CN101472611A - 调节il-22和il-17的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了通过使用IL－22与至少一种IL－17A、IL－17F或IL－23组合或者通过使用IL－22拮抗剂(例如抗体或可溶性受体或结合蛋白)与至少一种IL－17A、IL－17F或IL－23的拮抗剂组合，调节免疫反应的方法。

Description

调节IL-22和IL-17的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2006年6月19日提交的美国临时申请号No.60/814,573的优先权，其全部公开内容是本申请所依赖的并且被引入作为参考。
技术领域
本发明涉及通过使用IL-22与至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23组合或者通过使用IL-22拮抗剂(例如抗体或可溶性受体或结合蛋白)与至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂的组合来调节免疫反应的方法。
背景
已经明确确定了CD4T细胞在调节免疫反应和疾病中的作用。白细胞介素-22(IL-22)是II类细胞因子，其通过IL-9或ConA在T细胞中被上调(Dumoutier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97(18)：10144-49)。IL-22的一个功能是通过诱导抗微生物肽(包括β-防卫素2(hBD-2)、S100A7、S100A8和S100A9)的表达来增强外周组织的先天免疫(Wolk等人，Immunity(2004)21：241-54；Boniface等人，J.Immunol.(2005)174：3695-3702)。其它研究已经显示了IL-22 mRNA的表达响应LPS施用而在体内被诱导，并且IL-22调节指示了急性期反应的参数(Dumoutier L.等人(2000)；Pittman等人，Genes和Immunity，(2001)2：172)。总之，这些观察指示了IL-22在炎症中起作用(Kotenko S.V.，Cytokine & GrowthFactor Reviews(2002)13(3)：223-40)。一些T细胞病症，包括牛皮癣(Wolk等人，Immunity(2004)21：241-54)，类风湿性关节炎(Ikeuchi H.等人Arthritis Rheum 52：1037-1046)和炎症性肠病(Andoh，A.等人Gastroenterology 129：969-984)与IL-22的水平增加相关。
近期的数据已经证明了新的CD4+效应物谱系的存在，所述CD4+效应物谱系是由其表达IL-17A和IL-17F的能力所定义的(在下文中被称作Th17谱系)。(Aggarwal等人，J.Biol.Chem.，(2003)278：1910-14；Langrish等人，J.Exp.Med.，(2005)201：233-40；Harrington等人，Nat.Immunol.，(2005)6：1123-32；Park等人，Nat.Immunol.，(2005)6：1133-41；Veldhoen等人，Immunity，(2006)24：179-89；Mangan等人，Nature，(2006)441：231-34；Bettelli等人，Nature，(2006)441：235-38)。Th17细胞分化是由在促炎细胞因子(特别是IL-6，以及还有IL-1β和TNF-α)的背景中TGF-β信号传导所起始的。相反，Th17细胞的维持和存活取决于IL-23，其是包含IL-12p40和IL-23p19亚基的IL-12家族成员。缺乏IL-23的小鼠在一些鼠疾病和感染模型中产生显著更少的IL-17(Langrish等人，J.Exp.Med.，(2005)201：233-40；Murphy等人，J.Exp.Med.，(2003)198：1951-57；Happel等人，J.Exp.Med.，(2005)202：761-69；Khader等人，J.Immunol.，(2005)175：788-95)。因此，Th17分化是由TGF-β以及促炎细胞因子起始的并且随后由IL-23维持。
IL-17家族包含5个家族成员——IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(IL-25)，和IL-17F——它们共有17至55％之间的相对同源性(Aggarwal等人，Cytokine Growth Factor Rev.，(2003)14：155-74；Kolls等人，Immunity，(2004)21：467-76)。IL-17家族成员的表达是非常多样的。IL-17A和IL-17F是最同源的(55％)，在人染色体1上彼此邻近。与Th1或Th2细胞相比，在Th17细胞中IL-17A和IL-17F mRNA以更高水平表达。相反，IL-17B、IL-17C，和IL-17D在非淋巴组织中显著表达。IL-17E(IL-25)在Th2细胞中表达(Fort等人，Immunity，(2001)15：985-95)。除了IL-17A和IL-17F，也已经鉴定了TNF-α、IL-6和GM-CSF作为下述基因，所述基因被IL-23所诱导并且被Th17细胞潜在地表达(Langrish等人，J.Exp.Med.，(2005)201：233-40；Infante-Duarte等人，J.Immunol.，(2000)165：6107-15)。但是，由于Th1细胞可以表达TNF-α并且Th2细胞可以表达IL-6和GM-CSF，因此IL-6、TNF-α和GM-CSF的表达不限于Th17谱系。相反，Th17细胞被认为以谱系特异性方式产生IL-17A和IL-17F。
CD4效应细胞的亚型参与多种不同的疾病。在一些情形中，它们的活性对于生物是有帮助的。但是在其它疾病中，它们的活性是不希望的乃至是有害的。造成特定病理原因的CD4效应物群体中的细胞的那些亚型的鉴定允许靶向调节那些细胞，而无其它CD4效应细胞的不需要的阻抑。类似地，细胞亚型产生的细胞因子以及那些细胞因子如何相互作用的知识是开发全面疗法的前提，所述疗法提供了对涉及那些细胞因子的疾病的改善的操作。因此，本领域需要对于由CD4效应细胞的Th17谱系产生的细胞因子的进一步表征。
本申请通过以下来达到这一需求：通过表明IL-22(最初作为Th1细胞因子所描述的IL-10家族成员)也是Th17细胞因子，其可以与IL-17A或IL-17F合作(以及在一些情形中协同)作用。此外，也证明了通过IL-23对IL-22的诱导。
概述
本申请提供了通过使用白细胞介素-22(“IL-22”)与至少一种白细胞介素-17A(“IL-17A”)、白细胞介素-17F(“IL-17F”)或白细胞介素-23(“IL-23”)组合，或者通过使用IL-22拮抗剂(例如抗体或可溶性受体或结合蛋白)与至少一种IL-17A、IL-17F，或IL-23的拮抗剂组合，调节免疫反应的方法。
在一个实施方案中，该方法包括诊断、预防和/或治疗与IL-22和至少一种的IL-17A、IL-17F或IL-23相关的疾病。这可以通过(至少部分地)使用包含两种或多种抑制IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂(例如抗体、可溶性受体或结合蛋白)的组合物来实现。
用于预防和/或治疗疾病的拮抗剂的组合物和组合减少了IL-22以及至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的活性。例如，任何细胞因子的活性可以通过将其与包含结合所述细胞因子并且抑制其功能的抗体的组合物相接触来减少或抑制。细胞因子的功能性活性也可以通过使用物质减少或抑制其通过细胞受体的信号传导来影响，所述物质例如抗体或可溶性受体，抑制或减少通过细胞因子受体的信号传导。
本申请还提供了通过施用IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23来刺激免疫反应的方法。例如，当哺乳动物受到病原体(例如细菌或病毒)的感染，或者当将免疫原作为疫苗的一部分施用给哺乳动物时，需要免疫反应的刺激。因此，在一个实施方案中，本申请提供了在细胞(例如角质形成细胞)中诱导抗微生物肽的表达的方法，包括向细胞施用IL-22和IL-17A、IL-22和IL-17F、IL-22和IL-23，或IL-22、IL-17A和IL-17F。抗微生物肽可以是例如β-防卫素家族的成员，包括人β-防卫素1或人β-防卫素2；钙结合蛋白的S100家族的成员，包括S100A7、S100A8、或S100A9；组织蛋白酶抑制素，包括人组织蛋白酶抑制素LL-37(见Lee等人，PNAS(2005)102：3750-55)；或其组合。其他实施方案涉及诱导抗微生物肽的方法，包括向哺乳动物例如人施用在哺乳动物中有效诱导抗微生物肽的量的IL-22和IL-17A，IL-22和IL-17F，或IL-22、IL-17A和IL-17F。其他实施方案还涉及在细胞(例如角质形成细胞)中抑制或减少抗微生物肽的表达的方法，包括向细胞施用IL-22的拮抗剂，或者IL-22的拮抗剂和IL-17A的拮抗剂，IL-22的拮抗剂和IL-17F的拮抗剂，或者IL-22的拮抗剂、IL-17A的拮抗剂和IL-17F的拮抗剂，或者IL-22的拮抗剂、IL-17A的拮抗剂和IL-17F的拮抗剂。另一实施方案涉及抑制或减少抗微生物肽的表达的方法，包括向哺乳动物例如人施用IL-22的拮抗剂，或者IL-22的拮抗剂和IL-17A的拮抗剂，IL-22的拮抗剂和IL-17F的拮抗剂，或者IL-22的拮抗剂、IL-17A的拮抗剂和IL-17F的拮抗剂，所施用的量有效抑制或减少抗微生物肽的表达。在另一个实施方案中，IL-22和至少一种的IL-17A、IL-17F或IL-23被用作佐剂。例如，佐剂可以包含IL-22和IL-17A、IL-22和IL-17F、IL-22和IL-23，或者IL-22、IL-17A和IL-17F。疫苗中的目的免疫原可以是例如病毒抗原、细菌抗原或肿瘤抗原。本申请还提供了包含本文描述的佐剂(单独或者与免疫原组合)的试剂盒。
用于诊断与IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23相关的疾病的组合物仅需要检测细胞因子蛋白质或表达细胞因子的核酸。抗体和可溶性受体是可以用于检测细胞因子蛋白质的组合物中的物质的实例。可以通过多种标准技术，例如聚合酶链式反应(PCR)来检测表达细胞因子蛋白质的核酸。
在一个方面中，方法包括治疗患有与IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23相关的病症的受试者。该方法包括向受试者施用足以减少或抑制IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的活性的量的组合物，从而治疗所述病症。在一些实施方案中，组合物包含IL-22拮抗剂，以及至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂。在另一实施方案中，组合物包含一种或多种抗体，以及一种或多种可溶性受体或结合蛋白的组合。
可以用于本发明中的拮抗剂包括抗体；可溶性受体(包括截短的受体、天然可溶性受体，或者包含与另一蛋白质融合的受体(或其片段)的融合蛋白质，所述另一蛋白质例如免疫球蛋白的Fc部分)；肽抑制剂；小分子；配体融合体(ligand fusions)；以及结合蛋白。结合蛋白的实例包括描述在US2003/0170839中的天然存在的IL-22结合蛋白(或其片段)，所述文献的内容在此以其整体引入作为参考。小分子模块制药技术(SmallModular Immunopharmaceutical(SMIPTM))(特鲁宾制药公司(TrubionPharmaceuticals)，Seattle，WA)提供了包含结合结构域多肽的变体分子的实例。SMIP和其用途以及应用公开在例如美国公开的专利申请No.2003/0118592、2003/0133939、2004/0058445、2005/0136049、2005/0175614、2005/0180970、2005/0186216、2005/0202012、2005/0202023、2005/0202028、2005/0202534和2005/0238646，以及其相关的专利族成员中，所有这些在本文以其全文引入作为参考。
SMIPTM通常涉及结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，其包括结合结构域多肽，其与免疫球蛋白绞合部或者绞合部作用区域多肽融合或者以其它方式与其连接，后者随后与下述区域融合或以其它方式与其连接，所述区域包含一个或多个来自免疫球蛋白重链的天然或经改造的恒定区(CH1除外)，例如IgG和IgA的CH2和CH3区域，或者IgE的CH3和CH4区域(更多详细描述见例如Ledbetter，J.等人的U.S.2005/0136049，其被引入作为参考)。结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白可进一步包括这样的区域，所述区域包括与铰链区多肽融合或以其他方式与之连接的天然或经改造的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽(或就全部或部分衍生自IgE的构建体而言为CH3)，和与CH2恒定区多肽(或就全部或部分衍生自IgE的构建体而言为CH3)融合或以其他方式与之连接的天然或经改造的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽(或就全部或部分衍生自IgE的构建体而言为CH4)。通常，这样的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能够具有至少一种选自以下的免疫活性：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、补体结合，和/或与靶标例如靶抗原如人IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23结合。
在一个实施方案中，拮抗剂是VHH分子(或纳米抗体(nanobody))，如本领域技术人员已知的，其为来自天然不存在轻链的免疫球蛋白的重链可变区，所述免疫球蛋白例如来自如WO 9404678和美国专利号No.5,759,808中描述的驼科(Camelidae)的那些，所述文献均在本文引用作为参考。此类VHH分子可以来自在驼科物种中出现的抗体，例如在骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼和原驼中产生的抗体，并且有时被称作骆驼科动物的可变结构域或骆驼科动物化(camelized)可变结构域。见例如，引入本文作为参考的Muyldermans.，J.Biotechnology(2001)74(4)：277-302。除骆驼科外的其它物种可以产生天然不含轻链的重链抗体。VHH分子比IgG分子小大约10倍。它们是单一的多肽并且非常稳定，抵抗极端pH和温度条件。此外，它们抵抗蛋白酶的作用，常规抗体则不然。另外，体外表达VHH产生了高产量、适当折叠的功能性VHH。还有，在骆驼科中产生的抗体将识别这样的表位，所述表位不同于通过使用抗体文库体外产生的或者通过免疫除骆驼科外的其它哺乳动物所产生的抗体识别的那些(见WO 9749805和美国专利申请公开2004/0248201，它们均在本文引入作为参考)。
因此，在一个实施方案中，组合物包含与IL-22结合的第一抗体和与IL-17A、IL-17F或IL-23之一结合的第二抗体。在另一个实施方案中，组合物包含与IL-22结合的抗体和与IL-17A、IL-17F或IL-23结合的可溶性受体(或结合蛋白)。在另一个实施方案中，组合物包含与IL-22结合的可溶性受体和与IL-17A、IL-17F或IL-23结合的抗体或可溶性受体(或结合蛋白)。在另一个实施方案中，组合物包含IL-22结合蛋白和与IL-17A、IL-17F或IL-23结合的抗体或可溶性受体(或结合蛋白)。
可以单独或与本文描述的其它治疗剂组合将组合物施用给受试者。受试者可以是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，可以局部(locally)(例如局部(topically)、皮下或不在全身循环中的其它施用)施用组合物。在其它实施方案中，向全身循环施用组合物，例如通过静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)施用。不同的激动剂和拮抗剂可以被同时或相继施用。
与一种或多种IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23相关的病症的实例包括呼吸病、炎症性病症和自身免疫病症。特别地，与一种或多种IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23相关的病症包括关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、狼疮相关性关节炎或强直性脊椎炎)、硬皮病、系统性红斑性狼疮、血管炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括变应性皮炎和湿疹性皮炎)、重症肌无力，炎症性肠病(IBD)，克隆病，结肠炎，糖尿病(I型)；例如皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统的炎症(例如阿尔茨海默病)、肝脏的炎症(例如肝炎)、肾脏的炎症(例如肾炎)以及胰脏的炎症(例如胰腺炎)的炎症性病况；心血管病症，例如胆固醇代谢病症、氧自由基损伤(oxygen free radical injury)、局部缺血；创伤愈合相关病症；呼吸病，例如哮喘和COPD(例如囊性纤维化)；急性炎症性病况(例如，内毒素血症、败血症、中毒性休克综合征和感染性疾病)；移植排斥和过敏。
在另一个实施方案中，本申请提供了治疗牛皮癣的方法，通过向牛皮癣患者施用治疗有效量的包含IL-17F拮抗剂(例如抗体或可溶性受体)的组合物。可以将IL-17F拮抗剂单独施用或与IL-22拮抗剂(例如抗体、可溶性受体或结合蛋白)组合施用。
在另一方面中，本申请提供了在体外在样品中检测IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的存在的方法。样品可以包括生物材料例如血液、血清、血浆、组织、活检和支气管肺泡灌洗。目标方法可以用于诊断病症，如本申请中描述的，例如与一种或多种IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23相关的病症。此类方法可以包括：(1)将样品或对照样品与结合IL-22的第一试剂和结合IL-17A、IL-17F或IL-23的第二试剂接触，以及(2)检测第一和第二试剂与样品或对照样品之间的复合物的形成，其中相对于对照样品，在样品中复合物形成有统计学显著的变化表明样品中存在细胞因子。在一个实施方案中，方法包括将包含细胞的样品与经标记试剂相接触，所述经标记试剂，例如荧光抗体，在细胞中与IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23相结合。在细胞中检测的试剂的量与在细胞中表达的细胞内IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23的量成比例。
在另一个方面中，本申请提供了体内检测方法(例如受试者中的体内成像)。该方法可以用于诊断病症，包括本申请中描述的那些病症。此类方法包括(1)向受试者或对照受试者(在允许所述第一和第二试剂与它们的细胞因子相结合的条件下)施用与IL-22结合的第一试剂和与IL-17A、IL-17F或IL-23结合的第二试剂，以及(2)检测第一和第二试剂与它们的细胞因子之间的复合物的形成，其中相对于对照(例如对照受试者)，在受试者中复合物形成有统计学显著的变化表明存在细胞因子。
用在本发明方法中与细胞因子结合的试剂的实例包括抗体、可溶性受体和结合蛋白。这些试剂可以用可检测的物质直接或间接标记以促进检测。适当的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。
公开的其它方面将部分地在说明书中说明，并且部分地从说明书中显而易见，或者可以通过实践本发明获悉。某些实施方案已经在权利要求中阐明并且特别指出，并且该公开内容不应理解为限制权利要求的范围。下列详细的描述包括多种实施方案的示例性代表，其不限制所要求保护的主题。附图与描述一起构成了本说明书的一部分，仅仅是为了说明实施方案而非限制本发明。
附图简述
图1：Th1、Th2和Th17细胞的细胞因子转录物表达模式。(A)被诱导分化成Th1、Th2和Th17细胞的细胞中相对细胞因子表达的定量PCR分析。(B)在Th1、Th2和Th17细胞中诱导的相对IL-22水平。(C)在Th1、Th2和Th17细胞中的IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-21、IL-24、IL-25，和IL-31的相对水平。(D)在Th1、Th2和Th17细胞中IL-1、IL-7、IL-11、IL-15、IL-16、IL-18、IL-19、IL-20、IL-27和IL-28的相对水平。
图2.在T细胞亚群中IL-22和IL-17A蛋白质的表达水平。(A)在多种细胞因子、抗体和抗原存在时活化后的IL-22、IL-17A和IFN-γ蛋白质的水平。(B)在用抗原和多种细胞因子和抗体重新刺激的分化的细胞中的IL-22的水平。
图3.外源IL-22添加的影响。(A)在添加外源IL-22后在标明的群体中IL-22R1转录物的水平。(B)稚细胞响应外源IL-22的增殖。(C)响应外源IL-22，Th1细胞产生IFN-γ。(D)响应外源IL-22通过Th2细胞的IL-4产生。(E)响应外源IL-22通过Th17细胞的IL-17产生。
图4.T细胞群体中细胞内细胞因子水平。(A)在Th1、Th2和Th17细胞中IL-22与IFN-γ或IL-17A共表达的流式细胞分析。(B)在标明的细胞因子存在时培养的表达IL-22的CD4细胞中IL-17A和IL-17F共表达的流式细胞分析。(C)抗-TGF-β添加对IL-22水平的影响。
图5通过IL-23对产生IL-22的细胞的扩充。(A)与抗原和标明的细胞因子一起培养的幼稚T细胞中对于IL-22的细胞内染色。图表明了培养物中IL-22细胞的百分比，其作为时间的函数，而点图表明在第2和第4天IL-22和IL-17A的水平。(B)细胞在第4天的CFSE模式，所述细胞被分成4组：IL-22+IL-17A-、IL-22+IL-17A+、IL-22-IL-17A+，和IL-22-IL-17A-。(C)与LPS活化的DC、OVAp和对IL-23R或IL-12p40的中和抗体一起培养的幼稚DO11T细胞中的IL-22的表达。
图6.在IL-6或IL-23不存在时IL-22的体内表达。在用OVA免疫后在C57BL/6IL-6-/-(A)和C57BL/6IL-23p19-/-(B)小鼠中IL-22的表达。也显示了在野生型(WT)小鼠中IL-22的表达。
图7.体内IL-22与IL-17A和IL-17F共表达的流式细胞和ELISA分析。(A)就CD4与IL-22、IL-17A、IL-17F或同种型对照染色的LN细胞。(B)在CD4+ T细胞中与IFN-γ、IL-17A、IL-17F、IL-4和IL-10相关的IL-22表达。(C)在多种IL-17A+和IL-17F+群体中IL-22的表达。(D)在IL-22+细胞中IL-17A和IL-17F的表达。(E)通过ELISA在再刺激的第4天确定的IL-22和IL-17A的浓度。
图8.通过人Th17细胞和人Th1细胞的IL-22产生的分析。(A)在与标明的细胞因子和抗体一起进行人CD4+ T细胞培养后的IL-22和IL-17A的表达。每条线代表单个供体。(B)就在(A)中检查的六个供体中的每个计算表达IL-22的细胞的Th1或Th17细胞的百分比。通过IFN-γ的表达定义“Th1”细胞(空白条)。通过IL-17A的表达定义“Th17细胞”(条纹条)。
图9.TGF-β对于IL-22表达的影响。(A)用标明的细胞因子和抗体与人CD4+T细胞一起培养后的IL-22和IL-17A的表达。(B)用1μg/mlOVAp和IL-6活化的来自DO11.10小鼠的幼稚CD62L+CD4+ T细胞的IL-22的表达。如所标明的添加外源TGF-β细胞因子和TGF-β的中和抗体。
图10.IL-22不依赖IL-6诱导血清淀粉样蛋白A(SAA)。(A)在IL-22注射后的SAA血清ELISA。(B)在IL-22注射后，对SAA1、凝血因子I、触珠蛋白和清蛋白的定量PCR(根据β2微球蛋白进行标准化)。(C)在IL-22施用后血清IL-6和
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的ELASA。(D)对施用了IL-22的C57BL/6和C57BL/6IL-6-/-小鼠进行SAA血清ELISA。
图11.在IL-22施用后的嗜中性粒细胞数目和CXCL1水平。(A)在标明的时间点处确定的嗜中性粒细胞数目。(B)血清中的CXCL1蛋白质水平。(C)肝中CXCL1转录物水平的定量PCR。
图12.IL-22与IL-17A或IL-17F诱导的抗微生物肽转录物的定量PCR分析。(A)在用IL-22、IL-17A或IL-17F处理的初级人角质形成细胞中hBD-2、S100A7、S100A8和S100A9转录物的诱导倍数。(B)在用IL-22、IL-17A和IL-17F的组合成对处理的初级人角质形成细胞中hBD-2、S100A7、S100A8和S100A9转录物的诱导倍数。
图13.在牛皮癣患者的受损皮肤中IL-22、IL-17A、IL-17F和IL-23p19转录物表达。(A)IL-22、IL-17A、IL-17F和IL-23p19的定量PCR分析。(B)IL-22和IL-17A、IL-22和IL-17F、IL-17A和IL-17F、IL-22和IL-23、IL-23和IL17A，以及IL-23和IL-17F之间的斯皮尔曼等级相关分析。
详细描述
I.定义
为了使本发明更容易地被理解，首先定义了某些术语。在详细描述中阐明了额外的定义。
术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段，包括含抗原结合片段或抗原结合结构域的任何多肽。该术语包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体和体外产生的抗体。除非前面出现措辞“完整”，否则术语“抗体”包括抗体片段，如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、dAb和保留抗原结合功能的其它抗体片段。本发明不必须限制于任何特定的来源、产生方法或抗体的其他特定特征。此外，可以将抗体用可检测或功能性标志物来标记。这些标志物包括放射标记(例如131I或99Tc)，酶促标记(例如辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶)，以及其它化学部分(例如生物素)。
表述“抑制”或“拮抗”细胞因子活性和其关联物是指减少、抑制或缩小细胞因子的至少一种活性，这是由于抗细胞因子抗体或可溶性受体与细胞因子结合或者由于竞争结合细胞因子受体，其中减少是相对于在同样的抗体、可溶性受体或竞争性抑制剂不存在时细胞因子的活性。可以使用本领域已知的任何技术测量活性。抑制或拮抗不必需表明细胞因子生物活性全部消除。活性的减少可以是大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更多。
术语“细胞因子活性”，无论是一般性使用或者应用到特定的细胞因子例如IL-22、IL-17A、IL-17F、或IL-23时，都是指由于细胞因子与其细胞上的受体结合导致的起始或中断的至少一种细胞过程。IL-22的细胞因子活性包括至少一种但不限于：(1)与细胞受体亚基或复合物(例如IL-22R1、IL-10R2、或IL-22R1/IL-10R2)结合；(2)与信号转导分子(例如JAK-1)缔合；(3)刺激STAT蛋白质(例如STAT5、STAT3或其组合)的磷酸化；(4)激活STAT蛋白质；(5)诱导指示了急性期反应的参数，包括急性期反应物(例如血清淀粉样蛋白A、凝血因子I、触珠蛋白或血清清蛋白)和细胞(例如嗜中性粒细胞、血小板或红细胞)的调节；和(6)调节(例如增加或减少)上皮细胞、成纤维细胞或免疫细胞增殖、分化、效应细胞功能、细胞溶解活性、细胞因子分泌、存活或其组合。上皮细胞包括但不限于皮肤细胞、肠细胞、肝细胞、和肾细胞以及内皮细胞。成纤维细胞包括但不限于滑膜成纤维细胞。免疫细胞可以包括CD8+和CD4+ T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞、巨核细胞，以及特化的或组织免疫细胞，例如在炎性组织中发现的那些或者表达IL-22受体的那些。
IL-17A和IL-17F的细胞因子活性包括至少一种但不限于：(1)与细胞受体例如IL-17R、IL-17A、IL-17RC、IL-17RH1、IL-17RL、IL-17RD、或IL-17RE结合；(2)抑制血管发生；(3)调节(例如增加或减少)造血细胞或者在软骨、骨、半月板、脑、肾、肺、皮肤和肠中存在的细胞的增殖、分化、效应细胞功能、细胞溶解活性、细胞因子分泌、存活或其组合；(4)诱导IL-6和/或IL-8的产生；和(5)刺激氧化氮产生。
IL-23的细胞因子活性包括至少一种，但不限于：(1)与细胞受体例如IL-23R或IL-12Rβ1结合；(2)通过Jak2、Tyk2、Stat1、Stat3、Stat4、和Stat5的信号传导；(3)调节(例如增加或减少)免疫细胞例如CD4+ T细胞、NK细胞和巨噬细胞的增殖、分化、效应细胞功能、细胞溶解活性、细胞因子分泌、存活或其组合；和(4)诱导IL-22、IL-17A或IL-17F的产生。
术语“分离的”是指基本上脱离其天然环境的分子。例如，分离的蛋白质基本上不含细胞材料或来自获取之的细胞或组织源的其它蛋白质。此术语亦指就药物组合物而言，分离蛋白质是基本上纯的、或至少70-80％(w/w)纯、或至少80-90％(w/w)纯、或至少90-95％纯度或至少95％、96％、97％、98％、99％，或100％(w/w)纯的制品。
术语“特异性结合”是指两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征在于高亲和力、低至中的能力；这有别于非特异性结合，后者通常具有低亲和力、中至高的能力。通常，当结合常数KA高于106M-1时，结合被视为是特异性的。必要的情况下，可以通过改变结合条件减少非特异性结合，而不会实质上影响特异性结合。熟练的技术人员可通过使用常规技术对适宜的结合条件如抗体浓度、溶液的离子强度、温度、进行结合的时间、封闭剂(例如血清清蛋白、乳酪蛋白)的浓度等进行优化。
术语“治疗剂”为治疗或协助治疗医学病症的物质。如本文所用的，治疗剂是指这样的物质，当其与本发明的组合物一起施用给受试者时，提供了与单独施用治疗剂或本发明组合物相比，更好的治疗。治疗剂的非限制性实例或用途在本文中描述。
术语“有效量”是指足以调节细胞因子活性以实现所需的生物学结果例如减少的T细胞和/或B细胞活性、自身免疫阻抑、移植排斥的阻抑、炎症阻抑等(全身或局部)的剂量或量。
如本文使用，“治疗有效量”是指这样的量，其在对受试者(如病人)进行单剂或多剂施用时，能有效治疗、预防、治愈、延缓、减轻病症或复发病症的严重性，改善其至少一种症状，或延长受试者的存活使之长于无此类治疗的预期存活。
术语“治疗”是指治疗或预防措施。对罹患医学病症的受试者或最终可能会罹患病症的受试者给予治疗，以预防、治愈、延缓、减轻病症或复发病症的严重性，或改善其一或多种症状，或延长受试者的存活使之长于无此类治疗的预期存活。
II.调节剂
多种类型的物质可以用于调控或调节免疫反应，这部分地是由于一种或多种IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23的活性。在一些实施方案中，组合物包含与IL-22结合的抗体或其抗原-结合片段、与IL-17A结合的抗体或其抗原-结合片段、与IL-17F结合的抗体或其抗原-结合片段、与IL-23结合的抗体或其抗原-结合片段，或多于一种的这些抗体的组合。当抗体或其抗原结合片段结合IL-23时，其可以结合存在于IL-23的p19亚基上的表位、存在于IL-23的p40亚基上的表位、或通过IL-23的p19和p40亚基组合形成的表位。
在其它实施方案中，组合物包含IL-22的可溶性受体、IL-17A的可溶性受体、IL-17F的可溶性受体、IL-23的可溶性受体，或这些可溶性受体的组合。可溶性受体的实例包括其中免疫球蛋白Fc结构域已经与受体的细胞外部分连接的那些。
在另一个实施方案中，组合物包含与IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23结合的结合蛋白。与IL-22结合的结合蛋白的实例包括天然存在的IL-22结合蛋白，例如在其内容被引入作为参考的US2003/0170839中描述的那些。当结合蛋白结合IL-23时，其可以在IL-23的p19亚基上的位点、IL-23的p40亚基上的位点或通过IL-23的p19和p40亚基组合形成的位点处结合。
在另一个实施方案中，组合物包含1)一种或多种抗体和2)一种或多种可溶性受体或结合蛋白的组合。
III.调节剂的用途
可以作用为一种或多种IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23的激动剂或拮抗剂的组合物可以用于调节由IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F和IL-23引起的免疫反应，例如作用于实体组织中的上皮细胞和间接地调节下游免疫反应。相应地，本发明所述拮抗剂组合物可用以直接或间接抑制免疫或造血细胞(例如髓系、淋巴系或类红细胞系的细胞或其前体细胞)的活性(例如增殖、分化，和/或存活)，从而可用以治疗多种免疫病症及过度增生性病症。能够治疗的免疫病症的非限制性实例包括但不限于：自身免疫病症，例如关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎，狼疮相关性关节炎或强直性脊椎炎)、硬皮病、系统性红斑狼疮、血管炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括变应性皮炎及湿疹性皮炎)、重症肌无力、炎症性肠病(IBD)、克隆病、结肠炎、糖尿病(I型)；例如皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统的炎症(例如阿尔茨海默病)、肝脏的炎症(例如肝炎)、肾脏的炎症(例如肾炎)及胰脏的炎症(例如胰腺炎)的炎症性病况；心血管病症，例如胆固醇代谢病症、氧自由基损伤、局部缺血；创伤愈合相关病症；呼吸病，例如哮喘及COPD(例如囊性纤维化)；急性炎症性病况(例如内毒素血症、败血症、中毒性休克综合征及感染性疾病)；移植排斥及过敏。在一实施方案中，病症为关节炎的病症，例如选自以下的一或多种的病症：类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎或强直性脊椎炎；呼吸病(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD))；或例如以下的炎症性病况：皮肤(例如牛皮癣)、心血管系统(例如动脉粥样硬化)、神经系统(例如阿尔茨海默病)、肝脏(例如肝炎)、肾脏(例如肾炎)、胰脏(例如胰腺炎)和胃肠器官(例如结肠炎)、克隆病及IBD；急性炎症性病症，例如内毒素血症、败血症、中毒性休克综合征及感染性疾病；多器官衰竭；呼吸性疾病(ARD)；淀粉样变性；肾病，如肾小球硬化、膜性肾病、肾动脉硬化症、肾小球肾炎、肾纤维增生性疾病，以及其它肾功能障碍及肾肿瘤。由于IL-22和IL-17A和IL-17F对于上皮的影响，所以可以使用本文描述的拮抗剂的组合物和组合来治疗上皮癌，例如癌、黑素瘤等。
已知细胞因子IL-22、IL-17A、IL-17F和IL-23与这些免疫病症和过度增生性病症中的许多相关。由于现在已知这些细胞因子的表达和活性与CD4效应T细胞的特定类型相关并且是彼此相互依赖的，因此本发明提供了通过施用包含拮抗IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的活性的物质的组合物来治疗疾病的方法等。
与一种或多种这些细胞因子相关的病症的一个实例是牛皮癣。使用定量PCR，在来自牛皮癣病人的成对组织样品(损伤vs未损伤)中测量IL-22和IL-22R1RNA的水平的研究证明了，在牛皮癣损伤中IL-22和IL-22R1的水平上调。其它证据表明在牛皮癣的发展中涉及IL-22。例如，组成型表达IL-22的转基因小鼠展现出厚皮肤、单核免疫细胞浸润，特征为牛皮癣损伤，并且出生后不久死亡。WO 03/083062。类似地，向小鼠施用IL-22诱导皮肤加厚和单核免疫细胞浸润。WO 03/083062。IL-22还诱导人角质形成细胞增生，表明在皮肤炎症性过程中有重要作用。Boniface等人，J.Immunol.，(2005)174：3695-3702。在来自牛皮癣病人的成对的组织样品(损伤vs未损伤)中使用定量PCR，本申请还表明在牛皮癣损伤中IL-17A、IL-17F、和IL-23p19的水平被上调。考虑到不仅是IL-22，还有IL-17A和IL-17F与牛皮癣关联，本申请提供了通过施用组合物治疗牛皮癣的方法，所述组合物包含拮抗IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23p19的活性的物质。此外，由于IL-23也与牛皮癣相关，在本申请中描述的研究证明了IL-23在维持IL-22从Th17细胞中表达中的关键作用，本发明还企图施用包含IL-23拮抗剂和IL-22的拮抗剂(任选地与IL-17A或IL-17F的拮抗剂一起)的组合物。
与一种或多种IL-22、IL-17A、IL-17F和IL-23相关的病症的另一实例是类风湿性关节炎(RA)。RA的特征在于关节中的炎症。其为关节炎最常发生的形式，包括结缔组织及滑膜(其为关节的膜)炎症。发炎的滑膜通常浸润关节并损害关节软骨及骨。IL-22的抑制剂改善了RA动物模型中的症状(WO 02/068476A2；美国专利号No.6,939,545)。RA也与IL-23相关。近期的研究表明，缺乏IL-23p19的小鼠抗EAE(多发性硬化的模型)和胶原诱导的关节炎(CIA-RA的模型)，证明IL-23是这些自身免疫疾病的发病机制中的重要因素。在机制上，这可能是由于在缺乏IL-23的小鼠中减少的IL-17A和IL-17F的表达。但是，缺乏IL-17A的小鼠，尽管发展了严重性较低的疾病，但是仍然对于CIA易感，表明IL-17A不负责IL-23的所有功能。在本申请中描述的研究表明了IL-23在维持从Th17细胞表达IL-22中具有关键作用。我们的数据表明，IL-22与IL-17A和IL-17F类似，是CIA中IL-23信号传导的下游。我们也观察到在患有CIA的小鼠中的CD4T细胞中IL-22与IL-17A的共表达。此外，在类风湿性关节炎的患者中，IL-22在滑膜组织和单核细胞中表达。用IL-22处理从患者中分离的滑膜成纤维细胞诱导了趋化因子产生(Ikeuchi H.等人Arthritis Rheum 52：1037-1046)。IL-22还从结肠的肌成纤维细胞诱导IL-6、IL-8和多种趋化因子和基质金属蛋白酶(Andoh，A.等人Gastroenterology129：969-984.)。IL-22的全身施用增强了血清淀粉样蛋白A(SAA)的循环量，表明IL-22可以诱导指示急性期反应的参数(Dumoutier，L.等人2000.Proc NatlAcadSci U S A 97：10144-10149.)。IL-23p19转基因小鼠还表现出更高浓度的循环SAA(Wiekowski，M.等人2001 J Immunol.166：12(7563-70)，并且我们的数据表明这一影响至少部分是由IL-22介导的。
因此，本申请特别涉及使用不仅抑制IL-22，而且抑制IL-17A和IL-17F之一或二者的组合物治疗RA。本发明还涉及施用组合物，所述组合物包含IL-23的拮抗剂和IL-22的拮抗剂，任选地具有IL-17A或IL-17F的拮抗剂，因为IL-23影响IL-22和IL-17从Th17细胞中的产生。除了治疗RA外，本发明的方法也可以用于治疗人中的其它关节炎疾病。
也已知IL-22通过诱导抗微生物肽的表达来增强外周组织的先天免疫，所述抗微生物肽包括β-防卫素2(hBD-2)、S100A7、S100A8、和S100A9(Wolk等人，Immunity(2004)21：241-54；Boniface等人，J.Immunol.(2005)174：3695-3702)。在本申请中的数据表明，通过诱导一种或多种抗微生物肽的表达，并且因此增强先天免疫反应，IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23在抗击微生物感染中是特别有效的，因为IL-22可以与IL-17A和IL-17F叠加或协同地合作作用，并且其是由IL-23诱导的。相应地，本申请提供了在需要其的哺乳动物中诱导抗微生物肽的方法，包括向哺乳动物施用能有效诱导抗微生物肽的量的IL-22和IL-17A，IL-22和IL-17F，或者IL-22、IL-17A和IL-17F。在另一个实施方案中，在需要其的哺乳动物中诱导抗微生物肽的方法包括向哺乳动物施用有效诱导抗微生物肽的量的IL-22和IL-23，以及任选地IL-17A和/或IL-17F。在另一个实施方案中，抗微生物肽在细胞例如角质形成细胞中被诱导。
急性期反应是预示了炎症性病况的生物化学、生理学和行为改变的集合。已知作为急性期反应物的特异性蛋白质的调节是急性期反应和炎症的生物化学特点。(Gabay & Kushner，N.Engl.J.Med.(1999)340：448-55中的综述)。一些急性期蛋白质的浓度通常响应炎症而增加。这些蛋白质的实例包括C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、凝血因子I和触珠蛋白。其它蛋白质(例如清蛋白、运铁蛋白和甲胎蛋白)的浓度在急性期反应中通常降低。急性期蛋白质的表达模式可以根据下述条件而不同，并且多种急性期蛋白质的表达模式和相对水平可以用于确定炎症的性质和严重性。在本申请中的数据表明IL-22可以影响急性期反应。相应地，本申请提供了通过施用IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23诱导或增强急性期反应的方法。在另一实施方案中，本申请提供了增加急性期蛋白质(例如C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、凝血因子I或触珠蛋白)的表达或者减少急性期蛋白质(例如清蛋白、运铁蛋白或甲胎蛋白)的表达的方法，所述方法通过施用IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23。本申请还涉及施用包含IL-22的拮抗剂以及任选地一种或多种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂的组合物，以减少或抑制急性期反应。在另一个实施方案中，本申请提供了增加急性期蛋白质(例如C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、凝血因子I或触珠蛋白)的表达或者减少急性期蛋白质(例如清蛋白、运铁蛋白或甲胎蛋白)的表达的方法，所述方法通过施用IL-22的拮抗剂，以及任选地一种或多种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂。
IV.包含另外的治疗剂的组合疗法
尽管本申请包括包含抑制IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的活性的物质的组合的组合物，这些组合物可以另外包含对于治疗多种疾病有利的一种或多种另外的治疗剂。本文的术语“组合”意指基本上同时期，(同时或序惯地)给药包含治疗剂的组合物，其中组合物包含抑制一种或多种IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23的活性的物质的组合。在一实施方案中，若序惯给药，在开始施用第二种组合物时，治疗部位仍可检测到有效浓度的这两种组合物中的第一种组合物。在另一实施方案中，若序惯给药，在开始施用第二种组合物时，治疗部位不可检测到有效浓度的这两种组合物中的第一种组合物。
例如组合疗法可包括将包含至少一种抗IL-22抗体和至少一种抗-IL-17A、抗IL-17F或抗IL-23抗体的组合物与至少一种另外的治疗剂共配制和/或共施用。所述另外的治疗剂可包括如下文更为详述的至少一种除IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23之外的细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒剂和细胞生长抑制剂。本发明的组合物和组合可以用于调节与IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23相关的炎症病况，例如通过调节通过受体的细胞因子信号传导，所述受体位于多种组织的成纤维细胞和/或上皮细胞上(除了潜在被活化并且组织定位的免疫细胞外)，所述组织还包括但不限于胰腺、皮肤、肺、肠、肝、肾、唾液腺和血管内皮。
在一个实施方案中，另外的治疗剂用于关节炎的标准治疗，包括但不限于非甾类抗炎药(NSAID)；皮质类固醇，包括泼尼松龙、强的松(prednisone)、可的松(cortisone)和曲安西龙(triamcinolone)；及缓解疾病的抗风湿药(DMARD)，诸如氨甲蝶呤(methotrexate)、羟基氯喹(羟氯喹(PlaquenilTM))及柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)(AravaTM)；肿瘤坏死因子抑制剂，包括依那西普(etanercept)(EnbrelTM)、英利昔单抗(infliximab)(RemicadeTM)(带或不带氨甲蝶呤)和阿达木单抗(adalimumab)(HumiraTM)、抗CD20抗体(例如美罗华(RituxanTM))；可溶性白细胞介素-1受体，如阿那白滞素(anakinra)(KineretTM)、金、米诺环素(minocycline)(MinocinTM)、青霉胺和细胞毒剂，包括硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺和环孢菌素。这样的组合疗法可有利地使用较低剂量所施用的治疗剂，从而避免与多种单一疗法有关的毒性或并发症。此外，希望公开的治疗剂提供增强的和/或协同的作用。
另外的治疗剂可以是干扰不同阶段的自身免疫和后续炎症反应中的那些物质。在一个实施方案中，包含抑制一种或多种IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23的活性的物质的组合的组合物可以与至少一种生长因子拮抗剂或除IL-22、IL-17A、IL-17或IL-23之外的细胞因子的拮抗剂共配制和/或共施用。拮抗剂可以包括可溶性受体、肽抑制剂、小分子、配体融合体、抗体(结合细胞因子或生长因子或其受体或其它细胞表面分子)及其结合片段，以及“抗炎细胞因子”及其激动剂。
另外的治疗剂的非限制性实例包括但不限于以下至少一种的拮抗剂：白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12(或其亚基p35或p40之一)、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-24、IL-26、IL-28、IL-29、IL-31和IL-33；细胞因子(例如TNFα、LT、EMAP-II和GM-CSF)；及生长因子(例如FGF及PDGF)。所述物质亦可包括但不限于白细胞介素、细胞因子和生长因子的至少一种受体的拮抗剂。以下细胞表面分子的抑制剂(例如抗体)也可作为另外的治疗剂被使用：如CD2、CD3、CD4、CD8、CD20(例如美罗华(RituxanTM))、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或它们的配体(例如CD154(gp39、CD40L))，或LFA-1/ICAM-1及VLA-4/VCAM-1(Yusuf-Makagiansar等人(2002)Med Res Rev 22(2)：146-67)。在某些实施方案中，可以用作为另外的治疗剂的拮抗剂可包括以下的拮抗剂：IL-1、IL-12(或其亚基p35或p40之一)、TNFα、IL-15、IL-18、IL-19、IL-20，和IL-21以及它们的受体。
那些物质的实例包括IL-22拮抗剂(如结合IL-22(见例如WO00/56772)或其亚基p35或p40之一的抗体)；IL-12受体抑制剂(如IL-12受体的抗体)；及可溶性IL-12受体及其片段。IL-15拮抗剂的实例包括抗IL-15或其受体的抗体、IL-15受体的可溶性片段和IL-15结合蛋白。IL-18拮抗剂的实例包括IL-18的抗体、IL-18受体的可溶性片段和IL-18结合蛋白(IL-18BP，Mallet等人(2001)Circ.Res.(2001)28)。IL-1拮抗剂的实例包括白细胞介素-1-转化酶(ICE)抑制剂(如Vx70)、IL-1拮抗剂(例如IL-1RA(ANIKINRA(或KineretTM)，AMGEN))、sIL-1RII(Immunex)和抗IL-1受体抗体。
TNF拮抗剂的实例包括TNF(例如人TNFα)的抗体，诸如D2E7(人抗TNFα抗体，美国专利6,258,562，HumiraTM，BASF)；CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(抗TNFα人源化抗体，Celltech/Pharmacia)；cA2(抗TNFα嵌合抗体，RemicadeTM，Centocor)；及抗TNF抗体片段(例如CPD870)。其它实例包括可溶性TNF受体(例如人p55或p75)片段及其衍生物，诸如p55kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白，LenerceptTM)及75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM，Immunex，见例如Arthritis & Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med(1996)44卷，235A)。其它实例包括酶拮抗剂(例如TNFα转化酶抑制剂(TACE)，诸如α-磺酰基氧肟酸衍生物(WO01/55112)或N-羟基甲酰胺抑制剂(GW3333、-005或-022))及TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白，见例如Arthritis & Rheumatism(1996)39卷，9期(增刊)，S284；及Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.(1995)268卷，37-42页)。TNF拮抗剂可以是可溶性TNF受体(例如人p55或p75)片段及衍生物，如75kd TNFR-IgG；及TNFα转化酶(TACE)抑制剂。
在其它实施方案中，包含抑制一种或多种IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23的活性的物质的组合的组合物可以与下述的至少一种组合施用：IL-13拮抗剂，如可溶性IL-13受体和/或抗IL-13抗体；及IL-2拮抗剂，如IL-2融合蛋白(例如DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2，Seragen，见例如Arthritis& Rheumatism(1993)36卷，1223)及抗IL-2R抗体(例如抗Tac(人源化抗体，Protein Design Labs，见Cancer Res.(1990)50(5)：1495-502))。另一可以与包含抑制一种或多种IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23的活性的物质组合的组合物组合的另外的治疗剂是非耗竭性抗CD4抑制剂如IDEC-CE9.1/SB 210396(抗CD4抗体，IDEC/Smithkline)的组合。其它可以与包含抑制一种或多种IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23的活性的物质组合的组合物组合的另外的治疗剂包括共刺激性分子如CD80(B7.1)及CD86(B7.2)的拮抗剂(如抗体、可溶性受体或拮抗性配体)；ICOSL、ICOS、CD28和CTLA4(例如CTLA4-Ig(atabacept))；P-选择素糖蛋白配体(PSGL)；及抗炎性细胞因子及其激动剂(例如抗体)。抗炎性细胞因子可包括IL-4(DNAX/Schering)；IL-10(SCH52000、重组IL-10、DNAX/Schering)；IL-13；及TGF。
在其它实施方案中，可以与包含抑制一种或多种IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23的活性的物质的组合的组合物组合的另外的治疗剂为至少一种抗炎药、免疫抑制剂、代谢抑制剂和酶抑制剂。此类药物或抑制剂的非限制性实例包括但不限于以下的至少一种：非甾类抗炎药(NSAID)(如布洛芬(ibuprofen)、替尼达普(Tenidap)(见例如Arthritis & Rheumatism(1996)39卷，9期(增刊)，S280))、萘普生(Naproxen)(见例如Neuro Report(1996)7卷1209-1213页)、美洛昔康(Meloxicam)、吡罗昔康(Piroxicam)、双氯芬酸(Diclofenac)和吲哚美辛(Indomethacin)；柳氮磺吡啶(见例如Arthritis&Rheumatism(1996)39卷，9期(增刊)，S281)；皮质类固醇(如泼尼松龙)；细胞因子抑制性抗炎药(CSAID)；及核苷酸生物合成的抑制剂(如嘌呤生物合成的抑制剂(例如叶酸拮抗剂，如氨甲蝶呤)或嘧啶生物合成的抑制剂(例如二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)，诸如来氟米特(见例如Arthritis &Rheumatism(1996)39卷，9期(增刊)，S131；Inflammation Research(1996)45卷，103-107页))。
另外的抑制剂的实例包括以下的至少一种：皮质类固醇(口服、吸入及局部注射)；免疫抑制剂(诸如环孢菌素)及他克莫司(tacrolimus)(FK-506))；mTOR抑制剂(诸如西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))或雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物，诸如CCI-779(Elit.L.Current Opinion Investig.Drugs(2002)3(8)：1249-53；Huang，S.等人Current Opinion Investig.Drugs(2002)3(2)：295-304)))；干扰促炎细胞因子如TNFα及IL-1信号传导的物质(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)；COX2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib)及其变体(MK-966)，见例如Arthritis & Rheumatism(1996)39卷，9期(增刊)，S81)；磷酸二酯酶抑制剂(例如R973401，见例如Arthritis &Rheumatism(1996)39卷，9期(增刊)，S282)；磷脂酶抑制剂(例如胞浆型磷脂酶2(cPLA2)抑制剂，如三氟甲基酮类似物(U.S.6,350,892))；血管内皮细胞生长因子(VEGF)抑制剂；VEGF受体抑制剂；及血管生成抑制剂。
本文公开的包含抑制IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的活性的物质的组合的组合物可以与另外的治疗剂组合使用来治疗下文中更详细讨论的特定的免疫病症。
用于治疗关节炎病症(例如类风湿性关节炎、炎症性关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿关节炎、骨关节炎和银屑病关节炎)的另外的治疗剂的非限制性实例包括以下的至少一种：TNF拮抗剂(诸如抗TNF抗体)；TNF受体(例如人p55及p75)的可溶性片段及其衍生物(诸如p55kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白，LenerceptTM)及75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM))；TNF酶拮抗剂(诸如TACE抑制剂)；以下的拮抗剂：IL-12(或其亚基p35或p40之一)、IL-15、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21和IL-24；T细胞及B细胞耗竭剂(诸如抗CD4、抗CD20或抗CD22抗体)；小分子抑制剂(诸如氨甲蝶呤及来氟米特)；西罗莫司(雷帕霉素)及其类似物(诸如CCI-779)：Cox-2及cPLA2抑制剂；NSAID；p38、TPL-2、Mk-2及MFκB抑制剂；RAGE或可溶性RAGE；P-选择素或PSGL-1抑制剂(诸如小分子抑制剂及其抗体)；雌激素受体β(ERB)激动剂和ERB-NFκb拮抗剂。
用于治疗多发性硬化的另外的治疗剂的非限制性实例包括干扰素β(例如IFNβ-1a及IFNβ-1b)、科巴酮(copaxone)、皮质类固醇、IL-1抑制剂、TNF抑制剂、CD40配体的抗体、CD80的抗体和IL-12拮抗剂。
用于治疗炎症性肠病或克隆病的另外的治疗剂的非限制性实例包括布地奈德(budesonide)；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素；柳氮磺吡啶；氨基水杨酸；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑(metronidazole)；脂氧合酶抑制剂；美少胺(mesalamine)；奥沙拉秦(olsalazine)；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化剂；血栓烷(thromboxane)抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基咪唑化合物；本文所述的TNF拮抗剂；IL-4、IL-10、IL-13和/或TGFβ或它们的激动剂(例如激动剂抗体)；IL-11；波尼松龙、地塞米松(dexamethasone)或布地奈德的葡糖苷酸-或葡聚糖-缀合的前药；ICAM-1反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(ISIS2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；TCell Sciences，Inc.)；缓释美沙拉秦(mesalazine)；氨甲蝶呤；血小板活化因子(PAF)的拮抗剂；环丙沙星(ciprofloxacin)；及利多卡因(lignocaine)。
用于调节免疫反应(例如治疗或抑制移植排斥和移植物抗宿主疾病)的另外的治疗剂的非限制性实例包括下列：抗细胞表面分子的抗体，所述细胞表面分子包括但不限于CD25(IL-2受体α)、CD11a(LFA-1)、CD54
(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)或其组合，以及一般性免疫抑制剂，例如环孢菌素A或FK506。
相应地，本发明的另一方面涉及实施组合物以及任选地另外的治疗剂施用的试剂盒，所述组合物包含抑制IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的活性的物质的组合。在一个实施方案中，所述试剂盒包含配制在药物载体中的含有IL-22拮抗剂和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂的组合物。试剂盒还可以包含至少一种另外的治疗剂，酌情配制在一种或多种不同的药物制品中。
V.药物组合物和施用方法
本申请中描述的某些方法使用适合于患者的药物用途和施用的组合物。这些组合物包含药物赋形剂和一种或多种抗体、一种或多种可溶性受体、一种或多种结合蛋白、或者那些抗体、可溶性受体和/或结合蛋白的组合。如本文所所用的，“药物赋形剂”包括与药物施用兼容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂及吸收延缓剂等。这些物质被用作药物活性物质在本领域众所周知。组合物亦可含有补充、附加或增强治疗功用的其它活性化合物。药物组合物亦可包含在带有施用说明书的容器、包装或配药器中。
药物组合物可以配制为适合其目的施用途径。实现施用的方法为本领域普通技术人员所知。还可能产生这样的组合物，其可局部或以口服方式被施用，或能够跨粘膜输送的方式而施用。例如，施用可以是静脉内、腹膜内、肌内、腔内、皮下、皮肤或经皮。
皮内或皮下应用的溶液或悬浮液通常包括以下组份的至少一种：无菌稀释剂，诸如水、盐液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；及张度剂，诸如氯化钠或右旋糖。pH可经酸或碱调整。这样的制品可包封在安瓶、一次性注射器或多剂量瓶中。
用于静脉内施用的溶液或悬浮液包括载体，诸如生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)、乙醇或多元醇。在所有情况下，组合物必需无菌且为容易注射的流体。通常可使用卵磷脂或表面活化剂以获得合适流动性。组合物在制备及贮存的条件下亦必需具稳定性。可使用抗细菌剂及抗真菌剂以防止微生物，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，组合物可包含等渗剂(糖)、多元醇(甘露醇及山梨糖醇)或氯化钠。可通过添加能延缓吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶，而延长组合物的吸收。
口服组合物包括惰性稀释剂及可食用载体。可将组合物包封在明胶内或压制在片剂内。为口服给药目的，抗体可与赋形剂掺在一起，置于片剂、锭剂或胶囊剂内。组合物可包含药学上兼容的粘合剂或佐剂材料。所述片剂、锭剂和胶囊剂可含有：(1)粘合剂，诸如微晶状纤维素、黄芪树胶或明胶；(2)赋形剂，诸如淀粉或乳糖；(3)崩解剂，诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；(4)润滑剂，诸如硬脂酸镁；(5)助流剂，诸如胶态二氧化硅；或(6)甜味剂或调味剂。
药物组合物亦可通过经粘膜或经皮途径施用。例如含Fc部分的抗体可穿越肠、口或肺(经由Fc受体)粘膜。可通过使用糖锭(lozenge)、鼻喷雾剂、吸入剂或栓剂而进行经粘膜施用。亦可通过使用本领域已知的含组合物的软膏剂、药膏剂、凝胶剂或霜剂而进行经皮给药。就经粘膜或经皮施用而言，使用适于待穿透屏障的渗透剂。就吸入施用而言，自含有推进剂(例如液体或气体)或雾化器的加压容器或分配器以喷雾剂形式递送所述抗体。
在某些实施方案中，使用可保护所述活性成分免于身体快速消除的载体以制备药物组合物。通常使用生物可降解的聚合物(例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类(polyorthoester)、聚乳酸)。这样的制剂的制备方法为本领域技术人员所知。脂质体悬浮液亦可用作为可药用载体。可根据本领域中已确定的方法制备脂质体(美国专利4,522,811)。
所述药物组合物以所述的治疗有效量施用。治疗有效量可根据受试者年龄、病况、性别和病情的严重性而不同。可由医师根据临床指征而决定合适剂量。可以以单次推注剂量提供所述组合物而最长时间地最大化组合物活性成分的循环水平。在单次推注剂量后，亦可使用连续输注。
如本文使用，术语“受试者”旨在包括人及非人动物。本发明术语“非人动物”包括所有脊椎动物，诸如非人的灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
可向受试者施用的剂量范围的实例可选自：1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至100μg/kg、100μg/kg至1mg/kg、250μg/kg至2mg/kg、250μg/kg至1mg/kg、500μg/kg至2mg/kg、500μg/kg至1mg/kg、1mg/kg至2mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至20mg/kg、15mg/kg至20mg/kg、10mg/kg至25mg/kg、15mg/kg至25mg/kg、20mg/kg至25mg/kg和20mg/kg至30mg/kg(或更高)。根据剂量、施用方法、待治疗的病症或症状和个体受试者的特征，这些剂量可每日、每周、每两周、每月或以更低的频率例如每半年施用。亦可通过连续输注(如通过泵)施用剂量。所施用剂量亦可取决于施用途径。例如皮下施用所需的剂量可能高于静脉内施用。
在某些情况下，最好以剂量单位的形式配制组合物以便容易施用及剂量之一致性。如本文使用的剂量单位形式是指适于患者的物理上分离的单位。各剂量单位含有预定量的抗体，经计算可与载体一起产生治疗作用。剂量单位取决于抗体的特征及欲实现的具体治疗作用。
可在细胞培养物或实验动物中通过标准药学方法测定药物组合物的毒性及疗效，例如测定LD50(对50％群体致死的剂量)及ED50(对50％群体有疗效的剂量)。毒性与疗效间的剂量比为治疗指数，其可表达为LD50/ED50的比率。
可使用来自细胞培养测定及动物研究的数据以配制人用的剂量范围。这些化合物的剂量可落在血液循环抗体浓度的范围内，包括极少或无毒性的ED50。根据所使用组合物剂量形式及施用途径，剂量在此范围内可变动。可首先使用细胞培养测定以估计治疗有效剂量。剂量可以在动物模型中配制，以获得包括IC50(亦即获得症状半数最大抑制的物质浓度)的循环血浆浓度范围。可通过合适生物测定监控任何具体剂量的效用。合适的生物测定的实例包括DNA复制测定、基于转录的测定、受体结合测定和其它免疫学测定法。
VI.诊断用途
拮抗剂也可以用来检测生物样品中IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的存在。可以使用本领域已知的方法，包括本申请中公开的方法，细胞外或细胞内检测这些细胞因子。通过将这些蛋白质的存在或水平与医学病况关联起来，本领域技术人员可诊断有关的医学病况。例如IL-22诱导与炎症性细胞因子(诸如IL-1及TNFα)所致的病症有关的变化，且IL-22的抑制剂可改善类风湿性关节炎的动物模型中的症状(WO 02/068476A2)。如本申请中所公开的，在牛皮癣损伤中IL-22与IL-17A和IL-17F共表达，并且与那些细胞因子协同作用来增强抗微生物肽的表达。因此，可以根据本公开被诊断的示例性医学病况包括牛皮癣和类风湿性关节炎。多发性硬化、炎症性肠病和克隆病也可以根据本申请被诊断。此外，由于本申请表明IL-22可以诱导急性期反应，因此该反应可以使用根据本公开的方法来监控。
基于抗体的检测方法在本领域中众所周知，且包括ELISA、放射免疫测定、免疫印迹、Western印迹、流式细胞术、免疫荧光、免疫沉淀和其它相关技术。可在诊断试剂盒中提供抗体。试剂盒可含有其它组份、包装、说明书或有助于检测蛋白质及使用试剂盒的其它材料。
抗体可用可检测标记修饰，包括配体基团(例如生物素)、荧光团及发色团、放射性同位素、电子密试剂或酶。酶通过其活性而检测。例如辣根过氧化物酶通过其将四甲基联苯胺(TMB)转化成蓝色色素的能力而检测，以分光光度计定量。其它合适的结合配偶体包括生物素及抗生物素蛋白、IgG及A蛋白，以及本领域已知的其它受体-配体对。
抗体亦可以与至少一种其它分子实体功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或以其它方式连接)，所述其它分子实体例如其他抗体(例如双特异性或多特异性抗体)、毒素、放射性同位素、细胞毒剂或细胞生长抑制剂等。其它改变及可能性对于本领域普通技术人员而言是显而易见的，这些视为本发明范围内的等同物。
当检测方法是体外方法时，其包括：(1)将样品或对照样品与结合IL-22的第一试剂和结合IL-17A、IL-17F或IL-23的第二试剂接触，以及(2)检测第一和第二试剂与样品或对照样品之间的复合物的形成，其中相对于对照样品，在样品中复合物形成有统计学显著的变化表明样品中存在细胞因子。在一个实施方案中，方法包括将包含细胞的样品与被标记试剂相接触，所述被标记试剂例如荧光抗体，在细胞中与IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23相结合。在细胞中检测的试剂的量与在细胞中表达的细胞内IL-22、IL-17A、IL-17F或IL-23的量成正比。
检测方法也可以是体内检测方法(例如受试者中的体内成像)。该方法可以用于诊断病症，例如本文中描述的病症。方法包括(1)向受试者或对照受试者(在允许所述第一和第二试剂与它们的细胞因子相结合的条件下)施用与IL-22结合的第一试剂和与IL-17A、IL-17F或IL-23结合的第二试剂，以及(2)检测第一和第二试剂与它们的细胞因子之间的复合物的形成，其中相对于对照(例如对照受试者)，在受试者中复合物形成有统计学显著的变化表明存在细胞因子。
实施例
实施例1：在Th17细胞中比在Th1或Th2细胞中更高地表达IL-22转录物。
Th17细胞被认为以谱系特异性方式产生IL-17A和IL-17F。为了鉴定其它潜在的Th17细胞因子，将从C.Cg-Tg(DO11.10)10Dlo TCR转基因小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratories))纯化的幼稚(CD62LHiCD4+)T细胞分化成Th1(IL-12，抗-IL-4)、Th2(IL-4，抗-IFN-γ)和Th17(TGF-β、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-23、抗-IFN-γ，和抗-IL-4)谱系。根据厂商指导(米尔特尼生物技术公司(Miltenyi Biotec))，通过CD4阴性选择，随后通过CD62L阳性选择，从DO11小鼠的脾中纯化幼稚(CD62LHiCD4+)T细胞。所有淋巴细胞培养物生长在补充有10％FBS、2mML-谷氨酰胺、5mMHEPES、100U/ml Pen-Strep和2.5μMβ-巯基乙醇的RPMI1640中。CD4+CD62LHi细胞的纯度高于98％。将2×105DO11T细胞与4×106经辐射的BALB/cByJ脾细胞(3300rad)和1μg/ml OVA323-339肽(OVAp)(新英格兰肽公司(New England Peptide))一起培养。以10ng/ml使用重组细胞因子，但是IL-4(1ng/ml)和TGF-β(20ng/ml)除外。按10μg/ml使用中和抗体。鼠的IL-4、IL-6、IL-12、IL-23和TNF-α购自安迪系统公司(R&DSystems)。TGF-β购自西格玛公司(Sigma)。IL-1β自本德麦公司(BenderMedsystems)获得。IFN-γ的抗体(XMG1.2)和IL-4的抗体(BVD4-1D11)购自法明更公司(Pharmingen)。在分化7天后，将CD4T细胞再纯化并且放置过夜。然后将细胞用50ng/ml PMA、1μg/ml离子霉素再刺激，条件如下：Th1细胞(IL-12，抗-IL-4)、Th2细胞(IL-4，抗-IFN-γ)，或Th17(IL-23，抗-IFN-γ，抗-IL-4)，进行6小时。然后通过定量PCR检查再刺激后细胞因子的表达。制备RNA，并且使用SYBR Green Platinum Taq(英杰生命科学公司(Invitrogen))和预先限定的引物(pre-qualified primers)(强基因公司(Qiagen))进行细胞因子转录物的定量PCR。将所有细胞因子浓度标准化为HPRT。使用ΔΔCt方法相对于经纯化的，未激活幼稚DO11T细胞计算诱导倍数。图1中显示的数据是平均值±SD并且是两个实验的代表。
Th1细胞表达最大量的IFN-γ转录物，Th2细胞具有最高多度的IL-4，并且Th17细胞产生最大多度的IL-17A和IL-17F，表明这些细胞被成功分化(图1A)。在22个检查的额外的白细胞介素中，在Th17细胞中IL-22转录物比Th1细胞中的高～120倍，并且比Th2细胞中的高～700倍(图1B)。相反，与Th17相比，在Th1或Th2细胞中，IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-21、IL-24、IL-25和IL-31的表达相当，或者更丰富(图1C)。其它细胞因子(包括IL-1、IL-7、IL-11、IL-15、IL-16、IL-18、IL-19、IL-20、IL-27和IL-28)在任何T细胞谱系中均不高表达(图1D)。因此，将IL-22转录物鉴定为在Th17细胞中比在Th1或Th2细胞中以更高量表达的所检查的22个白细胞介素转录物之一。
实施例2：Th17细胞是IL-22的主要生产者
IL-22与IL-10、IL-19、IL-20、IL-24和IL-26一起是IL-10家族的成员(Dumoutier等人，J Immunol，(2000)164：1814-19；Xie等人，J.Biol.Chem.(2000)275：31335-39；Renauld等人，Nat.Rev.Immunol.(2003)3：667-76；Pestka等人，Ann.Rev.Immunol.(2004)22：929-79)。该家族的成员与IL-10共有强的结构同源性。人IL-22位于染色体12q15(小鼠染色体10)，离IFN-γ基因座大约90kb。以前的报道证明了用IL-12的人CD4T细胞的活化和抗-IL-4增强的IL-22转录物表达，表明Th1细胞表达IL-22(Wolk等人，J.Immunol.(2002)168：5397-402；Gurney，A.L.，Int.Immunopharmacol.(2004)4：669-677)。但是未报道从T细胞表达IL-22蛋白质。
为了检查IL-22蛋白质的表达，鼠的IL-22的单克隆抗体T(Ab-01，Ab-02，Ab-03)使用类似于以前描述的那些方法生成(Li等人，Int.Immunopharmacol.(2004)4：693-708)并且通过ELISA确定IL-22蛋白质浓度。用经辐射的脾细胞、1μg/ml OVAp和所标明的多种细胞因子和抗体来活化幼稚DO11T细胞。鼠的IL-4、IL-6、IL-12、IL-23和TNF-α购自安迪系统公司(R&D Systems)。TGF-β购自西格玛公司(Sigma)。鼠的IL-1β自本德麦公司(Bender Medsystems)获得。使用前述方法生成IL-22和IL-17F(Li等人，Int.Immunopharmacol.(2004)4：693-708)。IFN-γ的抗体(XMG1.2)、IL-4的抗体(BVD4-1D11)、IL-17A的抗体(TC11-18H10)和CD4的抗体(RM4-5)购自法明更公司(Pharmingen)。抗-DO11抗体(KJ126)购自凯尔特实验室(Caltag laboratories)。从活化第5天，在条件培养基上通过ELISA确定IL-22、IL-17A和IFN-γ浓度。使用抗体对(包被，检测)来检测IFN-γ(AN-18，R4-6A2，伊比生物科学公司(Ebioscience))、IL-17A(MAB721，BAF421，安迪系统公司(R&D Systems))和IL-22(Ab-01，生物素化的Ab-03).
仅用OVA323-339(OVAp)活化的幼稚DO11T细胞(Th0)产生小量的IL-22(<100pg/ml)(图2A)。尽管与Th0相比，在Th1和Th2分化期间IL-22表达增强，分别为110倍和40倍，用IL-17诱导条件活化导致IL-22的产量更加大的增加。TGF-β、IL-6、IL-1β和TNF-α将IL-22的表达增加了360倍，而用IL-23、抗-IFN-γ和抗-IL-4的活化则将IL-22的产量增加了460倍。这些条件的组合(Th17)产生了IL-22的最大表达，比Th0高～2400倍，比Th1高～22倍。这些数据表明IL-22蛋白质在Th17分化期间表达最丰富。
由于在初级T细胞活化过程中在Th1和Th2条件下诱导了一些IL-22，检查到了在这些细胞的第二次刺激后IL-22产生。在Th1、Th2或Th17条件下或者用TGF-β、IL-6、IL-1β和TNF-α，分化幼稚DO11细胞。在第7天，收获细胞，深入洗涤并且放置过夜。将2×105DO11T细胞用4×106经辐射的脾细胞、5ng/ml IL-2(西格玛公司(Sigma))再刺激，并且如所标明的添加IL-12和抗-IL-4、IL-4和抗-IFN-γ，或IL-23、抗-IFN-γ和抗-IL-4。在第5天确定IL-22浓度。显示的数据为平均值±SD。(图2B)
当用OVAp和经辐射的脾细胞再刺激这些细胞时，与Th1或Th2细胞相比，用TGF-β、IL-6、IL-1β和TNF-α或用Th17条件最初分化的细胞产生了至少5倍多的IL-22(图2B)。与用OVAp单独或者用IL-12和抗-IL-4再刺激细胞相比，通过用IL-23、抗-IFN-γ和抗-IL-4再刺激使得T细胞沿着Th17谱系的继续分化使得IL-22产量增加了至少12倍。相反，用IL-12、抗-IL-4再刺激Th1细胞或者用IL-4、抗-IFN-γ再刺激Th2细胞不增强IL-22产量。这些结果显示Th1或Th2的进一步分化不增强IL-22的产量。此外，用IL-23、抗-IFN-γ和抗-IL-4再刺激Th1和Th2细胞未将IL-22产量增加到在相同条件下活化的Th17细胞中所观察到的量。这些数据表明IL-23比IL-12在刺激IL-22表达方面更强，并且Th17细胞是IL-22的主要生产者。
在任何T细胞群体中均未检测到IL-22R1转录物(图3A)。还检查了IL-22调节增殖和从幼稚、Th1、Th2、和Th17细胞中产生IFN-γ、IL-4和IL-17A的能力，但是当T细胞用外源IL-22处理时没有观察到变化(图3B-3E)。IL-17A或IL-17F也不从幼稚、Th1、Th2或Th17细胞诱导IL-22表达。因此，IL-22和IL-17A/IL-17F不直接调节彼此的通过CD4T细胞的表达。
在Th17分化过程中IL-22的诱导表明IL-22和IL-17可以由相同的T细胞共表达。为了检查此，在多种条件下活化的T细胞上进行细胞内细胞因子染色。在活化第5天在来自图2A的细胞上进行针对IFN-γ、IL-17A、和IL-22的细胞内细胞因子染色。用50ng/ml PMA(西格玛公司(Sigma))、1μg/ml离子霉素(西格玛公司(Sigma))和GolgiPlug(法明更公司(Pharmingen))再刺激细胞6小时。首先就表面抗原对细胞进行染色，然后根据厂商指导用Cytofix/Cytoperm(法明更公司(Pharmingen))处理所述细胞。使用IFN-γ、IL-22、IL-17A和IL-17F的抗体进行细胞内细胞因子染色。根据厂商指导，抗-IL-22(-02)用Alexa647(分子探针公司(Molecular Probes))标记，并且抗-IL-17F(15-1)用FITC(皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnologies))标记。所有的图是在KJ126+CD4+细胞上进行并且显示了阳性的百分比。Th0、Th1和Th2活化的细胞具有IL-22产生细胞的最小扩展(≤0.2％)(图4A)。在Th17条件下的活化产生了IL-22表达细胞的重要的群体(8.7％)，其中81％的IL-22+细胞表达IL-17A并且仅1％表达IFN-γ。
另外检测了在Th17分化条件下的单个细胞因子的作用。用1μg/ml的OVAp、经辐射的脾细胞和标明的细胞因子活化幼稚DO11 T细胞。在活化的第5天进行针对IL-17A、IL-17F和IL-22的细胞内细胞因子染色。数据是3个实验的代表。用外源TGF-β活化的细胞的仅0.2％表达IL-22(图4B)。用IL-6、IL-1β和TNF-α活化增加了IL-22+细胞(1.9％)。将外源TGF-β加入到IL-6、IL-1β和TNF-α中进一步增加了IL-22+细胞(2.8％)，其中62％的IL-22+细胞表达IL-17A或IL-17F。用IL-23，与TGF-β、IL-6、IL-1β和TNF-α一起的活化导致了IL-22+细胞的～3倍的增加(9.5％)(图4B)。80％的IL-22+细胞产生了IL-17A或IL-17F，其中大多数细胞都表达IL-17A或IL-17F(44％)(图4B)。添加TGF-β的中性抗体表明外源TGF-β对于由IL-6、IL-1β和TNF-α诱导的IL-22的最优表达很重要(图4C)。总之，这些数据证明了Th17细胞更大量地产生了IL-22蛋白质，并且在Th17分化过程中IL-22与IL-17A和IL-17F共表达。
实施例3：在Th17分化过程中IL-23增加了IL-22产生细胞的扩展
为了进一步检测Th17分化过程中IL-23如何增强IL-22的表达，将用CFSE(分子探针公司(Molecular Probes))标记的幼稚DO11 T细胞用1μg/ml OVAp经辐射的脾细胞、TGF-β和IL-6分化。向一些培养物中添加TNF-α、IL-1β、IL-23或IL-12。从培养的第1到第5天分析IL-22的表达。在第1至第5天中进行针对IL-22和IL-17A的细胞内细胞因子染色。测定在d1-d5天IL-22+细胞的百分比。图5A表明作为时间函数作图的表达IL-22细胞的百分比，和来自第2和第4天的代表性的流式细胞术图。仅用TGF-β和IL-6活化的细胞在第2天达到IL-22(15％)表达的峰值，并且在第3天显著减少。添加TNF-α、IL-1β或者IL-12都不能阻止在第2天后观察到的IL-22表达的减少。相反，用IL-23、TGF-β和IL-6活化的细胞在第4天表达了至少5倍多的IL-22。
为了检查IL-23是否诱导IL-22产生细胞的扩展，我们分析了第4天表达IL-22和/或IL-17A的细胞的CFSE稀释谱(图5B)。在用TGF-β和IL-6单独活化的或者是当补充有IL-1β、TNF-α或IL-23时的IL-22-IL-17A+和IL-22-IL-17A-细胞之间没有观察到CFSE的差异。这显示了在IL-17A表达和增殖之间没有关联。用TGF-β和IL-6活化的IL-22+IL-17A-和IL-22+IL-17A+细胞的CFSE谱显示这些细胞的增殖少于IL-22-IL-17A-和IL-22-IL-17A+细胞。在补充有IL-1β、TNF-α或IL-12的培养物中观察到类似的发现。相反，在TGF-β和IL-6背景中IL-23增强了IL-22+IL-17A-和IL-22+IL-17A+细胞的增殖和扩展。这些发现证明了IL-23在Th17谱系中驱动了IL-22产生细胞的扩展。
为了检查内源IL-23对于最优的IL-22的表达是否必需，用LPS处理的树突细胞(“DC”)、OVAp和IL-23R或IL-12p40的中和抗体活化幼稚DO11T细胞。为了生成DC，将骨髓细胞与10ng/ml GM-CSF和1ng/mlIL-4一起培养7天。在通过CD11c阳性选择(米尔特尼生物技术公司(Miltenyi Biotec))纯化后，用1μg/ml LPS(大肠杆菌血清型0111-B4，西格玛公司(Sigma))使DC成熟24小时。然后将DC洗涤，并且将1×104DC与2×104经纯化的幼稚DO11T细胞、OVAp，和10μg/ml抗-IL-12p40、抗-IL-23R或相关同种型对照一起培养。
抗-IL-12p40(C17.8)和抗-IL-23R(258010)自安迪系统公司(R&DSystems)。在培养的第5天测定IL-22的浓度。数据是至少两个实验的代表。与同种型对照相比，IL-23R的中和将IL-22的产量减少了62％(1μg/mL OVAp)(图5C)。用抗-IL-12p40也观察到了IL-22表达的相似减少(64％)，表明IL-23而非IL-12负责了大多数IL-22的产量。总之，这些数据证明了IL-23诱导了IL-22产生细胞的最优扩展。
实施例4：小鼠IL-22的表达需要IL-6和IL-23。
IL-23可体外从小鼠T细胞中诱导IL-22表达。为了检查IL-23如何体内影响IL-22的表达，将缺乏C57BL/6 IL-23p16的小鼠(每组7只小鼠)用100μg的在CFA中乳化的OVA免疫。如前所述生成缺乏C57BL/6IL-23p19的小鼠(Thakker，P.等人，J.Immunol.(2007)178：2589-2598)。也免疫了缺乏IL-6的小鼠(B6；129S2-Il6tm1Kopf/J；杰克逊实验室(Jackson Laboratories)，每组5只小鼠)以检查IL-6如何体内影响IL-22的表达。免疫10天后，收获引流(draining)腹股沟淋巴结(“LN”)并且在OVA存在时离体再刺激。在离体再刺激的第4天时确定IL-22的浓度。与它们各自的WT对照相比，缺乏IL-23或IL-6的小鼠产生了显著更少的IL-22(图6，数据为至少两个实验的代表)。因此，体内IL-22表达细胞的最优分化需要IL-23和IL-6二者。
实施例5：IL-22不作用于幼稚或分化的T细胞
IL-22的功能性受体包括IL-22R1和IL-10R2之间的异二聚体复合物。尽管IL-10R2在所有组织中被普遍表达，IL-22R1则主要被限制在非淋巴组织和细胞中。尽管在幼稚或3天活化的人外周血淋巴细胞上没有检测到IL-22R1的表达，但是不知道分化的鼠Th1、Th2或Th17细胞是否可以表达IL-22R1。为检查此，在幼稚以及分化的DO11细胞中进行IL-22R1的定量PCR。在幼稚、Th1、Th2、或Th17T细胞中没有检测到IL-22R1的表达。相反，在皮肤中检测到IL-22R1阳性。尽管IL-22R1未在T细胞上表达，但是可能的是IL-22可以通过尚未定义的受体来信号传导。为了功能性检测IL-22是否可以作用于幼稚或经分化的T细胞上，在IL-22存在时活化幼稚、Th1、Th2和Th17T细胞。将外源IL-22添加至高到100ng/ml时，没有观察到相同的对于幼稚或分化的Th1，Th2，或Th17细胞的增殖和细胞因子产生(IFN-γ，IL-4，IL-17A)的作用。这些数据表明IL-22不作用于幼稚或分化的T细胞。
实施例6：IL-22在体内与IL-17A和IL-17F共表达。
体外数据证明了IL-22与IL-17A和IL-17F共表达。为了检查这一群体是否体内存在，用100μg在CFA(西格玛公司(Sigma))中乳化的OVA(西格玛公司(Sigma))皮下免疫C57BL/6小鼠。7天后，直接离体在引流LN上进行细胞内细胞因子染色。与未经免疫的小鼠相比，用OVA/CFA免疫增加了IL-22+(0.34％)、IL-17A+(0.35％)和IL-17F+(0.43％)细胞的扩展(图7A)。IL-22与IL-17A(44％的IL-17A+细胞是IL-22+)和IL-17F(45％的IL-17F+细胞是IL-22+)共表达，但是不与IFN-γ、IL-4或IL-10共表达(图7B)。当比较IL-17A和IL-17F的表达时，检测到两个细胞因子之间的相当大的但非完全的共表达(图7C)。IL-17A+IL-17F+细胞包含60％的IL-17A+和70％的IL-17F+细胞。结果证明了Th17细胞中的IL-17A和IL-17F表达的异质性。没有观察到IL-17F与IFN-γ、IL-4或IL-10共表达。还测量了IL-17A和/或IL-17F产生细胞中IL-22的表达并且在IL-17A+IL-17F+细胞中发现了最高的IL-22的表达(53.1％)(图7C)。也分析了IL-22+细胞中的IL-17A和IL-17F的表达(图7D)。70％的IL-22+细胞表达IL-17A或IL-17F，其中45％的IL-22+细胞二者都表达。
IL-17A、IL-17F和IL-22的体内表达模式与用TGF-β、IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-23体外产生的表达模式类似(见图4B)，表明这一体外条件足以复制体内Th17分化。在免疫后第4和第10天也观察到了IL-22、IL-17A和IL-17F的类似表达形式。这些数据证明了IL-22在体内不与IFN-γ、IL-4和IL-10共表达，但是与IL-17A和IL-17F共表达。
为了检查IL-23是否刺激了来自体内致敏T细胞的IL-22的产生，将LN细胞用200μg/ml OVA，OVA和IL-12，OVA和IL-23，或单独用培养基再刺激。在再刺激的第4天检查IL-22和IL-17A浓度。显示在图7E中的ELISA数据是平均值±SD，并且是三个独立实验的代表。与单独OVA相比，加入IL-23将IL-22的产量增加了7倍，但是外源IL-12没有影响。这些数据进一步支持了IL-23而非IL-12刺激增加了IL-22产量。
实施例7：IL-22由人Th17细胞表达，以及以较少的程度由人Th1细胞表达。
为了研究IL-22是否也由人Th17细胞表达，在多种刺激条件下，在混合淋巴细胞反应(MLR)中，将来自六个独立的供体的CD4+ T细胞用同种异源CD4-耗竭性外周血淋巴细胞(“PBL”)活化。通过Rosette Sep(干细胞技术(Stem cell technologies))将人CD4+ T细胞从供体的外周血纯化出来。在48孔板中，将7.5×105人T细胞与来自单独供体的7.5×105经辐射的(3300rad)CD4-耗竭性PBL一起培养。以下列浓度添加标明的细胞因子和抗体：20ng/ml IL-6、10ng/ml IL-1β、10ng/ml TNF-α、1ng/ml TGF-β、10μg/ml抗-IL-4(MP4-25D2，法明更公司(Pharmingen))、10μg/ml抗-IFN-γ(NIB412，法明更公司(Pharmingen))和10μg/ml抗-TGF-β(1D11，安迪系统公司(R&D Systems))。
在活化的第7天，收获条件培养基，并且通过用2.5μg/ml的抗-人IL-22抗体(Ab-04)包被平板并且用1μg/ml抗-人IL-22抗体(354A08)，然后是生物素化的抗-人IgG(法明更公司(Pharmingen)341620)和链霉抗生物素HRP检测，来定量存在的人IL-22。通过ELISA(用4μg/ml抗-人IL-17A(MAB317，安迪系统公司(R&D Systems))包被，并且用75ng/ml生物素化的抗-人IL-17A(BAF317，R&D Systems)和链霉抗生物素HRP检测)来确定条件培养基中的人IL-17A的浓度。检查了来自六个单独的供体的CD4+T细胞。不存在任何外源细胞因子时，产生了少量的IL-22(<600pg/ml)(图8A，每条线代表不同的供体)。使用IL-12以及抗IL-4的中和抗体的Th1条件活化将IL-22的表达平均增加了2.5倍。使用IL-6、IL-1β和TNF-α的Th17条件活化导致IL-22的更大表达，将产量平均增加了17倍。与在Th1条件下相比(1.4倍)，在Th17条件下更大程度地增加了IL-17A表达(9.5倍)(图8A)。这些数据表明，对于小鼠T细胞，用IL-6、IL-1β和TNF-α活化人CD4T细胞极大地增加了IL-22和IL-17A的产量。
也通过细胞内细胞因子染色检查了IL-22的表达，以确定哪种类型的CD4T细胞在我们的MLR系统中产生IL-22。将在Th1分化条件(IL-12、抗-IL-4)或Th17条件(IL-6、IL-1β、TNF-α)下活化的细胞用50ng/ml PMA、1μg/ml离子霉素和GolgiPlug(法明更公司(Pharmingen))再刺激5小时，固定并且用Cytofix/Cytoperm(法明更公司(Pharmingen))进行透化处理。使用抗-IL-22PE(安迪系统公司(R&D systems))、抗-IFN-γFITC(法明更公司(Pharmingen))、抗-CD4PerCp-Cy5.5(法明更公司(Pharmingen))和抗-IL-17A647(安迪系统公司(R&D Systems))进行对于IL-22、IL-17A、和IFN-γ的CD4+ T细胞的细胞内共染色。将Th1细胞定义为表达IFN-γ，并且将Th17细胞定义为它们表达IL-17A。对于检查的六个供体中的每一个计算表达IL-22的Th1或Th17细胞的百分比。数据是至少两个实验的代表。尽管在Th1细胞中检测了一些IL-22表达，在所有六个供体中，在Th17细胞中IL-22的表达始终比在Th1细胞中的高(图8B)。这些数据表明IL-22由人Th17细胞产生，而且由人Th1细胞以较低程度产生。
实施例8：TGF-β抑制了人T细胞的IL-22的表达。
外源TGF-β和IL-6支持在小鼠中Th17细胞的分化，其中IL-1β和TNF-α进一步增进了该反应(Veldhoen，M.等人，Immunity(2006)24：179-89；Mangan，P.R.等人，Nature(2006)441：231-34；Bettelli，E.等人，Nature(2006)441：235-38)。外源TGF-β减少了用抗-CD3、抗-CD28和IL-6活化的从人脐带血来源的幼稚CD4 T细胞的IL-22表达，表明了TGF-β不仅调节人IL-22的表达，而且作用为抑制其表达(Zheng，Y.等人，Nature(2007)445：648-651)。为了检查TGF-β在APC存在的MLR中的作用，将来自六个供体的CD4+ T细胞用IL-6、IL-1β和TNF-α单独地活化，或者另外用补充有外源TGF-β细胞因子(西格玛阿尔德里克公司(SigmaAldrich))或人TGF-β中和抗体(1D11，安迪系统公司(R&D Systems))的IL-6、IL-1β和TNF-α活化。确定了来自MLR的第7天条件培养基中的IL-22和IL-17A浓度。由于TGF-β可以由淋巴细胞产生，需要添加抗-TGF-β抗体来阻止内源TGF-β信号传导。在IL-6、IL-1β和TNF-α的背景中中和TGF-β将IL-22的表达平均增加了3.0倍，表明TGF-β抑制了人T细胞的IL-22产量(图9A，每条线代表不同的供体)。与这一观察相符的，添加到IL-6、IL-1β和TNF-α的外源TGF-β将IL-22的产量平均减少了4.4倍。TGF-β对IL-17A表达的作用也在我们的人MLR系统中进行了检查。添加TGF-β中和抗体或TGF-β细胞因子对于由IL-6，IL-1β，和TNF-α诱导的IL-17A的产量没有相符的影响(<1.2倍平均改变)。因此，这些数据证明了TGF-β抑制了PBL-来源的CD4+人T细胞的IL-22表达，但是其对于IL-17A的表达没有重要影响。
也检查了TGF-β在调节小鼠IL-22表达中的作用。用IL-6和用TGF-β细胞因子或TGF-β中和抗体之一活化幼稚CD62L+DO11 T细胞。在活化的第2天和第4天通过ELISA检查了IL-22的表达。尽管IL-22的表达不需要存在外源TGF-β，用抗体中和内源TGF-β在活化的第2天一贯减少了IL-22的表达(～1.8倍)，表明鼠的T细胞中内源TGF-β的存在确实有助于增强IL-22产量(图9B)。在第4天，中和TGF-β未对IL-22的表达产生同样大的影响，表明TGF-β在初始活化过程中对于增强IL-22表达具有其最大的影响。令人感兴趣地，添加大量的外源TGF-β(>＝10ng/ml)抑制了活化第2天和第4天的IL-22的表达。综上所述，这些数据表明在IL-6存在时，内源TGF-β信号传导增强了活化初始阶段过程中小鼠IL-22的产量，而添加大量的外源TGF-β实际上抑制了IL-22的表达。
实施例9：通过腺病毒载体的IL-22的施用影响了小鼠中的急性期反应
小鼠和人T细胞的IL-22表达都可以由IL-6、IL-1β和TNF-α诱导。已知这些促炎细胞因子诱导急性期反应。急性期反应是指示了炎症性病况的生物化学、生理学和行为改变集合。已知作为急性期反应物的特定蛋白质的调节是急性期反应和炎症的生物化学标志。用IL-22体外处理肝细胞和体内施用IL-22可以快速诱导血清淀粉样蛋白A(SAA，主要的急性期反应物)的表达(Dumoutier，L.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.(2000)97：10144-49；Wolk，K.等人，Immunity(2004)21：241-54).
为了研究IL-22在更多的慢性背景中的作用，将IL-22在C57BL/6小鼠中使用复制缺陷型腺病毒异位表达。在施用后直至2周检查急性期反应物的表达。与表达GFP的腺病毒相比，从第3天开始SAA表达被显著增强，并且保持显著增加直至14天后(数据未显示)。凝血因子I是另一个急性期反应物，也在施用了表达IL-22的腺病毒的小鼠中被显著增强，这是从早在第一天就开始的并且持续显著直到7天后(数据未显示)。尽管在急性期反应过程中诱导了一些蛋白质，但是在炎症过程中其它蛋白质例如清蛋白是降低的。与表达GFP的对照相比，用表达IL-22的腺病毒处理的小鼠表现出降低的清蛋白表达(数据未显示)。这些数据证明了使用腺病毒异位表达而暴露于IL-22两周导致了指示急性期反应的多个蛋白质的调节。
还研究了IL-22腺病毒施用对血细胞的影响。在病毒接种后，与GFP腺病毒对照相比，用表达IL-22的腺病毒处理的小鼠产生了血清血小板中的显著增加(7天为1.5倍，14天为2.0倍)(数据未显示)。随着血小板数量的这一增加，观察到轻度贫血，这是由红细胞的少量但是统计学显著的减少所指示的。还检测到在血清血细胞比容(hematocrit)和血红蛋白中的类似地显著减少(数据未显示)。还发现了血中分开的嗜中性粒细胞数量增加的趋势，尽管增加并不总是显著的。综上所述，在用表达IL-22的腺病毒处理的小鼠中观察到的生化和血液改变指示了IL-22体内诱导急性期反应(APR)。
实施例10：在IL-6不存在时IL-22蛋白质可以直接增强SAA。
我们使用腺病毒构建体的数据证明了IL-22能够体内调节指示了急性期反应的参数。但是，作为用腺病毒感染的结果IL-22与其它因子作用也是可能的。为了直接检查IL-22的作用，将IL-22蛋白质通过腹膜内注射施用给小鼠并且在一些时间点检查血清的急性期反应物的改变。通过腹膜内注射向小鼠施用25μg的IL-22蛋白质或PBS。使用前述方法生成小鼠IL-22(Li，J.，等人，Int.Immunopharmacol.(2004)4：693-708)。在0.5、1、3、6、和24小时收获血和肝，并且制备血清。使用SAA-特异性ELISA(英杰生命科学公司(Invitrogen))定量SAA。施用IL-22蛋白质足以显著增加血清中SAA蛋白质的表达，这是在施用后3小时时开始的并且直至24小时(图10A)。
也将施用了IL-22或PBS的小鼠的肝速冻并且随后使用RibopureRNA分离试剂盒(安宾公司(Ambion))处理得到RNA。使用Taqman(应用生物系统公司(Applied Biosystems))和预先定量的引物/探针(应用生物系统公司(Applied Biosystems))对SAA1、凝血因子I、触珠蛋白和清蛋白进行定量PCR。然后计算每个基因根据β2微球蛋白进行标准化后的相对量。肝中的SAA转录物表达在施用后0.5小时增加并且在1小时和3小时处显著增加(图10B)。除了SAA外，在注射后1小时内观察到IL-22显著增加了肝中的凝血因子I转录物(图10B)。在注射后直至3小时，触珠蛋白和清蛋白转录物没有显著改变(图10B)。因此，IL-22可以在腹膜内施用后1小时内开始影响急性期反应的改变。
尽管IL-22注射诱导SAA，但是可能是IL-22通过诱导随后直接增强SAA表达的其它细胞因子例如IL-6和TNF-α来间接作用。为了检查IL-22是否体内诱导IL-6和TNF-α，在IL-22施用后检查血清IL-6和TNF-α表达。使用炎症CBA试剂盒(Inflammation CBA kit)(法明更公司(Pharmingen))确定IL-6和TNF-α的浓度。在施用后直至24小时也没有观察到显著改变(图10C)。由于可能是产生的IL-6和TNF-α的量太低以至于难以检测，还将IL-22蛋白质直接施用给缺乏IL-6的小鼠中。通过腹膜内注射向C57BL/6和C57BL/6 IL-6-/-小鼠施用25μg的IL-22。将小鼠在注射后6小时时放血，并且从血清中定量SAA。每组检查15只小鼠，显示的数据是至少2个实验的代表。在缺乏IL-6的小鼠中，IL-6不存在对于IL-22诱导的SAA产量没有影响(图10D)。综上所述，这些数据支持了早期的研究，所述研究表明IL-22调节了指示急性期反应的参数。这些数据还指示了IL-22可以在IL-6信号传导不存在时调节主要的急性期反应物SAA。
实施例11：IL-22诱导血液中嗜中性粒细胞的活动化
也检查了IL-22蛋白质施用导致的血液改变。将小鼠通过腹膜内注射施用25μg的IL-22蛋白质或PBS。在施用后在多个时间点收集血并且使用Cell-Dyn血液分析仪(艾伯特诊断公司(Abbott Diagnostics))定量嗜中性粒细胞数量。在施用后1小时，IL-22诱导了血液中嗜中性粒细胞计数的显著的2倍的增加(图11A)。这一增加是瞬时的，因为在1小时后没有观察到统计学显著的改变。还检查了许多嗜中性粒细胞化学引诱物的表达。在施用后1小时时在血清中检测到CXCL1的显著增加(13倍)(图11B)。根据厂商指导，使用CXCL1-特异性ELISA(安迪系统公司(R&D Systems))定量CXCL1。定量PCR表明肝中CXCL1转录物也在注射后0.5小时处开始被显著增强(图11C)。数据是至少3个实验的代表。在任何时间点都没有观察到血清中CXCL2、CXCL5或G-CSF的增加。这些数据证明了IL-22可以诱导嗜中性粒细胞的活动化和嗜中性粒细胞化学引诱物CXCL1的表达(可能是从肝中)。
实施例12：IL-22、IL-17A和IL-17F合作诱导抗微生物肽
IL-22的一个功能是增强与宿主防御相关的抗微生物肽(包括β-防卫素2(hBD-2)、S100A7、S100A8和S100A9)的表达(Wolk等人，Immunity(2004)21：241-54；Boniface等人，J.Immunol.(2005)174：3695-3702)。为了检查IL-17A、IL-17F和IL-22是否可以合作作用来调节这些基因，将初级人角质形成细胞用IL-22、IL-17A、IL-17F或用这些细胞因子的组合处理。特别地，将初级人角质形成细胞(赛因细胞公司(ScienCell))在人凝血因子I包被的平板(BD生物科学公司(BD Biosciences))上在角质形成细胞培养基(赛因细胞公司(ScienCell))中进行培养。将细胞在80％汇合时传代并且所有实验在2-4代间进行。为了评估细胞因子影响，将15,000个细胞种植到24孔平板上并且允许附着48小时。然后将细胞用人IL-22、IL-17A和IL-17F处理44小时。将RNA纯化并且使用Taqman Real TimePCR和预先定量的引物-探针(应用生物系统公司(Applied Biosystems))进行定量PCR。通过根据GAPDH标准化来确定hBD-2、S100A7、S100A8和S100A9转录物的相对量。相对于未用任何细胞因子处理的角质形成细胞中的表达(在图12中用虚线表示)计算诱导倍数。IL-17A诱导所检查的所有4个抗微生物肽的上调(在200ng/ml时5-70倍诱导)(图12A)。IL-22也诱导了所有4个抗微生物蛋白质(在200ng/ml时2-5倍诱导)，而IL-17F(200ng/ml)将hBD-2诱导了8倍，将S100A8诱导了1.5倍，并且将S100A9诱导了2倍，但是不上调S100A7。
然后将角质形成细胞与IL-22、IL-17A和IL-17F的成对组合一起培养。将人角质形成细胞用IL-22(200ng/ml)、IL-17A(20ng/ml)和IL-17F(20
ng/ml)的成对组合刺激44小时。如上所述定量hBD-2、S100A7、S100A8和S100A9 mRNA。数据是平均值±SD并且是在3个独立供体上实施的实验的代表。用IL-22(200ng/ml)和IL-17A(20ng/ml)处理导致hBD-2(IL-22：5倍；IL-17A：60倍；IL-22+IL-17A：180倍)和S100A9(IL-22：2倍；IL-17A：5倍；IL-22+IL-17A：13倍)的协同增加(图12B)。用IL-22(200ng/ml)和IL-17F(20ng/ml)处理也协同增强了hBD-2(IL-22：5倍；IL-17F：2倍；IL-22+IL-17F：20倍)。即使S100A7、S100A8和S100A9未被IL-17F(20ng/ml)单独上调，IL-17F加IL-22将这3个肽的表达增加为IL-22单独所增加的2倍。这些数据证明了IL-22可以与IL-17A或IL-17F合作(协同或者叠加)作用。IL-17A和IL-17F的组合处理的角质形成细胞增强了S100A8，但是没有另外增强hBD-2、S100A7或S100A9的表达。与IL-22和IL-17A或IL-17F的组合相比，IL-17A和IL-17F的组合较低地诱导了这些基因。用IL-22、IL-17A或IL-17F的处理没有改变针对IL-22(IL-22R1)或IL-17(IL-17RA)的受体的表达，表明这些影响与受体表达的改变不相关。这些数据证明了IL-22与IL-17A或IL-17F组合合作增强了抗微生物肽的表达。
实施例13：IL-22、IL-17A、IL-17F和IL-23p19在牛皮癣中被上调。
数据证明了在用模型抗原免疫后体内IL-22与IL-17A和IL-17F共表达。为了进一步检查在人疾病中这些发现的关联性，在寻常性牛皮癣(皮肤的炎症性疾病)中分析了IL-22、IL-17A、IL-17F和IL-23p19的表达。牛皮癣是复杂的多基因疾病，影响大约2％的美国群体并且特征在于红的、凸起的疤状损伤的形成(Schon，M.等人，N.Engl J.Med.(2005)352：1899-1912)。尽管牛皮癣的病原学仍在讨论中，大量的证据存在表明T细胞是该疾病的病原成分(Christophers，E.等人，Int.Arch.AllergyImmunol.(1996)110：199-206)。T细胞存在于牛皮癣患者的损伤皮肤中，并且多种T细胞来源的细胞因子已经发现在损伤皮肤中被上调(Nickoloff，B.等人，Arch.Dermatol.(1991)127：871-884)。在此，在来自牛皮癣患者的皮肤中检查了IL-22、IL-17A、IL-17F和IL-23p19的表达，并且分析了这些基因之间的潜在相关表达。
从患有活跃牛皮癣的46位患者中获得非损伤和损伤性皮肤的成对活检物，并且通过定量PCR确定IL-22、IL-17A、IL-17F和IL-23p19的相对浓度(图13A)。在非损伤性皮肤中，在46名患者中的31位中，IL-22低于检测水平。与非损伤性皮肤相比，在损伤性皮肤中IL-22平均被显著上调25倍(p＝7×10-9)，其中所有46名患者上调IL-22。在46个非损伤皮肤活检物的26个中没有检测到IL-17A，但是其也显著上调了19倍(p＝1×10-16)，其中46名患者中的45位上调了IL-17A。在46名患者中的32位中，在非损伤皮肤中，IL-17F低于检测水平，IL-17F被上调了21.4倍(p＝4×10-10)，其中46名患者中的45位在损伤皮肤中具有更高水平的IL-17F。与非损伤皮肤相比，在损伤皮肤中IL-23p19的表达被增加了11(p<0.0001)倍，其中46个患者中的44位上调了IL-23p19。通过成对学生t检验确定所述值。
这些数据与前述报道相符，所述报道证明了在牛皮癣患者的损伤性皮肤中IL-22和IL-17A被上调(Wolk，K.等人，Immunity(2004)21：241-254；Wolk，K.等人，Eur.J.Immunol.(2006)36(5)：1309-23；Li，J.等人，J.Huazhong Univ.Sci.Technolog.Med.Sci.(2004)24：294-296)。但是，在本研究中，分析的更大量的患者，并且与以前使用的半定量方法相比，还通过定量PCR对IL-17A进行了检查。此外，在以前在牛皮癣中未被表征其表达的IL-17F也在损伤性皮肤中被显著上调。这些结果显示Th17细胞因子在牛皮癣的发病机制中起作用。
还通过进行斯皮尔曼等级相关分析检查了IL-22、IL-17A、IL-17F和IL-23在其相对浓度中的任何相关性(图13B)。IL-22表现出与IL-17A的正的但是不显著的相关性。相反，在IL-22和IL-17F(0.37，p＝0.01)之间以及IL-17A和IL-17F(0.44，p＝0.003)之间获得了正的以及显著的相关性。这些正的相关系数表明在IL-22和IL-17F之间以及在IL-17A和IL-17F之间存在相关性关系。尽管数据证明了在CD4+ T细胞中，IL-22与IL-17A和IL-17F二者都体内共表达，这些细胞因子的表达并不仅限于淋巴细胞。除了T细胞外，还在嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞中检测到了IL-17A mRNA，而也在NK细胞中检测到IL-22mRNA(Molet，S.等人，J.Allergy Clin.Immunol.(2001)108：430-438.；Ferretti，S.等人，J.Immunol.(2003)170：2106-2112.；Awane，M.等人，J.Immunol.(1999)162：5337-5344.；Wolk，K.等人，Immunity(2004)21：241-254)。由于已经报道了嗜中性粒细胞、单核细胞和NK细胞存在于损伤性皮肤中(Schon，M.等人2005.N.Engl J.Med.352：1899-1912)，因此这些细胞类型也贡献了皮肤中总的IL-22和IL-17A mRNA，并且因此影响我们的相关性分析，特别是在IL-22和IL-17A之间的相关性。但是，在IL-22和IL-17F之间，以及IL-17A和IL-17F之间正的和显著的相关性证明了在牛皮癣中这些细胞因子之间的正比关系。还在IL-23和IL-17A之间以及IL-23和IL-17F之间检测到了正的和显著的相关性。
实施例14：牛皮癣治疗的模型
SCID小鼠中的异种移植是认可的用于研究牛皮癣的模型，见例如Boehncke等人，Br.J.Dermatol.(2005)153(4)：758-66。在局部麻醉下，从慢性斑块期牛皮癣患者中切除损伤的开裂皮肤(厚度约0.5mm)。将人开裂移植物移植到6-8周龄SCID小鼠的背上。给予小鼠3周时间来接受移植物并且愈合。在移植后22天时，将小鼠隔日腹膜内注射单独包含IL-17F拮抗剂的组合物或者包含IL-22的拮抗剂以及至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23拮抗剂的组合物。作为阴性对照，小鼠每天接受胃内应用200μL PBS和/或同种型对照抗体。作为阳性对照，小鼠接受每天胃内应用200μl PBS中的2mg kg-1的地塞米松。阴性对照发展了牛皮癣的标志，包括棘层增厚、乳头瘤病、角化不全、和致密的单核浸润液。在移植后第50天处死小鼠，并且切除皮肤周围的移植物。将一半的移植物在福尔马林中固定，将另一半在液氮中冷冻。进行常规苏木精和伊红染色，并且在质地上(表皮分化)和数量上(表皮厚度，炎症性浸润)上分析移植物。使用目镜测微尺从表皮突的尖端到有活力表皮的边缘测量平均表皮厚度。炎症性浸润液的密度可以通过计算三个邻近的有效区域(power field)中的细胞数量来确定。可以使用组织分析来评估疾病进展以测量牛皮癣标志，例如棘层增厚、乳头瘤病、角化不全、炎症性浸润液，以及角膜层和颗粒层的出现。
用200μl PBS或同种型匹配的对照抗体注射接着进行移植物移植的阴性对照小鼠进行性发展牛皮癣。由于牛皮癣损伤处表达更高水平的IL-22、IL-17A、IL-17F和IL-23p19，用IL-22的拮抗剂和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂处理预期会阻抑或延缓牛皮癣。因此，由于该模型预告了对于牛皮癣的治疗功效，用IL-17F拮抗剂单独治疗或用IL-22拮抗剂与至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂组合治疗预期会阻抑或延缓人的牛皮癣。
实施例15：患者治疗
可以用IL-22的拮抗剂和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂治疗罹患自身免疫病症、呼吸病，皮肤、心血管系统、神经系统、肾脏、肝脏及胰脏炎症性病况的患者或移植患者。示例性的治疗方案和预期结果如下提供。可以根据需要调节剂量和频率。
表1：治疗方案
 
病症 用以下治疗 剂量 频率 预期结果
多发性硬化 α-IL-22 Abα-IL-17A Ab 1mg/kg 每周一次 病况改善或稳定
多发性硬化 α-IL-22 Abα-IL-17A Ab 500μg/kg 每天一次 病况改善或稳定
类风湿性关节炎 α-IL-22 Abα-IL-17A Ab 1mg/kg 每月一次或每两月一次 病况改善或稳定
类风湿性关节炎 α-IL-22 Abα-IL-17A Ab 500μg/kg 每周一次或每两周一次 病况改善或稳定
哮喘 α-IL-22 Abα-IL-17A Ab 100μg/kg 每天一次 病况改善或稳定
COPD α-IL-22 Abα-IL-17A Ab 100μg/kg 每天一次 病况改善或稳定
牛皮癣 α-IL-22 Abα-IL-17A Ab 500μg/kg 每周一次或每两周一次 病况改善或稳定
牛皮癣 α-IL-22 Abα-IL-17A Ab 1mg/kg 每月一次或每两月一次 病况改善或稳定
阿尔茨海默病 α-IL-22 Abα-IL-17A Ab 10mg/kg 每月一次或每两月一次 病况改善或稳定
阿尔茨海默病 α-IL-22 Abα-IL-17A Ab 1mg/kg 每周一次或每两周一次 病况改善或稳定
在表1中，可以用可溶性IL-22受体或结合蛋白替换抗-IL-22抗体。在表1中抗IL-17A抗体可以用抗-IL-23抗体、抗-IL-17F抗体或IL-17A、IL-17F或IL-23的可溶性受体或者结合蛋白替换。
已将IL-22表征为Th1细胞因子，因为发现IL-22 mRNA被IL-12上调(Wolk等人，J.Immunol.(2002)168：5397-5402)。本申请中描述的工作显示IL-22蛋白质也在Th17谱系中表达，揭示了来自Th17细胞的新的效应细胞因子。除了是Th17细胞因子外，IL-22位于距离IFN-γ～90kb处。IL-22和IFN-γ之间的不同的表达表明顺式调节元件存在于该基因座中，其可以调节Th1针对Th17细胞的分化。
这些数据还说明了IL-23在诱导IL-22表达中的新功能。尽管IL-17A是IL-23下游的效应细胞因子，某些数据表明了IL-17A并不负责IL-23的所有功能。例如缺乏IL-23p19的小鼠完全抵抗CIA中的疾病(Murphy等人，J.Exp.Med.(2003)198：1951-57)。缺乏IL-17A的小鼠仍然易感，尽管有显著减少的发病率和严重性(Nakae等人，J.Immunol.(2003)171：6173-77)。同样，缺乏IL-23p19的小鼠对于Citrobacter rodentium感染易感，不管是否维持了IL-17A的野生型表达(Mangan等人，Nature(2006)441：231-34)。这些数据表明涉及IL-23下游的其它细胞因子。
IL-22至少在类风湿性关节炎、牛皮癣和炎症性肠病中被上调(Wolk等人，Immunity(2004)21：241-54；Ikeuchi等人，Arthritis Rheum.(2005)52：1037-46；Andoh等人，Gastroenterology(2005)129：969-84)。与IL-17A和IL-17F类似，IL-22直接作用于外周组织的上皮细胞和成纤维细胞(Wolk等人，Immunity(2004)21：241-54；Ikeuchi等人，Arthritis Rheum.(2005)52：1037-46；Kolls，J.K.，和A.Linden.Immunity(2004)21：467-476)。这些数据证明了IL-22可以与IL-17A或IL-17F协同起作用来增强抗微生物肽的表达，表明这些细胞因子合作来防止感染。
根据本专利说明书所引述的参考文献的教导可最为彻底地了解本说明书。本说明书内的实施方案提供本发明实施方案的举例说明，而不应被视为对本发明范围的限制。熟练的技术人员很容易了解本发明所囊括的许多其它实施方案。本公开中所引述的所有出版物及专利的全文在此并入本案以作为参考。在并入本案以作为参考的材料与本说明书抵触或不一致的情况下，说明书将优于此类材料。本文任何参考文献的引证并非承认这样的参考文献为本发明的现有技术。
除非另有说明，本说明书、包括权利要求书中所用的表达成分、反应条件等的所有数目应理解为在所有情况下受术语“大约”的修饰。因此，除非另行有相反说明，所述数值参数为近似值，且可根据本发明要求保护的期望性质而不同。至少，且并非试图限制权利要求书范围等同原则的应用，各数值参数应根据有效数字的数值及一般舍入方法予以阐释。
除非另有说明，位于一系列要素之前的术语“至少”应理解为意指系列中的每一要素。本领域技术人员将会理解、或者仅通过常规实验就能够确定本文所述本发明具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在为如下权利要求书所涵盖。

Claims (22)

1.在受试者中治疗与IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23相关的病症的方法，其包括，向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含IL-22的拮抗剂和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂。
2.权利要求1的方法，其中IL-22的拮抗剂是抗体或其抗原结合片段，并且至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂是抗体或其抗原结合片段。
3.权利要求1的方法，其中IL-22的拮抗剂是可溶性受体或结合蛋白，并且至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂是抗体或其抗原结合片段。
4.权利要求1的方法，其中IL-22的拮抗剂是抗体或其抗原结合片段，并且至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的拮抗剂是可溶性受体或结合蛋白。
5.权利要求1-4的任一项的方法，其中所述病症选自牛皮癣、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、强直性脊椎炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、炎症性肠病、胰腺炎和克隆病.
6.权利要求1-5中任一项的方法，其还包括向受试者施用选自以下的另一治疗剂：细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒剂和细胞生长抑制剂。
7.权利要求6的方法，其中治疗剂选自TNF拮抗剂、IL-12拮抗剂、IL-15拮抗剂、IL-18拮抗剂、IL-21拮抗剂、T细胞耗竭剂、B细胞耗竭剂、氨甲蝶呤、来氟米特、西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物、Cox-2抑制剂、cPLA2抑制剂、NSAID和p38抑制剂。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中受试者是人。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中病症是牛皮癣。
10.权利要求1的方法，其中病症是牛皮癣，并且其中组合物包含与IL-22结合的抗体或其抗原结合片段，以及与IL-17A或IL-17F结合的抗体或其抗原结合片段。
11.权利要求1的方法，其中病症是关节炎，并且其中组合物包含与IL-22结合的抗体或其抗原结合片段，以及与IL-17A或IL-17F结合的抗体或其抗原结合片段。
12.权利要求1的方法，其中病症是类风湿性关节炎，并且其中组合物包含与IL-22结合的抗体或其抗原结合片段，以及与IL-17A或IL-17F结合的抗体或其抗原结合片段。
13.权利要求1的方法，其中病症是炎症性肠病，并且其中组合物包含与IL-22结合的抗体或其抗原结合片段，以及与IL-17A或IL-17F结合的抗体或其抗原结合片段。
14.权利要求1的方法，其中病症是克隆病，并且其中组合物包含与IL-22结合的抗体或其抗原结合片段，以及与IL-17A或IL-17F结合的抗体或其抗原结合片段。
15.在哺乳动物细胞中诱导抗微生物肽的方法，所述方法包括向哺乳动物细胞施用在哺乳动物细胞中有效诱导抗微生物肽的量的IL-22和IL-17A，IL-22和IL-17F，或IL-22、IL-17A和IL-17F。
16.权利要求15的方法，其中哺乳动物细胞是角质形成细胞。
17.权利要求15或16的方法，其中抗微生物肽是hBD-2、S100A7、S100A8或S100A9。
18.在体外，在样品中检测IL-22和至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的存在的方法，所述方法包括将样品与结合IL-22的第一试剂和结合IL-17A、IL-17F或IL-23的第二试剂接触，并且检测第一试剂和样品之间的第一复合物以及第二试剂和样品之间的第二复合物的形成，其中检测到第一复合物指示了样品中IL-22的存在，并且检测到第二复合物指示了样品中至少一种IL-17A、IL-17F或IL-23的存在。
19.权利要求18的方法，其中第一试剂是经标记的抗体。
20.权利要求19的方法，其中第二试剂是经标记的抗体。
21.权利要求18-20中任一项的方法，其中样品包含细胞。
22.权利要求21的方法，其中检测的第一复合物的量与细胞内IL-22的量成比例，并且检测的第二复合物的量与细胞内IL-17A、IL-17F或IL-23的量成比例。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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