HU226658B1 - Immortalized cell lines for virus growth - Google Patents
Immortalized cell lines for virus growth Download PDFInfo
- Publication number
- HU226658B1 HU226658B1 HU0000188A HUP0000188A HU226658B1 HU 226658 B1 HU226658 B1 HU 226658B1 HU 0000188 A HU0000188 A HU 0000188A HU P0000188 A HUP0000188 A HU P0000188A HU 226658 B1 HU226658 B1 HU 226658B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- virus
- immortalized
- cell
- cell line
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 114
- 230000012010 growth Effects 0.000 title description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 283
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 33
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 33
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 21
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 7
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 6
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 6
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 claims description 4
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 4
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 claims description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 3
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 claims 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 claims 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 claims 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 6
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 2
- 241000886677 Duck adenovirus 1 Species 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- -1 disodium salt Chemical class 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241001516406 Avian orthoreovirus Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 description 1
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 241001223089 Tremovirus A Species 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 description 1
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004135 animal tissue culture Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 208000014058 canine distemper Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000002219 extraembryonic membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 229940071125 manganese acetate Drugs 0.000 description 1
- UOGMEBQRZBEZQT-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);diacetate Chemical compound [Mn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UOGMEBQRZBEZQT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000002976 reverse transcriptase assay Methods 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000002100 tumorsuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/867—Retroviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16651—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
A találmány tárgya a sejtbiológia és a virológia területéhez tartozik. Ezen belül a találmány tárgyát immortalizált sejtvonalak képezik, valamint eljárások vírusszaporításra immortalizált sejtvonalak segítségével.
1931-ben Alice Miles Woodruff és Emest Goodpasture új módszert vezetett be vírusok tenyésztésére [American Journal of Patology, 1209-222 (1931)]. Beszámoltak arról, hogy a baromfihimlő („fowl pox”) vírusa tenyészthető fejlődő csirkeembriók korioallantoiszmembránján. A vírussal való beoltás után a vírust tartalmazó léziók (sérülések) jelennek meg a membránon. A tojás viszonylag olcsó volt és könnyebben beszerezhető, mint az állatok, amelyek a korai víruskutatások alanyai voltak. A tojásnak sokféle, különféle vírusok általi fertőzésre érzékeny sejtje és membránja van, és kontrollált, stabil környezetben tartható. A csirkeembriók jelentős módon hozzájárultak a virológia fejlődéséhez, mivel számos vírusra érzékeny, kényelmesen hozzáférhető, különböző sejttípusokat szolgáltatnak.
Jóllehet a tojás számos vírustörzs szaporodását lehetővé teszi, a tojások fertőzésére és a vírusnövekedés fenntartására szolgáló módszerek időigényesek és kényelmetlenek. Például a korioallantoiszmembrán fertőzéséhez először lyukat kell fúrni a tojáshéjon és a héjhártyán. A légzsák fölötti héjat perforálják, aminek hatására a levegő bejut a héjhártya és a korioallantoiszmembrán közé, ezáltal egy mesterséges légzsák jön létre, ahol a mintát elhelyezik. A minta érintkezik a magzatburok (korion) hámszövetével (epitélium) és a vírus lézióként (sérülésként) nő a membránon. Nem meglepő tehát, hogy a tojások vírusreplikációra való alkalmazása csökkent a sejttenyésztési technikák megjelenésével.
Sokféle sejt szaporítható in vitro. A sejtkultúrákat könnyű fenntartani, és a tojásokhoz képest igen nagy mértékben kontrollált környezetben tarthatók. Vannak azonban vírustörzsek, amelyek úgy tűnik, hogy jobban nőnek embrionális tojássejtekben, mint tenyésztett sejtekben. Ezenfelül sok tenyésztett sejtvonal belső (endogén) fertőző ágenseket tartalmaz, köztük mikoplazmákat, alacsony szintű bakteriális szennyeződéseket, endogén vírusokat és hasonlókat. Néhány olyan sejttípus, amely a leghatékonyabb a vírusreplikáció támogatásában, problémákat vet fel vírustörzsállomány („viral stock”) előállítása során, mivel a sejtek endogén vírust tartalmaznak. Az endogén vírus vagy alacsony szinten reprodukálódik, vagy akkor aktiválható, ha a sejteket egy második vírussal fertőzzük. A rágcsálósejtekről például ismert, hogy endogén vírusokat hordoznak és rágcsálósejt-tenyészetek elektronmikroszkópos vizsgálata gyakran kimutatja azonosítható vírusrészecskék jelenlétét a sejtek belsejében. A fertőzött sejtvonalakat nem lehet alapanyagként felhasználni kereskedelmi forgalomban kapható élő vagy inaktivált vakcinák előállítására.
Egyes vírusok esetében a vírusreplikációhoz választandó módszer a csirkeembrióra épülő módszer. Például a humán influenzavírus, veszettségvírus, szopomyicavírus (Canine Distemper), Marek-betegségvírus, Reovírus és baromfihimlő-vírus („fowlpox”) olyan vírusok, amelyeket előszeretettel megtermékenyített tojásban - mivel a tojás támogatja a nagytiterű vírusállomány-növekedést - vagy megtermékenyített tojásokból származó elsődleges sejtekben szaporítanak. Más esetekben a vírusokat azért tenyésztik tojásokban, mert szükség van bizonyíthatóan vírusmentes sejtekre mint alapanyagokra.
Elsődleges („primer) sejttenyészetnek olyan sejttenyészeteket nevezünk, amelyeket érintetlen szövetekből frissen izoláltak. Ezek a sejtek gyakran jó forrásként szolgálnak vírusmentes anyagok számára és jól megfelelnek vírusreplikációhoz alkalmazható gazdasejtként. Az elsődleges sejtek nem mindig hatékonyak vírusreplikációra és az elsődleges állati sejtek tenyészetben korlátozott élettartamot mutatnak, végül elöregszenek. Az öregedés során a sejtek megszűnnek osztódni, és idővel kihalnak. A sejtek időbeni osztódási képessége tenyészetben számos paramétertől függ, amelyek között szerepel a faj, amelyből a sejt származik, valamint a szövet kora abban az időpontban, amikor a sejttenyészetbe helyezték. Az olyan sejteket, amelyek öregedési folyamaton mennek át, nem lehet hosszú időn át tenyészetben fenntartani, ezért nem használhatók mint reprodukálható gazdák, kereskedelmi vírustörzsállományok tenyésztésére.
Némely elsődleges sejt elkerüli az öregedést és megszerzi az immortalitásra („halhatatlanságra”) való képességet. A rágcsálósejtek úgy tűnik, hogy viszonylag könnyen átmennek egy spontán immortalizálódási folyamaton [Curalto és munkatársai: In Vitro, 20, 597, (1984)], normális humán és madársejtekről ritkán, vagy soha nem mutatták ki, hogy képessé lennének a spontán immortalizációra [Harvey és munkatársai: Genes and Development, 5, 2375, (1991); Pereira-Smith: J. Cell Physiol., 144, 546, (1990); Smith és munkatársai: Science, 273, 63, (1996)]. Számos oka van annak, hogy egy adott sejtpopuláció miért megy át immortalizációs folyamaton. Sejtek immortalizációs folyamata kiváltható például olyan hatóanyagokkal, amelyekről ismert, hogy génmutációkat okoznak. Néhányan azt állítják, hogy a növekedés megszűnése, ami az öregedéshez kapcsolódik, döntő az immortalizációban, és az olyan események, amelyek inaktiválják a növekedésgátló géneket, kiválthatják az immortalitást [PereiraSmith és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85, 6042, (1988)].
Ha immortalizált, vírusmentes sejtek állnak rendelkezésre, az szükségtelenné teszi az elsődleges állati szövettenyészetek alkalmazását, vagy legalábbis csökkenti használatukat. Az elsődleges tenyészetek általában rosszul definiált sejtpopulációk, és gyakran szennyezettek. Ezek a tenyészetek sokszor nem tudják teljesíteni a kereskedelmi vakcinatermeléssel szemben támasztott szabályozási feltételeket. Az elsődleges sejttenyészetek gyakran szennyezettek Circodnaviriadeaevel (például csirkeanémia-vírus), vagy tojáscseppszindróma („Egg Drop Syndrome”) vírusával. A Marek-betegség vakcinája (amely élővírus-vakcina) például vírusállományként növeszthető kacsatojásban baromfi-vakcinációhoz. 1976-ban számos vakci2
HU 226 658 Β1 nált csirkénél jelentkezett a tojáscseppszindróma, amelyet egy kacsaadenovírus okozott, amelyről úgy gondolják, hogy megfertőzte a vakcinatenyészetet és adaptálódott a csirkében való növekedéshez.
A vakcinaiparban a termékbiztonságra, konzisztenciára és hatékonyságra vonatkozó szabályozási követelmények arra kényszerítik a vállalatokat, hogy áttérjenek a sejtvonalakra, mert az a legjobb alternatíva a jelenlegi gyakorlattal szemben, amelyben vakcina-alapanyagokként tojásalapú vakcina-alapanyagokat és elsődleges sejteket használnak. A biztonság és konzisztencia iránti igényt osztják mind az emberi, mind az állati vakcinákat gyártó cégek, mivel a vakcina-alapanyagokkal kapcsolatos szabályozási környezet fokozottan szigorodik mind az Egyesült Államokban, mind Európában. A vírustenyésztésre megfelelő sejtek azonosítása a megtermékenyített tojások helyett kedvezőnek tűnik, tekintetbe véve az „Egyesült Államok kormányának alapelveit a gerinces állatok hasznosításával és a róluk való gondoskodással kapcsolatban a vizsgálatok, kutatás és oktatás során”, valamint az .Állatok jólétére” vonatkozó törvényt (7 U.S.C. 2131. §), amely többek között kimondja, hogy minden esetben az olyan módszereket, mint az in vitro biológiai rendszerek, előnyben kell részesíteni az in vivő állati modellrendszerekkel szemben. Állati oltóanyagtermékek előállításához szükség van olyan sejtekre, amelyek vírusmentesek és amelyek támogatják az exogén vírusnövekedést.
A találmány tárgya spontán módon immortalizált csirkefibroblaszt-sejtvonalak azonosítása és eljárás a sejtvonalak kinyerésére. Ezen belül a találmány tárgya egy spontán módon immortalizált („halhatatlanná tett”) sejtvonal, amely elsődleges csirkeembrió-fibroblasztból származik, és amely a spontán módon immortalizált UMNSAH-DF1 CRL-12203 sejtvonal jellemzőivel bír, amelyet az ATTC-nél 1996. október 11-én a Budapesti Egyezménynek megfelelően letétbe helyeztünk. Ezenfelül a találmány tárgyát képezik ezen sejtek tenyészetei és a vírusreplikációt támogató immortalizált sejtvonal immortalizált szubklónjai.
A találmány egyik szempontja szerint a találmány szerinti immortalizált sejtek vírust tartalmaznak, egy másik szerint pedig a találmány szerinti immortalizált sejtek legalább egy vektort tartalmaznak, amely képes rekombináns protein expressziójának irányítására a sejtekben. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a találmány szerinti sejtek rekombináns proteint expresszálnak, egy másik szempont szerint pedig a találmány szerinti sejtekben jelen levő vektor egy rekombináns vírusnak legalább egy részét kódolja. Egy másik megvalósítási mód szerint a vektor retrovírus jellegű vektor.
A találmány egy másik szempontja szerint egy eljárást ismertetünk egy immortalizált sejtvonal előállítására csirkeembrió-fibroblasztból, amely a következő lépésekből áll: elsődleges csirkeembrió-fibroblasztot növesztünk tenyészetben; addig oltjuk át („passaging”) a fibroblasztokat a tenyészetben, amíg nem kezdenek elöregedni; a sejtöregedés során koncentráljuk a sejteket, és így mintegy 30-60%-ban összefolyó tenyészetet tartunk fenn; azonosítjuk a nem öregedő sejtgócokat („foci of cells); a nem öregedő sejteket legalább 30 cikluson át átoltva tenyésztjük.
A találmány egy további szempontja szerint egy eljárást ismertetünk sejtekben történő vírustenyésztésre, amely a következő lépésekből áll: elsődleges csirkeembrió-fibroblasztból származó, spontán immortalizált sejtvonalat tenyészetben növesztünk; a sejteket vírussal fertőzzük; a vírusokat replikálódni engedjük a sejtekben; begyűjtjük a sejtekben replikálódott vírusokat.
Jelenleg nem áll rendelkezésre nem vírusos, nem vírusos protein- vagy nem kémiailag transzformált madársejtvonal. Vírusállomány gyártására elsődleges sejtvonalakat folyamatosan előállítani kényelmetlen, és külön kell őket validálni, mint amelyek szennyezőmentes rezervoárként alkalmasak vírustenyésztésre. A találmány szerinti megoldásban csirkeembrió-fibroblasztsejtek (CEF) immortalizációját tárjuk fel, beleértve East Lansing Vonalból (ELL-0) származó csirkeembriókból származó sejtekét is.
Az immortalizáció (halhatatlanná tétel) fogalma alatt itt azt értjük, hogy nem rágcsáló sejteket képessé teszünk tenyészetben arra, hogy több mint 30 átoltáson („passage) keresztül fenntartsák a mintegy 1 naptól mintegy két napig terjedő duplázódás! idejüket a tenyészetben úgy, hogy már legalább mintegy hat hónapja folyamatos tenyészetben voltak. A madársejteket általában mintegy 20-tól mintegy 25 átoltás után tekintik immortalizáltnak tenyészetben. Az immortalizált sejtek abban különböznek a transzformált sejtektől, hogy a transzformált sejtektől eltérően sűrűségfüggő növekedést és/vagy növekedési gátlást mutatnak (például kontaktus révén gátoltak). A transzformált sejtek képesek növekedésre lágyagarban és általában képesek tumorképzésre, ha laboratóriumi állatokba injektáljuk őket. A találmány szerinti sejtek alkalmasak rezervoárként vírustenyésztésre vagy rekombináns proteinek vagy vírusok expressziójára, különösen akkor, ha fontos, hogy a sejtek ne legyenek szennyezettek vírusokkal vagy vírusproteinekkel. A sejtek hasznosak a sejtöregedés és az immortalizáció mögött rejlő mechanizmusok tanulmányozására is.
A 10 napos ELL-0 tojásokból úgy nyertünk elsődleges csirkeembrió-fibroblaszt (CEF) sejteket, hogy vettük a 10 napos embriók embriótorzióját, felaprítottuk a szövetet és a sejteket tenyészetbe helyeztük. Megtermékenyített tojások Hy-Vac-tól (Adél, lowa) szerezhetők be. A tojásokról és rétegeikről a szállító bizonylatot ad, amely szerint az negatív madárinfluenza (A típus), madárreovírus, madáradenovírusok (l-lll csoport), madár enkefalomyelitis vírus, baromfihimlő, Newcastle-betegségvírus, Paramyxovírus (2 típus), mikoplazma, salmonella és más olyan fertőző ágensek tekintetében, amelyekről ismert, hogy megfertőzhetnek egy baromfitenyészetet. Az elsődleges sejtek elkülönítését és az immortalizált sejtek azonosítását az 1. példában írjuk le.
A sejteket azért azonosítottuk, mert az immortalizált sejtvonal felfedezésének idején sejtpopulációkat választottunk ki a sejtöregedés vizsgálatára. Az emberi és a szárnyassejtekről ismert, hogy a legnehezebben
HU 226 658 Β1 immortalizálható sejtek közé tartoznak szövettenyésztés körülményei között. A rágcsálósejtektől eltérően nincs olyan lektorált irodalmi adat, amely normál donorokból származó humán vagy csirkefibroblaszt immortalizációjára alkalmas eljárást írna le [Smith és munkatársai, Science, 273, 63, (1996)], madárfibroblasztok esetében a kezeletlen sejtek csak körülbelül 20-25 átoltást bírnak ki. Ezt azt jelenti, hogy 30 átoltás után ezen szárnyassejtekből készült elsődleges kultúrák már halottak vagy haldokolnak. Amint a leírásban ismertetjük, annak érdekében, hogy 20 átoltást elérjünk, a sejteket a körülbelül 12. és körülbelül 20. ciklus között szükség szerint kisebb lemezekre vittük át és koncentráltuk (lásd az 1. példát). A gyorsabban növekvő sejtek gócait megfigyeltük és klónozógyűrűk segítségével (Bellco Glass, Inc. Vineland NJ) izoláltuk és tenyészetté bővítettük.
Az öregedést itt úgy definiáljuk, mint olyan sejtek tulajdonságát, amelyek populációs duplázódása mintegy 0,5 vagy kevesebb duplázódás naponta. A leírásban használt értelemben több mint 30 ciklusra immortalizált sejtek alatt olyan sejteket értünk, amelyek populációs duplázódás! sebessége (amit a napi teljes sejtszámból és az életképes sejtek számából határozunk meg tripánkék-exklúzió mellett) körülbelül 0,6 és körülbelül 1,2 populációduplázódás naponta, előnyösen körülbelül 0,7-től körülbelül 1,0 duplázódásig naponta, és amelyek emellett mutatják a kontaktgátlást, a sűrűségfüggést és normál sejtmorfológiával rendelkeznek.
Az eredetileg azonosított gócokból kapott sejtek, amint azt az 1. példában leírjuk, legalább 400 populációduplázódáson és legalább 160 cikluson mentek át. Sejtgóc alatt a leírásban olyan morfológiailag egységes sejtcsoportokat értünk, amelyek morfológiailag megkülönböztethetők a körülöttük levő sejtektől. Ezek a sejtgócok könnyen eltávol íthatók és későbbi vizsgálat számára szubklónozhatók. A találmány szerinti sejtek folyamatosan megduplázódtak minden 22-24 órában. A sejtek kontaktgátoltak, reverztranszkriptáz-negatívak voltak (lásd a 2. példát), sűrűségfüggő módon fejlődésükben leálltak, aneuploidok voltak [kromoszóma-kiterítési („chromosome spread”) analízissel, olajbemerítéses mikroszkópiával megfigyelve a kariotípus diploid/tetraploid kariotípusok keveréke volt, néhány sejt pedig az 1 kromoszóma transzlokációját látszott mutatni), és kilemezelési sűrűségig - 1,1-1,9x10® sejt/cm2 értékig - szaporodtak. Nem figyeltünk meg multinukleáris (többmagvú) óriássejteket. A sejtek fenotípusa egységes volt. A sejtek fenntartják a gyors növekedés jellegzetes mintáját, ami fontos a vírustenyésztéshez.
A sejtek nem voltak transzformáltak, amit az mutatott, hogy lágyagar próbákban nem nőttek (lásd a 3. példát). Ezenfelül a sejtek nem okoztak tumort csirkeszárnyba injektálva (4. példa). A találmány szerinti sejtpéldányokat UMNSAH-DF1 sejteknek neveztük el és letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál (ATCC, Amerikai típus-sejttenyészet gyűjtemény), 12203 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, a nyilvántartási szám CRL-12203. A letétbe helyezés 1996. október 11-én történt a Budapesti Egyezmény által meghatározott előírásoknak és körülményeknek megfelelően.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti immortalizált csirkeembriófibroblaszt-sejtek és a találmány szerinti immortalizált sejtek szubklónjai. Példának okáért a találmány szerinti sejteket úgy azonosítjuk, mint spontán módon immortalizált sejteket. A sejteket ismert vírusoktól mentes, ismert vegyi szennyezőktől mentes rétegekből nyerjük (tyúkok termelik az embrionális szöveteket, amelyek forrásként szolgálnak a találmány szerinti megoldásban) és a találmány szerinti sejteket termelő embrionális szövetek is mentesek vegyi szennyezőktől (vagyis nem kezelték őket olyan karcinogén anyagokkal vagy más anyagokkal, amelyekről tudjuk, hogy transzformálják a rágcsálósejteket) és mentesek ismert vírusoktól. Ha egyszer a találmány szerinti immortalizált sejtek tenyészetben vannak, a sejteket tovább szubklónozhatjuk más fiziológiai paraméterek alapján szelektálva, amelyek változhatnak a sejtpopuláción belül, miközben megmarad a kontaktgátlás és a vírusfertőzéssel szembeni érzékenység.
A sejteket ellenőriztük, hogy képesek-e HVT (pulykaherpeszvírus), madárherpeszvírus (III szerotípus), baromfihimlő-vírus és reovírus replikálására. A sejteket meg lehet vizsgálni a tekintetben, hogy képesek-e Circodnavirideae, csirke HSV II szerotípus és számos más vírus replikálására és megvizsgáltuk őket transzfekciós alapanyagként is. A sejtek hasznosnak bizonyultak mind madár-, mind nemmadár-vírusok tenyésztésére. Az 5. példa részletesen leírja HVT, baromfihimlő- és reovírus tenyésztési eljárásait. A sejtek hasznos alapanyagok vírustermelésre és a sejtek különösen hasznosak retrovírus termelésére, mivel a sejtek és rétegeik (vagyis anyáik) nem rendelkeztek detektálható retrovírus-fertőzéssel. A sejtek képesek szárnyas sarcoma leukémia vírus és Rous sarcoma vírus replikációjának támogatására.
Vírustörzsállomány készítéséhez a találmány szerinti sejteket be lehet oltani szövettenyésztő lombikokba, forgóüvegekbe, kevertetett kultúrákba, üregesszálreaktorokba vagy egyéb, sejtek tömegének tenyésztésére alkalmas rendszerekbe. Forgóüveges vírustenyésztéshez a sejteket 2-5χ104 sejt/cm2 sűrűséggel kell beoltani. A vírusállomány növekedésének megindításához szükséges fertőzési multiplicitás (a fertőző vírusrészecskék és a sejtek számának aránya) változik a vírustörzstől függően. A virológiában jártas szakember, különösen ha jártas bizonyos vírusok és vírustörzsek tenyésztésében, maximalizálni tudja a vírustörzsállomány kihozatalát a fertőzés multiplicitásának, a hőmérsékletnek és a közegeknek standard manipulációjával anélkül, hogy szükségtelenül sok kísérletet hajtana végre.
A vírusok begyűjtésének módja a fertőzés után, annak érdekében, hogy megkapjuk a fertőzőképes vírustörzset, szintén függ magától a vírustörzstől. A burokkal rendelkező vírusok lassabban ürülnek ki a tenyészet közegébe, mint a nem csomagolt vírusok. Vírustörzsállományok kinyerhetők pusztán a tenyészet kö4
HU 226 658 Β1 zegéből vagy sejtlizátumokból, amelyek együtt vannak a kondicionált közegekkel. Litikus vírusok esetében (amelyek a víruskiürülés során hatékonyan lizálják a sejteket) elegendő a kondicionált sejttenyészetközeget (vagyis a felhasznált közeget, amely tartalmazza a vírust) begyűjteni egy gyengéd centrifugálási lépés után, amely arra szolgál, hogy eltávolítsuk a sejtüledéket. Ismételjük, hogy szakember számára ismertek a vírusbegyűjtés és -izolálás módszerei a vírustörzsek széles köréből.
Számos, a szakember számára ugyancsak ismert eljárás létezik a vírusszaporodás kvantitatív meghatározására sejttenyészetből. A Herpesvírus-családba tartozó és számos más, citopatológiai gócokat létrehozó vírusállomány titere könynyen meghatározható sejtmonoréteg felületén plakkpróbával [az egység lehet plakkképző egység a sejttenyésztőközeg egy ml-ében (pke/ml) vagy plakk-képző egység kvantitatív vírusmeghatározásra alkalmas vakcina inokulum egységnyi dózisában], vagy szövettenyészet-fertőző dózis 50-ként (TCID50). A gyorsan oldó vírusok jobban meghatározhatók mennyiségileg TCID50-nel, aminek jelentése olyan dózis, vagy a vírusállomány olyan hígítása, amely adott idő alatt képes a tenyészet 50%-ának megfertőzésére. A vírustenyésztés és kvantitatív meghatározás módszerei ismertek a szakember számára, a vírusmeghatározással kapcsolatos kitanítás megtalálható például Fields és munkatársai (szerk.) könyvében: „Fundamental Virology (Bevezetés a virológiába), 1991, Raven Press, New York, vagy Mandell és munkatársai (szerk.) könyvében: „Principles and Practice of Infectious Diseases” (A fertőző betegségek elmélete és gyakorlata), 1985, John Wiley and Sons, New York.
A vírustenyésztés mellett találmány szerinti sejtek használhatók rekombináns vírusok (köztük retrovírusok) előállításánál csomagoló sejtvonalként. A sejtek használhatók rekombináns proteinek (köztük vírusproteinek és hasonlók) előállítására. A szakember számára ismertek rekombináns proteint kódoló nukleinsavak beviteli módszerei nukleinsawektorokba regulátor elemek ellenőrzése alatt, amelyek képesek a proteinexpressziót irányítani az eukarióta sejtekben, mint amilyenek a találmány szerint immortalizált sejtek. Az expressziós vektorok replikálható nukleinsavfragmentumok, amelyek egy rekombináns protein expresszióját irányíthatják. A szakfolyóiratokban és a kereskedelmi ismertetőkben sok expressziós vektor, köztük retrovírusvektor ismertetése megtalálható. Replikálható expressziósvektor-komponensek általában tartalmazzák a következőket, bár nem feltétlenül csak ezeket: egy replikációs origó, egy vagy több markergén, enhanszer elemek, promoter elemek, opcionálisan szignálszekvenciák és átírási (traszkripciós) terminátor szekvenciák. A szelekciós vagy markergének olyan proteineket kódolnak, amelyek arra szolgálnak, hogy segítségükkel azonosítani lehessen transzformált vagy transzfektált (átfertőzött) sejtek egy populációját. A tipikus szelekciós gének olyan proteineket kódolnak, amelyek ellenállást kölcsönöznek antibiotikumokkal vagy más toxinokkal szemben, kivédenek auxotróf hiányosságokat, vagy kritikus tápanyagokat szolgáltatnak, amelyek nincsenek jelen a komplex közegben.
Rekombináns proteineket kódoló nukleinsavat tartalmazó expressziós vektorokat transzfektálunk a sejtekbe és arra használjuk őket, hogy irányítsák a rekombináns protein expresszióját a találmány szerinti, immortalizált sejtekben. A vektor előnyösen kódolhat bármilyen olyan proteint, amely rendelkezik az expresszió képességével csirkeembriófibroblaszt-sejtekben, beleértve (de nem kizárólagos jelleggel) vírusproteint, beleértve reverz transzkriptázt és/vagy vírusszerkezeti proteint. Egy sejtben rekombináns protein gyártására szolgáló vektorokra példaként említhetünk többek között tumorszuppresszív proteint termelő retrovírusvektorokat, vagy olyan vírusszerkezeti proteineket, amilyeneket Givol és munkatársai [Oncogene 11, 2609, (1995)], Givol és munkatársai [Cell Growth and Differentiation, 5, 419 (1994)], Akiyama és munkatársai [Virology, 203, 211 (1994)] és Boyer és munkatársai [Oncogene, 20, 457(1993)] leírnak.
A találmány szerinti sejtek alapanyagként szolgálhatnak rekombináns vírus expressziójára, beleértve (de nem kizárólagos jelleggel) rekombináns retrovírust is. A találmány szerinti sejtek képesek arra, hogy csomagoló sejtvonalakként génterápiában hasznosíthatók legyenek genetikailag módosított vírusok számára és más hasonlók számára. Egy adott sejtvonal csomagoló sejtvonalként való felhasználására szolgáló módszerek és konstrukciók ismertek a szakember számára. Boerkoel és munkatársai [Virology, 195, 668 (1993)] például módszereket írnak le vírusok csomagolására csirkeembrió-fibroblasztok mint csomagoló sejtvonal felhasználásával. Ugyanezen módszerek használhatók vírusok csomagolására a találmány szerinti immortalizált sejtekben.
Mivel a legtöbb madársejtvonal és minden transzformált madársejt, valamint szinte minden transzformáit egérsejtvonal tartalmaz vírusszennyeződést, például endogén vírust vagy vírusfehérjét, nem megfelelőek humán vagy állati vakcinák termelésére. A sejtek nem használhatók rekombináns protein termelésére, mert az endogén szennyeződések a tisztított rekombináns proteinkészítményeket is szennyezhetik. A találmány szerinti sejtek előnyösen megfelelő alternatívát kínálnak ezen problémákra.
A találmány szerinti sejtek ugyancsak alapanyagként szolgálhatnak más sejtekből történő vírusszaporításra. Ezek között az egyéb sejtek között lehetnek elsődleges sejtek, vagy tenyésztett sejtek, amelyek sejttenyészetben nagyobb növekedést vagy élettartamot mutatnak más sejtek jelenlétében vagy sejten kívüli mátrixproteinek jelenlétében, mint amilyenek a kollagének, lamininek és hasonlók. A találmány egy megvalósítási módja szerint sejteket keverünk vírussal, majd a találmány szerint sejtekkel, előnyösen a sejtek és a találmány szerinti sejtek aránya mintegy 1:5 és mintegy 1:20 között van, még előnyösebben mintegy 1:10 arányban (1 sejt jut mintegy 10 találmány szerinti sejtre). A kevert sejteket ezután tenyészetbe helyez5
HU 226 658 Β1 zük. Egy másik megvalósítási mód szerint a sejteket vírussal keverjük össze és rárétegezzük a találmány szerinti immortalizált sejtek felületére, amelyek már hozzá vannak kötve egy sejttenyésztő felülethez. A találmány szerinti sejtek hordozóként szolgálhatnak az egyéb sejtek számára, és - anélkül, hogy beszűkítenénk a találmány oltalmi körét - növekedési faktorokat és egyebeket, valamint sejten kívüli mátrix komponenseket és másokat szolgáltathatnak, és így - miközben azok vírust termelnek - hozzájárulhatnak fenntartásukhoz. A 6. példa annak példáját mutatja be, hogy hogyan lehet a találmány szerinti sejteket sejtalapanyagként alkalmazni.
A továbbiakban részletesen ismertetjük a találmány különböző megvalósítási módjait és hivatkozunk különféle variációkra a találmány oltalmi körén belül. Számos alternatív módszer és eljárás ismert a szakember számára, amely ugyancsak lehetővé teszi, hogy sikeresen megvalósítsuk a találmány szerinti megoldást.
1. példa
Spontán csirkefibroblaszt-sejtvonal létrehozása
Két tucat ELL-0 tojást rendeltünk az East Lansing USDA baromfitörzsből (stock). A tojásokat sterilizált, izolált inkubátorban inkubáltuk 10 napig és elsődleges kultúrák céljából feldolgoztuk. Az embrionális szövetet tripszin/EDTA-oldat felhasználásával disszociáltuk és DMEM-közegben (Gibco) kilemezeltük, amely 10% magzati borjúszérumot tartalmazott (Gibco). 1% antibotikum/animikotikumot (Gibco) tartalmazó és 2 mM L-glutamin (Gibco). A disszociált sejtszuszpenziót 50 ml-es centrifugacsőbe gyűjtöttük össze, amely 10% magzati borjúszérumot tartalmazott a tripszin inaktiválására és 700 g-nél 10 percig centrifugáltuk.
A sejteket 10 Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegben reszuszpendáltuk, amelyet 36 pg/ml inzulinnal (Sigma), 1,6 pg/ml transzferrinnel (Sigma, St. Louis, MO), 2 mM L-glutaminnal, 10% magzati borjúszérummal, 1% antibiotikum/antimikotikum oldattal dúsítottunk, és egy 25 cm2-es Corning szövettenyésztő lombikba pipettáztuk és 40,5 °C-on, 5% CO2 és 95% levegő jelenlétében inkubáltuk. 24 óra inkubálás után a közeget megváltoztattuk. Az elsődleges kultúra számos explantátumot tartalmazott, amelyben epitéliumszerű sejtek és sugárszerűen növekedő („radiating”) fibroblasztcentrumok voltak jelen.
A kultúrákat összefolyásig („confluency”) engedtük szaporodni (5 nap) és egy tripszin/EDTA-oldat [0,05% tripszin és 0,02% etilén-diamin tetraecetsav (EDTA) PBS-ben] felhasználásával távolítottuk el a lemezről, majd egy második átoltáshoz újra kilemezeltük. A második átoltásnál bizonyos sejteket megfagyasztottunk egy kondicionált közegben, amely 50% DMEM-közeget, 12% DMSO-t és 38% magzati borjúszérumot tartalmazott. Ezeket a sejteket a gőzfázisú cseppfolyós nitrogénben fagyasztottuk meg 24 óráig, majd átvittük a cseppfolyós nitrogénbe hosszú távú tárolásra.
A sejteket a második átoltási ciklusban („passage”, P2) 2,7*104 sejt/cm2 sűrűséggel rétegeztük újra. A sejteket hónapokon keresztül továbbtenyésztésnek vetettük alá („subcultured”). A tenyésztett fibroblasztok 8-9 átoltási cikluson át gyorsan növekedtek, majd jelentős mértékű sejthalál mellett lelassultak. A krízisek alatt a sejteket ATV-oldat felhasználásával [8 g/l NaCI, 0,4 g KCI, 1 g dextróz, 0,58 g NaHCO3, 0,5 g tripszin (Difco 1:250), 0,2 g verzén (dinátriumsó) 1000 ml-ben] oltottuk át (passed). A sejteket Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegben növesztettük, amelyet 36 pg/ml inzulinnal (Sigma), 1,6 pg/ml transzferrinnel (Sigma), 2 mM L-glutaminnal, 10% magzati borjúszérummal és 1% antibiotikum/antimikotikum oldattal dúsítottunk. Feljegyeztük, hogy a sejtek többsége a 11. átoltásnál (P11) már halott volt, vagy haldoklott; a sejtek egy kis alpopulációja azonban egészséges fibroblasztnak tűnt. A P11-sejtek ott maradtak a lemezen négy hétig, miközben minden harmadik nap friss tápközeggel újratápláltuk őket. Bizonyos sejteket megfagyasztottunk és a megmaradt sejteket egy kisebb területre koncentráltuk, ahol még további két hétig hagytuk növekedni őket, mielőtt elegendően egybefolytak ahhoz, hogy második továbbtenyésztésre sor kerülhessen. P15-re a sejtek homogénebbnek tűntek a sejtmorfológiát illetően és naponta 0,32 populációduplázódási sebességgel nőttek. P20-ra a populációduplázódás mintegy 0,7-től mintegy 0,8 populációduplázódásig nőtt naponta. Ekkor úgy tűnt, hogy a sejtek igen egyforma morfológiával rendelkeznek. A sejteket UMNSAH/DF#1-gyel jelöltük és akkorra már több mint tizenkilenc hónapja folyamatosan tenyészetben voltak. A sejtek jelenleg már a 160. átoltásnál (passage) tartanak. A sejteket P5-től megfagyasztottuk (lásd fent) és kiolvasztottuk. A szubklónozott sejteket kiterjesztettük („expanded”) és a módszer reprodukálhatóságát megerősítettük más kiónok azonosítása (identifikációja) útján. Számos más szubklónt nyertünk P11-átoltásra.
2. példa
Sejtek vizsgálata vírusszennyezőkre
A találmány szerinti sejteket megvizsgáltuk vírusszennyezőkre PCR felhasználásával a szennyező nukleinsavfragmensek azonosítására. Számos, kereskedelmileg elérhető vizsgálati reagenskészlet létezik számos vírushoz, amelyeket felhasználhatunk annak meghatározására, hogy a találmány szerinti sejtek tartalmaznak-e szennyező vírust. Hasonlóan vannak kereskedelmileg elérhető vizsgálati módszerek vírusantigén detektálására (például kereskedelmileg elérhető ELISA-próba és más hasonlók), ahol az antigén számos különböző vírusból származik. Ezeket a módszereket alkalmazhatjuk a találmány szerinti sejtekre rutin kísérleti módszerek alkalmazásával, hogy demonstráljuk a tenyészetek mentességét szennyező vírusoktól.
Egy tesztsorozatban a sejteket megvizsgáltuk reverztranszkriptáz-aktivitásra. Gyorsan növekvő tenyészetekből 1*106 sejtet izoláltunk 4 ml közegben. A közeget számos fagyasztási-felolvasztási cikluson vittük át -80 °C-on, hogy feloldjuk a sejteket. A feloldott sejteket tartalmazó közeget 10%-os gliceringradiens fölé rétegeztük. A gradienst 60 percig 40 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk egy SW40-rotor felhaszná6
HU 226 658 Β1 lásával (Beckman Instruments, Palo Alto, CA). A vírusrészecskéket, amennyiben jelen voltak, leülepítettük. A közeget eldobtuk és az üledéket újraszuszpendáltuk 20 μΙ Nonidet Ρ-40-ben (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO).
Egy Eppendorf-csövet 41 °C-ra melegítettünk. 5 μΙ mintát adtunk 45 μΙ reverz-transzkriptáz keverékhez, amely tartalmazott 45 mM Trist, pH=7,8, 2 mM 2-bétamerkapto-etanolt, 2 mM mangán-acetátot, 0,1% Triton Χ-100-at, 10 mikromol dATP-t, dCTP-t és dGTP-t (Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN), 2,4 pg polyA-t (Sigma), 60 ng primer dT 12-19-et (Pharmacia), 0,4 pcurie/reakció 3H thymidin-trifoszfátot (15,OOO-től 28,000-ig terjedő cpm/pmol aktivitás, Amersham).
A reakciót egy óráig 41 °C-on inkubáltuk. Egy negatív kontroll 5 μΙ ddH2-t és 45 μΙ fenti keveréket tartalmazott. Két ismert pozitív kontrollt tartalmazott a próba. A próbát 1 ml 10%-os triklór-ecetsav (TCA, Columbus Chemical Industries, Inc., Columbus, Wl) hozzáadásával állítottuk le. A keveréket egy Whatman GF/C üveg 0,45 mikronos előszűrőn szűrtük át. 5%-os TCA felhasználásával többször mostuk. A szűrőt átvittük egy Beckman Instruments szcintillációs számlálóba, amelyek szcintillációs fiolái 5 ml szcintillációs folyadékot tartalmaznak. A mintákat egy 050-től 600-ig terjedő ablakbeállítás mellett számláltuk. Pozitívnak tekintettük a próbát, ha a keverékháttérhez képest (negatív kontroll) háromszoros növekedést tapasztaltunk.
Az elsődleges kultúrák negatívnak bizonyultak reverztranszkriptáz-aktivitás szempontjából éppúgy, mint a találmány szerinti immortalizált sejtek. A reverztranszkriptáz-próbára vonatkozó további információ megtalálható: Crittenden és munkatársai [Virology, 57, 128, (1974)].
3. példa
Lágyagaróz-telepképzési próba sejtek tumorogén (daganatkiváltó) potenciáljának becslésére
A tumorogén hatás vizsgálatára a sejteket megvizsgáltuk lágyagarban való növekedés szempontjából. Készítettünk egy lágyagaralapot oly módon, hogy összekevertünk 12 m 2%-os agarózoldatot (amelyet előzőleg autoklávoztunk és 56 °C-ra hűtöttünk) 21,6 ml dúsított McCoy 5A-közegben [Gibco, 120 ml borjúembrió-szérum (hőinaktivált), 5 ml Na-piruvát (2,2%-os készlet), 1 ml L-szerin (21 mg/ml készlet), 5 ml L-glutamin (200 mM készlet), 12,5 ml Hepes (1 M készlet)], 5,9 ml aszparagint (4,4 mg/ml szűréssel sterilizált készlet). Hét ml-t ebből a meleg tápközeg/agaroldatból egy 100 mm2-es szövetkultúratálra öntöttünk és szobahőmérsékleten hagytuk megszilárdulni egy szövettenyésztő fülkében 1 órán keresztül.
A sejteket az aktívan növekvő tenyészetekből (mintegy 40%-tól mintegy 70%-os összeolvadási szint) tripszinezéssel távolítottunk el, hogy egysejtes szuszpenzióhoz jussunk friss DMEM-tápközegben, amely 10% magzati borjúszérumot tartalmazott (L-glutaminnal és antibiotikumokkal-antimikotikummal). Megközelítőleg 1*106 sejtet adtunk 4,25 ml DMEM-közeghez, amely 10% magzati borjúszérumot, valamint 0,75 ml 1 %-os agarózt és 50 μΙ 2-béta-merkapto-etanolt tartalmazott. Oda kellett figyelni arra, hogy a meleg közeg és agaróz 42 °C-on legyen a sejtek hozzáadása előtt. A fenti sejtszuszpenzióból 5 ml-t gyorsan rárétegeztünk az agarózlemezekre.
A sejteket 37 °C-on 5% CO2-ban és 95% levegőben inkubátorban tenyésztettük és 35 napig megfigyeltük. Duplikátumlemezeket 3-nitro-fenil-5-fenil tetrazolium-klorittal (INT-festék) megfestettünk és 0,5, 10, 15, 20, 30 és 35 nap után megfigyeltük kolóniaképződés és növekedés szempontjából. Minden 60 μΐτι-nél nagyobb megfestett kolóniát pozitívnak tekintettünk.
Minden sejt vizsgálata negatívnak adódott. A lágyagar-próbáról további információ található Hamburger és munkatársainál [Prog. Clin. Bioi. Rés., 48, 43, 135 és 139. oldal, (1980)].
4. példa
Immortalizált sejtek tumorogenitása
A Minnesota! Egyetem Állatfelhasználási Protokolljában (950300-1 számú protokoll, 1995. március 1996. december) körvonalazott ajánlások szerint sejteket injektáltunk vizsgálati állatokba, hogy meghatározzuk: a sejtek tumorogének vagy sem.
Aktívan növekvő sejteket távolítottunk el a sejttenyészetlemezekről és hat SPAFAS-vonalba tartozó felnőtt csirkébe (Hy-VAC, Adél, lowa). Szubkután injekcióval 4*106 sejtet juttattunk a csirkék számyredőjébe („wing web”). Az injekciós helyeket 3,5 hónapig hetente vizsgáltuk. Semmilyen tumort nem észleltünk az injekciós helyeken egyik máig előállított transzfektált sejt esetében sem, mindegyik állat egészséges maradt. A kísérlet azt bizonyította, hogy az immortalizált sejtek nem tumorogének.
5. példa
A sejtek vírusnövekedést segítő képessége
A sejteket 5,0* 105 sejt/cm2 sűrűségben forgóüvegekbe oltottuk. 24 óráig kötni engedtük a sejteket és egy kontrollmintát gyűjtöttünk be sejtszámlálás céljából. A sejteket vírusfertőzés céljából DMEM-közegben tenyésztettük (4,5 g/l glükóz), 4% magzati borjúszérum, 2 mM L-glutamin, 50 mg/l gentamicin. A sejteket 0,0006 HVT vírusrészecske/sejt infekciós multiplicitással megfertőztük. A forgóüvegeket naponta figyeltük CPE-progresszió szempontjából. A palackokból 46 órával a fertőzés után mintát vettünk, amikor mintegy 50% CPE volt. HVT-fertőzött sejteket fagyasztottunk meg növekedési közegben 10% DMSO-val 2,0*107 sejt/ml koncentrációnál. A HVT-titereket plakkpróbával állapítottuk meg kvantitatíve. Hígítási sort készítettünk vírusból növekedési közegben és áteresztő („permissive”) sejtek egybefolyó (konfluens) monorétegeire helyeztük őket. A kultúrákat megadott ideig inkubáltuk, majd a sejteket fixáltuk és festettük. A monorétegeken levő plakkokat megszámláltuk és a vírustitert a dózisra jutó plakk-képző egységben fejeztük ki.
Ezeket a sejteket megvizsgáltuk abból a szempontból is, hogy mennyire képesek támogatni reovíruster7
HU 226 658 Β1 melést. 2,5*10® sejtet fertőztünk reovírus WSS-Reo 1733 törzsével, amelynek titere 8,2 TCID50/ml volt. Sejteket fertőztünk meg 0,005, 0,001 vagy 0,0005 fertőző vírusrészecske/sejt multiplicitással. Fertőzött sejteket növesztettünk forgóüvegekben, és a fertőzés után 48, 64, illetve 72 órával vizsgáltuk őket a produktív vírusnövekedés demonstrálása céljából.
6. példa
Transzfektált bőrsejtek használata sejtalapanyagként
A találmány szerinti sejtek elsődleges sejtek vírusreplikációjának támogatásában szubsztrátként használhatóak. Ezekben a kísérletekben az immortalizált sejteket elsődleges sejtekkel keverjük. Egy vizsgálatban az elsődleges sejteket megfertőzzük és összekeverjük az immortalizált sejtekkel és tenyészetbe helyezzük őket; egy másik vizsgálatban az elsődleges sejteket megfertőzzük és ráhelyezzük őket az immortalizált sejtekre úgy, hogy az immortalizált sejteket előzőleg már elhelyeztük pázsitként a szövettenyésztő üvegbe. Az egyik példában a tojáscseppszindróma-vírus („Egg Drop Syndrome Vírus”), és az elsődleges sejtek elsődleges csirkeembriómáj-sejtek. Egy második példában az elsődleges sejtek endotélsejtek, előnyösen veseendotélsejtek és a vírus fertőző bronchitisvírus. Az elsődleges sejtek és az immortalizált sejtek előnyös aránya mintegy 1:5-től mintegy 1:20-ig terjed, még előnyösebben mintegy 1:10. A kevert sejtpopulációban növekvő elsődleges sejtek vírustiterei nagyobbak, mint a tenyészetben egyedül növekvő elsődleges sejtek vírustiterei. Az immortalizált sejtek lehetővé teszik, hogy elsődleges sejteket használjunk vírustenyésztésre kereskedelmi viszonyok között.
Minden hivatkozott publikáció teljes terjedelmében része a kitanításnak. Bár a találmány szerinti megoldást itt adott megvalósítási módoknak megfelelő példák útján ismertettük, a szabadalmi bejelentés oltalmi körét szándékunk szerint csak az alábbi szabadalmi igénypontok korlátozzák.
Claims (26)
1. Spontán módon immortalizált sejtvonal, amely elsődleges csirkeembrió-fibroblasztból származik, és amely az ATCC-CRL-12203 nyilvántartási számon letétbe helyezett UMNSAH-DF1 sejtvonal.
2. Az 1. igénypont szerinti, immortalizált sejtvonal tenyészetei vagy immortalizált szubklónjai.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti sejtek, amelyek vírust tartalmaznak.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti sejtek, amelyek legalább egy, rekombináns protein expresszióját a sejtekben irányítani képes vektort tartalmaznak.
5. A 4. igénypont szerinti sejtek, amelyek rekombináns proteint expresszálnak.
6. A 4. vagy 5. igénypont bármelyike szerinti sejtek, amelyekben a vektor egy rekombináns vírus legalább egy részét kódolja.
7. Eljárás egy immortalizált sejtvonal előállítására karcinogénnel történő kezelés nélkül csirkeembrió-fibroblasztból, amely az alábbi lépéseket tartalmazza:
(a) tenyészetben elsődleges csirkeembrió-fibroblasztokat növesztünk, (b) addig oltjuk át a fibroblasztokat tenyészetben, amíg a sejtek nem kezdenek öregedni, (c) a sejtöregedés alatt annyira koncentráljuk a sejteket, hogy fennmaradjon mintegy 30%-tól mintegy 60%-ig terjedő mértékű összefolyás, (d) azonosítjuk a nem öregedő sejtek gócait a kultúrában, (e) izoláljuk a nem öregedő sejteket és (f) a nem öregedő sejteket több mint 30 átoltáson át tenyésztjük.
8. Immortalizált sejtvonal, amely a 7. igénypont szerinti eljárással előállított.
9. Az 1. vagy 8. igénypont szerinti, spontán immortalizált sejtvonal, amely sejtvonal tenyészetben mintegy 0,7-től mintegy 1,2 populációduplázódás/nap sebességgel képes növekedni.
10. Az 1. vagy 8. igénypont szerinti, spontán immortalizált sejtvonal, amelynek sejtjei képtelenek lágyagaron növekedni.
11. Az 1. vagy 8. igénypont szerinti, spontán immortalizált sejtvonal, amelynek sejtjei csirkék szárnyába injektálva nem eredményeznek tumort.
12. Az 1. igénypont szerinti, spontán immortalizált sejtvonal, amelynek sejtjei kontaktgátlást, sűrűségfüggést és normális sejtmorfológiát mutatnak.
13. Eljárás vírus szaporítására sejtben, azzal jellemezve, hogy (a) az 1., 3. vagy 8. igénypont szerinti sejteket vagy a 2. igénypont szerinti tenyészeteket vagy immortalizált szubklónokat tenyészetben szaporítunk, (b) a sejteket vírussal fertőzzük, (c) lehetővé tesszük a vírus replikációját a sejtekben, és (d) a sejtekben replikálódott vírusokat begyűjtjük.
14. Eljárás vírus szaporítására sejtből, azzal jellemezve, hogy (a) sejteket vírussal inkubálunk;
(b) a sejteket az 1. vagy 8. igénypont szerinti, immortalizált csirkesejtekkel kombináljuk, és (c) a sejtek és az immortalizált csirkesejtek kombinációjából előállított vírust izoláljuk.
15. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vírusként baromfihimlő-vírust vagy reovírust alkalmazunk.
16. Eljárás rekombináns vírus előállítására immortalizált sejtekből, azzal jellemezve, hogy (a) rekombináns vírus legalább egy részét kódoló, legalább egy nukleinsavfragmenst bejuttatunk az 1. vagy 8. igénypont szerinti immortalizált sejtbe, és (b) izoláljuk a rekombináns vírust az immortalizált sejtekből.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nukleinsavfragmensként vektort tartalmazó nukleinsavfragmenst alkalmazunk.
HU 226 658 Β1
18. A 14., 16. vagy 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vírusként retrovírust vagy herpeszvírust alkalmazunk.
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vírusként Marek-betegség vírusát alkalmazzuk.
20. Eljárás vírus mennyiségének kvantitatív meghatározására mintában, azzal jellemezve, hogy (a) vírusból legalább egy sorozathígítást készítünk;
(b) a vírus legalább egy hígításából származó vírusmintát az 1. vagy 8. igénypont szerinti, immortalizált csirkesejtekkel érintkeztetjük, és (c) a vírushígításban jelen lévő vírus mennyiségét kvantitatíven meghatározzuk.
21. Eljárás vírus mennyiségének kvantitatív meghatározására mintában, azzal jellemezve, hogy (a) vírusból sorozathígításokat készítünk;
(b) a vírus hígításából származó vírusmintát az 1. vagy 8. igénypont szerinti, immortalizált csirkesejtekkel érintkeztetjük, és (c) a vírushígításban jelen lévő vírus mennyiségét kvantitatíven meghatározzuk.
22. Eljárás fehérje előállítására immortalizált sejtben, azzal jellemezve, hogy (a) legalább egy fehérjét kódoló nukleinsavat az 1. vagy 8. igénypont szerinti immortalizált sejtekbe juttatunk be, és (b) a sejtekből fehérjét izolálunk.
23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább egy fehérjét kódoló nukleinsavként génvektort alkalmazunk.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a génvektor retrovirális vektor.
25. Eljárás sejtek szaporítására vírusszaporítás támogatására szolgáló szubsztrátként, azzal jellemezve, hogy (a) sejteket az 1. vagy 8. igénypont szerinti, immortalizált csirkesejtek tenyészetébe helyezünk, és (b) a sejteket sejttenyészetben fenntartjuk.
26. Rekombináns vírust vagy legalább egy fehérjét kódoló nukleinsavfragmenst tartalmazó sejt, amely az 1. vagy 8. igénypont szerinti, immortalizált csirkesejt.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/696,200 US5672485A (en) | 1996-08-13 | 1996-08-13 | Immortalized cell lines for virus growth |
| PCT/US1997/014384 WO1998006824A1 (en) | 1996-08-13 | 1997-08-13 | Immortalized cell lines for virus growth |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0000188A2 HUP0000188A2 (hu) | 2000-06-28 |
| HUP0000188A3 HUP0000188A3 (en) | 2005-11-28 |
| HU226658B1 true HU226658B1 (en) | 2009-06-29 |
Family
ID=24796108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0000188A HU226658B1 (en) | 1996-08-13 | 1997-08-13 | Immortalized cell lines for virus growth |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5672485A (hu) |
| EP (1) | EP0920491B1 (hu) |
| JP (3) | JP3754088B2 (hu) |
| KR (1) | KR100375871B1 (hu) |
| CN (1) | CN1228119B (hu) |
| AR (1) | AR008294A1 (hu) |
| AT (1) | ATE362524T1 (hu) |
| AU (1) | AU726820B2 (hu) |
| BR (1) | BR9711067A (hu) |
| CA (1) | CA2263725C (hu) |
| CO (1) | CO4700552A1 (hu) |
| DE (1) | DE69737735T2 (hu) |
| DK (1) | DK0920491T3 (hu) |
| DZ (1) | DZ2291A1 (hu) |
| ES (1) | ES2285738T3 (hu) |
| GT (1) | GT199700091A (hu) |
| HK (1) | HK1022496A1 (hu) |
| HN (1) | HN1997000124A (hu) |
| HU (1) | HU226658B1 (hu) |
| IL (4) | IL128511A (hu) |
| MA (1) | MA24303A1 (hu) |
| MY (1) | MY125594A (hu) |
| NZ (1) | NZ334147A (hu) |
| PE (1) | PE108198A1 (hu) |
| PT (1) | PT920491E (hu) |
| SV (1) | SV1997000071A (hu) |
| UY (1) | UY24668A1 (hu) |
| WO (1) | WO1998006824A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA977216B (hu) |
Families Citing this family (60)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5672485A (en) * | 1996-08-13 | 1997-09-30 | Regents Of The University Of Minnesota | Immortalized cell lines for virus growth |
| US6150505A (en) * | 1997-09-19 | 2000-11-21 | Hadasit Medical Research Services & Development Ltd. | Fibrin microbeads prepared from fibrinogen, thrombin and factor XIII |
| US6821741B1 (en) | 2001-04-27 | 2004-11-23 | University Hospitals Of Cleveland | Cells for detection of enteroviruses |
| US6552172B2 (en) * | 2001-08-30 | 2003-04-22 | Habto Biotech, Inc. | Fibrin nanoparticles and uses thereof |
| US20040023358A1 (en) * | 2001-12-21 | 2004-02-05 | Wyeth | Avian embryo particulate biomass for the production of virus antigens |
| FR2836924B1 (fr) | 2002-03-08 | 2005-01-14 | Vivalis | Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet |
| US20090217404A1 (en) * | 2002-09-27 | 2009-08-27 | Lowe Scott W | Cell-based RNA interference and related methods and compositions |
| US7410557B2 (en) * | 2002-09-30 | 2008-08-12 | Honda Motor Co., Ltd. | Hydrogen activating apparatus |
| WO2004056977A1 (en) * | 2002-12-13 | 2004-07-08 | Aventis Pasteur, Inc. | Production of alvac on avian embryonic stem cells |
| US20090186839A1 (en) * | 2003-02-17 | 2009-07-23 | Cold Spring Harbor Laboratory | Model for studying the role of genes in chemoresistance |
| WO2004074445A2 (en) * | 2003-02-17 | 2004-09-02 | Cold Spring Harbor Laboratory | Model for studying the role of genes in tumor resistance to chemotherapy |
| US20050198700A1 (en) * | 2003-03-07 | 2005-09-08 | Avigenics, Inc. | Genomic modification |
| US20040255345A1 (en) * | 2003-03-07 | 2004-12-16 | Rapp Jeffrey C. | Production of transgenic avians |
| US20050034186A1 (en) * | 2003-03-07 | 2005-02-10 | Harvey Alex J. | Site specific nucleic acid integration |
| EP1608219A4 (en) * | 2003-03-07 | 2007-03-14 | Avigenics Inc | AVIAN TRANSGENESIS MEDIATED BY INTEGRASE |
| US20050273873A1 (en) * | 2003-03-07 | 2005-12-08 | Avigenics, Inc. | Genomic modification |
| US7432101B2 (en) | 2003-07-22 | 2008-10-07 | Vivalis | Production of poxviruses with adherent or non adherent avian cell lines |
| US20070275010A1 (en) * | 2003-09-18 | 2007-11-29 | Mark Feinberg | Mva Vaccines |
| EP1528101A1 (en) | 2003-11-03 | 2005-05-04 | ProBioGen AG | Immortalized avian cell lines for virus production |
| US20060123504A1 (en) * | 2004-12-07 | 2006-06-08 | Avigenics, Inc. | Methods of producing polyclonal antibodies |
| US20060174364A1 (en) * | 2004-03-01 | 2006-08-03 | Avigenics, Inc. | Artificial chromosomes and transchromosomic avians |
| WO2006042214A1 (en) * | 2004-10-08 | 2006-04-20 | Avigenics, Inc. | Modified integrase and methods of use |
| US8137907B2 (en) * | 2005-01-03 | 2012-03-20 | Cold Spring Harbor Laboratory | Orthotopic and genetically tractable non-human animal model for liver cancer and the uses thereof |
| FR2884255B1 (fr) | 2005-04-11 | 2010-11-05 | Vivalis | Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe |
| US20070044164A1 (en) * | 2005-05-31 | 2007-02-22 | Cold Spring Harbor Laboratory | Methods for producing microRNAs |
| TR201909425T4 (tr) * | 2005-10-05 | 2019-07-22 | Alexion Pharma Inc | Yüksek ti̇treli̇ vi̇rüsün hizli üreti̇mi̇ |
| CA2656259C (en) | 2006-06-20 | 2013-03-19 | Transgene S.A. | Process for producing poxviruses and poxvirus compositions |
| CN100443588C (zh) * | 2006-12-11 | 2008-12-17 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 静宁鸡胚成纤维细胞系及其培养方法 |
| US8213704B2 (en) * | 2007-05-09 | 2012-07-03 | Kla-Tencor Corp. | Methods and systems for detecting defects in a reticle design pattern |
| EP2014279A1 (en) * | 2007-06-22 | 2009-01-14 | Pevion Biotech AG | Virosomes comprising hemagglutinin derived from an influenza virus produced in a cell line, compositions, methods of manufacturing, use thereof |
| JP5421250B2 (ja) | 2007-07-03 | 2014-02-19 | トランスジーン ソシエテ アノニム | トリ不死化細胞株 |
| US8357531B2 (en) * | 2007-07-03 | 2013-01-22 | Transgene S.A. | Immortalized avian cell lines |
| WO2009055724A2 (en) * | 2007-10-26 | 2009-04-30 | Cold Spring Harbor Laboratory | High throughput methods for functionally determining rna interference efficiency |
| CA2715719C (en) * | 2008-02-25 | 2019-08-06 | Baxter International Inc. | Method for producing continuous cell lines |
| JP2012526532A (ja) | 2009-05-12 | 2012-11-01 | トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム | 不死化鳥類細胞系およびその用途 |
| WO2010144797A2 (en) | 2009-06-12 | 2010-12-16 | Vaccine Technologies, Incorporated | Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof |
| DK2596099T3 (da) | 2010-07-20 | 2020-02-24 | Bavarian Nordic As | Fremgangsmåde til høst af ekspressionsprodukter |
| FR3008992A1 (fr) | 2013-07-25 | 2015-01-30 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede de selection d'une lignee cellulaire permissive pour la replication de virus aviaires |
| EP3226894B1 (en) | 2014-12-01 | 2019-08-07 | Transgene SA | Stable liquid vaccinia virus formulations |
| PL3227433T3 (pl) * | 2014-12-04 | 2019-01-31 | Intervet International B.V. | Unieśmiertelnione fibroblasty zarodków kurzych |
| KR101768581B1 (ko) * | 2015-08-13 | 2017-08-17 | 전북대학교 산학협력단 | 자발적 불멸화된 체세포의 단일 세포로부터 리프로그래밍 세포주의 제조방법 |
| US20190144831A1 (en) * | 2015-12-11 | 2019-05-16 | Intervet Inc. | Immortalised chicken embryonic epithelial kidney cells |
| WO2017191147A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Transgene Sa | Combination therapy with cpg tlr9 ligand |
| EP3522920A2 (en) | 2016-10-10 | 2019-08-14 | Transgene SA | Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy |
| US20200179507A1 (en) | 2016-11-17 | 2020-06-11 | Regents Of The University Of Minnesota | Immortalized cell lines and methods of use |
| AU2018269319A1 (en) | 2017-05-15 | 2019-11-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
| CA3062549A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
| AU2018287159A1 (en) | 2017-06-21 | 2020-01-16 | Transgene | Personalized vaccine |
| CN107858323B (zh) * | 2017-11-08 | 2020-10-09 | 广东省生物资源应用研究所 | 一种红耳龟胚胎成纤维细胞系及其构建方法 |
| CN109234239B (zh) * | 2018-07-13 | 2021-09-14 | 广东永顺生物制药股份有限公司 | 一种鸭瘟病毒的培养方法 |
| US20210187100A1 (en) | 2018-09-06 | 2021-06-24 | Bavarian Nordic A/S | Storage Improved Poxvirus Compositions |
| US20230031097A1 (en) | 2019-12-20 | 2023-02-02 | Intervet Inc. | Multivalent hvt vector vaccine |
| CN115243717A (zh) | 2020-03-12 | 2022-10-25 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 改善痘病毒稳定性的组合物 |
| AU2021309007A1 (en) | 2020-07-13 | 2023-02-16 | Transgene | Treatment of immune depression |
| CA3190070A1 (en) | 2020-09-07 | 2022-03-10 | Martijn Alexander LANGEREIS | Ha stem vaccine for ha antibody-positive targets |
| CN116648259A (zh) | 2020-12-24 | 2023-08-25 | 英特维特国际股份有限公司 | 多价hvt载体疫苗 |
| EP4370150A1 (en) | 2021-07-13 | 2024-05-22 | Intervet International B.V. | Overcoming antibody-interference in avians |
| WO2023213763A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab |
| WO2023213764A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf |
| WO2023213946A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Intervet International B.V. | New multivalent hvt vector vaccine |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3058438B2 (ja) * | 1990-10-19 | 2000-07-04 | 財団法人化学及血清療法研究所 | ヒト肝臓組織特異的ウイルスの感染可能な霊長類の不死化肝細胞およびその調製方法 |
| US5672485A (en) * | 1996-08-13 | 1997-09-30 | Regents Of The University Of Minnesota | Immortalized cell lines for virus growth |
-
1996
- 1996-08-13 US US08/696,200 patent/US5672485A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-08-12 GT GT199700091A patent/GT199700091A/es unknown
- 1997-08-12 MY MYPI97003686A patent/MY125594A/en unknown
- 1997-08-12 MA MA24765A patent/MA24303A1/fr unknown
- 1997-08-12 ZA ZA9707216A patent/ZA977216B/xx unknown
- 1997-08-13 PE PE1997000704A patent/PE108198A1/es not_active Application Discontinuation
- 1997-08-13 WO PCT/US1997/014384 patent/WO1998006824A1/en active IP Right Grant
- 1997-08-13 DK DK97938334T patent/DK0920491T3/da active
- 1997-08-13 ES ES97938334T patent/ES2285738T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-13 IL IL12851197A patent/IL128511A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 IL IL15830297A patent/IL158302A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 EP EP97938334A patent/EP0920491B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-13 DZ DZ970141A patent/DZ2291A1/fr active
- 1997-08-13 SV SV1997000071A patent/SV1997000071A/es active IP Right Grant
- 1997-08-13 HU HU0000188A patent/HU226658B1/hu unknown
- 1997-08-13 AU AU40691/97A patent/AU726820B2/en not_active Expired
- 1997-08-13 IL IL15830397A patent/IL158303A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 UY UY24668A patent/UY24668A1/es not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 CN CN971972818A patent/CN1228119B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-13 AR ARP970103696A patent/AR008294A1/es active IP Right Grant
- 1997-08-13 IL IL15830197A patent/IL158301A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 KR KR10-1999-7001214A patent/KR100375871B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 PT PT97938334T patent/PT920491E/pt unknown
- 1997-08-13 AT AT97938334T patent/ATE362524T1/de active
- 1997-08-13 CA CA002263725A patent/CA2263725C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-13 CO CO97046519A patent/CO4700552A1/es unknown
- 1997-08-13 NZ NZ334147A patent/NZ334147A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 JP JP51005398A patent/JP3754088B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-13 DE DE69737735T patent/DE69737735T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-13 BR BR9711067A patent/BR9711067A/pt active Search and Examination
- 1997-08-26 HN HN1997000124A patent/HN1997000124A/es unknown
- 1997-09-30 US US08/941,849 patent/US5879924A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-09-11 US US09/151,718 patent/US5985642A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-09-30 US US09/409,521 patent/US6207415B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-03-03 HK HK00101387.9A patent/HK1022496A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-01-19 JP JP2005011481A patent/JP2005118053A/ja active Pending
-
2006
- 2006-06-28 JP JP2006178683A patent/JP2006320328A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU226658B1 (en) | Immortalized cell lines for virus growth | |
| US6255108B1 (en) | Immortal avian cells | |
| US20050118700A1 (en) | Immortalized avian cell lines | |
| EP0956355B1 (en) | Method for immortalizing cells | |
| WO1998006827A9 (en) | Method for immortalizing cells | |
| MXPA99001485A (es) | Lineas de celulas inmortalizadas para crecimientode virus | |
| US20200179507A1 (en) | Immortalized cell lines and methods of use | |
| MXPA99001484A (es) | Metodo para inmortalizar celulas |