina je operativně spojena se sekvencí řídící expresi, která je funkční v mikrobiální buňce, kde uvedená nukleotidové sekvence kóduje funkčně aktivní polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze šestého a dvanáctého uhlíku od karboxylového konce molekuly mastné kyseliny.

    Konstrukce nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci vykazující obsah A/T méně než přibližně 60 % a kódující funkčně aktivní Δδ-desaturázu s aminokyselinovou sekvencí odpovídající nebo komplementární celou nebo částí aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2, operativně uvedená nukleotidové sekvence je spojena se sekvencí řídící transkripci, jenž je funkční v buňce kvasinky.

    Konstrukce nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci hub, která kóduje funkčně aktivní A12-desaturázu s aminokyselinovou sekvencí, která odpovídá nebo je komplementární s celou nebo částí aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 4, přičemž uvedená nukleotidové sekvence je operativně spojena se sekvencí řídící transkripci, která je funkční v buňce kvasinek.

    Rekombinantní buňka kvasinek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje konstrukci nukleové kyseliny podle nároku 23 nebo 24.

    kvasinek podle nároku 25, se tím, pricemz

    Rekombinantní buňka vyznačuj ící Saccharomyces. Rekombinannti buňka se tím, kvasinek, je buňkou vyznačuj ící ž e zahrnuje alespoň jednu kopii vektoru obsahujícího nukleotidovou sekvenci hub, která kóduje polypeptid, jenž přeměňuje mastné kyseliny 18:2 na mastné kyseliny 18:3 nebo mastné kyseliny 18:3 na mastné kyseliny

    145
14. 18:4, kde uvedená buňka kvasinek nebo její předchůdce se transformoval uvedeným vektorem, přičemž vzniká uvedená rekombinantní kvasinková buňka, a kde uvedená nukleotídová sekvence je operativně spojena se sekvencí řídící expresi, která je funkční v uvedené rekombinantní kvasinkové buňce. Rekombinantní kvasinková buňka podle nároku 27, vyznačuj ící sekvence buňka se tím, hub je nukleotídová kvasinek podle se tím, že uvedená sekvence nároku 28, je buňkou nukleotídová

    Mortierella.

    Rekombinantní vyznačuj ící Saccharomyces.

    Mikrobiální buňka podle nároku 27, vyznačuj ící se tím, že je uvedená sekvence řídící expresi se nachází v uvedeném expresívním vektoru.

    Způsob produkce GLA v kultuře vyznačující se tím, že kultivaci kultury kvasinek obsahující velké kvasinek, zahrnuj e: množství rekombinanntich kvasinkových buněk, kde uvedené kvasinkové buňky nebo jejich předchůdce se transformoval vektorem obsahujícím DNA hub kódující polypeptid, který přeměňuje LA na GLA, přičemž uvedená DNA je operativně spojena se sekvencí řídící expresi, která je funkční v uvedených kvasinkových buňkách, za podmínek, kdy se exprimuje DNA, čímž se v uvedené kvsainkové kultuře produkuje GLA z LA. Způsob podle nároku 31, vyznačuj ící se tím, že uvedená DNA hub je DNA Mortierella a uvedený polypeptid je Á6-desaturáza.

    Způsob podle nároku 32, vyznačuj ící se tím, že Mortierella je druh Mortierella alpina.

    34. Způsob podle nároku

    31, vyznačuj ící se tím, že uvedená LA se dodává exogenně

    35. Způsob podle nároku

    31, vyznačuj ící se tím, že uvedené podmínky lze vyvolat.

    • · «

    146

    36. Způsob produkce kyseliny stearidonové v kultuře kvasinek, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    kultivaci kultury kvasinek obsahující velké množství rekombinantních kvasinkových buněk, kde uvedené kvasinkové buňky nebo jejich předchůdce se transformoval vektorem obsahujícím DNA hub kódující polypeptid, který přeměňuje kyselinu α-linolenovou na kyselinu stearidonovou, přičemž uvedená DNA je operativně spojena se sekvencí řídící expresi, která je funkční v uvedených kvasinkových buňkách za podmínek, kdy se exprimuje DNA, čímž se v uvedené kvasinkové kultuře produkuje z kyseliny α-linolenové.

    37. Způsob podle nároku 36, se tím, že uvedená DNA hub je DNA Mortierella uvedený polypeptid je Δβ-desaturáza.

    38. Způsob podle nároku 37, vyznačuj ící se tím, že Mortierella je druh Mortierella alpina.

    kyselina stearidonová vyznačuj ící a

    39. Způsob podle nároku

    36, vyznačuj ící

    40. Způsob se tím, že uvedená kysleina α-linolenová se dodává exogenně.

    podle nároku 36, vyznačuj ící se tím, ž e se uvedené podmínky mohou vyvolat.

    Způsob produkce kyseliny linolenové v kultuře kvasinek, vyznačuj ící tím, zahrnuj e:

    kultivaci kultury kvasinek obsahující velké množství se uvedené rekombinantních kvasinkových buněk, kde kvasinkové buňky nebo jejich předchůdce transformoval vektorem obsahujícím DNA hub kódující polypeptid, který přeměňuje kyselinu olejovou na kyselinu linolenovou, přičemž uvedená DNA je operativně spojena se sekvencí řídící expresi, která je funkční v uvedených kvasinkových buňkách za podmínek, kdy se exprimuje DNA, čímž se v uvedené kvasinkové kultuře produkuje kyselina linolenová z kyseliny olejové.

    147 • · · · <

    42. Způsob podle nároku 41, vyznačuj ící se tím, že uvedená DNA hub je DNA Mortierella a uvedený polypeptid je Á12-desaturáza.

    43. Způsob podle nároku 42, vyznačuj i c i se t i m, že Mortierella je druh Mortierella alpina • 44 . Způsob podle nároku 41, vyznačuj í c í se t i m, že uvedené podmínky se mohou vyvolat. 45 . Izolovaný nebo čištěný polypeptid, který desaturuje molekulu mastné kyseliny v poloze dvanáctého uhlíku od

    desaturuj e uhlíku od karboxylového konce uvedeného polypeptidů, kde uvedený polypeptid je polypeptid hub nebo se získal z polypeptidů hub.

    Izolovaný nebo čištěný polypeptid podle nároku 46, kterým je A12-desaturáza organizmu Mortierella alpina.

    Izolovaný nebo čištěný polypeptid, který molekulu mastné kyseliny v poloze šestého karboxylového konce uvedeného polypeptidů, kde uvedený polypeptid je polypeptid hub nebo se získal z polypeptidů hub.

    Izolovaný nebo čištěný polypeptid podle nároku 48, kterým je Δβ-desaturáza.

    Izolovaná nukleová kyselina kódující polypeptid podle nároku 47 nebo 49.

    Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 23, kde uvedená část aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2 obsahuje aminokyseliny 1 až 457.

    Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že obsahuje konstrukci nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 22 až 24.

    Hostitelská buňka, jenž obsahuje vektor zahrnující nukleovou kyselinu, která kóduje desaturázu mastné kyseliny získanou z Mortierella alpina, vyznačující se tím, že uvedená desaturáza vykazuje aminokyselinovou sekvenci reprezentovanou SEQ ID

    148

    NO: 2, přičemž uvedená nukleotidová sekvence je operativně spojena s promotorem.

    53.

    54 .

    55.

    56.

    57 .

    Hostitelská buňka podle nároku 52, vyzná č u j i c i se tím, ž e uvedená hostitelská buňka je eukaryontní buňka. Hostitelská buňka podle nároku 53, vyzná č u j i c i se tím, ž e uvedená eukaryontní buňka se vybrala ze

    skupiny zahrnující savčí buňku, rostlinnou buňku, hmyzí

    buňku, buňku Hostitelská hub, ptačí buňku a buňka podle nároku buňku 54, řas. vyznač u jící se tím, Hostitelská ž e je buňkou hub. buňka podle nároku 21, vyznač u jící se tím, ž e uvedený promotor je do uvedené hostitelské buňky dodáván exogenně. Způsob produkce kyseliny stearidonové v kultuře eukaryontních buněk, vyzná č u j ící se tím,

    ž e zahrnuje: kultivaci kultury eukaryontních buněk obsahující velké množství rekombinantních eukaryontních buněk, kde uvedené rekombinantní eukaryontní buňky nebo jejich předchůdce se transformoval vektorem obsahujícím DNA hub kódující polypeptid, který přeměňuje kyselinu alinolenovou na kyselinu stearidonovou, přičemž uvedená DNA je operativně spojena se sekvencí řídící expresi, která je funkční v uvedených kvasinkových buňkách, za podmínek, kdy se exprimuje DNA, čímž se v uvedené kultuře eukaryontních buněk produkuje kyselina stearidonová z kyseliny alinolenové.

    Způsob produkce kyseliny linolenové v kultuře eukaryontních buněk, vyznačující se tím, ž e zahrnuje: kultivaci kultury eukaryontních buněk obsahující velké množství rekombinantních eukaryontních buněk, kde uvedené rekombinantní eukaryontní buňky nebo jejich předchůdce se transformovaly vektorem obsahujícím DNA hub kódující polypeptid, který přeměňuje kyselinu

    58 .

    149 olejovou na kyselinu linolenovou, přičemž uvedená DNA je operativně spojena se sekvencí řídící expresi, která je funkční v uvedených rekombinantních eukaryontních buňkách, za podmínek, kdy se exprimuje DNA, čímž se v uvedené kultuře eukaryontních buněk produkuje kyselina linolenová z kyseliny olejové.

    Způsob podle nároku 57 nebo 58, vyznačuj ící se tím, že uvedené eukaryontní buňky se vybraly ze skupiny zahrnující savčí buňky, rostlinné buňky, hmyzí buňky, buňky hub, ptačí buňky a buňky řas.

    Způsob podle nároku 59, vyznačuj ící se tím, že uvedené buňky hub jsou kvasinkové buňky rodu Saccharomyces.

    Rekombinantní buňka kvasinek obsahující:

    (1) alespoň jednu konstrukci nukleové kyseliny podle nároku 23 nebo 24 nebo (2) alespoň jednu konstrukci nukleové kyseliny podle nároku 23 a alespoň jednu konstrukci nukleové kyseliny podle nároku 24.

    Rekombinantní buňku kvasinek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje alespoň jednu konstrukci nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje funkčně aktivní A6-desaturázu vykazující aminokyselinovou sekvenci, která odpovídá nebo je komplementární s celou nebo s částí aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2 a alespoň jednu konstrukci nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje funkčně aktivní Δ12-desaturázu s aminokyselinovou sekvencí, která odpovídá nebo je komplementární s celou nebo s částí aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 4, přičemž uvedené konstrukce nukleové kyseliny jsou operativně spojeny se sekvencemi řídícími transkripci, jenž jsou funkční v buňce kvasinky.

    • ·

    150

    Způsob se tím, pripravy

    GLA, vyznačuj ící zahrnuje kultivaci rekombinantní kvasinkové buňky podle nároku 62 za podmínek, kdy se exprimují uvedené nukleotidové sekvence, čímž se v uvedené kvasinkové buňce produkuje GLA.

    Způsob se tím,

    66, přípravy GLA, vyznačuj ící ž e zahrnuje kultivaci rekombinantní kvasinkové buňky podle nároku 61 za podmínek, kdy se exprimují uvedené nukleotidové sekvence v uvedených konstrukcích nukleové kyseliny, čímž se v uvedené kvasinkové buňce produkuje GLA.

    Způsob získání upravené biosyntézy poly-nenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje kuktivace rostliny vykazující buňky, které obsahují jeden nebo více transgenů získaných z hub a řas, které kódují transgenní expresívní produkt desaturující molekulu mastné kyseliny v poloze uhlíku vybraného ze skupiny zahrnující šestý a dvanáctý uhlík od karboxylového konce uvedené molekuly mastné kyseliny, přičemž uvedený jeden nebo více transgenů je operativně spojen se sekvencí řídící expresi za podmínek, kdy se exprimuje jeden nebo více transgenů, čímž v uvedených buňkách dochází ke změně biosyntézy poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem.

    nároku 65, vyznačuj ící uvedená poly-nenasycená mastná kyselina ze skupiny zahrnující

    Způsob podle se tím, že s dlouhým řetězcem se vybrala 18:1099, LA, GLA, SDA a ALA.

    Mikrobiální olej nebo jeho frakce, vyznačuj ící se tím, ž e se produkuje způsobem podle nároku 65. Způsob léčby nebo prevence podvýživy vyznačuj ící se tím, že se aplikuje uvedený mikrobiální olej podle nároku 67 pacientovi, který potřebuje uvedenou léčbu • · · · ► · * * » · · ·

    151

    69.

    70 .

    71.

    72 .

    73.

    74 .

    75.

    76.

    nebo prevenci, v dostatečném množství, aby došlo k uvedené léčbě nebo prevenci.

    Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje uvedený mikrobiální olej nebo frakci podle nároku 67 a farmaceuticky přijatelný nosič.

    Farmaceutická kompozice podle vyznačuj ící kapalné formě.

    Farmaceutická kompozice podle vyznačuj ící kaspulí nebo tablet.

    Farmaceutická nároku

    69, se tím, že je v pevné nebo se tím, kompozice podle nároku je ve nároku

    70, formě

    69, skupiny zahrnující potravinovou vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jeden nutrient vybraný ze skupiny zahrnující vitamin, minerál, sacharid, cukr, aminokyselinu, volnou mastnou kyselinu, fosfolipid, antioxidant a fenolovou sloučeninu.

    Výživový přípravek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje uvedený mikrobiální olej nebo jeho frakci podle nároku 67.

    Výživový přípravek podle nároku 73, vyznačuj ící setím, že se vybral ze kojeneckou výživu, potravinový doplněk a náhradu.

    Výživový přípravek podle nároku 74, vyznačuj ící se tím, že uvedená kojenecká výživa, potravinový doplněk a potravinová náhrada je v kapalné nebo pevné formě.

    Kojenecká výživa, vyznačující se tím, že obsahuje uvedený mikrobiální olej nebo jeho frakci podle nároku 67.

    Kojenecká výživa podle nároku 76, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje alespoň jeden makronutrient vybraný ze skupiny zahrnující kokosový olej, sojový olej,

    77 .

    • ·

    152 olej kanoly, mono- a diglyceridy, glukózu, poživatelnou laktózu, elektrodialyzovanou syrovátku, elektrodialyzované netučné mléko, mléčnou syrovátku, sojový protein a jiné proteinové hydrolyzáty.

    Kojenecká výživa podle nároku 77, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje alespoň jeden vitamin vybraný ze skupiny zahrnující vitaminy A, C, D, E a B komplex a alespoň jeden minerál vybraný ze skupiny zahrnující vápník, hořčík, zinek, mangan, sodík, draslík, fosfor, měď, chlorid, jodid, selen a železo.

    Potravinový doplněk, vyznačující se tím, ž e obsahuje mikrobiální olej nebo jeho frakci podle nároku 67.

    Potravinový doplněk podle nároku 79, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje alespoň jeden makronutríent vybraný ze skupiny zahrnující kokosový olej, sojový olej, olej kanoly, mono- a diglyceridy, glukózu, poživatelnou laktózu, elektrodialyzovanou syrovátku, elektrodialyzované netučné mléko, mléčnou syrovátku, sojový protein a jiné proteinové hydrolyzáty.

    Potravinový doplněk podle nároku 80, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje alespoň jeden vitamin vybraný ze skupiny zahrnující vitaminy A, C, D, E a B komplex a alespoň jeden minerál vybraný ze skupiny obsahující vápník, hořčík, zinek, mangan, sodík, draslík, fosfor, měď, chlorid, jód, selen a železo.

    Potravinový doplněk podle nároku 79 nebo 81, vyznačující se tím, že se aplikuje člověku nebo zvířeti.

    Potravinová náhrada, vyznačuj ící se tím, že obsahuje uvedený mikrobiální olej nebo jeho frakci podle nároku 67.

    Potravinová náhrada podle nároku 83, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje alespoň jeden makronutríent

    153 vybraný ze skupiny zahrnující kokosový olej, sojový olej, olej kanoly, mono- a diglyceridy, glukózu, poživatelnou laktózu, elektrodialyzovanou syrovátku, elektrodialyzované netučné mléko, mléčnou syrovátku, sojový protein a jiné proteinové hydrolyzáty.

    85. Potravinová náhrada podle nároku 84, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje alespoň jeden vitamin vybraný ze skupiny zahrnující vitaminy A, C, D, E a B komplex a alespoň jeden minerál vybraný ze skupiny obsahující vápník, hořčík, zinek, mangan, sodík, draslík,

    fosfor, měď, chlorid, jód, selen a železo. 86. Potravinová náhrada podle nároku 83 nebo 85, v y z n a č u j ící se tím, že se aplikuj e člověku nebo zvířeti. 8 7 . Způsob léčby pacienta trpícího stavem způsobeným

    nedostatečným příjmem nebo produkcí poly-nenasycených mastných kyselin, vyznačující se tím, že se uvedenému pacientovi aplikuje uvedená potravinová náhrada podle nároku 83 nebo uvedený potravinový doplněk podle nároku 79 v množství, které je dostatečné, aby došlo k uvedené léčbě.

    88. Způsob podle nároku 87, vyznačuj ící se tím, že uvedená potravinová náhrada nebo uvedený potravinový doplněk se aplikuje enterálně nebo parenterálně.

    89. Kosmetický přípravek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje uvedený mikrobiální olej nebo

    jeho frakci podle nároku 67. 90. Kosmetický přípravek podle nároku 88, v y z n a č u jící se tím, ž e se aplikuje povrchově. 91. Farmaceutická kompozice podle nároku 69, v y z n a č u jící se tím, ž e se aplikuj e

    člověku nebo zvířeti.

    154 • · · • · · · · • ·

    92. Zvířecí krmivo, vyznač u j í c í s e tím, ž e obsahuj e uvedený mikrobiální olej nebo jeho frakci podle nároku 67 • 93. Způsob podle nároku 20, v y z n a č u j í c í se t í m, že uvedená houba i j e druh rodu Mortierella. 94 . Způsob podle nároku 93, v y z n a č u j í c í

    se tím, že uvedená houba je Mortierella alpina.

    95. Izolovaná peptidová sekvence vybraná ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 34 až SEQ ID NO: 40.

    96. Izolovaná peptidová sekvence vybraná ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25 a SEQ ID NO: 26.

    97. Způsob produkce kyseliny gama-linolenové v kultuře eukaryontních buněk, vyznačující se t i m, ž e zahrnuje: kultivaci kultury eukaryontních buněk obsahující velké množství rekombinantních eukaryontních buněk, kde uvedené rekombinantní eukaryontní buňky nebo jejich předchůdce se transformoval vektorem obsahujícím DNA hub kódující polypeptid, který přeměňuje kyselinu linolejovou na kyselinu gama-linolenovou, přičemž uvedená DNA je operativně spojena se sekvencí řídící expresi, která je funkční v uvedených rekombinantních eukaryontních buňkách, za podmínek, kdy se exprimuje uvedená DNA, čímž se v uvedené kultuře eukaryontních buněk produkuje kyselina gama-linolenová z kyseliny linolejové.

    98. Způsob podle nároku 97, vyznačuj ící se tím, že uvedené eukaryontní buňky se vybraly ze skupiny zahrnující savčí buňky, rostlinné buňky, hmyzí buňky, buňky hub, ptačí buňky a buňky řas.