KR20170091653A - 안정한 액체 백시니아 바이러스 제제 - Google Patents

안정한 액체 백시니아 바이러스 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 보관 시 안정한 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스의 액체 제제에 관한다. 이와 같은 안정한 액체는 a) 폭스 바이러스, 바람직하게 백시니아 바이러스, b) 약학적으로 허용 가능한 완충제, c) 1가 염, d) 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올, 그리고 e) 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제를 포함하고, 이때 본 제제의 pH는 6.5 내지 8.5에 포함된다.

Description

안정한 액체 백시니아 바이러스 제제{STABLE LIQUID VACCINIA VIRUS FORMULATIONS}
본 발명의 기술 분야
본 발명은 폭스 바이러스(poxvirus), 특히 백시니아 바이러스(vaccinia virus)의 액체 상태로의 보관을 위한, 안정한 액체 제제 분야에 속한다. 본 발명은 a) 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스, b) 약학적으로 허용 가능한 완충제, c) 1가 염, d) 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올, 그리고 e) 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제를 포함하는 액체 제제에 관하는데, 이때 본 제제의 pH는 6.5 내지 8.5에 포함된다.
배경 기술
폭스 바이러스는 주로 자체의 일반적이지 않은 형태, 자체의 큰 DNA 게놈 및 자체의 세포질 복제 위치로써 구별되고, 200 ㎚ 내지 300 ㎚에 포함되는 직경을 가지는 복합 외피보유 바이러스이다. 오르토폭스 바이러스(orthopoxvirus)의 몇몇 일원들, 예를 들어 백시니아 바이러스(VV)의 2가지 균주, 즉 코펜하겐(Copenhagen) 백시니아 바이러스 균주(GOEBEL et al., 1990, Virol. 179, 247-266 내지 517-563; JOHNSON et al., 1993, Virol. 196, 381-401), 와이어스(Wyeth) 균주(OSBORNE JD et al. Vaccine. 2007 Dec 17;25(52):8807-32), 그리고 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(Modified Vaccinia virus Ankara; MVA) 균주(ANTOINE et al., 1998, Virol. 244:365-396)의 게놈이 지도분석 및 서열결정되어 있다. VV는 약 200개의 단백질(이 중 약 100개는 바이러스 조립에 수반됨)을 암호화하는 이중 가닥 DNA 게놈(약 192 kb)을 가진다. MVA는, 백시니아 바이러스의 앙카라 균주를 닭 배 섬유아세포를 바탕으로 500회 초과하여 연속 계대 배양함으로써 제조되어 매우 약독화된 백시니아 바이러스 균주이다(MAYR et al., 1975, Infection 3:6-16). MVA 바이러스는 수탁번호 I-721로서 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)에 기탁되어 있다. MVA 게놈의 전체 서열의 결정 및 코펜하겐 VV 게놈과의 비교는 바이러스 게놈에서 발생한 변경들의 정확한 동정을 허용할 뿐만 아니라, 단편화된 ORF(Open Reading Frame)를 초래하는 다수의 돌연변이 및 결실 7가지(I-VII)의 정의도 허용한다(ANTOINE et al., 1998, Virology 244:365-396).
MVA는 천연두에 대한 예방적 백신으로서 사용되고, 재조합 MVA는 현재 다수의 표적 유형, 예를 들어 암(분명하게는 흑색종, 비 소세포 폐 암종, 신세포 암종, 전립선암, 직장 결장암), 바이러스성 질병(분명하게는 B 또는 C형 간염, HIV), 세균성 질병(분명하게는 결핵) 및 기생체성 질병(분명하게는 말라리아)에 대한 예방적 및 치료적 백신화에 대한 다수의 전 임상 및 임상 연구의 과제가 되고 있다[문헌(GOMEZ et al. Current Gene Therapy, 2008, 8:97-120) 참조].
암 살상 백시니아 바이러스도 또한 전 임상 및 임상 개발 중에 있다[문헌(KIRN et al. Nat Rev Cancer, 2009 Jan, 9(1):64-71) 참조].
이 두 경우에 있어서, 생 백시니아 바이러스가 사용된다.
생 백시니아 바이러스 예방적 또는 치료적 백신은 일반적으로 제조 및 정제 직후에는 환자에 투여되지 않으므로, 수일, 수주 또는 심지어 수개월 동안 자체의 효능을 잃지 않도록 보관될 필요가 있다.
생 백시니아 바이러스는 모든 생 바이러스와 마찬가지로, 자연에서 불안정성을 가지는데, 이러한 불안정성은, 백시니아 바이러스가 외피보유 바이러스라는 점(외피보유 바이러스는 외피 비 보유 바이러스보다 덜 안정한 것으로 공지되어 있음)[BURKE CJ et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999, 16(1):1-83; 및 REXROAD et al. Cell Preservation Technology. June 2002, 1(2):91-104 참조], 크기가 크고(200 ㎚ 내지 300 ㎚의 벽돌 모양), 게놈 또한 크다는 점, 그리고 UV 손상에 특히 민감한 것으로 알려져 있다는 점[LYTLE et al. J. Virol. 2005, 79(22):14244 참조]으로 인해 더 배가된다. 더욱이, 백시니아 바이러스 외피는 기타 외피보유 바이러스들의 외피보다 더욱더 복잡하다. 그러므로 백시니아 바이러스를 안정화하는 것은 특히 어렵다.
백시니아 바이러스를 안정화하고자 하는 시도들이 행하여져 오고 있다. 대부분의 경우, 동결 건조된 제제가 제안되고 있다[BURKE CJ et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999, 16(1):1-83]. 실제로, 동결 건조가 수행되는 동안 바이러스 역가에는 약간의 손실이 유도될 수 있지만, 일단 동결 건조가 진행되면, 낮은 온도, 이동성의 부재, 그리고 동결 건조된 상태의 화합물들 간 상호작용의 방지가 초래되고, 이는 동결 건조된 바이러스를 일반적으로 액체 상태인 바이러스보다 더욱 안정하게 만들어준다. 예를 들어 EP 1418942는, 실질적으로 순수한 백시니아 바이러스, 이당체, 약학적으로 허용 가능한 중합체, 그리고 인산염 완충제가 아닌 완충제를 포함하는, 동결 건조용 백시니아 바이러스 제제를 개시하고 있다. WO 2014/053571은, 폴리비닐피롤리돈(PVP) 또는 이의 유도체, 적어도 1개의 당(특히 수크로스), 적어도 2개의 상이한 아미노산(특히 글루탐산나트륨 및 L-아르기닌), 적어도 2개의 약학적으로 허용 가능한 염(특히 NaCl, Na2HPO4 및 KH2PO4)(여기서 이 염들 중 적어도 1개는 인산염임), 그리고 선택적으로는 약학적으로 허용 가능한 완충제(특히 Tris)를 포함하는 기타 동결 건조 MVA 제제를 개시하고 있다.
그러나, 동결건조는 비용이 많이 들어갈 뿐더러, 특수 장치를 필요로 하고, 동결 건조된 제제는 투여 전 재구성되어야 한다. 뿐만 아니라, 동결 건조는, 특히 고 바이러스 역가에서, 주사 투여에는 적합하지 않은 약간의 바이러스 응집을 초래할 수 있는 동결 단계를 수반한다. 그러므로 안정한 액체 백시니아 바이러스 제제를 이용 가능하도록 만드는 것은 매우 유용할 것이다.
대부분 경우, 50℃에서 1 시간 미만의 시간이 지난 후 1 log10보다 큰 대수 손실(log loss)이 관찰되었기 때문에, 백시니아 바이러스를 액체 상태로 안정화하고자 하는 이전의 시도들은 그다지 성공적이지 못했다[문헌(BURKE CJ et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999, 16(1):1-83) 참조].
Evans외 다수는, pH가 6 내지 8 사이로 완충되고, 염(일반적으로 NaCl), 당(대부분의 경우, 수크로스), 유리 라디칼 산화의 억제제(분명하게는 EDTA, 에탄올 또는 EDTA/에탄올 조합), 비 이온성 계면활성제 및 2가 염을 포함하는, 안정한 액체 아데노바이러스(외비 비 보유 DNA 바이러스) 제제를 개시하였다[문헌(EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75; 및 US 7,456,009) 참조]. 바람직한 제제는 또한 일반적으로 히스티딘을 포함한다. 안정성에 필수적인 것으로 확인된 매개변수들로서는, 유리 라디칼 산화의 억제제(특히 EDTA, 에탄올, EDTA/에탄올 조합, 및/또는 히스티딘)의 존재와, 비 이온성 계면활성제의 존재를 포함한다. 2가 염의 존재는 또한 아데노바이러스의 안정성을 증가시키는데에 중요한 것으로 확인된다.
안정화가 목적인 비 이온 계면활성제의 유용성이 또한 유두종 바이러스에 대해 기록되어 있다[문헌(SHI et al. J Pharm Sci. 2005 Jul, 94(7):1538-51) 참조]. US 2007/0161085에서는, 다양한 액체 제제가 인플루엔자 바이러스(외피보유 RNA 바이러스)의 안정화에 대해 시험되었다. 대부분의 안정한 제제는 아르기닌 및 젤라틴을 포함하였다. 이 연구에서, EDTA는 인플루엔자 바이러스 안정성에 어떠한 영향도 미치지 않는 것으로 보였다. 아르기닌과 젤라틴 이외에, 소량의 계면활성제가 유익한 것으로 확인되었다.
US 7,914,979는 비 환원 당체, 예를 들어 수크로스를 포함하는 외피보유 뉴캐슬병 바이러스의 안정화를 위한 제제에 관한다. 바람직한 조성물은 또한 리신 및 아르기닌으로부터 선택된 아미노산을 함유한다. 이와는 대조적으로, EDTA는 안정성에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보이므로, 바람직하게는 제제에 포함되지 않는다.
WO 2014/029702에 있어서, 다양한 유형의 제제가 4종의 개 바이러스; 2종의 소형 및 중형 외피 비 보유 바이러스(개 파르보바이러스 및 제2형 개 아데노바이러스), 그리고 파라믹소 바이러스 과의 외피보유 바이러스 2종(개 디스템퍼 바이러스 및 개 파라인플루엔자 바이러스)에 대해 시험되었다. 결과들은, 외피보유 바이러스는 외피 비 보유 바이러스보다 안정화되기 더 어렵다는 것과, 최적의 제제는 동일한 파라믹소 바이러스 과들 중 외피보유 바이러스 2종(개 디스템퍼 바이러스 및 개 파라인플루엔자 바이러스)에 대해서 조차도, 바이러스들 간에 유의적으로 달라짐을 보인다. 더욱이, (특히 17-25%의 농도로 존재하는) 수크로스 및 아미노산(예를 들어 아르기닌 및 메티오닌)은 효율적인 안정화제인 한편, 유리 라디칼 스캐빈저(예를 들어 EDTA)는 이것이 어느 정도 안정성에는 기여할 수 있을지라도 안정성 프로필을 유의적으로 변경하지는 않음이 실시예 1에 기술되어 있다.
상기 선행 기술에 대한 기술은, 다수의 안정화제 후보물질들이 당 업계에 공지되어 있고, 또한 이 후보물질들의 안정화 효과는 안정화될 특이 바이러스에 따라서 크게 달라지므로, 특정 바이러스용의 안정한 액체 제제를 디자인하는 것은 어려운 작업임을 명확히 설명해준다. 또한 상기 예시된 바와 같이, 백시니아 바이러스의 외피보유 성질, 큰 크기, 그리고 DNA 게놈으로 말미암아, 이 백시니아 바이러스는 분명하게는 액체 상태로서 안정화되기 특히 어렵다.
본 발명의 개요
본 발명의 맥락에 있어서, 본 발명의 발명자들은 약 5℃(즉 5℃±3℃) 이상에서 백시니아 바이러스의 액체 상태로서의 안정성을 유지하는데에 적합한 액체 제제를 동정하였다. 이러한 제제의 필수적 요소들로서는, 약학적으로 허용 가능한 완충제, 1가 염, 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올, 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제의 존재; 그리고 pH 6.5 내지 8.5의 조성이 있다. C2-C3 알코올의 추가의 존재는 액체 제제의 안정성을 더 개선한다.
그러므로 제1 양태에서, 본 발명은
a) 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스;
b) 약학적으로 허용 가능한 완충제;
c) 1가 염;
d) 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올; 그리고
e) 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제
를 포함하거나, 필수적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어졌으며, 자체의 pH가 6.5 내지 8.5에 포함되는 액체 제제에 관한다.
놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 또한 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA의 존재가 UV 손상으로부터 백시니아 바이러스를 보호함을 발견하였다. 그러므로 본 발명은 또한 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 UV 손상에 대해 안정화하기 위한 킬레이트화제의 용도에 관한 것이기도 하다.
도면들의 설명
도 1. 1가 염 존재의 유익 효과. 7, 14 또는 28 일 경과 후 +37℃에서, 0 mM 또는 50 mM의 NaCl과 함께 Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM을 함유하는 제제(pH 8.0) 중 MVA-MUC1의 감염성 손실(infectious loss). 감염성 바이러스는 입자 형성 단위(Particle Forming Unit; PFU)/㎖로서 측정되었으며, 감염성 손실은 log(PFU/㎖)로 표현된다.
도 2. EDTA 또는 EDTA / EtOH 존재의 유익 효과. 7, 14 또는 28 일 경과 후 +37℃에서, Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM 함유 대조군 DS 제제(pH 7.5); Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 5 mM, NaCl 75 mM 함유 대조군 DS2 제제(pH 7.5); 또는 Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 5 mM, NaCl 75 mM, 그리고 다양한 농도의 EDTA(50, 250, 500 및 1000 μM)와, 선택적으로는 EtOH 1% v/v 함유 제제(pH 7.5) 중 MVA-HCV의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(Infectious Genome; IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다.
도 3. EtOH 또는 EDTA / EtOH 존재의 유익 효과. 7, 14 또는 28 일 경과 후 +37℃에서, Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM 함유 대조군 DS 제제(pH 7.5); Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 5 mM, NaCl 75 mM 함유 대조군 DS2 제제(pH 7.5); 또는 Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 5 mM, NaCl 75 mM 및 다양한 농도의 EtOH(0.5; 1; 2 또는 4% v/v), 그리고 선택적으로는 EDTA(50 또는 1000 μM) 함유 제제(pH 7.5) 중 MVA-HCV의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다.
도 4a-4d. EDTA / EtOH 존재의 유익 효과 7, 14 또는 28 일 경과 후 +37℃에서(도 4a); 28일, 또는 2, 3 또는 6개월 경과 후 +25℃에서(도 4b); 또는 35일, 또는 3, 6, 12, 18 또는 24개월 경과 후 5℃에서(도 4c), Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM 함유 대조군 DS 제제(pH 7.5) 중; Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 2.5 mM, NaCl 75 mM 함유 대조군 DS2 제제(pH 7.5) 중; 또는 Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 2.5 mM, NaCl 75 mM, 그리고 다양한 농도의 EDTA(50, 150 또는 250 μM) 및 EtOH(0.5, 1.5 또는 2.5 % v/v) 함유 제제(pH 7.5) 중 MVA-HCV의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다. 도 7d: +37℃에서 7일 경과 후 감염성 손실, +37℃에서 28일 경과 후 감염성 손실, 그리고 +5℃에서 24개월 경과 후 감염성 손실의 종합적인 분석을 기반으로 하는, EDTA 농도(μM) 및 EtOH 농도(%)에 대한 요망도(desirability) 곡선. 구체적인 요망도 값이 얻어지는 EDTA 및 EtOH 농도의 값들을 나타내는 곡선들이 제시되어 있다. 높은 요망도 값을 초래하는 EDTA 및 EtOH가 바람직하다.
도 5a-5c. Na 글루탐산염의 낮은 농도에 관한 유익 효과. 7, 14 또는 28 일 경과 후 +37℃에서(도 5a); 28일, 또는 3, 6 또는 12개월 경과 후 +25℃에서(도 5b); 또는 2, 3, 6, 12, 18, 24 또는 30개월 경과 후 +5℃에서(도 5c), Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM 함유 대조군 DS 제제(pH 7.5) 중; Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 0 mM, NaCl 50 mM 함유 대조군 DS2 제제(pH 7.5) 중; 또는 Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 0 내지 10 mM, NaCl 75 mM,, EDTA 150 μM 및 EtOH 0.5 % v/v 함유 제제(pH 7.5) 중 MVA-HCV의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다.
도 6. 수크로스의 유익 효과. 7일 또는 14일 경과 후 +37℃에서, Tris-HCl 10 mM, Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM, 그리고 다양한 양(1.25, 2.5, 5, 7.5 및 10 %(w/v))의 수크로스 함유 제제(pH 8.0) 중 MVA-MUC1의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 입자 형성 단위(PFU)/㎖로서 측정되었으며, 감염성 손실은 log(PFU/㎖)로 표현된다.
도 7a-7c. 폴리솔베이트의 유익 효과 부재 및 심지어 유해 효과. 3, 7, 28 또는 60일 경과 후 +25℃에서(도 7a); 또는 1, 2, 3, 6, 12, 18 또는 24 개월 경과 후 +5℃에서, Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM 함유 대조군 DS 제제(pH 7.5) 중; Tris-HCl 5, 10 또는 20 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 5 mM, NaCl 50 또는 75 mM, 그리고 다양한 농도(0.005, 0.02 또는 1% v/v)의 폴리솔베이트 80 또는 폴리솔베이트 40(1% v/v) 함유 제제(pH 7.5) 중 MVA-HPV의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다. 도 7c: 인간 연속 세포 주에서 생산되고, +37℃에서 7, 14, 21 또는 28일 경과 후 적어도 1개의 프로테아제 처리 단계가 적어도 1회 수반되는 방법에 의해 정제된 백시니아 바이러스(VV) 와이어스 균주의, Tris-HCl 30 mM, 수크로스 10 %(w/v) 함유 대조군 제제 중, 또는 150 ㎍/㎖ 폴리솔베이트 80 추가 함유 제제 중 감염성 손실.
도 8a-8b. MgCl2 의 유익 효과 부재와, 오히려 고 농도일 때의 유해 효과. 도 8a: 14일 경과 후 +37℃에서, Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM, 및 다양한 양(0 M, 0.5 M 또는 1 M)의 MgCl2 함유 제제(pH 8.0) 중 MVA-MUC1의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 입자 형성 단위(PFU)/㎖로서 측정되었으며, 감염성 손실은 log(PFU/㎖)로 표현된다. 도 8b: 인간 연속 세포 주에서 생산되고, +37℃에서 7 또는 14일 경과 후 적어도 1개의 프로테아제 처리 단계가 적어도 1회 수반되는 방법에 의해 정제된 백시니아 바이러스(VV) 와이어스 균주의, Tris-HCl 30 mM, 수크로스 10 %(w/v) 함유 대조군 제제 중, 또는 1000 mM MgCl2 추가 함유 제제 중 감염성 손실.
도 9a-9b. 아르기닌의 유익 효과 부재 및 오히려 유해 효과. 도 9a: 3, 7, 14 또는 28 일 경과 후 +37℃에서, Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM, 그리고 다양한 양(0, 30, 50, 100 또는 200 mM)의 아르기닌 함유 제제(pH 8.0) 중 MVA-MUC1의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 입자 형성 단위(PFU)/㎖로서 측정되었으며, 감염성 손실은 log(PFU/㎖)로 표현된다. 도 9b: 인간 연속 세포 주에서 생산되고, +37℃에서 7, 14, 21 또는 28일 경과 후 적어도 1개의 프로테아제 처리 단계가 적어도 1회 수반되는 방법에 의해 정제된 백시니아 바이러스(VV) 와이어스 균주의, Tris-HCl 30 mM, 수크로스 10 %(w/v) 함유 대조군 제제 중, 또는 50 mM 아르기닌 추가 함유 제제 중 감염성 손실.
도 10. 아미노산 혼합물의 유익 효과 부재. 3, 7, 14 또는 28 일 경과 후 +37℃에서, Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM과, 다양한 양의 아미노산 혼합물(0 또는 1 %(w/v))을 함유하는 제제(pH 8.0) 중 MVA-MUC1의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 입자 형성 단위(PFU)/㎖로서 측정되었으며, 감염성 손실은 log(PFU/㎖)로 표현된다.
도 11a-11b. 3, 7, 14, 28 또는 60 일 경과 후 +25℃에서(도 11a); 또는 1, 2, 3, 6, 12, 18 또는 24 개월 경과 후 +5℃에서(도 11b), Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM 함유 대조군 DS 제제(pH 7.5); 또는 Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 5 mM, NaCl 75 mM 및 히스티딘 10 mM 함유 제제(pH 7.5) 중 MVA-HPV의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다.
도 12a-12b. pH의 효과. 7, 14 또는 28 일 경과 후 +37℃에서(도 12a); 또는 28일, 또는 3, 6 또는 12 개월 경과 후 +5℃에서(도 12b), pH 값이 다양한(6.0; 7.0; 7.5; 8.0 및 9.0) Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 5 mM, NaCl 75 mM, EDTA 150 μM 및 EtOH 0.5%(v/v) 함유 제제 중 MVA-HCV의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다.
도 13a-13c. 바이러스 농도의 효과. 7, 14 또는 28일 경과 후 +37℃에서(도 13a); 28일, 또는 3 또는 7 개월 경과 후 +25℃에서(도 13b); 또는 2, 6, 12 또는 18 개월 경과 후 5℃에서(도 13c), Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM 함유 대조군 DS 제제(pH 7.5) 중; 또는 Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 2.5 mM, NaCl 75 mM, EDTA 150 μM, EtOH 0.5%(v/v) 함유 제제(pH 7.5)(inv) 중 다양한 초기 농도(1.0×108 PFU/㎖; 5.0×107 PFU/㎖; 1.0×107 PFU/㎖; 또는 5.0×106 PFU/㎖)에서의 MVA-HCV의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다.
도 14a-14c. 본 발명에 의한 최적화 제제의, 변별적 이종 유전자를 발현하는 변별적 MVA 바이러스 3종에 대한 검증. 7, 14 또는 28일 경과 후 +37℃에서(도 14a); 28일, 또는 2, 3 또는 6 개월 경과 후 +25℃에서(도 14b); 또는 2, 3, 6, 12, 18, 24 또는 30 개월 경과 후 +5℃에서(도 14c), Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM 함유 대조군 DS 제제(MVA-HPV에 대해서는 pH 7.5, 그리고 MVA-HCV 및 MVA-MUC1에 대해서는 pH 8.0); 또는 Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 5 mM, NaCl 75 mM, EDTA 150 μM, EtOH 0.5%(v/v) 함유 제제(pH 7.5) 중 MVA-HCV, MVA-MUC1 및 MVA-HPV의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다.
도 15a-15b. 다양한 방법에 의해 생산/정제된 백시니아 바이러스의 다양한 균주들에 대한, 본 발명에 의한 최적화 제제의 검증. 도 15a: 7, 14, 21 또는 28일 경과 후 +37℃에서, 닭 배 세포에서 생산된 MVA-HCV(MVA-HCV/CEC), 또는 무한증식 조류 세포주에서 생산된 MVA-HCV(MVA-HCV/조류 세포주); 닭 배 세포에서 생산된 MVA-FCU1(MVA-FCU1/CEC) 및 닭 배 세포에서 생산된 코펜하겐-FCU1(코펜하겐-FCU1/CEC)의, 대조군 약물 성분(Tris-HCl 10 mM, Na 글루탐산염 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), NaCl 50 mM(pH 7.5)) 중, 또는 본 발명에 의한 최적화 제제(Tris-HCl 20 mM, Na 글루탐산염 5 mM, 수크로스 10 %(w/v), NaCl 75 mM, EDTA 150 μM, EtOH 0.5%)(pH 7.5) 중 제제화되었을 때의 감염성 손실. 도 15b: 7, 14, 21 또는 28일 경과 후 +37℃에서, 인간 연속 세포주에서 생산되어, 대조군 약물 성분(Tris-HCl 30 mM, 수크로스 10 %(w/v), pH 7.5) 중 적어도 1개의 프로테아제 처리 단계가 적어도 1회 수반되는 방법에 의해 정제되거나, 또는 본 발명에 의한 최적화 제제(Tris-HCl 30 mM, 수크로스 10 %(w/v), NaCl 200 또는 500 mM, EDTA 150 M, EtOH 0.5%, pH 7.5) 2개 중에 제제화된 백시니아 바이러스(VV) 와이어스 균주의 감염성 손실.
도 16a-16d. 초기 시험한 안정화제의, 동일 군 또는 또 다른 군의 다른 화합물들로의 대체. 도 16a: 7, 14, 21 또는 28 일 경과 후 +37℃에서 표 19에 정의된 다양한 제제들 중 MVA-MUC1의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다. 도 16b 및 도 16c: +37℃에서, 14일 경과 후(도 16b) 또는 28일 경과 후(도 16c), 새로 시험한 후보물질 등가물의, 처음 시험한 안정화 또는 새로 시험한 또 다른 후보물질 등가물로의 대체에 대한 영향의 통계학적 분석[NemrodW® 소프트웨어 사용]. 각각의 선은 후보물질 등가물 Y를 함유하는 제제로부터, 처음 시험한 안정화제 X 또는 새로 시험한 다른 후보물질 등가물 함유 제제로의 변화(Y→X)와, 연관된 막대(bar) 및 값을 나타낸다. 상기 값이 "+ 값"이라는 것은, 처음 시험한 안정화제 또는 새로 시험한 다른 후보물질 X가 후보물질 등가물 Y보다 MVA-MUC1을 더 잘 안정화함을 의미한다. 이와는 대조적으로, 상기 값이 "- 값"이라는 것은, 후보물질 등가물 Y가 처음에 시험한 안정화제 또는 다른 후보물질 등가물 X보다 MVA-MUC1을 더 잘 안정화함을 의미한다. 절대 값이 클수록, Y를 X로 대체할 때의 효과가 크다. 특히, 이와 같은 대체는, 막대가 점선을 넘을 때 MVA-MUC1 안정성에 유의적인 영향을 미치는 것으로 간주된다. 도 16d: 28, 90 및 180 일 경과 후 +5℃에서 표 19에 정의된 다양한 제제들 중 MVA-MUC1의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다.
도 17a-17b. 최적화 제제에 의한 MVA 바이러스의 UV 손상으로부터의 보호 도 17a: +25℃에서 1, 2, 3, 7, 14, 21 또는 28 일 경과 후, 빛이 차단되거나, PSM 광이 비추어지거나(ISO 10977에 따른 320-400 ㎚ UV 광선 시뮬레이션), 또는 ICH 광선이 비추어질 때(ICH Q1B Photostability Testing of New Drug Substances and Products), Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM 함유 대조군 제제(pH 7.5), 또는 Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 5 mM, NaCl 75 mM, EDTA 150 μM 및 EtOH 0.5%(v/v) 함유 최적화 제제(pH 7.5) 중 MVA-HCV의 감염성 손실. 도 17b: +25℃에서 2, 3, 7, 9, 14 또는 21 일 경과 후, 빛이 차단되거나, ICH 광선이 비추어질 때(ICH Q1B Photostability Testing of New Drug Substances and Products), Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 5 mM, NaCl 75 mM 함유 대조군 제제(pH 7.5), 또는 Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 5 mM, NaCl 75 mM 및 EDTA 150 μM 및/또는 EtOH 0.5%(v/v) 함유 제제(pH 7.5) 중 MVA-HCV의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다.
도 18. 성분들이 다양한 농도로 함유되어 있는 몇몇 제제들의 안정화 효과. +37℃에서 7, 14, 21 또는 28 일 경과 후, 성분들이 다양한 농도로 함유되어 있는 몇몇 제제(표 20 참조) 중 MVA-MUC1의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다.
도 19. 가성 소 폭스 바이러스( pseudocowpox virus)에 대한 안정화 효과. +37℃에서 7, 14, 21 또는 28 일 경과 후, Tris-HCl 10 mM, 수크로스 5 %(w/v), Na 글루탐산염 10 mM, NaCl 50 mM 함유 대조군 조성물(pH 8.0) 중, 또는 Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %(w/v), Na 글루탐산염 5 mM, NaCl 75 mM, EDTA 150 μM, EtOH 0.5 % v/v를 함유하는 본 발명에 의한 제제(pH7.5) 중 가성 소 폭스 바이러스의 감염성 손실. 감염성 바이러스는 감염성 게놈(IG)/㎖로서 측정되었고, 감염성 손실은 log(IG/㎖)로서 표현된다.
본 발명의 상세한 설명
안정한 액체 제제
상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 +5℃ 또는 이 이상의 온도에서 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스의 액체 상태로서의 안정성을 유지하기에 적합한 액체 제제를 동정하였다. 이러한 제제는 약학적으로 허용 가능한 완충제, 1가 염, 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올, 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제를 포함하여야 하고, pH는 6.5 내지 8.5이어야 한다.
그러므로 본 발명은
a) 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스;
b) 약학적으로 허용 가능한 완충제;
c) 1가 염;
d) 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올; 그리고
e) 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제
를 포함하거나, 필수적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어졌으며, 자체의 pH가 6.5 내지 8.5에 포함되는 액체 제제에 관한다.
본 발명에 의한 액체 제제는 수성 제제이다.
"포함하는" 및 "포함하다(포함한다)"는 해당 재료, 생성물, 제제, 조성물 및 방법이, 언급된 성분들 또는 단계들을 포함하되, 다른 것은 배제하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. "필수적으로 -으로 이루어진" 또는 "필수적으로 -으로 이루어지다(이루어진다)"가 생성물, 제제, 조성물 및 방법을 정의하는데에 사용될 때, 이 표현들은 임의의 필수적인 유의성을 가지는 다른 성분들 또는 단계들을 배제하는 의미일 것이다. 그러므로, 예를 들어 필수적으로 인용된 성분들로 이루어진 제제는 미량의 오염물질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 배제하지 않을 것이다. "-으로 이루어진" 또는 "-으로 이루어지다(이루어진다)"는 다른 성분들 또는 단계들의 미량의 성분들 또는 사소한 요소들 이상의 것들을 배제하는 의미일 것이다.
안정성
본 발명에 의한 제제는, 비용이 많이 들어가면서 시간이 오래 소요되는 동결건조 방법이 수행될 필요가 없을뿐더러, 사전 재구성 필요 없이 직접 투여될 수 있다는 이점을 가지는 액체이다.
생체 재료, 예를 들어 바이러스의, 특히 액체 상태로서의 안정화는, 바이러스가 제제의 모든 성분뿐만 아니라, 용기와도 상호 작용하는 능력을 가져서, 바이러스 역가 손실의 위험이 증가하는 관계로, 그리 간단한 문제는 아니다. 그러나, 본 발명은 액체 상태에서 안정하여, 이와 같은 난점들을 극복하는 것이 허용된 바이러스 제제를 제공한다. 특히
* 본 발명에 의한 액체 제제 중 감염성 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스의 역가 손실은, 적어도 1주일, 바람직하게는 적어도 2주일, 적어도 3주일, 또는 심지어 적어도 4주일 동안 +35℃에서 보관되는 중에 감염성 바이러스의 1 log10 미만인 것이 바람직하고,
* 본 발명에 의한 액체 제제 중 감염성 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스의 역가 손실은, 적어도 4주일, 바람직하게는 적어도 3개월, 또는 적어도 6개월 동안 +25℃에서 보관되는 중에 감염성 바이러스의 1 log10 미만인 것이 바람직하며/바람직하거나,
* 본 발명에 의한 액체 제제 중 감염성 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스의 역가 손실은, 적어도 12개월, 바람직하게는 적어도 18개월, 적어도 24개월, 적어도 30개월 또는 심지어 적어도 36개월 동안 약 +5℃(즉 +5℃±3℃)에서 보관되는 중에 감염성 바이러스의 0.3 log10 미만(50%의 감염성 손실에 대응함)이다.
제0일 및 이후의 임의의 경과일에서의 감염성 백시니아 바이러스 역가는, 1㎖ 당 감염성 게놈의 수(IG)(IG/㎖)를 측정하거나, 또는 BHK-21 세포 상 플라크 검정법(plaque assay)을 이용하여 측정될 수 있다[이후, 감염성 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스의 역가는 1㎖당 플라크 형성 단위(PFU)(PFU/㎖)로서 표현됨]. 1㎖당 감염성 게놈의 수(IG/㎖)의 측정법이 바람직할 수 있는데, 왜냐하면 이 방법이 더 신속하고 더 정확하기 때문이다. 1㎖당 감염성 게놈의 수(IG)(IG/㎖)를 측정하는 것에 대한 상세한 프로토콜 또는 BHK-21 세포 상 플라크 검정법에 대한 상세한 프로토콜은 실시예들에 개시되어 있다.
폭스 바이러스
본 발명에 의한 제제들은 폭스 바이러스를 포함한다.
상기 폭스 바이러스는 다음과 같은 과들, 즉 오르토폭스 바이러스(Orthopoxvirus)(예를 들어 백시니아 바이러스, 소 폭스 바이러스), 파라폭스 바이러스(Parapoxvirus)(예를 들어 소 구진성 구내염 바이러스, Orf 바이러스, 가성 소 폭스 바이러스), 수이 폭스 바이러스(Suipoxvirus)(예를 들어 돼지 폭스 바이러스), 야타 폭스 바이러스(Yatapoxvirus)(예를 들어 야바 유사 병(Yaba-like disease) 바이러스), 아비 폭스 바이러스(Avipoxvirus)(예를 들어 가금류 폭스 바이러스 및 카나리아 폭스 바이러스) 및 레포리 폭스 바이러스(Leporipoxvirus)(믹소마 바이러스(Myxoma virus))로부터 선택될 수 있다. 상기 폭스 바이러스는 특히 오르토폭스 바이러스(예를 들어 백시니아 바이러스, 소 폭스 바이러스) 및 파라폭스 바이러스(예를 들어 소 구진성 구내염 바이러스, Orf 바이러스, 가성 소 폭스 바이러스)로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 폭스 바이러스는 백시니아 바이러스 및 가성 소 폭스 바이러스이다.
바람직한 구현예에서, 상기 폭스 바이러스는 오르토폭스 바이러스이고, 더욱 바람직하게는 백시니아 바이러스(VV)이다.
본 발명의 발명자들은, 백시니아 바이러스의 액체 상태로서의 안정성은 제제 중 백시니아 바이러스 입자의 농도와 함께 증가함을 관찰하였다(실시예 4 참조). 결과적으로, 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스, 분명하게는 MVA, 와이어스 또는 코펜하겐 백시니아 바이러스)는 바람직하게 본 발명에 의한 액체 제제 중에 적어도 107 PFU/㎖, 바람직하게 적어도 2×107 PFU/㎖, 적어도 3×107 PFU/㎖, 적어도 4×107 PFU/㎖, 더욱 바람직하게 적어도 5×107 PFU/㎖, 또는 심지어 적어도 108 PFU/㎖의 역가로 존재한다. 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)의 안정성은, 제제 중 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스) 입자의 농도와 함께 증가하므로, 제제 중 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스) 입자의 최대 농도에 관하여 특별한 제한은 없다. 그러나, 실용적인 이유에서 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)는 일반적으로 본 발명에 의한 액체 제제 중에 1012 PFU/㎖ 이하, 1011 PFU/㎖ 이하, 또는 심지어 1010 PFU/㎖ 이하의 역가로 포함될 것이다. 특히 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)는 본 발명에 의한 액체 제제 중에 107 PFU/㎖ 내지 1012 PFU/㎖, 107 PFU/㎖ 내지 1011 PFU/㎖, 107 PFU/㎖ 내지 1010 PFU/㎖, 107 PFU/㎖ 내지 5×109 PFU/㎖, 107 PFU/㎖ 내지 109 PFU/㎖, 107 PFU/㎖ 내지 5×108 PFU/㎖, 107 PFU/㎖ 내지 108 PFU/㎖, 2×107 PFU/㎖ 내지 1012 PFU/㎖, 2×107 PFU/㎖ 내지 1011 PFU/㎖, 2×107 PFU/㎖ 내지 1010 PFU/㎖, 2×107 PFU/㎖ 내지 5×109 PFU/㎖, 2×107 PFU/㎖ 내지 109 PFU/㎖, 2×107 PFU/㎖ 내지 5×108 PFU/㎖, 2×107 PFU/㎖ 내지 108 PFU/㎖, 3×107 PFU/㎖ 내지 1012 PFU/㎖, 3×107 PFU/㎖ 내지 1011 PFU/㎖, 3×107 PFU/㎖ 내지 1010 PFU/㎖, 3×107 PFU/㎖ 내지 5×109 PFU/㎖, 3×107 PFU/㎖ 내지 109 PFU/㎖, 3×107 PFU/㎖ 내지 5×108 PFU/㎖, 3×107 PFU/㎖ 내지 108 PFU/㎖, 4×107 PFU/㎖ 내지 1012 PFU/㎖, 4×107 PFU/㎖ 내지 1011 PFU/㎖, 4×107 PFU/㎖ 내지 1010 PFU/㎖, 4×107 PFU/㎖ 내지 5×109 PFU/㎖, 4×107 PFU/㎖ 내지 109 PFU/㎖, 4×107 PFU/㎖ 내지 5×108 PFU/㎖, 4.×107 PFU/㎖ 내지 108 PFU/㎖, 5×107 PFU/㎖ 내지 1012 PFU/㎖, 5×107 PFU/㎖ 내지 1011 PFU/㎖, 5×107 PFU/㎖ 내지 1010 PFU/㎖, 특히 5×107 PFU/㎖ 내지 5×109 PFU/㎖, 5×107 PFU/㎖ 내지 109 PFU/㎖, 5×107 PFU/㎖ 내지 5×108 PFU/㎖, 5×107 PFU/㎖ 내지 108 PFU/㎖, 108 PFU/㎖ 내지 1012 PFU/㎖, 108 PFU/㎖ 내지 1011 PFU/㎖, 108 PFU/㎖ 내지 1010 PFU/㎖, 108 PFU/㎖ 내지 5×109 PFU/㎖, 108 PFU/㎖ 내지 109 PFU/㎖, 108 PFU/㎖ 내지 5×108 PFU/㎖의 역가로 포함될 수 있다.
폭스 바이러스는 바람직하게 정제 또는 반 정제되고, 그 결과 숙주 세포 단백질과 숙주 세포 DNA가 감소하며, 이로 말미암아 인간에 투여된 후에도 잘 관용된다. 더욱이, 주사 후 다수의 불순물은 인간 알레르기 반응의 원인이 될 수 있었다. 이러한 반 정제 방법 또는 정제 방법은 당 업계에서 통상적인 것으로서, 다양한 매개변수, 예를 들어 바이러스 자체, 생산자 세포, 사용된 배양 배지, 생산 및 정제 단계 동안 도입된 효소 및 기타 성분들(예를 들어 뉴클레아제, 프로테아제, 염 등) 에 따라서 달라질 수 있다. 예를 들어 난백 알부민 및 항생제와 같은 불순물은 통상 바이러스가 닭 배 섬유아세포(CEF)와 같은 1차 세포 상에서 생산될 때 존재하는 한편, 숙주 세포 핵산 및 단백질은 무한증식된 세포주, 예를 들어 오리의 세포주 및 인간 세포주 상에서 생산된 바이러스 제조물의 보통의 오염물질이다. 일반적인 지침으로서, 숙주 세포 DNA는 10 ng/용량 미만으로 줄이고(정규 명세서 참조), 숙주 세포 단백질은 150 ㎍/용량 이하로 줄일 것이 권장된다. 반 결정된 바이러스 제조물 또는 정제된 바이러스 제조물을 얻기에 적합한 기술에 관한 대표적인 예들은 접선 유동 여과, 효소 분해, 크로마토그래피 및 전면 여과 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러므로 바람직한 구현예에서, 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)는 숙주 세포 단백질을 용량당 5 ㎍ 내지 500 ㎍, 그리고 숙주 세포 DNA를 용량당 10 ng 이하 포함하도록 적어도 반 정제된다.
본 발명의 발명자들은 본 발명에 의한 액체 제제가 백시니아 바이러스의 변별적 균주 3종, 즉 MVA, 와이어스 및 코펜하겐을 안정화할 수 있음을 발견하였다(실시예 4 참조). 그러므로 다양한 백시니아 바이러스 균주는 본 발명에 의한 액체 제제가 사용될 때 안정화될 수 있다. 특히 상기 백시니아 바이러스는 엘스트리(Elstree), 웨스턴 리저브(Western Reserve), 와이어스, NYVAC, NYCBOH, 파리(Paris), 코펜하겐 및 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) 균주로부터 선택될 수 있다. 상기 백시니아 바이러스는 바람직하게 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA), 와이어스 및 코펜하겐 균주로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 제제 중에 존재하는 백시니아 바이러스는 MVA 바이러스, 특히 MVA 575(ECACC V00120707) 또는 MVA-BN(ECACC V00083008)이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 제제 중에 존재하는 백시니아 바이러스는 와이어스 백시니아 바이러스이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 제제 중에 존재하는 백시니아 바이러스는 코펜하겐 백시니아 바이러스이다.
본 발명에 의한 제제 중에 포함된 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스는 야생형, 약독화 또는 재조합 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스일 수 있다. 용어 "재조합 폭스 바이러스"란, 적어도 1개의 외인성 서열이 자체의 게놈에 삽입되어 포함된 폭스 바이러스를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "외인성 서열"이란, 부모 폭스 바이러스 내에 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 지칭한다.
본 발명에 의한 제제 중에 포함된 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)가 재조합체일 때, 외인성 서열(들)은 임의의 관심 외인성 서열일 수 있다.
제1의 바람직한 구현예에서, 재조합 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)는 직접적으로나 간접적으로 세포독성 기능을 가지는 분자를 암호화하는 외인성 서열을 포함한다. "직접적으로나 간접적으로 세포독성인"이란, 외인성 서열에 의해 암호화된 분자(예를 들어 독소, 시토킨 또는 효소, 예를 들어 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제) 자체가 독성일 수 있거나, 또는 독성인 생성물을 생성하도록 대사될 수 있거나, 또는 독성인 생성물을 생성하는 이외의 모종의 작용을 할 수 있음을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 외인성 서열에 의해 암호화된 분자는 독소, 예를 들어 리신 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A일 수 있다. 리신 cDNA의 서열은 LAMB외 다수의 문헌[Eur. J. Biochem., 1985, 148:265-270]에 개시되어 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 외인성 서열에 의해 암호화된 분자는 시토킨일 수 있다. 이러한 시토킨은 분명하게 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-감마(IFNγ) 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GMCSF)로부터 선택될 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 직접적으로나 간접적으로 세포독성 기능을 가지는 분자를 암호화하는 외인성 서열은 자살 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 비교적 무독성인 전구약물을 독성인 약물로 전환할 수 있는 단백질을 암호화한다. 예를 들어 효소 시토신 탈아미노효소는 5-플루오로시토신(5-FC)을 5-플루오로우라실(5-FU)로 전환하고[MULLEN et al., 1922, PNAS 89:33]; 헤르페스 심플렉스 효소 티미딘 키나아제는 항바이러스제인 갠시클로버(GCV) 또는 아시클로버가 사용되는 치료에 대해 세포를 감작화한다[MOOLTEN, 1986, Cancer Res. 46:5276; EZZEDINE et al., 1991, New Biol 3:608]. 임의의 유기체, 예를 들어 이.콜라이(E. coli) 또는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)의 시토신 탈아미노 효소가 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명의 바람직한 구현예에서, 자살 유전자는 시토신 탈아미노 효소 활성을 가지는 단백질, 더욱 바람직하게 본원에 참고문헌으로서 첨부되어 있는 특허출원 WO99/54481, WO2005/007857, WO2009/065546 및 WO2009/065547에 개시된 FCU 1 단백질 또는 FCU 1-8 단백질을 암호화한다. 이와 관련하여, 본 발명에 의한 액체 제제 중에 포함된, 바람직한 재조합 백시니아 바이러스는
- TG4023라고도 칭하여지는 MVA-FCU 1(WO99/54481 참조);
- MVA-FCU 1-8(WO2005/007857 참조); 및
- 더욱 특히 결손 I4L 및/또는 F4L 유전자, 그리고 결손 J2R 유전자를 포함하는 백시니아 바이러스(VV)인 VV-FCU 1(WO2009/065546 및 WO2009/065547 참조)
이다.
제2의 바람직한 구현예에서, 재조합 백시니아 바이러스는 표적화된 RNA 또는 DNA를 절단할 수 있는 리보자임을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 절단되도록 표적화된 RNA 또는 DNA는 세포의 기능에 필수적인 RNA 또는 DNA일 수 있어서, 이의 절단은 세포 사멸을 초래하거나, 또는 절단될 RNA 또는 DNA는 원치않는 단백질, 예를 들어 암 유전자 생성물을 암호화하는 RNA 또는 DNA일 수 있어서, 이 RNA 또는 DNA의 절단은 세포가 암 성이 되는 것을 막을 수 있다.
제3의 바람직한 구현예에서, 재조합 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)는 안티센스 RNA를 암호화하는 외인성 서열을 포함한다. "안티센스 RNA"란, 단백질을 암호화하는 mRNA 분자와 잡종화하여 이 mRNA 분자가 발현되는 것을 방해하거나, 또는 세포 내 다른 RNA 분자, 예를 들어 pre-mRNA 또는 tRNA 또는 rRNA와 잡종화하거나, 또는 어떤 유전자와 잡종화하여 이 유전자의 발현을 방해하는 RNA 분자를 의미한다.
제4의 바람직한 구현예에서, 재조합 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)는 표적 세포 내 결손 유전자의 기능을 대체하는 외인성 서열을 포함한다. 포유동물, 예를 들어 인간에서 유전되는 유전병으로서, 결손 유전자에 의해 유발되는 유전병이 수천 개 존재한다. 이러한 유전병의 예들로서는, CFTR 유전자에 돌연변이가 일어나 발생하는 것으로 공지된 낭성 섬유증; 디스트로핀 유전자에 돌연변이가 일어나 발생하는 것으로 공지된 듀켄(Duchenne)씨 근 이영양증; HbA 유전자에 돌연변이가 일어나 발생하는 것으로 공지된 겸상 적혈구 병을 포함한다. 암의 다수의 유형은 결손 유전자, 특히 원암 유전자와, 돌연변이가 일어난 종양 억제 유전자에 의해 유발된다. 원암 유전자의 예들로서는 ras, src 및 bcl 등이 있고; 종양 억제 유전자로서는 p53 및 Rb가 있다.
제5의 바람직한 구현예에서, 재조합 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)는 종양 연관 항원(Tumor Association Antigen; TAA)을 암호화하는 외인성 서열을 포함한다. TAA란, 동일 조직 유형의 비 종양 세포 내에서보다 종양 세포 내에서 더 높은 빈도 또는 밀도로 검출되는 분자를 지칭한다. TAA의 예들로서는 CEA, MART1 , MAGE1, MAGE3, GP-100, MUC1[본원에 참고문헌으로 첨부되어 있는 WO92/07000, WO95/09241 및 문헌(ROCHLITZ et al. J Gene Med. 2003 Aug;5(8):690-9) 참조], MUC2, 점 돌연변이가 일어난 ras 암 유전자, 정상 또는 점 돌연변이가 일어난 p53, 과발현된 p53, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, 티로시나아제, TRP1, TRP2, NY-ESO-1 , TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, 생존 및 LRP를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더 바람직한 구현예에 의하면, TAA는 MUC1이다.
제6의 바람직한 구현예에서, 재조합 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)는 항원을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "항원"이란, 항체에 의해 결합될 수 있는 리간드를 지칭하는데; 이 항원은 그 자체가 면역원성일 필요는 없다. 바람직하게 항원은
* 바이러스
[예를 들어 항원은
- HIV-1(예를 들어 gp 120 또는 gp 160),
- 고양이 면역결핍증 바이러스 중 임의의 것,
- 인간 또는 동물 헤르페스 바이러스(gD 또는 이의 유도체 또는 급속 초기 단백질, 예를 들어 HSV1 또는 HSV2 유래 ICP27),
- 사이토메갈로바이러스(예를 들어 gB 또는 이의 유도체),
- 수두-대상포진 바이러스(예를 들어 gpl, Il 또는 III),
- 간염 바이러스, 예를 들어 B형 간염 바이러스(HBV)(예를 들어 B형 간염 표면 항원 또는 이의 유도체), A형 간염 바이러스(HAV), C형 간염 바이러스(HCV)(WO2004/111082 참조; 바람직하게는 유전자형 1b 균주 ja 유래 비구조적 HCV 단백질) 및 E형 간염 바이러스(HEV),
- 호흡기 융합 바이러스,
- 인유두종 바이러스(HPV; WO90/10459, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885 및 WO 2007/121894 참조; HPV16 균주 유래 E6 및 E7 단백질이 바람직함; 또한 문헌(LIU et al., 2004 Oct 5, Proc Natl Acad Sci U S A, 101 Suppl 2:14567-71)도 참조), 또는
- 인플루엔자 바이러스
로부터 유래할 수 있음]
* 박테리아 병원체, 예를 들어 살모넬라(Salmonella), 네이세리아(Neisseria), 보렐리아(Borrelia)(예를 들어 OspA 또는 OspB 또는 이의 유도체), 클라미디아(Chlamydia), 보르데텔라(Bordetella)(예를 들어 P.69, PT 및 FHA) 또는 마이코박테리아(mycobacteria)(특히 마이코박테리움 튜베르큘로시스( mycobacterium tuberculosis) 및 마이코박테리움 보비스(mycobacterium bovis)(WO2014/009438 및 WO2014/009433 참조),
* 기생체, 예를 들어 플라스모디움(Plasmodium) 또는 톡소플라스마(Toxoplasma)
로부터 유래한다.
더욱 바람직한 구현예에 의하면, 항원은 HCV, HPV 또는 마이코박테리아(특히 마이코박테리움 튜베르큘로시스 및 마이코박테리움 보비스)의 항원들, 특히 상기 언급된 것들로부터 선택된다. 이와 관련하여, 본 발명에 의한 액체 제제 중에 존재하는 것으로서 바람직한 재조합 백시니아 바이러스는 NS3, NS4 및 NS5B HCV 항원을 암호화하며, TG4040라고도 칭하여지는 MVA-HCV이다(WO2004/111082 참조).
물론, 본 발명에 의한 액체 제제 중에 존재하는 재조합 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)는 1개 초과의 외인성 서열을 포함할 수 있고, 각각의 외인성 서열은 1개 초과의 분자를 암호화할 수 있다.
예를 들어 동일한 재조합 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스) 내에
- 예를 들어 (전술된 바와 같은) TAA 또는 (전술된 바와 같은) 항원을 암호화하는 외인성 서열과,
- 시토킨(예를 들어 인터루킨(IL, 예를 들어 IL-2)); 종양 괴사 인자(TNF); 인터페론(IFN); 콜로니 자극 인자(CSF) 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GMCSF))을 암호화하는 외인성 서열
을 결합시키는 것이 유용할 수 있다.
이 점에 있어서, 본 발명에 의한 액체 제제 중에 존재하는 바람직한 재조합 백시니아 바이러스는
- MUC1 TAA 및 인간 IL-2를 암호화하는, TG4010이라고도 칭하여지는 MVA-[MUC1-IL2] (WO92/07000 및 WO95/09241 참조); 및
- 발암성 HPV-16 E6 및 E7 폴리펩티드와 인간 IL-2를 암호화하는, TG4001이라고도 칭하여지는 MVA-[HPV-IL2] (WO90/10459, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885, WO2007/121894 참조)
이다.
동일한 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스) 벡터 중에서 2개의 외인성 서열의 유용한 결합의 또 다른 예는
- 외인성 관심 서열, 예를 들어 전술된 모든 것들(특히 자살 유전자, 시토킨, TAA 또는 병원체 항원) 및
- 선별 마커를 암호화하는 외인성 서열[이 경우, 이와 같은 선별 마커는, 분명하게는 용이하게 검정될 수 있는 효소들, 예를 들어 베타-갈락토시다아제, 그린 형광 단백질 및 루시퍼라아제로부터 선택될 수 있음]
을 포함하는 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스) 벡터이다.
이 점에 있어서, 본 발명에 의한 액체 제제 중에 존재하는 바람직한 제조합 백시니아 바이러스는, J2R 유전자가 결손되었고, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 암호화하는 외인성 서열을 포함하는 백시니아 바이러스(바람직하게 와이어스 균주)이다[예를 들어 문헌(KIM JH et al., 2006 Sep, Mol Ther., 14(3):361-70 내지 BREITBACH CJ et al., 2011, Curr Pharm Biotechnol. Vol 12. No 12) 참조].
폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 제조 및 정제하기 위한 방법은 당 업계의 숙련자들에게 공지되어 있다. 예를 들어 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 제조 및 정제하기 위한 방법은, 본원에 참고문헌으로서 첨부되어 있는 WO2007/147528 및 WO2010/130753에 개시되어 있다.
백시니아 바이러스는, 분명하게
a) 팩키징 세포(packaging cell)의 배양액을 준비하는 단계;
b) 상기 팩키징 세포 배양액을 백시니아 바이러스로 감염시키는 단계;
c) 상기 감염된 팩키징 세포를, 자손 백시니아 바이러스가 생산될 때까지 배양하는 단계; 및
d) 생산된 백시니아 바이러스를 배양 상청액 및/또는 팩키징 세포로부터 수집하는 단계
에 의해 처음에 증식될 수 있다.
상기 단계 a)에서, 적합한 팩키징 세포는 증식될 백시니아 바이러스의 유형에 따라서 달라진다.
MVA는 엄격하게 숙주 제한적으로서, 조류 세포, 즉 1차 조류 세포(예를 들어 닭 배 섬유아세포 또는 CEF) 또는 무한증식된 조류 세포주, 특히
- 텔로머라아제 역 전사 효소(TERT)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 머스코비 오리(Cairina moschata) 무한증식 조류 세포주[ECACC(European Collection of Cell Cultures)에 승인 번호 08060502로 기탁된 세포주 T3-17490, 그리고 ECACC에 승인 번호 08060501로 기탁된 세포주 T6-17490(WO 2007/077256에 개시됨) 참조];
- E1A 핵산 서열과, 텔로머라아제 역 전사 효소(TERT)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 머스코비 오리 무한증식 조류 세포주(WO 2009/004016에 개시됨);
- 10일령 East Lansing Line(ELL-O) 알로부터 유래하는, 자발적으로 무한증식된 닭 세포주인 DF1 세포주(특허 US 5,879,924에 개시됨);
- 생장 인자로부터의 점진적 단절(pregressive severance) 및 배양보조세포층법에 의해 배 줄기 세포로부터 유래하는 Ebx 닭 세포주(WO2005/007840에 개시됨); 또는
- 오리의 배 영구 세포주인 DEC99 세포주(IVANOV et al. Experimental Pathology 내지 Parasitology, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences)
를 기반으로 증식될 수 있다.
기타 백시니아 바이러스 또는 기타 폭스 바이러스 균주에 있어서는 1차 조류 세포(예를 들어 CEC라고도 칭하여지는 CEF("닭 배 섬유아세포") 또는 "닭 배 세포") 및 조류 세포주 이외에, 다수의 기타 비 조류 세포주, 예를 들어 Hela, BHK-21, MRC-5, HEK-293 및 Vero 세포가 증식에 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, MVA 이외의 백시니아 바이러스는 Hela 세포 내에서 증식된다.
팩키징 세포는, 바람직하게 동물 또는 인간 기원의 생성물이 존재하지 않는, 화학적으로 한정된 배지가 사용되어 동물 또는 인간 유래 생성물이 존재하지 않는 배지 중에서 배양된다. 특히 생장 인자가 존재할 수 있을 때, 이 생장 인자는 바람직하게는 재조합 생산되고, 동물 재료로부터 정제되지는 않는다. 적당한 동물성 물질 불포함 배지는 선택된 팩키징 세포에 따라서 당 업계의 숙련자들에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 이러한 배지는 시판되고 있다. 특히 CEF가 팩키징 세포로서 사용될 때, 이 CEF는 VP-SEM 세포 배양 배지(Invitrogen) 중에 배양될 수 있다. CEF는 또한 감염되기 전, 바람직하게는 1일 내지 5일, 더욱 바람직하게 1일 내지 2일, 그리고 더욱더 바람직하게 2일 동안 배양되기도 한다. 바람직하게 CEF는 +30℃ 내지 +37℃에 포함되는 온도에서 추가로 배양된다. 비 조류 무한증식 세포주 세포가 사용될 때, 이러한 세포는 감염되기 전, 바람직하게 2일 내지 7일 동안 배양된다. 만일 다수의 비 조류 무한증식 세포가 필요하면, 2일 내지 7일 동안의 계대배양이 수 회 진행될 수 있으며, 그 결과 세포의 총 수가 증가하게 된다. 비 조류 무한증식 세포는 바람직하게 +36℃ 내지 +38℃에 포함되는 온도, 더욱 바람직하게 약 +37℃에서 추가로 배양된다.
단계 b)에서, 팩키징 세포는 적당한 조건 하에 (특히 적당한 감염 다중도(MOI)가 적용되어) 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)에 의해 감염되며, 그 결과 팩키징 세포의 증식성 감염이 허용된다. 특히 백시니아 바이러스가 MVA(특히 WO 90/10459, WO 92/07000, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885, WO 2004/111082, WO 2007/121894, WO 2014/009438 및 WO 2014/009433에 개시된 것)이고, CEF가 사용되어 증식될 때, 이 MVA는 CEF를 함유하는 세포 배양 용기에, 바람직하게 0.001 내지 0.2, 더욱 바람직하게 0.03 내지 0.07, 그리고 더욱더 바람직하게 약 0.05에 포함되는 MOI로 접종될 수 있다. 기타 백시니아 바이러스 균주, 특히 암 살상 백시니아 바이러스, 예를 들어 와이어스 및 코펜하겐 균주(특히 WO 2007/030668, WO 2008/113078, WO 2009/065546, WO 2009/065547에 개시된 것들)의 경우, 백시니아 바이러스는 팩키징 세포를 함유하는 세포 배양 용기에, 바람직하게는 0.0001 내지 0.1에 포함되는 MOI, 더욱더 바람직하게는 약 0.0001의 MOI로 접종될 수 있다. 감염 단계는 또한 바람직하게 동물 유래 생성물 또는 인간 유래 생성물이 존재하지 않는 배지(팩키징 세포의 배양에 사용되는 배지와 동일할 수 있거나 상이할 수 있는 배지) 중에서 동물 또는 인간 기원의 생성물을 포함하지 않는, 화학적으로 한정된 배지가 사용되어 수행된다. CEF 중 MVA의 경우, 단계 b)에 사용된 배양 배지는 바람직하게 기저 배지, 분명하게는 Basal Medium Eagle 세포 배양 배지(Invitrogen)이다.
단계 c)에서, 감염된 팩키징 세포는 이후 당 업계의 숙련자들에게 널리 공지된 적당한 조건 하에서 자손 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)가 생산될 때까지 배양된다. 감염된 팩키징 세포의 배양은 또한, 바람직하게 동물 유래 생성물 또는 인간 유래 생성물이 존재하지 않는 배지(팩키징 세포의 배양에 사용되는 배지와 동일할 수 있거나 상이할 수 있는 배지 및/또는 감염 단계용 배지) 중에서 동물 또는 인간 기원의 생성물을 포함하지 않는, 화학적으로 한정된 배지가 사용되어 수행된다. CEF를 기반으로 증식한 MVA의 경우, CEF는 분명하게 기저 배지, 분명하게 기저 배지 Eagle 세포 배양 배지(Invitrogen) 중에 +33℃ 내지 +37℃의 온도에서 1일 내지 4일 동안 배양될 수 있다. 비 조류 무한증식 세포주 중에서 생산된 기타 백시니아 바이러스 균주의 경우, 단계 c)는 분명하게 1일 내지 4일 동안 +35℃ 내지 +38℃에서 수행될 수 있다.
단계 d)에서, 단계 c)에서 생산된 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)는 배양 상청액 및/또는 팩키징 세포로부터 수집된다. 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)가 팩키징 세포로부터 수집될 때(그리고 선택적으로는 배양 상청액으로부터 수집될 때), 단계 d)는 팩키징 세포막의 파열을 허용하는 단계에 선행될 수 있다. 이 단계는 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)의 팩키징 세포로부터의 유리(liberation)를 초래한다. 팩키징 세포막의 파열은 당 업계의 숙련자들에게 널리 공지된 다양한 기술, 예를 들어 동결/해동, 저장 용해(hypotonic lysis), 초음파 분해, 미세유동화 또는 고속 균질화(이에 한정되는 것은 아님)에 의해 유도될 수 있다.
그 다음, 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)는 당 업계에 널리 공지된 정제 단계들, 예를 들어
- 팩키징 세포 DNA를 제거하기 위한, 적어도 1개 뉴클레아제의 처리,
- 팩키징 세포 단백질을 제거하기 위한, 적어도 1개 프로테아제의 처리,
- (특히 염화세슘 구배를 통한) 초 원심 분리, 여과(특히 심층 여과) 또는 크로마토그래피(특히 이온 교환 크로마토그래피)가 사용되는, 오염물질로부터의 폭스 바이러스 분리
가 사용되어 추가로 정제될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 제제 중에 존재하는 백시니아 바이러스는, CEF를 기반으로 증식된 MVA 바이러스(특히 WO 90/10459, WO 92/07000, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885, WO 2004/111082, WO 2007/121894, WO 2014/009438 및 WO 2014/009433에 개시된 것), 더욱 바람직하게 CEF를 기반으로 증식되었으며, 적어도 1개 프로테아제의 처리 단계에 보내어지지 않은 MVA 바이러스(특히 WO 90/10459, WO 92/07000, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885, WO 2004/111082, WO 2007/121894, WO 2014/009438 및 WO 2014/009433에 개시된 것)이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 제제 중에 존재하는 백시니아 바이러스는 무한증식된 조류 세포주(예를 들어 텔로머라아제 역 전사 효소(TERT)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 머스코비 오리 무한증식 조류 세포주, E1A 핵산 서열 및 텔로머라아제 역 전사 효소(TERT)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 머스코비 오리 무한증식 조류 세포주, DF1 세포주, Ebx 세포주 또는 DEC99 세포주)를 기반으로 증식된 MVA 바이러스(특히 WO90/10459, WO92/07000, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885, WO2004/111082, WO2007/121894, WO2014/009438 및 WO2014/009433에 개시된 것)이고, 더욱 바람직하게는 적어도 1개 프로테아제의 처리 단계를 적어도 1회 거치지 않은 무한증식 조류 세포주(예를 들어 상기 언급된 것)를 기반으로 증식된 MVA 바이러스(특히 WO 90/10459, WO 92/07000, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885, WO 2004/111082, WO 2007/121894, WO 2014/009438 및 WO 2014/009433에 개시된 것)이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 제제 중에 존재하는 백시니아 바이러스는, Hela 세포를 기반으로 증식된 와이어스 또는 코펜하겐 백시니아 바이러스(특히 WO 2007/030668, WO 2008/113078, WO 2009/065546, WO 2009/065547에 개시된 것), 더욱 바람직하게 적어도 1개 프로테아제의 처리 단계를 적어도 1회 거친 Hela 세포를 기반으로 증식된 와이어스 또는 코펜하겐 백시니아 바이러스(특히 WO2007/030668, WO2008/113078, WO2009/065546, WO2009/06554에 개시된 것)이다.
pH 및 완충제
본 발명에 의한 액체 제제의 pH는 6.5 내지 8.5에 포함된다. 특히 본 발명에 의한 액체 제제의 pH는 6.5 내지 8.4, 6.5 내지 8.3, 6.5 내지 8.2, 6.5 내지 8.1, 6.5 내지 8.0, 6.5 내지 7.9, 6.5 내지 7.8, 6.5 내지 7.7, 6.5 내지 7.6, 6.5 내지 7.5, 6.6 내지 8.5, 6.6 내지 8.4, 6.6 내지 8.3, 6.6 내지 8.2, 6.6 내지 8.1, 6.6 내지 8.0, 6.6 내지 7.9, 6.6 내지 7.8, 6.6 내지 7.7, 6.6 내지 7.6, 6.6 내지 7.5, 6.7 내지 8.5, 6.7 내지 8.4, 6.7 내지 8.3, 6.7 내지 8.2, 6.7 내지 8.1, 6.7 내지 8.0, 6.7 내지 7.9, 6.7 내지 7.8, 6.7 내지 7.7, 6.7 내지 7.6, 6.7 내지 7.5, 6.8 내지 8.5, 6.8 내지 8.4, 6.8 내지 8.3, 6.8 내지 8.2, 6.8 내지 8.1, 6.8 내지 8.0, 6.8 내지 7.9, 6.8 내지 7.8, 6.8 내지 7.7, 6.8 내지 7.6, 6.8 내지 7.5, 6.9 내지 8.5, 6.9 내지 8.4, 6.9 내지 8.3, 6.9 내지 8.2, 6.9 내지 8.1, 6.9 내지 8.0, 6.9 내지 7.9, 6.9 내지 7.8, 6.9 내지 7.7, 6.9 내지 7.6, 6.9 내지 7.5, 7 내지 8.5, 7 내지 8.4, 7 내지 8.3, 7 내지 8.2, 7 내지 8.1, 7 내지 8, 7 내지 7.9, 7 내지 7.8, 7 내지 7.7, 7 내지 7.6, 7 내지 7.5, 7.1 내지 8.5, 7.1 내지 8.4, 7.1 내지 8.3, 7.1 내지 8.2, 7.1 내지 8.1, 7.1 내지 8, 7.1 내지 7.9, 7.1 내지 7.8, 7.1 내지 7.7, 7.1 내지 7.6, 7.1 내지 7.5, 7.2 내지 8.5, 7.2 내지 8.4, 7.2 내지 8.3, 7.2 내지 8.2, 7.2 내지 8.1, 7.2 내지 8, 7.2 내지 7.9, 7.2 내지 7.8, 7.2 내지 7.7, 7.2 내지 7.6, 7.2 내지 7.5, 7.3 내지 8.5, 7.3 내지 8.4, 7.3 내지 8.3, 7.3 내지 8.2, 7.3 내지 8.1, 7.3 내지 8, 7.3 내지 7.9, 7.3 내지 7.8, 7.3 내지 7.7, 7.3 내지 7.6, 7.3 내지 7.5, 7.4 내지 8.5, 7.4 내지 8.4, 7.4 내지 8.3, 7.4 내지 8.2, 7.4 내지 8.1, 7.4 내지 8, 7.4 내지 7.9, 7.4 내지 7.8, 7.4 내지 7.7, 7.4 내지 7.6, 7.4 내지 7.5, 7.5 내지 8.5, 7.5 내지 8.4, 7.5 내지 8.3, 7.5 내지 8.2, 7.5 내지 8.1, 7.5 내지 8, 7.5 내지 7.9, 7.5 내지 7.8, 7.5 내지 7.7, 또는 7.5 내지 7.6에 포함될 수 있다. 바람직하게 본 발명에 의한 액체 제제의 pH는 7 내지 8이고, 더욱 특히 7.5에 가까우며, 특히 7.2 내지 7.8, 7.3 내지 7.7, 7.4 내지 7.6에 포함되거나, 또는 약 7.5이다.
이 pH를 유지하기 위하여, 본 발명에 의한 액체 제제는 제제의 pH에서 완충 능을 가지는 완충제를 포함한다. 이러한 완충제는 당 업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있고, 분명하게는 다음과 같은 완충제들
- TRIS-HCl (트리스(하이드록시메틸)메틸아민-HCl),
- TRIS (트리스(하이드록시메틸)메틸아민),
- HEPES (4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산),
- Na2HPO4 및 KH2PO4의 혼합물, 또는 Na2HPO4 및 NaH2PO4의 혼합물을 포함하는인산염 완충제,
- ACES (N-(2-아세트아미도)-아미노에탄설폰산),
- PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)),
- MOPSO (3-(N-모폴리노)-2-하이드록시프로판설폰산),
- BIS-트리스-프로판 (1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]프로판),
- BES (N,N-비스(2-하이드록시에틸)2-아미노에탄 설폰산)
- MOPS (3-(N-모폴리노)프로판설폰산),
- TES (2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산),
- DIPSO (3-[비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판-1-설폰산),
- MOBS (4-(N-모폴리노)부탄설폰산),
- TAPSO (3-[N-트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-2-하이드록시프로판설폰산),
- HEPPSO (4-(2-하이드록시에틸)-피페라진-1-(2-하이드록시)-프로판설폰산),
- POPSO (2-하이드록시-3-[4-(2-하이드록시-3-설포프로필)피페라진-1-일]프로판-1-설폰산),
- TEA (트리에탄올아민),
- EPPS (N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-3-프로판설폰산), 그리고
- TRICINE (N-[트리스(하이드록시메틸)-메틸]-글리신)
을 포함한다.
바람직하게 상기 완충제는 TRIS-HCl, TRIS, 트리신, HEPES, 그리고 Na2HPO4 및 KH2PO4의 혼합물, 또는 Na2HPO4 및 NaH2PO4의 혼합물을 포함하는 인산염 완충제로부터 선택된다. 더욱 바람직하게, 상기 완충제는 TRIS-HCl, TRIS 또는 트리신 완충제로부터 선택되고, 더욱 바람직하게 상기 완충제는 TRIS-HCl 또는 TRIS 완충제이며, 더욱더 바람직하게 상기 완충제는 TRIS-HCl 완충제이다.
상기 완충제(특히 상기 언급된 것들, 분명하게는 TRIS-HCl)는 바람직하게 10 mM 내지 50 mM의 농도로 존재한다. 완충제는 특히 10 내지 45 mM, 10 내지 40 mM, 10 내지 35 mM, 10 내지 30 mM, 10 내지 25 mM, 10 내지 20 mM, 10 내지 15 mM, 15 내지 50 mM, 15 내지 45 mM, 15 내지 40 mM, 15 내지 35 mM, 15 내지 30 mM, 15 내지 25 mM, 15 내지 20 mM, 20 내지 50 mM, 20 내지 45 mM, 20 내지 40 mM, 20 내지 35 mM, 20 내지 30 mM, 20 내지 25 mM, 25 내지 50 mM, 25 내지 45 mM, 25 내지 40 mM, 25 내지 35 mM, 25 내지 30 mM, 30 내지 50 mM, 30 내지 45 mM, 30 내지 40 mM, 30 내지 35 mM, 35 내지 50 mM, 35 내지 45 mM, 35 내지 40 mM, 40 내지 50 mM, 40 내지 45 mM, 또는 45 내지 50 mM의 농도로 존재할 수 있다. 바람직하게 상기 완충제(특히 상기 언급된 것들, 분명하게는 TRIS-HCl)는 바람직하게 10 내지 40 mM, 특히 10 내지 30 mM의 농도로 존재한다.
1가 염
본 발명에 의한 액체 제제는 1가 염을 포함한다. 이 1가 염은 적당한 삼투압을 보장하는 것으로 생각된다. 더욱이 상기 1가 염은 또한 본 제제 중에 존재할 수 있는 프로테아제의 억제 특성을 가져서, 안정성을 개선하는 것으로 생각된다. 이러한 프로테아제는 팩키징 세포가 파열될 때 유리된 세포 프로테아제를 포함할 뿐만 아니라, 또한 제제 중에 존재하는 백시니아 바이러스가 프로테아제의 사용을 수반하는 방법에 의해 정제될 때에는 상기 첨가된 프로테아제 중 나머지 미량 프로테아제를 포함한다. 유의적 1가 염 농도의 프로테아제에 미치는 억제 효과가 당 업계에 기록되어 있다[문헌(T
Figure pct00001
UGU V et al. Eur J Biochem. 1994 Jun , 222(2):475-81) 참조]. 예를 들어 Pierce 트립신 프로테아제(Thermo Scientific)의 경우, 제조자는 지시문에 1가 염의 농도가 높으면(예를 들어 >100 mM NaCl) 트립신 활성이 억제될 수 있음을 안내하고 있다.
상기 1가 염은, 분명하게 NaCl 및 KCl로부터 선택될 수 있고, 바람직하게 상기 1가 염은 NaCl이다.
상기 1가 염(특히 NaCl)은 바람직하게 10 내지 1000 mM의 농도로 존재한다. 이 1가 염은, 분명하게 10 내지 950 mM, 10 내지 900 mM, 10 내지 850 mM, 10 내지 800 mM, 10 내지 750 mM, 10 내지 700 mM, 10 내지 650 mM, 10 내지 600 mM, 10 내지 550 mM, 10 내지 500 mM, 10 내지 450 mM, 10 내지 400 mM, 10 내지 350 mM, 10 내지 300 mM, 10 내지 250 mM, 10 내지 200 mM, 10 내지 150 mM, 10 내지 100 mM, 10 내지 90 mM, 10 내지 80 mM, 10 내지 75 mM, 10 내지 70 mM, 10 내지 60 mM, 10 내지 50 mM, 10 내지 40 mM, 10 내지 30 mM, 10 내지 25 mM, 10 내지 20 mM, 20 내지 1000 mM, 20 내지 950 mM, 20 내지 900 mM, 20 내지 850 mM, 20 내지 800 mM, 20 내지 750 mM, 20 내지 700 mM, 20 내지 650 mM, 20 내지 600 mM, 20 내지 550 mM, 20 내지 500 mM, 20 내지 450 mM, 20 내지 400 mM, 20 내지 350 mM, 20 내지 300 mM, 20 내지 250 mM, 20 내지 200 mM, 20 내지 150 mM, 20 내지 100 mM, 20 내지 90 mM, 20 내지 80 mM, 20 내지 75 mM, 20 내지 70 mM, 20 내지 60 mM, 20 내지 50 mM, 20 내지 40 mM, 20 내지 30 mM, 20 내지 25 mM, 25 내지 1000 mM, 25 내지 950 mM, 25 내지 900 mM, 25 내지 850 mM, 25 내지 800 mM, 25 내지 750 mM, 25 내지 700 mM, 25 내지 650 mM, 25 내지 600 mM, 25 내지 550 mM, 25 내지 500 mM, 25 내지 450 mM, 25 내지 400 mM, 25 내지 350 mM, 25 내지 300 mM, 25 내지 250 mM, 25 내지 200 mM, 25 내지 150 mM, 25 내지 100 mM, 25 내지 90 mM, 25 내지 80 mM, 25 내지 75 mM, 25 내지 70 mM, 25 내지 60 mM, 25 내지 50 mM, 25 내지 40 mM, 25 내지 30 mM, 30 내지 1000 mM, 30 내지 950 mM, 30 내지 900 mM, 30 내지 850 mM, 30 내지 800 mM, 30 내지 750 mM, 30 내지 700 mM, 30 내지 650 mM, 30 내지 600 mM, 30 내지 550 mM, 30 내지 500 mM, 30 내지 450 mM, 30 내지 400 mM, 30 내지 350 mM, 30 내지 300 mM, 30 내지 250 mM, 30 내지 200 mM, 30 내지 150 mM, 30 내지 100 mM, 30 내지 90 mM, 30 내지 80 mM, 30 내지 75 mM, 30 내지 70 mM, 30 내지 60 mM, 30 내지 50 mM, 30 내지 40 mM, 40 내지 1000 mM, 40 내지 950 mM, 40 내지 900 mM, 40 내지 850 mM, 40 내지 800 mM, 40 내지 750 mM, 40 내지 700 mM, 40 내지 650 mM, 40 내지 600 mM, 40 내지 550 mM, 40 내지 500 mM, 40 내지 450 mM, 40 내지 400 mM, 40 내지 350 mM, 40 내지 300 mM, 40 내지 250 mM, 40 내지 200 mM, 40 내지 150 mM, 40 내지 100 mM, 40 내지 90 mM, 40 내지 80 mM, 40 내지 75 mM, 40 내지 70 mM, 40 내지 60 mM, 40 내지 50 mM, 50 내지 1000 mM, 50 내지 950 mM, 50 내지 900 mM, 50 내지 850 mM, 50 내지 800 mM, 50 내지 750 mM, 50 내지 700 mM, 50 내지 650 mM, 50 내지 600 mM, 50 내지 550 mM, 50 내지 500 mM, 50 내지 450 mM, 50 내지 400 mM, 50 내지 350 mM, 50 내지 300 mM, 50 내지 250 mM, 50 내지 200 mM, 50 내지 150 mM, 50 내지 100 mM, 50 내지 90 mM, 50 내지 80 mM, 50 내지 75 mM, 50 내지 70 mM, 50 내지 60 mM, 60 내지 1000 mM, 60 내지 950 mM, 60 내지 900 mM, 60 내지 850 mM, 60 내지 800 mM, 60 내지 750 mM, 60 내지 700 mM, 60 내지 650 mM, 60 내지 600 mM, 60 내지 550 mM, 60 내지 500 mM, 60 내지 450 mM, 60 내지 400 mM, 60 내지 350 mM, 60 내지 300 mM, 60 내지 250 mM, 60 내지 200 mM, 60 내지 150 mM, 60 내지 100 mM, 60 내지 90 mM, 60 내지 80 mM, 60 내지 75 mM, 60 내지 70 mM, 70 내지 1000 mM, 70 내지 950 mM, 70 내지 900 mM, 70 내지 850 mM, 70 내지 800 mM, 70 내지 750 mM, 70 내지 700 mM, 70 내지 650 mM, 70 내지 600 mM, 70 내지 550 mM, 70 내지 500 mM, 70 내지 450 mM, 70 내지 400 mM, 70 내지 350 mM, 70 내지 300 mM, 70 내지 250 mM, 70 내지 200 mM, 70 내지 150 mM, 70 내지 100 mM, 70 내지 90 mM, 70 내지 80 mM, 70 내지 75 mM, 75 내지 1000 mM, 75 내지 950 mM, 75 내지 900 mM, 75 내지 850 mM, 75 내지 800 mM, 75 내지 750 mM, 75 내지 700 mM, 75 내지 650 mM, 75 내지 600 mM, 75 내지 550 mM, 75 내지 500 mM, 75 내지 450 mM, 75 내지 400 mM, 75 내지 350 mM, 75 내지 300 mM, 75 내지 250 mM, 75 내지 200 mM, 75 내지 150 mM, 75 내지 100 mM, 75 내지 90 mM, 75 내지 80 mM, 80 내지 1000 mM, 80 내지 950 mM, 80 내지 900 mM, 80 내지 850 mM, 80 내지 800 mM, 80 내지 750 mM, 80 내지 700 mM, 80 내지 650 mM, 80 내지 600 mM, 80 내지 550 mM, 80 내지 500 mM, 80 내지 450 mM, 80 내지 400 mM, 80 내지 350 mM, 80 내지 300 mM, 80 내지 250 mM, 80 내지 200 mM, 80 내지 150 mM, 80 내지 100 mM, 80 내지 90 mM, 90 내지 1000 mM, 90 내지 950 mM, 90 내지 900 mM, 90 내지 850 mM, 90 내지 800 mM, 90 내지 750 mM, 90 내지 700 mM, 90 내지 650 mM, 90 내지 600 mM, 90 내지 550 mM, 90 내지 500 mM, 90 내지 450 mM, 90 내지 400 mM, 90 내지 350 mM, 90 내지 300 mM, 90 내지 250 mM, 90 내지 200 mM, 90 내지 150 mM, 90 내지 100 mM, 100 내지 1000 mM, 100 내지 950 mM, 100 내지 900 mM, 100 내지 850 mM, 100 내지 800 mM, 100 내지 750 mM, 100 내지 700 mM, 100 내지 650 mM, 100 내지 600 mM, 100 내지 550 mM, 100 내지 500 mM, 100 내지 450 mM, 100 내지 400 mM, 100 내지 350 mM, 100 내지 300 mM, 100 내지 250 mM, 100 내지 200 mM, 100 내지 150 mM, 150 내지 1000 mM, 150 내지 950 mM, 150 내지 900 mM, 150 내지 850 mM, 150 내지 800 mM, 150 내지 750 mM, 150 내지 700 mM, 150 내지 650 mM, 150 내지 600 mM, 150 내지 550 mM, 150 내지 500 mM, 150 내지 450 mM, 150 내지 400 mM, 150 내지 350 mM, 150 내지 300 mM, 150 내지 250 mM, 150 내지 200, 200 내지 1000 mM, 200 내지 950 mM, 200 내지 900 mM, 200 내지 850 mM, 200 내지 800 mM, 200 내지 750 mM, 200 내지 700 mM, 200 내지 650 mM, 200 내지 600 mM, 200 내지 550 mM, 200 내지 500 mM, 200 내지 450 mM, 200 내지 400 mM, 200 내지 350 mM, 200 내지 300 mM, 200 내지 250 mM, 250 내지 1000 mM, 250 내지 950 mM, 250 내지 900 mM, 250 내지 850 mM, 250 내지 800 mM, 250 내지 750 mM, 250 내지 700 mM, 250 내지 650 mM, 250 내지 600 mM, 250 내지 550 mM, 250 내지 500 mM, 250 내지 450 mM, 250 내지 400 mM, 250 내지 350 mM, 250 내지 300 mM, 300 내지 1000 mM, 300 내지 950 mM, 300 내지 900 mM, 300 내지 850 mM, 300 내지 800 mM, 300 내지 750 mM, 300 내지 700 mM, 300 내지 650 mM, 300 내지 600 mM, 300 내지 550 mM, 300 내지 500 mM, 300 내지 450 mM, 300 내지 400 mM, 300 내지 350 mM, 350 내지 1000 mM, 350 내지 950 mM, 350 내지 900 mM, 350 내지 850 mM, 350 내지 800 mM, 350 내지 750 mM, 350 내지 700 mM, 350 내지 650 mM, 350 내지 600 mM, 350 내지 550 mM, 350 내지 500 mM, 350 내지 450 mM, 350 내지 400 mM, 400 내지 1000 mM, 400 내지 950 mM, 400 내지 900 mM, 400 내지 850 mM, 400 내지 800 mM, 400 내지 750 mM, 400 내지 700 mM, 400 내지 650 mM, 400 내지 600 mM, 400 내지 550 mM, 400 내지 500 mM, 400 내지 450 mM, 450 내지 1000 mM, 450 내지 950 mM, 450 내지 900 mM, 450 내지 850 mM, 450 내지 800 mM, 450 내지 750 mM, 450 내지 700 mM, 450 내지 650 mM, 450 내지 600 mM, 450 내지 550 mM, 또는 450 내지 500 mM의 농도로 존재할 수 있다.
MVA(특히 WO 90/10459, WO 92/07000, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885, WO 2004/111082, WO 2007/121894, WO 2014/009438 및 WO 2014/009433에 개시된 것)는 일반적으로 1차 조류 세포 중에서 증식되는데, 이 경우, 1차 세포는 위험한 것으로 간주되지 않으므로 1차 조류 세포 단백질 제거를 위한 프로테아제 처리는 필요하지 않다. 그러므로 MVA, 더욱 일반적으로 본 제제 중에 존재하는 폭스 바이러스(바람직하게 백시니아 바이러스)가 적어도 1개 프로테아제의 처리를 수반하지 않는 방법에 의해 정제되었을 때, 상기 1가 염(특히 NaCl)은 비교적 낮은 농도, 분명하게 10 내지 200 mM, 10 내지 150 mM, 10 내지 100 mM, 10 내지 90 mM, 10 내지 80 mM, 10 내지 75 mM, 20 내지 200 mM, 20 내지 150 mM, 20 내지 100 mM, 20 내지 90 mM, 20 내지 80 mM, 20 내지 75 mM, 25 내지 200 mM, 25 내지 150 mM, 25 내지 100 mM, 25 내지 90 mM, 25 내지 80 mM, 25 내지 75 mM, 30 내지 200 mM, 30 내지 150 mM, 30 내지 100 mM, 30 내지 90 mM, 30 내지 80 mM, 30 내지 75 mM, 40 내지 200 mM, 40 내지 150 mM, 40 내지 100 mM, 40 내지 90 mM, 40 내지 80 mM, 40 내지 75 mM, 50 내지 200 mM, 50 내지 150 mM, 50 내지 100 mM, 50 내지 90 mM, 50 내지 80 mM, 50 내지 75 mM, 60 내지 200 mM, 60 내지 150 mM, 60 내지 100 mM, 60 내지 90 mM, 60 내지 80 mM, 60 내지 75 mM, 70 내지 200 mM, 70 내지 150 mM, 70 내지 100 mM, 70 내지 90 mM, 70 내지 80 mM, 또는 70 내지 75 mM의 농도, 더욱 바람직하게 75 mM에 가까운 농도, 예를 들어 50 내지 100 mM, 60 내지 90 mM, 70 내지 80 mM, 또는 약 75 mM의 농도로 존재할 수 있다.
폭스 바이러스의 기타 균주, 특히 암 살상 백시니아 바이러스, 예를 들어 와이어스 또는 코펜하겐 백시니아 바이러스(분명하게 WO2007/030668, WO2008/113078, WO2009/065546, WO2009/065547에 개시된 것)는 일반적으로 다양한 무한증식 세포주를 기반으로 증식된다. 이와 같은 세포주들 중 일부는 암 유전자를 함유할 수 있는데, 이러한 경우에 생산 세포 DNA 및 단백질의 제거 또는 적어도 급격한 감소가 보건 당국에 의해 요구된다. 이러한 목적으로, 정제 방법은 일반적으로 적어도 1개 프로테아제의 처리 단계를 적어도 1회 수행하는 것을 포함한다. 특히 액체 제제 중 프로테아제(들) 나머지 미량은 백시니아 바이러스 안정성에 유해 효과를 보인다. 이러한 점에서, 본 발명의 발명자들은 상기 1가 염(특히 NaCl)의 농도가 증가하면 백시니아 바이러스의 안정성 개선이 초래됨을 발견하였다. 이론에 의해 국한되지 않을 때, 상기 1가 염(특히 NaCl)의 증가한 농도는 프로테아제(들) 나머지 미량에 억제 효과를 발휘하는 것으로 생각된다.
그러므로, 본 제제 중에 존재하는 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)가, 적어도 1개 프로테아제의 처리 단계를 적어도 1회 수행하는 것을 수반하는 방법에 의해 정제되었을 때, 상기 1가 염(특히 NaCl)은, 바람직하게 100 내지 1000 mM, 100 내지 950 mM, 100 내지 900 mM, 100 내지 850 mM, 100 내지 800 mM, 100 내지 750 mM, 100 내지 700 mM, 100 내지 650 mM, 100 내지 600 mM, 100 내지 550 mM, 100 내지 500 mM, 100 내지 450 mM, 100 내지 400 mM, 100 내지 350 mM, 100 내지 300 mM, 100 내지 250 mM, 100 내지 200 mM, 150 내지 1000 mM, 150 내지 950 mM, 150 내지 900 mM, 150 내지 850 mM, 150 내지 800 mM, 150 내지 750 mM, 150 내지 700 mM, 150 내지 650 mM, 150 내지 600 mM, 150 내지 550 mM, 150 내지 500 mM, 150 내지 450 mM, 150 내지 400 mM, 150 내지 350 mM, 150 내지 300 mM, 150 내지 250 mM, 150 내지 200, 200 내지 1000 mM, 200 내지 950 mM, 200 내지 900 mM, 200 내지 850 mM, 200 내지 800 mM, 200 내지 750 mM, 200 내지 700 mM, 200 내지 650 mM, 200 내지 600 mM, 200 내지 550 mM, 200 내지 500 mM, 200 내지 450 mM, 200 내지 400 mM, 200 내지 350 mM, 200 내지 300 mM, 200 내지 250 mM, 250 내지 1000 mM, 250 내지 950 mM, 250 내지 900 mM, 250 내지 850 mM, 250 내지 800 mM, 250 내지 750 mM, 250 내지 700 mM, 250 내지 650 mM, 250 내지 600 mM, 250 내지 550 mM, 250 내지 500 mM, 250 내지 450 mM, 250 내지 400 mM, 250 내지 350 mM, 250 내지 300 mM, 300 내지 1000 mM, 300 내지 950 mM, 300 내지 900 mM, 300 내지 850 mM, 300 내지 800 mM, 300 내지 750 mM, 300 내지 700 mM, 300 내지 650 mM, 300 내지 600 mM, 300 내지 550 mM, 300 내지 500 mM, 300 내지 450 mM, 300 내지 400 mM, 300 내지 350 mM, 350 내지 1000 mM, 350 내지 950 mM, 350 내지 900 mM, 350 내지 850 mM, 350 내지 800 mM, 350 내지 750 mM, 350 내지 700 mM, 350 내지 650 mM, 350 내지 600 mM, 350 내지 550 mM, 350 내지 500 mM, 350 내지 450 mM, 350 내지 400 mM, 400 내지 1000 mM, 400 내지 950 mM, 400 내지 900 mM, 400 내지 850 mM, 400 내지 800 mM, 400 내지 750 mM, 400 내지 700 mM, 400 내지 650 mM, 400 내지 600 mM, 400 내지 550 mM, 400 내지 500 mM, 400 내지 450 mM, 450 내지 1000 mM, 450 내지 950 mM, 450 내지 900 mM, 450 내지 850 mM, 450 내지 800 mM, 450 내지 750 mM, 450 내지 700 mM, 450 내지 650 mM, 450 내지 600 mM, 450 내지 550 mM, 또는 450 내지 500 mM의 농도로 존재한다. 예를 들어 상기 1가 염은 200 mM에 가까운 농도, 예를 들어 100 내지 300 mM, 150 내지 250 mM, 또는 약 200 mM의 농도로 존재할 수 있다. 대안적으로, 상기 1가 염은 500 mM에 가까운 농도, 예를 들어 250 내지 750 mM, 400 내지 600 mM, 또는 약 500 mM의 농도로 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 1가 염은 750 mM에 가까운 농도, 예를 들어 500 내지 1000 mM, 700 내지 800 mM, 또는 약 750 mM의 농도로 존재할 수 있다.
이당체 또는 당 알코올
본 발명에 의한 액체 제제는 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올을 포함한다.
이 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올은 동해방지제로서, 낮은 보관 온도, 예를 들어 약 +5℃에서 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)를 보호하는 것으로 생각된다. 뿐만 아니라, 이와 같이 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올은 액체 제제의 점도를 증가시키는데, 이 점은 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스) 및 잠재적으로 유해한 화합물 간 상호작용을 제한할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올은, 분명하게 수크로스, 트레할로스, 말토스, 락토스, 만니톨 및 솔비톨로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게 상기 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올은 수크로스이다.
약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올(특히 상기 언급된 것들, 분명하게 수크로스)은, 바람직하게 5 내지 20%(중량(g)/부피(L), 즉 w/v로서 지칭됨)의 농도로 존재한다. 특히 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올은 5 내지 19 %(w/v), 5 내지 18 %(w/v), 5 내지 17 %(w/v), 5 내지 16 %(w/v), 5 내지 15 %(w/v), 5 내지 14 %(w/v), 5 내지 13 %(w/v), 5 내지 12 %(w/v), 5 내지 11 %(w/v), 5 내지 10 %(w/v), 6 내지 20 %(w/v), 6 내지 19 %(w/v), 6 내지 18 %(w/v), 6 내지 17 %(w/v), 6 내지 16 %(w/v), 6 내지 15 %(w/v), 6 내지 14 %(w/v), 6 내지 13 %(w/v), 6 내지 12 %(w/v), 6 내지 11 %(w/v), 6 내지 10 %(w/v), 7 내지 20 %(w/v), 7 내지 19 %(w/v), 7 내지 18 %(w/v), 7 내지 17 %(w/v), 7 내지 16 %(w/v), 7 내지 15 %(w/v), 7 내지 14 %(w/v), 7 내지 13 %(w/v), 7 내지 12 %(w/v), 7 내지 11 %(w/v), 7 내지 10 %(w/v), 8 내지 20 %(w/v), 8 내지 19 %(w/v), 8 내지 18 %(w/v), 8 내지 17 %(w/v), 8 내지 16 %(w/v), 8 내지 15 %(w/v), 8 내지 14 %(w/v), 8 내지 13 %(w/v), 8 내지 12 %(w/v), 8 내지 11 %(w/v), 8 내지 10 %(w/v), 9 내지 20 %(w/v), 9 내지 19 %(w/v), 9 내지 18 %(w/v), 9 내지 17 %(w/v), 9 내지 16 %(w/v), 9 내지 15 %(w/v), 9 내지 14 %(w/v), 9 내지 13 %(w/v), 9 내지 12 %(w/v), 9 내지 11 %(w/v), 또는 9 내지 10 %(w/v)의 농도로 존재할 수 있다. 바람직하게 상기 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올(특히 상기 언급된 것들, 분명하게 수크로스)은, 바람직하게 10 %(w/v)에 가까운 농도, 예를 들어 5 내지 15 %(w/v), 6 내지 14 %(w/v), 7 내지 13 %(w/v), 8 내지 12 %(w/v), 9 내지 11 %(w/v), 또는 약 10%의 농도로 존재한다.
킬레이트화제
본 발명에 의한 액체 제제는 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제, 특히 2가 양이온을 킬레이트화하는 제제를 포함한다.
상기 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제가 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)의 액체 상태에서의 안정성을 개선하는 이유는 그다지 이해되지 못하고 있다. 정말로, 배경 기술 섹션에 설명되어 있는 바와 같이, 바이러스 안정성에 대한 EDTA의 효과는 상이한 바이러스들 간에 유의적으로 상이하고, EDTA가 유익 효과를 발휘하는 바이러스 대 EDTA가 유익 효과를 발휘하지 않거나, 심지어 유해 효과를 보이는 바이러스의 분명한 분류는 용이하게 이루어질 수 없다. 특히 유의적인 유익 효과가 아데노바이러스(외피 비보유 DNA 바이러스, 문헌(EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75) 및 US7,456,009 참조)에 대해서 발견되었을 때, 유의적 유익 효과는 인플루엔자 바이러스(외피보유 RNA 바이러스(US2007/0161085 참조)), 개 파르보바이러스(외피 비보유 DNA 바이러스), 제2형 개 아데노 바이러스(외피 비보유 DNA 바이러스), 개 디스템퍼 바이러스(외피보유 RNA 파라믹소 바이러스) 및 개 파라인플루엔자 바이러스(외피보유 RNA 파라믹소 바이러스)(WO2014/029702 참조)에 대해서는 발견되지 않았다. 마지막으로, 뉴캐슬(Newcastle) 바이러스(외피보유 RNA 파라믹소 바이러스)(US 7,914,979 참조)에 대하여 유해 효과가 관찰되었다.
그러나, 실험 섹션에서 증명된 바와 같이, 상기 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제는 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)의, 본 발명에 의한 액체 제제 중 안정화에 있어 필수적인 역할을 담당한다.
약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제는, 분명하게 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), 디머캅토숙신산(DMSA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA) 및 2,3-디머캅토-1-프로판설폰산(DMPS)으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게 상기 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제는 EDTA이다.
약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제(특히 상기 언급된 것, 분명하게 EDTA)는 바람직하게 적어도 50 μM의 농도로 존재한다. 특히 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제는 50 내지 1000 μM, 50 내지 750 μM, 50 내지 500 μM, 50 내지 400 μM, 50 내지 300 μM, 50 내지 250 μM, 50 내지 200 μM, 50 내지 150 μM; 50 내지 100 μM, 50 내지 75 μM, 75 내지 1000 μM, 75 내지 750 μM, 75 내지 500 μM, 75 내지 400 μM, 75 내지 300 μM, 75 내지 250 μM, 75 내지 200 μM, 75 내지 150 μM; 75 내지 100 μM, 100 내지 1000 μM, 100 내지 750 μM, 100 내지 500 μM, 100 내지 400 μM, 100 내지 300 μM, 100 내지 250 μM, 100 내지 200 μM, 100 내지 150 μM; 150 내지 1000 μM, 150 내지 750 μM, 150 내지 500 μM, 150 내지 400 μM, 150 내지 300 μM, 150 내지 250 μM, 150 내지 200 μM의 농도로 존재할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제(특히 상기 언급된 것, 분명하게 EDTA)는 분명하게 150 μM에 가까운 농도, 예를 들어 50 내지 250 μM, 100 내지 200 μM, 또는 약 150 μM의 농도로 존재할 수 있다. 그러나 더 높은 농도로도 존재할 수 있는데, 그 이유는 낮은 농도에서조차 안정성에 대해 유해 효과가 관찰되지 않았기 때문이다.
선택적 추가 성분
본 발명에 의한 액체 제제는 백시니아 바이러스에 안정화 효과를 발휘하는 추가 화합물을 더 포함할 수 있다.
C 2 - C 3 알코올
pH를 6.5 내지 8.5가 되도록 허용하는, 약학적으로 허용 가능한 완충제, 1가 염, 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당-알코올, 그리고 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제의 존재가 액체 상태인 백시니아 바이러스의 안정화에 필수적인 것으로 발견된 한편, 본 발명의 발명자들은 또한 낮은 농도 C2-C3 알코올의 추가 존재는 백시니아 바이러스의 안정화에 필수적이지는 않지만, 액체 상태인 백시니아 바이러스의 안정성을 추가로 개선하는 킬레이트화제의 존재와 상승작용을 수행함을 발견하였다. 이와는 대조적으로, 동일한 C2-C3 알코올의 농도가 지나치게 높으면 액체 상태인 백시니아 바이러스 안정성에 유해 효과를 보인다. 그러므로 본 발명에 의한 액체 제제는 바람직하게 C2-C3 알코올을 0.05 내지 5 %(부피/부피 또는 v/v)의 농도로 추가로 포함한다. 이러한 발견은 꽤 예상 밖의 것인데, 그 이유는, 외피 비보유 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스의 경우와는 반대로, 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스가 외피보유 바이러스이고, 이 외피보유 바이러스는 극성 용매의 첨가로 말미암아 그 외피가 변경될 것으로 예상될 수 있기 때문이다.
상기 C2-C3 알코올은 분명하게 에탄올 및 이소프로판올로부터 선택될 수 있고, 바람직하게 상기 C2-C3 알코올은 에탄올이다.
상기 C2-C3 알코올(특히 상기 언급된 것들, 분명하게 에탄올)은 분명하게 0.05 내지 5 %(v/v), 0.05 내지 4 %(v/v), 0.05 내지 3 %(v/v), 0.05 내지 2 %(v/v), 0.05 내지 1 %(v/v), 0.05 내지 0.9 %(v/v), 0.05 내지 0.8 %(v/v), 0.05 내지 0.7 %(v/v), 0.05 내지 0.6 %(v/v), 0.05 내지 0.5 %(v/v), 0.1 내지 5 %(v/v), 0.1 내지 4 %(v/v), 0.1 내지 3 %(v/v), 0.1 내지 2 %(v/v), 0.1 내지 1 %(v/v), 0.1 내지 0.9 %(v/v), 0.1 내지 0.8 %(v/v), 0.1 내지 0.7 %(v/v), 0.1 내지 0.6 %(v/v), 0.1 내지 0.5 %(v/v), 0.2 내지 5 %(v/v), 0.2 내지 4 %(v/v), 0.2 내지 3 %(v/v), 0.2 내지 2 %(v/v), 0.2 내지 1 %(v/v), 0.2 내지 0.9 %(v/v), 0.2 내지 0.8 %(v/v), 0.2 내지 0.7 %(v/v), 0.2 내지 0.6 %(v/v), 0.2 내지 0.5 %(v/v), 0.3 내지 5 %(v/v), 0.3 내지 4 %(v/v), 0.3 내지 3 %(v/v), 0.3 내지 2 %(v/v), 0.3 내지 1 %(v/v), 0.3 내지 0.9 %(v/v), 0.3 내지 0.8 %(v/v), 0.3 내지 0.7 %(v/v), 0.3 내지 0.6 %(v/v), 0.3 내지 0.5 %(v/v), 0.4 내지 5 %(v/v), 0.4 내지 4 %(v/v), 0.4 내지 3 %(v/v), 0.4 내지 2 %(v/v), 0.4 내지 1 %(v/v), 0.4 내지 0.9 %(v/v), 0.4 내지 0.8 %(v/v), 0.4 내지 0.7 %(v/v), 0.4 내지 0.6 %(v/v), 0.4 내지 0.5 %(v/v), 0.5 내지 5 %(v/v), 0.5 내지 4 %(v/v), 0.5 내지 3 %(v/v), 0.5 내지 2 %(v/v), 0.5 내지 1 %(v/v), 0.5 내지 0.9 %(v/v), 0.5 내지 0.8 %(v/v), 0.5 내지 0.7 %(v/v), 또는 0.5 내지 0.6 %(v/v)의 농도로 존재할 수 있다. 바람직하게 상기 C2-C3 알코올(특히 상기 언급된 것들, 특히 에탄올)은 2%(v/v)를 초과하지 않는 농도(특히 상기 개시된, 상한치가 2% 이하인 임의의 범위의 농도), 더욱 바람직하게 0.5%(v/v)에 가까운 농도, 예를 들어 0.1 내지 1 %(v/v), 0.1 내지 0.9 %(v/v), 0.2 내지 0.8 %(v/v), 0.3 내지 0.7 %(v/v), 0.4 내지 0.6 %(v/v), 가장 바람직하게 약 0.5%(v/v)로 존재한다.
글루탐산 나트륨
이의 안정화 효과는 덜 규명되어 있지만, 본 발명에 의한 액체 제제는 또한 10mM 이하의 농도, 예를 들어 0 내지 10 mM, 0 내지 9 mM, 0 내지 8 mM, 0 내지 7.5 mM, 0 내지 7 mM, 0 내지 6.5 mM, 0 내지 6 mM, 0 내지 5.5 mM, 0 내지 5 mM, 1 내지 10 mM, 1 내지 9 mM, 1 내지 8 mM, 1 내지 7.5 mM, 1 내지 7 mM, 1 내지 6.5 mM, 1 내지 6 mM, 1 내지 5.5 mM, 1 내지 5 mM, 2 내지 10 mM, 2 내지 9 mM, 2 내지 8 mM, 2 내지 7.5 mM, 2 내지 7 mM, 2 내지 6.5 mM, 2 내지 6 mM, 2 내지 5.5 mM, 2 내지 5 mM, 2.5 내지 10 mM, 2.5 내지 9 mM, 2.5 내지 8 mM, 2.5 내지 7.5 mM, 2.5 내지 7 mM, 2.5 내지 6.5 mM, 2.5 내지 6 mM, 2.5 내지 5.5 mM, 2.5 내지 5 mM, 3 내지 10 mM, 3 내지 9 mM, 3 내지 8 mM, 3 내지 7.5 mM, 3 내지 7 mM, 3 내지 6.5 mM, 3 내지 6 mM, 3 내지 5.5 mM, 3 내지 5 mM, 3.5 내지 10 mM, 3.5 내지 9 mM, 3.5 내지 8 mM, 3.5 내지 7.5 mM, 3.5 내지 7 mM, 3.5 내지 6.5 mM, 3.5 내지 6 mM, 3.5 내지 5.5 mM, 3.5 내지 5 mM, 4 내지 10 mM, 4 내지 9 mM, 4 내지 8 mM, 4 내지 7.5 mM, 4 내지 7 mM, 4 내지 6.5 mM, 4 내지 6 mM, 4 내지 5.5 mM, 4 내지 5 mM, 4.5 내지 10 mM, 4.5 내지 9 mM, 4.5 내지 8 mM, 4.5 내지 7.5 mM, 4.5 내지 7 mM, 4.5 내지 6.5 mM, 4.5 내지 6 mM, 4.5 내지 5.5 mM, 4.5 내지 5 mM, 5 내지 10 mM, 5 내지 9 mM, 5 내지 8 mM, 5 내지 7.5 mM, 5 내지 7 mM, 5 내지 6.5 mM, 5 내지 6 mM, 또는 5 내지 5.5 mM의 농도로 글루탐산 나트륨을 포함할 수도 있다. 특히 본 발명의 발명자들은, 분명하게 MVA에 대해서 글루탐산 나트륨이 약 5mM의 농도로 존재하는 것이 최적임을 발견하였다. 글루탐산 나트륨이 본 발명에 의한 액체 제제 중에 존재할 때, 이는 5mM에 가까운 농도, 예를 들어 2.5 내지 7.5 mM, 3 내지 7 mM, 3.5 내지 6.5 mM, 4 내지 6 mM, 4.5 내지 5.5 mM, 더욱 바람직하게 약 5mM로 존재하는 것이 바람직하다.
잠재적으로 배제된 화합물
계면활성제
비 이온성 계면활성제는 액체 상태인 다양한 바이러스의 안정화를 유도하는 것으로 보인다[예를 들어 문헌(EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75, US 7,456,009, SHI et al. J Pharm Sci. 2005 Jul, 94(7):1538-51, US 2007/0161085) 참조].
그러나, 본 발명의 발명자들은, 백시니아 바이러스에 대해서 계면활성제, 예를 들어 비 이온성 계면활성제 Tween 80(폴리솔베이트 80이라고도 공지됨)이 낮은 농도로 존재하면 유익 효과가 발휘되지 못하고, 약 0.02%v/v 초과 또는 심지어 0.005%v/v 초과하는 농도는 백시니아 바이러스의 안정성에 유해함을 발견하였다(실시예 1 참조).
만일 폴리솔베이트, 더욱 일반적으로는 비 이온성 계면활성제 또는 심지어 임의의 계면활성제가 본 발명에 의한 액체 조성물 중에 존재하면, 이는 0.1%(v/v) 이하, 0.05%(v/v) 이하, 0.04%(v/v) 이하, 0.03%(v/v) 이하, 0.02%(v/v) 이하, 0.01%(v/v) 이하, 0.009%(v/v) 이하, 0.008%(v/v) 이하, 0.007%(v/v) 이하, 0.006%(v/v) 이하, 0.005%(v/v) 이하, 0.004%(v/v) 이하, 0.003%(v/v) 이하, 0.002%(v/v) 이하, 또는 심지어 0.001%(v/v) 이하의 농도로 존재해야 한다.
본 발명에 의한 액체 조성물의 또 다른 바람직한 구현예에서, 액체 조성물은 폴리솔베이트를 포함하지 않고, 더욱 일반적으로는 비 이온성 계면활성제를 포함하지 않으며, 더욱더 일반적으로 임의의 계면활성제를 포함하지 않는다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 의한 액체 제제는 계면활성제를 포함하지 않거나, 또는 0.1%(v/v) 이하, 바람직하게 0.05%(v/v) 이하, 0.04%(v/v) 이하, 0.03%(v/v) 이하, 0.02%(v/v) 이하, 0.01%(v/v) 이하, 0.009%(v/v) 이하, 0.008%(v/v) 이하, 0.007%(v/v) 이하, 0.006%(v/v) 이하, 0.005%(v/v) 이하, 0.004%(v/v) 이하, 0.003%(v/v) 이하, 0.002%(v/v) 이하, 또는 심지어 0.001%(v/v) 이하의 농도의 계면활성제를 포함한다.
2가 염
2가 염, 예를 들어 MgCl2 또는 CaCl2는 액체 상태인 다양한 바이러스의 안정화를 유도하는 것으로 발견되었다[문헌(EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75) 및 US 7,456,009 참조]. 이와 같은 경우, 2가 양이온은 액체 제제 중에 적어도 0.5 mM, 바람직하게는 적어도 1 mM의 농도로 존재하였다.
그러나 본 발명의 발명자들은 2가 염의 존재가 백시니아 바이러스 안정성에 그다지 크게 유익 효과를 발휘하지는 않고(실시예 1 참조), 오히려 높은 농도(적어도 75 mM)에서는 유해 효과를 보임을 발견하였다. 그러므로 본 발명에 의한 액체 제제는 MgCl2 및/또는 CaCl2, 더욱 일반적으로 2가 염이 존재하지 않을 수 있다. 그러나 2가 양이온은 낮은 농도에서 백시니아 바이러스 안정성에 유해 효과를 주지 않는 것으로 보이므로, 이와 같은 2가 양이온은 본 발명에 의한 액체 제제 중에, 특히 낮은 농도로 존재할 수 있다. 이러한 2가 양이온(특히 MgCl2 또는 CaCl2)이 본 발명에 의한 액체 제제 중에 존재할 때, 그럼에도 불구 이 2가 양이온은 바람직하게 100 mM 이하, 바람직하게 90 mM 이하, 80 mM 이하, 75 mM 이하, 70 mM 이하, 60 mM 이하, 50 mM 이하, 45 mM 이하, 40 mM 이하, 35 mM 이하, 30 mM 이하, 25 mM 이하, 20 mM 이하, 15 mM 이하, 10 mM 이하, 9 mM 이하, 8 mM 이하, 7 mM 이하, 6 mM 이하, 5 mM 이하, 4 mM 이하, 3 mM 이하, 2 mM 이하, 더욱 바람직하게 1 mM 이하, 0.9 mM 이하, 0.8 mM 이하, 0.7 mM 이하, 0.6 mM 이하, 0.5 mM 이하의 농도로 존재한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 의한 액체 제제는 2가 염을 포함하지 않거나, 또는 2가 염을 100 mM 이하, 바람직하게 90 mM 이하, 80 mM 이하, 75 mM 이하, 70 mM 이하, 60 mM 이하, 50 mM 이하, 45 mM 이하, 40 mM 이하, 35 mM 이하, 30 mM 이하, 25 mM 이하, 20 mM 이하, 15 mM 이하, 10 mM 이하, 9 mM 이하, 8 mM 이하, 7 mM 이하, 6 mM 이하, 5 mM 이하, 4 mM 이하, 3 mM 이하, 2 mM 이하, 더욱 바람직하게 1 mM 이하, 0.9 mM 이하, 0.8 mM 이하, 0.7 mM 이하, 0.6 mM 이하, 0.5 mM 이하의 농도로 포함한다.
글루탐산 이외의 아미노산
아미노산, 특히 히스티딘, 아르기닌 또는 메티오닌은 액체 상태인 다양한 바이러스의 안정화를 유도하는 것으로 발견되었다[문헌(EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75), US 7,456,009, US 2007/0161085, US 7,914,979, WO 2014/029702, WO 2014/053571 참조]. 히스티딘이 액체 제제의 안정성을 개선하기 위해 이 액체 제제 중에 존재할 때, 히스티딘은 일반적으로 적어도 5 mM의 농도, 바람직하게 적어도 10 mM의 농도로 존재한다[문헌(EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75), US 7,456,009, WO 2014/029702 참조]. 아르기닌이 액체 제제의 안정성을 개선하기 위해 이 액체 제제 중에 존재할 때, 아르기닌은 일반적으로 적어도 50 mM의 농도로 존재하고[US 2007/0161085 참조; 적어도 약 57.4 mM에 대응하는 적어도 1%w/v의 아르기닌], 때로는 바람직하게 적어도 150 mM의 농도로 존재하며, 특히 약 300 mM의 농도로 존재한다[WO2014/029702 참조]. 안정성을 개선하기 위해 메티오닌이 액체 제제 중에 존재할 때, 메티오닌은 일반적으로 적어도 25 mM의 농도, 바람직하게는 약 67 mM의 농도로 존재한다(WO2014/029702 참조).
그러나 본 발명의 발명자들은, 글루탐산 이외의 아미노산(일반적으로 아르기닌, 히스티딘 또는 보통의 아미노산들)의 존재가 백시니아 바이러스 안정성에 유익 효과를 발휘하지 않음을 발견하였다(실시예 1 참조).
그러므로 본 발명에 의한 액체 제제는 히스티딘을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로나 부가적으로, 본 발명에 의한 액체 제제는 아르기닌을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 본 발명에 의한 액체 제제는 메티오닌을 포함하지 않을 수 있다. 특히 본 발명에 의한 액체 제제는 아르기닌 및 메티오닌을 포함하지 않을 수 있거나, 심지어는 히스티딘, 아르기닌 및 메티오닌을 포함하지 않을 수도 있다. 더욱 일반적으로 본 발명에 의한 액체 제제는 글루탐산 이외의 아미노산을 포함하지 않을 수 있다.
그러나 글루탐산나트륨 이외의 아미노산이 유익 효과를 가지지 않을 때, 이와 같은 아미노산은 유해 효과를 보이는 것으로 발견되지는 않았으므로, 이러한 아미노산은 본 발명에 의한 액체 제제 중에, 특히 낮은 농도로 존재할 수 있다.
히스티딘이 본 발명에 의한 액체 제제 중에 존재할 때, 그럼에도 불구 히스티딘은 10 mM 이하, 바람직하게는 9 mM 이하, 8 mM 이하, 7.5 mM 이하, 7 mM 이하, 6 mM 이하, 또는 심지어 5 mM 이하의 농도로 존재한다.
이와 유사하게, 아르기닌이 본 발명에 의한 액체 제제 중에 존재할 때, 그럼에도 불구 아르기닌은, 바람직하게 300 mM 이하, 바람직하게 150 mM 이하, 100 mM 이하, 75 mM 이하, 또는 심지어 50 mM 이하의 농도로 존재한다. 또한 메티오닌이 본 발명에 의한 액체 제제 중에 존재할 때, 그럼에도 불구 메티오닌은 60 mM 이하, 바람직하게 50 mM 이하, 40 mM 이하, 30 mM 이하, 또는 심지어 25 mM 이하의 농도로 존재한다. 더욱 일반적으로 글루탐산 나트륨 이외의 아미노산 1개 이상이 본 발명에 의한 액체 제제 중에 존재할 때, 이 아미노산(들)은 바람직하게 300 mM 이하, 바람직하게 150 mM 이하, 100 mM 이하, 75 mM 이하, 50 mM 이하, 40 mM 이하, 30 mM 이하, 25 mM 이하, 20 mM 이하, 10 mM 이하, 9 mM 이하, 8 mM 이하, 7.5 mM 이하, 7 mM 이하, 6 mM 이하, 또는 심지어 5 mM 이하의 농도로 존재한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 의한 액체 제제는 히스티딘을 포함하지 않거나, 10 mM 이하, 바람직하게는 9 mM 이하, 8 mM 이하, 7.5 mM 이하, 7 mM 이하, 6 mM 이하, 또는 심지어 5 mM 이하의 농도로 히스티딘을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 의한 액체 제제는 아르기닌을 포함하지 않거나, 300 mM 이하, 바람직하게는 150 mM 이하, 100 mM 이하, 75 mM 이하, 또는 심지어 50 mM 이하의 농도로 아르기닌을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 의한 액체 제제는 메티오닌을 포함하지 않거나, 60 mM 이하, 바람직하게는 50 mM 이하, 40 mM 이하, 30 mM 이하, 또는 심지어 25 mM 이하의 농도로 메티오닌을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 의한 액체 제제는 글루탐산 나트륨 이외의 아미노산을 포함하지 않거나, 300 mM 이하, 바람직하게는 150 mM 이하, 100 mM 이하, 75 mM 이하, 50 mM 이하, 40 mM 이하, 30 mM 이하, 25 mM 이하, 20 mM 이하, 10 mM 이하, 9 mM 이하, 8 mM 이하, 7.5 mM 이하, 7 mM 이하, 6 mM 이하, 또는 심지어 5 mM 이하의 농도로 글루탐산 나트륨 이외의 아미노산을 포함한다.
우레아
본 발명의 발명자들은 또한 우레아가 백시니아 바이러스 안정성에 유익 효과를 발휘하지 않음을 발견하였다(실시예 1 참조).
그러므로 본 발명에 의한 액체 제제는 우레아를 포함하지 않을 수 있다.
고분자량 중합체
동결 건조된 바이러스 제제는 일반적으로 동결 건조 중 케이크 형성을 돕는 고분자량 중합체, 예를 들어 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 함유한다(EP1418942 및 WO2014/053571 참조).
그러나, 이러한 고분자량 중합체는 액체 상태인 백시니아 바이러스의 안정화에 유용하지 않으므로, 본 발명에 의한 액체 제제는 이와 같은 고분자량 중합체를 포함하지 않을 수 있다. 만일 이 고분자량 중합체가 본 발명에 의한 액체 제제 중에 존재한다면, 이 중합체는 바람직하게 10 g/L 이하, 바람직하게 7.5 g/L 이하, 5 g/L 이하, 2.5 g/L 이하, 또는 심지어 1 g/L 이하의 농도로 존재한다.
그러므로 바람직한 구현예에서, 본 발명에 의한 액체 제제는 덱스트란, PVP, 또는 더욱 일반적으로는 고분자량 중합체를 포함하지 않거나, 10 g/L 이하, 바람직하게 7.5 g/L 이하, 5 g/L 이하, 2.5 g/L 이하, 또는 심지어 1 g/L 이하의 농도로 덱스트란, PVP, 또는 더욱 일반적으로는 고분자량 중합체를 포함한다.
동물 또는 인간 유래 안정화제
동물 또는 인간 유래 안정화제, 예를 들어 혈청 또는 젤라틴이 오랜기간 동안 생 바이러스의 안정화를 위해 사용되어 오고있다(US 2007/0161085 참조). 그러나, 이와 같은 동물 또는 인간 기원의 동물 또는 인간 유래 안정화제는 바이러스 또는 통상적이지 않은 제제에 의한 잠재적 오염으로 말미암는 건강상의 위험을 잠재적으로 수반한다.
이러한 동물 또는 인간 유래 안정화제는 본 발명에 의한 액체 제제 중 백시니아 바이러스의 안정성에 반드시 필요한 것은 아니므로, 본 발명에 의한 액체 제제는 바람직하게 동물 또는 인간 유래의 안정화제, 예를 들어 혈청이나 젤라틴을 포함하지 않는다.
바람직한 제제
본 발명에 의한 제제의 각각의 필수적 요소 또는 선택적 요소의 군에 속하는, 다양한 구체적 화합물들은 이 요소와 구체적으로 관련이 있는 상기 섹션에 기술되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 특정 요소에 적당한 화합물과, 특정 요소에 대해 개시된 각각의 구체적 화합물의 각각의 목록은, 기타 임의의 포괄적 요소, 상기 기타 요소에 적당한 화합물 또는 상기 기타 요소에 대해 개시된 임의의 구체적 화합물의 목록과 합하여질 수 있다.
특히, 본 발명에 의한 제제의 필수적 요소 또는 선택적 요소의 바람직한 구현예들은 기타 임의의 포괄적 요소 또는 상기 기타 요소의 바람직한 구현예들과 합하여질 수 있다.
본 발명에 의한 특히 바람직한 제제는 이하 표 1에 예시된 요소들을 포함하거나, 필수적으로 이 요소들로 이루어지거나 또는 이 요소들로 이루어진 제제들을 포함한다.
[표 1]
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
UV 손상에 대하여 백시니아 바이러스를 안정화하기 위한, 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제의 용도
백시니아 바이러스는 특히 UV 손상에 민감하다[문헌(LYTLE et al. J. Virol. 2005, 79(22):14244) 참조].
놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 EDTA가 UV 손상에 대해 백시니아 바이러스에 보호 효과를 제공함을 발견하였다(실시예 6 참조). 그러므로 본 발명은 또한 UV 손상에 대해 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)를 안정화하기 위한, 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제의 용도에 관한 것이기도 하다.
폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)의 UV 손상에 대한 안정화를 위하여, 킬레이트화제는 바람직하게 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), 디머캅토숙신산(DMSA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 그리고 2,3-디머캅토-1-프로판설폰산(DMPS)으로부터 선택되고, 바람직하게 상기 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제는 EDTA이다.
UV 손상에 대하여 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)를 안정화하기 위해 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제가 사용될 때, 상기 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)는 바람직하게 액체 조성물 중에 존재하고, 상기 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제(특히 상기 언급된 것들과, 분명하게는 EDTA)는 바람직하게 적어도 50 μM, 바람직하게 50 내지 1000 μM, 50 내지 750 μM, 50 내지 500 μM, 50 내지 400 μM, 50 내지 300 μM, 50 내지 250 μM, 50 내지 200 μM, 50 내지 150 μM; 50 내지 100 μM, 50 내지 75 μM, 75 내지 1000 μM, 75 내지 750 μM, 75 내지 500 μM, 75 내지 400 μM, 75 내지 300 μM, 75 내지 250 μM, 75 내지 200 μM, 75 내지 150 μM; 75 내지 100 μM, 100 내지 1000 μM, 100 내지 750 μM, 100 내지 500 μM, 100 내지 400 μM, 100 내지 300 μM, 100 내지 250 μM, 100 내지 200 μM, 100 내지 150 μM; 150 내지 1000 μM, 150 내지 750 μM, 150 내지 500 μM, 150 내지 400 μM, 150 내지 300 μM, 150 내지 250 μM, 또는 150 내지 200 μM의 농도로 존재한다.
더욱더 바람직하게, UV 손상에 대하여 폭스 바이러스(특히 백시니아 바이러스)를 안정화하기 위하여, 본 발명에 의한 (상기 개시된 바와 같은) 액체 제제가 사용된다.
이하 실시예들은 오로지 본 발명을 예시하는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1: 후보물질 안정화 화합물의 스크리닝
+5℃에서 액체 제제 중 MVA 바이러스를 안정화하기 위한 다양한 후보물질 화합물의 효과가, 기타 유형의 바이러스의 안정화 효과를 가지는, 선행 기술로부터 공지된 화합물들을 기반으로 시험되었다.
재료 및 방법
바이러스
하기 MVA 바이러스들이 사용되었다:
- 초기 목표 농도 1-4×108 PFU/㎖로 희석된, MUC1 종양 연관 항원 및 인터루킨 2를 발현하는 재조합 MVA 바이러스인 MVA-MUC1(TG4010)(WO 92/07000 및 WO 95/09241 참조),
- 초기 목표 농도 1-4×107 PFU/㎖로 희석된, HCV 유전자형 1b 균주 ja로부터 비 구조적 HCV 단백질(NS3, NS4 및 NS5B)을 발현하는 재조합 MVA 바이러스인 MVA-HCV(TG4040)(WO 2004/111082 참조),
- 초기 목표 농도 0.5-2×108 PFU/㎖로 희석된, 인간 유두종 바이러스 E6 및 E7 항원과, 인터루킨 2를 발현하는 재조합 MVA 바이러스인 MVA-HPV(TG4001)(WO 90/10459, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885, WO 2007/121894 참조).
MVA 바이러스 3종이 닭 배 섬유아세포에서 생산된 후, 감염 CEF 배양액의 회수, 기계적 수단에 의한 세포의 파괴, 그리고 임의의 프로테아제 처리 단계를 수반하지 않는 다양한 정제 단계들을 포함하는 방법에 의해 회수 및 정제되었다.
인간 연속 세포주에서 생산된 후, 적어도 1개의 프로테아제 처리 단계를 적어도 1회 수반하는 방법에 의해 정제된 재조합 백시니아 바이러스(와이어스 균주)도 또한 사용되었는데, 이때 초기 목표 역가는 2×108-2×109 PFU/㎖였다.
시험한 제제들
시험한 제제들은 이하 표 2-표 11에 제시되어 있다:
* 1가 염 존재의 유익 효과:
[표 2]
Figure pct00010
* EDTA, EtOH 또는 EDTA/EtOH 존재의 유익 효과:
[표 3]
Figure pct00011
[표 4]
Figure pct00012
* 낮은 농도의 Na 글루탐산염의 유익 효과:
[표 5]
Figure pct00013
* 낮은 농도의 수크로스의 유익 효과:
[표 6]
Figure pct00014
* 폴리솔베이트의 유익 효과 부재 및 심지어 유해 효과:
- MVA 바이러스:
[표 7A]
Figure pct00015
-VV 와이어스:
[표 7B]
Figure pct00016
* MgCl2의 유익 효과 부재:
- MVA 바이러스:
[표 8A]
Figure pct00017
- VV 와이어스:
[표 8B]
Figure pct00018
* 아르기닌의 유익 효과 부재:
- MVA 바이러스:
[표 9A]
Figure pct00019
-VV 와이어스:
[표 9B]
Figure pct00020
* 아미노산 혼합물의 유익 효과 부재:
[표 10]
Figure pct00021
* 히스티딘의 유익 효과 부재:
[표 11]
Figure pct00022
안정성 분석
+37℃(±2℃), +25℃(±2℃) 및/또는 +5℃(±3℃)에서 안정성이 분석되었다(결과 섹션 참조).
(가속화된 안정성 시험) +37℃(±2℃)에서 시료는 상대 습도 75%에 유지되었고, 안정성은 적어도 28일 동안의 감염성 손실을 측정함으로써 분석되었다(7일 및 14일에 중간 측정 수행).
(가속화된 안정성 시험) +25℃(±2℃)에서 시료는 상대 습도 60%에 유지되었고, 안정성은 적어도 6개월 동안의 감염성 손실을 측정함으로써 분석되었다(약 1개월, 그리고 약 2개월 및 약 3개월 경과 시 중간 측정 수행).
(목표 보관 온도 시험) +5℃(±3℃)에서 시료는 상대 습도를 전혀 제어하지 않으면서 유지되었으며, 안정성은 적어도 24개월 동안의 감염성 손실을 측정함으로써 분석되었다(약 1개월, 그리고 약 3개월, 약 6개월, 약 12개월 약 18개월 및 약 24개월 경과 시 중간 측정 수행).
감염성 손실은, 제0일에서의 IG/㎖ 또는 PFU/㎖ 초기 수치에 대하여 측정 시 1㎖당 감염성 게놈 또는 입자 형성 단위 수(IG/㎖ 또는 PFU/㎖)를 공제함으로써 산정되었고, 이는 십진 대수값(log10(IG/㎖ 또는 PFU/㎖))으로서 표현되었으며, 본 발명의 설명에서는 log로서 축약되어 제시되었다(IG/㎖ 또는 PFU/㎖).
감염성 역가의 측정
소정 시간에서의 감염성 역가는, 1㎖당 감염성 게놈(IG)(IG/㎖)의 수를 측정하거나, 또는 BHK-21 세포상 플라크 검정법을 사용하여 측정될 수 있다[감염성 백시니아 바이러스 역가는 이후 1㎖당 플라크 형성 단위(PFU)(PFU/㎖)로서 표현됨]. 이 방법은 더욱 신속하고 더욱 정확하기 때문에, 1㎖당 감염성 게놈의 수(IG/㎖)를 측정하는 것이 여기서는 선호되었다. 그러나, BHK-21 세포를 기반으로 한 플라크 검정법에 따른 구체적인 데이터가 보이지 않을 때, 감염성 역가는 몇몇 시점에서 플라크 검정법이 사용되어 BHK-21 세포를 기반으로 측정되었고, 이로부터 얻어진 결과들은 감염성 게놈 방법을 사용하여 구하여진 결과들과 항상 일치하는 것으로 관찰되었음을 주목해야 한다.
1㎖당 감염성 게놈의 수(IG/㎖)의 측정은 하기와 같이 수행된다:
- 제0일: 감염 및 세포 접종
바이러스 시료는 배양 96-웰 평판 중에 5% 소 태아 혈청(FCS)으로 보충된 DMEM 배양 배지 중에 연속으로 희석된다(100 ㎕/웰).
배양 배지(DMEM + 5% FCS) 중 BHK-21 세포가 수집되고, 바이러스 희석액을 함유하는 96-웰 평판에 1:100의 비율로(100 ㎕/웰) 접종된다.
이후, 배양 평판은 +37℃, 5% CO2 하에 24시간 ±4시간 동안 항온처리된다.
- 1일 경과시: 감염된 세포의 용해
감염 후 20-28시간 경과 시 상청액은 폐기되고, 세포 단일 층은 PBS로 2회 세정된다. 프로티나아제 K를 함유하는 용해 완충제 100 ㎕가 각각의 웰에 가하여진다. 이 평판은 +56℃에서 적어도 30분(내지 420분 이하) 동안 항온처리되고 나서, +95℃에서 5분 동안 가열되며, 그 결과 프로티나아제 K가 비활성화된다.
- 1일 내지 30일 경과시(-20℃): qPCR 분석
세포 용해물은 물로 49배 희석된 다음, 백시니아 바이러스 게놈의 분비 케모카인 결합 단백질(Secreted Chemokine Binding Protein; SCBP) 영역을 표적화하는 특이적 프라이머 및 프로브 세트가 사용되는 qPCR 과정으로 보내어진다.
시험 시료 감염성 게놈의 수(IG/㎖)는, (표준 플라크 형성 단위 검정이 사용되어 정립된) 감염성 역가(PFU/㎖)로 교정된 바이러스 표준이 사용되어 평행선 분석(Parallel Line Assay; PLA) 방법에 의해 정량된다.
이 방법은 적어도 1×105 IG/㎖와 같은 임의의 값에 대한 감염성 게놈(IG/㎖)을 측정할 수 있다.
플라크 검정이 사용되는, BHK-21 세포를 기반으로 한 감염성 역가 측정은 하기와 같이 수행된다:
1. 세포 도말
숙주 세포 BHK-21은 DMEM 중 단일 층에서 생장되었다. 세포합류(confluency)를 이룰 때, 세포는 PBS 10 ㎖로 세정되었고, 이후 트립신 처리되었다. 트립신이 제거된 후 세포는 37℃에서 10% SFV를 함유하는 DMEM 10 ㎖ 중에 재현탁되었다.
그 다음, 세포 현탁액은 균질화되었고, 다중 웰 평판에 분배되었다(평판의 6개 웰 각각에 2 ㎖씩). 그 다음, 상기 평판은 37℃ 및 5% CO2에서 항온처리되었다.
2. 세포 감염
세포 도말 후 약 1일 경과시, 바이러스 현탁액 분취량은 단계 1의 BHK-21 세포를 포함하는 각각의 웰에 첨가되었다. 만일 필요하다면, 상기 현탁액은 처음에 당 업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있는 방법에 따라 PBS, 양이온 100X 및 1% 소 태아 혈청(FCS) 중에서 연속으로 희석되었다. 경우에 따라서, 단계 1의 BHK-21 세포에 첨가되었던 바이러스 현탁액은 동결 건조 전 바이러스 함유 액체 조성물이거나, (동결건조 후 상이한 기간 및 온도에서) 바이러스 함유 조성물로 재구성되었다.
그 다음, 배양 배지는 제거되었고, 실온에서 60분 동안 교반된 후, 감염 배지(DMEM + 5% FCS) 2 ㎖가 각각의 웰에 분배되었다. 그 다음, 평판들은 37℃ 및 5% CO2 하에서 항온처리되었다.
3. 세포 고정
배지가 제거된 다음, 세포는 PBS(웰당 약 1 ㎖)로 세정되었다. 그 다음, 여기에 메탄올/아세톤 용액(50/50) 1 ㎖가 첨가되었으며, 이로부터 생성된 혼합물은 실온에서 가만히 교반되었다.
그 다음, 평판은 실온에서 건조되었다.
4. 검출 및 역가 측정
바이러스 역가 측정은, 퍼옥시다아제와 합하여진 항 백신 항체 및 항 토끼 항체가 사용되는, 널리 공지된 퍼옥시다아제 반응에 따라서 수행되었다. 더욱 정확하게 말하면, 반응 이전에 항 백신 항체들은 PBS + 2% FCS 중에서 100배 희석되었다. 그 다음, 상기 항체 500 ㎕가 각각의 웰에 가하여졌으며, 약 30분 동안 37℃에서 항온처리되었고, 이후 PBS + 1% Triton X-100 1 ㎖로 3회 세정되었다.
퍼옥시다아제와 합하여진 항 토끼 항체와의 반응이 동일한 방식으로 수행되었는데, 다만 반응 전에 상기 항체들은 PBS + 2% FCS 중에서 200배 희석되었다.
DAB 용액은, 1개의 시판 DAB 정제를 TRIS-HCl 0.05M 15 ㎖ 중에 용해함으로써 제조되었다. 그 다음, 얻어진 용액은 여과 단위 NALGENE(2 ㎛) 상에서 여과되었고, 이로부터 생성된 여과 용액은 H2O2 30% 수용액 15 ㎕에 첨가되었다. DAB 용액이 제조되면, 이 DAB 용액 1 ㎖는 각각의 웰에 가하여졌고, 갈색으로 발색할 때까지 방치되었다. 발색 용액은 추후 분리되었고, 결과들은 가시적으로 해석된다.
그 다음, 감염성 역가는 다음과 같은 식이 사용되어 PFU/㎖로 산정되었다:
[바이러스 플라크 수의 평균 × 4] × 희석 배율
= PFU /㎖ 수
이러한 방법들 각각은, 1회 측정시 약 ±0.30 log10의 유사한 변산도를 보였다. 그러나, 측정 횟수(즉 시험한 동일시료의 수)가 증가할 때 두 방법의 변산도는 감소한다. (동일 시료가 2가지 사용되는) 2회의 측정시 변산도는 ±0.25 log10으로 예상된다. (동일 시료가 3가지 사용되는) 3회의 측정시 변산도는 ±0.20 log10으로 예상된다. 모든 실시예에서, 1 ㎖당 감염성 게놈의 수(IG)(IG/㎖)가 측정될 때 1회의 측정이 실시되었던 한편, 1 ㎖당 플라크 형성 단위(PFU)(PFU/㎖)의 측정은 3회 반복 실시되었다.
결과
1가 염의 필요성
Tris-HCl, Na 글루탐산염, 수크로스를 함유하는 제제(pH 8.0), 그리고 0 mM 또는 50 mM의 NaCl을 함유하는 제제 중 MVA-MUC1의 안정성이 시험되었다(상기 표 2 참조).
37℃에서 7일, 14일 또는 28일 후 감염성 손실은 도 1에 제시되어 있다. 시험한 제제 2개 중 어느 것도 전혀 안정적이지 않은 한편, 결과들은 50 mM NaCl의 첨가는 14일 경과 시의 안정성(약 1 log의 손실 대 거의 2 log의 손실) 및 제28일 경과 시의 안정성(약 3 log의 손실 대 6 log 초과 손실)을 유의적으로 개선함을 명백히 보이고 있다.
그러므로 제제에 NaCl을 첨가하는 것은 안정성을 유의적으로 개선한다.
EDTA , 낮은 농도의 EtOH 또는 EDTA / EtOH 의 유익 효과
+37℃ 및 +5℃에서 Tris-HCl, Na 글루탐산염, 수크로스, NaCl 함유 제제(pH 7.5) 중 MVA-HCV의 안정성에 대한 EDTA의 영향력은, 다양한 농도의 EDTA가 사용되어 시험되었다(표 3 참조). 결과들은 도 2에 제시되어 있다.
+37℃(가속화 안정성 시험)에서, 7일 및 14일 경과 시, EDTA를 함유하는 모든 제제들은 1 log 미만의 감염성 손실을 보이며, 28일 경과시에는 1.5 log 미만의 감염성 손실을 보인다. 눈에 띄게 대조적으로, EDTA를 함유하지 않는 제제(대조군 DS 및 대조군 DS2)는 매우 약한 안정성 프로필을 보였다(7, 14 및 28일 경과 시, 약 1, 2.5 및 4 log 감염성 손실을 각각 보임). 사용된 EDTA의 농도(50 μM 내지 1000 μM)는 안정화 효과에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 28일 경과 시, EDTA 이외에 EtOH를 함유하는 제제는 더욱 안정화되는 것으로 보인다(도 2 참조).
+37℃ 및 +5℃에서 Tris-HCl, Na 글루탐산염, 수크로스, NaCl 함유 제제(pH 7.5) 중 MVA-HCV의 안정성에 대한 에탄올(EtOH)의 영향력은 다양한 농도의 EtOH가 사용되어 시험되었다(표 3 참조). 결과들은 도 3에 제시되어 있다. 37℃(가속화 안정성 시험)에서, 7일 및 14일 경과 시 EtOH를 함유하는 모든 제제들은, EtOH를 함유하지 않는 대조군보다 유의적으로 더 작은 감염성 손실을 보인다. 뿐만 아니라, 낮은 EtOH 농도의 더 큰 안정화를 지향하는 경향이 약간 관찰될 수 있다. 눈에 띄게 대조적으로, EtOH를 함유하지 않는 제제(대조군 DS 및 대조군 DS2)는 매우 약한 안정성 프로필을 보였다(7, 14 및 28일 경과 시, 약 1, 2.5 및 4 log 감염성 손실을 각각 보임). 더욱이, EtOH 이외에 EDTA를 함유하는 제제는 오로지 EtOH만을 함유하는 제제보다 유의적으로 더 작은 감염성 손실을 보인다(도 3 참조).
그러므로, EDTA 및 EtOH를 사용하는 1차 시험은, 두 화합물이 액체 제제 중 MVA-HCV 안정성을 독립적으로 증가시키고, 이때 EDTA의 안정화 효과는 EtOH의 안정화 효과보다 더 큼을 보인다. 더욱이, 두 화합물의 조합은 안정성을 더 증가시킨다.
다양한 농도의 EDTA(50 내지 250 μM) 및 EtOH(0.5 내지 2.5 %)를 함유하는 제제 중 MVA-HCV의, +37℃, 25℃ 및 5℃에서의 안정성을 확인하기 위해 추가의 실험이 수행되었다(표 4 참조). 결과들은 도 4a, 4b 및 4c에 제시되어 있다. 시험한 모든 온도에서, 모든 제제에 대해 우수한 안정성이 관찰된다. 특히 EDTA 및 EtOH를 함유하는 모든 제제의 경우, 28일 경과 후 37℃에서 감염성 손실은 1 log에 가까웠고(도 4a 참조), 12개월 후 +5℃에서 감염성 손실은 0.3 이하였다. +5℃에서, EDTA 및 EtOH를 함유하는 대부분의 제제는, 18개월 및 24개월 경과 후 0.3 log10 이하의 감염성 손실을 추가로 보인다. 이와는 대조적으로, EDTA 및 EtOH를 함유하지 않는 대조군 DS 및 DS2 제제의 안정성은, 특히 37℃ 및 25℃에서 매우 급속하게 감소하였다[예를 들어 7일 경과 시 37℃, 그리고 28일 경과 시 25℃에서 약 1 log의 감염성 손실을 보임].
+37℃ 및 +5℃에서 얻어진 결과들의 또 다른 묘사는 도 4d에 제시되어 있는데, 여기서는 +37℃(7일 및 28일 경과시) 및 +5℃(24개월 경과시) 둘 다에서 얻어진 결과들을 바탕으로 최적 EDTA 및 EtOH 농도를 정의하기 위해, EDTA 및 에탄올의 양에 따라 제제의 디자인 공간을 정의하는 실험 매트릭스가 사용되었다. 이 도면에서, EDTA 농도(μM)는 x-축에 표시되고, EtOH 농도(%)는 y-축에 표시된다. 그다음, 제제의 요망도에 대응하는 곡선들은 2차원 면적에 제시되는데, 이때 요망도 값이 클수록 해당 제제는 더욱 우수한 것이다.
도 4d는, EDTA 50-150 μM과 EtOH 0.5-1 %v/v에 대해 가장 우수한 제제가 얻어짐을 보인다.
이 분석을 기반으로 하였을 때, 150 μM EDTA와 0.5 %v/v EtOH가 사용될 때 최적의 제제가 정의되었다.
낮은 농도의 글루탐산 나트륨의 유익 효과
+37℃ 및 +25℃에서 Tris-HCl, Na 글루탐산염, 수크로스, NaCl 함유 제제(pH 7.5) 중 MVA-HCV의 안정성에 대한 Na 글루탐산염의 영향력은, 다양한 농도(0-10 mM)의 Na 글루탐산염이 사용되어, 그리고 사용되지 않고 시험되었다(표 5 참조). 결과들은 도 5a, 5b 및 5c에 각각 제시되어 있다.
+37℃에서 28일 경과 시, Na 글루탐산염 적어도 5 mM을 함유하는 3개의 제제들은 1 이하의 감염성 손실을 보이는 한편, Na 글루탐산염 0 mM 또는 2.5 mM을 함유하는 제제 2개는 1 이상이되 1에 가까운 감염성 손실을 보인다. 이는, Na 글루탐산염은 큰 안정화 효과를 보이지 않지만, 5 mM 내지 10 mM로 낮은 농도의 Na 글루탐산염은 최소의 안정화 효과를 보일 수 있음을 보인다. 또한, 도 5a는, Na 글루탐산염 7.5 mM 또는 10 mM을 함유하는 제제는 Na 글루탐산염 5 mM을 함유하는 제제보다 약간 작은 안정성을 보이는 것으로 보아, 최적 농도는 약 5 mM임을 암시한다(도 5a).
+25℃에서 12개월 경과 시의 감염성 손실은, Na 글루탐산염이 작은 안정화 효과를 보이고, 약 5 mM의 농도가 최적임을 확인시켜 준다(도 5b).
+5℃에서 12개월 내지 30개월 경과 시의 감염성 손실은, Na 글루탐산염이 작은 안정화 효과를 보이고, 약 5 mM의 농도가 최적임을 확인시켜 준다(도 5c).
+5℃에서 얻어진 결과들은, 12개월 경과 시 감염성 손실이 매우 작아서 Na 글루탐산염의 유익 효과를 입증하는 것은 어려움을 보인다. 사실, 제제 중 다른 화합물, 특히 EDTA 및 EtOH의 존재는 안정화 효과를 설명할 수 있고, Na 글루탐산염의 작은 효과는 이 온도에서 증명되기 어렵다. 그러나, 이는 +25℃ 및 +37℃의 고온에서 관찰된 최적 농도(약 5 mM) 및 작은 효과와 모순되는 것은 아니다.
낮은 농도의 수크로스의 유익 효과
+37℃에서 다양한 농도의 수크로스가 사용되어 Tris-HCl, Na 글루탐산염, 수크로스, NaCl 함유 제제(pH 8.0) 중 MVA-MUC1의 안정성에 대한 수크로스의 영향력이, 시험되었다(표 6 참조). 결과들은 도 6에 제시되어 있으며, 이는 수크로스 농도가 안정성 수준에 거의 영향을 미치지 않음을 보인다.
폴리솔베이트 80 또는 폴리솔베이트 40의 유익 효과의 부재 및 심지어 유해 효과
다른 바이러스에 안정화 효과를 발휘하는 것으로 보이는 폴리솔베이트 80 또는 폴리솔베이트 40이 다양한 농도로 사용되어, Tris-HCl, Na 글루탐산염, 수크로스, NaCl 함유 제제(pH 7.5)(표 7 참조) 중 MVA-HPV의 안정성에 대한 폴리솔베이트 80 또는 폴리솔베이트 40의 영향력이 +25℃ 및 +5℃에서 시험되었다[문헌(EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75, US7,456,009, SHI et al. J Pharm Sci. 2005 Jul, 94(7):1538-51) 및 US 2007/0161085 참조]. 결과는 도 7a 및 7b에 제시되어 있다.
+25℃ 및 +5℃에서 어떤 농도의 폴리솔베이트도, 폴리솔베이트를 함유하지 않는 대조군 제제와 비교되었을 때 안정성 증가를 허용하지 않으므로, 안정화 효과도 관찰되지 않는다.
이와는 대조적으로, 상기 두 온도에서 적어도 0.02%v/v의 폴리솔베이트 농도에 대해서, 사용된 폴리솔베이트 농도와 함께 증가하는 탈안정화 효과가 주목될 수 있다. +5℃ 및 심지어 매우 낮은 농도(0.005 %v/v)에서는 약간의 탈안정화 효과가 초래되었다.
그러므로 폴리솔베이트는 안정화 효과를 가지지 않으며, 적어도 0.02 %v/v의 농도는 오히려 탈안정화 효과를 가진다는 결론이 내려짐이 분명하다. 그러므로 폴리솔베이트는 백시니아 바이러스의 액체 제제로부터 제외되거나 매우 낮은 농도로 백시니아 바이러스의 액체 제제 중에 존재하는 것이 바람직할 것이다.
이와 유사하게, 인간 연속 세포주에서 생산되어, 적어도 1개의 프로테아제 처리 단계를 1회 이상 수반하는 방법에 의해 정제된 백시니아 바이러스 와이어스 균주의, Tris-HCl 30 mM, 수크로스 10%(w/v) 함유 제제, 또는 150 ㎍/㎖ 폴리솔베이트 80을 추가로 함유하는 제제 중 안정성은 +37℃에서 7일, 14일, 21일 또는 28일 경과 후에 시험되었다. 결과들은 도 7c에 제시되어 있으며, 이는 또한 이 백시니아 바이러스 균주에 대해 폴리솔베이트는 안정성에 긍정적인 효과를 보이지 않음을 명백히 보인다.
높은 농도의 MgCl 2 의 유익 효과 부재 및 심지어 유해 효과
14일 동안 +37℃에서, Tris-HCl, Na 글루탐산염, 수크로스, NaCl 함유 제제(pH 8.0)(표 8 참조) 중 MVA-MUC1의 안정성에 대한 MgCl2의 영향력이, 다른 바이러스에 안정화 효과를 발휘하는 것으로 보이는 다양한 농도의 MgCl2가 사용되어, 그리고 사용되지 않고 시험되었다[문헌(EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75) 및 US 7,456,009 참조]. 결과들은 도 8에 제시되어 있고, 이는 MgCl2가 MVA 안정성에 유익 효과를 보이지 않고, 적어도 0.5 M의 농도에서는 MVA 안정성에 심지어 유해 효과를 보임을 명확하게 보인다.
그러므로 MgCl2는 바람직하게 백시니아 바이러스 액체 제제에서 배제되거나 또는 이 제제 중에 낮은 농도로 존재하여야 한다.
본 발명에 의한 최적화 제제는, 폭스 바이러스 안정성, 더욱 특히 백시니아 바이러스 안정성에 대한 MgCl2의 임의의 작은 유익 효과를 방해할 수 있는 킬레이트화제(특히 2가 양이온 킬레이트화제, 더욱 바람직하게는 EDTA)를 함유하므로 이는 전적으로 더욱 사실과 맞는다.
본 발명에 의한 제제 중 MgCl2의 유해 효과에 관한 추가의 증거는 이하 실시예 5에 제시되어 있다(도 16도 참조).
이와 유사하게, 인간 연속 세포주에서 생산되어, 적어도 1개의 프로테아제 처리 단계를 1회 이상 수반하는 방법에 의해 정제된 백시니아 바이러스 와이어스 균주의, Tris-HCl 30 mM, 수크로스 10%(w/v) 함유 제제, 또는 1000 mM(1 M) MgCl2를 추가로 함유하는 제제 중 안정성은 +37℃에서 7일 또는 14일 경과 후에 시험되었다. 결과들은 도 8b에 제시되어 있으며, 또한 이 백시니아 바이러스 균주에 대해 MgCl2는 안정성에 긍정적인 효과를 보이지 않음을 명백히 보인다.
아르기닌의 유익 효과 부재 및 오히려 유해 효과
+37℃에서, Tris-HCl, Na 글루탐산염, 수크로스, NaCl 함유 제제(pH 8.0)(표 9 참조) 중 MVA-MUC1의 안정성에 대한 아르기닌의 영향력이, 다른 바이러스에 안정화 효과를 발휘하는 것으로 보이는 다양한 농도의 아르기닌이 사용되어, 그리고 사용되지 않고 시험되었다[US 2007/0161085 참조]. 결과들은 도 9에 제시되어 있고, 이는 아르기닌이 MVA 안정성에 유익 효과를 보이지 않음을 명확하게 보인다. 이와는 대조적으로, 37℃에서 28일 경과 후, 특히 높은 농도로의 아르기닌의 존재는 오히려 유해하다.
그러므로 아르기닌은 백시니아 바이러스의 액체 제제로부터 배제되거나 이 제제 중에 매우 낮은 농도로 존재하는 것이 바람직할 것이다.
이와 유사하게, 인간 연속 세포주에서 생산되어, 적어도 1개의 프로테아제 처리 단계를 1회 이상 수반하는 방법에 의해 정제된 백시니아 바이러스 와이어스 균주의, Tris-HCl 30 mM, 수크로스 10%(w/v) 함유 대조군 제제, 또는 50 mM 아르기닌을 추가로 함유하는 제제 중 안정성은 +37℃에서 7일, 14일, 21일 또는 28일 경과 후에 시험되었다. 결과들은 도 9b에 제시되어 있으며, 이는 아르기닌이 이 백시니아 바이러스 균주에 대해 안정성에 긍정적인 효과를 보이지 않음을 명백히 보인다.
아미노산 혼합물의 유익 효과 부재
+37℃ 및 +25℃에서, Tris-HCl, Na 글루탐산염, 수크로스, NaCl 함유 제제(pH 8.0)(표 10 참조) 중 MVA-MUC1의 안정성에 대한 아미노산 혼합물의 영향력이, 아미노산 혼합물이 사용되어, 그리고 사용되지 않고 시험되었다. 결과들은 도 10에 제시되어 있고, 이는 아미노산 혼합물의 존재가 MVA 안정성에 거의 영향을 미치지 않음을 명확하게 보인다.
아미노산 혼합물이 백시니아 바이러스의 액체 제제 중에 존재할 수 있을 때, 이 아미노산 혼합물은 필수적이지 않으며, 존재할 필요도 없음이 명확하다.
히스티딘의 유익 효과 부재 및 오히려 유해 효과
+25℃ 및 +5℃에서, Tris-HCl, Na 글루탐산염, 수크로스, NaCl 함유 제제(pH 7.5)(표 11 참조) 중 MVA-HPV의 안정성에 대한 히스티딘의 영향력이, 다른 바이러스에 안정화 효과를 발휘하는 것으로 보이는 농도의 히스티딘(10 mM)이 사용되어, 그리고 사용되지 않고 시험되었다[문헌(EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75), US 7,456,009, US 2007/0161085, US 7,914,979, WO 2014/029702, WO 2014/053571 참조]. 결과들은 도 11a 및 11b에 제시되어 있다.
+25℃ 또는 5℃에서 히스티딘의 안정화 효과는 관찰되지 않았다. 이와는 대조적으로, 상기 두 온도에서 탈안정화 효과를 지향하는 경향이 관찰될 수 있다.
그러므로, 히스티딘은, 바람직하게 백시니아 바이러스의 액체 제제로부터 배제되거나 또는 이 제제 중에 매우 낮은 농도로 존재해야 한다.
결론
상기 결과들은 다음과 같은 사항들을 명확히 보인다:
* 이하 화합물들은 액체 제제 중 백시니아 바이러스 안정성에 유의적인 유익 효과를 보인다:
- 1가 염, 예를 들어 NaCl;
- 낮은 %의 2당체, 예를 들어 수크로스[이와 같은 성분은 동해방지제로서, 낮은 보관 온도, 예를 들어 약 +5℃에서 백시니아 바이러스를 보호하는 것으로 생각됨. 또한, 이러한 화합물은 액체 제제의 점도를 증가시키는데, 이점은 백시니아 바이러스와 잠재적으로 유해한 화합물 간 상호작용을 제한할 수 있음];
- 안정화 효과가 큰 EDTA;
- EDTA보다 적게 존재함에도 불구 유의적 안정화 효과를 보이는 에탄올;
- EDTA 및 에탄올의 조합(이 조합은 각각의 화합물이 단독으로 함유되어 있는 경우와 비교되었을 때 추가의 안정화 효과를 제공함)
그러므로 이러한 화합물들 중 1개 이상은 안정한 액체 백시니아 바이러스 제제 중에 존재할 수 있다.
특히 상기 결과들은, 수크로스, 1가 염 및 EDTA를 함유하고, 바람직하게 에탄올도 또한 함유하는 완충 액체 제제가 특히 우수한 안정성을 보임을 보여준다.
* 이하 화합물들은 액체 제제 중 백시니아 바이러스 안정성에 유익 효과를 거의 보이지 않으나, 이에 유해 효과는 보이지 않는다:
- Na 글루탐산염(이 화합물은 안정성에 필수적이지는 않지만, 낮은 농도는 MVA에 작은 안정화 효과를 발휘할 수 있음);
- 아미노산들의 혼합물(이 화합물은 안정성에 필수적이지는 않지만, 낮은 농도는 MVA에 작은 안정화 효과를 발휘할 수 있음)
이러한 화합물은 본 발명에 의한 제제 중에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다.
* 이하 화합물들은 낮은 농도에서 액체 제제 중 백시니아 바이러스 안정성에 유익 효과를 보이지 않으며, 높은 농도에서는 유해 효과를 보이므로, 안정한 액체 백시니아 바이러스 제제 중 존재하지 않거나 매우 낮은 농도로 존재하여야 한다:
- 계면활성제, 예를 들어 폴리솔베이트(낮은 농도에서 효과는 관찰되지 않음. 그러나 적어도 0.02%v/v의 농도에서 폴리솔베이트의 농도와 함께 증가하는 탈안정화 효과가 관찰됨);
- 히스티딘(10 mM에서 약한 탈안정화 효과가 관찰될 수 있음);
- MgCl2: 0.5 또는 1 M, 아니면 심지어 75 mM(이하 실시예 5 참조)에서, 탈안정화 효과가 관찰됨.
- 아르기닌: 적어도 30 mM의 농도에서 약한 탈안정화 효과가 관찰되고, 탈안정화는 아르기닌 농도와 함께 증가함.
실시예 2: MVA 바이러스 안정성에 대한 pH의 영향력
안정한 액체 제제에 적합한 pH 범위를 결정하기 위해, 백시니아 바이러스 안정성에 대한 액체 제제 pH의 영향력이 시험되었다.
재료 및 방법
MVA 바이러스
사용된 MVA 바이러스는, HCV 유전자형 1b 균주 ja로부터 비 구조적 HCV 단백질(NS3, NS4 및 NS5B)을 발현하는 재조합 MVA 바이러스인 MVA-HCV(TG4040)[초기 목표 농도 4-8×107 IG/㎖로 희석됨]이었다(WO 2004/111082 참조). MVA-HCV는 닭 배 섬유아세포(CEF) 중에서 생산되었고, 감염된 CEF 배양액의 회수, 기계적 수단에 의한 세포의 파괴, 그리고 임의의 프로테아제 처리 단계를 수반하지 않는 다양한 정제 단계를 포함하는 방법에 의해 회수 및 정제되었다.
시험한 제제
시험한 제제는 이하 표 12에 제시되어 있다:
[표 12]
Figure pct00023
안정성 분석
안정성 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
감염성 역가의 측정
감염성 역가의 측정은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
결과
+37℃ 및 +5℃에서 pH가, Tris-HCl, Na 글루탐산염, 수크로스, NaCl, EDTA 및 에탄올을 함유하는 제제 중 MVA-HCV의 안정성에 미치는 영향력이 다양한 pH 값에서 시험되었다. 결과들은 도 12a 및 12b에 제시되어 있다.
+37℃(도 12a)에서, 이미 7일 경과 후 pH가 6 초과 9 미만 사이에 포함되는 것이 중요함은 분명하다. 특히 pH가 7 내지 8에 포함될 때 우수한 결과들이 얻어진다.
+5℃(도 12b)에서, 12개월 경과 시 결과들은, pH가 6 초과 9 미만 사이에 포함되는 것이 더 나음을 암시한다. 특히 pH가 7 내지 8에 포함될 때 우수한 결과들이 얻어진다.
결론
상기 결과들은, 백시니아 바이러스 액체 제제의 pH는 바람직하게 6 초과 9 미만 사이에 포함되어야 함을 보인다. 특히 pH가 7 내지 8에 포함될 때 우수한 결과들이 얻어진다. 그러므로 6.5 내지 8.5에 포함되는 pH가 허용 가능하다.
실시예 3: MVA 바이러스 초기 역가의 안정성에 대한 영향력
그 다음, 액체 제제 중 추후 안정성에 대한 백시니아 바이러스 초기 역가의 영향력도 또한 시험되었다.
재료 및 방법
MVA 바이러스
사용된 MVA 바이러스는, HCV 유전자형 1b 균주 ja로부터 비 구조적 HCV 단백질(NS3, NS4 및 NS5B)을 발현하는 재조합 MVA인 MVA-HCV(TG4040)[다양한 초기 목표 농도 1.0×108 PFU/㎖, 5.0×107 PFU/㎖, 1.0×107 PFU/㎖, 그리고 5.0×106 PFU/㎖로 희석됨]이었다(WO 2004/111082 참조).
MVA-HCV는 닭 배 섬유아세포 중에서 생산되었고, 감염된 CEF 배양액의 회수, 기계적 수단에 의한 세포의 파괴, 그리고 임의의 프로테아제 처리 단계를 수반하지 않는 다양한 정제 단계를 포함하는 방법에 의해 회수 및 정제되었다.
시험한 제제
시험한 제제는 이하 표 13에 제시되어 있다:
[표 13]
Figure pct00024
안정성 분석
안정성 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
감염성 역가의 측정
감염성 역가의 측정은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
결과
+37℃, +25℃ 및 +5℃에서, 다양한 초기 역가일 때 MVA-HCV의 감염성 손실의 진화는 도 13a, 13b 및 13c에 각각 제시되어 있다.
+37℃에서, 본 발명에 의한 모든 제제들의 감염성 역가는 7일 경과 후 1 log 이하였다. 그러나, 더 큰 초기 MVA-HCV 역가를 가지는 제제의 더 큰 안정성을 지향하는 경향이 관찰될 수 있다. 14일 경과 시, 초기 MVA-HCV 역가가 5.0×106 PFU/㎖인 제제를 제외한, 본 발명에 의한 모든 제제의 감염성 역가는 1 log보다 훨씬 작았지만, 초기 MVA-HCV 역가가 더 큰 제제의 더 큰 안정성에 대한 명확한 경향이 관찰된다. 이 관찰은, 28일 경과 시 오로지 본 발명에 의한 제제(초기 MVA-HCV 역가가 5.0×107 PFU/㎖ 또는 1.0×108 PFU/㎖)로서, 1 log 이하의 감염성 손실을 보이는 제제에 대해서만 확인된다(도 13a).
+25℃에서 동일한 유형의 관찰결과가 얻어질 수 있다(도 13b). 그러나, 초기 MVA-HCV 역가에 따른, 본 발명에 의한 제제의 안정성 차이는 오히려 2개의 하위 군을 구별한다: 적어도 1.0×107 PFU/㎖를 보이는 제제(7개월 경과 시, 1 log 미만의 감염성 역가 손실을 보임) 3개와, 1.0×107 PFU/㎖ 미만을 보이는 제제(5.0×106 PFU/㎖, 7개월 경과 시, 1 log 초과의 감염성 역가 손실을 보이고, 3개월 경과 시 이미 감염성 역가 손실을 거의 1 log 보임) 1개.
+5℃에서, MVA-HCV 초기 역가에 따른, 본 발명에 의한 제제의 안정성 차이는 25℃에서와 같이 동일한 하위 군 2개를 구별한다(도 13c): 적어도 1.0×107 PFU/㎖를 보이는 제제(18개월 경과 시, 0.2 log 미만의 감염성 역가 손실을 보임) 3개와, 1.0×107 PFU/㎖ 미만을 보이는 제제(5.0×106 PFU/㎖, 12개월 경과 시 이미 0.5 log 초과의 감염성 역가 손실을 보이고, 2개월 경과 시 이미 0.3 log의 한정된 한계를 초과하여 보임) 1개.
결론
상기 결과들을 보았을 때, 초기 역가 적어도 1.0×107 PFU/㎖는 MVA 액체 제제의 안정성 보장에 매우 바람직한 것으로 보인다.
실시예 4: 다양한 백시니아 바이러스 균주의 안정성
앞선 실시예들에 정의된, 최적화 제제들의 안정성을 확인하기 위해, 이와 같이 최적화된 제제가 변별적 실험 2회를 통해 다양한 백시니아 바이러스 균주에 대해 시험되었다.
재료 및 방법
바이러스
하기 백시니아 바이러스가 사용되었다:
* 실험 1:
- MUC1 종양 연관 항원 및 인터루킨 2를 발현하는 재조합 MVA 바이러스인 MVA-MUC1(TG4010)(WO 92/07000 및 WO 95/09241 참조)(초기 목표 농도 5-8×108 IG/㎖로 희석됨).
- HCV 유전자형 1b 균주 ja로부터 비 구조적 HCV 단백질(NS3, NS4 및 NS5B)을 발현하는 재조합 MVA 바이러스인 MVA-HCV(TG4040)(WO 2004/111082 참조)(초기 목표 농도 4-6×107 IG/㎖로 희석됨).
- 인간 유두종 바이러스 E6 및 E7 항원 및 인터루킨 2를 발현하는 재조합 MVA 바이러스인 MVA-HPV(TG4001)(WO 90/10459, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885, WO 2007/121894 참조)(초기 목표 농도 2-3×108 IG/㎖로 희석됨).
3개의 MVA 바이러스는 닭 배 섬유아세포 중에서 생산되어, 감염된 CEF 배양액의 회수, 기계적 수단에 의한 세포의 파괴, 그리고 임의의 프로테아제 처리 단계를 수반하지 않는 다양한 정제 단계를 포함하는 방법에 의해 회수 및 정제되었다.
* 실험 2:
- MVA-HCV(TG4040), 즉 닭 배 세포(MVA-HCV/CEC)(초기 목표 역가 2.5-3×107 IG/㎖), 또는 무한증식 오리 배 세포주(MVA-HCV/오리 세포주)(초기 목표 역가 3-4×107 IG/㎖)에서 생산되고, HCV 유전자형 1b 균주 ja로부터 비 구조적 HCV 단백질(NS3, NS4 및 NS5B)을 발현하는 재조합 MVA 바이러스(WO 2004/111082 참조);
- MVA-FCU1(TG4023), 즉 닭 배 세포(MVA-FCU1/CEC)에서 생산된(초기 목표 역가 1-1.5×108 IG/㎖), 시토신 탈아미노 효소 활성을 가지는 융합 단백질 1을 발현하는 재조합 MVA 바이러스(WO 99/54481 참조);
- 코펜하겐-FCU1(TG6002), 즉 닭 배 세포(코펜하겐-FCU1/CEC)에서 생산되고(초기 목표 역가 2-3.0×108 IG/㎖, 시토신 탈아미노 효소 활성을 가지는 FCU1 융합 단백질을 발현하며, 결손 I4L 및 결손 J2R 유전자를 포함하는, 재조합 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐(WO 2009/065546 및 WO 2009/065547 참조).
MVA-HCV/CEC, MVA-HCV/오리 세포주, MVA-FCU1/CEC, 및 코펜하겐-FCU1/CEC 바이러스를 생산/정제하기 위하여 사용되는 방법들은 프로테아제 효소를 첨가하는 임의의 단계를 포함하지 않았다.
* 실험 3:
- 인간 연속 세포주에서 생산되고, 적어도 1개의 프로테아제 처리 단계를 적어도 1회 수반하는 방법에 의해 정제된 와이어스 균주의 재조합 백시니아 바이러스 (VV 와이어스)도 또한 사용되었으며, 이때 초기 목표 역가는 5-8×108 PFU/㎖였다.
시험한 제제들
실험 1:
MVA 바이러스에 대해 실험한 제제들은 이하 표 14에 제시되어 있다:
[표 14]
Figure pct00025
실험 2:
MVA-HCV/CEC, MVA-HCV/오리 세포주, MVA-FCU1/CEC, 그리고 코펜하겐-FCU1/CEC 바이러스에 대하여 시험한 제제들은 이하 표 15a에 제시되어 있다:
[표 15A]
Figure pct00026
실험 3:
VV 와이어스 바이러스에 대해 시험한 제제들은 이하 표 15b에 제시되어 있다:
[표 15B]
Figure pct00027
안정성 분석
안정성 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
감염성 역가의 측정
감염성 역가의 측정은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
결과
실험 1:
+37℃, +25℃ 및 +5℃에서 본 발명의 최적화 제제 중 MVA 바이러스 3종의 안정성이 도 14a, 14b 및 14c에 각각 제시되어 있다.
+37℃에서, MVA 벡터 3종 모두는 28일 경과 시 감염성 역가 손실을 1 log 미만 보인 것으로 보아, 상기 벡터들은 이와 같은 고온에서 매우 우수한 안정성을 보인다.
+25℃에서, MVA 벡터 3종 모두는 또한 6개월 경과 시 감염성 역가 손실을 1 log 미만 보였던 것으로 보아, 상기 벡터들은 또한 이와 같은 온도에서 매우 우수한 안정성을 보인다.
마지막으로, MVA 벡터 3종 모두는 또한 30개월 경과 시 +5℃에서 감염성 역가 손실을 0.3 log 미만 보였던 것으로 보아, 상기 벡터들은 이와 같은 목표 보관 온도에서 매우 큰 안정성을 보인다.
사용된 MVA 벡터에 따라 몇몇 소수의 변동들이 관찰될 수 있을 때, 상기 결과들은, 상기 실시예들에서 디자인된 최적화 제제가, 임의의 MVA 벡터에 어떠한 이종 서열들이 삽입되었는지 간에 이러한 벡터에 적용될 수 있음을 명확히 보여준다.
실험 2:
이 두 번째 실험에서, MVA에 대해 이전에 최적화된 제제와 동일한 제제가 다양한 방법에 의해 얻어진 몇몇 MVA 바이러스, 그리고 또 다른 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐(벡터 TG6002)을 대상으로 시험되었다.
결과들은 도 15a에 제시되어 있는데, 이는 본 발명에 의하여 시험한 제제(MVA 바이러스에 대해 최적화된 제제)가 또한 다른 백시니아 바이러스 균주, 예를 들어 코펜하겐의 안정화를 허용하기도 함을 보여준다. 특히 1 log 미만의 손실은 14일 경과 시 시험한 바이러스 모두에 대해 관찰된다.
덜 안정화된 바이러스는 MVA-HCV/CEC이다. 이는, 이 바이러스가 최소 초기 역가에서 사용된 바이러스라는 사실에 의해 설명될 수 있다.
실험 3:
이 세 번째 실험에서, MVA에 대해 이전에 최적화한 제제와 동일한 제제가, 인간 연속 세포주에서 생산되었고, 적어도 1개의 프로테아제 처리 단계를 적어도 1회 수반하는 방법에 의해 정제된 또 다른 백시니아 바이러스 균주(와이어스 균주)에 대해 시험되었다.
결과들이 도 15b에 제시되어 있는데, 이는 바이러스 환경에 몇몇 프로테아제가 잠재적으로 잔존함에도 불구, 본 발명에 의하여 시험한 제제(MVA 바이러스에 대해 최적화된 제제)는 또한 와이어스 백시니아 바이러스 균주의 안정화를 허용함을 보여준다. 특히 28일 경과 시 1 log 미만의 손실이 관찰된다.
또한, 몇몇 잔여 프로테아제를 함유할 수 있는 바이러스 환경 중에 1가 염(NaCl)이 200 mM로부터 500 mM로 증가하면, 바이러스의 안정성도 또한 증가함을 주목하여야 한다.
결론
상기 결과들은, 본 발명의 발명자들에 의해 디자인된 최적화 제제들이 다양한 백시니아 바이러스 균주에 적용 가능하고, 이러한 바이러스에 삽입될 수 있는 이종 구성물은 본 발명에 의한 촤적화 제제에 의해 제공되는 안정화에 거의 영향을 미치지 않음을 명확하게 입증해 준다.
상기 결과들은 또한, 심지어 정제 방법이 적어도 1개의 프로테아제 처리를 수반하여, 바이러스 환경이 잔여 프로테아제를 함유할 수 있을 때, 본 발명의 발명자들에 의해 디자인된 최적화 제제가 사용될 수 있음을 보여준다. 이와 같은 특정의 경우에, 제제의 1가 염 농도가 200 mM을 초과하여 증가하면 안정성이 더 개선된다.
실시예 5: 바람직한 화합물들의, 동일한 군 또는 다른 군에 속하는 화합물들로의 대체
이전에 시험한 개별 화합물들이 동일한 군 또는 다른 군에 속하는 다른 화합물들로 대체될 수 있었는지에 대해 확인하기 위하여, 이전에 시험한 최적화 제제의 개별 화합물들 각각이 동일한 군 또는 다른 군에 속하는 화합물로 대체되어 실험이 수행되었다:
- 완충제: 이전에 시험한 완충제 Tris-HCl은 동일한 농도(20 mM)의 트리신 또는 HEPES 완충제로 대체되었다. 두 대체 완충제는 또한 pH7 내지 pH8에서 완충 능을 가진다.
- 염: 이전에 시험한 1가 염 NaCl은 동일한 농도(75 mM)의 또 다른 1가 염(KCl) 또는 2가 염(MgCl2)으로 대체되었다.
- 이당체 또는 당 알코올: 이전에 시험한 이당체 수크로스는 동일한 농도(10 %w/v))의 또 다른 이당체(트레할로스) 또는 당 알코올(만니톨)로 대체되었다.
- 킬레이트화제: 이전에 시험한 킬레이트화제 EDTA는, 동일한 농도(150 μM)의 기타 킬레이트화제 2개, 즉 EGTA 또는 DTPA로 대체되었다.
- C2-C3 알코올: 이전에 시험한 C2-C3 알코올인 에탄올은, 동일한 농도(0.5%)의 이소프로판올로 대체되었다.
재료 및 방법
바이러스
사용된 MVA 바이러스는 초기 목표 역가 8.0×107 내지 2×108 PFU/㎖로 희석된, MUC1 종양 연관 항원 및 인터루킨 2를 발현하는 재조합 MVA 바이러스인 MVA-MUC1(TG4010)(WO 92/07000 및 WO 95/09241 참조)이었다.
MVA-MUC1은 닭 배 섬유아세포 내에서 생산되어, 감염된 CEF 배양액의 회수, 기계적 수단에 의한 세포의 파괴, 그리고 임의의 프로테아제 처리 단계를 수반하지 않는 다양한 정제 단계를 포함하는 방법에 의해 회수 및 정제되었다.
시험한 제제
시험한 제제는 이하 표 16에 제시되어 있다:
[표 16]
Figure pct00028
Figure pct00029
안정성 분석
안정성 분석이 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
감염성 역가 측정
감염성 역가 측정은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
결과
+37℃에서 시험한 다양한 제제의 감염성 손실은 도 16a에 제시되어 있다.
+37℃에서 21일 경과 후(도 16b) 또는 28일 경과 후(도 16c), NemrodW® 소프트웨어가 사용되어, 처음 시험한 화합물의, 상기 인용된 기타 화합물들 중 하나로의 대체에 대한 통계학적 유의성이 분석되었다. 결과들은 다음의 사항들을 보여준다:
- 완충제: 21일 경과 시, Tris-HCl이 트리신 또는 HEPES 완충제로 대체되면, 비록 Tris-HCl이 MVA-MUC1을 약간 더 잘 안정화하는 것으로 보임에도 불구, MVA 바이러스 안정성에는 거의 영향이 미치지 않는다. 28일 경과 시, Tris-HCl이 트리신 으로 대체되면, 비록 Tris-HCl이 그 효과가 약간 더 큰 것으로 보임에도 불구, MVA 바이러스 안정성에는 거의 영향이 미치지 않고, HEPES 완충제는 Tris-HCl 및 트리신보다 덜 효과적이다.
- 염: 21일 또는 28일 경과 후, NaCl을 KCl로 대체하는 것은 MVA 바이러스의 안정성에 거의 영향을 미치지 않는다. 이와는 대조적으로, 21일 및 28일 경과 시, NaCl 또는 KCl을 MgCl2로 대체하는 것은 MVA 안정성에 유의적 유해 효과를 보이는데, 이는 MgCl2가 75 mM만큼의 낮은 농도에서도 유해할 수 있음을 추가로 확인시켜 주는 것이다.
- 이당체 또는 당 알코올: 수크로스를 만니톨로 대체하는 것은 MVA 바이러스 안정성에 거의 영향을 미치지 않는다. 수크로스가 트레할로스로 대체될 때, 21일 및 28일 경과 시에 MVA의 개선된 안정성을 지향하는 미미한 효과가 보였다.
- 킬레이트화제: EDTA를 DTPA 또는 EGTA로 대체하는 것은 21일 및 28일 경과 시에 MVA 바이러스 안정성에 거의 영향을 미치지 않는다.
- C2-C3 알코올: 에탄올(EtOH)을 이소프로판올로 대체하는 것은 21일 및 28일 경과 시 MVA 바이러스 안정성에 거의 영향을 미치지 않는다.
+5℃에서 시험한 다양한 제제의 감염성 손실은 도 16d에 제시되어 있다. 결과들은, 180일 경과 시 시험한 모든 제제들이 매우 작은(모두 0.3 log10 보다 작은) 감염성 손실을 보임을 보여준다.
결론
상기 결과들은, 본 발명에 의한 최적화 제제 중 처음에 시험한 화합물이, 백시니아 바이러스 안정성을 유의적으로 변경시키지 않고, 동일한 군의 다른 화합물로 대체될 수 있음[Tris-HCl은 pH7 내지 pH8에서 완충 능을 보이는 다른 완충제로, NaCl은 다른 1가 염으로, 수크로스는 다른 이당체 또는 당 알코올로, EDTA는 다른 킬레이트화제로, EtOH는 다른 C2-C3 알코올로 대체될 수 있음]을 명확히 입증해 준다.
이와는 대조적으로, NaCl 또는 다른 1가 염은 2가 염으로 대체되어서는 안되고, 따라서 이는 2가 염이 유의적 농도(여기서는 75 mM)로 존재할 때 유해 효과를 보이는 이전의 결과들을 확인시켜 주는 것이다.
실시예 6: 본 발명에 의한 안정한 액체 MVA 제제의 생체 내 면역화 특성
본 발명에 따라서 안정화된 액체 MVA 제제가 12개월 보관 후에도 방금 제조한 MVA 제제와 유사한 생체 내 면역원성을 가지는지 여부가 추가로 증명되었다.
재료 및 방법
MVA 바이러스
사용된 MVA 바이러스는 초기 목표 역가 1-3×108 PFU/㎖로 희석된, MUC1 종양 연관 항원 및 인터루킨 2를 발현하는 재조합 MVA 바이러스인 MVA-MUC1(TG4010)(WO 92/07000 및 WO 95/09241 참조)이었다.
MVA-MUC1은 닭 배 섬유아세포 내에서 생산되어, 감염된 CEF 배양액의 회수, 기계적 수단에 의한 세포의 파괴, 그리고 임의의 프로테아제 처리 단계를 수반하지 않는 다양한 정제 단계를 포함하는 방법에 의해 회수 및 정제되었다.
시험한 제제 및 보관
MVA-MUC1은 Tris-HCl 20 mM, 수크로스 10 %w/v, NaCl 75 mM, EDTA 150 μM, EtOH 0.5 %v/v 및 Na 글루탐산염 5 mM을 함유하는 액체 제제 중에 제제화되었다.
면역원성 시험을 위해, 방금 제제화되어 -80℃에 보관되었던 MVA(T=0) 또는 +5℃±3℃에서 12개월 동안 보관되었던 제제화 MVA(T=12개월) 중 어느 하나가 사용되었다.
면역원성 시험
사용된 모델은, MVA-MUC1 벡터가 마우스에 주사된 후 MUC1 항원을 발현하는 종양 세포가 추가로 투여된 예방적 모델이다. 추가의 상세한 설명이 이하에 제공되어 있다:
제1 실험:
* 마우스: C57BL/6 마우스가 사용되었다. 각각의 군은 20 마리의 동물로 이루어졌다.
- 제1군: 제제 단독 투여
- 제2군 - 제4군: T=0에 MVA-MUC1(104, 105 또는 106 PFU) 투여
- 제5군 - 제7군: T=12개월에 MVA-MUC1(104, 105 또는 106 PFU) 투여
* 시험할 결과물의 투여: 각각의 결과물은 각각의 조건에 대해서(T=0/T=12개월) 1주일 간격으로(D0/D7/D14) 3회 피하 주사되었다. 각각의 결과물에 대해서, 3가지 용량(104, 105 또는 106 PFU)이 시험되었다. 뿐만 아니라, 동일한 프로토콜에 따라서 음성 대조군으로서 (임의의 MVA-MUC1 바이러스 없이) 제제만이 단독으로 투여되었다.
* 종양 세포의 투여: 바이러스/제제의 마지막 주사 후 1주일 경과시(즉 제21일 경과 시(D21)), RMA-MUC1 세포가 피하 주사되었다.
* 107일(D107)까지 또는 종양 부피가 2000 ㎣가 될 때까지, 마우스 생존, 종양의 존재 및 크기가 모니터링되다가, 이에 도달할 때 마우스는 살생되었다.
제2 실험:
T=0 및 T=24개월일 때, 제제 단독 투여시 또는 MVA-MUC1 함유 제제 투여시 용량 104 PFU에 있어서 면역원성들의 비교를 위하여 동일한 모델이 사용되었다.
결과
제1 실험:
이하 표 17A는 86일 경과 시 결과물 및 주사한 용량에 따른 종양 부재 마우스의 %를 제시하고 있다[0개월 또는 12개월 보관 후 제제 단독 또는 MVA-MUC1 투여].
[표 17A]
Figure pct00030
상기 결과들은
- 시험한 액체 제제는 보통 말하는 면역 반응, 즉 RMA-MUC1 종양 세포에 대하여 마우스를 보호하는 면역 반응을 유도하지 않으며
- +5℃±+3℃에서 12개월 동안, 시험한 제제 중 MVA-MUC1의 보관은, MVA-MUC1이 RMA-MUC1 종양 세포에 대하여 마우스를 보호하는 면역 반응을 유도하는 능력에 거의 영향을 미치지 않음
을 보여주고 있다.
제2 실험:
이하 표 17B는 65일 경과 시 결과물에 따른 종양 부재 마우스의 %를 제시하고 있다[0개월 또는 24개월 보관 후 제제 단독 또는 MVA-MUC1 투여].
[표 17B]
Figure pct00031
상기 결과들은
- 시험한 액체 제제는 보통 말하는 면역 반응, 즉 RMA-MUC1 종양 세포 공격에 대하여 마우스를 보호하는 면역 반응을 유도하지 않으며
- +5℃±+3℃에서 24개월 동안, 시험한 제제 중 MVA-MUC1의 보관은, MVA-MUC1이 RMA-MUC1 종양 세포 공격에 대하여 마우스를 보호하는 면역 반응을 유도하는 능력에 거의 영향을 미치지 않음
을 보여주고 있다.
결론
상기 데이터는, 본 발명에 의한 최적화 제제가 2년 동안 보관되면서 감염성 바이러스 역가를 유지할 뿐만 아니라 생체 내 방어 면역 반응을 유도하는 능력도 유지함을 확인해 준다.
실시예 7: UV 손상에 대한 EDTA 의 보호 효과
백시니아 바이러스는 UV 손상에 민감한 것으로 공지되어 있다[문헌(LYTLE et al. J. Virol. 2005, 79(22):14244) 참조]. 다양한 제제들이 UV 손상에 대해 백시니아 바이러스를 보호하는 능력이 2회의 독립된 실험을 통해 시험되었다.
재료 및 방법
MVA 바이러스
사용된 MVA 바이러스는 초기 목표 역가 5×107 내지 7×107 IG/㎖(제1 실험) 및 3×108 내지 5×108 IG/㎖(제2 실험)으로 희석된, HCV 유전자형 1b 균주 ja로부터 비 구조적 HCV 단백질(NS3, NS4 및 NS5B)을 발현하는 재조합 MVA 바이러스인 MVA-HCV(TG4040)(WO 2004/111082 참조)였다.
MVA-HCV는 닭 배 섬유아세포 내에서 생산되어, 감염된 CEF 배양액의 회수, 기계적 수단에 의한 세포의 파괴, 및 임의의 프로테아제 처리 단계를 수반하지 않는 다양한 정제 단계를 포함하는 방법에 의해 회수 및 정제되었다.
시험한 제제
실험 1에서 MVA-HCV에 대해 시험한 제제들은 이하 표 18에 제시되어 있다:
[표 18]
Figure pct00032
실험 2에서 MVA-HCV에 대해 시험한 제제들은 이하 표 19에 제시되어 있다:
[표 19]
Figure pct00033
광 조건
시료들은 이하와 같은 광 조건에서 보관되었다:
- 빛이 비추지 않는 조건,
- PSM(D65/ID65 발광 표준과 유사한 아웃풋을 내도록 디자인된 임의의 광원, 예를 들어 가시 및 자외(UV) 아웃풋을 합한 인공 일광 형광 램프, 제논 또는 금속 할로겐화물 램프) 하에 두는 조건[D65는 ISO 10977(1993)에 정의된 바와 같이 실외 일광에 대하여 국제적으로 인지된 표준임. ID65는 이와 동급의 실내 간접 일광 표준임. 320 ㎚ 이하의 유의적 방사선을 방출하는 광원의 경우, 실온에서 적당한 필터(들)가 끼워지면 이러한 방사선이 차단될 수 있음], 또는
- ICH 광(320 ㎚ 내지 400 ㎚의 스펙트럼 분포를 가지고, 350 ㎚ 내지 370 ㎚에서 에너지가 최대로 방출되는 근 UV 형광 램프로서; UV의 유의적 비율만큼이 320 ㎚ 내지 360 ㎚의 대역과 360 ㎚ 내지 400 ㎚의 대역 둘 다에 있어야 함. "ICH Q1B Photostability Testing of New Drug Substances and Products" 참조).
안정성 분석
28일 동안 +25℃(±2℃)에서 안정성이 분석되었다.
감염성 손실은, 제0일에서의 IG/㎖ 초기 수치에 대하여 측정 시 1㎖당 감염성 게놈 수(IG/㎖)를 공제함으로써 산정되었고, 이는 십진 대수값(log10(IG/㎖))으로서 표현되었으며, 본 발명의 설명에서는 log로서 축약 제시되었다(IG/㎖).
감염성 역가의 측정
감염성 역가의 측정이 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
결과
결과는 도 17a 및 17b(각각 실험 1 및 실험 2)에 제시되어 있다. 도 17a에 있어서, 다양한 광 조건(무광, PSM 또는 ICH)의, 대조군 및 본 발명에 의한 최적화 제제 안정성에 대한 효과가 시험되었다. 모든 제제에 있어서, ICH 광 조건은 유의적 탈안정화를 초래하였는데, 이는 백시니아 바이러스의 감광성과 ICH 조건의 매우 강한 조명에 대해 아는 관계로 놀랍지 않은 결과이다. 그러나, 모든 제제의 탈안정화에도 불구, 본 발명에 의한 액체 제제가 사용될 경우 MVA-HCV의 감소한 탈안정화가 초래됨이 도 17a로부터 명백해진다(분명하게는 2, 3 및 7일 경과 시 감염성 손실 참조). 이처럼 극단적인 광 조건 하에서 대조군 제제에서 관찰된 감염성 역가 손실은 2일 경과 시 1 log에 도달하도록 증폭되었음을 주목해야 한다.
뿐만 아니라, 더욱 합리적인 광 조건(PSM 조건)의 경우, 본 발명에 의한 액체 제제가 사용되면 MVA-HCV의 유의적으로 감소한 탈안정화도 또한 초래되며, 이때 28일 경과 시 +25℃에서의 감염성 손실은 0.5 log보다 훨씬 작았던 반면에, 21일 경과 시 25℃에서의 감염성 손실은 대조군 제제의 경우 1 log를 초과하였다.
도 17b에서, ICH 광 조건 하에 다양한 제제의 안정화 효과가 시험되었다. 도 17a에서와 같이, Tris-HCl, NaCl, Na 글루탐산염, 수크로스, EDTA 및 EtOH를 함유하는 최적화 제제는, EDTA 및 EtOH를 포함하지 않는 대조군 제제보다 ICH 광 조건 하에서 안정성을 훨씬 더 향상시켰다. 뿐만 아니라, 도 17b는, EDTA는 포함하나 EtOH는 포함하지 않는 제제는 유사한 안정화 효과를 가지는 한편, EtOH는 포함하되 EDTA는 포함하지 않는 제제는 대조군 제제보다 안정화 효과가 크지 않은 것으로 보아, 안정화 효과가 EDTA로 말미암음을 보여준다.
결론
상기 결과들은, 본 발명에 의한 제제는 빛이 존재하지 않을 때 백시니아 바이러스를 안정화할 뿐만 아니라, UV 손상으로 말미암은 분해로부터 백시니아 바이러스를 한층 더 보호해 줌을 명확하게 보여준다. 이는 액체 제제 중 백시니아 바이러스 보관에 대한 제약들을 제한하는데에 큰 도움이 될 수 있다.
실시예 8: 다양한 성분 농도에서 본원에서 청구된 제제들의 강력한 안정화 효과
본 발명에 의한 제제들의 안정화 효과의 강력함을 시험하기 위해, 다양한 농도의 변별적 성분들을 함유하는 몇몇 제제가, MVA 벡터를 안정화하는 자체의 능력에 대해 시험되었다.
재료 및 방법
바이러스
사용된 MVA 바이러스는 초기 목표 역가 1-4×108 PFU/㎖로 희석된, MUC1 종양 연관 항원 및 인터루킨 2를 발현하는 재조합 MVA 바이러스인 MVA-MUC1(TG4010)(WO 92/07000 및 WO 95/09241 참조)이었다.
MVA-MUC1은 닭 배 섬유아세포 내에서 생산되어, 감염된 CEF 배양액의 회수, 기계적 수단에 의한 세포의 파괴, 및 임의의 프로테아제 처리 단계를 수반하지 않는 다양한 정제 단계를 포함하는 방법에 의해 회수 및 정제되었다.
시험한 제제
시험한 제제들은 이하 표 20에 제시되어 있다.
[표 20]
Figure pct00034
안정성 분석
안정성 분석이 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
감염성 역가의 측정
감염성 역가의 측정이 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
결과
+37℃에서 시험한 다양한 제제들의 감염성 손실이 도 18에 제시되어 있다.
제제화 후 21일 경과 시, 시험한 모든 제제는 1 log10보다 적은 감염성 손실을 보였다. 28일 경과 시, 시험한 대부분의 제제도 또한 1 log10보다 적은 감염성 손실을 보였다.
결론
상기 데이터는, 본 발명에 의한 최적화 제제가, 이 제제에 함유된 다양한 농도의 성분들에 대해 강력한 안정화 효과를 보임을 확인시켜 준다.
실시예 9: 본원에 청구된 제제들의 다른 유형의 폭스 바이러스에 대한 안정화 효과
재료 및 방법
바이러스
비 재조합 가성 소 폭스 바이러스(파라폭스 바이러스 과)가 초기 목표 역가 1-3×108 PFU/㎖로 사용되었다.
시험한 제제
시험한 제제가 이하 표 21에 제시되어 있다.
[표 21]
Figure pct00035
안정성 분석
안정성 분석이 37℃에서 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
감염성 역가의 측정
감염성 역가의 측정이 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
결과
결과가 도 19에 제시되어 있으며, 이는 본 발명에 의하여 시험한 제제가 가성 소 폭스 바이러스를 크게 안정화함을 보여주고 있다. 특히 Tris 및 수크로스만을 포함하는 대조군 가성 소 폭스 바이러스의 28일 경과 후 37℃에서 감염성 손실은 2.5 log10을 초과하는 한편, 제제화된 가성 소 폭스 바이러스의 28일 경과 후 37℃에서 감염성 손실은 약 0.5log10에 불과하다.
결론
상기 결과들은, 본 발명에 의한 제제들이 파라폭스 바이러스 과의 한 폭스 바이러스인 가성 소 폭스 바이러스를 안정화하는데 적합함을 명확히 보여준다.
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WO 2009/004016,
WO 2009/065546,
WO 2009/065547,
WO 2010/130753,
WO 2014/009433,
WO 2014/009438,
WO 2014/029702,
WO 2014/053571.

Claims (27)

  1. a) 폭스 바이러스, 특히 백시니아 바이러스;
    b) 약학적으로 허용 가능한 완충제;
    c) 1가 염;
    d) 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올; 그리고
    e) 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제
    를 포함하고, 자체의 pH가 6.5 내지 8.5에 포함되는 액체 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 액체 제제는 계면활성제를 포함하지 않거나, 0.005 %(w/v) 이하의 농도로 계면활성제를 포함하는 액체 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 액체 제제는 2가 염을 포함하지 않거나, 1 mM 이하의 농도로 2가 염을 포함하는 액체 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 액체 제제는 히스티딘을 포함하지 않거나, 5 mM 이하의 농도로 히스티딘을 포함하는 액체 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 액체 제제는 아르기닌과 메티오닌을 포함하지 않거나, 또는 300 mM 이하의 농도의 아르기닌 및/또는 60 mM 이하의 농도의 메티오닌을 포함하는 액체 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폭스 바이러스는 적어도 107 PFU/㎖의 역가로 존재하는 액체 제제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폭스 바이러스는 숙주 세포 단백질을 용량당 500 ㎍ 이하, 그리고 숙주 세포 DNA를 용량당 10 ng 이하 포함하도록 적어도 반 정제되는 액체 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 완충제는 pH7 내지 pH8에서 완충 능을 가지고, 10 내지 50 mM의 농도로 존재하는 액체 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 완충제는 pH7 내지 pH8에서 완충 능을 가지고, TRIS-HCl, TRIS, HEPES, Na2HPO4 및 KH2PO4의 혼합물, 또는 Na2HPO4 및 NaH2PO4의 혼합물을 포함하는 인산염 완충제, ACES, PIPES, MOPSO, BIS-Tris-프로판, BES, MOPS, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS 및 트리신 완충제로부터 선택되며, 바람직하게 상기 pH7 내지 pH8에서 완충 능을 가지는 약학적으로 허용 가능한 완충제는 TRIS-HCl 완충제인 액체 제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 1가 염은 10 내지 1000 mM의 농도로 존재하는 액체 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 1가 염은 NaCl 및 KCl로부터 선택되고, 바람직하게 상기 1가 염은 NaCl인 액체 제제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올은 5 내지 20 %(w/v), 바람직하게 5 내지 15 %(w/v), 그리고 더욱 바람직하게 약 10 %(w/v)의 농도로 존재하는 액체 제제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 말토스, 락토스, 만니톨 및 솔비톨로부터 선택되고, 바람직하게 상기 약학적으로 허용 가능한 이당체 또는 당 알코올은 수크로스인 액체 제제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제는 적어도 50 μM, 바람직하게 50 내지 250 μM의 농도로 존재하는 액체 제제.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), 디머캅토숙신산(DMSA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 그리고 2,3-디머캅토-1-프로판설폰산(DMPS)으로부터 선택되고, 바람직하게 상기 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제는 EDTA인 액체 제제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, C2-C3 알코올을 0.05 내지 5 %(v/v), 바람직하게 0.1 내지 2 %(v/v), 가장 바람직하게 약 0.5 %(v/v)의 농도로 추가로 포함하는 액체 제제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 C2-C3 알코올은 에탄올 및 이소프로판올로부터 선택되고, 바람직하게 상기 C2-C3 알코올은 에탄올인 액체 제제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 글루탐산나트륨을 10 mM 이하의 농도로, 바람직하게는 2.5 내지 7.5 mM의 농도로, 더욱 바람직하게는 약 5 mM의 농도로 추가로 포함하는 액체 제제.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, +37℃에서 적어도 1주일 동안 보관될 때 상기 액체 제제 중 감염성 폭스 바이러스 역가의 손실은 감염성 바이러스의 1 log10 미만인 액체 제제.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, +37℃에서 적어도 12개월 동안 보관될 때 상기 액체 제제 중 감염성 폭스 바이러스 역가의 손실은 감염성 바이러스의 0.3 log10 미만인 액체 제제
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폭스 바이러스는 오르토폭스 바이러스 또는 파라폭스 바이러스인 액체 제제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폭스 바이러스는 백시니아 바이러스이고, 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA), 와이어스 및 코펜하겐 균주로부터 바람직하게 선택되는 액체 제제.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스는
    - 직접적으로나 간접적으로 세포독성 기능을 가지는 분자를 암호화하는 외인성 서열, 특히 자살 유전자, 예를 들어 시토신 탈아미노 효소(CDase) 유전자,
    - 종양 연관 항원(TAA), 특히 MUC1과, 선택적으로는 시토킨, 특히 인터루킨 2(IL-2)를 암호화하는 외인성 서열,
    - 바이러스 항원, 특히 인간 유두종 바이러스 항원, B형 간염 바이러스 항원, C형 간염 바이러스 항원을 암호화하는 외인성 서열, 그리고
    - 박테리아 항원, 특히 마이코박테리움 항원을 암호화하는 외인성 서열
    로부터 선택되는 외인성 서열 적어도 1개를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스인 액체 제제.
  24. UV 손상에 대하여 폭스 바이러스를 안정화하기 위한, 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제의 용도.
  25. 제24항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), 디머캅토숙신산(DMSA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 그리고 2,3-디머캅토-1-프로판설폰산(DMPS)로부터 선택되고, 바람직하게 상기 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제는 EDTA인 용도.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 폭스 바이러스는 액체 조성물 중에 존재하고, 상기 약학적으로 허용 가능한 킬레이트화제는 적어도 50 μM, 바람직하게 50 내지 250 μM의 농도로 존재하는 용도.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폭스 바이러스는 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 의한 액체 조성물 중에 존재하는 용도.
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