ES2230619T3

ES2230619T3 - Metodo para inmortalizar celulas .

Info

Publication number: ES2230619T3
Application number: ES97937274T
Authority: ES
Inventors: Douglas N. Foster; James A. Farris; Linda K. Foster
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 2005-05-01
Anticipated expiration: 2017-08-13
Also published as: PE1899A1; HK1022497A1; US5830723A; AU3982997A; DE69731310D1; CA2263790A1; DE69731310T2; ZA977215B; JP3833714B2; AU717693B2; IL128512A0; MY121698A; UY24667A1; CN1228122A; HUP9903946A3; EP0956355B1; JP2000516469A; HUP9903946A2; AR008295A1; WO1998006827A2

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A LA INTRODUCCION DE P53 DEL PROMOTOR DE METALOTIONEINA EN CELULAS PRIMARIAS BAJO CONTROL CON EL FIN DE PRODUCIR LINEAS CELULARES INMORTALIZADAS. ESTAS CELULAS SON UTILES COMO SUSTRATOS PARA LA PROPAGACION VIRAL, COMO FUENTES LIBRES DE CONTAMINANTES PARA LA PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES, PARA LA PRODUCCION DE VIRUS RECOMBINADOS Y COMO SUSTRATOS CELULARES PARA SOPORTAR CELULAS PRIMARIAS Y MEJORAR EL RENDIMIENTO DE LOS VIRUS DURANTE LA PROPAGACION VIRAL.

Description

Método para inmortalizar células.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de la inmortalización de células y al uso de las células de pollo como reservorios para el crecimiento de virus y la expresión de proteínas recombinantes. En particular esta invención se refiere al uso de la proteína p53 bajo el control de un promotor inducible para la producción de células inmortalizadas de pollo.

Objetivos de la invención

Diversos virus que afectan a aves son utilizados para la producción de vacunas animales y de aves propagados en huevos embrionados de pollo o cultivos de fibroblastos primarios de pollo. Ejemplos de vacunas animales hechas utilizando estos sustratos de pollo incluyen el moquillo canino para perros; vacunas para la enfermedad de Marek para pavos, Reovirus, virus de la viruela aviaria y enfermedad infecciosa Bursal para aves de corral. Los cultivos de células primarias pueden ser muy variables y presentan un cierto riesgo de contaminación por virus endógenos, mycoplasmas, y similares. El origen de los tejidos animales desde los cuáles los cultivos de células primarias son derivadas son frecuentemente limitadas y caras debido a la necesidad de mantener animales en stock en un estado libre de patógenos.

Existe la necesidad de desarrollar una metodología reproducible para generar sustratos de células de ave inmortalizadas libres de virus, que son adecuadas para el uso en la fabricación de vacunas animales. La disponibilidad de las líneas celulares inmortalizadas (esto es continuas) bien caracterizadas tiene el beneficio de eliminar o reducir la dependencia con cultivos de tejidos primarios de animales que están poco controlados desde el punto de vista de la calidad. En la industria de la vacuna, los requisitos reguladores para un producto seguro, consistente, y potente son conducidos por compañías que se dedican a líneas celulares como la mejor alternativa para la práctica actual usando sustratos de vacunas celulares primarias y basadas en huevos. Las compañías productoras de vacunas deben tener definidas líneas celulares para la producción de virus para poder encontrar los requisitos reguladores para permitir a las compañías difundir sus vacunas. Los fabricantes de las vacunas humanas y animales en Estados Unidos y el extranjero deben demostrar que sus sustratos de vacunas están libres de contaminantes. La llegada de un método reproducible para generar líneas celulares animales continuas derivadas de tejidos primarios hará posible fabricaciones de productos biológicos para permitir un mejor control de la producción de productos biológicos y aumentar la seguridad y consistencia mientras por último se reduce el coste.

Resumen de la invención

Esta invención se refiere a un método para transformar las células de pollo y las células de pollo producidas mediante la introducción de ácido nucleico codificando a p53 bajo el control del promotor metalotioneina dentro de las células, y se seleccionan las células con características de inmortalización.

En un aspecto de esta invención, se expone un método para la transformación de células primarias de pollo, que comprende los pasos siguientes.

(a): colocación del ácido nucleico codificando p53 bajo el control de un promotor de metalotioneina en un vector génico capaz de dirigir la expresión de p53;

(b): introducción del vector génico en las células primarias de pollo; y

(c): selección del grupo de células que doblan la población de 0,6 a 1,5 veces por día, en dónde las células son transcriptasa reversa negativa y son no tumorales.

Las células primarias utilizadas en esta invención pueden ser de cualquier número de tejidos y en una realización preferida las células son obtenidas de la piel, tejido muscular de pechuga y tejido muscular cardíaco.

En otro aspecto de esta invención, se revelan las células. Estas células son células de pollo no transformadas inmortalizadas que contienen p53 bajo el control del promotor de la metalotioneina y contiene como mínimo un vector capaz de dirigir la expresión de la expresión de las proteínas recombinantes en las células. En una parte las células son derivadas de ave.

Esta invención también describe un método para el crecimiento de virus que comprende los siguientes pasos: poner en contacto como mínimo una partícula vírica infecciosa con una célula como mínimo de un cultivo de células inmortalizadas, dónde las células del cultivo contienen un vector génico capaz de dirigir la expresión de p53 bajo el control del promotor de metalotioneina, y de acumular los virus producidos por las células.

Dichos virus pueden ser Reovirus, HVT o virus de la viruela aviar.

La actual invención también relata un método para la propagación de virus que comprende los siguientes pasos:

(a) poner en contacto como mínimo una partícula vírica infecciosa con una célula primaria;

(b) hacer crecer las células primarias con células inmortalizadas de pollo que contienen el vector con un gen que expresa p53 bajo control del promotor de metalotioneina en un cultivo celular; y

(c) recopilar los virus producidos del cultivo celular.

Esta invención también se refiere a células de pollo inmortalizadas, no transformadas que contienen p53 bajo el control del promotor de metalotioneina y que contienen como mínimo un vector capaz de dirigir la expresión de una proteína recombinante en las células. Por un lado las células expresan proteínas recombinantes y por el otro lado el vector codifica como mínimo una porción del virus recombinante. No obstante en cualquier caso, el vector es un vector retroviral.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 es un esquema del vector pJFNII, utilizado preferentemente en esta invención.

Figura 2 es un esquema del vector pJFNIIcMTD, utilizado preferentemente en esta invención.

Descripción detallada de la invención

Existe la necesidad de un método para reproducir las células primarias inmortalizadas y generar líneas celulares continuas. El desarrollo de tecnologías para generar líneas celulares bien caracterizadas genéticamente, en las que se produce una replicación viral permitirá a las compañías ahorrar tiempo regularmente en la producción de células primarias y zanjará así los problemas asociados con los contaminantes e inconsistencias que existen entre los lotes de huevos. Las líneas celulares inmortalizadas definidas para el crecimiento de virus reducen el coste asociado con el control de calidad del producto final.

Esta invención revela la inmortalización de células primarias de pollo utilizando p53 bajo el control del promotor de metalotioneina inducible. Las células son útiles para el crecimiento de virus, para expresar proteínas de virus y para producir virus recombinantes.

Los cultivos de células primarias son más frecuentemente derivados de células recién aisladas procedentes de tejidos intactos. Estas células son normalmente una buena fuente de virus libres de material y son buenas como células hospedadoras para la replicación de virus. Las células primarias no son siempre eficientes en la replicación de virus y las células primarias de animales exhiben un intervalo de vida limitado en el cultivo, ya que finalmente padecen senescencia. En la senescencia las células dejan de dividirse y se extinguen en un tiempo importante. La habilidad de las células para dividirse en los cultivos depende de varios parámetros incluyendo las especies celulares originales del cultivo y la edad del tejido, cuando éste fue colocado en el cultivo. Las células que padecen senescencia no se pueden mantener en un cultivo por un largo periodo de tiempo y por ello no se pueden utilizar como hospedadores para el crecimiento de virus. Las células primarias generalmente padecen entre 23-26 divisiones antes de padecer la senescencia. Las células de la invención son preferiblemente transfectadas con p53 entre la segunda división hasta la cuarta división aproximadamente.

Las células inmortalizadas, utilizadas a lo largo de esta invención, hacen referencia a células capaces de crecer en cultivos más allá de 25 divisiones. Las células inmortalizadas se diferencian de las células transformadas porque a diferencia de las células transformadas, las células inmortalizadas presentan una parada del crecimiento dependiente de densidad y mantienen una morfología normal. En contraposición a las células inmortalizadas, las células transformadas son capaces de crecer en agar blando y son capaces de provocar tumores cuando son inyectadas en animales de laboratorio.

Las células de esta invención son inmortalizadas mediante la introducción en las células primarias preferiblemente del p53 bajo el control de un promotor inducible de metalotioneina. El oncogen nuclear p53 es uno de los genes supresores tumorales más estudiados supresor en parte debido a que las mutaciones en el gen p53 contribuyen, de cualquier modo, a aumentar en un 50% de los cánceres humanos (Levine et al, Nature. 351:453-456, 1991). El p53 es una fosfoproteína celular y se encuentra frecuentemente a niveles muy elevados en las células transformadas (De Leo, A.B. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2420-2424, 1979). El p53 de tipo salvaje realiza la función de supresor del crecimiento (Michalovity et al. Cell 62:671-680, 1990) y el p53 frena el ciclo celular en respuesta a una lesión en el DNA (Kastan, et al. Cancer Res. 51:6304-6311, 1991). La función se lleva a cabo mediante la acumulación del p53 y una inducción subsiguiente del GADD45 (una importante proteína reparadora de escisiones), WAF1 (p21) y genes MDM2 (que forma un complejo estable con p53)(Kastan, et al. Cell 71:587-597, 1992). Esta teoría se sostiene mediante la observación de mutaciones en p53 que pueden resultar de la inmortalización celular.

Varios estudios relacionan la molécula salvaje p53 con la inhibición de la división celular mediante un inhibidor universal de ciclina quinasa (esto es, Cip1, El-Deiry et al. Cell 75:817-825, 1993 WAF] por Harper et al, Cell 75:805-816, 1993). Los experimentos muestran que la proteína p53 estimula la producción de otra proteína p21, que en las células normales se desarrolla en un complejo cuaternario que incluye la quinasa dependiente de ciclina, ciclina, antígeno nuclear celular proliferador (PCNA) y p21. En las células transformadas, la pérdida de la función del p53 parece ser debida a las mutaciones que conducen a la pérdida del p21 y PCNA del complejo multiproteico, dando un crecimiento no controlado. Mientras las mutaciones en p53 han sido asociadas con la regulación de la proliferación celular, hay otras teorías que postulan otras rutas para la regulación del p53 de la proliferación celular (Milner, et al. Cell. Biol. Int. Rep. 4:663-667, 1980, Milner et al. 112:785-788, 1981, Mercer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6309-6312, 1982 y Mercer et al. Molec. Cell. Biol. 4:276-281, 1984). Por ejemplo, mutaciones en el gen p53 pueden ser las responsables de eliminar de las células la capacidad para reparar lesiones ocurridas durante puntos críticos en el ciclo celular debido a parámetros fisiológicos y físicos como el estrés, la edad, radiaciones ionizantes de la exposición a carcinógenos.

El p53 es conocido como regulador de la proliferación celular. Existe alguna evidencia de que ratas con p53 no mutadas pueden inmortalizar las células de roedor. Jenkins et al demostraron la inmortalizacion de condrocitos de rata sólo cuando fueron utilizados promotores constitutivos procedentes de virus tumorigénicos como el Virus del Sarcoma de Rous (RSV) y el Virus de Simios 40 (SV40) (Jenkins et al. Nature 317:816-818, 1985). Eliyahu et al. (Nature 312:646-649, 1984) and Parada, et al. (Nature 312:649-651, 1984) fueron, también, capaces de inmortalizar células de rata pero sus datos fueron contradictorios a los de Jenkins et al y demostraron que las construcciones de p53 no inmortalizaban células cuando el gen p53 era transfectado sólo, pero las construcciones de p53 generaban focos transformados cuando las células eran co-transfectadas con el oncogen ras. Aunque estas células tenían características de células transformadas, las células experimentaban senescencia y frenaban su multiplicación en un tiempo relativamente corto tras su transformación.

A diferencia de Jenkins, Eliyahu y Parada (todo supra), Rovinski y Benchimol (Oncogene 2:445-452, 1988) demostraron la inmortalización de fibroblastos de embrión de rata utilizando p53 bajo el control de su promotor endógeno. Los resultados fueron publicados por Rovinski, y pueden ser explicados por otros estudios que indican que las células de rata son conocidas por experimentar fácilmente inmortalización y transformación. Las células fueron cebadas en cualquier caso, puesto que éstas son particularmente sensibles a los estímulos de inmortalización y transformación. Los estudios han demostrado que los fibroblastos de roedores se inmortalizan espontáneamente con mucha frecuencia (Ponten, J. Virol Monogr. 8:1, 1971; Ponten J, Biochim, Biophys Acta 458:397,1976; Todaro y Green J. Cell Biol. 17:299-313, 1963; Meek et al, Exp. Cell Res 107:277-284, 1977 y Curatolo, et al. In Vitro 20:597-601, 1984). Actualmente, Rovinski y Bechimol (supra página 446) vieron que sus controles de fibroblastos de embrión de rata, transfectados sólo con un marcador de la expresión y tenían una frecuencia espontánea de inmortalización alrededor del 10%. En contraposición, un artículo de revisión en Science y otros estudios indican que no hay documentos de fibroblastos humanos o de pollos inmortalizados espontaneamente procedentes de donantes (Smith et al. Science 273:63-67, 1996, Hayflick, Exp. Cell Res. 37:614-636, 1965 and Smith et al., Adv. Cancer Res. 54:63-77, 1990). Además las células de rata llevan una gran variedad de virus endógenos, particularmente retrovirus que los hacen útiles para la producción de vacunas comerciales.

Hay un gran número de genes p53 que han sido aislados de una gran variedad de mamíferos. Por ejemplo la secuencia p53 de pollo (SEQ ID NO: 1) es asequible en el GenBank con números de acceso X 13057 y lo podemos encontrar en la literatura de Soussi, et al (Nucl. Acids Res 16(23):11383, 1988). La secuencia humana normal del p53 es asequible en el GenBank con números de Acceso W88747 y HSP53G y el clon puede ser obtenido por el público en la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington. El gen humano p53 es también suministrado como exones 1-11 con números de acceso al GenBank M22881-M22884, M22887-M22888 M22894-M33898 y fue publicado por Buchman et al. (Gene 70(2) 245-252, 1988) p53 del caballo se puede adquirir con número de acceso en el GenBank de U37120 y del mono verde africano (número de acceso al GenBank X16384). El p53 de mono Rhesus se puede obtener en el GenBank con número de acceso L20442, el de vaca p53 como X81704 (ver también Dequiedt F. et al, DNA Seq 5(4)261-64, 1995), y el p53 de gatos se adquiere con número de acceso D26608 (Okuda M. et al Int. J. Cancer 58(4)602-7, 1994). Otras secuencias y publicaciones se refieren al uso de aquellas secuencias que pueden ser obtenidas de bases de datos como el GenBank, y similares. Aquellos expertos en el arte estarán fácilmente capacitados a ir a la literatura o a la base de datos para obtener secuencias para p53.

El promotor de metalotioneina tiene un número de regiones ligantes metálicas y la expresión de los genes regulados por el promotor de metalotioneina puede ser inducido por Cd^{++}, Cu^{++} y Zn^{++}. El promotor contiene un número de múltiples sitios de unión potenciales para los factores de regulación metálicos y para factores de transcripción incluyendo SP1 y MLTF. Los elementos sensibles a metales dentro de las regiones del promotor y otras regiones identificadas en el promotor son discutidas con detalle por Mueller et al, (Genes & Development 4:412-426, 198.8).y Lee et al. (Nature 325:369-372, 1987)

Existe un número de genes de metalotioneina de una gran variedad de especies que son conocidas en este arte, como los genes que codifican por p53. Por ejemplo, la secuencia del promotor de metalotioneina de pollos (ID de SEC Nº: 2) se puede adquirir de la literatura de Fernando, et al (Gene.8:177-183, 1989). La región de promotor puede ser identificada del gen de metalotioneina de un número de secuencias de genes de metalotioneina publicados y basados en las características publicadas del promotor de metalotioneina (Mueller et al. supra and Lee et al, supra). La secuencia del promotor del gen de metalotioneina humano se puede adquirir del GenBank como W68639, X65607, V00594 (mirar también Stennard et al. Biochim. Biophys. Acta 1218(3):357-365, 1994; Richards et al, Cell 37(1):263-2722, 1984 y Karin et al, Nucl Acids Res 10(10):3165-3173, 1982). El promotor de metalotioneina en ovejas se obtiene del GenBank con número de Acceso X04626 (mirar Peterson et al, Eur. J. Biochem 160(3):579-585, 1986) Otras secuencias y publicaciones que se refieren al uso de la secuencia se pueden obtener de un número de base de datos de genes como GenBank, GenEMBL y similares. Aquellos expertos en el arte serán capaces fácilmente de obtener la secuencia de
genes para los promotores de metalotioneina mediante la literatura o las bases de datos.

Las células de esta invención fueron inmortalizadas a través de la introducción de un ácido nucleico que codifica por p53 en las células dónde el ácido nucleico que codifica por p53 está bajo control del promotor de metalotioneina que es, unido al ácido nucleico que codifica por p53. De un modo preferente en esta invención, se introdujo p53 bajo el control del promotor de metalotioneina a las células en un vector de expresión. Hay una gran variedad de vectores de expresión disponibles comercialmente y aquellos expertos en la materia apreciaran fácilmente que una gran variedad de vectores puede ser utilizada para expresar p53 en una célula animal de no roedor. El vector de expresión puede también incluir una variedad de otras características que facilitan la replicación del vector en las células procariotas, la selección del vector, la integración de otras secuencias de genes o facilitar la expresión de genes mediante la adición de otras secuencias reguladoras. Ejemplos de estas características incluyen pero no se limitan a la inclusión del origen bacteriano de replicación, genes que confieren resistencia a antibióticos, otros marcadores selectivos, incluyendo pero no limitados, a \beta-galactosidasa, luciferasa o similares, secuencias enlazantes, múltiples sitios de clonación y similares.

Ejemplo 1 detalla la identificación de un promotor de metalotioneina y un gen p53 junto con la incorporación del promotor y p53 en un vector de expresión. Preferiblemente el promotor de metalotioneina y el gen p53 son de la misma especie. La construcción de p53 bajo el control de un promotor de metalotioneina fue introducido a las células. Preferentemente las células son células primarias, como las utilizadas en la divulgación, son preferentemente células que han estado cultivadas durante 1-10 divisiones y/o menos de 2 meses.

Las células primarias son caracterizadas generalmente como células con una capacidad finita de crecer en un cultivo. Las células primarias son aquéllas células aisladas de tejidos intactos y colocados en un cultivo. Las células pueden ser obtenidas de cualquier número de tejidos de pollo. Por ejemplo, biopsias, muestras de tejidos, tejidos embrionarios, y similares, pueden ser troceados digeridos con tripsina y aislados por transfección como células simples en una suspensión como cultivos de monocapa o como fragmentos de tejidos pequeños pero intactos. Las células aisladas adecuadas para la transfección pueden ser fibroblastos, células musculares, células epiteliales, células endoteliales y otras. Estos expertos en el arte reconocerán que existen métodos bien conocidos para obtener y aislar una gran variedad de células de una gran variedad de tejidos simples y que estos métodos se pueden llevar a cabo sin excesiva experimentación. Ejemplo 2 describe el método para el aislamiento de células de tejido embrionario de pollo, incluyendo células de la piel, del músculo cardíaco y del músculo de la pechuga del pollo.

Existen diversos métodos conocidos en esta materia para introducir un vector capaz de dirigir la expresión de una secuencia de ácido nucleico o para introducir un ácido nucleico en las células. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, la precipitación con CaPO_{4}, electroporación, técnicas de transfección con lipofectina, técnicas de transfección con poliamina y transfección con partículas virales. Ejemplo 3 describe un método para la introducción de fragmentos de ácido nucleico metalotioneina/p53 en células eucariotas utilizando lipofectamina. Existen una gran variedad de kits comerciales útiles para incorporar los fragmentos de ácido nucleico a las células eucariotas utilizando diferentes métodos. Por ello, los métodos de introducción del ácido nucleico que codifica por p53 bajo el control del promotor de metalotioneina no deberían modificar los resultados de la invención.

Seguidamente de la transfección, las células de la invención crecen y se expanden bajo una presión selectiva de crecimiento, si es necesaria, para identificar los clones que contienen los fragmentos de ácido nucleico transfectados. Las células son tratadas con los cationes necesarios para promover la expresión del promotor de metalotioneina. Ejemplo 3 utiliza ZnSO_{4}, para inducir el promotor de metalotioneina. Un foco de células son seleccionadas y desarrolladas en el cultivo. El término foci se refiere a un grupo de células que tienen características que son diferentes de las células vecinas. En esta invención, las células inmortalizadas por fragmentos de ácido nucleico codificados por p53 bajo el control del promotor de metalotioneina crecen más rápidamente y forman grupos en monocapas en el cultivo primario. Estas agrupaciones pueden ser aisladas y repartidas en el cultivo utilizando anillos de clonación.

Las células fueron consideradas inmortalizadas cuando habían experimentado alrededor de 25 cultivos mediante la introducción de p53/metalotioneina incluyendo la construcción dentro de las células y cuando las células estaban experimentando como mínimo una duplicación de la población del 0,6 por día, y preferentemente entre 0,6 y 1,5 de duplicación de la población por día. Las células conservaron una morfología normal y exhibieron una densidad dependiente y/o un crecimiento inhibido. Las células de 3 tejidos de embriones de pollo fueron analizadas por su capacidad de ser inmortalizadas mediante métodos de esta invención. Se identificaron un número de clones de células del músculo cardíaco, células de músculo de pechuga y células de la piel como indica el ejemplo 5.

Las células inmortalizadas de esta invención deberían ser ensayadas con contaminantes virales así como con otros cultivos de tejidos contaminados como un bajo nivel de contaminantes bacterianos, mycoplasmas y similares. Las células pueden ser tratadas por la evidencia de la infección retroviral, influenza de aves (tipo A), reovirus de aves, Avian adenovirus (grupos I-III), Avian encephalomyelitis virus, viruela del ave de corral, Newcastle disease virus, Paramyxovirus (tipo2), tan bien como Mycoplasma, salmonella y otros contaminantes como los citados en 9 C.F.R. 113 y sus subapartados.

Las células pueden ser ensayadas en un amplio rango de contaminantes virales utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para identificar los fragmentos de ácido nucléico contaminantes. Existe una gran variedad de kits de tests comercialmente asequibles para una variedad de virus que pueden ser utilizados para determinar si las células de la invención contienen virus. Semejantemente, existen tests asequibles comercialmente para detectar antígenos virales, en dónde los antígenos derivan de una gran variedad de virus diferentes. Estos tests, incluyen ensayos de ELISA, ensayos de immunofluorescencia, y similares. Todos estos ensayos son perfectamente conocidos y comportan técnicas de rutina experimental. El ejemplo 4 proporciona un método para la determinación si las células de esta invención son transcriptasa reversa negativa. La evidencia de la presencia de la actividad de transcriptasa reversa en las células inmortalizadas que contienen p53 bajo control de un promotor de metalotioneina es evidencia de la contaminación por retrovirus.

Las células son también ensayadas por su potencial tumorigénico. Las células de esta invención son preferentemente no tumorigénicas. Las pruebas para determinar si la población de células es tumorigénica son conocidas en este campo. El ejemplo 6 proporciona métodos para ensayar el crecimiento de las células inmortalizadas de esta invención en agar blando y el ejemplo 7 proporciona métodos para la introducción de las células de esta invención en un animal que es preferentemente especies de las células de esta invención para determinar si las células de esta invención son capaces de inducir tumores en los animales. Para probar el potencial tumorigénico de las células humanas que contienen ácido nucleico que codifica a p53 bajo el control de un promotor de metalotioneina, las células pueden ser probadas mediante el crecimiento en agar blando, y por el crecimiento en ratones o otros animales de laboratorio con sistemas inmunes reconstituidos humanos.

En un aspecto de esta invención, las células son útiles para la propagación de virus. Las células de esta invención sostienen infecciones de reovirus, Herpes virus de pavo (HVT), y virus de Mareak como se demostró en el ejemplo 8. Las células de esta invención derivaron de tejido de pollo que también pueden ser buenos hospedadores para virus infeccioso Bursal, virus sincicial respiratorio, virus de Newcastle, virus infeccioso laringotraqueal, una gran variedad de adenovirus incluyendo adenovirus tipo III, Circodnaviridae, HSV de pollo, viruela del ave de corral y otros. Un gran número de virus humanos y animales crecen en huevos embrionados incluyendo pero no limitándose a, virus de la Rabia, Parvovirus canino, virus felino Panleucopenia, virus Calici, virus de la Hepatitis, Influenzae virus, virus Varicella Zoster y hospedadores de otros virus. Estos virus pueden también ser probados por su habilidad de crecer en las células inmortalizadas de esta invención.

Para producir un stock de virus, las células de esta invención pueden ser sembradas en frascos de cultivos de tejidos, botellas en cilindro, cultivos giratorios o en reactores vacíos de fibra. Para la propagación de virus en las botellas cilíndricas, las células son sembradas en una área de alrededor de 2-5 x 10^{4} células/cm^{2} de área superficial. La multiplicidad de la infección (cociente de partículas víricas infecciosas en las células) para iniciar el crecimiento de virus en stock cambiará dependiendo de las cepas de virus. Aquellos expertos en el campo de la virología y expertos en el crecimiento de virus particulares y cepas de virus serán capaces de maximizar los stocks de virus mediante la manipulación estándar de la multiplicidad de la infección, temperatura, cambios en el medio, y similares sin previa experimentación.

Los métodos para cultivar los virus después de la infección para obtener virus infecciosos en stock también cambia con distintas cepas de virus. Los virus envueltos progresan en el medio de cultivo más lentamente que los virus no envueltos. Los stocks de virus pueden ser obtenidos de medios de cultivo solos o de células lisadas combinado con el medio condicionado. Para virus líticos (aquellos que son eficientes para lisar células durante la progresión del virus) que se cultivan en el medio de cultivo condicionado (p.ej. medio agotado que contiene virus) después de una centrifugación para eliminar los restos de células, es suficiente. Nuevamente, los métodos para cultivar y salvar virus de un amplio rango de cepas de virus son bien conocidas en el campo.

Existen una gran variedad de métodos, también todos ellos conocidos en el arte, para cuantificar el crecimiento de virus de un cultivo de células. Por ejemplo, la cantidad de stock de virus para los miembros de la familia de Herpes virus y para una variedad de virus que producen focos de citopatología en monocapas de células de superficie son fácilmente cuantificados mediante un ensayo en placa (como unidades formadoras de placa/ml de cultivo fluido o como unidad formadora de placa/dosis para la cuantificación de virus del inóculo de vacunas) o como cultivo de tejido dosis infecciosa 50 (D_{50}). Rápidamente los virus líticos están mejor cuantificados por D_{50} como la dosis o la dilución de stock del virus capaz de infectar el 50% de los cultivos en un periodo de tiempo definido. Los métodos para el crecimiento y cuantificación de virus son conocidos en el campo y fuentes por enseñar los métodos de cuantificación de virus que son encontrados en Fields, et al. (eds) Fundamental Virology 1991, Raven Press, New York o en Mandell, et al. (eds) Principles and practice of infectious Diseases, 1985, John Wiley & Sons, New York.

Las células de esta invención son también utilizadas para la producción de proteínas recombinantes, incluyendo proteínas virales y similares. Los métodos para la incorporación de ácidos nucleicos que codifican por una proteína recombinante en un vector de ácido nucleico bajo el control de elementos reguladores capaces de dirigir la expresión de una proteína en una célula eucariota, como las células inmortalizadas de esta invención, son bien conocidos en este campo. Los vectores de expresión son fragmentos de ácido nucleico replicables que pueden directamente expresar una proteína recombinante. Varios vectores de expresión, incluyendo los vectores retrovirales, son asequibles en el campo mediante publicaciones diarias y distribuidores comerciales. Los componentes de un vector de expresión replicable incluyen, pero no están limitados sólo a, uno o más de los siguientes: el origen de replicación, uno o más marcadores genéticos, elementos potenciadores, promotores, secuencias señal opcionales y secuencias de parada de la transcripción. La selección o el marcador genético que codifica por una proteína que sirve para identificar una población de células transformadas o transfectadas. Los genes de selección típica codifican por proteínas que confieren resistencia a los antibióticos y otras toxinas, deficiencia auxotrófica de complementos, o suministro crítico de nutrientes no asequible por el medio complejo.

Los vectores de expresión que tienen ácido nucleico que codifica por una proteína recombinante son transfectados en las células y son utilizados para la expresión directa de proteínas recombinantes en las células inmortalizadas de esta invención. El vector preferiblemente puede codificar por cualquier proteína recombinante capaz de expresar en células de fibroblastos de embrión de pollo, incluyendo pero no limitándose a, proteínas víricas, incluyendo la transcriptasa reversa y/o proteínas estructurales virales. Los ejemplos de vectores para producir proteínas recombinantes en una célula incluyendo vectores retrovirales para producir proteínas supresoras de tumores, o proteínas estructurales virales como aquellas reveladas en Givol, et al. Oncogene 11(12):2609-2618, 1995, Givol;et al. Cell Growth & Differentiation 5(4):419-429, 1994, Akiyama, et al. Virology 203(2):211-220, 1994 y Boyer et al. Oncogene 20:457-66,
1993.

Las células de esta invención pueden servir como sustrato para expresar virus recombinantes, incluyendo, pero no limitándose a retrovirus recombinantes. Las células de esta invención pueden servir para empaquetar líneas celulares para virus modificados genéticamente útiles para la terapia génica, o similares. Las construcciones y métodos para utilizar una línea celular particular como el empaquetamiento de líneas celulares son conocidos en el campo. Por ejemplo, Boerkoel, et al. (Virology 195(2).669-79, 1993) revela métodos para el empaquetamiento de virus utilizando fibroblastos primarios de embriones de pollo como línea celular empaquetadora. Éstos son los mismos métodos que pueden ser utilizados para empaquetar virus en las células de esta invención.

Puesto que la mayoría de líneas celulares de aves y todas las células transformadas de aves así como prácticamente todas las líneas celulares transformadas de roedor contienen todas ellas contaminantes virales como virus endógenos o producen proteínas virales, por esto, éstas no son apropiadas para la producción de vacunas animales o humanas. Las células no pueden ser utilizadas para producir proteínas recombinantes porque los contaminantes endógenos pueden contaminar preparaciones de proteínas recombinantes purificadas. Favorablemente, las células de esta invención proporcionan una alternativa adecuada a estos problemas.

Las células de esta invención pueden también servir como sustrato para el crecimiento de virus de otras células. Estas otras células incluyen células primarias, o células cultivadas que muestran un crecimiento perfeccionado o larga vida en el cultivo en presencia de otras células o en la presencia de una matriz extracelular proteica como colágenos, lamininas, y similares. La presente invención describe que las células deben ser mezcladas con virus y después mezcladas con células de esta invención en una proporción de alrededor de 1:5 células a 1:20 células y más preferiblemente en un coeficiente de 1.10 (1 célula a 10 células de esta invención). Las células mezcladas son colocadas en el cultivo. La presente invención también describe que las células pueden ser mezcladas con virus y colocadas en la superficie de las células inmortalizadas de esta invención que están aún unidas a la superficie de un cultivo de tejidos. Las células de esta invención sirven como soporte a otras células y, sin variar el límite del alcance de esta invención, las células de esta invención pueden aportar factores de crecimiento y similares así como los componentes de la matriz extracelular, y similares, para dar apoyo a las otras células mientras éstas están produciendo virus. El ejemplo 9 proporciona un ejemplo del uso de las células de esta invención como sustrato
celular.

Todas las referencias aquí citadas son expresamente incorporadas por referencia en la revelación. Algunas partes de esta invención serán discutidas en detalle y las referencias han sido hechas para posibles variaciones dentro del campo de esta invención. Hay una gran variedad de técnicas alternativas y procedimientos adecuados para éstos, de los cuáles los expertos en el arte permitirían una de las sucesivas ejecuciones de la invención.

Ejemplo 1 Preparación de un ejemplo de vector de expresión p53

El plásmido pJFNII (5436 pb) se construyó partiendo del vector pBluescript SK (Stratagene, La Jolla, CA). El sitio de clonaje múltiple y el gen lacZ se quitaron utilizando Pvull. El fragmento 2513 bp del vector fue tratado con fosfatasa alcalina de intestino de ternera. El fragmento fue después tratado con EDTA, incubado a 65ºC y extraído con fenol/cloroformo seguido de la precipitación con etanol. El plásmido pRSVneo (Gorman, C., et al. Science 221:551-553, 1983) fue digerido con Bam H1 y NdeI. El fragmento se trató con el fragmento Klenow de la DNA polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA) y se ligó el extremo romo con el fragmento del vector de 2513 pb. Mediante el aislamiento de este clon, el vector se digerió con EcoRI, se trató con un fragmento Klenow y fue re-ligado. Esta digestión elimina el sitio EcoRI de la región promotora. El plásmido se designó como pJFNII (mirar Figura 1).

pJFNII fue cortado con BamH1 en el sitio del vector a 1000pb corriente abajo de la señal de poliadenilación SV40 utilizada por el gen que codifica la resistencia de neomicina. El promotor de metalotioneina de pollo se obtuvo utilizando PCR. Los siguientes cebadores se utilizaron en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) para obtener el promotor de metalotioneina:

Cebador izquierdo:

5' CGAAGATCTCTCAGCACGGCCCCACGCT 3' (ID de SEC Nº: 3)

\newpage

Cebador derecho:

5' CGAAGATCTTTATTCTCGAGATATCGAATTCT

CGGGTGGGCTCGTAGCAGT 3' (ID de SEC Nº: 4)

En estos experimentos la plantilla utilizada para la reacción del PCR fue el plásmido pCBcMTlacZ. El promotor inducible de metalotioneina de pollo (Fernando y Andrés, Gene 81:177-183, 1989) en el plásmido pCBcMtlacZ se obtuvo por el Dr. Ann Gibbins (University of Guelph, Guelf, Ontario, Canada). Estos expertos en la materia contemplaran que los promotores pueden ser también identificados a partir de librerías de expresión de genes para obtener el promotor de otras especies incluyendo el pollo. Los cebadores se adquirieron en IDT (Coralville, IA). El cebador derecho e izquierdo fueron diseñados para incluir sitios BglII. La amplificación utilizando estos cebadores generaron el promotor de metalotioneina contenido dentro del fragmento de ácido nucleico que corresponde a ID de SEC Nº: 2.

La secuencia preferida del promotor de metalotioneina de pollo (SEQ ID NO: 2) es: 5'

1

Este promotor contiene tres elementos reguladores metálicos principales, regiones GC-box y una TATA box. Los elementos metálicos reguladores unen el metal e inducen el gen de metalotioneina de pollo corriente abajo. El fragmento de metalotioneina amplificada, que incorpora la secuencia final BglI desde los cebadores de izquierda a derecha, se ligó a pJFNII mediante BamHI. El clon del vector identificado de este enlace se seleccionó por su habilidad de conferir resistencia a la neomicina. El clon se llamó pJFNIIcMTD y está formado de alrededor de 6088 pb. El vector incluyó múltiples sitios de clonaje incluyendo EcoRI, EcoRV y XhoI. Una señal de poliadenilación dentro del primer derecho permite la expresión eficiente de las secuencias de DNA que no tienen esta señal.

CDNA p53 de pollo (ID de SEC Nº: 1) proporcionó un injerto de EcoRI de T. Soussi (GenBank Acceso #X13057) que se incorporó en pJFNIIcMTD en el sitio de restricción endonucleasa EcoRI de múltiple clonaje. La secuencia de cDNA (Soussi et al, Nucl. Acids Res. 16:11383,1988) contiene 64 pb de la región no translocada 5'(UTR), un marco de lectura abierto de 1101 pb que codifican a 367 amino ácidos moléculas de p53, a 390 3'UTR y a un pequeño poly-A. El p53 de pollo tiene alrededor un 47% de homología al homólogo humano. Se obtuvo un fragmento de cDNA p53 de pollo que contiene EcoRI y la construcción cMT (metalotioneina)/SK se digerió con EcoRI. El injerto de cDNA p53 de pollo se añadió al sitio de EcoRI. Se identificaron los clones que contienen el injerto de p53 en el sentido para adelante. La construcción se transfectó en células Blue de E. coli XL-1 (Stratagene) y creció en caldo LB más ampicilina toda la noche. El plásmido se aisló de la preparación de maxi-plásmido por el método de Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor NY, 1989). Se purificó el plásmido de DNA dos veces por centrifugación con CsCl_{2} precedente a la transfección.

Ejemplo 2 Aislamiento de células primarias de tejidos intactos

Las líneas embrionarias SPAFAS de embriones de pollo (HyVac, Abel, LA) fueron la fuente primaria de las células primarias para estos experimentos. Los huevos y sus capas fueron declarados por el proveedor como negativos al virus de la influenza de aves (Tipo A), reoVirus de aves, adenovirus de aves (Grupos I-III); virus de la encefalomielitis del ave, viruela del ave de corral, virus de Newcastle, Paramyxovirus (tipo 2), Mycoplasma, Salmonella y otros agentes infecciosos conocidos por infectar aves de corral. Los huevos fertilizados se incubaron en un incubador aislado esterilizado y los embriones de 10 días y de 19 días de vida se procesaron para establecer cultivos primarios.

Tres embriones SPAFAS de 10 días de vida se usaron para obtener células de corazón, hígado, piel, músculo (pechuga y muslo). Embriones de 19 días de vida fueron también utilizados para establecer cultivos primarios de piel. Los tejidos embrionarios se disociaron utilizando una solución de tripsina/EDTA, y se colocaron en un medio DMEM (Gibco) que contenía 10% de suero fetal de ternero (Gibco), y 1% antibiótico/antimicótico (Gibco) y 2 mM de L-glutamina (Gibco). La suspensión de células disociadas se recogió en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene el 10% ml de suero fetal bovino para inactivar la tripsina y se centrifugó a 700 x g durante 10 minutos.

Las células se resuspendieron en 10 ml de medio Dulbecco Eagle modificado enriquecido con 36 \mug/ml de insulina (Sigma), 1,6 \mug/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 2 mM de L-glutamina, 10% de suero fetal de ternero, solución al 1% de antibiótico/antimicótico y se pipetearon en 4-5 placas de 100 mm^{2} con alrededor de 1 x 10^{6} células/placa y se incubaron a 40,5ºC en 5% de CO_{2}, 95% de aire. Después de 24 horas de incubación, el medio se cambió.

Los cultivos fueron capaces de crecer (5 días) y se quitaron de las placas utilizando una solución de tripsina/EDTA (0,05% de tripsina y 0,02% de ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) en PBS) y colocado en el segundo paso. Los stocks de células se congelaron en nitrógeno líquido.

Ejemplo 3 Transfección del promotor p53/metalotioneina en las células

Las células primarias de piel de pollo de embriones ELL-O de 19 días de vida se transformaron dentro del segundo paso. Las células fueron colocadas a una densidad de 5 x 10^{5} células en 100 mm^{2} de placas en suero fetal de ternera certificado al 10% DMEM más alta concentración de glucosa y enriquecido con 1,6 \mug/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO) 36 \mug/ml de insulina (Sigma) y antibióticos. Las células crecieron durante toda la noche para estabilizar los cultivos y volver a alimentar la siguiente mañana con 9 ml de medio y transfectado utilizando lipofectamina Transit II usando las direcciones del empaquetamiento (Pan vera Corporation, Madison, WI) Cada transfección utilizó 10 \mug de la construcción purificada p53. Las células fueron transfectadas durante 5 horas y el medio se cambió utilizando un antibiótico selectivo G418 (Sigma, St. Louis, MO) a 600 \mug/ml. Las células transfectadas se colocaron en un medio selectivo hasta que el foco se desarrolló (normalmente 4 = 10 días) y el foco clonado se seleccionó y se propagó.

Las células crecieron durante 2-3 pasadas para generar un foco de G418 (60 \mug/ml) de células resistentes (sobre 10^{3}-10^{4}). Las células se dividieron inicialmente cuando necesitaban 5 x 10^{5} células/100 mm^{2} de la placa para evitar influencias de la densidad de la placa por los efectos de la expresión del p53. Las células control no transfectadas se transfectaron falsamente con un plásmido control. Las células control envejecieron y murieron en el paso 12. Las células crecieron en 50 \muM de medio selectivo de ZnSO_{4} durante dos semanas hasta que establemente las células transfectadas empezaron a proliferar. Varias placas de cultivos control no recibieron sulfato de Zinc (no inducción del promotor de metalotioneina). Después de dos semanas de alimentación (cuatro semanas post-transfección) empezaron a aparecer fenotípicamente focos distintos de células que estaban creciendo más rápidamente que las células vecinas. Después de las alimentaciones adicionales, uno de los focos de las células de la piel transfectadas demostraron rápidamente el crecimiento de las células. Aproximadamente 5 x 10^{4} células/foco se quitaron de la placa de cultivo utilizando un anillo de clonaje. Estas células se transfirieron a una placa de 6 pocillos. Dos placas de células confluentes cercanas crecidas en presencia de Zn fueron divididas en seis placas de 2 x 10^{5} células/placa con la adición de 50 \muM de zinc. Las células de la piel se propagaron cada 3-4 días en la presencia de zinc a 1 x 10^{5} células/cm^{2} hasta el paso 17. Existe una disminución en la duplicación de la población en el paso 20-22 y más tarde incrementa otra vez alrededor de 0,7 a 1,0 duplicaciones de población por día. Se obtuvieron focos de células también de células de la piel transfectadas aisladas de embriones de pollo de 10 días de vida. Los resultados de este experimento fueron sorprendentes porque p53 es bien conocido en la literatura como un supresor de tumorigénesis y como regulador del crecimiento. Los cultivos duplicados de células de la piel se transfectaron con una construcción idéntica que contiene un fragmento del gen antisentido p53. las células transfectadas con esta construcción no experimentaron inmortalización.

Los cultivos congelados de células primarias de músculo cardíaco y de músculo de pechuga, se descongelaron y pasaron. Se transfectaron 8 x 10^{6} células (40-70% confluencia) de cada tipo de célula con el sentido de la construcción p53 con el compuesto poliamina, lipofectamina Transit II (Pan Vera Corporation, Madison, WI) en el paso 2. Las células no transfectadas se mantuvieron como control de crecimiento positivo y como control de muerte celular negativo (cultivos con adición de G418). Para la transfección, se añadieron 2-12 \mul/\mug de DNA en 100 \mul de medio libre de serum (RPMI 1640, Life Technologies). La mezcla se agitó enérgicamente y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se diluyeron 1-3 \mug de DNA en el reactivo Transit II abastecido por el fabricante y incubado durante 6 horas. Las células se lavaron y se realimentaron. Después de un periodo de 24 hr de recuperación, las células de corazón y de pechuga se dividieron en 4 placas cada uno a 3 x 10^{5} células y colocados bajo una selección G418 y una inducción por Zn. Los focos de células se identificaron en los tests de cultivos. No se obtuvieron focos en las placas control recibiendo 50 \muM de Zinc.

Ejemplo 4 Ensayar las células que contienen la construcción p53 para contaminantes víricos

Las células se ensayaron por su actividad de transcriptasa reversa. 1 x 10^{6} células de cultivos de crecimiento rápido se aislaron en 4 ml de medio. El medio se digerió mediante sucesivos congelamientos y descongelamientos a -80ºC para lisar las células. El medio con células lisadas fue expuesto a un gradiente por encima del 10% de glicerol. El gradiente giró durante 60 minutos a 40.000 rpm utilizando un rotor SW40 (Beckman Instruments, Palo Alto, CA). Las partículas de virus, si habían, sedimentaron. El medio fue descartado y el sedimento se resuspendió en 20 \mul de Nonidet P-40 (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO).

Un tubo eppendorf fue calentado a 41ºC. Se añadieron 5 \mul de muestra a 45 \mul de mezcla de transcriptasa reversa que contiene 45 mM Tris, pH 7,8, 2 mM 2-\beta mercaptoetanol, 2 mM acetato de manganeso, 0,1% Triton X-100, 10 \muM de cada uno de los siguientes compuestos dATP, dCTP, dGTP (Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN), 2,4 \mug de polyA (Sigma), 60 ng de cebador dT 12-19 (Pharmacia), 0,4 \muCi/reacción ^{3}H timidina trifosfato (15.000 a 28.000 actividad cpm/pmoles, Amersham).

La reacción se incubó durante una hora a 41ºC. Se utilizó un control negativo de 5 \mul de ddH_{2}O y 45 \mul de la mezcla. Se incluyeron dos controles positivos conocidos en el ensayo. El ensayo se paró mediante la adición de 1ml de ácido tricloroacético al 10% (TCA, Columbus Chemical Industries, Inc, Columbus, WI) La mezcla se filtró mediante un prefiltro de Whatman GF/C de vidrio de 0,45 micras. Se hicieron varios lavados utilizando 5% de TCA. El filtro se transfirió a un vial de centelleo que contenía 5 ml de fluido de centelleo. Las muestras se contaron en un contador de Beckman Instruments Scintillation utilizando 050 a 600 de poro. Un incremento de tres veces por encima del control negativo se consideró positivo.

Los cultivos primarios dieron negativos como daban otras células utilizadas en esta invención. Más adelante se vio la información en los ensayos de la transcriptasa reversa. (Crittenden, et al. Virology 57:128-138, 1974)

Ejemplo 5 Identificación de células inmortalizadas

Las células se caracterizaron como inmortales cuando experimentaban más de 25 pasos en cultivos tisulares mediante la introducción de la metalotioneina/p53 en las células y experimentaron de un 0,6 a 1,5 de duplicación de la población por día. Esta proporción se comparó con controles no tratados en fases avanzadas (esto es, células que no habían recibido el promotor de p53/metalotioneina) que tenían tasas de duplicación de población de 0,1 a 0,2 por día. Las células de la piel que recibieron el promotor de p53/metalotioneina están actualmente en la pasada 70 mediante la introducción de un gen en las células, están actualmente en el paso 70. Se identificaron más de veinte clones inmortalizados en el procedimiento de transfección. Las células eran morfológicamente normales y su contacto estaba inhibido. Las células del músculo de pechuga están actualmente en el paso 52, son morfológicamente normales, y su crecimiento se inhibe por el contacto y actualmente tienen un porcentaje de duplicación de población de 0,72. Se seleccionaron 13 clones para su análisis. Las células de corazón están actualmente en el paso 20, son morfológicamente normales, su contacto está inhibido, y tienen un aceptable porcentaje de duplicación de la población del 0,6. Varios clones tienen unas tasas de duplicación de población de entre 0,8 a 1,1. Se seleccionaron más de 10 clones para un estudio más profundo.

Ejemplo 6 Ensayo de formación de colonias en Agarosa blanda para ensayar el potencial tumorigénico de las células

Para probar el potencial tumorigénico, las células transfectadas con p53/metalotioneina se colocaron en agar blando para observar su posible crecimiento. La base de agarosa blanda se hizo mezclando 12 ml de una solución de agarosa al 2% (que había sido previamente autoclavada y enfriada a 56ºC) en 21,6 ml de medio enriquecido de McCoy's 5A [BRL/Gibco, 120 ml de suero fetal de ternero (inactivado por calor, 5 ml de piruvato de Na (2,2% en stock), 1 ml de L-serina (21 mg/ml stock), 5 ml de L-glutamina (200 mM stock), 12,5 ml Hepes (1 mM stock)], 5,9 ml Asparagina (4,4 mg/ml stock filtrado esterilizado). Se virtieron siete ml de agarosa templada sobre una placa de cultivo de tejidos de 100 mm^{2} y se facilitó la solidificación a temperatura ambiente en el cultivo de tejidos durante 1 hora.

Las células se eliminaron de los cultivos de crecimiento activo (40 a 70% confluente) mediante la tripsinización para lograr una suspensión simple de células en medio DMEM fresco, que contiene suero fetal de ternero al 10%. (con L-glutamina y antibióticos-antimicóticos). Se añadieron 1 x 10^{6} células aproximadamente a 4.2 ml de medio DMEM que contenía suero fetal de ternero al 10%, 0,75 ml de agarosa al 1%, y 50 \mul de 2\beta-mercaptoetanol. Se necesitó mucho cuidado para tener seguridad de que el medio de agarosa estaba a 42ºC antes de añadir las células. Rápidamente, 5 ml de la suspensión celular anterior fueron revestidas encima de las placas de agarosa.

Las células se dejaron crecer a 37ºC, con una atmósfera al 5% de CO_{2} y 95% de aire, y se observó durante 35 días. Las placas duplicadas se tiñeron con clorito de 3 p-nitrofenil-5-fenil tetrazolio (tinte INT) y se examinaron los días 0, 5, 10, 15, 20, 30 y 35 para la formación de colonias y el crecimiento. Todas las colonias de más de 60 \mum fueron consideradas positivas.

Todas las células ensayadas dieron negativas. Toda la información relacionada con el ensayo en agar blando se puede adquirir de Hamburger, et al. Prog. Clin. Biol. Res. 48:pps 43, 135, 179, 1980.

Ejemplo 7 Tumorgenicidad de las células inmortalizadas

Siguiendo la guía descrita en Protocolo de Consumo Animal de la Universidad de Minnesota (protocol #950300-1, Marzo 1995-Diciembre 1996), las células fueron inyectadas a animales de experimentación para determinar si son tumorigénicas o no. Para probar el potencial tumorigénico de p53 del pollo bajo el control del promotor de metalotioneina de pollo, las células inmortalizadas fueron inyectadas a los pollos.

Activamente las células en crecimiento se eliminaron de las placas de cultivos celulares y se inyectaron en seis líneas de adultos de pollos SPAFAS. Las inyecciones subcutáneas de 4 x 10^{6} células fueron colocadas en las alas de los pollos. Los sitios de inyección fueron examinados semanalmente durante 3-5 meses. No se observaron tumores en el lugar de inyección para ninguna de las células transfectadas (piel, corazón y músculo) producidas hasta ese momento y todos los animales permanecieron sanos.

Ejemplo 8 Propagación de virus en líneas celulares con p53/metalotioneina

Estas células son ensayadas por su capacidad por sostener la producción de virus. Se infectaron 2,5 x 10^{8} células que contienen el promotor p53 de metalotioneina, con cepas WSS-Reo 1733 Reovirus que tienen una cantidad de 8,2 TCID_{50}/ml. Las células fueron infectadas mediante una infección múltiple de 0,005, 0,001 ó 0,0005 partículas víricas infecciosas/célula. Las células infectadas se dejaron crecer en botellas cilíndricas y ensayadas a 48, 64 y 72 horas después de la infección y se demostró el crecimiento productivo viral.

Las células fueron también sembradas en botellas cilíndricas a 2,0 x 10^{4} células/cm^{2}. Las botellas cilíndricas se incubaron a 37ºC durante 8 días en un set cilíndrico rack de 0,4 a 0,5 RPM. Las células fueron infectadas con Herpesvirus de pavos (virus HVT, cepa R2/23). Las células fueron infectadas a una multiplicidad de infección de 0,001 cuando había 1,33 x 10^{7} células en las botellas cilíndricas. Las células fueron cultivadas de 90 a 96 horas aproximadamente cuando cerca del 40% de la monocapa daba la evidencia de citopatología asociada con infección. Las células se dejaron crecer y se mantuvieron en DMEM con 10% de Hyclone y FBS \gamma-irradiado, 2,5 g/L TPB, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml Penicilina, 0.10 mg/ml Estreptomicina, 0,25 \mug/ml Amfotericina B, 1,6 mg/L insulina y 1,6 mg/L Transferrina. Los estudios iniciales demostraron que las células producían alrededor de 1,4 x 10^{4} pfu/ml.

Las células fueron también capaces de mantener la replicación del virus de la enfermedad de Marek.

Experimento 9

Uso de las células de piel transfectadas como células sustrato

Las células de esta invención son útiles como sustrato para albergar la replicación de virus de células primarias. En estos experimentos las células de piel inmortalizadas p53 son mezcladas con células primarias. En un estudio las células primarias se infectaron y se mezclaron con células inmortalizadas y se colocaron en un cultivo y en otro estudio las células primarias fueron infectadas y colocadas sobre las células inmortalizadas dónde las células inmortalizadas están aún posicionadas como un césped en el matraz de cultivo tisular. En un ejemplo el virus es el virus del síndrome Egg Drop y las células primarias son células primarias embrionarias de hígado de pollo. En el segundo ejemplo las células primarias son células endoteliales, preferiblemente células endoteliales de riñón, y el virus es un virus infeccioso de bronquitis. El índice preferible de células primarias entre células inmortalizadas está alrededor de 1:5, hasta 1:20 y más, preferiblemente alrededor de 1:10. La concentración de virus de las células primarias en crecimiento en la población celular mixta es superior que la concentración de virus en el cultivo de células primarias solas. Las células inmortalizadas permiten a las células primarias ser utilizadas para la propagación de virus bajo condiciones comerciales.

Cuando las realizaciones detalladas en esta invención hayan sido descritos con detalle, quedará claro para aquellos expertos en el campo que estos temas son ejemplificantes más que limitantes, y el verdadero alcance de la invención es aquél definido en las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Un método para transformar las células primarias de pollo comprendiendo los siguientes pasos:

(a): situar el ácido nucleico que codifica por p53 bajo el control de un promotor de metalotioneina en un vector génico capaz de dirigir la expresión del p53;

(b): introducir el vector génico en las células primarias de pollo; y

(c): seleccionar los focos de células con 0,6 hasta 1,5 duplicaciones de la población por día, dónde las células son transcriptasa reversa negativa y no tumorigénicas.

2. El método de la reivindicación 1, en dónde las células son células de la piel, células del músculo de pechuga y células musculares cardíacas y fibroblastos.

3. Un método para propagar los virus que comprende los pasos:

(a): poner en contacto como mínimo una partícula infecciosa de virus con al menos una célula de un cultivo celular inmortalizado de pollo, en dónde las células del cultivo contienen el vector génico expresando el p53 bajo el control de un promotor de metalotioneina; y

(b): recoger los virus producidos por las células.

4. El método de la reivindicación 3, en dónde los virus son Reovirus, Herpesvirus de pavos o virus de la viruela de aves.

5. Un método pata la propagación de virus comprendiendo los siguientes pasos:

(a): poner en contacto como mínimo una partícula infecciosa de virus con una célula primaria;

(b): hacer crecer las células primarias con células inmortalizadas de pollo que contienen un vector génico que expresa el p53 bajo el control de un promotor de metalotioneina en un cultivo celular; y

(c): recoger los virus producidos del cultivo celular.

6. Las células de pollo inmortalizadas no transformadas contienen el p53 bajo el control de un promotor de metalotioneina y contienen como mínimo un vector capaz de dirigir la expresión de la proteína recombinante en las células.

7. Las células de la reivindicación 6, en dónde el vector es un vector retroviral.

8. Las células de la reivindicación 6 ó 7 expresando la proteína recombinante.

9. Las células de cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 8, en dónde el vector codifica como mínimo una porción del virus recombinante.