JP2000509271A

JP2000509271A - グリア細胞株由来神経栄養因子受容体

Info

Publication number: JP2000509271A
Application number: JP9538155A
Authority: JP
Inventors: フオツクス，ゲイリー・エム; ウエン，ドウアンツイ; チン，シユチエン
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1996-04-22
Filing date: 1997-04-15
Publication date: 2000-07-25
Also published as: SK140398A3; CA2250704A1; BR9708959A; US20030175876A1; NO984757D0; EP0909316A1; KR20000010571A; CA2250704C; ATE338115T1; US20060166325A1; CZ324598A3; WO1997040152A1; ES2271968T3; NO984757L; EA002924B1; AU720092B2; CN1219967A; DE69736597T2; EP0909316B1; IL126553A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、中枢神経系および末梢神経系の両方からの種々の細胞型に対して広いスペタトルの生物活性を示す強力なニューロトロフィンであるグリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）に関する。本発明は、GDNFの高親和性受容体のクローニングおよび特徴づけを含む。この分子は、受容体系の最初の公知成分であるため、GDNF受容体（GDNFR）と称されている。GDNFRタンパク質産物に関する核酸およびアミノ酸配列を記載する。シグナルペプチドの特徴を有する疎水性ドメインがアミノ末端に存在し、一方、カルボキシ末端の第２の疎水性ドメインが、細胞膜に対する該受容体の結合に関与している。膜貫通ドメインおよび細胞質領域が存在しないことは、膜貫通シグナル伝達を媒介するためにはGDNFRが１以上の補助分子を必要とすることを示している。GDNFR mRNAは、神経系および非神経性組織の両方に広く分布しており、これは、GDNFに関して見出される同様の分布と符合する。

Description

【発明の詳細な説明】グリア細胞株由来神経栄養因子受容体１．発明の分野本発明は、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）の受容体に関するものであり、GDNF受容体（GDNFR）をコードする核酸およびアミノ酸配列を提供する。本発明はまた、GDNF応答状態の治療のための治療技術に関する。２．発明の背景グリア細胞株由来神経栄養因子グリア細胞系由来神経栄養因子(GDNF)は、中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存を増強する強力な神経栄養因子としてラットB49細胞から当初単離されクローニングされた（Linら，Science,260,1130-1132,1993）。最近の研究は、この分子が、中枢神経系および末梢神経系の両方からのいくつかのタイプのニューロンに影響を及ぼす種々の他の生物活性を現すことを示している。中枢神経系（CN S）では、GDNFは、哺乳動物の顔面および脊髄運動ニューロンの、軸索切断により誘導される死を防ぎ（Liら，Proceedings Of The National Academy Of Sciences,U.S.A.,92,9771-9775,1995;Oppenheimら,Nature，373，344-346，1995 ;Yanら，Nature，373，341-344，1995;Hendersonら，Science，266，1062-1064 ，1994;Zurnら，Neuroreport，6，113-118，1994）、発生中のトリ運動ニューロンを、プログラムされた自然細胞死から救う（Oppenhei・ら，1995，前掲）ことが示されている。GDNFの局所投与は、軸索切断により誘導される変性(KearnsおよびGash,Brain Research,672，104-111，1995;Beckら，Nature，373，339-341 ，1995）、または神経毒により誘導される変性（Sauerら，Proceedings Of The National Academy Of Sciences U.S.A.，92，8935-8939,1995;Tomacら，Nature ，373，335-339，1995）から、黒質ドーパミン作動性ニューロンを保護することが示されている。さらに、GDNFの局所投与は、ドーパミン作動性ニューロンからの発芽を誘導し、ドーパミン、ノルアドレナリンおよびセロト二ンのレベルを増加させ、運動行動を改善することが示されている（Tomacら，1995，前掲）。つい最近、GDNFが、脳ノルアドレナリン作動性ニューロンおよびプルキンエ（ Purkinje）細胞の潜在的な栄養因子であることが報告された。GDNFを異所性発現する繊維芽細胞の移殖は、 6−ヒドロキシドーパミンにより誘導される変性を防ぎ、成体ノルアドレナリン作動性ニューロンの表現型をインビボで促進し（Arenasら，Neuron，15，1465-1 437，1995）、一方、外的に適用されたGDNFは、胚プルキンエ細胞の生存および形態学的分化をインビトロで有効に促進した（Mountら，Proceedings Of The Na tional Academy Of Sciences U.S.A.，92，9092-9096,1995）。末梢神経系では、GDNFは、節状神経節、毛様体神経節および交感神経節中のニューロン、ならびに脊髄後根神経節(DRG)および三叉神経節中の胚感覚ニューロン小集団の生存を促進することが示されている（Truppら，Journal Of Cell Biology，130，137-1 48，1995;Ebendalら，Journal Of Neuroscience Research，40，276-284，1995; Oppenheimら，1995，前掲;Yanら，1995，前掲;Hendersonら，1994，前掲）。また、GDNFは、培養された上頚神経節（SCG）ニューロン中のバソアクティブインテスティナルペプチドおよびプレプロタキキニンA ｍRNAの発現を増強し、それによりSCGニューロンの表現型を与え、束様発芽を誘導すると報告されている（T ruppら，1995，前掲）。 GDNFの発現は、神経系の種々の多数の細胞型および構造体で認められている。中枢神経系では、GDNF mRNA発現が、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により、黒質ドーパミン作動性神経支配の主要標的である発生中および成体のラット線条体において、また、海馬、皮質、視床、中隔、小脳、脊髄および延髄を含む他の領域において広く認められている（Arenasら，前掲，1995;Poulsenら，Neuron，13，1245-1252，1994;Springerら，Experimental N eurology，127，167-170，1994;Stroembergら，Experimental Neurology,124,40 1-412,1993;Schaarら，Experimental Neurology，124，368-371，1993）。また、ヒトでは、GDNF転写産物が、線条体において尾状核中では高レベルで、被殻中では低レベルで検出されている。また、海馬、皮質および脊髄では、検出可能なレベルが見出されるが、小脳では見出されない（Schaarら，Experimental Neuro logy,130，387-393，1994;Springerら，1994，前掲）。末梢では、生後１日のラットのDRGおよびSCG、坐骨神経、および新生児シュワン（Schwann）細胞の初代培養において、GDNF ｍRNAの発現が報告されている（Truppら，1995，前掲;Hoff erら，Neuroscience Letters，182, 107-111，1994;Hendersonら，1994，前掲;S pringerら，1994，前掲）。さらに、GDNF転写産物が、生後の精巣および腎臓、胚のひげパッド、胃および皮膚を含む末梢非ニューロン器官で広く発現されていることが、最近の研究で示されている。胚の筋肉、副腎および肢芽ならびに生後の肺、肝臓および卵巣においては、より低いレベルで発現を検出することができる（Truppら，1995，前掲;Hendersonら，1994 ，前掲）。しかしながら、現在のところ、GDNFの非ニューロン発現の生物学的意義は明らかでない。 GDNFタンパク質産物の調製および特徴づけの詳細な説明は、参考として開示を本明細書に組入れる1994年5月23日付け出願の米国特許出願第08/182,183号およびその親出願(1992年９月17日付け出願のPCT/US92/07888,WO 93/06116および欧州特許出願第92921022.7号，公開第EP 610 254号も参照されたい)に記載されている。追加的なGDNFタンパク質産物は、参考として開示を本明細書に組入れる19 95年９月28日付け出願の係属中の米国特許出願第08/535,681号に記載されている。本発明で用いる「GDNFタンパク質産物」なる語は、生物学的に活性な合成または組換えGDNFタンパク質ならびにそれらの類似体および化学修飾された誘導体を含む。GDNF類似体は、トランケート化GDNFタンパク質などの欠失変異体、ならびにGDNFの挿入および置換変異体を含む。また、ヒトGDNFタンパク質と実質的に相同なGDNFタンパク質も含まれる。GDNF 療法 GDNF療法は、１またはそれ以上の神経細胞型の生存および／または適切な機能を損なう状態により生じた神経損傷の治療において有用である。そのような神経損傷は、多種多様な原因から生じうる。神経損傷は、（１）損傷部位付近の軸索突起および／または神経細胞体の変性を引き起こす物理的損傷、（２）卒中などの場合の、神経系部分への血流の一時的または永久的な停止、（３）癌の治療用の化学療法剤（例えば、シスプラチナム）またはエイズの治療用のジデオキシシチジン（ddC）などの神経毒に対する意図的または偶然の曝露、（４）糖尿病、腎不全などの慢性代謝疾患、または（５）特定の神経集団の変性から生じるパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）などの神経変性疾患により、１以上の神経細胞型に生じうる。いくつかの研究は、GDNF療法が、パーキンソン病における黒質のドーパミン作動性ニューロンの変性などの神経変性状態の治療において特に有用であることを示している。パーキンソン病に対する現在の唯一の治療は、線条体内のドーパミンレベルを増加させることを目的とした姑息的なものである。GDNF療法の予想される影響としては、線条体内のドーパミン作動性神経終末におけるドーパミン作動性神経伝達の増加をもたらすこと（これは、症状の軽減につながるであろう）だけではなく、変性過程の進行を遅らせたり更には停止させ、損傷された黒質線条体経路を修復し、その機能を回復させることも挙げられる。また、GDNFは、ヒトの患者におけるドーパミン作動性神経細胞の他形態の損傷または不適当な機能を治療するのに使用することができる。そのような損傷または機能不全は、精神分裂病および他の形態の精神病で生じることもある。そのような状態に対する現在の唯一の治療は対症的なものであり、ドーパミン受容体またはドーパミン取込み部位に作用する薬物を必要とする。このことは、受容体を保持するこれらのニューロン集団を神経支配するドーパミン作動性ニューロンの不適当な機能が疾患過程に関与している可能性があるという見解と一致している。受容体タンパク質因子に対する結合および応答を媒介する多数の受容体（例えば、インスリン、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子およびその関連体、繊維芽細胞増殖因子、種々のインターロイキン、造血増殖因子および毛様体神経栄養因子の受容体）が特徴づけられ、分子的にクローニングされている（米国特許第5,426,177号）。いくつかの受容体は複数の（関連）増殖因子に結合し、また、他の場合には、同一の因子が複数の（関連）受容体に結合しそれらを活性化しうることを、研究結果は示している（例えば、Lupuら， Science，249，1552-1555，1990;Dionneら，EMBO J，9:2685-2692，1990; Miki ら，Science,251:72-75,1991）。ほとんどの受容体は、タンパク質因子に対する特異的結合を引き起こす細胞外タンパク質またはドメイン、細胞膜に広がる膜貫通ドメイン、および該受容体の細胞外部分に該タンパク質因子が結合した際のシグナル伝達の開始にしばしば関与する細胞内ドメインを有する、と大まかに特徴づけることができる。多数の受容体は単一のポリペプチド鎖よりなるが、他の受容体は、それらのタンパク質因子に高い親和性で結合し結合後の機能的応答が可能となるように２以上の分離したサブユニットを必要とするようである（例えば、Hempsteadら，Science，243:373-375，1989;Hibiら，Cell，63:1149-1157,199 0）。ある与えられた受容体の細胞外および細胞内部分が、他の受容体の対応領域と共通の構造モチーフを共有していることがあり、このことは、種々の受容体の間の進化的および機能的関係を示唆している。これらの関係は全くかけ離れたものとなることが多く、単に、ある一般的なドメイン構造が繰返し使用されることを反映しているのかもしれない。例えば、無関係な因子に結合する種々の異なる受容体は、それらの細胞外部分中の「免疫グロブリン」ドメインを利用し、一方、他の受容体は、それらの因子結合領域中の「サイトカイン受容体」ドメインを利用する（例えば、Akiraら，The FASEB J.，4:2860-2867，1990）。異なる細胞外結合ドメインを有する多数の受容体（したがってこれは、異なる因子に結合する）は、因子の結合に応答して活性化されるチロシン特異的プロテインキナーゼをコードする関連細胞質内ドメインを含有する（例えば、UllrichおよびSchlessin ger，Cell，61:203-212，1990）。因子の結合がシグナル伝達過程を「活性化」するメカニズムは、受容体型チロシンキナーゼの場合においても、十分には理解されていない。未知機能のドメインを細胞内ドメインがコードしているか又は未知機能の第２のタンパク質に結合成分か結合する他の受容体では（例えば、Hibiら，Cell,63:1149-1157，1990）、シグナル伝達の活性化が十分には特徴づけられていない。当該技術分野においては、GDNFのインビボでの作用様式は明確には解明されていない。これは１つには、GDNFの受容体に関する情報がないことによる。線条体に注射された[¹²⁵I]標識GDNFは、黒質中のドーパミン作動性ニューロンにより逆方向に輸送されうることを、２つのグループが別々に見出している（Tomacら，P roceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of A merica．92，8274-8278，1995;Yanら，1995，前掲）。また、脊髄運動ニューロン、DRG感覚ニューロンおよび網膜神経節のB層中のニューロンによる[¹²⁵I]-GDN Fの逆向性輸送も認められた。これらの逆向性輸送現象はすべて、100倍以上の濃度の未標識GDNFにより特異的に抑制することができ、このことは、飽和可能な受容体媒介性輸送過程を示唆している。インビトロでは、組換えGDNFは、非常に低い濃度で、培養ドーパミン作動性ニューロンの生存を強化し、該ニューロンのドーパミン取込みを促進することが示されている。これらのニューロン上で認められたGDNFの半有効濃度（EC₅₀）は、0.2〜1.6pMである（Linら，1993，前掲）。また、GDNFは、分散（dissociated）運動ニューロンの生存を低濃度で支持することが示されている。運動ニューロン上のGDNFのEC₅₀は、5〜10fMの範囲で、ドーパミン作動性ニューロン上のものより一層低いと報告されている（Hendersonら，1994，前掲）。総合すると、これらの観察は、これらの細胞中で発現されるGDNFの受容体が、非常に高い結合親和性を有することを示している。TGF-βファミリーのメンバーと同様、種々の細胞集団上でのGDNFの非常に多様な組織分布および種々の生物学的機能は、種々の型のGDNF受容体または受容体複合体が存在しうることを示唆している。E10雛島交感神経ニューロンに対する[¹²⁵I]-GDNFの飽和定常状態および競合的結合は、これらのニューロンが、ドーパミン作動性および運動ニューロンで観察されるものとは異なるGDNF結合部位を発現することを示している。これらの結合部位上のGDNFの半最大飽和（half maximal saturation）濃度および半最大阻害（half-maximalinhibition）濃度は、1〜5nMの範囲である（Truppら，199 5,前掲）。同様に、P1ラットSCGからの交感神経ニューロンの生存の支持におけるGDNFのEC₅₀は、ナノモルの範囲であると報告されている（Truppら，1995，前掲）。 GDNFがシグナル伝達を活性化してその効果を細胞に及ぼすメカニズムに関する理解をさらに深めるためには、このタンパク質因子に対する結合および応答を媒介する受容体を同定するのが有益であろう。また、GDNFのシグナル伝達をもたらしそれを増強する補助分子を同定しその製造を可能にすることは、GDNF療法にとって有益であろう。さらに、GDNFのタンパク質受容体の同定により、診断用途における（例えば、個体がGDNFタンパク質療法から利益を得るか否かの判定における補助手段としての）有効な適用が可能となるであろう。さらに、GDNFのタンパタ質受容体は、該受容体に結合し所望の生物活性を与える追加的な分子を同定するためのアッセイにおける主要成分となりうるであろう。発明の概要本発明は、図２および４（配列番号２および４）に示すアミノ酸配列およびその生物学的に等価な類似体を有する神経栄養因子受容体タンパク質をコードする核酸配列を提供する。本発明の神経栄養因子受容体タンパク質およびタンパク質産物は、本発明では、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体（GDNFR）タンパク質およびタンパク質産物と称される。この新規GDNFRは、 GDNFに特異的かつ高い親和性で結合する能力、およびGDNFのシグナル伝達効果を媒介または増強する分子複合体の一部として作用する能力により、機能的に特徴づけられる。GDNFRタンパク質産物は、典型的には、実質的に純粋な形態の可溶性受容体タンパク質として提供される。本発明は、１つの態様において、組換え遺伝子工学技術によるGDNFRタンパク質産物の製造を提供する。もう１つの実施態様においては、化学的技術により、あるいは組換え技術と化学的技術との組合せにより、GDNFRタンパク質を合成する。本発明のもう１つの態様においては、GDNFRタンパク質を、グリコシル化または非グリコシル化形態で製造することができる。GDNFRタンパク質の誘導体は、典型的には、水溶性重合体へのGDNFRタンパク質の結合を含む。例えば、水性環境中でのGDNFRタンパク質産物の沈殿を減少させるために、GDNFRタンパク質を１以上のポリエチレングリコール分子に結合させることができる。本発明のさらにもう１つの態様は、GDNFRタンパク質をコードする種々のポリヌクレオチドを含む。真核または原核宿主細胞中でのGDNFRの発現において、これらの核酸配列を使用する。この場合、GDNFに結合し、それによりGDNF活性（例えば、ドーパミン作動性細胞によるドーパミンの取込みを増加させる活性）を媒介しうる複合体を形成する能力により、該発現産物またはその誘導体は特徴づけられる。また、細胞療法または遺伝子治療の用途においても、該ポリヌクレオチドを使用することができる。適当な核酸配列には、図面に具体的に示されている核酸配列ならびに縮重配列、天然に生じる対立遺伝子変異体および修飾配列（本発明に基づくもの）が含まれる。代表的な核酸配列には、図２または４（配列番号２または４）に示すアミノ酸配列を含む神経栄養因子受容体タンパク質をコードする単離された核酸配列であって、該タンパク質が、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）と複合体を形成し、GDNFに対する細胞応答を媒介する能力を有する配列、およびその生物学的に等価な類似体が含まれる。そのような配列には、(a)Met¹〜Ser⁴⁶⁵をコードするヌクレオチドを含む図１（配列番号１）またはMet¹〜Ser⁴⁶⁸をコードするヌクレオチドを含む図３（配列番号３）に示す配列であって、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）と複合体を形成し、それによりGDNFに対する細胞応答を媒介する能力を有する神経栄養因子受容体タンパク質（GDNFR）をコードする配列；（b）（1）（a）の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列であって、（2）GDNFR活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列；および（c）遺伝暗号の縮重がなければ（a）の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列であって、（2）GDNFR活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列が含まれる。また、核酸配列の増幅または発現を引き起こしうる１以上の作動要素に典型的には作動的に結合している該核酸配列などのベクターも開示する。そのようなベクターを含有する宿主細胞も意図される。典型的には、該宿主細胞は、哺乳動物細胞および細菌細胞、例えば、それぞれCOS-7細胞または大腸菌（E．coli）から選ばれる。本発明のさらにもう１つの態様は、増幅および／または発現制御配列に作動的に結合したGDNFRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを含む。GDNFRタンパク質を発現させるために、原核性および真核性の両方の宿主細胞を、そのようなベクターで安定に形質転換またはトランスフェクトすることができる。本発明はさらに、そのような形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を適当な栄養培地中で増殖させ、該細胞により発現されたGDNFRを、所望により、該宿主細胞および／または該栄養培地から単離する、GDNFRタンパク質の組換え製造を含む。本発明はさらに、GDNFRをコードするポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドを含有するベクターの、遺伝子治療または細胞療法における使用を含む。また、宿主細胞を、ヒトへの移殖に対するその適合性に関して選択することができ、この場合、移殖される細胞は、本発明の神経栄養因子受容体を発現し分泌する。また、ヒトへの移殖に適した半透膜中に宿主細胞を封入することかできる。宿主細胞は、エクスビボ（ex vivo）で形質転換またはトランスフェクトすることができる。神経損傷を治療するための代表的な装置は、（a）移殖に適した半透膜、および（b）本明細書中に開示する神経栄養因子受容体を発現し分泌する、該膜内に封入された細胞を含む。該膜は、該神経栄養因子受容体タンパク質を透過しうるか該封入細胞に有害な物質を透過しない物質から選択する。本発明の神経栄養因子受容体の組換え製造のための方法も開示する。代表的な方法は、（a）グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）と複合体を形成し、GDNF に対する細胞応答を媒介する能力を有する本発明の神経栄養因子受容体（例えば、図２および４（配列番号２および４））またはその生物学的に等価な類似体をコードする核酸配列を含有する宿主細胞を培養し、（b）該宿主細胞による該神経栄養因子受容体の発現に適した条件下で該宿主細胞を維持し、（c）所望により、該宿主細胞により発現された該神経栄養因子受容体を単離することを含む。該宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であることが可能である。細菌性発現を伴う場合には、該方法はさらに、神経栄養因子受容体をリフォールディングさせる工程を含むことができる。本発明は、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）と複合体を形成しGDNFに対する細胞応答を媒介しうる図２および４（配列番号２および４）に示すアミノ酸配列を含む単離され精製されたタンパク質、およびその生物学的に等価な類似体を含む。代表的な類似体には、配列番号２（配列番号２）に示すアミノ酸配列Se r¹⁸〜Pro⁴⁴⁶、Asp²⁵〜Leu⁴⁴⁷およびCys²⁹〜Cys⁴⁴²を含むタンパク質、ならびに図４（配列番号４）に示すアミノ酸配列Met¹⁷〜Pro⁴⁴⁹およびCys²⁹〜Cys⁴⁴³を含むタンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明のタンパク質は、グリコシル化されていてもされていなくてもよく、組換え技術または化学合成により製造することができる。本発明はさらに、そのようなアミノ酸配列を含む受容体タンパク質をコードする核酸配列を含む。また、本明細書中には、本発明のタンパク質受容体と医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を開示する。製造、貯蔵、取り扱い、運搬および／または効力を改善するために、種々の他の製剤化物質を使用することができる。本発明のもう１つの態様は、GDNFR遺伝子およびタンパク質の治療用途を含む。例えば、循環性または可溶性GDNFRタンパク質産物を単独でまたはGDNFと組合せて、GDNFの膜貫通シグナル伝達の活性を増強することによる神経系の疾患または損傷の治療に使用することができる。したがって、本発明のタンパク質および医薬組成物は、ドーパミン作動性神経細胞の機能不全、パーキンソン病、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症の治療に使用することができる。あるいは、GDNFに対する感受性の増加により利益が得られる組織の細胞（例えば、筋萎縮性側索硬化症に罹患している患者の運動ニューロン）中に、組換えGDNFR遺伝子を挿入することができる。さらにもう１つの実施態様では、GDNF活性が有害と考えられる場合にGDNF活性を阻止するために、GDNFRを使用することができる。認められるGDNFの効果がGDNFRによるものであることを確認するために、GDNFRを使用することができる。本発明のもう１つの態様では、GDNFRプローブを使用して、正常状態または疾患状態においてGDNFに応答する細胞および組織を同定することができる。あるいは、該プローブを使用して、GDNF関連障害に罹患した患者におけるGDNFR発現の異常を検出することができる。本発明のもう１つの態様では、核酸および抗体プローブを含むGDNFRプローブを使用して、GDNFR関連分子を同定することができる。例えば、本発明は、GDNFR と複合体を形成し、それによりGDNFR機能に関与するそのような分子を提供する。もう１つの例として、本発明は、GDNFRに対して相同であるか又は抗原的に交差反応性である受容体分子であって、GDNFRと同一ではない受容体分子を提供する。本発明ではまた、該受容体に基づく、GDNFに関する結合および機能の両方のアッセイを開発する。例えば、GDNF活性を検出するためのアッセイ系は、細胞を含むことが可能であるが、そのような細胞は、高レベルのGDNFRを発現し、したがって非常に低濃度のGDNFまたはGDNF様分子に対しても非常に感受性のものである。さらにもう１つの実施態様では、可溶性GDNFRを使用して、GDNFまたはGDNF様分子に結合させ又はGDNFまたはGDNF様分子の存在を検出することかできる。さらに、本発明は、GDNFの生理的役割を研究するための実験モデル系を提供する。そのような系には、抗GDNFR抗体またはオリゴヌクレオチドプローブを含むアッセイ、および動物モデル（例えば、高レベルのGDNFRを発現するためGDNFに対して過敏性であるトランスジェニック動物、または内因性GDNFR遺伝子をゲノムから欠失させる胚幹細胞技術を用いて誘導した動物）が含まれる。抗GDNFR抗体は、神経栄養因子受容体タンパク質のペプチド部分に結合することになる。抗体には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。あるいは、既存抗体に対する免疫学的標識をGDNFRタンパク質に結合させて、検出における助けとすることができる。そのような標識には、Flag（IBI/Eastman Kodak）およびmyc配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、金属キレートカラム上での検出および精製のために、ポリヒスチジンなどの他の標識配列が使用されている。本発明の実施について詳細に説明する以下の記載を考慮すれば、本発明の追加的な態様および利点が当業者において明らかとなろう。図面の簡単な説明図１は、ヒトグリア細胞株由来神経栄養因子受容体（GDNFR）をコードする核酸配列（配列番号１）を示す。その完全長GDNFRタンパク質のアミノ酸配列は、核酸540〜1934にコードされている。図２は、完全長ヒトGDNFRタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。図３は、ラットGDNFRをコードする核酸配列（配列番号３）を示す。その完全長GDNFRタンパク質のアミノ酸配列は、核酸302〜1705にコードされている。図４は、完全長ラットGDNFRタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。図５は、種々のクローンにおいて産生されたGDNFR cDNA配列の一部の整列（アラインメント）および比較ならびにヒトGDNFRのコンセンサス配列を示す。図６は、GDNFRを発現するNeuro-2A由来細胞株の同定を示す。図７Aおよび７Bは、GDNFRを発現する細胞に対する[¹²⁵I]GDNF の平衡結合の結果を示す。図８は、GDNFRを発現する細胞中で発現されたGDNFRおよびRetに対する[¹²⁵I]G DNFの化学的架橋の結果を示す。図９は、GDNFRを発現する細胞中のGDNFによるc-Ratの自己リン酸化の誘導の結果を示す。図10は、GDNFおよび可溶性GDNFRによるc-Retの自己リン酸化の誘導の結果を示す。図11は、Ret-Fc融合タンパク質によるc-Retの自己リン酸化の阻止の結果を示す。図12は、運動ニューロン中のGDNFによるc-Retの自己リン酸化の誘導の結果を示す。図13は、GDNFRおよびRetに媒介されるGDNFシグナル伝達のモデルを示す。発明の詳細な説明グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）は、中枢神経系および末梢神経系の両方からの種々の細胞型に対して広いスペクトルの生物活性を示す強力な神経栄養因子である。それは、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）スーパーファミリーに対して疎遠な関係（20％未満の相同性）を有するグリコシル化されジスルフィド結合で連結された二量体である。GDNFがドーパミン作動性ニューロンおよび他のニューロン集団の生存を強化しうることは、パーキンソン病および他形態の神経損傷または機能不全の治療のためのその潜在的治療能力を示すものである。 GDNFの分布および生物活性に関する広範な研究とは対照的に、細胞に対するGD NFの結合を媒介し、それにより細胞内シグナル伝達および細胞応答を媒介する受容体の同定に関する報告はない。本発明は、生後ラットからの培養網膜細胞の表面上で最初に見出された高い親和性の受容体の知見に基づく。これらの受容体は、ドーパミン作動性および運動ニューロン、中脳ドーパミン作動性ニューロン(L inら，1993，前掲；Sauerら，1995前掲；KearnsおよびGash，1995，前掲；Beck ら，1995，前掲；Tomacら，1995a,前掲)、顔面および脊髄運動ニューロン（Lin ら，1995，前掲；Oppenheimら，1995，前掲；Yamら，1995，前掲；Zurnら，1994 ，前掲；Hendersonら，1994，前掲）において見出される受容体に匹敵する推定G DNF結合親和性を有する。この受容体分子は、GDNFの受容体系の最初の公知成分であるため、GDNF受容体（GDNFR）と呼ばれている。本発明はまた、GDNFR タンパク質の発現クローニングおよび特徴づけの最初の記載を提供するものである。該組換え受容体を発現するように修飾された細胞は、GDNFに高い親和性で結合する。培養細胞上でのドーパミン取込みアッセイおよび[¹²⁵I]-GDNF結合を用いて、G DNFに対する高い親和性の受容体をラット光受容体細胞の表面上で検出した。実施例においてさらに詳しく説明するとおり、光受容体細胞の研究は、GDNF受容体に関する発現クローニングによるcDNAクローンの単離につながった。GDNFRの核酸配列は、31個のシステイン残基および３個の潜在的なN−グリコシル化部位を有する468アミノ酸の部分をコードしている。つぎに、ラットcDNAクローン由来の核酸配列を使用して、ラット受容体とアミノ酸レベルでほぼ同一であると判明しているそのヒトホモログを単離した。ヒトGDNFR cDNA配列は、すべてのシステイン残基の位置および潜在的なN−グリコシル化部位（ラット受容体に対して保存されている）を有する465アミノ酸の部分をコードしている。一次配列のこの高度な保存性は、GDNFの生物学的機能におけるこの受容体に関する重要な役割を示した。前記のとおり、多数の受容体は、３個の主要ドメイン、すなわち、タンパク質因子に対する特異的結合を引き起こす細胞外または細胞表面ドメイン、細胞膜に広がる膜貫通ドメイン、およびタンパク質因子が細胞外ドメインに結合する場合にシグナル伝達を開始するのに典型的には関与している細胞内または細胞質ドメインを有する。しかしながら、後記にさらに詳しく説明するとおり、GDNFRは、配列または構造的特徴において公知のいずれのタンパク質（例えば、受容体キナーゼまたはサイトカイン受容体中に見出されるコンセンサス配列）とも無関係であり、細胞質ドメインを欠き、膜貫通ドメインに特徴的なC− 末端荷電残基を欠き、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）結合により細胞膜にアンカー（固定）されていることが確認された。細胞内触媒ドメインが存在しないことから、膜貫通シグナル伝達の直接的な役割は除外されたが、高い結合親和性および強い進化配列保存性はさらに、この受容体がGDNFの機能に重要であることを示唆した。 GDNFRは細胞質ドメインを欠くが、この受容体は、膜貫通シグナル伝達において何らかの役割を果たす１以上の補助分子と共に作用するに違いないと考えられた。ついで、GDNFの遺伝子を欠くトランスジェニックマウスは死亡し腎臓を有していないことが見出された。c-ret原癌遺伝子の遺伝子を欠くトランスジェニックマウス（Schuchardtら，Nature，367，380-383，1994）は、同様の表現型を有することが判明した。c-ret原癌遺伝子は、受容体型チロシンキナーゼ（RTK）（その正常な機能は未だ確認されていない）をコードしている。すべてのRTKは、類似したトポロジーを有する。すなわち、それらは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および触媒タンパク質チロシンキナーゼドメインを含有する細胞質セグメントを有する。リガンドの結合は、細胞内シグナル伝達を媒介する細胞におけるキナーゼドメインの活性化および特異的基質のリン酸化につながる。本発明は、GDNFRの可溶性形態を使用して、c-ret原癌遺伝子に対するGDNFの結合を媒介させ、それによりGDNFに対する細胞応答を惹起し、その細胞型特異性を修飾することができるという知見を含む。「受容体α」成分と呼ばれる同様の種は、リガンド結合特異性を付与するが、独力でシグナルを伝達することができない。そのような成分は、毛様体神経栄養因子（CNTF）およびインターロイキン６（IL-6）受容体系で見出される。GDNFR と同様に、また、IL-6受容体とは対照的に、CNTF受容体は、そのリガンドに高い親和性で結合し、疎水性C末端を有し、細胞質ドメインを有しておらず、G PI結合により細胞膜にアンカーされている（Davisら，1991）。シグナル伝達を媒介するために、CNTFはまずCNTF受容休に結合し、gp130に対する結合能を有する複合体を生成する。ついで、この不活性な複合体はLIF受容体に結合して、活性なシグナル伝達複合体を形成する（Davisら，Science,260，1805-1807,1993）。本発明の場合と同様、シグナル伝達が生じるためには、CNTF受容体（リガンド特異的結合成分）が存在していなければならないが、それが膜に結合している必要はない（Economidesら，Science，270，1351-1353，1995）。後記でさらに説明するとおり、GDNFRタンパク質は、細胞表面にアンカーされていたり、あるいは可溶性形態で提供されることが可能である。どちらの場合でも、GDNFRタンパク質は、GDNFとリガンド複合体を形成し、該リガンド複合体は細胞表面受容体に結合して、細胞内シグナル伝達を引き起こす。したがって、可溶性形態のGDNFRを使用して、GDNFRの作用を増強し及び／又はその細胞型特異性を修飾することができる。 GDNFRは、公知のいずれの受容体とも関連していない。 GenBankおよびWashington University-Merkデータベースにおいては、関連配列に関して見掛け上のマッチは存在しない。Washington University-Merk ESTデータベース中に見出される発現しているタグ配列（EST）は、GDNFRのコード領域の小さな部分（該クローンの5'末端から生成する配列の５２１ヌクレオチドのうちの約340ヌクレオチド）に対して75％の相同性を示す。このクローン（GenBank受託#H12981）をオリゴ-dTプライムドヒト乳児脳ライブラリーから単離し、Lafmid BAベクター（Hillier,Lら,未公開データ）中に一定方向に（directionally）クローニングした。#H12981クローンの3'末端は既に配列決定されているが、それは、GDNFRのいずれの部分に対しても相同性を示さない。この#H12981クローンと GDNFRとの間の短い領域にわたる相同性の出現（この相同性は後に消失した）は、#H12981クローンが、真正なcDNA転写産物ではなく、スプライシングされていない転写産物またはクローニング人工産物に相当することを示唆している。したがって、本発明は、GDNFRを発現する標的細胞を選択する方法を提供することにより、GDNFRタンパク質のクローニングを可能にする。本発明はさらに、G DNFRをコードする配列を富化する手段を提供することにより、GDNFRタンパク質の精製、およびGDNFRをコードするDNAの直接クローニングを提供する。GDNFR核酸およびアミノ酸配列のこの記載は、これらの実体および種々のGDNFR類似体を再生産するのに必要な情報を提供する。この情報を用いて、当業者に公知の任意の手段により、GDNFRタンパク質産物を単離し製造することができる。GDNFRタンパク質の組換え的または合成的製造のための種々の手段を開示する。本発明で用いる「GDNFRタンパク質産物」なる語は、生物学的に活性な精製された天然、合成または組換えGDNFR、GDNFR類似体（すなわち、挿入、置換および欠失変異を含むGDNFRホモログおよび変異体）および化学修飾されたそれらの誘導体を含む。GDNFR類似体は、図２および４（配列番号２および４）に記載のGDN FRアミノ酸配列と実質的に相同である。本発明で用いる「生物学的に活性」なる語は、GDNFRタンパク質産物が、GDNF に対して高い親和性の結合を示し、GDNFにより誘導されるシグナル伝達を媒介または増強することを意味する。GDNFRポリペプチド類似体が、図２および４に記載のGDNFRタンパク質産物と実質的に同じ生物活性を有するか否かを判定することは、本開示を用いれば当業者の能力の範囲内に十分に含まれるものである。本発明で用いる「実質的に相同」なアミノ酸配列なる語は、図２および４に記載のGDNFRアミノ酸配列に対して一定の「類似性」または相同性の程度を共有するアミノ酸配列であって、これらのGDNFRアミノ酸配列に関して記載されているのと同様の生物活性または機能を有するアミノ酸配列を意味する。該分子の三次元の立体配置または活性に影響を及ぼすことなく、アミノ酸配列中で比較的多数の個々の又は一群のアミノ酸残基を変化させたり、位置的に交換したり（例えば、逆順にしたり順序を戻したり）、または完全に欠失させたりすることが可能であると当業者には理解されるであろう。本開示に従えば、そのような修飾は当業者の能力の範囲内に十分に含まれるものである。そのような修飾配列の同定および入手手段は、後記でさらに詳しく説明する。実質的に相同なタンパク質（ペプチド）の相同性の程度は、70％以上であること（すなわち、70％〜100％の相同性の範囲）が好ましい。したがって、好ましい「実質的に相同」なGDNFRアミノ酸配列は、配列番号２および４に記載のアミノ酸配列に対して70％以上の相同性の程度を有することが可能である。相同性の程度は、より好ましくは85％以上、より一層好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上である。本明細書中に記載する相同性の割合（％）は、１つのタンパク質配列中に存在するアミノ酸残基のうち、第２のタンパク質配列中の同一または類似のアミノ酸残基とアラインメントするアミノ酸残基の割合（％）として計算する。例えば、 GDNFRの相同性の場合には、配列相同性の程度は、比較分子のアミノ酸残基を参照GDNFRポリペプチドのアミノ酸残基（例えば、配列番号２および４に示すアミノ酸残基または該図面に示す核酸配列によりコードされるアミノ酸残基）に対して最適にアラインメントさせて、それらの２つの配列間の符合（マッチ）を最大にすることにより決定することができる。そのようなアライメントは、適当な同類残基置換を含むことが可能であり、必要に応じてギャップを導入することにより比較配列のトランケート化および内部欠失または挿入を無視する、と当業者には理解されるであろう。例えば、Dayhoff,Atlas of Protein Sequence and Stru cture Vol.5（p.124，National Biochemical Research Foundation，Washington ，D.C．(1972);この開示を、参考として本明細書に組入れることとする）を参照されたい。この文献においては、アラインメントを助けるために、100アミノ酸長中に平均３個または４個のギャップを導入することが可能とされている。そのようにしてアラインメントを行なったら、比較ポリペプチド中のアラインメント残基数を該比較ポリペプチド中の全残基数で割ることにより、割合（％）を求める。さらに、本発明のGDNFR配列を使用して、少なくとも部分的にGDNFR活性を有する融合タンパク質またはキメラタンパク質の一部を形成させることができると意図される。そのようなタンパク質のアラインメントおよび相同性は、GDNFR活性に関連している、融合タンパク質またはキメラタンパク質の一部を使用することにより決定されるであろう。そのような実質的に相同なGDNFRタンパク質の起源には、ヒトGDNFRタンパク質に対して高い相同性の程度を有すると予想される他の哺乳動物のGDNFRタンパク質が含まれる。例えば、本明細書中に開示するラットおよびヒトGDNFRタンパク質間の相同性の程度は、約93％である。配列番号２および４のGDNFRアミノ酸配列に対する抗体との交差反応性に基づき、そのような哺乳動物から、実質的に相同なGDNFRタンパク質を単離することができる。あるいは、配列番号２および４のGDNFRをコードする遺伝子または遺伝子セグメントに対するハイブリダイゼーションにより単離した核酸配列、または配列番号２および４に例示する核酸配列の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列により、それらを発現させることができる。適当なハイブリダイゼーション条件は、後記にさらに詳しく説明する。意図する目的のためにこのポリペプチドを使用するのを損なう望ましくない物質を実質的に含まないGDNFRタンパク質産物を得るために、典型的には、該新規G DNFRタンパク質産物を単離し精製する。例えば、好ましいGDNFRタンパク質産物は、他のヒト（例えば、非GDNFR）タンパク質性物質または病原体の存在を実質的に含まない。好ましくは、該GDNFRタンパク質産物は、GDNFRタンパク質産物の製造で用いる製造技術上の理由から存在しうる他のタンパク質が約80％除かれている。該GDNFRタンパク質産物は、より好ましくは、他のタンパク質が約90％、特に好ましくは約95％、最も好ましくは約98％以上除かれている。さらに、本発明は、均一なGDNFRタンパク質を製造するためのポリヌクレオチド配列を提供するという独特の利点を与えるものである。付加、欠失および置換変異体を含む種々のGDNFR変異体が意図される。例えば、GDNFRタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から１以上のアミノ酸残基を除去することにより、一連の欠失変異体を製造することができる。von Heijne（von Heijne，Nucleic Acids Researh，14，4683- 4690，1986）に記載されているシグナルペプチド切断の予想の規則を適用すると、GDNF結合に関与しうるGDNFRタンパク質の最初のアミノ酸残基は、図２（配列番号２）中のヒトGDNFRの完全長アミノ酸配列に示すSer¹⁸となる。アミノ酸残基 Met¹〜Ser¹⁸は、シグナルペプチド配列の一部であると考えられ該受容体タンパク質の成熟形態中には含まれないアミノ末端疎水性領域中に存在する。同様に、 GDNF結合に必要と考えられるGDNFRタンパク質の最後のアミノ酸残基は、Ser⁴⁴⁶ である。アミノ酸残基Leu⁴⁴⁷〜Ser⁴⁶⁵は、細胞表面に対する該タンパク質のGPI 結合に関与するカルボキシ末端の疎水性領域中に存在する。したがって、GDNFR タンパク質に対するGDNF結合に影響を及ぼすことなく、Met¹〜Ser¹⁸および／またはLeu⁴⁴⁷〜Ser⁴⁶⁵（図２（配列番号２）に示すもの）からの残基のいずれかまたは全部を該タンパク質から除去し、それによりAla¹⁹〜Pro⁴⁴⁶の「コア」配列を残すようにすることができると意図される。さらに、公知分析技術を用いれば、N末端トランケート化は、Gly24までの及びそれを含む１以上のアミノ酸残基の除去を含むことが可能であると意図される。したがって、Asp²⁵〜Pro⁴⁴ ⁶ またはLeu⁴⁴⁷のアミノ酸配列がコア分子の基礎を形成するように、GDNFRトランケート化類似体は、いずれか一方または両方の末端からの１以上のアミノ酸残基の欠失を含むことも可能である。追加的なGDNFR類似体は、図４（配列番号４）のGDNFRアミノ酸配列中に示すアミノ酸残基Ser¹⁸〜Pro⁴⁴⁹を含むこと、すなわち、アミノ酸残基Met¹〜Ser¹⁸および／またはPro⁴⁴⁹〜Ser⁴⁶⁸として示す疎水性領域を含むいずれか一方または両方の末端からの１以上のアミノ酸残基を欠失させることが意図される。さらに、完全長配列中の最初および最後のシステイン残基に到達するまで、アミノ末端およびカルボキシ末端のいずれか一方または両方から１以上のアミノ酸残基を除去することができると意図される。GDNFRタンパク質の適切な分子内結合のためには、システイン残基を保有させるのが有利である。図２（配列番号２）中のヒトGDNFRの完全長アミノ酸配列中に示すとおり、Cys²⁹として現れる最初のシステイン残基を除去することなく、Met¹〜Asp²⁸からのいずれかまたは全部のアミノ酸残基をアミノ末端から除去することができる。同様に、Cys⁴⁴²として現れる最後のシステイン残基を除去することなく、Gly⁴⁴³〜Ser⁴⁶⁵からのいずれかまたは全部のアミノ酸残基をカルボキシ末端から除去することができる。図４（配列番号４）のGD NFRアミノ酸配列中に示すアミノ酸残基Cys²⁹〜Cys⁴⁴³を使用して、すなわち、アミノ酸残基Met¹〜Asp²⁸および／またはSer⁴⁴⁴〜Ser⁴⁶⁸として示す末端領域の全部または一部を欠失させて、他のGDNFR類似体を製造することができる。同じ理由により、GDNFRタンパク質の機能に影響を及ぼすことなく、これらの同定されたアミノ酸残基を、欠失させるのではなく置換することができると意図される、と当業者には理解されるであろう。あるいは、GDNFRタンパク質の機能に影響を及ぼすことなく、これらの同定されたアミノ酸残基を残基内挿入または末端付加により修飾することができる。さらにもう１つの実施態様では、１以上の欠失、置換または付加の組合せを適用することができる。本発明のGDNFRタンパク質または核酸は、治療方法または治療用医薬の製造法に使用することができる。そのような治療には、GDNFRタンパク質の過剰産生により特徴づけられる状態において、本発明のGDNFR（特に、可溶性形態のもの）を使用して、そのような過剰なGDNFタンパク質と複合体を形成させ、それにより該GDNFタンパク質を不活性化させることが含まれる。可溶性受容体を製造することにより（例えば、GDNF結合ドメインの使用）、あるいはそのようなGDNFRを含有する細胞集団を製造し、治療を要する個体にそのような細胞を移殖することにより、この治療を行なうことができる。また、本発明のGDNFRタンパク質産物は、欠損GDNF受容体を有する個体の治療に使用することができる。例えば、可溶性受容体を製造し、運搬することにより、あるいはそのような非欠損GDNFRを含有する細胞集団を製造し、そのような細胞を個体に移殖することにより、欠損GDNFRを有する個体を治療することができる。あるいは、個体が不適当な数のGDNF受容体を有していることもあり、個体が利用可能なGDNF受容体の数を増加させるために、そのような受容体を含有する細胞を移殖することができる。そのような組成物を、GDNFの送達と共に用いることができる。また、c-ret受容体型チロシンキナーゼの活性化に応答する状態の治療において、GDNFRタンパク質産物を使用することができると意図される。本発明のさらにもう１つの態様において、該新規組成物にとって更に有利な点は、GDNFタンパク質の医薬組成物を安定化するためのGDNFRの使用にある。本発明のもう１つの態様では、GDNFRを使用して、アンタゴニスト活性に関して化合物をスクリーニングする。本発明の他の態様および利点は、当業者に明らかであろう。例えば、追加的な用途には、新規アッセイ系、トランスジェニック動物、および抗体の製造が含まれる。研究モデル本発明は、本発明のGDNFR分子を発現する細胞または細胞系における惹起された生理的応答を測定することにより、ペプチドまたは非ペプチド化合物に対する曝露から生じるGDNF活性またはGDNF活性と同様の活性を検出することができるアッセイ系を提供する。生理的応答は、GDNFの任意の生物学的効果、例えば、少数ながら列挙すると、ドーパミンの取込み、神経突起の伸長、細胞生存または成長の増強、および或る核酸配列（例えば、プロモーター／エンハンサー要素および構造遺伝子）の転写活性化、GDNFに関連したプロセシング、翻訳またはリン酸化、およびGDNFにより直接的または間接的に誘導される過程に応答する二次過程の誘導など（これらの限定されるものではない）を含むことが可能である。例えば、過剰のGDNF活性の影響を研究するのに使用することができるモデル系を作製することができる。そのような系では、GDNFに対する細胞の応答を増加させることができる。これは、そのように修飾されていない細胞に関して、該モデル系の細胞上の増加した数のGDNFRを操作することにより行なうことができる。また、増加した数のGDNFRを、GDNFRを正常に発現する細胞上で選択的に与える系を開発することができる。GDNFRの発現を保証するためには、適当なプロモーター配列の制御下にGDNFR遺伝子を配置することができる。構成的および／または組織特異的プロモーター（CNSニューロン特異的エノラーゼ、神経フィラメントおよびチロシンヒドロキシラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない）、誘導プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、ヒト免疫不全ウイルスロングメーミナルリピート中のUV活性化プロモーター（Valeriら，1988,Nature 333:78-81）、またはCMVプロモーター（後記pCMX中に含まれているもの）または発生的に調節されるプロモーターの制御下に、GDNFR 遺伝子を配置するのが望ましいであろう。細胞性GDNFRの数を増加させることにより、内因性GDNFに対する応答を増加させることができる。該モデル系がGDNFをほとんど又は全く含有していない場合には、該系にGDNFを加えることができる。また、過剰なGDNF活性の影響を評価するために、モデル系に追加的なGDNFを加えるのが望ましいであろう。GDNF（または分泌されたGDNF）を過剰発現させることは、GDNFRを既に発現している細胞に対するGDNFレベルの上昇の影響を研究するための１つの方法であろう。GDNFR 療法もう１つの態様においては、ある症状が、GDNF応答性の増加から利益を得るであろう。したがって、GDNF療法に応答する症状に罹患している患者においては、 GDNFRの数または結合親和性を増加させるのが有益であろう。これは、例えば、組織特異的または誘導プロモーターにより制御されるGDNFR遺伝子を使用することにより、あるいは組換えGDNFR遺伝子を保持する複製欠損ウイルスで局在性感染を引き起こすことにより、適当な細胞中での組換えGDNFRの選択的発現を達成する遺伝子治療により行なうことが可能であろう。 GDNFRまたはGDNF／GDNFR組合せ送達から利益が得られる症状には、筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン障害、糖尿病に関連した神経学的障害、パーキンソン病、アルツハイマー病およびハンチントン舞踏病が含まれる（これらに限定されるものではない）と考えられる。GDNFRまたはGDNF／GDNFR組合せ運搬を用いる追加的な適応症には前記のものの他にさらに、緑内障または他の疾患および網膜神経節細胞変性を伴う状態；感覚ニューロンの損傷、発作または変性により生じる知覚神経異常症；光受容体変性が生じて失明を引き起こす、遺伝性網膜変性および加齢、疾患または損傷に関連した網膜症などの病理学的状態；および種々の原因による難聴を予防および／または治療するための毛細胞、聴覚ニューロンなどの内耳感覚細胞の損傷または変性の治療が含まれる。トランスジェニック動物さらにもう１つの態様では、組換えGDNFR遺伝子を使用して、内因性遺伝子を不活性化または「ノックアウト」し（例えば、相同組換えにより）、それにより GDNFR欠損細胞、組織または動物を作製することができる。例えば、GDNFRを不活性化する挿入突然変異を含有するように、組換えGDNFR遺伝子を操作することができる。適当なプロモーターの制御下にあるそのような構築物を、トランスフェクション、トランスダクション、注入などの通常の任意の方法により、胚幹細胞などの細胞中に導入することができる。ついで、該構築物を含有する細胞を、例えばG418耐性により選択することができる。ついで、無傷GDNFR遺伝子を欠く細胞を、例えばサザンブロット法またはノーザンブロット法または発現のアッセイにより同定する。ついで、無傷GDNFR遺伝子を欠く細胞を、初期胚細胞と融合させて、GDNFRが欠損したトランスジェニック動物を作製する。そのような動物を、内因性GDNFを発現しない動物と比較することにより、それらの２つの表現型のいずれかが完全に符合しているか否かが明らかとなり、追加的なGDNF様因子または受容体の存在が示唆されるであろう。そのような動物を使用して、通常はGDNFに依存している特異的ニューロン集団または他のインビボ過程を特定することができる。したがって、該動物がGDNFRを発現しておらず、したがってGDN Fに応答できなければ、これらの集団または過程に変化が生じると子想される。診断用途本発明では、正常状態または疾患状態においてGDNFに応答する細胞および組織を同定するために、GDNFRプローブを使用することができる。本発明は、GDNFに応答する細胞を、そのような細胞中でGDNFR発現を検出することにより同定する方法を提供する。GDNFR発現は、GDNFR mRNAの転写またはGDNFR タンパク質の産生により確認することができる。GDNFR発現は、GDNFR核酸またはタンパク質を同定するプローブを使用して、あるいはGDNFRタンパク質に人為的に付加した「タグ」配列を検出することにより検出することができる。 GDNFR発現を検出するために使用しうるプローブの１つの変形は、GDNFRをコードするRNAを当該技術分野で公知の任意の方法（例えば、in situハイブリダイゼーション、ノーザンプロット分析またはPCR関連技術が挙げられるが、これらに限定されるものではない）により検出するために使用しうる核酸プローブである。本発明の核酸産物を、検出マーカー（例えば、放射能標識、およびビオチンなどの非同位体標識）で標識し、ハイブリダイゼーション法において使用して、染色体地図中のヒトGDNFR遺伝子の位置および／またはいずれかの関連遺伝子ファミリーの位置を決定することができる。また、それらを、ヒトGDNFR遺伝子障害をDNAレベルで同定するために使用し、近傍遺伝子およびそれらの障害を同定するための遺伝子マーカーとして使用することかできる。本発明では、そのような標識物質を含有するキットが意図される。検出マーカー物質または標識（例えば、放射性同位体、蛍光または化学発光性化合物、酵素、または当業者に入手可能な他の標識）との結合により、本発明のポリペプチド産物を「標識」し、固体組織および流体サンプル（例えば、血液または尿）中のGDNFの検出および定量に有用な試薬を得ることができる。また、正常状態または疾患状態でGDNFに応答する細胞および組織の検出において、そのような産物を使用することができる。試験サンプル中のGDNFの存在を検出し、GDNF様分子の存在に関してスクリーニングするためのもう１つの可能なアッセイは、固相上に固定化したGDNFRペプチドに該試験サンプルを接触させ、それにより、GDNFRに結合したGDNFを得ることを含む。所望により、GDNFRに結合したGDNFを検出試薬（例えば、GDNFに特異的な標識抗体）と接触させ、それにより、検出可能な産物を生成させることができる。そのようなアッセイは、試験サンプルを分析するためのアッセイ装置の形態として開発することができる。基本形態では、そのような装置は、GDNFRを含有するか又はGDNFRでコーティングされた固相を含む。GDNFの存在に関して試験サンプルを分析するための方法は、GDNFRタンパク質を含むアッセイ試薬に該サンプルを接触させることを含んでなり、該GDNFRタンパク質が、該試験サンプル中に存在するGDNFと反応し、GDNFの存在を示す検出可能な反応産物を産生することを特徴とする。また、本発明で提供するアッセイ試薬は、キットまたは製造品の一部として含有させることができる。本発明で提供する核酸またはアミノ酸配列の１以上の調製物と包装材とを含んでなる製造品が意図される。そのような包装材は、生物学的サンプル中のGDNF、GDNFRまたはGDNFR欠損体を検出するのに該調製物が有用であることを示すラベルを含むであろう。そのようなものとして、該キットは、所望により、そのような試験を実施するための物質(例えば、タンパク質分析、DNA またはRNAハイブリダイゼーション分析またはPCR分析を血液、尿または組織サンプル上で実施するのに有用な試薬)を含むことができる。抗GDNFR抗体本発明では、抗GDNFR抗体を産生させるための免疫原として、GDNFRタンパク質またはその断片もしくは誘導体を使用することができる。抗GDNFR免疫応答を得る可能性をさらに向上させるために、GDNFRのアミノ酸配列を分析して、免疫原性の増加と関連があると考えられる分子部分を同定することができる。例えば、アミノ酸配列をコンピューター分析に付して、コンピユーターが作製したGDNFRの親水性、表面確率、柔軟性、抗原指数、両親媒性ヘリックス、両親媒性シートおよび二次構造のプロットを示す表面エピトープを同定することができる。あるいは、種々の種からのGDNFRのアミノ酸配列を比較し、比較的に非相同な領域を同定することが可能であろう。これらの非相同領域は、種々の種にわたり免疫原性である可能性が高いであろう。また、GDNFR内の連続アミノ酸配列または二次コンホメーションの一部のみと重複するポリペプチド断片であって、哺乳動物GDNFRの１つの活性（例えば、免疫学的活性）を有し他の活性（例えば、GDNFタンパク質結合活性）を有さないことが可能なポリペプチド断片も包含される。したがって、抗体の産生は、抗ペプチド抗体の産生を含む。GDNFR配列を使用して、以下の代表的なペプチドを合成した。ペプチドSJP-6、７および８は、ラットおよびヒトGDNFRにおいて同一である。ペプチドSJP-9および10は、該ラット配列に由来し、それぞれ１個のアミノ酸がヒトとは異なっている。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、これらのペプチドまたは他のGDNFR部分を使用して当該技術分野で公知の方法により製造することができる。 GDNFRに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続継代細胞株による抗体分子の産生につながる任意の公知技術により製造することができる。例えば、モノクローナル抗体を得るためにKohlerおよびMilsteinにより最初に開発されたハイブリドーマ技術（Nature，256:495-497，1975）、およびトリオーマ（trioma）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら，Immunology Today,4:72,1983 )、EBVハイブリドーマ技術（Coleら，″Monoclonal Antibodies and Cancer The rapy,″Alan R． Liss，Inc．pp．77-96，1985）などを用いることができる。また、ヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト−マウス(または他の種)モノクローナル抗体を、治療用途のために製造することができ、当該技術分野で公知の多数の技術のいずれかにより製造することができる(例えば、Tengら，Proc.Na tl.Acid.Sci．U.S.A.，80:7308-7312，1983; Kozborら，Immunology Today，4:7 2-79，1983; Olssonら，Meth．Enzymol，92:3-16，1982)。ヒト定常領域を有するマウス抗原結合ドメインを含有するキメラ抗体分子を製造することができる（ Morrisonら，Proc．Natl．Acid．Sci．U.S.A.，81:6851，1984; Takedaら，Natu re，31:452，1985）。ポリクローナル抗体を製造するためには、当該技術分野で公知の種々の方法を用いることができる。抗体の製造には、GDNFRタンパク質またはその断片または誘導体を注射することにより、ウサギ、ラットなど(これらに限定されるものではない)の種々の宿主動物を免疫することができる。選択した宿主種に応じて、種々のアジュバントを使用して免疫応答を増強させることができる。有用なアジュバントには、フロイント（完全または不完全）アジュバント、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびヒトアジュバント、例えばBCG（Baci1le Calmette-Guerin）およびコリネバタテリウム・バルブム（Corynebacterium parvum）が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、公知技術により、GDNFRエピトープに対する抗体の分子クローンを製造することができる。組換えDNA法（例えば、Maniatisら，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Habor Laborotory，Cold Spring Harbor，N.Y .，1982）を用いて、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築することができる。抗体分子は、公知技術、例えば免疫吸収または免疫アフィニティークロマトグラフィー、クロマトグラフィー法（例えば、高速液体クロマトグラフィー）またはそれらの組合わせなどにより精製することができる。本発明は、抗体分子、およびそのような抗体分子の断片を提供する。該分子のイディオタイプを含有する抗体断片は、公知技術により作製することができる。例えば、そのような断片には、抗体分子のペプシン消化により得ることができるF(ab')2断片、F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することにより得ることができるFab'断片、およびパパインおよび還元剤で該抗体分子を処理することにより得ることができるFab断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような選択的結合分子自体を、GDNFRタンパク質の代わりに使用することができ、医薬組成物として製剤化することができる。GDNFR タンパク質の組換え発現本発明は、GDNFRタンパク質をコードする種々のポリヌクレオチドを提供する。該発現産物またはその誘導体の特徴づけは、特異的かつ高い親和性でGDNFと結合し、シグナル伝達分子とのさらなる相互作用を引き起こし、それにより、ドーパミン作動性細胞によるドーパミン取込みの増加などのGDNF活性を産生または増強する能力により行なうことができる。また、細胞療法または遺伝子治療の用途において、該ポリヌクレオチドを使用することができる。本発明では、新規GDNFRタンパク質、およびそのような受容体の全部または一部をコードするDNA配列を提供する。一次構造コンホメーションの少なくとも一部と組換えヒトGDNFRの生物学的特性の１以上とを有するポリペプチド産物の、原核または真核宿主細胞中での発現を確保するのに有用な配列を、本発明の新規核酸配列は含む。所望のコード領域が、本ポリペプチドを製造するのに有用なものとなるように、該核酸を精製し単離することができる。あるいは、後記でより詳しく説明するとおり、該核酸配列を診断目的に使用することができる。本発明の代表的なDNA配列は、図２および４に示し配列番号２および４に記載するGDNFRアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。さらに、本発明で開示するDNA配列は、特に、（a）図１および３に示すDNA配列（および相補鎖）のいずれか、（b）下位部分（a）におけるDNA配列またはその断片とハイブリダイズ（後記のcDNAライブラリースクリーニングの項で開示するハイブリダイゼーション条件下、または同等の条件下またはより厳密な条件下で）するDNA配列、および（c）遺伝暗号の縮重がなければ、下位部分（a）におけるDNA配列とハイブリダイズすると考えられるDNA配列を含む。特に、部分（b ）および（c）には、ヒトGDNFRの対立遺伝子変異体型をコードする及び／又は他の哺乳動物種からのGDNFRをコードするゲノムDNA配列、ならびにGDNFR、GDNFR断片およびGDNFR類似体をコードする製造されたDNA配列であって、細菌宿主中でのメッセンジャーRNAの転写および翻訳を促進するコドンを含むことが可能なDNA配列が含まれる。そのような製造された配列は、当該技術分野で公知の方法および本明細書中に記載の方法に従い容易に構築することができる。本明細書中に記載する説明または他の公知方法に従い行なう組換え発現技術を用いて、これらのポリヌクレオチドを製造し、種々のGDNFRタンパク質を発現させることができる。例えば、当業者であれば、GDNFRタンパク質をコードする核酸配列を適当なベクター中に挿入することにより、多量の所望のヌタレオチド配列を容易に製造することができる。ついで該配列を使用して、検出プローブまたは増幅プライマーを作製することができる。あるいは、GDNFRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクター中に挿入することができる。該発現ベクターを適当な宿主中に導入することにより、所望のGDNFRタンパク質を多量に製造することができる。本明細書中でさらに説明するとおり、核酸配列の増幅および／またはGDNFRタンパク質の製造に利用可能な多数の宿主／ベクター系が存在する。これらには、プラスミド、ウイルスおよび挿入ベクターならびに原核および真核宿主が含まれるが、それらに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の配列を産生または発現するように、異種DNAを増殖または発現しうる宿主／ベクター系を適合させることができる。そのような組換え技術により、より高い純度を有する本発明のGDNFRタンパク質を、商業的な量で容易に製造することができる。さらに、本開示を考慮して、新規核酸配列は、図面中に具体的に記載されているGDNFRタンパク質をコードする縮重核酸配列、GDNFRタンパク質の変異体をコードする配列、およびこれらの核酸配列の相補体とハイブリダイズする(好ましくは、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする)核酸配列を含む、と当業者には理解されるであろう（例えば、Maniatisら，Molecular Cloning(A Laboratory Manual);Col d Spring Harbor Laboraotory，p．387-389，1982）。代表的な厳密なハイブリダイゼーション条件は、4×SSC中、62〜67℃でハイブリダイズさせた後、0.1×S SC中、62〜67℃で約１時間洗浄するというものである。あるいは、代表的な厳密なハイブリダイゼーション条件は、45〜55％ホルムアミド、4×SSC中、40〜 45℃でのハイブリダイゼーションである。GDNFRタンパク質に関する相補鎖と緩和な（relaxed）ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするDNA配列および本発明のGDNFRタンパク質をコードするDNA配列も、本発明に含まれる。そのような緩和なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下は、45〜55℃ で4×SSC、あるいは40〜45℃で30〜40％ホルムアミドでのハイブリダイゼーションである。 GDNFRをコードするポリヌクレオチドの製造本発明の開示に基づけば、完全長GDNFRポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を、化学合成、cDNAまたはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニングおよび／またはcDNAのPCR増幅を含む(これらに限定されるものではない)種々の方法で容易に製造または入手することができる。これらの方法および核酸配列の製造に有用な他の方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Sambrookら（Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Sp ring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989）、Ausbelら編 (Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols Press,1994)、およびBergerおよびKimmel(Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques，vol．152，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1987)に記載されている。GDNFRをコードする好ましい核酸配列は、哺乳動物配列である。また、Engelsら（Angew.Chem.Intl.Ed.,28:716-734,1989）に記載されている方法などの当該技術分野で公知の方法を用いて、GDNFRタンパク質をコードする核酸配列の化学合成を行なうことができる。これらの方法には、とりわけ、核酸配列合成のホスホトリエステル、ホスホルアミジットおよびH-ホスホナート法が含まれる。そのような化学合成のための好ましい方法は、標準的なホスホルアミジット化学を用いる重合体担持（polymer-supported）合成である。典型的には、所望のポリペプチドをコードするDNAは、数百塩基対（bp）長または数百ヌクレオチド長となろう。これらの方法を用いて、約100ヌクレオチドより長い核酸配列を数個の断片として合成することができる。ついでこれらの断片を互いに連結して、完全長GDNFRポリペプチドまたはその一部の発現のための配列を得ることができる。あるいは、適当なcDNAライブラリー（すなわち、該タンパク質を発現すると考えられる１以上の組織源からのライブラリー）またはゲノムライブラリー（全ゲノムDNAから調製したライブラリー）をスクリーニングすることにより、適当な核酸配列を得ることができる。該cDNAライブラリーの起源は、典型的には、合理的な量でGDNFRを発現すると考えられる組織である。典型的には、該ゲノムライブラリーの起源は、GDNFRをコードする遺伝子を保持すると考えられる哺乳動物種からの任意の組織である。該ライブラリー中に存在するGDNF R cDNAまたは遺伝子と選択的にハイブリダイズする１以上の核酸プローブ（例えば、本発明で開示している配列に基づくオリゴヌクレオチド、cDNAまたはゲノム DNA断片）を使用して、GDNFR cDNA／遺伝子の存在に関して該ライブラリーをスクリーニングすることができる。そのようなライブラリースクリーニングに典型的に使用するプローブは、該ライブラリーの調製の起源種と同一または類似の種からのGDNFR核酸配列の小さな領域をコードする。あるいは、本明細書中に記載のとおり、該プローブは縮重していることが可能である。ライブラリーのスクリーニングは、典型的には、該オリゴヌクレオチドプローブまたはcDNAを該ライブラリー中のクローンに対してアニーリングさせることにより行なう。この場合、非特異的結合を妨げるが、該プローブまたはプライマーに対して有意なレベルの相同性を有するクローンの結合（ハイブリダイゼーション）を許容するストリンジェンシーの条件下で、該アニーリングを行なう。典型的なハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシー条件は、１つには、cDNAまたはオリゴヌクレオチドプローブのサイズ（すなわち、長さを表すヌクレオチド数）、および該プローブが縮重しているか否かに依存する。また、ハイブリダイゼーション溶液の設計においては、該クローンの入手可能性（例えば、cDNAまたはゲノムライブラリーがスクリーニングされているか否か；それがcDNAライブラリーである場合には、関心のある cDNAが高レベルで存在する可能性）も考慮する。 DNA断片（例えば、cDNA）をプローブとして使用する場合には、典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、Ausubelら編（前掲）に記載の条件を含む。ハイブリダイゼーション後、プローブのサイズ、クローンに対するプローブの予想される相同性、スクリーニングされているライブラリーの型、スクリーニングされているクローンの数などのいくつかの要因に応じて、該ライブラリーを含有するブロットを適当なストリンジェンシーで洗浄する。ストリンジェント洗浄溶液（これは、通常、イオン強度が低く、比較的高温で使用される）は以下の通りである。１つのそのようなストリンジェント緩衝液は、0. 015M NaCl、0.005Mクエン酸Naおよび0.1％SDS（55〜65℃）である。もう１つのそのようなストリンジェント緩衝液は、１mM Na₂EDTA、40mM NaHPO₄（pH7.2）および１％SDS（約40〜50℃）である。１つの他のストリンジェント洗浄は、0.2× SSCおよび0.1％SDS(約50〜65℃)である。また、オリゴヌクレオチドプローブを使用してcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするストリンジェント洗浄条件の代表的なプロトコールがある。例えば、第１のプロトコールは、プローブの長さに応じて約35〜62℃で、0.05 ％ピロリン酸ナトリウムを含む６×SSCを使用する。例えば、14塩基のプローブは35〜40℃で、17塩基のプローブは45〜50℃で、20塩基のプローブは52〜57℃で、23塩基のプローブは57〜63℃で洗浄する。バックグラウンドの非特異的結合が高いと考えられる場合には、温度を2〜3℃上昇させることができる。第２のプロトコールは、洗浄に塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）を使用する。１つのそのようなストリンジェント洗浄溶液は、3M TMAC、50mM Tr is-HCl（pH8.0）および0.2％SDSである。 GDNFRタンパク質をコードする核酸配列を得るためのもう１つの適当な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。この方法では、GDNFRを発現する組織からポリ(A)+RNAまたは全RNAを抽出する。ついで、逆転写酵素を使用して(すなわち、RT-PCR)、RNAからcDNAを調製する。ついで、GDNFR cDNA（オリゴヌクレオチド）の２個の分離した領域と典型的には相補的である２個のプライマーを、Taq ポリメラーゼなどのポリメラーゼと共に、該cDNAに加える。該ポリメラーゼは、それらの２個のプライマーの間のcDNA領域を増幅する。所望のGDNFRタンパク質をコードする核酸配列を製造するのに選択した方法が、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブの使用を要する場合（例えば、 PCR、cDNAまたはゲノムライブラリースクリーニング）には、ライブラリースクリーニングまたはPCR増幅の間に生じる非特異的結合の量を最小限に抑えるように、プローブまたはプライマーとして選択するオリゴヌクレオチド配列は適度に長く十分に明白（unambiguous）であるべきである。該プローブまたはプライマーの実際の配列は、通常、別の生物からの同一または類似の遺伝子からの保存された又は高度に相同な配列または領域（例えば、本発明に含まれるラット核酸配列）に基づく。所望により、該プローブまたはプライマーは、完全または部分的に縮重していることが可能である。すなわち、該プローブまたはプライマーが含有しうるプローブ／プライマーの混合物のすべてが、同じアミノ酸配列をコードしているが、それを行なうために異なるコドンを使用していることが可能である。デジェネレート（縮重）プローブを調製するための別法は、種によって異なるコドン位のいくつか又はすべてにイノシンを配置することである。該オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、前記のDNA化学合成法により調製することができる。また、GDNFRをコードするこれらの核酸配列に基づく GDNFRタンパク質、およびそれらの突然変異体または変異体の配列も、本発明の範囲内に含まれると意図される。突然変異体または変異体の配列には、野生型配列と比較した場合に１以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を含有し、野生型アミノ酸配列と比較した場合のアミノ酸配列変異の発現を引き起こす配列が含まれる。場合によっては、自然対立遺伝子変異の存在のために、天然に生じるGDNFRアミノ酸突然変異体または変異体が存在するかもしれない。そのような天然に生じる突然変異体または変異体に基づくGDNFRタンパク質も、本発明の範囲内に含まれる。また、合成突然変異配列の調製は当該技術分野でよく知られており、例えば、Wellsら（Gene，34:315，1985）およびS ambrookら（前掲）に記載されている。場合によっては、天然に生じるGDNFRの核酸および／またはアミノ酸変異体を製造するのが望ましいかもしれない。核酸変異体（野生型または天然に生じるGD NFRとは異なる１以上のヌクレオチドを設計する場合）は、部位特異的突然変異誘発により、あるいは所望の点突然変異を有するプライマーを使用するPCR増幅により製造することができる（突然変異誘発技術の説明に関しては、Sambrookら，前掲およびAusubelら，前掲を参照されたい）。また、Engelsら（前掲）に記載されている化学合成により、そのような変異体を製造することができる。当業者に公知の他の方法も用いることができる。好ましい核酸変異体は、GDNFRを組換え的に製造するのに使用することになる宿主細胞中でのコドン優先性（codon preference）を与えるヌクレオチド置換を含有する核酸変異体である。他の好ましい変異体は、野生型に対する同類アミノ酸変化（例えば、異なるアミノ酸で置換したとしても、天然に生じるアミノ酸側鎖の荷電または極性が実質的に改変されない場合）をコードする変異体、および／またはGDNFR上に新規グリコシル化および／またはリン酸化部位を生成するように設計されているか又はGDNFR上に存在するグリコシル化および／またはリン酸化部位を欠失するように設計されている変異体である。ベクター所望のGDNFRタンパク質をコードするcDNAまたはゲノムDNAを、さらなるクローニング（該DNAの増幅）または発現のためにベクター中に挿入する。適当なベクターが商業的に入手可能であるか、あるいは該ベクターを特別に構築することができる。可能なベクターには、コスミド、プラスミドまたは修飾ウイルスが含まれるが（これらに限定されるものではない）、該ベクター系は、選択した宿主細胞に適合するものでなければならない。そのようなベクターには、バクテリオファージ（例えば、ラムダ誘導体）またはプラスミド（例えば、pBR322、pUCまた CA)）が含まれるが、これらに限定されるものではない。該組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは他の公知技術により宿主細胞中に導入することができる。例えば、適当な宿主細胞に対する形質転換、導入または感染に使用するクローニングベクター中に、GDNFRをコードする核酸配列を挿入して、該核酸配列の多数のコピーを生成させる。これは、相補的な付看末端を有するクローニングベクター中にDNA断片を連結することにより行なうことができる。該DNAを断片化するのに使用する相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合には、該DNA分子の末端を酵素的に修飾することができる。また、得られる核酸配列がベクター中に挿入されるのを容易にするために、ポリメラーゼ連鎖反応で使用するオリゴヌクレオチドプライマー中に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を取込ませるのが有利となるかもしれない。あるいは、DNA末端上にヌクレオチド配列（リンカー）を連結することにより、所望の任意の部位を作ることができる。これらの連結リンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする化学的に合成された特異的オリゴヌクレオチドを含むことが可能である。もう１つの方法では、切断されたベクターとGDNFR をコードする核酸配列とを、ホモポリマーテーリングにより修飾することができる。特定の実施態様では、単離されたGDNFR遺伝子、cDNAまたは合成DNA配列を取込む組換えDNA分子による宿主細胞の形質転換により、多コピーの該遺伝子の産生が可能になる。したがって、形質転換体を増殖させ、該形質転換体から該組換えDNA分子を単離し、必要に応じて、その単離された組換えDNAから該挿入遺伝子を回収することにより、GDNFRをコードする核酸配列を多量に得ることができる。適当なベクターの選択または構築は、１）それをDNAの増幅に使用するのか、D NAの発現に使用するのか、２）該ベクター中に挿入しようとするDNAのサイズ、および３）該ベクターで形質転換しようとする宿主細胞（例えば、哺乳動物、昆虫、酵母、真菌、植物または細菌の細胞）に左右される。各ベクターは、その機能（DNAの増幅またはDNAの発現）および意図する宿主細胞に対するその適合性に応じて、種々の成分を含有する。DNAの発現の場合には、ベクター成分に、シグナル配列、複製起点、１以上の選択またはマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、転写終結配列などを含めることが可能であるが、これらに限定されるものではない。これらの成分は、公知方法により天然源から入手したり合成することができる。本発明のベクターは、GDNF Rをコードする核酸配列の増幅もしくは発現を指令し、制御しまたは引き起こしうる１以上の増幅、発現制御、調節または同様の作動要素に作動的に結合した、関心のあるGDNFRタンパク質をコードする核酸配列を含む。 GDNFR核酸配列挿入断片を含有する発現ベクターは、以下の３つの一般的アプローチにより同定することができる：（a）DNA-DNAハイブリダイゼーション、（ b）「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在、および（c）挿入された配列の発現。最初のアプローチでは、発現ベクター中に挿入された外来核酸配列の存在を、GDNFRをコードする挿入された核酸配列に対して相同な配列を含むプローブを使用するDNA-DNAハイブリダイゼーションにより検出することができる。第２のアプローチでは、該ベクター中への外来核酸配列の挿入により生じる或る「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換の表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成など）の存在または不存在に基づき、組換えベクター／宿主系を同定し、選択することができる。例えば、GDNF Rをコードする核酸配列を該ベクターのマーカー遺伝子配列中に挿入する場合には、GDNFR挿入断片を含有する組換え体はマーカー遺伝子機能の不存在により同定することができる。第３のアプローチでは、組換え核酸配列により発現された外来タンパク質産物を検出することにより、組換え発現ベクターを同定することができる。そのようなアッセイは、発現されたGDNFRタンパク質産物の物理的または機能的特性に基づくもの、例えば、GDNFに対する、あるいはGDNFRを直接認識する抗体に対するGDNFRタンパク質の結合によるものであってもよい。シグナル配列シグナル配列は、該ベクターの一成分であることが可能である。あるいは、それは、該ベクター中に挿入するGDNFR DNAの一部であることが可能である。天然G DNFR DNAは、成熟GDNFRタンパク質を生成するタンパク質の翻訳後プロセシング中に切断されるタンパク質のアミノ末端においてシグナル配列をコードしている。本発明の範囲内には、天然シグナル配列を有するGDNFRポリヌクレオチド、および天然シグナル配列が欠失し異種シグナル配列で置換されているGDNFRポリヌクレオチドが含まれる。選択する異種シグナル配列は、宿主細胞により認識されプロセシングされる、すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断されるものでなければならない。天然GDNFRシグナル配列を認識したりプロセシングしたりしない原核宿主細胞の場合には、該シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは耐熱性エンテロトキシンIIリーダーの群から選ばれる原核性シグナル配列で置換する。酵母分泌のためには、天然GDNFRシグナル配列を、酵母インベルターゼ、α因子または酸ホスファターゼリーダーで置換することができる。哺乳動物の細胞発現においては、該天然シグナル配列で十分であるが、他の哺乳動物のシグナル配列が適していることもある。複製起点発現およびクローニングベクターは、一般には、選択した１以上の宿主細胞中での該ベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。クローニングベクターにおいては、この配列は、典型的には、宿主染色体DNAと独立して該ベクターが複製されるのを可能にする配列であり、複製起点または自律複製配列を含む。そのような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスに関して良く知られている。プラスミドpBR322からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、種々の起点（例えば、SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPV）が、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターには必ずしも必要でない（例えば、SV40は、初期プロモーターを含有しているという理由のみで使用することが多い）。選択遺伝子発現およびクローニングベクターは、選択遺伝子を含有することが可能である。この遺伝子は、選択培地中で増殖させた場合の形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要な「マーカー」タンパク質をコードしている。該ベクターで形質転換されなかった宿主細胞は、選択遺伝子を含有しないため、培地中で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、（a）抗生物質または他の毒素(例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン)に対する耐性を付与する、（b）栄養要求性の欠損を補う、または（c）培地から利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしている。他の選択遺伝子を使用して、発現される遺伝子を増幅することができる。増幅は、増殖に決定的に重要なタンパク質の産生において要求度がより高い遺伝子が、組換え細胞の連続世代の染色体内でタンデムに反復される（reiterated）過程である。哺乳動物用の適当な選択マーカーには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）およびチミジンキナーゼが含まれる。哺乳動物細胞形質転換体を、該ベクター中に存在するマーカーのおかげで生存するように、該形質転換体のみを独自に適応させる選択圧下に置く。培地中の選択剤の濃度が連続的に変化することにより選択遺伝子とGDNFRをコードするDNAとの両方の増幅につながる条件下で、該形質転換細胞を培養することにより、選択圧をかける。その結果、量的に増加したGDNFRが、その増幅されたDNAから合成される。例えば、まず最初に、DHFR選択遺伝子で形質転換した細胞を同定する。これは、DHFRの競合的アゴニストであるメトトレキセートを含有する培地中で該形質転換体のすべてを培養することにより行なう。野生型DHFRを使用する場合に適当な宿主細胞は、DHFR活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣細胞系である（例えば、UrlaubおよびChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，77(7): 4216-4220， 1980を参照されたい）。ついで、該形質転換細胞を、上昇させたレベルのメトトレキセートにさらす。これにより、多コピーのDHFR遺伝子と、発現ベクター中に存在する多コピーの他のDNA(例えば、GDNFRタンパク質をコードするDNA)との合成が同時に生じる。プロモーター本発明の発現およびクローニングベクターは、典型的には、GDNFRタンパク質をコードする核酸配列に作動的に結合した、宿主生物に認識されるプロモーターを含有する。プロモーターは、ある特定の核酸配列（例えば、GDNFRをコードする核酸配列）の転写および翻訳を制御する、構造遺伝子（一般には、約100〜100 0bp以内）の出発コドンの上流（5'側）に位置する非翻訳配列である。プロモーターは、通常、誘導的プロモーターおよび構成的プロモーターの２つのクラスのうちの１つに分類される。誘導的プロモーターは、培養条件中の何らかの変化( 例えば、栄養素の存在もしくは不存在、または温度変化)に応答して、その制御下、増加したレベルの転写をDNAから開始する。潜在的な種々の宿主細胞により認識される多数のプロモーターが、よく知られている。これらのプロモーターを、GDNFRをコードするDNAに作動的に結合させる。これは、制限酵素消化により該プロモーターを起源DNAから取り出し、所望のプロモーター配列を該ベクター中に挿入することにより行なう。GDNFR DNAの増幅および／または発現を指令するためには、天然GDNFR プロモーター配列を使用することができる。しかしながら、異種プロモーターが、天然プロモーターと比べて強力な転写および高い収量を許容する場合、および異種プロモーターが、使用するために選択した宿主細胞系に適合する場合には、そのような異種プロモーターが好ましい。原核性宿主と共に使用するのに適したプロモーターには、βーラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（tr p）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、tacプロモーター）が含まれる。他の公知の細菌プロモーターも好適である。それらのヌクレオチド配列は公開されている。したがって、必要ないずれかの制限部位を付与するために、必要に応じて、リンカーまたはアダプターを使用して、該ヌクレオチド配列を所望のDNA配列に連結することが、当業者において可能である。酵母宿主と共に使用するための適当なプロモーター配列も、当該技術分野で良く知られている。酵母エンハンサーを酵母プロモーターと共に使用するのが有利である。哺乳動物宿主細胞と共に使用するための適当なプロモーターは良く知られており、それらには、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはシミアンウイルス40（SV40）などのウイルスのゲノムから得られるプロモーターが含まれる。他の適当な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。CHO細胞中でのGDNFRタンパク質の製造における可能な用途のためのプロモーターとしては、SRaが挙げられる（Takebeら，Mol．Cell．Biol.，8(1): 466-472,1 988を参照されたい）。適当な発現ベクターはpDSRa2である。適当なGDNFR cDNA を含有するpDSRa2プラスミド構築物は、参考として開示を本明細書に組入れる19 90年３月29日付け出願の共有同時係属米国特許出願第501,904号（1990年５月18 日付け出願の欧州特許出願第90305433号，公開第EP398753号およびWO 90/14363 (1990)も参照されたい）に記載の方法に実質的に従い調製することができる。 GDNFR発現の制御において関心が持たれる追加的なプロモーターには、SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon，Nature，290:304-310，1981)；CM Vプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの3'ロングターミナルリピート中に含有されているプロモーター（Yama motoら，Cell，22:787-797，1980）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ Wagnerら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，78:144-1445，1981）；メタロチオネイン遺伝子（Brinsterら，Nature，296:39-42,1982）の調節配列；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核性発現ベクター(Villa-Kamaroffら，Proc．Natl ．Acad．Sci．U.S.A.，75:3727-3731,1978);またはtacプロモーター(DeBoerら,P roc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，80:21-25，1983)が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域も関心が持たれる：膵小胞体細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftら，Cell，38:639-646，1984；Orn itzら，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．50:399-409，1986;MacDonald ，Hepatology，7:425-515，1987）；膵β細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahan，Nature，315:115-122,1985）；リンパ系細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら，Cell，38:647-658，1984；Adamesら， Nature，318:533-538，1985; Alexanderら，Mol． Cell．Biol.，7:1436-1444，1987）；精巣細胞、乳細胞、リンパ系細胞およびマスト細胞中で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Laderら，Cell，45:485-495 ，1986）；肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Prinkertら，Genes and Devel.，1:268-276,1987）；肝臓中で活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら，Mol．Cell．Biol.，5:1639-1648,1985; Hammerら，Science，2 35:53-58，1987）；肝臓中で活性なα１アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kels eyら，GenesおよびDevel，1:161-171，1987）；骨髄細胞中で活性なβグロビン遺伝子制御領域（Mogramら，Nature，315:338-340，1985;Kolliasら，Cell，46: 89-94，1986）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら，Cell，48:703-712，1987）；骨格筋中で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Sani，Nature，314:283-286,1985）；および視床下部中で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Maso nら，Science,234:1372-1378,1986）。エンハンサー要素本発明のGDNFRタンパク質をコードするDNA配列の、高等真核生物による転写を増加させるために、エンハンサー配列を挿入することができる。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる通常は10〜 300bp長のシス作用性のDNA要素である。エンハンサーは、配向および位置にはそれほど左右されない。それは、転写単位の5'側および3'側に見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーを使用することになろう。SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが、真核性プロモーターの活性化のための代表的なエンハンサー要素である。エンハンサーは、 GDNFRDNAの5'側または3'側の位置でベクター中にスプライシングされうるが、それは典型的には、プロモーターの5'側の部位に位置する。転写終結また、真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）中で使用する発現ベクターは、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列を含有するであろう。そのような配列は、一般に、真核DNAまたはcDNAの5'非翻訳領域、時には3'非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、GDNFRをコードする・RNAの非翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。 GDNFRをコードする所望の配列と共に前記で挙げた成分の１以上を含有する適当なベクターの構築は、標準的な連結技術により行なう。単離されたプラスミドまたはDNA断片を、切断し、操作し、所望の順序で再連結して、必要なプラスミドを得る。正しい配列が構築されたことを確認するために、該連結混合物を使用して大腸菌（E．coli）を形質転換することができ、意図したとおりに得られた形質転換体を公知技術（例えば、前記のアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）により選択することができる。ついで該形質転換体からのプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、および／または配列決定して、所望の構築物の存在を確認する。また、GDNFRをコードするDNAを哺乳動物細胞中で一過性に発現するベクターを使用することもできる。一般には、一過性発現では、宿主細胞中で効率的に複製する能力を有する発現ベクターを使用して、宿主細胞が多コピーの発現ベクターを蓄積し、そして該発現ベクターにコードされる高レベルの所望のタンパク質を合成するようにする。適当な発現ベクターと宿主細胞とを含む一過性発現系は、クローン化DNAにコードされるタンパク質の簡便な陽性同定と、所望の生物学的または生理的特性に関するそのようなタンパク質の迅速なスクリーニングとを可能にする。したがって、一過性発現系は、該タンパク質の変異体の同定において特に有用である。宿主細胞の選択および形質転換本発明はまた、組換えGDNFRタンパク質の発現に使用する核酸配列で形質転換された宿主細胞（例えば、細菌、哺乳動物、昆虫、酵母または植物細胞）を提供する。形質転換された宿主細胞を、該核酸配列の発現を許容する適当な条件下で培養する。適当な宿主細胞の選択と、形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物の製造および精製のための方法とは、当該技術分野で良く知られている。例えば、GethingおよびSambrook，Nature，293:620-625 (1981)またはKaufman ら，Mol．Cell．Biol.，5(7): 1750-1759(1985)またはHowleyら，米国特許第 4,419,446号を参照されたい。追加的な代表的な材料および方法は、本明細書中に記載されている。形質転換された宿主細胞を適当な培地中で培養し、ついで、発現されたGDNFRタンパク質を、所望により、当該技術分野で公知の適当な手段により、培地から（または細胞内で発現させた場合には、該細胞から）回収し、単離し、精製する。種々の宿主細胞が、翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えば、グリコシル化、切断）の特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングが保証されるように、適当な細胞系または宿主系を選択することができる。例えば、細菌系中での発現により、非グリコシル化コアタンパク質産物を得ることができる。酵母中での発現により、グリコシル化産物を得ることができる。哺乳動物細胞中での発現により、異種GDNFR タンパク質の「天然」グリコシル化を保証することができる。さらに、タンパク質分解切断などのプロセシング反応が生じる度合が、ベクター／宿主発現系によって異なることがある。本明細書中に開示するベクターのクローニングまたは発現のための適当な宿主細胞としては、原核細胞、酵母細胞または高等真核細胞が挙げられる。GDNFRタンパク質の発現には、糸状菌、酵母などの真核微生物が適当な宿主となることがある。下等真核宿主微生物のなかでは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）または一般的なパン酵母が最も一般的に使用されるが、多数の他の属、種および株が良く知られており、一般に入手可能である。また、グリコシル化GDNFRタンパク質の発現に使用する宿主細胞は、多細胞生物に由来する。そのような宿主は、複雑なプロセシングを行ないグリコシル化活性を示す能力を有する。原則として、任意の高等真核細胞培養の使用が、そのような培養が脊椎動物細胞を含むか無脊椎動物細胞（植物細胞および昆虫細胞を含む）を含むかにかかわらず、可能であろう。培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は、よく知られている方法である。有用な哺乳動物宿主細胞系には、例えば、SV40（COS7）で形質転換されたサル腎CV1系、ヒト胎児腎系(293または懸濁培養中での増殖のためにサブクローニングされた293細胞)、乳児ハムスター腎細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の適当な哺乳動物細胞系には、HeLa、マウスL-929細胞、Swiss 、Balb- cもしくはNIHマウス由来の3T3系、BHKまたはHaKハムスター細胞系が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、適当な宿主細胞には、原核細胞が含まれる。原核宿主細胞には、細菌細胞、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌（E．coli）、バシラス（Bacilli）、例えばバシラス．サチリス（B．subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）種、例えばシュードモナス・エルジノーサ（P．aeruginosa）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）またはセラチア・マルセッセンス（Serratia marcescans）が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、宿主細胞としては、大腸菌（E．coli）の種々の株（例えば、HB101、DH5a、DH10およびMC1061）が、バイオテクノロジーの分野において良く知られている。また、ストレプトマイセス（Streptomyces）種などの種々の株を使用することもできる。GDNFRタンパク質を製造するための現在好ましい宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌（Escherichia．coli））および哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、COS細胞など）である。前記の発現またはクローニングベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、好ましくは形質転換し、通常の栄養培地中で培養する。プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、あるいは所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適宜、培地を修飾することができる。当業者に良く知られており、用いる宿主細胞に応じて適宜選択される標準的な技術を用いて、トランスフェクションおよび形質転換を行なう。例えば、細胞壁のない哺乳動物細胞の場合には、リン酸カルシウム沈殿法を使用することができる。また、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよび他の公知技術を用いることもできる。宿主細胞の培養本発明のGDNFRタンパク質を製造するのに使用する形質転換細胞を、適当な培地中で培養する。必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えば、HEPES ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ケンタマイシン）、微量元素（マイクロモルの範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物と定義される）およびグルコースまたは他のエネルギー源で、培地を補足することができる。また、当業者には理解されるとおり、他の補足剤を適当な濃度で加えることも可能である。選択した宿主細胞と共に用いる温度、pHなどの適当な培養条件は、当業者に良く知られている。 GDNFRタンパク質が産生したら、それを、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティーおよびサイジング(sizing)カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差（differential solubility）などの標準的な方法により、あるいはタンパク質の精製のための他の任意の標準的な技術により単離し、精製することができる。特に、固定支持体に結合させたGDNFまたは抗GDNFR抗体を含むアフィニティーカラムに対する結合により、GDNFRタンパク質を単離することができる。相同組換えさらに、相同組換えにより、あるいは、GDNFRをコードするDNAを既に含有する細胞中に導入された制御要素を使用する組換え製造法により、GDNFRタンパク質を製造することができると考えられる。例えば、相同組換え法を用いて、通常は転写的にサイレント（silent）なGDNFR遺伝子または過少発現（under expressed ）遺伝子を含有する細胞を修飾することができる。相同組換えは、転写的に活性な遺伝子中で突然変異を誘導または修正するために遺伝子をターゲッティングするために元来開発された技術である (Kucherlapati，Prog．in Nucl．Acid Res．and Mol．Biol.，36:301，1989)。その基本的な技術は、哺乳動物ゲノムの特定の領域中に特定の突然変異を導入するため(Tomasら，Cell，44:419-428，1986; TomasおよびCapecchi，Cell，51:50 3-512，1987; Doetschmanら，Proc．Natl．Acad．Sci.,85:8583-8587，1988)、または欠損遺伝子内の特定の突然変異を修正するため（Doetschmanら，Nature， 330:576-578，1987）の方法として開発された。代表的な相同組換え技術は、米国特許第5,272,071号（EP 91 90 3051，EP公開第505 500号；PCT/US90/07642，国際公開第WO 91/09955号）（その開示を参考として本明細書に組入れることとする）に記載されている。相同組換えにより、ゲノム中に挿入するDNA配列を、関心のある遺伝子の特定の領域に導くことができ、これは、それをターゲッティングDNAに結合させることにより行なうことができる。該ターゲッティングDNAは、ゲノムDNAの領域に相補的（相同）なDNAである。ゲノムの特定の領域に相補的なターゲッティングDNA の小片を、DNA複製過程中に親鎖と接触させる。細胞中に挿入されているDNAの一般的な特性は、共有されている相同領域にわたり、他の内因性DNA片とハイブリダイズし、それと組換えを起こすことである。この相補鎖が、突然変異または異なるDNA配列を含有するオリゴヌクレオチドに結合している場合には、組換えの結果、それもまた、新たに合成された鎖中に取込まれる。プルーフリーディング機能の結果、新たなDNA配列が鋳型として機能することが可能である。このようにして、導入されたDNAがゲノム中に取込まれる。本発明で提供するGDNFRの核酸配列、プレプロ配列または発現制御配列などの或る特定の遺伝子の配列が既知であれば、例えば、関心のある領域の境界となる特定の認識部位での該天然DNAの適当な制限酵素処理により、該遺伝子の選択された領域に相補的なDNA断片を合成または入手することができる。この断片は、細胞中への挿入の際のターゲッティング配列として働き、該ゲノム内のその相同領域とハイブリダイズすることになる。このハイブリダイゼーションがDNA複製中に生じる場合は、このDNA断片と、それに結合している追加的な任意の配列とが、岡崎フラグメントとして作用し、新たに合成される娘鎖DNA中に返し縫い（b ackstitched）されることになる。ターゲッティングDNAのこれらの断片に結合しているのは、 GDNFRタンパク質の発現と相互作用しうるDNA領域である。例えば、プロモーター／エンハンサー要素、サプレッサー、または外因性転写モジュレーション要素を、所望のGDNFRタンパク質をコードするDNAの転写に影響を及ぼすのに十分な接近性と配向で、意図される宿主細胞のゲノム中に挿入する。該制御要素は、GDNFR をコードしないが、その代わりに、宿主細胞ゲノム中に存在するDNAの一部を制御する。したがって、GDNFRタンパク質の発現は、GDNFR遺伝子自体をコードする DNAのトランスフェクションによってではなく、GDNFRタンパク質転写のための認識可能なシグナルを内因性遺伝子配列に与えるDNA調節セグメントと結合したターゲッティングDNA（これは、関心のある内因性遺伝子に相同な領域を含有する）の使用により行なうことができる。A ．GDNFR変異体前記のとおり、本発明で用いる「GDNFR類似体」なる語は、天然に生じるGDNFR ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、図２および４（配列番号２および４）に示すアミノ酸配列）内の残基と比べて、アミノ酸が欠失している（「欠失変異体」）、挿入されている（「付加変異体」）または置換されている（「置換変異体」）ポリペプチドを含む。そのような変異体は、該ポリペプチドをコードするDNA中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のポリペプチドのインビトロ化学合成により製造する。当業者においては、最終的な分子がGDNFRの活性を有する限り、成熟ヒトGDNFRなどのアミノ酸配列に欠失、挿入および置換の多数の組合せを施すことができると理解されるであろう。 GDNFRアミノ酸配列のこの記載に基づけば、図面に示しているものとは１以上の残基の種類または位置の点で異なる一次コンホメーションを有するポリペプチドの組換え（例えば微生物）発現での使用に適した種々の核酸配列を容易に設計し製造することが、当業者において可能である。図２および４に示す核酸配列にコードされる１以上の選択されたアミノ酸残基の置換、挿入または欠失のための突然変異誘発法は、当業者によく知られている(例えば、米国特許第4,518,584号（その開示を、参考として本明細書に組入れることとする))。置換変異体の構築においては、突然変異部位の位置、および突然変異の性質という２つの主要な変数がある。GDNFR置換変異体を設計する場合には、突然変異部位および突然変異の性質の選択は、修飾するGDNFRの特性に左右されるであろう。突然変異の部位は、例えば、（１）まず同類アミノ酸修飾体で置換し、ついで、得られた結果に応じて、よりラジカルな選択物で置換する、（２）標的アミノ酸残基を欠失させる、あるいは（３）その位置する部位の隣にアミノ酸残基を挿入することにより、個別的または連続的に修飾することができる。１〜30個の連続したアミノ酸の同類変化が好ましい。また、Ｎ末端およびＣ末端が欠失しているGDNFRタンパク質変異体は、タンパク質分解酵素により得ることができる。 GDNFRの欠失変異体の場合、欠失は、一般には約１〜30個の連続した残基、通常は約１〜10個の連続した残基、典型的には約１〜５個の連続した残基に及ぶ。Ｎ末端、Ｃ末端および内部の配列内欠失が意図される。GDNFRの活性を修飾するために、非ヒトGDNFRに対して低い相同性を有する分子の領域内に欠失を導入してもよい。非ヒトGDNFRに対して実質的に相同な領域内で欠失させると、GDNFRの生物活性がより有意に修飾される可能性が高くなるであろう。連続的な欠失の数は、影響を受けるドメイン（例えば、システイン架橋）内のGDNFRタンパク質産物の三次構造を維持するよう選択する。欠失変異体の非限定的な具体例には、Ｎ末端またはＣ末端アミノ酸残基を欠くトランケート化GDNFRタンパク質産物が含まれる。例えば、細胞質膜に対するGDNFR受容体のグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーに関与するペプチド領域の除去により、可溶性受容体を製造することができる。 GDNFRの付加変異体の場合、アミノ酸配列の付加は、典型的には、１残基から1 00以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のＮ末端および／またはＣ末端の融合または末端付加、ならびに内部または中間部への単一または複数のアミノ酸残基の付加を含む。また、本発明のポリペプチドは、開始メチオニンアミノ酸残基（所望のポリペプチドの最初のアミノ酸残基に対して−１位）を含むことが可能である。内部の付加は、一般には約１〜10個の連続した残基、より典型的には約１〜５個の残基、通常は約１〜３個のアミノ酸残基に及ぶ。Ｎ末端付加変異体には、例えば、組換え宿主細胞から成熟GDNFRが分泌されるのを促進し、それにより収穫または生物学的利用能を促進するための異種Ｎ末端シグナル配列をGDNFRのＮ末端に含有するGDNFRが挙げられる。そのようなシグナル配列は、一般には、意図される宿主細胞種から得ることになるため、それと同種となる。また、付加には、他の神経栄養因子の配列に由来するアミノ酸配列が含まれていてもよい。例えば、連結配列を使用するか使用しないで、GDNFとGDNF Rとの融合タンパク質を製造し、それにより単一の分子治療物質を得ることが意図される。 GDNFRの置換変異体では、GDNFRのアミノ酸配列のアミノ酸残基の１以上が除去されており、その位置に異なる残基が挿入されている。そのような置換変異体には、種集団における天然に生じるヌクレオチド配列の変化（これは、アミノ酸の変化を引き起こしても引き起こさなくてもよい）により特徴付けられる対立遺伝子変異体が含まれる。その他の変異体形態に関しては、置換変異体は、１以上の異なる位置での単一または連続したアミノ酸残基の置換を含むことが可能である。 GDNFアミノ酸配列の特異的な突然変異は、グリコシル化部位（例えば、セリン、トレオニンまたはアスパラギン）に対する修飾を含むことが可能である。グリコシル化の不存在または部分的でしかないグリコシル化は、任意のアスパラギン -結合グリコシル化認識部位またはO-結合炭水化物の付加により修飾される分子の任意の部位におけるアミノ酸の置換または欠失から生じる。アスパラギン-結合グリコシル化認識部位は、適当な細胞グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、Asn-Xaa-ThrまたはAsn-Xaa-Ser（式中、XaaはPro以外の任意のアミノ酸である）のいずれかである。グリコシル化認識部位の１番目または３番目のアミノ酸位置の一方または両方が種々のアミノ酸で置換されたり欠失したりすると（および／または、２番目の位置のアミノ酸が欠失すると）、修飾されたトリペプチド配列部位でのグリコシル化が生じない。したがって、適当な改変ヌクレオチド配列の発現により、その部位でグリコシル化されていない変異体が得られる。別法として、グリコシル化部位を付加するように、GDNFRのアミノ酸配列を修飾することができる。突然変異誘発のためのGDNFRのアミノ酸残基または領域を同定するための１つの方法は、CunninghamおよびWells(Science，244:1081-1085，1989)に記載されているとおり、「アラニンスキャニング突然変異誘発（alanine scanning mutag enesis）」と称される。この方法では、標的残基のアミノ酸残基または基を同定し（例えば、Arg、Asp、His、LysおよびGluなどの荷電残基）、それを中性のまたは負に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置換して、それらのアミノ酸と細胞内外における周囲の水性環境との相互作用に影響を与える。ついで、それらの置換に対し機能的な感受性を示すドメインを、該置換部位に追加的または代替的な残基を導入することにより、改良する。このようにして、アミノ酸配列変異を導入するための標的部位を決定し、対応する標的コドンまたは該DN A配列の領域上でアラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発を行ない、発現されたGDNFR変異体を、所望の活性と活性の程度との最適な組合せに関してスクリーニングする。置換突然変異誘発において最も関心のある部位としては、種々の種からのGDNF Rタンパク質中に見出されるアミノ酸が、側鎖の嵩高さ、電荷および／または疎水性の点で実質的に異なっている部位などが挙げられる。関心のある他の部位は、種々の種から得られるGDNFR様タンパク質の特定の残基が同一である部位である。そのような位置は、一般には、タンパク質の生物活性に重要である。まず、これらの部位を、比較的に同類的に置換する。そのような同類置換を、表２の「好ましい置換」の項目に示す。そのような置換により生物活性が変化すれば、より実質的な変化（代表的な置換）を導入し、および／または、他の付加または欠失を行なってもよく、得られた産物を活性に関してスクリーニングする。アミノ酸配列に対する同類修飾（およびコードする核酸配列に対する対応する修飾）は、天然に生じるGDNFRと同様の機能的および化学的特性を有するGDNFRタンパク質産物を与えると予想される。これに対して、GDNFRタンパク質産物の機能的および／または化学的特性の実質的な修飾は、（a）置換領域におけるポリペプチドバックボーンの構造（例えば、シートまたはらせんコンホメーションとしての構造）、（b）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（c）側鎖の嵩高さを維持することに対するその効果の点で有意に異なる置換を選択することにより達成することができる。天然に生じる残基は、一般的な側鎖の特性に基づき、以下のグループに分類される：１）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；２）中性親水性：Cys、Ser、Thr；３）酸性：Asp、Glu；４）塩基性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Gly、Pro；および６）芳香族：Trp、Tyr、Phe。非同類置換は、これらのうちの１つのクラスのメンバーを別のクラスのものに交換することを含むことが可能である。そのような置換残基は、非ヒトGDNFRタンパク質と相同なヒトGDNFRタンパク質領域中、または該分子の非相同領域中に導入することができる。したがって、GDNFRタンパク質、その類似体または誘導体には、図２および４（配列番号２および４）に示すアミノ酸配列の全部または一部を一次アミノ酸配列として含有する生物学的に活性な分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。該タンパク質には、配列内の残基が生物学的に等価なアミノ酸残基で置換されてサイレント変化を引き起こす改変配列が含まれるであろう。例えば、該配列内の１以上のアミノ酸残基が、機能的等価体として作用する同様の極性を有する別のアミノ酸で置換されて、サイレント改変が生じることが可能である。該配列内のアミノ酸を置換する場合、その置換基は、該アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。また、 GDNFRタンパク質、類似体またはその断片もしくは誘導体は、例えばリン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質加水分解切断、抗体分子に対する結合、膜分子または他のリガンドにより、翻訳中または後に種々に修飾されることが意図される。 B．GDNFR 誘導体 GDNFRまたはGDNFR類似体の化学修飾された誘導体は、本開示に基づき、当該技術分野における技量の１つにより製造することができる。誘導体化に最も適した化学的部分には、水溶性重合体が含まれる。水溶性重合体が望ましいのは、水溶性重合体が結合したタンパク質は、水性環境（例えば、生理的環境）中で沈殿しないからである。治療用産物または組成物の製造のためには、好ましくは、該重合体は医薬上許容されるものである。当業者であれば、該重合体／タンパク質結合体を治療用に使用するか否かの考慮、また、そうであれば所望の用量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性およびその他の考慮事項に基づき、所望の重合体を選択することが可能であろう。誘導体化の有効性は、誘導体を所望の形態で（すなわち、浸透ポンプにより、あるいはより好ましくは注射または注入により、あるいは、例えば経口、肺または他の運搬経路のためにさらに製剤化することにより）投与し、その有効性を判定することにより確認することができる。適当な水溶性重合体には、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルホキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモ重合体またはランダム共重合体のいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中で安定であるため、製造上有利かもしれない。該重合体は、任意の分子量のものであってもよく、また、分枝状であっても非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールでは、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さの点で、約２kDa〜約100kDaである（「約」なる語は、ポリエチレングリコール調製物のうち、ある分子は、示されている分子量より大きく、ある分子は小さいことを示す）。所望の治療プロフィール（例えば、所望の徐放性の持続時間、生物活性に対する存在する効果、取り扱い易さ、抗原性の程度または欠如、および治療用タンパク質または変異体に対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に応じて、他のサイズを用いてもよい。このように結合するポリマー分子の数は、様々であることが可能であり、当業者であれば、機能に対するその効果を確認することができるであろう。モノ−誘導体化（mono-derivatize）を行なうことが可能であり、あるいは同じまたは異なる化学的部分（例えば、種々の重量のポリエチレングリコールなどの重合体）で、ジ−、トリ−、テトラ−誘導体化あるいは誘導体化のいくつかの組み合わせを行なうことが可能である。タンパク質（またはペプチド）分子に対する重合体分子の比率は、反応混合物中のそれらの濃度と同様、特に限定されるものではない。一般に、最適な比率（過剰な未反応タンパク質または重合体が存在しないという点での反応効率に関して）は、誘導体化の所望の程度（例えば、モノ−、ジ−、トリ−など）、選択した重合体の分子量、該重合体が分枝状か非分枝状か、反応条件などの因子により決定されることとなる。ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、該タンパク質の機能ドメインまたは抗原ドメインに対する効果を考慮して該タンパク質に結合させるべきである。多数の結合方法が当業者に利用可能である。例えば、参考として本明細書に組入れるEP 0 401 384（G-CSFに対するPEGの結合）を参照されたい。また、Malikら，Exp．Hematol．20:1028-1035(1992)（塩化トレシル(tresyl chl oride)を用いるGM-CSFのＰＥＧ化を報告している）も参照されたい。例えば、反応性基（例えば、遊離アミノまたはカルボキシル基）を介してアミノ酸残基により、ポリエチレングリコールを共有結合させることができる。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合しうる基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リシン残基およびＮ末端アミノ酸残基が含まれうる。遊離カルボキシル基を有するものには、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基が含まれうる。また、ポリエチレングリコール分子を結合させるための反応性基として、スルフヒドリル基を使用してもよい。治療目的に好ましいのは、アミノ基における結合、例えば、Ｎ末端またはリシン基における結合である。受容体の結合が望まれる場合には、受容体の結合に重要な残基での結合は避けるべきである。 N末端で化学修飾されたタンパク質が特に望まれる場合もある。ポリエチレングリコールを本組成物の例示として用いることにより、反応混合物中のタンパク質（またはペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の比率、行なうＰＥＧ化反応の型、およびＮ末端がＰＥＧ化された選択したタンパク質の入手方法を、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝などによる）から選択することができる。Ｎ末端がＰＥＧ化された調製物の入手方法（すなわち、必要に応じて、他のモノＰＥＧ化部分からこの部分を分離すること）は、ＰＥＧ化されたタンパク質分子の集団から、Ｎ末端がＰＥＧ化された物質を精製することにより実施することができる。選択的なＮ末端の化学修飾は、ある特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な種々のタイプの一級アミノ基の反応性の相違（リシン対該Ｎ末端）を利用する還元的アルキル化により達成することができる。適当な反応条件下で、カルボニル基含有重合体による、N末端での該タンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。例えば、リシン残基のε−アミノ基と該タンパク質のN末端残基のα−アミノ基との間のpKaの相違を利用可能にするpHで反応を行なうことにより、該タンパク質のＮ末端を選択的にＰＥＧ化することができる。そのような選択的な誘導体化により、タンパク質に対する水溶性重合体の結合を制御する。すなわち、該重合体との結合は該タンパク質のＮ末端で優先的に生じ、他の反応性基（例えば、リシン側鎖アミノ基）の有意な修飾は生じない。還元的アルキル化を用いる場合は、該水溶性重合体は、前記のタイプのものであってもよく、該タンパク質に結合するための単一の反応性アルデヒドを有するべきである。単一の反応性アルデヒドを含有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用してもよい。本発明は、少なくとも１つのポリエチレングリコール分子に結合した、原核生物により発現されたGDNFR誘導体またはその変異体の使用、ならびにアシルまたはアルキル結合を介して１以上のポリエチレングリコール分子に結合したGDNFR またはその変異体の使用を意図する。ＰＥＧ化は、当該分野で公知の任意のＰＥＧ化反応により行なうことができる。例えば、Focus on Growth Factors,3(2):4-10(1992); EP 0 154 316（その開示を、参考として本明細書に組入れることとする）；EP 0 401 384;およびＰＥＧ化に関する、本明細書中に引用する他の刊行物を参照されたい。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似した反応性水溶性重合体）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行なうことができる。アシル化によるＰＥＧ化は、一般に、ポリエチレングリコール（PEG）の活性エステル誘導体をGDNFRタンパク質または変異体と反応させることを含む。公知であるかまたは後に見出されることとなる任意の反応性PEG分子を使用して、GDN FRタンパク質または変異体のＰＥＧ化を行なうことができる。好ましい活性化PE Gエステルは、N−ヒドロキシスクシンイミド（「NHS」）に対してエステル化されたPEGである。本発明で用いる「アシル化」は、治療用タンパク質と水溶性重合体（例えば、PEG）との間のアミド、カルバマート、ウレタンなど（これらに限定されるものではない）の型の結合を包含する意である。 Bioconjugate Chem.，5:133-140(1994)を参照されたい。反応条件は、ＰＥＧ化の技術分野で公知のまたは後に開発されることとなる任意のものから選択することができるか、修飾するGDNFRまたは変異体を不活性化する温度、溶媒およびpH の条件は避けるべきである。アシル化によるＰＥＧ化からは、一般に、ポリ−ＰＥＧ化GDNFRタンパタ質または変異体が生じるであろう。好ましくは、該連結結合はアミドである。また、好ましくは、得られる産物は、実質的に専ら（例えば、＞95％）モノ、ジ−またはトリ−ＰＥＧ化されている。しかしながら、ＰＥＧ化度がより高いいくつかの種が、用いる特定の反応条件に応じた量で生成するかもしれない。所望により、とりわけ透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過タロマトグラフィー、電気泳動などの標準的な精製法により、該混合物、特に未反応種から、より精製されたＰＥＧ化種を分離することができる。アルキル化によるＰＥＧ化は、一般に、還元剤の存在下、PEGの末端アルデヒド誘導体をGDNFRタンパク質または変異体と反応させることを含む。アルキル化によるＰＥＧ化からは、ポリ−ＰＥＧ化GDNFRタンパク質または変異体が生じることもある。さらに、実質的にGDNFRタンパタ質または変異体のN末端のα−アミノ基においてのみ（すなわち、モノ−ＰＥＧ化タンパタ質）ＰＥＧ化を有利に行なえるように、反応条件を操作することができる。モノＰＥＧ化またはポリＰＥＧ化のいずれかの場合には、PEG基を、好ましくは、-CH₂-NH-基を介して該タンパク質に結合させる。特に-CH₂-基に関しては、この型の結合を本発明では「アルキル」結合と称することとする。モノＰＥＧ化産物を与える還元的アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化に利用可能な種々のタイプの一級アミノ基の反応性の相違（リシン対該N末端）を利用する。該反応は、リシン残基のε−アミノ基と該タンパク質のN末端残基の α−アミノ基との間のpKaの相違を利用可能にするpHで行なう。そのような選択的な誘導体化により、アルデヒドなどの反応性基を含有する水溶性重合体の、タンパタ質に対する結合を制御される。すなわち、該重合体との結合は該タンパタ質のN末端で優先的に生じ、他の反応性基（例えば、リシン側鎖アミノ基）の有意な修飾は生じない。１つの重要な態様においては、本発明は、モノ重合体／GD NFRタンパク質(または変異体)結合体分子（重合体分子が実質的に専ら（すなわち、＞95％）単一の部位で結合しているGDNFRタンパク質または変異体を意味する）の実質的に均一な調製物の使用を意図する。より詳しくは、ポリエチレングリコールを使用する場合には、本発明はまた、抗原結合基をおそらく欠いておりポリエチレングリコール分子がGDNFRタンパク質または変異体に直接結合しているＰＥＧ化GDNFRタンパタ質または変異体の使用を含む。このように、本発明のGDNFRタンパタ質産物は、PEG基がアシルまたはアルキル基を介して結合したＰＥＧ化GDNFRタンパタ質または変異体を含む。前記のとおり、そのような産物は、モノ−ＰＥＧ化またはポリ−ＰＥＧ化されている（例えば、２〜６個、好ましくは２〜５個のPEG基を含有する）ことが可能である。PEG 基は、一般に、アミノ酸のα−またはε−アミノ基において該タンパク質に結合するが、PEG基は、適当な反応条件下でPEG基に結合するようになるのに十分な程度に反応性である該タンパク質に結合している任意のアミノ基に結合することもできると意図される。アシル化およびアルキル化の両方のアプローチにおいて使用する重合体分子は、前記の水溶性重合体から選択することができる。選択した重合体は、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有するように修飾すべきであり、それにより、本方法で記載されているとおりに重合度を制御することができる。代表的な反応性PEGアルデヒドは、水溶性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノC1-C10アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である（米国特許第5,252,714号を参照されたい）。該重合体は、分枝状であっても非分枝状であってもよい。アシル化反応の場合には、選択する重合体は、単一の反応性エステル基を有するべきである。本還元的アルキル化の場合には、選択する重合体は、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。一般に、水溶性重合体は、天然に生じるグリコシル残基からは選択しない。なぜなら、これらの残基は、通常、哺乳動物組換え発現系により、より簡便に得られるからである。該重合体は、任意の分子量を有していてもよく、また、分枝状であっても非分枝状であってもよい。本発明で使用するための特に好ましい水溶性重合体は、ポリエチレングリコールである。本発明で用いるポリエチレングリコールは、他のタンパク質の誘導体化に使用されている任意の形態のPEG（例えば、モノ−(C1-C10)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール）を包含する意である。一般に、化学誘導体化は、生物学的に活性な物質を活性化重合体分子と反応させるのに使用される適当な任意の条件下で行なうことができる。ＰＥＧ化GDNFR タンパク質または変異体の製造法は、一般には、(a)GDNFRタンパタ質産物を、該タンパク質が１以上のPEG基に結合するようになる条件下で、ポリエチレングリコール（例えば、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させ、そして(b)反応産物を得る工程を含む。一般には、アシル化反応の最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて、その場合ごとに決定することとなる。例えば、PEG：タンパク質の比が大きくなるほど、ポリ−ＰＥＧ化産物の割合が高くなる。モノ重合体／GDNFRタンパク質産物の実質的に均一な集団を得るための還元的アルキル化は、一般には、(a)GDNFRタンパク質または変異体を、還元的アルキル化条件下、該GDNFRタンパク質または変異体のアミノ末端におけるα−アミノ基の選択的修飾を得るのに適したpHにて、反応性PEG分子と反応させ、そして(b)反応産物を得る工程を含む。モノ重合体／GDNFRタンパク質産物の実質的に均一な集団の場合、還元的アルキル化反応条件は、GDNFRタンパク質または変異体のN末端に対する水溶性重合体部分の選択的な結合を許容する条件である。そのような反応条件は、一般に、リシンアミノ基とN末端のα−アミノ基とのpKaの相違を与える（ pKaは、アミノ基の50％がプロトン化され50％がプロトン化されないpHである）。また、pHは、使用するタンパタ質に対する重合体の比率に影響を及ぼす。一般に、pHが低いほど、タンパク質に対してより過剰の重合体が必要となるであろう (すなわち、N末端のα−アミノ基の反応性が低いほど、最適条件を得るためにはより大量の重合体か必要となる)。pHがより高ければ、重合体：タンパク質の比は、それほど大きくする必要はない(すなわち、利用可能な基の反応性が高いほど、重合体分子は少なくてすむ)。本発明の目的には、pHは、一般に、３〜９、好ましくは３〜６の範囲内となるであろう。考慮すべきもう１つの重要な点は、重合体の分子量である。一般に、重合体の分子量が大きいほど、該タンパタ質に結合しうる重合体分子は少なくなる。同様に、これらのパラメーターを最適化する場合には、重合体の分枝を考慮すべきである。一般に、分子量が大きくなるほど（あるいは分枝が著しくなるほど）、重合体：タンパク質の比は大きくなる。一般に、本発明で意図されるＰＥＧ化反応の場合、好ましい平均分子量は、約２kDa〜約100kDaである。好ましい平均分子量は、約５kDa〜約50kDa、特に好ましくは約12kDa〜約25kDaである。GD NFタンパタ質または変異体に対する水溶性重合体の比率は、一般に、１：１から 100：１、好ましくは、（ポリＰＥＧ化の場合には）１：１から20：１、（モノＰＥＧ化の場合には）１：１から５：１の範囲であろう。前記の条件を用いて還元的アルキル化を行なえば、アミノ末端にα−アミノ基を有する任意のGDNFRタンパタ質または変異体に対する重合体の選択的結合か得られ、モノ重合体／GDNFRタンパク質（または変異体）結合物の実質的に均一な調製物が得られるであろう。本発明で用いる「モノ重合体／GDNFRタンパク質（または変異体）結合物」なる語は、GDNFRタンパタ質またはGDNFR変異体タンパタ質の１分子に単一の重合体分子が結合してなる組成物を意味する。モノ重合体／ GDNFRタンパク質（または変異体）結合物は、好ましくは、リシンのアミノ側鎖基上以外のN末端に位置する重合体分子を有するであろう。該調製物は、好ましくは、90％以上のモノ重合体／GDNFRタンパク質（または変異体）結合物、より好ましくは、95％以上のモノ重合体／GDNF Rタンパク質（または変異体）結合物であり、認められうる分子の残りは末反応のもの（すなわち、重合体部分を欠くタンパタ質）である。また、GDNFRタンパク質産物は、融合タンパタ質または連結されたGDNFRおよびGDNF分子を含むＰＥＧ化分子の調製物を含みうると考えられる。本還元的アルキル化の場合には、還元剤は、水溶液中で安定であるべきであり、好ましくは、還元的アルキル化の初期過程で生じるシッフ塩基のみを還元する能力を有する。適当な還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボランおよびピリジンボランから選択することができる。特に好ましい還元剤は、シアノホウ水素化ナトリウムである。溶媒、反応時間、温度などの他の反応パラメーター、および産物の精製手段は、水溶性重合体によるタンパク質の誘導体化に関する公開されている情報に基づいて、場合ごとに決定することができる（本明細書中で引用している刊行物を参照されたい）。 C．GDNFR タンパク質産物の医薬組成物 GDNFRタンパク質産物の医薬組成物は、典型的には、投与法に対する適合性に応じて選択される１以上の医薬上および生理的に許容される製剤化物質と混合された、GDNFRタンパタ質産物の治療的または予防的に有効な量を含む。適当な製剤化物質には、抗酸化剤、保存剤、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝剤、送達用ビヒタル、希釈剤、賦形剤および／または医薬補助剤が含まれるか、これらに限定されるものではない。例えば、適当なビヒクルは、非経口投与用組成物中で一般に用いられる他の物質でおそらく補足される注射用水、生理食塩水または人工脳脊髄液である。中性の緩衝化塩類液、または血清アルブミンと混合された塩類液は、さらに典型的なビヒクルである。本発明で用いる「医薬上許容される担体」または「生理的に許容される担体」なる語は、医薬組成物としてのGDNFRタンパタ質産物の送達を達成し促進するのに適した製剤化物質を意味する。ビヒクル中の主な溶媒は、事実上、水性であっても非水性であってもよい。さらに、ビヒクルは、pH、浸透圧、粘性、清澄性、色、無菌性、安定性、溶解速度または製剤の臭気を改変したり維持するための他の医薬上許容される賦形剤を含有していてもよい。同様に、ビヒタルは、GDNFRタンパク質産物の放出速度を改変したり維持するための、あるいは血液脳関門を通過することによるGD NFRタンパタ質産物の吸収または透過を促進するための追加的な製剤化物質を含有していてもよい。治療用医薬組成物を製剤化したら、それを、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体または脱水もしくは凍結乾燥した粉末として、無菌バイアル中に保存することができる。そのような製剤は、すぐに使用できる形態で保存することもできるし、あるいは投与前に再構成を要する形態（例えば、凍結乾燥形態）で保存することもできる。当業者であれば、投与経路および所望の用量に応じて、最適な医薬製剤を決定することができるであろう。例えば、開示を参考として本明細書に組入れるRemi ngton's Pharmaceutical Sciences，第18版（1990，Mack Publishing Co.，East on，PA18042）の第1435〜1712頁を参照されたい。そのような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理学的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼしうる。有効な投与形態、例えば、（１）徐放製剤、（２）吸入ミスト、または（３）経口的に活性な製剤が意図される。また、GDNFR タンパク質産物の医薬組成物を非経口投与用に製剤化することができる。そのような非経口投与される治療用組成物は、典型的には、医薬上許容されるビヒクル中にGDNFRタンパク質産物を含む、発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態である。１つの好ましいビヒクルは、生理食塩水である。また、GDNF Rタンパク質産物の医薬組成物には、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の、あるいはリポソーム中の粒子製剤が含まれうる。また、ヒアルロン酸を使用することができ、これは、循環中での維持の持続化を促進する効果を有するかもしれない。非経口注射に特に適しているビヒクルは、適切に保存されている無菌等張液としてGDNFRタンパク質産物を製剤化するのに使用する無菌蒸留水である。さらにもう１つの製剤は、後にデポー注射剤として送達されうる、該タンパタ質の遅延放出または徐放を与える注射可能なミタロスフェアまたはリポソームなどの物質と共に、GDNFRタンパク質産物の製剤を含むことが可能である。GDNFRタンパク質産物の導入のための他の適当な手段には、GDNFRタンパク質産物を含有する移殖可能な薬物送達装置が含まれる。本発明の製剤は、当該技術分野で良く知られている他の成分、例えば、非経口的に許容される保存剤、等張化剤、共存溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝剤、抗微生物剤、抗酸化剤および界面活性剤を含むことが可能である。例えば、適当な等張促進剤には、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、ソルビトールなどが含まれる。適当な保存剤には、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、タロルヘキシジン、ソルビン酸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。また、保存剤として過酸化水素を使用することができる。適当な共存溶媒としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールが挙げられる。適当な錯化剤としては、例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シタロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが挙げられる。適当な界面活性剤または湿潤剤には、ソルビタンエステル、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート80）、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなどか含まれる。緩衝剤は、ホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、炭酸水素塩またはTris-HCl などの通常の緩衝剤であることが可能である。製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝剤を使用して、生理的pHまたはそれより少し低いpH、典型的には約５〜約８のpH範囲内に該組成物を維持する。吸入用に医薬組成物を製剤化することができる。例えば、吸入用の乾燥粉末として、GDNFRタンパタ質産物を製剤化することができる。また、エアゾール運搬用の液化噴射剤中に、GDNFRタンパク質産物の吸入溶液を製剤化することもできる。さらにもう１つの製剤では、溶液を噴霧化することができる。また、GDNFRタンパク質産物を含有するある種の製剤を経口投与することも意図される。このようにして投与するGDNFRタンパク質産物は、錠剤、カプセル剤などの固形剤形の配合に通常使用される担体を使用してまたは使用しないで製剤化することかできる。例えば、カプセル剤は、生物学的利用能が最大になり前全身分解（pre-systemic degradation）が最小になる胃腸管内部位で該製剤の活性部分を放出するよう設計することができる。GDNFRタンパク質産物の吸収を促進するために、追加的な製剤化物質を含有させることができる。また、希釈剤、香味剤、低融点ロウ、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤および結合剤を使用することができる。もう１つの製剤は、錠剤の製造に適した無毒性の賦形剤との混合物中に、有効量のGDNFRタンパク質産物を含むことができる。無菌水または他の適当なベヒクル中に錠剤を溶解することにより、単位投与形の液剤を製造することができる。適当な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴムなどの結合剤、またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの滑沢剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。 GDNFタンパク質産物と共にGDNFRタンパク質産物を含有する製剤を包含する追加的なGDNFRタンパク質産物製剤が、当業者には明らかであろう。また、他の種々の徐放または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生分解性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射剤を製剤化するための技術は、当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達用の制御放出性多孔性高分子微粒子に関するSupers axoらの記載（国際公開第WO 93/15722号；国際出願第PCT/US93/00829号）（その開示を参考として本明細書に組入れることとする）を参照されたい。 D．GDNFR タンパク質産物の投与 GDNFRタンパク質産物は、皮下、筋肉内、静脈内、経肺的、経皮的、鞘内および脳内送達を含む種々の経路で非経口的に投与することができる。さらに、血液脳関門を容易に通過しないタンパタ質性因子を、脳内に直接投与したり、あるいは、それを血液脳関門を通して輸送する他の要素と共に投与することができる。例えば、GDNFRタンパク質産物を、脳室内または脳もしくは脊髄くも膜下腔内に投与することができる。また、GDNFRタンパク質産物を、脳実質中に直接的に脳内投与することができる。GDNFRタンパク質産物は、血液脳関門を通過するように化学修飾またはパッケージングされた形態で脳外に投与してもよいし、あるいは、GDNFRタンパク質産物が該関門を透過するのを促進しうる１以上の物質と共に投与することができる。例えば、NGFとモノクローナル抗トランスフェリン受容体抗体との結合物は、トランスフェリン受容体に対する結合を介して脳へ輸送されることが示されている。 GDNFRタンパク質産物の所望のレベルを得るためには、反復して毎日行なう注射またはそれより低頻度の注射により投与したり、あるいは、GDNFRタンパク質産物を、流出が一定またはプログラム可能な埋め込みポンプ（constant- or programmable-flow implanted pump）から連続的または一時的に注入することができる。また、生分解性重合体マトリックス中に包埋した神経栄養因子を含有する脳内の徐放性インプラントも、GDNFRタンパタ質産物を送達することができる。投与頻度は、製剤化されたG DNFRタンパク質産物の薬物動態学的パラメーターならびに投与の経路および部位に左右されるであろう。投与方法にかかわらず、具体的な用量は、体重、体表面積または器官のサイズに基づき計算することができる。前記製剤のそれぞれを含む治療のための適当な用量を決定するのに必要なさらに厳密な計算は、当業者が日常的に行なっているものである。適当な用量は、適当な用量反応データを用いることにより確認することができる。具体的な損傷または症状の治療方法に関連した最終的な投与計画は、担当医師により決定されることになる。一般には、本GDNFRポリペプチドの有効量は、薬物の作用を改変する種々の因子（例えば、患者の年齢、状態、体重、性および食事、いずれかの感染の重症度、投与時間ならびに他の臨床的因子）を考慮することにより決定されることになる。例えば、参考として本明細書に組入れるRemington's Pharmaceutical Sciences(前掲)p.697-773を参照されたい。GDNFの作用を増強するためにGDNFRを使用する場合には、GDNFRの用量は、GDNF療法に要求される用量と同様のものとなるように選択され、GDNFの作用を拮抗するためにGDNFRを使用する場合には、GDNFRの用量はGDNFの用量の数倍になると考えられる。投与は、１日１回または２回、あるいはそれより低頻度で行なうことが可能であり、本明細書中に記載の他の組成物と一緒に行なうことが可能である。本発明は、本明細書中に挙げられている用量に限定されるものではないことに注意すべきである。 GDNFRの連続的投与または持続的送達が、ある与えられた治療に有利であると考えられる。連続的投与は、機械的手段（例えば、注入ポンプ）を介して行なうことができるが、他の連続的またはほぼ連続的な投与方法を実施することも可能であると意図される。例えば、化学的誘導体化またはカプセル化により、予め決定された投与計画に基づいて予測可能な量で血流中に連続的に存在するという効果を有する該タンパク質の徐放性形態を得ることが可能である。したがって、GD NFRタンパク質産物は、そのような連続的投与を達成するように誘導体化または製剤化されたタンパク質を含む。GDNFRタンパク質産物の徐放性形態は、所望の有効な１日量または１週量を与えるように製剤化されることとなる。さらに、GDNFRタンパタ質産物は、GDNFと組合せた形態で投与することができる。あるいは、GDNFRタンパク質産物とGDNFタンパク質産物とを、連続的または同時に、別々に投与することができる。また、本発明のGDNFRタンパク質産物は、単独で又は他の増殖因子と組合せて、神経疾患の治療において使用することができる。さらに、他の因子または他の分子（化学組成物を含む）を、GDNFRタンパク質産物と共に使用することができる。パーキンソン病の治療においては、GDNFRタンパタ質産物を単独で使用したり、あるいは、GDNFRが、内因性GDNFの活性を増強し、それにより、増加した濃度のドーパミンのニューロン取込みを増強する場合には、レボドーパの投与と組合せて使用することが意図される。前記のとおり、追加的な神経栄養因子またはニューロン成長促進因子が、いくつかのニューロン細胞集団またはいくつかのタイプの損傷または疾患の治療に有用であるかまたは必要であると考えられる。GDNFRと共に、あるいはGDNFRとGDNFとの組合せと共に使用しうる他の因子には、インスリン、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、血管作用性増殖因子、下垂体アデニル酸シタラーゼ活性化ポリペプチド、インターフェロン、ソマトスタチンなどのマイトジェン；神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4/5、ニューロトロフィン6、インスリン様増殖因子、毛様体神経栄養因子、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子、繊維芽細胞増殖因子5、トランスフォーミング増殖因子β、コカイン−アンフェタミン調節転写産物（cocaine-amphetamine regulated transcript）（CART）などの神経栄養因子；および上皮増殖因子、白血病阻害因子、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子などの他の増殖因子；ならびにこれらの因子の機能的等価体である分子および物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。GDNFR タンパタ質産物の細胞療法および遺伝子治療また、GDNFRタンパク質産物細胞療法（例えば、GDNFRタンパク質産物を産生する細胞の脳内移植）も意図される。この実施態様は、生物学的に活性な形態のGD NFRタンパク質産物を合成し分泌する能力を有する細胞を患者中に移植することを含むであろう。そのようなGDNFRタンパタ質産物を産生する細胞は、GDNFRタンパク質産物の天然の生産体である細胞であってもよいし、あるいは所望のGDNFRタンパク質産物をコードする遺伝子での形質転換によりGDNFRタンパク質産物を産生する能力が増強されている組換え細胞であってもよい。そのような修飾は、該遺伝子を送達しその発現および分秘を促進するのに適したベクターを用いて行なうことができる。外来種のGDNFRタンパタ質産物を投与された患者における潜在的な免疫反応を最小限に抑えるために、GDNFRタンパク質産物を産生する天然の細胞がヒト由来であり、ヒトGDNFRタンパク質産物を産生することが好ましい。同様に、GDNFRタンパク質産物を産生する組換え細胞を、ヒトGDNFRタンパク質産物をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換することが好ましい。周囲の組織の浸潤を避けるために、移植細胞をカプセル化することができる。 GDNFRタンパク質産物の放出を許容するが、患者の免疫系による又は周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ生体適合性で半透過性の高分子封入物または膜中のヒトまたはヒト以外の動物の細胞を、患者に移植することができる。別法として、GDNFRタンパク質産物を産生するようex vivoで形質転換した患者自身の細胞を、そのようなカプセル化を行なうことなく、患者体内に直接移植することもできるであろう。生存細胞のカプセル化のための方法は、当業者によく知られており、カプセル化された細胞の作製および患者内へのその移植は、過度な実験を行なうことなく達成することができる。例えば、Baetgeら（国際公開第WO95/05452号；国際出願第PCT/US94/09299号（その開示を参考として本明細書に組入れることとする））は、生物学的に活性な分子の有効な運搬のための遺伝的に操作された細胞を含有する生体適合性カプセルを記載している。また、米国特許第4,892,538号、第5,0 11,472号および第5,106,627号（それらのそれぞれを、参考として本明細書中に特に組入れることとする）を参照されたい。生存細胞をカプセル化するための系は、参考として本明細書中に特に組入れるAebischerらのPCT出願WO91/10425に記載されている。また、AebischerらのPCT出願WO91/10470; Winnら，Exper．Neuro l.，113:322-329，1991;Aebischerら，Exper．Neurol.， 111:269-275，1991;Trescoら，ASAIO，38:17-23，1992（それらのそれぞれを、参考として本明細書中に特に組入れることとする）も参照されたい。また、インビボおよびインビトロ遺伝子治療におけるGDNFRの送達も意図される。インビトロ遺伝子治療は、GDNFRタンパク質産物をコードする遺伝子を、核酸構築物または他の適当な送達用ベクターの局所注射により、標的細胞内に導入することにより行なうことができる（Hefti，J．Neurobiol．25:1418-1435，199 4）。例えば、GDNFRタンパク質産物をコードする核酸配列を、標的細胞内への送達用のアデノ随伴ウイルスベクター中に含有させることができる（例えば、John son，国際公開第WO 95/34670号；国際出願第PCT/US95/07178号（その開示を参考として本明細書中に組入れる））。その他のウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびパピローマウイルスのベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。また、リポソーム媒介性導入、直接注射（裸のDNA）、受容体媒介性導入（リガンド−DNA複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿または微粒子衝撃（遺伝子銃）により、適宜インビボまたはエクスビボのいずれかで物理的な導入を行なうことができる。 GDNFRタンパク質産物による遺伝子治療または細胞療法は、さらに、GDNFタンパク質産物の送達を含むことが可能である。例えば、GDNFRタンパク質産物とGDN Fタンパク質産物との両方を発現し放出するように宿主細胞を修飾することができる。あるいは、GDNFRタンパク質産物とGDNFタンパク質産物とを、別々の細胞中で発現させ、それらの細胞から放出させることができる。そのような細胞を別々に患者内に導入したり、あるいは該細胞を、単一の移殖可能な装置（例えば、前記のカプセル化用膜）中に含有させることができる。本明細書に記載のGDNFRタンパク質産物の製剤は、獣医学的適用およびヒトに対する適用に用いてもよく、「患者」なる語は限定的なものではないことに注意すべきである。獣医学的適用の場合、用量範囲は、前記のとおりに決定することができる。実施例高親和性GDNF結合部位を発現する細胞の同定発現クローニングは、有意なレベルの日的転写産物を含有する可能性があるmR NA源の選択を含むものであった。網膜光受容体細胞が非常に低い濃度のGDNFに反応することを確認した。これは、機能的な高親和性受容体の存在を示唆した。ラット光受容体細胞が、GDNFに対する高親和性受容体を発現したことを確認するために、[¹²⁵I]GDNF結合および写真乳液分析を行なった。ラット網膜細胞培養５日齢のC57Bl/6子マウスまたは３日齢のSprague-Dawley子ラット（Jackson L aboratories，Bar Harbor，MA）の神経網膜を注意深く取り出し、色素上皮から切り離し、1mm²の断片に切断し、氷冷リン酸緩衝食塩水（PBS）中に入れた。ついで該網膜を、120単位のパパインと2000単位のDNアーゼとを含有する10mLのハンタス均衡塩類溶液（HBSS）中に移し、約200rpmのロータリープラットフォームシェーカー上、37℃で20分間インキュベートした。ついで該細胞を、火造りされた（fire-polished）パスツールピペットに通して粉砕することにより分散させ、20μｍ Nitrexナイロンメッシュに通して篩にかけ、 200×gで５分間遠心した。得られた細胞ペレットを、1％オボアルブミンと500単位のDNアーゼとを含有するHBSS中に再懸濁し、4％オボアルブミン溶液（HBSS中）上に重層し、500×gで10分間遠心した。最終ペレットを完全培地（後記を参照されたい）中に再懸濁し、約15,000細胞/mLに調節し、Louisら，Journal Of Pha rmacology And Experimental Therapeutics,262，1274-1283，1992に既に記載されているとおり、ポリオルニチンおよびラミニンでコーティングされた組織培養プレート中に90μｌのアリコートで播いた。該培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）とF12培地との1:1混合物よりなり、2.5％熱不活性化ウマ血清(Hyclone，Logan, UT)、B27培地補足剤（GIBCO ，Grand Island，NY）、D−グルコース(最終濃度：5mg/mL)、L−グルタミン（最終濃度：2mM）、20mM HEPES、ウシインスリンおよびヒトトランスフェリン（最終濃度：それぞれ2.5および1.0mg/mL）で補足されたものであった。光受容体の免疫細胞化学的同定桿体特異的抗原であるアレスチンに関する免疫染色により、光受容体を同定した。光受容体の培養を、PBS(pH7.4)中、4％パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定し、ついでPBSで３回洗浄した。ついでその固定された培養を、該抗体の侵入を促進するために1％Nonidet P-40を含有するSuperblockブロッキング緩衝液（Pierce,Rockford,IL）中でインキュベートした。ついで抗アレスチン抗体（アレスチンの合成ペプチド配列：Val-Phe-Gl u-Glu-Phe-Ala-Arg-Gln-Asn-Leu-Lys-Cysに対するポリクローナルウサギ抗体）を、同じ緩衝液中の１：2000の希釈度にて適用し、該培養をロータリーシェーカー上37℃で１時間インキュベートした。PBSで３回洗浄した後、該培養を1:500の希釈度のヤギ抗ウサギIgG（Vector Laboratories，Burlingame，CAからのVectas tainキット）と共に37℃で１時間インキュベートした。PBSで３回洗浄した後、二次抗体を、１：500に希釈されたアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体で標識した（45分、37℃）。PBSでさらに３回洗浄した後、該標識細胞培養を、0.04％ 3',3'−ジアミノベンジジン−(HCl)4、0.06％NiCl₂および0.02％過酸化水素を含有する0.1M Tris-HCl(pH7.4)の溶液中で5〜20分間反応させた。アレスチンの免疫反応性に基づけば、該培養中の細胞の約90％が桿体光受容体であった。 200倍の倍率の明光レンズ（bright-lightoptics）でアレスチン染色培養を調べることにより、光受容体の生存を判定した。6mmウェルの全表面積の約20％に相当する、直径に沿った1×6mmの１つの細片上で、アレスチン陽性光受容体の数を計数した。生存可能な光受容体を、通常の短い軸索様突起と共に一定の形状の細胞体を有するものとして特徴づけた。不規則で空胞化した核周囲部細胞体または断片化神経突起を有するなどの変性の徴候を示す光受容体は、計数しなかった（しかし、変性している光受容体のほとんどは、培養基層から剥離していた）。細胞数をいずれも、6mmウェル当たりの細胞数として表した。光受容体に関して富化された培養ラット網膜細胞（10,000/6mmウェル）を、ヒト組換えGDNF（10ng/mL〜1pg/mLの範囲の10倍系列希釈）で処理した。該培養を６日後に固定し、桿体特異的抗原であるアレスチンに関して免疫染色した。GDNF で処理していない培養においては、光受容体の数は、時間経過と共に一定の割合で減少し、６日間の培養後には最初の数の約25％に達した。GDNFによる該培養の処理により、６日間の培養後に、生存可能なアレスチン陽性光受容体の数は約２倍になった。GDNFの効果は約200pg/mLで最大となり、ED₅₀は約30pg/mL であった。GDNFの添加は、光受容体の生存を促進するだけでなく、それらの軸索様突起の伸長をも刺激し、これは、光受容体の形態学的発達に対する効果を示している（神経突起の長さの平均は、対照培養では27±18μmであったのに対して、GDNFでは68μmであった）。ラット網膜が高親和性GDNF受容体を発現することを確認するために、［¹²⁵I]G DNF結合および写真乳液分析を行なった。これらの実験の3〜4日前に、生後ラットの光受容体細胞をプラスチックスライドフラスケット（flaskettes）（Nunc）上に2800細胞/mm²の密度で播いた。該細胞を氷冷洗浄緩衝液（25mM N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N'−2−エタンスルホン酸(HEPES)(pH7.5)を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)）で１回洗浄した。競合結合のために、結合緩衝液（25mM HEPES(pH7.5)と2mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)とを含有するDH EM）中の種々の濃度の[¹²⁵I]GDNFと共に、500nMの未標識GDNFの存在下または不存在下で、該細胞を4℃で４時間インキュベートした。細胞を氷冷洗浄緩衝液で４回洗浄し、1M NaOH中で溶解し、該細胞に結合している放射能をガンマカウンターで測定した。低いリガンド濃度（わずか30pM）においても、有意な量の[¹²⁵I]GDNFが該光受容体細胞に結合し、この結合は、過剰な未標識GDNF の存在により完全に阻害された。写真乳液検出では、500nMの未標識GDNFの存在下または不存在下、結合緩衝液中の50pMの[¹²⁵I]GDNFと共に細胞を4℃で４時間インキュベートした。細胞を氷冷洗浄緩衝液で６回洗浄し、2.5％グルタルアルデヒドで固定し、50％エタノールおよび70％エタノールで順次脱水し、NTB-2写真乳液（Eastman Kodak，Roches ter NY）中に浸した。５日間の露光後、該スライドを現像し、検査した。この写真乳液分析は、該光受容体細胞のいくつかに対する［¹²⁵I]GDNFの結合を示し、それにより、GDNFに対する受容体の存在を示した。一方、この結合は、未標識GD NFの添加により効率的に遮断された。実施例２光受容体細胞からのGDNFRの発現クローニングラット光受容体細胞を、実施例１に記載のとおり、それらの細胞表面に対する放射能標識GDNFの結合と、非常に低い濃度の該リガンドに応答するそれらの能力とに基づき、GDNFに対する高親和性受容体の可能な起源として選択した。該受容体を同定するために、哺乳動物発現ベクター（pSRの誘導体,Takebeら， 1988前掲）と、培養された生後ラット光受容体細胞から単離したmRNAとを使用して、約50,000個の独立したクローンのサイズ選択されたcDNAライブラリーを後記の方法により構築した。該ライブラリーを、約1,500〜2,000個の独立したクローンのプールに分割し、確立されている発現クローニングアプローチ（Gearingら，EMBO Journal，8，3667-3676，1989）を用いてスクリーニングした。該ライブラリーの各プールを代表するプラスミドDNAを調製し、プラスチック顕微鏡スライドフラスケット（Nunc,Naperville,IL）上で増殖させたCOS7細胞中にトランスフェクトした。それらのトランスフェクトした細胞を、［¹²⁵I]GDNFで処理し、グルタルアルデヒドで固定し、脱水し、オートラジオグラフィー用写真乳液中に浸した。５日間露光させた後、該スライドを現像し、GDNFに対する受容体を該細胞が発現したことによる該細胞表面に対する[¹²⁵I]GDNFの結合を示す銀粒子で覆われた細胞の存在に関して検査した。［¹²⁵I]EGFで処理された、EGF受容体をトランスフェクトした細胞を、陽性対照として使用した。このようにしてスクリーニングした27個のプールのうちの１個（F8-11）が、トランスフェクション後に19個の陽性細胞を示した。このようにして、GDNFRを発現するcDNAクローンを含有する単一のcDNA ライブラリーのプールを同定した。このプールを、100クローン/プールのより小さなサブプール60個に分割し、それらを前記と同じ方法で再スクリーニングした。これらのプールのうちの５個が陽性であると確認され、それらの５個のプールのうちの２個を更に小分けして、GDNF結合活性を与える単一のクローンを得た。これらの単一クローンからのプラスミドDNAをCOS7細胞中にトランスフェクトすることにより、該細胞の約15％に対する[¹²⁵I]GDNFの結合が得られた。この結合は、過剰な未標識GDNFとの競合により特異的に阻害された。発現cDNAライブラリーの構築ラット網膜細胞を、生後3〜7日のラットから収穫し、ラミニンおよびポリオルニチンでコーティングされた培養皿中に約5700細胞/mm²の密度で播いた。3〜4日間培養した後、該集団は、約80％の光受容体細胞を含有すると推定された。標準的な方法によりこの培養から全RNAを調製し、ポリＡトラクト（tract）キット（ Promega,Madison,WI）を使用してポリA＋RNAを精製した。Gibco Superscript Ch oice System（Gibco/BRL，Gaithersburg，MD）を使用して、cDNAラット光受容体ポリA＋ RNAからライブラリーを構築した。２μｇのポリA＋RNAを、50ngのランダムヘキサマーと混合し、70℃に10分間加熱し、ついで氷上で急冷した。第１鎖の合成を、400U Superscript II RTで37℃で１時間行なった。dNTP、10Uの大腸菌（E．co li）DNAリガーゼ、40Uの大胞菌（E．coli）DNAポリメラーゼＩおよび2Uの大腸菌（E．coli）RNアーゼＨを加えた後、第２鎖の合成を同じ管中で行なった。16℃ で２時間後、10UのT4ポリメラーゼで16℃で更に５分間処理することにより、該c DNA末端を平滑化した。イソプロパノール沈殿後、10μｇの非リン酸化EcoRIアダプターオリゴヌタレオチドに一晩連結させることにより、該cDNAにEcoRIクローニング部位を付加した。ついでEcoRIアダプター化cDNAをリン酸化し、SephacrylS-500 HRサイズ分画カラムにアプライした。ローディング後、該カラムを100μｌのアリコートのTEN緩衝液（10mM Tris-HCl，pH7.5、10mM EDTA、25mM NaCl）で洗浄し、30μ１の画分を集めた。約34ngの高分子量cDNAを含有する画分6〜8をプールし、沈殿させた。回収されたEcoRIアアプター化cDNAを、EcoRIで切断したベクターpBJ5の50ngに一晩連結させた。それぞれ約15ngのcDNAを含有する連結混合物のアリコートを、エレクトロポレーションによりコンピテント細胞（大腸菌（E．coli）株DH10B; GIBCO/BR L，Gaithersburg，MD）中に形質転換した。該形質転換混合物を、力価測定し、ついで27Amp/LBプレート上に1500コロニー/プレートの密度でプレーティングした。コロニーを各プレートから擦り取り、10mlのルリアブロス（LB）中に集めて、それぞれ1500個の独立したクローンの27個のプールを作製した。各プールからの細胞の一部をグリセロール中で凍結した。Qiagen tip-500キット（Qiagen Inc .,Chatsworth,CA）を用いてプラスミドDNAを単離するために、その残りの部分を使用した。COS 細胞のトランスフェクションおよび写真乳液分析トランスフェクションの前日に、ProNectin（リン酸緩衝食塩水（PBS）中10μ g/mL）でコーティングされたプラスチックスライドフラスケット（Nunc）上にCO S7細胞を播いた(220,000細胞/スライド)。トランスフェクションのために、２μ ｇのcDNAを含有する700μｌのOpti MEMI(GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD)を、エッペンドルフ管中の35μｌのDEAEデキストラン溶液（10mg/mL，Sigma，St．Louis ，MO）と穏やかに混合した。細胞をPBSで２回洗浄し、5％CO₂雰囲気中、該トランスフェクション混合物と共に37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、10％ウシ胎児血清（FCS）と80nMクロロキン（Sigma，St．Louis，MO）とを含有する3 mLのDMEM培地を、各フラスケットに加えた。細胞をさらに3.5時間インキュベートし、DMEM中の10％ジメチルスルホキシドで室温で２分間ショックを与え、PBS で１回洗浄し、10％FCSを含有するDMEM中で増殖させた。48時間後、トランスフェクトしたCOS細胞を氷冷洗浄緩衝液（25mM HEPES,pH7.5を含有するDMEM）で１回洗浄し、50pM[¹²⁵I]GDNFで補足された氷冷結合緩衝液（25mM HEPES，pH7.5と2 mg/mL BSAとを含有するDMEM）中、4℃で４時間インキュベートした。細胞を氷冷洗浄緩衝液中で６回洗浄し、2.5％グルタルアルデヒドで室温で５分間固定し、5 0％エタノールおよび70％エタノールで順次脱水し、NTB-2写真乳液（Eastman Ko dak）中に浸した。暗所中4℃で4〜５日間露光した後、該スライドを現像し、明視野および暗視野顕微鏡検査によりスクリーニングした。陽性プールの小分け推定GDNF受容体クローンを含有する単一のプールを同定した。このプールからのクローンを、60個のプレートに100コロニー/プレートの密度でプレーティングした。細胞を各プレートから擦り取り、L B中に採集し、37℃で4〜5時間増殖させた。前記のとおり、凍結ストックおよびD NA調製物を各プールから作製して、それぞれ100個の独立したクローンを含有する60個のサブプールを作製した。前記の方法により、これらの60個のサブプールのうちの２個が陽性であることを確認し、それらのプールからのクローンを低密度でプレーティングして、単コロニーの単離が可能となるようにした。単コロニー(384)を、それらの２個のサブプールのそれぞれから拾い、96ウェルプレート中の200μｌのLB中で６時間増殖させた。GDNFRを発現する単一のクローンを選択するために、それらの４個の96ウエルプレートを、16列および24段よりなる単一の大きなマトリックス中に配置した。各列中および各段中のウェルからの細胞を一緒にして、合計40個の混合物を得た。これらの混合物を10mL LB/Amp（100μｇ /mL）中で一晩増殖させ、Qiagen tip-20キットを用いてDNAを調製した。推定GDN F受容体クローンに関して分析したところ、３個の列混合物および３個の段混合物が陽性シグナルを示し、これは、９個の潜在的な陽性単一クローンを示唆している。それらの潜在的に陽性な単一クローンのそれぞれからのDNAを調製し、EcoRIおよびPStIで消化した。それらの９個の単一クローンの３個からのDNAは、同一の制限パターンを示し、一方、残りの６個は無関係であった。このことは、それらの３個が、GDNFRを含有する真正なクローンを代表することを示唆している。実施例３ DNA配列決定および配列分析陽性の単一クローンからのDNAを調製し、自動ABI373A DNAシークエンサー（Pe rkin/Elmer Applied Biosystems，Santa Clara，CA）とジデオキシ−ダイ−ターミネーター(dideoxy-dye-terminators)とを製造業者の指示に従い使用して配列決定した。GDNF受容体配列とすべての入手可能な公開データベースとの比較を、 University of Wisconsin Genetics Computer Groupパッケージ（Program Manua l for the Wisconsin Package，Version 8，1994年9月，Genetics Computer Gro up，Madison，Wisconsin）に記載されているとおりにFASTA（PearsonおよびLipm an，Proceedings Of The National Academy Of Sciences U.S.A.，85，2444-244 8，1988）プログラムアルゴリズムを使用して行なった。ラットGDNFRの配列の特徴づけ前記実施例２に記載のタローンからのプラスミドDNAを調製し、DNA配列分析に提出した。クローニングされた2138bpのラットcDNAのヌクレオチド配列分析は、 468アミノ酸残基の翻訳タンパタ質をコードする単一の大きなオープンリーディングフレームを示した（図３）。該コード配列は、301bpの５'非翻訳領域と、潜在的なポリアデニル化部位を含有しない430bpの3'非翻訳領域とに隣接している。塩基対302にある最初のATGの上流のインフレーム停止コドンの存在およびその周囲のヌクレオチド環境は、このメチオニンコドンが、十中八九、翻訳開始部位であることを示している（Koza k,Nucleic Acids Research．15，8125-8148,1987）。該ラットcDNAクローン中の3'非翻訳配列の430ヌクレオチド中に、ポリアデニル化シグナルは見出されない。これは驚くべきことではない。なぜなら、ノーザンブロットのデータは、最も短いmRNA転写産物が約3.6kbであることを示しているからである。該GDNFRポリペプチド配列は、分秘シグナルペプチドの特徴を有する約19残基（メチオニン-１〜アラニン-19、図３）のN 末端疎水性領域を有する（von Heijine,Protein Sequences And Data Analysis ．1，41-42，1987;Von Heijine，Nucleic Acids Research．14，4683-4690，198 6）。膜貫通ドメインとして機能しうる内部疎水性ドメインは見出されなかった。その代わりに、21残基（図３中のロイシン-448〜セリン-468）のカルボキシ末端疎水性領域が存在し、これは、細胞質膜に対する該受容体のグリコシル−ホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーに関与している可能性がある。３個の潜在的なN結合グリコシル化部位の存在を除き、保存配列も構造モチーフも見出されなかった。該タンパク質はシステイン（468個のアミノ酸残基のうちの31個）に非常に富み、それらの間隔（spacing）は、公知受容体の細胞外部分に見出されるシステインに富むドメインと共有されていない。 FASTAを用いて、該GDNFR配列を、入手可能な公開データベース中の配列と比較した。その検索は、他の公開されている配列に対する有意な相同性を示さなかった。該ラットcDNAクローンを得たら、それを放射能標識し、後記実施例５に記載のとおりにヒト脳黒質から調製したcDNAライブラリーをプローブするのに使用した。実施例４ GDNFRを発現する細胞に対するGDNFの結合 Jingら（Journal Of Ce1l Biology，110，283-294，1990）に既に記載されているアッセイ法に従い、結合アッセイを行なった。該アッセイは、GDNFRを発現するようにトランスフェクトされているラット光受容体細胞、COS7細胞または29 3T細胞に対する[¹²⁵I]GDNFの結合を含むものであった。293T細胞の表面上で発現された組換えGDNFRは、ラット網膜細胞上のGDNF結合部位で認められる親和性に匹敵する親和性で特異的にGDNFに結合する能力を有していた。前記実施例１に記載のとおり、ラット光受容体細胞を調製し、該アッセイの2 〜3日前に、ポリオルニチンとラミニンとで予めコーティングされた24ウェルのC ostar組織培養プレート中に5.7×10⁵細胞/cm²の密度で播いた。COS7細胞を、該アッセイの１日前に2.5×10⁴細胞/cm²の密度で播き、DEAE−デキストラン−クロロキン法（AruffoおよびSeed，Proceedings Of The National Academy Of Scien ces U.S.A.，84，8573-8577，1987）により10〜20ngのプラスミドDNAでトランスフェクトした。各皿から細胞を取り出し、該トランスフェクションの24時間後に、 24ウェルCostar組織培養プレートの30個のウェル中に再び播き、さらに48時間増殖させた。ついで細胞を氷上に5〜10分間放置し、氷冷洗浄液で１回洗浄し、未標識GDNFの存在下または不存在下で種々の濃度の[¹²⁵I]GDNFを含有する0.2mLの結合緩衝液と共に4℃で４時間インキュベートした。細胞を0.5mLの氷冷洗浄緩衝液で４回洗浄し、0.5mLの1M NaOHで溶解した。該ラィセートを、1470 Wizard自動ガンマカウンター中で計数した。いくつかの結合実験には、一過性にトランスフェクトされた293T細胞を使用した(293T細胞トランスフェクションに関する後記を参照されたい)。トランスフェクションの２日後、2×バーサイン（versine）により皿から細胞を取り出した。細胞をペレット化し、氷冷結合緩衝液で１回洗浄し、氷冷結合緩衝液中で3×10⁵ 細胞/mLの密度で再懸濁した。該細胞懸濁液を、1.5×10⁵細胞/サンプルを含有するアリコートに分割した。ついで細胞をペレット化し、500nMの未標識GDNFの存在下または不存在下で種々の濃度の[¹²⁵I]GDNFと共に、穏やかに攪拌しながら4 ℃で４時間インキュベートした。細胞を氷冷洗浄緩衝液で４回洗浄し、0.5mL洗浄緩衝液中に再懸濁した。２個の0.2mLの該懸濁液アリコートをガンマカウンター中で計数して、該細胞に結合した[¹²⁵I]GDNFの量を測定した。すべてのアッセイにおいて、重複サンプル（そのうちの一方は、500nMの未標識GDNFを含有する）を用いて非特異的結合を測定した。非特異的結合のレベルは、未標識GDNFの不存在下で測定した特異的結合の10％〜20％の範囲の種々の値となり、それを特異的結合から差し引いた。このアッセイは、細胞をGDNFR cDNAクローンでトランスフェクトしなければ、該細胞はGDNFに結合しないことを示した。実施例５ GDNFR mRNAの組織分布胚マウス、成体マウス、ラットおよびヒト組織におけるGDNFR mRNAの発現のパターンを、ノーザンブロット分析で調べた。Ramdom Primed DNA Labeling K it（Boehringer Mannheim Indianapolis，IN）を製造業者が示す手順に従い使用して、クローニングされたラットGDNFR cDNAを標識した。ラット、マウスおよびヒトの組織RNAブロット（Clontech，Palo Alto，CAから購入）を該プローブにハイブリダイズさせ、ExpressHyb Kit(Clontech)の試薬を製造業者の指示に従い使用して洗浄した。成体ラット、マウスおよびヒトの組織から調製した組織ノーザンブロットは、 GDNFR mRNAが、肝臓、脳および腎臓内で最も高度に発現されることを示した。また、肺内でも高いmRNA発現が検出され、脾臓、腸、精巣および骨格筋内では低いか又は検出不能な量であった。マウス胚から単離したmRNAから作製したブロットでは、発現は胚７日目には検出不能であり、E11日目では明らかとなり、E17日目までに非常に高くなった。GDNFR mRNAは、ヒト成人の脳のいくつかの亜領域から単離された組織中では比較的に等しいレベルで発現された。ヒト成人の脳内での GDNFR mRNAの発現は、いすれかの特定の領域に対する特異性をほとんど示さなかった。ほとんどの組織では、２個の異なるサイズの転写産物が存在した。マウスおよびヒトの組織では、8.5および4.4kbの転写産物が見出され、一方、ラットでは、転写産物は8.5kbおよび3.6kbであった。その大きい方および小さい方の転写産物の相対量は組織型によって異なっており、小さい方の転写産物は肝臓および腎臓内で優勢であり、大きい方は脳内でより豊富にあった。pBKRSVベクター中のGDNF R cDNAクローンでトランスフェクトした293T細胞に対するGDNFの結合を、スキャッチャード分析で調べた。２つのクラスの結合部位が検出され、一方は小さいピコモルの範囲の結合親和性を有し、もう一方は約500pMの親和性を有していた。実施例６組換えヒトGDNFR バクテリオファージgt10中でクローニングしたヒト成人の黒質cDNAライブラリー（5'伸長およびcDNAライブラリー、Clontech，Palo Alto，CA）を、実施例１のラットGDNFR cDNAクローンをプローブとして用いてスクリーニングした。Rand om Primed DNA Labeling Kit（Boehringer Mannheim Indianapolis，IN）を製造業者の指示に従い使用して、該プローブを[³²P]dNTPで標識した。ヒト黒質cDNA ライブラリーからの約1.2×10⁶個のgt10ファージを15cmアガロースプレート上にプレーティングし、二重ニトロセルロースフィルター上に複写した。ついで該放射能標識プローブとのハイブリダイゼーションにより、該フィルターをスクリーニングした。該フィルターを、200mLの6×SSC、1×デンハルト溶液、0.5％SDS、 50μｇ/mLサケ精子DNA中、55℃で3.5時間プレハイブリダイズさせた。２×10⁸cp mの放射能標識プローブを加えた後、ハイブリダイゼーションを18 時間継続した。ついでフィルターを、55℃の0.5×SSC、0.1％SDS中で２回、それぞれ30分間洗浄し、増感紙を用いてX線フィルムに一晩露出した。ヒトGDNFR cDNAの一部に相当するcDNA挿入断片を有する５個の陽性プラークを単離した。図３に示すラットGDNFRの核酸配列（bp0〜2140）と比べて、５個のヒトGDNFRクローンは以下の配列を含有することが判明した。図５に示すとおり、それらの配列のアラインメントおよび比較から、ヒトGDNF Rのコンセンサス配列が得られた。ヒトcDNA配列により予想される翻訳産物は、4 65アミノ酸よりなり、ラットGDNFRと93％同一である。完全長GDNFRをコードするヒトcDNAを作製するために、クローン21Bおよび２の一部を内部BgIII部位で互いにスプライシングし、哺乳動物発現ベクターpBKRSV(Stratagene,La Jolla，CA)中にサブクローニングした。哺乳動物細胞中での発現のために、組換えヒトGDNFR発現ベクターを調製することができる。前記のとおり、発現は、細菌細胞などの非哺乳動物細胞においても可能てある。商業的に入手可能なヒト胎児腎細胞系「293」を含む哺乳動物細胞中での発現のために、本明細書に開示する核酸配列を、商業的に入手可能な哺乳動物ベクター（例えば、CEP4，Invitrogen）中に配置することができる。細菌細胞中での発現のためには、典型的には、リーダー配列をコードする部分（例えば、図１の核酸配列1〜590）を除去することになろう。細菌性発現のために、N 末端に追加的なメチオニルを付加することができる。さらに、天然リーダー配列を、異なるリーダー配列、または発現を容易にするための切断用の他の配列で置換することができる。実施例７可溶性GDNFR構築物可溶性ヒトGDNFRタンパク質産物を製造した。以下の実施例は、図２に示す残基番号で表される、カルボキシ末端でのみ相違する４個の異なる形態を提供する。そのうちの２個は、最後のシステイン残基からの疎水性テイルの直ぐ上流の種々の位置でトランケート化している可溶性形態である。残りの２つは、同じトランケート化体であるが、オクタペプチドである「FLAG」配列の付加を有し、このオクタペプチドに対する市販の抗体（Eastman Kodak）が入手可能である。FLAG配列は、H2N-DYKDDDDK-COOH である。方法ヒトGDNFRのほぼ完全なコード領域を含有するラムダファージクローン#21を、 EcoRIで消化して、cDNA挿入断片を切り出した。この断片を精製し、EcoRIで切断されたpBKRSVベクター（Stratagene，La Jolla，CA）中に連結してクローン21-B -3/pBKRSVを得た。鋳型としての該ヒトGDNFRクローン21-B-3/pBKRSVと共に、後記に示すプライマー１および２をPCR反応で使用した。PCR条件は、94℃で５分、ついで94℃で１分、55℃で１分、72℃で２分の25サイクル、および72℃で５分の伸長であった。これにより、ヒトGDNFRクローンおよび終止コドンのヌクレオチド1265〜1868ならびにプライマー２により付与されるHindIII制限部位よりなる断片を得た。この断片を制限酵素HindIII（プライマー２中に含有）およびBgIII （ヒトGDNFR中の1034位）で消化し、得られた572ヌクレオチド断片をゲル電気泳動により単離した。この断片は、イソロイシン-255〜グリシン-443のhGDNFRコード領域を含有していた。プライマー１および３で同様の方法を用いて、イソロイシン-255〜プロリン-446をコードするBglIIおよびHindIII末端を有する断片を得た。hGDNFRの同じ領域およびプライマー１および３をコードするかFlagペプチドコード配列の付加を有する断片を産生するように、プライマー４および５を設計した(IBI/Kod ak,New Haven，CN）。Flagペプチド配列は８個のアミノ酸（H2N-Asp-Tyr-Lys-As p-Asp-Asp-Asp-Lys-COOH）よりなり、それに対する抗体は商業的に入手可能である。プライマー１および４または１および５を、前記と同じ鋳型と共にPCR反応で使用し、前記のとおりにHindIIIおよびBglIIで消化した。この方法により、イソロイシン-255〜グリシン-443およびイソロイシン-255〜プロリン-446をコードし、それらのカルボキシ末端にFlagペプ４チドの付加を有する断片が得られた。プライマー前記のとおりに得た全４個の断片を、21B3/pBKRSV中に再導入した。該21B3/pB KRSVクローンをBglIIおよびHindIIIで消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）で処理した。該ベクターとBgIII部位までのヒトGDNFRコード領域とを含有する大きな断片をゲル精製し、ゲルから抽出した。前記のとおりに得た４個の BglII/HindIII断片のそれぞれをこのベクター中に連結して、pBKRSV中の以下の構築物を得た。全クローンが正しく構築されていることを、DNA配列決定により確認した。pBK RSVクローンからの挿入断片を、後記のpBKRSVポリリンカー配列中に存在する酵素部位を用いて他の発現ベクターに導入した。また、可溶性GDNFR(例えば、sGDN FR/glyおよびsGDNFR/pro)が、一過性発現用ベクター中に、また、CHO細胞中での安定発現のためのpDSR-2中に導入されている。pDSR α2+PLクローン：適当なpBKRSVクローンをXbaIおよびSalIで消化する。該挿入断片を、同じ酵素で切断されCIAPで処理されたpDSRα2+PLに連結する。CHO細胞中でのGDNFRの安定発現のために、この構築物を使用することができる。pCEP4 クローン：適当なpBKRSVクローンをSpeIおよびXhoIで消化する。該挿入断片を、NheI（Sp eI末端）およびXhoIで消化されCIAPで処理されたpCEP4(Invitrogen,San Diego,C A)に連結する。GDNFRの一過性発現のために、この構築物を使用することができる。プラスミド構築物pDSR-2は、1990年３月29日付け出願の共有同時係属米国特許出願第501,904号（1990年５月18日付け出願の欧州特許出願第90305433号，公開第EP 398 753号およびWO 90/14363 (199 0)も参照されたい）に記載の方法に実質的に従うことにより調製する。GDNFR類似体をコードする種々の核酸配列が使用可能であると当業者には理解される。もう１つの構築物は、プラスミドpCD（Okayama & Berg,Mol．Cell Biol．3:28 0-289，1983）の誘導体であるpDSRα2であり、これは以下の３つの主要な修飾を有する：（ｉ）SV40ポリアデニル化シグナルが、ウシ濾胞刺激ホルモンのα−サブユニットα-bFSH(Goodwinら,Nucleic Acids Res.11:6873-6882,1983)からのシグナルで置換されている、（ii）マウスジヒドロ葉酸レダクターセミニ遺伝子（ Gasserら，Proc．Natl．Acad．Sci．79:6522-6526，1982）が、形質転換体の選択および増幅を可能にするように発現カセットの下流に挿入されている、および（iii）「R要素」とヒトT細胞白血病ウイルス１型（HTLV-1）のロングターミナルリピート（LTR）の「U5」配列の一部とを含有する267bpの断片が、SV40プロモーターと、既に記載されているスプライスシグナル（Takebeら，Mol．Cell Biol ．8:466-472,1988）との間にクローニングされ挿入されている。 CHO細胞中でのGDNFRの発現は、該細胞表面に対するヨウ素化GDNFの結合により確認されている。前記のとおり、組換え的に発現された可溶性GDNFRタンパク質産物を使用して、GDNFの活性または細胞特異性を増強することができる。また、検出可能な標識に結合している可溶性GDNFRを、前記のとおり、診断用途で使用することができる。実施例８ GDNFとGDNFRとの化学的架橋その結合特性および分子的特徴を研究するために、該ラットcDNAクローンのトランスフェクションにより、293T細胞の表面上でGDNFRを一過性に発現させた。リン酸カルシウムトランスフェクション系（Calcium Phosphate Transfection S ystem）（GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD）を製造業者の指示に従い使用して、29 3T細胞のトランスフェクションを行なった。トランスフェタションの２日後、細胞を2×バーサイン（versine）処理により取り出し、洗浄緩衝液で１回洗浄し、洗浄緩衝液中に2×10⁶細胞/mLの密度で再懸濁した。重複した細胞セットを、[¹² ⁵ I]GDNF結合の前に、0.5u/mL PI-PLCと共に37℃で30分間インキュベートした。これらの細胞を氷冷結合緩衝液で３回洗浄し、ついで1〜3nM[¹²⁵I]GDNFおよび他の細胞と共に4℃で４時間インキュベートした。細胞を氷冷洗浄緩衝液で４回洗浄し、架橋用の1mMビススベラート（Bis suberate）（BS³ Pierce，Rockford，IL）で補足された洗浄緩衝液中に再懸濁し、室温で30分間インキュベートした。TBSでの３回の洗浄後、重複した１群のサンプルを、0.5u/mLのPI-PLCにより37℃で30分間処理した。これらの細胞をペレット化し、該上清を集めた。ついで該細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、すべての他の細胞と共に2×SDS-PAGEサンプル緩衝液で溶解した。該細胞ライセートおよび集めた上清を、7.5％SDS-PAGE上で分離した。該細胞懸濁液を、1.5×10⁵細胞/サンプルを含有するアリコートに分割した。ついで細胞をペレット化し、500nMの未標識GDNFの存在下または不存在下、種々の濃度の[¹²⁵I]GDNFと共に、穏やかに攪拌しながら4℃で４時間インキュベートした。細胞を氷冷洗浄緩衝液で４回洗浄し、0.5mL洗浄緩衝液に再懸濁させた。該懸濁液の２個の0.2mLアリコートをガンマカウンター中で計数して、該細胞に結合した[¹²⁵I]GDNFの量を測定した。模擬トランスフェクトした293T細胞は、GDNF結合能を何ら示さなかったが、GD NFRでトランスフェクトした細胞は、ピコモルの濃度においても[¹²⁵I]GDNFに強力に結合した。この結合は、500nMの未標識GDNFにより、ほぼ完全に阻害された。このことは、発現された該受容体に対する天然GDNFの特異的結合を示している。 293T細胞により発現されたGDNFRは、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ(PI-PLC,Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)での処理により該細胞から遊離させることができる。トランスフェクトした細胞をリガンド結合の前にPI-PLCで処理すると、該細胞のGDNF結合能がほぼ完全に喪失した。また、架橋後のトランスフェクト化細胞の処理は、大多数の架橋産物を培地中に遊離させた。これらの結果は、GDNFRがGPI結合により細胞膜にアンカーされていることを強く示唆している。架橋データはさらに、GDNFRの分子量が約50〜65kDであることを示し、このことは、低レベルのグリコシルか存在することを示唆している。架橋された主要な種は、該受容体の単量体に符合した分子質量を有するが、二量体と予想されるものとほぼ等しい質量を有する少量の種が見出されている。実施例９ GDNFシグナル伝達はGDNFRとRet受容体タンパク質チロシンキナーゼとの複合体により媒介される序論 GDNF遺伝子中に標的ヌル突然変異を保持するマウスは、神経堤細胞由来の組織中、自律神経系中、および三叉神経および脊髄運動ニューロン中の種々の欠損を示す。最も重篤な欠損は、腎臓の不存在および消化管内の腸ニューロンの完全な喪失である。GDNFノックアウトマウスの表現型は、c-retノックアウト動物の表現型に著しく類似しており（Schuchardtら，1994）、このことは、GDNFのシグナル伝達経路とc-retとの間の可能な連関を示唆している。原癌遺伝子c-retは、遺伝子導入実験において単離された癌遺伝子に由来するプローブを使用して同定された（Takahashiら，Cell．42，581-588，1985; Taka hashiおよびCooper，Mol．Cell.，7，1378-1385，1987）。c-ret cDNAの配列分析は、新規受容体タンパク質型チロシンキナーゼ(PTK)をコードする大きなオープンリーディングフレームを示した。受容体PTKのファミリーは、細胞外ドメインの構造および細胞内キナーゼドメイン内の配列相同性に基づいて、いくつかのサブファミリーに分類されている（ van der Geerら，1994）。Retは、独特の細胞外ドメイン構造を有するため、公知のいずれの受容体PTKサブファミリーにも含まれない。それは、シグナルペプチド、カドヘリン様モチーフ、およびシステインに富む領域を含む（van Heynin gen，Nature，367，319-320，1994;Iwamotoら，1993）。in situハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学的分析は、中枢神経系および末梢神経系の発達において、およびマウス胚の排泄系において、ret mRNAおよびタンパク質の高レベルの発現を示し(Pachnisら，1993;Tsuzukiら，Oncogene，10,191-198，1995）、このことは、この発達における、あるいはこれらの組織の機能におけるRet受容体の役割を示唆している。Ret受容体の機能的リガンドは未だ同定されていないため、Retシグナル伝達の分子メカニズムに関する更なる理解が制限されている。c -rat遺伝子中の突然変異は、家族性髄様甲状腺癌（FMTC）ならびに多内分泌腺新生物2A型（MEN2A）および2B（MEN2B）における癌に対する遺伝的素因に関連している。これらの疾患は、おそらく、Retキナーゼを構成的に活性化する「機能の獲得（gain of function）」突然変異により引き起こされるのであろう（Donis-Kellerら，Hum．Molec．Genet．2，851-856，1993;Hofstraら，Nat ure．367，375-376，1994;Mulliganら，Nature．363，458-460，1993;Santoroら，Science．267，381-383，1995）。それらは、特に、神経堤（この部位では、通常初期発達においてretが発現される）由来の組織における悪性疾患に対する素因を付与する。もう１つのret関連遺伝的障害であるヒルシュシュプルング病（HSCR）は、下部胸管内の副交感神経支配の先天的な不存在により特徴づけられる（Ederyら，Nature．367，378-380，1994;Romeoら，1994）。HSCRの最も可能性の高い原因は、キナーゼドメインを欠くトランケート化Retタンパク質の産生を引き起こすナンセンス突然変異、またはRetキナーゼを不活性化するミスセンス突然変異である。前記のとおり、マウスにおけるc-ret原癌遺伝子の標的化破壊は、腎臓の無発生または重篤な発育不全、および消化管の全体にわたる腸内ニューロンの欠如を引き起こす（Schuchardtら，1994）。この表現型は、GDNFノックアウトマウスの表現型と非常に類似している。総合すると、これらのデータは、RetおよびGDNFが共に、腎臓および腸神経系の発達に決定的に重要なシグナル伝達経路に関与していることを示唆している。しかしながら、どのようにしてRetおよびGDNFが関与しているかは知られていない。前記のとおり、発現クローニングによるGDNFRのcDNAの単離および特徴づけは、形質転換されたヒト胎児腎細胞系293T中でのGDNFRの発現につながった。形質転換は、高い親和性（約2pMのKd）および低い親和性（約200pMのKd）の両方の結合部位の出現をもたらした。高い親和性の結合部位は、GDNFRのみのホモ二量体またはホモオリゴマーよりなることや、GNFRと他の分子とのヘテロ二量体またはヘテロオリゴマーよりなることが可能であろう。前記のとおり、GDNFRは細胞質ドメインを欠くため、GDNFシグナル伝達において一定の役割を果たすためには、 GDNFRは１以上の補助分子により機能するに違いない。本研究において、本発明者らは、GDNFが、GDNFRの存在下、Retタンパタ質チロシンキナーゼ受容体に結合し、Retの自己リン酸化を迅速に誘導することを確認する。結果 GDNFR を発現するNeuro 2a細胞はGDNFに高い親和性で結合する Neuro 2aは、高レベルのRetタンパク質を内因的に発現するマウス神経芽細胞腫細胞系であるが（Ikedaら，Oncogene．5， 1291-1296，1990;Iwamotoら，Oncogene．8，1087-1091，1993;TakahashiおよびC ooper，1987）、ノーザンブロットによる判定では検出可能なレベルのGDNFR mRN Aを発現しない。GDNFRの存在下でRetがGDNFに結合しうるか否かを確認するために、GDNFRを発現するように操作したNeuro 2a細胞に対する[¹²⁵I]GDNFの結合を調べるための研究を行なった。Neuro 2a細胞に、ラットGDNFR cDNAを含有する哺乳動物発現ベクター（例えば、前記の発現プラスミド）をトランスフェクトした。３個のクローン系（NGR-16、NGR-33およびNGR-38）を、［¹²⁵I]GDNFに対するそれらの結合能に関して試験した。未結合の[¹²⁵I]GDNFをインキュベーション終了時に取り出し、該細胞に結合している放射能の量を測定した（「実験方法」に記載のとおりに行なった）。３個すべての系が、［¹²⁵I]GDNFに特異的に結合する能力を有していた。一方、親Neuro 2a細胞は、[¹²⁵I]GDNF結合をほとんど又は全く示さなかった（図６）。500nMの未標識GDNFの添加により、結合を有効に競合させることができた。これらの結果は、Neuro 2a細胞上で発現されたRet受容体が、GDNFRの不存在下ではGDNFに結合する能力を有していないことを示しており、容易に感知可能なレベルではGDNFRがNeuro 2a 細胞中で発現されないという従来の観察と一致している。 NGR-38細胞に対する[¹²⁵I]GDNFの平衡結合を、広範囲のリガンド濃度(500nMの未標識GDNFの存在下または不存在下の0.5pM〜1nMの[¹²⁵I]GDNF)にわたって調べた（図7Aを参照されたい）。インキュベーション後、未結合[¹²⁵I]GDNFを取り出し、該細胞に結合した放射能を測定した（「実験方法」に記載のとおりに行なった）。結果を図７に示す：(A)未標識GDNFの存在下（白丸および白正方形）または不存在下（黒丸および黒正方形）でのNGR-38細胞（丸）およびNeuro 2a細胞（正方形）に対する[¹²⁵I]GDNFの平衡結合；(B)NGR-38細胞に対する[¹²⁵I]GDNF結合のスキャッチャード分析。Neuro 2a細胞は、1nMの［¹²⁵I]GDNF濃度においても、ほとんど結合を示さず、この結合は、過剰な末標識GDNFの添加により影響されなかった。図7Bに示すとおり、NGR-38細胞に対する結合を、スキャッチャードプロットにより分析した。２つのクラスの結合部位（その一方はKd＝1.5±0.5pM、他方はKd＝332±53pM）を検出した。これらの解離定数は、GDNFRを発現する293T 細胞において高い親和性および低い親和性の結合部位に関して前記のとおりに得た値と非常に類似している。GDNFR を発現するNeuro 2a細胞においてGDNFはRetと会合する GDNFRを発現する細胞においてRet受容体PTKがGDNFと会合するか否かを確認するために、NGR-38および親Neuro 2a細胞を使用して架橋実験を行なった。NGR-38 細胞を[¹²⁵I]GDNFと共にインキュベートし、架橋試薬で処理し、ついでSDS-PAGE サンプル緩衝液中またはTriton X-100溶解試薬で直接的に溶解し、さらに抗Ret 抗体で免疫沈降させた（「実験方法」に記載のとおりに行なった）。該免疫沈降物を、メルカプトエタノールの不存在下（NR）または存在下（R）、SDS-PAGEにより分析した。ライセートをRet特異的抗体で処理し、免疫沈降させ、還元条件下でSDS-PAGEにより分析した（図８参照、バンドの表示は以下のとおり：〜75kD ）黒三角；〜150kD、白三角；〜185kD）黒矢印；〜250kD、アステリスタ；〜400 kD、白矢印）。最も著明な架橋種は〜75kDおよび〜185kDにあり、それほど強くないバンドが〜150kDおよび〜250kDにある。非常に不鮮明なバンドも認められる（図8、レーン2）。免疫沈降物を非還元SDS-PAGEにより分析すると、〜75kD、〜 150および〜185kDバンドは還元ゲルとほぼ同じ強度で存在したが、〜400kDのバンドの量は劇的に増加した（図8、レーン4）。また、〜250kDのバンドも、より著明になった。 NGR-38の代わりに親Neuro 2a細胞を使用した場合、還元および非還元条件下で、同様の分子量であるが強度が大きく低下したバンドが認められた（図8、レーン１および３）。〜75kDおよび〜150kDの種は、GDNFとGDNFRとの架橋複合体を表しているらしい。なぜなら、Retを発現しない293T細胞中で、架橋により、同一の分子量を有する種が産生されるからである。さらに、Retの分子量は170kDであるため、Retを含む任意の複合体は、少なくともこのサイズでなければならない。これらの複合体が抗Ret抗体により免疫沈降されるという事実は、それらが、該ゲル分析の条件下で破壊された、RetとGDNF/GDNFR複合体との結合の産物であることを示している。〜185kDの広いバンドは、いくつかの二量体GDNFを含んでいるかもしれないが、おそらく、単量体組換えGDNF（15kD）の１分子と架橋されたRet（170kD）の１分子よりなると考えられる。この種中のRetの存在は、別の実験により確認した。その実験において、未標識GDNFをNGR-38細胞に架橋させ、該産物をウエスタンブロットにより抗Ret抗体で検査したところ、同じ分子量のバンドが認められた（データは示していない）。〜400kDのバンドは、確実には同定できなかった。それは、１つには、その分子量を推定するのが困難であったからである。それが非還元条件下でのみ著明であるという事実は、それが、還元条件下で認められる１以上の種のジスルフィド結合二量体であることを示している。それは、２個のRet、１個または２個のGDNFR および１個または２個のGDNF分子よりなる高分子量複合体の混合物かもしれないが、最も可能性の高い説明は、それが、185kDの種の二量体を表しているというものである。〜250kDのバンドの正確な実体は未だ決定されていない。１つの可能性は、それが、〜75kD（GDNF＋GDNFR）複合体と〜185(GDNF＋Ret)複合体との架橋ヘテロ二量体を表しているというものである。GDNFR を発現するNeuro 2a細胞においてGDNFはRetの自己リン酸化を刺激する Retタンパク質チロシンキナーゼ受容体がGDNFRの存在下でGDNFと結合しうることは、Retの自己リン酸化のGDNF刺激の研究につながった。NGR-38細胞をGDNFで処理し、溶解し、該ライセートを抗Ret抗体で免疫沈降させた。「実験方法」に記載のとおり、該免疫沈降物を、抗ホスホチロシン抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した。哺乳動物（CHO細胞；図9A、レーン4）または大腸菌（E.coli）細胞（図9A、レーン1、3）のいずれかにおいて産生された精製組換えGDNFでNGR-38細胞（図9A、レーン2〜4）を処理したところ、170kDに強力なバンドが認められ、これは、Retの成熟形態上のチロシン残基の自己リン酸化を示している。はるかに弱い対応バンドが、GDNFで処理したNeuro 2a細胞で認められた（図9A、レーン1）。Retの代替的に（alternatively）グリコシル化された150kDの前駆体形態上では、リン酸化は認められなかった（図9A）。GDNFによるRetの自己リン酸化の誘導は、用量依存的であった。NGR-38細胞においてGDN Fにより誘導されるRetチロシンリン酸化の用量反応および速度論を、パネルＢおよびＣに示す。すべてのパネルにおいて、チロシンリン酸化された170kDのRetのバンドを、黒矢印で示す。抗Ret抗体（Santa Cruz，C-19，Cat．#sc-167）での該免疫ブロットの再プローブにより測定した、各レーン中にローディングされた Retタンパク質の量を、パネルＡの右側に示す。〜150kDのバンドは、自己リン酸化しないRetの代替的にグリコシル化された未熟形態を表す。図9Bに示すとおり、NGR-38細胞におけるRet自己リン酸化の刺激は、 50pg/mlのGDNFで検出することができ、その反応は20〜50ng/mLのGDNFで飽和した。処理後0〜20分にわたるNGR-38細胞における精製組換えGDNFによるRet自己リン酸化の刺激を、図9Cに示す。Ret自己リン酸化のレベルの増加は、GDNF処理の１分以内に認めることができ、処理後10分で最大になった(図9A)。GDNF および可溶性GDNFRはNeuro 2A細胞においてRet自己リン酸化を誘導する前記のとおり、GDNFRは、GPI結合により、細胞質膜にアンカーされており、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーセ(PI-PLC)での処理により遊離されうる。NGR-38細胞をPI-PLCと共にインキュベートすると、これらの細胞におけるGDNFにより誘導されるRetの受容体自己リン酸化は妨げられた（図10A;「実験方法」に記載のとおり、PI-PLCで処理された（レーン１）または処理されなかった(レーン２および３)NGR-38細胞を、GDNFと共に(レーン１および３)またはGDNF 無しで（レーン2）インキュベートし、免疫ブロット法によりRet自己リン酸化に関して分析した）。図10Bは、「実験方法」に記載のとおりに免疫ブロット法によりRet自己リン酸化に関して分析した、Neuro 2aまたは NGR-38細胞から得たPI-PLC/CMの存在下（レーン5〜8）または不存在下（レーン1 〜4）でGDNFで処理した（レーン2、4、6、8）または処理しなかった（レーン1、 3、5、7）親Neuro 2A細胞を示す。GDNFで処理したNGR-38細胞を陽性対照として使用した。ＡおよびＢの両パネルにおいて、自己リン酸化された170kDのRetのバンドを黒矢印で表示する。NGR-38のPI-PLC処理により遊離した可溶性GDNFRを含有する調整培地（conditioned）（PI-PLC/CM）をGDNFと共に親Neuro 2a細胞に加えたところ、NGR-38細胞のGDNF処理で得られたものに匹敵するRet受容体の自己リン酸化が認められた（図10B、レーン２および８）。GDNFを加えない場合またはNeuro 2a細胞のPI-PLC処理に由来する調整培地を試験した場合には、Ret自己リン酸化のバッタグラウンドレベルしか認められなかった（図10B、レーン3〜7 ）。Ret-Fc 融合タンパク質は、GDNFおよび可溶性GDNFRにより誘導されるRetリン酸化を阻止する GDNFRの存在下でGDNFにより誘導されるRetリン酸化が、受容体の自己リン酸化によるものであることを確認するために、Ret細胞外ドメイン／免疫グロブリンF c（Ret-Fc）融合タンパク質が、Retの活性化を阻止しうるか否かを判定するための研究を行なった。NGR-38細胞上で発現される多数のGDNFα受容体を遮断することが技術的に困難であるため、PI-PLCで処理したNGR-38細胞から取り出した培地をGD NFR源として、Neuro 2aを標的細胞として使用して、Ret自己リン酸化アッセイを行なった。図11に示すとおり、GDNF（50ng/mL）、可溶性GDNFRを含有する培地（例えば、NGR-38細胞由来のPI-PLC/CM）および種々の濃度のRet-Fc融合タンパク質を単独または種々の組合わせで含む混合物で、細胞を処理した。GDNF、可溶性 GDNFR含有培地、Ret-Fcまたはプレインキュベートした混合物で、Neuro 2a細胞を処理した。ついで該細胞を溶解し、抗Ret抗体を使用する免疫沈降法によりc-R et自己リン酸化に関して該ライセートを分析した（「実験方法」に記載のとおりに行なった）。該免疫沈降物を、抗ホスホチロシン抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した。 GDNFと可溶性GDNFR含有培地とのプレインキュベーション混合物は、GDNFで処理されたNGR-38対照細胞に匹敵するレベルで、Neuro 2a中で発現されるRet受容体のチロシンリン酸化を誘導した(図11、レーン２および７)。自己リン酸化された170kDのRetのバンドの位置を、黒矢印で表示する。Ret-Fc融合タンパク質をプレインキュベーションGDNF/GDNFR混合物中に含めた場合には、Ret自己リン酸化は用量依存的に阻害された（図11、レーン8〜10）。これは、Retリン酸化が、GDNFRにより媒介されるGDNF/Ret相互作用の結果であることを示した。未処理のNeuro 2a細胞、またはGDNFRの不存在下でGDNFまたはRet-Fc融合タンパク質のいずれかの組合せで処理した細胞では、バックグラウンドレベルのRet自己リン酸化しか認められなかった（図11、レーン3〜6）。GDNF は、胚運動ニューロン中で発現されたc-RETの自己リン酸化を誘導する脊髄運動ニューロンは、インビボにおけるGDNF作用の主要標的の１つである(H endersonら，Science.266，1062-1064，1994;Liら，Proceedings Of The Nation al Academy Of Sciences，U.S.A．92，9771-9775，1995;Oppenheimら，Nature． 373，344-346，1995;Yanら，Nature．373，341-344，1995;Zurnら，Neuroreport .6，113-118，1995）。これらの細胞においてGDNFがRetの自己リン酸化を誘導する能力を調べるために、胚ラット脊髄運動ニューロンを20ng/mLのGDNFで処理するか（レーン２および4）または処理せず（レーン１および３）、ついで該細胞を溶解し、抗Ret抗体で免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体によるウエスタンブロット法で分析した（「実験方法」に記載のとおりに行なった）。GDNF で処理した細胞のライセートにおいては、〜170kDの分子量を有するチロシンリン酸化タンパタ質のバンドが認められた（図12、レーン2）。結合緩衝液のみで処理した細胞では、そのようなシグナルは認められなかった（図12、レーン1）。同じウエスタンブロットフィルターを剥がし、抗Ret抗体で再プローブさせたところ（すなわち、各レーンにローディングされたc-Retタンパク質の量は、該免疫ブロットを該抗Ret抗体で再プローブすることにより測定した）、同じ分子量および同様の強度を有するバンドが両サンプルにおいて出現した（図12、レーン3および4）。GDNFで処理した細胞におけるホスホチロシンのバンドは、Retタンパク質のバンドと共に移動した。このことは、GDNFがRetの自己リン酸化を刺激したことを示している。自己リン酸化したRetバンド（レーン１および２）および対応するタンパク質バンド（レーン3および4）を黒矢印で表示する。考察ポリペプチド増殖因子は、それらに対応する細胞表面受容体に対する結合を介して、生物学的効果を惹起する。受容体は、それらの構造および作用メカニズムに基づいて、いくつかのクラスに分類することができる。これらの分類は、タンパク質チロシンキナーゼ（PTK）、セリン／トレオニンキナーゼ、およびサイトカイン受容体を含む。受容体型PTKのシグナル伝達は、リガンドとの直接的な相互作用により開始し、そのような相互作用は受容体の二量化またはオリゴマー化を誘導し、これが今度は受容体の自己リン酸化を引き起こす。ついで、活性化された受容体は、細胞内基質をリクルートしリン酸化し、最終的に生物学的反応に至る事象のカスケードを開始させる（SchlessingerおよびUllr ich，Neuron 9，383-391，1992）。これに対して、セリン／トレオニンキナーゼまたはサイトカイン受容体によるシグナル伝達は、リガンド結合成分とシグナル伝達成分とが別個である多成分の受容体複合体の形成を伴うことが多い。具体例としては、互いに分離している結合成分（II型）とシグナル伝達成分（Ｉ型）とよりなるセリン／トレオニンキナーゼ受容体であるTGF-受容体複合体、およびCN TFファミリーが挙げられる。CNTF、インターロイキン６（IL-6）および白血球阻害因子（LIF）は、共通のシグナル伝達成分である gp130および／またはLIFRを、それらのそれぞれの受容体複合体中に共有する。これらの複合体のリガンド特異性は、それぞれのリガンドに対する特異的結合サブユニットにより決定されるが、シグナル伝達は、リガンドとリガンド結合サブユニットとの開始複合体が、リガンドに直接的には結合できない他の受容体サブユニットと結合することを要する（Ipら，Cell．69，1121-1132，1992）。CNTF 受容体複合体では、リガンド結合成分はCNTF受容体（CNTFR）であり、これは、G DNFRと同様に、GPIでアンカーされる膜タンパク質である。本発明は、分離したリガンド特異的結合成分との結合に依存したリン酸化が生じる受容体型PTKの最初の具体例の記載を含む。本研究では、高い親和性でGDNFに結合するGPI結合膜タンパク質であるGDNFRが、Ret受容体型PTKとGDNFとの効率的な結合に必要であることを確認する。GDNFR の不存在下では、GDNFはRetに結合したり、あるいはRet受容体自己リン酸化を刺激する能力を有さない。GDNFRの存在下では、GDNFはRetに結合し、Retの自己リン酸化を用量依存的に迅速に誘導する。前記のとおり、GDNFRは、膜結合形態または可溶性形態のいずれかで機能しうる（図11）。50pg/mL（1.7pM）の濃度のGD NFは、 GDNFRを発現する細胞中でRetチロシンキナーゼを活性化しうる。これは、NGR-38 細胞上の高い親和性のGDNF結合部位に関して見出される解離定数（1.5pM）と符合する。GDNFによるRetの自己リン酸化の迅速な誘導（処理後１分で検出可能である）と、Ret-Fcが自己リン酸化を阻止しうることとは、Retが、下流におけるいくつかの他の受容体のリン酸化の結果としてではなく、直接的に活性化されていることを示唆している。架橋研究は、GDNFに対するRetの効率的な結合がGDNFRに依存するという仮説を支持している。高レベルのGDNFRを発現するNGR-38細胞におけるRetに対するGDNF の架橋は強固であるが、親Neuro 2a細胞においては、架橋産物はほとんど検出できない。該架橋複合体のすべての決定的な同定は困難であるが、該データは、Re tとGDNFとの会合がGDNFRの存在に依存すること、およびGDNFRが該架橋産物のいくつかに含まれることを明らかに示している。Neuro 2a中の少量の架橋種の存在の理由は明らかでない。Neuro 2a細胞におけるGDNFR mRNAの発現は、ノーザンブロットでは検出できなかったが、GDNFRがこれらの細胞中で非常に低いレベルで発現される可能性はある。培養ラット胚脊髄運動ニューロンにおいてRetがGDNFにより活性化されうるという事実は、Ret/GDNF相互作用の生物学的関連性を示すものである。これらの細胞は、インビボにおけるGDNFの主要標的であり、低用量のGDNF にインビトロで応答することが示されている（Hendersonら，1994）。運動ニューロン細胞をPI-PLCで前処理すると、Retのリン酸化の刺激が妨げられた（データは示していない）。このことは、GDNFによるRetの活性化にはGDNFRが必要であることを示唆している。受容体細胞外ドメインに対するリガンドの結合は、他の公知受容体PTKの活性化における第１段階であるが、本データは、これが、GDNFおよびRetには当てはまらないことを示している。図13は、GDNFRおよびRetに対するGDNFの結合と、その結果、GDNFに応答して生じるRet PTKの活性化とのモデルを示している。この過程の最初の事象は、ジスルフィド結合で連結されたGDNFの二量体が、単量体または二量体のいずれかの形態のGDNFRに結合することである。現在のところ、二量体のGDNFRの存在に関する直接的な証拠はないが、293T細胞にGDNFR cDNAをトランスフェクトすると、２つのクラスの結合部位が出現する。この観察に関する最も簡単な説明は、それぞれが独自のリガンド結合親和性を有する単量体および二量体のGDNFRの存在である。これは、GDNFの結合親和性が、見掛け上はRetの存在によっては影響されないという知見と符合している。本実験では、二量体のGDNFRが、GDNFの不存在下で、その単量体と平衡状態にあるか否か、あるいはGDNF結合により二量化が誘導されるか否かの問題を検討しないため、これらの可能性は代替経路として与えられている。二量体のGDNFRと二量体のGDNFとよりなる複合体は、２分子のRet に結合して、活性なシグナル伝達複合体を形成する。他のPTKに関しては、２つのRet分子の細胞内触媒ドメイン間の密接な接触が、受容体の自己リン酸化を引き起こすらしい。このメカニズムによりRetが機能するという見解は、Retの定常状態二量化を引き起こすMEN2A突然変異がRetキナーゼの構成的活性化を引き起こすという事実により裏付けられる（Santoroら，1995）。運動ニューロンは、わずか5fMのED₅₀でGDNFに応答すると報告されている（Hen dersonら，1994）。生物学的応答に関して結合親和性をED₅₀と比較することは困難であるが、非常に高い親和性のGDNF結合部位が、これらの細胞上に存在している可能性がある。胚ニワトリ交感神経ニューロンなどの他の細胞は、1〜5nMのKd でGDNFに結合すると報告されている（Truppら， Journal Of Cell Biology．130，137-148，1995）。そのような低い親和性部位についての受容体複合体にGDNFRが関与しているとは考えられないが、GDNFとRet との間の弱い直接的相互作用が存在するかもしれない。腸内神経系の細胞を含む発達中の中枢および末梢神経系の多数の細胞系統において、胚形成中にc-retの発現が認められている(Pachnisら，Development，119 ，1005-1017，1993;Tsuzukiら，1995)。神経系以外では、c-retの発現は、ウォルフ管、尿管芽上皮および腎臓の集合管で検出されている（Pachnisら，前掲;Ts uzukiら，1995）。また、Retの発現は、神経堤(Ikedaら，1990)および外科切除された神経芽細胞腫(Nagaoら，1990;Takahashi & Cooper，1987)に由来するすべての神経芽細胞腫細胞系で検出されている。GDNFの発現は、CNSおよびPNSの両方において、および肝発生中の非ニューロン組織において認められている。多数の非ニューロン組織で見出されるGDNF発現のレベルは、神経系のものより高い（Ch oi-LundbergおよびBohn，Brain Res．Dev．Brain Res．85，80-88，1995）。GDN FRの発現は広範には研究されていないが、最初のノーザンブロット分析は、成体ラットおよびマウスの肝臓、脳および腎臓中の高レベルのGDNFR mRNAの存在を検出した。発達中の神経系および腎臓におけるret、G DNFおよびGDNFRの発現パターンの類似性は、それらが発達中に一緒になって作用することと符合する。哺乳動物の腎発生は、後腎と発生中の尿管（ウォルフ管の尾部分から発生する枝）との間の互いの相互作用から生じると仮定されている（Saxen，Organogenes is of the kidney．Development and Cell Biology series，Cambridge Univers ity Press，Cambrige，England，1987）。Retの発現は、発達中の胚中の尿管芽では見出されているが周囲の間葉では見出されておらず、一方、GDNFの発現は、未分化の腎臓の後腎帽では検出されたが、成体の腎臓の後腎帽では検出されなかった。これらの観察は、GDNFとRetとの相互作用が、尿管構造の発達の開始を引き起こすことを示唆している。この仮定の更なる裏付けは、非常に類似した表現型欠損を腎臓において引き起こすGDNFおよびret遺伝子の標的破壊により得られる（Schuchardtら，Nature．367，380-383，1994;Sanchez，印刷中）。GDNF（− /−）およびret（−/−）ノックアウト動物で認められるもう１つの主要な表現型欠損は、消化管全体にわたる腸内ニューロンの完全な喪失である。また、下部腸管中の副交感神経支配の先天的な不存在により特徴づけられる遺伝的障害であるヒルシュシュプルング病も、ret中の「機能の喪失（loss-of-function）」突然変異に連関している（Romeo ら，Nature．367，377-378，1994．Ederyら，1994）。その後の報告（Angristら ,Hum．Mol．Genet．4，821-830，1995）は、以前の観察に反して、いくつかのヒルシュシュプルング病患者がret中の突然変異を保持していないことを示している。現在では、そのような患者は、GDNF、GDNFR、またはこのシグナル伝達経路におけるいくつかの他の重要な成分中の突然変異を保持している可能性があると考えられている。実験方法 GDNFR を発現するNeuro 2a細胞に対する[¹²⁵I]GDNFの結合前記のとおり、リン酸カルシウムトランスフェクション系（Calcium Phosphat e Transfection System）（GIBCO/BRL）を製造業者の指示に従い使用して、Neur o 2a細胞（ATCC #CCL 131）を発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、400μｇ/mL G418抗生物質（Sigma）中で増殖させることにより、プラスミドの発現に関して選択した。G418耐性クローンを増大させ、 [¹²⁵I]GDNF（Amersham，Inc.，custom iodination，catalog #IMQ1057）に対する結合により、GDNFR発現に関してアッセイした。各クローンからの細胞を、ポリオルニチンで予めコーティングされた 24ウェル組織培養プレート（Becton Dickinson）の重複ウェル中に3×10⁴細胞/c m²の密度で播いた。細胞を氷冷洗浄緩衝液（25mM HEPES(pH7.5)を含有するDMEM) で１回洗浄し、ついで結合緩衝液(洗浄緩衝液＋0.2％BSA)中、500mMの未標識GDN Fの存在下または不存在下、50pM[¹²⁵I]GDNFと共に4℃で４時間インキュベートした。ついで細胞を氷冷洗浄緩衝液で４回洗浄し、1M NaOH中で溶解し、細胞に結合した放射能標識を、1470 Wizard自動ガンマカウンター（Wallac Inc.）中で定量した。個々のタローンにより発現されたGDNFRの量を、未標識GDNFの不存在下および存在下で細胞に結合した[¹²⁵I]GDNFの比率により推定した。３個のタローンを、結合実験に使用する高、中および低レベルのGDNFR発現体の代表例として選択した。未標識GDNFの不存在下および存在下で結合した[¹²⁵I]GDNFの、これらのクローンについての比率は、NGR-38）16：1、NGR-16）12.8:１およびNGR-33）８:１であった。標識GDNF濃度が0.5pM〜1nMの範囲にある以外は前記のとおりに、NGR-38細胞に対する[¹²⁵I]GDNFの平衡結合を行なった。すべてのアッセイにおいて、500nMの未標識GDNFの存在下における細胞に対する放射能標識結合の量により推定される非特異的結合を、未標識GDNFの不存在下における結合から差し引いた。結合データを、スキャッチャードプロットにより分析した。化学的架橋 Neuro 2aまたはNGR-38細胞を、リン酸緩衝食塩水（PBS，pH7.1）で１回洗浄し、ついで500nMの未標識GDNFの存在下または不存在下の結合緩衝液中の１または3 nM[¹²⁵I]GDNFで4℃で４時間処理した。結合後、細胞を氷冷洗浄緩衝液で４回洗浄し、洗浄緩衝液中の1mMビススベラート(BS³，Pierce）で室温で45分間インキュベートした。該細胞をTris緩衝食塩水（TBS，pH7.5）で３回洗浄することにより、該架橋反応をクエンチした。ついで該細胞を、直接、SDS-PAGEサンプル緩衝液（80mM Tris HCl[pH6.8]，10％グリセロール，1%SDS，0.025%ブロモフェノールブルー）中またはTriton X-100溶解緩衝液（50mM Hepes, pH7.5，1%Triton X- 100，50mM NaCl，50mM NaF，10mMピロリン酸ナトリウム，1％アプロチニン(Sigm a，Cat.# A-6279)，1mMPMSF(Sigma，Cat.# P-7626)，0.5％ Na₃VO₄(Fisher，Cat .# S454-50))中で溶解した。該ライゼートを遠心分離により清澄化し、5μｇ/mLの抗Ret抗体（Santa Cruz Antibody，C-19，Cat．#SC-167）と共にインキュベートし、得られた免疫複合体を、プロテインA−セファロースCL-4B （Pharmacia）での沈降により集めた。該免疫沈降物を該溶解緩衝液で３回、50m M NaClおよび20mM Tris-Cl（pH7.5）を含有する0.5％NP-40で１回洗浄し、ついでSDS-PAGEサンプル緩衝液中に再懸濁した。全細胞ライセートおよび該免疫沈降物の両方を、１：200のビス：アクリルアミドの比で7.5％SDS-PAGEにより分画した。ウエスタンブロット分析 Ret受容体の自己リン酸化を、ウエスタンブロット分析により調べた。簡単に説明すると、該アッセイの24時間前に、６ウェル組織培養皿中に1.5×10⁶細胞/ ウェルの密度で細胞を播いた。細胞を結合緩衝液で１回洗浄し、結合緩衝液中の種々の濃度の異なる試薬（GDNF、PI-PLC、PI-PLC/CMおよびRet-Fc融合タンパク質を含む）の単独または組合せたもので、種々の長さの時間にわたり処理した。処理細胞および未処理対照をTriton X-100溶解緩衝液中で溶解し、前記のとおり、抗Ret抗体(Santa Cruz，C-19，Cat．#SC-167)およびプロテインAセファロースで免疫沈降させた。HarlowおよびLane（Antibodies:A Laboratory Manual．Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor，New York，1988）に記載のとおり、免疫沈降物をSDS-PAGEにより分画し、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。該メンブレンを5％BSA（Sigma）で予めブロッキングし、該メンブレンを抗ホスホチロシンモノクローナル抗体4G10 （UBI，Cat．#05-321）で室温で４時間ブロッティングすることにより、該受容体のチロシンリン酸化のレベルを測定した。同じメンブレンを剥ぎ取り、それを抗Ret抗体で再プローブすることにより、各レーンに含まれるタンパク質の量を測定した。最後に、該メンブレンを、製造業者の指示に従い化学発光試薬(ECL,A mersham)で処理し、X線フィルム(Hyperfilm-ELC，Amersham)に露出させた。PI-PLC での細胞の処理およびPI-PLC処理調整培地の生成 GPIで連結されたGDNFRを細胞表面から遊離させるために、細胞を洗浄緩衝液で１回洗浄し、ついで1U/mLホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（PI-PLC，BoehringerMannheim，Cat．#1143069）と共に、緩衝緩衝液中、37℃ で45分間インキュベートした。ついで該細胞を洗浄緩衝液で３回洗浄し、Ret自己リン酸化アッセイまたは架橋のために更に加工した。PI-PLCで処理された調整培地（PI-PLC/CM）を得るために、2mMのEDTAを含有するPBSで細胞を37℃で5〜10分間処理することにより、8×10⁶細胞を組織培養皿から取り出した。細胞を洗浄緩衝液で１回洗浄し、1U/mLのPI-PLCを含有する結合緩衝液1mLに再懸濁し、37℃で45分間インキュベートした。該細胞をペレット化し、PI-PLC/CMを集めた。Ret-Fc 融合タンパク質の調製マウスc-Ret（Iwamotoら，1993;van Heyningen，1994）の最初の20アミノ酸に対応するオリゴヌタレオチドプローブを使用して、c-Retの全コード領域を含むc DNAを、17日目のラット胎盤のcDNAライブラリーから単離した。既に文献（Bartl eyら，Nature．368，558-560，1994）に記載されているとおりに、Ret受容体の細胞外ドメイン（最後のアミノ酸R636で終結する）をコードする領域を、ヒトIg G（IgG1）のFc領域をコードするDNAとインフレームで融合させ、発現ベクターpD SR2中にサブクローニングした。ret-Fc/pDSRa2プラスミドをチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞中にトランスフェクトし、組換えRet-Fc融合タンパク質を、Ni⁺⁺カラム（Qiagen）を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。胚ラット脊髄運動ニューロン培養の調製富化された肝ラット脊髄運動ニューロン培養を、E15 Sprague-Dawleyラット胎児の全脊髄から、実験の24時間前に調製した。該脊髄を解剖し、髄膜および脊髄後根神経節（DRG）を取り出した。該脊髄を、より小さな断片に切断し、L15メディウム中のパパイン（Papain Kit,Worthington）で消化した。該分散細胞懸濁液中に含まれる他の型の細胞より大きい運動ニューロンを6.8％メトリザミド勾配を用いて富化させた。(CamuおよびHenderson，J Neuroscience．44，59-70，199 2)。該メトリザミドクッションと該細胞懸濁液との間の界面に存在する富化された運動ニューロンを集め、洗浄し、予めポリ−L−オルニチンおよびラミニンでコーティングされている組織培養皿中に〜9×10⁴細胞/cm²の密度で播き、37℃で培養した。本明細書中には種々の参照文献が引用されているが、それらの開示の全体を参考として本明細書に組入れることとする。本発明は、好ましい実施態様および代表的な核酸およびアミノ酸配列に関して記載されているが、変形および修飾が当業者において見出されると理解される。したがって、添付の請求の範囲は、特許請求されている本発明の範囲内に含まれるそのようなすべての等価な変形を包含すると意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 21/08 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号０８／８３７，１９９ (32)優先日平成９年４月14日(1997．4．14) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ウエン，ドウアンツイアメリカ合衆国、カリフオルニア・91360、サウザンド・オークス、レインダンス・ストリート・517 (72)発明者チン，シユチエンアメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、サウザンド・オークス、ボルデロ・レイン・3254

Claims

【特許請求の範囲】１．図２または４（配列番号２または４）に示すアミノ酸配列およびその類似体を含んでなる単離され精製されたタンパク質であって、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）と複合体を形成し、それによりGDNFに対する細胞応答を媒介する能力を有することを特徴とするタンパク質。２．図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。３．図４（配列番号４）に示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。４．図２（配列番号２）に示すSer¹⁸〜Pro⁴⁴⁶のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。５．図２（配列番号２）に示すAsp²⁵〜Leu⁴⁴⁷のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。６．図２（配列番号２）に示すCys²⁹〜Cys⁴⁴²のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。７．図４（配列番号４）に示すAla¹⁹〜Val⁴⁵⁰のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。８．図４（配列番号４）に示すCys²⁹〜Cys⁴⁴³のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。９．グリコシル化されている、請求項１に記載のタンパク質。 10．グリコシル化されていない、請求項１に記載のタンパク質。 11．組換え技術または化学合成により製造される、請求項１ないし10のいずれか１項に記載のタンパク質。 12．請求項１ないし10のいずれか１項に記載のタンパク質と医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。 13．請求項１ないし８のいずれか１項に記載のアミノ酸配列を含む神経栄養因子受容体タンパク質をコードする単離された核酸配列。 14．図２または４（配列番号２または４）に示すアミノ酸配列およびその類似体を含む神経栄養因子受容体タンパク質をコードする単離された核酸配列であって、該タンパク質が、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）と複合体を形成し、それによりGDNFに対する細胞応答を媒介する能力を有することを特徴とする核酸配列。 15．図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を含む神経栄養因子受容体タンパク質をコードする、請求項14に記載の核酸配列。 16．図４（配列番号４）に示すアミノ酸配列を含む神経栄養因子受容体タンパク質をコードする、請求項14に記載の核酸配列。 17．（a）Met¹〜Ser⁴⁶⁵をコードするヌクレオチドを含む図１（配列番号１）またはMet¹〜Ser⁴⁶⁸をコードするヌクレオチドを含む図３（配列番号３）に示す配列であって、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）と複合体を形成し、それによりGDNFに対する細胞応答を媒介する能力を有する神経栄養因子受容体タンパク質（GDNFR）をコードする配列、（b）（1）（a）の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列であって、（2）GD NFR活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、および（c）遺伝暗号の縮重がなければ（a）の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列であって、（2）GDNFR活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸配列。 18．請求項14ないし17のいずれか１項に記載の核酸配列を含んでなるベクターであって、該核酸配列が、該核酸配列の増幅または発現を引き起こす能力を有する１以上の作動的要素に作動的に結合していることを特徴とするベクター。 19．図２または４（配列番号２または４）に示すアミノ酸配列を含む神経栄養因子受容体タンパク質をコードする核酸配列を含んでなるベクターであって、該核酸配列が、該核酸配列の増幅または発現を引き起こす能力を有する１以上の作動的要素に作動的に結合していることを特徴とするベクター。 20．請求項18に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。 21．請求項19に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。 22．哺乳動物細胞および細菌細胞よりなる群から選ばれる、請求項20に記載の宿主細胞。 23． COS-7細胞または大腸菌（E．coli）である、請求項22に記載の宿主細胞。 24．ヒトに対する移殖に適しており、該神経栄養因子受容体を発現し分秘する、請求項20に記載の宿主細胞。 25．ヒトに対する移殖に適しており、該神経栄養因子受容体を発現し分秘する、詰求項21に記載の宿主細胞。 26．エクスビボ（exvivo）で形質転換またはトランスフェクトされた、請求項 20に記載の宿主細胞。 27．ヒトに対する移殖に適した半透膜中に封入された、請求項20に記載の宿主細胞。 28．（a）図２および４（配列番号２および４）に示すアミノ酸配列およびその類似体を含む神経栄養因子受容体タンパク質（該タンパク質は、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）と複合体を形成し、それによりGDNFに対する細胞応答を媒介する能力を有する）をコードする核酸配列を含有する宿主細胞を、該宿主細胞による該神経栄養因子受容体タンパク質の発現に適した条件下で培養し、（b）所望により、該宿主細胞により発現された該神経栄養因子受容体タンパク質を単離する工程を含んでなる、神経栄養因子受容体タンパク質の製造法。 29．該核酸配列が、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を含む神経栄養因子受容体タンパク質をコードする、請求項28に記載の製造法。 30．該核酸配列が、図４（配列番号４）に示すアミノ酸配列を含む神経栄養因子受容体タンパク質をコードする、請求項28に記載の製造法。 31．神経栄養因子受容体タンパタ質の製造法であって、（a）請求項17に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、該宿主細胞による該神経栄養因子受容体タンパク質の発現に適した条件下で培養し、（b）所望により、該宿主細胞により発現された該神経栄養因子受容体タンパク質を単離する工程を含んでなる製造法。 32．前記の単離された神経栄養因子受容体をリフォールディングさせる工程をさらに含む、請求項28または31に記載の製造法。 33．該宿主細胞が原核細胞である、請求項28または31に記載の製造法。 34．該宿主細胞が真核細胞である、請求項28または31に記載の製造法。 35．請求項28〜31のいずれか１項に記載の製造法により製造された実質的に精製された神経栄養因子受容体タンパク質。 36．医薬組成物の製造のための、請求項１に記載の神経栄養因子受容体タンパク質の使用。 37．請求項１に記載の神経栄養因子受容体タンパク質を投与することによる、ドーパミン作動性神経細胞の機能不全の治療方法。 38．請求項１に記載の神経栄養因子受容体タンパク質を投与することによる、パーキンソン病の治療方法。 39．請求項１に記載の神経栄養因子受容体タンパク質を投与することによる、アルツハイマー病の治療方法。 40．請求項１に記載の神経栄養因子タンパク質を投与することによる、筋萎縮性側索硬化症の治療方法。 41．配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む神経栄養因子受容体タンパク質に結合する抗体。 42．モノクローナル抗体である、請求項41に記載の抗体。 43．ポリクローナル抗体である、請求項41に記載の抗体。 44．配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む神経栄養因子受容体タンパク質で動物を免疫することにより製造される抗体。 45．配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む神経栄養因子受容体タンパク質に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 46．（a）移殖に適した半透膜、および（b）請求項１に記載の神経栄養因子受容体タンパク質を分泌する、該膜内に封入された細胞を含んでなる、神経損傷を治療するための装置であって、該膜が、該神経栄養因子受容体タンパク質を透過しうるが、該細胞に有害な物質を透過しないことを特徴とする装置。 47．該細胞が、該神経栄養因子受容体タンパク質を分秘する天然に生じる細胞である、請求項46に記載の装置。 48．（a）Met¹〜Ser⁴⁶⁵をコードするヌクレオチドを含む図１（配列番号１）またはMet¹〜Ser⁴⁶⁸をコードするヌクレオチドを含む図３（配列番号３）に示す配列であつて、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）と複合体を形成し、GDNF に対する細胞応答を媒介する能力を有する神経栄養因子受容体タンパク質（GDNF R）をコードする配列、（b）（1）（a）の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列であって、（2） GDNFR活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、および（c）遺伝暗号の縮重がなければ（a）の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列であって、（2）GDNFR活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列により、該細胞が、該神経栄養因子受容体タンパク質を分秘するように修飾されている、請求項46に記載の装置。 49． GDNFRタンパク質を含有するか又はGDNFRタンパク質でコーティングされた固相を含んでなる、グリア細胞株由来神経栄養因子の存在に関して試験サンプルを分析するためのアッセイ装置であって、該GDNFRタンパク質が、該試験サンプル中に存在するGDNFと反応し、GDNFの存在を示す検出可能な反応産物を産生することを特徴とするアッセイ装置。 50． GDNFRタンパク質を含むアッセイ試薬に試験サンプルを接触させることを含んでなる、グリア細胞株由来神経栄養因子の存在に関して試験サンプルを分析するための方法であって、該GDNFRタンパク質が、該試験サンプル中に存在するG DNFと反応し、GDNFの存在を示す検出可能な反応産物を産生することを特徴とする方法。