KR100375871B1 - 바이러스 증식을 위한 불멸화된 세포주 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 계배 초대 섬유아세포로부터 얻은 불멸화된 세포주의 생산 및 용도에 관한 것이다. 세포는 바이러스 증식, 재조합 단백질 발현 및 재조합 바이러스 생산을 위한 배양기로서 유용하다.

Description

바이러스 증식을 위한 불멸화된 세포주 {IMMORTALIZED CELL LINES FOR VIRUS GROWTH}
1931년에 앨리스 마일즈 우드러프(Alice Miles Woodruff) 및 어니스트 굿패스쳐(Ernest Goodpasture)는 바이러스를 배양하기 위한 새로운 방법을 소개하였다. 이들은 발생중인 계배(chick embryo)의 난황요막(chorioallantoic membrane)에서 계두(fowl pox)바이러스가 증식될 수 있음을 보고하였다. 바이러스 접종 후에 막상에 바이러스를 함유한 병변이 나타났다. 계란은 초기에 바이러스 연구를 위해 사용된 동물 배양기(substrate)에 비해 비교적 싸고 쉽게 구입이 가능하였다. 계란은 다른 바이러스들에 의해 감염되기 쉬운 여러가지 세포들과 막들을 가지며 제어된 안정한 환경에서 유지될 수 있다. 계배는 많은 바이러스에 감염되기 쉬운 여러 종류의 세포들을 편리하게 제공함으로써 바이러스학의 발달에 중요한 수단으로 기여하고 있다.
계란은 여러 종류의 바이러스 균주들의 복제를 허용하지만, 계란을 감염시키고 바이러스를 유지시키는 방법은 많은 시간을 요하며 힘들다. 예컨대, 난황요막에 접종하기 위해, 우선 계란껍질 및 껍질막을 통해 구멍을 뚫는다. 공기주머니 상부의 껍질에 구멍을 뚫어 껍질막과 난황요막 사이로 공기가 들어갈 수 있도록 하고, 이로 인해 인공적인 공기주머니가 형성되는데, 여기에 샘플이 놓여진다. 샘플은 난막상피(chorionic epithelium)와 접촉하며 바이러스는 막상에 병변으로서 증식한다. 예상대로, 세포배양 기술의 도래와 함께 바이러스 복제를 위한 계란 사용은 감소하였다.
여러 종류의 세포들이 시험관내에서 증식될 수 있다. 세포배양은 계란에 비하여 유지하기가 쉽고 고도로 제어된 환경에서 지속될 수 있다. 그러나, 배양된 세포에서보다는 수정란 세포에서 더 잘 증식하는 바이러스 균주들이 여전히 있다. 게다가, 배양된 많은 세포주들은 마이코플라스마, 낮은 수준의 세균성 오염, 내재성 바이러스 등을 포함하여 내재성 감염제를 지니고 있다. 바이러스 복제를 허용하는데 가장 효과적인 세포 타입중의 일부는 이들 세포들이 내재성 바이러스를 함유한다는 점에 있어서 바이러스 스톡(stock) 생산에 문제점이 있다. 내재성 바이러스는 낮은 수준으로 복제하고 있거나 또는 제 2 바이러스 균주로 세포를 감염시킬 경우 활성화될 수 있다. 예컨대, 설치류 세포들은 내재성 바이러스를 함유하는 것으로 알려져 있으며 배양액중의 설치류 세포의 전자현미경 사진은 종종 세포내에 확인가능한 바이러스 입자가 존재함을 입증한다. 오염된 세포주는 상업적인 살아있는 백신 또는 불활성화된 백신을 위한 배양기로 사용될 수가 없다.
일부 바이러스에 있어서 바이러스 복제를 위해 선택되는 수단은 수정란이다. 예컨대, 사람 인플루엔자 바이러스, 광견병 바이러스, 개과 디스템퍼 바이러스, 마렉병 (Marek's disease) 바이러스, 레오바이러스 및 계두 바이러스는 높은 역가로 바이러스 스톡 증식을 허용하는 수정란 또는 그로부터 유래한 초대세포에서 바람직하게 증식된다. 다른 경우들에 있어서는, 바이러스 부재(virus free)를 보증할만한 배양기(substrate)의 필요성 때문에 계란에서 바이러스 증식이 이루어진다.
초대세포 배양물은 온전한 조직으로부터 새롭게 단리된 세포들의 배양물이다. 이들 세포들은 종종 바이러스 부재 물질의 좋은 공급원이 되고 바이러스 복제를 위한 숙주세포로서도 매우 적합하다. 초대세포들이 바이러스 증식에 항상 효과적인 것은 아니며 동물 초대세포는 배양시에 제한된 수명을 나타내어 결국 노화과정을 겪게 된다. 노화과정에 접어들면 세포는 분열을 멈추게 되며 결국 사멸하는건 시간문제이다. 배양에서 시간이 지남에 따라 세포가 분열할 수 있는 능력은 세포의 종 기원, 배양에 사용된 조직의 연령 등을 포함하는 몇 가지 변수에 좌우된다. 노화를 겪고 있는 세포들은 오랜 시간동안 배양이 계속될 수 없기 때문에 상업적인 바이러스 스톡의 증식을 위한 유용한 번식 숙주가 아니다.
일부 초대세포들은 노화과정에서 벗어나 불멸화 능력을 획득한다. 설치류 세포들은 자발적으로 매우 쉽게 불멸화되는 것이 분명하지만(Curatolo et al.In Vitro20:597-601, 1984) 사람 및 조류의 정상적인 세포가 자발적으로 불멸화되는 것은, 만약 있다고 해도, 거의 드문 일로 보인다(Harvey, et al.Genes and Development5:2375-2385, 1991; Pereira-Smith,J.Cell Physiol144:546-9, 1990; Smith et al.Science273:63-67, 1996). 어떤 특정 세포 군집이 불멸화 과정을 겪는 것에 대해서는 여러가지 이유들이 있다. 세포들은 유전자 돌연변이를 유발하는 것으로 알려진 작용제에 노출된 후에 불멸화를 겪도록 유도될 수가 있다. 일부 당업자들은 노화과정과 관련한 성장 정지가 불멸화에서는 지배적이고 증식-억제 유전자를 불활성화시키는 사건이 불멸화를 초래할 수 있는 것으로 가정한다(Pereira-Smith et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)85:6042-6046, 1988).
바이러스 부재인 불멸화된 세포들의 유용성은 동물 초대조직 배양물의 이용을 배제시키거나 감소시킬 수 있다. 초대배양물은 일반적으로 불명확한 세포 군집이며 종종 오염이 되어있다. 이들 배양물은 상업적인 백신 생산을 위한 규제 요건을 충족시키지 못한다. 세포의 초대배양물은 시르코드나비리대(Circodnavirideae) (예컨대, 닭 빈혈(Chicken anemia) 바이러스) 또는 에그 드롭 신드롬(Egg Drop Syndrome) 바이러스 등으로 오염될 수 있다. 예컨대, 마렉병 백신(살아있는 바이러스 백신)은 가금류 백신 접종을 위하여 오리 알에서 바이러스 스톡으로서 증식될 수 있다. 1976년에, 백신을 접종받은 닭 집단은 에그 드롭 신드롬의 증상을 보였는데, 이는 백신 스톡을 오염시켜 닭에서의 증식에 적응된 것으로 여겨지는 오리 아데노바이러스에 의해 유발된 것이었다.
백신산업에 있어서, 제품 안전성, 균일성 및 효능 등의 규제 요건 때문에 업체들은 현재 사용중인 계란 및 초대세포 백신 배양기에 대한 최적의 대안으로써 세포주를 찾고자 하고 있다. 미국 및 유럽에서는 백신 배양기와 관련하여 매우 엄격한 규제 환경 때문에 안전성 및 균일성에 대한 관심사는 사람 및 동물 백신제품을 생산하는 제조업체들이 다함께 공감하는 바이다. 수정란을 대체할 만한 바이러스 증식을 위한 적합한 세포의 확인은 시험, 연구, 및 훈련에 있어서 척추동물의 이용 및 보호에 관한 미국 정부 근본방침(US Goverment Principles for the Utilization and Care of Vetebrate Animals in Testing, Research, and Training)및, 모든 경우에 있어서, 시험관내 생물계와 같은 방법들은 생체내 동물 모델계에 대신하는 것으로 간주되어야 한다고 부분적으로 기술하고 있는 동물 복지법(Animal Welfare Act(7 U.S.C §2131))의 관점에서 지지를 받고 있다. 바이러스 부재이면서 외인성 바이러스 증식을 허용하여 동물 백신제품을 생산할 수 있는 세포가 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 자발적으로 불멸화된 닭 섬유아세포 세포주의 동정 및 이들 세포주를 획득하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 부다페스트조약의 기간 및 조건에 따라 ATCC에 기탁된 자발적으로 불멸화된 세포주 UMNSAH-DF1의 특징을 지닌 계배 초대 섬유아세포로부터 유래한 자발적으로 불멸화된 세포주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 세포의 배양 및 바이러스 복제를 허용하는 불멸화된 세포주의 불멸화된 서브클론에 관한 것이다.
본 발명의 한 면에 있어서 본 발명의 불멸화된 세포들은 바이러스를 함유하며 다른 면에 있어서 본 발명의 불멸화된 세포들은 세포내에서 재조합 단백질을 발현시킬 수 있는 하나 이상의 벡터를 함유한다. 본 발명의 한 구체예에 있어서 본 발명의 세포들은 재조합 단백질을 발현하며, 본 발명의 다른 면에 있어서 본 발명의 세포들내에 함유된 벡터는 재조합 바이러스의 적어도 일부분을 엔코딩한다. 다른 구체예에 있어서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
본 발명의 다른 면에 있어서 계배 초대 섬유아세포를 배양 증식시키는 단계; 섬유아세포의 노화가 시작될 때까지 계대 배양하는 단계; 세포 노화 동안 약 30 % 내지 약 60 % 배양 컨플루언스를 유지하도록 세포들을 농축하는 단계; 배양기내 비-노화 세포의 포커스를 확인하는 단계; 및 비-노화 세포를 30계대 이상 증식시키는 단계를 포함하는, 계배 섬유아세포로부터 불멸화된 세포주를 생성시키기 위한 방법이 개시된다.
본 발명의 또 다른 면에 있어서 계배 초대 섬유아세포로부터 유래한 자발적으로 불멸화된 세포주를 배양 증식시키는 단계; 세포를 바이러스로 감염시키는 단계; 세포에서 바이러스가 복제되도록 하는 단계; 및 세포내에서 복제된 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 세포내에서 바이러스를 증식시키기 위한 방법이 개시된다.
본 발명은 세포생물학 및 바이러스학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 바이러스 증식을 위한 불멸화된 세포의 용도에 관한 것이다.
현재, 본질적으로 비-바이러스성, 비-바이러스성 단백질 또는 비-화학적으로 혈질전환된 조류 세포주를 입수할 수는 없다. 바이러스 스톡 생산을 위해서 계속적으로 초대세포주를 생성하는 것은 귀찮은 일이고, 초대세포주는 바이러스 증식을 위해서 오염원이 제거된 저장소로서 개별적으로 확인되어져야 한다. 본 발명은 이스트 랜싱 라인(ELL-0) 계배로부터 유래된 세포를 포함하여 계배 섬유아세포(CEF)의 세포 불멸화에 관하여 설명한다.
본원에 사용된 불멸화(immortalization)란 용어는 배양에서 배가시간 약 1일 내지 약 2일을 유지하면서 30 계대 이상을 증식할 수 있고 약 6 개월 이상으로 연속배양된 비-설치류 세포를 의미한다. 조류 세포는 일반적으로 배양에서 약 20 계대 내지 약 25 계대 후에 불멸화되는 것으로 생각된다. 불멸화된 세포는 형질전환된 세포와는 달리, 불멸화된 세포는 밀도 의존적이고/이거나 성장 정지되는(예컨대, 접촉 억제) 점에서 형질전환된 세포와 구별된다. 형질전환된 세포들은 소프트 아가에서 증식이 가능하고 보통은 실험동물에 주입시 종양을 형성시킬 수 있다. 본 발명의 세포는 바이러스를 증식시키기거나, 또는 재조합 단백질 또는 바이러스를 발현시키기 위한 저장기로 유용하며, 특히 세포가 오염 바이러스 또는 바이러스 단백질을 함유하지 않는 것이 중요하다. 본 발명의 세포는 또한 세포의 노화과정 및 불멸화의 기본 메카니즘을 연구하는데 유용하다.
10일이 된 배(embryo)의 몸통을 꺼집어 내어, 조직을 분쇄하고 배양액중에 위치시킴으로써 10일이 지난 ELL-0 계란으로부터 계배 섬유아세포(CEF)의 초대세포들을 획득하였다. 수정란은 입수가능한 Hy-Vac(Adel, Iowa)이다. 계란 및 그것을 낳은 닭(layer)은 제공업체에 의해 조류 인플루엔자(Type A), 조류 레오바이러스, 조류 아데노바이러스(Group I-III), 조류 뇌척수염 바이러스 (Avian encephalomyelitis), 계두 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 파라믹소바이러스(Type 2), 마이코플라즈마, 살모넬라 및 기타 가금류를 감염하는 것으로 알려진 다른 감염체가 없는 것으로 증명되었다. 초대세포의 분리 및 불멸화된 세포의 확인은 실시예 1에서 제공된다.
불멸화된 세포주의 발견시에, 세포 군집은 세포 노화의 효과를 연구하기 위하여 선택되고 있었기 때문에, 불멸화된 세포들을 확인하였다. 사람 또는 조류세포는 조직배양 조건에서 불멸화시키기 가장 어려운 세포이다. 설치류 세포와는 달리, 정상적인 제공자로부터 얻은 사람 또는 닭 섬유아세포를 불멸화시키기 위한 방법에 관한 상세한 보고는 없다(Smith, et al.Science273:63-67, 1996). 조류 섬유아세포에 있어서, 처리되지 않은 세포들은 전형적으로 20-25 계대만 지속되었다. 즉, 30 계대까지는, 이들 조류 세포의 초대세포 배양물은 사멸하였거나 사멸중이었다. 본 발명에 개시된 것처럼, 20 계대까지 도달하기 위하여, 세포들은 약 12 계대부터 약 20 계대까지는 필요한 경우 보다 작은 플레이트에서 계대되고 농축되었다(실시예 1 참조). 보다 빠르게 증식하는 세포들의 포커스가 관찰되었고 이들 포커스는 클로닝 링을 사용하여 분리되어(Bellco Glass, Inc. Vineland, N.J.) 배양액중에 확장되었다.
본원에서 노화는 집단 배가 속도가 하루당 약 0.5 이하인 세포로서 정의된다. 본 발명에 있어서, 불멸화된 세포는 30 계대 이상 배양된 세포로, 접촉 억제, 밀도 의존성 및 정상적인 세포 형태를 나타내면서, 집단 배가 속도(트립판 블루 배제방법을 사용하여 1 일당 전체 세포 카운트 및 생세포 카운트에 의해 결정됨)가 약 0.6 내지 약 1.2 (집단 배가/일) 및, 바람직하게는 약 0.7 내지 약 1.0 (집단 배가/일)으로 증식하는 세포이다.
처음에 확인된 포커스로부터 얻은 세포들은, 실시예 1에 기재된 것처럼, 400(집단 배가) 이상 및 160 계대 이상을 나타내었다. 본 명세서에서 포커스는 주변의 다른 세포와 형태학적으로 구별될 수 있는, 형태학적으로 일정한 세포들의 클러스터를 나타내었다. 세포들의 포커스는 쉽게 채취되어져 차후 연구를 위하여 서브클로닝될 수 있다. 본 발명의 세포들은 22 내지 24시간마다 계속 배가하였다. 세포들은 접촉 억제되고, 역전사효소 네가티브이고(실시예 2 참조), 밀도 의존성으로 증식 정지된, 이수체(aneuploid)(오일 이머전 현미경하에서 염색체 확산 분석에 의해 관찰되어졌으며, 핵형은 이배체/사배체 핵형의 집합이었고 일부 세포들에서는 1번 염색체의 전위가 명백하게 관찰됨)였으며, 1.1 내지 1.9 X 105cells/cm2의 높은 플레이팅 밀도로 증식하였다. 다핵 거대 세포들은 전혀 관찰되지 않았다. 세포들은 일정한 표현형을 나타냈다. 또한 세포들은 바이러스 증식에 중요한 특징적인 빠른 증식 패턴을 유지했다.
세포들은 소프트 아가 검정에서 이들의 증식 불능에 의해 입증되듯이 비형질전환된 세포들이었다(실시예 3 참조). 게다가, 세포들은 닭의 날개에 주입되었을 때 종양을 유발시키지 않았다(실시예 4 참조). 본 발명의 모범적인 세포는 UMNSAH-DF1으로 지정되며, 부다페스트조약의 기간 및 조건에 따라 1996년 10월 11일 ATCC(미국 20852 록빌레 매릴랜드 파크론 드라이브 12301)에 수탁번호 CRL-12203으로 기탁되어졌다.
본 발명은 또한 본 발명의 불멸화된 계배 섬유아세포 및 본 발명의 불멸화된 세포의 서브클론에 관한 것이다. 예컨대, 본 발명의 세포들은 자발적으로 불멸화된 세포로서 확인되었다. 세포들은 공지된 바이러스 부재 및 공지된 화학적 오염물질 부재인 알 낳는 닭(본 발명의 공급원인 배조직을 생산하는 암닭)으로부터 수득하였고, 본 발명의 세포를 생산하기 위해 사용된 배조직도 또한 화학적 오염물질이 없었고(즉, 설치류 세포를 형질전환시키는 것으로 알려진 공지된 발암물질이나 다른 원인물질에 의한 처리가 없음) 공지된 바이러스도 없었다. 일단 본 발명의 불멸화된 세포가 배양되면, 여전히 접촉 억제 및 바이러스 감염에 대한 감수성을 유지하며, 또한 세포 집단내에서 변화할 수 있는 다른 생리학적 변수들을 선별하기 위하여 세포들을 추가로 서브클로닝할 수 있다.
세포들을 HVT(칠면조 헤르페스바이러스), 조류 헤르페스바이러스(혈청형 III), 계두 바이러스 및 레오바이러스를 복제하는 능력에 대해 시험하였다. 세포들은 수많은 다른 바이러스에 대해 시르코드나비리대, 닭 HSV 혈청형 II 복제가 가능한지 시험될 수 있고 트랜스펙션을 위한 배양기로 시험되었다. 세포들은 조류 및 비조류 바이러스들 둘 모두의 증식을 위해서 유용하였다. 실시예 5는 HVT, 계두 바이러스 및 레오바이러스를 증식시키기 위한 방법을 상세히 설명한다. 세포들은 바이러스 생성을 위한 배양기로서 유용하며, 특히 세포 및 세포가 유래한 알 낳는 닭(즉, 이들의 모(母))은 어떠한 검출가능한 레트로바이러스 감염을 나타내지 않았기 때문에 세포들은 레트로바이러스의 생산을 위해서 유용하다. 세포들은 조류 사코마 류케미아 바이러스 및 라우스 사코마 바이러스의 복제를 허용할 수 있다.
바이러스 스톡을 생산하기 위하여, 본 발명의 세포들은 조직 배양 플라스크, 롤러 바틀(roller bottle), 교반 배양기, 실관 반응기, 또는 기타 대량 배양 시스템내로 시딩될 수 있다. 롤러 바틀 바이러스 증식을 위해서, 세포들은 1cm2의 표면적당 약 2 내지 5 X 104세포로 접종된다. 바이러스 스톡 증식을 개시하기 위한 감염 다중도(세포 대 감염성 바이러스의 비)는 바이러스 균주에 따라 달라질 것이다. 바이러스학 분야 및 특정한 바이러스/바이러스 균주의 증식 분야에 있어서의 당업자는 과도한 실험없이도 감염 다중도, 온도, 배지 변형 등의 표준 조작기술을 이용하여 바이러스 스톡 수율을 최대화할 수 있을 것이다.
또한 감염성 바이러스 스톡을 수득하기 위하여 감염 후에 바이러스를 수집하는 방법도 바이러스 균주에 따라 다양하다. 외막을 가진 바이러스는 비외막 바이러스보다도 훨씬 천천히 배양배지내로 방출된다. 배양배지만으로부터 또는 조건화된 배지에 푸울링된 세포 용해질로부터 바이러스 스톡이 수득될 수 있다. 용균성 바이러스(바이러스 방출시에 세포를 용균시키는데 효율적인 바이러스들)에 있어서는, 세포 잔해물을 제거하기 위하여 온화한 원심분리 단계를 실시한 후에 조건화된 배양배지(예컨대, 바이러스를 함유한 소모된 배지)를 회수하는 것으로 충분하다. 한편, 넓은 범위의 바이러스 균주로부터 바이러스를 회수하고 저장하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
또한, 세포 배양물로부터 바이러스 증식을 정량화하기 위한 다양한 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 헤르페스바이러스 과(family)의 구성원 및 세포단일층 표면에서 세포병변성 포커스를 생성시키는 다양한 종류의 바이러스들에 있어서 바이러스 스톡의 역가는 플라크 검정(플라크 형성 유닛/ml 배양액 또는 백신접종 바이러스 정량화를 위한 플라크 형성 유닛/투여량으로 정량화)에 의해 또는 조직배양 감염성 투여량-50(TCID50)으로서 쉽게 정량화된다. 빠른 용균성 바이러스들은 정의된 시간 이내에 배양물의 50 %를 감염시킬 수 있는 바이러스 스톡의 희석량 또는 투여량을 나타내는 TCID50에 의해 보다 잘 정량화된다. 바이러스를 증식시키고 정량화하는 방법들은 당업계에 공지되어 있으며 바이러스 정량화 방법을 교시하는 자료(Fields, et al.(eds)Fundamental Virology1991, Raven Press, New York or Mandell, et al.(eds)Principles and Practice of Infectious Diseases, 1985, John Wiley Sons, New York)들은 당업계에 알려져 있다
본 발명의 세포들은 바이러스 증식을 허용할 뿐만 아니라, 레트로바이러스를 포함하여 재조합 바이러스를 생산하기 위한 패키징 세포주로서도 사용될 수 있다. 세포들은 또한 바이러스 단백질 등을 포함하여 재조합 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 불멸화된 세포와 같은 진핵 세포에서 단백질의 발현을 유도할 수 있는 조절 엘리먼트의 제어를 받는 핵산 벡터내로 재조합 단백질을 엔코딩하는 핵산을 혼입시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 발현 벡터들은 재조합 단백질의 발현을 유도할 수 있는 복제가능한 핵산단편이다. 레트로바이러스 벡터를 포함하는 많은 발현 벡터들은 저널 발간 및 상업적인 공급업체를 통해 당업계에서 입수가 가능하다. 복제가능한 발현벡터 구성요소들은 일반적으로 하기중 하나 이상(이에 제한되지는 않음)을 포함한다: 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 엘리먼트, 프로모터 엘리먼트, 선택적인 서그널 서열 및 전사종결 서열. 선별 유전자 또는 마커 유전자는 형질전환되거나 트랜스펙션된 세포들의 군집을 확인하기 위해 사용할 수 있는 단백질을 엔코딩한다. 전형적인 선별 유전자는 항생제 또는 다른 독소들에 대한 내성을 부여하거나, 영양요구성을 보충하거나 또는 복합배지로부터는 이용할 수 없는 필수적인 영양물질을 공급하는 단백질을 엔코딩한다.
재조합 단백질을 엔코딩하는 핵산을 함유한 발현 벡터는 세포내로 트랜스펙션되며 본 발명의 불멸화된 세포내에서 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위해 사용된다. 벡터는 바람직하게는 역전사 효소 및/또는 바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 계배 섬유아세포에서 발현가능한 임의의 재조합 단백질을 엔코딩할 수 있다. 세포내에서 재조합 단백질을 생성시키는 벡터들의 예로는 종양억제 단백질, 또는 문헌(Givol et al., Oncogene 11(12):2609-2618, 1995; Givol et al., Cell growth Differentiation 5(4):419-429, 1994; Akiyama et al., Virology 203(2):211-220, 1994 and Boyer et al., Oncogene 20:457-66, 1993)에 개시된 것과 같은 바이러스 구조 단백질을 생산하는 레트로바이러스 벡터가 포함된다.
본 발명의 세포들은 재조합 레트로바이러스(이에 제한되지는 않음)를 포함하는 재조합 바이러스를 발현하기 위한 기질로 이용될 수 있다. 본 발명의 세포들은 유전자 치료법 등에 유용한 유전적으로 조작된 바이러스의 패키징 세포주로 이용하기에 적합하다. 패키징 세포주로서 특정한 세포주를 사용하는 방법 및 작제물은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 보에르코엘(Boerkoel) 등은 문헌(Virology195(2):669-79, 1993)에서 패키징 세포주로서 계배 초대 섬유아세포를 사용하여 바이러스를 패키징하는 방법을 개시하였다. 본 발명의 불멸화된 세포에서 바이러스를 패키징하기 위해 이들 유사 방법들이 사용될 수 있다.
거의 모든 형질전환된 마우스 세포주 뿐만 아니라 대부분의 조류 세포주 및 모든 형질전환된 조류 세포들은 내재성 바이러스와 같은 오염 바이러스를 함유하거나 또는 바이러스 단백질을 생산하기 때문에, 이들 세포들은 사람 또는 동물 백신의 생산에는 적합하지 않다. 정제된 재조합 단백질 제제를 내재성 오염물질들이 오염시킬 수 있기 때문에 이들 세포들은 재조합 단백질 생산에 사용될 수 없다. 본 발명의 세포들은 이러한 문제점들에 대한 적합한 대안을 제공하는 잇점이 있다.
본 발명의 세포들은 또한 다른 세포들로부터의 바이러스 증식을 허용하기 위한 배양기로서 이용될 수 있다. 이들 다른 세포들은 다른 세포들의 존재 또는 콜라겐, 라미닌 등과 같은 세포외 매트릭스 단백질의 존재하에 배양에서 개선된 증식이나 영속성을 보이는 초대세포 또는 배양된 세포들을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 세포들은 바이러스와 혼합된 다음, 본 발명의 세포들과 바람직하게는 상기 세포 : 본 발명의 세포가 약 1:5 세포 내지 약 1:20 세포, 더욱 바람직하게는 약 1:10 세포(1 개의 상기 세포당 약 10 개의 본 발명의 세포)의 비로 혼합된다. 그 다음 혼합된 세포들은 배양액중에 놓여진다. 두 번째 구체예에 있어서, 세포들은 바이러스와 혼합되고 조직배양 표면에 이미 부착되어 있는 본 발명의 불멸화된 세포들의 표면상에 플레이팅된다. 본 발명의 세포들은 다른 세포들을 부양하기 위한 역할을 하며, 본 발명의 범위를 제한함이 없이, 본 발명의 세포들은 세포외 매트릭스 구성요소 등 뿐만 아니라 성장 인자를 제공하여, 다른 세포들이 바이러스를 생산하는 동안 다른 세포들을 부양할 수 있다. 실시예 6은 본 발명의 세포들이 세포 배양기로서 이용되는 예를 제공한다.
본 발명의 특정한 구체예가 상세히 설명될 것이고, 본 발명의 범위내에서 변형이 언급되었다. 당업자가 본 발명을 성공적으로 유사하게 수행할 수 있도록 하는 이용가능한 다양한 대안적인 기술 및 방법이 존재한다.
실시예 1
자발적인 닭 섬유아세포 세포주의 제조
24개의 ELL-0 계란을 이스트 랜싱 USDA 가금류 스톡으로부터 주문하였다. 계란을 멸균된 인큐베이터내에서 10일동안 인큐베이션하고 초대배양을 위한 과정을 수행하였다. 트립신/EDTA 용액을 사용하여 배조직을 분리하여, 10%의 우태아혈청(Gibco), 1%의 항생제/항진균제(Gibco), 및 2 mM의 L-글루타민(Gibco)을 함유한 DMEM 배지(Gibco)에 플레이팅하였다. 트립신을 불활성화시키기 위하여 10% 우태아혈청 10 ml를 함유한 50 ml 원심분리 튜브에 분리된 세포 현탁액을 수집하고 700 X g 에서 10분동안 원심분리하였다.
세포들을 36 ㎍/ml 인슐린(Sigma), 1.6 ㎍/ml 트랜스페린(Sigma, St. Louis, MO), 2 mM L-글루타민, 10% 우태아혈청, 1% 항생제/항진균제 용액으로 부화된 10 ml의 둘베코 변형 이글스 배지에 재현탁하고, 25 cm2코닝 조직배양 플라스크에 피펫팅하고, 40.5℃의 5% CO2, 95% 공기 인큐베이터에서 배양하였다. 배양한 지 24시간 후에, 배지를 교환하였다. 초대배양은 표피 유사 세포 및 방사형 섬유아세포의 중심을 가진 수많은 이식편(explant)을 함유하였다.
배양 세포들을 컨플루언트하게 증식시키고(5일) 트립신/EDTA 용액(PBS중의 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA)을 사용하여 플레이트로부터 채취하고 제 2계대를 위해 다시 플레이팅하였다. 제 2계대에서 50% DMEM 배지, 12% DMSO 및 38% 우태아혈청을 함유한 조건화된 배지에서 일부 세포들을 동결시켰다. 이들 세포들을 증기상의 액체질소에서 24시간동안 동결시킨 다음 장기간 보관을 위해 용액상의 액체질소로 옮겼다.
제 2 계대(P2)에서 세포들을 2.7 X 104세포/cm2의 시딩 밀도로 재플레이팅하였다. 수개월동안 세포들을 계대배양하였다. 배양된 섬유아세포들은 8 계대 내지 9 계대동안은 빠르게 증식하였고, 그 다음 상당한 세포 사멸을 동반하며 증식이 감소되기 시작하였다. 이러한 위기 동안에, ATV 용액(1000 ml중에 8 mg/l NaCl, 0.4 mg KCl, 1 mg 덱스트로오스, 0.58 mg NaHCO3, 0.5 mg 트립신(Difco 1:250), 0.2 mg 베르센(디소듐 염))을 사용하여 세포들을 계대하였다. 세포를 36 ㎍/ml 인슐린 (Sigma), 1.6 ㎍/ml 트랜스페린(Sigma), 2 mM L-글루타민, 10% 우태아혈청 및 1%의 항생제/항진균제 용액을 함유한 강화된 둘베코 변형 이글스 배지에서 증식하였다. 11 계대(P11)에서 대부분의 세포는 사멸하였거나 사멸중이었다; 그러나, 건강한 섬유아세포들의 작은 아집단이 나타났다. P11 세포들에 매 3일마다 새로운 배지를 재공급해주면서 4주동안 디쉬에 유지시켰다. 일부 세포들을 동결시키고, 남은 세포들을 보다 좁은 지역으로 농축하였으며, 두 번째 계대배양을 할 정도로 충분히 컨플루언트하게 되기 전에 2주 동안 증식시켰다. P15까지, 세포들은 세포 형태에 있어서 보다 균일해지고 하루당 0.32 집단 배가속도로 증식하였다. P20까지, 집단 배가는 하루당 약 0.7 내지 약 0.8 집단 배가속도로 증가하였다. 이 시점에서, 세포들은 매우 균일한 형태를 나타내었다. 이들 세포를 UMNSAH/DF #1이라 표기하고 19개월 이상 계속해서 배양시켰다. 이들 세포들은 현재 160 계대에 있다. 전술한 것처럼 세포들을 동결시키고 P5부터 해동하였다. 서브클로닝된 세포들을 확장시켰으며, 다른 클론들의 확인을 통하여 본 발명의 재현성을 확증하였다. 서너가지 이상의 서브클론을 P11까지 수득하였다.
실시예 2
바이러스 오염에 대한 세포 시험
오염 핵산 단편을 확인하기 위한 PCR 기법을 사용하여 본 발명의 세포를 오염 바이러스에 대해 시험하였다. 본 발명의 세포들이 오염 바이러스를 함유하고 있는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는, 다양한 바이러스에 대한 다양한 종류의 검사 키트들이 시판되고 있다. 유사하게, 바이러스 항원을 검출하기 위한 검사 키트(예컨대, 시판되는 ELISA 검정 등)가 시판되고 있으며, 여기서 항원은 여러가지 상이한 바이러스로부터 유래한 것이다. 배양물에 오염 바이러스가 부재함을 증명하기 위해 통상적인 실험 기술들을 사용하여 본 발명의 세포들에도 이러한 검사를 사용할 수 있다.
검사의 한 시리즈에서, 세포를 역전사 효소 활성에 대해 검사하였다. 빠른 증식을 보이는 배양물로부터 얻은 1 X 106세포들을 4 ml 배지에 단리하였다. 세포들을 용균시키기 위하여 -80℃에서 서너번의 동결 및 해동을 통해 배지를 취하였다. 용균된 세포들이 들어있는 배지를 10% 글리세롤 농도구배상에 층지게 하였다. 상기 구배를 SW40 로우터(Beckman Instruments, Palo Alto, CA)를 사용하여 40,000 rpm에서 60분동안 회전시켰다. 바이러스 입자들은, 만약 존재한다면 펠릿이 되었다. 배지를 버리고 펠릿을 노니데트(Nonidet) P-40(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 20 ㎕에 재현탁하였다.
에펜도르프 튜브를 41℃에서 가열하였다. 45 mM Tris, pH 7.8, 2 mM 2-β 머캡토에탄올, 2 mM 망간 아세테이트, 0.1% Triton X-100, 각 10 ㎛의 dATP, dCTP, dGTP(Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN), 2.4 ㎍ 폴리A(Sigma), 60 ng 프라이머 dT 12-19(Pharmacia), 0.4 μCi/반응3H-TTP(15,000 내지 28,000 cpm/pmole 활성, Amersham)을 함유한 역전사효소 칵테일 45 ㎕에 샘플 5 ㎕를 첨가하였다.
41℃에서 한 시간동안 반응물을 인큐베이션시켰다. 네가티브 대조군은 5 ㎕의 ddH2O 및 45 ㎕의 칵테일을 함유하였다. 두 개의 공지된 포지티브 대조군을 상기 검정에 포함시켰다. 상기 검정을 1 ml의 10% 트리클로로아세트산(TCA, Columbus Chemical Industries, Inc., Columbus, WI)을 첨가함으로써 중지시켰다. 와트만(Whatman) GF/C 글래스 0.45 마이크론 예비필터를 통해 혼합물을 여과시켰다. 5% TCA를 사용하여 서너번의 세척을 수행하였다. 신틸레이션 카운팅 액 5 ml를 함유한 신틸레이션 바이알을 사용하는 벡맨 인스트루먼트 신틸레이션 카운터(Beckman Instruments Scintillation Counter)로 필터를 옮겼다. 050 내지 600 윈도우 세팅상에서 샘플을 카운팅하였다. 칵테일 백그라운드(네가티브 대조군)보다 3배의 증가된 카운트를 양성으로 간주하였다.
본 발명에서 수득한 불멸화된 세포가 그랬던 것처럼, 초대배양 세포는 역전사 효소에 대해서 네가티브였다. 역전사 효소 검출에 대한 추가 정보는 문헌 (Crittenden, et al.Virology57:128-138, 1974)을 참조하기 바란다.
실시예 3
세포의 종양유발 잠재능을 평가하기 위한 소프트 아가로오스 콜로니 형성 검정
종양유발 잠재능을 검사하기 위하여, 세포를 소프트 아가에서의 증식에 대해 시험하였다. 소프트 아가로오스 베이스를 21.6 ml의 부화된 맥코이(McCoy) 5A 배지[Gibco, 120 ml의 우태아혈청(열 불활성화됨), 5 ml의 Na 피루베이트(2.2% 스톡), 1 ml의 L-세린(21 mg/ml 스톡), 5 ml의 L-글루타민(200 mM 스톡), 12.5 ml의 HEPES(1 M 스톡)], 5.9 ml의 아스파라긴(여과멸균된 4.4 mg/ml 스톡)에 12 ml의 2% 아가로오스 용액(오토클레이빙시키고 56℃로 냉각시킴)을 혼합함으로써 제조하였다. 7 ml의 따뜻한 배지/아가로오스를 100 mm2조직배양 디쉬에 붓고, 조직 배양 후드내에서 1시간 동안 실온에서 고체화하였다.
10% 우태아혈청(L-글루타민 및 항생제-항진균제 함유)을 함유한 신선한 DMEM 배지에 단일세포 현탁액을 만들기 위해서 활발하게 증식하는 배양물(약 40% 내지 약 70% 컨플루언트)로부터 트립신 처리에 의해 세포를 채취하였다. 대략 1 X 106세포들을 10% 우태아혈청, 0.75 ml의 1% 아가로오스, 및 50 ㎕의 2β-머캡토에탄올을 함유한 4.25 ml의 DMEM 배지에 첨가하였다. 세포를 첨가하기 전에 따뜻한 배지/아가로오스가 42℃를 유지하도록 주의하였다. 빠르게, 5 ml의 세포 현탁액을 아가로오스 플레이트상에 도말하였다.
세포를 5% CO2, 95% 공기 인큐베이터에서 37℃에서 증식시키고, 35일동안 관찰하였다. 듀플리케이트 플레이트(duplicate plate)를 3 p-니트로페닐-5-페닐 테트라졸리움 클로라이트로 염색시키고(INT 염색) 0, 5, 10, 15, 20, 30 및 35일에 콜로니 형성 및 증식을 조사하였다. 60 ㎛ 이상으로 염색된 모든 콜로니들을 포지티브로 간주하였다.
검사한 모든 세포들은 네가티브였다. 소프트 아가 검정과 관련한 추가 정보는 문헌(Hamburger, et al.Prog. Clin. Biol. Res. 48:pps 43, 135, 179, 1980)에 기재되어 있다.
실시예 4
불멸화된 세포의 종양유발성
미네소타 대학교 동물 이용 프로토콜(프로토콜 #950300-1, 1995.3-1996.12)에 약술된 지침에 따라, 세포의 종양유발성 여부를 결정하기 위해 세포들을 실험 동물에 주입하였다.
세포배양 플레이트로부터 활발하게 증식하는 세포들을 채취하여 6 마리의 SPAFAS계 성숙한 닭(Hy-Vac, Adel, Iowa)에 주입하였다. 4 X 106세포들을 피하주사하여 닭의 날개 우판(web)에 주입하였다. 주사한 부위를 3.5개월 동안 매주 조사하였다. 건강한 나머지 모든 동물을 사용한 실험에서 지금까지 생성시킨 임의의 트랜스펙션된 세포에 대해 어떠한 종양도 주사 부위에서 관찰되지 않았다. 본 실험으로 불멸화된 세포는 종양유발성이 아님을 증명하였다.
실시예 5
세포의 바이러스 증식 허용능
세포들을 5.0 X 105cells/cm2의 농도로 롤러 바틀(roller bottle)에 접종하였다. 세포들을 24시간동안 부착시키고 대조군을 세포 카운트를 위해서 수집하였다. 바이러스 감염을 위하여 세포들을 DMEM(4.5 g/l 포도당), 4% 우태아혈청, 2 mM L-글루타민, 50 mg/l 젠타마이신에서 성장시켰다. 세포들을 세포 당 0.0006 HVT 바이러스 입자인 다중도로 감염시켰다. CPE 진행에 대해 롤러 바틀을 매일 관찰하였다. 대략 50%의 CPE에 도달한 때인 감염시킨 지 46시간 후에 바틀을 수집하였다. HVT 감염 세포들을 10% DMSO 함유 성장배지에 2.0 X 107세포/ml의 농도로 동결시켰다. HVT의 역가를 플라크 검정에 의해 평가하였다. 바이러스를 성장배지에서 연속 희석시키고 허용성(permissive) 세포의 컨플루언트 단일층위에 도말하였다. 지정된 시간동안 배양물을 인큐베이션시키고 세포를 고정화시키고 염색하였다. 단일층상의 플라크를 카운팅하고 바이러스 역가를 투여량당 플라크 형성 유닛으로서 표시하였다.
이들 세포들에 대해 또한 레오바이러스 증식 허용능 검사를 수행하였다. 2.5 X 108세포들을 8.2 TCID50/ml의 역가를 지닌 레오바이러스 WSS-Reo 1733 균주로 감염시켰다. 세포들을 0.005, 0.001 또는 0.0005 감염성 바이러스 입자/세포의 다중도로 감염시켰다. 감염된 세포들을 롤러 바틀에서 증식시키고 감염시킨 지 48, 64, 및 72시간후에 검사하여 생산성 바이러스 증식을 입증하였다.
실시예 6
세포 배양기로서 트랜스펙션된 피부 세포의 이용
본 발명의 세포는 초대세포들의 바이러스 복제를 허용하기 위한 배양기로서 유용하다. 이들 실험에서 불멸화된 세포를 초대세포들과 혼합하였다. 한 연구에 있어서 초대세포들을 감염시키고 불멸화된 세포와 혼합하여 배양하였고, 다른 연구에 있어서는 초대세포들을 감염시키고 조직배양 플라스크에 론(lawn)으로 이미 자리잡은 불멸화된 세포들상에 도말하였다. 하나의 예에서, 바이러스는 에그 드롭 신드롬 바이러스였고 초대세포는 계배 초대 간 세포였다. 제 2의 예에 있어서, 초대세포는 상피세포, 바람직하게는 신장 상피세포였고 바이러스는 감염성 기관지염 바이러스였다. 초대세포 대 불멸화된 세포의 바람직한 비율은 약 1:5 내지 약 1:20이고 더욱 바람직하게는 1:10이다. 혼합된 세포 군집내에서 증식하는 초대세포로부터 얻은 바이러스의 역가는 초대세포 배양 자체만으로부터 얻은 바이러스 역가보다 높았다. 불멸화된 세포는 초대세포가 상업적인 조건에서 바이러스 증식을 위해 사용되어지도록 한다.
모든 인용문헌을 전체로서 본 명세서에 참조로 인용하였다. 본 발명이 비록 특정한 구체예와 관련해서 설명되었지만, 특허의 권리범위는 오직 하기 청구의 범위에 의해서만 제한된다.

Claims (32)

  1. 계배 초대 섬유아세포(primary chicken embryonic fibroblast)로부터 유래하고, 하루에 0.6 내지 1.2의 집단 배가 속도로 배양 증식할 수 있는, 바이러스 또는 발암물질에 노출됨이 없이 자발적으로 불멸화된 세포주.
  2. 바이러스 복제를 허용하는 제 1항에 따른 불멸화된 세포주의 배양물 또는 불멸화된 서브클론.
  3. 바이러스를 함유한 제 1항 또는 제 2항에 따른 세포.
  4. 세포내에서 재조합 단백질의 발현을 유도할 수 있는 벡터를 하나 이상 함유한 제 1항 또는 제 2항에 따른 세포.
  5. 재조합 단백질을 발현시키는 제 4항에 따른 세포.
  6. 제 4항에 있어서, 벡터가 재조합 바이러스의 적어도 일부분을 엔코딩함을 특징으로 하는 세포.
  7. 제 4항에 있어서, 벡터가 레트로바이러스 벡터임을 특징으로 하는 세포.
  8. 계배 초대 섬유아세포를 배양 증식시키는 단계;
    세포 노화가 시작될 때까지 섬유아세포를 계대 배양시키는 단계;
    30 % 내지 60 % 의 배양 컨플루언스를 유지하도록 세포 노화 도중에 세포를 농축시키는 단계;
    배양물내 비-노화 세포의 포커스를 확인하는 단계;
    비-노화 세포를 단리하는 단계; 및
    비-노화 세포를 30계대 초과로 증식시키는 단계를 포함하는, 계배 섬유아세포로부터 불멸화된 세포주를 생성시키는 방법.
  9. 제 1항에 따른 세포를 배양 증식시키는 단계;
    세포를 바이러스로 감염시키는 단계;
    세포내에서 바이러스를 복제시키는 단계; 및
    세포내에서 복제된 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 세포내에서 바이러스를 증식시키는 방법.
  10. 제 1 세포를 바이러스와 함께 인큐베이션시키는 단계;
    계배 초대 섬유아세포를 배양 증식시키고, 세포 노화가 시작될 때까지 섬유아세포를 계대 배양시키고, 30 % 내지 60 % 의 배양 컨플루언스를 유지하도록 세포 노화 도중에 세포를 농축시키고, 배양물내 비-노화 세포의 포커스를 확인하고, 비-노화 세포를 단리하고, 비-노화 세포를 30계대 초과로 증식시킴으로써 수득된 불멸화된 계배 섬유아세포와 제 1 세포를 혼합하는 단계; 및
    제 1 세포와 불멸화된 닭 세포의 혼합물로부터 생성된 바이러스를 단리하는 단계를 포함하는, 제 1 세포로부터 바이러스를 증식시키는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 바이러스가 헤르페스바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 바이러스가 마렉(Marek)병 바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10항에 있어서, 바이러스가 계두 바이러스 또는 레오바이러스로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10항에 있어서, 불멸화된 세포가 ATCC 기탁 번호 CRL-12203으로서 확인되는 세포임을 특징으로 하는 방법.
  16. 바이러스의 하나 이상의 연속 희석물을 제조하는 단계;
    계배 초대 섬유아세포를 배양 증식시키고, 세포 노화가 시작될 때까지 섬유아세포를 계대 배양시키고, 30 % 내지 60 % 의 배양 컨플루언스를 유지하도록 세포 노화 도중에 세포를 농축시키고, 배양물내 비-노화 세포의 포커스를 확인하고, 비-노화 세포를 단리하고, 비-노화 세포를 30계대 초과로 증식시킴으로써 수득된 불멸화된 닭 세포를 바이러스의 하나 이상의 희석물로부터의 바이러스 샘플과 접촉시키는 단계; 및
    바이러스 희석물에 존재하는 바이러스의 양을 정량화하는 단계를 포함하는, 샘플내의 바이러스의 양을 정량화하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 불멸화된 세포가 ATCC 기탁 번호 CRL-12203으로서 확인되는 세포임을 특징으로 하는 방법.
  18. 계배 초대 섬유아세포를 배양 증식시키고, 세포 노화가 시작될 때까지 섬유아세포를 계대 배양시키고, 30 % 내지 60 % 의 배양 컨플루언스를 유지하도록 세포 노화 도중에 세포를 농축시키고, 배양물내 비-노화 세포의 포커스를 확인하고, 비-노화 세포를 단리하고, 비-노화 세포를 30계대 초과로 증식시킴으로써 불멸화된 닭 세포를 수득하는 단계;
    하나 이상의 핵산 단편(핵산 단편의 적어도 일부분은 재조합 바이러스를 엔코딩한다)을 하나 이상의 불멸화된 세포내로 도입시키는 단계; 및
    불멸화된 세포로부터 재조합 바이러스를 단리하는 단계를 포함하는, 불멸화된 세포로부터 재조합 바이러스를 생성시키는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 핵산 단편이 벡터를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 바이러스가 헤르페스바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 바이러스가 마렉병 바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 18항에 있어서, 불멸화된 세포가 ATCC 기탁 번호 CRL-12203으로서 확인되는 세포임을 특징으로 하는 방법.
  24. 재조합 바이러스를 엔코딩하는 핵산 단편을 포함하는 세포로서, 계배 초대 섬유아세포를 배양 증식시키고, 세포 노화가 시작될 때까지 섬유아세포를 계대 배양시키고, 30 % 내지 60 % 의 배양 컨플루언스를 유지하도록 세포 노화 도중에 세포를 농축시키고, 배양물내 비-노화 세포의 포커스를 확인하고, 비-노화 세포를 단리하고, 비-노화 세포를 30계대 초과로 증식시킴으로써 수득된 불멸화된 닭 세포임을 특징으로 하는 세포.
  25. 계배 초대 섬유아세포를 배양 증식시키고, 세포 노화가 시작될 때까지 섬유아세포를 계대 배양시키고, 30 % 내지 60 % 의 배양 컨플루언스를 유지하도록 세포 노화 도중에 세포를 농축시키고, 배양물내 비-노화 세포의 포커스를 확인하고, 비-노화 세포를 단리하고, 비-노화 세포를 30계대 초과로 증식시킴으로써 불멸화된 닭 세포를 수득하는 단계;
    하나 이상의 단백질을 엔코딩하는 핵산을 세포내로 도입시키는 단계; 및
    세포로부터 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 불멸화된 세포에서 단백질을 생성시키는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 하나 이상의 단백질을 엔코딩하는 핵산이 유전자 벡터임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25항에 있어서, 불멸화된 닭 세포를 수득하는 단계가 ATCC 기탁 번호 CRL-12203으로서 확인되는 세포를 수득하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26항에 있어서, 유전자 벡터가 레트로바이러스 벡터임을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 25항에 따른 단백질을 생성시키는 불멸화된 닭 세포.
  30. 계배 초대 섬유아세포를 배양 증식시키고, 세포 노화가 시작될 때까지 섬유아세포를 계대 배양시키고, 30 % 내지 60 % 의 배양 컨플루언스를 유지하도록 세포 노화 도중에 세포를 농축시키고, 배양물내 비-노화 세포의 포커스를 확인하고, 비-노화 세포를 단리하고, 비-노화 세포를 30계대 초과로 증식시킴으로써 수득된 불멸화된 닭 세포와 함께 제 1 세포를 세포 배양물내에 정위시키는 단계; 및
    배양물내에서 제 1 세포를 유지시키는 단계를 포함하는, 세포를 증식시키는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 불멸화된 세포가 ATCC 기탁 번호 CRL-12203으로서 확인되는 세포임을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1항에 있어서, 불멸화된 세포주가 ATCC 기탁 번호 CRL-12203으로서 확인됨을 특징으로 하는 세포주.
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