PT920491E

PT920491E - Linhas de células imortalizadas para o crescimento de vírus

Info

Publication number: PT920491E
Application number: PT97938334T
Authority: PT
Inventors: Douglas N Foster; Linda K Foster
Original assignee: Univ Minnesota
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 2007-07-27
Also published as: JP2005118053A; JP3754088B2; WO1998006824A1; US5985642A; US5672485A; CA2263725C; ZA977216B; CA2263725A1; MY125594A; IL158301A0; DE69737735T2; KR20000029968A; HUP0000188A3; JP2006320328A; US6207415B1; ES2285738T3; IL128511A; NZ334147A; DK0920491T3; AU726820B2

Description

LINHAS DE CÉLULAS IMORTALIZADAS PARA O CRESCIMENTO

DE VIRUS

Domínio da Invenção A presente invenção tem por objecto os campos da biologia e da virologia celular. Em particular, a presente invenção tem por objecto a utilização de células imortalizadas para a propagação de vírus.

Antecedentes da Invenção

Em 1931 Alice Miles Woodruff e Ernest Goodpasture introduziram um novo processo para a cultura de vírus. Eles referiram que os vírus da varíola aviária podiam ser desenvolvidos sobre a membrana corioalantóica dos embriões de frangos em crescimento. As lesões que contêm o vírus apareceram sobre a membrana após a inoculação do vírus. 0 ovo era relativamente barato e fácil de obter quando comparado com animais que constituíam o substrato para estudos precoces de vírus. 0 ovo tem uma variedade de células e de membranas susceptíveis a infecção por diferentes vírus e pode ser mantido num ambiente estável e controlado. Os embriões de pintos têm contribuído de uma maneira importante para o desenvolvimento da virologia proporcionando, de uma maneira conveniente, uma variedade de tipos de células susceptíveis a muitos vírus.

Muito embora o evo suporte a replicação de uma vâtIsisdíS de estirpes de vírus, os processos para infectar os ovos e manter o crescimento dos vírus são demorados e complicados. Por exemplo, para a inoculação da membrana corioalantóica, perfura-se em primeiro lugar um orifício através da casca & ovo e da membrana da casca. Perfura-se a casca sobre o saco de ar o que faz com que o ar penetre entre a membrana da casca e a membrana corioalantóica, criando um saco de ar artificial, onde se deposita a amostra. A amostra entra em contacto com o epitéiio coriónico e o vírus cresce sob a forma de lesões na membrana. Não inesperadamente, a utilização de ovos para a replicação de vírus tem diminuído com o advento das técnicas de culturas de células.

Uma variedade de células pode ser desenvolvida ín vitro. As culturas de células são fáceis de manter e podem ser mantidas num ambiente altamente controlado quando comparados com os ovos. No entanto, há ainda estirpes de vírus que parecem crescer melhor em células de ovo embrionário do que em células em cultura. Além disso, muitas linhas de células em cultura transportam agentes infecciosos endógenos incluindo micoplasmas, um baixo nível de contaminantes bacterianos, vírus endógenos e similares. Alguns dos tipos de células que são as mais eficazes para suportar as replicações de vírus apresentam problemas para a produção de stock virai na medida em que as células contêm vírus endógenos. 0 vírus endógeno encontra-se quer a replicar a um baixo nível ou pode ser activado quando as células se encontram infectadas com uma segunda estirpe de vírus. Por exemplo, sabe-se que as células de roedores transportam vírus endógenos e a microscopia electrónica das células de roedores em cultura demonstra com frequência a existência de partículas virais identificáveis dentre das células. As linhas de células contaminadas não podem sei utilizadas como substratos para vacinas comerciais vivas ou inactivadas.

Para alguns vírus o processo de eleição para a replicação virai é o frango embrionado. Por exemplo, o vírus da gripe humana, o da raiva, o vírus de Canine Distemper, o vírus da doença de Marek, o Reovirus e o poxvírus das aves são vírus que crescem de preferência no ovo embrionado visto que o ovo suporta um título elevado do crescimento do stock de vírus ou em células primárias derivadas de ovos embrionaaos. Noutros casos, os vírus crescem em ovos visto que existe uma necessidade de substratos certificáveis de células isentas de vírus.

As culturas primárias de células são culturas de células que foram recentemente isoladas a partir de tecidos intactos. Estas células constituem frequentemente uma boa fonte de material isento de vírus e são bastante bem apropriadas como células hospedeiras para a replicação de vírus. As cklulas primárias nem sempre são eficazes na replicação de vírus e as células primárias de animais têm um tempo de vida limitado, em cultura, sofrendo de maneira eventual senescência. Na senescência as células cessam de se dividir e morrem em pouco tempo. A capacidade das células para se dividirem ao longo do tempo, em cultura, está dependente de diversos parâmetros incluindo a espécie de origem da célula e a idade do tecido quando foi colocado em cultura. As células que sofrem senescência não podem ser mantidas em cultura durante longos períodos de tempo e, por consequência, não constituem hospedeiros reprodutíveis Úteis para o crescimento de stocks comerciais de vírus.

Algumas células primárias escapam í* senescência e adquirem a capacidade para se tornarem imortais, Ar células de roedores parecem sofrer uma imortalízação espontânea de maneira bastante fácil (Curatolo et ai, In ¥iíto 20: 597--601, 19S4) mas as células normais humanas e de aves têm-se mostrado raramente, se é que o têm alguma vez, capazes de imortalização espontânea (Harvey, et al. Genes and Development 5: 2375-2385, 1991; Pereira-Smith, J, Cell Physíol 144: 546-9, 1990; Smith et ai. Science 273: 63-67, 1396). Há uma variedade de razões pelas quais uma população particuiar de células poderia sofrer imortalização. As células podem ser induzidas de modo a sofrerem imortalizadas após exposição a agentes conhecidos por induzirem mutações genéticas. Alguns indivíduos postulam que a cessação do crescimento, relacionada com a senescência, é dominante para a imortalização e os acontecimentos que inactivam os genes que restringem o crescimento podem ter como resultado a imortalização (Pereira-Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85: 6042-6046, 1988).

Foster et al. (Poultry Science 74 (supl. 1): 73, 1995) descrevem células fibroblásticas de embrião de frangos imortalizadas com o agente carcinogéneo químico 20-metilcolantreno. A disponibilidade de células imortalizadas isentas de vírus, pode eliminar ou reduzir a utilização de culturas primárias de tecido animal. As culturas primárias são geralmente de populações de células definidas como doentes e encontram-se frequentemente contaminadas. Estas culturas não conseguem com frequências satisfazer os requisitos reguladores para a produção comercial de vacinas. As culturas de células primárias podem ser contaminadas com Circodnavirideae (por exemplo, Chickenanemia Vírus) ou com o vírus de síndroma da queda de ovo (Egg Drop Syndrome na terminologia inglesa). Por exemplo, a vacina da doença de Marek (uma vacina de vírus livre) pode ser desenvolvida como stocks de vírus em ovos de patas para a vacinação de aves domésticas. Em 1976, bandos de frangos que receberam a vacina apresentaram evidências de Síndroma da Queda de Ovo provocado por um adenovírus de pato que se julga ter contaminado o stock de vacina e se tornou adaptado ao crescimento em frangos.

Na indústria de vacinas, os requisitos regulamentares para o produto são a segurança, a consistência e a potência e encontram-se a orientar as companhias no sentido de pesquisarem linhas de células como a melhor alternativa para a pratica corrente de utilização de substratos de vacinas de células primárias e a base ovo. As preocupações quanto a segurança e a consistência são partilhas pelos fabricantes quer de produtos de vacina humana como animal devido a uma crescente severidade da regulação do meio ambiente em relação aos substratos de vacinas tanto para os Estados Unidos da América como para a Europa. A identificação de células apropriadas para o crescimento de vírus para substituir os ovos embrionados é também favorecida tendo em vista os Princípios Governamentais dos Estados Unidos da América para a Utilization and Care of Vertebrãte Animais in Testing, Research, and Training and the Animal Welfare Act (7 U.S.C. § 2131) estabelecendo, em parte, que em todos os casos, os processos tais como os sistemas biológicos in vitro deveriam ser considerados em vez dos sistemas de animal in vivo. Existe uma necessidade de células que sejam isentas de vírus e suportem o crescimento de vírus exógenos para produzir produtos de vacina animal.

Sumário da Invenção A presente invenção tem por objecto a identificação de linhas de células de fibroblastos de frangos espontânea-mente imortalizadas e a processo para a obtenção das linhas de células. Em particular, a presente invenção diz respeito a uma linha de células espontaneamente imortalizadas derivada de fibroblastos embriónicos primários de frangos que é a linha de células espontaneamente imortalizadas UMNSAH-DF1 a qual se encontra depositada na ATCC sob os termos e condições do tratado de Budapeste. Mátí disso, a presente invenção diz respeito a culturas destas células e a subclones imortalizados da linha de células imortalizadas que suportam a replicação do virus.

De acordo com um aspecto da presente invenção, as células imortalizadas da invenção contêm virus e de acordo com um outro as células imortalizadas da invenção contêm pelo menos um vector susceptivel de dirigir a expressão da proteína recombinante nas células. De acordo com um aspecto as células de acordo com a presente invenção exprimem a proteína recombinante e de acordo com outro aspecto da presente invenção o vector contido nas células da invenção codifica pelo menos uma parte de um vírus recombinante. De acordo com uma outra forma de realização o vector é um vector retroviral.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção descreve-se o processos para a produção de uma linha de células imortalizadas a partir de fibroblastos embriónicos de frango sem tratamento com agentes carcinogéneos que compreende as fases que consistem em: desenvolver fibroblastos embriónicos primários de frango em cultura; fazer passar os fibroblastos em cultura mié ter início a senescência das células; promover a concentração das células durante a senescência da célula para manter cerca de 30% a cerca de 60% de confluência de cultura; promover a identificação de focos êt células não senescentes; e deixar crescer as células não senescentes durante mais do que 30 passagens.

De acordo ainda com um outro aspecto da presente invenção descreve-se um processo para o crescimento de vírus numa célula que compreende as fases que consistem em: promover o crescimento de uma linha de células espontaneamente imortalizadas derivadas de fibroblastos embriónicos primários de frango de acordo com a invenção em cultura; promover a infecção das células com vírus; deixar que o vírus se replique nas células; e isolar o vírus que se replicou nas células.

Descrição Pormenorizada das Formas de Realização Preferidas

Presentemente não existem essencialmente disponíveis proteínas não virais, não irais ou linhas de células aviárias não quimicamente transformadas. As células primárias são difíceis de produzir de maneira contínua para a produção de stocks de vírus e têm de ser validadas separadamente como reservatórios isentos de contaminantes para o crescimento de vírus. A presente invenção descreve a imortalização de células fibroblásticas embrionárias de frango (CEF) incluindo as células que derivam de embriões de frango East Lansing Line (ELL-O). O termo imortalização é utilizado na presente memória descritiva para referir células de não roedores susceptíveis de crescer em cultura durante mais do que 30 passagens que mantêm um tempo de duplicação em cultura de cerca de 1 a cerca de 2 dias e têm estado em cultura continua durante mais do que cerca de 6 meses. As células de aves são consideradas, de uma maneira geral, Imortalizadas após cerca de 20 a cerca de 25 passagens em cultura. As células imortalizadas diferenciam-se das células transformadas na medida que ao contrário das células transformadas, as células imortalizadas são dependentes da densidade e/ou da interrupção do crescimento (por exemplo, contacto inibido). As células transformadas são susceptíveis de crescer em agar macio e são habitualmente susceptíveis de formar tumores quando injectadas em animais de laboratório. As células de acordo com a presente invenção são úteis como reservatórios para o crescimento de vírus ou para a expressão de proteína recombinante ou vírus particularmente onde é importante que as células não abriguem um vírus contaminante ou uma proteína virai. As células são igualmente úteis para o estudo dos mecanismos subjacentes da senescência celular e da imortalização.

As células primárias de fibroblásticas de embriões de galinhas [Chicken Embryo Fibroblastic (CEF) na terminologia inglesa] provenientes de ovos ELL-0 com 10 dias de idade foram obtidas tomando o torso embriónico dos embriões com 10 dias de idade, picando o tecido e colocando as células em cultura. Os ovos fertilizados encontram-se disponíveis a partir de Hy-Vac (Adel, Iowa). Os ovos e as suas camadas foram certificados pelo fornecedor como negativos para a influenza aviária (Tipo A) , retrovírus aviários, adenovírus aviário (Grupos 1-111), vírus da encefalomielite aviária, varíola aviaria, vírus da doença de Newcastle, paramixovírus (Tipo 2), micoplasma, salmonelas e outros agentes infecciosos conhecidos por infectar o stock de criacão. O isolamento de células primárias e a identificação de células imortalizadas é proporcionado no Exemplo 1.

As oélilLsí; foram identificadas dado que no momento -dá observação da linha de células imortalizadas, as populações de células se encontravam a ser seleccionadas para estudar os efeitos da senescência. Sabe-se que as células humanas e de aves constituem algumas das células mais difíceis de imortalizar sob condições de cultura de tecidos. Ao contrário das células de roedores, não existem relatórios de revisão geral de processos para a imorzalização de fibroblastos humanos ou de pintos a partir de doadores normais (Smith, et al. Science 273: 63-67, 1996). Em fibroblastos aviários, as células não tratadas duram tipicamente apenas 20-25 passagens. Ou seja, por volta das 30 passagens as culturas primárias destas células de aves encontram-se mortas ou a morrer. Conforme se descreve na presente invenção, para atingir as 20 passagens, fizeram-se passar as células e concentraram-se (ver o Exemplo 1) entre cerca da passagem 12 até cerca da passagem 20 por placas mais pequenas conforme necessário. Observaram-se focos de células que cresciam mais rapidamente e isolaram-se estes focos utilizando anéis de clonagem (Bellco Glass, Inc. Vineland, N.J.) e expandiram-se em cultura. A senescência é definida na presente memória descritiva como sendo as células que possuem duplicações da população de cerca de 0,5 duplicações da população ou menos por dia. Para a presente invenção, as células imortalizadas são células da cultura durante mais do que 30 passagens, crescendo para uma velocidade de duplicação da população (conforme determinado pelas contagens das células totais e pelas contagens de células viáveis o dia utilizando a exclusão de azul de tripano) de cerca de entre 0,6 e cerca de 1,2 duplicações da população por dia e de preferência entre cerca de 0, e cerca de 1,0 duplicações da população por dia enquanto exibem inibição de contacte, dependência de densidade e uma morfologia normal da célula.

As células obtidas a partir de focos originalmente identificados, conforme se descreve no Exemplo 1, foram submetidas a mais do que 400 (duplicações de população) e mais do que 160 passagens. O termo foco é utilizado na presente memória descritiva para referir cachos de célula morfologicamente uniformes que se podem distinguir a partir da morfologia das células em torno delas. Estes focos de células podem ser removidos facilmente e sub-clonados para estudo ulterior. As células de acordo com a presente invenção continuaram a duplicar de 22 em 24 horas. As células foram inibidas do contacto, a transcriptase inversa negativa (ver Exemplo 2), interrompida a dependência da densidade, aneuplóides (conforme observado por análise de espalhamento cromossómico sob microscopia de imersão em óleo o cariótipo era um mistura de cariótipos diplói-des/tetraplóides com algumas células a apresentar uma translocação aparente do cromossoma ];, e crescem até densidades elevadas de plaqueamento compreendidas entre 11-19 x 105 células/cm2. Não se observaram quaisquer células multinucleares gigantes. As células têm um fenotipo uniforme. As células mantêm igualmente um padrão caracteristico de crescimento rápido que é importante para a propagação do vírus.

As células eram não transformadas conforme se demonstra pela sua incapacidade de crescerem em ensaios de agar mole (ver o Exemplo 3). Além disso, as células não produziram tumores quando injectadas nas asas de frangos (ver o Exemplo 4) . As células de acordo com a presente invenção foram designadas por células UMNSAH-DF1 e encontram-se depositadas na American Type Culture Collectíon (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland, 20852 sob o número de admissão CRL-12.2G3, depositadas em 11 de Outubro de 1996 sob os termos e as condições do Tratado de Budapeste. A presente invenção refere-se igualmente a células de fibroblastos embriónicos imortalizadas de frangos de acordo com a invenção em cultura e aos sub-clones das células imortalizadas da invenção. Por exemplo, as células de acordo com a presente invenção são identificadas como células imortalizadas espontâneas. As células são obtidas a partir de camadas isentas de vírus, camadas conhecidas isentas de contaminantes químicos (galinhas que produzem os tecidos embriónicos que constituem a fonte da presente invenção) e os tecidos embriónicos utilizados para produzir as células de acordo com a presente invenção são igualmente isentos de contaminantes químicos (isto é, isentas de tratamento por agentes carcinogéneos conhecidos ou outros agentes que se sabem transformar as células do roedores) e isentas de vírus conhecidos. Uma vez as células imortalizadas de acordo com a presente invenção se encontrarem em cultura, é possível sub-clonar as células para selecciona-las para outros parâmetros fisiológicos que podem variar na população de células embora mantendo ainda a inibição de contacto e a susceptibilidade a infecção virai.

As células foram ensaiadas quanto à sua capacidade para replicar HVT ("Herpesvirus of Turkeys" - vírus de Herpes de perus), vírus de Herpes de aviário (serotipo IIT), vírus da Varíola Aviária e reovírus. As células podem ser ensaiadas quanto a sua capacidade para replicar Circodnavirideae, HSV de frangos serotipo II para uma variedade de outros vírus e foram ensaiados como um substrato para transfecção. As células foram úteis para â propagação tanto de vírus aviários como vírus nâc aviários. 0 Exemplo 5 pormenoriza processos para a propagação de HVT, vírus da Varíola Aviária e reovírus. As células são úteis como um substrato para a produção virai e, em particular, as células t úteis para a produção de reirovírus visto que as células e as suas camadas (isto é, as suas mães) não possuem infecções detectáveis de retrovírus. As células são susceptíveis de suportar a replicação de vírus da leucemia do sarcoma de aves (Avian Sarcoma Leukemia Vírus) e vírus do sarcoma de Rous.

Para produzir o stock de vírus, semeiam-se as células de acordo com a presente invenção em frascos de cultura de tecido, frascos cilíndricos, cultura agitada, em reactores de fibras ocas ou outros sistemas de cultura em massa. Para a propagação dos vírus em frascos cilíndricos, semeiam-se as células a cerca de 2 luli?/tsr de área superficial. A multiplicidade da infecção (razão de partículas de vírus infeccioso para células) para iniciais o crescimento do stock de vírus variará na dependência da estirpe do vírus. Os peritos na técnica de virologia e os peritos no crescimento de vírus particulares e estirpes particulares de vírus estarão em condições de maximizar o rendimento do stock de vírus através da manipulação convencional da multiplicidade da infecção, temperatura, variações de meio, e similares, sem experimentação indevida,

Os processos para a colheita do vírus após a infecção para se obter um stock de Viius infeccioso variam também com a estirpe de vírus. Os vírus revestidos saem para o meio de cultura mais lentamente do que os virus não revestidos. Pode obter-se os stocks de vírus a partir do meio de cultura isolado ou a partir de lisados de células reunidos com o meio condicionado. Para vírus líticos (os que são eficientes na lise de uma célula durante a saída do vírus), a colheita do meio de cultura condicionado (por exemplo, meio gasto que contém o vírus) após uma fase de centrifugação suave para eliminar os detritos celulares é suficiente. Mais uma vez, os processos de colheita e para guardar os vírus a partir de uma ampla gama de estirpes de vírus são bem conhecidos na técnica.

Existe uma variedade de processos, todos também conhecidos na especialidade, para a quantificação do crescimento do vírus a partir da cultura de células. Por exemplo, o título do stock de vírus para membros da família do vírus de Herpes e para uma variedade de vírus que produzem focos de citopatologia numa superfície monocamada celular são facilmente quantificados por um ensaio de placas (como placa que forma unidades/ml de fluido de cultura ou como placa que forma unidades/dose para a quantificação do vírus do inoculo da vacina) ou como dose infecciosa da cultura de tecido-50 (T€íJ'%;, Os vírus rapidamente líticos são mais facilmente quantificados por TCIOps como a dose ou diluição de stock de vírus susceptível de infectar 50% das culturas num intervalo de tempo definido. Os processos para o crescimento e a quantificação de vírus são conhecidos na especialidade e as fontes para ensinar os processos de quantificação de vírus encontram-se descritos em Fields, et al. (eds) Fundamental Virology 1991, Raven Press, New York ou em Mandell, et al. (eds.) Principies and Practice of Infectious Diseases, 1985, John Wiley & Sons, New York.

Além de suportarem o crescimento dos vírus, as células de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas como linhas de embalagem para produzir vírus recombinantes, incluindo retrovírus. As células podem ser igualmente utilizadas para produzir proteínas recombinantes, incluindo proteínas virais, e similares. Os processos para incorporar a proteína recombinante que codifica o ácido nucleico no vector de ácido nucleico sob o controlo de elementos reguladores susceptíveis de dirigir a expressão de uma proteína numa célula eucariótica, tal como as células imortalizadas de acordo com a presente invenção, são bem conhecidas na especialidade. Os vectores de expressão são fragmentos de ácido nucleico replicáveis que podem dirigir para a expressão de uma proteína recombinante. Muitos vectores de expressão, incluindo vectores retrovirais, encontram-se disponíveis na especialidade através de publicações periódicas e fornecedores comerciais. Os componentes do vector de expressão replicável incluem, de uma maneira geral, mas não ficando limitados a estes, um ou mais dos seguintes: uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, elementos intensificadores, elementos promotores, sequências opcionais de sinal e sequências de terminação da transcripção. Os genes de selecção ou marcadores codificam a proteína que serve para identificar uma população de células transformadas ou transfectadas. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que conferem resistência aos antibióticos ou outras toxinas, complementam deficiências auxotróficas ou fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos.

Os vectores de expressão que comportam proteína recombinante que codifica o ácido nucleico são transfectados nas células e são utilizados para dirigir a expressão da proteína recombinante nas células imortalizadas de acordo com a presente invenção. De preferência, o vector pode codificar qualquer proteína recombinante susceptível de expressão em células de fibroblastos embriónicos de frangos, incluindo, mas não ficando limitados a estes, proteína de vírus, incluindo transcriptase inversa e/ou proteína virai estrutural. Exemplos de vectores para produzir a proteína recombinante numa célula incluem vectores retrovirais para produzir a proteína supressora de tumor ou a proteína estrutural viril tal como as aescritas por Givol, et al. Oncogene 11 (12): 2609-2618, 1995, Givol, et al. Cell Growth & Dífferentiation 5 (4): 419-429, 1994, Akiyama, et al. Virology 203 (2): 211-220, 1994 e Boyer, et al. Oncogene 20: 457-66, 1993.

As células de acordo com a presente invenção podem servir como substrato para exprimir vírus recombinantes, incluindo, mas não ficando limitadas a estas, retrovírus recombinantes. As células de acordo com a presente invenção são apropriadas para servir como linhas de células de embalagem para vírus produzidos por engenharia genética úteis para terapia genética, ou similares. As estruturas e processos para a utilização de uma linha de células particulare como uma linha de células de embalagem são conhecidas na técnica. Por exemplo, Boerkoel et al. (Virology 195 (2) : 669-79, 1993) descreve métodos para a embalagem de vírus utilizando os fibroblastos embriónicos primários de frangos como linha de células de embalagem. Estes mesmos processos podem ser utilizados para embalar vírus nas células imortalizadas de acordo com a presente invenção,

Gadc que a maior parte das linhas de células de aves e todas as células de aves transformadas bem como virtualmente todas as linhas de células transformadas de murganho ou contêm contaminantes virais tais como vírus endógenos ou produzem proteína virai, elas não são apropriadas para a produção de vacinas humanas ou animais. As células não podem ser utilizadas para produzir a proteína recombinante visto que os contaminantes endógenos podem contaminar as preparações purificadas de proteína recombinante. Com vantagem, as células de acordo com a presente invenção produzem uma alternativa apropriada para estes problemas.

As células de acordo com a presente invenção podem servir igualmente como um substrato para suportar o crescimento de vírus a partir de outras células. Estas outras células incluem células primárias, ou células cultivadas que mostram o crescimento ou longevidade melhorados em cultura na presença de outras células ou na presença de proteínas de matriz extracelular tais como colagénios, lamininas e similares. De acordo com um outro aspecto, misturam-se as células com vírus e misturam-se então com as células de acordo com a presente invenção, de preferência numa razão de células: para células de acordo com a presente invenção de cerca de entre 1:5 células a cerca de 1:20 e mais de preferência numa razão de cerca de 1:10 (1 célula para cerca de 10 células de acordo com a presente invenção). As células misturadas são então colocadas em cultura. De acordo com uma segunda forma de realização, as células são misturadas com vírus e plaqueadas sobre a superfície das células imortalizadas de acordo com a presente invenção já se encontram ligadas a superfície da cultura de tecido. As células de acordo com a presente invenção servem como suporte para outras células e, sem pretender limitar o escopo da presente invenção, as céiulas da presente invenção podem fornecer factores de crescimento e similares bem como componentes de matriz extracelular, para suportar as óctraç células enquanto se encontram a produzir c vírus. O Exemplo 6 proporciona um exemplo da utilização das células de acordo com a presente invenção como um substrato celular.

Os enquadramentos particulares de acordo com a presente invenção serão descritos em pormenor e far-se-á referência a variações possíveis dentro do âmbito da invenção. Elas constituem uma variedade de técnicas e processos alternativos disponíveis para os peritos na especialidade que permitiriam de maneira análoga que se realizasse com sucesso a invenção em questão.

Exemplo 1

Estabelecimento da Linha de Células Espontânea de Fibroblastos de Frangos

Adquiriram-se duas dúzias de ovos ELL-0 a partir de stocks de criação East Lansing USDA. Incubaram-se os ovos num incubador isolado esterilizado durante 10 dias e processaram-se para culturas primárias. Dissociou-se o tecido embriónico utilizando uma solução de fc:r::tpsivíA/SS'iS. e plaquearam-se em meios DMEM (Gibco) que contém 10% de soro fetal de vitela (Gibco). Contém 1% de antibióti-co/antimicótico (Gibco) e 2 mL de L-glutamina (Gibco). Isolou-se a suspensão dissociada de células num tubo de centrífuga de 50 ml contendo 10% de soro fetal de vitslA para inactivar a tripsina e centrifugou-se a 700xg durante 10 minutos.

Voltou a suspender-se as células em 10 mL de meio de Eagle modificado por Dulbecco enriquecido com 36 μ^Μή de insulina (Sigma), 1,6 p4/iíiL da transferrina (SífSà? St. bfiuisq MO), 2 rnM de L-glutamina, 10% de soro fetal de vitela, 1% de baluçlíS de e pipetou-se para um balão de cultura de tecido cerealífero de 25 απ' e incubou-se a temperatura de 40*5*2) em 5% de C02, 958 de ar. Decorridas 24 horas de incubação, alterou--se o meio. A cultura primária continha numerosos explantes com centros de células semelhantes a células epiteliais e fibroblastos radiantes.

Deixou-se crescer as culturas até a confluência (5 dias) e removeram-se das placas utilizando uma solução de tripsina/EDTA (0,05% de tripsina e 0,02% de ácido etileno diamino tetra acético (EDTA) em PBS) e voltaram a plaquear--se para a segunda passagem. Na segunda passagem congelaram-se algumas das células no meio condicionado que contém 50% de meio DMEM, 12% de DMSO e 38% de soro fetal de vitela. Congelaram-se estas células em azoto líquido em fase de vapor durante 24 horas e transferiram-se então para o azoto aquoso líquido para armazenagem a longo prazo.

Replaquearam-se as células na segunda passagem (P2) para uma densidade de sementeira de 2,7 x 104 células/cm2. Fez-se uma sub-cultura das células durante diversos meses. Os fibroblastos em cultura crescerem rapidamente durante 8 a 9 passagens, e então começaram a abrandar com uma morte celular significativa. Durante as crises, fizeram-se passar as células utilizando uma solução de ATV (8 gm/1 de NaCl, 0,4 gm de KC1, 1 gm de dextrose, 0,58 gm de 0,5 gm de tripsina (Difco 1:250), 0,2 gm de verseno (sal díssódicc) em 1000 mL). Deixaram-se crescer as células em meio de Eagle modificado por Dulbecco enriquecido com 36 pg/ml de insulina (Sigma), 1,6 μρ/ιηΐ de transferrina (Sigma), 2 mis de L-glutamina, 10% de soro fetal de vitela e 1% de solução de antíbiótico/antimicótico. Verificou-se que a maior parte das células na passagem 11 (Pll) estavam mortas ou a morrer; no entanto, uma pequena sub-população de células pareceu ser constituída por fibroblastos saudáveis. As células Pll permaneceram no disco durante quatro semanas com re-alimentação de três em três dias com meio fresco. Congelaram-se algumas células e concentraram-se as células remanescentes numa área mais pequena e deixaram-se crescer durante mais duas semanas antes de serem suficientemente confluentes para uma segunda sub-cultura. Por volta de P15, as células pareceram ser mais homogéneas quanto à morfologia celular e cresceram com uma velocidade de 0,32 duplicações da população por dia. Por volta de P20, as duplicações da população aumentaram para cerca de 0,7 a cerca de duplicações da população por dia. Nesta altura, as células pareceram ter uma morfologia muito uniforme. As células foram designadas por UMNSAH/DF #1 e foram mantidas em cultura contínua durante mais de 19 meses. As células encontram-se correntemente na passagem 160. Congelaram-se as células (tal como descritas anteriormente) e descongelaram-se a partir de P5. Expandiram-se as células sub-clonadas e confirmou-se a reprodutibilidade do processo através da identificação de outros clones. Obtiveram-se vários sub-clones adicionais por volte de Pll.

Exemplo 2 Células de ensaio relativamente aos contaminantes de vírus

Ensaiaram-se as células de acordo com a presente invenção no que toca aos contaminantes virais utilizando PYR para identificar os fragmentos de ácido nucleico contaminantes. Existe uma ampla variedade de kits de ensaio disponíveis no comércio para uma variedade de vírus que podem ser utilizados para determinar que as células de acordo com a presente invenção contêm vírus contaminantes.

De maneira análoga, existem ensaios disponíveis no comércio para detectar o antigénio virai (por exemplo, os ensaios ELISA disponíveis no comércio e similares), em que o antigénio é derivado de uma variedade de diferentes vírus. Estes ensaios podem ser utilizados nas células de acordo com a presente invenção utilizando técnicas experimentais de rotina para demonstrar que as culturas se encontram isentas de vírus contaminantes.

Numa série de ensaios, ensaiaram-se as células no que toca a actividade da transcriptase reversa. Isolaram-se 1 x XÔS células a partir de culturas que crescem rapidamente em 4 ml de meio. Lavou-se o meio através de diversos ciclos de congelação descongelação k temperatura de -80°C para promover a lise das células. Acamou-se o meio com as células lisadas sobre um gradiente de 10% de glicerol. O gradiente foi rodado durante 60 minutos a 40 000 rpm utilizando um rotor SW40 (Beckman Instruments, Paio Alto, CA) . Granularam-se as partículas de vírus, se presentes. Descartou-se o meio e voltou a suspender-se o grânulo em 20 μΐ de Nonidet P-40 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Aqueceu-se um tubo de Eppendorf a temperatura e 41°c. Adicionou-se 5 μΐ de amostra a 45 μΐ de cocktail de transcriptase inversa contendo 45 mM de Tris, pH 7,8, 2 mM de 2-p-mercaptotanol, 2 vc: de acetato de manganês, 0,1% de Triton X-100, 10 μΜ cada da dATP, dCTP, dGTP (Boehringer Mannheim Biochemícal, Indianapolis, IN), 2,4 \iq de polia (Sigma), 60 ng de iniciador dT 12-19 (Pharmacia), 0,4 /ze&cçko trífosfato de tímidina (15 00Ώ a 28 303 cpm/pmole de actividade, Amersham).

Incubou-se a mistura reaccional durante uma hora à temperatura e 41°C. Um controlo negativo incluía 5 μΐ de ddHaO e 45 μΐ do cocktail. Incluíram-se no ensaio dois controlos positivos conhecidos. Interrompeu-se o ensaio pela adição del ml de ácido tricloroacético a 10% (TCA, Columbus Chemical Industries, Inc., Columbus, WI). Filtrou--se a mistura através de um pré-filtro de vidro com 0,45 micrómetros Whatman GF/C. Realizaram-se diversas lavagens utilizando 5% de TCA. Transferiu-se o filtro para um Beckman Instruments Scintillation Counter utilizando frascos de cintilação que contem 5 ml de fluido de contagem de cintilação. Contaram-se as amostras sobre uma fixação de janela 050 a 600. Um aumento do limiar de contagem em relação a base do cocktail (controlo negativo) foi considerado positivo. O ensaio das culturas primárias mostrou-se negativo no que toca a transcriptase reversa tal como o fizeram as células imortalizadas obtidas na presente invenção. Para mais informação sobre os ensaios de transcriptase inversa veja-se (Crittenden, et al. Virology 57: 128-138, 1974).

Exemplo 3

Ensaio de Formações de Colónia de Agarose Mole para Determinar o Potencial Tumorigénico das Células

Para ensaiar o potencial tumorigénico, ensaiaram-se as células quanto ao crescimento em agar mole. Preparou-se a base de agarose mole mediante mistura de 12 mL de uma solução de agarose a 2% (que tinha sido autoclavada e arrefecida I temperatura de 56°C) em 21,6 ml de meio de McCoy 5A enriquecido [Gibco, 120 mL de soro fetal de vitela (ínactivado pelo calor, 5 ml de piruvato de Na (2,2% de stock), 1 mL de L-serina (21 mg/ml de stock), 5 mis de L-giutamina (200 mM de stock), 12,5 ml de Hepes (1M de stock)], 5,9 mis de Asparagina (4,4 mg/ml de stock esterilizado filtrado). Despejaram-se sete mililitros de meio quente/agarose sobre um disco de cultura de tecido de 100 mm2 e deixou-se solidificar a temperatura ambiente num cobertura de tecido de cultura durante 1 hora.

Removeram-se as células a partir das culturas em crescimento activo (cerca de 40% a cerca de 70% de confluência) mediante tripsinização para se obter uma suspensão de células individuais em meios DMEM fresco que contém 10% de soro fetal de vitela (com L-glutamina e antibióticos-antimicóticos). Adicionaram-se cerca de 1 x 106 células a 4,25 ml de meio DMEM contendo 10% de soro fetal de vitela, 0,75 ml de agarose a 1% e 50 μΐ de 2β-ΓηβΓθ3ρ1θΘΐβηο1. Foi necessário ter cuidado para garantir que o meio quente/agarose se encontrava a temperatura de 42°C antes da adição das células. Rapidamente, promoveu-se uma sobrecamada de 5 ml sobre a suspensão das células anteriores sobre as placas de agarose.

Deixaram-se crescer as células a temperatura de 37°C num incubador com 5 % de C02 e 95 % de ar e observaram-se durante 35 dias. Coraram-se as placas em duplicado com cloreto de 3 p-nitrofenil-5-fenil-tetrazólio (corante INT) e examinaram-se nos dias 0, 5, 10, 15, 20, 30 e 35 no que toca a formaçao e ao crescimento da cclónia. Todas as colónias coradas maiores do que 60 pm foram consideradas positivas.

Todas as células ensaiadas foram negativas. Informação ulterior relacionada com o ensaio de agar mole encontra-se disponível a partir de Hamburger, et al. Prog. Clin. Biol. Res. 48: pág. 43, 135, 179, 1980.

Exemplo 4

Tumorgenicidade das Células Imortalizadas

Sob as linhas de orientação delineadas pela University of Minnesota Animal Usage Protocol (protocolo #950300-1, Março 1995 - Dezembro 1996) injectaram-se células em animais de ensaio para determinar se sim ou não as células eram tumorigénicas.

Retiraram-se as células com crescimento activo das placas de cultura de células e injectaram-se em seis frangos adultos da linha SPAFAS (Hy-Vac, Adcl, Iowa). Introduziram-se injecções subcutâneas de 4 x 106 células nas palmuras das asas de frangos. Examinaram-se os locais de injecção semanalmente durante 3,5 meses. Não se observaram quaisquer tumores no local da injecção para quaisquer das células transfectadas produzidas até a data com todos os animais a permanecerem saudáveis. A experiência demonstrou que as células imortalizadas eram não tumorigénicas.

Exemplo 5

Capacidade das Células para Suportar o Crescimento do Vírus

Semearam-se as células em frascos cilíndricos I razão de 5,0 x 10': cè; e) cr-y'·. Deixaram-se ligar as células durante 24 horas e colheu-se um controlo para a contagem das células. Deixaram-se crescer as células para infecção do vírus em DMEM (4,5 g/L de glicose), 4% de Soro Feral de

Bovino, 2 mM de L-Glutamina, 50 mg/L de Gentamicina. Infectaram-se as células para uma multiplicidade de infecção de partículas de vírus 0,0006 HVT por célula. Os frascos cilíndricos foram observados diariamente quanto a progressão de CPE. Colheram-se os frascos as 46 horas post infecção quando existia aproximadamente 50% de CPE. Congelaram-se as células Lnfectadas HVT em meio de cultura com 10% de DMSO para uma concen-cração de 2,0 χ ΚΓ de células/ml. Quantificaram-se os títulos de HVT por placa de ensaio. Diluíram-se os vírus em série em meio de crescimento e colocaram-se em mono camadas confluentes de células permissivas. Incubaram-se as culturas durante um intervalo de tempo designado e fixaram-se e coraram-se as células. Contaram-se as placas sobre as monocamadas e exprimiu-se o título do vírus sobre a forma de unidades que formam placa por dose.

Ensaiaram-se igualmente estas células quanto a sua capacidade para suportar a produção de reovirus.

Q

Infectaram-se 2,5 x 10 células com a estirpe WSS-Reo 1733 de Reovirus com um título de 8,2 TCX^/si!, Infectaram-se as células de uma multiplicidade de infecção de 0,005, 0,001 ou 0,0005 de partículas de vírus infeccioso/célula. Deixaram-se crescer as células infectadas em frascos cilíndricos e ensaiaram-se as 48, 64 e 72 horas após a infecção para demonstrar o crescimento virai produtivo.

Exemplo 6

Utilização de Células de Pele Transfectadas como Substrato Celular

As células de acordo com a presente ince' são úteis como um substrato para suportar a replicação de vírus de células primárias. Nestas experiências, misturam-se as células imortalizadas com células primarias. Num estudo, infectaram-se as células primarias e misturaram-se com as células imortalizadas e colocaram-se em cultura e num segundo estudo infectaram-se as células primárias e colocaram-se sobre as células imortalizadas onde as células imortalizadas já se encontravam posicionadas sob a forma de uma relva no frasco de tecido de cultura. Num exemplo, o virus é o virus de Egg Drop Syndrome e as células primarias são células de fígado embriónico primárias de frango. Num segundo exemplo, as células primárias, são células endoteliais, de preferência células endoteliais de rim e o vírus é o vírus da bronquite infecciosa. A razão preferida de células primárias para células imortalizadas encontra-se compreendida entre cerca de 1:5 e cerca de 1:20 e mais preferivelmente é igual a cerca de 1:10. Os títulos dos vírus provenientes do crescimento de células primárias da população de células mista são mais elevados do que os títulos dos vírus provenientes de células primárias na cultura isolada. As células imortalizadas permitem que as células primárias sejam utilizadas para a propagação de vírus em condições comerciais.

Lisboa, 17 de Julho de 2007

Claims

1. Linha celular imortalizada espontaneamente, caracterizada pelo facto de derivar de fibroblastos embriónicos primários de frango, que é a linha de células UMNSAH-DFl depositada na American Type Culture Collection com o N.° de Acesso # CRL-12203.

2. Culturas ou sub-clones imortalizados da linha de células imortalizadas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo facto de suportarem a replicação do virus .

3. Células de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizadas pelo facto de conterem vírus.

4. Células de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizadas pelo facto de conterem pelo menos um vector susceptível de dirigir a expressão da proteína recombinante nas células.

5. Células de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo facto de o vector codificar pelo menos uma parte de um vírus recombinante.

6. Células de acordo com a reivindicação 4 ou 5 caracterizadas pelo facto de expressarem uma proteína recombinante.

7. Células de acordo com uma qualquer das reivindicações 4 a 6, caracterizadas pelo facto de o vector codificar pelo menos uma parte de um vírus recombinante.

8. Processo para a produção de uma linha de células imortalizadas a partir de fibroblastos embriónicos de frangos sem tratamento por carcinogéneos caracterizado pelo facto de compreenaer as fases que consistem em: (a) promover o crescimento de fibroblastos embriónicos primários de frangos em cultura; (b) fazer passar os fibroblastos em cultura até ter início a senescência das células; (c) promover a concentração das células durante a senescência das células para manter cerca de 30 % a cerca de 60 % de confluência da cultura; (d) promover a identificação de focos de células não senescentes na cultura; (e) promover o isolamento das células não senescentes; e (f) promover o crescimento das células não senescentes durante mais do que 30 passagens.

9. Linha de células imortalizadas caracterizada pelo facto de ter sido produzida por um processo de acordo com a reivindicação 8.

10. Processo para o crescimento de vírus numa célula caracterizado pelo facto de compreender as fases que consistem em: (a) promover o crescimento das células de acordo com a reivindicação 1, 3 ou 9 ou as culturas ou sub-clcnes imortalizados de acordo com a reivindicação 2 em cultura; (b) promover a infecção das células com vírus; (c) deixar replicar o vírus nas células; e (d) isolar os vírus que replicaram nas células.

11. Processo para o crescimento de vírus a partir de células caracterizado pelo facto de compreender as fases que consistem em: (a) promover a incubação das células com vírus; (b) promover a combinação das células com células imortalizadas de frango de acordo com a reivindicação 1 ou 9; e (c) promover o isolamento do vírus produzido a partir da combinação das células com as células imortalizadas de frango.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o vírus ser o vírus da varíola aviaria (poxvírus das aves) ou o reovírus.

13. Processo para a produção de um vírus recombinante a partir de uma célula imortalizada caracterizado pelo facto de compreender as fases que consistem em: (a) promover a introdução de pelo menos um fragmento de ácido nucleico, codificando o fragmento de ácido nucieico pelo menos uma parte de um vírus recombinante, em células imortalizadas de acordo com a reivindicação 1 ou 9; e (b) promover o isolamento do vírus recombinante a partir das células imortalizadas.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o fragmento de ácido nucleico compreende ainda um vector.

15. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 11, 13 ou 14, caracterizado pelo facto de o vírus ser um retrovírus ou um vírus de herpes.

16. Processo para a quantificação da quantidade de vírus numa amostra caracterizado pelo facto de compreender as fases que consistem em: (a) promover a preparação de pelo menos uma diluição em série de um vírus; (b) promover o contacto de uma amostra de vírus a partir de pelo menos uma diluição de vírus com células imortalizadas de frango de acordo com a reivindicação 1 ou 9; e (c) promover a quantificação da quantidade de vírus presente na diluição de vírus.

17. Processo para a quantificação da quantidade de vírus numa amostra caracterizado pelo facto de compreender as fases que consistem em: (a) promover a preparação de diluições em série de um vírus; (b) promover o contacto de uma amostra de vírus a partir de uma diluição de vírus com células imortalizadas de frango de acordo com a reivindicação 1 ou 9; e (c) promover a quantificação da quantidade de vírus presente na diluição de vírus.

18. Processo para a produção de uma proteína numa célula imortalizada caracterizado pelo facto de compreender as fases que consistem em: (a) promover a introdução de ácido nucleico, que codifica pelo menos uma proteína, em células imortalizadas de acordo com a reivindicação 1 ou 9; e (b) promover o isolamento da proteína a partir das células.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de o ácido nucleico que codifica pelo menos uma proteína ser um vector de gene.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o vector de gene é um vector retroviral.

21. Processo para o crescimento de células sob a forma de um substrato para o suporte do crescimento de vírus caracterizado pelo facto de compreender as fases que consistem em: (a) colocar as células em meio de cultura com células imortalizadas de frango ae acordo com a reivindicação 1 ou 9: e (b) manter as células em cultura.

22. Célula caracterizada pelo facto de compreender um fragmento de ácido nucleico que codifica um virus recombinante ou pelo menos uma proteína, em que a célula é uma célula imortalizada de frango de acordo com a reivindicação 1 ou 9. Lisboa, 17 de Julho de 2007