ES2285738T3 - Lineas celulares inmortalizadas para el crecimiento de virus. - Google Patents
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Abstract
Línea celular inmortalizada espontáneamente, derivada de fibroblastos embrionarios de pollo primarios, que es la línea celular UMNSAH-DF1 depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de registro CRL-12203.
Description
Líneas celulares inmortalizadas para el
crecimiento de virus.
Esta invención se refiere a los campos de la
biología celular y la virología. En particular, esta invención se
refiere al uso de células inmortalizadas para la propagación de
virus.
En 1931, Alice Miles Woodruff y Ernest
Goodpasture introdujeron un nuevo método para obtener cultivos de
virus. Notificaron que el virus de la viruela aviar podía hacerse
crecer en la membrana corioalantoidea de embriones de pollo en
desarrollo. Las lesiones que contenían el virus aparecieron en la
membrana tras la inoculación del virus. El huevo era relativamente
barato y fácil de obtener en comparación con animales que fueron el
sustrato de los estudios víricos iniciales. El huevo tiene una
variedad de células y membranas sensibles a la infección por
diferentes virus y puede mantenerse en un ambiente controlado,
estable. Los embriones de pollo han contribuido de manera
importante al desarrollo de la virología proporcionando
convenientemente una variedad de tipos celulares sensibles a muchos
virus.
Aunque el huevo permite la replicación de una
variedad de cepas víricas, los métodos para infectar los huevos y
mantener el crecimiento de virus requieren mucho tiempo y son
engorrosos. Por ejemplo, para la inoculación en la membrana
corioalantoidea, en primer lugar se taladra un orificio a través de
la cáscara del huevo y la membrana de la cáscara. Se perfora la
cáscara sobre el saco aéreo provocando la entrada de aire entre la
membrana de la cáscara y la membrana corioalantoidea, creando un
saco aéreo artificial, en el que se deposita la muestra. La muestra
se pone en contacto con el epitelio coriónico y el virus crece en
forma de lesiones en la membrana. No resulta inesperado que el uso
de huevos para la replicación vírica haya disminuido con la llegada
de las técnicas de cultivos celulares.
Puede hacerse crecer una variedad de células
in vitro. Los cultivos celulares son fáciles de mantener y
pueden conservarse en un ambiente altamente controlado en
comparación con los huevos. Sin embargo, todavía hay cepas víricas
que parecen crecer mejor en células de huevo embrionario que en
células en cultivo. Además, muchas líneas celulares en cultivo
portan agentes infecciosos endógenos incluyendo micoplasmas,
contaminantes bacterianos de bajo nivel, virus endógenos y
similares. Algunos de los tipos celulares que son los más eficaces
permitiendo la replicación vírica tienen problemas para la
producción de reservas víricas en las que las células contienen
virus endógenos. Los virus endógenos o bien están replicando a un
nivel bajo o bien pueden activarse cuando se infectan las células
con una segunda cepa vírica. Por ejemplo, se sabe que las células de
roedores portan virus endógenos y la microscopía electrónica de las
células de roedores en cultivo a menudo demuestra la existencia de
partículas víricas que pueden identificarse dentro de las células.
Las líneas celulares contaminadas no pueden usarse como sustratos
para vacunas comerciales vivas o inactivadas.
Para algunos virus, el método de elección para
la replicación vírica es el pollo embrionario. Por ejemplo, el
virus de la gripe humana, el de la rabia, el virus del moquillo en
perros, el virus de la enfermedad de Marek, reovirus y el virus de
la viruela aviar son virus que se hacen crecer preferiblemente en
huevos embrionarios debido a que el huevo permite el crecimiento de
reservas víricas de título superior o en células primarias
derivadas de huevos embrionarios. En otros casos, los virus se hacen
crecer en huevos debido a que hay una necesidad de sustratos
celulares libres de virus certificables.
Los cultivos celulares primarios son cultivos de
células recientemente aisladas de tejidos intactos. Estas células a
menudo constituyen una buena fuente de material libre de virus y son
muy adecuadas como células huésped para la replicación vírica. Las
células primarias no son siempre eficaces en la replicación de virus
y las células animales primarias muestran una vida útil limitada en
cultivo, experimentando finalmente senescencia. En la senescencia,
las células dejan de dividirse y mueren en cuestión de tiempo. La
capacidad de las células para dividirse a lo largo del tiempo en
cultivo depende de varios parámetros, incluyendo la especie de
origen de la célula y la edad del tejido cuando se puso en cultivo.
Las células que experimentan senescencia no pueden mantenerse en
cultivo durante largos periodos de tiempo y, por tanto, no son
huéspedes reproducibles útiles para el crecimiento de reservas de
virus comerciales.
Algunas células primarias evitan la senescencia
y adquieren la capacidad para convertirse en inmortales. Las
células de roedores parecen experimentar inmortalización espontánea
con bastante facilidad (Curatolo et al. In vitro
20:597-601, 1984) pero las células aviares y humanas
normales han mostrado en raras ocasiones, si acaso, poder alcanzar
la inmortalización espontánea (Harvey, et al. Genes and
Development 5:2375-2385, 1991;
Pereira-Smith, J. Cell Physiol
144:546-9, 1990; Smith et al. Science
273:63-67, 1996). Hay una variedad de motivos por
los que una población particular de células experimentaría
inmortalización. Puede inducirse a las células a experimentar
inmortalización tras la exposición a agentes que se sabe que inducen
mutaciones génicas. Algunos individuos presuponen que el cese del
crecimiento, relacionado con la senescencia, es dominante frente a
la inmortalización y que acontecimientos que inactivan los genes que
limitan el crecimiento pueden dar como resultado la inmortalización
(Pereira-Smith et al., Proc. Natl. Acad
Sci. (USA) 85:6042-6046, 1988).
\newpage
Foster et al. (Poultry Science 74
(suppl. 1): 73, 1995) describe células fibroblásticas de embriones
de pollo inmortalizadas con el agente carcinógeno químico
20-metilcolantreno.
La disponibilidad de células libres de virus,
inmortalizadas, puede eliminar o reducir el uso de cultivos de
tejidos animales primarios. Los cultivos primarios generalmente son
poblaciones de células definidas como enfermas y a menudo están
contaminadas. Con frecuencia, estos cultivos no cumplen los
requerimientos normativos para la producción de vacunas
comerciales. Los cultivos primarios de células pueden estar
contaminados con Circodnavirideae (por ejemplo, virus de la
anemia del pollo) o el virus del síndrome del descenso de puesta.
Por ejemplo, la vacuna de la enfermedad de Marek (una vacuna con
virus vivos) puede hacerse crecer como reservas de virus en huevos
de pato para la vacunación de aves de corral. En 1976, bandadas de
pollos que recibieron la vacuna, mostraron pruebas del síndrome del
descenso de puesta, provocada por un adenovirus de pato que se cree
que había contaminado la reserva de la vacuna y que se adaptó al
crecimiento en pollos.
En la industria de las vacunas, los
requerimientos normativos para la seguridad, regularidad y potencia
del producto están conduciendo a las compañías a adquirir líneas
celulares como la mejor alternativa a las prácticas actuales de
usar sustratos de vacunas basados en huevo y de células primarias.
Los fabricantes de productos de vacunas tanto para seres humanos
como para animales comparten las preocupaciones de seguridad y
regularidad debido a un ambiente normativo cada vez más rigurosos
con respecto a los sustratos de vacunas tanto en los Estados Unidos
como en Europa. La identificación de células adecuadas para el
crecimiento de virus para sustituir a los huevos embrionarios
también se ve favorecida en vista de los Principles for the
Utilization and Care of Vertebrate Animals in Testing, Research,
and Training (Principios para la Utilización y Cuidado de Animales
Vertebrados en Pruebas, Investigación y Formación) y la Animal
Welfare Act (Ley sobre el Bienestar Animal) (7 U.S.C. (U.S. code,
código de los EE.UU.), párrafo 2131) del Gobierno de los EE. UU. que
declara, en parte, que en todos los casos, deben considerarse
métodos tales como los sistemas biológicos in vitro en lugar
de los sistemas de modelos animales in vivo. Hay una
necesidad de células que estén libres de virus y el crecimiento de
virus exógenos para generar productos de vacunas animales.
Esta invención se refiere a la identificación de
líneas celulares de fibroblastos de pollo inmortalizadas
espontáneamente y a los métodos para obtener las líneas celulares.
En particular, esta invención se refiere a una línea celular
inmortalizada espontáneamente derivada de fibroblastos embrionarios
de pollo primarios que tiene las características de la línea
celular inmortalizada espontáneamente UMNSAH-DF1 que
está depositada en la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo)
en los términos y condiciones del Tratado de Budapest. Además, esta
invención se refiere a los cultivos de estas células y a los
subclones inmortalizados de la línea celular inmortalizada que
permite la replicación vírica.
En un aspecto de esta invención, las células
inmortalizadas de esta invención contienen virus y en otro, las
células inmortalizadas de esta invención contienen al menos un
vector que puede dirigir la expresión de proteínas recombinantes en
las células. En una realización, las células de esta invención
expresan proteínas recombinantes y en otro aspecto de esta
invención, el vector contenido en las células de esta invención
codifica para al menos una parte de un virus recombinante. En otra
realización, el vector es un vector de retrovirus.
En otro aspecto de esta invención se describe un
método para producir una línea celular inmortalizada a partir de
fibroblastos embrionarios de pollo sin tratamiento con agentes
carcinógenos, que comprende las etapas de: hacer crecer
fibroblastos embrionarios de pollo primarios en cultivo; realizar
pases de los fibroblastos en cultivo hasta que comienza la
senescencia celular; concentrar las células durante la senescencia
celular para mantener de aproximadamente el 30% a aproximadamente
el 60% de confluencia de cultivo; identificar focos de células no
senescentes; y hacer crecer las células no senescentes durante más
de 30 pases.
En todavía otro aspecto de esta invención se
describe un método para hacer crecer virus en una célula, que
comprende las etapas de: hacer crecer una línea celular
inmortalizada espontáneamente de la invención derivada de
fibroblastos embrionarios de pollo primarios en cultivo; infectar
las células con virus; permitir que el virus se replique en las
células; y recoger los virus que se replicaron en las células.
Actualmente, no se dispone esencialmente de
líneas celulares de ave no transformadas químicamente o sin
proteínas víricas, sin virus. La generación de líneas celulares
primarias de forma continua para la producción de reservas de virus
es engorrosa y deben validarse por separado como reservorios libres
de contaminantes para el crecimiento de virus. Esta invención
describe la inmortalización de células fibroblásticas de embriones
de pollo (CEF) incluyendo células derivadas de embriones de pollo
de East Lansing Line (ELL-0).
El término inmortalización se usa en el presente
documento para referirse a células que no son de roedores capaces
de crecer en cultivo durante más de 30 pases que mantienen un tiempo
en cultivo que se duplica de aproximadamente 1 a aproximadamente 2
días y han estado en cultivo continuo durante más de aproximadamente
6 meses. Generalmente, se considera que las células de ave están
inmortalizadas después de aproximadamente 20 a aproximadamente 25
pases en cultivo. Las células inmortalizadas se diferencian de las
células transformadas en que, a diferencia de las células
transformadas, las células inmortalizadas son dependientes de la
densidad y/o detención del crecimiento (por ejemplo, inhibidas por
contacto). Las células transformadas pueden crecer en agar blando y
normalmente pueden formar tumores cuando se inyectan en animales de
laboratorio. Las células de esta invención son útiles como
reservorios para hacer crecer virus o para expresar proteínas o
virus recombinantes particularmente cuando es importante que las
células no alberguen virus o proteínas víricas contaminantes. Las
células también son útiles para el estudio de los mecanismos
subyacentes de la senescencia e inmortalización celulares.
Se obtuvieron células primarias fibroblásticas
de embriones de pollo (CEF) procedentes de huevos
ELL-0 de 10 días tomando el torso embrionario de
embriones de 10 días, disgregando el tejido y poniendo las células
en cultivo. Están disponibles huevos fertilizados
Hy-Vac (Adel, Iowa). Los huevos y sus capas estaban
certificados por el proveedor como negativos para la gripe aviar
(tipo A), reovirus aviar, adenovirus aviar (grupos
I-III), virus de la encefalomielitis aviar, viruela
aviar, virus de la enfermedad de Newcastle, paramixovirus (tipo 2),
Mycoplasma, Salmonella y otros agentes infecciosos que
se sabe infectan a las reservas de las aves de corral. En el
ejemplo 1 se facilita el aislamiento de las células primarias y la
identificación de las células inmortalizadas.
Se identificaron las células debido a que en el
momento del descubrimiento de la línea inmortalizada, las
poblaciones de células se estaban seleccionando para estudiar los
efectos de la senescencia celular. Se sabe que las células humanas
y de aves son algunas de las células más difíciles de inmortalizar
en condiciones de cultivo tisular. A diferencia de las células de
roedores, no hay informes revisados por expertos de métodos de
inmortalización de fibroblastos de pollo o humanos de donantes
normales (Smith, et al. Science
273:63-67, 1996). En los fibroblastos de aves, las
células sin tratar normalmente sólo duran 20-25
pases. Es decir, a los 30 pases los cultivos primarios de estas
células de ave están muertos o muriéndose. Tal como se describe en
esta invención, para alcanzar 20 pases, se hicieron pasar y se
concentraron las células (véase el ejemplo 1) entre aproximadamente
el pase 12 hasta aproximadamente el pase 20 en placas más pequeñas
según fuera necesario. Se observaron los focos de crecimiento
celular más rápido y se aislaron estos focos usando aros de
clonación (Bellco Glass, Inc. Vineland, N.J.) y se extendieron en
cultivo.
La senescencia se define en el presente
documento como las células que tienen duplicaciones de población de
aproximadamente 0,5 duplicaciones de población o menos al día. Para
esta invención, las células inmortalizadas son células en cultivo
durante más de 30 pases, que crecen a una velocidad de duplicación
de la población (determinada por el recuento de células totales y
el recuento de células viables por día usando exclusión con azul de
tripano) de aproximadamente entre 0,6 a aproximadamente 1,2
duplicaciones de población al día y preferiblemente entre
aproximadamente 0,7 a aproximadamente 1,0 duplicaciones de población
al día mientras muestran inhibición por contacto, dependencia de la
densidad y una morfología celular normal.
Las células obtenidas de los focos identificados
originalmente, tal como se describe en el ejemplo 1, han
experimentado más de 400 (duplicaciones de población) y más de 160
pases. El término focos se usa en el presente documento para
denominar conjuntos de células uniformes morfológicamente que pueden
distinguirse de la morfología de las células de alrededor. Estos
focos de células pueden extraerse fácilmente y subclonarse para el
estudio adicional. Las células de esta invención han seguido
duplicándose cada 22-24 h. Las células se inhibieron
por contacto, eran negativas para la transcriptasa inversa (véase
el ejemplo 2), se detuvo la dependencia de la densidad, eran
aneuploides (tal como se observó mediante el análisis de extensión
cromosómica por microscopía de inmersión en aceite, el cariotipo
fue una mezcla de cariotipos diploides/tetraploides mostrando
algunas células una clara translocación del cromosoma 1), y crecían
en elevadas densidades de cultivo en placa de entre
1,1-1,9 x 10^{5} células/cm^{2}. No se
observaron células gigantes multinucleadas. Las células tienen un
fenotipo uniforme. Las células también mantienen un patrón
característico de crecimiento rápido que es importante para la
propagación del virus.
Las células no eran transformadas, tal como se
demostró por su incapacidad para crecer en los ensayos en agar
blando (véase el ejemplo 3). Además, las células no produjeron
tumores cuando se inyectaron en las alas de pollos (véase el
ejemplo 4). Las células ejemplo de esta invención se denominaron
células UMNSAH-DF1 y están depositadas en la
Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 12301 Parklawn Drive,
Rockville Maryland, 20852 con el número de registro CRL- 12203,
depositadas el 11 de octubre de 1996 bajo los términos y condiciones
del tratado de Budapest.
Esta invención también se refiere a las células
de fibroblasto embrionarias de pollo inmortalizadas de esta
invención en cultivo y a subclones de las células inmortalizadas de
esta invención. Por ejemplo, las células de esta invención se
identifican como células inmortalizadas espontáneas. Las células se
obtienen de capas libres de productos químicos contaminantes
conocidos, libres de virus conocidos (las gallinas que producen los
tejidos embrionarios que son la fuente de esta invención) y los
tejidos embrionarios usados para producir las células de esta
invención también están libres de productos químicos contaminantes
(es decir, libres del tratamiento con agentes carcinógenos
conocidos u otros agentes que se sabe que transforman las células de
roedores) y libres de virus conocidos. Una vez que las células
inmortalizadas de esta invención están en cultivo, es posible
subclonar adicionalmente las células para seleccionar otros
parámetros fisiológicos que pueden variar en la población celular
mientras que aún mantienen la inhibición por contacto y la
sensibilidad a la infección por virus.
Se sometió a prueba la capacidad de las células
para replicar el HVT (herpesvirus de pavo), herpesvirus aviar
(serotipo III), virus de la viruela aviar, y reovirus. Puede
someterse a prueba la capacidad de las células para replicar
Circodnavirideae, VHS de pollo serotipo II para una variedad
de otros virus y se han sometido a prueba como sustrato para
transfección. Las células fueron útiles para propagar tanto virus
aviares como no aviares. El ejemplo 5 detalla métodos para propagar
HVT, virus de la viruela aviar y reovirus. Las células son útiles
como sustrato para producción vírica, y en particular las células
son útiles para la producción de retrovirus, ya que las células y
sus capas (es decir, sus madres) no tuvieron infecciones por
retrovirus detectables. Las células pueden permitir la replicación
del virus de la leucemia del sarcoma aviar y el virus del sarcoma de
Rous.
Para producir reservas de virus, pueden
sembrarse las células de esta invención en tubos de cultivo tisular,
botellas redondas, cultivo agitado, en reactores de fibras huecas u
otros sistemas de cultivo masivo. Para la propagación de virus en
botellas redondas, se siembran las células a aproximadamente
2-5 x 10^{4} células/cm^{2} de área
superficial. La multiplicidad de la infección (razón de partículas
víricas infecciosas frente a células) para iniciar el crecimiento
de reserva de virus variará dependiendo de la cepa de virus. Los
expertos en la técnica de la virología y los expertos en el
crecimiento de virus y cepas de virus particulares podrán maximizar
el rendimiento de la reserva de virus mediante la manipulación
convencional de la multiplicidad de la infección, la temperatura,
variaciones de los medios y similares, sin experimentación
excesiva.
Los métodos para recoger el virus tras la
infección para obtener las reservas de virus infecciosos también
varían con la cepa del virus. Los virus con envuelta se extraen de
los medios de cultivo de forma más lenta que los virus sin
envuelta. Pueden obtenerse reservas de virus a partir del medio de
cultivo solo o a partir de lisados celulares reunidos con los
medios condicionados. Para los virus líticos (los que son eficaces
en la lisis de una célula durante la salida del virus), es
suficiente con recoger los medios de cultivo condicionado (por
ejemplo, los medios usados que contienen virus) tras una etapa de
centrifugación suave para eliminar los desechos celulares. De
nuevo, los métodos para recoger y obtener virus a partir de una
amplia variedad de cepas víricas se conocen bien en la técnica.
Hay una variedad de métodos, también conocidos
en la técnica, para cuantificar el crecimiento de virus de un
cultivo de células. Por ejemplo, el título de una reserva de virus
para los miembros de la familia de los herpesvirus y para una
variedad de virus que producen focos citopatológicos sobre la
superficie de una monocapa de células se cuantifica fácilmente
mediante ensayo en placa (como unidades formadoras de placa/ml de
líquido de cultivo o como unidades formadoras de placa/dosis para
la cuantificación de virus de inóculo de vacunas) o como la dosis
necesaria para infectar el 50% de los cultivos tisulares
(TCID_{50}). Los virus líticos rápidos se cuantifican mejor
mediante TCID_{50} como la dosis o dilución de reserva de virus
que puede infectar el 50% de los cultivos en un periodo de tiempo
definido. Los métodos para hacer crecer y cuantificar virus se
conocen en la técnica y las fuentes para enseñar los métodos de
cuantificación de virus se encuentran en Fields, et al.
(eds) Fundamental Virology 1991, Raven Press, Nueva York o en
Mandell, et al. (eds.) Principles and Practice of
Infectious Diseases, 1985, John Wiley & Sons, Nueva
York.
Además de permitir el crecimiento de virus, las
células de esta invención pueden usarse como líneas de
empaquetamiento para producir virus recombinantes, incluyendo
retrovirus. Las células también pueden usarse para producir
proteínas recombinantes, incluyendo proteínas víricas, y similares.
Los métodos para incorporar un ácido nucleico que codifica para una
proteína recombinante en un vector de ácido nucleico bajo el control
de elementos reguladores capaces de dirigir la expresión de una
proteína en una célula eucariota, tales como las células
inmortalizadas de esta invención, se conocen bien en la técnica.
Los vectores de expresión son fragmentos de ácidos nucleicos
replicables que pueden dirigir la expresión de una proteína
recombinante. Muchos vectores de expresión, incluyendo los vectores
de retrovirus, están disponibles en la técnica a través de
publicaciones en revistas y proveedores comerciales. Los
componentes de vectores de expresión replicables generalmente
incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: un
origen de replicación, uno o más genes marcadores, elementos
potenciadores (enhancers), elementos promotores, secuencias señal
opcionales y secuencias de terminación de la transcripción. Los
genes de selección o marcadores codifican para proteínas que sirven
para identificar una población de células transformadas o
transfectadas. Los genes de selección habituales codifican para
proteínas que confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas,
suplementan carencias auxótrofas o suministran nutrientes críticos
que no están disponibles en los medios complejos.
Los vectores de expresión que tienen un ácido
nucleico que codifica para proteínas recombinantes se transfectan
en las células y se usan para dirigir la expresión de las proteínas
recombinantes en las células inmortalizadas de esta invención. El
vector preferiblemente puede codificar para cualquier proteína
recombinante que puede expresarse en células de fibroblasto
embrionario de pollo, incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas
víricas, incluyendo transcriptasa inversa y/o proteínas víricas
estructurales. Los ejemplos de vectores para producir proteínas
recombinantes en una célula incluyen vectores de retrovirus para
producir proteínas supresoras de tumores, o proteínas víricas
estructurales tales como las descritas por Givol, et al.
Oncogene 11(12):2609-2618, 1995,
Givol, et al. Cell Growth & Differentiation
5(4):419-429, 1994, Akiyama, et al.
Virology 203(2):211-220, 1994 y
Boyer, et al. Oncogene 20:457-66,
1993.
Las células de esta invención pueden servir como
sustrato para expresar virus recombinantes, incluyendo, pero sin
limitarse a retrovirus recombinantes. Las células de esta invención
son adecuadas para servir de líneas celulares de empaquetamiento
para virus producidos por ingeniería genética útiles para terapia
génica, o similares. Los constructos y métodos para usar una línea
celular particular como línea celular de empaquetamiento se conocen
bien en la técnica. Por ejemplo, Boerkoel, et al.
(Virology 195(2):669-79, 1993)
describe métodos para el empaquetamiento de virus usando
fibroblastos embrionarios de pollo primarios como línea celular de
empaquetamiento. Pueden usarse estos mismos métodos para empaquetar
virus en las células inmortalizadas de esta invención.
Ya que la mayoría de las líneas celulares de
aves y todas las células de aves transformadas así como casi todas
las líneas celulares transformadas de ratón o bien contienen
contaminantes víricos tales como virus endógenos o bien producen
proteínas víricas, no son adecuadas para la producción de vacunas
para seres humanos o animales. Las células no pueden usarse para
producir proteínas recombinantes debido a que los contaminantes
endógenos pueden contaminar las preparaciones de proteínas
recombinantes purificadas. Ventajosamente, las células de esta
invención proporcionan una alternativa adecuada a estos
problemas.
Las células de esta invención también pueden
servir como sustrato para permitir el crecimiento de virus a partir
de otras células. Estas células incluyen células primarias, o
células cultivadas que muestran una mejora en el crecimiento o en
la longevidad en cultivo en presencia de otras células o en
presencia de proteínas de la matriz extracelular tales como
colágeno, lamininas y similares. En una realización, las células se
mezclan con virus y después se mezclan con las células de esta
invención preferiblemente en una razón de células : células de esta
invención de aproximadamente entre 1:5 células a aproximadamente
1:20 células y más preferiblemente en una razón de aproximadamente
1:10 (1 célula con respecto a aproximadamente 10 células de esta
invención). Las células mezcladas se ponen entonces en cultivo. En
una segunda realización, las células se mezclan con virus y se
siembran en placa en la superficie de las células inmortalizadas de
esta invención que ya están unidas a una superficie de cultivo
tisular. Las células de esta invención sirven como soporte para las
otras células y, sin pretender limitar el alcance de esta
invención, las células de esta invención pueden suministrar
factores de crecimiento y similares, así como componentes de la
matriz extracelular y similares para dar soporte a las otras
células mientras están produciendo virus. El ejemplo 6 proporciona
un ejemplo del uso de las células de esta invención como sustrato
celular.
Las realizaciones particulares de esta invención
se tratarán en detalle y se ha hecho referencia a posibles
variaciones dentro del alcance de esta invención. Hay una variedad
de técnicas alternativas y procedimientos disponibles para los
expertos en la técnica que permitirían llevar a cabo
satisfactoriamente la invención pretendida de manera similar.
Se pidieron dos docenas de huevos
ELL-0 de las reservas de aves de corral de East
Lansing USDA. Se incubaron los huevos en una incubadora aislada
esterilizada durante 10 días y se procesaron para cultivos
primarios. Se disoció el tejido embrionario usando una disolución
de tripsina/EDTA y se sembraron en placa en medio DMEM (Gibco) que
contenía suero de ternera fetal al 10% (Gibco). Que contenía
antibiótico/antimicótico (Gibco) al 1% y
L-glutamina 2 mM (Gibco), Se recogió la suspensión
celular disociada en un tubo de centrífuga de 50 ml que contenía
suero bovino fetal 10% ml para inactivar la tripsina y se centrifugó
a 700xg durante 10 minutos.
Se resuspendieron las células en 10 ml de medio
Eagle modificado por Dulbecco enriquecido con 36 \mug/ml de
insulina (Sigma), 1,6 \mug/ml de transferrina (Sigma, St. Louis,
MO), L-glutamina 2 mM, suero de ternera fetal al
10%, disolución de antibiótico/antimicótico al 1% y se pipeteó en un
tubo de cultivo tisular Corning de 25 cm^{2} y se incubó a 40,5ºC
en CO_{2} al 5%, aire al 95%. Tras 24 horas de incubación, se
cambió el medio. El cultivo primario contenía numerosos explantes
con centros de células de tipo epitelial y fibroblastos en forma de
estrella.
Se permitió crecer a los cultivos hasta la
confluencia (5 días) y se extrajeron de las placas usando una
disolución de tripsina/EDTA (tripsina al 0,05% y ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,02% en PBS) y se sembraron de
nuevo en placa en un segundo pase. En el segundo pase, se congelaron
algunas de las células en un medio condicionado que contenía un 50%
de medio DMEM, un 12% de DMSO y un 38% de suero de ternera fetal. Se
congelaron estas células en nitrógeno líquido en fase de vapor
durante 24 horas, después se transfirieron a nitrógeno líquido
acuoso para el almacenamiento a largo plazo.
Se sembraron de nuevo en placa las células del
segundo pase (P2) a una densidad de siembra de 2,7 x 10^{4}
células/cm^{2}. Se subcultivaron las células durante varios meses.
Los fibroblastos cultivados crecieron rápidamente durante de 8 a 9
pases, después empezaron a ralentizarse con una muerte celular
significativa. Durante las crisis, se pasaron las células a una
disolución de ATV (8 g/l de NaCl, 0,4 g de KCl, 1 g de dextrosa,
0,58 g de NaHCO_{3}, 0,5 g de tripsina (Difco 1:250), 0,2 g de
verseno (sal disódica) en 1000 ml). Se hicieron crecer las células
en medio Eagle modificado por Dulbecco enriquecido con 36 \mug/ml
de insulina (Sigma), 1,6 \mug/ml de transferrina (Sigma),
L-glutamina 2 mM, suero de ternera fetal al 10% y
disolución de antibiótico/antimicótico al 1%. Se observó que la
mayoría de las células en el pase 11 (P11) estaban muertas o
muriéndose; sin embargo, una pequeña subpoblación de células
parecían ser fibroblastos sanos. Las células de P11 permanecieron en
la placa durante cuatro semanas con realimentación cada tres días
con medio nuevo. Se congelaron algunas células y las células
restantes se concentraron en un área más pequeña y se les permitió
crecer durante otras dos semanas antes de que fueran lo
suficientemente confluentes para un segundo subcultivo. En el P15,
las células parecían ser más homogéneas respecto a la morfología
celular y crecían a una velocidad de 0,32 duplicaciones de
población al día. En el P20, las duplicaciones de población
aumentaron hasta aproximadamente de 0,7 a aproximadamente 0,8
duplicaciones de población al día. A este momento las células
parecían tener una morfología muy uniforme. Las células se
denominaron UMNSAH/DF Nº 1 y han estado en cultivo continuo durante
más de 19 meses. Las células están actualmente en el pase 160. Se
congelaron las células (como anteriormente) y se descongelaron las
del P5. Se extendieron las células subclonadas y se confirmó la
reproducibilidad del método mediante identificación de otros
clones. Se obtuvieron varios subclones más mediante el P11.
Se sometieron a prueba las células de esta
invención para determinar contaminantes víricos usando PCR para
identificar fragmentos de ácidos nucleicos contaminantes. Hay una
amplia variedad de kits de prueba disponibles comercialmente para
una variedad de virus que pueden usarse para determinar si las
células de esta invención contienen virus contaminantes. De forma
similar, hay ensayos disponibles comercialmente para detectar
antígenos víricos (por ejemplo, ensayos de ELISA disponibles
comercialmente y similares), en los que el antígeno deriva de una
variedad de virus diferentes. Pueden usarse estas pruebas en las
células de esta invención usando técnicas experimentales rutinarias
para demostrar que los cultivos están libres de virus
contaminantes.
En una serie de pruebas, se sometieron a prueba
las células para determinar la actividad transcriptasa inversa. Se
aislaron 1 x 10^{6} células de cultivos que crecían rápidamente en
4 ml de medio. Se sometió al medio a varias
congelaciones-descongelaciones a -80ºC para lisar
las células. El medio con las células lisadas se estratificó sobre
un gradiente de glicerol al 10%. Se centrifugó el gradiente durante
60 minutos a 40.000 rpm usando un rotor SW40 (Beckman Instruments,
Palo Alto, CA). Se sedimentaron las partículas víricas, si estaban
presentes. Se desechó el medio y se resuspendió el sedimento en 20
\mul de Nonidet P-40 (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO).
Se calentó un tubo eppendorf a 41ºC. Se
añadieron 5 \mul de muestra a 45 \mul de cóctel de transcriptasa
inversa que contenían Tris 45 mM, pH 7,8, 2-\beta
mercaptoetanol 2 mM, acetato manganoso 2 mM, Triton
X-100 al 0,1%, 10 \muM de cada uno de dATP, dCTP,
dGTP (Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN), 2,4
\mug de poli-A (Sigma), 60 ng de cebador dT
12-19 (Pharmacia), 0,4 \muCi/reacción de
^{3}H-trifosfato de timidina (de 15.000 a 28.000
cpm/pmol de actividad, Amersham).
Se incubó la reacción durante una hora a 41ºC.
Un control negativo incluyó 5 \mul de H_{2}0 dd y 45\mul del
cóctel. Se incluyeron dos controles positivos conocidos en el
ensayo. Se detuvo el ensayo añadiendo 1 ml de ácido tricloroacético
al 10% (TCA, Columbus Chemical Industries, Inc., Columbus, WI). Se
filtró la mezcla a través de un prefiltro de vidrio de 0,45 micras
Whatman GF/C. Se realizaron varios lavados usando TCA al 5%. Se
transfirió el filtro a un contador de centelleo Beckman Instruments
usando viales de centelleo que contenían 5 ml de líquido para
recuento por centelleo. Se contaron las muestras en un ajuste de
intervalo de 050 a 600. Se consideró positivo un aumento del triple
de cuentas sobre el fondo de cóctel (control neg.).
Los cultivos primarios resultaron ser negativos
para la transcriptasa inversa, tal como lo hicieron las células
inmortalizadas obtenidas en esta invención. Para información
adicional sobre ensayos de transcriptasa inversa véase (Crittenden,
et al. Virology 57: 128-138,
1974).
Para determinar el potencial tumorigénico, se
sometieron a prueba las células para determinar el crecimiento en
agar blando. Se preparó una base de agarosa blanda mezclando 12 ml
de una disolución de agarosa al 2% (que se había sometido a
autoclave y enfriado a 56ºC) en 21,6 ml de medio de McCoy 5A
enriquecido [Gibco, 120 ml de suero de ternera fetal (inactivado
por calor, 5 ml de piruvato de Na (disolución madre al 2,2%), 1 ml
de L-serina (disolución madre de 21 mg/ml), 5 ml de
L-glutamina (disolución madre 200 mM), 12,5 ml de
Hepes (disolución madre 1M)], 5,9 ml de asparagina (disolución
madre esterilizada filtrada de 4,4 mg/ml). Se vertieron siete ml de
medio caliente/agarosa en una placa de cultivo tisular de 100
mm^{2} y se permitió solidificara a temperatura ambiente en una
campana de cultivo tisular durante 1 h.
Se eliminaron las células de los cultivos en
crecimiento activo (de aproximadamente el 40% a aproximadamente el
70% confluentes) mediante tripsinización para lograr una única
suspensión celular en medio DMEM nuevo que contenía un 10% de suero
de ternera fetal (con L-glutamina y
antibióticos-antimicóticos). Se añadieron
aproximadamente 1 x 10^{6} células a 4,25 ml de medio DMEM que
contenía un 10% de suero de ternera fetal, 0,75 ml de agarosa al
1%, y 50 \mul de 2\beta- mercaptoetanol. Fue necesario tener
cuidado para estar seguro que el medio/agarosa caliente estaba a
42ºC antes de añadir las células. Rápidamente, se recubrieron 5 ml
de la suspensión de células anterior sobre las placas de
agarosa.
Se hicieron crecer las células a 37ºC en una
incubadora con CO_{2} al 5%, aire al 95% y se observaron durante
35 días. Se tiñeron placas por duplicado con clorito de 3
p-nitrofenil-5-feniltetrazolio
(tinción INT) y se examinaron en los días 0, 5, 10, 15, 20, 30 y 35
para determinar la formación de colonias y el crecimiento. Se
consideraron positivas todas las colonias teñidas mayores de 60
\mum.
Todas las células probadas resultaron negativas.
Se dispone de información adicional referida al ensayo de agar
blando en Hamburger, et al. Prog. Clin. Biol. Res. 48:
páginas 43, 135, 179, 1980.
Bajo las directrices resumidas en el Animal
Usage Protocol (Protocolo de uso de animales) de la Universidad de
Minnesota (protocolo nº 950300-1, marzo de
1995-diciembre de 1996) se inyectaron las células en
animales de experimentación para determinar si las células eran
tumorigénicas o no.
Se extrajeron células en crecimiento activo de
placas de cultivos celulares y se inyectaron en seis pollos adultos
de la línea SPAFAS (Hy-Vac, Adcl, Iowa). Se
introdujeron inyecciones subcutáneas de 4 x 10^{6} células en la
membrana de las alas de los pollos. Los sitios de inyección se
examinaron semanalmente durante 3,5 meses. No se observaron tumores
en el sitio de inyección para ninguna de las células transfectadas
producidas hasta la fecha, permaneciendo sanos todos los animales.
El experimento demostró que las células inmortalizadas no eran
tumorigénicas.
Se sembraron las células en botellas redondas a
5,0 x 10^{5} células/cm^{2}. Se permitió que las células se
unieran durante 24 horas y se recogió un control para el recuento
celular. Se hicieron crecer las células para infección vírica en
DMEM (glucosa 4,5 g/l), suero bovino fetal al 4%,
L-Glutamina 2 mM, gentamicina 50 mg/l. Se
infectaron las células a una multiplicidad de infección de 0,0006
partículas de virus HVT por célula. Se observaron las botellas
redondas diariamente para determinar la progresión de CPE. Se
recogieron las botellas 46 h después de la infección cuando había
aproximadamente un 50% de CPE. Se congelaron las células infectadas
por HVT en medio de crecimiento con DMSO al 10% a una concentración
de 2,0 x 10^{7} células/ml. Se cuantificaron los títulos de HVT
mediante ensayo de placas de lisis. Se hicieron diluciones seriadas
del virus en medio de crecimiento y se puso sobre monocapas
confluentes de células permisivas. Se incubaron los cultivos durante
un tiempo determinado y se fijaron y tiñeron las células. Se
contaron las placas de lisis en las monocapas y se expresaron los
títulos de los virus como unidades formadoras de placas por
dosis.
También se sometió a prueba la capacidad de
estas células para permitir la producción de reovirus. Se infectaron
2,5 x 10^{8} células con la cepa de reovirus
WSS-Reo 1733 teniendo un título de 8,2
TCID_{50}/ml. Se infectaron las células a una multiplicidad de
infección de 0,005, 0,001 ó 0,0005 partículas víricas
infecciosas/célula. Se hicieron crecer las células infectadas en
botellas redondas y se sometieron a prueba en 48, 64 y 72 horas
tras la infección para demostrar el crecimiento vírico
productivo.
Experimento
6
Las células de esta invención son útiles como
sustrato para permitir la replicación vírica de células primarias.
En estos experimentos, se mezclan las células inmortalizadas con
células primarias. En un estudio, se infectan las células primarias
y se mezclan con las células inmortalizadas y se ponen en cultivo y
en otro estudio, se infectan las células primarias y se ponen sobre
las células inmortalizadas en las que las células inmortalizadas ya
están colocadas en una capa en el frasco de cultivo tisular. En un
ejemplo, el virus es el virus del síndrome del descenso de puesta y
las células primarias son células de hígado embrionario de pollo
primarias. En un segundo ejemplo, las células primarias son células
endoteliales, preferiblemente células endoteliales de riñón y el
virus es el virus de la bronquitis infecciosa. La razón preferida de
las células primarias con respecto a las células inmortalizadas es
de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:20 y más preferiblemente,
de aproximadamente 1:10. Los títulos de virus para las células
primarias que crecen en la población mixta de células son superiores
a los títulos de virus de las células primarias en cultivo solas.
Las células inmortalizadas permiten usar las células primarias para
la propagación de virus en condiciones comerciales.
Claims (22)
1. Línea celular inmortalizada espontáneamente,
derivada de fibroblastos embrionarios de pollo primarios, que es la
línea celular UMNSAH-DF1 depositada en la Colección
Americana de Cultivos Tipo con el número de registro
CRL-12203.
2. Cultivos o subclones inmortalizados de la
línea celular inmortalizada según la reivindicación 1, que permiten
la replicación vírica.
3. Células según la reivindicación 1 ó 2, que
contienen virus.
4. Células según la reivindicación 1 ó 2, que
contienen al menos un vector capaz que puede dirigir la expresión
de proteína recombinante en las células.
5. Células según la reivindicación 4, en las que
el vector codifica para al menos una parte de un virus
recombinante.
6. Células según la reivindicación 4 ó 5, que
expresan proteína recombinante.
7. Células según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, en las que el vector codifica para al menos
una parte de un virus recombinante.
8. Método para producir una línea celular
inmortalizada de fibroblastos embrionarios de pollo sin tratamiento
con agentes carcinógenos que comprende las etapas de:
- (a)
- hacer crecer fibroblastos embrionarios de pollo primarios en cultivo;
- (b)
- realizar pases de los fibroblastos en cultivo hasta que comiencen la senescencia celular;
- (c)
- concentrar las células durante la senescencia celular para mantener de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 60% de confluencia de cultivo;
- (d)
- identificar focos de células no senescentes en el cultivo;
- (e)
- aislar las células no senescentes; y
- (f)
- hacer crecer las células no senescentes durante más de 30 pases.
9. Línea celular inmortalizada producida
mediante un método según la reivindicación 8.
10. Método para hacer crecer virus en una célula
que comprende las etapas de:
- (a)
- hacer crecer las células según las reivindicaciones 1, 3 ó 9 o los cultivos o subclones inmortalizados según la reivindicación 2 en cultivo;
- (b)
- infectar las células con virus
- (c)
- permitir que el virus se replique en las células; y
- (d)
- recoger los virus que se replicaron en las células.
11. Método para hacer crecer virus a partir de
células que comprende las etapas de:
- (a)
- incubar células con virus;
- (b)
- combinar las células con células de pollo inmortalizadas según la reivindicación 1 ó 9; y
- (c)
- aislar los virus producidos a partir de la combinación de las células y las células de pollo inmortalizadas.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
el virus es el virus de la viruela aviar o reovirus.
13. Método para producir un virus recombinante a
partir de una célula inmortalizada que comprende las etapas de:
- (a)
- introducir al menos un fragmento de ácido nucleico, codificando el fragmento de ácido nucleico al menos para una parte de un virus recombinante, dentro de células inmortalizadas según la reivindicación 1 ó 9; y
- (b)
- aislar el virus recombinante de las células inmortalizadas.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
el fragmento de ácido nucleico comprende además un vector.
15. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 11, 13 ó 14, en el que el virus es un retrovirus o
un herpesvirus.
16. Método para cuantificar la cantidad de virus
en una muestra que comprende las etapas de:
- (a)
- preparar al menos una dilución seriada de un virus;
- (b)
- poner en contacto una muestra de virus de al menos una dilución de virus con células de pollo inmortalizadas según la reivindicación 1 ó 9; y
- (c)
- cuantificar la cantidad de virus presentes en la dilución del virus.
17. Método para cuantificar la cantidad de virus
en una muestra que comprende las etapas de:
- (a)
- preparar diluciones seriadas de un virus;
- (b)
- poner en contacto una muestra de virus de una dilución de virus con células de pollo inmortalizadas según la reivindicación 1 ó 9; y
- (c)
- cuantificar la cantidad de virus presentes en la dilución del virus.
18. Método para producir proteínas en una célula
inmortalizada que comprende las etapas de:
- (a)
- introducir un ácido nucleico que codifica para al menos una proteína dentro de células inmortalizadas según la reivindicación 1 ó 9; y
- (b)
- aislar la proteína de las células.
19. Método según la reivindicación 18, en el que
el ácido nucleico que codifica para al menos una proteína es un
vector génico.
20. Método según la reivindicación 19, en el que
el vector génico es un vector de retrovirus.
21. Método para hacer crecer células como
sustrato para permitir el crecimiento vírico que comprende las
etapas de:
- (a)
- colocar las células en cultivos celulares con células de pollo inmortalizadas según la reivindicación 1 ó 9; y
- (b)
- mantener las células en cultivo.
22. Célula que comprende un fragmento de ácido
nucleico que codifica para un virus recombinante o al menos una
proteína, en la que la célula es una célula inmortalizada de pollo
según la reivindicación 1 ó 9.
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