JP2000501924A

JP2000501924A - 神経膠細胞系由来神経栄養因子のレセプター類

Info

Publication number: JP2000501924A
Application number: JP9519039A
Authority: JP
Inventors: イバネズ，カルロス; アルマエ，ウルマス; サリオラ，ハンヌ; スバント，ペトロ; トルツプ，ミレス; サールマ，マルト
Original assignee: イバネズ，カルロス; アルマエ，ウルマス; サリオラ，ハンヌ; スバント，ペトロ; トルツプ，ミレス; サールマ，マルト
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 2000-02-22
Also published as: EP0879247A1; NZ324511A; KR19990067508A; NO982141D0; EP0879247A4; AU718979B2; NO982141L; AU1158897A; CA2237641A1; WO1997018240A1

Abstract

(57)【要約】神経膠細胞系由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のレセプター類、これらの細胞発現、単離及び生化学的特性化が開示される。ＧＤＮＦの一つのレセプターとしてｃ−ＲＥＴが開示され、さらなる新規なレセプター類も開示される。ＧＤＮＦに対するモノクーナル抗体の調製も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】神経膠細胞系由来神経栄養因子のレセプター類３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従って、本出願は、全てそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる１９９５年１１月１３日に出願された仮出願第６０／００６，６１９号、１９９６年４月１６日に出願された第６０／０１５，７６７号、１９９６年６月２７日に出願された第６０／０２１，９６５号、１９９６年６月２７日に出願された第６０／０２０，６３８号及び１９９６年６月２７日に出願された第２０／０２０，６３９号の優先権の利益を請求する。発明の分野本発明は、ＧＤＮＦのレセプター類及び機能の同定、並びにこれらのレセプターを発現する細胞系に関する。発明の背景神経膠細胞系由来神経成長因子（ＧＤＮＦ）は、栄養ポリペプチドである。１３４アミノ酸の長さの２個のグリコシル化ポリペプチドがジスルフィド架橋で結合したホモダイマーであり、各モノマーは約２５−３０ｋＤの分子量を有する。１９９３年のＧＤＮＦの分子クローニングの前に、研究者等は、パーキンソン病に関連したニューロンの損失、特に前中脳のドーパミン作動性ニューロンの損失を軽減する栄養ポリペプチドを探していた。このニューロンの亜集団の生存は、神経膠細胞系の調節培地中に存在する可溶性因子によりしばらくの間促進されることが知られている。胚の前中脳ニューロンから調製された初代培養物においてドーパミンの取り込みを促進する能力に基づいてＧＤＮＦタンパク質が最初に単離されたのは、これらの細胞系の一つからであった（Ｌｉｎ等、２６０Ｓｃｉｅｎｃｅ１１２０、１９９３）。続いて、パーキンソン症候群に似た薬理学的処置及び損傷の後に、ＧＤＮＦがインビボで成体の黒質ニューロンの生存を促進することが示された（Ｂｅｃｈ等、３７７Ｎａｔｕｒｅ３３９、１９９５；Ｔｏｍａｃ等、３７３Ｎａｔｕｒｅ３３５、１９９５）。ＧＤＮＦは、最初、ドーパミン作動性ニューロンに非常に特異的であると報告されたけれども、顔及び脊髄の運動ニューロン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ等、２６６Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１０６２、１９９４；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ等、３７３Ｎａｔｕｒｅ３４４、１９９５；Ｙａｎ等、３７３Ｎａｔｕｒｅ３４１、１９９５）、青班のノルアドレナリン作動性ニューロン（Ａｒｅｎａｓ等、Ｎｅｕｒｏｎ、印刷中、１９９５）、小脳プルキンエ細胞（Ｍｏｕｎｔ等、９２ＰＮＡＳ９０９２、１９９５）、抹消神経節の交感及び感覚ニューロン（Ｔｒｕｐｐ等、１３０Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３７、１９９５）及び標的由来でパラクリン形態の作用を有する抹消ニューロン群（Ｔｒａｐｐ、Ｍ．等、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、１３０、１３７−１４８（１９９５）；Ｐｉｔｃｈｅｌ、Ｊ．、Ｓａｒｉｏｌａ、Ｈ．、Ｈｏｆｆｅｒ、Ｂ．＆Ｗｅｓｔｐｈａｌ、Ｈ．（未発表の報告）；Ｂｕｊ−Ｂｅｌｌｏ、Ａ．、Ｂｕｃｈｍａｎ、Ｖ．Ｌ．Ｈｏｒｔｏｎ、Ａ．、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、Ａ．＆Ｄａｖｉｅｓ、Ａ．Ｍ．Ｎｅｕｒｏｎ、１５、８２１−８２８（１９９５））の生存及び表現型反応を初めとする、この分子の他のいくつかの重要な活性が続いて示されている。これらのニューロンの多くは神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅｓ）において冒されているので、ＧＤＮＦは、有効な治療用途を有する可能性がある。特に、外部から投与したＧＤＮＦは、齧歯類で実験的に誘導したパーキンソン病において黒質のドーパミン作動性ニューロンを維持し（Ｂｅｃｋ等、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３７３、３３９−３４１；Ｔｏｍａｃ等、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３７３、３３５− ３３９）、パーキンソン病のアカゲザルにおいて機能的回復をもたらす（Ｇａｓｈ等、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ、３８０、２５２−２５５）。また、ＧＤＮＦ処置は、実験的に軸索を切断したネズミの運動ニューロンの約半分を救済し（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ等、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３７３、３４４−３４６；Ｌｉ等、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２、９７７１−９７７５）、これらは、運動ニューロン疾患の治療にＧＤＮＦを使用できることを示唆している。しかしながら、正常及び発病状態におけるＧＤＮＦの作用機構の研究は、そのレセプターが知られていなかったので基本的に妨げられていた。構造の類似性（主として、７個の保存されたシステインアミノ酸残基）に基づくと、ＧＤＮＦは、ＴＧＦ−β類、アクチビン類、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）並びに成長及び分化因子類（ＧＤＦ類）を含む、多機能サイトカインのトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−１３）スーパーファミリーの遠縁のメンバーであると思われる（Ｒｏｂｅｒｔｓ等、３２７Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌａｎｄ．１４５、１９９０）。ＴＧＦ−β及び関連リガンドは、上皮及び免疫細胞で増殖を抑えること、初期発生においてモルフォゲンとして機能すること、骨格組織の異所発現を誘導すること、及びニューロンの存続及び分化を促進することが知られている。ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、反応性細胞の表面の多数のレセプターサブユニットと相互作用する（Ａｔｔｉｓａｎｏ等、１２２２Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＲｅｓ．７１、１９９４；Ｄｅｒｙｎｃｋ、１９ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．５４８、１９９４）。異なるレセプター型が、親和性標識複合体の分子量に基づいて記述されている。これらの中にはＩ型、II型及びIII型のレセプターがあり、これらは、それぞれ、５５ｋＤ、７０ｋＤ及び３００ｋＤの結合タンパク質である。III型レセプターは、短い細胞質末端を有する約３００ｋＤの多量に発現されるトランスメンブレンプロテオグリカンであり、オリゴマーのレセプター複合体へのリガンドの召集において機能すると考えられている（Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓ等、６７Ｃｅｌｌ７８５、１９９１）。実際、III型レセプターは、シグナル伝達レセプターへのＴＧＦ−β２結合のためにいくつか細胞系で必要とされる。Ｉ型及びII型のレセプターは、細胞内のセリン−トレオニンキナーゼドメインを有するトランスメンブレンタンパク質であり、それ故、リガンド結合の際にシグナルをさらに先に伝達することができる（Ａｔｔｉｓａｎｏ等、７５Ｃｅｌｌ６７１、１９９３；Ｄｅｒｙｎｅｋ、１９９４上記）。II型レセプターは構成的活性化キナーゼであり、リガンドが結合すると、シグナル伝達複合体にＩ型レセプターを召集する。この複合体において、Ｉ型レセプターは、セリン残基に富んだ膜近傍ドメインでII型レセプターによりリン酸化され、このリン酸化は、Ｉ型レセプターのセリン−トレオニンキナーゼ活性の活性化及びその後のシグナル伝達をもたらすと考えられている（Ｗｒａｎａ等、３７０Ｎａｔｕｒｅ３４１、１９９４）。このモデルによると、ある場合には、II型レセプターへの効率よい結合のためにＩ型レセプターが必要であるけれども、ＴＧＦ− βスーパーファミリータンパク質は、 II型レセプターの非存在下ではＩ型レセプターに結合できない（Ｌｅｔｓｏｕ等、８０Ｃｅｌｌ８９９、１９９５）。７種の哺乳類Ｉ型レセプター、４種の II型レセプター及び１種のIII型ベータグリカンレセプターを初めとする、ＴＧＦ−β類、アクチビン類及びＢＭＰ類のＩ、II及びIII型レセプターの多数のｃＤＮＡクローンが、発現または相同クローニングのいずれかにより単離されている。このファミリーの異なるメンバーに結合するさらなる膜タンパク質は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＳ）に結合した未知の構造及び機能の１５０ｋＤ及び１８ＯｋＤタンパク質（ＭａｃＫａｙ及びＤａｎｉｅｌｐｏｕｒ、２６６Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９９０７、１９９１）、並びにＴＧＦ−β １に結合するがＴＧＦ−β２には結合しない１８０ｋＤのジスルフィド結合ダイマーであるエンドグリンを含む。ＧＤＮＦレセプターの単離及び特性化は、ＧＤＮＦの生物学的作用の全範囲及び反応性細胞にＧＤＮＦが結合した際に起こるシグナル伝達事象を理解するための前提条件である。現在まで、ＧＤＮＦに反応する細胞系、すなわち、ＧＤＮＦレセプターを含んでなる細胞系の欠如により、この分野の進歩は妨げられていた。発明の要約本明細書において、ＧＤＮＦのレセプター類、並びにそれらを発現する細胞系が開示される。これらのレセプターを同定し、単離する方法も開示される。一つの態様として、本発明は、ＧＤＮＦに結合する単離されたレセプターに関する。別の態様として、本発明は、ＧＤＮＦレセプターに結合する化合物または組成物の測定方法に関する。なお別の態様として、本発明は、チロシンリン酸化、ｃ−ｆｏｓｍＲＮＡの増加、及び細胞の生存の増加のような類似した生物学的作用を有する化合物または組成物を選別することによる、ＧＤＮＦの相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）を同定する方法に関する。さらに別の態様として、本発明は、上に挙げたようなＧＤＮＦの生物学的作用を相殺する化合物または組成物を選別することによる、ＧＤＮＦの類似体（ａｎａｌｏｇｓ）を同定するための方法に関する。図面の簡単な説明図１．¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦのヒヨコ交感ニューロンのレセプターへの結合。（ａ）¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦのＥ１０胚のヒヨコ交感ニューロンへの飽和定常状態結合。データは、３重の測定の平均±ＳＤとして表される。（ｂ）（ａ）に示されたデータのスキャッチャード変換。（ｃ）（ａ）に示されたデータのヒル変換。ｎＨ：ヒル係数。図２．ヒヨコ交感ニューロンのＧＤＮＦレセプターの親和性標識。¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦをＥ１０胚のヒヨコ交感ニューロンに架橋させ、レセプター複合体をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離し、ゲルオートラジオグラフィーで視覚化した（真ん中のレーン）。１００ｋＤでのダブレット及び３００ｋＤの複合体を矢印で示す。過剰のコールドＧＤＮＦは、¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦの架橋を妨げた（右のレーン）。比較のために、¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−βのミンク肺上皮細胞ＭｕＩＬｕへの架橋も示す（左のレーン）。分子量マーカーをｋＤ単位で示す。図３．細胞系のレセプターの親和性標識。架橋剤としてＤＳＳまたはＥＤＡＣのいずれかを用いて、Ｃ６神経膠腫、ＲＮ３３Ｂ縫合神経核（ｒａｐｈｅｎｕｃｌｅｕｓ）、Ｌ６筋芽細胞及びＭＮ−１運動ニューロン細胞系に¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦを架橋させた。レセプター複合体をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離し、ゲルオートラジオグラフィーで視覚化した。過剰のコールドＧＤＮＦは、¹² ⁵ Ｉ−ＧＤＮＦの架橋を妨げた（コールド）。分子量マーカーをｋＤ単位で示す。図４．ＲＮ３３Ｂ及びＭＮ−１細胞のＧＤＮＦレセプターサブユニットの個々の成分の親和性。（ａ）ＦＤＡＣまたはＤＳＳを用いた架橋後のＲＮ３３Ｂ及びＭＮ−１細胞の異なるＧＤＮＦレセプター複合体の大きさ。（ｂ）及び（ｃ）増加する濃度のコールドのＧＤＮＦの存在下で¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦをＲＮ３３Ｂ（ｂ）またはＭＮ−１（ｃ）細胞に架橋させた。示したレセプターサブユニットへの¹² ⁵ Ｉ−ＧＤＮＦ結合の割合を結合中に用いたコールドＧＤＮＦの濃度の関数として示す。図５．ＧＤＮＦレセプターを発現する細胞系におけるＧＤＮＦｍＲＮＡの発現。（ａ）示した細胞系からの同量の全ＲＮＡを用いたＲＮａｓｅ保護アッセイのオートラジオグラム。出生後１日の腎臓及びイーストｔＲＮＡをそれぞれ陽性及び陰性コントロールとして用いた。（ｂ）Ｐ１腎臓のレベルに対する異なる細胞系のＧＤＮＦｍＲＮＡレベルの定量化、ｕｎｄｉｆｆＲＮ３３Ｂ、未分化のＲＮ３３Ｂ細胞；ｄｉｆｆＲＮ３３Ｂ、分化したＲＮ３３Ｂ細胞；ｄｉｆｆＲＮ３３Ｂ＋ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦの存在下で分化させたＲＮ３３Ｂ細胞。図６．異なる細胞系におけるｃ−ｒｅｔのｍＲＮＡの発現。図７．ＲＮ３３Ｂ及びＭＮ−１細胞におけるＥＲＫ類のチロシンリン酸化のＧＤＮＦ剌激。ＲＮ３３Ｂ（ａ）またはＭＮ−１（ｂ）細胞単層を５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦに示した期間（分単位）さらし、細胞ライセートをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロットを抗−ホスホチロシン抗体（αＰ−Ｔｙｒ）で検出した。これらのブロットをはがし、ｐ４２^erk１２及びｐ４４^erk1の両方を認識する抗ＥＲＫ２抗体（α−ＥＲＫ２）で再検出した（右側の矢印）。分子量マーカーをｋＤ単位で示す。図８．ＲＮ３３Ｂ及びＭＮ−１細胞におけるｃ−ｆｏｓｍＲＮＡ発現のＧＤＮＦ剌激。ＲＮ３３Ｂ（ａ）またはＭＮ−１（ｂ）細胞単層を５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦに示した期間（分単位）さらし、全ＲＮＡを抽出し、アガロースゲルで分離し、ノーザンブロットを³²Ｐで標識したラットｃ−ｆｏｓプローブで検出した。示したものは、高いストリンジェンシーで洗浄したフィルターのｘ線オートラジオグラムである。図９．ＧＤＮＦは、ＲＮ４６Ａ細胞の生存を増加した。ＲＮ４６Ａ細胞を培地± ０−５０ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦ中で８日間分化させた。データは、独立した３実験の平均±ＳＥＭを表す（条件当たり１，５００−３，０００の細胞が数えられた）。ＡＮＯＶＡは、培地のみに比べてＧＤＮＦが全ての濃度で生存に著しい作用を有することを示した（全体的ＡＮＯＶＡ：ｄｆ＝６，２０３；Ｆ＝１１．３９、ｐ，０．００１；異なるＮＬＳＤ事後試験、ｐ．０．００１）。図１０ａ−ｃ．ＧＤＮＦに対するＭＮ−１の生物学的及び生化学的反応。（ａ）ＧＤＮＦは、血清を欠いたＭＮ−１細胞の生存を剌激する。（ｂ）ＧＤＮＦは、ＭＮ−１細胞のいくつかのタンパク質（星印）の迅速で一時的なチロシンリン酸化を剌激する。ＧＤＮＦ処理の時間（分単位）及び分子量マーカーを示す。（ｃ）ＭＮ−１細胞においてＧＤＮＦにより剌激された迅速で持続するＥＲＫＩ及びＥＲＫ２のチロシンリン酸化。図１１ａ−ｃ．ｃ−ＲＥＴは、ＧＤＮＦのシグナル変換レセプターである。（ａ）ＭＮ−１細胞におけるＧＤＮＦ−レセプター複合体の免疫沈降分析。ＧＤＮＦで標識された結合タンパク質をレクチンセファロースビーズ、またはＧＤＮＦ、ホスホ−チロシン（Ｐ−Ｔｙｒ）及びｃ−ＲＥＴに対する抗体で沈降することができた。コントロールの免疫前の抗体は、ＧＤＮＦレセプター複合体を免疫沈降しなかった。（ｂ）ＧＤＮＦは、ＭＮ−１細胞でｃ−ＲＥＴのチロシンリン酸化を誘導する。ｃ−ＲＥＴのチロシンリン酸化は、ＧＤＮＦの添加５分後にすでに検出された（上のパネル）。３０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦで飽和が見られた（下のパネル）。図１２ａ−ｃ．ｃ−ｒｅｔの発現は、繊維芽細胞においてＧＤＮＦに対する結合及び生物学的反応を媒介するために十分である。（ａ）ＭＥＮ２ａ−ｒｅｔまたは野生型ｃ−ｒｅｔ発現プラスミドで安定にトランスフェクトした３Ｔ３細胞にヨウ素化したＧＤＮＦを架橋することができた。トランスフェクトしなかった３Ｔ３細胞（３Ｔ３）は、ＧＤＮＦを結合しなかった。結合の特異性は、５０Ｘ過剰のコールドＧＤＮＦを用いた標識の置換により示された。（ｂ）ＧＤＮＦは、ｃ−ｒｅｔ発現プラスミドで安定にトランスフェクトした３Ｔ３繊維芽細胞の生存及び増殖反応を促進する。トランスフェクトしなかった細胞は、ＧＤＮＦに反応しなかった。図１３ａ−ｃ．成体の脳及び発生中の黒質におけるｃ−ｒｅｔｍＲＮＡの発現。（ａ）成体ラットの脳の異なる領域におけるｃ−ｒｅｔｍＲＮＡ発現のリボヌクレアーゼ保護分析（ＲＰＡ）。（ｂ）ラット前中脳（黒質）の発生中のｃ− ｒｅｔｍＲＮＡ発現及び発生中の線条体におけるＧＤＮＦｍＲＮＡ発現のＲＰＡ。（ｃ）新生動物のそれぞれの領域の発現レベルに１００が相当する、任意の単位のｍＲＮＡ発現を示す。図１４ａ−ｈ．ｃ−ＲＥＴは、ＧＤＮＦ反応性黒質ドーパミン作動性ニューロンで発現される。（ａ）成体の黒質においてインサイチューハイブリダイゼーションにより分析されたｃ−ｒｅｔｍＲＮＡ発現の暗視野オートラジオグラム。縮尺棒、４０μｍ。（ｂ）ｃ−ｒｅｔｍＲＮＡを含有する黒質ニューロンを示す明視野オートラジオグラム。縮尺棒、７．５μｍ。（ｃ）成体の黒質におけるｃ −ＲＥＴタンパク質発現の免疫組織化学分析。縮尺棒、２７μｍ。（ｄ）６−ＯＨＤＡでの一側性損傷後の成体ラットの脳におけるｃ−ｒｅｔｍＲＮＡのインサイチューハイブリダイゼーションを示すオートラジオグラム。この有毒なドーパミン類似体の中前脳束への注入は、ドーパミンを活発に取り込み逆行して運ぶ細胞のみを傷つけることを保証する。損傷の１日及び５日後に損傷を受けた黒質（矢じり）においてｃ−ｒｅｔｍＲＮＡに対する標識が消失していることに注目せよ。（ｅ）６−ＯＨＤＡで損傷を与え、モック（ｍｏｃｋ）をトランスフェクトした繊維芽細胞（コントロール移植片）を移植した後の成体の黒質におけるｃ−ＲＥＴタンパク質発現の免疫組織化学分析。損傷により引き起こされるｃ− ＲＥＴ−Ｌ１のほとんど完全な消失に注目せよ。縮尺棒、２０ｐｍ。（ｆ）ＧＤＮＦを発現する繊維芽細胞の移植は、ｃ−ＲＥＴ−Ｌ１を救済する。ＧＤＮＦを生産する移植片（矢印）を取り囲み、侵入するｃ−ＲＥＴ陽性の繊維に注目せよ。（ｅ）と同じ倍率。（ｇ）６−ＯＨＤＡで損傷を与え、モックをトランスフェクトした繊維芽細胞（コントロール移植片）を移植した後の成体の青班におけるｃＲＥＴタンパク質発現の免疫組織化学分析。縮尺棒、２３μｍ。（ｈ）６−ＯＨＤＡ損傷を受けた青班においてｃ−ＲＥＴ−Ｌ１を発現する細胞体のＧＤＮＦによる救済。（ｅ）と同じ倍率。移植片は、（ｅ）及び（ｆ）では右側、（ｇ）及び（ｈ）では上側にある。図１５ａ−ｃ．ＰＣ１２及びＮＢ２／ａ細胞は、ＧＤＮＦに反応し、ＧＤＮＦに結合する。（ａ）ＧＤＮＦは、血清を欠いたＰＣ１２細胞の生存を促進する。（ｂ）ＧＤＮＦは、ＮＢ２／ａ細胞の数を増加する。（ｃ）¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦは、５０倍の非標識ＧＤＮＦの非存在下（開いた柱）または存在下（閉じた柱）でＰＣ１２及びＮＢ２／ａ細胞に結合する。図１６．¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦの細胞系への親和性架橋。ＰＣ１２細胞（レーン１）、ＳＹ５Ｙ細胞（レーン２）、Ｅ２０ラット腎臓細胞（レーン３）及びＮＢ２／ａ細胞（レーン４）に¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦを架橋させ、得られた複合体を抗−ＧＤＮＦ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）で溶剤ライセートから沈降させた。図１７ａ−ｂ．ＧＤＮＦは、ｃ−ＲＥＴに特異的に結合する。（ａ）１００倍過剰の非標識ＧＤＮＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＥＣＬｔｄ．）の存在下（＋）または非存在下（−）で、¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦをＮＢ２／ａ細胞に架橋させ、得られた複合体をｃＲＥＴの細胞外及び細胞内ドメインをそれぞれ認識するモノクローナル及びポリクローナル（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）の抗−ｃ−ＲＥＴ抗体の混合物で溶剤ライセートから沈降させた。また、ライセートは、モノクローナル抗 −神経フィラメント抗体１３ＡＡ８（レーン３）、プロテインＡ−セファロース（ＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（レーン４）及びＷＧＡ−アガロース（ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ）（レーン５）でも沈降させた。（ｂ）¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦは、ｃ−ＲＥＴを一時的に発現するＣＯＳ細胞に結合するが、モック（ｐＢＫ−ＣＮＶプラスミド）でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞には結合しない。開いた柱は５０倍過剰の非標識ＧＤＮＦの非存在下での結合を表し、閉じた柱は存在下でのものを表す。図１８．ＧＤＮＦは、トランスフェクトしたＣＯＳ細胞においてｃ−ＲＥＴのチロシンリン酸化を増加する。ｃ−ｒｅｔｃＤＮＡでトランスフェクトしたＧＤＮＦ処理（＋）（レーン１）または未処理（−）（レーン２）のＣＯＳ細胞またはｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドでモックトランスフェクトしたＣＯＳ細胞（レーン３）の溶剤ライセートからｃ−ＲＥＴを免疫沈降させた。（ａ）抗−ｃ−ＲＥＴ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）で検出した免疫ブロット。（ｂ）抗−ホスホチロシン抗体で再検出した同じフィルター。図１９ａ−ｈ．ＧＤＮＦは、ｃ−ｒｅｔ陽性の発生中腸ニューロンにインサイチューで結合する。（ａ、ｂ）Ｅ１５ラットの腸からのパラフィン切片へのＧＤＮＦアンチセンスｃＲＮＡハイブリダイゼーションの暗視野（ａ）及び対応する明視野（ｂ）顕微鏡写真。（ｃ、ｄ）¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦのＥ１５ラット腸外植片へのインサイチュー結合の暗視野（ｃ）及び対応する明視野（ｄ）顕微鏡写真。（ｅ）Ｅ１５ラットの腸からの凍結切片に対するｃ−ｒｅｔアンチセンスｃＲＮＡハイブリダイゼーション。（ｆ）Ｅ１５ラットの腸凍結切片の抗−ペリフェリン抗体での免疫染色。（ｇ）Ｅ１５ラットの腸切片に対するＧＤＮＦセンスｃＲＮＡハイブリダイゼーション。（ｈ）２５０倍過剰の非標識ＧＤＮＦの存在下での¹²⁵ Ｉ−ＧＤＮＦのＥ１５ラット腸外植片へのインサイチュー結合。ｍ、筋肉層；ｎ、腸神経叢。棒、１００μｍ。図２０ａ−ｂ．ＧＤＮＦ反応性細胞系及びｃ−ｒｅｔをトランスフェクトした細胞から、架橋されたＧＤＮＦ−ｃ−ＲＥＴ複合体が得られる。（ａ）ＰＣ１２細胞、ＮＢ２／ａ細胞、解離したＥ２０ラットの腎臓細胞、及びＣＯＳ細胞にＥＤＡＣを用いて¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦを架橋させ、得られた複合体を抗−ＧＤＮＦ抗体で沈降させた。（ｂ）５００倍過剰の非標識ＧＤＮＦまたはＴＧＦ−β１の存在下（＋）または非存在下（−）で、ＰＣ１２細胞、ｃ−ｒｅｔで安定にトランスフェクトした（Ｒｅｔ．−３Ｔ３）またはモックでトランスフェクトした（ｍｏｃｋ−３Ｔ３）３Ｔ３細胞の抽出物、並びに解離したＥ１５腎臓細胞から、ＥＤＡＣで架橋された¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦ−ｃ−ＲＥＴ複合体を抗−ｃ−ＲＥＴ抗体を用いて免疫沈降させた。全てのゲルの〜５０Ｋバンドは、ＧＤＮＦの架橋されたダイマーである。図２１ａ−ｂ．ＧＤＮＦは、安定にトランスフェクトした３Ｔ３細胞系でｃ−ＲＥＴの自己リン酸化を増加する。（ａ）ＧＤＮＦは、ｃ−ｒｅｔでトランスフェクトした（ｒｅｔ−３Ｔ３）細胞でｃ−ＲＥＴの１６０ｋＤアイソフォームのチロシンリン酸化を投与量に依存して増加するが、モックでトランスフェクトした（モック）細胞では増加しない。（ｂ）ＧＤＮＦは、ｃ−ｒｅｔでトランスフェクトした３Ｔ３細胞でｃ−ＲＥＴの１６０ｋＤアイソフォームのチロシンリン酸化を時間に依存して増加する。上のパネル（Ｒｅｔ−ＰＴｙｒ）は、抗−ホスホチロシン抗体で染色した免疫ブロットであり、下のパネル（Ｒｅｔ）は、対応するフィルターの抗−ｃ−ＲＥＴ抗体での再検出を示す。図２２．ＧＤＮＦは、ｃ−ＲＥＴを一時的に発現するｔｒｋＣ−３Ｔ３繊維芽細胞の数を増加するが（開いた丸）、モックでトランスフェクトした細胞では増加しない（閉じた丸）。５つ並行して、ｃ−ｒｅｔ及びモックでトランスフェクトした細胞を示した濃度のラットＧＤＮＦまたはＮＴ−３で５日間処理した。Ａｂａｃｕｓ^TM（商標）セルプロリファレーションキット（ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＫｉｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて定量した細胞数を成長因子を含まないコントロール細胞のパーセントとして表す。モックでトランスフェクトした細胞に比較して、＊、ｐ＜０．００１。図２３ａ−ｂ．Ｌ６筋芽細胞からのレセプターの精製。（ａ）Ｌ６細胞ライセートの陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた画分のプラズモン共鳴分析。画分の全タンパク質も示す。（ｂ）（ａ）から得られた１Ｍ画分の疎水性相互作用クロマトグラフィーによるさらなる精製。図２４．成体ラットの脳（レーン２）及び肝臓（レーン３）からのタンパク質を用いたリガンドブロット¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦのオートラジオグラフィーフィルム。５０倍過剰の非標識ＧＤＮＦ（レーン１）は、この結合を顕著に減少する。発明の詳細な説明ＧＤＮＦの作用の全範囲及び機構を理解するための前提条件は、ＧＤＮＦレセプター類及びそれらのシグナル伝達経路を特性化することである。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーのレセプターは十分に特性化されているけれども、ＧＤＮＦレセプターは本開示まで特定されないままであった。本明細書に開示されるものは、ＧＤＮＦレセプターの生化学的特性化並びに交感ニューロン及び反応性細胞系におけるそれらの後の反応である。親和性標識を用いて、ＧＤＮＦの胚交感ニューロンへの協同結合を媒介する多数のＧＤＮＦ結合サブユニットを同定する。３０細胞系にわたるスクリーニングでは、最初、縫合神経核からの条件的に不死化したニューロン前駆物質において５５ｋＤ、７０ｋＤ、１３５ｋＤ及び３００ｋＤのＧＤＮＦ結合タンパク質の多量の発現が示された。データが示すように、ＧＤＮＦレセプターは、これらの細胞のニューロン分化後に多量に誘導され、同時にこれらの細胞は、ＧＤＮＦの生存促進作用に感受性になった。これらのサブユニットの異なる組み合わせは、神経膠腫、筋芽細胞及びセルトリ細胞においても見られた。異なるレセプター型が、運動ニューロンハイブリッド細胞系において見いだされ、その主要な成分は、１５５ｋＤのＣＰＩ固定化（ＣＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ）タンパク質であった。他のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーのレセプター型との著しい類似性にもかかわらず、免疫沈降実験により、５５ｋＤ、７０ｋＤ、１３５ｋＤ及び３００ｋＤのＧＤＮＦレセプターサブユニットは新規なタンパク質であることが示された。１５５ｋＤサブユニットは、続いて、排泄及び神経系の部分の発生のために重要なレセプターチロシンキナーゼであるｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子産物、ｃ −ＲＥＴであると決定された。ＧＤＮＦは、縫合神経核及び運動ニューロン細胞系において異なる時間経過でＥＲＫチロシンリン酸化及びｃ−ｆｏｓｍＲＮＡ発現を剌激し、これらは、ＧＤＮＦレセプターサブユニットの異なる補体が異なるシグナル伝達複合体を形成する可能性があることを示唆する。同時に、別の細胞系においてｃ−ＲＥＴがＧＤＮＦのレセプターとして同定された。ＧＤＮＦは、パーキンソン病の損傷モデルにおいてｃ−ＲＥＴ陽性のドーパミン作動性及びノルアドレナリン作動性ニューロンを救済し、これは、成体の脳においてｃＲＥＴがＧＤＮＦの抗パーキンソン病作用を媒介している可能性を示唆する。ｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、（１９８５）Ｃｅ１１、４２、５８１−５８８）は、レセプターチロシンキナーゼ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、（１９８８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、３、５７１−５７８）に構造的に関連したタンパク質をコードしている。その細胞外部分は、稀なカドヘリン様ドメイン及びシステインに富んだドメインも含有し、これらの生物学的役割は理解されていない。選択スプライシングによるｃ−ｒｅｔｍＲＮＡのいくつかのアイソフォームが記述されている（Ｔａｈｉｒａ等、（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、５、９７−１０２；Ｍｙｅｒｓ等、（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１１、２０３９−２０４５；Ｌｏｒｅｎｚｏ等、（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１０、１３７７−１３８３）が、これらの生物学的意味は、現在、理解されていない。いくつかの細胞系において、ｃ−ｒｅｔがコードする１６０ｋＤ及び１４０ｋＤの分子量を有するタンパク質が記述されており、これらは、１２０ｋＤのコアタンパク質のそれぞれ完全及び部分的にグリコシル化されたアイソフォームである（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、１９８８）。他のレセプターチロシンキナーゼでのように、ｃ−ＲＥＴは、ホモダイマー化及びそれに続くそのチロシン残基のリン酸化により活性化される。排泄系では、ｃ−ｒｅｔは、腎管、尿管芽及び集合管の成長端で発現されている（Ｐａｃｈｎｉｓ等、（１９９３）、上記）。ｃ−ｒｅｔ遺伝子のヌル突然変異に関してホモであるマウスは、腎臓がないかまたは未発達のいずれかであり、腸の神経系に重度の欠陥を示し、誕生後すぐに死亡する（Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔ等、Ｎａｔｕｒｅ３６７、３８０−３（１９９４））。この事実に基づき、同種のｃ−ｒｅｔリガンドが、形態形成及び神経発生のための重要な成長因子である可能性があることが提案されていた。ネズミの胚形成中に、ｃ−ｒｅｔｍＲＮＡは、主に神経及び排泄系で発現される。ｃ−ｒｅｔｍＲＮＡは、後根、交感、腸及び脳神経節（Ｐａｃｈｎｉｓ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１９、１００５−１７（１９９３））、並びに移動後の神経冠細胞、並びに褐色細胞腫、甲状腺髄様癌及び神経芽細胞腫を初めとする神経冠起源の様々な腫瘍（Ｉｋｅｄａ、I等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ５、１２９１−６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｍ．等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ５、１５９５−１５９８（１９９０））で見いだされている。発生中の中枢神経系において、ｃ−ｒｅｔの発現部位は、神経管の腹側部分、網膜、並びに脊髄及び後脳の運動ニューロンを含む（Ｐａｃｈｎｉｓ等、（１９９３）、上記）。しかしながら、成体の神経系におけるｃ−ｒｅｔの発現様式はこれまで報告されていない。ｃ−ＲＥＴの既知のリガンドの欠如のために、ｃ−ＲＥＴが媒介する可能性がある細胞内経路の研究が基本的に妨げられていた。繊維芽細胞または造血細胞で発現させた上皮成長因子レセプター／ｃ−ＲＥＴキメラの成長促進活性の比較分析は、上皮成長因子レセプターのものと明らかに区別できる生物学的表現型を示した（Ｓａｎｔｏｒｏ等、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４、６６３−６７５）。本発明者等は、ＮＧＦ及びＧＤＮＦの両方がＰＣ１２細胞の生存を促進し、一方、ＮＧＦのみがその分化を誘導することを本明細書に開示し、ｃ−ＲＥＴ及びＮＧＦのレセプターであるｔｒｋＡのシグナル伝達経路の一部だけの重複を示唆する。アダプタータンパク質Ｇｒｂ２のｃ−ＲＥＴの癌遺伝子型への結合は示されている（Ｂｏｒｒｅｌｌｏ等、（１９９４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、９、１６６１−１６６８）。しかしながら、これらの経路の詳細は、完全には知られていない。ここでは、ＧＤＮＦをリガンドとして用いて、ＧＤＮＦが結合した際のｃ−ＲＥＴの細胞内シグナル伝達を述べることが可能である。ｃ−ＲＥＴのように、ＧＤＮＦは、消化管の筋肉層及び腎臓の凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）間葉で多量に発現されている（Ｓｕｖａｎｔｏ等、（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、８、８１６−８２２）。さらに、本明細書に開示されるように、ＧＤＮＦは発生中の腸のｃ−ＲＥＴ陽性細胞に特異的に結合し、いくつかの細胞系及び発生中の腎臓のｃ−ＲＥＴにＧＤＮＦを架橋することができ、ＧＤＮＦはｃ−ＲＥＴのチロシンリン酸化を特異的に誘導し、３Ｔ３細胞でのｃ−ＲＥＴの異所発現はＧＤＮＦに対するこれらの細胞の生物学的反応を与える。従って、ｃ−ＲＥＴは、ＧＤＮＦにより活性化され、その機能を媒介する。ｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子の産物は、ヒトの疾患において重要な役割を果たしている。ｃ−ｒｅｔ遺伝子の再配列及び突然変異は、いくつかの腫瘍、例えば、家族性甲状腺髄様癌、多発性内分泌腫瘍２型等、並びに後腸の腸ニューロンの欠如を特徴とし、乳児及び成人において便秘症及び巨大結腸をもたらす疾患であるヒルシュスプルング病にも関係している（Ｍａｋ、Ｙ．Ｆ．及びＰｏｎｄｅｒ、Ｂ．Ａ．Ｊ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、６、８２−８６に概説される）。ｃ−ＲＥＴのリガンドとしてＧＤＮＦを同定したことにより、これらの疾患の分子的基礎の分析がさらに可能となる。特に、ｃ−ｒｅｔ遺伝子座が突然変異していない場合のヒルシュスプルング病の可能な原因としてＧＤＮＦ遺伝子の突然変異を研究できる。本明細書で使用する「ＧＤＮＦレセプター」及び「ＧＤＮＦのレセプター」という語句は各々、ＧＤＮＦに結合する単一のサブユニット並びにＧＤＮＦに結合するレセプターサブユニットの組み合わせをいう。本明細書で使用する「作用」という用語は、改変または変化を意味する。作用は、ある物質の増加を生じるような陽性、またはアンタゴニストまたは阻害のような陰性であることができる。本明細書で使用する「相同体」という用語は、本明細書に開示されるような、ＧＤＮＦと類似した生物学的作用を有する化合物または組成物をいう。本明細書で使用する「類似体」という用語は、ＧＤＮＦの生物学的作用に対するアンタゴニスト作用を有する化合物または組成物をいう。ＧＤＮＦレセプターに関連して本明細書で使用する「単離された」という用語は、その本来の環境、または組換え体として発現される場合、その発現環境から分離された化合物を意味する。化合物と関連して本明細書で使用する「実質的に純粋な」という語句は、本来付随する他の成分から分離された単離化合物を意味する。典型的には、例えば、容量、湿量もしくは乾量、またはモルパーセントもしくはモル比で測定した時に、化合物が全物質の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９９％である場合に実質的に純粋である。本明細書で使用する「非許容培養条件」という語句は、インビトロで培養する細胞の生存を通常維持しない条件、例えば、温度、培地成分等をいう。競合アッセイにおける標識したＧＤＮＦの添加に関連して使用する「過剰の」という語句は、競合化合物の検出を促進するために十分な標識したＧＤＮＦの量 −例えば、試験する化合物の量の２倍である標識したＧＤＮＦの量をいう。本明細書で使用する「結合」という用語は、ＧＤＮＦリガンド及びそのレセプター間の相互作用をいい、この結合は十分に強く、かつ十分な時間の間であるので、本明細書に開示されるアッセイの条件下で該結合を検出することができる。数値に関連して「約」という用語は、その数値の±１０％、より好ましくは± ５％、最も好ましくは±２％を意味する。以下に示す特定の実施例は、１）ＧＤＮＦレセプターが、多数の神経及び非神経細胞型に存在する、２）ＧＤＮＦレセプターが、協同して高い親和性結合を得る多数のサブユニットからなる、３）ＥＲＫ／ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーが、ＧＤＮＦのシグナル伝達機構の成分である、そして、４）ｃ−ＲＥＴが、ＧＤＮＦの機能的レセプターである、ことを例示する。１．多数の神経及び非神経細胞型における新規なＧＤＮＦレセプターの発現これまで同定されていなかったレセプターが、本明細書においてＧＤＮＦレセプターとして同定される。これらの新規なＧＤＮＦレセプターは、神経細胞で最も多量であるようであるが、異なる起源の細胞系でも見いだされた。好ましくは、これらの細胞系は、ＲＮ３３Ｂ、ＲＮ４６Ａ及びＣ６（表Ｉ参照）からなる群から選択され、ＲＮ３３Ｂが最も好ましい。多数のこれらの細胞型におけるＧＤＮＦレセプターの同定は、インビボでＧＤＮＦに反応する新規な細胞集団を示唆する。ＧＤＮＦは、ニューロンの異なる亜集団、特にドーパミン作動性及びノルアドレナリン作動性中枢ニューロン、並びに脊髄及び顔の運動ニューロンの生存及び表現型を促進することが示されている。様々なモノアミン作動性ニューロンにおけるＧＤＮＦの活性を考慮すると、骨髄縫合由来の細胞系におけるＧＤＮＦレセプターの発見は、セロトニン作動性ニューロンもインビボでＧＤＮＦに反応する可能性があることを示す。これらの細胞によるＧＤＮＦの内因的発現は、この因子が縫合神経核内でパラクリン／オートクリン様式で作用する可能性があることを示唆する。セルトリＴＭ４細胞におけるＧＤＮＦレセプターの発現は、発生中の精巣におけるＧＤＮＦの非神経的役割を示唆する。インビボで、精巣におけるＧＤＮＦｍＲＮＡの一時的な発現はセルトリ細胞集団の増大と相関関係があり（Ｔｒｕｐｐ等、上記）、これは、ＴＭ４細胞系におけるＧＤＮＦレセプターの発見と共に、セルトリ細胞の成熟中のＧＤＮＦのオートクリン作用を示唆する。同様に、ラット筋芽細胞Ｌ６細胞におけるＧＤＮＦレセプターの存在は、インビボで発生中の筋肉における発現と共に（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ等、上記；Ｔｒｕｐｐ等、上記）、筋肉形成中のＧＤＮＦのパラクリンの役割の可能性を示す。胚の交感ニューロンにおけるＧＤＮＦのレセプター及び生物学的活性の存在にもかかわらず、ＮＧＦで交感様ニューロンに分化させたＰＣ１２細胞は、最初の実験条件下でＧＤＮＦレセプターを発現しなかった。しかしながら、以下に説明するように、最終的にＰＣ１２細胞上にＧＤＮＦレセプターを同定した。ＧＤＮＦレセプターは、脳橋ノルアドレナリン作動性細胞系ＣＡＴＨ．ａ．には存在しない。成体の青班からの中枢ノルアドレナリン作動性ニューロンに対するＧＤＮＦの強力な作用を考慮すると、ＣＡＴＨ．ａ．のＧＤＮＦレセプターの欠如は興味深い。しかしながら、最近、Ｇｏｎｇ等は、ＧＤＮＦが６−ＯＨ−ドーパミン処理により誘導されるＣＡＴＨ．ａ．細胞の変性を防ぐことを報告しており（Ｇｏｎｇ等、２１Ａｂｓ．Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１７８９、１９９５）、これは、６−ＯＨ−ドーパミン損傷後にこれらの細胞でＧＤＮＦレセプターが誘導される可能性があることを示唆している。実際、インビボでの研究は、ＧＤＮＦが、損傷を受けていない青班でよりも６−ＯＨ−ドーパミン注入後に、ノルアドレナリン作動性ニューロンの表現型の強い誘導を引き起こすことを示している。さらに、Ｔｒｅａｎｏｒ等は、最近、中前脳束処理後の黒質の切片におけるＧＤＮＦ結合のアップレギュレーションを報告しており（Ｔｒｅａｎｏｒ等、２１Ａｂｓ．Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３０１、１９９５）、これは、レセプターのアップレギュレーションが中枢神経系におけるＧＤＮＦ応答の制御の一般的な機構である可能性を示唆している。ＧＤＮＦレセプターのアップレギュレーションは、縫合神経核細胞のインビトロでの分化中にも見られた。これらの系は、最近、成体の脳への移植後に局所的微環境シグナルに応答する能力を保持し、移植部位の内因性ニューロンのものと一致する方向に分化することが示されている（Ｓｈｉｈａｂｕｄｄｉｎ等、１５Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６６６６、１９９５）。しかしながら、インビトロで、非許容温度へ移行すると、これらはデフォールト（ｄｅｆａｕｌｔ）経路に沿ってそれぞれグルタメート作動性（ＲＮ３３Ｂ）またはセロトニン作動性（ＲＮ４６Ａ）表現型に分化する。培養における分化は、ニューロトロフィンレセプター類ｐ７５^LNGFR及びｔｒｋＢを初めとする、これらの細胞の他の栄養因子に対するレセプターの発現を増加することも示されている（Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ及びＷｈｉｔe、６１５ＢｒｉｔｉｓｈＲｅｓ．２７、１９９３）。移植の部位により異なるニューロン型を生じることができるけれども、ＲＮ３３Ｂ細胞は神経膠成分を生じることはできず、これは、これらの細胞がニューロンとして限られた多分化能前駆物質であることを示唆している（Ｓｈｉｈａｂｕｄｄｉｎ等、上記）。この点で、２種の多分化ニューロン幹細胞型においてＧＤＮＦレセプターが欠如すること（Ｒｅｎｆｒａｎｚ等、６６Ｃｅｌｌ７１３、１９９１；Ｓｎｙｄｅｒ等、３０６８Ｃｅｌｌ３３、１９９２）に注目することは興味深く、これらの細胞が縫合神経核細胞系よりも制限が少ないことを示唆している。合わせると、これらの結果は、ＧＤＮＦレセプターの発現が、最初、新たに分化した有糸分裂後のニューロンに生じ、そしてニューロンの成熟中に漸次増加する可能性があることを示唆する。２．多数のＧＤＮＦレセプターサブユニットデータは、新規なＧＤＮＦレセプターが、協同して高い親和性結合を達成する多数のサブユニットからなることを示している。従って、ＧＤＮＦの胚の交感ニューロンへの協同結合は、レセプター集合の多段階機構を示す可能性がある。結合アッセイは４℃で実施されるので、結合の協同性は、トランスメンブレンレセプタータンパク質の実質的な横方向の流動性から生じたとは思われず、ＧＤＮＦ結合が、膜上で部分的に実施されるレセプター複合体の構造的変化を導くことを示唆している。また、架橋により得られた異なるＧＤＮＦレセプターサブユニットのほぼ同一の親和性も、部分的に前もって集まったレセプター複合体へのＧＤＮＦの協同結合の概念を支持する。ＧＤＮＦ及びＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー間の構造的類似性は、ＧＤＮＦのレセプターが、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーのレセプターに対して記述された原型のいくつかに一致するかもしれないことを示唆する。実際、本明細書に記述されたＧＤＮＦ結合タンパク質の型は、Ｉ型、II型及びIII型のＴＧＦ−βレセプターと非常に類似している。ＧＤＮＦ及びＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプター間の全体的な類似性にもかかわらず、ミンク肺上皮細胞系ＭｕＩＬｕを初めとする、各種ＴＧＦ−β 及びアクチビンレセプターサブユニットを発現することが知られているいくつかの細胞系でＧＤＮＦレセプターを検出することはできなかった。この結果と一致して、最近単離されたＢＭＰ類のII型レセプター（Ｒｏｓｅｎｗｅｉｇ等、９２ＰＮＡＳＵＳＡ７６３２、１９９５）及び新規な脳特異的Ｉ型レセプター（Ｒｙｄｅｎ等、２１Ａｂｓ．Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ１７５４、１９９５）を初めとする、既知のＩ型及びII型のＴＧＦ−βスーパーファミリーレセプターの異なる組み合わせでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞においてＧＤＮＦの結合は検出されていない（Ｉｂａｎｅｚ、Ｃ．未発表；Ｐ．ｔｅｎＤｉｊｋｅ、私信）。さらに、クローン化したＴＧＦ−βスーパーファミリーレセプターのいずれに対する抗ペプチド抗血清での免疫沈降後も、ＧＤＮＦレセプター複合体を回収することができず、これは、ＧＤＮＦレセプター成分が新規なタンパク質であることを示している。３．ｃ−ＲＥＴはＧＤＮＦのレセプターである。ＧＤＮＦレセプターは、運動ニューロン−神経芽細胞腫ハイブリッド細胞に見いだされたが、同じ神経芽細胞腫とのハイブリッドである基底前脳細胞には見いだされず、これは、ＭＮ−１細胞で検出されるレセプターが、生理学的に関係した運動ニューロンのＧＤＮＦレセプターであることを示唆している。縫合神経核細胞と対照的に、運動ニューロン細胞系でＧＤＮＦ発現を検出することができず、これは、インビボでの筋肉由来のＧＤＮＦの標的由来の作用形態と一致する（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ等、２６６Ｓｃｉｅｎｃｅ１０６２、１９９４；Ｔｒｕｐｐ等、上記）。ＧＤＮＦは、ｃ−ｒｅｔの産物として同定されたこれらのレセプターに結合し、そのチロシンリン酸化を引き起こす。ｃ−ｒｅｔは、未処理の（ｎａｉｖｅ）繊維芽細胞へのトランスフェクションの際に、ＧＤＮＦの結合及びＧＤＮＦに対する生存／生育反応を媒介することもできる。さらに、成体の黒質のドーパミン作動性ニューロンが高いレベルのｃ−ｒｅｔｍＲＮＡを発現することが見いだされ、ＣＮＳのｃ−ＲＥＴを発現しているドーパミン作動性及びノルアドレナリン作動性ニューロンは、インビボで外因性のＧＤＮＦの保護作用に反応した。合わせると、これらの結果は、ドーパミン作動性、ノルアドレナリン作動性及び運動ニューロンに対するＧＤＮＦの神経栄養作用を媒介することができるこの因子の機能的レセプターをｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子の産物がコードすることを示す。本明細書に開示された結果は、ｃ−ＲＥＴレセプターチロシンキナーゼが、ＧＤＮＦのシグナル変換レセプターであることを示す。これまで特徴づけられたＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの全てのレセプターがレセプターセリンートレオニンキナーゼであること（Ｄｅｒｙｎｃｋ、Ｒ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ１９、５４８−５５３（１９９４）；Ａｔｔｉｓａｎｏ等、Ｊ．Ｂｂａ−ＭｏｌＣｅｌｌＲｅｓ、２２２、７１−８０（１９９４））を考慮すると、この発見は意外である。実際、ＧＤＮＦは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの非常に分岐したメンバーであり、主として、アミノ酸配列中の保存されたシステイン残基間の間隔を共有している。レセプターチロシンキナーゼと相互作用する能力は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーからさらに機能的に分岐していることを示す。逆に、これらの発見は、他のＴＧＦ− βスーパーファミリーのメンバーが、レセプターチロシンキナーゼも利用する可能性があることを示唆できるかもしれない。本明細書に開示される以下の結果も、ＧＤＮＦの機能的レセプターとしてｃ− ｒｅｔ癌原遺伝子産物を関係づける。ｉ）ＧＤＮＦは、ｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子を異所的に発現するＣＯＳ細胞に結合する、 ii）ＣＯＳ細胞で異所的に発現したｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子の産物にＧＤＮＦを化学的に架橋することができる、または、ＮＢ２／ａ及びＰＣ１２細胞から、 iii）ＣＯＳ細胞及びＮＢ２／ａ細胞で異所的に発現したｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子産物は、ＧＤＮＦが結合した際にチロシン残基において迅速にリン酸化される、 iv）ＧＤＮＦは、生物学的作用、すなわち、ｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子産物を発現する細胞の有糸分裂促進または栄養作用を促進する。ＧＤＮＦは、ＲＥＴを発現する腸ニューロン及び発生中の腎臓の尿管芽の先端に特異的に結合する（図１９ｃ、ｄ、ｈ）。これらの組織は、ｃ−ｒｅｔ欠失マウスで存在しないかまたは非常に小さくなっていた（Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔ等、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ、３６７、３８０−３８３；Ｄｕｒｂｅｃ等、（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２２、３４９−３５８）。本明細書に開示されたデータは、さらに、ＧＤＮＦ反応性細胞及びｃ−ｒｅｔをトランスフェクトした細胞、並びに胚の腎臓細胞からのＧＤＮＦ−ｃ−ＲＥＴ複合体を示す。最後に、ＧＤＮＦは、時間及び投与量に依存してｃ−ＲＥＴを活性化し、そしてＧＤＮＦに反応しない細胞へのｃ−ｒｅｔの導入は、ＧＤＮＦ反応性をもたらす。４．ＧＤＮＦレセプターにより活性化される先のシグナル伝達経路縫合神経核及び運動ニューロン細胞系におけるＧＤＮＦシグナル変換機構の研究を実施した。これらの細胞においてＧＤＮＦにより引き起こされる先の反応は、本明細書で同定されたＧＤＮＦ結合タンパク質が機能的ＧＤＮＦレセプターであることを示す。ＧＤＮＦシグナル変換経路の最初の生化学的特性化により、ＧＤＮＦシグナル伝達機構の成分としてＥＲＫ／ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーが同定された。リン酸化によるＥＲＫ／ＭＡＰキナーゼの活性化は、ＴＧＦ −β（Ｙａｎ等、２６９Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１３２３１、１９９４；Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ及びＭｕｌｄｅｒ、２７０Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７１１７、１９９５）及び神経成長因子（Ｔｈｏｍａｓ等、６８Ｃｅｌｌ１０３１、１９９２；Ｗｏｏｄ等、６８Ｃｅｌｌ１０ II、１９９２）を初めとする、各種成長因子によるＲａｓ経路の活性化後に始動するキナーゼカスケードの最終工程である。より最近では、Ｒａｓを活性化することは知られていない、インターフェロン類及びインターロイキン類のようないくつかのサイトカイン類により活性化されるシグナル変換経路の一部をＥＲＫ２が形成することも示されている（Ｄａｖｉｄ等、２６９Ｓｃｉｅｎｃｅ１７２１、１９９５）。Ｒａｓの活性化がＧＤＮＦのシグナル変換機構の工程の一つであるかどうかは、さらに興味深い分野である。縫合神経核ＲＮ３３Ｂ細胞及び運動ニューロンＭＮ−１細胞の間でＧＤＮＦで誘導されるＥＲＫのリン酸化のパターンに興味深い相違が見られた。ＲＮ３３Ｂ細胞では、ＧＤＮＦ処理は非常に迅速で（５分で最大）一時的な（６０分後に検出できない）ＥＲＫ１及びＥＲＫ２のチロシンリン酸化を刺激したが、ＭＮ−１細胞では、比較的ゆっくりで（１５分で最大）より持続した（１２０分後になお検出できる）ＥＲＫ２のリン酸化を剌激したが、ＥＲＫ１のリン酸化は剌激しなかった。これらの相違が機能的意義を有する可能性があることが、異なった成長因子で処理されたＰＣ１２細胞で最近得られた結果から示唆されている。ＰＣ１２細胞をＮＧＦまたは繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）にさらすと、ニューロンの分化、並びにＲａｓ活性及びＥＲＫチロシンリン酸化の持続した上昇をもたらす（Ｑｉｕ及びＧｒｅｅｎ、７Ｎｅｕｒｏｎ９７７、１９９１）。対照的に、ＤＮＡ合成及びＰＣ１２細胞の増殖を刺激する上皮成長因子での処理は、Ｒａｓ及びＥＲＫ類の一時的な（＜１時間）活性化のみをもたらす（Ｑｕｉ及びＧｒｅｅｎ、１９９１）。従って、ＥＲＫ活性化の異なる時間経過は、ＰＣ１２細胞において異なる生物学的反応を生じる。合わせると、ＲＮ３３Ｂ及びＭＮ−１細胞におけるＧＤＮＦレセプター及びＧＤＮＦが誘導するＥＲＫリン酸化の異なるパターンは、異なる細胞型では異なるＧＤＮＦレセプターサブユニットが協同して異なるシグナル伝達複合体を作ることができることを示唆する。異なるＧＤＮＦシグナル変換経路がＧＤＮＦの異なる生物学的作用を引き起こすかどうかは、さらに興味深い分野である。活性化されると、ＥＲＫ類は核へ移動し、そこでリン酸化し、それにより転写因子の活性を調節し、次にこれらの転写因子は遺伝子発現を制御する。ｐ６７^SR ^F 及びｐ６２^TCF転写因子のリン酸化は、これらをｃ−ｆｏｓ遺伝子プロモーターの血清反応成分（ＳＲＥ）に集め、ｃ−ｆｏｓ遺伝子の転写を剌激する（Ｇｉｌｌｅ等、３５８Ｎａｔｕｒｅ４１４、１９９２）。ｃ−ｆｏｓの転写は、ＰＣ１２細胞をＮＧＦ（Ｍｉｌｌｂｒａｎｄｔ、８３ＰＮＡＳＵＳＡ４７８９、１９８６）、または骨芽細胞をＴＧＦ−β（Ｍａｃｈｗａｔｅ等、９Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１８７、１９９５）にさらすことを初めとする、各種剌激の後に迅速かつ一時的に誘導される。ｃ−ｆｏｓは、ＡＰ−１転写因子複合体の一部を形成し、この複合体は、成長因子、神経ペプチド及び神経伝達物質の合成酵素遺伝子を初めとする、多数の遺伝子の調節に関与すると考えられている（Ｇｉｚａｎｇ−Ｇｉｎｓｂｅｒｇ及びＺｉｆｆ、４ＧｅｎｅｓＤｅｖ．４７７、１９９０；Ｈｅｎｇｅｒｅｒ等、８７ＰＮＡＳＵＳＡ３８９９、１９９Ｏ；Ｊａｌａｖａ及びＭａｉ、９Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２３６９、１９９４）。ＧＤＮＦによるｃ−ｆｏｓ転写の剌激は、ＧＤＮＦが誘導する遺伝子発現におけるＡＰ−１複合体の役割を示す。従って、ｃ−ｆｏｓは、中枢ノルアドレナリン作動性ニューロンのＧＤＮＦ処理の際に見られるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現の増加、または上頚部神経節からの培養交感ニューロンにおけるＧＤＮＦが誘導する血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）及びプレプロタキキニン−Ａ（ＰＰＴＡ）のｍＲＮＡのアップレギュレーションを媒介する可能性がある（Ｔｒｕｐｐ等、１３０Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３７、１９９５）。分化したセロトニン作動性縫合神経核細胞の生存に対するＧＤＮＦの作用は、これらの細胞で同定されたＧＤＮＦレセプターが、関連する生物学的反応を引き起こすことができることを示している。増殖の停止、分化、及びＧＤＮＦ反応性がこれらの細胞の増加したＧＤＮＦレセプター発現に付随することは、ＧＤＮＦがインビボで発生中のセロトニン作動性縫合神経核ニューロンの生存因子である可能性があることを示唆する。本特許開示のデータは、ＧＤＮＦが媒介するニューロンの生存におけるＥＲＫ類及びｃ−ｆｏｓの役割を示唆する。これは、優性欠陥（ｎｅｇａｔｉｖｅｓ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて直接立証することができる。本明細書に開示されるＧＤＮＦレセプターサブユニット及び複合体は、幅広い用途を有する。ＧＤＮＦレセプターの同定及び単離は、例えば、神経疾患、特に神経細胞死が関与するものの治療に有用な薬剤の合理的な薬剤設計を促進する。先に説明したように、パーキンソン症候群に似た薬理学的処置及損傷の後に、ＧＤＮＦがインビボで成体の黒質ニューロンの生存、並びに他のニューロン細胞系の生存反応を促進することが示されている。ＧＤＮＦレセプターへの結合親和性、及び以下に開示したＧＤＮＦのその後の作用--すなわち、ＥＲＫ２及びＥＲＫ１のリン酸化、に対する影響に関して薬剤を試験することができる。ＧＤＮＦレセプターは悪性細胞系でも同定されているので、癌の治療における使用のための薬剤の設計も明らかである。さらに、ＢＭＰとの構造的類似性を考慮すると、骨に関係した疾患、すなわち、骨粗鬆症の治療に用いられる薬剤、及び骨折の治癒を促す薬剤の開発も考えられるとりわけ、ＧＤＮＦの類似体及び相同体である化合物または組成物を選別するために本発明の単離されたレセプターを使用することができる。まず、単離されたレセプターまたはレセプターを発現する細胞系--すなわち、ＮＢ２／ａ細胞-- のいずれか及び¹²⁵Ｉで標識したＧＤＮＦを用いる競合結合アッセイにおいて、類似体及び相同体の可能性のあるものを選別することができる。実施例１３に開示されたもののような方法を用いることができる。次に、例えば、ＲＥＴ癌原遺伝子のチロシンリン酸化のそれぞれ減少または増加に作用するこれらの化合物及び組成物をさらに同定することにより、類似体または相同体の活性を確かめることができる。実施例１７に開示されたもののような方法を用いることができる。また、上に引用した方法またはそれらの変形を用いて、他のレセプターを選別し、同定するためにＧＤＮＦを用いることができる。また、ＧＤＮＦレセプターの単離は、レセプターに対するポリクローナル及びモノクローナルの両方の抗体の開発を促進する。レセプター自体を精製し、ＧＤＮＦレセプターを発現する他の細胞を同定し、それにより他の治療用途を促し、他のＩ型相互作用レセプターを同定するためにこれらの抗体を用いることができ、並びに薬剤自体として用いることができる。まず、本明細書に開示されるリガンド／レセプター複合体を免疫原として用いることにより、これらの抗体を作ることができる。リガンドでの吸着により、リガンドに特異的な抗体をポリクローナル血清から取り除くことができる。リガンドの結合に基づいて、モノクローナルの生産のためのハイブリドーマを選択することができ、レセプターと複合体を形成していないリガンドには結合しないクローンのみを増やす。当業者によく知られた方法により、抗体を調製することができる。また、ＧＤＮＦレセプター及びＧＤＮＦタンパク質に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体をＧＤＮＦレセプター分子クローンの特性化及び／または単離ために使用することができる。さらに、相同体の選別、またはＧＤＮＦに似た抗−イディオタイプ抗体の生産に抗−ＧＤＮＦ抗体をおそらく使用することができる。また、ＧＤＮＦレセプターの単離は、診断及び治療用途のための、インビトロ及びインビボの両方の、組換え体ＧＤＮＦレセプターの発現のための核酸の単離及び／または生産も促進する。本明細書に用いる「核酸」という用語は、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを含む。ＧＤＮＦレセプターの少なくとも一部をシークエンスすると、ＧＤＮＦレセプターのゲノムＤＮＡ及びレセプターのｍＲＮＡを単離するためのオリゴヌクレオチドプライマーを開発することができる。単離されたｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製することができる。核酸の単離及び生成は、引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８２に記述されるような標準的な分子生物学技術を用いた当業者によく知られている方法を利用して達成することができる。組換え体として生産されたレセプターを合理的薬剤設計のための結晶学研究に用いることができる。組換え体の細胞外ドメインを作り、リガンドを除去する用途の薬剤として、例えば、アンタゴニスト特性を有するリガンドに使用することができる。上記の核酸を、インビボ及びエクスビボ技術の両方を用いて、遺伝子治療に利用することができる。また、例えば、低いストリンジェンシーのスクリーニング及び逆転写酵素ＰＣＲを用いて他の関連したレセプターをクローン化するため、そして例えばパンニングによる他のリガンドのスクリーニング、並びにレセプターアゴニスト、アンタゴニストまたは部分的なアゴニスト及びアンタゴニストとして働く他の物質のスクリーニングのためのレセプターを過剰発現する細胞を作るためにこれらの核酸を使用することができる。また、組換え体として作られたレセプター自体をスクリーニングアッセイに用いることができる。さらに、シグナル経路を解明するために、他のＴＧＦ−βレセプターファミリーのメンバーを用いてキメラのレセプターを発現する細胞を作ることができる。例えば、酵母の２−ハイブリッド系（Ｃｈｅｎ等、３７７Ｎａｔｕｒｅ５４８、１９９５、引用することにより本明細書に組み込まれる）を用いて、ＧＤＮＦレセプターの細胞内の標的を同定することができる。また、トランスジェニック及び／または遺伝子標的動物を開発するために、上記の核酸を用いることもできる。例えば、ＧＤＮＦレセプターの過剰発現の作用を試験するためのトランスジェニック動物を開発することができる。両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｈｏｇａｎ等、ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｌｙｏ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８６及びＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．、ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ、５：７０−７６、１９８９に記述されるような方法を利用することができる。また、ＧＤＮＦによるシグナル伝達を阻止した影響を確かめるために、ＧＤＮＦレセプターを発現することができない細胞系及びトランスジェニック動物を調製することができる。引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｗｕｒｓｔ等、ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ第１２６巻、Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ編集、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆ oｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、ｐｐ３３−６１、１９９３に記述されるような方法を利用することができる。他の応用及び修正は、本明細書に開示される本発明の意図及び範囲内であり、当業者に容易に明らかである。実施例以下の実施例は、本発明を明らかにするためであり、開示または請求の範囲を限定するためではない。別に示さないかぎり、結合及び生化学的研究は、バキュロウイルス発現系を用いてＳｆ２１昆虫細胞で生産された組換え体ラットＧＤＮＦを用いて実施された。タンパク質は、以前に記述されたように（Ｔｒｕｐｐ等、上記、引用することにより本明細書に組み込まれる）生産され、精製された。ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルの銀染色後に、ＧＤＮＦと類似した分子量のタンパク質の市販されている試料で得られた標準曲線を用いてＧＤＮＦタンパク質を定量した。精製されたヒトＴＧＦ−β１は、Ｊｕｎ−ｉｃｈｉＫｏｕｍｅｇａｗａ、ＫｉｒｉｎＢｒｅｗｅｒｙ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎから提供された。クロラミン−Ｔ法によりタンパク質をＮａ−¹²⁵ Ｉで約１ｘ１０⁸ｃｐｍ／μｇの非活性に標識した。別に示さないかぎり、結合アッセイを以下のように実施した。ミリポアハイドロフィリックデュラポア（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＨｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃＤｕｒａｐｏｒｅ）９６ウェル濾過プレート上でダルベッコのリン酸緩衝食塩水及び２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で、細胞をヨウ素化したＧＤＮＦとインキュベートした。４℃で２時間強く振盪した後、真空下でよく冷えた結合バッファーで細胞を２回洗浄した。乾燥したフィルターをはずし、結合した¹²⁵ Ｉ−ＧＤＮＦをガンマカウンターで定量した。５００倍過剰のコールドリガンドを結合混合物に添加することにより、非特異的結合を測定した。親和性標識のために、ヨウ素化したタンパク質を初期ニューロンまたは細胞系の単層培養物に結合させた。結合前に、解離させたヒヨコ交感ニューロンをポリオルニチン／ラミニン被覆皿でＮＧＦの存在下で４８時間培養した。培養した細胞を上記の結合バッファー中で１０ｎｇ／ｍｌの¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦと４℃でインキュベートした。ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）または１−エチル− ３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ）のいずれかを用いて、室温で３０分間、リガンド／レセプター複合体を化学的に架橋させた。架橋反応をクエンチした後、１０ｍＭＴｒｉｓ／Ｈｃｌ緩衝食塩水、２ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ＮＰ−４０、１％Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアンチパイン、５０μｇ／ｍｌアプロチニン、１００ｐｇ／ｍｌベンズアミジン塩酸塩、１０μｇ／ｍｌペプスタチン及び１ｍＭＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ製のプロテイナーゼインヒビター）で細胞を２回洗浄した。澄んだライセートをＳＤＳ／β−メルカプトエタノールバッファー中で５分間沸騰させ、４−２０％濃度勾配の電気泳動ゲルでＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、オートラジオグラフィーで視覚化した。示した分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで視覚化した架橋複合体の見積もった分子量からＧＤＮＦリガンドモノマーの量、例えば２５−３０ｋＤ、より好ましくは２３ｋＤを引くことにより得られた。架橋複合体の親和性測定では、増加する量の非標識ＧＤＮＦの存在下で上記のようにプレート上で細胞をインキュベートした。これらの試料を濃度勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、次にゲルを乾燥し、オートラジオグラムから決定された分子量に従って特定のバンドを切り出し、ガンマカウンターで数えた。親和性標識したレセプター複合体の免疫沈降では、ヨウ素化したリガンドの結合及び架橋の後に、細胞ライセートを清澄にし、異なるＩ、II及びIII型のＴＧＦ−βスーパーファミリーレセプターに対する５− １０μｌの抗ペプチドウサギ抗血清（ｔｅｎＤｉｊｋｅ等、２６４Ｓｃｉｅｎｃｅ１０１、１９９４）（ＰｅｔｅｒｔｅｎＤｉｊｋｅ）ＬｕｄｗｉｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎから提供された）と４℃で一晩インキュベートした。免疫複合体をプロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて集め、溶菌バッファー中で洗浄し、５分間沸騰させ、その後、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジトグラフィーを実施した。実施例１胚の交感ニューロンのＧＤＮＦレセプターＧＤＮＦは、神経成長因子（ＮＧＦ）と同様な効力及び投与量反応曲線で培養したニワトリ胚交感ニューロンの生存を促進する（Ｔｒｕｐｐ等、上記）。先に記述されたように（Ｔｒｕｐｐ等、上記）ニワトリ交感ニューロンを単離し、調製した。トリプシンの存在下で物理的に解離させた１０日胚（Ｅ１０）のヒヨコ脊椎傍交感神経節から単離したニューロンにヨウ素化したＧＤＮＦを用いた飽和結合を実施した。ニューロンを増やし、レセプターを再発現させるために、この調製物を未処理の組織培養プラスチック上で２時間前もって培養した。飽和結合データのプロットは、Ｓ字形曲線を生じ、これから４００ｐＭのＫｄが概算できた（図１ａ）。この曲線のＳ字形特性と一致して、このデータのスキャッチャード変換は、協同結合を示す逆Ｕ字形曲線を生じた（図１ｂ）。１．６３のプラスの勾配を生じるヒル変換から結合の協同性の大きさを確認することができ、これは、リガンドまたはレセプターサブユニットのいずれかのオリゴマー化を示唆している。交感ニューロンの膜上のＧＤＮＦ結合成分を同定するために、¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦのこれらの細胞への化学的架橋を用い、続いて、得られた複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで視覚化した。濃度勾配ゲル電気泳動は、７０及び３００ｋＤ（以下に報告するＧＤＮＦレセプターサブユニットの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで視覚化された架橋複合体の見積もった分子量からＧＤＮＦリガンドモノマーの量、例えば２３ｋＤを引くことにより求められた）の結合タンパク質を分離し、ＭｕＩＬｕミンク肺上皮細胞へのＴＧＦ−β１の架橋後に得られたものに類似したバンドのパターンを生じた（図２）。この結果は、ＴＧＦ−βレセプターのように、ＧＤＮＦ結合タンパク質もオリゴマーのレセプター系を形成している可能性があることを示唆した。大過剰のコールドリガンドは、レセプター複合体からヨウ素化したＧＤＮＦを置換し、標識の特異性を示した。実施例２細胞系のＧＤＮＦレセプターヨウ素化したＧＤＮＦでの親和性標識を用いて、３０にわたる細胞系をＧＤＮＦレセプターの発現に関して選別した（表Ｉ、下記）。別に記述しないかぎり、この試験に用いた全ての細胞系は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手でき、ＡＴＣＣにより記述されている。Ａ８７５ヒト神経芽細胞腫は、ＭａｒｔＳａａｒｍａ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄから提供された。チロシンヒドロキシラーゼプロモーターの転写制御下でＳＶ４０Ｔ抗原を発現するトランスジェニックマウスの脳橋の腫瘍から単離されたノルアドレナリン作動性細胞系、ＣＡＴＨ．Ａ（Ｓｕｒｉ等、１９９３）は、ＤｏｎａＣｈｉｋａｒａｉｓｈｉ、ＴｕｆｔｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡにより作製され、提供された。ラット神経幹細胞系Ｃ１７−２（Ｓｎｙｄｅｒ等、６８Ｃｅｌｌ３３、１９９２）は、ＥｖａｎＳｎｙｄｅｒ、ＨａｒｖａｒｄＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡにより作製され、提供された。ＬＡＮ５ヒト神経芽細胞腫は、ＳｖｅｎＰａｈｌｍａｎ、ＵｐｐｓａｌａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｗｅｄｅｎから提供された。ＤａｖｉｄＨａｍｍｏｎｄ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｃａｇｏは、マウス基底前脳コリン作動性ニューロン及びマウス神経芽細胞腫Ｎ１８ＴＧ２のハイブリッドであるＳＮ６細胞を作製し、提供した（Ｈａｍｍｏｎｄ等、１９８６）。ヒト神経芽細胞腫ＳＹ５Ｙは、ＤａｖｉｄＫａｐｌａｎ、ＡＢＬ−ＢａｓｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒａｍ、ＮＣＩ −ＦｒｅｄｅｒｉｃｋＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｅｎｔｅｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤから提供された。ＳＴ１５Ａラット神経幹細胞系は、ＲｏｎＭｃＫａｙ、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｄｏｆＨｅａｌｔｈ、ＭＤから提供された。縫合神経核細胞系ＲＮ３３Ｂ及びＲＮ４６Ａの生成及び特性化は、他に記述されている（Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ及びＷｈｉｔｅ、１９９３）。ＲＮ３３Ｂ及びＲＮ４６Ａ細胞は、マイアミ大学のＳｃｏｔｔＷｈｉｔｔｅｒｍｏｒｅ博士から入手した。運動ニューロンハイブリッド細胞系２ＦＩ．１０．１４（本明細書ではＭＮ−１という）は、以前に記述されている（Ｓａｌａｚａｒ−Ｇｒｕｅｓｏ等、２Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ５０５、１９９１）。多数のＧＤＮＦレセプターサブユニットが、各種の神経膠、神経及び非神経細胞で検出された（表Ｉ）。ジスクシミジルスベレート（ＤＳＳ）での架橋後、いくつかの細胞系において３００ｋＤの高分子量バンドが最も主要な種類であるようであり、これは、全ての他のレセプターの非存在下でリガンドに結合すると思われる唯一のレセプターであった（表Ｉ）。類似したパターンが、ラットＣ６神経膠腫、マウスセルトリＴＭ４細胞、並びにグルタメート（ＲＮ３３Ｂ）及びセロトニン（ＲＮ４６Ａ）の合成酵素を初めとする多数のニューロンマーカーを発現することが以前に示されている（Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ及びＷｈｉｔｅ、６１５ＢｒａｉｎＲｅｓ．２７、１９９３；Ｗｈｉｔｅ等、１４Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．、１９９４；Ｅａｔｏｎ等、１７０Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６９、１９９５）ラット縫合神経核の胚ニューロン前駆物質由来の２種の細胞系において見られた。ＤＳＳでの架橋後のこれらの細胞における一致したパターンは、３００ｋＤの高分子量バンド、並びにそれぞれ５０−５５ｋＤ及び６５−７０ｋＤの分子量を有する２個の他のレセプターサブユニットからなった（図３及び表Ｉ）。５０−５５ｋＤの成分は、しばしば、ダブレットまたはトリプレットとして泳動した。高分子量成分により示されるスミアーの出現及び大きさの不均一な範囲は、翻訳後の修飾、おそらくグリコシル化を示唆し、これは、III型ベータグリカンＴＧＦ−βレセプターに関して以前に記述されたものと類似しているようである。この種類は、縫合神経核由来の細胞では幾分小さく、異なるコアタンパク質または異なったレベルのグリコシル化のいずれかを示すことができた。ＮＧＦが誘導する交感ニューロン様表現型への分化の後でさえ、４℃の現在のアッセイ条件下で褐色細胞腫ＰＣ１２細胞においてＧＤＮＦレセプターを検出できなかった（表Ｉ、データは示さない）。各種神経芽細胞腫及び２種の多分化ニューロン幹細胞では、ＧＤＮＦレセプターの発現は、全くみられないか、非常に少量であった（表Ｉ）。示した細胞系における特定のＧＤＮＦレセプター複合体の存在（＋）または欠如（−）架橋剤エチル−ジメチル−アミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いた親和性標識は、ＤＳＳ架橋複合体でゲルの非常に長い露出の後にのみ見られる１２０−１３５ｋＤのさらなるＧＤＮＦレセプター成分の存在を明らかにした（図３）。ＤＳＳのように、ＥＤＡＣもＧＤＮＦを５０−５５ｋＤ及び６５−７０ｋＤのレセプターに架橋したが、しかしながら、３００ｋＤの高分子量サブユニットは、ＥＤＡＣではあまり効率よく架橋されなかった（図３）。縫合神経核細胞系は、条件的にのみ不死化され、トランスフォーメーションの兆候を示さない。非許容温度で、そして特定の培地中で、これらは増殖を停止し、有糸分裂後のニューロンに分化する（Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ及びＷｈｉｔｅ、１９９３）。ＧＤＮＦの結合は、分化後のＲＮ３３Ｂ及びＲＮ４６Ａ細胞で大きく増した（示さない）。全体的なパターン及びＧＤＮＦレセプター成分の相対的な量は、分化後に変化しなかった。ラット筋芽細胞系Ｌ６のＧＤＮＦ結合タンパク質の分析は、５０−５５ｋＤ及び６５−７０ｋＤレセプターが明らかに存在しないことを特徴とする異なるレセプターサブユニットのパターンを示した。ＤＳＳでの架橋後に２００−４００ｋＤの高分子量成分のみを見ることができた（図３）。しかしながら、ＥＤＡＣでの架橋は、Ｃ６、ＴＭ４及び縫合神経核細胞系で以前に見られた１２０−１３５ｋＤサブユニットを容易に標識した（図３）。これらの他の細胞系でのように、この成分は、Ｌ６筋芽細胞においてもダブレットとして泳動する。異なるレセプター複合体を胚マウス脊髄運動ニューロンハイブリッド細胞で見いだした（図３）。この系は、Ｅ１４マウス脊髄運動ニューロン及びＮ１８ＴＧ２マウス神経芽細胞腫の融合、及びそれに続く、高レベルのコリンアセチルトランスフェラーゼ活性を発現しているクローンの選択により得られた（Ｓａｌａｚａｒ−Ｇｒｕｅｓｏ等、２Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ５０５、１９９１）。重要なことには、胚マウス基底前脳コリン作動性ニューロン及び同じＮ１８ＴＧ２神経芽細胞腫のハイブリッド細胞系であるＳＮ６（Ｈａｍｍｏｎｄ等、２３４Ｓｃｉｅｎｃｅ１２３７、１９８６）がＧＤＮＦレセプターを全く示さず（表Ｉ）、これは、運動ニューロン細胞（以下、ＭＮ−１と称する）で見られたＧＤＮＦ結合タンパク質が、脊髄の運動ニューロンに存在するＧＤＮＦレセプター成分であると思われることを示す。Ｌ６筋芽細胞でのように、ＭＮ−１細胞で顕著なレセプターは、これらの細胞では１５５ｋＤのより大きいタンパク質であったけれども、ＥＤＡＣで優先的に架橋された（図３）。続いて、これは、ｃ−ＲＥＴレセプターであると同定された（以下の実施例９を参照）。ＭＮ−１細胞は、６５−７０ｋＤの結合タンパク質及び少量の３００ｋＤレセプターも発現した（図３及び表Ｉ）。ＧＤＮＦレセプターサブユニットの個々の成分の親和性を分析するために置換結合アッセイを実施し、架橋及びＳＤＳ−ＰＡＧＥをこれに続。レセプター−リガンド複合体をオートラジオグラフィーで視覚化し、ゲルから切り出し、ガンマカウンターで数えた。得られた置換曲線は、ＲＮ３３Ｂ及びＮＭ−１細胞の全ての成分に対して約０．２ｎＭのＫｄを示した（図４ａ−ｃ）。これらのデータは、現在のところ、全てのＧＤＮＦレセプターサブユニットが同じような結合親和性を示すかどうか、または高い親和性のレセプター複合体を組み立てるためにこれらが全て必要とされるかどうかをはっきりとは立証していない。実施例３ＧＤＮＦレセプターの生化学的特性化ＧＤＮＦ及びＴＧＦ−β間のレセプターのパターンの全体的な類似性から、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの以前に同定されたレセプターのいずれかがＧＤＮＦレセプター複合体の一部であるかどうかの試験が促された。Ｉ型レセプター（ＡＬＫ−１ないしＡＬＫ−６）、II型レセプターのＴＢＲII、ＡｃｔＲII及びＢＭＰＲII、III型レセプターのベータグリカン及びエンドグリンを初めとするあらゆるクローン化されたＴＧＦ−ｆ３スーパーファミリーレセプターに特異的な異なる抗−ペプチド抗血清を用いた免疫沈降に、分化したＲＮ３３Ｂ細胞からの架橋¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦ−レセプター複合体を供した。並行したコントロール実験では、¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β１をミンク肺上皮細胞系ＭｖＩＬｕのＩ型、II型及びIII型レセプターに架橋し、続いて、それぞれＴＢＲＩ（ＡＬＫ−５）、ＴＢＲII及びベータグリカンに対する抗血清で免疫沈降した。コントロール実験ではＩ型、II型及びIII型のＴＧＦ−βレセプターが回収されたけれども、分化したＲＮ３３Ｂ細胞のＧＤＮＦレセプター成分のいずれも、あらゆる試験した抗血清で免疫沈降することができなかった（示さない）。これらのデータから、これらの細胞で発現されるＧＤＮＦレセプターサブユニットが新規なタンパク質であることが確かめられた。実施例４ＧＤＮＦレセプターを発現する細胞系における内因性ＧＤＮＦの発現神経栄養因子の作用の伝統的なモデルは、特定のニューロン亜集団の生存及び分化を促進する標的由来のポリペプチドとしてこれらを記述している。より最近では、神経栄養因子がパラクリン及びオートクリン形態さえの作用も有する可能性があることが明らかになっている（Ｅｒｎｆｏｒｓ及びＰｅｒｓｓｏｎ、３Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９５３、１９９１；Ａｃｈｅｓｏｎ等、３７４Ｎａｔｕｒｅ４５０、１９９５）。ＧＤＮＦレセプターを発現する細胞系におけるＧＤＮＦｍＲＮＡの発現を調べた。細胞をグアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）及びβ−メルカプトエタノール中でホモジナイズした。ＲＮＡ抽出及びＧＤＮＦＲＮａｓｅ保護アッセイは、以前に記述されている（Ｔｒｕｐｐ等、上記）。意外にも、運動ニューロン系のＭＮ−１を除いた全ての細胞系が、ＲＮａｓｅ保護分析によりアッセイされた場合にかなりのレベルのＧＤＮＦｍＲＮＡを発現した（図５）。最も多量のＧＤＮＦｍＲＮＡ発現は、縫合神経核からの細胞で見られ、これは発生中のラットのＧＤＮＦｍＲＮＡの最も豊富な供給源の一つである出生後１日（Ｐ１）の腎臓（Ｔｒｕｐｐ等、上記）のものより５倍まで多量の発現を示した。興味深いことには、ＲＮ３３Ｂ細胞が分化すると、ＧＤＮＦｍＲＮＡの発現は、未分化の細胞のレベルの約３０％まで減少した（図５）。分化したＲＮ３３Ｂ細胞のＧＤＮＦ処理は、ＧＤＮＦｍＲＮＡ（図５）またはＧＤＮＦレセプター（示されない）の発現を変えなかった。ＲＮａｓｅ保護アッセイを用いて、ｃ−ｒｅｔｍＲＮＡの発現をＲＮ３３Ｂ、Ｌ６及びＭＮ−１細胞で調べた。マウスｃ−ｒｅｔｍＲＮＡのキナーゼドメインからのコーディング配列の４００ヌクレオチドに相補的なリボプローブを用いて、示した細胞系からの１０μｇの全ＲＮＡを分析した。ＭＮ−１細胞では多量の発現が見られたけれども、ＲＮ３３ＢまたはＬ６細胞のいずれにおいてもｃ−ｒｅｔｍＲＮＡは検出されなかった（図６）。これらの結果は、ｃ−ＲＥＴ以外のＧＤＮＦのシグナル伝達レセプターがこれらの細胞に存在するにちがいないことを示している。実施例５ＧＤＮＦ反応性細胞系のＥＲＫシグナル変換経路の活性化細胞系において特性化されたＧＤＮＦ結合タンパク質がリガンドに依存したシグナル伝達複合体を形成できるかどうかも調べた。１０ｃｍプレート中の細胞単層を５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦの存在下で３７℃で示した期間インキュベートし、すぐに１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを添加したよく冷えた（上記のような）溶菌バッファー１ｍｌで溶菌させた。全細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）で分離し、ニトロセルロースフィルターにブロットした。ウェスタンブロットを抗−ホスホチロシン抗血清（ＵＢＩ、ＬａｋｅＰｌａｃｅｄ、ＮＹ）、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧで検出し、ＥＣＬウェスタンディテクションシステム（ＷｅｓｔｅｒｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）を用いて染色した。再検出のために、まず、６２．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ６．７、１００ｍＭβ−メルカプトエタノール、２％ドデシル硫酸ナトリウム中、５０℃で３０分のインキュベーションによりブロットをはがした。抗体の除去後、ＥＲＫ１及びＥＲＫ２の両方を認識する、組み換え体ラットＥＲＫ２に対して作製されたウサギポリクローナル抗血清（ＴｅｒｉＢｏｕｌｔｏｎ、ＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ．、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹの贈与）を用いて検出し、西洋わさびぺルオキシダーゼ結合ヤギ抗−ウサギ二次抗体を用いて上記のように染色した。ＧＤＮＦレセプターサブユニットのパターンが異なるため、まず、縫合神経核細胞系ＲＮ３３Ｂ及び運動ニューロン細胞系ＭＮ−１において細胞内シグナル伝達反応を特性化した。ＲＮ３３ＢまたはＭＮ−１細胞のＧＤＮＦ処理により引き起こされるチロシン−リン酸化タンパク質のパターンの変化を調べた。チロシンリン酸化は、多数のサイトカイン及び成長因子により剌激される細胞内シグナル伝達タンパク質の調節の一般的な機構である。ＲＮ３３Ｂ及びＭＮ−１単層を飽和濃度のＧＤＮＦ（５ｎｇ／ｍｌ）に異なる期間さらし、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ及び抗−ホスホチロシンモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより全細胞ライセートをチロシンリン酸化に関して分析した。ＲＮ３３Ｂ細胞のＧＤＮＦ処置の５分以内に、それぞれ４２ｋＤ及び４４ｋＤに相当する移動度を有する２つのタンパク質がチロシンでリン酸化された（図７Ａ）。ＧＤＮＦにさらした分化したＲＮ３３Ｂ細胞で同様の結果が得られた（示さない）。成長因子が誘導するタンパク質チロシンリン酸化の他の記述（Ｑｉｕ及びＧｒｅｅｎ、９Ｎｅｕｒｏｎ７０５、１９９２）との大きさの比較に基づくと、４２ｋＤ及び４４ｋＤの種類は、それぞれ、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ、微小管結合タンパク質キナーゼとも呼ばれる）ファミリー（Ｂｏｕｌｔｏｎ等、６５Ｃｅｌｌ６６３、１９９１）のタンパク質セリン−トレオニンキナーゼの２つのメンバーであるｐ４２，ｋ２及びｐ４４，ｋＩであると思われる。これらのタンパク質がそれぞれＥＲＫ２及びＥＲＫ１と同一であることを確認するために、抗−ホスホチロシン抗体と反応させたタンパク質ブロットをはがし、タンパク質ブロットでＥＲＫ１及びＥＲＫ２の両方を認識する、組換え体ＥＲＫ２に対して作製されたＥＲＫウサギポリクローナル抗体を用いて再検出した。抗−ホスホチロシン抗体及び抗−ＥＲＫ２抗体で検出したブロットのオートラジオグラムの比較により、ｐ４２及びｐ４４タンパク質をそれぞれＥＲＫ２及びＥＲＫ１と同定した（図７ａ）。ＭＮ− １細胞のＧＤＮＦ処理は、ＥＲＫ２のリン酸化のみを剌激するようであるけれども、ＥＲＫ１及びＥＲＫ２の両方がＭＮ−１細胞ライセートに存在した（図７ｂ）。このように、ＧＤＮＦ処理は、ＲＮ３３Ｂ細胞では迅速で一時的なＥＲＫ１及びＥＲＫ２のチロシンリン酸化を剌激するが、ＭＮ−１細胞では比較的遅い、より持続したＥＲＫ２のリン酸化を剌激した。ＥＲＫ経路の活性化が、ｃ−ｆｏｓ癌原遺伝子を初めとする即時型初期遺伝子の転写の迅速で一時的な増加を誘導することが以前に示されている（Ｇｉｌｌｅ等、３５８Ｎａｔｕｒｅ４１４、１９９２）。それ故、分化した縫合神経核ＲＮ３３Ｂ細胞及び運動ニューロンＭＮ−１細胞におけるｃ−ｆｏｓｍＲＮＡを誘導するＧＤＮＦの能力を調べた。細胞系におけるｃ−ｆｏｓｍＲＮＡの分析では、細胞単層への１００ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦの添加の９０分前に培養培地を変えた。示した時間間隔で培地を除去し、グアジニンイソチオシアナート及び β−メルカプトエタノールで細胞を可溶化し、ＲＮＡを以前に記述されたように（Ｔｒｕｐｐ等、上記）抽出した。２０μｇの全ＲＮＡを０．７％ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルで分離し、ハイボンド−Ｃ（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ）膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）に移した。ノーザンブロットをα−³²Ｐ−ｄＣＴＰで標識したラットｃ−ｆｏｓ遺伝子フラグメント（Ｃｕｒｒａｎ等、２Ｏｎｃｏｇｅｎｅ７９、１９８７）でハイブリダイズし、高いストリンジェンシーで洗浄し、ｘ−線フィルムでオートラジログラフィーにより視覚化した。細胞単層を飽和濃度のＧＤＮＦに異なる期間さらし、続いてｃ−ｆｏｓｍＲＮＡのレベルを全ＲＮＡのノーザンブロットで分析した（図８）。この分析は、ＲＮ３３Ｂ細胞をＧＤＮＦに露出した１５分後のｃ−ｆｏｓｍＲＮＡの一時的なアップレギュレーション、処理の４５分後の基礎レベルへの回復を示した（図８ａ）。ｃ−ｆｏｓｍＲＮＡは、ＭＮ−１細胞でもアップレギュレートされたが、これはＧＤＮＦ処置後３０分たってからであった（図８ｂ）。上昇したｃ− ｆｏｓｍＲＮＡレベルは約１時間持続し、そして処理の開始後１２０分で基礎レベルに戻った（図８ｂ）。従って、ＥＲＫ類のチロシンリン酸化のように、ＧＤＮＦ処置により誘導されるｃ−ｆｏｓｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＲＮ３３Ｂ細胞では非常に迅速で一時的であったが、ＭＮ−１細胞では幾分ゆっくりであった。実施例６分化した縫合神経核細胞においてＧＤＮＦにより促進される生存反応ＧＤＮＦが分化した縫合神経核ニューロンの生存因子であるかどうかを調べるために、縫合神経核セトロニン作動性細胞系ＲＮ４６Ａの条件的な不死化特性を利用した。以前に記述されたように（Ｅａｔｏｎ等、１９９５、上記）生存アッセイを実施した。簡潔に言えば、１０⁵のＲＮ細胞をコラーゲン／ファイブロネクチンを被覆した８ウェルガラススライドに接種し、７５−９０％の融合まで３３℃（生育許容温度）でインキュベートした。次に、これらのスライドを３９℃（非許容温度）に移し、０−５０ｎｇ／ｍｌｒｈＧＤＮＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を加えてまたは加えずに１％ＢＳＡ、１μｇ／ｍｌトランスフェリン、５μｇ／ｍｌインシュリン、１００ｍＭプトレシン及びｎＭプロゲステロンを含有するＢ１６限定培地（Ｂｒｅｗｅｒ及びＣｏｔｍａｎ、４９４ＢｒａｉｎＲｅｓ．６５、１９８９）に血清を含有する培地を置き換えた。培地及びＧＤＮＦを２日ごとに８日間置き換え、その後、細胞を４％パラホルムアルデヒド／２％グルタルアルデヒド中で固定し、すすぎ、そして生存できる神経核を染色するために１ｍＭビスベズアミド（ヘキスト色素３３３４２）を含有するグリセロール顕鏡用培地で被覆した。ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡で細胞の視野を４０ｘに拡大し、蛍光を放つ神経核を調べ（３５５ｎＭで励起、４６５ｎＭの放射）、これらの像をビデオで捕らえ、ＩｍａｄｅＩ^TM（商標）ソフトウェアで細胞を数えた。各条件に対して３回の独立した実験の各々から１０視野の細胞を数えた。増加する濃度のＧＤＮＦの存在下で限定培地中でＲＮ４６Ａ細胞を非許容温度で培養した。接種の９日後に、生存細胞を数え、ＧＤＮＦの非存在下で樹立された培養物と比較した。ＧＤＮＦの存在下で生育した培養物で、生存細胞の数の３倍の増加が見られた（図９）。分化したＲＮ４６Ａ細胞の生存に対するＧＤＮＦの作用は投与量に依存し、５ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を有した。実施例７抗−ＧＤＮＦモノクローナル抗体の作製、クローニング及び特性化免疫法５匹の若いメスのマウスを完全フロインドアジュバント（ＦＡ）で乳化した昆虫細胞由来の組換え体ＧＤＮＦ３５μｇで免疫した。不完全ＦＡ中で最初の免疫の２及び４週後に２次及び３次免疫を実施した。全ての注射を腹腔内（ｉ．ｐ．）に与えた。最後の免疫の２週後に、標準的な方法を用いたＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット分析により血清中の抗体力価を調べた。最も高い力価（１：２０００より高い）を有するマウスに不完全ＦＡ中の３μｇのＧＤＮＦをｉ．ｐ．で追加投与して免疫を高め、３日後に細胞融合を実施した。細胞融合いくつか修正して、引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）の方法に従って、細胞融合を実施した。ａ）融合の前日：Ｓｐ２／０ネズミ細胞系からの生存できる細胞を完全ＤＭＥＭ（１０％ウシ胎仔血清、１％Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ストレプトマイシン硫酸塩）を用いて２ｘ１０⁵細胞／ｍｌに調整した。０．３４Ｍショ糖溶液の注入により、腹腔から非免疫マウスからの細胞を得た。これらの細胞をヒポキサンチン１００μＭ、アミノプテリン０．４Ｍ及びチミジン１６μＭを含有する完全ＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）中で１ｘ１０⁵細胞／ｍｌに懸濁した。細胞懸濁液の１００μｌを９６ウェルプレートの内側の６０ウェルに添加し、空気中５％ＣＯ₂の大気中で３７ ℃で一晩インキュベートした。これらの細胞は、成長因子の供給源であった。ｂ）融合滅菌フード中で表面の脂肪及び他の付着している組織を除いた後、最も高い血清力価（上記参照）を示すマウスからの脾臓細胞を１０ｍｌのＤＭＥＭ中でホモジナイズした。融解したＰＥＧ（３０００−３７００、Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ、Ｓｉｇｍａ）の溶液中で、４．２ｘ１０⁷のＳｐ２／０細胞を８．４ｘ１０⁷の牌臓細胞と融合させた。次に、これらの細胞を空気中５％ＣＯ₂の大気中で３７℃でＨＡＴ培地中で生育させた。１週間の培養後、ウェルを調べた。ハイブリッド細胞がウェルの表面積の１０ないし５０％を被覆した場合、ＥＬＩＳＡによりそれらの培養上清の抗体をアッセイした。ＥＬＩＳＡでは、マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＥＩＡ／ＲＩＡプレート高結合）のウェルを炭酸塩／重炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６に希釈した２μｇ／ｍｌのＧＤＮＦ１００μｌで被覆した。４℃で一晩インキュベーションした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２（ＰＢＳ−Ｔ）でウェルをすすいだ。３％無脂乳及び１％ヤギ正常血清を含有するＰＢＳ−Ｔで非特異的な結合をブロックした。上清の試料を室温で４時間インキュベートした。ペルオキシダーゼヤギ抗−マウス抗体を用い、基質はｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）であった。ＥＬＩＳＡ読み取り装置で４９２ｎｍでプレートを読み取った。陰性コントロールは、完全培地及び正常マウス血清を含んだ。ハイブリッドを融合後２週までＨＡＴ培地で生育させた。続いて、限界希釈法を用いて、２回のクローニング手続きが完了するまで細胞をＨＴ培地で生育させた。（細胞が１０ないし５０％融合に達する）各工程の後に、ＥＬＩＳＡにより上清中の特異的な抗体のアッセイを実施した。再クローニングの際に、５個の陽性ハイブリドーマクローンを選択し、これらの細胞を完全ＤＭＥＭ中で３０日間保持した。モノクローナル抗体のアイソタイプの決定マウスモノクローナル抗体のアイソタイプ決定のためのＤＡＫＯパネルを用いてＥＬＩＳＡによりモノクローナル抗体のクラス及びサブクラスを決定した。５個のモノクローナル抗体は全てＩｇＧ₁として特性化された。モノクローナル抗体の精製培養上清からのモノクローナル抗体をプロテインＧセファロースファストフロー（ＰｒｏｔｅｉｎＧＳｅｐｈａｒｏｓｅｆａｓｔｆｌｏｗ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂｉｏｔｅｃｈ）により製造業者の説明書に従って精製した。すなわち、培養上清を濃縮し、０．４５μｍ膜（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｅｒａｎｄＳｃｈｕｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を通して濾過し、次に、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で前もって平衡化したカラムに一晩通した。Ｉｇを０．０５Ｍグリシンバッファーで溶出させた。実施例８ＧＤＮＦに対する生物学的及び生化学的反応を示す運動ニューロン細胞系ＭＮ−１細胞単層を血清を含まない培地中で増加する濃度のＧＤＮＦにさらし、３日後に酸性ホスファターゼ活性の測定（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により細胞の生存及び生育に関してアッセイした。以前に記述されたように（Ｔｒｕｐｐ等、上記）バキュロウイルスが感染した昆虫細胞からＧＤＮＦを生産し、精製した。血清を欠いたＭＮ−１単層のＧＤＮＦ処理は、投与量に依存して細胞数を増加した（図１０ａ）。ＭＮ−１細胞の生物学的反応は、ＧＤＮＦ処理に対する生化学的及び転写反応と相関した。ＭＮ−１単層を５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦに増加する期間さらし、細胞ライセートをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロットを抗−ホスホチロシン抗体（ＵＢＩ）を用いて検出した。ＭＮＩ細胞のＧＤＮＦ処理後に、４２Ｋの電気泳動の移動度を有するタンパク質を初めとするいくつかのタンパク質が増加したチロシンリン酸化を有するのが見られた（図１０ｂ）。成長因子が誘導するタンパク質チロシンリン酸化の他の記述（Ｂｏｕｌｔｏｎ、Ｔ．Ｇ．等、Ｃｅｌｌ６５、６６３−７５（１９９１））との大きさの比較に基づくと、４２Ｋの種類は、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）ファミリーのセリン−トレオニンキナーゼのメンバーのｐ４２^erk2 であると思われる。抗ＥＲＫ２ポリクローナル抗血清を用いた免疫沈降及びそれに続くチロシンリン酸化の分析後に、このタンパク質がＥＲＫ２と同一であると確かめられた（図１０ｃ）。ＧＤＮＦで剌激したＭＮ−１細胞のライセートをＥＲＫ１も認識する抗−ＥＲＫ２抗血清（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）で免疫沈降させ、続いて抗ホスホチロシンウェスタンブロッティングを実施した。この分析は、ＭＮ−１細胞のＧＤＮＦ処置後にＥＲＫファミリーの別のメンバーであるｐ４４ｅｒｋ１もチロシンでリン酸化されることをさらに明らかにした（図１０ｃ）。ＥＲＫ経路の活性化は、ｃ− ｆｏｓ癌原遺伝子を初めとする即時型初期遺伝子の転写の迅速かつ一時的な増加を誘導することが以前に示されでいる（Ｇｉｌｌｅ等、Ｎａｔｕｒｅ３５８、４１４−７（１９９２））。実施例９ＧＤＮＦのシグナル変換レセプターとしてのｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子の産物抗−ＧＤＮＦ抗体を用いた免疫沈降またはレクチン−セファロースビーズへの結合により、ＭＮ−１細胞からのＧＤＮＦレセプター複合体を回収することができた（図１１ａ）。意外にも、抗−ホスホチロシン抗体での免疫沈降により、１８０ｋＤのレセプター複合体（すなわち、ｃ−ＲＥＴ；１８０ｋＤ−２３ｋＤ＝１５７ｋＤ、これは、ｃ−ＲＥＴとして同定された１５５ｋＤレセプターとほぼ等しい−−実施例２、以下を参照）も回収することができ（図１１ａ）、これは、この複合体のＧＤＮＦ結合タンパク質がレセプターチロシンキナーゼの可能性があることを示している。ｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子の産物は、初期運動ニューロンで多量に発現されており（Ｐａｃｈｎｉｓ等、上記、及びＴｓｕｚｕｋｉ、Ｔ．等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１０、１９１−８（１９９５））、ＭＮ−１細胞で検出された主要なＧＤＮＦレセプター成分（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｍ．等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ３、５７１− ５７８（１９８８））と類似した分子量のものである。抗−ｃ−ＲＥＴ抗体を用いた免疫沈降により、この種がｃ−ＲＥＴ−ＧＤＮＦ架橋複合体であるかどうかを調べた。ＥＤＡＣを用いて¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦをＭＮ−１細胞に架橋し、ＧＤＮＦに対する抗体（Ｔｒｕｐｐ等、上記）、レクチンセファロースビーズ（Ｆｏｒｍｉｃａ）、抗−ホスホチロシン抗体（ＵＢＩ）、抗−ｃ−ＲＥＴ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）及び非免疫ウサギからのコントロール抗体を用いて、レセプター複合体を沈降させた。抗ペプチドｃ−ＲＥＴウサギ抗血清は、ＭＮ− １細胞の主要な１８０ｋＤのリガンドーレセプター複合体を容易に免疫沈降し（図１１ａ）、一方、コントロールとして用いた多数の無関係なモノクローナル及びポリクローナル抗体はこの複合体を免疫沈降することができなかった（図１１ａ及びデータは示さない）。ｃ−ｒｅｔ遺伝子の産物はレセプターチロシンキナーゼであるので、ＧＤＮＦがＭＮ−１細胞においてｃ−ＲＥＴタンパク質のチロシンリン酸化を剌激することができるかどうかを調べた。異なる濃度で、または異なる期間ＧＤＮＦにＭＮ −１細胞単層をさらし、細胞ライセートを抗−ｃ−ＲＥＴ抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ及び上に開示した抗ホスホチロシン抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。ＧＤＮＦ処置は、ＭＮ−１細胞における迅速なｃ −ＲＥＴチロシンリン酸化を剌激した（図１１ｂ）。ＧＤＮＦ処理の５分後に最大のリン酸化が達成され、少なくとも６０分間持続した。ＭＮ−１細胞におけるＧＤＮＦが誘導するｃ−ＲＥＴリン酸化の投与量反応分析は、３０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦで最大のリン酸化を示し（図１１ｂ）、これは、血清を欠いたＭＮ−１細胞（図１０ａ）及び胚交感ニューロン（Ｔｒｕｐｐ等、上記）の両方のＧＤＮＦに対する反応に類似している。合わせると、これらのデータは、ｃ−ＲＥＴレセプターがＧＤＮＦのシグナル変換機構の重要な成分である可能性があることを示している。実施例１０ｃ−ｒｅｔのトランスフェクションは、ＧＤＮＦの結合及びＧＤＮＦに対する生物学的活性を再構成する。ＧＤＮＦレセプターを欠いた細胞にＧＤＮＦを結合させるためにｃ−ｒｅｔ遺伝子産物の発現が十分であるかどうかを決定するための実験を実施した。この目的のために、未処理の３Ｔ３繊維芽細胞、及び野生型のｃ−ｒｅｔまたはＭＥＮ２ａ患者で見いだされたこの遺伝子の癌遺伝子型（Ｍｕｌｌｉｇａｎ等、上記）のいずれかを安定にトランスフェクトした３Ｔ３細胞で、ＧＤＮＦ結合及び架橋の実験を実施した。トランスフェクトした細胞でのｃ−ｒｅｔ発現のために、ヒト野生型ｃ−ｒｅｔ及びＭＥＮ２ａ−ｒｅｔのｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。コールドＧＤＮＦを５０ｘモル過剰で使用した。生存／生育アッセイでは、示した濃度のＧＤＮＦを補充した血清を含まない培地中で６日間細胞を培養し、培地及びＧＤＮＦを２日ごとに置き換えた。酸性ホスファターゼ活性の測定により（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、細胞数を定量化した。ｃ−ＲＥＴ抗体で免疫沈降した後、ＭＥＮ２ａ−ｒｅｔ及びｃ−ｒｅｔでトランスフェクトした３Ｔ３繊維芽細胞の両方でＧＤＮＦで標識された約１８０Ｋのレセプター複合体が検出されたが、トランスフェクトしなかった細胞では検出されなかった（図１２ａ）。過剰のコールドＧＤＮＦで標識を置換することができ、これは、特異的なＧＤＮＦ結合であることを示している（図１２ａ）。また、反応しない細胞にトランスフェクションした際に、ｃ−ｒｅｔがＧＤＮＦに対する生物学的反応を媒介することができるかどうかを決定するために実験を実施した。血清を含まない培地中で培養したトランスフェクトしなかった３Ｔ３繊維芽細胞及びｃ−ｒｅｔでトランスフェクトした３Ｔ３繊維芽細胞において、ＧＤＮＦに対する生存及び生育反応を調べた。ＧＤＮＦは、ｃ−ｒｅｔでトランスフェクトした３Ｔ３細胞で投与量に依存した細胞数の増加を引き起こしたが、トランスフェクトしなかった３Ｔ３細胞ではこれを引き起こさず（図１２ｂ）、これらは血清を欠いたＭＮ−１細胞で以前に観察されたものに類似していた。未処理の３Ｔ３細胞は、トランスフェクション前にいかなる識別可能な量のＧＤＮＦレセプターも発現しなかったので（図１２ａ）、ｃ−ｒｅｔの発現が、これらの細胞においてＧＤＮＦに対する生物学的反応を媒介するために十分であると結論づけられた。実施例１１成体の脳及び黒質のドーパミン作動性ニューロンにおけるｃ−ｒｅｔの発現ラットの中枢神経系の異なる領域におけるｃ−ｒｅｔの発現を調べることにより、ｃ−ｒｅｔ産物が脳においてＧＤＮＦの神経栄養作用を媒介することが可能であるかどうかを決定するための実験を実施した。配列Ｕ２２５１３及びＵ２２５１４（ジーンバンク登録番号）に基づくプライマーを用いたＰＣＲにより得られたｃＤＮＡフラグメントを鋳型として用いて、ラットｃ−ｒｅｔリボプローブを作成した。ＭＮ−１細胞及びラット脊髄で高いレベルのｃ−ｒｅｔｍＲＮＡが見られた（データは示されない）。高いｃ−ｒｅｔｍＲＮＡ発現は、成体の脳橋、髄、青班及び視床下部（図１３ａ）、並びに視床及び小脳（データは示さない）でも見られた。ｃ−ｒｅｔｍＲＮＡは、線条体、海馬及び大脳皮質ではわずかに検出できるレベルで発現されていた（図１３ａ）。ＧＤＮＦ応答性ドーパミン作動性ニューロンの細胞体を含んでいる腹側中脳では、ｃ −ｒｅｔｍＲＮＡレベルは、生後の発生中に漸次増加した（図１３ｂ）。発現のピークは、生後６日（Ｐ６）及びＰ８の間で検出され、その時、黒質のドーパミン作動性ニューロンのアキソンは線条体の神経分布を開始し、この標的領域におけるＧＤＮＦｍＲＮＡ発現の増加と同時に起こる（図１３ｂ）。ｍＲＮＡの定量化のために、グリセルアルデヒド−３−Ｐデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）リボプローブをＲＰＡ中に含み、ゲルのオートラジオグラムをデンシトメーターで走査した後に得られた相対的なｍＲＮＡ発現の値を各ＲＮＡ試料のＧＡＰＤＨシグナルを用いて正規化した。ＧＤＮＦｍＲＮＡのＲＰＡは、以前に記述されている（Ｔｒｕｐｐ等、上記）。インサイチューハイブリダイゼーション及び免疫組織化学を以前に記述されたように実施した（Ａｒｅｎａｓ、Ｅ．＆Ｐｅｒｓｓｏｎ）Ｈ．Ｎａｔｕｒｅ３６７、３６８−３７１（１９９４）；Ｎｅｖｅｕ、Ｉ＆Ａｒｅｎａｓ、Ｅ．Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．印刷中（１９９６））。ラットｃ−ＲＥＴも認識するハムスターモノクローナル抗−マウスｃ−ＲＥＴ抗体（Ｌｏ、上記）、続いてフルオレセインを結合したウサギ抗−ハムスター二次抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｃ−ＲＥＴタンパク質を検出した。成体の黒質からの切片に対するインサイチューハイブリダイゼーションでは、この構造中のニューロンにわたって強く標識化された（図１４ａ−ｂ）。さらに、ｃ−ＲＥＴ様免疫反応性に陽性の細胞（ｃ−ＲＥＴ−Ｌ１）が、細胞体にわたって強く標識化されて成体の黒質中に見られた（図１４ｃ）。成体の黒質におけるｃ−ｒｅｔの発現がドーパミン作動性ニューロンに限定されることを確認するために、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）を片側だけに注入することで選択的にこれらの細胞に損傷を与え、続いてインサイチューハイブリダイゼーションによりｃ−ｒｅｔｍＲＮＡ発現に関してこれらの細胞を分析した。８匹のブタに以下の位置、すなわち、両耳間線にわたって５ｍｍの切開線（ｉｎｃｉｓｏｒｂａｒ）で、ブレグマの後ろ１．６ｍｍ、正中線の横１．３ｍｍ、硬膜面の下８．４ｍｍで、中前脳束に６−ＯＨＤＡを定位固定注入することにより黒質のドーパミン作動性ニューロンに損傷を与えた。６ −ＯＨＤＡ注入の３０分前に２５ｍｇ／ｋｇのデシプラミン（ｉ．ｐ．）で動物を前処理した。３μｌの培地中のＧＤＮＦ発現繊維芽細胞０．７５ｘ１０⁶を以下の位置、すなわち、−３．３ｍｍでの切開線で、両耳間線から３．１ｍｍ、正中線の横２ｍｍ、硬膜面の下７ｍｍで、黒質上に（ｓｕｐｒａｎｉｇｒａｌｌｙ）注入した。青班における損傷及び移植は、以前に記述されたとおりであった（Ａｒｅｎａｓ等、Ｎｅｕｒｏｎ１５、１４６５−１４７３（１９９５））。ＧＤＮＦを発現する繊維芽細胞の作製及び特性化は、以前に記述されている（Ａｒｅｎａｓ等、上記）。損傷の５時間後では、損傷と同じ側及び反対側の間でｃ−ｒｅｔｍＲＮＡ発現に相違は見られなかった（図１４ｄ）。しかしながら、６−ＯＨＤＡ処理の１日後ですでにｃ−ｒｅｔｍＲＮＡ発現の顕著な減少が損傷を受けた黒質で見られ、損傷の５日後にはほとんど存在しなかった（図１４ｄ）。しかしながら、損傷の反対側のｃ−ｒｅｔｍＲＮＡ発現は影響を受けなかった（図１４ｄ）。この結果から、成体の黒質では、ｃ−ｒｅｔｍＲＮＡの発現がドーパミン作動性ニューロンに限定されていることが示された。実施例１２ＧＤＮＦは、ｃ−ＲＥＴ陽性ドーパミン作動性及びノルアドレナリン作動性ニューロンを救済する。成人の黒質及び青班のｃ−ＲＥＴ発現ニューロンがＧＤＮＦに反応するかどうかを決定するための実験を実施した。このために、黒質のドーパミン作動性ニューロンに６−ＯＨＤＡで損傷を与え、次にＧＤＮＦを発現する繊維芽細胞の移植片がｃ−ＲＥＴ免疫反応性ニューロンに対する反応を誘導するかどうかを決定するためにこれらを調べた。コントロールの繊維芽細胞の移植を受けた損傷動物では、ｃ−ＲＥＴ−Ｌ１を検出することはできず、これは、成体の黒質のドーパミン作動性ニューロンの選択的損傷によるｃ−ｒｅｔ発現細胞の枯渇を示している（図１４ｅ）。しかしながら、ＧＤＮＦを発現する移植片によりｃ−ｒｅｔ−Ｌ１を救済することができ、ｃ−ＲＥＴ免疫陽性の繊維が移植片を取り囲み、そしてこれに侵入しているのを見ることができた（図１４ｆ）。同様な結果が青班でも得られ、６−ＯＨＤＡでの損傷は、ｃ−ＲＥＴ−免疫反応性細胞体を枯渇させ（図１４ｇ）、ＧＤＮＦの外因的投与によりこれらを救済することができた（図１４ｈ）。両方の脳の領域において、ＧＤＮＦを発現する繊維芽細胞を移植した動物におけるｃ−ＲＥＴ−Ｌ１陽性細胞の救済及び出現は、チロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性と一致し（データは示さない）、これらは、ｃ−ＲＥＴを発現する成体のドーパミン作動性及びノルアドレナリン作動性ニューロンがＧＤＮＦに反応することを示している。実施例１３ＧＤＮＦｃ−ＲＥＴレセプターの同定５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ（ＰｅｐｒｏｔｅｃｈＥＣＬｔｄ．）の存在下または非存在下で、被覆しない（ＮＢ／２ａ細胞）またはコラーゲンを被覆した（ＰＣ１２細胞）皿で培養した（皿当たり５０００−６０００細胞）ＰＣ１２細胞及びＮＢ／２ａ細胞を、それぞれ、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０またはＤＭＥＭで３回洗浄し、４８時間後に細胞数を顕微鏡で数えた。ＰＣ１２及びＮＢ／２ａ細胞を集め（１００，０００細胞、５つ並行して）、５０倍の非標識ＧＤＮＦの存在下または非存在下で１０ｎｇ／ｍｌの（クロラミンＴ法によりヨウ素化した、１００μＣｉ／μｇ）ヒト¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦと氷上で１２０−１５０分間インキュベートし、３０％ショ糖クッション中での遠心分離により非結合因子を除き、細胞に結合した放射能を１２７１ＲＩＡＧＡＭＭＡカウンター（ＬＫＢＷａｌｌａｃ）で数えた。組換え体ヒトＧＤＮＦは、５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、血清を欠いたラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞の約２０％の生存を促進した（図１５ａ）。血清を欠いたＰＣ１２細胞は、神経成長因子（ＮＧＦ）によっても維持される。また、（ＮＧＦ）で処理すると、ＰＣ１２細胞は分裂を停止し、長い神経突起を有する交感ニューロン様細胞に分化する。このように、ＧＤＮＦは、ＮＧＦより効力が低いが、ＰＣ１２細胞の生存促進因子である。しかし、おそらく、ＮＧＦ活性化ｔｒｋＡレセプター及びＧＤＮＦレセプターのシグナル変換の違いのために、ＧＤＮＦは調べた濃度でＰＣ１２細胞の分化を誘導しない。５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦの存在下または非存在下で、ヒト神経芽細胞腫ＮＢ／２ａ細胞を血清を含まない培地中で培養し、４８時間培養した後、細胞数を数えた。ＧＤＮＦは、ＮＢ／２ａ細胞の数を顕著に増加した（図１５ｂ）。サルＣＯＳ細胞、ヒトＳＹ５Ｙ細胞及びマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ＧＤＮＦに対する分裂促進及び生存反応のいずれも示さなかった（データは示さない）。従って、ＧＤＮＦは、ラットＰＣ１２細胞及びヒトＮＢ／２ａ細胞に対して生物学的作用を及ぼし、これは、両細胞系が機能的なＧＤＮＦレセプターを発現することを示している。ＧＤＮＦが反応性細胞に結合するかどうかを決定するために、図１５の説明文に示したようにＰＣ１２細胞及びＮＢ／２ａ細胞を¹²⁵Ｉで標識したヒトＧＤＮＦと４０℃でインキュベートした。図１５ｃに示されるように、ＰＣ１２及びＮＢ／２ａ細胞系の両方とも、ＧＤＮＦを効率よく結合する。より重要なことには、５０倍過剰の非標識ＧＤＮＦで¹²⁵Ｉで標識したＧＤＮＦの結合を競合することができた（図１５ｃ）。従って、ＰＣ１２及びＮＢ／２ａ細胞のレセプターに対するＧＤＮＦの結合は、特異的であると思われる。実施例１４ＧＤＮＦｃ−ＲＥＴ結合成分の同定ＰＣ１２細胞、ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫及びＮＢ／２ａ細胞をＥＤＣを用いて¹² ⁵ Ｉ−ＧＤＮＦに化学的に架橋させた。３−５ｘ１０⁶細胞または２個のＥ２０ラット腎臓からの物理的に解離させた細胞を１０ｎｇ／ｍｌの¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦと氷上で１時間インキュベートし、３０ｍＭＥＤＡＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて氷上で３０分間架橋させた。溶剤ライセートを免疫沈降させ、沈降物をプロテインＡ−セファロースで集め、７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰｈｏｐｈｏｒｉｍａｇｅｒＳＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）で視覚化した。得られた複合体をＧＤＮＦに対するウサギ抗体で免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、オートラジオグラフィーで視覚化した。胚の腎臓細胞も推定されるＧＤＮＦレセプターの供給源として調べた（Ｓｕｖａｎｔｏ、Ｐ．等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、８、１０１−１０７（１９９６）；Ｓａｉｎｉｏ、Ｋ．等、Ｎａｔｕｒｅ、（１９９６）投稿中）。ＰＣ１２細胞、ＳＹ５Ｙ細胞及びＮＢ／２ａ細胞の抽出物からは、１７０及び１９０ｋＤの架橋複合体が得られ、胚の腎臓抽出物からは１９０ｋＤの複合体が得られた（図１６）。架橋されたタンパク質の分子量から実質的に約２５−３０ｋＤのＧＤＮＦを引くと、正確でないにしても、稀な（ｏｒｐｈａｎ）レセプターチロシンキナーゼであるｃ−ＲＥＴ癌原遺伝子の分子量に相当する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｍ．、Ｒｉｔｚ、Ｊ．＆Ｃｏｏｐｅｒ、Ｇ．Ｍ．Ｃｅｌｌ、４２、５８１−５８８、１９８５；Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｍ．等、Ｏｎｃｏｇｅｎe、３、５７１−５７８（１９８８））（ｃ−ＲＥＴの異なったグリコシル化形である、１４０ｋＤ及び１６０ｋＤ、Ｔｓｕｚｕｋｉ、Ｔ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｍ．、Ａｓａｉ、Ｎ．、Ｉｗａｓｈｉｔａ、Ｔ．、Ｍａｔｓｕｙａｍａ、Ｍ．＆Ａｓａｉ、Ｊ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１０、１９１−１９８（１９９５））。実施例１５ｃ−ＲＥＴに対するＧＤＮＦの親和性架橋ｃ−ＲＥＴレセプターの細胞外及び細胞内部分を認識する抗体の混合物を用いて、架橋された複合体をＮＢ／２ａ細胞から免疫沈降させた。図１７ａ（レーン１）に示されるように、１７０ｋＤ及び１９０ｋＤの複合体が抗−ｃ−ＲＥＴ抗体により沈降し、従って、これらは架橋されたＧＤＮＦｃ−ＲＥＴ複合体に相当する。¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦのｃ−ＲＥＴタンパク質への結合は、５００倍過剰の非標識ＧＤＮＦで完全に消失した（レーン２）。モノクローナル抗−神経フィラメント抗体（レーン３）またはプロテインＡ− セファロースのみ（レーン４）ではタンパク質は沈降しなかった。ＣＯＳ細胞からは架橋複合体は得られなかった（示さない）。ｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子は糖タンパク質であるので、¹²⁵Ｉで標識されたＮＢ２／ａ細胞抽出物はコムギ胚アグルチニンでも免疫沈降した。ここでも、１７０及び１９０ｋＤのタンパク質が得られた（レーン５）。ＧＤＮＦがｃ−ＲＥＴに特異的に結合することをさらに立証するために、マウスｃ−ｒｅｔｃＤＮＡを噛乳類の発現ベクタ−ｐＢＫ−ＣＭＶにクローン化し、サルＣＯＳ細胞で一時的に発現させた。ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中のマウスｃ−ｒｅｔｃＤＮＡ（Ｐａｃｈｎｉｓ、Ｖ．、Ｍａｎｋｏｏ、Ｂ．＆Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ、Ｆ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１１９、１００５−１０１７（１９９３））をＳａｃII及びＥｃｏＲＶで切断し、ｐＢＫ−ＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）のＳａｃII及びＳａｍＩ部位にクローン化した。同時にトランスフェクトしたＰＥＦ−ＢＯＳベクター中のレッドシフトグリーンフルオレセントプロテイン(ＲｅｄＳｈｉｆｔＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ)の蛍光により３０％の効率で、エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ）により、ｃ−ｒｅｔｃＤＮＡまたは空のプラスミドでＣＯＳ細胞を一時的にトランスフェクトした。４８時間後、１０ｘ１０’のトランスフェクトしたＣＯＳ細胞または３−５ｘ１０⁶の親のＣＯＳ細胞もしくはＮＢ／２ａ細胞を¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦで処理し、架橋させ、図１５及び図１６の説明文に特定したように分析した。まず、ｃ−ＲＥＴタンパク質の発現をウェスタンブロッティングにより調べた。ｃ−ｒｅｔをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞（図１８ａ）及びＮＢ２／ａ細胞（示さない）は、検出できる量のｃ−ＲＥＴタンパク質を発現し、一方、モック（ｐＢＫ−ＣＭＶプラスミド）でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞ではｃ−ＲＥＴタンパク質は検出されなかった（図１８ａ）。ＮＢ／２ａ細胞またはｃ−ｒｅｔをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞よりかなり低いレベルであるが、ＰＣ１２細胞もｃ−ＲＥＴタンパク質を発現する（示さない）。マウスｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子を一時的に発現するＣＯＳ細胞を¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦとインキュベートした。図１７ｂに示されるように、これらの細胞はＧＤＮＦに結合し、過剰の非標識ＧＤＮＦで¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦの結合を競合することができる。対照的に、モックでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞ではＧＤＮＦの顕著な結合は見られなかった。実施例１６チロシン残基のリン酸化（トランスフェクションの４８時間後に）１０ｘ１０⁶のトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を血清を含まないＤＭＥＭ中で５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ（ＰｒｅｐｒｏｔｅｃｈＥＣＬｔｄ．）で５分間処理し、または処理せず、次に同じ培地ですばやく洗浄した。ＮＢ２／ａ細胞を同様に処理した（結果は示さない）。モノクローナル（Ｌｏ、Ｌ．＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｄ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｎ、１５、５２７−５３９（１９９５））及びポリクローナル（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）の抗−ｃ−ｒｅｔ抗体の混合物でｃ−ＲＥＴタンパク質を溶剤抽出物から免疫沈降させ、７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに移し、抗−ｃ−ｒｅｔ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）で検出し、これをはがし、抗−ホスホチロシン抗体（Ｓｉｇｍａ）で再検出した。この処理は、１９０ｋＤｃＲＥＴ癌原遺伝子のチロシンリン酸化の顕著な増加をもたらし、１７０ｋＤ型は、より少なくリン酸化された（図１８ｂ）。両方の細胞系で、おそらくこれらの細胞により分泌される内因性ＧＤＮＦ及び／またはリガンドに非依存的はレセプターのダイマー化により、ＧＤＮＦの非存在下でも比較的多いｃ−ＲＥＴのリン酸化が検出された（図１８）。実施例１７¹²⁵ Ｉ−ＧＤＮＦはｃ−ｒｅｔ陽性の腸ニューロンに結合する。¹²⁵ Ｉ−ＧＤＮＦは、発生中のラット組織の外植片にインサイチューで結合した。クロラミンＴ法によりヨウ素化したヒト¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ．ＥＣＬｔｄ．）のインサイチューでの結合を本質的に記述されたように（Ｐａｒｔａｎｅｎ及びＴｈｅｓｌｅｆｆ、１９８７）実施した。簡潔に言えば、ヌクレポア（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）フィルター（Ｃｏｓｔａｒ）上でイーグルの最小必須培地中でＥ１５ラット腸の外植片を１０ｎｇ／ｍｌの¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦと室温で９０分間インキュベートした。外植片を制御するための競合物として２５０倍過剰の非標識ＧＤＮＦを添加した。注意深く洗浄した後、これらの外植片をＰＢＳ中３．５％のパラホルムアルデヒドで固定し、切片にし、ＮＴＢ−２エマルジョン（Ｋｏｄａｋ）にさらした。消化管はＧＤＮＦｍＲＮＡを強く発現し（Ｓｕｖａｎｔｏ等、１９９６）（図１９ａ及びｂ）、ｃ−ｒｅｔを欠失したマウスの消化管にはｃ−ＲＥＴ陽性のニューロンが存在しない（Ｓｃｈｕｃｈａｒｔ等、１９９４；Ｄｕｒｂｅｃ等、１９９６）ので、これを選択した。¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦは、胚（Ｅ）１５日のラットの腸の筋肉層の中の一群の細胞に結合する（図１９ｃ及びｄ）。この結合は、２５０倍過剰の非標識ＧＤＮＦと完全に競合したので、特異的であった（図１９ｈ）。ＧＤＮＦに結合するこれらの細胞は、ペリフェリン免疫反応性により示されるように（図１９ｆ）、筋層間神経叢の腸ニューロンであった。さらに、インサイチューハイブリダイゼーションにより示されるように、これらのニューロンはｃ−ｒｅｔｍＲＮＡも発現した（図１９ｅ）。ＧＤＮＦｃＤＮＡのクローニング及びＧＤＮＦプローブでのインサイチューハイブリダイゼーションを全く記述されたように（Ｓｕｖａｎｔｏ等、１９９６）実施した。ｃ−ｒｅｔの短い方の型（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、１９９８）の３ ’領域に及ぶマウスｃ−ｒｅｔｃＤＮＡ（Ｐａｃｈｎｉｓ等、１９９３）の６４６ｂｐの長さのフラグメントをｐＢＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ部位にクローン化した。アンチセンス及びセンスの方向のｃＲＮＡをジゴキシゲニン−ＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で標識し、Ｅ１５ラットの腸からの凍結切片にハイブリダイズさせ、製造業者の説明書に従ってアルカリホスファターゼを結合した抗−ジゴキシゲニン抗体を用いて視覚化した。両方の場合で、センス方向の対応するプローブのハイブリダイゼーションで、バックグランドの標識化のみが得られた（図１９ｇ）。ポリクローナル抗−ペリフェリン抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を１：１００の希釈でＥ１５ラットの腸の凍結切片に１時間添加し、ＦＩＴＣを結合した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）で視覚化した。このように、ＧＤＮＦは、発生中のラットのｃ−ＲＥＴを発現する腸ニューロンに特異的に結合する。実施例１８ｃ−ＲＥＴに対するＧＤＮＦの親和性架橋５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＥＣＬｔｄ．）の存在下または非存在下で、被覆しない（ＮＢ２／ａ細胞）またはコーラゲンを被覆した（ＰＣ１２細胞）皿で培養した（３重で、皿当たり５０００−６０００細胞）ＰＣ１２細胞及びＮＢ２／ａ細胞を、それぞれ、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０またはＤＭＥＭで３回洗浄し、４８時間後に細胞数を顕微鏡で数えた。トランスフェクトした細胞におけるｃ−ＲＥＴ発現のために、ヒト野生型ｃ− ｒｅｔｃＤＮＡの短い方の型（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、１９８８）をｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。ｃ−ｒｅｔ発現プラスミドまたは空のベクター（モック）で３Ｔ３繊維芽細胞を安定にトランスフェクトし、陽性の細胞系をＧ４１８で選択した。ｐｃＤＮＡ３ベクター中のヒトｃ−ｒｅｔｃＤＮＡまたは空のベクターでのｔｒｋＣ３Ｔ３繊維芽細胞（Ｉｐ等、（１９９３）Ｎｅｕｒｏｎ、１０、１３７−１４９）の一時的なトランスフェクションをリポフェクチン法（Ｇｉｂｃｏ −ＢＲＩ）により実施した。ｃ−ｒｅｔ及びモックでトランスフェクトした細胞（ウェル当たり１０，０００−１５，０００細胞）を５つ並行して示した濃度のラットＧＤＮＦ（Ｔｒｕｐｐ等、（１９９５）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３０、１３７−１４８）で５日間処理した。陽性コントロールとしてＮＴ−３を３０ｎｇ／ｍｌで用いた。Ａｂａｃｕｓ^TM（商標）セルプロリファレーションキット（ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＫｉｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた酸性ホスファターゼ活性の測定により、細胞数を定量化した。３−５ｘ１０⁶のＰＣ１２細胞、ＮＢ２／ａ細胞、ＣＯＳ細胞またはｃ−ｒｅｔ−３Ｔ３、並びにモック−３Ｔ３細胞、または２個のＦ２０もしくは１７個のＥ１５ラット腎臓から物理的に解離させた細胞を、クロラミンＴ法でヨウ素化した１０ｎｇ／ｍｌの¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＥＣＬｔｄ．製のヒトＧＤＮＦまたはＣ．Ｆ．ＩｂａｎｅｚからのラットＧＤＮＦ）（Ｔｒｕｐｐ等、１９９５）と氷上で１時間インキュベートした。試料を制御するために、２５０倍過剰の非標識ＧＤＮＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＥＣ）または（Ｍ．Ｌａｉｈｏ博士から提供された）ＴＧＦ−β１を添加した。次に、３０ｍＭのエチル −ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦをこれらの細胞に氷上で３０分間架橋させた。ポリクローナル抗−ＧＤＮＦ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、またはモノクローナル（Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ博士から提供された、Ｌｏ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９５）及びポリクローナル（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）の抗−ｃ−ＲＥＴ抗体でこれらの細胞の溶剤ライセートを免疫沈降させ、神経フィラメントタンパク質に対する抗体（Ｉ．Ｖｉｒｔａｎｅｎ博士の贈与）をコントロール抗体として用いた。沈降物をプロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはＷＧＡ−アガロース（Ｏ．Ｒｅｎｋｏｎｅｎ博士からの贈与）で集め、７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒＳＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｎＬｉｃｓ）で視覚化した。まず、エチル−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いて¹²⁵ Ｉ−ＧＤＮＦをＰＣ１２細胞、ＮＢ２／ａ細胞及びＣＯＳ細胞に架橋し、複合体を抗−ＧＤＮＦ抗体で沈降させた。図２０ａに示されるように、１９０ｋＤ及び１７０ｋＤの分子量を有する複合体がＰＣ１２及びＮＢ２／ａ細胞から得られたが、ＣＯＳ細胞からは得られなかった。（〜２５ＫのＧＤＮＦ単量体を引いた）架橋されたタンパク質の分子量は、ｃ−ＲＥＴのものに相当する（ｃ−ＲＥＴのそれぞれ部分的及び完全にグリコシル化されたアイソフォームである１４０ｋＤ及び１６０ｋＤ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、１９８８）。次に、ＥＤＡＣにより¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦをＰＣ１２及びＮＢ２／ａ細胞に架橋し、形成された複合体を抗−ｃ−ＲＥＴ抗体で免疫沈降させた。１９０ｋＤの分子量を有するバンドが両方の細胞系から得られた（図２０ａ及びｂ）。これらの複合体の形成は、５００倍過剰の非標識ＧＤＮＦで消失した。ｃ−ＲＥＴの完全及び部分的にグリコシル化された型の両方が抗−ＧＤＮＦ抗体で沈降するが、抗 −ｃ−ＲＥＴ抗体では大きい方のアイソフォームだけが沈降する理由は、はっきりしない。同じ複合体が、より弱くではあるが、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を架橋剤として用いた場合にも得られた（データは示さない）。また、成長する尿管分岐の先端でｃ−ｒｅｔｍＲＮＡが強く発現されるＥ１５胚の腎臓細胞からＧＤＮＦ−ｃ−ＲＥＴ複合体を示すためにＥＤＡＣ架橋法を用いた。抗−ＧＤＮＦ及び抗−ｃ−ＲＥＴ抗体の両方で、１９０ｋＤのバンドが得られ（図２０ａ及びｂ）、これは過剰な非標識ＧＤＮＦと競合した。従って、胚の腎臓細胞ではｃ−ＲＥＴの完全にグリコシル化された型のみが発現される。ｃ−ｒｅｔを異所的に発現する細胞からも架橋された¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦ−ｃ− ＲＥＴ複合体が示された。３Ｔ３細胞をｃ−ｒｅｔｃＤＮＡまたは空のプラスミドでトランスフェクトし、安定なトランスフェクト細胞系（ｃ−ｒｅｔ−３Ｔ３細胞またはモック−３Ｔ３細胞）を樹立した。これらの細胞への¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦの架橋及びそれに続く抗−ＲＥＴ沈降は、１９０ｋＤのバンドを示し、これは２５０倍過剰の非標識ＧＤＮＦで消失した（図２０ｂ）。ＧＤＮＦはＴＧＦ− βファミリーの遠縁のメンバーであるので、２５０倍過剰のＴＧＦ−β１も競合物として用いた。ＴＧＦ−β１では競合は見られなかった（図２０ｂ）。合わせると、これらのデータは、ＧＤＮＦがｃ−ＲＥＴに直接的かつ特異的に結合することが示す。実施例１９ＧＤＮＦは、ｃ−ＲＥＴのチロシンリン酸化を特異的に増加する。ｃ−ｒｅｔ−３Ｔ３細胞及びモック−３Ｔ３細胞をＧＤＮＦで処理し、これらの細胞からのタンパク質を抗−ｃ−ＲＥＴ抗体で免疫沈降させた。次に、沈降したタンパク質を抗−ホスホチロシン抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。１ｍＭＮａ₃ＶＯ₄を含有する、血清を含まないダルベッコの修正イーグル培地中で、１０ｘ１０⁶のｃ−ｒｅｔ−３Ｔ３細胞を異なる投与量のＧＤＮＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＬＣＬｔｄ．またはＣ．Ｆ．Ｉｂａｎｅｚから）（Ｔｒｕｐｐ等、１９９５）で５分間、または５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦで示した時間処理し、次に同じ培地ですばやく洗浄した。モノクローナル（Ｌｏ、Ｌ．及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｄ．Ｊ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ、１５５２７−５３９）及びポリクローナル（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）の抗−ｃ−ＲＥＴ抗体の混合物で１ｍＭＮａ₃ＶＯ₄を含有する溶剤ライセートからｃ−ＲＥＴタンパク質を免疫沈降させ、７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに移し、これを抗−ホスホチロシン抗体ＰＹ２０（ＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出し、次にこれをはがし、抗−ｃ−ＲＥＴ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）で再検出した。図２１ａに示されるように、ｃ−ｒｅｔ−３Ｔ３細胞のＧＤＮＦでの短い処理は、１６０ｋＤのｃ−ＲＥＴアイソフォームのチロシンリン酸化を投与量に依存して（２５ｎｇ／ｍｌで始まる）増加し、一方、１４０ｋＤのアイソフォームのリン酸化は変わらないままであった。ｃ−ＲＥＴのリン酸化の増加は、２５ｎｇ／ｍｌ以上のＧＤＮＦで明らかであった。モック−３Ｔ３細胞ではｃ−ＲＥＴタンパク質は検出されなかった。また、ｃ−ｒｅｔ−３Ｔ３細胞をＧＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で異なる期間処理した。ｃ−ＲＥＴチロシンリン酸化の増加は、処理の５分後で明らかであり、少なくとも１時間続いた（図２１ｂ）。長い露出では、小さい方のｃ−ＲＥＴアイソフォームのリン酸化の増加も明らかになった。おそらく、レセプターのリガンド非依存的なダイマー化によるｃ−ＲＥＴリン酸化の基礎レベルが、ＧＤＮＦの非存在下で検出された。これらの実験におけるｃ −ＲＥＴタンパク質の量を明らかにするために、フィルターを抗体からはがし、抗−ｃ−ＲＥＴ抗体で再検出した。ｃ−ｒｅｔ−３Ｔ３細胞では、ｃ−ＲＥＴタンパク質のレベルはＧＤＮＦ処置により変化しなかった（図２１ａ及びｂ、下のパネル）。ＧＤＮＦがｃ−ＲＥＴを特異的に活性化するという発見は、ｃ−ＲＥＴがＧＤＮＦのシグナル伝達レセプターであることを示す。実施例２０ｃ−ＲＥＴの発現は、３Ｔ３細胞にＧＤＮＦ反応性を与える。ｔｒｋＣを発現するマウス３Ｔ３繊維芽細胞系（ｔｒｋＣ−３Ｔ３）（Ｉｐ等、１９９３）をｃ−ｒｅｔ発現プラスミドで一時的に形質転換した。ｔｒｋＣ− ３Ｔ３細胞は、ｔｒｋＣリガンドのニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）の非存在下では血清を含まない培地中で２−３日以内に死に（Ｉｐ等、１９９３）、検出できる量のｃ−ｒｅｔを発現しない。ＧＤＮＦは、ｃ−ｒｅｔをトランスフェクトしたｔｒｋＣ−３Ｔ３細胞の数を投与量に依存して増加するが、モックをトランスフェクトしたものは増加せず（図２２）、これは、ＮＴ−３により引き起こされる反応に類似した。データからは、これが増殖反応または生存促進反応のいずれであるかを区別することはできなかった。このように、ＧＤＮＦに応答しない細胞へのｃ−ＲＥＴの導入は、ＧＤＮＦに対する生物学的反応を生じるために十分である。実施例２１ＧＤＮＦレセプターの単離Ｌ６筋芽細胞を１％ＮＰ４０で溶菌し、細胞ライセートをＱ−セファロース（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムで陰イオン交換により分離した。異なるイオン強度で溶出された画分を透析し、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のチップに固定したＧＤＮＦへの結合に関してアッセイした。Ｌ６細胞ライセートのある画分ではっきり識別できる結合成分を検出した（図２３ａ）。この図で、黒い棒は（２８０ｎｍでの吸光度として）全タンパク質を示し、斜線の棒は（共鳴単位の）ＧＤＮＦ結合を示す。この画分は、タンパク質が特に豊富ではなく、全タンパク質混合物に対する実質的な精製を示す。ＣＯＳ細胞ライセートの同等画分は、同じ条件下で結合を示さなかった（データは示さない）。疎水性相互作用クロマトグラフィー後に、最初のＩＭ塩画分のＧＤＮＦ結合活性のさらなる精製が得られた（図２３ｂ）。このデータは、（共鳴単位の）ＧＤＮＦ結合及びタンパク質濃度（２８０ｎｍのＯＤ）間の比を表す。硫酸アンモニウムの段階的勾配で画分を溶出した。また、トレーサー量の放射性標識したリガンドの存在下で細胞にＧＤＮＦを架橋することにより精製を行ってもよく、リガンド／レセプター複合体をイオン交換クロマトグラフィー及びそれに続く疎水性相互作用クロマトグラフィー及びＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離することができる。ＧＤＮＦ−レセプター複合体の分子量に相当するバンドを切り出し、解離させ、次に回収率により、質量分析法またはエドマン分解によりシークエンスした。実施例２２脳の新規なＧＤＮＦ結合タンパク質リガンドブロッティングにより、全脳抽出物から別のＧＤＮＦ結合タンパク質を同定した。脳及び肝臓の全抽出物からのタンパク質を保有するフィルターに¹² ⁵ Ｉ−ＧＤＮＦを結合させた（リガンドブロットアッセイ）。約５０ｋＤのＭＷを有する主要なバンドが脳抽出物から得られたが、肝臓からは得られなかった（図２４）。¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦは全ライセートからの他のタンパク質には結合せず、肝臓ライセート（またはいくつかの他の組織）には見つからず、過剰の非標識ＧＤＮＦで競合することができるので、この結合は特異的である。このリガンドブロットでは、¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦのｃ−ＲＥＴへの結合は示されなかった。この理由は、全脳抽出物におけるｃ−ＲＥＴの非常に低い割合の可能性がある。また、ＧＤＮＦの他のレセプターと同様に、ＧＤＮＦはｃ−ＲＥＴに直接結合しないかもしれず、まず別の非シグナル伝達レセプターに結合し、それがその後シグナル伝達レセプターであるｃ−ＲＥＴへリガントを提示するのかもしれない。５０ｋＤのＧＤＮＦ結合タンパク質は、推定される提示レセプターの申し分のない候補である。実施例２３ＧＤＮＦの新規なシグナル伝達レセプターを単離するためのプロトコル細胞表面に適当なレセプターが発現されている場合、血清の非存在下で、３Ｔ３繊維芽細胞を定められた外因性成長因子に依存的にすることができる。ＲＮ３３ＢｃＤＮＡを用いて発現ライブラリーを作ることができ、これを次に、当該技術分野でよく知られている方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、上記）により３Ｔ３繊維芽細胞にトランスフェクトすることができる。ＧＤＮＦを補足した血清を含まない培地中で安定なトランスフェクタントを選択することができる。シグナル伝達ＧＤＮＦレセプターを発現する繊維芽細胞クローンを血清をふくまない培地中でＧＤＮＦの存在下で選択的に増殖させることができる。この選択工程は、他と異なった増殖優位性のために非常に稀なクローンでさえ検出できる可能性がある。ＧＤＮＦを含むまたは含まない培地中で回収されたクローンをさらに分析することは、クローンのＧＤＮＦに依存的な生存をＧＤＮＦに非依存的なものと区別することに役立つ。本明細書に引用された全ての参考文献は、そのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年１月２２日（１９９８．１．２２）【補正内容】ＧＤＮＦは、ニューロンの異なる亜集団、特にドーパミン作動性及びノルアドレナリン作動性中枢ニューロン、並びに脊髄及び顔の運動ニューロンの生存及び表現型を促進することが示されている。様々なモノアミン作動性ニューロンにおけるＧＤＮＦの活性を考慮すると、骨髄縫合由来の細胞系におけるＧＤＮＦレセプターの発見は、セロトニン作動性ニューロンもィンビボでＧＤＮＦに反応する可能性があることを示す。これらの細胞によるＧＤＮＦの内因的発現は、この因子が縫合神経核内でパラクリン／オートクリン様式で作用する可能性があることを示唆する。セルトリＴＭ４細胞におけるＧＤＮＦレセプターの発現は、発生中の精巣におけるＧＤＮＦの非神経的役割を示唆する。インビボで、精巣におけるＧＤＮＦｍＲＮＡの一時的な発現はセルトリ細胞集団の増大と相関関係があり（Ｔｒｕｐｐ等、上記）、これは、ＴＭ４細胞系におけるＧＤＮＦレセプターの発見と共に、セルトリ細胞の成熟中のＧＤＮＦのオートクリン作用を示唆する。同様に、ラット筋芽細胞Ｌ６細胞におけるＧＤＮＦレセプターの存在は、インビボで発生中の筋肉における発現と共に（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ等、上記；Ｔｒｕｐｐ等、上記）、筋肉形成中のＧＤＮＦのパラクリンの役割の可能性を示す。胚の交感ニューロンにおけるＧＤＮＦのレセプター及び生物学的活性の存在にもかかわらず、ＮＧＦで交感様ニューロンに分化させたＰＣ１２細胞は、最初の実験条件下でＧＤＮＦレセプターを発現しなかった。しかしながら、以下に説明するように、最終的にＰＣ細胞上にＧＤＮＦレセプターを同定した。ＧＤＮＦレセプターは、脳橋ノルアドレナリン作動性細胞系ＣＡＴＨ．ａ．には存在しない。成体の青班からの中枢ノルアドレナリン作動性ニューロンに対するＧＤＮＦの強力な作用を考慮すると、ＣＡＴＨ．ａ．のＧＤＮＦレセプターの欠如は興味深い。しかしながら、最近、Ｇｏｎｇ等は、ＧＤＮＦが６−ＯＨ−ドーパミン処理により誘導されるＣＡＴＨ．ａ．細胞の変性を防ぐことを報告しており（Ｇｏｎｇ等、２１Ａｂｓ．Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１７８９、１９９５）、これは、６−ＯＨ−ドーパミン損傷後にこれらの細胞でＧＤＮＦレセプターが誘導される可能性があることを示唆している。実際、インビボでの研究は、ＧＤＮＦが、損傷を受けていない青班でよりも６−ＯＨ−ドーパミン注入後に、ノルアドレナリン作動性ニューロンの表現型の強い誘導を引き起こすことを示している。さらに、Ｔｒｅａｎｏｒ等は、最近、中前脳束処理後の黒質の切片におけるＧＤＮＦ結合のアップレギュレーションを報告しており（Ｔｒｅａｎｏｒ等、２１Ａｂｓ．Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３０１、１９９５）、これは、レセプターのアップレギュレーションが中枢神経系におけるＧＤＮＦ応答の制御の一般的な機構である可能性を示唆している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/566 33/566 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号６０／０２０，６３８ (32)優先日平成８年６月27日(1996．6．27) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０２０，６３９ (32)優先日平成８年６月27日(1996．6．27) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０２１，９６５ (32)優先日平成８年６月27日(1996．6．27) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者イバネズ，カルロススウエーデン・エス−ストツクホルム (72)発明者アルマエ，ウルマスフインランド・エフアイエヌ−ヘルシンキ (72)発明者サリオラ，ハンヌフインランド・エフアイエヌ−ヘルシンキ (72)発明者スバント，ペトロフインランド・エフアイエヌ−ヘルシンキ (72)発明者トルツプ，ミレススウエーデン・エス−ストツクホルム (72)発明者サールマ，マルトフインランド・エフアイエヌ−ヘルシンキ

Claims

【特許請求の範囲】１．神経膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）に結合する単離されたレセプターであって、４−２０％の濃度勾配ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される約５５ｋＤ、７０ｋＤ、１３５ｋＤ及び３００ｋＤの分子量のポリペプチドからなる群から選択される分子量を有する少なくとも１つのポリペプチドを含んでなレセプター。２．ＧＤＮＦレセプターに結合する化合物を同定するための競合アッセイであって、ａ）過剰の標識したＧＤＮＦの存在下でｃ−ＲＥＴレセプターを発現する細胞と該化合物をインキュベートし、ｂ）該細胞に結合した標識したＧＤＮＦの量を測定し、そして、ｃ）該細胞に結合した標識したＧＤＮＦの量を該化合物とインキュベートしなかったコントロールのものと比較する、ことを含んでなるアッセイ。３．細胞が、ＮＢ２／ａ、ＭＮ−１及びＰＣ１２細胞からなる群から選択される、請求の範囲２の方法。４．標識したＧＤＮＦが¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦである、請求の範囲２の方法。５．単離されたＧＤＮＦレセプターに結合する化合物を同定するための競合アッセイであって、ａ）過剰の標識したＧＤＮＦの存在下で該化合物を単離されたｃ−ＲＥＴレセプターとインキュベートし、ｂ）該レセプターに結合した標識したＧＤＮＦの量を測定し、そして、ｃ）該レセプターに結合した標識したＧＤＮＦの量を該化合物とインキュベートしなかったコントロールのものと比較する、ことを含んでなるアッセイ。６．レセプターが、約５５ｋＤ、７０ｋＤ、１３５ｋＤ、１５５ｋＤ及び３００ｋＤの分子量のポリペプチドからなる群から選択されるＧＤＮＦに結合するポリペプチドである、請求の範囲５の方法。７．ポリペプチドが約１５５ｋＤの分子量である、請求の範囲６の方法。８．単離されたレセプターがｃ−ＲＥＴである、請求の範囲５の方法。９．標識したＧＤＮＦが¹²⁵Ｉ−ＧＤＮＦである、請求の範囲５の方法。１０．ＧＤＮＦ相同体である化合物を同定するための方法であって、ａ）ｃ−ＲＥＴレセプターを発現する細胞と該化合物をインキュベートし、そして、ｂ）該化合物がチロシンリン酸化をもたらすかどうかを測定する、ことを含んでなる方法。１１．該細胞が、ＰＣ１２、ＭＮ−１及びＮＢ２／ａからなる群から選択される、請求の範囲１０の方法。１２．ＧＤＮＦ相同体である化合物を同定するための方法であって、ａ）ｃ−ＲＥＴレセプターを発現する細胞と該化合物をインキュベートし、そして、ｂ）該化合物がｃ−ｆｏｓｍＲＮＡレベルの増加をもたらすかどうかを測定する、ことを含んでなる方法。１３．該細胞が、ＰＣ１２、ＭＮ−１及びＮＢ２／ａからなる群から選択される、請求の範囲１２の方法。１４．ＧＤＮＦ相同体である化合物を同定するための方法であって、ａ）ｃ−ＲＥＴレセプターを発現する細胞と該化合物を該細胞の非許容条件下でインキュベートし、そして、ｂ）該化合物とインキュベートしなかったコントロールと比較した生存細胞数を測定する、ことを含んでなる方法。１５．該細胞が、ＰＣ１２、ＭＮ−１及びＮＢ２／ａからなる群から選択される、請求の範囲１４の方法。１６．ＧＤＮＦ類似体である化合物を同定するための方法であって、ａ）チロシンをリン酸化するために有効なＧＤＮＦの濃度の存在下で、ｃ −ＲＥＴレセプターを発現する細胞と該化合物をインキュベートし、そして、ｂ）該化合物とインキュベートしなかったコントロールと比較して、該化合物がチロシンリン酸化の減少をもたらすかどうかを測定する、ことを含んでなる方法。１７．該細胞が、ＰＣ１２、ＭＮ−１及びＮＢ２／ａからなる群から選択される、請求の範囲１６の方法。１８．ＧＤＮＦ類似体である化合物を同定するための方法であって、ａ）ｃ−ｆｏｓｍＲＮＡレベルを増加するために有効なＧＤＮＦの濃度の存在下で、ｃ−ＲＥＴレセプターを発現する細胞と該化合物をインキュベートし、そして、ｂ）該化合物とインキュベートしなかったコントロールと比較して、該化合物がｃ−ｆｏｓｍＲＮＡレベルの減少をもたらすかどうかを測定する、ことを含んでなる方法。１９．該細胞が、ＰＣ１２、ＭＮ−１及びＮＢ２／ａからなる群から選択される、請求の範囲１８の方法。２０．ＧＤＮＦ類似体である化合物を同定するための方法であって、ａ）細胞の生存のために有効なＧＤＮＦの量の存在下で、ｃ−ＲＥＴレセプターを発現する細胞と該化合物を該細胞の非許容条件下でインキュベートし、そして、ｂ）該化合物とインキュベートしなかったコントロールと比較した生存細胞数を測定する、ことを含んでなる方法。２１．該細胞が、ＰＣ１２、ＭＮ−１及びＮＢ２／ａからなる群から選択される、請求の範囲２０の方法。