CN107206063B - 稳定的液体痘苗病毒制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在储存过程中稳定的痘病毒(特别是痘苗病毒)的液体制剂。这种稳定的液体制剂包含a)痘病毒，优选痘苗病毒，b)药学上可接受的缓冲液，c)单价盐，d)药学上可接受的二糖或糖醇，和e)药学上可接受的螯合剂，其中所述制剂的pH为6.5至8.5之间。

Description

稳定的液体痘苗病毒制剂
技术领域
本发明是用于液体储存痘病毒(特别是痘苗病毒)的稳定液体制剂领域。它涉及液体制剂，其包含a)痘病毒，特别是痘苗病毒，b)药学上可接受的缓冲剂，c)单价盐，d)药学上可接受的二糖或糖醇，和e)药学上可接受的螯合剂，其中所述制剂的pH值在6.5至8.5之间。
背景技术
痘病毒是直径在200至300nm之间的复杂包膜病毒，他们主要通过不寻常的形态、它们的大DNA基因组及它们的复制的胞质位点区分。正痘病毒属的几个成员的基因组已被绘制图谱和测序，包括痘苗病毒(VV)的两个毒株：哥本哈根痘苗病毒毒株(GOEBEL等，1990，Virol 179,247-266和517-563；JOHNSON等，1993，Virol196,381-401)、惠氏毒株(OSBORNEJD等，Vaccine.2007Dec 17；25(52)：8807-32)和经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)毒株(ANTOINE等，1998，Virol.244：365-396)。VV具有约192kb的双链DNA基因组，其编码约200个蛋白质，其中约100个参与病毒装配。MVA是一种高度减毒的痘苗病毒毒株，其通过痘苗病毒的安卡拉毒株在鸡胚成纤维细胞中多于500次的系列传代产生(MAYR等，1975，Infection3：6-16)。MVA病毒保藏在微生物培养物国家收藏中心(Collection Nationale deCultures de Microorganismes)(CNCM)，保藏号为N°I-721。MVA基因组的完整序列的确定和与哥本哈根VV基因组的比较，使得可以精确鉴定病毒基因组中发生的变化以及界定七个缺失(I至VII)以及导致ORF(开放阅读框)片段化的许多突变(ANTOINE等，1998，Virology244：365-396)。
MVA用作针对天花的预防性疫苗，并且重组MVA目前是针对多种类型的靶的预防性和治疗性接种的许多临床前和临床研究的主题，所述靶包括癌症(尤其是黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、前列腺癌、结肠直肠癌)、病毒(尤其是乙型或丙型肝炎、HIV)、细菌(尤其是结核病)和寄生虫病(尤其是疟疾)(参见GOMEZ等，Current Gene Therapy，2008,8：97-120)。
溶瘤痘苗病毒也在临床前和临床开发之中(参见KIRN等，Nat Rev Cancer，2009Jan，9(1)：64-71)。
在这两种情况下，使用活痘苗病毒。
活痘苗病毒预防性或治疗性疫苗通常不是在刚生产和纯化之后就向患者施用，并且因此需要不失去其效力地保存数天、数周或甚至数月。
像所有的活病毒一样，活痘苗病毒具有天然的不稳定性，该不稳定性由于痘苗病毒是包膜病毒(已知包膜病毒比非包膜病毒稳定性更低，参见BURKE CJ等，Crit Rev TherDrug Carrier Syst.1999,16(1)：1-83；以及REXROAD等，Cell Preservation Technology，2002年6月，1(2)：91-104)、具有大尺寸(砖形200～300nm)、大基因组和已知对UV损伤特别敏感(参见LYTLE等，J.Virol.2005，79(22)：14244)的事实进一步增加。此外，痘苗病毒包膜甚至比其他包膜病毒更复杂。因此，稳定痘苗病毒特别具有挑战性。
已经尝试了痘苗病毒的稳定化。在大多数情况下，已经提出了一种冻干的制剂(BURKE CJ等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1999,16(1)：1-83)。实际上，尽管冻干的执行可能会导致病毒滴度的一些损失，但一旦冻干，在冻干状态下，低温和缺乏运动以及化合物之间的相互作用使得冻干病毒通常比液态病毒更稳定。例如，EP1418942公开了用于冻干的痘苗病毒制剂，其包括基本上纯的痘苗病毒、二糖、药学上可接受的聚合物和不是磷酸盐缓冲剂的缓冲剂。WO2014/053571公开了其它冻干的MVA制剂，其包含聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其衍生物、至少一种糖(特别是蔗糖)、至少两种不同的氨基酸(特别是谷氨酸钠和L-精氨酸)、至少两种药学上可接受的盐(特别是NaCl、Na2HPO4和KH2PO4)(其中至少一种所述盐是磷酸盐)和任选地药学上可接受的缓冲剂(特别是Tris)。
然而，冻干是昂贵的，需要特定的设备，并且冻干的制剂在施用前需要被重建(reconstitute)。此外，冻干包括可能导致一些病毒聚集(特别是高病毒滴度)的冷冻步骤，其不适于注射施用。因此，提供稳定的液体痘苗病毒制剂是非常有用的。
以前在液态下稳定痘苗病毒的尝试并没有非常成功，因为在大多数情况下观察到在50℃下小于1小时后的log损失(log loss)大于1log10(参见BURKE CJ等，Crit Rev TherDrug Carrier Syst 1999，16(1)：1-83)。
Evans等公开了在pH6至pH8之间缓冲的稳定的液体腺病毒(非包膜DNA病毒)制剂，其包含盐(通常为NaCl)、糖(大多数情况下为蔗糖)、自由基氧化的抑制剂(特别是EDTA、乙醇或EDTA/乙醇组合)，非离子表面活性剂和二价盐(参见EVANS等J Pharm Sci.2004Oct，93(10)：2458-75；和US7,456,009)。优选的制剂通常还包含组氨酸。确认对于稳定性必需的基本参数包括自由基氧化作用的抑制剂的存在(特别是EDTA、乙醇、EDTA/乙醇组合和/或组氨酸)和非离子表面活性剂的存在。二价盐的存在也被确认对于增加腺病毒稳定性是重要的。
用于稳定化目的的非离子表面活性剂的有用也已经针对乳头瘤病毒被记载(参见SHI等，J Pharm Sci.2005Jul，94(7)：1538-51)。
US2007/0161085测试了用于稳定流感病毒(包膜RNA病毒)的各种液体制剂。最稳定的制剂包括精氨酸和明胶。在本研究中，EDTA显示对流感病毒的稳定性没有影响。发现除了精氨酸和明胶之外，少量的表面活性剂是有益的。
US7,914,979涉及用于稳定包膜新城疫病毒的制剂，其包含非还原性糖如蔗糖。优选的组合物还含有选自赖氨酸和精氨酸的氨基酸。相比之下，表明EDTA对稳定性具有负面影响，并且优选不存在于制剂中。
在WO2014/029702中，已经测试了各种类型的制剂用于稳定四种犬科病毒：两种中小型无包膜病毒(犬细小病毒和犬腺病毒2型)和副粘液病毒(paramyxovirus)家族的两种包膜病毒(犬瘟热病毒和犬副流感病毒)。结果显示，包膜病毒比非包膜病毒更难稳定，以及即使对于相同副粘液病毒家族的两种包膜病毒(犬瘟热病毒和犬副流感病毒)，病毒之间的最佳配方显著不同。另外，在实施例1中表明，尽管蔗糖-特别是17-25％的浓度-和氨基酸(如精氨酸和甲硫氨酸)是有效的稳定剂，但是自由基清除剂(如EDTA)不显著改变稳定性谱(profile)，尽管它们可能在一定程度上有助于稳定性。
现有技术的上述描述清楚地说明，为特定病毒设计稳定的液体制剂是困难的任务，因为本领域已知许多稳定剂候选物且由于它们的稳定效果根据待稳定的具体病毒而大不相同。此外，如上所述，由于其包膜性质、其大尺寸和其DNA基因组，痘苗病毒特别难以稳定，特别是在液体状态下。
发明内容
在本发明的上下文中，发明人鉴定了在约5℃(即5℃±3℃)或更高温度下维持液态的痘苗病毒的稳定性的液体制剂。这种制剂的基本要素是药学上可接受的缓冲剂、单价盐、药学上可接受的二糖或糖醇、药学上可接受的螯合剂的存在；以及pH在6.5和至8.5之间。C2-C3醇的额外存在进一步提高了所述液体制剂的稳定性。
在第一方面，本发明因此涉及一种液体制剂，其包含、基本上由以下组成或由以下组成：
a)痘病毒，特别是痘苗病毒，
b)药学上可接受的缓冲剂，
c)单价盐，
d)药学上可接受的二糖或糖醇，和
e)药学上可接受的螯合剂，
其中所述制剂的pH为6.5至8.5之间。
发明人还惊奇地发现，螯合剂(如EDTA)的存在保护痘苗病毒免受UV损伤。因此，本发明还涉及螯合剂用于稳定痘病毒(特别是痘苗病毒)抗紫外线损伤的用途。
附图说明
图1.单价盐的存在的有益效果。含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、pH8.0和0mM或50mM NaCl的制剂在+37℃下7、14或28天后MVA-MUC1的感染性损失(infectious loss)。感染性病毒已经以颗粒形成单位(PFU)/mL测量，并且感染性损失以log(PFU/mL)表示。
图2.EDTA或EDTA/乙醇的存在的有益效果。含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH7.5的对照DS制剂的MVA-HCV感染性损失；含有20mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、5mM谷氨酸钠，75mM NaCl、pH7.5的对照DS2制剂的MVA-HCV感染性损失；或含有20mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、5mM谷氨酸钠、75mM NaCl、pH7.5和各种浓度的EDTA(50、250、500和1000μM的)和任选的1％(v/v)乙醇的制剂在+37℃下7、14或28天后的MVA-HCV感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。
图3.乙醇或EDTA/乙醇的存在的有益效果。含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH7.5的对照DS制剂的MVA-HCV感染性损失；含有20mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、5mM谷氨酸钠、75mM NaCl、pH7.5的对照DS2制剂的MVA-HCV感染性损失；或含有20mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、5mM谷氨酸钠、75mM NaCl、pH7.5和各种浓度的乙醇(0.5、1、2或4％(v/v))和任选的EDTA(50或1000μM)的制剂在+37℃下7、14或28天后的MVA-HCV感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。
图4.EDTA/乙醇存在的有益效果。含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH7.5的对照DS制剂的MVA-HCV感染性损失；含有20mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、2.5mM谷氨酸钠、75mM NaCl、pH7.5的对照DS2制剂的MVA-HCV感染性损失；或含有20mMTris-HCl、10％(w/v)蔗糖、2.5mM谷氨酸钠、75mM NaCl、pH7.5和各种浓度的EDTA(50、150或250μM)和乙醇(0.5、1.5或2.5％(v/v))的制剂，(A)在+37℃下7、14或28天后的MVA-HCV感染性损失；(B)在+25℃下28天后或2、3或6个月后的MVA-HCV感染性损失；或(C)在+5℃下35天后或3、6、12、18或24个月后的MVA-HCV感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。(D)基于对+37℃7天后、+37℃28天后和+5℃24个月后感染性损失的综合分析的EDTA(μM)和乙醇(％)浓度的期望曲线(desirability curve)。给出了代表获得特定希望值的EDTA和乙醇浓度值的曲线。导致更高期望值的EDTA和乙醇是优选的。
图5.低浓度谷氨酸钠的有益效果。含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH7.5的对照DS制剂的MVA-HCV感染性损失；含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、0mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH7.5的对照DS2制剂的MVA-HCV感染性损失；或含有20mMTris-HCl、10％(w/v)蔗糖、0至10mM谷氨酸钠、75mM NaCl、150μM EDTA和0.5％(v/v)乙醇、pH 7.5的制剂，(A)在+37℃下7、14或28天后的MVA-HCV感染性损失；(B)在+25℃下28天后，或3、6或12个月后的MVA-HCV感染性损失；(C)在+5℃下2、3、6、12、18、24或30个月后的MVA-HCV感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。
图6.蔗糖的有益效果。含有10mM Tris-HCl、10mM谷氨酸钠、50mMNaCl、pH8.0和不同量的蔗糖(1.25、2.5、5、7.5和10％(w/v))的制剂在+37℃下7或14天后的MVA-MUC1的感染性损失。感染性病毒已经以颗粒形成单位(PFU)/mL测量，以及感染性损失以log(PFU/mL)表示。
图7.聚山梨酸酯没有有益效果且甚至有有害影响。(A)和(B)在含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH7.5的对照DS制剂中的MVA-HPV感染性损失；或在含有Tris-HCl(5、10或20mM)、5％(w/v)蔗糖、5mM谷氨酸钠、50或75mM NaCl、pH7.5和各种浓度的聚山梨醇酯80(0.005；0.02或1％(v/v))或聚山梨醇酯40(1％(v/v))的制剂中(A)在+25℃下3、7、28或60天后的MVA-HPV感染性损失；或(B)在+5℃下1、2、3、6、12、18或24个月后的MVA-HPV感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。(C)在含有30mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖的对照制剂中或在还含有150μg/mL聚山梨醇酯80制剂中在+37℃下7、14、21或28天后，在人连续细胞系中生产并通过涉及至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤的方法纯化的痘苗病毒(VV)惠氏毒株的感染性损失。
图8.在高浓度条件下，MgCl2没有有益效果且有有害影响。(A)在含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH8.0和不同量的MgCl2(0M；0.5M；或1M)的制剂中在+37℃下14天后的MVA-MUC1感染性损失。感染性病毒已经以颗粒形成单位(PFU)/mL测量，以及感染性损失以log(PFU/mL)表示。(B)在含有30mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖的对照制剂，或进一步含有1000mM MgCl2的制剂中在+37℃下7或14天后在人连续细胞系中生产并且通过涉及至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤的方法纯化的痘苗病毒(VV)惠氏毒株的感染性损失。
图9.精氨酸没有有益效果且有有害影响。(A)在含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH8.0和不同量精氨酸(0、30、50、100或200mM)的制剂中在+37℃下3、7、14或28天后的MVA-MUC1感染性损失。感染性病毒已经以颗粒形成单位(PFU)/mL测量，以及感染性损失以log(PFU/mL)表示。(B)在含有30mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖的对照制剂中，或在还含有50mM精氨酸的制剂中在+37℃下7、14、21或28天后在人连续细胞系中生产并且通过涉及至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤的方法纯化的痘苗病毒(VV)惠氏菌株的感染性损失，。
图10.氨基酸混合物没有有益效果。含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH8.0和不同量的氨基酸混合物(0或1％(w/v))的制剂在37℃下3、7、14或28天后的MVA-MUC1的感染性损失。感染性病毒已经以颗粒形成单位(PFU)/mL测量，以及感染性损失以log(PFU/mL)表示。
图11.组氨酸没有有益效果。含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH7.5的对照DS制剂的MVA-HPV感染性损失；或在含有20mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、5mM谷氨酸钠、75mM NaCl和10mM组氨酸、pH7.5的制剂(A)在+25℃下3、7、14、28或60天后MVA-HPV的感染性损失；或(B)在+5℃下1、2、3、6、12、18或24个月后MVA-HPV的感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。
图12.pH值的影响。含有20mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、5mM谷氨酸钠、75mMNaCl、150μM EDTA和0.5％(v/v)乙醇、具有不同pH值(6.0；7.0；7.5；8.0和9.0)的制剂(A)在+37℃下7、14或28天后MVA-HCV的感染性损失，或(B)在+5℃下28天后或3、6或12个月后MVA-HCV的感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。
图13.病毒浓度的影响。含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mMNaCl、pH7.5的对照DS制剂中，MVA-HCV在各种初始浓度(1.0 108PFU/mL；5.0 107PFU/mL；1.00 107PFU/mL或5.0 106PFU/mL)MVA-HCV的感染性损失；或含有20mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、2.5mM谷氨酸钠、75mM NaCl、150μM EDTA、0.5％(v/v)乙醇、pH 7.5的制剂(Inv)(A)在+37℃下14或28天后MVA-HCV的感染性损失；(B)在+25℃下28天或3或7个月后MVA-HCV的感染性损失；或(C)在+5℃下2、6、12或18个月后MVA-HCV的感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。
图14.根据本发明的优化的制剂在表达不同异源基因的3种不同MVA病毒中的验证。含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH7.5的对照DS制剂(针对MVA-HPV)和pH8.0的对照DS制剂(针对MVA-HCV和MVA-MUC1)的MVA-HCV、MVA-MUC1和MVA-HPV的感染性损失；或20mM含有Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、5mM谷氨酸钠、75mM NaCl、150mMHEDTA、0.5％(v/v)乙醇、pH 7.5的制剂(A)在+37℃下7、14或28天后的MVA-HCV、MVA-MUC1和MVA-HPV的感染性损失；或(B)在+25℃下28天或2、3或6个月后MVA-HCV、MVA-MUC1和MVA-HPV的感染性损失；或(C)在+5℃下2、3、6、12、18、24或30个月后MVA-HCV、MVA-MUC1和MVA-HPV的感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。
图15.根据本发明优化的制剂在通过各种方法生产/纯化的各种痘苗病毒株中的验证。(A)在鸡胚细胞(MVA-HCV/CEC)或永生化的禽细胞系(MVA-HCV/禽细胞系)的细胞中生产的MVA-HCV的感染性损失；在鸡胚细胞(MVA-FCU1/CEC)中生产的MVA-FCU1和在鸡胚细胞(哥本哈根-FCU1/CEC)中生产的哥本哈根-FCU1的感染性损失；在对照药物物质(10mMTris-HCl、10mM谷氨酸钠、5％(w/v)蔗糖、50mM NaCl、pH7.5)中的感染性损失或根据本发明的优化的制剂配制的(20mM Tris-HCl、5mM谷氨酸钠、10％(w/v)蔗糖、75mM NaCl、150μMEDTA、0.5％乙醇、pH7.5)，在37℃下14、21或28天后的感染性损失。(B)在对照药物物质(30mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、pH 7.5)或根据本发明的两种优化的制剂的配制(30mMTris-HCl、10％(w/v)蔗糖、200或500mM NaCl、150μM EDTA、0.5％乙醇、pH7.5)中在37℃下7、14、21或28天后，在人连续细胞系中生产并通过涉及至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤的方法纯化的痘苗病毒(VV)惠氏毒株的感染性损失。
图16.由同一家族或其他家族的其他化合物代替初始经测试的稳定剂。(A)在表19中定义的各种制剂在+37℃下7、14、21或28天后MVA-MUC1的感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。(B)和(C)使用
Figure GDA0001559831270000081
软件，在+37℃下在14天(B)或28天(C)后将新的测试候选等效物(candidate equivalent)替换为初始经测试的稳定剂或其他新的测试候选等效物的影响的统计学分析。每行表示从含有候选等效Y的制剂到含有初始经测试的稳定剂或其他新的测试候选等效物(Y＝>X)的制剂的变化，以及相关的条形(bar)和值。当值为正时，这意味着初始经测试的稳定剂或其他新的测试候选物X比候选等效物Y更好地稳定MVA-MUC1。相反，负值意味着候选等效物Y比初始经测试的稳定剂或其他候选等效物X更好地稳定MVA-MUC1。绝对值越高，将Y替换为X的效果越强。特别是，当条形超过虚线时，认为替换对MVA-MUC1的稳定具有显著影响。(D)表19中定义的各种制剂在+5℃下的28、90和180天后MVA-MUC1的感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。
图17.通过针对紫外线损伤优化的制剂来保护MVA病毒。(A)含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH7.5的对照制剂中的MVA-HCV的感染性损失，或含有20mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、5mM谷氨酸钠、75mM NaCl、150μM EDTA和0.5％(v/v)乙醇、pH7.5的优化的制剂在+25℃下在无光、PSM光(根据ISO 10977的320-400nm紫外光模拟)或ICH光(ICH Q1B新药物和产品的光稳定性测试(Photostability Testing of NewDrug Substances and Products))下1、2、3、7、14、21或28天后MVA-HCV的感染性损失。(B)含有20mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、5mM谷氨酸钠、75mM NaCl、pH7.5的对照制剂或含有20mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、5mM谷氨酸钠、75mM NaCl和150μM EDTA和/或0.5％(v/v)乙醇、pH7.7的制剂在+25℃在无光或ICH光(ICH Q1B光稳定性测试新药物和产品)下2、3、7、9、14或21天后的MVA-HCV的感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。
图18.具有不同浓度的成分的几种制剂的稳定效果。在具有不同浓度的成分的几种制剂(见表20)中在+37℃下7、14、21或28天后MVA-MUC1的感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。
图19.对假牛痘病毒(pseudocowpox virus)的稳定效果。含有10mM Tris-HCl、5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠、50mM NaCl、pH8.0的对照组合物中或含有20mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖、5mM谷氨酸钠、75mM NaCl、150μM EDTA、0.5％(v/v)乙醇、pH7.5的根据本发明的制剂在+37℃7、14、21或28天后的假牛痘病毒的感染性损失。用感染性基因组(IG)/mL测量感染性病毒，以及感染性损失以log(IG/mL)表示。
具体实施方式
稳定的液体制剂
如上所述，本发明人发现适合于在约+5℃或更高温度下维持痘病毒，特别是液态痘苗病毒的稳定性的液体制剂。这类制剂应包含药学上可接受的缓冲剂、单价盐、药学上可接受的二糖或糖醇、药学上可接受的螯合剂；和pH在6.5至8.5之间。
因此，本发明涉及一种液体制剂，其包含、基本上由以下组成或由以下组成：
a)痘病毒，特别是痘苗病毒，
b)药学上可接受的缓冲剂，
c)单价盐，
d)药学上可接受的二糖或糖醇，和
e)药学上可接受的螯合剂，
其中制剂的pH为6.5至8.5之间。
根据本发明的所述液体制剂是水性制剂。
“包含”旨在表示材料、产品、制剂、组合物和方法包括提及的成分或步骤，但不排除其他。当用于定义产品、制剂，组合物和方法时，“基本上由……组成”应当旨在排除其他任何实质重要性的成分或步骤。因此，例如，基本上由所记述的组分组成的制剂不会排除痕量污染物和药学上可接受的载体。“由……组成”应当旨在不包括超过痕量元素的其他成分或步骤。
稳定性
根据本发明的制剂是液体的，其优点是不需要昂贵且耗时的冻干方法，并且它们可以被直接施用，而不需要提前重建。
生物学材料如病毒(特别是液体状态的)的稳定并不简单，由于病毒与制剂的所有成分以及容器相互作用的能力，其增加了病毒滴度损失的风险。
然而，本发明提供了在液体状态下稳定并允许克服这些困难的病毒制剂。具体是：
·根据本发明的液体制剂中感染性痘病毒(特别是痘苗病毒)滴度的损失优选在+37℃储存至少1周(优选至少2周、至少3周或甚至至少4周)期间小于1log10感染性病毒，
·根据本发明的液体制剂中感染性痘病毒(特别是痘苗病毒)滴度的损失优选在+25℃储存至少4周(优选至少3个月或至少6个月)期间小于1log10感染性病毒，和/或
·根据本发明的液体制剂中感染性痘病毒(特别是痘苗病毒)滴度的损失优选在约+5℃(即+5℃±3℃)储存至少12个月(优选至少18个月、至少24个月、至少30个月或甚至至少36个月)期间小于0.3log10感染性病毒(其对应于50％的感染性损失)。
可以通过测量每毫升的感染基因组(IG)(IG/mL)的数量或通过在BHK-21细胞上使用空斑测定(plague assay)(然后感染性痘病毒(特别是感染性痘病毒)的滴度以每毫升的空斑形成单位(PFU)(PFU/mL)表示)来确定在第0天和任何以下日期的感染性痘苗病毒的滴度。可优选测量每毫升感染性基因组(IG/mL)的数量，因为该方法更快速和更精确。在实施例中公开了测量每毫升感染性基因组(IG)(IG/mL)的数量或在BKH-21细胞中空斑测定的详细方案。
痘病毒
根据本发明的制剂包含痘病毒。
所述痘病毒可选自以下家族：正痘病毒属(例如痘苗病毒、牛痘病毒)，副痘病毒属(例如牛流行性口炎病毒(Bovine popular stomatitis virus)、羊传染性口疮病毒(Orfvirus)、假牛痘病毒)、猪痘病毒属(suipoxvirus)(例如猪痘病毒)、亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus)(例如亚巴样病病毒(Yaba-like disease virus))、禽痘病毒属(例如禽痘病毒(fowlpox virus)和金丝雀痘病毒)和兔病毒属(Leporipoxvirus)(粘液瘤病毒)。所述痘病毒可特别选自正痘病毒属(例如痘苗病毒、牛痘病毒)和副痘病毒属(例如牛流行性口炎病毒、羊传染性口疮病毒、假牛痘病毒)。特别优选的痘病毒是痘苗病毒和假牛痘病毒。
在优选的实施方案中，所述痘病毒是正痘病毒，更优选为痘苗病毒(VV)。
发明人观察到，痘苗病毒在液态中的稳定性随着制剂中痘苗病毒颗粒的浓度而增加(参见实施例4)。因此优选地，所述痘病毒(特别是痘苗病毒，以及特别是MVA、惠氏或哥本哈根痘苗病毒)优选以至少107PFU/mL，优选至少2.107PFU/mL、至少3.107PFU/mL、至少4.107PFU/mL、更优选至少5.107PFU/mL，或甚至至少108PFU/mL的滴度存在于根据本发明的液体制剂中。由于痘病毒(特别是痘苗病毒)的稳定性随着所述制剂中痘病毒(特别是痘苗病毒)颗粒的浓度增加，对于所述制剂中痘病毒(特别是痘苗病毒)颗粒的最大浓度没有特别的限制。然而，出于实际原因，痘病毒(特别是痘苗病毒)通常将以至多1012PFU/mL、至多1011PFU/mL或甚至至多1010PFU/mL的滴度包含在根据本发明的所述液体制剂中。特别地，痘病毒(特别是痘苗病毒)可以以107PFU/mL至1012PFU/mL、107PFU/mL至1011PFU/mL、107PFU/mL至1010PFU/mL、107PFU/mL至5.109PFU/mL、107PFU/mL至109PFU/mL、107PFU/mL至5.108PFU/mL、107PFU/mL至108PFU/mL、2.107PFU/mL至1012PFU/mL、2.107PFU/mL至1011PFU/mL、2.107PFU/mL至1010PFU/mL、2.107PFU/mL至5.109PFU/mL、2.107PFU/mL至109PFU/mL、2.107PFU/mL至5.108PFU/mL、2.107PFU/mL至108PFU/mL、3.107PFU/mL至1012PFU/mL、3.107PFU/mL至1011PFU/mL、3.107PFU/mL至1010PFU/mL、3.107PFU/mL至5.109PFU/mL、3.107PFU/mL至109PFU/mL、3.107PFU/mL至5.108PFU/mL、3.107PFU/mL至108PFU/mL、4.107PFU/mL至1012PFU/mL、4.107PFU/1011PFU/mL、4.107PFU/mL至1010PFU/mL、4.107PFU/mL至5.109PFU/mL、4.107PFU/mL至109PFU/mL、4.107PFU/mL至5.108PFU/mL、4.107PFU/mL至108PFU/mL、5.107PFU/mL至1012PFU/mL、5.107PFU/mL至1011PFU/mL、5.10 7PFU/mL至1010PFU/mL，特别是5.107PFU/mL至5.109PFU/mL，5.107PFU/mL至109PFU/mL，5.107PFU/mL至5.108PFU/mL、5.107PFU/mL至108PFU/mL、108PFU/mL至1012PFU/mL、108PFU/mL至1011PFU/mL、108PFU/mL至1010PFU/mL、108PFU/mL至5.109PFU/mL、108PFU/mL至109PFU/mL、108PFU/mL至5.108PFU/mL的滴度包含在根据本发明的所述液体制剂中。
痘病毒优选地被纯化或半纯化以减少宿主细胞蛋白质和宿主细胞DNA，以便在人施用后能够被良好耐受。此外，许多杂质可能是注射后人过敏反应的起因。这样的半纯化或纯化方法是本领域常规的，并且可以作为函数随各种参数(例如病毒本身、生产细胞、使用的培养基、在生产和纯化步骤期间引入的酶和其它成分(例如核酸酶、蛋白酶、盐等))的变化而变化。例如，当病毒在诸如鸡胚成纤维细胞(CEF)的原代细胞中生产时，通常存在例如卵清蛋白(egg ovalbumin)和抗生素的杂质，而宿主细胞核酸和蛋白质是在永生化细胞系如鸭细胞系和人细胞系上生产的病毒制备物的通常污染物。用于一般性指导，建议将宿主细胞DNA降低至少于10ng/剂量(见质量管理规格标准(regulatory specification))，并且宿主细胞蛋白质低于150μg/剂量。用于实现半纯化或纯化的病毒制备物的合适技术的代表性实例包括但不限于切向流过滤、酶消化、色谱法、前过滤(frontal filtration)等。因此，在优选的实施方案中，所述痘病毒(特别是痘苗病毒)至少被半纯化，其包含5至500μg/剂量的宿主细胞蛋白质和低于10ng/剂量的宿主细胞DNA。
发明人发现根据本发明的液体制剂能够稳定三种不同的痘苗病毒毒株：MVA、惠氏和哥本哈根(参见实施例4)。因此可以使用根据本发明的所述液体制剂稳定痘苗病毒的各种毒株。特别地，所述痘苗病毒可以选自埃尔斯特里(Elstree)、西储(Western Reserve)、惠氏、NYVAC、NYCBOH、巴黎(Paris)、哥本哈根以及经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)毒株。所述痘苗病毒可优选选自经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)、惠氏和哥本哈根毒株。在优选的实施方案中，所述制剂中存在的痘苗病毒是MVA病毒，特别是MVA575(ECACC V00120707)或MVA-BN(ECACC V00083008)。在另一个优选的实施方案中，所述制剂中存在的痘苗病毒是惠氏痘苗病毒。在另一个优选的实施方案中，所述制剂中存在的痘苗病毒是哥本哈根痘苗病毒。
包含在根据本发明的所述制剂中的所述痘病毒(特别是痘苗病毒)可以是野生型、减毒型或重组痘病毒(特别是痘苗病毒)。术语“重组痘病毒”是指包含插入其基因组中的至少一个外源序列的痘病毒。如本文所用，“外源序列”是指亲本痘病毒中非天然存在的核酸。
当根据本发明的所述制剂中包含的所述痘病毒(特别是痘苗病毒)是重组的时，所述外源序列可以是任何感兴趣的外源序列。
在第一优选实施方案中，所述重组痘病毒(特别是痘苗病毒)包含编码具有直接或间接细胞毒性功能的分子的外源序列。通过“直接或间接”的细胞毒性，我们的意思是由所述外源序列编码的所述分子本身可能是有毒的(例如毒素；细胞因子或酶(如核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶))，或者它可能被代谢形成有毒的产物，或者它可能采取其他行动形成有毒产品。在优选的实施方案中，由所述外源序列编码的所述分子可以是毒素，例如蓖麻毒素或假单胞菌外毒素A。蓖麻毒素cDNA的序列公开于LAMB等(Eur.J.Biochem.，1985,148：265-270)。在另一个优选的实施方案中，由所述外源序列编码的所述分子可以是细胞因子。这种细胞因子可以尤其选自肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN2)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。在另一个优选的实施方案中，编码具有直接或间接细胞毒性功能的分子的所述外源序列可以是自杀基因。自杀基因编码能够将相对无毒的前体药物转化成毒性药物的蛋白质。例如，酶胞嘧啶脱氨酶将5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为5-氟尿嘧啶(5-FU)(MULLEN等，1922，PNAS89:33)；单纯疱疹酶胸苷激酶使细胞对抗病毒剂更昔洛韦(GCV)或阿昔洛韦(MOOLTEN，1986，Cancer Res.46：5276；EZZEDINE et al.，1991，NewBiol3：608)治疗敏感。可以使用任何生物体的胞嘧啶脱氨酶，例如大肠杆菌或酿酒酵母。因此，在本发明的优选实施方案中，所述自杀基因编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的蛋白质，并且更优选为专利申请WO99/54481、WO2005/007857、WO2009/065546和WO2009/065547中公开的FCU 1蛋白质或FCU 1-8蛋白质，其通过引用并入本文。在这方面，根据本发明的所述液体制剂中包含的优选的重组痘苗病毒是：
-MVA-FCU 1(参见WO99/54481)，也被称为TG4023；
-MVA-FCU 1-8(参见WO2005/007857)；和
-VV-FCU 1，其中所述痘苗病毒(VV)更特别地包含有缺陷的I4L和/或F4L基因，和有缺陷的J2R基因(参见WO2009/065546和WO2009/065547)。
在第二优选实施方案中，所述重组痘苗病毒包含编码能够切割被靶向的RNA或DNA的核酶的外源基因。待切割的被靶向的RNA或DNA可以是对细胞功能必需的RNA或DNA其切割导致细胞死亡，或者待切割的RNA或DNA可以是编码不期望的蛋白质(例如致癌基因产物)的RNA或DNA，并且该RNA或DNA的切割可以阻止细胞变成癌。
在第三优选实施方案中，所述重组痘病毒(特别是痘苗病毒)包含编码反义RNA的外源序列。反义RNA序是指与编码蛋白质的mRNA分子或细胞内的其他RNA分子(如前体mRNA或tRNA或rRNA)杂交并干扰表达的RNA分子。
在第四优选实施方案中，所述重组痘病毒(特别是痘苗病毒)包含替代靶细胞中缺陷基因(defective gene)的功能的外源序列。有数千种哺乳动物(包括人)的由缺陷基因引起的遗传的遗传性疾病。这种遗传性疾病的实例包括囊性纤维化，其中已知在CFTR基因中存在突变；杜氏肌营养不良症，其中已知肌营养不良蛋白基因中存在突变；镰状细胞病，其中已知HbA基因存在突变。许多类型的癌症是由缺陷基因，特别是原癌基因和已经发生突变的肿瘤抑制基因引起的。原癌基因的例子有ras、src、bcl等；肿瘤抑制基因的例子是p53和Rb。
在第五优选实施方案中，所述重组痘病毒(特别是痘苗病毒)包含编码肿瘤相关抗原(TAA)的外源序列。TAA是指检测到在肿瘤细胞中以比相同组织类型的非肿瘤细胞中频率或密度更高的分子。TAA的实例包括但不限于CEA、MART1、MAGE1、MAGE3、GP-100、MUC1(参见WO92/07000、WO95/09241和ROCHLITZ等J Gene Med.2008Aug；5(8)：690-9，通过引用并入本文)、MUC2、点突变的ras致癌基因、正常或点突变的p53、过表达的p53、CA-125、PSA、C-erb/B2、BRCA I、BRCA II、PSMA、酪氨酸酶、TRP1、TRP2、NY-ESO-1、TAG72、KSA、HER-2/neu、bcr-abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、surviving和LRP。根据更优选的实施方案，TAA是MUC1。
在第六优选实施方案中，所述重组痘病毒(特别是痘苗病毒)包含编码抗原的外源基因。如本文所用，“抗原”是指可被抗体结合的配体；抗原本身不需要是免疫原性的。优选地，所述抗原来源于：
·病毒
例如，所述抗原可以来源于：
o HIV-1(如gp 120或gp 160)，
o任何猫免疫缺陷病毒，
o人或动物疱疹病毒，例如gD或其衍生物或立即早期蛋白(immediate earlyprotein)，例如来自HSV1或HSV2的ICP27，
o巨细胞病毒(例如gB或其衍生物)，
o水痘带状疱疹病毒(如gpl、II或III)，
o肝炎病毒，例如乙型肝炎病毒(HBV)(如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV；参见WO2004/111082；优选来自基因型1b型毒株ja的非结构型HCV蛋白质)和戊型肝炎病毒(HEV)，
o呼吸道合胞病毒，
o人乳头状瘤病毒(HPV；参见WO90/10459，WO95/09241，WO98/04705，WO99/03885和WO2007/121894；优选来自HPV16毒株的E6和E7蛋白；另见LIU等，2004Oct 5，Proc NatlAcad Sci USA，101Suppl2：14567-71)，或
o流感病毒。
·细菌性病原体，如沙门氏菌属、奈瑟球菌属(Neisseria)、疏螺旋体属(Borrelia)(例如OspA或OspB或其衍生物)、衣原体、博德特氏菌属(Bordetella)(例如P.69、PT和FHA)或分枝杆菌属(特别是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌，参见WO2014/009438和WO2014/009433)，
·寄生虫，如疟原虫或弓形虫。
根据更优选的实施方案，所述抗原选自HCV、HPV或分枝杆菌属(特别是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌)的抗原，特别是上述抗原。在这方面，存在于根据本发明的所述液体制剂中的优选的重组痘苗病毒是MVA-HCV(参见WO2004/111082),也被称为TG4040编码NS3、NS4和NS5B HCV抗原。
当然，根据本发明的所述液体制剂中存在的所述重组痘病毒(特别是痘苗病毒)可以包含多于一个外源序列，并且每个外源序列可以编码多于一个分子。
例如，在相同的重组痘病毒(特别是痘苗病毒)中关联可能是有用的：
·编码例如TAA(如前所述)或抗原(如前所述)的外源序列，和
·编码细胞因子的外源序列(例如白介素(IL例如IL-2))；肿瘤坏死因子(TNF)；干扰素(IFN)；集落刺激因子(CSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF))。
在这方面，存在于根据本发明的所述液体制剂中的优选的重组痘苗病毒是：
-也称为TG4010的编码MUC1TAA和人IL-2的MVA-[MUC1-IL2](参见WO92/07000和WO95/09241)；和
-也称为TG4001的编码非致癌性HPV-16E6和E7多肽和人IL-2的MVA-[HPV-IL2](参见WO90/10459、WO95/09241、WO98/04705、WO99/03885、WO2007/121894)。
另一个在相同痘病毒(特别是痘苗病毒)载体中的两个外源序列的有用的关联的实例是痘病毒(特别是痘苗病毒)载体，其包含：
·感兴趣的外源序列，包括上述所有那些(特别是自杀基因、细胞因子、TAA或病原体抗原)，以及
·编码选择标记的外源序列。这种选择标记可以尤其选自可易于被测定的酶、例如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白和荧光素酶。
在这方面，存在于根据本发明的所述液体制剂中的优选的重组痘苗病毒是J2R基因缺陷的痘苗病毒(优选惠氏毒株)，并且包含编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的外源序列(参见KIM JH等，2006Sep，Mol Ther.，14(3)：361-70和BREITBACH CJ等，2011，Curr Pharm Biotechnol.Vol.12No 12)。
制备和纯化痘病毒(特别是痘苗病毒)的方法是那些本领域技术人员已知的。例如，在WO2007/147528和WO2010/130753中公开了生产和纯化痘病毒(特别是痘苗病毒)的方法，其通过引用并入本文。
痘苗病毒可尤其首先扩增，通过：
a)准备包装细胞(packaging cell)的培养物；
b)用痘苗病毒感染所述包装细胞培养物；
c)培养所述受感染的包装细胞，直到产生后代痘苗病毒，以及
d)收集培养物上清液和/或包装细胞中产生的痘苗病毒。
在步骤a)中，合适的包装细胞取决于待扩增的痘苗病毒的类型。
MVA严格受宿主限制，并且可能在禽类细胞(或是原代禽类细胞(如鸡胚成纤维细胞或CEF)或永生化禽细胞系)中扩增，并且特别是：
·包含编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列的疣鼻栖鸭(Cairina moschata)永生化禽细胞系(参见在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏编号为08060502的细胞系T3-17490和在ECACC保藏编号为08060501的细胞系T6-17490，公开于WO2007/077256)，
·如WO2009/004016所公开的，包含E1A核酸序列和编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列的疣鼻栖鸭永生化禽细胞系，
·专利US5,879,924中公开的DF1细胞系，其为来源于10日龄东兰辛系(ELL-O)卵(East Lansing Line Egg)的自发永生化鸡细胞系，
·WO2005/007840中公开的Ebx鸡细胞系，其通过从生长因子和饲养层逐渐分离(progressive severance)而来源于胚胎干细胞；或
·DEC 99细胞系(IVANOV等Experimental Pathology and Parasitology，4/2000Bulgarian Academy of Sciences)，其是鸭胚胎永久细胞系。
对于其他痘苗病毒或其他痘病毒毒株，除了禽原代细胞(如CEF-“鸡胚成纤维细胞”-也称为CEC或“鸡胚细胞”)和禽细胞系之外，还有许多其他非禽细胞系可用于扩增，包括Hela、BHK-21、MRC-5、HEK-293和非洲绿猴肾细胞(Vero cell)。在优选的实施方案中，在Hela细胞中扩增除MVA之外的痘苗病毒。
包装细胞优选在不含动物或人来源的产品的培养基中培养，使用没有动物或人源的化学成分确定的培养基。特别地，虽然生长因子可能存在，但他们优选被重组生产并且不从动物材料中纯化。根据选择的包装细胞，本领域技术人员可以容易地选择合适的无动物成分培养基。这种培养基是市售的。特别地，当将CEF用作包装细胞时，可以将其在VP-SFM细胞培养基(Invitrogen)中培养。CEF还优选在感染前培养1至5天，更优选培养1至2天，甚至更优选培养2天。进一步优选将CEF在包含+30℃至+37℃之间的温度下培养。当使用非禽永生化细胞系细胞时，它们优选在感染前培养2至7天。如果需要大量的非禽永生化细胞，可以进行2至7天的几次传代以增加细胞总数。非禽永生化细胞进一步优选在包含+36℃至+38℃之间的温度下培养，更优选在约+37℃培养。
在步骤b)中，包装细胞在适当的条件(特别是使用适当的感染复数(MOI))下被痘病毒(特别是痘苗病毒)感染以允许包装细胞的生产性感染。特别地，当痘苗病毒是MVA(特别是WO90/10459、WO92/07000、WO95/09241、WO98/04705、WO99/03885、WO2004/111082、WO2007/121894、WO2014/009438和WO2014/009433中公开的那些)并且使用CEF进行扩增时，其可以以优选包含0.001至0.1，更优选0.03至0.07，甚至更优选约0.05的MOI接种在含有CEF的细胞培养容器中。对于其它痘苗病毒毒株，特别是溶血性痘苗病毒如惠氏和哥本哈根菌株(特别是在WO2007/030668、2008/113078、WO2009/065546、WO2009/065547中公开的那些)，痘苗病毒可以以优选为0.0001至0.1，更优选为约0.0001的MOI被接种在含有包装细胞的培养基中。感染步骤还优选在不含动物或人来源的产品的培养基(其可以与用于培养包装细胞的培养基相同或不同)中进行，所述培养基使用没有动物或人源的产物的化学成分确定的培养基。对于在CEF中的MVA，步骤b)中使用的所述培养基优选为基础培养基，尤其是Eagle基本培养基(Basal Medium Eagle)细胞培养基(Invitrogen)。
在步骤c)中，然后在本领域技术人员熟知的适当条件下培养受感染的包装细胞，直到产生后代痘病毒(特别是痘苗病毒)。受感染的包装细胞的培养物也优选在不含动物或人来源的产品的培养基(其可以与用于培养包装细胞和/或用于感染步骤的培养基相同或不同)中培养，所述培养基使用不含动物或人来源的产物的化学成分确定培养基。对于在CEF中扩增的MVA，CEF可以尤其在基础培养基(特别是Basal Medium Eagle细胞培养基(Invitrogen))中在+33℃和+37℃之间的温度下培养1至4天。对于在非禽永生化细胞系中生产的其它痘苗病毒毒株，步骤c)可以尤其在+35℃和+38℃之间进行1至4天。
在步骤d)中，从培养物上清液和/或包装细胞中收集步骤c)中生产的痘病毒(特别是痘苗病毒)。当从包装细胞(和任选也从培养物上清液)中收集痘病毒(特别是痘苗病毒)时，步骤d)之前可以有允许破坏所述包装细胞膜的步骤。该步骤导致从包装细胞释放痘病毒(特别是痘苗病毒)。包装细胞膜的破坏可以通过本领域技术人员熟知的各种技术来诱导，包括但不限于：冷冻/解冻、低渗裂解、超声处理、微流化或高速匀浆。
然后可以使用本领域熟知的纯化步骤进一步纯化痘病毒(特别是痘苗病毒)，例如：
·用至少一种核酸酶处理以除去包装细胞DNA，
·用至少一种蛋白酶处理以除去包装细胞蛋白质，
·用超速离心(特别是通过氯化铯梯度)、过滤(特别是深度过滤)或色谱法(特别是离子交换层析)将痘病毒(特别是痘苗病毒)与污染物分离。
在本发明的优选实施方案中，所述制剂中存在的痘苗病毒是在CEF上扩增的MVA病毒(特别是在WO90/10459、WO92/07000、WO95/09241、WO98/04705、WO99/03885、WO2004/111082、WO2007/121894、WO2014/009438和WO2014/009433)，更优选地在CEF上扩增的MVA病毒(特别是在WO90/10459、WO92/07000、WO95/09241、WO98/04705、WO99/03885、WO2004/111082、WO2007/121894、WO2014/009438和WO2014/009433中公开的那些))尚未经历用至少一种蛋白酶处理的步骤。
在另一个优选的实施方案中，所述制剂中存在的痘苗病毒是在永生化禽细胞系中扩增的MVA病毒(特别是WO90/10459、WO92/07000、WO95/09241、WO98/04705、WO99/03885、WO2004/111082、WO2007/121894、WO2014/009438和WO2014/009433)，所述永生化禽细胞系包括包含编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列的疣鼻栖鸭(cairina moschata)永生化禽细胞系、包含E1A核酸序列和编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列的疣鼻栖鸭永生化禽细胞系、DF1细胞系、Ebx细胞系或DEC99细胞系，更优选地在永生化禽细胞系(包括上述那些)中扩增的MVA病毒(特别是WO90/10459、WO92/07000、WO95/09241、WO98/04705、WO99/03885、WO2004/111082、WO2007/121894、WO2014/009438和WO2014/009433中公开的那些)尚未经历至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤。
在另一个优选的实施方案中，存在于所述制剂中的痘苗病毒是在Hela细胞中扩增的惠氏或哥本哈根痘苗病毒(特别是在WO2007/030668、WO2008/113078、WO2009/065546、WO2009/065547中公开的那些)，更优选在Hela细胞中扩增的惠氏或哥本哈根痘苗病毒(特别是在WO2007/030668、WO2008/113078、WO2009/065546、WO2009/065547中公开的那些)已经经历至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤。
pH和缓冲剂
根据本发明的液体制剂具有6.5至8.5之间的pH。特别地，根据本发明的液体制剂可以具有包含6.5至8.4之间、6.5至8.3之间、6.5至8.2之间、6.5至8.1之间、6.5至8.0之间、6.5至7.9之间、6.5至7.8之间的pH、6.5至7.7之间、6.5至7.6之间、6.5至7.5之间、6.6至8.5之间、6.6至8.4之间、6.6至8.3之间、6.6至8.2之间、6.6至8.1之间、6.6至8.0之间、6.6至7.9之间、6.6至7.8之间、6.6至7.7之间、6.6至7.6之间、6.6至7.5之间、在6.7至8.5之间、6.7至8.4之间、6.7至8.3之间、6.7至8.2之间、6.7至8.1之间、6.7至8.0之间、6.7至7.9之间、6.7至7.8之间、6.7至7.7之间、6.7至7.6之间、6.7至7.5之间、6.8至8.5之间、6.8至8.4之间、6.8至8.3之间、6.8至8.2之间、6.8至8.1之间、6.8至8.0之间、6.8至7.9之间、6.8至7.8之间、6.8至7.7之间、6.8至7.6之间、6.8至7.5之间、6.9至8.5之间、6.9至8.4之间、6.9至8.3之间、6.9至8.2之间、6.9至8.1之间、6.9至8.0之间、6.9至7.9之间、6.9至7.8之间、6.9与7.7之间、6.9至7.6之间、6.9至7.5之间、7至8.5之间、7至8.4之间、7至8.3之间、7至8.2之间、7至8.1之间、7至8之间、7至7.9之间、7至7.8之间、7至7.7之间、7至7.6之间、7至7.5之间、7.1至8.5之间、7.1至8.5之间、7.1至8.4之间、7.1至8.3之间、7.1至8.2之间、7.1至8.1之间、7.1至8之间、7.1至7.9之间、7.1至7.8之间、7.1至7.6之间、7.1至7.5之间、7.2至8.5之间、7.2至8.4之间、7.2至8.3之间、7.2至8.2之间、7.2至8.1之间、7.2至8之间、7.2至7.9之间、7.2至7.8之间、7.2至7.7之间、7.2至7.6之间、7.2至7.5之间、7.3至8.5之间、7.3至8.4之间、7.3至8.3之间、7.3至8.2之间、7.3至8.1之间、7.3至8之间、7.3至7.9之间、7.3至7.8之间、7.3至7.7之间、7.3至7.6之间、7.3至7.5之间、7.4至8.5之间、7.4至8.4之间、7.4至8.3之间、7.4至8.2之间、7.4至8.1之间、7.4至8之间、7.4至7.9之间、7.4至7.8之间、7.4至7.7之间、7.4至7.6之间、7.4至7.5之间、7.5至8.5之间、7.5至8.4之间、7.5至8.3之间、7.5至8.2之间、7.5至8.1之间、7.5至8之间、7.5至7.9之间、7.5至7.8之间、7.5至7.7之间或7.5至7.6之间的pH。优选地，根据本发明的液体制剂具有7至8之间的pH，更特别地接近7.5，特别是7.2至7.8之间、7.3至7.7之间、7.4至7.6之间或约7.5。
为了保持该pH，根据本发明的所述液体制剂包含在所述制剂的pH下具有缓冲能力的缓冲剂。这样的缓冲剂是本领域技术人员所熟知的，并且尤其包括以下缓冲剂：
·TRIS-HCl(三(羟甲基)甲胺-HCl)，
·TRIS(三(羟甲基)甲胺)，
·HEPES(4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸)，
·含有Na2HPO4和KH2PO4的混合物或Na2HPO4和NaH2PO4的混合物的磷酸盐缓冲剂，
·ACES(N-(2-乙酰氨基)-氨基乙磺酸)，
·PIPES(哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸))，
·MOPSO(3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸)，
·BIS-三-丙烷(1,3-双[三(羟甲基)-甲胺基]丙烷)，
·BES(N,N-双(2-羟乙基)2-氨基乙磺酸)
·MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)，
·TES(2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸)，
·DIPSO(3-[双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸)，
·MOBS(4-(N-吗啉代)丁烷磺酸)，
·TAPSO(3-[N-三(羟甲基)甲胺基]-2-羟基丙磺酸)，
·HEPPSO(4-(2-羟乙基)-哌嗪-1-(2-羟基)-丙磺酸)，
·POPSO(2-羟基-3-[4-(2-羟基-3-磺丙基)哌嗪-1-基]丙烷-1-磺酸)，
·TEA(三乙醇胺)，
·EPPS(N-(2-羟乙基)-哌嗪-N'-3-丙磺酸)，和
·TRICINE(N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸)。
优选地，所述缓冲剂选自TRIS-HCl、TRIS、Tricine、HEPES和磷酸盐缓冲剂，所述磷酸盐缓冲剂包含Na2HPO4和KH2PO4的混合物或Na2HPO4和NaH2PO4的混合物。更优选地，所述缓冲剂选自TRIS-HCl、TRIS或Tricine缓冲剂，并且更优选地，所述缓冲剂是TRIS-HCl或TRIS缓冲剂，甚至更优选地，所述缓冲剂是TRIS-HCl缓冲剂。
所述缓冲剂(特别是上面提到的那些，尤其是TRIS-HCl)优选以10至50mM的浓度存在。它可以尤其以10至45mM、10至40mM、10至35mM、10至30mM、10至25mM、10至20mM、10至15mM、15至50mM、15至45mM、15至40mM、15至35mM、15至30mM、15至25mM、15至20mM、20至50mM、20至45mM、20至40mM、20至35mM、20至30mM、20至25mM、25至50mM、25至45mM、25至40mM、25至35mM、25至30mM、30至50mM、30至45mM、30至40mM、30至35mM、35至50mM、35至45mM、35至40mM、40至50mM、40至45mM或45至50mM的浓度存在。优选地，所述缓冲剂(特别是上述提到的那些，尤其是TRIS-HCl)优选以10至40mM，特别是10至30mM的浓度存在。
单价盐
根据本发明的液体制剂包含单价盐。这种单价盐被认为确保适当的渗透压(osmotic pressure)。此外，所述单价盐也被认为具有可能存在于所述制剂中的蛋白酶的抑制特性，从而提高稳定性。这种蛋白酶包括当破坏包装细胞时释放的细胞蛋白酶，并且当存在于所述制剂中的痘苗病毒已经通过涉及使用蛋白酶的方法被纯化，剩余痕量的所述添加的蛋白酶。本领域已经记载了显著单价盐浓度对蛋白酶的抑制作用(参见
Figure GDA0001559831270000221
等，Eur J Biochem.1994Jun，222(2)：475-81)。例如，对于皮尔斯胰蛋白酶(pierce trypsinprotease)(Thermo Scientific)，制造商在说明中指出，高单价盐浓度，如>100mM NaCl，可能会干扰胰蛋白酶活性。
所述单价盐可以尤其选自NaCl和KCl，优选所述单价盐是NaCl。
所述单价盐(特别是NaCl)优选以10至1000mM的浓度存在。其可以以10至950mM、10至900mM、10至850mM、10至800mM、10至750mM、10至700mM、10至650mM、10至600mM、10至550mM、10至500mM、10至450mM、10至400mM、10至350mM、10至300mM、10至250mM、10至200mM、10至150mM、10至100mM、10至90mM、10至80mM、10至75mM、10至70mM、10至60mM、10至50mM、10至40mM、10至30mM、10至25mM、10至20mM、20至1000mM、20至950mM、20至900mM、20至850mM、20至800mM、20至750mM、20至700mM、20至650mM、20至600mM、20至550mM、20至500mM、20至450mM、20至400mM、20至350mM、20至300mM、20至250mM、20至200mM、20至150mM、20至100mM、20至90mM、20至80mM、20至75mM、20至70mM、20至60mM、20至50mM、20至40mM、20至30mM、20至25mM、25至1000mM、25至950mM、25至900mM、25至850mM、25至800mM、25至750mM、25至700mM、25至650mM、25至600mM、25至550mM、25至500mM、25至450mM、25至400mM、25至350mM、25至300mM、25至250mM、25至200mM、25至150mM、25至100mM、25至90mM、25至80mM、25至75mM、25至70mM、25至60mM、25至50mM、25至40mM、25至30mM、30至1000mM、30至950mM、30至900mM、30至850mM、30至800mM、30至750mM、30至700mM、30至650mM、30至600mM、30至550mM、30至500mM、30至450mM、30至400mM、30至350mM、30至300mM、30至250mM、30至200mM、30至150mM、30至100mM、30至90mM、30至80mM、30至75mM、30至70mM、30至60mM、30至50mM、30至40mM、40至1000mM、40至950mM、40至900mM、40至850mM、40至800mM、40至750mM、40至700mM、40至650mM、40至600mM、40至550mM、40至500mM、40至450mM、40至400mM、40至350mM、40至300mM、40至250mM、40至200mM、40至150mM、40至100mM、40至90mM、40至80mM、40至75mM、40至70mM、40至60mM、40至50mM、50至1000mM、50至950mM、50至900mM、50至850mM、50至800mM、50至750mM、50至700mM、50至650mM、50至600mM、50至550mM、50至500mM、50至450mM、50至400mM、50至350mM、50至300mM、50至250mM、50至200mM、50至150mM、50至100mM、50至90mM、50至80mM、50至75mM、50至70mM、50至60mM、60至1000mM、60至950mM、60至900mM、60至850mM、60至800mM、60至750mM、60至700mM、60至650mM、60至600mM、60至550mM、60至500mM、60至450mM、60至400mM、60至350mM、60至300mM、60至250mM、60至200mM、60至150mM、60至100mM、60至90mM、60至80mM、60至75mM、60至70mM、70至1000mM、70至950mM、70至900mM、70至850mM、70至800mM、70至750mM、70至700mM、70至650mM、70至600mM、70至550mM、70至500mM、70至450mM、70至400mM、70至350mM、70至300mM、70至250mM、70至200mM、70至150mM、70至100mM、70至90mM、70至80mM、70至75mM、75至1000mM、75至950mM、75至900mM、75至850mM、75至800mM、75至750mM、75至700mM、75至650mM、75至600mM、75至550mM、75至500mM、75至450mM、75至400mM、75至350mM、75至300mM、75至250mM、75至200mM、75至150mM、75至100mM、75至90mM、75至80mM、80至1000mM、80至950mM、80至900mM、80至850mM、80至800mM、80至750mM、80至700mM、80至650mM、80至600mM、80至550mM、80至500mM、80至450mM、80至400mM、80至350mM、80至300mM、80至250mM、80至200mM、80至150mM、80至100mM、80至90mM、90至1000mM、90至950mM、90至900mM、90至850mM、90至800mM、90至750mM、90至700mM、90至650mM、90至600mM、90至550mM、90至500mM、90至450mM、90至400mM、90至350mM、90至300mM、90至250mM、90至200mM、90至150mM、90至100mM、100至1000mM、100至950mM、100至900mM、100至850mM、100至800mM、100至750mM、100至700mM、100至650mM、100至600mM、100至550mM、100至500mM、100至450mM、100至400mM、100至350mM、100至300mM、100至250mM、100至200mM、100至150mM、150至1000mM、150至950mM、150至900mM、150至850mM、150至800mM、150至750mM、150至700mM、150至650mM、150至600mM、150至550mM、150至500mM、150至450mM、150至400mM、150至350mM、150至300mM、150至250mM、150至200、200至1000mM、200至950mM、200至900mM、200至850mM、200至800mM、200至750mM、200至700mM、200至650mM、200至600mM、200至550mM、200至500mM、200至450mM、200至400mM、200至350mM、200至300mM、200至250mM、250至1000mM、250至950mM、250至900mM、250至850mM、250至800mM、250至750mM、250至700mM、250至650mM、250至600mM、250至550mM、250至500mM、250至450mM、250至400mM、250至350mM、250至300mM、300至1000mM、300至950mM、300至900mM、300至850mM、300至800mM、300至750mM、300至700mM、300至650mM、300至600mM、300至550mM、300至500mM、300至450mM、300至400mM、300至350mM、350至1000mM、350至950mM、350至900mM、350至850mM、350至800mM、350至750mM、350至700mM、350至650mM、350至600mM、350至550mM、350至500mM、350至450mM、350至400mM、400至1000mM、400至950mM、400至900mM、400至850mM、400至800mM、400至750mM、400至700mM、400至650mM、400至600mM、400至550mM、400至500mM、400至450mM、450至1000mM、450至950mM、450至900mM、450至850mM、450至800mM、450至750mM、450至700mM、450至650mM、450至600mM、450至550mM、或450至500mM的浓度存在。
MVA(特别是WO90/10459、WO92/07000、WO95/09241、WO98/04705、WO99/03885、WO2004/111082、WO2007/121894、WO2014/009438和WO2014/009433中公开的那些)通常在原代禽细胞中扩增，在这种情况下由于原代细胞不被认为是危险的，所以不需要蛋白酶处理来消除原代禽细胞蛋白质。因此，对于MVA，更通常地，当所述制剂中存在的所述痘病毒(优选痘苗病毒)已经通过不涉及至少一种蛋白酶处理的方法纯化时，所述单价盐(特别是NaCl)可以以相对低浓度存在，尤其是浓度为10至200mM、10至150mM、10至100mM、10至90mM、10至80mM、10至75mM、20至200mM、20至150mM、20至100mM、20至90mM、20至80mM、20至75mM、25至200mM、25至150mM、25至100mM、25至90mM、25至80mM、25至75mM、30至200mM、30至150mM、30至100mM、30至90mM、30至80mM、30至75mM、40至200mM、40至150mM、40至100mM、40至90mM、40至80mM、40至75mM、50至200mM、50至150mM、50至100mM、50至90mM、50至80mM、50至75mM、60至200mM、60至150mM、60至100mM、60至90mM、60至80mM、60至75mM、70至200mM、70至150mM、70至100mM、70至90mM、70至80mM、或70至75mM、更优选地浓度接近75mM，例如50至100mM、60至90mM、70至80mM或约75mM。
痘病毒的其他毒株，并且尤其是溶瘤痘苗病毒，例如惠氏或哥本哈根痘苗病毒(尤其是WO2007/030668、WO2008/113078、WO2009/065546、WO2009/065547中公开的)，通常在各种永生化细胞系上扩增。这些细胞系中的一些可能含有致癌基因，并且消除或至少大大降低了在这种情况下为健康细胞所必需的生产细胞DNA和蛋白质。为此，纯化方法通常包括至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤。特别是在液体制剂中，剩余痕量的蛋白酶可能对痘苗病毒稳定性具有有害影响。在这方面，本发明人发现增加所述单价盐(特别是NaCl)的浓度导致痘苗病毒的稳定性提高。不受理论的约束，认为所述单价盐(特别是NaCl)的浓度增加对剩余痕量的蛋白酶具有抑制作用。
因此，当所述制剂中存在的所述痘病毒(特别是痘苗病毒)已经通过涉及至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤的方法纯化时，所述单价盐(特别是NaCl)优选以浓度100至1000mM、100至950mM、100至900mM、100至850mM、100至800mM、100至750mM、100至700mM、100至650mM、100至600mM、100至550mM、100至500mM、100至450mM、100至400mM、100至350mM、100至300mM、100至250mM、100至200mM、150至1000mM、150至950mM、150至900mM、150至850mM、150至800mM、150至750mM、150至700mM、150至650mM、150至600mM、150至550mM、150至500mM、150至450mM、150至400mM、150至350mM、150至300mM、150至250mM、150至200、200至1000mM、200至950mM、200至900mM、200至850mM、200至800mM、200至750mM、200至700mM、200至650mM、200至600mM、200至550mM、200至500mM、200至450mM、200至400mM、200至350mM、20 0至300mM、200至250mM、250至1000mM、250至950mM、250至900mM、250至850mM、250至800mM、250至750mM、250至700mM、250至650mM、250至600mM、250至550mM、250至500mM、250至450mM、250至400mM、250至350mM、250至300mM、300至1000mM、300至950mM、300至900mM、300至850mM、300至800mM、300至750mM、300至700mM、300至650mM、300至600mM、300至550mM、300至500mM、300至450mM、300至400mM、300至350mM、350至1000mM、350至950mM、350至900mM、350至850mM、350至800mM、350至750mM、350至700mM、350至650mM、350至600mM、350至550mM、350至500mM、350至450mM、350至400mM、400至1000mM、400至950mM、400至900mM、400至850mM、400至800mM、400至750mM、400至700mM、400至650mM、400至600mM、400至550mM、400至500mM、400至450mM、450至1000mM、450至950mM、450至900mM、450至850mM、450至800mM、450至750mM、450至700mM、450至650mM、450至600mM、450至550mM或450至500mM存在。例如，所述单价盐可以以接近200mM的浓度存在，例如100至300mM、150至250mM或约200mM。或者，所述单价盐可以以接近500mM的浓度存在，例如250至750mM、400至600mM或约500mM。在另一个实施方案中，所述单价盐可以以接近750mM的浓度存在，例如500至1000mM、700至800mM或约750mM。
二糖或糖醇
根据本发明的液体制剂包含药学上可接受的二糖或糖醇。
这种药学上可接受的二糖或糖醇是冷冻保护剂，并且被认为在低储存温度(例如约+5℃)下保护所述痘病毒(特别是痘苗病毒)。此外，这种药学上可接受的二糖或糖醇增加所述液体制剂的粘度，这可能限制痘病毒(特别是痘苗病毒)和潜在的有害化合物之间的相互作用。
所述药学上可接受的二糖或糖醇可以尤其选自蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇和山梨醇，优选所述药学上可接受的二糖或糖醇是蔗糖。
所述药学上可接受的二糖或糖醇(特别是上面提到的那些，尤其是蔗糖)优选以5至20％的浓度(以克计的重量/以升计的体积，称为w/v)存在。特别地，其可以以5至19％(w/v)、5至18％(w/v)、5至17％(w/v)、5至16％(w/v)、5至15％(w/v)、5至14％(w/v)、5至13％(w/v)、5至12％(w/v)、5至11％(w/v)、5至10％(w/v)、6至20％(w/v)、6至19％(w/v)、6至18％(w/v)、6至17％(w/v)、6至16％(w/v)、6至15％(w/v)、6至14％(w/v)、6至13％(w/v)、6至12％(w/v)、6至11％(w/v)、6至10％(w/v)、7至20％(w/v)、7至19％(w/v)、7至18％(w/v)、7至17％(w/v)、7至16％(w/v)、7至15％(w/v)、7至14％(w/v)、7至13％(w/v)、7至12％(w/v)、7至11％(w/v)、7至10％(w/v)、8至20％(w/v)、8至19％(w/v)、8至18％(w/v)、8至17％(w/v)、8至16％(w/v)、8至15％(w/v)、8至14％(w/v)、8至13％(w/v)、8至12％(w/v)、8至11％(w/v)、8至10％(w/v)、9至20％(w/v)、9至19％(w/v)、9至18％(w/v)、9至17％(w/v)、9至16％(w/v)、9至15％(w/v)、9至14％(w/v)、9至13％(w/v)、9至12％(w/v)、9至11％(w/v)或9至10％(w/v)的浓度存在。优选地，所述药学上可接受的二糖或糖醇(特别是上面提及的那些，尤其是蔗糖)优选以接近10％(w/v)的浓度存在，例如5至15％(w/v)、6至14％(w/v)、7至13％(w/v)、8至12％(w/v)、9至11％(w/v)或约10％。
螯合剂
根据本发明的液体制剂包含药学上可接受的螯合剂，特别是双阳离子螯合剂(agent chelating dication)。
所述药学上可接受的螯合剂提高液态的痘病毒(特别是痘苗病毒)的稳定性的原因尚不非常清楚。
实际上，如背景技术部分所述，EDTA对病毒稳定性的影响在不同的病毒之间显著不同，并且EDTA对其有益的病毒与EDTA对其无益或甚至轻易产生有害作用的病毒没有明显的分类。特别地，虽然已经发现腺病毒(非包膜DNA病毒，参见EVANS等J PharmSci.2004Oct，93(10)：2458-75；和US7,456,009)具有显著的有益效果，但已经发现对流感病毒(包膜RNA病毒，参见US2007/0161085)、犬细小病毒(非包膜DNA病毒)、犬2型腺病毒(非包膜DNA病毒)、犬瘟热病毒(包膜RNA副粘液病毒)和犬副流感病毒(包膜RNA副粘病毒)(参见WO2014/029702)没有显著的益处。最后，已经发现对新城疫病毒(包膜RNA副粘液病毒，参见US7,914,979)有有害的作用。
然而，如实验部分所示，所述药学上可接受的螯合剂在根据本发明的液体制剂中在痘病毒(特别是痘苗病毒)的稳定中具有重要作用。
所述药学上可接受的螯合剂可以尤其选自乙二胺四乙酸(EDTA)、1,2-双(邻-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二巯基琥珀酸(DMSA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)，优选所述药学上可接受的螯合剂是EDTA。
所述药学上可接受的螯合剂(特别是上述那些，尤其是EDTA)优选以至少50μM的浓度存在。特别地，它可以以50至1000μM、50至750μM、50至500μM、50至400μM、50至300μM、50至250μM、50至200μM、50至150μM、50至100μM、50至75μM、75至1000μM、75至750μM、75至500μM、75至400μM、75至300μM、75至250μM、75至200μM、75至150μM；75至100μM、100至1000μM、100至750μM、100至500μM、100至400μM、100至300μM、100至250μM、100至200μM、100至150μM、150至1000μM、150至750μM、150至500μM、150至400μM、150至300μM、150至250μM、150至200μM的浓度存在。所述药学上可接受的螯合剂(特别是上面提到的那些，尤其是EDTA)可以尤其以接近150μM的浓度存在，例如50至250μM、100至200μM或约150μM。然而，可能存在更高的浓度，因为即使在低浓度下也没有观察到对稳定性有害的影响。
可选额外成分
根据本发明的液体制剂还可以包含对痘苗病毒具有稳定作用的额外化合物。
C2-C3醇
虽然药学上可接受的缓冲剂的存在允许具有pH在6.5至8.5之间，但已经发现单价盐、药学上可接受的二糖或糖醇以及药学上可接受的螯合剂对于液态的痘苗病毒的稳定是必需的，本发明人还发现额外存在的低浓度的C2-C3醇，虽然对于痘苗病毒的稳定不是必需的，其与螯合剂的存在协同作用以进一步提高液态的痘苗病毒的稳定性。相反，相同C2-C3醇的浓度过高对液态的痘苗病毒的稳定性具有有害影响。因此，根据本发明的所述液体制剂优选还包含浓度为0.05至5％(体积/体积或v/v)的C2-C3醇。这个发现是非常意料不到的，因为痘病毒(特别是痘苗病毒)是包膜病毒，与非包膜病毒(如腺病毒)的情况相反，极性溶剂的添加可能会期待改变所述包膜。
所述C2-C3醇可以尤其选自乙醇和异丙醇，优选地所述C2-C3醇是乙醇。
所述C2-C3醇(特别是上述的那些，尤其是乙醇)可以以0.05至5％(v/v)、0.05至4％(v/v)、0.05至3％(v/v)、0.05至2％(v/v)、0.05至1％(v/v)、0.05至0.9％(v/v)、0.05至0.8％(v/v)、0.05至0.7％(v/v)、0.05至0.6％(v/v)、0.05至0.5％(v/v)、0.1至5％(v/v)、0.1至4％(v/v)、0.1至3％(v/v)、0.1至2％(v/v)、0.1至1％(v/v)、0.1至0.9％(v/v)、0.1至0.8％(v/v)、0.1至0.7％(v/v)、0.1至0.6％(v/v)、0.1至0.5％(v/v)、0.2至5％(v/v)、0.2至4％(v/v)、0.2至3％(v/v)、0.2至2％(v/v)、0.2至1％(v/v)、0.2至0.9％(v/v)、0.2至0.8％(v/v)、0.2至0.7％(v/v)、0.2-0.6％(v/v)、0.2-0.5％(v/v)、0.3-5％(v/v)、0.3-4％(v/v)、0.3-3％(v/v)、0.3至2％(v/v)、0.3至1％(v/v)、0.3至0.9％(v/v)、0.3至0.8％(v/v)、0.3至0.7％(v/v)、0.3至0.6％(v/v)、0.3至0.5％(v/v)、0.4至5％(v/v)、0.4至4％(v/v)、0.4至3％(v/v)、0.4至2％(v/v)、0.4至1％(v/v)、0.4至0.9％(v/v)、0.4至0.8％(v/v)、0.4至0.7％(v/v)v)、0.4至0.6％(v/v)、0.4至0.5％(v/v)、0.5至5％(v/v)、0.5至4％(v/v)、0.5至3％(v/v)、0.5至2％(v/v)、0.5至1％(v/v)、0.5至0.9％(v/v)、0.5至0.8％(v/v)、0.5至0.7％(v/v)或0.5至0.6％(v/v)的浓度存在。优选地，所述C2-C3醇(特别是上面提到的那些，尤其是乙醇)以不超过2％(v/v)的浓度存在(特别是上面公开的具有更高值至多2％的任何范围)，以及更优选地接近0.5％(v/v)，例如0.1至1％(v/v)、0.1至0.9％(v/v)、0.2至0.8％(v/v)、0.3至0.7％v)、0.4至0.6％(v/v)、最优选约0.5％(v/v)。
谷氨酸钠
虽然其稳定效果不太明显，但根据本发明的所述液体制剂还可以包含浓度低于10mM的谷氨酸钠，例如0至10mM、0至9mM、0至8mM、0至7.5mM、0至7mM、0至6.5mM、0至6mM、0至5.5mM、0至5mM、1至10mM、1至9mM、1至8mM、1至7.5mM、1至7mM、1至6.5mM、1至6mM、1至5.5mM、1至5mM、2至10mM、2至9mM、2至8mM、2至7.5mM、2至7mM、2至6.5mM、2至6mM、2至5.5mM、2至5mM、2.5至10mM、2.5至9mM、2.5至8mM、2.5至7.5mM、2.5至7mM、2.5至6.5mM、2.5至6mM、2.5至5.5mM、2.5至5mM、3至10mM、3至9mM、3至8mM、3至7.5mM、3至7mM、3至6.5mM、3至6mM、3至5.5mM、3至5mM、3.5至10mM、3.5至9mM、3.5至8mM、3.5至7.5mM、3.5至7mM、3.5至6.5mM、3.5至6mM、3.5至5.5mM、3.5至5mM、4至10mM、4至9mM、4至8mM、4至7.5mM、4至7mM、4至6.5mM、4至6mM、4至5.5mM、4至5mM、4.5至10mM、4.5至9mM、4.5至8mM、4.5至7.5mM、4.5至7mM、4.5至6.5mM、4.5至6mM、4.5至5.5mM、4.5至5mM、5至10mM、5至9mM、5至8mM、5至7.5mM、5至7mM、5至6.5mM、5至6mM或5至5.5mM。
特别地，本发明人已经发现，尤其是对于MVA，浓度为约5mM的谷氨酸钠的存在是最佳的。因此当谷氨酸钠存在于根据本发明的液体制剂中时，其优选以接近5mM的浓度存在，例如2.5至7.5mM、3至7mM、3.5至6.5mM、4至6mM、4.5至5.5mM，更优选约5mM。
潜在排除的化合物
表面活性剂
已经显示非离子表面活性剂诱导液体中各种病毒的稳定(参见EVANS等J PharmSci.2004Oct，93(10)：2458-75，US7,456,009，SHI等J Pharm Sci2005Jul，94(7)：1538-51，US2007/0161085)。
然而对于痘苗病毒，本发明人发现低浓度的表面活性剂(如非离子表面活性剂吐温80(也称为聚山梨醇酯80))的存在没有有益效果，并且浓度高于0.02％(v/v)甚至高于0.005％(v/v)对痘苗病毒的稳定性有害(参见实施例1)。
如果根据本发明的液体组合物中存在聚山梨醇酯，或更通常为非离子表面活性剂或甚至任何表面活性剂，则其应以低于0.1％，优选低于0.05％(v/v)、低于0.03％(v/v)、低于0.02％(v/v)、低于0.01％(v/v)、低于0.009％(v/v)、低于0.008％(v/v)、低于0.007％(v/v)、低于0.006％(v/v)、低于0.005％(v/v)、低于0.004％(v/v)、低于0.003％(v/v)、低于0.002％(v/v)、或甚至低于0.001％(v/v)的浓度存在。
在根据本发明的液体组合物的另一个优选实施方案中，所述液体组合物不含聚山梨醇酯，或更通常不含非离子表面活性剂，或甚至更通常不含任何表面活性剂。
在优选的实施方案中，根据本发明的所述液体制剂不含表面活性剂或包含浓度低于0.1％、优选低于0.05％(v/v)、低于0.04％(v/v)、低于0.03％(v/v)、低于0.02％(v/v)、低于0.01％(v/v)、低于0.009％(v/v)、低于0.008％(v/v)、低于0.007％(v/v)、低于0.006％(v/v)、低于0.005％(v/v)、低于0.004％(v/v)、低于0.003％(v/v)低于0.002％(v/v)、或甚至低于0.001％(v/v)的表面活性剂。
二价盐
已经发现二价盐(例如MgCl2或CaCl2)诱导液态中各种病毒的稳定(参见EVANS等，JPharm Sci.2004Oct，93(10)：2458-75和US7,456,009)。在这种情况下，二价阳离子以至少0.5mM(优选至少1mM)的浓度存在于液体制剂中。
然而发明人发现二价盐的存在对痘苗病毒稳定性没有高的有益效果(参见实施例1)，而在较高浓度(至少75mM)下具有有害作用。因此，根据本发明的液体制剂可以不含MgCl2和/或CaCl2，或更通常不含二价盐。
然而，由于二价阳离子似乎对痘苗病毒在低浓度下的稳定性没有有害影响，所以这种二价阳离子可以存在于根据本发明的液体制剂中，特别是在低浓度下。当这种二价阳离子(特别是MgCl2或CaCl2)存在于根据本发明的液体制剂中时，它们优选以低于100mM，优选低于90mM、低于80mM、低于75mM、低于70mM、低于60mM、低于50mM、低于45mM、低于40mM、低于35mM、低于30mM、低于25mM、低于20mM、低于15mM、低于10mM、低于9mM、低于8mM、低于7mM、低于6mM、低于5mM、低于4mM、低于3mM、低于2mM，更优选低于1mM、低于0.9mM、低于0.8mM、低于0.7mM、低于0.6mM、低于0.5mM的浓度存在。
在优选的实施方案中，根据本发明的所述液体制剂不含二价盐，或包含浓度低于100mM的二价盐，优选低于90mM、低于80mM、低于75mM、低于70mM、低于60mM、低于50mM、低于45mM、低于40mM、低于35mM、低于30mM、低于25mM、低于20mM、低于15mM、低于10mM、低于9mM、低于8mM、低于7mM、低于6mM、低于5mM、低于4mM、低于3mM、低于2mM，更优选低于1mM、低于0.9mM、低于0.8mM、低于0.7mM、低于0.6mM、低于0.5mM。
除谷氨酸以外的氨基酸
已经发现氨基酸，特别是组氨酸、精氨酸或甲硫氨酸诱导液态各种病毒的稳定性(参见EVANS等J Pharm Sci.2004Oct，93(10)：2458-75，US7,456,009，US2007/0161085，US7,914,979，WO2014/029702，WO2014/053571)。当组氨酸存在于液体制剂中以提高稳定性时，组氨酸通常以至少5mM，并且优选至少10mM的浓度存在(参见EVANS等J PharmSci.2004Oct，93(10)：2458-75，US7,456,009，WO2014/029702)。当精氨酸存在于液体制剂中以提高稳定性时，精氨酸通常以至少50mM的浓度存在(参见US2007/0161085，至少1％(w/v)精氨酸对应于至少约57.4mM)，和有时优选至少150mM，特别是约300mM(参见WO2014/029702)。当甲硫氨酸存在于液体制剂中以提高稳定性时，甲硫氨酸通常以至少25mM，并且优选约67mM的浓度存在(参见WO2014/029702)。
然而，本发明人发现除了谷氨酸之外的氨基酸(精氨酸、组氨酸或通常的氨基酸)的存在对痘苗病毒的稳定性没有有益的影响(参见实施例1)。
因此，根据本发明的液体制剂可以不含组氨酸。或者或此外，根据本发明的液体制剂可以不含精氨酸。或者或此外，根据本发明的液体制剂可以不含甲硫氨酸。特别地，根据本发明的液体制剂可以不含精氨酸和甲硫氨酸，或甚至不含组氨酸、精氨酸和甲硫氨酸。更通常地，根据本发明的液体制剂可以不含谷氨酸以外的氨基酸。
然而，虽然没有有益效果，但是除了谷氨酸钠以外的这些氨基酸没有发现具有有害作用，因此可以存在于根据本发明的液体制剂中，特别是在低浓度下。
当组氨酸存在于根据本发明的液体制剂中时，它优选以低于10mM，优选低于9mM、低于8mM、低于7.5mM、低于7mM、低于6mM或甚至低于5mM的浓度存在。
类似地，当精氨酸存在于根据本发明的液体制剂中时，优选以低于300mM，优选低于150mM、低于100mM、低于75mM或甚至低于50mM的浓度存在。
此外，当甲硫氨酸存在于根据本发明的液体制剂中时，优选以低于60mM，优选低于50mM、低于40mM、低于30mM或甚至低于25mM的浓度存在。
更通常地，当根据本发明的液体制剂中存在一种或多种除了谷氨酸钠之外的氨基酸时，它们优选以低于300mM，优选低于150mM、低于100mM、低于75mM、低于50mM、低于40mM、低于30mM、低于25mM、低于20mM、低于10mM、低于9mM、低于8mM、低于7.5低于7mM、低于6mM或甚至低于5mM的浓度存在。
在优选的实施方案中，根据本发明的所述液体制剂不含组氨酸，或包含浓度低于10mM，优选低于9mM、低于8mM、低于7.5mM、低于7mM、低于6mM或甚至低于5mM的组氨酸。
在优选的实施方案中，根据本发明的所述液体制剂不含精氨酸或包含浓度低于300mM，优选低于150mM、低于100mM、低于75mM或甚至低于50mM的精氨酸。
在优选的实施方案中，根据本发明的所述液体制剂不含甲硫氨酸或包含浓度低于60mM，优选低于50mM、低于40mM、低于30mM或甚至低于25mM的甲硫氨酸。
在优选的实施方案中，根据本发明的所述液体制剂不含谷氨酸钠以外的氨基酸，或包含浓度低于300mM，优选低于150mM、低于100mM、低于75mM、低于50mM、低于40mM、低于30mM、低于25mM、低于20mM、低于10mM、低于9mM、低于8mM、低于7.5mM、低于7mM、低于6mM或甚至低于5mM的谷氨酸钠以外的氨基酸。
尿素
本发明人还发现，尿素对痘苗病毒稳定性没有有益的影响(见实施例1)。
因此，根据本发明的液体制剂可优选不含尿素。
高分子量聚合物
冻干的病毒制剂通常含有高分子量聚合物如葡聚糖或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，其有助于在冻干过程中形成饼(cake)(参见EP1418942和WO2014/053571)。
然而，这种高分子量聚合物不能用于液态痘苗病毒的稳定，并且因此根据本发明的液体制剂可以不含这种高分子量聚合物。如果存在于根据本发明的液体制剂中，它们优选以低于10g/L，优选低于7.5g/L、低于5g/L、低于2.5g/L或甚至低于1克/升的浓度存在。
在优选的实施方案中，根据本发明的所述液体制剂因此不含葡聚糖、PVP或更通常的高分子量聚合物，或者包含浓度低于10g/L，优选低于7.5g/L、低于5g/L、低于2.5g/L或甚至低于1g/L的葡聚糖、PVP或更通常的高分子量聚合物。
动物或人来源的稳定剂
动物或人源稳定剂如血清或明胶已经长时间用于活病毒的稳定(参见US2007/0161085)。然而，动物或人源的这种动物或人来源的稳定剂可能由于病毒或非常规药剂的潜在污染而涉及健康风险。
因此，根据本发明的液体制剂中，这种动物或人来源的稳定剂对于痘苗病毒的稳定性不是必需的，并且根据本发明的液体制剂优选不含动物或人来源的稳定剂，如血清或明胶。
优选制剂
属于根据本发明的所述制剂的每种必需或任选元素的家族的各种具体化合物已在上文具体相关该元素的部分中进行了描述。在本发明的上下文中，针对特定元素和特定元素公开的每种特定化合物的每种列出的合适化合物可以与任何通用的其它元素、针对所述其他元素或针对所述其它元素公开的任何特定化合物的列出的合适化合物组合。
特别地，根据本发明的所述制剂的必需或任选元素的优选实施方案可以与任何通用的其它元素或所述其它元素的优选实施方案组合。
根据本发明的特别优选的制剂包括以下表1中提到的元素、主要由以下表1中提到的元素组成或由以下表1中提到的元素组成：
Figure GDA0001559831270000351
Figure GDA0001559831270000361
Figure GDA0001559831270000371
Figure GDA0001559831270000381
Figure GDA0001559831270000391
Figure GDA0001559831270000401
Figure GDA0001559831270000411
Figure GDA0001559831270000421
表1.根据本发明的优选制剂包括上述元素、基本上由上述元素组成或由上述元素组成。
使用药学上可接受的螯合剂来稳定痘苗病毒以防UV损伤
痘苗病毒对紫外线损伤特别敏感(参见LYTLE等J.Virol.2005,79(22)：14244)。
令人惊奇的是，本发明人发现EDTA对痘苗病毒具有对UV损伤的保护作用(参见实施例6)。因此，本发明还涉及药学上可接受的螯合剂用于稳定痘病毒(特别是痘苗病毒)以防UV损伤的用途。
为了稳定痘病毒(特别是痘苗病毒)以防UV损伤，所述螯合剂优选选自乙二胺四乙酸(EDTA)、1,2-双(邻-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)，二巯基琥珀酸(DMSA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)，优选所述药学上可接受的螯合剂是EDTA。
当使用药学上可接受的螯合剂来稳定痘病毒(特别是痘苗病毒)以防UV损伤时，所述痘病毒(特别是痘苗病毒)优选为液体组合物，并且所述药学上可接受的螯合剂(特别是上述提及的那些以及尤其EDTA)优选以至少50μM，优选50至1000μM、50至750μM、50至500μM、50至400μM、50至300μM、50至250μM、50至200μM、50至150μM、50至100μM、50至75μM、75至1000μM、75至750μM、75至500μM、75至400μM、75至300μM、75至250μM、75至200μM、75至150μM；75至100μM、100至1000μM、100至750μM、100至500μM、100至400μM、100至300μM、100至250μM、100至200μM、100至150μM、150至1000μM、150至750μM、150至500μM、150至400μM、150至300μM、150至250μM或150至200μM的浓度存在。
甚至更优选地，为了稳定痘病毒(特别是痘苗病毒)以防UV损伤，使用根据本发明的液体制剂(如上所述)。
以下实施例仅仅是为了说明本发明。
实施例
实施例1：筛选候选稳定化合物
已经根据现有技术已知的具有其他类型病毒稳定效果的化合物，测试各种候选化合物在+5℃液体制剂中稳定MVA病毒的效果。
材料和方法
病毒
使用以下MVA病毒：
·MVA-MUC1(TG4010)，表达MUC1肿瘤相关抗原和白介素2的重组MVA病毒(参见WO92/07000和WO95/09241)，将其稀释至1-4 108PFU/mL的初始目标浓度。
·MVA-HCV(TG4040)，表达来自HCV基因型1b型毒株ja(参见WO2004/111082)的非结构性HCV蛋白(NS3、NS4和NS5B)的重组MVA病毒，其被稀释至1-4 107PFU/毫升的初始目标浓度。
·MVA-HPV(TG4001)，表达人乳头状瘤病毒E6和E7抗原和白介素2的重组MVA病毒(参见WO90/10459、WO95/09241、WO98/04705、WO99/03885、WO2007/121894)，其被稀释至0.5-2 108PFU/mL的目标浓度。
三种MVA病毒在鸡胚成纤维细胞中产生，并通过包括被感染的CEF培养物的回收、通过机械手段破碎细胞以及不涉及用蛋白酶处理的任何步骤的各种纯化步骤的方法回收和纯化。
还使用在人连续细胞系中生产并通过涉及至少一个用至少一种蛋白酶(惠氏VV)处理的步骤的方法纯化的惠氏毒株的重组痘苗病毒，其初始目标滴度为2 108至2 109PFU/mL。
测试制剂
测试的制剂在下表2至11中表示：
·单价盐存在的有益效果：
0mM NaCl 50mM NaCl
Tris-HCl(mM) 10 10
蔗糖(％w/v) 5 5
谷氨酸钠(mM) 10 10
NaCl(mM) 0 50
pH 8.0 8.0
表2.针对MVA-MUC1测试具有和不具有NaCl的制剂
·EDTA、乙醇或EDTA/乙醇存在的有益效果：
Figure GDA0001559831270000441
Figure GDA0001559831270000451
Figure GDA0001559831270000452
表3.针对MVA-HCV测试具有EDTA、乙醇或EDTA/乙醇的第一制剂
Figure GDA0001559831270000453
Figure GDA0001559831270000454
表4.针对MVA-HCV测试具有EDTA、乙醇或EDTA/乙醇的其他制剂
·低浓度谷氨酸钠的有益效果：
Figure GDA0001559831270000455
Figure GDA0001559831270000461
表5.针对MVA-HCV测定具有谷氨酸钠的制剂
·低浓度蔗糖的有益效果：
蔗糖1.25％ 蔗糖2.5％ 蔗糖5％ 蔗糖7.5％ 蔗糖10％
Tris-HCl(mM) 10 10 10 10 10
谷氨酸钠(mM) 10 10 10 10 10
蔗糖(％w/v) 1.25 2.5 5 7.5 10
NaCl(mM) 50 50 50 50 50
pH 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0
表6.针对MVA-MUC1测试具有蔗糖的制剂
·聚山梨醇酯的无效果甚至有害影响：
o MVA病毒：
Figure GDA0001559831270000462
表7A.针对MVA-HP V测试具有或无聚山梨醇酯的制剂
惠氏VV：
Tris+蔗糖 Tris+蔗糖+聚山梨醇酯80
Tris-HCl(mM) 30 30
蔗糖(％w/v) 10 10
聚山梨醇-80(μg/mL) 0 150
表7B.针对惠氏VV测试具有或无聚山梨醇酯的制剂
·MgCl2无有益效果：
o MVA病毒：
对照(0M MgCl<sub>2</sub>) 0.5M MgCl<sub>2</sub> 1M MgCl<sub>2</sub>
Tris-HCl(mM) 10 10 10
谷氨酸钠(mM) 10 10 10
蔗糖(％w/v) 5 5 5
NaCl(mM) 50 50 50
MgCl<sub>2</sub>(M) 0 0.5 1
pH 8.0 8.0 8.0
表8A.针对MVA-MUC1测试具有或无MgCl2的制剂。
惠氏VV：
Tris+蔗糖 Tris+蔗糖+聚山梨醇酯80
Tris-HCl(mM) 30 30
蔗糖(％w/v) 10 10
MgCl<sub>2</sub>(mM) 0 1000
表8B.针对惠氏VV测试具有或无MgCl2的制剂
·精氨酸无有益效果：
o MVA病毒：
Figure GDA0001559831270000471
表9A.针对MVA-MUC1测试具有或无精氨酸的制剂
惠氏VV：
Tris+蔗糖 Tris+蔗糖+精氨酸
Tris-HCl(mM) 30 30
蔗糖(％w/v) 10 10
精氨酸(mM) 0 50
表9B.惠氏VV测试具有或无精氨酸的制剂
·氨基酸混合物无有益效果：
Figure GDA0001559831270000472
Figure GDA0001559831270000481
表10.针对MVA-MUC1测试具有或无氨基酸混合物的制剂
·组氨酸无有益效果：
DS对照 10mM组氨酸
Tris-HCl(mM) 10 20
谷氨酸钠(mM) 10 5
蔗糖(％w/v) 5 10
NaCl(mM) 50 75
组氨酸(mM) 0 10
pH 7.5 7.5
表11.针对MVA-HPV测试具有或无组氨酸的制剂
分析稳定性
在+37℃(±2℃)、+25℃(±2℃)和/或±5℃(±3℃)下分析稳定性(参见结果部分)。
在+37℃(±2℃)(加速的稳定性试验)下，将样品存放在75％的相对湿度，并通过在至少28天内测量感染性损失(在第7和14天中间测量)来分析稳定性。
在+25℃(±2℃)(加速的稳定性试验)下，将样品存放在60％的相对湿度，并通过在至少6个月内测量感染性损失(在约1个月、2个月和3个月中间测量)来分析稳定性。
在+5℃(±3℃)(目标储存温度测试)下，将样品存放不受相对湿度的控制，并通过在至少24个月内测量感染性损失(在约1个月以及在3、6、12、18和24个月中间测量)来分析稳定性。
感染性损失通过将在测量时间时的感染性基因组数量或每毫升颗粒形成单位(IG/mL或PFU/mL)的数量从第0天的IG/mL或PFU/mL的初始数量中减去，并表示为十进制对数(log 10(IG/mL或PFU/mL))，在本说明书中缩写为log(IG/mL或PFU/mL)。
测量感染性滴度
在给定时间的感染性滴度可以通过测量每毫升感染性基因组(IG)的数目(IG/mL)或通过使用BHK-21细胞上的空斑测定来测量(感染性痘苗病毒滴度然后以空斑形成单位表达(PFU)/mL(PFU/mL))。这里优选测量每毫升感染性基因组(IG/mL)的数量，因为该方法更快速且更精确。然而，虽然在BHK-21细胞上没有显示使用空斑测定的具体数据，但是应当注意，感染性滴度也在BHK-21细胞使用空斑测定在某些时间点进行测量，并且总是发现结果与使用感染性基因组方法获得的结果一致。
感染基因组数的数目/mL(IG/mL)的测定如下进行：
·D天：感染和细胞接种
将病毒样品在补充有5％胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中在96孔板(100μL/孔)中连续稀释。
在培养基(DMEM+5％FCS)中收获BHK-21细胞，并在含有病毒稀释液的96孔板中以1:100的比例(每孔100μL)接种。
然后将培养板在+37℃、5％CO2下孵育24小时+/-4小时。
·D+1天：被感染的细胞裂解
感染后20-28h，弃去上清液，用PBS洗涤细胞单层2次。将100μL含有蛋白酶K的裂解缓冲剂加入到每个孔中。将板在+56°温育至少30分钟(最多420分钟)，然后在+95℃加热5分钟以使蛋白酶K失活。
·从D+1天到D+30天(在-20℃)：qPCR分析
细胞裂解产物在水中稀释49倍，并使用特异性引物和针对痘苗病毒基因组的分泌趋化因子结合蛋白(SCBP)区域的探针组进行qPCR。
通过使用在感染滴度(PFU/mL)中校准的病毒标准(使用标准空斑形成单位测定建立)的平行线测定(PLA)方法来定量测试样品感染性基因组(IG/mL)的数量。
该方法可以测量至少1.105(IG/mL)的任何值的感染性基因组(IG/mL)。
在BHK-21细胞上使用空斑测定法测量感染性滴度如下进行：
1、细胞扩散
宿主细胞BHK-21在DMEM中单层生长。在汇合时，所述细胞用10mLPBS洗涤，然后进行胰蛋白酶消化。在除去胰蛋白酶后，将细胞在37℃下重悬于具有10％SFV的10mL DMEM中。
然后，将细胞悬浮液均质化并分布在多孔板(板的6个孔中的每个2mL)中。然后，将所述板在37℃、5％CO2下温育。
2、细胞感染
在细胞扩散后约1天，在包含步骤1的BHK-21细胞的每个孔中加入等分的病毒悬浮液。如果必要，首先根据本领域技术人员公知的方法将所述悬浮液在PBS、阳离子100X和1％胎牛血清(FCS)中连续稀释。根据情况，添加到步骤1的BHK-21细胞中的所述病毒悬浮液是冻干前的含病毒的液体组合物或重建的含病毒的组合物(即在不同时间段和温度下冻干后)。
然后除去培养基，在室温下搅拌60分钟后，在每个孔中分配2mL感染培养基(DMEM+5％FCS)。然后将板在37℃、5％CO2下温育。
3、细胞固定
除去培养基后，用PBS洗涤细胞(每孔约1mL)。然后，加入1mL甲醇/丙酮溶液(50/50)，并将所得混合物在室温下轻柔搅拌。
然后将板在室温下干燥。
4、检测和滴度测定
根据熟知的过氧化物酶反应使用抗疫苗抗体和抗兔结合过氧化物酶进行病毒滴度测定。更准确地说，在反应之前将抗疫苗抗体在PBS+2％FCS中稀释100倍。然后，在每个孔中加入500μL所述抗体，并在37℃下温育约30分钟，然后用1mL PBS+1％Triton X-100洗涤3次。
抗兔抗体结合过氧化物酶的反应以相同的方式进行，不过在反应之前，将所述抗体在PBS+2％FCS中稀释200倍。
通过将一种商业DAB片剂溶解在15mL的0.05M TRIS-HCL中制备DAB溶液。然后，将得到的溶液在2μm的过滤单元NALGENE上过滤，并将得到的过滤溶液加入15μL 30％的H2O2水溶液中。一旦制备好，将1mLDAB溶液加入到每个孔中，直到出现棕色着色。随后除去着色溶液，视觉体现结果。
然后，使用以下公式以PFU/mL计算所述感染性滴度：
[病毒空斑平均数×4]×稀释系数＝PFU/mL的数量
这些方法中的每一种具有相似的变异性(variability)，对于单次测定，约±0.30log10。然而，当增加测定次数(即重复测试的次数)时，两种方法的变异性都会降低。对于双重测定(使用一式两份样品)，期待变异性为±0.25log10。对于三重测定(使用一式三份样品)，期待变异性为±0.20log10。在所有实施例中，当测量每mL的感染性基因组(IG)(IG/mL)的数量时，已经完成了单次测定，同时每毫升空斑形成单位(PFU)(PFU/mL)的测定已经在一式三份中完成。
结果
单价盐的必要性
已经在含有Tris-HCl、谷氨酸钠、蔗糖、pH8.0和含有0mM或50mM NaCl的制剂中测试MVA-MUC1的稳定性(参见上表2)。
在37℃7、14或28天后的感染性损失如图1所示。尽管两种被测试的制剂中没有一种非常稳定，但结果清楚地表明加入50mM NaCl显著提高了第14天(约1log损失对比近2log损失)和第28天(大约3log损失对比超过6log损失)的稳定性。
因此，向所述制剂中加入NaCl可显著提高稳定性。
EDTA的有益效果，低浓度的乙醇或EDTA/乙醇
已经使用各种浓度的EDTA(参见表3)在含有Tris-HCl、谷氨酸钠、蔗糖、NaCl、pH7.5的制剂中+37℃和+5℃下测试了EDTA对MVA-HCV稳定性的影响。结果如图2所示。
在+37℃(加速稳定性试验)，含有EDTA的所有制剂在7天和14天显示小于1log的感染性损失，并且在28天显示小于1.5log的感染性损失。形成鲜明对比地，没有EDTA的制剂(对照DS和对照DS2)显示出非常弱的稳定性分布(在7、14和28天分别为约1、2.5和4log感染性损失)。使用的EDTA浓度(从50μM到1000μM)似乎不会影响稳定效果。在28天，除了EDTA之外含有乙醇的制剂似乎进一步被稳定(参见图2)。
已经使用各种浓度的乙醇测试了含有Tris-HCl、谷氨酸钠、蔗糖、NaCl、pH7.5的制剂中在+37℃和+5℃乙醇(EtOH)对MVA-HCV稳定性的影响(参见表3)。结果如图3所示。
在37℃(加速的稳定性试验)中，含有乙醇的所有制剂在第7天和第14天显示明显低于没有乙醇的对照组的感染性损失。此外，可以观察到较低的乙醇浓度的较高稳定性的一些趋势。形成鲜明对比地，没有乙醇的制剂(对照DS和对照DS2)显示出非常弱的稳定性分布(在7、14和28天分别为约1、2.5和4log感染性损失)。此外，除了乙醇之外，含有EDTA的制剂显示出比仅含有乙醇的那些显著降低的感染损失(参见图3)。
因此，使用EDTA和乙醇的初步测试显示，两种化合物独立地提高了液体制剂中MVA-HCV的稳定性，EDTA的稳定效果高于乙醇的稳定效果。而且，两种化合物的组合进一步提高了稳定性。
进行进一步的实验以确认在+37℃、25℃和5℃下含有不同EDTA(50至250μM)和乙醇(0.5至2.5％)浓度(见表4)的制剂中MVA-HCV的稳定性。结果示于图4A、4B和4C中。在所有测试的温度下，对所有制剂都观察到良好的稳定性。特别地，对于含有EDTA和乙醇的所有制剂，在37℃下28天后感染性损失接近1log(参见图4A)，在+5℃下12个月后感染性损失低于0.3。在+5℃时，含EDTA和乙醇的大多数制剂在18和24个月后进一步显示低于0.3log10的感染性损失。相比之下，没有EDTA和乙醇的对照DS和DS2制剂的稳定性非常迅速地降低，特别是在37℃和25℃下(例如在37℃下7天和25℃下28天的约1log感染性损失)。
在图4D中给出了在+37℃和+5℃下获得的结果的另一个表示，通过使用实验矩阵根据EDTA和乙醇的量来定义所述制剂的设计空间，基于在+37℃(第7和28天)和+5℃(24个月)获得的结果定义最佳的EDTA和乙醇浓度。在该图中，EDTA浓度(μM)表示为x轴，乙醇浓度(％)表示为y轴。然后在该二维区域中表示对应于期待的制剂的曲线，期望值越高，制剂越好。
图4D显示，对于50-150μM EDTA和0.5-1％v/v乙醇获得最佳制剂。
基于该分析，定义了使用150μM EDTA和0.5％v/v乙醇的最佳制剂。
低浓度谷氨酸钠的有益效果
已经在具有或无各种浓度的谷氨酸钠0至10mM(参见表5)含有Tris-HCl、谷氨酸钠、蔗糖、NaCl、pH7.5的制剂中在+37℃和+25℃下测试谷氨酸钠对MVA-HCV的稳定性的影响。结果分别示于图5A、5B和5C中。
在+37℃时，含有至少5mM谷氨酸钠的三种制剂在第28天显示低于1的感染性损失，而含有0mM或2.5mM谷氨酸钠的两种制剂具有高于但接近1的感染性损失。这表明谷氨酸钠不具有很高的稳定作用，但低浓度的谷氨酸钠在5至10mM之间可能具有较小的稳定作用。此外，图5A表明，最佳浓度为约5mM，因为具有7.5mM和10mM谷氨酸钠的制剂具有比具有5mM谷氨酸钠的制剂略低的稳定性(图5A)。
在+25℃时，12个月的感染性损失证实谷氨酸钠具有小的稳定作用，约5mM的浓度是最佳的(图5B)。
在+5℃时，从12个月到30个月的感染性损失证实谷氨酸钠具有小的稳定作用，并且约5mM的浓度是最佳的(图5C)。
在+5℃获得的结果显示12个月时感染性损失很小以致难以显示出谷氨酸钠的有益效果。事实上，在其他化合物特别是EDTA和乙醇在配方中的存在可能解释了稳定作用，并且在该低温下难以证明谷氨酸钠的小的作用。然而，这并不与在+25℃和+37℃的较高温度下观察到的小的作用和约5mM的最佳浓度相矛盾。
低浓度蔗糖的有益效果
已经用不同浓度的蔗糖(参见表6)测试了在含有Tris-HCl、谷氨酸钠、蔗糖、NaCl、pH8.0的制剂中+37℃下蔗糖对MVA-MUC1稳定性的影响。结果如图6所示，表明蔗糖浓度不会显著影响稳定性水平。
聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯40没有有益效果甚至有有害的作用
已经在各种浓度的聚山梨醇酯80或聚山梨酯40含有Tris-HCl、谷氨酸钠、蔗糖、NaCl、pH7.5(参见表7)的制剂中在+25℃和+5℃测试了聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯40对MVA-HPV稳定性的影响，聚山梨醇酯80或聚山梨酯40显示出对其他病毒具有稳定作用(参见EVANS等J Pharm Sci.2004Oct，93(10)：2458-75，US7,456,009，SHI等J PharmSci.2005Jul，94(7)：1538-51，US2007/0161085)。结果示于图7A和7B中。
在+25℃和+5℃时，与不含聚山梨醇酯的对照制剂相比，聚山梨醇酯的浓度不能提高稳定性，因此没有观察到稳定作用。
相比之下，在两个温度下，对于至少0.02％v/v的聚山梨醇酯的浓度，可以注意到去稳定作用，其随着使用的聚山梨醇酯的浓度而增加。在+5℃时，即使极低浓度的0.005％v/v也会导致一些去稳定的作用。
因此，必须得出结论，聚山梨醇酯不具有稳定作用，并且至少0.02％v/v的浓度具有去稳定作用。因此，优选聚山梨醇酯在痘苗病毒的液体制剂中被排除或以非常低的浓度存在。
类似地，在人连续细胞系中生产并且通过涉及包含至少一种蛋白酶的至少一个步骤的处理方法纯化的痘苗病毒惠氏毒株的稳定性，在含有30mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖的对照制剂，或在进一步含有150μg/mL聚山梨醇酯80的制剂中在37℃7、14、21或28天后进行测试。结果如图7C所示，并清楚地表明，对于这种痘苗病毒毒株，聚山梨醇酯对稳定性没有积极作用。
在高浓度的MgCl2时，无有益效果甚至有害影响
已经在具有或无各种浓度的MgCl2含有Tris-HCl、谷氨酸钠、蔗糖、NaCl、pH 8.0(参见表8)的制剂中在+37℃测试MgCl2对MVA-MUC1的稳定性的影响，MgCl2显示出对其他病毒具有稳定作用(参见EVANS等，JPharm Sci.2004Oct，93(10)：2458-75和US7,456,009)。结果示于图8中，并清楚地表明，MgCl2对MVA稳定性没有有益的影响，甚至至少0.5M的浓度对MVA稳定性具有有害影响。
因此，优选在痘苗病毒的液体制剂中将MgCl2排除或以低浓度存在。
这更为真实，因为根据本发明的优化的制剂含有螯合剂(特别是二价阳离子螯合剂，更优选EDTA)，因此可能干扰MgCl2对痘病毒(更特别是痘苗病毒)的稳定性的任何低的有益效果。
根据本发明的制剂中MgCl2的有害作用的进一步证据在下面的实施例5中给出(也参见图16)。
类似地，在人连续细胞系中生产并且通过涉及包含至少一种蛋白酶的至少一个步骤的处理方法纯化的痘苗病毒惠氏毒株的稳定性，在含有30mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖的对照制剂，或进一步含有1000mM(1M)MgCl2的制剂中在37℃7或14天后测试。结果示于图8B，并清楚地表明，对于这种痘苗病毒株，MgCl2对稳定性没有积极的影响。
精氨酸没有有益效果，而且有有害影响
已经在含有Tris-HCl、谷氨酸钠、蔗糖、NaCl、pH8.0(参见表9)的制剂中，有或无各种浓度的已被显示对其他病毒具有稳定作用的(参见US2007/0161085)精氨酸，在+37℃下测试精氨酸对MVA-MUC1稳定性的影响。结果如图9所示，并清楚地表明精氨酸对MVA稳定性没有有益的作用。相比之下，在37℃下28天后，精氨酸的存在是相当有害的，特别是在高浓度下。
因此，优选在痘苗病毒的液体制剂中将精氨酸排除或以非常低的浓度存在。
类似地，在人连续细胞系中生产并且通过涉及包含至少一种蛋白酶的至少一个步骤的处理方法纯化的痘苗病毒惠氏毒株的稳定性在含有30mM Tris-HCl、10％(w/v)蔗糖的对照制剂中，或在进一步含有50mM精氨酸的制剂中在37℃7、14、21或28天后测试。结果如图9B所示，清楚地表明，对于这种痘苗病毒株，精氨酸对稳定性没有积极的影响。
氨基酸混合物没有有益效果
已经在具有或无氨基酸混合物含有Tris-HCl、谷氨酸钠、蔗糖、NaCl、pH8.0的制剂中+37℃和+25℃下测试了氨基酸混合物对MVA-MUC1的稳定性的影响(参见表10)。结果示于图10中，并清楚地表明氨基酸混合物的存在对MVA稳定性没有显著影响。
虽然氨基酸混合物可能存在于痘苗病毒的液体制剂中，但其显然不是必需的，并且不需要存在。
组氨酸没有有益效果反而有有害作用
已经在具有或无10mM组氨酸(参见表11)的含有Tris-HCl、谷氨酸钠、蔗糖、NaCl、pH7.5的制剂中在+25℃和+5℃测试组氨酸对MVA-HPV稳定性的影响，10mM是显示对其他病毒具有稳定作用的浓度(参见EVANS等J Pharm Sci.2004Oct，93(10)：2458-75，US7,456,009，US2007/0161085，US7,914,979，WO2014/029702，WO2014/053571)。结果示于图11A和11B中。
在+25℃或5℃时，没有观察到组氨酸的稳定作用。相比之下，在两个温度下都可以观察到趋向去稳定影响的趋势。
因此，优选在痘苗病毒的液体制剂中将组氨酸排除或以非常低的浓度存在。
结论
上述结果清楚地表明：
·以下化合物对液体制剂中痘苗病毒的稳定性有显著的有益效果：
o单价盐如NaCl。
o二糖如低百分比的蔗糖。这些组分是冷冻保护剂，因此被认为在低储存温度(例如约+5℃)下保护痘苗病毒。此外，这些化合物增加所述液体制剂的粘度，这可能限制痘苗病毒和潜在的有害化合物之间的相互作用。
o EDTA，具有很强的稳定作用。
o乙醇，其具有显著的稳定作用，尽管少于EDTA。
o EDTA和乙醇的组合，与单独的每种化合物相比，这种组合提供了进一步的稳定作用。
因此，这些化合物中的一或多种可以存在于稳定的液体痘苗病毒制剂中。
特别地，上述结果表明，含有蔗糖、单价盐和EDTA，优选还含有乙醇的缓冲的液体制剂表现出特别好的稳定性。
·以下化合物对液体制剂中痘苗病毒的稳定性没有显著的有益效果，但没有有害影响：
o谷氨酸钠。虽然该化合物对稳定性不是必需的，但是低浓度可能对MVA具有小的稳定作用。
o氨基酸混合物。虽然该化合物对稳定性不是必需的，但是低浓度可能对MVA具有小的稳定作用。
这样的化合物可以存在或不存在于根据本发明的制剂中。
·以下化合物在液体制剂中在较低浓度对痘苗病毒稳定性没有有益作用并在较高浓度对痘苗病毒稳定性有有害作用，因此优选不存在或以非常低的浓度存在于稳定的液体痘苗病毒制剂中：
o表面活性剂如聚山梨醇酯。在低浓度下，没有观察到效果。然而，在至少0.02％v/v的浓度下，观察到随着聚山梨酯浓度而增加的去稳定作用。
o组氨酸：在10mM时，可以观察到弱的去稳定作用。
o MgCl2：在0.5或1M，或甚至75mM(参见下面的实施例5)，观察到去稳定作用，
o精氨酸：在至少30mM的浓度下观察到弱的去稳定作用，并且随着精氨酸浓度的去稳定性增加。
实施例2：pH对MVA病毒稳定性的影响
已经测试了液体制剂的pH对痘苗病毒稳定性的影响，以便确定对于稳定液体制剂的合适的pH范围。
材料和方法
MVA病毒
使用的MVA病毒是MVA-HCV(TG4040)，一种表达来自HCV基因型1b型毒株ja的非结构HCV蛋白(NS3，NS4和NS5B)的重组MVA病毒(参见WO2004/111082)，其被稀释至初始目标浓度4-8 107IG/mL。
在鸡胚成纤维细胞(CEF)中生产MVA-HCV，并通过包括感染的CEF培养物回收、通过机械手段破坏细胞和不涉及用蛋白酶处理的任何步骤的各种纯化步骤的方法回收和纯化。
经测试的制剂
经测试的制剂如下表12所示：
pH 6.0 pH 7.0 pH 7.5 pH 8.0 pH 9.0
Tris-HCl(mM) 20 20 20 20 20
谷氨酸钠(mM) 5 5 5 5 5
蔗糖(％w/v) 10 10 10 10 10
NaCl(mM) 75 75 75 75 75
EDTA(μM) 150 150 150 150 150
乙醇(％v/v) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
pH 6.0 7.0 7.5 8.0 9.0
表12.用不同pH测试的制剂
分析稳定性
如实施例1所述完成稳定性分析。
测量感染性滴度
如实施例1所述完成感染性滴度的测量。
结果
已经在各种pH值下测试了含有Tris-HCl、谷氨酸钠、蔗糖、NaCl、EDTA和乙醇的制剂中在37℃和+5℃下pH对MVA-HCV稳定性的影响。结果示于图12A和12B中。
在+37℃(图12A)，7天后已经清楚重要的是pH值在6以上且小于9之间。特别是当pH值在7和8之间时获得良好的结果。
同样地，在+5℃时(图12B)在12个月的结果表明，pH值在6以上且小于9之间是更好的。特别是当pH值在7和8之间时获得良好的结果。
结论
上述结果表明，痘苗病毒的液体制剂的pH应优选在6以上且小于9之间。特别地，当pH为7至8时获得良好的结果。因此pH值在6.5和8.5之间可能是可以接受的。
实施例3：MVA病毒初始滴度对稳定性的影响
然后还测试了痘苗病毒初始滴度对液体制剂中随后稳定性的影响。
材料和方法
MVA病毒
使用的MVA病毒是MVA-HCV(TG4040)，其表达来自HCV基因型1b型毒株ja(参见WO2004/111082)的非结构性HCV蛋白(NS3、NS4和NS5B)的重组MVA病毒，其被稀释到不同的初始目标浓度：1.0-108PFU/mL，5.0107PFU/mL，1.0 107PFU/mL和5.0 106PFU/mL。
在鸡胚成纤维细胞中生产MVA-HCV，并通过包括感染的CEF培养物回收、通过机械方法破坏细胞和不涉及用蛋白酶处理的任何步骤的各种纯化步骤的方法回收和纯化。
经测试的制剂
经测试的制剂如下表13所示：
对照DS 本发明
Tris-HCl(mM) 10 20
谷氨酸钠(mM) 10 2.5
蔗糖(％w/v) 5 10
NaCl(mM) 50 75
EDTA(μM) 0 150
乙醇(％v/v) 0 0.5
pH 7.5 7.5
表13.用不同的MVA初始滴度测试的制剂
分析稳定性
如实施例1所述完成稳定性分析。
测量感染性滴度
如实施例1所述完成感染性滴度的测量。
结果
在图13A、13B和13C分别示出了在+37℃、+25℃和+5℃下不同初始滴度下MVA-HCV感染性损失的演变。
在+37℃，根据本发明的所有制剂的感染性滴度在7天后低于1log。然而，可以观察到具有较高初始MVA-HCV滴度的制剂的更高稳定性的趋势。在第14天，根据本发明的所有制剂的感染性滴度除了含有5.0106PFU/mL的初始MVA-HCV滴度的制剂仍然低于1log，但观察到更稳定的制剂具有较高初始MVA-HCV滴度的清晰趋势。在第28天证实了这一观察，仅根据本发明的包含5.0107PFU/mL或1.0 108PFU/mL的初始MVA-HCV滴度的制剂显示低于1log的感染性损失(图13A)。
可以在+25℃进行相同类型的观察(图13B)。然而，根据本发明的制剂的稳定性差异取决于MVA-HCV初始滴度，而不是区分两个亚家族：三种具有至少1.0 107PFU/mL的制剂(其在7个月时显示小于1log的感染性滴度损失)和唯一制剂具有1.0 107PFU/mL(5.0106PFU/mL，在7个月时显示超过1log的感染性滴度损失，并且在3个月时已经显示几乎为1log的感染性滴度损失)。
在+5℃，取决于MVA-HCV初始滴度的根据本发明的制剂的稳定性差异在25℃区分相同的两个亚家族(图13C)：三种制剂具有至少1.0 107PFU/mL(其在18个月时显示小于0.2log的感染性滴度损失)，并且唯一制剂具有小于1.0 107PFU/mL(5.0 106PFU/mL，其在12个月时已经显示超过0.5log的感染性滴度损失，并且在2个月时已经超过定义的0.3log的限制)。
结论
鉴于上述结果，似乎对于保证MVA的液体制剂的稳定性，非常优选至少为1.0107PFU/mL的初始滴度。
实施例4：各种痘苗病毒毒株的稳定性
为了证实前述实施例中定义的优化的制剂的稳定性，在两个不同的实验中在各种痘苗病毒毒株上测试了这些优化的制剂。
材料和方法
病毒
使用以下痘苗病毒：
·实验1：
o MVA-MUC1(TG4010)，表达MUC1肿瘤相关抗原和白介素2的重组MVA病毒(参见WO92/07000和WO95/09241)，其被稀释至5至8 108IG/mL的初始目标浓度。
o MVA-HCV(TG4040)，表达来自HCV基因型1b型毒株ja的非结构性HCV蛋白(NS3、NS4和NS5B)的重组MVA病毒(参见WO2004/111082)，其被稀释至4至6 107IG/mL的初始目标浓度。
o MVA-HPV(TG4001)，表达人乳头瘤病毒E6和E7抗原和白介素2的重组MVA病毒(参见WO90/10459、WO95/09241、WO98/04705、WO99/03885、WO2007/121894)，其被稀释至2至3108IG/mL的初始目标浓度。
三种MVA病毒在鸡胚成纤维细胞中生产，并通过包括感染的CEF培养物回收、通过机械手段破坏细胞和不涉及用蛋白酶处理的任何步骤的各种纯化步骤的方法回收和纯化。
·实验2：
o MVA-HCV(TG4040)，表达来自HCV基因型1b型毒株ja的非结构性HCV蛋白(NS3、NS4和NS5B)的重组MVA病毒(参见WO2004/111082)，其在以下中被生产：
·鸡胚细胞(MVA-HCV/CEC)(初始目标滴度为2.5至3 107IG/mL)，或
·永生化鸭胚胎细胞系(MVA-HCV/鸭细胞系)(初始目标滴度为3至4 107IG/mL)，
o MVA-FCU1(TG4023)，表达具有胞嘧啶脱氨酶活性1(参见WO99/54481)的融合蛋白的重组MVA病毒，在鸡胚细胞(MVA-FCU1/CEC)中生产(初始目标滴度为1至1.5 108IG/mL)，
o哥本哈根-FCU1(TG6002)，重组痘苗病毒毒株哥本哈根，表达具有胞嘧啶脱氨酶活性的FCU1融合蛋白并且包含缺陷的I4L和缺陷的J2R基因(参见WO2009/065546和WO2009/065547)在鸡胚细胞中产生(哥本哈根-FCU1/CEC)(初始目标滴度为2至3.0 108IG/mL)。
用于生产/纯化MVA-HCV/CEC、MVA-HCV/鸭细胞系、MVA-FCU1/CEC和哥本哈根-FCU1/CEC病毒的方法不包括添加蛋白酶的任何步骤。
·实验3：
o惠氏毒株(惠氏VV)的重组痘苗病毒，也使用在人连续细胞系中生产并通过涉及用至少一种蛋白酶的至少一个处理的步骤的方法纯化，其初始目标滴度为5至8 108PFU/mL。
测试配方
实验1：
针对MVA病毒经测试的制剂如下表14所示：
对照DS 本发明
Tris-HCl(mM) 10 20
谷氨酸钠(mM) 10 5
蔗糖(％w/v) 5 10
NaCl(mM) 50 75
EDTA(μM) / 150
乙醇(％v/v) / 0.5
pH 7.5or 8.0* 7.5
表14.针对3种MVA病毒被测试的制剂。*MVA-HPV的pH7.5和MVA-HCV和MVA-MUC1的pH8.0。
实验2：
针对MVA-HCV/CEC、MVA-HCV/鸭细胞系、MVA-FCU1/CEC和哥本哈根-FCU1/CEC病毒的经测试制剂如下表15A所示：
Figure GDA0001559831270000611
Figure GDA0001559831270000621
表15A.针对MVA-HCV/CEC、MVA-HCV/细胞系、MVA-FCU1/CEC和哥本哈根-FCU1/CEC病毒的被测试制剂。
实验3：
针对VV惠氏病毒的经测试制剂如下表15B所示：
对照 制剂1 制剂2
Tris-HCl(mM) 30 30 30
蔗糖(％w/v) 10 10 10
NaCl(mM) 0 200 500
EDTA(μM) 0 150 150
乙醇(％v/v) 0 0.5 0.5
pH 7.5 7.5 7.5
表15B.针对VV惠氏病毒的被测试制剂。
分析稳定性
如实施例1所述完成稳定性分析。
测量感染性滴度
如实施例1所述完成感染性滴度的测量。
结果
实验1：
在图14A、14B和14C中分别示出在+37℃、+25℃和+5℃下本发明优化的制剂中的三种MVA病毒的稳定性。
在+37℃时，所有三种MVA载体在第28天显示小于1log的感染性滴度损失，因此在该升高的温度下表现出非常好的稳定性。
在+25℃时，所有三种MVA载体在6个月时也显示小于1log的感染性滴度损失，因此在该温度下也显示非常好的稳定性。
最后，所有三种MVA载体在+5℃30个月后也显示出低于0.3log的感染性滴度损失，因此在该目标储存温度下显示非常高的稳定性。
虽然取决于所使用的MVA载体可以观察到一些微小的变化，但是上述结果清楚地表明，在前面的实施例中设计的优化的制剂适用于任何MVA载体，无论嵌入其中的是什么是异种序列。
实验2：
在该第二个实验中，针对通过各种方法获得的几种MVA病毒和另一种痘苗病毒株：哥本哈根(载体TG6002)测试了先前针对MVA优化的相同制剂。
结果示于图15A中，并且显示已经针对MVA病毒优化的根据本发明的经测试的制剂还允许其他痘苗病毒株(如哥本哈根)的稳定化。特别地，对于所有经测试的病毒，在第14天观察到小于1log损失。
较不稳定的病毒是MVA-HCV/CEC。这可以通过以下事实来解释：该病毒是以最低初始滴度使用的病毒。
实验3：
在第三个实验中，先前针对MVA优化的相同配方在另一种痘苗病毒毒株(惠氏毒株)上测试，其已经在人连续细胞系中生产并通过涉及至少一种蛋白酶的至少一个步骤的处理的方法进行纯化。
结果示于图15B中，并且显示了已经针对MVA病毒优化的本发明的经测试的制剂也允许惠氏痘苗病毒毒株的稳定化，尽管病毒环境中一些蛋白酶的潜在残留存在。特别地，在第28天观察到小于1log损失。
还应当注意，在可能含有一些残留蛋白酶的病毒环境的情况下，将单价盐(NaCl)从200增加到500mM进一步增加病毒的稳定性。
结论
上述结果清楚地表明，本发明人设计的优化的制剂适用于各种痘苗病毒菌株，并且可插入这种病毒的异种构造不会显著影响根据本发明的优化的制剂提供的稳定性。
上述结果还表明，即使当纯化过程涉及用至少一种蛋白酶处理本发明人设计的优化的制剂也是适用的，因此当病毒环境可能含有残留蛋白酶时也是适用的。在这种特殊情况下，增加制剂的单价盐浓度超过200mM进一步提高稳定性。
实施例5：由相同家族或其他家族的化合物替代优选的化合物
为了确认以前测试的单个化合物是可以被同一家族或其他家族的其他化合物替代，进行了一个实验，其中优化的制剂的每个先前经测试的单个化合物被同一家庭或其他家庭替代：
·缓冲剂：先前经测试的缓冲剂Tris-HCl被相同浓度的20mM的Tricine或HEPES缓冲剂替代。两种替代缓冲剂也具有pH7和pH8之间的缓冲能力。
·盐：先前经测试的单价盐NaCl由另一种单价盐(KCl)或二价盐(MgCl2)以75mM的相同浓度替代。
·二糖或糖醇：先前经测试的二糖蔗糖由另外的二糖(海藻糖)或糖醇(甘露醇)以10％w/v的相同浓度替代。
·螯合剂：先前经测试的螯合剂EDTA用150μM的相同浓度的EGTA或DTPA，另外两种螯合剂替代。
·C2-C3醇：先前经测试的C2-C3醇乙醇用0.5％的相同浓度的异丙醇替代。
材料和方法
病毒
使用的MVA病毒是MVA-MUC1(TG4010)，其是表达MUC1肿瘤相关抗原和白介素2的重组MVA病毒(参见WO92/07000和WO95/09241)，稀释至初始目标滴度为8.0 107至2 108IG/mL。
MVA-MUC1在鸡胚成纤维细胞中生产，并通过包括感染的CEF培养物回收、通过机械方法破坏细胞和不涉及用蛋白酶处理的任何步骤的各种纯化步骤的方法回收和纯化。
经测试的制剂
经测试的制剂如下表16所示：
Figure GDA0001559831270000641
Figure GDA0001559831270000651
Figure GDA0001559831270000652
Figure GDA0001559831270000653
表16.MVA-MUC1测试的配方
分析稳定性
如实施例1所述完成稳定性分析。
测量感染性滴度
如实施例1所述完成感染性滴度的测量。
结果
各种经测试的制剂在+37℃下的感染性损失在图16A中表示。
在+37℃21(图16B)或28(图16C)天后，使用
Figure GDA0001559831270000654
软件分析用上述其中一种其他化合物替代初始经测试的化合物的统计学显著性。结果表明：
·缓冲剂：在第21天，用Tricine或HEPES缓冲剂替代Tris-HCl并不显著影响MVA病毒的稳定性，尽管对于稳定MVA-MUC1Tris-HCl似乎略好。在第28天，尽管Tris-HCl似乎略好，但是用Tricine替代Tris-HCl并不显著影响MVA病毒的稳定性，并且HEPES缓冲剂的效果比Tris-HCl和Tricine差。
·盐：21天或28天后，用KCl替代NaCl不显著影响MVA病毒的稳定性。相比之下，在第21天和第28天，用MgCl2替代NaCl或KCl对MVA稳定性具有显著的有害影响，进一步证实MgCl2在浓度低至75mM时可能是有害的。
·二糖或糖醇：用甘露醇替代蔗糖不会显著影响MVA病毒的稳定性。当用海藻糖代替蔗糖时，在第21天和第28天注意到小的影响趋向于改善的MVA稳定性。
·螯合剂：通过DTPA或EGTA替代EDTA在第21天和第28天不会显著影响MVA病毒的稳定性。
·C2-C3醇：用异丙醇替代乙醇(EtOH)在第21和28天时不会显著影响MVA病毒的稳定性。
+5℃下各种经测试的制剂的感染性损失在图16D中表示。结果显示，在第180天，所有经测试的制剂显示非常低的感染性损失，均低于0.3log10。结论
上述结果清楚地表明，在根据本发明的优化的制剂中，初始经测试的化合物可被同一家族的其他化合物(Tris-HCl由具有缓冲能力在pH7和8之间的另一缓冲剂替代，NaCl被另一种单价盐替代，蔗糖被另一种二糖或糖醇替代，EDTA被另一种螯合剂替代，乙醇被另一种C2-C3醇替代)替代，而不显著改变痘苗病毒的稳定性。
相比之下，NaCl或其它单价盐不能被二价盐代替，因此证实先前的结果显示当以显著浓度(这里为75mM)存在时二价盐的有害作用。
实施例6：根据本发明的稳定的液体MVA制剂的体内免疫特性
进一步验证根据本发明的稳定的液体MVA制剂在12个月储存后是否具有与刚获得的MVA制剂在体内相似免疫原性。
材料和方法
MVA病毒
使用的MVA病毒是MVA-MUC1(TG4010)，其为表达MUC1肿瘤相关抗原和白介素2的重组MVA病毒(参见WO92/07000和WO95/09241)，稀释至1至3 108PFU/mL的初始目标滴度。
MVA-MUC1在鸡胚成纤维细胞中生产，并通过包括感染的CEF培养物回收、通过机械方法破坏细胞和不涉及用蛋白酶处理的任何步骤的各种纯化步骤的方法回收和纯化。
经测试的制剂和储存
将MVA-MUC1配制成含有20mM Tris-HCl、10％w/v蔗糖、75mM NaCl、150μM EDTA、0；5％v/v乙醇和5mM谷氨酸钠的液体制剂。
对于免疫原性测试，使用储存在-80℃的刚配制的MVA(T＝0)或在+5℃±3℃下12个月内储存的配制的MVA(T＝12个月)。
免疫原性试验
使用的模型是预防性模型，其中所述MVA-MUC1载体在进一步施用表达MUC1抗原的肿瘤细胞之前注射到小鼠中。更多细节如下：
第一个实验：
·小鼠：使用C57BL/6小鼠。每组由20只动物组成：
o第1组：仅制剂，
o组2-4：MVA-MUC1T＝0(104、105或106PFU)，
o组5-7：MVA-MUC1T＝12个月(104、105或106PFU)。
·待测试产品的施用：对于每种条件(T＝0/T＝12个月)，每个产品以一周间隔(D0/D7/D14)皮下注射三次。对于每个产品，测试三个剂量(104、105或106PFU)。此外，作为阴性对照，以相同的方案施用仅制剂(不含任何MVA-MUC1病毒)。
·肿瘤细胞的施用：最后一次注射病毒/制剂一周后，即在第21天(D21)，皮下注射RMA-MUC1细胞。
·监测小鼠的存活、肿瘤的存在和大小，直到第107天(D107)或直到肿瘤体积为2000mm3，此时处死小鼠。
第二个实验：
在T＝0和T＝24个月时，使用相同的模型比较仅制剂或MVA-MUC1的制剂的免疫原性，剂量为104PFU。
结果
第一个实验：
下表17A示出了取决于产品(储存0或12个月后的仅制剂或MVA-MUC1)和注射剂量，第86天无肿瘤小鼠的百分比。
Figure GDA0001559831270000681
表17A.取决于产品(储存0或12个月后的制剂或MVA-MUC1)和注射剂量，在第86天无肿瘤小鼠的百分比。
以上结果表明：
·经测试的液体制剂本身不诱导保护小鼠抵抗RMA-MUC1肿瘤细胞的免疫应答，以及
·在经测试的制剂中+5℃±3℃下储存12个月的MVA-MUC1并不显著影响MVA-MUC1诱导保护小鼠抵抗RMA-MUC1肿瘤细胞的免疫应答的能力。
第二个实验：
下表17B示出了取决于产品(储存0或24个月后的仅制剂或MVA-MUC1)，第65天无肿瘤小鼠的百分比。
Figure GDA0001559831270000682
表17B.取决于产品(储存0或24个月后的仅制剂或MVA-MUC1)，在第65天无肿瘤小鼠的百分比。
以上结果表明：
·经测试的液体制剂本身不会诱导保护小鼠免受RMA-MUC1肿瘤细胞攻击的免疫应答，以及
·在经测试的制剂中，+5℃±3℃储存24个月的MVA-MUC1不会显著影响MVA-MUC1诱导保护小鼠免受RMA-MUC1肿瘤细胞攻击的免疫应答的能力。
结论
上述数据证实，根据本发明的优化的制剂不仅在储存两年期间保持感染性病毒的滴度，而且还保持在体内诱导保护性免疫应答的能力。
实施例7：EDTA对UV损伤的保护作用
已知痘苗病毒对UV损伤敏感(参见LYTLE等J.Virol.2005,79(22)：14244)。在两个独立实验中测试了各种制剂保护痘苗病毒免受UV损伤的能力。
材料和方法
MVA病毒
使用的MVA病毒是MVA-HCV(TG4040)，一种表达来自HCV基因型1b型毒株ja的非结构型HCV蛋白(NS3、NS4和NS5B)的重组MVA病毒(参见WO2004/111082)，其被稀释至初始目标滴度为5 107至7 107IG/mL(针对实验1)和3 108至5 108IG/mL(针对实验2)。
在鸡胚成纤维细胞中生产MVA-HCV，并通过包括感染的CEF培养物回收、通过机械方法破坏细胞和不涉及用蛋白酶处理的任何步骤的各种纯化步骤的方法回收和纯化。
经测试的制剂
实验1中针对MVA-HCV经测试的制剂在下表18中表示：
对照制剂 优化的制剂
Tris-HCl(mM) 10 10
蔗糖(％w/v) 5 5
谷氨酸钠(mM) 10 10
NaCl(mM) 50 50
EDTA(μM) 0 150
乙醇(％v/v) 0 0.5
pH 7.5 7.5
表18.在不同光照条件下针对MVA-HCV测试的制剂(实验1)。
实验2中针对MVA-HCV经测试的制剂在下表19中表示：
对照 EDTA+乙醇 EDTA 乙醇
Tris(mM) 20 20 20 20
蔗糖(％w/v) 10 10 10 10
谷氨酸钠(mM) 5 5 5 5
NaCl(mM) 75 75 75 75
EDTA(μM) 0 150 150 0
乙醇(％v/v) 0 0.5 0 0.5
pH 7.5 7.5 7.5 7.5
表19.在ICH光照条件下MVA-HCV测试的制剂(实验2)。
光照条件
样品在以下光照条件下储存：
·没有光，
·在PSM下(任何旨在产生类似于D65/ID65发射标准的输出的光源，例如结合可见光和紫外线(UV)输出的人造日光荧光灯、氙气或金属卤化物灯。如ISO 10977(1993)中定义的，D65是针对室外日光的国际公认标准。ID65是等效的室内间接日光标准。对于发射320nm以下的显著辐射的光源，可以安装适当的过滤器以消除这种辐射)在室温下，或
·在ICH灯下(近紫外荧光灯具有320nm至400nm的光谱分布，具有在350nm和370nm之间的最大能量发射；相当大比例的UV应在320至360nm和360至400nm两个频带中。参见ICHQ1B新药物和产品的光稳定性试验)
分析稳定性
在+25℃(±2℃)下在28天内分析稳定性。
通过将测量时间时的每毫升感染性基因组数(IG/mL)从第0天的初始IG/mL数量中减去计算出感染性损失，并以十进制对数(log10(IG/mL))表示，在本说明书缩写为log(IG/mL)。
测量感染性滴度
如实施例1所述完成感染性滴度的测量。
结果
针对实验1和2的结果分别示于图17A和17B中。
在图17A中，已经测试了各种光条件(无光、PSM或ICH)对根据本发明的对照和优化的制剂的稳定性的影响。对于所有制剂，ICH光照条件导致显著的去稳定，了解痘苗病毒的光敏感性和ICH条件的非常强烈的光照这并不奇怪。然而，尽管所有制剂的去稳定化，但是从图17A可以清楚地看出，使用根据本发明的液体制剂导致MVA-HCV的去稳定性降低(参见尤其是第2、3和7天感染性损失)。必须注意的是，在这些剧烈的光照条件下，用对照制剂观察到的感染性滴度损失被扩大，在第2天达到1log。
此外，在更合理的光照条件(PSM条件)的情况下，使用根据本发明的液体制剂也导致MVA-HCV的去稳定性显著降低，在+25℃下28天后的感染性损失大大低于0.5log，而对照制剂在25℃下21天后超过1log。
在图17B中，已经测试了各种制剂在ICH光照条件下的稳定作用。如图17A所示，含有Tris-HCl、NaCl、谷氨酸钠、蔗糖、EDTA和乙醇的优化的制剂改善了在ICH光照条件下的稳定性，优于不含EDTA和乙醇的对照制剂。此外，图17B显示稳定效应是由于EDTA，因为具有EDTA但不含乙醇的制剂具有相似的稳定作用，而具有乙醇但不含EDTA的制剂不比对照制剂更好。
结论
上述结果清楚地表明，根据本发明的制剂不仅在不存在光的情况下稳定痘苗病毒，而且进一步保护痘苗病毒免受由于UV损伤的降解。这可能非常有助于减少液体制剂中痘苗病毒储存的约束。
实施例8：在不同成分浓度下稳定所要求保护的制剂的稳定效果
为了测试根据本发明的制剂的稳定作用的稳定性(robustness)，已经测试了含有不同浓度的不同成分的几种制剂的稳定MVA载体的能力。
材料和方法
病毒
使用的MVA病毒是MVA-MUC1(TG4010)，其为表达MUC1肿瘤相关抗原和白介素2的重组MVA病毒(参见WO92/07000和WO95/09241)，稀释至1至4 108PFU/mL的初始目标滴度。
MVA-MUC1在鸡胚成纤维细胞中生产，并通过包括感染的CEF培养物回收、通过机械方法破坏细胞和不涉及用蛋白酶处理的任何步骤的各种纯化步骤的方法回收和纯化。
经测试的制剂
经测试的制剂如下表20所示：
Figure GDA0001559831270000721
表20.针对MVA-MUC1测试的制剂
分析稳定性
如实施例1所述完成稳定性分析。
测量感染性滴度
如实施例1所述完成感染性滴度的测量。
结果
各种经测试的制剂在+37℃下的感染性损失在图18中表示。
在配制后的第21天，所有经测试的制剂具有低于1log10的感染性损失。在第28天，大多数经测试的制剂也具有低于1log10的感染性损失。
结论
上述数据证实，根据本发明的优化的制剂在包含在所述制剂中的成分浓度范围内具有稳定的稳定作用。
实施例9：要求保护的制剂对另一种类型的痘病毒的稳定作用
材料和方法
病毒
以1至3 108PFU/mL的初始目标滴度使用非重组假牛痘病毒(副痘病毒科)。
经测试的制剂
经测试的制剂在下表21中表示：
对照 制剂
Tris-HCl(mM) 10 20
谷氨酸钠(mM) 10 5
蔗糖(％w/v) 5 10
NaCl(mM) 50 75
EDTA(μM) 0 150
乙醇(％v/v) 0 0.5
pH 8.0 7.5
表21.针对假牛痘病毒测试的制剂
分析稳定性
如实施例1中所述在37℃下完成稳定性分析。
测量感染性滴度
如实施例1所述完成感染性滴度的测量。
结果
结果示于图19中，并且显示根据本发明的所述经测试的制剂极大地稳定假牛痘病毒。特别是，虽然在37℃下28天后的感染性损失对于仅用Tris和蔗糖的对照假牛痘病毒超过2.5log10，但在37℃下28天后的感染性损失对于配制的假牛痘病毒仅为约0.5log10。
结论
上述结果清楚地表明，根据本发明的制剂也适用于稳定假牛痘病毒，一种副痘病毒家族的痘病毒。
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Claims (34)

1.一种稳定的痘病毒的液体制剂，其包含：
a)滴度为107PFU/mL至1012PFU/mL的痘病毒，
b)浓度为10mM至50mM的选自Tris-HCl、TRIS或Tricine的药学上可接受的缓冲剂，
c)浓度为10mM至1000mM的选自NaCl或KCl的单价盐，
d)浓度为5％w/v至20％w/v的选自蔗糖、海藻糖或甘露醇的药学上可接受的二糖或糖醇，
e)浓度为50μM至250μM的选自乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸或二亚乙基三胺五乙酸的药学上可接受的螯合剂，
f)浓度为0.1％v/v至2％v/v的选自乙醇或异丙醇的C2-C3醇，以及
g)浓度低于10mM的谷氨酸钠，
其中所述制剂的pH为7.0至8.0之间，并且
其中所述液体制剂：
i)不含表面活性剂或包含浓度低于0.005％w/v的表面活性剂；
ii)不含二价盐或包含浓度低于1mM的二价盐；
iii)不含组氨酸或包含浓度低于5mM的组氨酸；且
iv)不含精氨酸和甲硫氨酸，或包含浓度低于300mM的精氨酸和/或浓度低于60mM的甲硫氨酸；
其中在+37℃储存至少1周期间，所述液体制剂中感染性痘病毒滴度的损失小于感染性病毒的1log10，或者在+5℃储存至少12个月期间，所述液体制剂中感染性痘病毒滴度的损失小于感染性病毒的0.3log10，其中所述感染性痘病毒滴度是通过测量每毫升感染性基因组的数量或通过在BKH-21细胞中空斑测定来确定的。
2.权利要求1的液体制剂，其中所述痘病毒以107PFU/mL至1010PFU/mL的滴度存在。
3.权利要求1的液体制剂，其中所述痘病毒至少是半纯化的，其包含低于500μg/剂量的宿主细胞蛋白质和低于10ng/剂量的宿主细胞DNA。
4.权利要求1的液体制剂，其中所述药学上可接受的缓冲剂具有pH7至pH8之间的缓冲能力，并且以10至30mM的浓度存在。
5.权利要求1的液体制剂，其中所述药学上可接受的缓冲剂具有pH7至pH8之间的缓冲能力、以10至50mM的浓度存在并且是TRIS-HCl缓冲剂。
6.权利要求1的液体制剂，其中所述单价盐为NaCl。
7.权利要求1的液体制剂，其中在所述制剂中存在的所述痘病毒已通过不包括至少一种蛋白酶处理的方法纯化，并且所述单价盐以10至200mM的浓度存在。
8.权利要求1的液体制剂，其中在所述制剂中存在的所述痘病毒已通过不包括至少一种蛋白酶处理的方法纯化，并且所述单价盐以50至100mM的浓度存在。
9.权利要求1的液体制剂，其中在所述制剂中存在的所述痘病毒已通过不包括至少一种蛋白酶处理的方法纯化，并且所述单价盐以75mM的浓度存在。
10.权利要求1的液体制剂，其中所述痘病毒是MVA并且已通过不包括至少一种蛋白酶处理的方法纯化，并且NaCl以50至100mM的浓度存在。
11.权利要求1的液体制剂，其中在所述制剂中存在的所述痘病毒已通过包括至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤的方法纯化，并且所述单价盐以100至1000mM的浓度存在。
12.权利要求1的液体制剂，其中在所述制剂中存在的所述痘病毒已通过包括至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤的方法纯化，并且所述单价盐以100至300mM的浓度存在。
13.权利要求1的液体制剂，其中在所述制剂中存在的所述痘病毒已通过包括至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤的方法纯化，并且所述单价盐以250至750mM的浓度存在。
14.权利要求1的液体制剂，其中在所述制剂中存在的所述痘病毒已通过包括至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤的方法纯化，并且所述单价盐以500至1000mM的浓度存在。
15.权利要求1的液体制剂，其中在所述制剂中存在的所述痘病毒是痘苗病毒，并且已通过包括至少一个用至少一种蛋白酶处理的步骤的方法纯化，并且NaCl以250至750mM的浓度存在。
16.权利要求1的液体制剂，其中所述药学上可接受的二糖或糖醇以5至15％w/v的浓度存在。
17.权利要求1的液体制剂，其中所述药学上可接受的二糖或糖醇以10％w/v的浓度存在。
18.权利要求1的液体制剂，其中所述药学上可接受的二糖或糖醇是蔗糖。
19.权利要求1的液体制剂，其中所述药学上可接受的二糖或糖醇以5至15％w/v的浓度存在，并且是蔗糖。
20.权利要求1的液体制剂，其中所述药学上可接受的螯合剂是乙二胺四乙酸。
21.权利要求1的液体制剂，其中所述C2-C3醇以0.5％v/v的浓度存在。
22.权利要求1的液体制剂，其中所述C2-C3醇是乙醇。
23.权利要求21的液体制剂，其中所述C2-C3醇是乙醇。
24.权利要求1的液体制剂，其中所述谷氨酸钠以浓度为2.5至7.5mM存在。
25.权利要求1的液体制剂，其中所述谷氨酸钠以浓度为5mM存在。
26.权利要求22的液体制剂，其中所述乙醇以浓度为0.1至2％v/v存在和所述谷氨酸钠以浓度为2.5至7.5mM存在。
27.权利要求1的液体制剂，其中：
a)所述痘病毒至少是半纯化的，其包含低于500μg/剂量的宿主细胞蛋白质和低于10ng/剂量的宿主细胞DNA；
b)所述药学上可接受的缓冲剂具有pH7至pH8之间的缓冲能力、以10至50mM的浓度存在并且是TRIS-HCl缓冲剂；
c)所述单价盐以10至1000mM的浓度存在，并且是NaCl；
d)所述药学上可接受的二糖或糖醇以5至15％w/v的浓度存在，并且是蔗糖；以及
e)所述药学上可接受的螯合剂以50至250μM之间的浓度存在，并且是乙二胺四乙酸。
28.权利要求27的液体制剂，其中所述C2-C3醇为乙醇并且以0.1至2％v/v的浓度存在。
29.权利要求27的液体制剂，其中所述谷氨酸钠以浓度为2.5至7.5mM存在。
30.权利要求1至14和16至29中任一项的液体制剂，其中所述痘病毒是正痘病毒或副痘病毒。
31.权利要求30的液体制剂，其中所述痘病毒是痘苗病毒。
32.权利要求31的液体制剂，其中所述痘苗病毒选自经修饰的痘苗病毒安卡拉、惠氏或哥本哈根毒株。
33.权利要求31的液体制剂，其中所述痘苗病毒是包含至少一种选自以下的外源序列的重组痘苗病毒：
编码具有直接或间接细胞毒性功能的分子的外源序列，
编码肿瘤相关抗原的外源序列，
编码病毒抗原的外源序列，和
编码细菌抗原的外源序列。
34.权利要求33的液体制剂，其中所述痘苗病毒是包含至少一种选自以下的外源序列的重组痘苗病毒：
胞嘧啶脱氨酶基因，
编码MUC1以及白介素2的外源序列，
编码人乳头瘤病毒抗原、乙型肝炎抗原或丙型肝炎抗原的外源序列，以及
编码分枝杆菌抗原的外源序列。
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