CN113785201A

CN113785201A - 用于检测镍纹蛋白-β活性的方法

Info

Publication number: CN113785201A
Application number: CN202080026266.7A
Authority: CN
Inventors: G·A·博尼; M·H·鲁伊斯; D·M·苏珀
Original assignee: Biolegend Inc
Current assignee: Biolegend Inc
Priority date: 2019-02-08
Filing date: 2020-02-05
Publication date: 2021-12-10
Also published as: EP3921651A2; US20220034906A1; WO2020163469A9; WO2020163469A3; WO2020163469A2

Abstract

本技术部分地涉及用于检测镍纹蛋白‑β及其修饰形式的活性的方法。

Description

用于检测镍纹蛋白-β活性的方法

相关专利申请

本专利申请要求名为Gerardo Arrevillaga BONI等人作为发明人于2019年2月8日提交的标题为METHODS FOR DETECTING METEORIN-BETA ACTIVITY的美国临时专利申请No.62/803,047的权益，并由代理人案卷号BLD-2002-PV指定。前述申请的全部内容以引用方式并入本文，包括所有文本、表格和附图。

技术领域

本技术部分地涉及用于检测镍纹蛋白-β及其修饰形式的活性的方法。

背景技术

细胞因子是参与免疫应答、宿主防御、炎症和免疫系统发育的小分泌蛋白。细胞因子通常通过结合靶细胞膜上的特异性受体来发挥其效应。细胞因子的实例包括白介素、趋化因子、干扰素和肿瘤坏死因子超家族的成员。某些细胞因子涉及自身免疫疾病、癌症和其他小病；并且可用于免疫疗法。

镍纹蛋白-β(meteorin-β)通常被认为是巨噬细胞相关的细胞因子，并且可用于某些研究应用(例如，研究某些疾病的发病机制；研究免疫细胞活化和分化)、诊断和/或某些类型的免疫疗法。本文提供了用于检测镍纹蛋白-β(例如，重组镍纹蛋白-β及其修饰形式)的活性的方法。

发明内容

在一些方面，本文提供了用于评估镍纹蛋白-β多肽的活性的方法，该方法包括：a)使细胞与包含共刺激剂的第一组合物以及包含镍纹蛋白-β多肽的第二组合物接触；b)测量细胞的选自CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、IL-6和IL-1RA的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生，从而测量细胞因子产生；以及c)根据(b)中测量的细胞因子产生来检测第二组合物中的镍纹蛋白-β多肽的活性。

在一些方面，本文还提供了用于鉴定细胞是否表达或者能够表达镍纹蛋白-β受体的方法，该方法包括：a)使细胞与包含刺激剂的第一组合物接触；b)在结合条件下使细胞与包含镍纹蛋白-β多肽的第二组合物接触；c)检测结合至细胞的镍纹蛋白-β多肽的存在、不存在和/或量；以及d)根据(c)中检测的镍纹蛋白-β多肽的存在、不存在和/或量，鉴定细胞是否表达或者能够表达镍纹蛋白-β受体。

在一些方面，本文还提供了试剂盒，该试剂盒包含：a)第一组合物，该第一组合物包含一种或多种选自IFN-γ、IL-4、IL-10和TGFβ多肽的共刺激剂；b)一种或多种用于测量细胞因子和/或趋化因子产生的组分，其中细胞因子和/或趋化因子选自CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、IL-6和IL-1RA中的一种或多种；以及c)使用说明书。

在以下具体实施方式、实施例、权利要求和附图中进一步描述了某些实施方式。

附图说明

附图示出了本技术的某些实施方式并且不是限制性的。为了清楚和便于说明，附图未按比例绘制，并且在一些情况下，各种方面可以夸大或放大地示出，以利于理解具体实施方式。

图1示出了在镍纹蛋白-β刺激(上图)以及IFN-γ和镍纹蛋白-β共刺激(下图)下THP-1细胞产生的CCL2。

图2示出了在IFN-γ和镍纹蛋白-β共刺激下THP-1细胞产生的CXCL10(上图)、IL1RA(中图)和IL-6(下图)。

图3A示出了对照与镍纹蛋白-β处理的细胞之间的比较差异。第一列表明了对照与镍纹蛋白-β处理的细胞之间针对不同细胞因子的相对比较差异，并且第二列表明了一般活性。除了第三列中示出的样品数据(未经处理的vs.镍纹蛋白-β)之外，所有样品均用1μg/ml的IFN-γ共处理。第四列示出了对照vs.6XHis肽(用作内部对照)的处理比较。第五列、第六列和第七列分别比较了用IFN-γ以及IFN-γ加上1μg/ml、2μg/ml或2.5μg/ml的镍纹蛋白-β共刺激的细胞。数据使用LEGENDplex^TM(BioLegend)获得。(-)没有差异，(+)相对于对照增加小于50％，(++)相对于对照增加超过50％，(+++)相对于对照增加超过100％。

图3B示出了仅用细胞因子(例如，IFN-γ、TGFβ、IL-4和IL-10)活化的细胞与用细胞因子活化且用镍纹蛋白-β共处理的细胞之间的比较差异。表明了第一列中列出的几种趋化因子的相对比较差异。第二列表明了每种趋化因子的一般活性的描述。样品不处理，仅用2.5μg/mL镍纹蛋白-β处理，仅用1μg/mL细胞因子处理，或者用1μg/mL细胞因子和2.5μg/mL镍纹蛋白-β共处理。数据使用LEGENDplex^TM(BioLegend)获得。(＝)表示没有差异，(--)表示相对于对照减少小于50％，(+++)相对于对照增加超过100％。

图4A示出了通过人重组镍纹蛋白-β-6XHis(hrMetrnβ-6XHis)与预先经IFN-γ(250ng)处理的THP-1细胞中的镍纹蛋白-β受体结合的能力所测量的IFN-γ对镍纹蛋白-β受体的诱导。使用抗6xHis抗体来定量配体-受体相互作用。通过流式细胞术获得数据。

图4B和4C示出了通过人重组镍纹蛋白-β-6xHis(hrMetrnβ-6xHis)与预先经不同细胞因子(250ng)处理的THP-1细胞中的镍纹蛋白-β受体结合的能力所测量的IL-10、IL-4和TGFβ对镍纹蛋白-β受体的诱导。使用抗6xHis抗体来定量配体-受体相互作用。通过流式细胞术获得数据。

图5示出了检测靶细胞中的镍纹蛋白-β受体的一般策略的示意图。

具体实施方式

镍纹蛋白-β可用于某些研究应用、诊断和/或免疫疗法。因此，用于评估镍纹蛋白-β、重组镍纹蛋白-β、镍纹蛋白-β变体、镍纹蛋白-β片段以及镍纹蛋白-β的其他修饰形式的活性的生物测定对于开发镍纹蛋白-β的实际应用是有用的。本文提供了用于评估镍纹蛋白-β的活性的方法。本文还提供了鉴定细胞是否表达或者能够表达镍纹蛋白-β受体的方法。

镍纹蛋白-β

本文提供了用于评估镍纹蛋白-β多肽的活性的方法。本文还提供了鉴定细胞是否表达或者能够表达镍纹蛋白-β受体的方法。镍纹蛋白-β可称为镍纹蛋白β、镍纹蛋白-beta、镍纹蛋白-b、Metrn-β、Metrnβ、镍纹蛋白样、镍纹蛋白神经胶质细胞分化调节因子样因子、镍纹蛋白样蛋白、METRNL、MGC99788、Subfatin、Cometin、白介素41(IL-41)或白介素39(IL-39)，是一种与镍纹蛋白(人体中)具有58％相似性的311个氨基酸(aa)的蛋白质。成熟人镍纹蛋白-β与小鼠和大鼠镍纹蛋白-β分别共享79％和80％的aa序列同一性。选择性剪接生成额外的同种型，其缺乏N-末端82个氨基酸，包括信号肽。镍纹蛋白-β在某些成体小鼠组织中表达，其中在肌肉组织、脂肪组织和活化单核细胞中表达最高。镍纹蛋白-β的表达可以在运动后的肌肉中和冷暴露时的脂肪组织中诱导。镍纹蛋白-β可能具有神经营养活性，因为其在体内增强神经突增生和成神经细胞迁移。镍纹蛋白-β也可间接地参与白色脂肪“褐变”为更生热的“米色脂肪”。

人镍纹蛋白-β核酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:2(GENBANK登录号NM_001004431.3)，并且人镍纹蛋白-β氨基酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NP_001004431.1)。小鼠镍纹蛋白-β核酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:4(GENBANK登录号NM_144797.3)，并且小鼠镍纹蛋白-β氨基酸序列的实例在本文提供为SEQID NO:3(GENBANK登录号NP_659046.1)。

镍纹蛋白-β多肽可指前体镍纹蛋白-β多肽(包括信号肽)或成熟镍纹蛋白-β多肽(不包括信号肽)。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽是前体镍纹蛋白-β多肽(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-311的前体人镍纹蛋白-β多肽；包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-311的前体小鼠镍纹蛋白-β多肽)。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽是成熟镍纹蛋白-β多肽(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸46-311的成熟人镍纹蛋白-β多肽；包含SEQ ID NO:3的氨基酸46-311的成熟小鼠镍纹蛋白-β多肽)。

在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽是重组镍纹蛋白-β多肽。重组镍纹蛋白-β多肽通常是由已克隆到支持DNA表达和信使RNA翻译的载体或系统中的DNA(即镍纹蛋白-β核酸序列)编码的镍纹蛋白-β多肽。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽是重组人镍纹蛋白-β多肽(rh-镍纹蛋白-β)。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽是重组小鼠镍纹蛋白-β多肽(rm-镍纹蛋白-β)。

本文中的镍纹蛋白-β多肽可指未经修饰的镍纹蛋白-β多肽。未经修饰的多肽通常是指天然或野生型全长(前体或成熟)多肽，其没有氨基酸取代、没有插入、没有缺失、没有化学修饰、没有氨基酸侧链修饰、没有标签、没有可检测标记、没有融合等。

本文中的镍纹蛋白-β多肽可指修饰镍纹蛋白-β多肽。修饰多肽通常是指包含一个或多个氨基酸取代、一个或多个插入、一个或多个缺失、一种或多种化学修饰、一个或多个氨基酸侧链修饰、一个或多个标签、一个或多个可检测标记、一个或多个融合等，以及它们的组合的多肽。修饰可以包括例如添加一个或多个荧光团、糖基化、异戊二烯化、聚乙二醇化、连接至固体表面、生物素化、抗体缀合、与治疗剂缀合、半胱氨酸处的化学修饰(例如，氨乙基化、碘乙酰胺、马来酰亚胺、Dha形成、二硫化物形成、Dha与硫醇的反应，以及二硫化物的脱硫)、引入一个或多个非天然氨基酸等，以及它们的组合。

在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽是指镍纹蛋白-β变体或突变体。此类变体包括例如镍纹蛋白-β多肽的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。镍纹蛋白-β变体可包括缺失、插入和取代的任何组合。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽包含一个或多个氨基酸取代。这些变体具有从镍纹蛋白-β多肽移除的至少一个氨基酸残基以及在其位置中插入的不同残基。例如，镍纹蛋白-β变体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸取代。镍纹蛋白-β变体可包括保守取代和/或非保守取代，并且可以使用本文所述的用于评估镍纹蛋白-β活性的一种或多种生物测定来筛选变体。取代的实例在以下列出：

氨基酸残基取代实例

Ala(A) val；leu；ile；val

Arg(R) lys；gln；asn；lys

Asn(N) gln；his；asp；lys；gln；arg

Asp(D) glu；asn

Cys(C) ser；ala

Gln(Q) asn；glu

Glu(E) asp；gln

Gly(G) ala

His(H) asn；gln；lys；arg

Ile(I) leu；val；met；ala；leu；phe；正亮氨酸

Leu(L) 正亮氨酸；ile；val；ile；met；ala；phe

Lys(K) arg；gln；asn

Met(M) leu；phe；ile

Phe(F) leu；val；ile；ala；tyr

Pro(P) ala

Ser(S) thr

Thr(T) ser

Trp(W) tyr；phe

Tyr(Y) trp；phe；thr；ser

Val(V) ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸

对镍纹蛋白-β多肽的生物学特性的实质性修饰可以通过选择在维持以下方面的效果上有显著差异的取代来实现：(a)多肽骨架在取代区域中的结构，例如作为折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，和/或(c)侧链的体积。天然存在的残基基于共同的侧链特性被划分为以下组：

(1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；

(2)中性亲水性：cys，ser，thr；

(3)酸性：asp，glu；

(4)碱性：asn，gln，his，lys，arg；

(5)影响链取向的残基：gly，pro；以及

(6)芳族：trp，tyr，phe。

非保守取代通常需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。

在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽包含一个或多个插入。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽包含一个或多个插入，其中每个插入包含一个或多个氨基酸。例如，每个插入可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个插入的氨基酸。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽包含一个或多个缺失。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽包含一个或多个缺失，其中每个缺失从全长氨基酸序列移除一个或多个氨基酸。例如，每个缺失可移除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。

在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽包含融合多肽。融合多肽可称为融合蛋白或嵌合蛋白。融合多肽通常通过连接两个或多个编码独立蛋白质的基因而产生。该融合构建体的翻译可以导致具有衍生自各原始蛋白的功能特性的单个或多个多肽。重组融合蛋白可以通过用于生物学研究或疗法的重组DNA技术人工产生。融合多肽的实例包括与荧光蛋白标签(例如绿色荧光蛋白(GFP))、治疗性蛋白(例如抗体)，或本文所述的任何蛋白标签融合的镍纹蛋白-β。在一些实施方式中，融合多肽包含接头(例如，柔性接头、刚性接头、可剪切接头)。

在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽包含一种或多种标签(例如，一种或多种氨基酸或肽标签；一种或多种亲和标签)。标签可有利于镍纹蛋白-β多肽的检测、分离和/或纯化。标签有时特异性地结合例如固相或可检测标记的分子或部分，从而具有分离、纯化和/或检测镍纹蛋白-β多肽的实用性。在一些实施方式中，标签包括以下元件中的一种或多种：Fc(衍生自免疫球蛋白Fc结构域)、FLAG(例如DYKDDDDKG)、V5(例如GKPIPNPLLGLDST)、c-MYC(例如EQKLISEEDL)、HSV(例如QPELAPEDPED)、流感病毒血凝素HA(例如YPYDVPDYA)、VSV-G(例如YTDIEMNRLGK)、细菌谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、链霉亲和素-或亲和素-结合标签(例如pcDNA^TM6 BioEase^TM

Biotinylation System(Invitrogen))、硫氧还原蛋白、β-半乳醣苷酶、VSV-糖蛋白、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白或其多种颜色变体之一(例如，黄色、红色、蓝色))、聚赖氨酸或聚精氨酸序列、聚组氨酸序列(例如His6、6XHis)或其他螯合金属(例如，钴、锌、铜)的序列，和/或与含砷分子结合的富含半胱氨酸的序列。在某些实施方式中，富含半胱氨酸的标签包含氨基酸序列CC-Xn-CC，其中X是任何氨基酸并且n是1至3，并且富含半胱氨酸的序列有时是CCPGCC。在某些实施方式中，标签包括富含半胱氨酸的元件和聚组氨酸元件(例如CCPGCC和His6)。

标签可以与结合配偶体结合。例如，一些标签与抗体(例如FLAG)结合，并且有时与小分子特异性结合。例如，聚组氨酸标签特异性地螯合二价金属，如铜、锌和钴；聚赖氨酸或聚精氨酸标签与锌指特异性结合；谷胱甘肽S-转移酶标签与谷胱甘肽结合；并且富含半胱氨酸的标签与含砷分子特异性结合。含砷分子包括LUMIO^TM试剂(Invitrogen,California)，如FlAsH^TM(EDT2[4',5'-双(1,3,2-二硫砷烷-2-基)荧光素-(1,2-乙二硫醇)2])和ReAsH试剂。此类抗体和小分子有时与固相连接以用于分离靶蛋白或靶肽。

在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽包含一个或多个可检测标记物或标记。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽与可检测标记物或标记缀合。例如，对于研究和诊断应用，修饰镍纹蛋白-β多肽可以用可检测部分标记。许多标记是可用的，其通常包括放射性同位素(例如³⁵S、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I)、荧光标记(例如，稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白、Texas Red和Brilliant Violet^TM)，以及酶底物标记(例如，描述于美国专利No.4,275,149中，其以引用方式并入本文，荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素；美国专利No.4,737,456，其以引用方式并入本文)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等)。

在某些情况下，标记间接缀合至镍纹蛋白-β多肽。例如，镍纹蛋白-β多肽可以与生物素缀合，并且上述任何合适的标记可以与亲和素缀合，或反之亦然。生物素选择性地结合亲和素，标记能够以该间接方式与镍纹蛋白-β多肽缀合。或者，为了实现标记与镍纹蛋白-β多肽的间接缀合，使镍纹蛋白-β多肽与小半抗原(例如地高辛)缀合，并且使上述标记类型之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)缀合。

在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽是指镍纹蛋白-β多肽的片段。通常，镍纹蛋白-β片段包含比全长成熟镍纹蛋白-β更少的氨基酸。例如，镍纹蛋白-β片段可包括成熟人镍纹蛋白-β多肽的一部分(即，SEQ ID NO:1的氨基酸46-311的一部分)，或成熟小鼠镍纹蛋白-β多肽的一部分(即，SEQ ID NO:3的氨基酸46-311的一部分)。全长成熟人镍纹蛋白-β的长度为266个氨基酸。因此，人镍纹蛋白-β的片段的长度可为265个氨基酸或更短。全长成熟小鼠镍纹蛋白-β的长度为266个氨基酸。因此，小鼠镍纹蛋白-β的片段的长度可为265个氨基酸或更短。

在一些实施方式中，镍纹蛋白-β多肽是指镍纹蛋白-β多肽的功能片段。本文提供了用于评估镍纹蛋白-β多肽以及镍纹蛋白-β的功能片段的活性的方法。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β的功能片段是表现出全长成熟镍纹蛋白-β的至少50％活性的片段。例如，镍纹蛋白-β的功能片段是表现出全长成熟镍纹蛋白-β的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高活性的片段。

在一些实施方式中，将镍纹蛋白-β多肽固定到固体载体或基底上。在一些实施方式中，将镍纹蛋白-β多肽非扩散地固定到固体载体上(例如，镍纹蛋白-β多肽不从固体载体脱离)。固体载体或基底可以是镍纹蛋白-β多肽可直接或间接地附着于其上的任何物理上可分离的固体，包括但不限于由微阵列和孔提供的表面，以及粒子如珠(例如，顺磁珠、磁珠、微珠、纳米珠)、微粒和纳米粒子。固体载体也可包括例如芯片、柱、光纤、擦拭物、过滤器(例如平面过滤器)、一根或多根毛细管、玻璃以及改性或官能化玻璃(例如可控孔度玻璃(CPG))、石英、云母、重氮化膜(纸或尼龙)、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、纸、陶瓷、金属、准金属、半导电材料、量子点、包被的珠或粒子、其他色谱材料、磁性粒子；塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯或其他材料的共聚物、聚丁烯、聚氨酯、TEFLON^TM、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、聚偏二氟乙烯(PVDF)等)、多糖、尼龙或硝化纤维、树脂、硅石或基于硅石的材料(包括硅、硅胶和改性硅)、

碳、金属(例如钢、金、银、铝、硅和铜)、无机玻璃、导电聚合物(包括聚合物如聚吡咯和聚吲哚)；微米或纳米结构表面，如核酸瓦片阵列、纳米管、纳米线或纳米粒子装饰表面；或多孔表面或凝胶，如甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、糖聚合物、纤维素、硅酸盐，或其他纤维或链聚合物。在一些实施方式中，固体载体或基底可以使用被动或化学衍生的涂层用任何数量的材料(包括聚合物，如葡聚糖、丙烯酰胺、明胶或琼脂糖)涂覆。珠和/或粒子可以是游离的或彼此结合的(例如烧结的)。在一些实施方式中，固体载体或基底可以是粒子的集合。在一些实施方式中，粒子可包含硅石，并且硅石可包括二氧化硅。在一些实施方式中，硅石可以是多孔的，并且在某些实施方式中，硅石可以是无孔的。在一些实施方式中，粒子还包含赋予粒子顺磁性的物质。在某些实施方式中，该物质包括金属，并且在某些实施方式中，该物质是金属氧化物(例如，铁或铁氧化物，其中铁氧化物含有Fe²⁺和Fe³⁺的混合物)。镍纹蛋白-β多肽可以通过共价键或通过非共价相互作用连接至固体载体，并且可以直接或间接地(例如，经由中间物质如间隔分子或生物素)连接至固体载体。

刺激剂和共刺激剂

本文提供的某些方法包括使用刺激剂或共刺激剂。刺激剂和共刺激剂的用途可以包括在例如评估镍纹蛋白-β多肽的活性的方法中，和/或鉴定细胞是否表达或者能够表达镍纹蛋白-β受体的方法中。刺激剂可以在某些情况下使用(例如，在暴露于镍纹蛋白-β之前刺激细胞)。共刺激剂可以在某些情况下使用(例如，在镍纹蛋白-β暴露期间共刺激细胞)。在一些实施方式中，使细胞或细胞群与刺激剂/共刺激剂接触。在一些实施方式中，使细胞或细胞群与刺激剂/共刺激剂和镍纹蛋白-β多肽同时接触。在一些实施方式中，使细胞或细胞群与刺激剂/共刺激剂接触，然后与镍纹蛋白-β多肽接触。

在某些情况下，刺激剂/共刺激剂可加强或增强镍纹蛋白-β对细胞或细胞群的效应。例如，刺激剂/共刺激剂可以增强响应于镍纹蛋白-β刺激的某些细胞因子和/或趋化因子的产生。刺激剂和共刺激剂也可上调镍纹蛋白-β受体表达。在某些情况下，当与镍纹蛋白-β组合时，刺激剂/共刺激剂可以提供协同增强。例如，刺激剂/共刺激剂可以协同地增强响应于镍纹蛋白-β刺激的某些细胞因子和/或趋化因子的产生。由刺激剂或共刺激剂提供的增强可以是累加的、倍增的或指数的。

任何合适的刺激剂/共刺激剂可以与本文所提供的方法结合使用。在一些实施方式中，刺激剂/共刺激剂包括可溶性/分泌性蛋白。在一些实施方式中，刺激剂/共刺激剂包括细胞因子。在一些实施方式中，刺激剂/共刺激剂包括趋化因子。刺激剂/共刺激剂的非限制性实例包括干扰素-γ(IFN-γ)、脂多糖(LPS)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)、白介素13(IL-13)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、感染(例如真菌感染、蠕虫感染)、免疫复合物、白介素-1受体(IL-1R)、白介素10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)、糖皮质素、白介素6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、腺苷、补体成分和白介素32(IL-32)。在一些实施方式中，刺激剂/共刺激剂包括IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β中的一种或多种。

IFN-γ

本文提供的某些方法包括使用干扰素-γ(IFN-γ)作为刺激剂或共刺激剂。干扰素-γ(也称为IFN-γ、IFNγ、IFN-g、IFNg、IFN-gamma、干扰素γ、免疫干扰素、II型干扰素)是二聚化可溶性细胞因子和II型类别的干扰素。IFN-γ通常涉及针对某些病毒、细菌和原生动物感染的先天和适应性免疫。IFN-γ可用作巨噬细胞的激活剂以及II类主要组织相容性复合体(MHC)分子表达的诱导剂。IFN-γ可直接抑制病毒复制，并可提供免疫刺激和免疫调节效应。异常的IFN-γ表达通常与许多自身炎症性疾病和自身免疫疾病相关。IFN-γ通常由以下产生：自然杀伤(NK)和自然杀伤T(NKT)细胞，作为先天性免疫应答的一部分；CD4Th1和CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应T细胞，一旦抗原特异性免疫发展；以及非细胞毒性先天淋巴细胞(ILC)。

任何合适的IFN-γ、或其功能片段、或修饰形式可与本文所述的方法结合使用(例如，作为与镍纹蛋白-β的共刺激剂；作为镍纹蛋白-β暴露前的刺激剂)。在一些实施方式中，IFN-γ是人IFN-γ。人IFN-γ核酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:6(GENBANK登录号NM_000619.3)，并且人IFN-γ氨基酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:5(GENBANK登录号NP_000610.2)。在一些实施方式中，IFN-γ是小鼠IFN-γ。小鼠IFN-γ核酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:8(GENBANK登录号NM_008337.4)，并且小鼠IFN-γ氨基酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:7(GENBANK登录号NP_032363.1)。

IFN-γ可指前体IFN-γ多肽(包括信号肽)或成熟IFN-γ多肽(不包括信号肽)。在一些实施方式中，IFN-γ是前体IFN-γ多肽(例如，包含SEQ ID NO:5的氨基酸1-166的前体人IFN-γ多肽；包含SEQ ID NO:5的氨基酸1-161的前体人IFN-γ多肽；包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-155的前体小鼠IFN-γ多肽)。在一些实施方式中，IFN-γ多肽是成熟IFN-γ多肽(例如，包含SEQ ID NO:5的氨基酸24-166的成熟人IFN-γ多肽；包含SEQ ID NO:5的氨基酸24-161的成熟人IFN-γ多肽；包含SEQ ID NO:7的氨基酸23-155的成熟小鼠IFN-γ多肽)。

在一些实施方式中，IFN-γ是重组IFN-γ多肽。重组IFN-γ多肽通常是由已克隆到支持DNA表达和信使RNA翻译的载体或系统中的DNA(即IFN-γ核酸序列)编码的IFN-γ多肽。在一些实施方式中，IFN-γ是重组人IFN-γ多肽(rhIFN-γ)。在一些实施方式中，IFN-γ是重组小鼠IFN-γ多肽(rmIFN-γ)在一些实施方式中，IFN-γ是市售的重组人IFN-γ(例如BioLegend目录号570202)。在一些实施方式中，IFN-γ是市售的重组小鼠IFN-γ(例如BioLegend目录号575302)。

IFN-γ可指未经修饰的IFN-γ多肽、修饰IFN-γ多肽、IFN-γ变体、IFN-γ突变体；或其片段或其功能片段。本文描述了未经修饰的多肽、修饰多肽、突变体、变体和片段。在一些实施方式中，IFN-γ是指包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7至少约75％相同的氨基酸序列的多肽。例如，IFN-γ可指包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。

在一些实施方式中，IFN-γ是指IFN-γ多肽的片段。通常，IFN-γ片段包含比全长成熟IFN-γ更少的氨基酸。例如，IFN-γ片段可包括成熟人IFN-γ多肽的一部分(例如，SEQID NO:5的氨基酸24-166的一部分；SEQ ID NO:5的氨基酸24-161的一部分)，或成熟小鼠IFN-γ多肽的一部分(即SEQ ID NO:7的氨基酸23-155的一部分)。全长成熟人IFN-γ的一个实例的长度为143个氨基酸。因此，人IFN-γ的片段的长度可为142个氨基酸或更短。全长成熟人IFN-γ的另一实例的长度为138个氨基酸。因此，人IFN-γ的片段的长度可为137个氨基酸或更短。全长成熟小鼠IFN-γ的长度为133个氨基酸。因此，小鼠IFN-γ的片段的长度可为132个氨基酸或更短。

在一些实施方式中，IFN-γ是指IFN-γ多肽的功能片段。用于评估IFN-γ和IFN-γ的功能片段的活性的任何合适的方法均可用于确定IFN-γ片段是否是功能片段。例如，一种用于评估IFN-γ活性的测定是在靶细胞中诱导抗病毒状态，有时称为细胞病变保护效应(CPE)测定。CPE测定的实例使用脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)(EMCV)攻击的A549人肺癌细胞，并且将效应与人IFN-γ的标准(例如Gxg01-902-535，BEIResources)进行比较。在一些实施方式中，IFN-γ的功能片段是表现出IFN-γ标准或全长成熟IFN-γ的至少50％活性的片段。例如，IFN-γ的功能片段是表现出IFN-γ标准或全长成熟IFN-γ的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高活性的片段。

IL-4

本文提供的某些方法包括使用白介素4(IL-4)作为刺激剂或共刺激剂。白介素4(也称为IL-4、B细胞生长因子1(BCGF-1)、B-细胞刺激因子1(BSF-1)、白介素-4、淋巴细胞刺激因子1、MGC79402)是涉及Th2-介导的应答的发展的主要细胞因子，其与变态反应和哮喘相关。I型受体包含IL-4Rα和公共γ-链(γc)，其也是细胞因子IL-2、-7、-9、-15和-21所共享的并且存在于造血细胞中。IL-4可以利用包含IL-4Rα和IL-13Rα1的II型复合物，其存在于非造血细胞中。该第二受体复合物是IL-13的功能性受体，其与IL-4共享约25％的同源性。I型受体复合物可仅由IL-4形成且在Th2发育中呈活性。相比之下，由IL-4或IL-13形成的II型受体复合物在气道过度敏感和粘液分泌期间更具活性，并且不存在于T细胞中。

任何合适的IL-4、或其功能片段、或修饰形式可与本文所述的方法结合使用(例如，作为与镍纹蛋白-β的共刺激剂；作为镍纹蛋白-β暴露前的刺激剂)。在一些实施方式中，IL-4是人IL-4。人IL-4核酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:12(全mRNA序列，提供为GENBANK登录号NM_000589)，并且人IL-4氨基酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:11(GENBANK登录号NP_000580.1)。在一些实施方式中，IL-4是小鼠IL-4。小鼠IL-4核酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:14(全mRNA序列，提供为GENBANK登录号NM_021283)，并且小鼠IL-4氨基酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:13(GENBANK登录号NP_067258.1)。

IL-4可指前体IL-4多肽(包括信号肽)或成熟IL-4多肽(不包括信号肽)。在一些实施方式中，IL-4是前体IL-4多肽(例如，包含SEQ ID NO:11的氨基酸1-153的前体人IL-4多肽；包含SEQ ID NO:13的氨基酸1-140的前体小鼠IL-4多肽)。在一些实施方式中，IL-4多肽是成熟IL-4多肽(例如，包含SEQ ID NO:11的氨基酸25-153的成熟人IL-4多肽；包含SEQ IDNO:13的氨基酸21-140的成熟小鼠IL-4多肽；包含SEQ ID NO:13的氨基酸23-140的成熟小鼠IL-4多肽)。

在一些实施方式中，IL-4是重组IL-4多肽。重组IL-4多肽通常是由已克隆到支持DNA表达和信使RNA翻译的载体或系统中的DNA(即IL-4核酸序列)编码的IL-4多肽。在一些实施方式中，IL-4是重组人IL-4多肽(rhIL-4)。在一些实施方式中，IL-4是重组小鼠IL-4多肽(rmIL-4)。在一些实施方式中，IL-4是市售的重组人IL-4(例如BioLegend目录号574002)。在一些实施方式中，IL-4是市售的重组小鼠IL-4(例如BioLegend目录号574302)。

IL-4可指未经修饰的IL-4多肽、修饰IL-4多肽、IL-4变体、IL-4突变体；或其片段或其功能片段。本文描述了未经修饰的多肽、修饰多肽、突变体、变体和片段。在一些实施方式中，IL-4是指包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13至少约75％相同的氨基酸序列的多肽。例如，IL-4可指包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。

在一些实施方式中，IL-4是指IL-4多肽的片段。通常，IL-4片段包含比全长成熟IL-4更少的氨基酸。例如，IL-4片段可包括成熟人IL-4多肽的一部分(即SEQ ID NO:11的氨基酸25-153的一部分)，或成熟小鼠IL-4多肽的一部分(即SEQ ID NO:13的氨基酸21-140的一部分)。全长成熟人IL-4的实例的长度为129个氨基酸。因此，人IL-4的片段的长度可为128个氨基酸或更短。全长成熟小鼠IL-4的实例的长度为120个氨基酸。因此，小鼠IL-4的片段的长度可为119个氨基酸或更短。全长成熟小鼠IL-4的另一实例的长度为118个氨基酸。因此，小鼠IL-4的片段的长度可为117个氨基酸或更短。

在一些实施方式中，IL-4是指IL-4多肽的功能片段。用于评估IL-4和IL-4的功能片段的活性的任何合适的方法均可用于确定IL-4片段是否是功能片段。例如，一种用于评估IL-4活性的测定是细胞增殖测定。细胞增殖测定的实例根据TF-1细胞增殖的剂量依赖性刺激来测量IL-4的ED₅₀。细胞增殖测定的另一实例根据CTLL-2细胞增殖的剂量依赖性刺激来测量IL-4的ED₅₀。在一些实施方式中，IL-4的功能片段是表现出IL-4标准(例如人IL-4的WHO国际标准(WHO International Standard for Human IL-4)(NIBSC代码：88/656))或全长成熟IL-4的至少50％活性的片段。例如，IL-4的功能片段是表现出IL-4标准或全长成熟IL-4的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高活性的片段。

IL-10

本文提供的某些方法包括使用白介素10(IL-10)作为刺激剂或共刺激剂。白介素10(也称为IL-10、B-TCGF、CSIF、TGIF)起初被描述为由辅助性T细胞2(Th2)细胞克隆产生的细胞因子。其抑制Th1细胞中的干扰素(IFN)-γ合成，因此其最初称为细胞因子合成抑制因子(CSIF)。巨噬细胞是IL-10的主要来源，并且其分泌可由内毒素(经由Toll样受体4，NF-κB依赖性)、肿瘤坏死因子TNF-α(经由TNF受体p55，NF-κB依赖性)、儿茶酚胺和IL-1来刺激。IL-10通过抑制单核细胞/巨噬细胞、嗜中性粒细胞和T细胞中的促炎性细胞因子、趋化因子、粘附分子以及抗原呈递和共刺激分子的表达来控制炎性过程。IL-10抑制单核细胞和巨噬细胞产生促炎介质，如内毒素-和IFN-γ-诱导的IL-1α、IL-6、IL-8、G-CSF、GM-CSF和TNF-α释放。此外，其增强抗炎介质如IL-1RA和可溶性TNFα受体的产生。IL-10抑制单核细胞和巨噬细胞向T细胞呈递抗原的能力。这通过使组成型和IFNγ-诱导的II类MHC、共刺激分子如CD86以及一些粘附分子如CD58的细胞表面水平下调来实现。

任何合适的IL-10、或其功能片段、或修饰形式可与本文所述的方法结合使用(例如，作为与镍纹蛋白-β的共刺激剂；作为镍纹蛋白-β暴露前的刺激剂)。在一些实施方式中，IL-10是人IL-10。人IL-10核酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:16(全mRNA序列，提供为GENBANK登录号NM_000572)，并且人IL-10氨基酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:15(GENBANK登录号NP_000563.1)。在一些实施方式中，IL-10是小鼠IL-10。小鼠IL-10核酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:18(全mRNA序列，提供为GENBANK登录号NM_010548)，并且小鼠IL-10氨基酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:17(GENBANK登录号NP_034678.1)。

IL-10可指前体IL-10多肽(包括信号肽)或成熟IL-10多肽(不包括信号肽)。在一些实施方式中，IL-10是前体IL-10多肽(例如，包含SEQ ID NO:15的氨基酸1-178的前体人IL-10多肽；包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-178的前体小鼠IL-10多肽)。在一些实施方式中，IL-10多肽是成熟IL-10多肽(例如，包含SEQ ID NO:15的氨基酸19-178的成熟人IL-10多肽；包含SEQ ID NO:17的氨基酸19-178的成熟小鼠IL-10多肽)。

在一些实施方式中，IL-10是重组IL-10多肽。重组IL-10多肽通常是由已克隆到支持DNA表达和信使RNA翻译的载体或系统中的DNA(即IL-10核酸序列)编码的IL-10多肽。在一些实施方式中，IL-10是重组人IL-10多肽(rhIL-10)。在一些实施方式中，IL-10是重组小鼠IL-10多肽(rmIL-10)。在一些实施方式中，IL-10是市售的重组人IL-10(例如BioLegend目录号715602；BioLegend目录号571002)。在一些实施方式中，IL-10是市售的重组小鼠IL-10(例如BioLegend目录号575802)。

IL-10可指未经修饰的IL-10多肽、修饰IL-10多肽、IL-10变体、IL-10突变体；或其片段或其功能片段。本文描述了未经修饰的多肽、修饰多肽、突变体、变体和片段。在一些实施方式中，IL-10是指包含与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17至少约75％相同的氨基酸序列的多肽。例如，IL-10可指包含与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。

在一些实施方式中，IL-10是指IL-10多肽的片段。通常，IL-10片段包含比全长成熟IL-10更少的氨基酸。例如，IL-10片段可包括成熟人IL-10多肽的一部分(即SEQ ID NO:15的氨基酸19-178的一部分)，或成熟小鼠IL-10多肽的一部分(即SEQ ID NO:17的氨基酸19-178的一部分)。全长成熟人IL-10的实例的长度为160个氨基酸。因此，人IL-10的片段的长度可为159个氨基酸或更短。全长成熟小鼠IL-10的实例的长度为160个氨基酸。因此，小鼠IL-10的片段的长度可为159个氨基酸或更短。

在一些实施方式中，IL-10是指IL-10多肽的功能片段。用于评估IL-10和IL-10的功能片段的活性的任何合适的方法均可用于确定IL-10片段是否是功能片段。例如，一种用于评估IL-10活性的测定是IFN-γ抑制测定。IFN-γ抑制测定的实例测量了IL-10抑制PHA活化的人PBMC中INF-γ的诱导的程度。用于评估IL-10活性的另一种测定涉及剂量依赖性刺激MC/9细胞增殖。在一些实施方式中，IL-10的功能片段是表现出IL-10标准或全长成熟IL-10的至少50％活性的片段。例如，IL-10的功能片段是表现出IL-10标准或全长成熟IL-10的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高活性的片段。

TGF-β

本文提供的某些方法包括使用转化生长因子β(TGF-β)作为刺激剂或共刺激剂。转化生长因子β(也称为TGF-β、TGF-β1、TGFB、DPD1、转化生长因子、转化生长因子β1、TGF-β-1)在细胞中作为390-氨基酸多肽合成。弗林蛋白酶在278位残基裂解蛋白质，得到对应于潜在联系多肽(LAP)的N-末端裂解产物，并且前体的25-kD C-末端部分构成成熟TGF-β1。TGF-β激活剂可从LAP释放TGF-β。这些激活剂包括降解LAP、血小板反应蛋白-1、活性氧类，以及整联蛋白avb6和avb8的蛋白酶。小鼠TGF-β将初始T细胞转化为防止自身免疫的调节性T(Treg)细胞。虽然人TGF-β1广泛用于在体外诱导FOXP3+，但其可能不是人Treg分化的必需因素。可以通过TGF-β1以及IL-6或IL-21的组合由初始CD4+T细胞诱导小鼠Th17。然而，人Th17分化的调节是不同的。TGF-β1似乎以剂量依赖性方式对人Th17分化具有双重效应。虽然TGF-β1对来自脐带血的人初始CD4+T细胞中RORγt的表达是必需的，但TGF-β1可在高剂量下抑制RORγt的功能。通过使用无血清培养基，已经阐明人Th17分化的最佳条件是TGF-β1、IL-1β和IL-2与IL-6、IL-21或IL-23的组合。

任何合适的TGF-β、或其功能片段、或修饰形式可与本文所述的方法结合使用(例如，作为与镍纹蛋白-β的共刺激剂；作为镍纹蛋白-β暴露前的刺激剂)。在一些实施方式中，TGF-β是人TGF-β。人TGF-β核酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:20(全mRNA序列，提供为GENBANK登录号NM_000660.7)，并且人TGF-β氨基酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:19(GENBANK登录号NP_000651.3)。人TGF-β核酸序列的另一实例提供为GENBANK登录号BC000125.1，并且人TGF-β氨基酸序列的另一实例提供为GENBANK登录号P01137。在一些实施方式中，TGF-β是小鼠TGF-β。小鼠TGF-β核酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:22(全mRNA序列，提供为GENBANK登录号NM_011577.2)，并且小鼠TGF-β氨基酸序列的实例在本文提供为SEQ ID NO:21(GENBANK登录号NP_035707)。

TGF-β可指前体TGF-β多肽(包括信号肽)或成熟TGF-β多肽(不包括信号肽；或不包括信号肽和潜在联系多肽)。在一些实施方式中，TGF-β是前体TGF-β多肽(例如，包含SEQ IDNO:19的氨基酸1-390的前体人TGF-β多肽；包含SEQ ID NO:21的氨基酸1-390的前体小鼠TGF-β多肽)。在一些实施方式中，TGF-β多肽是成熟TGF-β多肽(例如，包含SEQ ID NO:19的氨基酸30-390的成熟人TGF-β多肽；包含SEQ ID NO:19的氨基酸279-390的成熟人TGF-β多肽；包含SEQ ID NO:21的氨基酸29-390的成熟小鼠TGF-β多肽；包含SEQ ID NO:21的氨基酸279-390的成熟小鼠TGF-β多肽)。

在一些实施方式中，TGF-β是重组TGF-β多肽。重组TGF-β多肽通常是由已克隆到支持DNA表达和信使RNA翻译的载体或系统中的DNA(即TGF-β核酸序列)编码的TGF-β多肽。在一些实施方式中，TGF-β是重组人TGF-β多肽(rhTGF-β)。在一些实施方式中，TGF-β是重组小鼠TGF-β多肽(rmTGF-β)。在一些实施方式中，TGF-β是市售的重组人TGF-β(例如BioLegend目录号580704；BioLegend目录号781802)。在一些实施方式中，TGF-β是市售的重组小鼠TGF-β(例如BioLegend目录号763102)。

TGF-β可指未经修饰的TGF-β多肽、修饰TGF-β多肽、TGF-β变体、TGF-β突变体；或其片段或其功能片段。本文描述了未经修饰的多肽、修饰多肽、突变体、变体和片段。在一些实施方式中，TGF-β是指包含与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21至少约75％相同的氨基酸序列的多肽。例如，TGF-β可指包含与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。

在一些实施方式中，TGF-β是指TGF-β多肽的片段。通常，TGF-β片段包含比全长成熟TGF-β更少的氨基酸。例如，TGF-β片段可包括成熟人TGF-β多肽的一部分(例如，SEQ IDNO:19的氨基酸30-390的一部分；SEQ ID NO:19的氨基酸279-390的一部分)，或成熟小鼠TGF-β多肽的一部分(例如，SEQ ID NO:21的氨基酸29-390的一部分；SEQ ID NO:21的氨基酸279-390的一部分)。全长成熟人TGF-β的实例的长度为112个氨基酸。因此，人TGF-β的片段的长度可为111个氨基酸或更短。全长成熟小鼠TGF-β的实例的长度为112个氨基酸。因此，小鼠TGF-β的片段的长度可为111个氨基酸或更短。

在一些实施方式中，TGF-β是指TGF-β多肽的功能片段。用于评估TGF-β和TGF-β的功能片段的活性的任何合适的方法均可用于确定TGF-β片段是否是功能片段。例如，一种用于评估TGF-β活性的测定是细胞增殖抑制测定。细胞增殖抑制测定的实例测量了TGF-β抑制由重组小鼠IL-4诱导的小鼠HT-2细胞增殖的程度。在一些实施方式中，TGF-β的功能片段是表现出TGF-β标准或全长成熟TGF-β的至少50％活性的片段。例如，TGF-β的功能片段是表现出TGF-β标准或全长成熟TGF-β的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高活性的片段。

细胞

本文所述的某些方法包括刺激细胞或细胞群(例如，用镍纹蛋白-β；用刺激剂；用镍纹蛋白-β+共刺激剂)。细胞可以从受试者和/或细胞源获得，或者可以作为已建立的细胞系获得。细胞源可包括胚胎干细胞(ES)、诱导性多能干细胞(iPSC)等的群体。细胞可以从胚胎或者衍生自胚胎的干细胞培养物分离。细胞可以从诱导性多能干细胞(iPSC)培养物分离。细胞可以以各种方式从受试者获得(例如，从活组织如活体组织切片、拔取的毛囊、体液如尿液或体腔液收获得到，或从循环中分离)。受试者可包括任何动物，包括但不限于任何哺乳动物，如小鼠、大鼠、犬、猫、牛、马、猪、非人灵长类动物和人类。在某些实施方式中，受试者是人类。在一些实施方式中，受试者是在宫内环境中妊娠长于胚胎的动物或人，并且通常是出生后的人类或出生后的动物(例如，新生儿、新生动物、成年人或成年动物)。受试者有时是幼年动物、幼年人、成年动物或成年人。

在一些实施方式中，细胞从受试者的样品分离。分离的细胞是指已经从其原始环境的组分中分离(例如，从宿主分离和/或从样品纯化)并因此从其原始环境通过人为干预(例如，“通过人工”)而改变的细胞。样品可包括从受试者或其部分中分离或获得的任何标本。标本的非限制性实例包括得自受试者的流体或组织，包括但不限于血液或血液制品(例如血清、血浆等)、脐带血、骨髓、绒膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液(例如支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节镜)、活检样品或活体组织切片、口腔拭子、腹腔穿刺样品、女性生殖道的洗液、尿液、粪便、痰、唾液、鼻粘膜、前列腺液、灌洗液、精液、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、母乳、乳腺液、硬组织(例如肝、脾、肾、肺或卵巢)等，或它们的组合。术语血液涵盖全血、血液制品或血液的任何级分，如常规定义的血清、血浆、血沉棕黄层等。血浆是指由经抗凝血剂处理的血液离心所得到的全血的级分。血清是指血样凝聚后剩余的流体的似水部分。

在一些实施方式中，细胞包括正常健康细胞(例如未病变细胞)。在一些实施方式中，细胞包括遗传改变的细胞。在一些实施方式中，细胞包括未遗传改变的细胞。在一些实施方式中，细胞包括病变细胞。病变细胞可包括来自携带致病突变的受试者的细胞。病变细胞可包括来自异常组织的细胞，如来自瘤变、增生、恶性肿瘤或良性肿瘤。在某些实施方式中，病变细胞包括不是肿瘤细胞的细胞。在某些实施方式中，病变细胞可包括从受试者的循环(例如循环肿瘤细胞(CTC))中分离的细胞。在某些实施方式中，病变细胞可包括从例如身体样品分离的细胞，如尿液、精液、大便(粪便)等。

在一些实施方式中，细胞包括原代细胞。原代细胞通常直接从活组织如活体组织切片、拔取的毛囊、身体样品如大便样品、体液如尿液、精液或体腔液获取，或者从循环中分离。在某些情况下，原代细胞尚未传代。在某些情况下，原代细胞已经传代一次。原代细胞可以从分化的组织中分离。通常，原代细胞是新鲜分离的，例如，通过组织消化和铺板。原代细胞可以或不可冷冻，然后稍后解冻。此外，从其中分离出原代细胞的组织可以或不可在临处理前以一些其他方式冷冻或保存。通常，在细胞已传代超过一次之后，细胞不再是原代细胞。一次或多次传代并在传代后立即冷冻的细胞在解冻时也不被视为原代细胞。在某些实施方式中，细胞初始是原代细胞，而在传代后变成非原代细胞。在一些实施方式中，在从分化组织分离细胞之后且在本文所述的方法中使用之前，使细胞在细胞培养物中维持或增殖。

在一些实施方式中，细胞包括非原代细胞，如来自已建立的细胞系的细胞、转化细胞、来自先前冷冻的收集物的解冻细胞等。任何合适的细胞系可以与本文所述的方法结合使用。已建立的细胞系的实例包括例如THP-1(急性髓性白血病(acute myeloidleukemia))、DU145(前列腺癌(prostate cancer))、H295R(肾上腺皮质癌(adrenocorticalcancer))、HeLa(宫颈癌(cervical cancer))、KBM-7(慢性髓细胞性白血病(chronicmyelogenous leukemia))、LNCaP(前列腺癌(prostate cancer))、MCF-7(乳腺癌(breastcancer))、MDA-MB-468(乳腺癌)、PC3(前列腺癌)、SaOS-2(骨癌(bone cancer))、SH-SY5Y(成神经细胞瘤(neuroblastoma)，克隆自骨髓瘤(myeloma))、T-47D(乳腺癌)、U87(恶性胶质瘤(glioblastoma))、Vero(绿猴属非洲绿猴(African green monkey Chlorocebus)肾上皮细胞系)、MC3T3(胚胎颅盖(embryonic calvarium))、GH3(垂体瘤(pituitary tumor))、PC12(嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma))、CHO(中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary))、MDCK(肾上皮)、A6(肾上皮)和AB9。在一些实施方式中，细胞包括THP-1细胞。

在一些实施方式中，细胞包括免疫细胞。免疫细胞可包括例如淋巴细胞、白细胞、无颗粒白细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树突细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、先天淋巴细胞(ILC)、巨核细胞、髓源性抑制细胞(MDSC)、自然杀伤细胞(NK细胞)、血小板、红细胞(RBC)、T细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和胸腺细胞。在一些实施方式中，细胞包括或者衍生自外周血单核细胞(PBMC)，其可包括例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和单核细胞。

在一些实施方式中，细胞包括单核细胞。单核细胞是白细胞或白血细胞的一种类型，并且可分化成巨噬细胞和髓系树突细胞。单核细胞是脊椎动物先天免疫系统的一部分，并且可影响适应性免疫的过程。在人血液中存在单核细胞的至少三种亚类，其可根据某些标记物来表征。例如，典型单核细胞的特征在于CD14细胞表面受体的高水平表达(CD14++CD16-单核细胞)；非典型单核细胞示出CD14的低水平表达以及CD16受体的额外共表达(CD14+CD16++单核细胞)；并且中间单核细胞的特征在于CD14的高水平表达以及CD16的低水平表达(CD14++CD16+单核细胞)。

在一些实施方式中，细胞包括巨噬细胞。巨噬细胞是一类吞没并消化外源蛋白和其他物质、细胞碎片、微生物和癌细胞的白血细胞。巨噬细胞可称为吞噬细胞、组织细胞、库弗氏(Kupffer)细胞、肺泡巨噬细胞或小胶质细胞，并且可存在于几乎所有的身体组织中。巨噬细胞参与非特异性防御(先天免疫)，并可通过募集其他免疫细胞如淋巴细胞来帮助引发特异性防御机制(适应性免疫)。巨噬细胞还具有抗炎作用并且可以通过细胞因子的释放来减少免疫反应。促进炎症的巨噬细胞通常称为M1巨噬细胞，而减少炎症并促进组织修复的巨噬细胞通常称为M2巨噬细胞。巨噬细胞通过单核细胞的分化而产生。巨噬细胞可以使用流式细胞术和/或免疫组织化学染色，通过其对蛋白质如CD14、CD40、CD11b、CD64、F4/80、EMR1、溶菌酶M、MAC-1/MAC-3和CD68的特异性表达来鉴定。功能障碍性巨噬细胞可引起疾病，如导致频繁感染的慢性肉芽肿病(chronic granulomatous disease)。

在一些实施方式中，细胞包括非免疫细胞。非免疫细胞可包括例如上皮细胞(例如体腔内衬细胞)、衍生自中枢神经系统的细胞(例如神经细胞、神经元、神经胶质细胞)、基质细胞(例如结缔组织细胞、成纤维细胞、周细胞)、干细胞(例如胚胎干细胞、成体干细胞)、肌细胞(例如骨骼、心脏、平滑肌)、软骨小体(例如软骨细胞)、骨细胞(例如成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、骨衬细胞)、皮肤细胞(例如角质细胞、黑素细胞、默克尔细胞、朗格汉斯细胞)、内皮细胞(例如血管内衬细胞细胞)、脂肪细胞(例如白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞)和生殖细胞(精细胞、卵细胞)。

在一些实施方式中，细胞包括上皮细胞。上皮细胞或上皮通常是指排列在中空器官的一个或多个细胞，以及构成腺体和身体外表面的那些。上皮细胞可包括鳞状上皮细胞、柱状上皮细胞、腺瘤上皮细胞或移行上皮细胞。取决于器官和位置，上皮细胞可以单层排列或者可以多层排列，并且可包括角质细胞(KE)上皮细胞或非角质细胞(NKE)上皮细胞。

角质细胞形成了存在于解剖学部位如皮肤、眼表面、口腔粘膜、食道和子宫颈处的鳞状上皮。角质细胞最终分化为扁平高度角质化的无活力细胞，其通过形成保护性屏障来帮助防御环境和感染。角质细胞上皮细胞的实例包括但不限于真皮角质细胞、眼上皮细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、食道上皮细胞和宫颈上皮细胞。

非角质细胞(NKE)上皮细胞形成身体的上皮，如存在于乳腺、前列腺、肝脏、呼吸道、视网膜和胃肠道中。NKE细胞通常分化为例如在吸收和/或分泌中起作用的功能性活细胞。这些细胞通常不形成鳞状上皮细胞特征性的高度角质化结构。NKE细胞的实例包括但不限于前列腺细胞、乳腺细胞、肝细胞、肝上皮细胞、胆管上皮细胞、胆囊细胞、胰岛细胞、胰腺β细胞、胰腺导管上皮细胞、肺上皮细胞、气道上皮细胞、鼻上皮细胞、肾细胞、膀胱细胞、尿道上皮细胞、胃上皮细胞、大肠上皮细胞、小肠上皮细胞、睾丸上皮细胞、卵巢上皮细胞、输卵管上皮细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞、垂体细胞、腺细胞、羊膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、汗腺上皮细胞、皮脂腺上皮细胞和毛囊细胞。

细胞因子和趋化因子产生

本文所述的某些方法包括测量一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生。细胞因子通常是指参与细胞信号传导的小蛋白(通常约5–20kDa)，并且细胞因子的释放可对附近细胞的行为有影响。细胞因子通常被视为免疫调节剂，并且可能涉及自分泌信号传导、旁分泌信号传导和内分泌信号传导。细胞因子可包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、单核因子、集落刺激因子和肿瘤坏死因子。细胞因子可通过免疫细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞)、内皮细胞、成纤维细胞和基质细胞产生。

在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的一种或多种细胞因子。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的一种或多种白介素。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的一种或多种IL-6家族细胞因子。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的一种或多种IL-1家族细胞因子。本文的方法可包括测量下表1所提供的一种或多种细胞因子的产生。表1中还提供了相应的人基因和人受体，然而，表1中所列的细胞因子、基因和受体不限于人细胞因子、基因和受体。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的结合至表1所提供的一种或多种受体的细胞因子。

趋化因子通常指细胞因子(细胞分泌的信号蛋白)的亚家族。趋化因子可在附近反应细胞中诱导定向趋化作用，并可称为趋化性细胞因子。趋化因子较小(通常约8-10kDa)并且通常在保守位置具有4个半胱氨酸残基以形成其三维形状。某些趋化因子是促炎性的并且可在将免疫系统的细胞募集到感染部位的免疫应答期间被诱导，并且某些趋化因子是稳态的并且在组织维持或发育的正常过程期间参与控制细胞的迁移。趋化因子可分为亚家族(即C、CX3C、CC和CXC)，并通过与靶细胞表面上存在的G蛋白-连接的跨膜受体(趋化因子受体)相互作用而发挥其生物学效应。

在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的一种或多种趋化因子。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的一种或多种C家族趋化因子。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的一种或多种CX3C家族趋化因子。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的一种或多种CC家族趋化因子。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的一种或多种CXC家族趋化因子。本文的方法可包括测量下表2所提供的一种或多种趋化因子的产生。表2中还提供了相应的人基因和人受体，然而，本文的趋化因子、基因和受体不限于人趋化因子、基因和受体。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的结合至表2所提供的一种或多种受体的趋化因子。

在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的一种或多种选自CCL2、CXCL10、IL-6和IL-1RA的细胞因子和/或趋化因子。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的一种或多种选自CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、IL-6和IL-1RA的细胞因子和/或趋化因子。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的CCL2。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的CXCL10。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的IL-6。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的IL-1RA。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的CCL5。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的CXCL1。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的CXCL8。在一些实施方式中，本文的方法包括测量细胞产生的CXCL9。

细胞因子和/或趋化因子的产生可以使用用于测量蛋白质分泌和/或DNA表达(例如mRNA)的任何合适的方法、设备或机器来测量。例如，细胞因子和/或趋化因子的产生可以通过免疫测定法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、Western印迹、蛋白质免疫染色)、光谱测定法(例如高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC/MS))、流式细胞术、定量聚合酶链反应(qPCR)、凝胶电泳、光度计、荧光计、分光光度计、合适的基因芯片或微阵列分析、质谱法、色谱法、细胞荧光分析、荧光显微术、合适的荧光或数字成像方法、共聚焦激光扫描显微术、激光扫描细胞计量术、亲和层析、手动成批模式分离、电场悬浮、合适的核酸测序方法和/或核酸测序设备等以及它们的组合来测量。免疫测定法的实例包括具有具有预包被板的LEGEND MAX^TMELISA试剂盒(BioLegend)、Macrophage/Microglia LEGENDplex^TM板(BioLegend)和Chemokine Inflammatory LEGENDplex^TM板(BioLegend)。

用于评估镍纹蛋白-β活性的方法

本文提供了用于评估镍纹蛋白-β活性的方法。用于评估镍纹蛋白-β活性的方法通常离体(即在生物体外)或体外(即在试管、培养皿或生物体外的其他容器中进行或发生)进行。术语离体和体外可互换使用，并且通常与在人工环境或人工系统中进行的方法结合使用。本文的方法通常包括使细胞与镍纹蛋白-β或镍纹蛋白-β和共刺激剂接触，并且此类接触通常离体/体外(例如在细胞培养物中)进行。

在一些实施方式中，方法包括使细胞与镍纹蛋白-β接触，测量本文所述的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生，并且根据细胞因子产生来检测镍纹蛋白-β的活性。在一些实施方式中，检测镍纹蛋白-β的活性包括将测试条件下(镍纹蛋白-β刺激)的细胞因子/趋化因子产生与对照条件下(无镍纹蛋白-β刺激)的细胞因子/趋化因子产生进行比较。在一些实施方式中，检测镍纹蛋白-β的活性包括将测试条件下的细胞因子/趋化因子产生与标准曲线中的细胞因子/趋化因子产生(例如，针对多种不同量的活性镍纹蛋白-β测量的细胞因子/趋化因子产生)进行比较。活性镍纹蛋白-β可包括镍纹蛋白-β标准(例如，未经修饰的全长成熟镍纹蛋白-β；包含增强活性的修饰的全长成熟镍纹蛋白-β)。在一些实施方式中，检测镍纹蛋白-β的活性包括将测试条件下的细胞因子/趋化因子产生与对照所测量的细胞因子/趋化因子产生进行比较，从而提供比较。对照可包括例如在不存在镍纹蛋白-β时测量的细胞因子/趋化因子产生。通常，对于对照，或对于生成标准曲线，测量用于评估镍纹蛋白-β活性(测试条件)的相同细胞(例如，相同细胞类型、相同细胞来源和/或相同细胞群)的细胞因子产生。通常，对于对照，或对于生成标准曲线，细胞因子/趋化因子产生可以是细胞因子/趋化因子的测量水平，或者细胞因子、趋化因子的组合中的细胞因子/趋化因子，或细胞因子和趋化因子的测量水平。通常，对于测试条件和对照条件或标准曲线的条件，测量相同的细胞因子/趋化因子的水平，或者相同的细胞因子、趋化因子，或细胞因子和趋化因子在相同的细胞因子/趋化因子组合中的水平。

在一些实施方式中，方法包括使细胞与镍纹蛋白-β和共刺激剂(例如IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β)接触，测量本文所述的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生，并且根据细胞因子产生来检测镍纹蛋白-β的活性。在一些实施方式中，检测镍纹蛋白-β的活性包括将测试条件下(镍纹蛋白-β+共刺激剂)的细胞因子/趋化因子产生与对照条件下(无镍纹蛋白-β、无共刺激剂、或无镍纹蛋白-β+共刺激剂)的细胞因子/趋化因子产生进行比较。在一些实施方式中，检测镍纹蛋白-β的活性包括将测试条件下的细胞因子/趋化因子产生与标准曲线中的细胞因子/趋化因子产生(例如，针对多种不同量的活性镍纹蛋白-β或活性镍纹蛋白-β+共刺激剂测量的细胞因子/趋化因子产生)进行比较。活性镍纹蛋白-β可包括镍纹蛋白-β标准(例如，未经修饰的全长成熟镍纹蛋白-β；包含增强活性的修饰的全长成熟镍纹蛋白-β)。在一些实施方式中，检测镍纹蛋白-β的活性包括将测试条件下的细胞因子/趋化因子产生与对照所测量的细胞因子/趋化因子产生进行比较，从而提供比较。对照可包括例如在不存在镍纹蛋白-β时测量的细胞因子/趋化因子产生；在不存在共刺激剂时测量的细胞因子/趋化因子产生；在不存在镍纹蛋白-β和共刺激剂时测量的细胞因子/趋化因子产生。通常，对于对照，或对于生成标准曲线，测量用于评估镍纹蛋白-β活性(测试条件)的相同细胞(例如，相同细胞类型、相同细胞来源和/或相同细胞群)的细胞因子产生。通常，对于对照，或对于生成标准曲线，细胞因子/趋化因子产生可以是细胞因子/趋化因子的测量水平，或者细胞因子、趋化因子的组合中的细胞因子/趋化因子，或细胞因子和趋化因子的测量水平。通常，对于测试条件和对照条件或标准曲线的条件，测量相同的细胞因子/趋化因子的水平，或者相同的细胞因子、趋化因子，或细胞因子和趋化因子在相同的细胞因子/趋化因子组合中的水平。

在一些实施方式中，与对照条件下(即，不存在镍纹蛋白-β或镍纹蛋白-β+共刺激剂)的产生相比，在测试条件下(即，在镍纹蛋白-β刺激下或在镍纹蛋白-β+共刺激剂刺激下)的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生增加。在一些实施方式中，与对照条件下的产生相比，测试条件下的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生增加至少约10％。例如，与对照条件下的产生相比，测试条件下的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生可增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％、1000％或更多。在一些实施方式中，与对照条件下的产生相比，测试条件下的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生增加至少约2倍。例如，与对照条件下的产生相比，测试条件下的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。

在一些实施方式中，与对照条件下(即，不存在镍纹蛋白-β或镍纹蛋白-β+共刺激剂)的产生相比，在测试条件下(即，在镍纹蛋白-β刺激下或在镍纹蛋白-β+共刺激剂刺激下)的CCL2的产生增加。在一些实施方式中，与对照条件下(例如，分别IFN-γ或IL-4，无镍纹蛋白-β)的产生相比，在测试条件下(例如，镍纹蛋白-β+IFN-γ，或镍纹蛋白-β+IL-4)的CCL2的产生增加。

在一些实施方式中，与对照条件下(即，不存在镍纹蛋白-β或镍纹蛋白-β+共刺激剂)的产生相比，在测试条件下(即，在镍纹蛋白-β刺激下或在镍纹蛋白-β+共刺激剂刺激下)的CCL5的产生增加。在一些实施方式中，与对照条件下(例如，分别IFN-γ、IL-4或IL-10，无镍纹蛋白-β)的产生相比，在测试条件下(例如，镍纹蛋白-β+IFN-γ、镍纹蛋白-β+IL-4、或镍纹蛋白-β+IL-10)的CCL5的产生增加。

在一些实施方式中，与对照条件下(即，不存在镍纹蛋白-β或镍纹蛋白-β+共刺激剂)的产生相比，在测试条件下(即，在镍纹蛋白-β刺激下或在镍纹蛋白-β+共刺激剂刺激下)的CXCL9的产生增加。在一些实施方式中，与对照条件下(例如，IFN-γ，无镍纹蛋白-β)的产生相比，在测试条件下(例如，镍纹蛋白-β+IFN-γ)的CXCL9的产生增加。

在一些实施方式中，与对照条件下(即，不存在镍纹蛋白-β或镍纹蛋白-β+共刺激剂)的产生相比，在测试条件下(即，在镍纹蛋白-β刺激下或在镍纹蛋白-β+共刺激剂刺激下)的CXCL10的产生增加。在一些实施方式中，与对照条件下(例如，IFN-γ，无镍纹蛋白-β)的产生相比，在测试条件下(例如，镍纹蛋白-β+IFN-γ)的CXCL10的产生增加。

在一些实施方式中，与对照条件下(即，不存在镍纹蛋白-β或镍纹蛋白-β+共刺激剂)的产生相比，在测试条件下(即，在镍纹蛋白-β刺激下或在镍纹蛋白-β+共刺激剂刺激下)的IL-6的产生增加。在一些实施方式中，与对照条件下(例如，IFN-γ，无镍纹蛋白-β)的产生相比，在测试条件下(例如，镍纹蛋白-β+IFN-γ)的IL-6的产生增加。

在一些实施方式中，与对照条件下(即，不存在镍纹蛋白-β或镍纹蛋白-β+共刺激剂)的产生相比，在测试条件下(即，在镍纹蛋白-β刺激下或在镍纹蛋白-β+共刺激剂刺激下)的IL-1RA的产生增加。在一些实施方式中，与对照条件下(例如，IFN-γ，无镍纹蛋白-β)的产生相比，在测试条件下(例如，镍纹蛋白-β+IFN-γ)的IL-1RA的产生增加。

在一些实施方式中，与对照条件下(即，不存在镍纹蛋白-β或镍纹蛋白-β+共刺激剂)的产生相比，在测试条件下(即，在镍纹蛋白-β刺激下或在镍纹蛋白-β+共刺激剂刺激下)的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生减少。在一些实施方式中，与对照条件下的产生相比，测试条件下的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生减少至少约10％。例如，与对照条件下的产生相比，测试条件下的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生可减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％、1000％或更多。在一些实施方式中，与对照条件下的产生相比，测试条件下的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生减少至少约2倍。例如，与对照条件下的产生相比，测试条件下的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生可减少至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。

在一些实施方式中，与对照条件下(即，不存在镍纹蛋白-β或镍纹蛋白-β+共刺激剂)的产生相比，在测试条件下(即，在镍纹蛋白-β刺激下或在镍纹蛋白-β+共刺激剂刺激下)的CXCL8的产生减少。在一些实施方式中，与对照条件下(例如，IL-10，无镍纹蛋白-β)的产生相比，在测试条件下(例如，镍纹蛋白-β+IL-10)的CXCL8的产生减少。

在一些实施方式中，与对照条件下(即，不存在镍纹蛋白-β或镍纹蛋白-β+共刺激剂)的产生相比，在测试条件下(即，在镍纹蛋白-β刺激下或在镍纹蛋白-β+共刺激剂刺激下)的CXCL1的产生减少。在一些实施方式中，与对照条件下(例如，IFN-γ，无镍纹蛋白-β)的产生相比，在测试条件下(例如，镍纹蛋白-β+IFN-γ)的CXCL1的产生减少。

镍纹蛋白-β受体表达

在一些实施方式中，本文的方法包括鉴定细胞是否表达或者能够表达镍纹蛋白-β受体。此类方法可包括使细胞或细胞群(例如，本文所述的细胞)与刺激剂(例如，本文所述的刺激剂(例如，IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β))接触。通常，使细胞或细胞群与刺激剂接触一段持续时间，然后暴露于镍纹蛋白-β。与刺激剂接触的持续时间可包括约1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时、48小时或更多。在一些实施方式中，使细胞与刺激剂接触约18小时。用于使细胞与刺激剂接触的条件可包括约35℃至40℃的温度。在一些实施方式中，使细胞与刺激剂在37℃下接触。

在一些实施方式中，方法可包括在结合条件下使细胞或细胞群与镍纹蛋白-β接触。结合条件通常包括有利于配体-受体结合(例如，镍纹蛋白-β与受体结合)的条件(温度、培养基组分、pH)。配体-受体结合通常是非共价的，并且通过分子间力如离子键、氢键和范德华力发生。结合率可称为配体-受体结合亲和力。通常，高亲和性配体结合由配体与其受体之间的较大分子间力产生，而低亲和性配体结合涉及配体与其受体之间的较小分子间力。高亲和性结合通常导致配体在其受体结合位点的占据程度高于低亲和性结合。

通常，在细胞与刺激剂接触一段持续时间之后，使细胞或细胞群与镍纹蛋白-β接触。与镍纹蛋白-β接触的持续时间可包括约10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟或更多。在一些实施方式中，使细胞与镍纹蛋白-β接触约90分钟。用于使细胞与镍纹蛋白-β接触的条件可包括约1℃至20℃的温度。用于使细胞与镍纹蛋白-β接触的条件可包括约1℃至19℃、或约1℃至18℃的温度。在一些实施方式中，使细胞与刺激剂在4℃下接触。不受理论的限制，用于使细胞与镍纹蛋白-β接触的条件可在低温下进行以防止镍纹蛋白-β受体的活化和潜在内化。

在一些实施方式中，方法可包括检测结合至细胞的镍纹蛋白-β多肽的存在、不存在和/或量。任何合适的蛋白质检测方法均可用于检测结合至细胞的镍纹蛋白-β多肽的存在、不存在和/或量，如本文所述的蛋白质检测方法(例如免疫测定法、流式细胞术)。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β包含标签，如本文所述的标签，并且方法包括使标记的镍纹蛋白-β与能够结合至标签的物质接触。在一些实施方式中，该物质是抗体、包含可检测标记的抗体或其片段。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β包含结合对的成员，并且方法包括使镍纹蛋白-β与结合对的第二成员接触。可以使用任何合适的结合对，并且本文描述了结合对的实例。在一些实施方式中，镍纹蛋白-β或结合镍纹蛋白-β的物质包含可检测标记，如本文所述的可检测标记，并且方法包括检测可检测标记(例如，通过流式细胞术)。

在一些实施方式中，评估镍纹蛋白-β的表达的细胞来自于患有疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患，或者怀疑患有疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的受试者。来自患有疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的受试者的细胞可称为受影响的细胞。在一些实施方式中，疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的特征在于镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达改变。在一些实施方式中，疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的特征在于镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达提高。在一些实施方式中，疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的特征在于镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达降低。镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的改变的、提高的或降低的表达可以是相对于来自未患有疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的受试者的一个或多个细胞而言的。未患有疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的受试者可以是不同的受试者；或者可以是在发展疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患之前的相同受试者，或者由疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患恢复之后的相同受试者。来自未患有疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的受试者的细胞可称为对照细胞。

在一些实施方式中，与对照细胞中的表达相比，受影响细胞中的镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达提高至少约10％。例如，与对照细胞中的表达相比，受影响细胞中的镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达可提高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％、1000％或更多。在一些实施方式中，与对照细胞中的表达相比，受影响细胞中的镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达提高至少约2倍。例如，与对照细胞中的表达相比，受影响细胞中的镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达可提高至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。

试剂盒

在某些实施方式中提供了试剂盒。试剂盒可以包括可用于以任何合适的组合执行本文所述的任何方法的本文所述的任何组分和组合物(例如IFN-γ、IL-4、IL-10和/或TGF-β；用于测量细胞因子和/或趋化因子产生的一种或多种组分；细胞或细胞群)。在一些实施方式中，试剂盒还包括镍纹蛋白-β(例如，用作标准/对照和/或供用户生成标准曲线)。用于测试的镍纹蛋白-β可以由试剂盒的用户/购买者提供。试剂盒还可包括可用于实施本文所述的任何方法的任何试剂、缓冲剂或其他组分。例如，试剂盒可包括在结合条件下免疫特异性结合一种或多种细胞因子和/或趋化因子的一种或多种结合分子。

试剂盒的组分可存在于单独的容器中，或者多种组分可存在于单个容器中。合适的容器包括单个管(例如小瓶)、细胞培养板、板的一个或多个孔(例如，6孔板、12孔板、24孔板、96孔板、384孔板等)等。

试剂盒还可包括用于执行本文所述的一种或多种方法和/或本文所述的一种或多种组分的描述的说明书。说明书和/或描述可以是印刷形式并且可以包括在试剂盒插页中。在一些实施方式中，说明书和/或描述被提供为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，便携式闪存驱动器、DVD、CD-ROM、磁盘等)上的电子存储数据文件。试剂盒还可包括提供此类说明书或描述的互联网位置的书面描述。

实施例

下文阐述的实施例示出了某些实施方式而不对技术作出限制。

实施例1：在IFN-γ和镍纹蛋白-β刺激下THP-1细胞的细胞因子和趋化因子产生

在该实施例中，测量了在镍纹蛋白-β刺激和IFN-γ+镍纹蛋白-β共刺激下THP-1细胞产生的某些细胞因子和趋化因子。6XHis标记的镍纹蛋白-β(R&D Systems，目录号9339-MN-050)和人重组IFN-γ(BioLegend，目录号752802)用于下述测定。镍纹蛋白-β产品包含以下组分：N-末端-人镍纹蛋白-β(Gln46-Asp311；登录号Q641Q3)；HP；接头肽(GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:9))；和6XHis(HHHHHH(SEQ ID NO:10))–C-末端。可以通过其在E16E18胚胎大鼠皮层神经元中诱导STAT3磷酸化的能力来测量镍纹蛋白-β活性。

测量了在IFN-γ和镍纹蛋白-β共刺激下THP-1细胞产生的CCL2。在具有或不具有1μg/ml的rhIFN-γ(BioLegend，目录号570202)以及具有或不具有不同浓度(1μg/ml、2μg/ml或2.5μg/ml)的镍纹蛋白-β(R&D Systems，目录号9339-MN-050)或其对照肽(6XHis 2.5μg/ml；BioLegend)的情况下，将THP-1细胞(5×10⁴)在96孔培养板上用37℃的RPMI 1％FBS和p/s 1X(200μl)孵育24小时。对于细胞因子测量，使用人CCL2 ELISA(BioLegend)分析样品，并且结果示于图1中。

测量了在IFN-γ和镍纹蛋白-β共刺激下THP-1细胞产生的CXCL10、IL1RA和IL-6。在具有或不具有1μg/ml的rhIFN-γ(BioLegend，目录号570202)以及具有或不具有不同浓度(1μg/ml、2μg/ml或2.5μg/ml)的镍纹蛋白-β(R&D Systems，目录号9339-MN-050)或其对照肽(6XHis 2.5μg/ml；BioLegend)的情况下，将THP-1细胞(5×10⁴)在96孔培养板上用37℃的RPMI 1％FBS和p/s 1X(200μl)孵育24小时。对于细胞因子测量，使用LEGENDplex^TM(BioLegend)分析样品，并且结果示于图2(CXCL10(上图)、IL1RA(中图)和IL-6(下图))中。

测量了在IFN-γ和镍纹蛋白-β共刺激下THP-1细胞产生的其他细胞因子(即，ARGINASE、IL12p70、TNFa、IL-4、IL-10、IL-1b、CCL17(也称为TARC)、IL12p40和IL-23)，并且比较结果提供于图3A中。

类似地，测量在镍纹蛋白-β加上IFN-γ、TGFβ、IL-4或IL-10共刺激下THP-1细胞产生的趋化因子，并比较结果提供于图3B中。

实施例2：THP-1细胞中镍纹蛋白-β受体表达的鉴定

在该实施例中，示出了在THP-1细胞中镍纹蛋白-β受体表达的鉴定(示意性一般检测策略参见图5)。具体地，在具有或不具有250ng的rhIFN-γ(BioLegend，目录号570202)、IL-10(BioLegend，目录号715602)、IL-4(BioLegend，目录号574002)或TGFβ(BioLegend，目录号580704)的情况下，将THP-1细胞(3×10⁵)在24孔培养板上用37℃的RPMI 1％FBS和p/s1X(400μl)孵育过夜(18小时)。然后将细胞转移，并用2ml染色缓冲液(ST)在2ml Eppendorf管中洗涤。在室温(RT)下，将细胞用5μl的Fc受体阻断溶液(Human TruStain FcX^TM(BioLegend))/100μl细胞悬浮液预孵育10分钟。然后将细胞与镍纹蛋白-β在4℃下一起孵育90分钟。在将细胞用2ml的PBS洗涤1X并涡旋之后，将细胞以1:300在PBS/Zombie NIR^TM(BioLegend)溶液中在室温下于暗处孵育10分钟。用2ml的ST洗涤细胞一次。接着，将与藻红蛋白(BioLegend,Inc.目录号J095G46)偶联的抗6XHis抗体在暗处于4℃下加入到100ml的悬浮细胞中30分钟。最后，用ST洗涤细胞2X，并且通过流式细胞术读数(图4A、4B、4C)。

实施例3：氨基酸和核酸序列的实例

实施例4：实施方式的实例

下文阐述的实施例示出某些实施方式并且不限制技术。

A1.一种用于评估镍纹蛋白-β多肽的活性的方法，其包括：

a)使细胞与包含共刺激剂的第一组合物以及包含镍纹蛋白-β多肽的第二组合物接触；

b)测量所述细胞产生的一种或多种选自CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、IL-6和IL-1RA的细胞因子和/或趋化因子，从而测量细胞因子产生；以及

c)根据(b)中测量的所述细胞因子产生来检测所述第二组合物中的镍纹蛋白-β多肽的活性。

A2.根据实施方式A1所述的方法，其中与未接触所述第一组合物和所述第二组合物的细胞的产生相比，所述一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生增加。

A3.根据实施方式A1所述的方法，其中与接触所述第一组合物且未接触所述第二组合物的细胞的产生相比，所述一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生增加。

A3.1根据实施方式A1所述的方法，其中与接触所述第一组合物且未接触所述第二组合物的细胞的产生相比，所述一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生减少。

A4.根据实施方式A3所述的方法，其中与接触所述第一组合物且未接触所述第二组合物的细胞的产生相比，所述一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生增加至少约10％。

A4.1根据实施方式A3.1所述的方法，其中与接触所述第一组合物且未接触所述第二组合物的细胞的产生相比，所述一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生减少至少约10％。

A5.根据实施方式A1至A4.1中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述第一组合物和所述第二组合物同时接触。

A6.根据实施方式A1至A4.1中任一项所述的方法，其包括在所述细胞与所述第二组合物接触之前，使所述细胞与所述第一组合物接触。

A7.根据实施方式A1至A6中任一项所述的方法，其中所述共刺激剂包括IFN-γ。

A7.1根据实施方式A1至A6中任一项所述的方法，其中所述共刺激剂包括一种或多种选自IFN-γ、IL-4、IL-10和TGFβ多肽的多肽。

A8.根据实施方式A1至A7.1中任一项所述的方法，其中所述细胞来自受试者。

A9.根据实施方式A1至A7.1中任一项所述的方法，其中所述细胞来自细胞系。

A10.根据实施方式A1至A9中任一项所述的方法，其中所述细胞是分离的细胞。

A11.根据实施方式A1至A10中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。

A12.根据实施方式A6所述的方法，其中所述细胞是单核细胞。

A13.根据实施方式A6所述的方法，其中所述细胞是巨噬细胞。

A14.根据实施方式A1至A10中任一项所述的方法，其中所述细胞是非免疫细胞。

A15.根据实施方式A14所述的方法，其中所述细胞是基质细胞或者衍生自中枢神经系统的细胞。

A16.根据实施方式A1至A15中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述第一组合物和所述第二组合物离体或体外接触。

A17.根据实施方式A1至A16中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组镍纹蛋白-β多肽。

A18.根据实施方式A1至A16中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是人镍纹蛋白-β多肽。

A19.根据实施方式A18所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组人镍纹蛋白-β多肽。

A20.根据实施方式A18或A19所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。

A21.根据实施方式A18或A19所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸46-311。

A22.根据实施方式A18或A19所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的片段。

A23.根据实施方式A18或A19所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

A24.根据实施方式A18或A19所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含含有SEQID NO:1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代的片段。

A25.根据实施方式A1至A16中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是小鼠镍纹蛋白-β多肽。

A26.根据实施方式A25所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组小鼠镍纹蛋白-β多肽。

A27.根据实施方式A25或A26所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列。

A28.根据实施方式A25或A26所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:3的氨基酸46-311。

A29.根据实施方式A25或A26所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的片段。

A30.根据实施方式A25或A26所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

A31.根据实施方式A25或A26所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含含有SEQID NO:3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代的片段。

A32.根据实施方式A1至A31中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含一种或多种化学修饰。

A33.根据实施方式A1至A32中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含标签。

A34.根据实施方式A1至A33中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含可检测标记。

A35.根据实施方式A1至A34中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含融合多肽。

B1.一种试剂盒，其包括：

a)包含IFN-γ多肽的第一组合物；

b)一种或多种用于测量细胞因子和/或趋化因子产生的组分，其中所述细胞因子和/或趋化因子选自CCL2、CXCL10、IL-6和IL-1RA中的一种或多种；以及

c)使用说明书。

B1.1一种试剂盒，其包括：

a)第一组合物，所述第一组合物包含一种或多种选自IFN-γ、IL-4、IL-10和TGFβ多肽的共刺激剂；

b)一种或多种用于测量细胞因子和/或趋化因子产生的组分，其中所述细胞因子和/或趋化因子选自CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、IL-6和IL-1RA中的一种或多种；以及

c)使用说明书。

B2.根据实施方式B1或B1.1所述的试剂盒，其还包括包含镍纹蛋白-β多肽的第二组合物。

B3.根据实施方式B2所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组镍纹蛋白-β多肽。

B4.根据实施方式B2所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽是人镍纹蛋白-β多肽。

B5.根据实施方式B4所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组人镍纹蛋白-β多肽。

B6.根据实施方式B4或B5所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。

B7.根据实施方式B4或B5所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸46-311。

B8.根据实施方式B4或B5所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的片段。

B9.根据实施方式B4或B5所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

B10.根据实施方式B4或B5所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含含有SEQID NO:1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代的片段。

B11.根据实施方式B2所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽是小鼠镍纹蛋白-β多肽。

B12.根据实施方式B10所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组小鼠镍纹蛋白-β多肽。

B13.根据实施方式B11或B12所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列。

B14.根据实施方式B11或B12所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:3的氨基酸46-311。

B15.根据实施方式B11或B12所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的片段。

B16.根据实施方式B11或B12所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

B17.根据实施方式B11或B12所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代的片段。

B18.根据实施方式B2至B17中任一项所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含一种或多种化学修饰。

B19.根据实施方式B2至B18中任一项所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含标签。

B20.根据实施方式B2至B19中任一项所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含可检测标记。

B21.根据实施方式B2至B20中任一项所述的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含融合多肽。

B22.根据实施方式B2至B21中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种用于测量细胞因子产生的组分中的每一种包含在结合条件下免疫特异性结合细胞因子之一的结合分子。

B23.根据实施方式B2至B22中任一项所述的试剂盒，其还包括细胞或细胞群。

C1.一种用于鉴定细胞是否表达或者能够表达镍纹蛋白-β受体的方法，其包括：

a)使细胞与包含刺激剂的第一组合物接触；

b)在结合条件下使所述细胞与包含镍纹蛋白-β多肽的第二组合物接触；

c)检测结合至所述细胞的镍纹蛋白-β多肽的存在、不存在和/或量；以及

d)根据(c)中检测的镍纹蛋白-β多肽的存在、不存在和/或量，鉴定所述细胞是否表达或者能够表达镍纹蛋白-β受体。

C2.根据实施方式C1所述的方法，其中所述刺激剂包括可溶蛋白。

C2.1根据实施方式C1或C2所述的方法，其中所述刺激剂包括细胞因子或趋化因子。

C2.2根据实施方式C1至C2.1中任一项所述的方法，其中所述刺激剂包括IFN-γ。

C2.3根据实施方式C1至C2.1中任一项所述的方法，其中所述刺激剂包括一种或多种选自IFN-γ、IL-4、IL-10和TGFβ的多肽。

C3.根据实施方式C1至C2.3中任一项所述的方法，其中所述细胞来自受试者。

C4.根据实施方式C3所述的方法，其中所述受试者患有疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患，或者怀疑患有疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患。

C5.根据实施方式C4所述的方法，其中所述疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的特征在于镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达改变。

C5.1根据实施方式C4所述的方法，其中所述疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的特征在于镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达提高。

C5.2根据实施方式C4所述的方法，其中所述疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的特征在于镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达降低。

C6.根据实施方式C1至C2.2中任一项所述的方法，其中所述细胞来自细胞系。

C7.根据实施方式C1至C6中任一项所述的方法，其中所述细胞是分离的细胞。

C8.根据实施方式C1至C7中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。

C9.根据实施方式C8所述的方法，其中所述细胞是单核细胞。

C10.根据实施方式C8所述的方法，其中所述细胞是巨噬细胞。

C11.根据实施方式C1至C7中任一项所述的方法，其中所述细胞是非免疫细胞。

C12.根据实施方式C11所述的方法，其中所述细胞是基质细胞或者衍生自中枢神经系统的细胞。

C13.根据实施方式C1至C12中任一项所述的方法，其中所述方法是离体或体外进行的。

C14.根据实施方式C1至C13中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组镍纹蛋白-β多肽。

C15.根据实施方式C1至C13中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是人镍纹蛋白-β多肽。

C16.根据实施方式C15所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组人镍纹蛋白-β多肽。

C17.根据实施方式C1至C13中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是小鼠镍纹蛋白-β多肽。

C18.根据实施方式C17所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组小鼠镍纹蛋白-β多肽。

C19.根据实施方式C1至C18中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含标签。

C20.根据实施方式C19所述的方法，其中(c)包括使所述镍纹蛋白-β多肽与能够结合至标签的物质接触。

C21.根据实施方式C20所述的方法，其中所述物质是抗体。

C22.根据实施方式C1至C18中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含结合对的第一成员。

C23.根据实施方式C22所述的方法，其中(c)包括使所述镍纹蛋白-β多肽与所述结合对的第二成员接触。

C24.根据实施方式C1至C18中任一项所述的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含可检测标记。

C25.根据实施方式C24所述的方法，其中(c)包括检测所述可检测标记。

***

本文引用的每个专利、专利申请、出版物和文献的全部内容据此以引用方式并入本文。上述专利、专利申请、出版物和文献的引用既不承认任何前述内容都是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。它们的引用并不指示检索的相关公开内容。关于文献的日期或内容的所有陈述均基于可用信息，而并不是对其准确性或正确性的承认。

在不偏离本技术的基本方面的情况下，可以对前述内容进行修改。尽管已经参考一个或多个具体实施方式相当详细地描述了本技术，但是本领域的普通技术人员将认识到，可以对本申请中具体公开的实施方式进行改变，然而这些修改和改进在本技术的范围和精神之内。

本文例示性描述的技术可适当地在不存在本文未具体公开的任何要素的情况下来实践。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一者可以被其它两个术语中的任一者替代。所采用的术语和表达被作为描述而非限制的术语使用，并且使用的此类术语和表达不排除所示出和描述的特征的任何等同物或其部分，并且在所要求保护的技术的范围之内各种修改均是可能的。术语“一种”或“一个”可指其修饰的一个或多个要素(例如，“一种试剂”可意指一种或多种试剂)，除非上下文清楚地描述了一个要素或多于一个要素。如本文所用，术语“约”是指在基础参数的10％内的值(即，加或减10％)，并且在一系列值的开头使用的术语“约”修饰所述值中的每一者(即，“约1、2和3”是指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量可以包括90克与110克之间的重量。此外，当本文描述值的列表(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)时，该列表包括其所有中间值和分数值(例如，54％、85.4％)。因此，应当理解，尽管本发明技术已经由代表性实施方式和可选的特征具体地公开，但是本领域技术人员可采用本文所公开的概念的修改和变化，并且认为此类修改和变化在该技术的范围之内。

在随后的权利要求中阐述了本技术的某些实施方式。

Claims

1.一种用于评估镍纹蛋白-β多肽的活性的方法，其包括：

b)测量所述细胞的选自CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、IL-6和IL-1RA的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生，从而测量细胞因子产生；以及

2.权利要求1的方法，其中与未接触所述第一组合物和所述第二组合物的细胞的产生相比，所述一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生增加。

3.权利要求1的方法，其中与接触所述第一组合物且未接触所述第二组合物的细胞的产生相比，所述一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生增加或减少。

4.权利要求3的方法，其中与接触所述第一组合物且未接触所述第二组合物的细胞的产生相比，所述一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生增加或减少至少约10％。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中使所述细胞与所述第一组合物和所述第二组合物同时接触。

6.权利要求1至4中任一项的方法，其包括在所述细胞与所述第二组合物接触之前，使所述细胞与所述第一组合物接触。

7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述共刺激剂包含选自IFN-γ、IL-4、IL-10和TGFβ的一种或多种多肽。

8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述细胞来自受试者。

9.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述细胞来自细胞系。

10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述细胞是分离的细胞。

11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述细胞是免疫细胞。

12.权利要求6的方法，其中所述细胞是单核细胞。

13.权利要求6的方法，其中所述细胞是巨噬细胞。

14.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述细胞是非免疫细胞。

15.权利要求14的方法，其中所述细胞是基质细胞或者衍生自中枢神经系统的细胞。

16.权利要求1至15中任一项的方法，其中使所述细胞与所述第一组合物和所述第二组合物离体或体外接触。

17.权利要求1至16中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组镍纹蛋白-β多肽。

18.权利要求1至16中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是人镍纹蛋白-β多肽。

19.权利要求18的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组人镍纹蛋白-β多肽。

20.权利要求18或19的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

21.权利要求18或19的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸46-311。

22.权利要求18或19的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段。

23.权利要求18或19的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

24.权利要求18或19的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含片段，所述片段包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

25.权利要求1至16中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是小鼠镍纹蛋白-β多肽。

26.权利要求25的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组小鼠镍纹蛋白-β多肽。

27.权利要求25或26的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

28.权利要求25或26的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸46-311。

29.权利要求25或26的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段。

30.权利要求25或26的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

31.权利要求25或26的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含片段，所述片段包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

32.权利要求1至31中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含一种或多种化学修饰。

33.权利要求1至32中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含标签。

34.权利要求1至33中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含可检测标记。

35.权利要求1至34中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含融合的多肽。

36.一种试剂盒，其包括：

a)第一组合物，所述第一组合物包含选自IFN-γ、IL-4、IL-10和TGFβ多肽的一种或多种共刺激剂；

b)用于测量细胞因子和/或趋化因子产生的一种或多种组分，其中所述细胞因子和/或趋化因子选自CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、IL-6和IL-1RA中的一种或多种；以及

c)使用说明书。

37.权利要求36的试剂盒，其进一步包含第二组合物，所述第二组合物包含镍纹蛋白-β多肽。

38.权利要求37的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组镍纹蛋白-β多肽。

39.权利要求37的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽是人镍纹蛋白-β多肽。

40.权利要求39的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组人镍纹蛋白-β多肽。

41.权利要求39或40的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

42.权利要求39或40的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸46-311。

43.权利要求39或40的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段。

44.权利要求39或40的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

45.权利要求39或40的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含片段，所述片段包含SEQID NO:1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

46.权利要求37的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽是小鼠镍纹蛋白-β多肽。

47.权利要求45的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组小鼠镍纹蛋白-β多肽。

48.权利要求46或47的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

49.权利要求46或47的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸46-311。

50.权利要求46或47的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段。

51.权利要求46或47的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

52.权利要求46或47的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含片段，所述片段包含SEQID NO:3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

53.权利要求37至52中任一项的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含一种或多种化学修饰。

54.权利要求37至53中任一项的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含标签。

55.权利要求37至54中任一项的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含可检测标记。

56.权利要求37至55中任一项的试剂盒，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含融合的多肽。

57.权利要求36至56中任一项的试剂盒，其中所述用于测量细胞因子产生的一种或多种组分中的每一种包含在结合条件下免疫特异性结合所述细胞因子之一的结合分子。

58.权利要求36至57中任一项的试剂盒，其进一步包含细胞或细胞群。

59.一种用于鉴定细胞是否表达或者能够表达镍纹蛋白-β受体的方法，其包括：

a)使细胞与包含刺激剂的第一组合物接触；

c)检测与所述细胞结合的镍纹蛋白-β多肽的存在、不存在和/或量；以及

60.权利要求59的方法，所述刺激剂包含可溶蛋白。

61.权利要求59或60的方法，所述刺激剂包含细胞因子或趋化因子。

62.权利要求59至61中任一项的方法，所述刺激剂包含选自IFN-γ、IL-4、IL-10和TGFβ的一种或多种多肽。

63.权利要求59至62中任一项的方法，其中所述细胞来自受试者。

64.权利要求63的方法，其中所述受试者患有疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患，或者怀疑患有疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患。

65.权利要求64的方法，其中所述疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的特征在于镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达改变。

66.权利要求64的方法，其中所述疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的特征在于镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达提高。

67.权利要求64的方法，其中所述疾病、障碍、综合征、病症、感染或疾患的特征在于镍纹蛋白-β和/或镍纹蛋白-β受体的表达降低。

68.权利要求59至62中任一项的方法，其中所述细胞来自细胞系。

69.权利要求59至66中任一项的方法，其中所述细胞是分离的细胞。

70.权利要求59至69中任一项的方法，其中所述细胞是免疫细胞。

71.权利要求70的方法，其中所述细胞是单核细胞。

72.权利要求70的方法，其中所述细胞是巨噬细胞。

73.权利要求59至69中任一项的方法，其中所述细胞是非免疫细胞。

74.权利要求73的方法，其中所述细胞是基质细胞或者衍生自中枢神经系统的细胞。

75.权利要求59至74中任一项的方法，其中所述方法是离体或体外进行的。

76.权利要求59至75中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组镍纹蛋白-β多肽。

77.权利要求59至75中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是人镍纹蛋白-β多肽。

78.权利要求77的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组人镍纹蛋白-β多肽。

79.权利要求59至75中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是小鼠镍纹蛋白-β多肽。

80.权利要求79的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽是重组小鼠镍纹蛋白-β多肽。

81.权利要求59至80中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含标签。

82.权利要求81的方法，其中(c)包括使所述镍纹蛋白-β多肽与能够与所述标签结合的物质接触。

83.权利要求82的方法，其中所述物质是抗体。

84.权利要求59至80中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含结合对的第一成员。

85.权利要求84的方法，其中(c)包括使所述镍纹蛋白-β多肽与所述结合对的第二成员接触。

86.权利要求59至80中任一项的方法，其中所述镍纹蛋白-β多肽包含可检测标记。

87.权利要求86的方法，其中(c)包括检测所述可检测标记。