DE69737735T2

DE69737735T2 - Immortalisierte zelllinien für das wachstum von viren

Info

Publication number: DE69737735T2
Application number: DE69737735T
Authority: DE
Inventors: Douglas N. Roseville FOSTER; Linda K. Roseville FOSTER
Original assignee: University of Minnesota Twin Cities; University of Minnesota System
Current assignee: University of Minnesota Twin Cities; University of Minnesota System
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2017-08-14
Also published as: MA24303A1; HU226658B1; JP3754088B2; CO4700552A1; JP2000516095A; AU4069197A; HUP0000188A3; PE108198A1; KR20000029968A; ZA977216B; US5672485A; UY24668A1; ATE362524T1; US5879924A; BR9711067A; IL158302A0; IL158301A0; CA2263725C; AU726820B2; US5985642A

Description

Fachgebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Fachbereiche Zellbiologie und Virologie. Diese Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von immortalisierten Zellen für die Virusvermehrung.
Hintergrund der Erfindung
1931 führten Alice Miles Woodruff und Ernest Goodpasture ein neues Verfahren für die Züchtung von Viren ein. Sie berichteten, dass das Geflügelpockenvirus auf der Chorionallantois-Membran von sich entwickelnden Hühnerembryonen gezüchtet werden konnte. Nach Virus-Inokulation erschienen das Virus enthaltende Läsionen auf der Membran. Das Ei war, verglichen mit Tieren, die das Substrat früher Virusstudien waren, relativ billig und leicht erhältlich. Das Ei besitzt eine für eine Infektion verschiedener Viren empfängliche Vielzahl von Zellen und Membranen und kann in einer kontrollierten, stabilen Umgebung gehalten werden. Hühnerembryonen haben in wichtiger Weise zur Entwicklung der Virologie durch zweckmäßige Bereitstellung einer Reihe für viele Viren empfänglicher Zelltypen beigetragen. Obwohl das Ei die Replikation einer Vielzahl von Virusstämmen unterstützt, sind die Methoden zur Infektion der Eier und Aufrechterhaltung des Viruswachstums zeitaufwendig und mühsam. Für die Inokulation der Chorionallantois-Membran wird zum Beispiel zuerst ein Loch durch die Eischale und Schalenmembran gebohrt. Die Schale über dem Luftsack wird perforiert, was einen Lufteintritt zwischen die Schalenmembran und die Chorionallantois-Membran verursacht und einen künstlichen Luftsack erzeugt, wo die Probe abgelegt wird. Die Probe hat Kontakt mit dem Chorionepithel und das Virus wächst als Läsionen auf der Membran. Die Verwendung von Eiern für die Virusreplikation hat mit der Einführung von Zellkulturverfahren nicht unerwartet abgenommen.
Eine Vielzahl von Zellen kann in vitro gezüchtet werden. Zellkulturen sind leicht aufrechtzuerhalten und können in einer, verglichen mit Eiern, hoch kontrollierten Umgebung gehalten werden. Es gibt jedoch noch Virusstämme, die scheinbar besser in befruchteten Eizellen wachsen, als in gezüchteten Zellen. Außerdem tragen viele gezüchtete Zelllinien endogene infektiöse Agenzien, einschließlich Mycoplasmen, niedriger Spiegel bakterieller Kontaminanten, endogener Viren und ähnlichem. Einige der Zelltypen, die am effizientesten in der Unterstützung der Virusreplikation sind, haben, dadurch dass sie endogenes Virus enthalten, Probleme bei der Herstellung viraler Stammlösungen. Das endogene Virus wird entweder auf niedriger Stufe repliziert oder es kann aktiviert werden, wenn die Zellen mit einem zweiten Virus-Stamm infiziert werden. Von Nagerzellen ist zum Beispiel bekannt, dass sie endogene Viren tragen und eine Elektronenmikroskopie von Nagerzellen in Kultur zeigt oft die Existenz von identifizierbaren Viruspartikeln in den Zellen. Kontaminierte Zelllinien können nicht als Substrate für kommerzielle Lebend- oder inaktivierte Impfstoffe verwendet werden.
Für einige Viren ist das einen Embryo enthaltende Huhn die Methode der Wahl für eine virale Replikation. Das menschliche Grippevirus, Tollwut-Virus, Hundestaupevirus, Marek-Virus, Reovirus und Geflügelpest-Virus sind zum Beispiel Viren, die vorzugsweise in Eiern, da das Ei die Züchtung einer Virusausgangslösung mit hohem Titer fördert oder in von befruchteten Eiern stammenden primären Zellen gezüchtet werden. In anderen Fällen werden die Viren in Eiern gezüchtet, da ein
Bedarf für bescheinigte Virus-freie Zellsubstrate besteht. Primäre Zellkulturen sind Kulturen von Zellen, die frisch aus intaktem Gewebe isoliert wurden. Diese Zellen sind oft eine gute Quelle für Virus-freies Material und sind gut als Wirtszellen für die Virusreplikation geeignet. Primäre Zellen sind nicht immer für eine Virusreplikation tauglich und primäre Tierzellen weisen eine begrenzte Lebensdauer in Kultur auf und erleben schließlich eine Seneszenz. Bei Seneszenz hören die Zellen auf sich zu teilen und sterben im Laufe der Zeit ab. Die Fähigkeit der Zellen, sich im Laufe der Zeit in der Kultur zu teilen, hängt von mehreren Parametern, einschließlich der Ursprungsspezies der Zelle und des Alters des Gewebes, wenn es in Kultur genommen wurde, ab. Zellen, die Seneszenz durchmachen, können nicht für einen längeren Zeitraum in Kultur gehalten werden und sind daher keine brauchbaren reproduzierbaren Wirte für das Wachstum kommerzieller Virus-Ausgangslösungen.
Einige primäre Zellen entgehen einer Seneszenz und erwerben die Fähigkeit, unsterblich zu werden. Nagerzellen scheinen spontane Immortalisierung ziemlich leicht zu erleben (Curatolo et al., In Vitro 20:597-601, 1984), normale humane und Vogel-Zellen haben dagegen, wenn überhaupt, selten die Fähigkeit spontaner Immortalisierung gezeigt (Harvey et al., Genes and Development 5:2375-2385, 1991; Pereira-Smith, J. Cell Physiol. 144:546-9, 1990; Smith et al., Science 273:63-67, 1996). Es gibt eine Reihe von Gründen, warum eine besondere Zellpopulation eine Immortalisierung durchleben würde. Zellen können im Anschluss an die Exposition gegenüber Agenzien, die bekannt dafür sind, Genmutationen zu induzieren, dazu veranlasst werden, eine Immortalisierung durchzumachen. Einige Personen postulieren, dass der in Zusammenhang mit Seneszenz stehende Wachstums-Stillstand dominant gegenüber der Immortalisierung ist und Vorgänge, die Wachstum-hemmende Gene inaktivieren, eine Immortalisierung ergeben können (Pereira-Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:6042-6046, 1988). Forster et al., Poultry Science 74 (Ergänzunsbd. 1):73, 1995) offenbart mit dem chemischen Carcinogen 20.Methylcholanthren immortalisierte fibroblastische Hühnerembryo-Zellen.
Die Verfügbarkeit immortalisierter Virus-freier Zellen kann die Verwendung von primären Tiergewebe-Kulturen eliminieren oder reduzieren. Primäre Kulturen sind im Allgemeinen schlecht definierte Zellpopulationen und oft kontaminiert. Diesen Kulturen fehlen oft die regulativen Anforderungen für eine kommerzielle Impfstoff-Herstellung. Primäre Zellkulturen können mit Circodnaviridae (z. B. Hühner-Anämie-Virus) oder dem Egg-Drop-Syndrom-Virus kontaminiert sein. Der Impfstoff gegen die Marek-Krankheit (ein Lebendvirus-Impfstoff) kann für eine Geflügelimpfung als Virus-Ausgangslösung in Enteneiern gezüchtet werden. 1976 zeigten Scharen von Hühnern, die den Impfstoff erhielten, Anzeichen des Egg-Drop-Syndroms, das von einem Enten-Adenovirus hervorgerufen wird, von dem angenommen wird, dass es die Impfstoff-Ausgangslösung kontaminiert und sich an ein Wachstum in Hühnern angepasst hat.
In der Impfstoff-Industrie zwingen regulative Anforderungen für Produktsicherheit, Konsistenz und Wirksamkeit die Firmen, als beste Alternative zur derzeitigen Praktik der Verwendung von auf Eiern basierenden und primären Zell-Impfstoff-Substraten, Zelllinien fortzuführen. Die Bedenken bezüglich Sicherheit und Konsistenz werden, aufgrund eines zunehmend stringenten regulativen Umfelds bezüglich Impfstoff-Substraten sowohl in den Vereinigten Staaten als auch in Europa, sowohl von Herstellern humaner als auch tierischer Impfstoff-Produkte geteilt. Die Identifizierung geeigneter Zellen für die Viruszüchtung, um befruchtete Eier zu ersetzen, wird auch angesichts der Principles for the Utilization and Care of Vertebrate Animals in Testing, Research and Training der US-Regierung und des Animal Welfare Act (7 U.S.C. § 2131) befürwortet, die teilweise feststellen, dass in allen Fällen an Stelle eines in vivo-Tiermodells Methoden wie biologische in vitro-Systeme in Betracht gezogen werden sollten. Es besteht ein Bedarf an Zellen, die Virus-frei sind und die ein exogenes Viruswachstum unterstützen, um tierische Impfstoffprodukte herzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Identifikation spontan immortalisierter Hühnerfibroblasten-Zelllinien und Verfahren, diese Zelllinien zu erhalten. Insbesondere betrifft diese Erfindung eine von primären embryonalen Hühnerfibroblasten stammende, spontan immortalisierte Zelllinie, die die Charakteristika der spontan immortalisierten Zelllinie UMNSAH-DF1 besitzt, die bei der ATCC unter den Bestimmungen und Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt wurde. Außerdem betrifft diese Erfindung Kulturen dieser Zellen und immortalisierte Subclone der immortalisierten Zelllinie, die eine Virusreplikation unterstützen.
In einem Aspekt der Erfindung beinhalten die immortalisierten Zellen dieser Erfindung Viren und in einem anderen beinhalten die immortalisierten Zellen dieser Erfindung mindestens einen Vektor, der in der Lage ist, die Expression von rekombinantem Protein in den Zellen zu lenken. In einer Ausführungsform exprimieren die Zellen dieser Erfindung rekombinantes Protein und in einem anderen Aspekt dieser Erfindung codiert der in den Zellen dieser Erfindung enthaltene Vektor mindestens einen Teil eines rekombinanten Virus. In einer anderen Ausführungsform ist der Vektor ein retroviraler Vektor.
In einem anderen Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren für die Herstellung einer immortalisierten Zelllinie aus embyonalen Hühnerfibroblasten ohne Carcinogen-Behandlung offenbart, umfassend die Schritte: Anzucht von primären embryonalen Hühnerfibroblasten in Kultur; Passagieren der Fibroblasten in Kultur, bis Zellseneszenz einsetzt; Konzentrieren der Zellen während der Zellseneszenz, um etwa 30 % bis etwa 60 % Kulturkonfluenz zu erhalten; Identifizieren von Foci nicht-altender Zellen in der Kultur und Züchten der nicht-alternden Zellen für mehr als 30 Passagen.
In noch einem anderen Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren zum Anzüchten von Viren in einer Zelle offenbart, umfassend die Schritte: Anzucht einer von primären embryonalen Hühnerfibroblasten stammenden, spontan immortalisierten Zelllinie dieser Erfindung in Kultur; Infizieren der Zellen mit Virus; Zulassung der Virusreplikation in den Zellen und Sammeln der Viren, die in den Zellen repliziert haben.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Derzeit sind im Wesentlichen keine nicht-viral, durch nicht-virales Protein oder nicht-chemisch transformierte Vogel-Zelllinien verfügbar. Für die kontinuierliche Erzeugung einer Virus-Ausgangslösung sind primäre Zelllinien schwer zu handhaben und sie müssen gesondert als kontaminationsfreie Reservoirs für die Viruszüchtung bestätigt werden. Diese Erfindung offenbart die Immortalisierung von embryonalen Hühnerfibroblasten (CEF)-Zellen, einschließlich Zellen, die von Hühnerembryos der East Lansing Line (ELL-0) stammen.
Der Begriff Immortalisierung wird hierin verwendet, um sich auf nicht-Nagerzellen zu beziehen, die in der Lage sind, in Kultur für mehr als 30 Passagen zu wachsen, die eine Verdopplungszeit in Kultur von etwa 1 bis etwa 2 Tagen aufrechterhalten und die sich in kontinuierlicher Kultur für mehr als etwa 6 Monate befunden haben. Vogelzellen werden im Allgemeinen nach etwa 20 bis etwa 25 Passagen in Kultur als immortalisiert betrachtet. Immortalisierte Zellen werden von transformierten Zellen dadurch unterschieden, dass im Gegensatz zu transformierten Zellen die immortalisierten Zellen Dichte-abhängig sind und/oder das Wachstum stillsteht (z. B. Kontakt inhibiert). Transformierte Zellen sind in der Lage, in Weichagar zu wachsen und sind üblicherweise imstande, Tumore zu erzeugen, wenn sie in Versuchstiere injiziert werden. Die Zellen dieser Erfindung sind als Reservoir für die Viruszüchtung oder für die Expression eines rekombinanten Proteins oder Virus nützlich, insbesondere wo es wichtig ist, dass die Zellen kein kontaminierendes Virus oder virales Protein beherbergen. Die Zellen sind auch für die Untersuchung der zu Grunde liegenden Mechanismen zellulärer Seneszenz und Immortalisierung wertvoll. Primäre embryonale Hühnerfibroblasten (CEF)-Zellen von 10 Tage alten ELL-0-Eiern wurden durch die Entnahme des embryonalen Torso des 10 Tage alten Embryos, Zerkleinerung des Gewebes und das Bringen der Zellen in Kultur erhalten. Befruchtete Eier waren von Hy-Vac (Adel, Iowa) erhältlich. Die Eier und ihre Legehennen wurden durch den Anbieter als negativ für Vogel-Influenza (Typ A), Vogel-Reovirus, Vogel-Adenoviren (Gruppen I-III), Vogel-Encephalomyelitis-Virus, Geflügelpest, Newcastle Diesease-Virus, Paramyxovirus (Typ 2), Mycoplasmen, Salmonellen und andere infektiöse Agentien, die bekannt dafür sind, Geflügelbestände zu infizieren, zertifiziert. Die Isolierung primärer Zellen und die Identifizierung immortalisierter Zellen wird in Beispiel 1 bereitgestellt.
Die Zellen wurden identifiziert, weil zur Zeit der Entdeckung der immortalisierten Linie Zellpopulationen selektiert wurden, um die Effekte von Zellseneszenz zu untersuchen. Menschliche und Vogel-Zellen sind dafür bekannt, dass sie zu einigen der am schwierigsten zu immortalisierenden Zellen unter Gewebekulturbedingungen gehören. Im Gegensatz zu Nagerzellen gibt es keine von Experten überprüften Berichte von Verfahren, menschliche oder Hühner-Fibroblasten von normalen Spendern zu immortalisieren (Smith, et al., Science 275:63-67, 1996). In Vogelfibroblasten überdauern unbehandelte Zellen normalerweise nur 20-25 Passagen. Das heißt, bei 30 Passagen sind primäre Kulturen dieser Vogelzellen tot oder absterbend. Wie in dieser Erfindung offenbart, wurden die Zellen, um 20 Passagen zu erreichen, wie erforderlich, zwischen etwa der 12. Passage bis zu etwa der 20. Passage auf kleineren Platten Passagen unterzogen und konzentriert (siehe Beispiel 1). Es wurden Foci schneller wachsender Zellen beobachtet und diese Foci wurden unter Verwendung von Clonierungsringen (Bellco Glass, Inc. Vineland, N. J.) isoliert und in Kultur expandiert.
Seneszenz wird hierein als Zellen definiert, die Populations-Verdoppelungen von etwa 0,5 Populations-Verdoppelungen oder weniger pro Tag aufweisen. Für diese Erfindung sind immortalisierte Zellen Zellen in Kultur für mehr als 30 Passagen, die bei einer Populations-Verdopplungsrate (wie durch Gesamtzell-Auszählungen und Lebendzell-Auszählungen pro Tag unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluß bestimmt wurde) von zwischen etwa 0,6 bis etwa 1,2 Populations-Verdopplungen pro Tag und vorzugsweise zwischen etwa 0,7 bis etwa 1,0 Populations-Verdopplungen pro Tag wachsen, während sie Kontaktinhibition, Dichteabhängigkeit und eine normale Zellmorphologie aufweisen.
Die von den ursprünglich identifizierten Foci erhaltenen Zellen haben, wie in Beispiel 1 beschrieben, mehr als 400 (Populationsverdopplungen) und mehr als 160 Passagen durchlebt. Der Begriff Foci wird hierin in Bezug auf Anhäufungen von morphologisch gleichförmigen Zellen, die von der Morphologie der Zellen um sie herum unterschieden werden können, verwendet. Diese Zellfoci können leicht entfernt und für weitere Untersuchungen subcloniert werden. Die Zellen dieser Erfindung haben sich kontinuierlich alle 22 bis 24 Stunden verdoppelt. Die Zellen waren kontaktinhibiert, negativ für reverse Transkriptase (siehe Beispiel 2), Dichteabhängig arretiert, aneuploid (wie durch Chromosomenausbreitungs-Analyse unter Ölemulsion-Mikroskopie beobachtet wurde, war der Karyotyp ein Gemisch aus diploiden/tetraploiden Karyotypen mit einigen Zellen, die eine sichtbare Translokation von Chromosom 1 zeigten) und wachsen bis zu einer hohen Plattendichte von 1,1-1,9 × 10⁵ Zellen/cm². Es wurden keine vielkernigen Riesenzellen beobachtet. Die Zellen haben einen gleichförmigen Phänotyp. Die Zellen halten auch ein charakteristisches Muster schnellen Wachstums aufrecht, welches wichtig für die Virusvermehrung ist.
Die Zellen waren nicht transformiert, was durch ihre Unfähigkeit gezeigt wurde, in Weichagar-Untersuchungen zu wachsen (siehe Beispiel 3). Außerdem lösten die Zellen keine Tumore aus, wenn sie in Hühnerflügel injiziert wurden (siehe Beispiel 4). Musterzellen dieser Erfindung wurden als UMNSAH-DF1-Zellen bezeichnet und sind bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklaven Drive, Rockville Maryland, 20852 unter der Zugangsnummer CRL-12203, hinterlegt am 11. Oktober 1996 unter den Bestimmungen und Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
Diese Erfindung betrifft auch die immortalisierten embryonalen Hühnerfibroblastenzellen dieser Erfindung in Kultur und die Subclone der immortalisierten Zellen dieser Erfindung. Die Zellen dieser Erfindung werden zum Beispiel als spontan immortalisierte Zellen identifiziert. Die Zellen werden von Legehennen (Hennen, die die embryonalen Gewebe produzieren, die die Quelle dieser Erfindung sind), die bekannt Virus-frei und bekannt frei von chemischen Kontaminationen sind, erhalten und die embryonalen Gewebe, die verwendet werden, um die Zellen dieser Erfindung herzustellen, sind ebenfalls frei von chemischer Kontamination (d. h. frei von der Behandlung durch bekannte Carcinogene oder anderen Agenzien, die bekannt dafür sind, Nagerzellen zu transformieren), und frei von bekannten Viren sind. Sobald sich die immortalisierten Zellen dieser Erfindung in Kultur befinden, ist es möglich, die Zellen weiter zu subclonieren, um auf andere physiologische Parameter zu selektieren, die in der Zellpopulation variieren mögen, während sie immer noch Kontaktinhibition und Suszeptibilität für Virusinfektion aufrechterhalten.
Die Zellen wurden auf ihre Fähigkeit, HVT (Truthahn-Herpesvirus), Vogel-Herpesvirus (Serotyp III), Geflügelpest-Virus und Reovirus zu replizieren, getestet. Die Zellen können auf ihre Fähigkeit, Circodnaviridae, Hühner-HSV Serotyp II und eine Vielzahl anderer Viren zu replizieren, getestet werden und wurden als Transfektionssubstrat untersucht. Die Zellen waren sowohl nützlich für die Vermehrung von Vogel- wie auch nicht-Vogel-Viren. Beispiel 5 beschreibt genau Verfahren zur Vermehrung von HVT, Geflügelpest-Virus und Reovirus. Die Zellen sind als Substrat für die virale Produktion verwendbar und insbesondere sind die Zellen für die Retrovirusproduktion nützlich, da die Zellen und ihre Legehennen (d. h. ihre Mütter) keine detektierbaren retroviralen Infektionen aufwiesen. Die Zellen sind in der Lage, die Replikation des Vogelsarkom-Leukämie-Virus und des Rous-Sarkoma-Virus zu unterstützen.
Zur Herstellung eines Virusausgangslösung können die Zellen dieser Erfindung in Gewebekulturflaschen, Rollflaschen, Rührkultur, in Hohlfaser-Reaktoren oder andere Massenkultursysteme gebracht werden. Für die Rollflaschen-Virusvermehrung werden die Zellen mit etwa 2-5 × 10⁴ Zellen/cm² Oberfläche ausgesät. Die Infektions-Multiplizität (Verhältnis von infektiösen Viruspartikeln zu Zellen), um die Züchtung eines Virusausgangslösung zu initiieren, wird abhängig vom Virus-Stamm variieren. Fachleute für Virologie und die Züchtung besonderer Viren und Virus-Stämme werden ohne übermäßiges Experimentieren in der Lage sein, durch die Standardmanipulation der Infektionsmultiplizität, der Temperatur, Mediumvariationen und ähnliches den Ertrag des Virusausgangslösung zu maximieren.
Verfahren, das Virus nach Infektion zu ernten, um die infektiöse Virusausgangslösung zu erhalten, variieren ebenfalls mit dem Virus-Stamm. Umhüllte Viren treten langsamer in das Kulturmedium ein wie Viren ohne Hülle. Virusausgangslösungen können allein aus dem Kulturmedium oder von mit konditioniertem Medium vereinigten Zell-Lysaten erhalten werden. Für lytische Viren (die effizient während des Virusaustritts die Zelle lysieren), ist das Ernten des konditionierten Kulturmediums (z. B. verbrauchtes, virushaltiges Medium) nach einem sanften Zentrifugationsschritt, um Zelltrümmer zu entfernen, ausreichend. Auf dem Fachgebiet sind wiederum Verfahren zur Ernte und Sicherung von Viren für eine große Auswahl von Virus-Stämmen gut bekannt.
Ebenso gibt es eine Vielzahl von Verfahren, auf dem Fachgebiet alle bekannt sind, für die Quantifizierung des Viruswachstums aus einer Zellkultur heraus. Die Titer einer Virusausgangslösung können für die Mitglieder der Herpesvirus-Familie und für eine Vielzahl von cytopathische Foci auf Oberflächen von Einzelzellschichten produzierenden Viren leicht durch den Plaque-Test (als Plaque bildende Einheiten/ml Kulturflüssigkeit oder als Plaque bildende Einheitenden/Dosis für eine Impfstoff-Inoculum-Virusquantifizierung) oder als infektiöse Gewebekultur-Dosis-50 (TCID₅₀) quantifiziert werden. Rasch lytische Viren werden besser durch die TCID₅₀ als die Dosis oder Verdünnung der Virusausgangslösung, die in der Lage ist, 50 % der Kulturen in einem definierten Zeitraum zu infizieren, quantifiziert. Auf dem Fachgebiet sind Verfahren zur Züchtung und Quantifizierung von Viren bekannt und Quellen der Lehre der Methoden der Virusquantifizierung werden in Fields, et al., (Hrsg.) Fundamental Virology 1991, Raven Press, New York oder in Mandell, et al., (Hrsg.) Principles and Practice of Infectious Diseases, 1985, John Wiley & Sons, New York, gefunden.
Außer der Unterstützung des Viruswachstums können die Zellen dieser Erfindung als Verpackungslinien benutzt werden, um rekombinante Viren herzustellen, einschließlich Retroviren. Die Zellen können auch für die Herstellung rekombinanter Proteine verwendet werden, einschließlich viraler Proteine und ähnliche. Verfahren zur Einfügung einer ein rekombinantes Protein codierenden Nucleinsäure in einen Nucleinsäurevektor unter der Kontrolle eines regulierenden Elements, das in der Lage ist, die Expression eines Proteins in einer eukaryontischen Zelle zu lenken, wie in den immortalisierten Zellen dieser Erfindung, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Expressionsvektoren sind replizierbare Nucleinsäurefragmente, die die Expression eines rekombinanten Proteins lenken können. Viele Expressionsvektoren, einschließlich retrovirale Vektoren, sind durch Veröffentlichungen in Journalen und kommerzielle Anbieter erhältlich. Replizierbare Expressionsvektor-Komponenten beinhalten im Allgemeinen eine oder mehrere der folgenden, sind aber nicht darauf beschränkt: einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, Enhancer-Elemente, Promotor-Elemente, optionale Signalsequenzen und Transkriptions-Terminations-Sequenzen. Das Selektions- oder Markergen codiert ein Protein, das hilft, eine Population transformierter oder transfizierter Zellen zu identifizieren. Typische Selektionsgene codieren Proteine, die Resistenzen gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen verleihen, auxotrophe Mängel komplementieren oder kritische Nährstoffe liefern, die vom Komplex-Medium nicht erhältlich sind.
Expressionsvektoren, die eine rekombinantes Protein codierende Nucleinsäure besitzen werden in die Zellen transfiziert und werden verwendet, um die Expression des rekombinanten Proteins in den immortalisierten Zellen dieser Erfindung zu lenken. Der bevorzugte Vektor kann jedes rekombinante Protein codieren, das zu Expression in embryonalen Hühnerfibroblasten fähig ist, einschließlich, aber nicht beschränkt darauf, eines Virusproteins, einschließlich reverse Transkriptase und/oder viraler Strukturproteine. Beispiele für Vektoren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins in einer Zelle schließen retrovirale Vektoren ein, um ein Tumor unterdrückendes Protein oder ein virales Strukturprotein herzustellen, wie die, die durch Givol, et al., Oncogene 11 (12):2609-2618, 1995, Givol, et al., Cell Growth & Differentiation 5 (4):419-429, 1994, Akiyama, et al., Virology 203 (2):211-220, 1994 und Boyer, et al., Oncogene 20:457-466, 1993, offenbart wurden.
Die Zellen dieser Erfindung können als Substrat dienen, um rekombinante Viren zu exprimieren, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, rekombinanter Retroviren. Die Zellen dieser Erfindung sind geeignet, als Verpackungszelllinien für für die Gentherapie verwendbare, gentechnisch veränderte Viren oder ähnliches zu dienen. Konstrukte und Verfahren, eine besondere Zelllinie als Verpackungs-Zelllinie zu verwenden, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel offenbaren Boerkoel, et al., (Virology 195 (2):669-679, 1993) Methoden zur Virusverpackung unter Verwendung von primären embryonalen Hühnerfibroblasten als Verpackungs- Zelllinie. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um Viren in den immortalisierten Zellen dieser Erfindung zu verpacken.
Da sowohl die meisten Vogel-Zelllinien und alle transformierten Vogelzellen als auch nahezu alle transformierten Maus-Zelllinien entweder virale Kontaminationen wie endogene Viren enthalten, oder virales Protein produzieren, sind sie nicht für die Herstellung von menschlichen oder tierischen Impfstoffen geeignet. Die Zellen können nicht verwendet werden, rekombinantes Protein herzustellen, weil die endogenen Kontaminationen gereinigte rekombinante Proteinpräparationen verunreinigen können. Die Zellen dieser Erfindung stellen vorteilhaft eine geeignete Alternative für diese Probleme bereit.
Die Zellen dieser Erfindung können auch als Substrat für die Unterstützung des Viruswachstums anderer Zellen dienen. Diese anderen Zellen schließen primäre Zellen oder gezüchtete Zellen, die ein verbessertes Wachstum oder eine lange Lebensdauer in Kultur in Gegenwart anderer Zellen oder in Gegenwart extrazellulärer Matrixproteine wie Kollagenen, Lamininen und ähnlichen zeigen, ein. In einer Ausführungsform werden Zellen mit dem Virus und dann mit den Zellen dieser Erfindung vorzugsweise in einem Verhältnis von Zellen zu Zellen dieser Erfindung von etwa 1:5 Zellen bis etwa 1:20 Zellen und mehr bevorzugt in einem Verhältnis von etwa 1:10 (1 Zelle bis etwa 10 Zellen dieser Erfindung) gemischt. Die gemischten Zellen werden dann in Kultur gegeben. In einer zweiten Ausführungsform werden die Zellen mit dem Virus gemischt und auf der Oberfläche der immortalisierten, bereits auf einer Gewebekulturoberfläche haftenden Zellen dieser Erfindung ausplattiert. Die Zellen dieser Erfindung dienen als Unterstützung für die anderen Zellen und, ohne den Umfang der Erfindung beschränken zu wollen, können die Zellen dieser Erfindung sowohl Wachstumsfaktoren und ähnliches als auch extrazelluläre Matrixkomponenten und ähnliches liefern, um die anderen Zellen, während sie Virus herstellen, zu unterstützen. Beispiel 6 stellt ein Beispiel der Verwendung der Zellen dieser Erfindung als Zellsubstrat bereit.
Besondere Ausführungsformen dieser Erfindung werden im Detail diskutiert werden und auf mögliche Variationen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung wurde Bezug genommen. Es gibt eine Vielzahl für den Fachmann nutzbare, alternative Techniken und Verfahren, die es einem in ähnlicher Weise erlauben, die vorgesehene Erfindung erfolgreich durchzuführen.
Beispiel 1
Etablierung einer spontanen Hühnerfibroblasten-Zelllinie
Es wurden zwei Dutzend ELL-0-Eier des East Lansing USDA-Geflügelbestands angefordert. Die Eier wurden für 10 Tage in einem sterilisierten, isolierten Inkubator inkubiert und für primäre Kulturen verarbeitet. Das embryonale Gewebe wurde unter Verwendung einer Trypsin/EDTA-Lösung dissoziiert und in 10 % fötales Kälberserum (Gibco), 1 % Antibiotikum/Antimykotikum (Gibco) und 2 mM L-Glutamin (Gibco) enhaltendem DMEM-Medium (Gibco) ausplattiert. Die dissoziierte Zellsuspension wurde in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen, das 10 % fötales Kälberserum enthielt, gesammelt, um Trypsin zu inaktivieren und bei 700 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden in 10 ml Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, angereichert mit 36 µg/ml Insulin (Sigma), 1,6 µg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 2 mM 1-Glutamin, 10 % fötales Kälberserum, 1 % Antibiotikum/Antimykotikum-Lösung resuspendiert und in eine 25 cm²-Corning-Gewebekulturflasche pipettiert und bei 40,5°C in 5 % CO₂, 95 % Luft inkubiert. Nach 24 Stunden Inkubation wurde das Medium gewechselt. Die primäre Kultur enthielt zahlreiche Explantate mit Zentren von Epithel-ähnlichen Zellen und sternförmigen Fibroblasten.
Den Kulturen wurde erlaubt bis zur Konfluenz zu wachsen (5 Tage) und sie wurden von den Platten unter Verwendung einer Trypsin/EDTA-Lösung (0,05 % Trypsin und 0,02 % Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in PBS) entfernt und für eine zweite Passage wieder ausplattiert. Bei der zweiten Passage wurden einige der Zellen in einem konditionierten Medium, das 50 % DMEM-Medium, 12 % DMSO und 38 % fötales Kälberserum enthält, eingefroren. Diese Zellen wurden in der Dampfphase flüssigen Stickstoffs für 24 Stunden eingefroren und dann für eine langfristige Lagerung in den wässrigen flüssigen Stickstoff überführt.
Zellen bei der zweiten Passage (P2) wurden bei einer Aussaat-Dichte von 2,7 × 10⁴ Zellen/cm² erneut ausplattiert. Die Zellen wurden für mehrere Monate subkultiviert. Die kultivierten Fibroblasten wuchsen für 8 bis 9 Passagen rasch, dann begannen sie ihr Wachstum mit signifikantem Zelltod zu verlangsamen. Während der Krisen wurden die Zellen unter Verwendung einer ATV-Lösung (8 g/l NaCl, 0,4 g KCl, 1 g Dextrose, 0,58 g NaHCO₃, 0,5 g Trypsin (Difco 1:250), 0,2 g Versen (Dinatrium-Salz) in 1000 ml) Passagen unterworfen. Die Zellen wurden in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, das mit 36 μg/ml Insulin (Sigma), 1,6 μg/ml Transferrin (Sigma), 2 mM L-Glutamin, 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Antibiotikum/Antimykotikum-Lösung angereichert war, gezüchtet. Es wurde bemerkt, dass die Mehrheit der Zellen bei Passage 11 (P11) tot oder absterbend waren; eine kleine Subpopulation von Zellen schien jedoch gesunde Fibroblasten zu sein. Die P11-Zellen blieben für 4 Wochen auf der Platte, wobei frisches Medium alle drei Tage erneut gefüttert wurde. Einige Zellen wurden eingefroren und die verbleibenden Zellen wurden auf einer kleineren Fläche konzentriert und es wurde ihnen für 2 Wochen erlaubt, zu wachsen, bevor sie konfluent genug für eine zweite Subkultur waren. Bei P15 schienen die Zellen homogener in der zellulären Morphologie zu sein und wuchsen bei einer Rate von 0,32 Populationsverdoppelungen pro Tag. Bei P20, stiegen die Populationsverdoppelungen auf etwa 0,7 bis etwa 0,8 Populationsverdoppelungen pro Tag. Zu dieser Zeit schienen die Zellen eine sehr gleichförmige Morphologie zu besitzen. Die Zellen wurden als UMNSAH/DF #1 bezeichnet und befanden sich für über 19 Monate in kontinuierlicher Kultur. Die Zellen befinden sich derzeit bei Passage 160. Von P5 wurden Zellen (wie vorstehend) eingefroren und aufgetaut. Die subclonierten Zellen wurden expandiert und die Reproduzierbarkeit des Verfahrens wurde durch die Identifizierung anderer Clone bestätigt. Mehrere weitere Subclone wurden bei P11 erhalten.
Beispiel 2
Untersuchung von Zellen auf Viruskontaminanten
Die Zellen dieser Erfindung wurden unter Verwendung von PCR, um kontaminierende Nucleinsäurefragmente zu identifizieren, auf virale Kontaminanten untersucht. Es gibt eine breites Angebot im Handel erhältlicher Test-Kits für eine Vielzahl von Viren, die verwendet werden können, um zu bestimmen, ob die Zellen dieser Erfindung kontaminierende Viren enthalten. Es gibt gleichermaßen im Handel erhältliche Tests, um virales Antigen nachzuweisen (z. B. im Handel erhältliche ELISA-Tests und ähnliches), wobei das Antigen von einer Vielzahl verschiedener Viren abgeleitet wurde. Diese Tests können auf die Zellen dieser Erfindung unter Verwendung experimenteller Routinetechniken angewendet werden, um zu zeigen, dass die Kulturen frei von kontaminierendem Virus sind.
In einer Testserie wurden die Zellen auf reverse Transkriptase untersucht. 1 × 10⁶ Zellen von rasch wachsenden Kulturen wurden in 4 ml Medium isoliert. Das Medium wurden mehrere Male bei –80°C eingefroren und aufgetaut, um die Zellen zu lysieren. Das Medium mit den lysierten Zellen wurde auf einen 10 % Glycerin-Gradienten geschichtet. Der Gradient wurde in einem SW40-Rotor (Beckman Geräte, Palo Alto, KA) bei 40000 UpM für 60 Minuten zentrifugiert. Viruspartikel wurden, falls vorhanden, pelletiert. Das Medium wurde verworfen und das Pellet in 20 µl Nonidet P-40 (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) resuspendiert.
Ein Eppendorf-Rektionsgefäß wurde auf 41°C erwärmt. 5 µl der Probe wurden zu 45 µl eines reverse Transkriptase-Cocktails, der 45 mM Tris, pH-Wert 7,8, 2 mM 2-β-Mercaptoethanol, 2 mM Manganacetat, 0,1 % Triton X-100, je 10 µM dATP, dCTP, dGTP (Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN), 2,4 µg Poly(A) (Sigma), 60 ng Primer dT(12-19) (Pharmacia), 0,4 µCi/Reaktion ³H-Thymidintriphosphat (15000 bis 28000 ZpM („cpm", Zählimpulse pro Minute/pMol Aktivität, Amersham) enthielt, gegeben.
Die Reaktion wurde für 1 Stunde bei 41°C inkubiert. Eine Negativkontrolle enthielt 5 µl ddH₂O und 45 µl des Cocktails. Es wurden zwei bekannte Positivkontrollen in den Test eingeschlossen. Der Test wurde durch die Zugabe 1 ml 10 % Trichloressigsäure (TCA, Columbus chemische Industrien, Inc., Columbus, WI) gestoppt. Unter Verwendung von 5 % TCA wurden mehrere Waschungen durchgeführt. Der Filter wurde in einem Beckman-Instruments Scintillation Counter unter Verwendung von 5 ml Scintillationszähl-Flüssigkeit enthaltenden Scintillationsgefäßen überführt. Die Proben wurden bei einer Fenstereinstellung von 050 bis 600 gezählt. Ein dreifacher Anstieg der Zählimpulse über den Cocktail-Hintergrund (Negativkontrolle) wurde als positiv betrachtet.
Die primären Kulturen wurden, wie die in dieser Erfindung erhaltenen immortalisierten Zellen, negativ für reverse Transkriptase getestet. Zur weiteren Information zu Tests auf reverse Transkriptase siehe (Crittenden, et al., Virology 57: 128-138, 1974).
Beispiel 3
Kolonie-Bildungstest in Weichagar zur Berurteilung des tumorigenen Potentials von Zellen
Um das tumorigene Potential zu untersuchen, wurden die Zellen auf ein Wachstum in Weichagar getestet. Es wurde eine Weichagar-Basis durch Mischen von 12 ml einer 2 % Agarose-Lösung (die autoklaviert und auf 56°C abgekühlt worden war) mit 21,6 ml angereichertem McCoy-5A-Medium [Gibco, 120 ml fötales Kälberserum (hitzeinaktiviert, 5 ml Na-Pyruvat (2,2 % Ausgangslösung), 1 ml L-Serin (21 mg/ml Ausgangslösung), 5 ml L-Glutamin (200 mM Ausgangslösung), 12,5 ml Hepes (1 M Ausgangslösung)], 5,9 ml Asparagin (4,4, mg/ml gefilterter sterilisierter Ausgangslösung) hergestellt. Sieben ml warmes Medium/Agarose wurden in eine 100 mm²-Gewebekultur-Schale gegossen und man ließ das Ganze 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer Gewebekultur-Abzugshaube fest werden.
Die Zellen aktiv wachsender Kulturen (etwa 40 bis etwa 70 % konfluent) wurden durch Trypsinieren, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, in frisches, 10 % fötales Kälberserum (mit L-Glutamin und Antibiotoka-Antimykotikum) enthaltendes DMEM-Medium entfernt. Annähernd 1 × 10⁶ Zellen wurden in 4,25 ml 10 % fötales Kälberserum, 0,75 ml 1 % Agarose und 50 µl 2β-Mercaptoethanol enthaltendes DMEM-Medium gegeben. Sorgfältig wurde darauf geachtet, dass sich das warme Medium/Agarose vor Zugabe der Zellen bei 42°C befand. Rasch wurden 5 ml der vorstehenden Zellsuspension auf die Agaroseplatten geschichtet.
Die Zellen wurden für 35 Tage bei 37°C in einem 5 % CO₂, 95 % Luft-Inkubator gezüchtet. Platten in zweifacher Ausfertigung wurden mit 3-p-Nitrophenyl-5-phenyltetrazoliumchlorit (INT-Färbemittel) angefärbt und an den Tagen 0, 5, 10, 15, 20, 30 und 35 auf Koloniebildung und Wachstum untersucht. Alle gefärbten Kolonien, die größer als 60 µm waren, wurden als positiv betrachtet.
Alle getesteten Zellen waren negativ. Weitere Informationen bezüglich des Weichagartests sind von Hamburger, et al., Prog. Clin. Biol. Res. 48:S. 43, 135, 179, 1980, erhältlich.
Beispiel 4
Tumorgenität immortalisierter Zellen
Unter den Richtlinien, die im Animal Usage Protocol der Universität von Minnesota zusammengefasst sich (Protokoll #950300-1, März 1995-Dezember 1996), wurden Zellen in Versuchstiere injiziert, um zu bestimmen, ob die Zellen tumorigen waren oder nicht.
Aktiv wachsende Zellen wurden von Zellkulturplatten entfernt und in sechs adulte Hühner der SPAFAS-Linie (Hy-Vac, Adel, Iowa) injiziert. In das Flügelgewebe der Hühner wurden 4 × 10⁶ Zellen subcutan injiziert. Die Injektionsstellen wurden wöchentlich für 3,5 Monate untersucht. Bis heute sind für keine der hergestellten, transfizierten Zellen Tumore an der Injektionsstelle beobachtet worden, alle Tiere blieben gesund. Das Experiment zeigte, dass die immortalisierten Zellen nicht tumorigen waren.
Beispiel 5
Fähigkeit der Zellen Viruswachstum zu unterstützen
Die Zellen wurden zu 5,0 × 10⁵ Zellen/cm² in Rollflaschen ausgesät. Den Zellen wurde 24 Stunden erlaubt, sich anzuheften und es wurde eine Kontrolle für Zellzählungen geerntet. Die Zellen wurden für eine Virusinfektion in DMEM (4,5 g/l Glucose), 4 % fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 50 mg/l Gentamicin gezüchtet. Die Zellen wurden bei einer Multiplizität der Infektion von 0,0006 HVT-Viruspartikeln/Zelle infiziert. Die Rollflaschen wurden täglich auf das Fortschreiten von CPE überwacht. Die Flaschen wurden nach 46 Stunden nach Infektion geerntet, wenn annähernd 50 % CPE erreicht war. HVT infizierte Zellen wurden in Wachstumsmedium mit 10 % DMSO bei einer Konzentration von 2,0 × 10 Zellen/ml eingefroren. HVT-Titer wurden durch einen Plaque-Test quantifiziert. Virusverdünnungsreihen in Wachstumsmedium wurden auf konfluente Einzelschichen permessiver Zellen platziert. Die Kulturen wurden für eine bestimmte Zeit inkubiert und die Zellen wurden fixiert und gefärbt. Die Plaques auf den Einzelschichten wurden gezählt und der Virustiter wurde als Plaque bildende Einheiten pro Dosis ausgedrückt.
Diese Zellen wurden auch auf ihre Fähigkeit getestet, Reovirus-Produktion zu unterstützen. 2 × 10⁸ Zeilen wurden mit dem einen Titer von 8,2 TCID₅₀/ml besitzenden Reovirus-Stamm WSS-Reo 1733 infiziert. Die Zellen wurden bei einer Multiplizität der Infektion von 0,005, 0,001 oder 0,0005 infektiösen Viruspartikel/Zelle, infiziert. Die infizierten Zellen wurden in Rollflaschen gezüchtet und 48, 64 und 72 Stunden nach Infektion getestet, um produktives Viruswachstum zu zeigen.
Experiment 6
Verwendung tranfizierter Hautzellen als Zellsubstrat
Die Zellen dieser Erfindung sind als Substrat zur Unterstützung der Virusreplikation von primären Zellen nützlich. In diesen Experimenten werden die immortalisierten Zellen mit primären Zellen gemischt. In einer Studie werden die primären Zellen infiziert und mit den immortalisierten Zellen gemischt und in Kultur gegeben und in einer anderen Untersuchung werden die primären Zellen infiziert und auf die immortalisierten Zellen gegeben, wobei die immortalisierten Zellen bereits als Rasen in der Gewebekulturflasche positioniert sind. In einem Beispiel ist das Virus das Egg-Drop-Syndrom-Virus und die primären Zellen sind primäre embryonale Leberzellen des Huhns. In einem zweiten Beispiel sind die primären Zellen Endothelzellen, vorzugsweise endotheliale Nierenzellen und das Virus ist ein Virus für infektiöse Bronchitis. Das bevorzugte Verhältnis von primären zu immortalisierten Zellen beträgt etwa 1:5 bis etwa 1:20 und bevorzugter etwa 1:10. Die Virustiter von primären Zellen, die in der gemischten Zellpopulation wachsen, sind höher als die Virustiter von primären Zellen allein in Kultur. Die immortalisierten Zellen erlauben, dass die primären Zellen zur Virus-Vermehrung unter kommerziellen Bedingungen verwendet werden.

Claims

Spontan immortalisierte Zelllinie, abgeleitet von primären embryonischen Hühnerfibroblasten, welche die Zelllinie UMNSAH-DF1 ist, hinterlegt bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer CRL-12203.
Kulturen oder immortalisierte Subclone der immortalisierten Zelllinie gemäß Anspruch 1, welche Virusreplikation unterstützen.
Zellen nach Anspruch 1 oder 2, die Viren beinhalten.
Zellen nach Anspruch 1 oder 2, die mindestens einen Vektor beinhalten, der in der Lage ist, die Expression von rekombinantem Protein in den Zellen zu lenken.
Zellen nach Anspruch 4, wobei der Vektor mindestens einen Teil eines rekombinanten Virus codiert.
Zellen nach Anspruch 4 oder 5, die rekombinantes Protein exprimieren.
Zellen nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei der Vektor mindestens einen Teil eines rekombinanten Virus codiert.
Verfahren zur Herstellung einer immortalisierten Zelllinie von embryonalen Hühnerfibroblasten ohne Carcinogen-Behandlung, umfassend die Schritte: (a) Anzucht von primären embryonalen Hühnerfibroblasten in Kultur; (b) Passagieren der Fibroblasten in Kultur, bis Zellseneszenz einsetzt; (c) Konzentrieren der Zellen während der Zellseneszenz, um etwa 30 % bis etwa 60 % Kulturkonfluenz beizubehalten; (d) Identifizieren von Foci von nicht-alternden Zellen in der Kultur; (e) Isolieren der nicht-alternden Zellen; und (f) Züchten der nicht-alternden Zellen für mehr als 30 Passagen.
Immortalisierte Zelllinie hergestellt gemäß einem Verfahren nach Anspruch 8.
Verfahren zum Züchten von Viren in einer Zelle, umfassend die Schritte: (a) Anzucht der Zellen gemäß Anspruch 1, 3 oder 9 oder der Kulturen oder immortalisierten Subclone gemäß Anspruch 2 in Kultur; (b) Infizieren der Zellen mit Virus; (c) Zulassen, dass das Virus in den Zellen repliziert; und (d) Sammeln der Viren, die in den Zellen repliziert haben.
Verfahren zum Anzüchten von Viren in Zellen, umfassend die Schritte: (a) Inkubieren von Zellen mit Viren; (b) Kombinieren der Zellen mit immortalisierten Hühnerzellen gemäß Anspruch 1 oder 9; und (c) Isolieren von Viren, die von der Kombination der Zellen und der immortalisierten Hühnerzellen produziert werden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Virus Geflügelpockenvirus oder Reovirus ist.
Verfahren zur Herstellung rekombinanter Viren von immortalisierten Zellen, umfassend die Schritte: (a) Einführen von mindestens einem Nucleinsäurefragment, welches mindestens einen Teil eines rekombinanten Virus codiert, in immortalisierte Zellen gemäß Anspruch 1 oder 9; und (b) Isolieren des rekombinanten Virus von den immortalisierten Zellen.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Nucleinsäurefragment weiterhin einen Vektor umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11, 13 oder 14, wobei das Virus ein Retrovirus oder Herpesvirus ist.
Verfahren zum Quantifizieren der Virusmenge in einer Probe, umfassend die Schritte: (a) Herstellen von wenigsten einer seriellen Verdünnung eines Virus; (b) Inkontaktbringen einer Probe von Viren von mindestens einer Virusverdünnungsstufe mit immortalisierten Hühnerzellen gemäß Anspruch 1 oder 9; und (c) Quantifizieren der Virusmenge, welche in der viralen Verdünnungsstufe vorhanden ist.
Verfahren zum Quantifizieren der Virusmenge in einer Probe, umfassend die Schritte: (a) Herstellen von seriellen Verdünnungsstufen des Virus, (b) Inkontaktbringen einer Probe von Viren von einer Virusverdünnungsstufe mit immortalisierten Hühnerzellen gemäß Anspruch 1 oder 9; und (c) Quantifizieren der Virusmenge, welche in der viralen Verdünnungsstufe vorhanden ist.
Verfahren zur Herstellung von Protein in einer immortalisierten Zelle, umfassend die Schritte: (a) Einführen von Nucleinsäure, welche mindestens ein Protein codiert, in immortalisierte Zellen gemäß Anspruch 1 oder 9; und (b) Isolieren des Proteins von den Zellen.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Nucleinsäure, welche mindestens ein Protein codiert, ein Genvektor ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Genvektor ein retroviraler Vektor ist.
Verfahren zum Züchten von Zellen als Substrat, um virales Wachstum zu unterstützen, umfassend die Schritte: (a) Platzieren von Zellen in Zellkultur mit immortalisierten Hühnerzellen gemäß Anspruch 1 oder 9; und (b) Halten der Zellen in Kultur.
Zelle umfassend ein Nucleinsäurefragment, welches ein rekombinantes Virus oder mindestens ein Protein codiert, wobei die Zelle eine immortalisierte Hühnerzelle gemäß Anspruch 1 oder 9 ist.