DE69736858T2

DE69736858T2 - Unsterbliche vogelzellen

Info

Publication number: DE69736858T2
Application number: DE69736858T
Authority: DE
Inventors: Jean-Francois Bouquet; Catherine Cleuziat; Jacques Samarut; Philippe Desmettre
Original assignee: Merial SAS
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
Priority date: 1996-05-23
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2017-05-23
Also published as: CA2256039A1; US6255108B1; DK0901522T3; EP0901522B1; US20010016348A1; FR2749022A1; US6642042B2; EP0901522A1; JP4149518B2; WO1997044443A1; AU732577B2; JP2000511052A; ES2275287T3; ATE343630T1; PT901522E; AU3036797A; DE69736858D1; US20040048352A1; NZ333007A; BR9703386A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Vogelzelllinien und ihre Derivate.
Die Etablierung von Vogelzelllinien ausgehend von Organen, die Vogelarten entnommen wurden, kann nicht spontan erreicht werden, wie es mit bestimmten Organen, die aus Säugerarten stammen, der Fall ist.
Die einzigen bis jetzt verfügbaren Zelllinien wurden unter Verwendung der transformierenden Eigenschaften von bestimmten Geflügelviren mit oncogenen Eigenschaften, wie die Retroviren der Gruppe Vogelleukosen, oder das Virus der Marek'schen Krankheit, oder bestimmter chemischer Moleküle, wie Methylcholanthren und Diethylnitrosamin, erhalten.
Diese Zelllinien weisen größtenteils einen bedeutenden Transformationscharakter auf, der sie für die Vermehrung von Impfstoffviren ungeeignet macht.
Autoren haben sich für einen neuen Weg eingesetzt, bestehend aus dem Einbringen in die Zellen eines Vektors, der keinen oncogenen Charakter aufweist, sondern in der Lage ist, in diese Zellen ein Gen zu integrieren, das aufgrund seiner Fähigkeit, die Immortalisation zu induzieren, ausgewählt wird.
Die ersten Versuche wurden mit Hilfe von Vektoren durchgeführt, die Vogel-Retrovirusgene integrieren, wie erbA, erbB.
Die französische Patentanmeldung FR-A-2 596 770 schlägt ein Verfahren zur Immortalisierung vor, wobei eine Kultur von Vogelzellen oder Säugerzellen mit einem Vektor oder einem System infiziert wird, das für diese Zellen keinen oncogenen Charakter zeigt, aber in der Lage ist, in diese Zellen ein Gen, ausgewählt aus v-myb, v-ets und v-erbA, zu integrieren. Geeignete Vektoren können die Viren AMV, E26 und XJ12 sein, wobei letzteres ein Virus ist, das von dem AEV-Virus abgeleitet ist, in dem das Gen v-erB, das oncogen ist, unterdrückt wurde.
In der Praxis erlaubten diese Versuche, ausgehend von Zellen der hämatopoietischen Linie, etablierte Zelllinien zu erhalten, jedoch ergaben sie nicht die Resultate, die für die Hühnerembryo-Zellen in adhärenter Kultur erwartet wurden, wie Fibroblasten oder epitheliale Zellen.
Nicht transformierte Vogelzelllinien vom myeloblastoiden Typ (Blutzellen) konnten mit Hilfe des Oncogens myb erhalten werden (internationale Patentanmeldung WO 91/18971).
Gleichzeitig haben Autoren die frühen Gene t und T des Affenvirus SV40 zur Immortalisierung von Zellen, die aus verschiedenen Säugergeweben stammen, vorgeschlagen (D.S. Neufeld et al., Molecular and Cellular Biology, August 1987, 2794-2802, O. Kellermann und F. Kelly, Differentiation 1986, 32: 74-81 und französische Patentanmeldung FR-A-2 649 721).
Die französische Patentanmeldung FR-A-2 649 721 schlägt ihrerseits ein Verfahren zur konditionellen Immortalisierung vor, das für alle Zelltypen und in sämtlichen Arten anwendbar wäre, wobei die Aufgabe hier darin besteht, den Nachteil der großen Spezifität der klassischen Wege (Beschränkung auf bestimmte Arten und/oder Zelltypen) zu beheben: die Transformation der Zellen durch ein transformierendes Virus (Adenovirus, Epstein-Barr-Virus, bestimmte Papovaviren, wie das SV40-Virus oder das Polyoma Virus; beispielsweise ist angegeben, dass das SV40-Virus nur die Nagerzellen und die menschlichen Zellen transformiert); Transfektion mit Konstrukten, die ein transformierendes Gen enthalten, das mit einem viralen Promotor verknüpft ist; Transfektion mit einem transformierenden Gen, das mit einem zellulären Promotor verknüpft ist. Die Wahl dieser Patentanmeldung betrifft ein Konstrukt, das ein DNA-Fragment der regulatorischen Sequenz von Vimentin und ein DNA-Fragment assoziiert, das ein immortalisierendes Gen codiert, das das T-Antigen des SV40-Virus unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors des Vimentins sein kann. Die Vogelarten werden in diesem Dokument nie erwähnt.
Bei den Vogelarten wurde die tatsächliche Verwendung von solchen viralen Oncogenen noch niemals beschrieben, mit Ausnahme der Verwendung der 12S-Form des E1A-Proteins des menschlichen Adenovirus 5, die die Immortalisierung von epithelioiden Wachtelzellen ermöglichte (Guilhot et al. (1993), Oncogene 8: 619-624).
Wider allen Erwartungen gelang es den Erfindern, unsterbliche und nicht transformierte Vogelzelllinien zu produzieren.
Allgemein haben die Erfinder festgestellt, dass es möglich war, unsterbliche, nicht transformierte und apoptoseresistente Vogelzelllinien herzustellen, sogar ausgehend von Geflügelgewebezellen, d. h., von anderen als den im Blut zirkulierenden Zellen oder den hämatopoietischen Zellen.
Gegenstand der Erfindung sind demnach immortalisierte, nicht transformierte, apoptoseresistente Vogelzellen, insbesondere solche, die von Geflügelgeweben abstammen, d. h., von anderen als Blutzellen oder hämatopoietischen Zellen, insbesondere Fibroblasten und epitheliale Zellen, beispielsweise von Embryonen.
Die vorliegende Erfindung hat insbesondere eine unsterbliche, nicht transformierte Vogelzelllinie zum Gegenstand, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

– der Linie TDF-2A bcl-2, hinterlegt bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de I'Institut Pasteur) unter der Hinterlegungsnummer I-1709,
– der Linie TCF-4.10, hinterlegt bei der CNCM unter der Hinterlegungsnummer I-1710,
– der Linie TCF-4.10 bcl-2, hinterlegt bei der CNCM unter der Hinterlegungsnummer I-1711.

Natürlich umfasst die Erfindung die Zellen, die aus diesen Linien hervorgehen. Darunter muss verstanden werden, dass nicht nur die Zellen umfasst sind, die bei der CNCM unter den angegebenen Hinterlegungsnummern hinterlegt sind, sondern auch die Zellen, die die Nachkommenschaft der Vorläufer darstellen, einerseits diejenigen, die durch einfache Vermehrung erhalten werden und Mutationen während der Vermehrung erfahren können, und andererseits Zellen, die nach beabsichtigten Modifikationen erhalten werden, die demnach abgeleitete Zellen („Derivate") genannt werden, und natürlich diejenigen, die die beide Typen von Modifikationen erfahren haben.
Die Erfindung umfasst demnach auch abgeleitete Zellen („Derivate"), die durch Modifikationen der obigen Zellen erhalten werden. Diese Modifikationen können umfassen:

– Insertion von einer oder mehreren Expressionskassetten, umfassend jeweils eine oder mehrere Nucleotidsequenzen, die ein Molekül von industriellem Interesse codieren, wobei diese Expressionskassetten dazu geeignet sind, dieses Molekül nach Insertion in die erfindungsgemäßen Zellen zu produzieren. Die Technik ist dem Fachmann wohlbekannt. Als Moleküle von industriellem Interesse können insbesondere die viralen Untereinheiten von der Art Peptid, Protein, Glycoprotein, insbesondere zur Verwendung als Impfstoff oder diagnostisches Reagens, Proteinmoleküle wie Hormone, etc., genannt werden.
– Chronische Infektion durch ein Virus, das dazu geeignet ist, sich in diesen Zellen zu Zwecken viraler Produktion oder Impfstoffproduktion, mit oder ohne vorherige Modifikation der Empfindlichkeit gegenüber diesem Virus, zu vermehren. Die Infektion kann auch nicht chronisch sein, sondern auf einer zur viralen Vermehrung ausgewählten Zellcharge realisiert werden.

(Die folgenden Modifikationen verstehen sich vorzugsweise in vorteilhafter Kombination mit den beiden vorherigen Typen).

– Einbau von Überlebensgenen oder Anti-Apoptose-Genen, die andere sind als bcl-2, wie die Gene, die die Proteine p19E1B des humanen Adenovirus (Rao et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7742-7746), LMP-1 (Gregory et al. (1991), Nature 349: 612-614) und BHRF1 (Pearson et al. (1987), Virology 160: 151-161) des Epstein-Barr-Virus, ICP34.5 des Herpes-simplex-Virus (Chou und Roizman (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3266-3270) und p35 des Baculovirus (Clem et al. (1991), Science 254: 1388-1390) codieren, um diese Linien gegenüber Kulturbedingungen, insbesondere Aufrechterhalten der Konfluenz, resistenter zu machen.
– Überexpression von Genen, die an der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt sind, durch Vektoren, die zur Steigerung der Proliferationsgeschwindigkeit geeignet sind. In der Tat wurde gezeigt, dass in bestimmten Fällen die Überexpression von Genen, die Cycline codieren, eine Verkürzung des Zellzyklus und daher einen Anstieg der Proliferationsgeschwindigkeit zur Folge hatte (Rosenberg et 995), al. (1Oncogene 10: 1501-1509; Quelle et al. (1993), Genes and Dev. 7: 1559-1571).
– Modifikation des viralen Empfindlichkeitsspektrums der Zelllinien durch Integration von Genen, die Rezeptoren von Viren von Interesse codieren, im Hinblick auf ihre Vermehrung. Bezug genommen werden kann auf Säugerarten, wo die Expression des Rezeptors des Masern-Virus (CD46) durch murine Zellen, die normalerweise für das Virus nicht permissiv sind, eine Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber diesem Virus und die Fähigkeit, es zu replizieren, zur Folge hat (Naniche et al. (1993), J. Virol. 67: 6025-6032). Das Interesse besteht normalerweise darin, die Zellen gegenüber einem Virus empfindlich zu machen, um es in diesen zu produzieren.
– Integration von Oncogenen, die zur Beschleunigung des Zellwachstums geeignet sind.

Es versteht sich von selbst, dass die erfindungsgemäßen abgeleiteten Zellen („Derivate") eine oder mehrere der vorstehend angegebenen Modifikationen einschließen können.
Die Erfindung hat außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Molekülen von industriellem Interesse oder von Viren zum Gegenstand, das die Kultur der vorstehend beschriebenen Zellen umfasst.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird insbesondere auf die Produktion von Molekülen oder von Viren zur Realisierung diagnostischer Reagenzien oder Impfstoffe oder auch von Molekülen von therapeutischem Interesse eingegangen.
Die Erfindung wird nun detaillierter mit Hilfe von Ausführungsformen beschrieben, die als nicht einschränkende Beispiele dienen und sich auf die beigefügte Zeichnung beziehen, in welcher:
1 die Struktur des Vektors pDAMT zeigt, der zur Herstellung der Linien TDF-2A dient, wobei folgendes gilt:

LTR:: direkt wiederholte Sequenz (Long Terminal Repeat)
δLTR:: deletiertes LTR
MTI:: muriner Metallothionein-I-Promotor
SV40T+t:: frühe SV40-Region
SV40:: SV40-Promotor

2 die Struktur des Vektors pphMT zeigt, der zur Herstellung der Linie TCF-4.10 dient, wobei folgendes gilt:

LTR:: direkt wiederholte Sequenz (Long Terminal Repeat)
Phleo:: Pfleomycinresistenzgen
SV40pA:: polyASV40
MTI:: muriner Metallothionein-I-Promotor
SV40T+t:: frühe SV40-Region

BEISPIEL 1: Herstellung der Zelllinie TDF-2A
I. Beschreibung ihres Ursprungs und ihrer Merkmale
1.1 Beschreibung des verwendeten Vektors: pDAMT-Vektor
Er umfasst die frühe Region des SV40-Virus (codiert die Antigene T und t) (HindIII/BamHI-Fragment) (Fiers et al. (1978), Nature 273: 113-120) unter der Kontrolle des Metallothionein I-Promotors der Maus (EcoRI/BgIII-Fragment, transformiert an der HindIII-Schnittstelle) (Durnam et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6511-6515; Brinster et al. (1982), Nature 296: 39-42).
Das EcoRI/EcoRI-Fragment, das diese transkriptionelle Einheit enthält, die aus dem Vektor pMTSVneo stammt (Peden et al. (1989), Exp. Cell. Res. 185: 60-72), wurde in die XbaI-Stelle des pDA1-Vektors (Aubert et al. (1991), J. Cell. Biol. 113: 497-506) inseriert. Dieser letztere leitet sich im Wesentlichen von dem Genom des Rous-Sarcoma-assoziierten Virus-2 (RAV-2) ab, nach Modifikation des LTR, das 3' liegt. In der Tat wurde die U3-Region des LTR3' von RAV-2 deletiert und mit den Regionen R und U5 verbunden, die aus dem LTR des Rous-Sarcoma-assoziierten Virus-1 (RAV-1) isoliert wurden. Er trägt auch eine transkriptionelle Einheit, die das Neomycinresistenzgen enthält, unter der Kontrolle des SV40-Promotors, die aus dem Vektor pSV2neo stammt (Southern und Berg (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341). Siehe 1.
1.2 Etablieren der Linie und Zeigen des Unsterblichkeitscharakters
Zellen, die aus 14 Tage alten Embryonen von Barbarie-Enten stammen, wurden mit dem pDAMT-Vektor durch das Verfahren transfiziert, das Dimethylsulfoxid (DMSO) verwendet und bereits von Kawai und Nishizawa (1984), Mol. Cell. Biol. 4: 1172-1174, beschrieben wurde. Die transfizierten Zellen werden anschließend durch Anwendung von Geneticin G418 (150 µg/ml) während 15 Tagen selektioniert. Die resistenten Klone werden nun regelmäßig mit 1 bis 2 Passagen pro Woche subkultiviert. Nach diesem 3 Monate währenden Zeitraum der aktiven Proliferation traten die Zellen in einen Krisenzeitraum ein, während dessen der größte Teil der Zellen abstirbt. Nach diesem Zeitraum, der etwa 2 Monate währte, haben mehrere Klone wieder eine aktive Proliferation aufgenommen, was ihre Immortalisierung nahe legt.
Die Zelllinie TDF-2A geht somit aus zwei Kulturen hervor. Sie wurde näher untersucht.
Die TDF-2A-Zellen haben 200 Passagen erfahren, das heißt ca. 460 Generationen, und wurden somit während mehr als 600 Tagen kontinuierlich in Kultur gehalten. Vergleichsweise können Kontrollzellen, die die frühe Region des SV40-Virus nicht exprimieren, nicht für mehr als 20 Passagen in Kultur gehalten werden.
1.3 Proliferationsmerkmale
Die immortalisierten Zellen werden bei 38 °C in Rollerflaschen kultiviert, in einem Medium, das 6 % HAM F-10 10X, 4 % 199 HANKS 10X, 2,95 % bis 4 % Tryptose-Phosphat Bouillon, 5,6 % bis 2,5 % Natriumbicarbonat, 0,1 % Vitamin BME 100X, 3 % fötales Kälberserum, 5 % bis 1 % Kanamycin, 0,5 % bis 1 % Vancomycin enthält.
Unter diesen Bedingungen beträgt ihre Verdoppelungsrate 1 pro 24 Stunden.
1.4 Expression des T-Antigens
Durch Immunfluoreszenz oder indirekte Immunphosphatase unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers für das T-Antigen (Pab 101: Santa Cruz Biotechnology Ref. sc147) wurde verifiziert, dass sämtliche Zellen das T-Antigen in ihrem Kern exprimieren, was anzeigt, dass sie alle den Vektor integriert haben.
Diese Integration wurde zudem durch Southern Blot gezeigt. Die genomische DNA der immortalisierten Fibroblasten wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI, BstXI verdaut. Durch die Hybridisierung mit einer für das T-Antigen spezifischen Sonde (NdeI/NdeI-Fragment von 1018 bp) lässt sich bestätigen, dass die transkriptionelle Einheit, die die Expression des immortalisierenden Gens erlaubt und in die TDF-2A-Zellen inseriert war, keine größeren Umlagerungen erfahren hatte. In der Tat ist die Größe der erhaltenen Hybidisierungsfragmente mit derjenigen, die erwartet wird, konform.
1.5 Abwesenheit eines tumorigenen Potentials
Die immortalisierten Zellen zeigen kein tumorigenes Potentials. Sie sind nicht in der Lage, Kolonien in halbfestem Medium oder Tumore auf Chorioallantoismembran von Hühner- oder Enteneiern zu bilden. Sie sind ferner nicht in der Lage, Tumore auf Nacktmäusen („nude" Mäuse) oder auf 1 Tag alten SPF (ohne pathogene Organismen)-Küken von Hühnern und Enten zu bilden.
1.6 Karyotyp
Der Karyotyp der TDF-2A-Zellen wurde in der 114. und 135. Passage untersucht. Es ließ sich verifizieren, dass die Zellen durchaus aviären Ursprungs waren, mit dem Vorliegen von Mikrochromosomen, die für diese Art charakteristisch sind. Ferner sind die beobachteten Chromosomen für Chromosomen repräsentativ, die in primären Zellen von Enten-Embryonen festgestellt werden, was somit den Ursprung der Zelllinie bestätigt.
II. Eigenschaften
Die TDF-2A-Zellen zeigen insbesondere eine Empfindlichkeit gegenüber spezifischen Viren der Ente, wie Adenovirus, Parvovirus und Reovirus, die üblicherweise auf primären Zellen von Enten-Embryonen repliziert werden. Somit können diese Viren auf dieser Linie produziert werden.
BEISPIEL 2: Charakterisierung der TDF-2A-Zelllinie durch Identifizierung der Integrationsstellen
Die genomische DNA der TDF-2A-Zellen, hergestellt aus Zellen, die aus der 114. und der 135. Passage stammen, wurde mit den Restriktionsenzymen BgIII und KpnI verdaut. Die so behandelte DNA wird nun durch Gelelektrophorese aufgetrennt, auf Nylonmembran übertragen und dann mit einer T-Antigen-spezifischen Sonde hybridisiert (NdeI/NdeI-Fragment von 1018 bp). Derart lassen sich nach Verdau mit BgIII zwei Hybridisierungsbanden von großer Größe (etwa 15 und 23 kb) erhalten, was die Existenz von zwei Integrationsstellen nahe legt. Der Verdau mit KpnI hat den Erhalt einer Hauptbande von großer Größe (etwa 20 kb) und mindestens einer kleineren Bande zur Folge, was die Existenz von mindestens zwei Integrationsstellen bestätigt.
BEISPIEL 3: Herstellung der Zelllinie TCF-4.10
1. Beschreibung ihres Ursprungs und ihrer Merkmale
1.1 Beschreibung des verwendeten Vektors: pphMT-Vektor
Er umfasst die frühe Region des SV40-Virus (codiert die Antigene T und t) (HindIII/BamHI-Fragment) (Fiers et al. (1978), Nature 273: 113-120) unter der Kontrolle des Metallothionein I-Promotors der Maus (EcoRI/BgIII-Fragment, transformiert an der HindIII-Schnittstelle) (Durnam et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6511-6515; Brinster et al. (1982), Nature 296: 39-42).
Das EcoRI/EcoRI-Fragment, das diese transkriptionelle Einheit enthält, die aus dem Vektor pMTSVneo stammt (Peden et al. (1989), Exp. Cell. Res. 185: 60-72), wurde in die EcoRI-Stelle des pUT507-Vektors (erhältlich von der Firma CAYLA-FRANCE) inseriert, die 3' von der Region liegt, die die Expression des Phleomycinresistenzgens erlaubt (2). Die Struktur des pUT507-Vektors ist bei Mulsant et al. (1988), Somatic Cell and Molecular Genetics 14: 243-252, beschrieben.
1.2 Etablierung der Linie und Zeigen des Unsterblichkeitscharakters
Fibroblasten, die von Hühner-Embryonen stammen, wurden mit dem pphMT-Vektor durch das Verfahren transfiziert, das Dimethylsulfoxid (DMSO) verwendet und von Kawai und Nishizawa (1984), Mol. Cell. Biol. 4: 1172-1174, beschrieben ist. Anschließend werden die transfizierten Zellen durch progressive Anwendung (10 µg/ml bis 50 µg/ml) von Phleomycin während 15 Tagen selektioniert. Die resistenten Klone werden nun regelmäßig mit 1 bis 2 Passagen pro Woche subkultiviert. Nach einem etwa 2 Monate währenden Zeitraum der aktiven Proliferation traten die Zellen in einen Krisenzeitraum ein, in dem das Zellwachstum sehr schwach ist und die Mortalität sehr hoch ist. Nach einem Zeitraum, der 3 bis 4 Monate währte, haben einige Zellen des Klons TCF-4.10 eine aktive Proliferation wieder aufgenommen, was ihre Immortalisierung nahe legt.
Die TCF-4.10-Zellen haben somit 200 Passagen in Kultur erfahren, d. h. etwa 400 Generationen, und wurden 3 Jahre lang in Kultur gehalten. Vergleichsweise können Kontrollfibroblasten, die die frühe Region des SV40-Virus nicht exprimieren, nicht für mehr als 20 bis 30 Passagen in Kultur gehalten werden.
1.3 Proliferationsmerkmale
Die immortalisierten Fibroblasten werden in einem Medium, das 6 % HAM F-10 10X, 4 % 199 HANKS 10X, 2,95 % bis 4 % Tryptose-Phosphat Bouillon, 5,6 % bis 2,5 % Natriumbicarbonat, 0,1 % Vitamin BME 100X, 3 % fötales Kälberserum, 5 % bis 1 % Kanamycin, 0,5 % bis 1 % Vancomycin enthält, bei 38 °C kultiviert. Unter diesen Bedingungen beträgt ihre Verdoppelungsrate 0,7 pro 24 Stunden.
2.2 Expression des T-Antigens
Durch Immunfluoreszenz oder indirekte Immunphosphatase unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers für das T-Antigen (Pab 101: Santa Cruz Biotechnology Ref. sc147), wurde verifiziert, dass sämtliche Zellen das T-Antigen in ihrem Kern exprimieren, was anzeigt, dass sie alle den Vektor integriert haben.
2.3 Fehlen eines tumorigenen Potentials
Die immortalisierten Fibroblasten zeigen kein tumorigenes Potential. Sie sind nicht in der Lage, Tumore auf Chorioallantoismembran von Hühner- oder Enteneiern zu bilden.
3. Eigenschaften
Die TCF-4.10-Zellen zeigen insbesondere eine Empfindlichkeit gegenüber Geflügelviren. Insbesondere können die Geflügel-Pockenviren, wie Kanarienpockenvirus, Geflügelpockenvirus, oder auch die Viren der Marek'schen Krankheit (Serotypen 1, 2 und 3 (HVT)), das Virus der Gumboro-Krankheit genannt werden. Somit können diese Viren auf dieser Linie produziert werden.
BEISPIEL 4: Vermehrung des Kanarienpockenvirus auf TCF-4.10-Zellen
Die TCF-4.10-Zellen werden in Rollerflaschen überimpft. Das Kanarienpockenvirus wird auf einen entwickelten Zellrasen überimpft. Wenn die durch das Virus erzeugte zytopathische Wirkung generalisiert ist, wird die Ernte durch Schütteln vorgenommen, so dass sich der Zellrasen löst. Diese besteht nun aus dem Zellrasen und dem Kulturüberstand. Die Gesamtheit wird durch eine Ultraturrax-Behandlung während 1 Minute bei 13500 Umdrehungen/Minute (IKA-Gerät Typ T25) homogenisiert.
Die Bestimmung des Titers an infektiösen Viren wird mit der Mikromethode auf einer 96-Well-Platte vorgenommen. Die Virusverdünnungen werden auf einen entwickelten Zellrasen von sekundären Zellen von Hühner-Embryonen überimpft. Jede Virusverdünnung wird in 6 Vertiefungen überimpft. Die Platten werden zur Inkubation in einen CO₂-Inkubator für 8 Tage verbracht. Die Gegenwart von Virus in den Vertiefungen wird mikroskopisch kontrolliert, indem der charakteristische zytopathische Effekt (ECP) beobachtet wird. Der Titer an infektiösen Viren wird nach der Methode von KARBER berechnet und wird durch den Logarithmus der Umkehr der Virusverdünnung ausgedrückt, die 50 % ECP ergibt [Titer = d + r/Nx(n + N/2)], wobei d der Verdünnung, ausgedrückt in log, entspricht, für die 100 % positive Vertiefungen vorhanden sind, und r dem Verdünnungsverhältnis, N der Anzahl von Vertiefungen pro Verdünnung und n der Anzahl von positiven Vertiefungen zwischen 0 und 100 % entsprechen.
Ergebnisse: Die erhaltenen Virus-Titer entsprechen denjenigen, die auf primären Zellen von Enten-Embryonen erhalten werden.
BEISPIEL 5: Integration des bcl-2-Gens
Ein Vektor, der die Expression des bcl-2-Gens unter der Kontrolle des CMV (humanes Cytomegalovirus)-Promotors gestattet, wird in die TDF-2A und TCF-4.10-Zellen durch die klassischen Transfektionsverfahren (DMSO-Verfahren, beschrieben von Kawai und Nishizawa (1984), Mol. Cell. Biol. 4: 1172-1174, oder Lipofectamin nach den Empfehlungen des Herstellers (GIBCO-BRL)) transfiziert.
Nach Selektion der transfizierten Zellen wird die Expression des bcl-2-Proteins durch Western Blot nachgewiesen.
Die Zellen, die das Bcl-2-Protein exprimieren, werden nun auf ihre Fähigkeit getestet, unter Kulturbedingungen zu überleben, bei dem ein Apoptose-Prozess festgestellt wird (Aufrechterhaltung der Zellen bei Konfluenz).
Somit wird im Falle der TDF-2A bcl-2-Zellen der Apoptose-Prozess, der durch die Ankunft von Zellen bei Konfluenz ausgelöst wird, im Vergleich zu den TDF-2A-Zellen um 3 bis 4 Tage verschoben. Im Falle der TCF-4.10 bcl-2-Zellen wird eine Erhöhung der Zelldichte bei Konfluenz im Vergleich zu den TCF-4.10-Zellen beobachtet.

Claims

Immortalisierte, nicht transformierte Vogelzelle, die in ihrem Genom die frühe Region des SV40-Virus, die die Antigene T und t codiert, integriert enthält und die ein Gen enthält, das ein Anti-Apoptose-Protein codiert, wobei die frühe Region des SV40-Virus, die die Antigene T und t codiert, und das Gen, das das Anti-Apoptose-Protein codiert, durch Transfektion in die Zelle eingeführt wurden.
Zelle gemäß Anspruch 1, wobei das Anti-Apoptose-Protein blc-2 ist.
Zelle gemäß Anspruch 1, wobei das Anti-Apoptose-Protein p19E1B des humanen Adenovirus, LMP-1 des Epstein-Barr-Virus, BHRF1 des Epstein-Barr-Virus, ICP34.5 des Herpes-simplex-Virus oder p35 des Baculovirus ist.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die frühe Region des SV40-Virus, die die Antigene T und t codiert, durch den MTI-Promotor kontrolliert wird.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, die ausgehend von Geflügelgewebe erhalten wurde.
Zelle gemäß Anspruch 5, die ausgehend von Fibroblasten oder Epithelialzellen erhalten wurde.
Zelllinie, die Zellen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst.
Zelllinie immortalisierter, nicht transformierter Vogelzellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: – Zelllinie TDF-2A bcl-2 hinterlegt bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de I'Institut Pasteur) unter der Hinterlegungsnummer I-1709 – Zelllinie TCF-4.10 hinterlegt bei der CNCM unter der Hinterlegungsnummer I-1710 – Zelllinie TCF-4.10 bcl-2 hinterlegt bei der CNCM unter der Hinterlegungsnummer I-1711
Immortalisierte, nicht transformierte Vogelzelle, die von einer Zelllinie gemäß Anspruch 8 abgeleitet ist.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und 9, umfassend die Integration eines Gens, das einen viralen Rezeptor codiert.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und 9, umfassend die Integration eines Oncogens, das geeignet ist, das Zellwachstum zu beschleunigen.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und 9 bis 11, die zusätzlich eine heterologe Nucleotidsequenz enthält.
Zelle gemäß Anspruch 12, wobei die Zelle ein von der heterologen Nucleotidsequenz codiertes Produkt exprimiert.
Zelle gemäß Anspruch 13, wobei die Nucleotidsequenz ein Peptid, ein Protein oder ein virales Glycoprotein codiert.
Zelle gemäß Anspruch 14, wobei die Nucleotidsequenz ein Hormon codiert.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und 9 bis 11, die mit einem Virus infiziert ist.
Zelle gemäß Anspruch 16, die ausgehend von einer Zelle erhalten wurde, die von einem Entenembryo abstammt.
Zelle gemäß Anspruch 17, wobei das Virus ein Virus der Ente ist, das insbesondere ausgewählt ist aus dem Adenovirus der Ente, dem Parvovirus der Ente und einem Reovirus.
Zelle gemäß Anspruch 16, die ausgehend von einem Fibroblasten erhalten wurde, der von einem Hühnerembryo abstammt.
Zelle gemäß Anspruch 19, wobei das Virus ein Geflügelvirus ist, das insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe der Pockenviren, wie z.B. Kanarienpockenvirus, Geflügelpockenvirus, Viren der Marek'schen Krankheit (Serotyp 1, 2), Puten-Herpes-Virus (HVT) und einem Virus der Gumboro-Krankheit.
Verfahren zur Herstellung eines Virus, umfassend die Infizierung der Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und 9 bis 11 mit dem Virus unter Bedingungen, die die Herstellung des Virus erlauben.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids, eines Proteins oder eines viralen Glycoproteins, umfassend die Infizierung der Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und 9 bis 11 mit dem Virus unter Bedingungen, die die Herstellung des Peptids, des Proteins oder des viralen Glycoproteins erlauben.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Zelle eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 18 oder 20 ist.