JP2002523098A - エロンガーゼ遺伝子及びそれらの使用 - Google Patents
エロンガーゼ遺伝子及びそれらの使用Info
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Abstract
Description
エロンガーゼ(elongase)」)の同定及びそれらの使用に関する。特に
、エロンガーゼ酵素は、脂肪酸の他の脂肪酸への変換において利用される。例え
ば、エロンガーゼは、ガンマリノレン酸(GLA)のジホモ−γ−リノレン酸(
DGLA、20:3n−6)への変換及びステアリドン酸(stearidon
ic acid)(STA、18:4n−3)の(n−3)−エイコサテトラエ
ン酸(20:4n−3)への変換を触媒する。エロンガーゼは、アラキドン酸(
AA、20:4n−6)のアドレン酸(ADA、22:4n−6)への変換、エ
イコサペンタエン酸(EPA、20:5n−3)のω3−ドコサペンタエン酸(
22:5n−3)への変換及びα−リノレン酸(ALA、18:3n−3)の2
0:3n−3への変換も触媒する。例えば、DGLAは、薬学的組成物、栄養組
成物、動物飼料及び化粧品のようなその他の製品へ添加されうる、アラキドン酸
(AA)のようなその他のポリ不飽和脂肪酸(PUFA)の製造において利用さ
れうる。
る。さらに、それらは、動物及び植物の両方に存在する。哺乳動物において見出
されるものは、飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸及びポリ不飽和脂肪酸に作用する
能力を有する。対照的に、植物において見出されるものは、飽和脂肪酸又はモノ
不飽和脂肪酸に特異的である。従って、植物においてポリ不飽和脂肪酸を生成さ
せるためには、PUFA特異的なエロンガーゼが必要である。
ると考えられている(Lassnerら,The Plant Cell 8:
281−292(1996))。CoAが、アシル・キャリヤーである。第1段
階は、マロニル−CoAと長鎖アシル−CoAとの縮合を含み、それにより二酸
化酸素と、アシル部分の2炭素原子が伸長されたβ−ケトアシル−CoAとが生
じる。続く反応には、β−ヒドロキシアシル−CoAへの還元、エノイル−Co
Aへの脱水及び第二の還元が含まれ、それにより伸長されたアシル−CoAが生
じる。最初の縮合反応は、基質特異的な段階であるのみならず、律速段階でもあ
る。
エロンガーゼは、多くの重要な機能を有する長鎖ポリ不飽和脂肪酸の生成におい
て重要である。例えば、PUFAは、細胞膜の重要な成分であり、細胞膜にリン
脂質の形態で見出される。PUFAは、哺乳動物のプロスタサイクリン、エイコ
サノイド、ロイコトリエン及びプロスタグランジンの前駆体としてもはたらく。
さらに、PUFAは、発達中の幼児の脳の適切な発達、並びに組織の形成及び修
復に必要である。PUFAの生物学的重要性を考慮して、それら及びそれらの生
成に至る中間体を効率的に製造すべく、努力がなされている。
に関与している。例えば、リノレン酸(LA、18:2−△9,12又は18:
2n−6)は、△12デサチュレースにより、オレイン酸(OA、18:1−△
9又は18:1n−9)から生成される。GLA(18:3−△6,9,12)
は、△6−デサチュラーゼにより、リノレン酸から生成される。AA(20:4
−△5,8,11,14)は、△5−デサチュラーゼにより、ジホモ−γ−リノ
レン酸(DGLA、20:3−△8,11,14)から生成される。前述のよう
に、DGLAは、エロンガーゼにより、GLAから生成される。
レン酸に変換することができないことに注意しなければならない。同様に、動物
は、Δ15デサチュラーゼ活性を欠いているため、α−リノレン酸(ALA、1
8:3−△9,12,15又は18:3n−3)を合成することができない。し
かし、α−リノレン酸は、哺乳動物及び藻類においては、Δ6−デサチュラーゼ
(PCT公開第96/13591号参照:米国特許第5,552,306号も参
照のこと)により、ステアリドン酸(STA、18:4−Δ6,9,12,15
)へ変換され、続いて(n−3)−エイコサテトラエン酸(20:4−Δ8,1
1,14,17又は20:4n−3)へ伸長されうる。このポリ不飽和脂肪酸(
即ち、20:4−Δ8,11,14,17)は、次いで、Δ5−デサチュラーゼ
により、エイコサペンタエン酸(EPA、20:5−Δ5,8,11,14,1
7)へと変換されうる。真菌及び植物を含むその他の真核生物は、12位(PC
T公開第94/11516号及び米国特許第5,443,974号を参照のこと
)及び15位(PCT公開第93/11245号参照)の炭素を不飽和化する酵
素を有する。従って、動物の主要なポリ不飽和脂肪酸は、食事、並びに/又はリ
ノール酸もしくはα−リノレン酸の不飽和化及び伸長に由来する。哺乳動物が、
これらの必須長鎖脂肪酸を生成させることができないことを考慮すると、これら
の脂肪酸を天然に生成させる種から、PUFA生合成に関与している遺伝子を単
離し、商業的な品質の一つ又は複数のPUFAの製造を提供するように改変され
うる、微生物、植物又は動物の系において、これらの遺伝子を発現させることは
非常に重要である。従って、エロンガーゼ酵素、その酵素をコードする遺伝子及
びこの酵素を製造する組み換え法が、明らかに必要とされている。さらに、天然
に存在する油よりも高いレベルのPUFAを含有する油、及び新規なPUFAが
濃縮された油が必要とされている。そのような油は、エロンガーゼ遺伝子の単離
及び発現によってのみ作製されうる。
る。AAは、繊維状真菌に見出され、肝臓及び副腎を含む哺乳動物の組織からも
精製されうる。前述のように、AAのDGLAからの生成は、Δ5−デサチュラ
ーゼにより触媒され、DGLAのγ−リノレン酸(GLA)からの生成は、エロ
ンガーゼにより触媒される。しかし、本発明以前には、長鎖PUFA、特に、A
A、エイコサペンタエン酸(EPA)、アドレン酸、ドコサヘキサエン酸(DH
A、22:6n−3)、ω3−ドコサペンタエン酸(22:5n−3)又はω6
−ドコサペンタエン酸(22:5n−6)の生成のための経路において、基質脂
肪酸に対する活性を有するエロンガーゼは、同定されていなかった。
えられた。特に、ホホバβ−ケトアシル−補酵素Aシンターゼ(KCS)又はホ
ホバKCS(ジェンバンク(GenBank)登録番号U37088)は、脂肪
酸アシル−CoA伸長経路の最初の反応(即ち、マロニル−CoAと長鎖アシル
−CoAとの縮合(Lassner ら,The Plant Cell 8:
281−292(1996)))を触媒する。ホホバKCSの基質選択性は、1
8:0、20:0、20:1、18:1、22:1、22:0及び16:0であ
る。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomcyes cerevi
siae)エロンガーゼ(ELO2)も、長鎖の飽和脂肪酸及びモノ不飽和脂肪
酸の変換を触媒し、高レベルの22:0、24:0を生成させ、18:0、18
:1、20:0、20:1、22:0、22:1及び24:1も生成させる(O
hら,The Journal of Biological Chemist
ry 272(28):17376−17384(1997);ELO2の配列
を含むヌクレオチド配列に関しては、米国特許第5,484,724号の参照の
こと;実施例Vに記載されているグリコシル化阻害因子の配列の考察に関しては
、PCT公開第88/07577号を参照のこと)。これらの2つの遺伝子間の
相同性の考慮に基づき、PUFA−エロンガーゼ活性に関する発現スクリーニン
グにより、モルチエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)
における長鎖PUFA特異的エロンガーゼの研究を開始した。
0%と一致するか、又は相補的である、単離されたヌクレオチド配列に関する。
この単離された配列は、配列番号1により表されうる。その配列は、ポリ不飽和
脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を基質として利用する、機能的活性を有するエロン
ガーゼをコードする。特に、その配列は、モルチエレラ属の真菌に由来するもの
であってよく、特に、モルチエレラ・アルピナから単離されうる。
含み、さらに、ポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を伸長し、かつ前記ヌク
レオチド配列によりコードされる精製されたタンパク質のアミノ酸配列と少なく
とも約50%のアミノ酸類似性を有する、精製されたポリペプチドも含む。
を単離する工程、b)i)プロモーター、およびii)該プロモーターと機能的
に連結された単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、並び
にc)エロンガーゼ酵素の発現にとって十分な時間及び条件で、宿主細胞へベク
ターを導入する工程を含む、エロンガーゼ酵素を製造する方法を包含する。宿主
細胞は、真核細胞であっても、又は原核細胞であってもよい。
又は枯草菌(B. subtilis)細胞でありうる。真核細胞は、例えば、
真核細胞の適当な例には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び真菌細胞であ
りうる。真菌細胞は、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞で
ありうる。真菌細胞は、例えば、サッカロミセス種(Saccharomyce
s spp.)、カンジダ種(Candida spp.)、リポミセス種(L
ipomyces spp.)、ヤロウイア種(Yarrowia spp.)
、クルイベロミセス種(Kluyveromyces spp.)、ハンセヌラ
種(Hansenula spp.)、アスペルギルス種(Aspergill
us spp.)、ペニシリウム種(Penicillium spp.)、ノ
イロスポラ種(Neurospora spp.)、トリコデルマ種(Tric
hoderma spp.)又はピキア種(Pichia spp.)でありう
る。特に、真菌細胞は、サッカロミセス種、特にサッカロミセス・セレビシエ、
カンジダ種、ハンセヌラ種、又はピキア種のような酵母細胞でありうる。
た配列番号1(図6)により表されるヌクレオチド配列を含むベクターも含み、
さらに、このベクターを含む宿主細胞も含む。宿主は、真核細胞であっても、又
は原核細胞であってもよい。原核細胞の適当な例には、大腸菌細胞、シアノバク
テリア細胞、又は枯草菌細胞が含まれる。真核細胞の適当な例には、哺乳動物細
胞、昆虫細胞、植物細胞及び真菌細胞が含まれる。真菌細胞は、例えば、サッカ
ロミセス種、カンジダ種、リポミセス種、ヤロウイア種、クルイベロミセス種、
ハンセヌラ種、アスペルギルス種、ペニシリウム種、ニューロスポラ種、トリコ
デルマ種及びピキア種でありうる。特に、真菌細胞は、例えば、例えばサッカロ
ミセス種、特にサッカロミセス・セレビシエ、カンジダ種、ハンセヌラ種及びピ
キア種のような酵母細胞でありうる。
物組織によるモノ不飽和脂肪酸及びポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される
少なくとも一つの脂肪酸の生成が引き起こされる、前記ベクターを含む植物細胞
、植物又は植物組織を含む。ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ジホモ−γ−リノレ
ン酸(DGLA)、20:4n−3及びアドレン酸(ADA)でありうる。本発
明は、植物細胞、植物又は植物組織により発現された一つ又は複数の植物油又は
脂肪酸も含む。さらに、本発明は、ベクターのヌクレオチド配列の発現により、
トランスジェニック植物の種子におけるポリ不飽和脂肪酸の生成が引き起こされ
る、前記ベクターを含むトランスジェニック植物を包含する。
するDNA配列を含むゲノムを有する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物
を含む。DNA配列は、配列番号1(図6)により表されうる。本発明は、少な
くとも一つのエロンガーゼ、又は例えばDGLA、ω6−ドコサペンタエン酸、
ADA及び/もしくは20:4n−3(図1参照)のようなそれらの生成物を検
出可能なレベルで含む、ヒト以外のトランスジェニック動物により産生された体
液(例えば、乳汁)も含む。
を単離する工程、b)単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工
程、c)単離されたヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発
現にとって十分な時間及び条件で、宿主細胞へベクターを導入する工程、並びに
d)基質を「生成物」ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、発現されたエロンガー
ゼ酵素を「基質」ポリ不飽和脂肪酸へ曝露する工程を含む、ポリ不飽和脂肪酸を
製造するための方法を含む。基質ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、γ−リノレン酸
(GLA)、ステアリドン酸(STA)及びアラキドン酸(AA)からなる群よ
り選択され、生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれDGLA、20:4
n−3及びADAからなる群より選択されうる。本発明は、生成物ポリ不飽和脂
肪酸を「第二生成物」ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、生成物ポリ不飽和脂肪
酸を、少なくとも一つのデサチュラーゼへ曝露する工程をさらに含みうる。生成
物ポリ不飽和脂肪酸は、例えばDGLA、20:4n−3及びADAからなる群
より選択されうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれAA、エ
イコサペンタエン酸(EPA)、ω6−ドコサペンタエン酸からなる群より選択
され、少なくとも一つのデサチュラーゼは、AA又はEPAの製造に関してはΔ
5−デサチュラーゼであり、ω6−ドコサペンタエン酸の製造に関してはΔ4−
デサチュラーゼである。この方法は、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を「最終」ポ
リ不飽和脂肪酸へ変換するため、少なくとも一つのエロンガーゼ及び少なくとも
一つの付加的なデサチュラーゼからなる群より選択される一つ又は複数の酵素へ
、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を曝露する工程をさらに含みうる。最終ポリ不飽
和脂肪酸は、例えば、ドコサヘキサエン酸(DHA)、AA、ω6−ドコサペン
タエン酸又はω3−ドコサペンタエン酸でありうる。
に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び前記方法に従い製造された最
終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂
肪酸を含む栄養組成物を含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えばDGLA、2
0:4n−3及びADAからなる群より選択されうる。第二生成物ポリ不飽和脂
肪酸は、例えば、AA、EPA又はω6−ドコサペンタエン酸でありうる。最終
ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DHA、アドレン酸、ω6−ドコサペンタエン酸
又はω3−ドコサペンタエン酸でありうる。栄養組成物は、例えば、幼児用調合
物、栄養補助食品又は食品代用物であってよく、ヒト又は動物へ投与されること
ができ、経口的又は非経口的に投与されうる。栄養組成物は、ココヤシ油、ダイ
ズ油、カノーラ油、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、グルコー
ス、食用ラクトース、電気透析されたホエー、電気透析されたスキムミルク、乳
清、ダイズ・タンパク質、タンパク質加水分解物、ヒマワリ油、ベニバナ油、コ
ーン油及びアマ油からなる群より選択される、少なくとも一つの多量養素をさら
に含みうる。栄養組成物は、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE
及びビタミンB複合体からなる群より選択される少なくとも一つのビタミン、並
びにカルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、ナトリウム、カリウム、リン
、銅、塩素、ヨウ素、セレン及び鉄からなる群より選択される少なくとも一つの
無機物も含みうる。
請求項32の前記方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び前記方
法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくと
も一つのポリ不飽和脂肪酸と、2)薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成
物を包含する。この組成物は、ヒト又は動物へ投与されうる。この組成物は、ビ
タミン、無機物、塩、炭水化物、アミノ酸、遊離脂肪酸、保存料、賦形剤、抗ヒ
スタミン、増殖因子、抗生物質、希釈剤、リン脂質、抗酸化剤及びフェノール化
合物からなる群より選択される少なくとも一つの要素をさらに含みうる。この組
成物は、経口、非経口、局所、直腸内、筋肉内、皮下、皮内、又はその他の任意
の適当な手段により、投与されうる。
い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び前記方法に従い製造された最終ポ
リ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸
を含む動物飼料も含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えばDGLA、20:4
n−3及びADAでありうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、AA、
EPA又はω6−ドコサペンタエン酸でありうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例
えば、DHA、アドレン酸、ω6−ドコサペンタエン酸又はω3−ドコサペンタ
エン酸でありうる。
方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び前記方法に従い製造され
た最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽
和脂肪酸を含む化粧品も含む。
者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の不十分な摂取又は生成により引き
起こされる状態を予防又は治療する方法を含む。
35%と一致するか、又は相補的である、単離されたヌクレオチド配列も含む。
この配列は、配列番号2により表されうる。その配列は、ポリ不飽和脂肪酸を基
質として利用する、機能的活性を有するエロンガーゼをコードする。この配列は
、例えば、モルチエレラ属の真菌に由来するものであってよい。特に、それは、
M.アルピナに由来するものであってよい。
パク質を含み、さらに、ポリ不飽和脂肪酸を伸長し、かつ精製されたタンパク質
のアミノ酸配列と少なくとも約30%のアミノ酸類似性を有する、精製されたポ
リペプチドを含む。
挿入される配列は、配列番号2(図22)により表される。宿主細胞は、原核細
胞であっても、又は真核細胞であってもよい。適当な例は、前記と同様である。
た配列番号2(図22)により表されるヌクレオチド配列を含むベクターも含み
、さらに、このベクターを含む宿主細胞も含む。この場合にも、宿主細胞は、原
核細胞であっても、又は真核細胞であってもよい。適当な例は、前記と同様であ
る。
物組織によるポリ不飽和脂肪酸の生成が引き起こされる、前記ベクターを含む植
物細胞、植物又は植物組織も含む。ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DGLA、2
0:4n−3又はADAでありうる。さらに、本発明は、植物細胞、植物又は植
物組織により発現された一つ又は複数の植物油又は脂肪酸を含む。
、トランスジェニック植物の種子におけるポリ不飽和脂肪酸の生成が引き起こさ
れる、前記ベクターを含むトランスジェニック植物も含む。
A配列(配列番号2)を含むゲノムを有する、ヒト以外のトランスジェニック哺
乳動物も含む。本発明は、少なくとも一つのエロンガーゼ又はそれらの生成物を
検出可能なレベルで含む、ヒト以外のトランスジェニック動物により産生された
体液も含む。
する工程、b)単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、c
)単離されたヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現にと
って十分な時間及び条件で、宿主細胞へベクターを導入する工程、並びにd)基
質を生成物ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、発現されたエロンガーゼ酵素を基
質ポリ不飽和脂肪酸へ曝露する工程を含む、ポリ不飽和脂肪酸を製造するための
方法も含む。基質ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、GLA、STA及びAAであり
、生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれDGLA、20:4n−3又は
ω6−ドコサペンタエン酸でありうる。本発明は、生成物ポリ不飽和脂肪酸を第
二生成物ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、発現されたエロンガーゼ酵素を、少
なくとも一つのデサチュラーゼへ曝露する工程をさらに含みうる。生成物ポリ不
飽和脂肪酸は、例えばDGLA、20:4n−3又はADAであり、第二生成物
ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれAA、EPA又はω6−ドコサペンタエ
ン酸であり、少なくとも一つのデサチュラーゼは、AA又はEPAの製造に関し
てはΔ5−デサチュラーゼであり、ω6−ドコサペンタエン酸の製造に関しては
Δ4−デサチュラーゼである。この方法は、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を最終
ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、少なくとも一つのエロンガーゼ及び少なくと
も一つの付加的なデサチュラーゼからなる群より選択される一つ又は複数の酵素
へ、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を曝露する工程をさらに含みうる。最終ポリ不
飽和脂肪酸は、例えば、ドコサヘキサエン酸、AA、ω6−ドコサペンタエン酸
又はω3−ドコサペンタエン酸でありうる。
飽和脂肪酸、配列番号2に関して記載された方法に従い製造された第二生成物ポ
リ不飽和脂肪酸及び配列番号2に関して記載された方法に従い製造された最終ポ
リ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸
を含む栄養組成物を含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DGLA、20
:4n−3及びADAからなる群より選択されうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪
酸は、例えば、AA、EPA及びω6−ドコサペンタエン酸からなる群より選択
されうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DHA、AA、ω6−ドコサペン
タエン酸及びω3−ドコサペンタエン酸からなる群より選択されうる。投与、特
徴、成分等に関する組成物のその他の属性は、前記と同様である。
飽和脂肪酸、配列番号2に関する前記の方法に従い製造された第二生成物ポリ不
飽和脂肪酸及び配列番号2に関する前記の方法に従い製造された最終ポリ不飽和
脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸と、2)
薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も含む。前記の薬学的組成物の特
徴(例えば、投与、成分等)が、この組成物にも適合する。
飽和脂肪酸、配列番号2に関する前記の方法に従い製造された第二生成物ポリ不
飽和脂肪酸及び配列番号2に関して記載された方法に従い製造された最終ポリ不
飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含
む動物飼料も含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DGLA、20:4n
−3又はADAでありうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、AA、E
PA又はω6−ドコサペンタエン酸でありうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例え
ば、DHA、アドレン酸、ω6−ドコサペンタエン酸又はω3−ドコサペンタエ
ン酸でありうる。
脂肪酸、配列番号2に関する前記の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和
脂肪酸及び配列番号2に関する前記の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪
酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む化粧品
も含む。
栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の不十分な摂取又は
生成により引き起こされる状態を予防又は治療する方法を含む。
くとも約35%と一致するか、又は相補的である、単離されたヌクレオチド配列
も含む。この配列は、配列番号3により表されるものでありうる。この配列は、
ポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を基質として利用する、機能的活性を有
するエロンガーゼをコードする。この配列は、例えばヒトのような哺乳動物に由
来する。
含む。また、本発明は、ポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を伸長し、かつ
この精製されたタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約30%のアミノ酸類似
性を有する、精製されたポリペプチドを含む。
列を単離する工程、b)i)プロモーター、およびii)該プロモーターと機能
的に連結された単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、並
びにc)エロンガーゼ酵素の発現にとって十分な時間及び条件で、宿主細胞へ該
ベクターを導入する工程を含む、エロンガーゼ酵素を製造する方法を含む。宿主
細胞は、配列番号1又は2を利用した対応する方法に関する前記の細胞と同様で
ありうる。
た配列番号3(図43)により表されたヌクレオチド配列を含むベクターも含み
、さらに、このベクターを含む宿主細胞も含む。宿主細胞は、前記の細胞と同様
でありうる。
物組織によるモノ不飽和脂肪酸及びポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される
少なくとも一つの脂肪酸の生成が引き起こされる、前記ベクターを含む植物細胞
、植物又は植物組織も含む。ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DGLA、20:4
n−3又はADAでありうる。本発明は、植物細胞、植物又は植物組織により発
現された一つ又は複数の植物油又は酸も含む。
物の種子におけるポリ不飽和脂肪酸の生成が引き起こされる、配列番号3を含む
ベクターを含むトランスジェニック植物も含む。
するヒトDNA配列を含むゲノムを有する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳
動物を含む。DNA配列は、配列番号3(図43)により表される。本発明は、
少なくとも一つのエロンガーゼ又はそれらの生成物を検出可能なレベルで含む、
ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物により産生された体液も含む。
する工程、b)該ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、c)単離さ
れたヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現にとって十分
な時間及び条件で、宿主細胞へベクターを導入する工程、並びにd)基質を生成
物ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、発現されたエロンガーゼ酵素を基質ポリ不
飽和脂肪酸へ曝露する工程を含む、ポリ不飽和脂肪酸を製造するための方法も包
含する。基質ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、GLA、STA又はAAであり、生
成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれDGLA、20:4n−3又はAD
Aでありうる。この方法は、生成物ポリ不飽和脂肪酸を第二生成物ポリ不飽和脂
肪酸へ変換するため、生成物ポリ不飽和脂肪酸を、少なくとも一つのデサチュラ
ーゼへ曝露する工程をさらに含みうる。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、D
GLA、20:4n−3及びADAであり、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例
えば、それぞれAA、EPA及びω6−ドコサペンタエン酸であり、少なくとも
一つのデサチュラーゼは、AA又はEPAの生成に関してはΔ5−デサチュラー
ゼであり、ω6−ドコサペンタエン酸の生成に関してはΔ4−デサチュラーゼで
ある。この方法は、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸へ変換
するため、少なくとも一つのエロンガーゼ及び少なくとも一つの付加的なデサチ
ュラーゼからなる群より選択される一つ又は複数の酵素へ、第二生成物ポリ不飽
和脂肪酸を曝露する工程をさらに含みうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、
DHA、ADA、ω6−ドコサペンタエン酸及びω3−ドコサペンタエン酸であ
りうる。
肪酸、配列番号3に関する前述の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂
肪酸及び配列番号3に関する前述の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸
でありうる、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物。生成物ポリ
不飽和脂肪酸は、例えば、DGLA、20:4n−3又はADAでありうる。第
二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、AA、EPA又はω6−ドコサペンタエン酸から
なる群より選択されうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DHA、ADA、
ω6−ドコサペンタエン酸又はω3−ドコサペンタエン酸でありうる。組成物の
その他の特性又は特徴(例えば、投与、成分等)は、他の栄養組成物に関する前
述のものと同様である。
物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号3に関する前記の方法に従い製造された第二生成
物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号3に関する前記の方法に従い製造された最終ポ
リ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸
と、2)薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も含む。組成物のその他
の特性(例えば、投与、付加的成分等)は、他の薬学的組成物に関する前述のも
のと同様である。
脂肪酸、配列番号3に関する前述の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和
脂肪酸及び配列番号3に関する前述の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪
酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む動物飼
料も含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DGLA、20:4n−3又は
ADAでありうる。ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、AA、EPA又はω6−ドコ
サペンタエン酸でありうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DHA、ADA
、ω6−ドコサペンタエン酸又はω3−ドコサペンタエン酸でありうる。
不飽和脂肪酸、配列番号3に関する前述の方法に従い製造された第二生成物ポリ
不飽和脂肪酸及び配列番号3に関する前述の方法に従い製造された最終ポリ不飽
和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む
化粧品を含む。
を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の不十分な摂取又は生成により
引き起こされる状態を予防又は治療する方法。
くとも約35%と一致するか、又は相補的である、単離されたヌクレオチド配列
を含む。この配列は、配列番号4により表されうる。この配列は、ポリ不飽和脂
肪酸を基質として利用する、機能的活性を有するエロンガーゼをコードする。こ
の配列は、セノラブディティス(Caenorhabditis)属の線虫に由
来し、又はそれから単離され、特にC.エレガンス(C. elegans)か
ら単離されうる。
含む。本発明は、ポリ不飽和脂肪酸を伸長し、かつこの精製されたタンパク質の
アミノ酸配列と少なくとも約30%のアミノ酸類似性を有する精製されたポリペ
プチドも含む。
列を単離する工程、b)i)プロモーター、およびii)該プロモーターと機能
的に連結された単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、並
びにc)エロンガーゼ酵素の発現にとって十分な時間及び条件で、宿主細胞へベ
クターを導入する工程を含む、エロンガーゼ酵素を製造する方法を含む。宿主細
胞の特性は、配列番号1、配列番号2及び配列番号3に関する前記の特性と同様
である。
た配列番号4(図46)により表されるヌクレオチド配列を含むベクターも包含
し、さらに、このベクターを含む宿主細胞も包含する。宿主細胞は、配列番号1
、配列番号2及び配列番号3のための前述の宿主細胞に関する前述の特性と同一
の特性を有する。
植物又は植物組織によるポリ不飽和脂肪酸の生成が引き起こされる、配列番号4
を含む前記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織を含む。ポリ不飽和脂肪
酸は、例えば、DGLA、20:4n−3又はADAでありうる。本発明は、植
物細胞、植物又は植物組織により発現された一つ又は複数の植物油又は脂肪酸も
含む。
物の種子におけるポリ不飽和脂肪酸の生成が引き起こされる、配列番号4に相当
するヌクレオチド配列を含む前記ベクターを含むトランスジェニック植物も含む
。
するC.エレガンスDNA配列を含むゲノムを有する、ヒト以外のトランスジェ
ニック哺乳動物を含む。そのDNA配列は、配列番号4(図46)により表され
うる。本発明は、少なくとも一つのエロンガーゼ又はそれらの生成物を検出可能
なレベルで含む、請求項187のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物により
産生された体液も含む。
する工程、b)単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、c
)単離されたヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現にと
って十分な時間及び条件で、宿主細胞へベクターを導入する工程、並びにd)基
質を生成物ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、発現されたエロンガーゼ酵素を基
質ポリ不飽和脂肪酸へ曝露する工程を含む、ポリ不飽和脂肪酸を製造するための
方法も含む。基質ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、GLA、STA又はAAであり
、生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれDGLA、20:4n−3又は
ADAでありうる。この方法は、該生成物ポリ不飽和脂肪酸を第二生成物ポリ不
飽和脂肪酸へ変換するため、発現されたエロンガーゼ酵素を、少なくとも一つの
デサチュラーゼへ曝露する工程をさらに含みうる。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、
例えば、DGLA、20:4n−3又はADAであり、第二生成物ポリ不飽和脂
肪酸は、例えば、それぞれAA、EPA又はω6−ドコサペンタエン酸であり、
少なくとも一つのデサチュラーゼは、AA又はEPAの製造に関してはΔ5−デ
サチュラーゼであり、ω6−ドコサペンタエン酸の製造に関してはΔ4−デサチ
ュラーゼである。この方法は、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂
肪酸へ変換するため、少なくとも一つのエロンガーゼ及び少なくとも一つの付加
的なデサチュラーゼからなる群より選択される一つ又は複数の酵素へ、第二生成
物ポリ不飽和脂肪酸を曝露する工程をさらに含みうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は
、例えば、DHA、ADA、ω6−ドコサペンタエン酸又はω3−ドコサペンタ
エン酸でありうる。
酸、配列番号4に関する前記の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪
酸及び配列番号4に関する前述の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸か
らなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物
も含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DGLA、20:4n−3又はA
DAでありうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、AA、EPA又はω
6−ドコサペンタエン酸でありうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DHA
、ADA、ω6−ドコサペンタエン酸又はω3−ドコサペンタエン酸でありうる
。組成物のその他の特徴は、前記の栄養組成物に関して記述されたものと同様で
ある。
物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号4に関する前述の方法に従い製造された第二生成
物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号4に関する前述の方法に従い製造された最終ポ
リ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸
と、2)薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を含む。組成物は、他の
薬学的組成物に関する前記の特性と同様の特性(例えば、投与、追加要素等)を
有する。
脂肪酸、配列番号4に関する前述の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和
脂肪酸及び配列番号4に関する前記の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪
酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む動物飼
料も含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DGLA、20:4n−3又は
ADAでありうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、AA、EPA又は
ω6−ドコサペンタエン酸でありうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、DH
A、ADA、ω6−ドコサペンタエン酸又はω3−ドコサペンタエン酸でありう
る。
リ不飽和脂肪酸、配列番号4に関する前述の方法に従い製造された第二生成物ポ
リ不飽和脂肪酸及び配列番号4に関する前記の方法に従い製造された最終ポリ不
飽和脂肪酸からなる群より選択されるポリ不飽和脂肪酸を含む化粧品を含む。
て記述された栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の不十
分な摂取又は生成により引き起こされる状態を予防又は治療する方法を包含する
。
明細書に組み込まれる。
されたい。
(%)を示す図である。
レビシエELO2配列を示す図である。
図である。図4Bは、酵母におけるエロンガーゼ酵素産生に使用された構成性発
現ベクターpRAE−5の物理的地図を示す図である。
示す図である。
オチド配列を示す図である。
ロンガーゼのアミノ酸配列を示す図である。
レビシエELO3(SUR4)と図7に示された翻訳されたMAELO配列との
アミノ酸配列アラインメントを示す図である。
クレオチド配列との比較を示す図である。
性を示す図である。
NAと共に共発現された場合のMAELOのPUFAエロンガーゼ活性を示す図
である。
セレビシエ由来のELO2の過剰発現との比較を示す図である。
レオチド配列由来のアミノ酸配列と、翻訳されたMAELOとの3つの異なる比
較を示す図である。
酸翻訳と、翻訳されたMAELOとの比較を示す図である。
号を参照)と、データベース検索において検出されたMAELO由来のアミノ酸
配列との比較を示す図である。
を示す図である。
GLA(C20:3n−6)ピークの検出に注意されたい。
たPUFAエロンガーゼ活性を示す図である。全てのクローンが明白なエロンガ
ーゼ活性を有する。
により957bp長のオープン・リーディング・フレームが明らかとなった。
ミドpRPB2に含まれるM.アルピナcDNAの全長ヌクレオチド配列を示す
図である。
ーゼのアミノ酸配列を示す図である。
物におけるn−6 PUFAエロンガーゼ活性を示す図である。
)の誘導された培養物におけるn−3及びn−6 PUFAエロンガーゼ活性を
示す図である。
Aと共に共発現された場合の、GLELOのGLAを基質として用いたエロンガ
ーゼ活性を示す図である。図26Bは、EPAを生成するようM.アルピナのΔ
5−デサチュラーゼcDNAと共に共発現された場合の、GLELOのSTAを
基質として用いたエロンガーゼ活性を示す図である。
配列(図7参照)との比較を示す図である。
)、MAELO配列(図7参照)、S.セレビシエELO2(GNS1)及びS
.セレビシエELO3(SUR4)の翻訳されたアミノ酸配列の比較を示す図で
ある。ヒスチジン・ボックスが下線で示されている。
配列とのアラインメントを示す図である。
配列とのアラインメントを示す図である。
2配列とのアラインメントを示す図である。
5632配列とのアラインメントを示す図である。
15960配列とのアラインメントを示す図である。
配列とのアラインメントを示す図である。
04050配列とのアラインメントを示す図である。
2配列とのアラインメントを示す図である。
225632配列とのアラインメントを示す図である。
7107とのアラインメントを示す図である。
749(F56H11.4)ホモログ配列とのアラインメントを示す図である。
749(F56H11.4)ホモログ配列とのアラインメントを示す図である。
エ・ホモログ配列DM1とのアラインメントを示す図である。
エ・ホモログ配列DM1とのアラインメントを示す図である。
である。
る。
)の誘導された培養物のエロンガーゼ活性(PUFA及びその他)を示す図であ
る。
を示す図である。
す図である。
334(pRET−22)の誘導された培養物のPUFAエロンガーゼ活性を示
す図である。
す図である。
ある。
レオチド配列及び対応するアミノ酸配列に関し、さらにヒト由来のエロンガーゼ
cDNAのヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列、並びにC.エレガンス
由来のエロンガーゼcDNAのヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列に関
する。さらに、本発明は、cDNAの使用、及び遺伝子によりコードされるタン
パク質の使用も含む。例えば、遺伝子及び対応する酵素は、薬学的組成物、栄養
組成物及びその他の有用な製品へ添加されうる、DGLA、AA、ADA、EP
A及び/又はDHAのような、ポリ不飽和脂肪酸及び/又はモノ不飽和脂肪酸の
製造において使用されうる。
、様々なポリ不飽和脂肪酸、特に20〜24個の炭素を含むPUFAの生成に必
須である。本発明に関して、単離されたM.アルピナ・エロンガーゼcDNA(
MAELO)のヌクレオチド配列は、図6に示され、このヌクレオチド配列によ
りコードされる対応する精製されたタンパク質又は酵素のアミノ酸配列は、図7
に示されている。さらに、単離されたGLAエロンガーゼcDNA(GLELO
)のヌクレオチド配列は、図22に示され、このヌクレオチド配列によりコード
される対応する精製されたタンパク質又は酵素のアミノ酸配列は、図23に示さ
れている。単離されたヒト配列1(HSELO1)エロンガーゼのヌクレオチド
配列は、図43に示され、この配列によりコードされる対応する精製されたタン
パク質又は酵素のアミノ酸配列は、図44に示されている。さらに、単離された
C.エレガンス・エロンガーゼcDNA(CEELO1)のヌクレオチド配列は
、図46に示され、それによりコードされる対応する精製されたタンパク質又は
酵素のアミノ酸配列は、図47に示されている。
GLAをDGLAへ、又はSTAを20:4n−3へ、又はAAをADAへ伸長
する。次いで、DGLAからのアラキドン酸の生成、又は20:4n−3からの
EPAの生成が、Δ5−デサチュラーゼにより触媒される。従って、AA(又は
EPA)、DGLA(又は20:4n−3)、ADA(又はω3−ドコサペンタ
エン酸)は、いずれも、少なくとも一つのエロンガーゼcDNA及びそれらによ
りコードされる酵素が存在しない場合には合成されえない。
O cDNAのヌクレオチド配列(図6参照))の少なくとも約50%、好まし
くは少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約70%と一致する(即ち
、同一性を有する)か、又は相補的な配列を有するヌクレオチド配列(及び対応
するコードされるタンパク質)も包含することに注意されたい。さらに、本発明
は、配列番号2のヌクレオチド(即ち、本明細書に記載されたGLELO cD
NAのヌクレオチド配列(図22参照))の少なくとも約35%、好ましくは少
なくとも約45%、より好ましくは少なくとも約55%と一致する(即ち、同一
性を有する)か、又は相補的な配列を有するヌクレオチド配列(及び対応するコ
ードされるタンパク質)も含む。さらに、本発明は、配列番号3のヌクレオチド
(即ち、本明細書に記載されたヒト配列1(HSELO1)cDNAのヌクレオ
チド配列(図43参照))の少なくとも約35%、好ましくは少なくとも約45
%、より好ましくは少なくとも約55%と一致する(即ち、同一性を有する)か
、又は相補的な配列を有するヌクレオチド配列(及び対応するコードされたタン
パク質)も含む。さらに、本発明は、配列番号4のヌクレオチド(即ち、本明細
書に記載されたC.エレガンスcDNA、CEELO1のヌクレオチド配列(図
46参照))の少なくとも約35%、好ましくは少なくとも約45%、より好ま
しくは少なくとも約55%と一致する(即ち、同一性を有する)か、又は相補的
な配列を有するヌクレオチド配列(及び対応するコードされるタンパク質)も含
む。そのような配列は、モルチエレラ以外の起源(例えば、真核生物(例えば、
トラウストキトリウム種(Thraustochytrium spp.)(例
えば、トラウストキトリウム・アウレウム(Thraustochytrium
aureum)及びトラウストキトリウム・ロセウム(Thraustoch
ytrium roseum))、シゾキトリウム種(Schizochytr
ium spp.)(例えば、シゾキトリウム・アグレガツム(Schizoc
hytrium aggregatum))、コニディオボルス種(Conid
iobolus spp.)(例えば、コニディオボルス・ナノデス(Coni
diobolus nanodes))、エントモルフトラ種(Entomor
phthora spp.)(例えば、エントモルフトラ・エキシタリス(En
tomorphthora exitalis))、サプロレグニア種(Sap
rolegnia spp.)(例えば、サプロレグニア・パラシティカ(Sa
prolegnia parasitica)及びサプロレグニア・ディクリナ
(Saprolegnia diclina))、レプトミツス種(Lepto
mitus spp.)(例えば、レプトミツス・ラクテウス(Leptomi
tus lacteus))、エントモフトラ種(Entomophthora
spp.)、ピチウム種(Pythium spp.)、ポルフィリディウム
種(Porphyridium spp.)(例えば、ポルフィリジウム・クル
エンツム(Porphyridium cruentum))、コニディオボル
ス種(Conidiobolus spp.)、フィトフトラ種(Phytop
hathora spp.)、ペニシリウム種、コイドスポリウム種(Coid
osporium spp.)、ムコール種(Mucor spp.)(例えば
、ムコール・サーシネロイデス(Mucor circinelloides)
及びムコール・ジャバニクス(Mucor javanicus))、フザリウ
ム種(Fusarium spp.)、アスペルギルス種及びロドトルラ種(R
hodotorula spp.))、酵母(例えば、ディポダスコプシス・ユ
ニヌクレアタ(Dipodascopsis uninucleata))、哺
乳動物以外の生物、例えばハエ(キイロショウジョウバエ(Drosophil
a melanogaster))又はセノラブディティス種(例えば、セノラ
ブディティス・エレガンス)、又は哺乳動物(例えば、ヒトもしくはマウス))
に由来するものでありうる。そのような配列は、アルピナ種以外のモルチエレラ
属に属する種、例えば、モルチエレラ・エロンガタ(Mortierella
elongata)、モルチエレラ・エキシグア(Mortierella e
xigua)、モルチエレラ・イザベリナ(Mortierella isab
ellina)、モルチエレラ・ヒグロフィラ(Mortierella hy
grophila)及びモルチエレラ・ラマニアナ(Mortierella
ramanniana)、va.アングリスポラ(va. angulispo
ra)に由来するものであってもよい。さらに、本発明は、本発明のヌクレオチ
ド配列(即ち、配列番号1(MAELO)、配列番号2(GLELO)、配列番
号3(HSELO1)及び配列番号4(CEELO1))及びモルチエレラ以外
の起源に由来する、前記の相補性又は一致性/同一性を有する配列の断片及び誘
導体も包含する。前記配列の機能的等価物(即ち、エロンガーゼ活性を有する配
列)も、本発明に包含される。
と定義する。これは適当な条件下で1個のDNAセグメントのセンス鎖が別のD
NAセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズして2重らせんを形成する能
力を測定することにより決定する。2重らせんではアデニンが一方の鎖に現れる
ともう一方の鎖にはいつもチミンが現れる。同様に一方の鎖にグアニンが現れる
ともう一方の鎖にはいつもシトシンが現れる。2個のDNAセグメントのヌクレ
オチド配列間の関連性が大きいほど2個のDNAセグメントの鎖間でハイブリッ
ド2本鎖を形成する能力が大きくなる。
(センスまたはアンチセンスのいずれか)間の同一性、対応性または同等性の程
度と定義する。同一性%が大きくなるほど、鎖間の対応性、同一性または同等性
が高くなる。
保存アミノ酸残基の存在と定義する。2個のアミノ酸配列間の類似性の程度が高
いほど、2個の配列の対応性、同一性または同等性が高くなる。(2個のアミノ
酸配列間の「同一性」を両配列における一連の正確に類似したまたは不変のアミ
ノ酸残基の存在と定義する) 「相補性」、「同一性」および「類似性」の定義は当業者に周知である。
アミノ酸配列に対して少なくとも約50%のアミノ酸類似性を有し(例えば図7
(MAELO)を参照のこと)、また前記ヌクレオチド配列によりコードされる
精製ポリペプチドをも含む。さらに、本発明はポリ不飽和脂肪酸を伸長し、前記
のタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約30%のアミノ酸類似性を有
し(例えば図23(GLELO)を参照のこと)、また前記ヌクレオチド配列に
よりコードされる精製ポリペプチドをも含む。さらに、本発明はまたポリ不飽和
およびモノ不飽和脂肪酸を伸長し、前記のタンパク質のアミノ酸配列に対して少
なくとも約30%のアミノ酸類似性を有し(例えば図44(HSELO1)を参
照のこと)、また前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチドを
も含む。また、本発明はポリ不飽和脂肪酸を伸長し、前記のタンパク質のアミノ
酸配列に対して少なくとも約30%のアミノ酸類似性を有し(例えば図47(C
EELO1)を参照のこと)、また前記ヌクレオチド配列によりコードされる精
製ポリペプチドをも含む。
ト条件下で図6に示す配列番号1(MAELO)および/または図22に示す配
列番号2(GLELO)および/または図43に示す配列番号3(HSELO1
)および/または図46に示す配列番号4(CEELO1)により表されるヌク
レオチド配列に対応するまたは相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸にハ
イブリダイズできる単離されたヌクレオチド配列をも包含する。適当な温度およ
びイオン強度条件下で核酸分子の1本鎖形態が別の核酸分子にアニーリングでき
る場合、核酸分子は別の核酸分子に「ハイブリダイズできる」(Sambroo
kら、「Molecular Cloning:A Laboratory M
anual」第2版(1989)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州)。温度およ
びイオン強度はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」により決定す
る。「ハイブリダイゼーション」には相補的な配列を含有する2個の核酸が必要
である。しかしながら、ハイブリダイゼーションの厳密性に応じて塩基間の誤対
合を生じ得る。核酸をハイブリダイズするのに適当な厳密性は核酸の長さおよび
相補性の程度に依存する。このような変動要因は当業界で周知である。より具体
的には、2個のヌクレオチド配列間の類似性または相同性が高くなるほど、これ
らの配列を有する核酸のハイブリッドのTm(融解温度)値が高くなる。100
ヌクレオチド以上の長さのハイブリッドに関しては、Tmを算出するための方程
式が誘導されている(前記で引用したSambrookらを参照のこと)。短い
核酸でのハイブリダイゼーションに関しては、誤対合の位置がより重要であり、
オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(前記で引用したSambr
ookらを参照のこと)。
プラスミドまたは構築物を使用して原核または真核宿主細胞のいずれかに導入で
きる。
ゼをコード化するヌクレオチド配列および宿主細胞中で機能し、ヌクレオチド配
列によりコードされるエロンガーゼの発現を誘導できるいずれかのプロモーター
を含むことができる。プロモーターはヌクレオチド配列と関連して機能できるか
またはヌクレオチド配列と機能的に連結できる。(プロモーターがコーディング
配列の転写または発現に影響する場合、プロモーターはコーディング配列と「機
能的に連結している」と言える。)適当なプロモーターには例えばアルコールデ
ヒドロゲナーゼ、グリセロアルデヒド−3−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、
ホスフォグルコイソメラーゼ、ホスフォグリセレートキナーゼ、酸ホスファター
ゼ、T7、TP1、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメガロウィルス前初
期、乳清酸性タンパク質、グルコアミラーゼ、およびガラクトースの存在下で活
性化されるプロモーター、例えばGAL1およびGAL10などがある。さらに
、その他のタンパク質、オリゴ糖、脂質等をコードするヌクレオチド配列もまた
ベクターおよびポリアデニル化シグナル(例えばSV−40T抗原、卵アルブミ
ンまたはウシ成長ホルモンのポリAシグナル)のようなその他の制御配列に含ま
れ得る。構築物に存在する配列の選択は望ましい発現生成物および宿主細胞の特
性に依存する。
えばトランスフェクション、形質転換およびエレクトロポレーション(Samb
rookら、「Molecular Cloning:A Laborator
y Manual」第2版(1989)1ないし3巻、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレスを参照のこと)により、これを選択した宿主細
胞に導入できる。次いでPUFAの発現を可能にする適当な条件下で宿主細胞を
培養し、次いで回収し、精製する。
またはベクターを用いる場合、独特のトリグリセリドまたはオイルを設計できる
ことにも留意すべきである(例えばMAELO、GLELO、HSELO1およ
び/またはCEELO1)。次いでこのベクターを1個の宿主細胞に導入できる
。別法として、各々の配列を別個のベクターに導入できる。次いでこれらのベク
ターを各々2個の宿主細胞に、または1個の宿主細胞に導入できる。
coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)のような細菌、お
よびスピルリナ(Spirulina)種(すなわち青緑藻)のようなシアノバ
クテリアなどが挙げられる。適当な真核細胞宿主の例としては、例えば哺乳動物
細胞、植物細胞、酵母細胞、例えばサッカロミセス(Saccharomyce
s)種、リポミセス(Lipomyces)種、カンジダ(Candida)種
例えばヤロウィア(Yarrowia)(カンジダ)種、クルイベロミセス(K
luyveromyces)種、ピチア(Pichi)種、トリコデルマ(Tr
ichoderma)種もしくはハンセヌラ(Hansenula)種、または
糸状菌細胞のような真菌細胞、例えばアスペルギルス(Aspergillus
)、ニューロスポラ(Neurospora)およびペニシリウム(Penic
illium)などが挙げられる。好ましくはビール酵母菌(Saccharo
myces cerevisiae)(パン酵母)細胞を用いる。
過性の発現は宿主細胞で機能する発現シグナルを含有する導入構築物から生じる
ことができるが、この構築物は複製せず、宿主細胞に組み込まれることはまれで
あるか、または宿主細胞は増殖性でない。一過性の発現はまた目的の遺伝子に機
能的に連結した制御可能なプロモーターの活性を誘導することにより達成するこ
ともできるが、このような誘導システムでは発現レベルの基底値がたびたび低く
なる。安定した発現は宿主ゲノムに組み込むことができるかまたは宿主細胞にお
いて自発的に複製される構築物の導入により達成できる。発現構築物に位置する
かまたは発現構築物でトランスフェクトされた選別可能なマーカーを使用し、続
いてマーカーを発現する細胞を選別することにより、目的の遺伝子の安定発現を
選択することができる。組み込みにより安定発現が得られた場合、構築物の組み
込み部位を宿主ゲノム内に無作為に生じることができるか、または宿主座との組
換えを標的化するのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有する構築物を使用
することにより構築物の組み込み部位を標的化できる。構築物が内在性の座を標
的にする場合、転写または翻訳制御領域の全てまたは一部が内在性の座により提
供できる。
なわちエロンガーゼ)を発現するために、トランスジェニックマウスをも用いる
ことができる。より具体的には、一度前記の構築物を作ると、これを胚の前核に
挿入できる。次いで胚を受体の雌に移植できる。別法として、核の移送法をも利
用できる(Schniekeら、Science、278:2130−2133
(1997))。次いで妊娠および出産してもよい(例えば米国特許第5750
176号、米国特許第5700671号を参照のこと)。次いで子孫の乳、組織
またはその他の体液サンプルは非トランスジェニック動物に通常見出されるレベ
ルに比較して変化したレベルのPUFAを含有するはずである。レベルが変化し
たまたは増加したPUFA生成、およびエロンガーゼ酵素をコードする一つのま
たは複数の遺伝子のゲノムへの組み込みに関して次世代をモニター観察できる。
宿主として利用される哺乳動物は例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、
ヒツジ、ウマおよびウシからなる群から選択できる。しかしながら、目的の酵素
をコードするDNAをゲノムに組み込む能力を有すればいずれの哺乳動物を用い
てもよい。
よび終止領域をエロンガーゼポリペプチドをコードするDNAに機能できるよう
に結合する。転写および翻訳開始および終止領域を、発現すべきDNAを含む種
々の非排他的供給源、望ましい系において発現可能であると知られているかもし
くは考えられている遺伝子、発現ベクター、化学合成から、または宿主細胞の内
在性の座から誘導する。植物組織および/または植物の部分における発現はとり
わけ組織または部分が種子、葉、果実、花、根等のような初期に収穫されたもの
である場合、特定の有効性を呈する。特異的な制御配列例えば米国特許第546
3174号、4943674号、51066739号、5175095号、54
20034号、5188958号および5589379号の配列を利用すること
により発現を植物のその位置に標的化できる。また別に、発現したタンパク質は
、直接かまたはさらに修飾して宿主植物からの液体分画に混合することができる
生成物を生成する酵素でよい。一つのまたは複数のエロンガーゼ遺伝子の発現、
またはアンチセンスエロンガーゼ転写物は植物部分および/または植物組織に見
出される特異的PUFAまたはその誘導体のレベルを変化させることができる。
望ましいPUFAを高い比率で含有するか、またはPUFA組成物がヒト母乳に
よりよく類似している組織および/または植物部分を作るために、エロンガーゼ
コーディング領域を単独でまたはその他の遺伝子をと共に発現できる(Prie
toら、PCT公開WO95/24494)。開始領域が得られる遺伝子の3’
領域から、または異なる遺伝子から終止領域を誘導できる。多くの終止領域が周
知であり、同一および異なる属および種の種々の宿主において満足できるもので
あることが解っている。終止領域は通常いずれかの特別な特性のためというより
むしろ利便性から選択する。
(大豆)またはブラシカ・ナプス(Brassica napus)カノーラ)
)、植物組織、トウモロコシ、ジャガイモ、ヒマワリ、紅花または麻を各々エロ
ンガーゼ酵素発現のための宿主または宿主細胞として用いることもでき、またポ
リ不飽和脂肪酸の生成に利用することができる。より具体的には、望ましいPU
FAを種子に発現できる。種子油の単離方法は当業界で周知である。このように
、PUFA供給源の提供に加え、エロンガーゼ遺伝子および恐らくデサチュラー
ゼ遺伝子の発現により種子油成分を操作して栄養組成物、薬学的組成物、動物飼
料および化粧品に加えることができる種子油を提供できる。再度、一時的にエロ
ンガーゼ遺伝子が十分に発現できる条件下で、機能的にプロモータに結合したエ
ロンガーゼをコードするDNA配列を含んでなるベクターを植物組織または植物
に導入する。ベクターは別の酵素例えばΔ4−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュ
ラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ9−デサチュラーゼ
、Δ10−デサチュラーゼ、Δ12−デサチュラーゼ、Δ13−デサチュラーゼ
、Δ15−デサチュラーゼ、Δ17−デサチュラーゼおよび/またはΔ19−デ
サチュラーゼをコードする1個またはそれ以上の遺伝子をも含んでなってよい。
植物組織または植物は酵素が作用する関連基質(例えばDGLA、GLA、ST
A、AA、ADA、EPA、20:4n−3、等)を生成できるか、またはこの
ような基質を生成する酵素をコードするベクターを植物組織、植物細胞、植物、
または目的の宿主細胞に導入できる。加えて、適当な酵素を発現する植物組織に
基質をスプレーできる。これらの種々の技術を用いることにより、植物細胞、植
物組織、植物または目的の宿主細胞を用いてPUFA(例えばDGLA、AAも
しくはADAのようなn−6不飽和脂肪酸、またはEPA、もしくはDHAのよ
うなn−3脂肪酸)を生成できる。本発明はまた前記したベクターを含んでなる
トランスジェニック植物をも包含し、この場合ベクターのヌクレオチド配列の発
現の結果、例えばトランスジェニック植物の種子にポリ不飽和脂肪酸を生成する
ことにも注目すべきである。
、および続いて宿主細胞に導入されるベクターに存在するDNA配列によりコー
ドされ得る酵素を図1に示す。
配列を単離する工程;2)該ヌクレオチド配列を含んでなるベクターを構築する
工程;および3)エロンガーゼ酵素を生成するのに十分な時間および条件下で該
ベクターを宿主細胞に導入する工程;からなる前記のエロンガーゼ酵素の一つを
生成する方法をも包含する。
のように生成したエロンガーゼに曝露することからなるポリ不飽和脂肪酸の生成
方法をも包含する。例えばGLAをエロンガーゼに曝露するとGLAはDGLA
に変換される。次いでDGLAをΔ5−デサチュラーゼに曝露すると、これはD
GLAをAAに変換する。次いでΔ17−デサチュラーゼを用いてAAをEPA
に変換でき、またエロンガーゼおよびΔ4−デサチュラーゼを用いてDHAに変
換できる。別法として、エロンガーゼを用いて18:4n−3を20:4n−3
に変換し、これをΔ5−デサチュラーゼに曝露してEPAに変換できる。またエ
ロンガーゼを用いて18:3n−3を20:3n−3に変換し、これをまたΔ8
−デサチュラーゼにより20:4n−3に変換できる。このようにエロンガーゼ
をポリ不飽和脂肪酸の生成に用いることができ、またこれを特定の有益な目的の
ために使用することができる。(いくつかの生合成経路でエロンガーゼが果たす
多くの重要な役割の説明に関して図1を参照のこと。) エロンガーゼ遺伝子およびそれによりコードされる酵素の使用 前記するように単離されたエロンガーゼcDNAおよびそれによりコードされ
る対応するエロンガーゼ酵素(または精製ポリペプチド)には多くの用途がある
。例えば各々のcDNAおよび対応する酵素をポリ不飽和脂肪酸、例えばDGL
A、AA、ADA、20:4n−3またはEPAの生成において間接的または直
接的に使用できる。(「直接的」とは酵素が直接的に酸を別の酸に変換する状況
を包含することを意味し、後者の酸は組成物において利用される(例えばGLA
のDGLAへの変換)。)「間接的」とはエロンガーゼにより脂肪酸を別の脂肪
酸(すなわち経路中間体)に(例えばGLAをDGLAに)変換する状況を包含
することを意味し、次いでエロンガーゼ以外の酵素を用いて後者の脂肪酸を別の
脂肪酸に(例えばΔ5−デサチュラーゼによりDGLAをAAに)変換する。こ
れらのポリ不飽和脂肪酸(すなわちエロンガーゼ酵素の活性により直接的または
間接的のいずれかにより生成されたもの)を例えば栄養組成物、薬学的組成物、
化粧品および動物用飼料に添加することができ、これらはすべて本発明に包含さ
れる。これらの用途に関しては以下に詳細に記載する。
経腸または非経口摂取を含むヒト摂取用のいずれかの食物または調製物が含まれ
、これは体内に取り込まれると(a)栄養を与える、もしくは組織を作り上げる
、もしくはエネルギーを供給するおよび/または(b)十分な栄養状態もしくは
代謝機能を維持、回復もしくは補助する。
一つのエロンガーゼ酵素を用いて生成し、固体または液体のいずれかの形態でよ
い少なくとも一つの油または酸を含んでなる。加えて、組成物は特定の用途に望
ましい量の食用多量要素、ビタミンおよびミネラルを含んでよい。このような成
分の量は、組成物を正常で健康な幼児、子供に使用することを意図しているのか
、それとも特定の代謝状態を伴う成人のような特別な必要性を有する(すなわち
代謝障害)成人に使用することを意図しているのかに依存して変動する。
タンパク質などがあるが、これらに限定するものではない。このような食用脂肪
の例としてはココナッツ油、大豆油並びにモノおよびジグリセリドなどが挙げら
れるが、これらに限定するものではない。このような炭水化物の例としてはグル
コース、食用乳糖および加水分解デンプンなどが挙げられるが、これらに限定す
るものではない。加えて、本発明の栄養組成物において用いることができるタン
パク質の例としては大豆タンパク質、電気透析乳清、電気透析スキムミルク、乳
清、またはこれらのタンパク質の加水分解物などが挙げられるが、これらに限定
するものではない。
してよい:カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、
マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレニウム、ヨウ素並びにビタミンA、E、D、Cお
よびB複合体。その他のこのようなビタミンおよびミネラルを添加してもよい。
ある。半精製または精製したとは天然物の精製により、または合成により調製さ
れた物質を意味する。
よび再水和組成物などが挙げられるが、これらに限定するものではない。特定の
目的の栄養組成物には、幼児用の経腸または非経口補助食品、幼児専用調合物、
高齢者用の補助食品、並びに胃腸障害および/または吸収不良を有する者の補助
食品に利用するものなどが挙げられるが、これらに限定するものではない。
よい。例えば、マーガリン、調製バター、チーズ、ミルク、ヨーグルト、チョコ
レート、キャンディー、スナック類、サラダ油、調理用油、調理用脂肪、肉、魚
および飲料などのいかなる型の食品に添加してもよいが、これらに限定するもの
ではない。
くは成人または小児科用の経腸栄養剤である。ストレスを経験しているかまたは
慢性もしくは急性の疾病状態のために特に必要性のある成人または子供にこの組
成物を投与できる。組成物は本発明に従って生成したポリ不飽和脂肪酸に加えて
、前記するような多量要素、ビタミンおよびミネラルを含んでなってよい。多量
要素は人乳に存在するのと等価の量で、またはエネルギーを基準にして、すなわ
ちカロリー当たりを基準にして存在してよい。
。(以下の実施例も参照のこと。) 例えば経腸処方を滅菌し、次いでそのまま供給できるよう(ready−to
−feed:RTF用)にするかまたは濃縮液体もしくは粉末として保存する。
粉末は前記するように調製した処方をスプレー乾燥して調製でき、濃縮物を再水
和することにより再構成する。成人および小児科栄養調合物は当業界で周知であ
り、市販により入手できる(例えば、ロス・プロダクツ・ディビジョン、アボッ
ト・ラボラトリーズ、コロンバス、オハイオ州のSimilac(登録商標)、
Ensure(登録商標)、Jevity(登録商標)、およびAliment
um(登録商標))。本発明に従って製造される油または脂肪酸をこれらの処方
のいずれかに添加してよい。
ら約3kcal/mlの範囲でよい。固体または粉末の形態では栄養補助食品は
約1.2から9kcal/g以上、好ましくは約3ないし7kcal/gを含ん
でよい。一般に、液体製品のオスモル濃度は700ミリオスモル以下、より好ま
しくは660ミリオスモル以下にすべきである。
、ビタミンおよびミネラルを含んでよい。これらの付加的な成分が存在すること
により個体がこれらの要素の1日最低必要量を摂取するのを助ける。PUFAの
供給に加えて亜鉛、銅、葉酸および抗酸化剤を組成物に添加するのも望ましい。
これらの物質はストレスをうけた免疫系を高め、それにより組成物を摂取してい
る個体がさらなる利益を享受することになると考えられる。薬学的組成物もまた
これらの要素を補給しうる。
PUFAに加えて、少なくとも炭水化物の5重量%が消化しにくいオリゴ糖であ
る炭水化物供給源を含んでなる。より好ましい実施態様では栄養組成物はさらに
タンパク質、タウリンおよびカルニチンを含んでなる。
その他の症状もしくは疾病状態の予防もしくは治療のために、本発明に従って製
造したPUFAまたはその誘導体を食品代用物または栄養補助食品、とりわけ幼
児調合物に添加してよい。背景としてヒトの母乳は約0.15%から約0.36
%のDHA、約0.03%から約0.13%のEPA。約0.30%から約0.
88%のAA、約0.22%から約0.67%のDGLA、および約0.27%
から約1.04%のGLAからなる脂肪酸プロフィールを有することに留意すべ
きである。従って、本発明に従って製造したDGLA、AA、EPAおよび/ま
たはデコサヘキサエノン酸(DHA)のような脂肪酸を用いて例えばヒトの母乳
のPUFA含量をよりよく模写するために幼児調合物の組成を変化させるか、ま
たはヒト以外の哺乳動物の乳に通常見出されるPUFAの存在を変化させること
ができる。とりわけ薬理学的に、または栄養補助食品、特に母乳代用品もしくは
補助食品において使用するための組成物は一つまたはそれ以上のAA、DGLA
およびGLAを含んでなるのが好ましい。より好ましくは、油ブレンドは約0.
3から30%のAA、約0.2から30%のDGLA、および/または約0.2
から約30%のGLAからなる。
重量%含んでなり、これは本発明に包含される。好ましい組成物ではGLAとし
て全PUFA組成物の約1から約25重量%含まれる(米国特許第519619
8号)。その他のビタミン、とりわけビタミンA、D、EおよびL−カルニチン
のような脂溶性ビタミンを含んでもよい。望む場合、アルファ・トコフェロール
のような保存剤を約0.1重量%の量で加えてもよい。
ることができる。母乳補助食品または代用品として処方する場合、一つまたはそ
れ以上のAA、DGLAおよびGLAを含んでなる組成物が各々約1:19:3
0から約6:1:0.2の比率で提供される。例えば、動物の乳はAA:DGL
A:GLAの比率が1:19:30から6:1:0.2の範囲で変動し、好まし
くは約1:1:1、1:2:1、1:1:4の中間的な比率も含まれる。宿主細
胞において一緒に製造した場合、GLAおよびDGLAのような前駆体基質のA
Aへの変換率および%を調整してPUFAの比率を正確に調節できる。例えばD
GLAのAAへの変換率を5%から10%にしてAAのDGLAに対する比率を
約1:19にでき、一方変換率を約75%から80%にしてAAのDGLAに対
する比率を約6:1にできる。このように、細胞培養系においても宿主動物にお
いても、エロンガーゼ発現およびその他のデサチュラーゼ発現の時期、程度およ
び特異性を制御してPUFAレベルおよび比率を調節できる。次いで本発明に従
って製造したPUFA/酸(例えばAAおよびDGLA)を望ましい濃度および
比率で別のPUFA/酸(例えばGLA)と組み合わせてよい。
動物用補助食品として用いて動物の組織または乳脂肪酸組成をヒトまたは動物の
摂取により望ましいものに変化させることもできる。
ゼcDNA(すなわちMAELO、GLELO、HSELO1またはCEELO
)を用いて製造した一つまたはそれ以上の脂肪酸および/または得られた油を含
んでなる薬学的組成物をも包含する。より具体的にはこのような薬学的組成物は
一つまたはそれ以上の酸および/または油、ならびに標準的で周知の無毒性の医
薬的に許容される担体、アジュバントまたはベヒクル例えばリン酸緩衝生理食塩
水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤または水/油エマルションの
ようなエマルションを含んでなってよい。組成物は液体または固体の形態でよい
。例えば、組成物を錠剤、カプセル、摂取可能な液体または粉末、注射可能なま
たは局所用軟膏またはクリームの形態でよい。例えば分散液の場合、必要な粒子
径を維持することにより、および界面活性剤を使用することにより適当な流動性
を維持できる。等張化剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含有するのも望ましい
。このような不活性希釈剤に加え、組成物はまたアジュバント、例えば湿潤化剤
、乳化および懸濁化剤、甘味剤、香味剤並びに芳香剤をも含有できる。
ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロー
ス、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントま
たはこれらの基質の混合物を含んでなってよい。
できる。例えば、本発明に従って製造されたPUFAをラクトース、スクロース
、およびコーンスターチのような慣用される錠剤基剤をアカシア、コーンスター
チまたはゼラチンのような結合剤、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸のよう
な崩壊剤、およびステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤
と組み合わせて錠剤化できる。これらの賦形剤を抗酸化剤および適当なPUFA
と共にゼラチンカプセルに組み入れてカプセルを調製できる。抗酸化剤およびP
UFA成分は前記したガイドラインに適合しなければいけない。
ralipids(登録商標)のような市販の処方に組み入れてよい。典型的な
正常の成人血漿脂肪酸プロフィールは6.64から9.46%のAA、1.45
から3.11%のDGLAおよび0.02から0.08%のGLAからなる。患
者の正常な脂肪酸プロファイルを達成するために、これらのPUFAまたはその
代謝前駆体を単独でまたはその他のPUFAと組み合わせて、投与できる。望む
場合、処方の各々の成分を別個に、キットの形態で1回または多数回投与用に提
供できる。特定の脂肪酸の典型的な投与量は1日0.1mgから20g(100
gまで)、好ましくは1日10mgから1、2、5または10gである。
腸経路)および非経口経路等がある。例えば、液体調製物を例えば経口または直
腸経路で投与できる。加えて、均質な混合物を水に完全に分散し、滅菌条件下で
生理学的に許容される希釈剤、保存剤、緩衝液またはプロペラントと混合してス
プレーまたは吸入剤を形成できる。
た、または加齢皮膚の処置または外傷のあるまたは火傷した皮膚の処置、または
疾病もしくは症状の影響を受けた皮膚もしくは髪の処置に用いる場合、恐らく局
所的に適用できる。
年齢、患者の免疫状態等に依存する。
次いで再構築するための滅菌粉末にできる。
々障害の処置をも包含する。とりわけ、本発明の組成物を用いて血管形成後の再
狭窄を処置することができる。さらに、本発明の組成物を用いて炎症、リウマチ
性関節炎、喘息および乾癬の症状を処置することもできる。PUFAがカルシウ
ム代謝に関与し得ることも実証されており;従って、本発明の組成物を恐らく骨
粗鬆症および腎臓または尿路結石の処置または予防に利用することができる。
酸組成を変化させていることが明らかになっている。脂肪酸の添加がその成長を
遅延させ、細胞死を招き、化学療法剤の感受性を高めることが示されている。さ
らに本発明の組成物はまた癌に関連する悪液質の処置にも有益である。
877号およびHorrobinら、Am.J.Clin.Nutr.57(補
):732S−737Sを参照のこと)。糖尿病の動物では脂肪酸代謝および組
成が変化していることが明らかにされている。
製造したPUFAを含んでなる本発明の組成物を、湿疹の処置、血圧低下および
数学的な試験スコアの改善にも用いることができる。加えて、本発明の組成物を
血小板凝集の阻止、血管拡張の誘発、コレステロール値の低下、血管壁平滑筋お
よび繊維組織の増殖の阻止(Brennerら、Adv.Exp.Med.Bi
ol.83:85−101(1976))、消化管出血およびその他の非ステロ
イド性抗炎症薬の副作用の低減または予防(米国特許第4666701号)、子
宮内膜症および月経前症候群の予防または処置(米国特許第4758592号)
、並びに筋肉脊髄炎およびウイルス感染後の慢性疲労の処置(米国特許第511
6871号)に用いることができる。
害の処置、並びに一般的な健康状態の保持における使用も含まれる。
合物を形成するように既存の化粧用組成物に加えるか、または単独の組成物とし
て用いることができる。
以外の動物)に関連して利用できることも注目すべきである。動物はヒトと同じ
必要性および状況を多く経験するからである。例えば、本発明の油または酸を動
物用栄養補助食餌、動物用食餌代用品、動物用ビタミンに、または動物用局所用
軟膏に利用することができる。
はない。
コドンの決定 1000のランダムcDNAクローンの5’末端をモルチエレラ・アルピナ(
Mortierella alpina)cDNAライブラリーからシークエン
シングした。配列をファストAアルゴリズムを用いるGCG(ジェネティックス
・コンピューター・グループ(マジソン、ウィスコンシン州))を用いて6個の
読み枠で翻訳し(PearsonおよびLipman、Proc.Natl.A
cad.Sci.USA、85:2444−2448(1988))、クエリー
配列と同型の配列群(核酸またはタンパク質)の類似性を、とりわけスイスポー
ト・データベース(ジェネバイオ、ジュネーブ、スイス)を用いて調べた。既知
遺伝子に対するタンパク質配列相同性に基づいて多くのクローンを推定ハウスキ
ーピング遺伝子として同定した。データベースの既知ハウスキーピング遺伝子に
適合する21個のM.アルピナ(M.alpina)cDNA配列を選別した(
以下の表1を参照のこと)。これらの21個の配列およびM.アルピナΔ5−(
図18を参照のこと)、Δ6−およびΔ12−デサチュラーゼ配列全長に基づい
てM.アルピナコドンバイアスの表(表2を参照のこと)を作った。M.アルピ
ナcDNA配列によってコードされる推定タンパク質および既知タンパク質配列
間のファストA整列化がいくつかの区域で弱いので、相同性の強い区域のコドン
のみを用いた。
菌(Saccharomyces cerevisiae)エロンガーゼ(EL
O2)を並べてアミノ酸相同性の区域を決定した(図2を参照のこと)。コドン
バイアスを二つのエロンガーゼ間の相同性アミノ酸に対応する配列の区域に適用
し、この配列の偏りに基づいてプライマーを設計した(図3を参照のこと)。M
11M.アルピナcDNAライブラリーから挿入物の大きさの平均が1.1キロ
塩基対である約6x105のクローンを含むcDNAを切除した(Knutzo
nら、J.Biol.Chem.273:29360−29366(1998)
)。内在プライマーRO339(5’−TTG GAG AGG AGG AA
G CGA CCA CCG AAG ATG ATG−3’)およびベクター
順行プライマーRO317(5’−CAC ACA GGA AAC AGC
TAT GAC CAT GAT TAC G−3’)を用いて切除したcDN
Aを増幅した。切除したM.アルピナcDNAライブラリー300ng、各プラ
イマー50ピコモル、10倍バッファー10μl、10mM PCRヌクレオチ
ド・ミックス(ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポ
リス、インディアナ州)、およびTaqポリメラーゼ1.0ユニット;を含有す
る100μlの容量でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施した。パーキン・
エルマー9600(ノーウォーク、コネチカット州)の熱循環器条件は以下のと
おりである:94℃で2分間、次いで94℃で1分間を30サイクル、58℃で
2分間、および72℃で3分間。続いて72℃で2分間さらにPCRを延長した
。
精製し、ABI 373ADNAシークエンサー(パーキン・エルマー、フォス
ター・シティー、カリフォルニア州)を用いて単離したフラグメントを直接的に
シークエンシングした。GCGの配列分析パッケージを用いて得られた配列を既
知配列と比較した。ファストAアルゴリズムを用いるGCG分析プログラムで、
6個の読み枠全てで配列を翻訳した(PearsonおよびLipman、前記
で引用)。タンパク質のスイスポートデータベース(ジェネバイオ、ジュネーブ
、スイス)を検索した。ビール酵母菌ELO2(GNS1)に対する推定タンパ
ク質配列の相同性に基づき、この翻訳したcDNAフラグメントを推定エロンガ
ーゼの一部であると同定し、これは63個のアミノ酸において41.3%の同一
性を有した。
したベクター、pZL1(ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーティッド、
ガイザースブルグ、メリーランド州)配列に基づいて新規プライマーを設計した
。前記した条件を用いて、BamHI制限部位を加えた(下線)プライマーRO
350(5’−CAT CTC ATG GAT CCG CCA TGG C
CG CCG CAA TCT TG−3’)、およびベクター逆行プライマー
RO352(5’−ACG CGT ACG TAA AGC TTG−3’)
を使用してM.アルピナ切除したcDNAライブラリーを再度PCR増幅し、M
.アルピナエロンガーゼcDNAの全長を単離した。約1.5キロ塩基対のPC
R増幅フラグメントの末端をT4 DNAポリメラーゼ(ベーリンガー・マンハ
イム・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ州)で埋め、ブラ
ント末端を作り、pCR−ブラントベクター(インビトロゲン・コーポレーショ
ン、カールスバッド。カリフォルニア州)にクローン化した。これにより2個の
クローン、pRAE−1およびpRAE−2を得た(図4Aを参照のこと)。(
ブダペスト条約の条件下、1998年8月28日、プラスミドDNA pRAE
−2をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、10801ボウルバー
ド大学、マナサス、バージニア州20110−2209に寄託し、寄託番号:A
TCC 203166が付与された。)これらのベクターからのエロンガーゼc
DNAをEcoRIフレグメントとして切断し、EcoRI消化pYX242(
ノバゲン、マジソン、カリフォルニア州)ベクターにクローン化した。pRAE
−5およびpRAE−6クローン(図4Bを参照のこと)は各々pRAE−1お
よびpRAE−2に由来するエロンガーゼcDNAを有する。(ブダペスト条約
の条件下、1998年8月28日、プラスミドDNA pRAE−5をアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション、10801ボウルバード大学、マナサ
ス、バージニア州20110−2209に寄託し、寄託番号:ATCC 203
167が付与された。)pRAE−5およびpRAE−6のシークエンシングに
よりpRAE−5のエロンガーゼ遺伝子の5’未翻訳領域は16塩基対であり、
pRAE−6のエロンガーゼ遺伝子よりも短い(図5を参照のこと)。完全なM
.アルピナエロンガーゼcDNA配列はMAELOと称し、pRAE−2より得
られた(図6を参照のこと)。図7はMAELOの翻訳により得られたアミノ酸
である。前記したように翻訳MAELOでスイスポートデータベースを再度検索
した:MAELOはビール酵母菌GNS1(ELO2)と317個のアミノ酸に
おいて44.3%の同一性を有し、ビール酵母菌SUR4(ELO3)と318
個のアミノ酸において44.7%の同一性を有する。3個のエロンガーゼ間のフ
ァストA整列化を図8に示す。ヌクレオチドレベルでは(図9を参照のこと)、
MAELOビール酵母菌GNS1(ELO2)と549塩基対の重複において5
7.4%の同一性を有する。しかしながら、954塩基対の完全MAELO遺伝
子およびビール酵母菌GNS1(ELO2)間の同一性は33.0%である。
Hovelandら、Gene、83:57−64(1989))、エロンガー
ゼ活性についてスクリーニングした。pYES2ベクター(インビトロゲン・コ
ーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州)のホホバKCS遺伝子を
含有するプラスミドpCGN7875(カルジーン、エルエルシー、デービス、
カリフォルニア州)を陽性対照として用いた。M.アルピナエロンガーゼ(MA
ELO)におけるエロンガーゼ活性を検出するために用いた基質はGLAであり
、ホホバKCSの基質はオレイン酸(OA)であった。陰性対照株はpYX24
2ベクターを含有するビール酵母菌334であった。選択培地(Ausubel
ら、Short Protocols in Molecular Biolo
gy、13章:3−5(1992))中、特定の基質を存在させて培養物を25
℃で40ないし48時間成長させた。pYES2にクローン化したホホバKCS
遺伝子の発現はGAL1プロモーターの調節下にあり、一方pYX242のプロ
モーターはTP1であり、これは構成要素である。従って、334(pCGN7
875)および334(pYES2)培養物はガラクトースにより誘導される。
各細胞ペレットの脂質分画のGC−FAME分析は前記するように実施した(K
nutzonら、前記で引用)。
る。ホホバKCSはモノ不飽和脂肪酸18:1n−9長鎖を20:1n−9に伸
長する。M.アルピナエロンガーゼ(MAELO)並びにビール酵母菌ELO2
およびELO3間のアミノ酸相同性により、これらの遺伝子によりコードされた
タンパク質は類似の基質特異性を有することが示唆された。M.アルピナエロン
ガーゼの活性、モノ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸長鎖の伸長(MAELO)は
18:1n−9の20:1n−9への変換、また24:0の合成においても認め
られる。調節株、334(pYX242)では20:1および24:0の量は非
常に少ししか、または全く検出されなかった(図10Aを参照のこと)。M.ア
ルピナエロンガーゼ(MAELO)はまた少なくとも一つのPUFAに作用し、
18:3n−6(GLA)を20:3n−6(DGLA)に変換する。全脂質に
おける20:3n−6のパーセンテージは、対照334(pYX242)と比較
した場合、M.アルピナエロンガーゼ(MAELO)cDNAを有する334(
pRAE−5)および334(pRAE−6)において高い。製造した20:3
n−6のパーセンテージは334(pYX242)で0.092%であり、対し
て334(pRAE−5)では0.324%であり、334(pRAE−6)で
0.269%であった(図10Aおよび10Bの括弧に示す)。脂肪酸プロフィ
ールにおけるこの差異はまた生成した20:3n−6の全量にも認められる。3
34(pYX242)により20:3n−6が0.226μgしか生成されなか
ったが、一方334(pRAE−5)および334(pRAE−6)では各々2
0:3n−6が2.504μg、および20:3n−6が1.006μg生成さ
れた。また、基質を加えない場合、20:3n−6のレベルは検出されなかった
。
と、Δ5−デサチュラーゼは望ましい発現系においてそれをAAに変換できる。
この仮説を試験するために、pRAE−5およびpRAE−4構築物(プラスミ
ドを含有するΔ5−デサチュラーゼ)をビール酵母菌334に同時形質転換し、
AA生成に関してスクリーニングした。使用した基質はGLA(18:3n−6
) 25μMであった。M.アルピナエロンガーゼ(MAELO)が酵母におい
て活性である場合、次いで基質をDGLA(20:3n−6)に変換し、これを
Δ5−デサチュラーゼがAA(20:4n−6)に変換する。図11に示す結果
よりAAの生成、すなわちM.アルピナエロンガーゼ(MAELO)の活性が確
認される。
ーゼの発現により脂肪酸の外来性の供給を必要とせずにAAを生成(図1を参照
のこと)するはずである。
ル酵母菌エロンガーゼELO2の発現の比較 制限部位(下線部)BamHIおよびHindIII(各々)を組み込んだプ
ライマーRO514(5’−GGC TAT GGA TCC ATG AAT
TCA CTC GTT ACT CAA TAT G−3’)およびRO5
15(5’−CCT GCC AAG CTT TTA CCT TTT TC
T TCT GTG TTG AG−3)を用いて、酵母エロンガーゼをコード
化するELO2遺伝子をビール酵母菌ゲノムライブラリー(オリジーン、ロック
ビル、メリーランド州)からクローン化した。ELO2遺伝子をBamHIおよ
びHindIII部位でベクターpYX242にクローン化し、これをpREL
Oと称し、ビール酵母菌宿主334に形質転換し(Hovelandら、前記で
引用)、PUFAエロンガーゼ活性に関してスクリーニングした。陰性対照とし
てベクタープラスミドを用い、PUFAエロンガーゼ活性を比較するために33
4(pRAE−5)を成長させた。培地中ガラクトースを含まず、基質として2
5μM GLAを添加して、前記するように培養物を成長させた。図12は33
4(pRAE−5)により生成された20:3n−6またはDGLA(18:3
n−6またはGLAから伸長)の量を示すが、これは変化していないベクターp
YX242を含む陰性対照の約4倍になり、一方2個の別個のクローン334(
pRELO−1)および334(pRELO−2)は陰性対照の2倍にしかなら
なかった。加えて、生成したDGLAを全脂質のパーセントとして表現した場合
(図12の括弧に示す)、クローン334(pRELO−1)および334(p
RELO−2)は各々DGLA0.153%および0.2%を生成し、一方33
4(pYX242)はDGLA0.185%を生成した。このようにこれらの株
は全て類似のパーゼンテージのDGLAを生成した。しかしながら、株334(
pRAE−5)はDGLA0.279%を生成し、334(pYX242)(陰
性対照)より50.8%増加している。これらのデータは、ビール酵母菌エロン
ガーゼ遺伝子ELO2が酵母において過剰発現する場合においてさえ、GLAを
DGLAに効果的に伸長しないことを示している。対照、334(pYX242
)に比較して高量のDGLAが生成されることから明白であるように、M.アル
ピナPUFAエロンガーゼ活性はこの変換に関して特異的である。
を用いてクエリーペプチド配列および6個の読み枠の各々に翻訳されたデータベ
ースDNA配列間の類似性を検索した。GCGのGenEMBLデータベース(
6/98)でGCGのTファストA検索に翻訳されたMAELOをクエリーとし
て用い、翻訳MAELOに対するアミノ酸類似性の比較に基づいて別の潜在性エ
ロンガーゼ配列を同定した。例えば図13および14において、2個の整列化は
染色体IIIおよびMAELOに由来する2個の異なるシー・エレガンス(C.
elegans)配列の翻訳の間に示されている。シー・エレガンスDNA配列
(ジェンバンク受入番号:Z68749)はGNS1(ELO2)との類似性を
意味すると注釈されており、一方さらにシー・エレガンスDNA配列(ジェンバ
ンク受入番号:U61954)はGNS1およびSUR4(ELO3)の両方に
類似することが示されている。これらはスプライシングされたDNSフラグメン
トであり、ここではイントロンはゲノム配列から除去されており、エクソンが集
められ翻訳されている。シー・エレガンスの推定PUFAエロンガーゼおよび翻
訳MAELO間の同一アミノ酸の量は約30%である。これは脂肪酸代謝におい
て共通する機能、例えばPUFAエロンガーゼを示している。図15は染色体I
IIに由来する翻訳シー・エレガンス配列(ジェンバンク受入番号:AF003
134)の別の実例である。DNA配列がビール酵母菌ELO2に対してDNA
相同性を有することが同定された。このDNA配列およびそのアミノ酸翻訳をさ
らに検査し、翻訳MAELOと相同性があることが決定された。従って、シー・
エレガンスはPUFAエロンガーゼを含有し得る。
A配列の整列化を示す。マウス配列CIG30(ジェンバンク受入番号:U97
107)を褐色脂肪組織から単離し、「酵母SUR4タンパク質に類似する」と
報告されている。図16に示すように、U97107の翻訳のアミノ酸番号13
0ないし152は翻訳MAELOに対し高度の類似性を有する。染色体4に由来
するヒト配列(ジェンバンク受入番号:AC004050)はHTGS(ハイ・
スループット・ゲノム・シークエンス)による。この配列に注釈はない。しかし
ながら、翻訳AC004050は翻訳MAELOと150個のアミノ酸において
28.7%の相同性を有した。この遺伝子フラグメントは、翻訳MAELOに対
するアミノ酸類似性に基づくと、ヒトPUFAエロンガーゼのフラグメントであ
り得る。
465、PCT番号WO88/07577)のアミノ酸整列化を示しており、こ
れはこの配列の発現物に由来するタンパク質がポリコスリル化阻害因子であるこ
とを主張している。二つのタンパク質間のアミノ酸同一性は関連する機能、例え
ばPUFAエロンガーゼ活性があり得ることを意味している。
らの実例は前記の実施例のいずれかが潜在的にPUFAエロンガーゼになり得る
ことを説明している。これらの実施例は可能なエロンガーゼ全てを包含するもの
ではない。しかしながら、MAELOまたはそのアミノ酸翻訳をデータベース検
索のクエリーとして使用してPUFAエロンガーゼ活性を有する別の遺伝子を同
定することができる。
ースクリーニング M.アルピナに由来するさらなるPUFAエロンガーゼ遺伝子を単離するため
に、慣用的なプラークハイブリダイゼーション法を用いてラムダベクターに作成
したM.アルピナcDNAライブラリーをスクリーニングした。MAELOヌク
レオチド配列に基づいてDNAプローブを作り、これを用いてλジプロックスベ
クター(Knutzonら、J.Biol.Chem.273:29360−2
9366(1998))に作成したM7+8M.アルピナcDNAライブラリー
をスクリーニングした。
ELO cDNAをNspIおよびPvuI制限エンドヌクレアーゼで消化した
。平均約300塩基対の大きさの小型DNAフラグメント3個を作り、プローブ
として使用した。フラグメント化したMAELO cDNAの混合物を用いる原
理はM.アルピナに存在する種々PUFAエロンガーゼに保存されているアミノ
酸配列の共通の領域またはドメインがあるであろうという仮定に基づいている。
標準的なプロトコル(Sambrookら、Molecular Clonin
g、第2版、コールド・スプリング・ハーバー(1989))に準じ、プラーク
ハイブリダイゼーション技術により、MAELO DNAプローブを用いてcD
NAライブラリーをスクリーニングした。
膜を変性し、20% ホルムアミド、0.2% PVP、BSA、フィコール、
0.1% SDSおよび0.5M NaClを含有するハイブリダイゼーション
バッファー中、アルファ32P−dCTP標識MAELO DNAプローブで一
晩ハイブリダイズした。37℃で0.5X SSCを用いてフィルターを洗浄し
、オートラジオグラフィー用にX線フィルムに曝露した。この手順を3回繰り返
した。繰り返しハイブリダイズした4個のクローン(F1、F2、F3およびF
4と称する)を取り、7% DMSOを含有するSMバッファー(Sambro
okら、前記で引用)に懸濁した。
YX242(ノバゲン・インコーポレーティッド、マジソン、ウィスコンシン州
)にサブクローン化した。cDNAクローンF1およびF3をEcoRI部位で
pYX242にサブクローン化し、一方F2およびF4をNcoI/HindI
II部位でサブクローン化した。酵母で発現するために、各候補を含有する組換
えpYX242をSC334に形質転換した(Hovelandら、前記で引用
)。エロンガーゼ活性および基質特異性を決定するために、実施例IIIに記載
のGLA基質25μMの存在下、ロイシンを欠く最低培地で各cDNAクローン
を含有するSC334を成長させた。Knutzonら(J.Biol.Che
m.273:29360−29366(1998))に記載されるように脂肪酸
分析を実施した。その結果、GLAのDGLAへの変換においてこれら4個のc
DNAクローンはいずれも有意な活性を呈しないことが示された。このように、
さらなるPUFAエロンガーゼの同定には、ハイブリダイゼーション法は成功し
ないようである。
でM.アルピナcDNAライブラリーをスクリーニングした。とりわけ、パン酵
母がデサチュラーゼおよびエロンガーゼの各々を欠如しているために長鎖PUF
Aを生成することができないので、ビール酵母菌にM.アルピナの発現cDNA
ライブラリーを構築する試みを行った。ビール酵母菌におけるcDNAライブラ
リーを発現するために、GAL1プロモーターを含有するベクターpYES2(
ノバゲン・インコーポレーティッド、マジソン、ウィスコンシン州)を選択した
。
DNA/ベクターの宿主細胞への形質転換)は酵母においては困難である。なぜ
ならばライゲートしたDNA混合物の直接的エレクトロポレーションによる形質
転換効率は精製スーパーコイル化プラズミドDNAの効率に比較して非常に低い
。しかしながらこの方法の主に優れた点は中間体として大腸菌(E.coli)
にライブラリーを作成した場合に起こる1次クローンの増幅を避けられることで
ある。スクリーニングされるコロニー数が制限されるために、cDNA/ベクタ
ーライゲーション混合物を用いて異なるビール酵母菌株において形質転換する効
率を最初に最適化することが決まっている。得られた最もよい結果ではビール酵
母菌株SC334におけるライゲートしたDNAのμgあたり4ないし5x10 5 の形質転換体を生じた(Hovelandら、前記で引用)。
NAを真菌類から単離した。M.アルピナ真菌類(ATCC番号:32221)
をコーンミール寒天(ディフコ・ラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン州)上
にプレートし、室温で3ないし4日間成長させた。一度菌類の成長が可視化され
ると、これをジャガイモデキストローズブロス50mlに接種し、室温で非常に
ゆっくりと振盪して胞子を形成させる。一度胞子が可視化されると、培養物50
mlをジャガイモデキストロースの培養物1lに接種し、胞子を72時間成長さ
せた。滅菌ガーゼを通してろ過した後、さらにRNA抽出するためにすぐに細胞
を液体窒素で凍結した。熱フェノール/LiCl抽出法(Sambrookら、
前記で引用)を用いて細胞ペレット36gから全RNAを調製した。10mM
EDTA、1% SDSおよび200mM 酢酸ナトリウムの溶液(pH4.8
)中で細胞ペレットをホモジナイズした。ホモジネートにフェノールおよびクロ
ロホルムを加え、水層を抽出した。再度フェノールおよびクロロホルムで水層を
戻し抽出した。次いで4M 塩化リチウム等量を加えた。氷上で3時間サンプル
をエタノール沈殿させ、遠心によりペレットを得た。RNAペレットを70%エ
タノールで洗浄し、DEPC処理した水に再懸濁した。分光測光法により全RN
Aを定量し、アガロースゲル電気泳動により可視化し、28Sおよび18Sリボ
ソームのバンドの存在を確認した。細胞ペレット36gから全RNA約15mg
を得た。
ng、第2版、コールド・スプリング・ハーバー(1989))に準じてライブ
ラリーを構築した。オリゴdTセルロース・アフィニティー精製を用いて全RN
AからメッセンジャーRNAを調製した。AMV逆転写酵素を用いてXhoI制
限部位を含有するオリゴdTプライマーでメッセンジャーRNAを逆転写した。
cDNAの第1の鎖を合成した後、大腸菌DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAリ
ガーゼおよびRNアーゼ Hを添加してcDNAの第2の鎖を合成した。
Aにライゲートした。T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてcDNAサンプル
をキナーゼ処理し、XhoIで消化し、カラムバッファーで希釈し、セファクリ
ルS−400カラムに通した。高塩濃度バッファーによりDNAサンプルを希釈
した。400ないし5000塩基対のDNAを含有するサンプルをプールし、こ
れをpYES2ベクター(インビトロゲン・コーポレーション、カールスバッド
、カリフォルニア州)へのライゲーションに用いた。T4 DNAリガーゼを用
いてEcoRI/XhoI消化pYES2ベクターにcDNAをライゲートした
。酵母の直接的形質転換には多量のライゲート化DNA(2ないし3μg)が必
要であるので、大容量のライゲーション反応を実施した。
に、LiAc TRAFO法を用いてコンピーテントSC334細胞を調製した
(Gietzら、Mol.Cell.Biol.5:255−269(1995
))。簡単には、プレートからのSC334の新鮮培養物をYPD培地50ml
に接種した。30℃で振盪しながら600でのODが1.0に達するまで培養物
を成長させた。この出発物質30mlをYPD液体培地300mlに接種し、培
養物の細胞数が〜3ないし5x106セル/mlに達するまで(約3ないし4時
間)振盪しながらインキュベートした。細胞を収穫し、滅菌水で洗浄した。全細
胞ペレットを新しく調製した1X TE/LイAc(0.1M LiAc)1.
5mlに再懸濁した。すぐにこれらの細胞を形質転換に用いた。
分した。cDNA/pYES2ライゲートしたDNAの約2μgを担体DNAと
共に細胞に加え、穏やかに混合した。滅菌した40%PEG/LiAc3mlを
細胞に加え、穏やかにしかし完全に混合した。振盪しながら30℃で30分間細
胞をインキュベートし、続いて42℃で15分間熱ショックを与えた。細胞を冷
却し、ペレット化し、1X TE5mlに再懸濁した。前記の細胞の100μl
アリコートをウラシル不含の150mm選択寒天プレート50個にプレートし(
Ausubel、前記で引用)、30℃で3日間インキュベートした。全部で8
x105個の1次クローンを得た。5個のコロニーをウラシル不含の最低培地1
mlにプールし(Ausubelら、前記で引用)、貯蔵用にグリセロールを添
加した。全部で5000個のプールをスクリーニング用に作った。
リーの品質を分析した。ライブラリーのスクリーニングがcDNAの発現に基づ
いているので、ライブラリーに存在するcDNAの平均の大きさを決定すること
が重要である。最も長いcDNAを含有する発現ライブラリーを選択するのが、
目的のcDNA全長を単離するために最も適切であろう。この目標のために、実
施例VIIに記載するように、無作為に選択したプールを選択寒天プレートにプ
レートし、個々のコロニーを得た。40個の異なる酵母コロニーを無作為に取り
、各コロニーをウラシル不含の選択液体培地5mlに接種し(実施例VIIに記
載するように)、30℃で24時間、振盪しながら成長させた。ビーズ・ビーテ
ィング法(Hoffmanら、Gene、57:267(1987))を以下の
ように適応させてこれらのコロニーからプラスミドDNAを抽出した: 100mM NaCl、10mMトリス、pH8.0、1mM EDTAおよ
び0.1% SDS溶液0.5ml中培養物5mlからのペレットを溶解した。
等量の滅菌0.5mmガラスビーズを加え、3分間手動で攪拌した。同じバッフ
ァー200μlを加え、混合物をさらに1分間攪拌した。サンプルを高回転で2
分間遠心し、次いで新しいチューブに細胞抽出物を移した。等容量のフェノール
/CHCl3をサンプルに加え、攪拌し、再度2分間遠心した。水層を2回再抽
出し、0.3M酢酸ナトリウムおよび約2.5容量のエタノールを用いて−20
℃で30分間沈殿させた。70%エタノールで沈殿物を洗浄し、水に再懸濁した
。RNAおよびいかなるタンパク質夾雑物をも排除するために、製造者プロトコ
ルに準じてQIAプレップ・スピン・ミニプレット・キットを用いて(キアゲン
・インコーポレーティッド、バレンシア、カリフォルニア州)、40個の異なる
サンプルから単離したプラスミドDNAをさらに精製した。次いでEcoRIお
よびXhoI制限エンドヌクレアーゼでプラスミドDNAサンプルを制限してc
DNAフラグメントを放出し、1%アガロースゲル上で消化物を分析した。その
結果、直接ライブラリーのcDNAの大部分が0.8キロ塩基対から1.5キロ
塩基対の長さで変動することが示された。
0.5mlをウラシル不含(Ausubelら、前記で引用)の液体選択培地5
mlに加え、30℃で24時間成長させた。次いで培養物を2%ガラクトースお
よび25μlGLA(エロンガーゼ酵素の基質)を含むウラシル不含液体選択培
地50mlに移して25℃で24時間攪拌した。各々の誘導培養物の細胞ペレッ
ト中の脂質含量のGC−FAME分析を前記のように実施した(Knutzon
ら、前記で引用)。MAELO(ウラシル不含選択培地中で成長したpYX24
2のpRAE−5)を各バッチのランにおける陽性対照として用いた。MAEL
Oはは一貫してGLAの1.5%をDGLAに変換できる(実施例IIIを参照
のこと)。
分析した後、実施例VIIIに記載するように、5個のコロニーからなる1個の
プール(すなわちMAD708)がGLAのDGLAへの変換における有意な酵
素活性を有すると考えられた。DGLA/GLA比率に関してこの活性はM.ア
ルピナエロンガーゼ活性(MAELO)よりも約5倍の高いことが認められた(
図19)。同じアッセイ条件下でプールを再度試験し、最初の知見を確認した。
反復試験によりGLAがDGLAに9.5%変換され、M.エアルピナエロンガ
ーゼ活性(MAELO)より約5倍高かった。これらの結果よりMAD708プ
ールが、基質であるGLAに特異的なエロンガーゼ候補を含有することが強く示
された。MAD708が異なる5個のクローンからなる1個のプールであるので
、このプールからエロンガーゼ活性をコードする個々のcDNAクローンを単離
する必要があった。そのために元来のMAD708グリセロール貯蔵物をウラシ
ル不含の選択培地寒天プレートにプレートした(Ausubelら、前記で引用
)。30個の個々のコロニーを取り、実施例VIIIに前記するように、GLA
の存在下ウラシル不含で2%ガラクトースを含む液体選択培地で成長させた。次
いで各培養物から得られた細胞ペレットを陽性対照が334(pRAE−5)(
pYX242のMAELO)の脂肪GC−FAME分析(Knutzonら、前
記で引用)に供した。酵母のMAD708発現プールからの30個の個々のクロ
ーンの脂肪酸分析により、30個のクローンのうち5個がGLAのDGLAへの
変換においてエロンガーゼ活性を示すことが明らかにされた。活性クローンMA
D708−2、MAD708−10、MAD708−18、MAD708−19
およびMAD708−30の脂肪酸プロフィールを図20に示す。この図に示さ
れるように、MAD708−2、10および30が最もDGLAを生成し、MA
ELO(pRAE−5)の約25倍以上である。これらの3個は41%ないし4
9%の範囲でGLAをDGLAに変換する。その他のクローン、MAD708−
18およびMAD708−19は8%および21%GLAをDGLAに変換する
。全てのMAD708クローンはエロンガーゼをコードするMAELOに関して
高いパーセンテージてGLAをDGLAに変換する(3.4%)。
特異性エロンガーゼ活性を呈するSC334酵母クローン(MAD708プール
)からプラスミドDNAを抽出した。cDNA挿入物の大きさを決定するために
、陽性エロンガーゼクローンから得た各プラスミドDNAを鋳型として用いてP
CRを実施した。順行プライマーRO541(5’−GAC TAC TAG
CAG CTG TAA TAC−3’)および逆行プライマーRO540(5
’−GTG AAT GTA AGC GTG ACA TAA −3’)はp
YES2ベクターのマルチクローニング部位にあり、EcoRIおよびXhoI
部位内のcDNA挿入物を増幅するのに使用した。プラスミドDNA 4マイク
ロl、各プライマー50ピコモル、10Xバッファー5μl、10μM PCR
ヌクレオチドミックス(ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インデ
ィアナポリス、インディアナ州)1μlおよびハイ・ファイブ・Taqポリメラ
ーゼ(ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、イ
ンディアナ州)0.5μl含有する50μl容量中PCRを実施した。増幅は以
下のように実施した:94℃で2分間変性、次いで94℃で1分間、55℃で2
分間、および72℃で3分間、30サイクル、増幅の最後に72℃で7分間延長
。PCR増幅生成物を1%アガロースゲル上で分析し、エロンガーゼcDNAの
大きさが約1.0ないし1.2キロ塩基対であることが示された。潜在エロンガ
ーゼcDNAを含有するプラスミドDNAをpRPB2、pRPB10、pRP
B18、pRPB19およびpRPB30と称する。pYES2ベクターのEo
RIおよびXhoI部位でcDNAライブラリーを作成したので、前記プラスミ
ドをEcoRIおよびXhoIで消化することにより各プラスミドに存在するc
DNAの大きさをさらに確認した。
離したプラスミドDNAを大腸菌で再増幅した。製造者プロトコルに従って、大
腸菌TOP10(インビトロゲン・コーポレーション、カールスバッド、カリフ
ォルニア州)細胞をpRPB組換えプラスミドで形質転換した。各プラスミドD
NAから得た形質転換体をアンピシリン(50μg/ml)含有LBに接種し、
振盪しながら37℃で一晩成長させた。製造者プロトコルに従ってQIAプレッ
プ・スピン・ミニプレップ(キアゲン・インコーポレーティッド、バレンシア、
カリフォルニア州)を用いてこれらの培養物からプラスミドDNAを単離した。
次いで精製プラスミドDNAを用いて5’および3’の両末端よりシークエンシ
ングした。製造者プロトコルに従って373AストレッチABI自動DNAシー
クエンサー(パーキン・エルマー、フォスター・シティー、カリフォルニア州)
を用いてDNAシークエンシングを実施した。シークエンシングに用いたプライ
マーはpYES2ベクターのマルチクローニング部位に含まれる順行プライマー
RO541(5’−GAT TAC TAG CAG CTG TAA TAC
−3’)および逆行プライマーRO540(5’−GTG AAT GTA A
GC GTG ACA TAA −3’)である。得られたヌクレオチド配列を
分析するためにシークエンサー・ソフトウェア・プログラム(ジーン・コード・
コーポレーション、アン・アルボア、ミシガン州)に移した。DNA配列分析に
より5個のエロンガーゼcDNA全てが301ヌクレオチドの共通重複と同等の
ヌクレオチドを含有することが示された。各DNA配列は5’末端の初めに推定
出発部位を、3’末端でポリAテールを有する停止コドンを含有する。DNA配
列をさらに確認するために内部の順行プライマーRO728(5’−GAG A
CT TTG AGC GGT TCG−3’)およびRO730(5’−TC
T CTG CTG CGT TGA ACT CG−3’)を逆行プライマー
RO729(5’−AAA GCT CTT GAC CTC GAA C−3
’)およびRO731(5’−AAC TTG ATG AAC GAC AC
G TG−3’)と共にcDNA内に設計し、pRPB2のシークエンシングに
用いた。なぜならばこの候補は最も高いエロンガーゼ活性を有するからである。
シークエンサープログラムにより全ヌクレオチド配列を分析し、pRPB2の全
cDNA配列から推測される最も長いオープン・リーディング・フレームは95
7塩基対の長さであると考えられた(図22)。次いで推測されるオープン・リ
ディング・フレームを対応するアミノ酸配列に翻訳し、予測される配列を図23
に示す。M.アルピナから同定されたcDNAによりコードされたエロンガーゼ
は318アミノ酸長のタンパク質であると考えられ、これは翻訳MAELOの大
きさとほとんど同等である。この新規エロンガーゼを「GLELO」と称し、そ
のコード化タンパク質を「GLAエロンガーゼ」と命名した。
B2をアメリカン・カルチャー・コレクション、10801 ボウルバード大学
、マナサス、バージニア州20110−2209に寄託した。これにはATCC
寄託番号:PTA−402が付与された。
さらに確認するために、pRPB2プラスミドを含有する酵母クローンSC33
4でエロンガーゼ活性スクリーニングを繰り返した。またこの実験を行うことに
より一貫した脂質抽出を確実にし、4つの別個の実験を平均化することによりG
LAエロンガーゼ活性を検出できた。pRPBを含有するビール酵母菌334グ
リセロール貯蔵物をウアシル不含の最低培地寒天プレートにプレートした。個々
のコロニーを無作為に取り、実施例VIIIに記載するように、ウラシル不含の
最低培地で成長させた。4個の別個の培養物を組み合わせ、5mlアリコートを
用いて4個の別個の培養物50mlに接種した。次いでGLAの存在下培養物を
成長させ、実施例VIIIに記載するように、pYES2を含有するビール酵母
菌334の陰性対照と共に脂肪酸分析に供した。25μM GLAを含む334
(pRPB2)の4個の別個の培養物の平均エロンガーゼ活性を図24に示す。
334(pRPB2)の4個の別個のサンプルの各々のGLAエロンガーゼ活性
は62%のGLAのDGLAへの平均変換に一致すると考えられた。
培養物をGLAに加えて別の脂肪酸基質(例えばSA(18:0)、OA(18
:1)、LA(18:2n−6)、AA(20:4n−6)、ADA(22:4
n−6)、ALA(18:3n−3)、STA(18:4n−3)、およびEP
A(20:5n−3))で試験した。同等のアッセイ条件下でエロンガーゼ酵素
により利用される唯一の別の基質はn−3経路の脂肪酸、STAであった。GL
Aエロンガーゼは73%のSTAを20:4n−3に変換できた(図25)。こ
れらの実験より、GLAエロンガーゼがGLAとSTAの両方に基質特異性を有
すると結論づけられ、これはこれがn−6およびn−3経路の両方でエロンガー
ゼ活性を有していることを示している。
発現 望ましい同時発現系において一度GLAエロンガーゼによりDGLA(20:
3n−6)を生成すると、Δ5−デサチュラーゼがそれをAA(20:4n−6
)に変換できる。図1で表されるように、この反応図式はEcoRI部位でクロ
ーン化されたプラスミドpRPB2およびpRPB31(Δ5−デサチュラーゼ
cDNAを含有する組換えプラスミドpYX242)(図18)を用いてビール
酵母菌334を同時形質転換することにより試験できる。同時形質転換した酵母
培養物に25μM GLAを補充し、AA合成に関して分析した。エロンガーゼ
およびΔ5−デサチュラーゼ酵素の両方を発現する場合、GLA基質はDGLA
に変換され、これは次いでAAに変換される。26Aの結果はGLAエロンガー
ゼおよびΔ5−デサチュラーゼのGLA基質に及ぼす一連の作用の結果、平均2
7%のGLAをAAに変換する。従って、GLAエロンガーゼはn−6PUFA
合成経路において別の酵素と働いて望ましい脂肪酸を生成することができる。
STAの存在下同様の同時発現実験を実施した。再度両酵素を発現する場合、
STA基質は20:4n−3に変換され、これがΔ5−デサチュラーゼによりE
PA(20:5n−3)に変換される。図26BではEPAの生成(約40%)
が観察されたことを示している。再度、GLAエロンガーゼがn−3経路におい
てΔ5−デサチュラーゼと共に働いて望ましい脂肪酸を生成できることが示され
た。
列を既知タンパク質配列と比較した。GLELOオープン・リーディング・フレ
ームのヌクレオチド配列が最初に翻訳され、これをクエリー配列として用いてフ
ァストAアルゴリズム(実施例Iを参照のこと)を用いるスイスポートデータベ
ース(実施例Iを参照のこと)を検索した。アミノ酸配列類似性に基づき、ビー
ル酵母菌YJT6(未知の注釈を付したEST)と189個のアミノ酸重複にお
いて33.9%の同一性、ビール酵母菌ELO2(GNS1)と295個のアミ
ノ酸重複において25.8%の同一性、およびビール酵母菌ELO3(SUR4
)と313個のアミノ酸重複において25.2%の同一性で最も適合することが
見出された。GLELOのMAELOとのファストA整列化により275個のア
ミノ酸において30.9%の同一性が示された(図27)。発展的なペア化した
整列化を用い(実施例Iを参照のこと)、前記のエロンガーゼと共に用いてGC
Gパイルアッププログラムにより、関連する配列群から多数の配列整列化を作っ
た。パイルアップの結果により、エロンガーゼには推定ヒスチジンボックスを含
む多くの保存領域があり、これには下線を付してある(Knutzonら、J.
Biol.Chem.273:29360−29366(1998))(図28
)。このように、GLELOはMAELOと類似性を有するが、基質優先性は恐
らくコード化されたエロンガーゼにおける差異によるものであろう。GLAエロ
ンガーゼはM.アルピナよりも高いパーセンテージでGLAをDGLAに変換で
きる。加えてビール酵母菌におけるMAELOの発現はGLAのDGLAへの伸
長に加え、飽和およびモノ不飽和脂肪酸の伸長を呈する(実施例IIIを参照の
こと)。
ーク・ロード、アボット・パーク、イリノイ州60064のユニファイド・ヒュ
ーマン・トランスクリプト・データベースを検索した。ベーシック・ローカル・
整列化・サーチ・ツール(BLAST)(Altschulら、Nuc.Aci
ds.Res.25:3389−3402(1997))を用いてデータベース
を検索した。このツールは「クエリーがタンパク質であるかDNAであるかにか
かわらず、全ての可能な配列データベースのずべてを探るために設計された一連
の類似性検索プログラムである」。具体的には、ツブラストン(tblastn
)アルゴリズムを用いた(すなわち6個の読み枠で翻訳されたヌクレオチドデー
タベースに対するタンパク質クエリー検索)。ユニファイド・ヒューマン・トラ
ンスクリプト・データベースにおけるコンティグ(CC)配列は共通のドメイン
および発現配列タグ(EST)のIncyte LIFESEQ(登録商標)デ
ータベース(インサイト・ファーマシューティカルズ・インコーポレーティッド
、3174ポーター・ドライブ、パロ・アルト、カリフォルニア州94304)
(規定した配列相同性に基づいてクラスター化し、重複配列に基づいてアセンブ
ルする)に由来する発現配列タグ(EST)cDNAの群を代表するコンセンサ
ス配列である。このデータベースからの2個の配列、CC067284R1およ
びCC1484548T1は各々翻訳MAELO配列を有し、242個のアミノ
酸重複において28%の同一性、266個のアミノ酸重複において28.6%の
同一性を有した。2個の誘導および編集した配列を各々hs1およびhs2と称
し、GCGの配列分析ソフトウェアパッケージにコピーした(実施例Iを参照の
こと)。ファストAアルゴリズムを用いて翻訳MAELO配列を翻訳HS1(2
42個のアミノ酸において28.5%の同一性)および翻訳HS2(266個の
アミノ酸において28.2%の同一性)cDNA配列と整列化し、各々図29お
よび30に示した。HS1 cDNAヌクレオチド配列はまた844塩基対にお
いてI05465ヌクレオチド配列と86.9%の同一性を有した(実施例Vを
参照のこと)。翻訳HS2 cDNA配列は受入番号:W74824のジェンバ
ンクからのアミノ酸配列と100%の同一性を有した(公開PCT出願WO98
39448を参照のこと)。
NCBI、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を用
いてAC004050(TファストA検索で同定されたヒト配列、実施例Vを参
照のこと)から翻訳された28個のアミノ酸配列(DTIFIILRKQKLI
FLHWYHHITVLLYSW)を有するツブラストンを用いるデータベース
検索を行った。このアミノ酸配列はヒスチジンボックス(下線部)を含み、これ
はデサチュラーゼ(Knutzonら、前記で引用)並びにMAELOおよびG
LELOの両方のPUFAエロンガーゼの注目すべきモチーフを有する(図28
を参照のこと)。実施例Vにおいて前記した翻訳マウス配列(ジェンバンク受入
番号:U97107)および翻訳シー・エレガンス配列(ジェンバンク受入番号
:U41011)はこの28個のアミノ酸クエリーと高度に適合する。翻訳U4
1011をクエリーとして用いてNCBIマウスESTデータベースを再度ツブ
ラストンで検索した。さらなるマウス配列を同定し(ジェンバンク受入番号:A
F014033.1)、「脂肪酸伸長における関与が推定される」と注釈した。
マウスESTデータベースを翻訳AF014033.1でツブラストン検索する
ことによりこれらの長い配列(ジェンバンク受入番号:AA591034、AA
189549、およびAA839346)を同定し、mm2と称する1個の配列
と組み合わせた。翻訳mm2およびMAELOのファストA整列化(実施例Iを
参照のこと)を図31に示す。関連するが同一ではない別のマウス配列(ジェン
バンク受入番号:AI225632)をもAF014033.1でマウスEST
データベースのツブラストン検索において同定した。MAELOに対する翻訳A
I225632のファストA整列化を図32に示す。翻訳MM2およびAI22
5632の両方の翻訳MAELOとの同一性パーセントは各々191個および1
15個のアミノ酸重複において30.4%である。これらの2個の翻訳マウス配
列と翻訳MAELOとのアミノ酸同一性のレベルより、これらがPUFAエロン
ガーゼの推定相同体であることが確認される。
々において翻訳されているデータベースDNA配列と比較するTファストAアル
ゴリズムを使用した。GCGのジーンEMBLデータベースを用いて、翻訳GL
ELOに対するアミノ酸類似性に基づいて別の潜在するエロンガーゼ配列を同定
した。3個のヒト配列がGLELOアミノ酸配列に適合することが解った。これ
らの配列はジェンバンク受入番号:1)AI815960、2)AL03437
4および3)AC004050を有する。AI815960、ホモ・サピエンE
ST配列は144個のアミノ酸重複において翻訳GLELOと40.3%の同一
性を有する(図33を参照のこと)。ヒトゲノムの翻訳領域、AL034374
は染色体VIに由来し、60個のアミノ酸重複において翻訳GLELOと46.
7%の同一性を有する(図33を参照のこと)。AL034374における相同
領域は翻訳MAELOと相同性を有することが示されているHS1アミノ酸配列
の一部であると考えられる(実施例XIIIを参照のこと)。従って、HS1配
列はMAELO(図29を参照のこと)とGLELO(図34を参照のこと)の
両方と類似性を有する。染色体IVに由来するヒトゲノム配列AC004050
の翻訳領域は89個のアミノ酸重複において翻訳GLELOと34.8%の同一
性を有する(図35を参照のこと)。GLELOとこれらのヒト配列間のアミノ
酸同一性により、これらのヒト配列に由来するタンパク質がPUFAエロンガー
ゼ活性のような機能と関連し得ることが示される。
エリーとして用い、ジーンEMBLでTファストA検索を実施した。Tファスト
A検索により翻訳GLELOに高度に適合する3個のマウス配列を同定した:(
ジェンバンク受入番号:1)AF104033、2)AI595258および3
)U97107)。AF104033には「酵母ELO3(SUR4)に相同で
ある推定脂肪酸エロンガーゼを有するMUELタンパク質」と注釈し、これはM
M2の配列の一部である。MM2配列は最初AF104033マウス配列から誘
導したが、最終的にはさらなるマウスESTデータベース検索により全MM2配
列を得、これもまた翻訳MAELOと相同であることが示された(実施例XII
Iおよび図31を参照のこと)。ファストAを用いてこのMM2アミノ酸配列を
翻訳GLELO配列と整列化した場合、211個のアミノ酸重複において34.
6%の同一性が見出され(図36を参照のこと)、このことはMM2もまたGL
ELOと相同であることを示している。AI595258は酵母ELO3エロン
ガーゼと5’類似性を有するマウスcDNAクローンであり、マウスEST c
DNA AI225632の一部である。AI225632マウス配列はAI5
95258よりも長い配列であり、翻訳MAELOと類似性を有することが示さ
れた(図32を参照のこと)。AI225632をまた翻訳GLELOとも整列
化し、ファストAアルゴリズムを図37に示す。199個のアミノ酸重複におい
て35.3%の同一性が見出された。第3の配列、U97107はマウス配列で
あり、「酵母ELO3(SUR4)遺伝子に類似する」と注釈されている。翻訳
GLELOのU97107との整列化を図38に示すが、ここでは279個のア
ミノ酸重複において23.7%の同一性が見出された。前記するように、ファス
トA整列化に基づいてU97107の領域はまたMAELOと高度な相同性を有
することも見出された(実施例Vおよび図16を参照のこと)。
用いて同一のヒトおよびマウス配列が得られることが明白に示された。
体の同定 A)カエノルハブディティス・エレガンス シー・エレガンスの染色体配列から推測される推定アミノ酸配列(ジェンバン
ク受入番号:U41011)は、GLAエロンガーゼ(GLELO)およびM.
アルピナエロンガーゼ(MAELO)の両方とアミノ酸類似性を有するマウスM
M2推定PUFAエロンガーゼに含まれる部分配列を同定できる。従ってGLE
LOまたはMAELOのシー・エレガンス相同体が線虫データベースに存在する
かもしれないと考えられる。GLELOおよびMAELO配列に由来する推定ア
ミノ酸配列をクエリーとして用いて別個に線虫データベースを検索した。BLA
ST検索(実施例XIIIを参照のこと)をウォームペップ16(ブラストプ(
blastp)はヌクレオチド配列データベースに対してアミノ酸クエリー配列
を比較する)およびウォームペップ16cDNA(ツブラストン)データベース
(これはシー・エレガンスゲノムシクエンシングプロジェクトまたはESTおよ
びその対応するcDNA配列から得られるタンパク質およびcDNAを予測する
)で実施した。これらの配列データはシー・エレガンスシークエンシング群によ
り作られ、サンガー・センターおよびゲノム・シークエンシング・センターによ
り統合され、ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/dat
abases/wormpep/より入手できる。少なくとも7個の推定シー・
エレガンス翻訳ハイブリダイゼーションをGLELOおよびMAELOの両方の
翻訳アミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列により同定した。推定アミノ酸を含
有するこれらのゲノム配列のジェンバンク受入番号はZ19154、U6874
9(2個の推定タンパク質(F56H11.4およびF56H11.3(ウォー
ムペップ受入番号)))、U41011、U61954(2個の推定タンパク質
(F41H10.7およびF41H10.8(ウォームペップ受入番号)))お
よびZ81058であると同定された。これらの下線部分は翻訳MAELOをク
エリーとして用いる前記の検索において同定された(実施例Vを参照のこと)。
実例として、翻訳GLELOおよびMAELOを有する翻訳U68749(F5
6H11.4)のファストAアミノ酸整列化を図39および40に示す。翻訳U
68749(F56H11.4)は約200個のアミノ酸重複においてM.アル
ピナエロンガーゼおよびGLAエロンガーゼの両方と25ないし30%の同一性
を有する(図39、40を参照のこと)。7個の翻訳推定シー・エレガンスcDN
Aの全てに関して、翻訳GLELOに対するファストA整列化により200個の
アミノ酸重複で同一性が25ないし30%であり、一方翻訳MAELOに関して
は同一性は少なくとも188個のアミノ酸重複において26ないし34%であっ
た。整列化の類似性により翻訳GLELOまたはMAELOのいずれかを用いて
エロンガーゼ活性を有するシー・エレガンス由来の潜在遺伝子を同定できる。
ster) NCBI(実施例XIIIを参照のこと)による「その他のEST」データベ
ースのブラストン検索(ヌクレオチドデータベースに対してヌクレオチドクエリ
ー配列を比較する)において、ゲノム配列U41011(シー・エレガンス)の
翻訳推定cDNAはドロソフィラ・メラノガスター(Drosohila me
lanogaster)EST(受入番号:AI134173)と高度に適合し
、重複DNA ESTフラグメント(受入番号:AI517255)と共にアセ
ンブルした。GCGのファストAを用いて2個の重複配列に由来する翻訳DNA
フラグメントDM1を翻訳GLELOおよびMAELO(図41および42を参
照のこと)と整列化した(実施例Iを参照のこと)。整列化により206個のア
ミノ酸重複においてGLAエロンガーゼと27.2%の同一性が示され、237
個のアミノ酸重複においてM.アルピナエロンガーゼと30%の同一性が示され
た。このように、アミノ酸類似性に基づいて、DM1をPUFAエロンガーゼ様
活性を有するGLELOまたはMAELOに対する潜在相同体であり得る。さら
に、データベース検索のためのクエリーとしてGLELOおよびMAELOのD
NA配列を用いて、ドロソフィラからPUFAエロンガーゼ活性を有する相同体
を同定できる。
、多くの潜在PUFAエロンガーゼを同定した。これらの配列の潜在エロンガー
ゼ活性を決定するために、次いで、本実施例で示すように、タンパク質全長をコ
ードするcDNAを同定し、クローン化し、発現した。
CC ATG GAA CAT TTT GAT GCA TC−3’)および
RO720(5’−GGT TTC AAA GCT TTG ACT TCA
ATC CTT CCG−3’)を設計し、これを用いてヒト肝臓マラソン・
レディーcDNA(クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド、
パロ・アルト、カリフォルニア州)を増幅した。ヒト肝臓マラソン・レディーc
DNA 5μl、各プライマー50ピコモル、10mM PCRヌクレオチドミ
ックス(ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、
インディアナ州)1μl、10X バッファー5μlおよびアドバンテージ・ク
レンTaq・ポリメラーゼ・ミックス(クロンテック・ラボラトリーズ・インコ
ーポレーティッド、パロ・アルト、カリフォルニア州)を含有する50μl容量
で、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施した。パーキン・エルマー9600
(ノーウォーク、コネチカット州)の熱循環器条件は以下のとおりであった:9
4℃で2分間、次いで94℃、1分間を30サイクル、58℃で2分間、および
72℃で3分間。続いてさらに72℃で7分間PCRのサイクルを延長した。
製され、T4 DNAポリメラーゼ(ベーリンガー・マンハイム・コーポレーシ
ョン、インディアナポリス、インディアナ州)でフラグメントの末端を埋め、製
造者プロトコルに従ってpCRブラントベクター(インビトロゲン・コーポレー
ション、カールスバッド、カリフォルニア州)にクローン化した。新規プラスミ
ドをpRAE−52と称し、ABI 373AストレッチDNAシークエンサー
(パーキン・エルマー、フォスター・シティー、カリフォルニア州)を用いて、
このクローンにおける推定PUFAエロンガーゼcDNAをシークエンシングし
た。プラスミドpRAE−52のこの推定PUFAエロンガーゼcDNA配列を
図43に示し、翻訳配列を図44に示す。
oI/HindIIIで消化し、ゲル精製し、pYX242(NcoI/Hin
dIII)にライゲートした。新規プラスミドをpRAE−58−A1と称した
。(ブダペスト条約の条件下、1999年8月19日にプラスミド58−A1を
アメリカン・タイプ・オブ・カルチャー・コレクション、10801ボウルバー
ド大学、マナサス、バージニア州20110−2209に寄託し、寄託番号 が付与された。) 構築物pRAE−58−A1をビール酵母菌334(Hovelandら、前
記で引用)に形質転換し、エロンガーゼ活性に関してスクリーニングした。陰性
対照株はpYX242ベクターを含有するビール酵母菌であった。25μM G
LAまたはAA存在下、選択培地(Ausubelら、前記で引用)で培養物を
30℃で24時間成長させた。この研究においてDGLAまたはアドレン酸(A
DA、22:4n−6)は各々ヒトエロンガーゼ活性の生成が予測されている。
基質としてGLAを用いた場合、ヒトエロンガーゼcDNAを含有する酵母細胞
に含まれるDGLAレベルは上昇しており、対照細胞と比較すると各々全脂肪酸
の2.75%対0.09%であった(図45を参照のこと)。基質としてAAを
用いた場合、、ヒトエロンガーゼcDNAを含有する酵母細胞に含まれるADA
レベルは対照細胞と比較して上昇しており、各々全脂肪酸の未検出対1.21%
であった。このように、ヒトエロンガーゼは18および20炭素鎖長のPUFA
を共にその各々の伸長脂肪酸に変換する。
1n−7、20:1n−7、20:1n−9および18:1n−5などのモノ不
飽和脂肪酸のレベルをも上昇させた。従って、これらの結果より同定されたヒト
エロンガーゼはPUFAおよびモノ不飽和脂肪酸を基質として利用できることが
示された。このように、このヒト配列HSELO1、およびそれにコードされる
タンパク質は基質特異性とは独立してエロンガーゼ活性を有する。
ELOの両方に対してアミノ酸相同性が確立されている。ヒトcDNA配列を有
するので、cDNAクローニングおよび酵母における発現により、これが本当に
PUFAエロンガーゼであるかどうかを決定した。制限部位EcoRIおよびS
alI(下線部)を有するプライマーRO738(5’−AAT CAG GA
A TTC ATG GCT CAG CAT CCG CTC GTT CA
A C−3’)およびRO739(5’−CCG CTT GTC GAC T
TA GTT GTT CTT CTT CTT TGG CAC−3’)は各
々、ゲノム配列U68749(ウォームペップcDNA受入番号:F56H11
.4)に含まれる推定cDNA配列に基づいた。切除シー・エレガンスライブラ
リーcDNA(オリジーン・テクノロジーズ・インコーポレーティッド、ロック
ビル、メリーランド州)250ng、各プライマー50ピコモル、10X反応バ
ッファー(ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス
、インディアナ州)10μl、10mM PCRヌクレオチドミックス1μl(
ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、インディ
アナ州)およびTaqポリメラーゼ(ベーリンガー・マンハイム・コーポレーシ
ョン、インディアナポリス、インディアナ州)2.5ユニットを含有する100
μl容量でPCR増幅を行った。パーキン・エルマー9600(ノーウォーク、
コネチカット州)の熱循環器条件は以下のとおりであった:95℃で5分間、次
いで94℃、30秒間を25サイクル、55℃で2分間、および72℃で2分間
。続いてさらに72℃で7分間PCRのサイクルを延長した。
切断し、製造者プロトコルに従ってラピッド・ライゲーション・キット(ベーリ
ンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ州
)を用いてpYX242にライゲートし、大腸菌Top10細胞(インビトロゲ
ン・コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州)に形質転換した。
新規プラスミドをpRET−21およびpRET−22(ライゲーションによる
2個の個々のクローン)と称し、373AストレッチDNAシークエンサーAB
I(パーキン・エルマー、フォスター・シティー、カリフォルニア州)でシーク
エンシングし、cDNA配列を同定した。推定エロンガーゼを含有するプラスミ
ドpRET−22の867個の塩基のcDNAヌクレオチド配列を図46に示し
、288個のアミノ酸の翻訳配列を図47に示す。(ブダペスト条約の条件下、
1999年8月19日にプラスミドpRET−22をアメリカン・タイプ・オブ
・カルチャー・コレクション、10801ボウルバード大学、マナサス、バージ
ニア州20110−2209に寄託し、寄託番号 が付与された。) 前記するようにプラスミドpRET−21および−22をビール酵母菌334
に形質転換し(実施例IIIを参照のこと)、得られた酵母培養物(334(p
RET−21)および334(pRET−22))を50μM GLAおよびA
Aの存在下、ロイシン不含の選択培地100ml中(Ausubelら、前記で
引用)20℃で48時間成長させた。細胞ペレットを収集し、脂肪酸分析に供し
、結果を図48に示す。GLAの伸長により生成されると予測されるDGLAが
2個のサンプルにおいて全脂質の平均1.79%見出され、これに対して陰性対
照(プラスミドpYX242を含有する334)では0.13%であり、このこ
とはpRET−21およびpRET−22の両方によりコードされる酵素がGL
Aエロンガーゼ活性を有していることが示された。334(pRET−21)お
よび334(pRET−22)によるGLAのDGLAへの変換パーセントは各
々11.1%および19.4%であり、平均15.25%であった。興味深いこ
とに、AAまたは外因性の脂肪酸はほとんど全く伸長が観察されなかった(図4
8)。これらの結果によりこの新規に同定されたシー・エレガンスcDNA、C
EELO1によりコードされるエロンガーゼはGLAをDGLAに特異的に伸長
でき、このことにより、これがGLAエロンガーゼのシー・エレガンス相同体で
あり得ることが示唆される。
ために、プライマーRP735(5’−CCT CCT GAA TTC CA
QA CAC TAT TCA GCT TTC−3’)およびRO73(5’
−TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG−3’)を用いてヒ
ト肝臓マラソン・レディーcDNA(クロンテック・ラボラトリーズ・インコー
ポレーティッド、パロ・アルト、カリフォルニア州)をPCR増幅した。製造者
のプロトコルに従って、Advantage(登録商標) cDNA PCRキ
ット(クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド、パロ・アルト
、カリフォルニア州)を用いて、ヒト肝臓マラソン・レディーcDNA5μlお
よび各プライマー50ピコモルでPCRを実施した。パーキン・エルマー960
0(ノーウォーク、コネチカット州)の熱循環器条件は以下のとおりであった:
94℃で2分間、次いで94℃、1分間を30サイクル、58℃で2分間、およ
び72℃で3分間。続いてさらに72℃で7分間PCRのサイクルを延長した。
製し、製造者の指示書に従って、フラグメントの末端をT4 DNAポリメラー
ゼ(ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、カールスバッド、カリフォ
ルニア州)で埋めた。新規プラスミドをpRAE−59と称し、このプラスミド
の推定PUFAエロンガーゼcDNAをHS3と称し、ABI 373Aストレ
ッチ・シークエンサー(パーキン・エルマー、フォスター・シティー、カリフォ
ルニア州)を用いてシークエンシングした。推定PUFAエロンガーゼcDNA
配列HS3を図49に示し、翻訳配列を図50に示す。
代替剤、および他の栄養溶液に利用することができる。
の飲料。ラクトースを避けるべき疾患(ラクターゼ欠乏症、乳糖不耐症、および
ガラクトース血症)の患者に与えるため。
ンパク質単離物。
。
に設計された2種の炭水化物(dual carbohydrates)。
酸第一鉄として)。
ロース)、2.1%ダイズ油、1.9%ダイズタンパク質単離物、1.4%ココ
ナッツ油、0.15%クエン酸カルシウム、0.11%三塩基性リン酸カルシウ
ム、クエン酸カリウム、塩基性リン酸カリウム、塩化カリウム、モノおよびジグ
リセリド、ダイズレシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、L−メチオニン、塩
化マグネシウム、二塩基性リン酸カリウム、塩化カルシウム、塩化コリン、タウ
リン、硫酸第一鉄、m−イノシトール、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、L
−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチ
ン酸ビタミンA、チアミンクロリド塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、
葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナト
リウム、ビタミンD3、およびシアノコバラミン。
方物。
ることが臨床的に示されている。
イズタンパク単離物。
。
に設計された2種の炭水化物。
can Academiy of Pediatricsに推奨され、Infa
nt Formula Actで必要とされるビタミンおよびミネラルレベルを
満たすか超えている。
酸第一鉄として)。
クロース)、2.1%ダイズ油、2.0%ダイズタンパク質単離物、1.4%コ
コナッツ油、0.77%ダイズ食物繊維、0.12%クエン酸カルシウム、0.
11%三塩基性リン酸カルシウム、0.1%クエン酸カリウム、塩化カリウム、
塩基性リン酸カリウム、モノおよびジグリセリド、ダイズレシチン、カラゲナン
、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、L−メチオニン、二塩基性リン酸カリウ
ム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、m−イノシトール、
α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、L−カルニチン、ナイアシンアミド、パン
トテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンA、チアミンクロリド塩酸
塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、
フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、ビタミンD3、およびシアノコ
バラミン。
耐の乳児、小児、および成人用の飲料。ラクトースおよびスクロースを避けるべ
き疾患の患者に与えるため。
ンパク質単離物。
、Polycose(登録商標)Glucose Polymerである)。
。
酸第一鉄として)。
1%ダイズ油、4.1%ダイズタンパク質単離物、2.8%ココナッツ油、1.
0%改変コーンスターチ、4.9%コーンシロップ、0.38%三塩基性リン酸
カルシウム、0.17%クエン酸カリウム、0.13%塩化カリウム、モノおよ
びジグリセリド、ダイズレシチン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、L−メ
チオニン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、カラゲナン、タウリ
ン、硫酸第一鉄、m−イノシトール、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、L−
カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン
酸ビタミンA、チアミンクロリド塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉
酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリ
ウム、ビタミンD3、およびシアノコバラミン。
Cal/オンス)) 用途:ダイズ食が望ましい場合。
クロース)、2.1%ダイズ油、1.9%ダイズタンパク質単離物、1.4%コ
コナッツ油、0.15%クエン酸カルシウム、0.11%三塩基性リン酸カルシ
ウム、クエン酸カリウム、塩基性リン酸カリウム、塩化カリウム、モノおよびジ
グリセリド、ダイズレシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、L−メチオニン、
塩化マグネシウム、二塩基性リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タ
ウリン、硫酸第一鉄、m−イノシトール、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、
L−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミ
チン酸ビタミンA、チアミンクロリド塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン
、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナ
トリウム、ビタミンD3、およびシアノコバラミン。
と診断された場合、母乳栄養の補助食品が必要な場合、または母乳栄養不適用の
場合の日常の摂食。
熱変性タンパク質。
化)由来の脂肪。
油、モノおよびジグリセリド、ダイズレシチン、アスコルビン酸、カラゲナン、
塩化コリン、タウリン、m−イノシトール、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛
、ナイアシンアミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチ
ン酸ビタミンA、チアミンクロリド塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、
葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、ビタミン
D3、およびシアノコバラミン。
) 用途:退院後の未熟幼児の特別に栄養を必要とする場合。Similac N
eoCareは、成長の遅れを取り戻すのを促進し、発達を支持するために必要
な付加的なカロリー、タンパク質、ビタミン、およびミネラルを未熟児が得られ
るように開発された栄養的に完全な処方物である。
0 Cal/オンス)よりカロリーが高い(22 Cal/オンス)。
、高吸収性脂肪酸混合物。
のタンパク質、ビタミン、およびミネラルを含む。
イズ油、高オレイン酸ベニバナ油、分留ココナッツ油(中鎖トリグリセリド)、
ココナッツ油、クエン酸カリウム、三塩基性リン酸カルシウム、炭酸カルシウム
、アスコルビン酸、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、タウリ
ン、硫酸第一鉄、m−イノシトール、塩化コリン、アスコルビン酸パルミテート
、L−カルニチン、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、混
合トコフェロール、クエン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、チ
アミンクロリド塩酸塩、ビタミンAパルミテート、β−カロテン、リボフラビン
、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、セレン酸
ナトリウム、ビタミンD3、およびシアノコバラミン。
24 Cal/オンス))。
されている。
ツ油(中鎖トリグリセリド)、ホエイタンパク質濃縮物、ダイズ油、ココナッツ
油、三塩基性リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン
酸ナトリウム、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、モノおよびジグリセリド、ダ
イズレシチン、カラゲナン、塩化コリン、m−イノシトール、タウリン、ナイア
シンアミド、L−カルニチン、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、塩化カリウ
ム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸銅、リボフラビン、ビタミンA
パルミテート、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキシン、ビオチン、葉酸、
硫酸マンガン、フィロキノン、ビタミンD3、セレン酸ナトリウム、およびシア
ノコバラミン。
児用処方物と置換するか添加することができる。
養補助剤または食事の代わりとして用いるように設計された低残渣流動食である
。ENSUREは、無ラクトースおよび無グルテンであり、低コレステロール食
を含む加工食(modified diet)としての使用に適切である。主に
経口補助剤であるが、チューブによって摂取させることができる。
ゼイン酸カルシウムおよびカゼイン酸ナトリウム、高オレイン酸ベニバナ油、ダ
イズタンパク質単離物、ダイズ油、カノーラ油、クエン酸カリウム、三塩基性リ
ン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、二塩基性リン酸マグ
ネシウム、人工香料、塩化ナトリウム、ダイズレシチン、コリンクロリド、アス
コルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフェロール、G
ellanガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫化マンガン、
硫酸銅、ビタミンAパルミテート、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキシン
、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ
化カリウム、セレン酸ナトリウム。
ンスの取れた栄養素である。ENSURE BARSは、他のスナックより美味
で、栄養豊富である。ENSURE BARSは、バーあたり1g未満のラクト
ースを含み、チョコレート味のブラウニー風味は、グルテンを含まない(ハニー
グラハムクランチ風味は、グルテンを含む)。
者。
使用しない。
ンパク質、黒砂糖、ハチミツ、マルトデキストリン(トウモロコシ)、Cris
p Rice(製粉したコメ、糖(スクロース)、塩(塩化ナトリウム)、およ
び麦芽)、カラスムギのふすま、部分水素付加綿実油およびダイズ油、ダイズ多
糖類、グリセリン、ホエイタンパク質濃縮物、ポリデキストリン、フルクトース
、カゼイン酸カルシウム、コカ粉末、人工香料、カノーラ油、高オレイン酸ベニ
バナ油、脱脂粉乳、ホエイ粉末、ダイズレシチン、およびトウモロコシ油。ナッ
ツを加工する施設で製造される。
ム、酸化マグネシウム、塩(塩化ナトリウム)、塩化カリウム、アスコルビン酸
、オルトリン酸第二鉄、α−酢酸トコフェロール、ナイアシンアミド、酸化鉛、
パントテン酸カルシウム、グルコン酸銅、硫酸マンガン、リボフラン、β−カロ
テン、塩酸ピリドキシン、チアミン硝酸塩、葉酸、ビオチン、塩化クロム、ヨウ
化カリウム、セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、フィロキノン、ビ
タミンD3、およびシアノコバラミン。
質単離物とミルクタンパク質との混合物である。
ズ油、カノーラ油、高オレイン酸ベニバナ油、およびダイズレシチンとの混合物
である。 部分的水素付加綿実油およびダイズ油 76% カノーラ油 8% 高オレイン酸ベニバナ油 8% トウモロコシ油 4% ダイズレシチン 4% 炭水化物:ハニーグラハムクランチ−炭素供給源は、高フルクトースコーンシ
ロップ、黒砂糖、マルトデキストリン、ハチミツ、クリスプライス(crisp
rice)、グリセリン、ダイズ多糖類、およびカラスムギふすまの組み合わ
せである。
タンパク質、ビタミン、およびミネラルを必要とする患者用に設計された濃縮高
タンパク質流動食である。これは、食事中もしくは食間の経口補助剤として、ま
たは適切な量を食事の代わりとして使用することができる。ENSURE HI
GH PROTEINは、無ラクトースおよび無グルテンであり、一般的な手術
または臀部骨折から回復しつつある患者および圧迫潰瘍のリスクを負う患者への
使用に適切である。
者(一般的な手術または臀部骨折から回復しつつある患者および圧迫潰瘍のリス
クを負う患者および低コレステロール食患者など)。
含む。
た供給源である。
ン(トウモロコシ)、カゼイン酸カルシウムおよびカゼイン酸ナトリウム、高オ
レイン酸ベニバナ油、ダイズタンパク質単離物、ダイズ油、カノーラ油、クエン
酸カリウム、三塩基性リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウ
ム、二塩基性リン酸マグネシウム、人工香料、塩化ナトリウム、ダイズレシチン
、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−酢酸
トコフェロール、Gellanガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウ
ム、硫酸マンガン、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンA、チアミンクロリド塩酸塩
、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロ
ム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミン
D3、およびシアノコバラミン。
カゼインおよびダイズ)の混合物である。
およびダイズ油)の混合物である。
(AHA)のガイドラインを満たす。ENSURE HIGH PROTEIN
中の6gの脂肪は、全カロリーの24%を占め、そのうち2.6%の脂肪は飽和
脂肪酸に由来し、7.9%はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は、AH
Aガイドライン(脂肪由来の全カロリーの30%未満、飽和脂肪酸由来の10%
未満のカロリー、およびポリ不飽和脂肪酸由来の全カロリーの10%未満)の範
囲内である。
とスクロースとの組み合わせを含む。ほのかに甘い、種々の風味(バニラシュプ
リーム、チョコレートロイヤル、ワイルドベリー、およびバナナ)ならびにペカ
ン、チェリー、ストロベリー、レモン、およびオレンジの香りのVARI−FL
AVORS(登録商標)Flavor Pacsは、風味に関する不快感を避け
る一助となり、患者の服薬遵守の援助となる。 バニラおよび他のチョコレート以外の風味は以下である。
剤として使用するために設計された低脂肪流動食である。ENSURE LIG
HTは、無ラクトースおよび無グルテンであり、低コレステロール食を含む加工
食としての使用に適切である。
食品中に付加的な栄養を必要とする正常な体重または超過体重の患者用。
。
スクロース)、カゼイン酸カルシウム、高オレイン酸ベニバナ油、カノーラ油、
塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン
酸マグネシウム、天然香料および人工香料、三塩基性リン酸カルシウム、Gel
lanガム、塩化コリン、ダイズレシチン、カラゲナン、塩(塩化ナトリウム)
、アスコルビン酸、セルロースガム、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフェロール、硫
酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、
チアミンクロリド塩酸塩、パルミチン酸ビタミンA、塩酸ピリドキシン、リボフ
ラビン、塩化クロム、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、ビオチン、ヨウ化カリウ
ム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンD3、およびシアノコバラミ
ン。
油)の混合物である。
イドラインを満たす。ENSURE LIGHT中の3gの脂肪は、全カロリー
の13.5%を占め、そのうち1.4%の脂肪は飽和脂肪酸に由来し、2.6%
はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は、AHAガイドライン(脂肪由来
の全カロリーの30%未満、飽和脂肪酸由来の10%未満のカロリー、およびポ
リ不飽和脂肪酸由来の全カロリーの10%未満)の範囲内である。
の組み合わせを含む。チョコレート風味はコーンシロップなどを含む。ほのかに
甘い種々の風味(フレンチバニラ、チョコレートシュプリーム、ストロベリース
ワール)ならびにペカン、チェリー、ストロベリー、レモン、およびオレンジの
香りのVARI−FLAVORS(登録商標)Flavor Pacsは、風味
に関する不快感を避ける一助となり、患者の服薬遵守の援助となる。 バニラおよび他のチョコレート以外の風味は以下である。
、24種類の重要なビタミンおよびミネラルのRDIの少なくとも24%が得ら
れる。
を含む。
るが、通常のタンパク質濃度が必要な場合の、高カロリーの低残渣流動食である
。これは、主に、食事中または食間に使用する経口栄養補助食品としてまたは適
切な量を食事の代わりとして使用するように設計されている。ENSURE P
LUSは、無ラクトースおよび無グルテンである。主に経口補助剤であるが、チ
ューブによって摂取させることができる。
パク質濃度が必要な患者。
)、トウモロコシ油、カゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カルシウム、糖(
スクロース)、ダイズタンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム
、三塩基性リン酸カルシウム、ダイズレシチン、天然香料および人工香料、クエ
ン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫
酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフェロール、ナイアシンアミド、パントテン
酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキ
シン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンA、葉酸、ビオチン、塩化クロム、
モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン
、シアノコバラミン、およびビタミンD3。
カゼインおよびダイズ)の混合物である。 カゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カルシウム 84% タンパク質単離物 16% 脂肪:脂肪源はトウモロコシ油である。
組み合わせである。ほのかに甘い、種々の風味(バニラ、チョコレート、ストロ
ベリー、コーヒー、バターペカン、およびエッグノッグ)ならびにペカン、チェ
リー、ストロベリー、レモン、およびオレンジの香りのVARI−FLAVOR
S(登録商標)Flavor Pacsは、風味に関する不快感を避ける一助と
なり、患者の服薬遵守の援助となる。
25種類の重要なビタミンおよびミネラルのRDIの少なくとも15%が得られ
る。
を含む。コーヒー香料には微量のカフェインを含む。
要とするか摂取体積が制限される患者用に設計された、栄養的に完全な高カロリ
ーおよび高窒素流動食である。これは、経口での栄養補給またはチューブによる
全栄養支持に有用であり得る。ENSURE PLUS HNは、無ラクトース
および無グルテンである。
トリウムおよびカゼイン酸カルシウム、トウモロコシ油、糖(スクロース)、ダ
イズタンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、三塩基性リン酸
カルシウム、ダイズレシチン、天然香料および人工香料、クエン酸ナトリウム、
塩化コリン、アスコルビン酸、タウリン、L−カルニチン、硫酸亜鉛、硫酸第一
鉄、α−酢酸トコフェロール、ナイアシンアミド、カラゲナン、パントテン酸カ
ルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキシン
、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンA、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリ
ブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シ
アノコバラミン、およびビタミンD3。
は食間に使用される経口栄養補助剤として設計された低残渣流動食である。EN
SURE POWDERは、無ラクトースおよび無グルテンであり、低カロリー
食を含む加工食としての使用に適切である。
スクロース)、トウモロコシ油、カゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カルシ
ウム、ダイズタンパク質単離物、人工香料、クエン酸カリウム、塩化マグネシウ
ム、クエン酸ナトリウム、三塩基性リン酸カルシウム、塩化カリウム、ダイズレ
シチン、アスコルビン酸、塩化コリン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフ
ェロール、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、チアミ
ンクロリド塩酸塩、硫酸銅、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビ
タミンA、葉酸、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ヨウ化カリ
ウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンD3、およびシアノコバラ
ミン。
カゼインおよびダイズ)である。
リンとスクロースとの組み合わせである。ENSURE POWDERのほのか
に甘さならびにペカン、チェリー、ストロベリー、レモン、およびオレンジの香
りのVARI−FLAVORS(登録商標)Flavor Pacsは、風味に
関する不快感を避ける一助となり、患者の服薬遵守の援助となる。
体形態のバランスのとれた栄養素を得るための栄養密度の高い補助食品である。
これは、継続的な加工食(たとえば、軟らかい、ピューレ状、または完全な液体
)を摂取している患者および嚥下障害患者に適切である。ENSURE PUD
DINGは、無グルテンである。
取している患者。
%、全脂肪34.9%、炭水化物54.2%である。
食品デンプン、硫酸マグネシウム、ステアロイルラクチリン酸ナトリウム、二塩
基性リン酸ナトリウム、人工香料、アスコルビン酸、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α
−酢酸トコフェロール、塩酸コリン、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パント
テン酸カルシウム、FD&C Yellow #5、クエン酸カリウム、硫酸銅
、ビタミンAパルミテート、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボ
フラビン、FD&C Yellow #6、葉酸、ビオチン、フィロキノン、ビ
タミンD3、およびシアノコバラミン。
の組み合わせである。ほのかな甘さおよび多種の風味(バニラ、チョコレート、
バタースカッチ、およびタピオカ)は、風味に関する不快感を避ける一助となる
。製品には、1回の食事あたり9.2グラムのラクトースを含む。
することに利点を有し得る患者用に設計された、食物繊維を含む栄養的に完全な
流動食である。ENSURE WITH FIBERは、低残渣食を必要としな
い患者に適切である。これは、経口およびチューブによって摂取させることがで
き、通常の食事の栄養補助剤として、または適切な量を食事の代わりとして与え
ることができる。ENSURE WITH FIBERは、無ラクトースおよび
無グルテンであり、低コレステロール食を含む加工食としての使用に適切である
。
ゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カルシウム、カラスムギ繊維、高オレイン
酸ベニバナ油、カノーラ油、ダイズタンパク質単離物、トウモロコシ油、ダイズ
繊維、三塩基性リン酸カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、セル
ロースゲル、ダイズレシチン、二塩基性リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、
天然および人工香料、塩化コリン、リン酸マグネシウム、アスコルビン酸、セル
ロースガム、塩化カリウム、カラゲナン、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフェロール
、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸
銅、パルミチン酸ビタミンA、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リ
ボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カ
リウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンD3、およびシアノコバ
ラミン。
カゼインおよびダイズ)の混合物である。
およびダイズ油)の混合物である。
HA)のガイドラインを満たす。ENSURE WITH FIBER中の6g
の脂肪は、全カロリーの22%を占め、そのうち2.01%の脂肪は飽和脂肪酸
に由来し、6.7%はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は、AHAガイ
ドライン(脂肪由来の全カロリーの30%以下、飽和脂肪酸由来の10%以下の
カロリー、およびポリ不飽和脂肪酸由来の全カロリーの10%以下)の範囲内で
ある。
クロースとの組み合わせを含む。ほのかに甘く、種々の風味(バニラ、チョコレ
ート、およびバターペカン)ならびにペカン、チェリー、ストロベリー、レモン
、およびオレンジの香りのVARI−FLAVORS(登録商標)Flavor
Pacsは、風味に関する不快感を避ける一助となり、患者の服薬遵守の援助
となる。
スムギ繊維およびダイズ繊維からなる。この混合物により、8オンス缶あたり全
食物繊維の約4グラムが得られる。不溶性繊維:可溶性繊維は95:5である。
置換および/または補充することができる。
れた、低炭水化物でカロリー密度が高い経腸栄養製品である。これは、エイコサ
ペンタエン酸(魚油由来のEPA)、γ−リノレン酸(ルリヂサ油由来のGLA
)を含み、抗酸化レベルを高めた特許油混合物を含む固有の成分の組み合わせで
ある。
密度は高い(1.5 Cal/mL(355 Cal/8オンス))。
を含む。
)、20%ルリヂサ油、20%魚油、および3.2%ダイズレシチンとのオイル
混合物である。Oxepaの典型的な脂肪酸プロフィールを、表Vに示す。
和脂肪酸、一不飽和脂肪酸、および飽和脂肪酸が得られる。
乳化されることなく腸管によって吸収されるので、胃排出の一助となる。
Aと置換および/または補充することができる。
.0gである。
5%スクロース(単糖類)であり、これらは共に容易に消化吸収される。
最小になるように設計する。高CO2レベルは、人工呼吸器に依存している患者
の離乳を複雑にし得る。低レベルの炭水化物はまた、ストレス誘導性高血糖症患
者に有用であり得る。
、体内のグルコースと変換することができる。この過程の間中、グルコース依存
性組織(中枢神経系および赤血球など)の炭水化物要求が満たされる。しかし、
炭水化物を含まない食事は、ケトーシス、組織タンパク質の過剰な異化、および
体液および電解質の欠乏を誘導し得る。これらの効果を、カロリー摂取が適切で
ある場合、50gから00gの消化しやすい炭水化物の毎日の注射によって予防
することができる。Oxepa中の炭水化物レベルはまた、エネルギー要求が満
たされる場合、糖新生を最小にするのに十分である。
のタンパク質を含む。
脂肪体重の維持に十分なタンパク質が得られる。高タンパク質の摂取は、胚不全
患者に重要である。タンパク質は、CO2産生に対してほとんど効果がないにも
かかわらず、高タンパク質食は、人工呼吸器の運転性を向上させる。
び13.2%のカゼイン酸カルシウムである。
ーによって設定された高品質のタンパク質の基準を満たすか超える。
。
示す図である。
ELO2配列を示す図である。
図である。図4Bは、酵母におけるエロンガーゼ酵素産生に使用された構成性発
現ベクターpRAE−5の物理的地図を示す図である。
ある。
列を示す図である。
ゼのアミノ酸配列を示す図である。
ELO3(SUR4)と図7に示された翻訳されたMAELO配列とのアミノ酸
配列アラインメントを示す図である。
ド配列との比較を示す図である。
である。
である。
共発現された場合のMAELOのPUFAエロンガーゼ活性を示す図である。
由来のELO2の過剰発現との比較を示す図である。
ノ酸配列と、翻訳されたMAELOとの3つの異なる比較を示す図である。
ノ酸配列と、翻訳されたMAELOとの3つの異なる比較を示す図である。
ノ酸配列と、翻訳されたMAELOとの3つの異なる比較を示す図である。
ノ酸配列と、翻訳されたMAELOとの3つの異なる比較を示す図である。
翻訳されたMAELOとの比較を示す図である。
と、データベース検索において検出されたMAELO由来のアミノ酸配列との比
較を示す図である。
ある。
20:3n−6)ピークの検出に注意されたい。
エロンガーゼ活性を示す図である。全てのクローンが明白なエロンガーゼ活性を
有する。
7bp長のオープン・リーディング・フレームが明らかとなった。
B2に含まれるM.アルピナcDNAの全長ヌクレオチド配列を示す図である。
ノ酸配列を示す図である。
n−6 PUFAエロンガーゼ活性を示す図である。
れた培養物におけるn−3及びn−6 PUFAエロンガーゼ活性を示す図であ
る。
Aと共に共発現された場合の、GLELOのGLAを基質として用いたエロンガ
ーゼ活性を示す図である。図26Bは、EPAを生成するようM.アルピナのΔ
5−デサチュラーゼcDNAと共に共発現された場合の、GLELOのSTAを
基質として用いたエロンガーゼ活性を示す図である。
参照)との比較を示す図である。
LO配列(図7参照)、S.セレビシエELO2(GNS1)及びS.セレビシ
エELO3(SUR4)の翻訳されたアミノ酸配列の比較を示す図である。ヒス
チジン・ボックスが下線で示されている。
ラインメントを示す図である。
ラインメントを示す図である。
アラインメントを示す図である。
列とのアラインメントを示す図である。
配列とのアラインメントを示す図である。
ラインメントを示す図である。
配列とのアラインメントを示す図である。
アラインメントを示す図である。
2配列とのアラインメントを示す図である。
のアラインメントを示す図である。
56H11.4)ホモログ配列とのアラインメントを示す図である。
56H11.4)ホモログ配列とのアラインメントを示す図である。
グ配列DM1とのアラインメントを示す図である。
グ配列DM1とのアラインメントを示す図である。
れた培養物のエロンガーゼ活性(PUFA及びその他)を示す図である。
ある。
。
RET−22)の誘導された培養物のPUFAエロンガーゼ活性を示す図である
。
。
Claims (212)
- 【請求項1】 配列番号1(図6)に示すヌクレオチド配列の約50%に一
致するまたは相補的である単離ヌクレオチド配列。 - 【請求項2】 前記配列が配列番号1で表されることを特徴とする請求項1
に記載の単離ヌクレオチド配列。 - 【請求項3】 前記配列が、ポリ不飽和脂肪酸またはモノ不飽和脂肪酸を基
質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードすることを特徴とする請
求項1または2に記載の単離ヌクレオチド配列。 - 【請求項4】 前記配列がMortirella属の真菌から誘導されるこ
とを特徴とする請求項1に記載のヌクレオチド配列。 - 【請求項5】 前記真菌がalpina種であることを特徴とする請求項4
に記載のヌクレオチド配列。 - 【請求項6】 請求項1または2に記載の前記ヌクレオチド配列によってコ
ードされた精製タンパク質。 - 【請求項7】 ポリ不飽和脂肪酸またはモノ不飽和脂肪酸を伸張させる精製
タンパク質であり、かつ請求項6に記載の前記精製タンパク質のアミノ酸配列と
約50%のアミノ酸類似性を有する精製ポリペプチド。 - 【請求項8】 a)配列番号1(図6)で表される前記ヌクレオチド配列を
単離する工程と、 b)i)プロモーター、およびii)該プロモーターに機能的に連結した前記単
離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程と、 c)前記エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件の下で、前記ベクター
を宿主細胞に導入する工程とを含むエロンガーゼ酵素の製造方法。 - 【請求項9】 前記宿主細胞が真核細胞または原核細胞から成る群から選択
されることを特徴とする請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 前記原核細胞が、E.coli、Cyanobacter
iaおよびB.subtilisから成る群から選択されることを特徴とする請
求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 前記真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞およ
び真菌細胞から成る群から選択されることを特徴とする請求項9に記載の方法。 - 【請求項12】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp.
、Candida spp.、Lipomyces starkey、Yarr
owia spp.、Kluyveromyces spp.、Hansenu
la spp.、Aspergillus spp.、Penicillium
spp.、Neurospora spp.、Trichoderma sp
p.およびPichia spp.から成る群から選択されることを特徴とする
請求項11に記載の方法。 - 【請求項13】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp.
、Candida spp.、Hansenula spp.およびPichi
a spp.から成る群から選択された酵母菌細胞であることを特徴とする請求
項11に記載の方法。 - 【請求項14】 前記酵母菌細胞が、Saccharomyces cer
evisiaeであることを特徴とする請求項13に記載の方法。 - 【請求項15】 a)プロモーターおよびb)該ブロモーターに機能的に連
結した配列番号1(図6)によって表されるヌクレオチド配列を含むベクター。 - 【請求項16】 請求項15に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項17】 前記宿主細胞が真核細胞または原核細胞から成る群から選
択されることを特徴とする請求項16に記載の宿主細胞。 - 【請求項18】 前記原核細胞が、E.coli、Cyanobacter
iaおよびB.subtilisから成る群から選択されることを特徴とする請
求項17に記載の宿主細胞。 - 【請求項19】 前記真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞およ
び真菌細胞を含む群から選択されることを特徴とする請求項17に記載の宿主細
胞。 - 【請求項20】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp.
、Candida spp.、Lipomyces starkey、Yarr
owia spp.、Kluyveromyces spp.、Hansenu
la spp.、Aspergillus spp.、Penicillium
spp.、Neurospora spp.、Trichoderma sp
p.およびPichia spp.から成る群から選択されることを特徴とする
請求項19に記載の宿主細胞。 - 【請求項21】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp.
、Candida spp.、Hansenula spp.およびPichi
a spp.から成る群から選択された酵母菌細胞であることを特徴とする請求
項20に記載の宿主細胞。 - 【請求項22】 前記宿主細胞が、Saccharomyces cere
visiaeであることを特徴とする請求項21に記載の宿主細胞。 - 【請求項23】 請求項15に記載のベクターを含む植物細胞、植物または
植物組織であって、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現が、前記植物細
胞、植物または植物組織による、モノ不飽和脂肪酸およびポリ不飽和脂肪酸から
成る群から選択された少なくとも一つの脂肪酸の生成をもたらすことを特徴とす
る、前記植物細胞、植物または植物であって、前記植物細胞、植物または植物組
織。 - 【請求項24】 前記ポリ不飽和脂肪酸が、ジホモ−γ−リノレン酸(DG
LA)、20:4n−3およびアドレニン酸(ADA)から成る群から選択され
ることを特徴とする請求項23に記載の植物細胞、植物または植物組織。 - 【請求項25】 請求項23に記載の植物細胞、植物または植物組織によっ
て発現される一つまたは複数の植物油または脂肪酸。 - 【請求項26】 請求項15に記載の前記ベクターを含むトランスジェニッ
ク植物であって、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現が、前記トランス
ジェニック植物の種子中にポリ不飽和脂肪酸の生成をもたらすことを特徴とする
トランスジェニック植物。 - 【請求項27】 そのゲノムが、プロモーターに機能的に連結したエロンガ
ーゼをコードするDNA配列を含むヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項28】 前記DNA配列が配列番号1(図6)によって表されるこ
とを特徴とする請求項27に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項29】 請求項28に記載の前記ヒト以外のトランスジェニック哺
乳動物によって生成される体液であって、前記体液が、検出可能なレベルの少な
くとも一つのエロンガーゼまたはその生成物を含むことを特徴とする前記体液。 - 【請求項30】 a)配列番号1(図6)で表される前記ヌクレオチド配列
を単離する工程と、 b)前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程と、 c)前記単離ヌクレオチド配列によってコードされたエロンガーゼ酵素の発現に
十分な時間および条件の下で、前記ベクターを宿主細胞に導入する工程と、 d)基質ポリ不飽和脂肪酸を生成物ポリ不飽和脂肪酸に変換するために、前記基
質に前記発現エロンガーゼ酵素を曝露させる工程、とを含むポリ不飽和脂肪酸の
製造方法。 - 【請求項31】 前記の基質ポリ不飽和脂肪酸が、γ−リノレン酸(GLA
)、ステアリドン酸(STA)およびアラキドン酸(AA)から成る群から選択
されること、そして前記の生成物ポリ不飽和脂肪酸が、それぞれDGLA、20
:4n−3およびADAから成る群から選択されることを特徴とする請求項30
に記載の方法。 - 【請求項32】 前記の生成物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に
変換するために、前記生成物ポリ不飽和脂肪酸を少なくとも一つのデサチュラー
ゼ(desaturase)に曝露する工程をさらに含むことを特徴とする請求
項30に記載の方法。 - 【請求項33】 前記生成物ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n−
3およびADAから成る群から選択されること、そして別のポリ不飽和脂肪酸が
、それぞれAA、エイコサペンタエン酸(EPA)、ω6−ドコサペンタエン酸
から成る群から選択されること、そして少なくとも一つの前記デサチュラーゼが
、AAまたはEPAの生成に関してはΔ5−デサチュラーゼであり、ω6−ドコ
サペンタエン酸の生成に関してはΔ4−デサチュラーゼであることを特徴とする
請求項32に記載の方法。 - 【請求項34】 前記別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換
するために、前記別の不飽和ポリ脂肪酸を、少なくとも一つのエロンガーゼと、
少なくとも一つの付加的なデサチュラーゼとから成る群から選択された一つまた
は複数の酵素に曝露する工程をさらに含むことを特徴とする請求項32に記載の
方法。 - 【請求項35】 最終ポリ不飽和脂肪酸が、ドコサヘキサエン酸(DHA)
、AA、ω6−ドコサペンタエン酸およびω3−ドコサペンタエン酸から成る群
から選択されることことを特徴とする請求項34に記載の方法。 - 【請求項36】 請求項30に記載の方法に従って製造された前記生成物ポ
リ不飽和脂肪酸と、請求項32に記載の方法に従って製造された前記別のポリ不
飽和脂肪酸と、請求項34に記載の方法に従って製造された前記最終ポリ不飽和
脂肪酸とから成る群から選択された少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含むこ
とを特徴とする栄養組成物。 - 【請求項37】 前記生成物ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n−
3およびADAから成る群から選択されることを特徴とする請求項36に記載の
栄養組成物。 - 【請求項38】 前記別のポリ不飽和脂肪酸が、AA、EPAおよびω6−
ドコサペンタエン酸から成る群から選択されることを特徴とする請求項36に記
載の栄養組成物。 - 【請求項39】 前記最終ポリ不飽和脂肪酸が、DHA、アドレニン酸、ω
6−ドコサペンタエン酸およびω3−ドコサペンタエン酸から成る群から選択さ
れることを特徴とする請求項36に記載の栄養組成物。 - 【請求項40】 前記栄養組成物が、幼児用調合物、栄養補助食品および食
品代用物から成る群から選択されることを特徴とする請求項36に記載の栄養組
成物。 - 【請求項41】 前記栄養組成物がヒトまたは動物に投与されることを特徴
とする請求項40に記載の栄養組成物。 - 【請求項42】 前記栄養組成物が、経口的または非経口的に投与されるこ
とを特徴とする請求項41に記載の栄養組成物。 - 【請求項43】 前記栄養組成物が、ココナッツ油、大豆油、カノラ油、モ
ノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、グルコース、食用ラクトース、
電気透析ホエー、電気透析スキムミルク、乳清、大豆タンパク、タンパク質加水
分解物、ヒマワリ油、サフラワー油、コーン油および亜麻油から成る群から選択
された少なくとも一つのマクロ栄養物をさらに含むことを特徴とする請求項40
に記載の栄養組成物。 - 【請求項44】 ビタミンA、C、D、EおよびB複合体から成る群から選
択された少なくとも一つのビタミンと、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マン
ガン、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレンおよび鉄から
成る群から選択された少なくとも一つのミネラルとをさらに含むことを特徴とす
る請求項43に記載の栄養組成物。 - 【請求項45】 1)請求項30に記載の方法に従って製造された前記生成
物ポリ不飽和脂肪酸と、請求項32に記載の方法に従って製造された前記別のポ
リ不飽和脂肪酸と、請求項34に記載の方法に従って製造された前記最終ポリ不
飽和脂肪酸とから成る群から選択された少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸と、
2)薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。 - 【請求項46】 前記薬学的組成物がヒトまたは動物に投与されることを特
徴とする請求項45に記載の薬学的組成物。 - 【請求項47】 前記薬学的組成物が、ビタミン、ミネラル、塩、炭水化物
、アミノ酸、遊離脂肪酸、保存料、賦形剤、抗ヒスタミン、成長因子、抗生物質
、希釈剤、リン脂質、酸化防止剤およびフェノール性化合物から成る群から選択
された少なくとも一つの要素をさらに含むことを特徴とする請求項45に記載の
薬学的組成物。 - 【請求項48】 請求項30に記載の方法に従って製造された前記生成物ポ
リ不飽和脂肪酸と、請求項32に記載の方法に従って製造された前記別のポリ不
飽和脂肪酸と、請求項34に記載の方法に従って製造された前記最終ポリ不飽和
脂肪酸とから成る群から選択された少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む動
物飼料。 - 【請求項49】 前記生成物ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n−
3およびADAから成る群から選択されることを特徴とする請求項48に記載の
動物飼料。 - 【請求項50】 前記別のポリ不飽和脂肪酸が、AA、EPAおよびω6−
ドコサペンタエン酸から成る群から選択されることを特徴とする請求項48に記
載の動物飼料。 - 【請求項51】 前記最終ポリ不飽和脂肪酸が、DHA、ADA、ω6−ド
コサペンタエン酸およびω3−ドコサペンタエン酸から成る群から選択されるこ
とを特徴とする請求項48に記載の動物飼料。 - 【請求項52】 請求項30に記載の方法に従って製造された前記生成物ポ
リ不飽和脂肪酸と、請求項32に記載の方法に従って製造された前記別のポリ不
飽和脂肪酸と、請求項34に記載の方法に従って製造された前記最終ポリ不飽和
脂肪酸とから成る群から選択されたポリ不飽和脂肪酸を含む化粧品。 - 【請求項53】 ポリ不飽和脂肪酸の摂取量の不足によって起こる状態を防
止または治療する方法であって、前記防止または治療に有効な量の、請求項36
に記載の前記栄養組成物を前記患者に投与することを含む前記防止または治療方
法。 - 【請求項54】 配列番号2(図22)に示されたヌクレオチド配列の少な
くとも約35%に一致するまたは相補的である単離ヌクレオチド配列。 - 【請求項55】 前記配列が配列番号2で表されることを特徴とする請求項
54に記載の単離ヌクレオチド配列。 - 【請求項56】 前記配列が、ポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能
的に活性なエロンガーゼをコードすることを特徴とする請求項54または55に
記載の単離ヌクレオチド配列。 - 【請求項57】 前記配列がMortirella属の真菌から誘導される
ことを特徴とする請求項55に記載のヌクレオチド配列。 - 【請求項58】 前記真菌がalpina種であることを特徴とする請求項
57に記載のヌクレオチド配列。 - 【請求項59】 請求項54または55記載の前記ヌクレオチド配列によっ
てコードされた精製タンパク質。 - 【請求項60】 ポリ不飽和脂肪酸を伸張させる精製タンパク質であり、か
つ請求項59に記載の前記精製タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約30%
のアミノ酸類似性を有する精製ポリペプチド。 - 【請求項61】 a)配列番号2(図22)で表される前記ヌクレオチド配
列を単離する工程と、 b)i)プロモーター、およびii)該ブロモーターに機能的に連結した前記単
離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程と、 c)前記エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件の下で、前記ベクター
を宿主細胞に導入する工程とを含むエロンガーゼ酵素の製造方法。 - 【請求項62】 前記宿主細胞が真核細胞または原核細胞から成る群から選
択されることを特徴とする請求項61に記載の方法。 - 【請求項63】 前記原核細胞が、E.coli、Cyanobacter
iaおよびB.subtilisから成る群から選択されることを特徴とする請
求項62に記載の方法。 - 【請求項64】 前記真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞およ
び真菌細胞から成る群から選択されることを特徴とする請求項62に記載の方法
。 - 【請求項65】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp.
、Candida spp.、Lipomyces starkey、Yarr
owia spp.、Kluyveromyces spp.、Hansenu
la spp.、Aspergillus spp.、Penicillium
spp.、Neurospora spp.、Trichoderma sp
p.およびPichia spp.から成る群から選択されることを特徴とする
請求項64に記載の方法。 - 【請求項66】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp.
、Candida spp.、Hansenula spp.およびPichi
a spp.から成る群から選択された酵母菌細胞であることを特徴とする請求
項65に記載の方法。 - 【請求項67】 前記酵母菌細胞が、Saccharomyces cer
evisiaeであることを特徴とする請求項66に記載の方法。 - 【請求項68】 a)プロモーター、およびb)該プロモーターに機能的に
連結した配列番号2(図22)によって表されるヌクレオチド配列を含むベクタ
ー。 - 【請求項69】 請求項68に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項70】 前記宿主細胞が真核細胞または原核細胞から成る群から選
択されることを特徴とする請求項69に記載の宿主細胞。 - 【請求項71】 前記原核細胞が、E.coli、Cyanobacter
iaおよびB.subtilisから成る群から選択されることを特徴とする請
求項70に記載の宿主細胞。 - 【請求項72】 前記真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞およ
び真菌細胞を含む群から選択されることを特徴とする請求項70に記載の宿主細
胞。 - 【請求項73】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp.
、Candida spp.、Lipomyces starkey、Yarr
owia spp.、Kluyveromyces spp.、Hansenu
la spp.、Aspergillus spp.、Penicillium
spp.、Neurospora spp.、Trichoderma sp
p.およびPichia spp.から成る群から選択されることを特徴とする
請求項72に記載の宿主細胞。 - 【請求項74】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp.
、Candida spp.、Hansenula spp.およびPichi
a spp.から成る群から選択された酵母菌細胞であることを特徴とする請求
項73に記載の宿主細胞。 - 【請求項75】 前記宿主細胞が、Saccharomyces cere
visiaeであることを特徴とする請求項74に記載の宿主細胞。 - 【請求項76】 請求項68に記載のベクターを含む植物細胞、植物または
植物組織であって、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現が、前記植物細
胞、植物または植物組織によるポリ不飽和脂肪酸の生成をもたらすことを特徴と
する、前記植物細胞、植物または植物組織。 - 【請求項77】 前記ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n−3およ
びADAから成る群から選択されることを特徴とする請求項76に記載の植物細
胞、植物または植物組織。 - 【請求項78】 請求項76に記載の植物細胞、植物または植物組織によっ
て発現される一つまたは複数の植物油または脂肪酸。 - 【請求項79】 請求項68に記載のベクターを含むトランスジェニック植
物であって、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現が、前記トランスジェ
ニック植物の種子中にポリ不飽和脂肪酸の生成をもたらすことを特徴とするトラ
ンスジェニック植物。 - 【請求項80】 そのゲノムが、プロモーターに機能的に連結したエロンガ
ーゼをコードするM.alpina由来のDNA配列を含むヒト以外のトランス
ジェニック哺乳動物。 - 【請求項81】 前記DNA配列が配列番号2(図22)によって表される
ことを特徴とする請求項80に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項82】 請求項81に記載の前記ヒト以外のトランスジェニック哺
乳動物によって生成される体液であって、前記体液が、検出可能なレベルの少な
くとも一つのエロンガーゼまたはその生成物を含むことを特徴とする前記体液。 - 【請求項83】 a)配列番号2(図22)で表される前記ヌクレオチド配
列を単離する工程と、 b)前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程と、 c)前記単離ヌクレオチド配列によってコードされたエロンガーゼ酵素の発現に
十分な時間および条件の下で、前記ベクターを宿主細胞に導入する工程と、 d)基質ポリ不飽和脂肪酸を生成物ポリ不飽和脂肪酸に変換するために、前記基
質に前記発現エロンガーゼ酵素を曝露する工程、とを含むポリ不飽和脂肪酸の製
造方法。 - 【請求項84】 前記基質ポリ不飽和脂肪酸が、GLA、STAおよびAA
から成る群から選択されること、そして前記の生成物ポリ不飽和脂肪酸が、それ
ぞれDGLA、20:4n−3およびω6−ドコサペンタエン酸から成る群から
選択されることを特徴とする請求項83に記載の方法。 - 【請求項85】 前記の生成物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に
変換するために、前記の発現されたエロンガーゼ酵素を少なくとも一つのデサチ
ュラーゼに曝露する工程をさらに含むことを特徴とする請求項83に記載の方法
。 - 【請求項86】 前記生成物ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n−
3およびADAから成る群から選択されること、そして別のポリ不飽和脂肪酸が
、それぞれAA、EPAおよびω6−ドコサペンタエン酸から成る群から選択さ
れること、そして少なくとも一つの前記デサチュラーゼが、AAまたはEPAの
生成に関してはΔ5−デサチュラーゼであり、ω6−ドコサペンタエン酸の生成
に関してはΔ4−デサチュラーゼであることを特徴とする請求項85に記載の方
法。 - 【請求項87】 前記別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換
するために、前記別の不飽和ポリ脂肪酸を、少なくとも一つのエロンガーゼと、
少なくとも一つの付加的なデサチュラーゼとから成る群から選択された一つまた
は複数の酵素に曝露する工程をさらに含むことを特徴とする請求項86に記載の
方法。 - 【請求項88】 最終ポリ不飽和脂肪酸が、ドコサヘキサエン酸、AA、ω
6−ドコサペンタエン酸およびω3−ドコサペンタエン酸から成る群から選択さ
れることことを特徴とする請求項87に記載の方法。 - 【請求項89】 請求項83に記載の方法に従って製造された前記生成物ポ
リ不飽和脂肪酸と、請求項85に記載の方法に従って製造された前記別のポリ不
飽和脂肪酸と、請求項87に記載の方法に従って製造された前記最終ポリ不飽和
脂肪酸とから成る群から選択された少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含むこ
とを特徴とする栄養組成物。 - 【請求項90】 前記生成物ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n−
3およびADAから成る群から選択されることを特徴とする請求項89に記載の
栄養組成物。 - 【請求項91】 前記別のポリ不飽和脂肪酸が、AA、EPAおよびω6−
ドコサペンタエン酸から成る群から選択されることを特徴とする請求項89に記
載の栄養組成物。 - 【請求項92】 前記最終ポリ不飽和脂肪酸が、DHA、AA、ω6−ドコ
サペンタエン酸およびω3−ドコサペンタエン酸から成る群から選択されること
を特徴とする請求項89に記載の栄養組成物。 - 【請求項93】 前記栄養組成物が、幼児用調合物、栄養補助食品および食
品代用物から成る群から選択されることを特徴とする請求項89に記載の栄養組
成物。 - 【請求項94】 前記栄養組成物がヒトまたは動物に投与されることを特徴
とする請求項93に記載の栄養組成物。 - 【請求項95】 前記栄養組成物が、経口的または非経口的に投与されるこ
とを特徴とする請求項94に記載の栄養組成物。 - 【請求項96】 前記栄養組成物が、ココナッツ油、大豆油、カノラ油、モ
ノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、グルコース、食用ラクトース、
電気透析ホエー、電気透析スキムミルク、乳清、大豆タンパク、タンパク質加水
分解物、ヒマワリ油、サフラワー油、コーン油および亜麻油から成る群から選択
された少なくとも一つのマクロ栄養物をさらに含むことを特徴とする請求項93
に記載の栄養組成物。 - 【請求項97】 ビタミンA、C、D、EおよびB複合体から成る群から選
択された少なくとも一つのビタミンと、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マン
ガン、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレンおよび鉄から
成る群から選択された少なくとも一つのミネラルとをさらに含むことを特徴とす
る請求項96に記載の栄養組成物。 - 【請求項98】 1)請求項83に記載の方法に従って製造された前記生成
物ポリ不飽和脂肪酸と、請求項85に記載の方法に従って製造された前記別のポ
リ不飽和脂肪酸と、請求項87に記載の方法に従って製造された前記最終ポリ不
飽和脂肪酸とから成る群から選択された少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸と、
2)薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。 - 【請求項99】 前記薬学的組成物がヒトまたは動物に投与されることを特
徴とする請求項98に記載の薬学的組成物。 - 【請求項100】 前記薬学的組成物が、ビタミン、ミネラル、塩、炭水化
物、アミノ酸、遊離脂肪酸、保存料、賦形剤、抗ヒスタミン、成長因子、抗生物
質、希釈剤、リン脂質、酸化防止剤およびフェノール性化合物から成る群から選
択された少なくとも一つの要素をさらに含むことを特徴とする請求項98に記載
の薬学的組成物。 - 【請求項101】 請求項83に記載の方法に従って製造された前記生成物
ポリ不飽和脂肪酸と、請求項85に記載の方法に従って製造された前記別のポリ
不飽和脂肪酸と、請求項87に記載の方法に従って製造された前記最終ポリ不飽
和脂肪酸とから成る群から選択された少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む
動物飼料。 - 【請求項102】 前記生成物ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n
−3およびADAから成る群から選択されることを特徴とする請求項101に記
載の動物飼料。 - 【請求項103】 前記別のポリ不飽和脂肪酸が、AA、EPAおよびω6
−ドコサペンタエン酸から成る群から選択されることを特徴とする請求項101
に記載の動物飼料。 - 【請求項104】 前記最終ポリ不飽和脂肪酸が、DHA、アドレニン酸、
ω6−ドコサペンタエン酸およびω3−ドコサペンタエン酸から成る群から選択
されることを特徴とする請求項101に記載の栄養組成物。 - 【請求項105】 請求項83に記載の方法に従って製造された前記生成物
ポリ不飽和脂肪酸と、請求項85に記載の方法に従って製造された前記別のポリ
不飽和脂肪酸と、請求項87に記載の方法に従って製造された前記最終ポリ不飽
和脂肪酸とから成る群から選択されたポリ不飽和脂肪酸を含む化粧品。 - 【請求項106】 ポリ不飽和脂肪酸の摂取量の不足によって起こる状態を
防止または治療する方法であって、前記治療に有効な量の、請求項89に記載の
前記栄養組成物を前記患者に投与することを含む前記防止または治療方法。 - 【請求項107】 配列番号3(図43)に示されたヌクレオチド配列の少
なくとも約35%に一致するまたは相補的である単離ヌクレオチド配列。 - 【請求項108】 前記配列が配列番号3で表されることを特徴とする請求
項107に記載の単離ヌクレオチド配列。 - 【請求項109】 前記配列が、ポリ不飽和脂肪酸またはモノ不飽和脂肪酸
を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードすることを特徴とす
る請求項107または108に記載の単離ヌクレオチド配列。 - 【請求項110】 前記配列が哺乳類から誘導されることを特徴とする請求
項109に記載のヌクレオチド配列。 - 【請求項111】 前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項11
0に記載のヌクレオチド配列。 - 【請求項112】 請求項107または108記載の前記ヌクレオチド配列
によってコードされた精製タンパク質。 - 【請求項113】 ポリ不飽和脂肪酸またはモノ不飽和脂肪酸を伸張させる
精製ポリペプチドであり、かつ請求項112に記載の前記精製タンパク質のアミ
ノ酸配列と少なくとも約30%のアミノ酸類似性を有する精製ポリペプチド。 - 【請求項114】 a)配列番号3(図43)で表される前記ヌクレオチド
配列を単離する工程と、 b)i)プロモーター、およびii)該プロモーターに機能的に連結した前記単
離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程と、 c)前記エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件の下で、前記ベクター
を宿主細胞に導入する工程とを含むエロンガーゼ酵素の製造方法。 - 【請求項115】 前記宿主細胞が真核細胞または原核細胞から成る群から
選択されることを特徴とする請求項114に記載の方法。 - 【請求項116】 前記原核細胞が、E.coli、Cyanobacte
riaおよびB.subtilisから成る群から選択されることを特徴とする
請求項115に記載の方法。 - 【請求項117】 前記真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞お
よび真菌細胞から成る群から選択されることを特徴とする請求項115に記載の
方法。 - 【請求項118】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp
.、Candida spp.、Lipomyces starkey、Yar
rowia spp.、Kluyveromyces spp.、Hansen
ula spp.、Aspergillus spp.、Penicilliu
m spp.、Neurospora spp.、Trichoderma s
pp.およびPichia spp.から成る群から選択されることを特徴とす
る請求項117に記載の方法。 - 【請求項119】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp
.、Candida spp.、Hansenula spp.およびPich
ia spp.から成る群から選択された酵母菌細胞であることを特徴とする請
求項118に記載の方法。 - 【請求項120】 前記酵母菌細胞が、Saccharomyces ce
revisiaeであることを特徴とする請求項119に記載の方法。 - 【請求項121】 a)プロモーター、およびb)該プロモーターに機能的
に連結した配列番号3(図43)によって表されるヌクレオチド配列を含むベク
ター。 - 【請求項122】 請求項121に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項123】 前記宿主細胞が真核細胞または原核細胞から成る群から
選択されることを特徴とする請求項122に記載の宿主細胞。 - 【請求項124】 前記原核細胞が、E.coli、Cyanobacte
riaおよびB.subtilisから成る群から選択されることを特徴とする
請求項123に記載の宿主細胞。 - 【請求項125】 前記真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞お
よび真菌細胞を含む群から選択されることを特徴とする請求項123に記載の宿
主細胞。 - 【請求項126】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp
.、Candida spp.、Lipomyces starkey、Yar
rowia spp.、Kluyveromyces spp.、Hansen
ula spp.、Aspergillus spp.、Penicilliu
m spp.、Neurospora spp.、Trichoderma s
pp.およびPichia spp.から成る群から選択されることを特徴とす
る請求項125に記載の宿主細胞。 - 【請求項127】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp
.、Candida spp.、Hansenula spp.およびPich
ia spp.から成る群から選択された酵母菌細胞であることを特徴とする請
求項126に記載の宿主細胞。 - 【請求項128】 前記宿主細胞が、Saccharomyces cer
evisiaeであることを特徴とする請求項127に記載の宿主細胞。 - 【請求項129】 前記ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現が、前記植
物細胞、植物または植物組織によるモノ不飽和脂肪酸およびポリ不飽和脂肪酸か
ら成る群から選択された少なくとも一つの脂肪酸の生成をもたらすことを特徴と
する、請求項121に記載の前記ベクターを含む植物細胞、植物または植物組織
。 - 【請求項130】 前記ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n−3お
よびADAから成る群から選択されることを特徴とする請求項129に記載の植
物細胞、植物または植物組織。 - 【請求項131】 請求項130に記載の植物細胞、植物または植物組織に
よって発現される一つまたは複数の植物油または脂肪酸。 - 【請求項132】 請求項121に記載のベクターを含むトランスジェニッ
ク植物であって、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現が、前記トランス
ジェニック植物の種子中にポリ不飽和脂肪酸の生成をもたらすことを特徴とする
トランスジェニック植物。 - 【請求項133】 そのゲノムが、プロモーターに機能的に連結したエロン
ガーゼをコードするヒトDNA配列を含むヒト以外のトランスジェニック哺乳動
物。 - 【請求項134】 前記DNA配列が配列番号3(図43)によって表され
ることを特徴とする請求項133に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動
物。 - 【請求項135】 請求項134に記載の前記ヒト以外のトランスジェニッ
ク哺乳動物によって生成される体液であって、前記体液が、検出可能なレベルの
少なくとも一つのエロンガーゼまたはその生成物を含むことを特徴とする前記体
液。 - 【請求項136】 a)配列番号3(図43)で表される前記ヌクレオチド
配列を単離する工程と、 b)前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程と、 c)前記単離ヌクレオチド配列によってコードされたエロンガーゼ酵素の発現に
十分な時間および条件の下で、前記ベクターを宿主細胞に導入する工程と、 d)基質ポリ不飽和脂肪酸を生成物ポリ不飽和脂肪酸に変換するために、前記基
質に前記発現エロンガーゼ酵素を曝露する工程、とを含むポリ不飽和脂肪酸の製
造方法。 - 【請求項137】 前記基質ポリ不飽和脂肪酸が、GLA、STAおよびA
Aから成る群から選択されること、そして前記の生成物ポリ不飽和脂肪酸が、そ
れぞれDGLA、20:4n−3およびADAから成る群から選択されることを
特徴とする請求項136に記載の方法。 - 【請求項138】 前記の生成物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸
に変換するために、発現された前記の不飽和脂肪酸を少なくとも一つのデサチュ
ラーゼに曝露する工程をさらに含むことを特徴とする請求項136に記載の方法
。 - 【請求項139】 前記生成物ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n
−3およびADAから成る群から選択されること、そして別のポリ不飽和脂肪酸
が、それぞれAA、EPAおよびω6−ドコサペンタエン酸から成る群から選択
されること、そして少なくとも一つの前記デサチュラーゼが、AAまたはEPA
の生成に関してはΔ5−デサチュラーゼであり、ω6−ドコサペンタエン酸の生
成に関してはΔ4−デサチュラーゼであることを特徴とする請求項138に記載
の方法。 - 【請求項140】 前記別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変
換するために、前記別の不飽和ポリ脂肪酸を、少なくとも一つのエロンガーゼと
少なくとも一つの付加的なデサチュラーゼから成る群から選択された一つまたは
複数の酵素に曝露する工程をさらに含むことを特徴とする請求項138に記載の
方法。 - 【請求項141】 最終ポリ不飽和脂肪酸が、DHA、ADA、ω6−ドコ
サペンタエン酸およびω3−ドコサペンタエン酸から成る群から選択されること
ことを特徴とする請求項140に記載の方法。 - 【請求項142】 請求項136に記載の方法に従って製造された前記生成
物ポリ不飽和脂肪酸と、請求項138に記載の方法に従って製造された前記別の
ポリ不飽和脂肪酸と、請求項140に記載の方法に従って製造された前記最終ポ
リ不飽和脂肪酸とから成る群から選択された少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸
を含むことを特徴とする栄養組成物。 - 【請求項143】 前記生成物ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n
−3およびADAから成る群から選択されることを特徴とする請求項142に記
載の栄養組成物。 - 【請求項144】 前記別のポリ不飽和脂肪酸が、AA、EPAおよびω6
−ドコサペンタエン酸から成る群から選択されることを特徴とする請求項142
に記載の栄養組成物。 - 【請求項145】 前記最終ポリ不飽和脂肪酸が、DHA、AA、ω6−ド
コサペンタエン酸およびω3−ドコサペンタエン酸から成る群から選択されるこ
とを特徴とする請求項142に記載の栄養組成物。 - 【請求項146】 前記栄養組成物が、幼児用調合物、栄養補助食品および
食品代用物から成る群から選択されることを特徴とする請求項142に記載の栄
養組成物。 - 【請求項147】 前記栄養組成物がヒトまたは動物に投与されることを特
徴とする請求項146に記載の栄養組成物。 - 【請求項148】 前記栄養組成物が、経口的または非経口的に投与される
ことを特徴とする請求項147に記載の栄養組成物。 - 【請求項149】 前記栄養組成物が、ココナッツ油、大豆油、カノラ油、
モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、グルコース、食用ラクトース
、電気透析ホエー、電気透析スキムミルク、乳清、大豆タンパク、タンパク質加
水分解物、ヒマワリ油、サフラワー油、コーン油および亜麻油から成る群から選
択された少なくとも一つのマクロ栄養物をさらに含むことを特徴とする請求項1
43に記載の栄養組成物。 - 【請求項150】 ビタミンA、C、D、EおよびB複合体から成る群から
選択された少なくとも一つのビタミンと、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マ
ンガン、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレンおよび鉄か
ら成る群から選択された少なくとも一つのミネラルとをさらに含むことを特徴と
する請求項149に記載の栄養組成物。 - 【請求項151】 1)請求項136に記載の方法に従って製造された前記
生成物ポリ不飽和脂肪酸と、請求項138に記載の方法に従って製造された前記
別のポリ不飽和脂肪酸と、請求項140に記載の方法に従って製造された前記最
終ポリ不飽和脂肪酸とから成る群から選択された少なくとも一つのポリ不飽和脂
肪酸と、2)薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。 - 【請求項152】 前記薬学的組成物がヒトまたは動物に投与されることを
特徴とする請求項151に記載の薬学的組成物。 - 【請求項153】 前記薬学的組成物が、ビタミン、ミネラル、塩、炭水化
物、アミノ酸、遊離脂肪酸、保存料、賦形剤、抗ヒスタミン、成長因子、抗生物
質、希釈剤、リン脂質、酸化防止剤およびフェノール性化合物から成る群から選
択された少なくとも一つの要素をさらに含むことを特徴とする請求項151に記
載の薬学的組成物。 - 【請求項154】 請求項136に記載の方法に従って製造された前記生成
物ポリ不飽和脂肪酸と、請求項138に記載の方法に従って製造された前記別の
ポリ不飽和脂肪酸と、請求項140に記載の方法に従って製造された前記最終ポ
リ不飽和脂肪酸とから成る群から選択された少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸
を含む動物飼料。 - 【請求項155】 前記生成物ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n
−3およびADAから成る群から選択されることを特徴とする請求項154に記
載の動物飼料。 - 【請求項156】 前記別のポリ不飽和脂肪酸が、AA、EPAおよびω6
−ドコサペンタエン酸から成る群から選択されることを特徴とする請求項154
に記載の動物飼料。 - 【請求項157】 前記最終ポリ不飽和脂肪酸が、DHA、ADA、ω6−
ドコサペンタエン酸およびω3−ドコサペンタエン酸から成る群から選択される
ことを特徴とする請求項154に記載の栄養組成物。 - 【請求項158】 請求項136に記載の方法に従って製造された前記生成
物ポリ不飽和脂肪酸と、請求項138に記載の方法に従って製造された前記別の
ポリ不飽和脂肪酸と、請求項140に記載の方法に従って製造された前記最終ポ
リ不飽和脂肪酸とから成る群から選択されたポリ不飽和脂肪酸を含む化粧品。 - 【請求項159】 ポリ不飽和脂肪酸の摂取量の不足によって起こる状態を
防止または治療する方法であって、前記治療に有効な量の、請求項142に記載
の前記栄養物を前記患者に投与することを含む前記防止または治療方法。 - 【請求項160】 配列番号4(図46)に示されたヌクレオチド配列の少
なくとも約35%に一致するまたは相補的である単離ヌクレオチド配列。 - 【請求項161】 前記配列が配列番号4で表されることを特徴とする請求
項160に記載の単離ヌクレオチド配列。 - 【請求項162】 前記配列が、ポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機
能的に活性なエロンガーゼをコードすることを特徴とする請求項160または1
61に記載の単離ヌクレオチド配列。 - 【請求項163】 前記配列がCaenorhabditis属の線虫(n
ematode)から誘導されることを特徴とする請求項162に記載のヌクレ
オチド配列。 - 【請求項164】 前記線虫がelegans種であることを特徴とする請
求項163に記載のヌクレオチド配列。 - 【請求項165】 請求項160または161記載の前記ヌクレオチド配列
によってコードされた精製タンパク質。 - 【請求項166】 ポリ不飽和脂肪酸を伸張させる精製ポリペプチドであり
、かつ請求項165に記載の前記精製タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約
30%のアミノ酸類似性を有する精製ポリペプチド。 - 【請求項167】 a)配列番号4(図46)で表される前記ヌクレオチド
配列を単離する工程と、 b)i)プロモーター、およびii)該プロモーターに機能的に連結した前記単
離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程と、 c)前記エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件の下で、前記ベクター
を宿主細胞に導入する工程とを含むエロンガーゼ酵素の製造方法。 - 【請求項168】 前記宿主細胞が真核細胞または原核細胞から成る群から
選択されることを特徴とする請求項167に記載の方法。 - 【請求項169】 前記原核細胞が、E.coli、Cyanobacte
riaおよびB.subtilisから成る群から選択されることを特徴とする
請求項168に記載の方法。 - 【請求項170】 前記真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞お
よび真菌細胞から成る群から選択されることを特徴とする請求項168に記載の
方法。 - 【請求項171】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp
.、Candida spp.、Lipomyces starkey、Yar
rowia spp.、Kluyveromyces spp.、Hansen
ula spp.、Aspergillus spp.、Penicilliu
m spp.、Neurospora spp.、Trichoderma s
pp.およびPichia spp.から成る群から選択されることを特徴とす
る請求項170に記載の方法。 - 【請求項172】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp
.、Candida spp.、Hansenula spp.およびPich
ia spp.から成る群から選択された酵母菌細胞であることを特徴とする請
求項171に記載の方法。 - 【請求項173】 前記酵母菌細胞が、Saccharomyces ce
revisiaeであることを特徴とする請求項172に記載の方法。 - 【請求項174】 a)プロモーター、およびb)該プロモーターに機能的
に連結した配列番号4(図46)によって表されるヌクレオチド配列を含むベク
ター。 - 【請求項175】 請求項174に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項176】 前記宿主細胞が真核細胞または原核細胞から成る群から
選択されることを特徴とする請求項175に記載の宿主細胞。 - 【請求項177】 前記原核細胞が、E.coli、Cyanobacte
riaおよびB.subtilisから成る群から選択されることを特徴とする
請求項176に記載の宿主細胞。 - 【請求項178】 前記真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞お
よび真菌細胞を含む群から選択されることを特徴とする請求項176に記載の宿
主細胞。 - 【請求項179】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp
.、Candida spp.、Lipomyces starkey、Yar
rowia spp.、Kluyveromyces spp.、Hansen
ula spp.、Aspergillus spp.、Penicilliu
m spp.、Neurospora spp.、Trichoderma s
pp.およびPichia spp.から成る群から選択されることを特徴とす
る請求項178に記載の宿主細胞。 - 【請求項180】 前記真菌細胞が、Saccharomyces spp
.、Candida spp.、Hansenula spp.およびPich
ia spp.から成る群から選択された酵母菌細胞であることを特徴とする請
求項179に記載の宿主細胞。 - 【請求項181】 前記宿主細胞が、Saccharomyces cer
evisiaeであることを特徴とする請求項1180に記載の宿主細胞。 - 【請求項182】 前記ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現が、前記植
物細胞、植物または植物組織によるポリ不飽和脂肪酸の生成をもたらすことを特
徴とする、請求項174に記載の前記ベクターを含む植物細胞、植物または植物
組織。 - 【請求項183】 前記ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n−3お
よびADAから成る群から選択されることを特徴とする請求項182に記載の植
物細胞、植物または植物組織。 - 【請求項184】 請求項182に記載の植物細胞、植物または植物組織に
よって発現される一つまたは複数の植物油または脂肪酸。 - 【請求項185】 請求項174に記載のベクターを含むトランスジェニッ
ク植物であって、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現が、前記トランス
ジェニック植物の種子中にポリ不飽和脂肪酸の生成をもたらすことを特徴とする
トランスジェニック植物。 - 【請求項186】 そのゲノムが、プロモーターに機能的に連結したエロン
ガーゼをコードする、C.elegansからのDNA配列を含むヒト以外のト
ランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項187】 前記DNA配列が配列番号4(図46)によって表され
ることを特徴とする請求項186に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動
物。 - 【請求項188】 請求項187に記載の前記ヒト以外のトランスジェニッ
ク哺乳動物によって生成される体液であって、前記体液が、検出可能なレベルの
少なくとも一つのエロンガーゼまたはその生成物を含むことを特徴とする前記体
液。 - 【請求項189】 a)配列番号4(図46)で表される前記ヌクレオチド
配列を単離する工程と、 b)前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程と、 c)前記単離ヌクレオチド配列によってコードされたエロンガーゼ酵素の発現に
十分な時間および条件の下で、前記ベクターを宿主細胞に導入する工程と、 d)基質ポリ不飽和脂肪酸を生成物ポリ不飽和脂肪酸に変換するために、前記基
質に前記発現エロンガーゼ酵素を曝露する工程、とを含むポリ不飽和脂肪酸の製
造方法。 - 【請求項190】 前記基質ポリ不飽和脂肪酸が、GLA、STAおよびA
Aから成る群から選択されること、そして前記の生成物ポリ不飽和脂肪酸が、そ
れぞれDGLA、20:4n−3およびADAから成る群から選択されることを
特徴とする請求項189に記載の方法。 - 【請求項191】 前記の生成物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸
に変換するために、前記の発現されたエロンガーゼ酵素を少なくとも一つのデサ
チュラーゼに曝露する工程をさらに含むことを特徴とする請求項189に記載の
方法。 - 【請求項192】 前記生成物ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n
−3およびADAから成る群から選択されること、そして別のポリ不飽和脂肪酸
が、それぞれAA、EPAおよびω6−ドコサペンタエン酸から成る群から選択
されること、そして少なくとも一つの前記デサチュラーゼが、AAまたはEPA
の生成に関してはΔ5−デサチュラーゼであり、ω6−ドコサペンタエン酸の生
成に関してはΔ4−デサチュラーゼであることを特徴とする請求項191に記載
の方法。 - 【請求項193】 前記別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変
換するために、前記別の不飽和ポリ脂肪酸を、少なくとも一つのエロンガーゼと
少なくとも一つの付加的なデサチュラーゼから成る群から選択された一つまたは
複数の酵素に曝露する工程をさらに含むことを特徴とする請求項192に記載の
方法。 - 【請求項194】 最終ポリ不飽和脂肪酸が、DHA、ADA、ω6−ドコ
サペンタエン酸およびω3−ドコサペンタエン酸から成る群から選択されること
ことを特徴とする請求項193に記載の方法。 - 【請求項195】 請求項189に記載の方法に従って製造された前記生成
物ポリ不飽和脂肪酸と、請求項191に記載の方法に従って製造された前記別の
ポリ不飽和脂肪酸と、請求項193に記載の方法に従って製造された前記最終ポ
リ不飽和脂肪酸とから成る群から選択された少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸
を含むことを特徴とする栄養組成物。 - 【請求項196】 前記生成物ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n
−3およびADAから成る群から選択されることを特徴とする請求項195に記
載の栄養組成物。 - 【請求項197】 前記別のポリ不飽和脂肪酸が、AA、EPAおよびω6
−ドコサペンタエン酸から成る群から選択されることを特徴とする請求項195
に記載の栄養組成物。 - 【請求項198】 前記最終ポリ不飽和脂肪酸が、DHA、AA、ω6−ド
コサペンタエン酸およびω3−ドコサペンタエン酸から成る群から選択されるこ
とを特徴とする請求項195に記載の栄養組成物。 - 【請求項199】 前記栄養組成物が、幼児用調合物、栄養補助食品および
食品代用物から成る群から選択されることを特徴とする請求項195に記載の栄
養組成物。 - 【請求項200】 前記栄養組成物がヒトまたは動物に投与されることを特
徴とする請求項199に記載の栄養組成物。 - 【請求項201】 前記栄養組成物が、経口的または非経口的に投与される
ことを特徴とする請求項200に記載の栄養組成物。 - 【請求項202】 前記栄養組成物が、ココナッツ油、大豆油、カノラ油、
モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、グルコース、食用ラクトース
、電気透析ホエー、電気透析スキムミルク、乳清、大豆タンパク、タンパク質加
水分解物、ヒマワリ油、サフラワー油、コーン油および亜麻油から成る群から選
択された少なくとも一つのマクロ栄養物をさらに含むことを特徴とする請求項1
99に記載の栄養組成物。 - 【請求項203】 ビタミンA、C、D、EおよびB複合体から成る群から
選択された少なくとも一つのビタミンと、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マ
ンガン、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレンおよび鉄か
ら成る群から選択された少なくとも一つのミネラルとをさらに含むことを特徴と
する請求項202に記載の栄養組成物。 - 【請求項204】 1)請求項189に記載の方法に従って製造された前記
生成物ポリ不飽和脂肪酸と、請求項191に記載の方法に従って製造された前記
別のポリ不飽和脂肪酸と、請求項193に記載の方法に従って製造された前記最
終ポリ不飽和脂肪酸とから成る群から選択された少なくとも一つのポリ不飽和脂
肪酸と、2)薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。 - 【請求項205】 前記薬学的組成物がヒトまたは動物に投与されることを
特徴とする請求項204に記載の薬学的組成物。 - 【請求項206】 前記薬学的組成物が、ビタミン、ミネラル、塩、炭水化
物、アミノ酸、遊離脂肪酸、保存料、賦形剤、抗ヒスタミン、成長因子、抗生物
質、希釈剤、リン脂質、酸化防止剤およびフェノール性化合物から成る群から選
択された少なくとも一つの要素をさらに含むことを特徴とする請求項203に記
載の薬学的組成物。 - 【請求項207】 請求項189に記載の方法に従って製造された前記生成
物ポリ不飽和脂肪酸と、請求項191に記載の方法に従って製造された前記別の
ポリ不飽和脂肪酸と、請求項193に記載の方法に従って製造された前記最終ポ
リ不飽和脂肪酸とから成る群から選択された少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸
を含む動物飼料。 - 【請求項208】 前記生成物ポリ不飽和脂肪酸が、DGLA、20:4n
−3およびADAから成る群から選択されることを特徴とする請求項207に記
載の動物飼料。 - 【請求項209】 前記別のポリ不飽和脂肪酸が、AA、EPAおよびω6
−ドコサペンタエン酸から成る群から選択されることを特徴とする請求項207
に記載の動物飼料。 - 【請求項210】 前記最終ポリ不飽和脂肪酸が、DHA、ADA、ω6−
ドコサペンタエン酸およびω3−ドコサペンタエン酸から成る群から選択される
ことを特徴とする請求項207に記載の栄養組成物。 - 【請求項211】 請求項189に記載の方法に従って製造された前記生成
物ポリ不飽和脂肪酸と、請求項191に記載の方法に従って製造された前記別の
ポリ不飽和脂肪酸と、請求項193に記載の方法に従って製造された前記最終ポ
リ不飽和脂肪酸とから成る群から選択されたポリ不飽和脂肪酸を含む化粧品。 - 【請求項212】 ポリ不飽和脂肪酸の摂取量の不足によって起こる状態を
防止または治療する方法であって、前記防止または治療に有効な量の、請求項1
95に記載の前記栄養物を前記患者に投与することを含む前記防止または治療方
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