SA97180647B1 - طريقة لتخليد الخلايا cell immortalization - Google Patents
طريقة لتخليد الخلايا cell immortalization Download PDFInfo
- Publication number
- SA97180647B1 SA97180647B1 SA97180647A SA97180647A SA97180647B1 SA 97180647 B1 SA97180647 B1 SA 97180647B1 SA 97180647 A SA97180647 A SA 97180647A SA 97180647 A SA97180647 A SA 97180647A SA 97180647 B1 SA97180647 B1 SA 97180647B1
- Authority
- SA
- Saudi Arabia
- Prior art keywords
- cells
- virus
- cell
- metallothionein
- vector
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 44
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 97
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 claims abstract description 56
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 claims abstract description 55
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims abstract description 26
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 284
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 56
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 37
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 24
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 20
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 10
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 7
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 claims description 4
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 claims description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims 3
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 claims 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims 1
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 11
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 abstract description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 28
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 18
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 12
- KUUVQVSHGLHAKZ-UHFFFAOYSA-N thionine Chemical compound C=1C=CC=CSC=CC=1 KUUVQVSHGLHAKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 9
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 9
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 7
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 7
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 4
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 4
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 3
- 241001516406 Avian orthoreovirus Species 0.000 description 3
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001133064 Gallus gallus Metallothionein Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 3
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002976 pectoralis muscle Anatomy 0.000 description 3
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 2
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 241001223089 Tremovirus A Species 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZEDFYFVAXSGTGU-RPZXMPESSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZEDFYFVAXSGTGU-RPZXMPESSA-N 0.000 description 1
- 101150080796 053 gene Proteins 0.000 description 1
- QBPPRVHXOZRESW-UHFFFAOYSA-N 1,4,7,10-tetraazacyclododecane Chemical compound C1CNCCNCCNCCN1 QBPPRVHXOZRESW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000701915 Feline panleukopenia virus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 201000008197 Laryngitis Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000337661 Parada Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 208000008104 Reoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000208445 Sarcodes Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 240000006909 Tilia x europaea Species 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004135 animal tissue culture Methods 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000012820 cell cycle checkpoint Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 229910001919 chlorite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052619 chlorite group Inorganic materials 0.000 description 1
- QBWCMBCROVPCKQ-UHFFFAOYSA-N chlorous acid Chemical compound OCl=O QBWCMBCROVPCKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- SSJJWVREPZVNBF-DGXVIIAXSA-N dG10 Chemical compound C1=NC(C(NC(N)=N2)=O)=C2N1[C@H](O[C@@H]1COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)CO)C[C@@H]1OP(O)(=O)OC[C@@H](O1)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 SSJJWVREPZVNBF-DGXVIIAXSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003475 lamination Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- UOGMEBQRZBEZQT-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);diacetate Chemical compound [Mn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UOGMEBQRZBEZQT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 101150024228 mdm2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 230000028617 response to DNA damage stimulus Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000225 tumor suppressor protein Substances 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16351—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
الملخص: يتعلق الاختراع الحالي بادخال p53 تحت سيطرة معزز ثيونين فلزي metallothionein في خلايا اوليه وذلك لانتاج خطوط خلية مخلدةimmortalized cell lines . وتعتبر الخلايا مفيدة باعتبارها ركائز لتكاثر الفيروس، وباعتبارها مصادر خالية من الملوثات وذلك لانتاج البروتين المأشوب recombinant protein ، ولانتاج الفيروس المأشوب recombinant virus وباعتبارها ركائز خلية لتدعيم الخلايا الاولية وتحسيننتاج الفيروس أثناء تكاثر الفيروس.
Description
طريقة لتخليد الخلايا cell immortalization الوصف الكامل
خلفية الاختراع
يتعلق الاختراع الحالي بمجال alas الخلية cell immortalization واستعمال الخلايا كمستودعات
لتكاثر الفيروس وقدرة الملوثات البروتين المأشوب recombinant protein . وعلى وجه
الخصوص يتعلق هذا الاختراع باستخدام بروتين 053 تحت تحكم معزز قابل للحث لانتاج خلايا
. immortalized cell مخلدة ©
ان العديد من الفيروسات الطيرية avian viruses الخاصة بالطيور التي يتم استخدامها لانتاج
لقاحات طيرية وحيوانية ASD avian and animal vaccines في بيض دجاج حاوياً أجنة أو
مزارع خلية ليفية داجنة اولية . وتتضمن أمثلة اللقاحات الحيوانية المصنوعة باستخدام ركائز
الدجاج لقاحات الاعتلال الكلبي بالنسبة للكلاب ؛ لقاحات مرض ماريك Marek's بالنسبة للديوك ٠ الرومي ؛ الفيروس الريوي Reovirus ؛ ولقاحات السرطان الظهاري Fowl Pox ومرض
الصرة المعدي Infectious بالنسبة للطيور . وقد تكون مزارع الخلية الاولية متنوعة بدرجة
عالية وتعرض خطر التلوث بواسطة فيروسات داخلية المنشأ endogenous viruses ؛ الفطريات
المصورية mycoplasmas ؛ وما شابه . وتعتبر مصادر الانسجة الحيوانية التي يتم Saf
المزارع الخلوية الاولية منها محدودة في الغالب وغالية نتيجة الحاجة للاحتفاظ بالسلالات ١ الحيوانية في حالة خالية من Age المرض .
v
وهناك dala لتطوير منهجية قابلية اعادة الانتاج لتوليد ركائز خلية طيرية مخلدة خالية من
الفيروس تناسب استعمالها في تصنيع منتجات اللقاح الحيواني . وان اتاحية خطوط الخلية
المخلدة immortalized (اي الدائمة) المميزة جيداً لها فائدة القضاء على أو تقليل الاعتمادية
على مزارع النسيج الحيواني الاولي التي تفتقد إلى التحكم من ناحية الجودة . وفي صناعة
© اللقاح؛ فان الشروط التنظيمية لأمان المنتج ؛ والانسجام الافضل للممارسة الحالية لركائز لقاح
الخلية الاولية التي اساسها البيض . ويجب على شركات انتاج اللقاح تحديد خطوط الخلايا
المنسجمة لانتاج الفيروس وذلك للوفاء بالشروط التنظيمية للسماح للشركات بنشر لقاحاتها . وان
واجب مناع كل من منتجات اللقاح البشرية والحيوانية في كل من الولايات المتحدة والخارج
اظهار ان ركائز لقاحها خالية من الملوثات . وان ظهور طريقة قابلة لاعادة اولية سوف يمكن ٠ صناع المنتجات البيولوجية من التحكم بصورة افضل في عمليات الانتاج وزيادة كل من امان
المنتج وتجانسه مع تقليل التكلفة لاقصى درجة .
وصف عام للاختراع
ان الاختراع الحالي يتعلق بطريقة لتحويل الخلايا والخلايا المنتجة بواسطة تقديم حمض نووي
nucleic acid ترميز 053 تحت سيطرة معزز ثيونين الفلزي metallothionein في الخلايا ١ وانتقاء الخلايا ذات الخصائص المخلدة immortalized .
وفي احد مظاهر الاختراع يتم الكشف عن طريقة لتحويل خلايا غير قارضة اولية aah
الخطوات التالية : وضع الحمض النووي ترميز 053 تحت سيطرة معزز ثيونين فلزي
metallothionein في ناقل جينة له القدرة على توجيه قدرة الملوثات 053 ؛ تقديم ناقل الجينة
في خلايا غير قارضة اولية ؛ انتقاء بؤرات الخلايا ذات مرات تضاعف التجمع من حوالي ٠,6 ٠ الى ٠,9 في اليوم ؛ حيث تكون الخلايا سالبة انزيم انتساخ عكسي وغير مولدة للأورام . وفي
¢ احد نماذج الاختراع تكون الخلايا غير القارضة الأولية عباره عن خلايا مشتقة من الطيور وفي نموذج اخر تكون مشتقة من البشر . ويمكن ان تكون الخلايا الأولية المستخدمة في هذا الاختراع تتكون من أي عدد من الأنسجة وفي نموذج مفضل يمكن الحصول على الخلايا من نسيج جلدي skin tissue المخلدة؛ أو نسيج diac الصدر breast muscle tissue و/أو نسيج © عضلة القلب heart muscle tissue .
وفي مظهر آخر للاختر | 2 يتم الكشف عن الخلايا ؛ و هذه الخلايا عباره عن خلايا ليفية مخلدة تحتوي على ناقل جينات له القدرة على قدرة الملوثات p33 تحت سيطرة معزز ثيونين فلزي metallothionein . وفي احد النماذج تكون الخلايا مشتقة من الطيور . ويتعلق الاختراع الحالي ايضا بطريقة لزرع فيروس تتضمن الخطوات التالية :- ربط جزيء
٠ فيروس معدي واحد على الاقل بخلية واحدة على الاقل من مزرعة خلية مخلدة ؛ Cua تحتوي خلايا المزرعة على ناقل جينات له القدرة على توجيه قدرة الملوثات p53 تحت سيطرة معزز ثيونين فلزي metallothionein ؛ تجميع الفيروس الذي تنتجه الخلايا . وفي احد النماذج يكون الفيروس عباره عن الفيروس الريوي ؛ وفي نموذج آخر عباره عن HVT وفي نمودج ثالث عباره عن فيروس سرطان ظهاري .
Ve وفي مظهر Lad AT لهذا الاختراع يتم الكشف عن طريقة لتكاثر فيروس تتضمن الخطوات التالية : ربط جزيء فيروس معدي واحد على الأقل بخلية اولية ¢ زراعة الخلايا الأولية مع خلايا مخلدة immortalized cell تحتوي على ناقل جينات يقوم بقدرة الملوثات 53م تحت سيطرة معزز ثيونين فلزي metallothionein في مزرعة الخلية ؛ وتجميع الفيروس المنتج من مزرعة الخلية .
© وكذلك ايضاً يتعلق الاختراع بخلايا مخلدة immortalized cell ؛ غير متحولة تحتوي على p53 تحت سيطرة معزز ثيونين فلزي metallothionein وتحتوي على ناقل واحد على الاقل له القدره على توجيه قدرة الملوثات البروتين المأشوب في الخلايا . وفي احد النماذج تقوم الخلايا بقدرة الملوثات للبروتين المأشوب recombinant virus . وفي نموذج JA) يرمز الناقل لجبزء 0 على الاقل من الفيروس المأشوب recombinant virus . وفي نموذج اخر كذلك يكون الناقل عباره عن ناقل فيروس ارتدادي retroviral . شرح مختصر Gla pu ll شكل ١ عباره عن تخطيط لناقل 1 .؛ المستخدم في النموذج المفضل للاختراع الحالي . شكل ؟ عباره عن تخطيط لناقل 1701101410م ؛ المستخدم في نموذج مفضل للاختراع الحالي. ٠ الوصف التفصيلي ان هناك حاجة إلى طريقة لتخليد الخلايا الأولية بشكل يقبل إعادة الإنتاج . ولتشكيل خطوط خلية cell lines دائمة . وان تطور تكنولوجيات تشكيل خطوط خلية متميزة تساعد في المضاعفة الفيروسية سوف يسمح للشركات بتوفير الوقت في التشكيل المتكرر للخلايا الاولية ويخفف من المشكلات المصحوبة بالملوثات contaminants واللاتجانسات inconsistencies التي توجد بين فئات البيض . وان خطوط الخلية المخلدة immortalized المحددة للكشف عن تكاثر الفيروس تقلل من التكاليف المصاحبة لاختبار تحكم النوعية للمنتجات النهائية . وهذا الاختراع يكشف عن تخليد الخلايا الحيوانية غير القارضة الاولية non-rodent animal « وخصوصاً الخلايا الطيرية والبشرية وذلك باستعمال بروتين 053 مأشوب تحت سيطرة معزز ثيونين فلزي metallothionein قابل Call . وتعد الخلايا مفيدة بالنسبة لزراعة سلالات فيروس
;
وقدرة الملوثات لبروتينات الفيروس وتجميع خطوط الخلية لانتاج الفيروس المأشوب recombinant virus
وفي الغالب المعتاد يتم اشتقاق مزارع الخلية الاولية من خلايا معزولة جديدة من أنسجة سليمة ¢
وغالباً ما تكون هذه الخلايا مصدراً جيداً للمادة الخالية من الفيروس ومناسبة باعتبارها خلايا
© حاضنة وذلك لمضاعفة الفيروس . ودائماً لا تكون الخلايا الأولية ذات كفاءة في مضاعفة
الفيروس وتقوم الخلايا الحيوانية الاولية بعرض مدى حياة محدود في المزرعة ؛ وفي النهاية
تخضع للشيخوخة . وفي مرحلة الشيخوخة تتوقف الخلايا عن الانقسام وتموت مع مرور الزمن.
وان قدرة الخلايا على الانقسام في المزرعة تعتمد على وسائط متعددة تشمل نوع اصل الخلية
jee النسيج عند وضعه في المزرعة . واما الخلايا التي تخضع للشيخوخة فلا يمكن الاحتفاظ ٠ بها في المزرعة لمدد زمنية طويلة وبالتالي تعتبر حاضنات غير قابلة لاعادة الانتاج بالنسبة
لتكاثر سلالات الفيروس . وتخضع الخلايا بوجه عام بين YY الى YT امرار قبل الومسول
لمرحلة الشيخوخة . ومن المفضل بالنسبة بخلايا هذا الاختراع اصابتها ب 53م في الامرار ؟
الى الامرار 4 .
والخلايا المخلدة «immortalized حسب استخدامها من خلال هذا الاختراع ؛ تشير الى الخلايا Vo القادرة على النمو في المزرعة لاكثر من Yo امرار . ويتم تمييز الخلايا المخلدة immortalized
عن WAY المتحولة في انه على عكس WAY المتحولة ؛ تظهر الخلايا المخلدة immortalized
كبح نمو اعتمادية الكثافة وتحتفظ بشكل طبيعي . وعلى عكس الخلايا المخلدة immortalized «
فان الخلايا المتحولة قادرة على النمو في اجار ناعم ولها القدرة عادة على تشكيل أورام عند
حقنها في الحيوانات المعملية .
ل ويتم تخليد خلايا الاختراع بواسطة تقديم p53 تحت سيطرة معزز ثيونين فلزي metallothionein داخل الخلايا الاولية على نحو افضل وان 53م Age الاورام النووي يعتبر احد جينات كبح الورم المدروسة جيداً من ناحية بسبب حقيقة ان التحولات في جينة 53م تسهم بشكل ما لما يصل الى 5٠0 7 من كل السرطانات البشرية Levine) واخرون ؛ دورية بعنوان © الطبقة To) aad . صفحة £OY الى 4876 6 )١441 و 53م عباره عن بروتين فسفوري خلوي وغالباً ما يكون موجوداً عند المستويات المرتفعة في الخلايا المتحولة ( De Leo, A. B. واخرون + دورية اجراءات الجمعية الاكاديمية الوطنية الامريكية المجلد 776 . صفحة VEY. الى 7474 ؛ (VV . ويظهر مفعول 053 النمط البري في حالة النمو القمعية Michalovity) واخرون. دورية بعنوان الخلية ؛ المجلد 17 . صفحة +97١ الى )١195960 0 TAC ويقوم 53م ٠ بكبح الخلايا عند نقاط تفتيش دورة الخلية استجابة لضرر Kastan) DNA واخرون ؛ دورية بعنوان أبحاث السرطان . المجلد )0 ؛ صفحة 1904 الى 5371١ + 1991) . ويتم تنفيذ عملية نقطة الفحص بواسطة تراكم p53 والحث التالي ل 6801045 (بروتين اصلاح الاستشسال الهام) . (WAFT (p21 وجينات MDM2 (الذي يشكل تركيباً مستقراً مع Kastan) . (p53 واخرون . دورية بعنوان الخلية . المجلد ١/١ . 8817 الى )١57 cody . . ويدعم هذه النظرية ملاحظة ان التحولات في 53م يمكن ان تؤدي الى التخليد الخلوي ٠ وتربط تقارير عديدة جزيء 053 النمط الذي يمنع تقسيم الخلية عن طريق مثبط عام الانزيمات
AYe إلى 8٠7 صفحة . Vo واخرون. دورية بعنوان الخلية . المجلد Cipl, El-Deiry) سايكلين صفحة 805 الى . Vo واخرون ¢ دورية الخلية ؛ المجلد Harper _بواسطة 1721 ¢ Y44Y ٠ يثير انتاج بروتين اخر + 021 ؛ والذي p53 ؛ وتوضح التجارب ان بروتين )1997 + 3
A
؛ مولد cyclin يكون في الخلايا الطبيعية متضمنا في تركيب ربعي يتضمن انزيم يعتمد على . p21 و (PCNA) مضاد نووي خلوي متكاثر و p21 وفي الخلايا المتحولة يظهر فقدان عمل 53م انه ناتج عن التحولات المؤدية لفقدان . من مركب البروتين المتعدد ؛ الذي يؤدي التكاثر غير التحكمي PCNA ° وفي حين تكون التحولات في 3 مصحوبة بنظام الانتشار الخلوي ٠؛ هناك نظريات اخرى تفترض ان الطرق الاخرى لنظام 53م لانتشار الخلية . Milner) واخرون. دورية ale احياء الخلية Int. Rep المجلد ؛ ؛ صفحة 177 الى Milner ¢ 1486 6 TTY واخرون. ؛ المجلد ١١١ ؛ صفحة VAC الى Mercer » YAAY ¢ YAA واخرون. دورية اجراءات الجمعية الاكاديمية الوطنية الامريكية ؛ المجلد VA . صفحة 304 الى 3717 ¢ YAAY ء و Mercer واخرون. . ( YAAE ¢ YA) الى ١7١6 المجلد ؛ . صفحة ٠. دورية بعنوان علم احياء الخلية الجزيئي ٠ على سبيل المثال ؛ قد تكون التحولات في جينة 053 هي المسئولة عن نفي قدرة الخلايا على أصلاح الآفات الحادثة أثناء النقاط الحاسمة في دورة الخلية نتيجة الوسائط الفسيولوجية والمادية . الضغط وتقدم العمر ؛ الاشعاع الايوني أو التعرض لمولدات السرطان Jie
Jil معروفاً في هذا المجال بتنظيم انتشار الخلية . وهناك دليل على ان بروتين 53م p53 ويعد واخرون تخليد الخلايا Jenkins غير المتحول يمكن ان يخلد الخلايا القارضة . ويظهر Vo يتم استخدام المعززات التشكيلية من الفيروسات المولدة للأورام مثل Lovie الغضروفية لفأر فقط واخرون ؛ دورية Jenkins ) (SV 40( 460 سيمبان us és (RSV) rous sarcoma virus واخرون (دورية Eliyahu . (V4AS ¢ AVA صفحة 816 الى . TAY الطبيعة . المجلد واخرون (دورية Parada و ¢ ( YAAE 4 الطبيعة. | لمجلد ءءء صفحة 17 الى
الطبيعة ؛ المجلد ٠١١ . صفحة 149 الى )10 ؛ (VAAL ؛ وهي قادرة ايضاً على تخليد خلايا la ؛ ولكن بياناتها تناقض Jenkins واخرين وتظهر ان تركيبات ps3 تفشل في تخليد الخلايا عندما يتم اصابة جينة 053 وحدها ولكن تركيبات 053 تقوم بتشكيل بؤرات متحولة عندما يتم الاصابة المشتركة للخلايا ب راس مولد الاورام . وبينما تحتوي هذه الخلايا على خصائص © الخلايا المتحولة ؛ تخضع الخلايا للشيخوخة وتتوقف عن التضاعف في غضون زمن قصير نسبياً يعقب التحول .
sRovinski (المذكور بالمصادر عاليه) يظهر Parada 5 Eliyahu و Jenkins عكس Je (دورية 'مولد الاورام" . المجلد ؟ . صفحة £40 الى £07( تخليد خلايا ليفية Benchimol لجنين فأر بأستعمال 53م فأر تحت سيطرة معززه الداخلي المنشأ . ويمكن تفسير النتائج المنشورة بواسطة 80710510 بالدراسات الاخرى التي تشير الى ان خلايا الفأر معروفة ٠ بخضوعها اليسير للتخليد والتحول . ويسود الاعتقاد في ان الخلايا يتم اعداداها بطريقة ما بحيث
تكون حساسة على نحو خاص لحافز التخليد والتحول . وتظهر الدراسات على نحو قابل لاعادة الانتاج ان الخلايا الليفية القارضة تقوم تلقائياً بالتخليد عند التكرار العالي . Ponten) دورية جريدة دراسة مبحث الفيروسات . المجلد cA صفحة .١ ٠٠ 149/1 ء Ponten « دورية بعنوان الكيمياء الحيوية وعلم الطبيعة الاحيائي Acta . المجلد 57؛ ٠ صفحة Todaro 1959756 + YAY وجرين ¢ جريدة علم احياء الخلية ؛ المجلد VY صفحة 4 الى Meek « 1337 2٠“ واخرون ؛ دورية بعنوان أبحاث الخلية التجريبية . المجلد ٠١7 صفحة YVY الى 7846 197/76 وكوراتولو ؛ واخرون ؛ دورية بعنوان أنابيب الاختبار؛ المجلد Yo ؛ صفحة 097 الى 301 (VAAL .85 الواقع لاحظ sRovinski Bechimol | ٠ (المذكورين عاليه صفحة £47( ان تحكمات الخلية الليفية لجنين الفأر ؛ مصابة
٠١ وعلى النقيض من . 7 ٠١ بواسم قدرة الملوثات وحدة وتحتوي على تكرار تلقائي للتخليد حوالي ودراسات اخرى تشير الى انه لا يوجد تقارير عن خلايا ليفية Talal ذلك في تقرير في دورية . واخرون؛ دورية العلم Smith) بشرية أو داجنة مأخوذة من معطين طبيعيين تتخلد تلقائياً
YY أبحاث الخلية التجريبية . المجلد (Hayflick 1935 ¢ TY المجلد 777 ؛ صفحة 9+ الى .5 4 واخرون ؛ أبحاث السرطان المتقدمة ؛ المجلد Smith 14566 (AFT ؛ صفحة 114 الى © كبيرة من Ac sane وعلاوة على ذلك فان خلايا الفأر تحمل . )١19960 VY صفحة 17 الى الفيروسات داخلية المنشأً وعلى وجه الخصوص الفيروسات الارتدادية التي تجعلها غير ملائمة . لانتاج اللقاح التجاري وهناك عدد كبير من جينات 053 يتم عزلها عن مجموعة متنوعة من الثدييات . على سبيل برقم الحصول GenBank لدى )١ : بالدجاجة (رقم تعريف التسلسل p53 المثال يتوافر تسلسل ٠ (YT) واخرون (أبحاث الاحماض النووية المجلد ¢ Soussi ويتوافر في كتابات X 13057 عليه GenBank البشري الطبيعي متوافر لدى p53 وتسلسل . (YAAA CVITAY صفحة . VY والمستنسخ متوافر للجمهور من خلال مدرسة جامعة HSPS3 و W88747 بأرقام الطلبات
GenBank وارقام الحصول على exons 1 - 11 ايضاً باسم p53 واشنطن للطب . ويتوافر جين الى 14133898 ومنشور بواسطة M22894 و M22884 , M22887 الى M22881 ١ ¢ YOY الى Yeo das ar 10 : )7( واخرون (دورية بعنوان الجينية المجلد Buchman ومن قرد افريقي 1137120 GenBank ويتوافر 53م من الحصان برقم الحصول على . )١148 . (GenBank X16384 اخضر (برقم الحصول على ؛ و 53م البقر برقم 120442 GenBank قرد الرّيص برقم الحصسول على pS3 ويتوافر . 0 )4( المجلد . DNA واخرون ؛ دورية بعنوان تسلسل Dequiedt F (راجع ايضاً X81704 Y-
١١
صفحة 15١١ الى 764 + 1490( و p53 القطط متوافر برقم الحصول على GenBank
2607 صفحة . 0A )١( واخرين . دورية الجريت الدولية للسرطان المجلد Okuda M) D26608
الى 6509 ؛ )١1994 . ويمكن الحصول على التسلسلات والاصدارات الاخرى التي تشير الى
استعمال هده التسلسلات من عدد من بيانات الجين «GenBank Jie وما شابه ذلك . وسوف © يتمكن المتخصصون في هذا المجال بسهولة من الرجوع الى الكتابات أو بيانات الجين للحصول
على تسلسلات الجين بالنسبة ل 053 المعروف في هذا المجال .
ويتضمن معزز ثيونين الفلزي metallothionein عدداً من مناطق الربط الفلزي وان قدرة
الملوثات للجينات التي ينظمها معزز الثيونين الفلزي metallothionein يمكن حثها بواسطة
. ++Zn 4 ++(Cd++, Cu
٠ ويحتوي المعزز على عدد من مواقع الربط الممكنة المتعددة للعوامل التنظيمية الفلزية ولعوامل الانتساخ بما في ذلك Spl و MLTF . وتوجد مناقشة تفصيلية للعناصر الحساسة الفلزية داخل مناطق المعزز والمناطق المحددة الاخرى بواسطة Mueller واخرون (دورية بعنوان الجينات والتطور . المجلد ؛ صفحة 6VY الى 4775 ؛ (VAAN و Lee واخرون (دورية بعنوان الطبيعة . المجلد 775 ؛ صفحة 268 الى 7ل )١897 .
٠ ومثل جينات ترميز 53م ؛ هناك عدد من جينات الثيونين الفلزي metallothionein من مجموعة متنوعه من الانواع المعروفه في هذا المجال ؛ على سبيل المثال ؛ يتوافر تسلسل معزز الثيونين الفلزي metallothionein من الدجاجات (رقم تعريف التسلسل : )١ في كتابات Fernando واخرون (دورية بعنوان الجين . المجلد 7 ؛ صفحة ١777 الى 187 1484) ويمكن تحديد منطقة المعزز من تسلسل جين ثيونين فلزي metallothionein لعدد من تسلسلات جين الثيونين
٠ الفلزي metallothionein الصادرة المتوافرة في المجال القائم على الخصائص المنشورة لمعزز
YY
واخرون « نفس Lee ؛ عاليه و (5als Mueller ) metallothionein الثيونين الفلزي
GenBank sa! metallothionein المصادر عاليه) . ويتوافر تسلسل جين معزز الثيونين القلزي واخرون؛ الكيمياء Stennard Lad (راجع W68639 , 2265607 , X6560 , 700594 برقم ١446077659 ؛ صفحة 597 الى 1718 (TY) المجلد . Acta الحيوية وعلم الطبيعة الحيوي
CYVY الى YAY dad a )١( TY ؛ واخرون ؛ دورية بعنوان الخلية . المجلد Richards © صفحة . ٠١0 )٠١( واخرون ؛ دورية بعنوان ابحاث الاحماض النووية المجلد Karin و 64 في الغنم لدى metallothionein ويتوافر معزز الثيونين الفلزي . (VAAY الى 71977 ؛ Yio واخرون ؛ الجريدة الاوروبية للكيمياء الحيوية Peterson (راجع X04626 برقم GenBank ويمكن الحصسول على التسلسلات . (VAAT صفحة 7495© الى 8085 ؛ . )( ٠6١ المجلد ؛ GenBank والاصدارات الاخرى التي تشير لاستعمال التسلسل من عدد من بيانات الجين مثل ٠ سهوله من الرجوع JS وما شابه . وسوف يتمكن المتخصصون في هذا المجال EMBL وجين الى الكتابات أو بيانات الجين للحصول على تسلسلات الجين لمعززات الثيونين الفلزية . المعروفة في هذا المجال metallothionein ويتم تخليد خلايا الاختراع الحالي عن طريق الحمض النووي ترميز 53م في الخلايا حيث يكون Vo تحت سيطرة معزز الثيونين الفلزي metallothionein ؛ اي ؛ يتم ربط معزز الثيونين =$ . 053 بطريقة عملية بالحمض النووي ترميز metallothionein وفي نموذج مفضل لهذا الاختراع يتم ادخال 053 الواقع تحت سيطرة معزز الثيونين الفكلزي .في الخلايا في ناقل قدرة الملوثات . وهناك مجموعة متنوعه من نواقل قدرة metallothionein الملوثات المتاحة تجارياً وسوف يتمكن المتخصصون في هذا المجال بكل سهولة من تقدير امكانية استعمال مجموعه متنوعه من النواقل لقدرة الملوثات 053 في خلية حيوانية غير قارضة ©
VY
- ويمكن ان يتضمن ناقل قدرة الملوثات ايضاً مجموعة متنوعه من الملامح الاخرى التي تسهل تضاعف الناقل في الخلايا بدائية النواه ؛ أو انتقاء الناقل ؛ أو اندماج تسلسلات جينية اخرى أو تسهيل قدرة الملوثات الجين عن طريق اضافة تسلسلات تنظيمية اخرى . وتتضمن امثلة هذه الملامح الاخرى ؛ دون الاقتصار على تضمين اصل بكتيري للتضاعف ؛ الجينات التي تعطي مقاومة مضاد حيوي ؛ والواسمات الانتقائية الاخرى ؛ بما في ذلك دون حصر B-galactosidase luciferase « ؛ أو ما شابه ؛ ذلك ؛ تسلسلات المعزز ؛ ومواقع الاستنساخ المتعددة ؛ وما شابه ذلك . ومثال ١ عباره عن تفصيل لتحديد معزز الثيونين الفلزي metallothionein وجين p53 مع ادماج المعزز و 053 في ناقل قدرة ملوثات . ويفضل ان يكون معزز الثيونين الفلسزي metallothionein ٠ وجين p53 من نفس النوع . وتم ادخال تركيب 053 الواقع تحت سيطرة معزز الثيونين الفلزي metallothionein في الخلايا . ومن الافضل ان تكون الخلايا عباره عن خلايا اوليه ؛ وهذه الخلايا الاولية ¢ حسب استخدامها في هذا الاختراع ؛ من المفضل ان تكون الخلايا التي في المزرعة حوالي من ١ الى ٠١ إمرار و/أو اقل من شهرين . . وتتميز الخلايا الاولية بوجه عام بأنها خلايا ذات قدرة محدودة على التكاثر في المزرعة ١٠ والخلايا الاولية هي الخلايا المعزولة عن الانسجة السليمة والموضوعة في مزرعة . ويمكن . الحصول على الخلايا من اي عدد من الانسجة من مجموعة متنوعه من الثدييات ومن الممكن ان يتم فرم وهضم قطع من أنسجة بشرية ؛ وعينات نسيجية من كلب وحصان وخنزير ؛ ودجاجة وبقرة ؛ وأنسجة جينية وما شابه ذلك ؛ بالتربسين وعزلها لاصابتها بأعتبارها
V¢
خلايا وحيدة في مستعلق أو بأعتبارها مزارع ذات طبقة واحدة أو بأعتبارها عينات نسيجية صغيرة ولكنها سليمة وتتضمن الخلايا المعزولة المناسبة للاصابة خلايا ليفية ؛ وخلايا عضلية ؛ وخلايا ظهارية ؛ وخلايا بطانية وخلايا اخرى . وسوف يتعرف المتخصصون في هذا المجال ان هناك طرقاً معروفة جيداً للحصول على وعزل مجموعة متنوعة من الخلايا من مجموعة © متنوعة من العينات النسيجية وان هذه الطرق يمكن اجراؤها دون تجريب غير ضروري . ويكشف مثال ١ عن طريقة Jad الخلايا عن نسيج جيني لدجاجة ؛ تشمل خلايا من الجلد skin cells ¢ وخلايا عضلة القلب heart muscle cells وخلايا عضلة الصدر breast muscle cells . وهناك عدد من الطرق المعروفة في هذا المجال لادخال ناقل له القدرة على توجيه قدرة الملوثات تسلسل حمض نووي nucleic acid أو لادخال جزء حمض نووي nucleic acid ٠ الخلايا . وتتضمن هذه الطرق؛ دون حصر؛ ترسيب CaPO4 التجزيء الكهربي؛ أساليب نقل عدوى ليبوفكتين lipofectin ¢ أساليب نقل عدوى متعدد امين polyamine ونقل العدوى بجزيئات فيروسية . ويوفر مثال ¥ طريقة لادخال اجزاء 53م/حمض نووي nucleic acid ثيونين فلزي metallothionein من هذا الاختراع في خلايا سوية النوى باستعمال مجموعة متنوعه من الطرق . ولذلك لا يجب ان تصرف طرق ادخال الحمض النووي ترميز 053 تحت
. النظر عن مدى هذا الاختراع metallothionein سيطرة معزز الثيونين الفلزي ١٠ وبعد ان يتم نقل العدوى ؛ يتم زراعة الخلايا وتوسيعها تحت ضغط نمو انتقائي عند الحاجة ؛ لتحديد المستنسخات التي تحتوي على جزء الحمض النووي المصاب . ويتم معالجة الخلايا metallothionein الضرورية لتعزيز القدرة لملوثات من معزز الثيونين الفلسزي fons بالايونات ويتم انتقاء . metallothionein وذلك لحث معزز الثيونين الفلزي ZnSO, ¥ Jl ويستخدم ٠ الخلايا وزراعتها في المزرعة . ويشير مصطلح "بؤرات" الى عناقيد الخلايا التي تحتوي cy © yo على خصائص تختلف عن الخلايا المحيطة . وفي هذا الاختراع ؛ فان الخلايا المخلدة بواسطة جزء الحمض النووي ترميز 053 تحت سيطرة معزز الثيونين الفلزي 10 كذلك تنمو . immortalized بسرعة أكبر من نظائرها غير المخلدة sali metallothionein . بصورة اسرع وتشكل عناقيد على طبقات المزرعة الاولية immortalized الخلايا المخلدة ٠ وتعتبر الخلايا مخلدة immortalized cell عندما تخضع لحوالي YO امرار مزرعة نسيجية بعد ادخال 53م/الثيونين الفلزي metallothionein الذي يحتوي على تركيب في الخلايا وعندما تخضع الخلايا لمضاعفات تجمع ١7 على الاقل في اليوم ويفضل ما بين 0,6 الى 1,9 في اليوم . وتحتفظ الخلايا بشكل طبيعي وتظهر اعتمادية كثافة و/أو نمو wile للتلامس . ويتم تحليل خلايا من ثلاثة انسجة مأخوذة من أجنة دجاجة للكشف عن قدرتها على التخليد بواسطة طرق . هذا الاختراع ٠ ويتم تحديد عدد من المستنسخات من خلايا عضلة القلب ؛ وخلايا عضلة الصدر وخلايا الجلد . © كما هو متوفر في مثال لهذا الاختراع للكشف عن الملوثات immortalized ومن الواجب اختبار الخلايا المخلدة culture contaminants وكذلك ملوثات المزرعة النسيجية viral contaminants الفبروسية ¢ low level bacterial contaminants الاخرى مثل الملوثات البكتيرية منخفضة المستوى ١٠ وما شابه ذلك . ويمكن اختبار الخلايا للكف عن » mycoplasmas الفطريات المصورية
Avian ؛ والمتلازمة الطيرية (نوع أ) retroviral infection وجود الاصابة الفيروسية الارتدادية الفيروس الغدي الطيري ¢ Avian reovirus والفيروس الريوي الطيري ¢ influenza (Type A) ؛ فيروس التهاب الدماغ والنخاع Avian adenovirus (Groups IID) (¥ - ١ (المجموعات من وفيروس « Fowl pox والسرطان الظهاري ¢ Avian encephalomyelitis virus الشوكي الطيري vy
١
Paramyxovirus (type )١ ؛ بارامكسو فيروس (نوع Newcastle disease virus مرض نيوكاسل )2 ؛ وكذلك الفطريات المصورية Mycoplasma ء سلامونيلا Salmonella والملوثات الاخرى مثل تلك المدونة في 113 .9600 CFR. 9 واجزائها الفرعية . ويمكن اختبار الخلايا للكشف عن سلسلة واسعة من الملوثات الفيروسية باستعمال تفاعل سلسلة © بوليمراز polymerase chain لتحديد اجزاء الحمض النووي الملوثة . وهناك مجموعة متنوعه من اجهزه الاختبار المتوافرة تجارياً للكشف عن مجموعه من الفيروسات التي يمكن استخدامها لتحديد ما اذا كانت خلايا الاختراع تحتوي على فيروس ملوث. وبالمثل ؛ هناك اختيارات متوافره تجارياً للكشف عن مولد المضاد الفيروسي + حيث يتم اشتقاق مولد المضاد من مجموعة متنوعه من الفيروسات المختلفة . ٠ وتتضمن هذه الاختبارات معايرات ELISA معايرات التألق المناعي ؛ وما شابه ذلك. وكل هذه المعايرات معروفه Tam وتتضمن أساليب تجريبية روتينية ٠ ويوفر مثال ؛ طريقة لتحديد ما اذا كانت خلايا الاختراع سالبة انزيم انتساخ عكسي . وان دليل وجود فاعلية انزيم Flo عكسي في الخلايا المخلدة immortalized المحتوية على 053 تحت سيطرة معزز الثيونين الفلزي metallothionein هو دليل وجود تلوث فيروسي ارتدادي ١ retrovirus . tumorigenic potential وكذلك ايضاً يتم اختبار الخلايا للكشف عن امكانيتها المولده للأورام ٠ وتعتبر . not tumorigenic ومن المفضل ان تكون خلايا هذا الاختراع غير مولدة للأورام اختبارات تحديد ما اذا كانت مجموعه من الخلايا مولده للاورام معروفه في هذا المجال . ويوفر طريقة ١ في اجار ناعم ويوفر مثال immortalized مثال + طرقاً لتقييم نمو الخلايا المخلدة لادخال الخلايا في حيوان والذي يفضل ان يكون نوعاً لخلايا الاختراع لتحديد ما اذا كانت © الخلايا قادرة على اثارة الاورام في الحيوانات المتلقية . ولاختبار امكانية توليد الاورام للخلايا
ب البشرية التي تحتوي على حمض نووي nucleic acid ترميز p53 تحت سيطرة معزز الثيونين الفلزي metallothionein ؛ فانه من الممكن اختبار الخلايا للكشف عن نموها في اجار واختبار نموها في فثران عادية أو فثران أو حيوانات معملية اخرى باستخدام اجهزة مناعية بشرية أعيد تكوينها . © وفي احد مظاهر الاختراع الحالي ؛ تعتبر الخلايا مفيدة لتكاثر الفيروس . وتساعد خلايا الاختراع على الاصابة بالفيروس الريوي support reovirus infection « وفيروس Mall الذي يصيب الديوك الرومية Herpesvirus of Turkeys (HVT) (HVT) وفيروس مرض ماريك 05 كما هو موضح في مثال 4 . ويمكن ان تعمل الخلايا المشتقة من نسيج دجاجي chicken tissue ايضاً باعتبارها حاضنة ٠ لفيروس مرض الصرة المعدي Bursal Disease virus ؛ وفيروس الالتهاب الشعبي المعدي Infectious Bronchitis Virus ¢ وفيروس مرض تنيوكاسل Newcastle Disease Virus «¢ وفيروس التهاب الحنجرة المعدي 4c gana gy « Infectious laryngotrachio virus متنوعه من الفيرروسات الغدية التي تتضمن الفيروس الغدي نوع adenovirus type 111 ١ ¢ سركود نا يريديا HSV Circodnavirideae الدجاج Chicken HSV ؛ وفيروس السرطان الظهاري fowl pox virus 10 ؛ وفيروسات اخرى . وينمو عدد من الفيروسات البشرية والحيوانية في البيض الحاوي أجنة embryonated eggs ؛ والذي يتضمن ¢ دون حصر » Gus md السعار Rabies virus ؛ الفيرروسات الصغيرة الكلبية Canine Parvovirus ¢ وفيروس بانليوكوبينا السفوري Feline Panleukopenia virus ¢ وفيروس كاليس Calici Virus ؛ وفيروس هيباتيتس Hepatits virus « والفيروسات المتلازمة Influenza viruses « وفيروس منطقة الجديري Varicella Zoster Virus
م ومجموعه الفيروسات الاخرى . ويمكن ايضاً اختيار هذه الفيروسات لقياس قدرتها على النمو الخلايا المخلدة immortalized . ولانتاج سلالة فيروس ؛ يمكن بذر خلايا الاختراع في قارورات مزرعة نسيجية culture flasks ؛ زجاجات دوؤارة roller bottles ؛ مزرعة تدريم spin culture 0 في مفاعلات ليف مجوفة hollow fiber reactors © . وبالنسبة لتكاثر فيروس الزجاجة الدوّارة . يتم بذر الخلايا بمقدار ١ الى "٠١ x0 خلية/سما من مساحة السطح . وسوف تختلف تعدديه الاصابة (نسبة جزيئات الفيروس المعدية الى الخلايا) لبدء تكاثر سلسلة الفيروس اعتماداً على سلالة الفيروس . وسوف يتمكن المتخصصون في مجال علم الفيروسات والمتخصصون في مجال نمو فيروسات معينه وسلالات الفيروسات من زيادة نتاج مخزون الفيروس عن طريق المعالجة القياسية لتعددية ٠ الاصابة ؛ ودرجة الحرارة ؛ وتنوعات الوسيط ؛ وما شابه ذلك ؛ دون تجريب غير ضروري . وكذلك تختلف ايضاً طرق حصد الفيروس بعد الاصابة للحصول على مخزون الفيروس المعدي مع AD الفيروس . وتنبثق الفيروسات المطورة في Jala وسيط المزرعة بصورة أبطئ من الفيروس غير المطور . ويمكن الحصول على مخزونات الفيروس من وسيط المزرعة وحده أو من حلالات الخلية المتجمعة مع الوسيط المكيف . وبالنسبة للفيروسات الحالّه (اي الفيروسات vo ذات الكفاءة في حل الخلية أثناء انبثاق الفيروس) ؛ يكفي حصد وسيط المزرعة المكيفة Ma) الوسيط المستهلك الذي يحتوي على فيروس) بعد خطوة طرد مركزي لطيفة لازالة حطام الخلية. ومرة اخرى تعتبر طرق حصد وادخال الفيروس من سلسلة واسعة من سلالات الفيروس معروفة في هذا المجال . وهناك مجموعة متنوعه من الطرق ؛ المعروفة ايضاً في هذا المجال ؛ لقياس نمو الفيروس من ٠ مزرعة خلايا . على سبيل المثال ؛ يتم قياس عيار مخزون فيروس الافراد عائلة فيروس الحلا
V4
ولمجموعة متنوعه من الفيروسات المنتجة لبؤر باثولوجيا الخلايا على سطح طبقة الخلية بواسطة معايرة الصفحة المعدنية (بأعتبارها صفيحة تشكل وحدات/[« من سائل المزرعة أو تشكل وحدات/جرعة بالنسبة لمقدار فيروس مادة اللقاح) أو جرعة = +0 (TCID50) المزرعة النسيجية المعدية . والافضل ان يتم قياس الفيروسات الحالة بسرعة بواسطة 701050 بأعتبار ٠ الجرعة أو تخفيف مخزون الفيروس قادر على اصابة 5٠ 7 من المزارع في فترة زمنية محددة ٠. وطرق زراعة وقياس الفيروس معروفة في هذا المجال ومصادر تعليم طرق قياس الفيروس موجوده في كتابات Fields واخرون .(طبعات) مبحث الفيروسات الجوهري 1955١ ؛ مطبعة Raven Press « نيويورك أو في Mandell واخرون (طبعات) مبادئ وممارسة الامراض
المعدية John Wiley & Sons Y4A0 «¢ نيويورك . ٠ وتعد خلايا الاختراع مفيدة ايضاً لانتاج بروتينات مأشوبة ؛ بما في ذلك البروتينات الفيروسية وما شابه ذلك . وطرق ادماج الحمض النووي ترميز البروتين المأشوب في ناقل حمض نووي nucleic acid .تحت سيطرة العناصر التنظيمية قادر على توجيه قدرة الملوثات للبروتين في خلية سوية النواة ؛ Jia الخلايا المخلدة immortalized في هذا الاختراع ؛ معروفة في هذا المجال . ونواقل قدرة الملوثات عباره عن اجزاء حمض نووي nucleic acid متضاعفة ١ تستطيع توجيه قدرة الملوثات للبروتين المأشوب . والعديد من نواقل قدرة الملوثات؛ بما في ذلك نواقل الفيروس الارتدادي ؛ متوافر في هذا المجال من خلال اصدارات الجرائد والموردين التجاريين . وتتضمن مكونات ناقل لقدرة الملوثات المتضاعفه بوجه عام . دون حصر ؛ واحداً أو أكثر مما يلي : أصل التضاعف ؛ جينة أو أكثر من جينة واسمة ؛ عناصر معززه ؛ عناصر محرضة ؛ تسلسلات اشارية اختيارية وتسلسلات انهاء الانتساخ . وجينات الواسم أو الانتقاء Ye ترمز البروتين الذي يعمل على تحديد مجموعة من الخلايا المتحولة أو المصابة . وترمز جينات
Y. الانتقاء النمطية الى البروتين الذي يعطي مقاومة للمضادات الحيوية والتوكسينات الاخرى ؛ نقصان زوائد الاغتذاء المكملة ؛ أو مغذيات الامداد الحاسمة غير المتوافره من وسيط المركب ترميز البروتين nucleic acid ويتم نقل نواقل قدة الملوثات التي تتضمن حمض نووي ٠ المأشوب في الخلايا واستخدامها لتوجيه قدرة الملوثات البروتين المأشوب في الخلايا المخلدة ويفضل ان يرمز الناقل لاي بروتين مأشوب له القدره على قدرة الملوثات في . immortalized © في ذلك ؛ دون حصر بروتين الفيروس ؛ الذي يتضمن انزيم Lay خلايا ليفية جينية داجنة ؛ انتساخ عكسي و/أو بروتين هيكلي فيروسي . وتتضمن امثلة نواقل انتاج البروتين المأشوب في خلية النواقل الفيروسية الارتداية لانتاج بروتين قمع الورم ؛ أو بروتين هيكلي فيروسي مثل تلك
SOY) ١١ ؛ واخرون ؛ دورية بعنوان مولد الاورام . المجلد Givol المكشوف عنها بواسطة . حتى 1714 ؛ 1195 01701؛ واخرون ؛ دورية بعنوان "مبحث الفيروسات" 7١5 صفحة ٠ ؛ دورية مولد gg —=algFederspiel ١994 + 77١ Ja YY) ؛ صفحة )7( ٠١7 المجلد الاختراع WA ويمكن ان تعمل ١1997 سنة £17 Ja 45١7 ؛ صفحة Yo الاورام . المجلد بأعتبارها ركيزة لقدرة الملوثات للفيروس المأشوب . بما في ذلك ؛ دون حصر ¢ الفيروس . الارتدادي المأشوب
Givol, et al. Oncogene 11(12):2609-2618, 1995, Givol, et al. Cell Growth & Vo
Differentiation 5(4):419-429, 1994, Federspiel, et al. Virology 203(2):211-220, 1994 and Boyer, et al. Oncogene 20:457-66, 1993. ويمكن ان تعمل خلايا الاختراع بأعتبارها خطوط خلية تجميع لفيروس الهندسة الوراثية المفيد لمعالجة الجينة أو ما شابه ذلك . وان تركيبات وطرق استعمال خط خلية معين بأعتباره خط . خلية تجميع معروفة في هذا المجال YY
نض وعلى سبيل المثال ؛ يكشف Boerkoel ؛ واخرون (دورية مبحث الفيروسات . المجلد (Y) Yao ٠ صفحة 154 الى (V44Y «TVA عن طرق لفيروس التجميع باستخدام خلايا ليفية جنينية داجنة اوليه بأعتبارها خط خلية التجميع . ويمكن استخدام نفس الطرق لتجميع الفيروس في الخلايا المخلدة immortalized لهذا الاختراع .
0 وحيث ان معظم خطوط الخلية الطيرية وكل الخلايا الطيرية المتحولة وكذلك اساساً كل خطوط الخلية المتحولة القارضة اما تحتوي على ملوثات فيروسية مثل الفيروس داخلي Land) أو تتتج بروتيناً فيروسياً ؛ فهي غير مناسبة لانتاج اللقاحات البشرية أو الحيوانية . ولا يمكن استخدام الخلايا لانتاج البروتين المأشوب لان الملوثات داخلية Land) بأمكانها تلويث مستحضرات البروتين المأشوب المنقى . وعلى نحو مفضل ؛ توفر خلايا الاختراع بديلاً مناسباً لهذه
. المشكلات ٠ اخرى . وتتضمن WIA الاختراع ايضاً كركيزة لتدعيم نمو الفيروس من WIA ويمكن ان تعمل هذه الخلايا اولية ؛ أو خلايا مستزرعة يمكن ان تظهر نمواً محسناً أو طول عمر في المزرعة collagens الكولاجينات Jie اخرى أو في وجود بروتينات نسيجية خارج خلوية WDA في وجود
. وما شابه ذلك laminins اللينينات »٠
Vo وفي احد النماذج ؛ يتم خلط الخلايا مع الفيروس ثم خلطها مع خلايا الاختراع ويفضل بنسبة خلايا الى خلايا الاختراع ما بين ١ : © الى حوالي ١ : 70 ؛ والافضل بنسبة ٠١ : ١ (خلية واحدة ؛ الى حوالي ٠١ خلايا من هذا النوع) ثم بعد ذلك يتم وضع الخلايا المخلوطة في المزرعة . وفي نموذج اخر يتم خلط الخلايا مع الفيروس وتصفيحها على سطح الخلايا المخلدة 13g) immortalized الاختراع وتكون مرتبطة بالفعل بسطح المزرعة النسيجي . ويمكن ان
٠ تعمل DA الاختراع بأعتبارها دائماً للخلايا الاخرى ؛ ودون قصد حصر مدى الاختراع ؛
YY
يمكن ان تعمل خلايا الاختراع على دعم عوامل النمو وما شابه ذلك وكذلك مكونات النسيج خارج الخلوية ؛ وما شابه ذلك ؛ لتدعيم الخلايا الاخرى في حين تقوم بانتاج الفيروس . ويوفر . مثال 9 نموذجاً لاستعمال خلايا الاختراع بأعتبارها ركيزة خلية وكل المراجع المستوحاه هنا متضمنة بجلاء بالمرجع في هذا الكشف . وسوف يتم مناقشفة . النماذج الخاصة لهذا الاختراع بالتفصيل والاشارة للتغيرات الممكنة داخل اطار الاختراع ِِ وهناك مجموعه متنوعه من الاساليب والاجراءات المتاحة البديلة للمتخصصين في هذا المجال . والتي قد تسمح بالمثل باجراء الاختراع المقصود بنجاح ١ مثال : نموذجي pS3 تحضر ناقل قدرة الملوثات (مؤسة SK- pBluescript بناقل eal بواسطة (pJFNII (5436 bp يتم تركيب بلازميد Ve
Pull باستعمال lacZ ويتم إزالة موقع الاستنساخ المتعدد وجينة ٠ (Stratagene, LaJolla, Calif لمعدة عجل . ويتم alkaline phosphatase ويعالج جزء ناقل 50720817 بفوسفاتاز قلوي ٠. phenol/chloroform المحضن في 10 م ومستخلص ب EDTA معالجة الجزء بعد ذلك ب ء واخرون ء Gorman, 0 pRSVneo ويتم هضم بلازميد .ethanol وبعدة ترسيب ايثانول ويتم . .Nde I و Bam Hl— YAAY( ( coY الى 00) dada. YY) دورية العلم؛ ا لمجلد yo (مؤسسة ستراتاجين ؛ لا وار ء DNA polymerase من بوليمراز Klenow جزء كلينو dallas وبعد عزل هذا المستنسخ؛ يتم ٠ bpY 517 كاليفورنيا) 6 وبربط الطرف الغير حاد بجزء ناقل واعادة رابطه ؛ ويزيل هذا الهضم موضع Klenow ومعالجته بجزء كلينو EcoRI هضم الناقل .)١ تحت مسمى 0171111 (راجع شكل plasmid من منطقة المعزز . ويقع هذا البلازميد 1
Yy في اتجاه التيسار من 50٠٠٠١ عند موقع في الناقل حوالي Bam Hl ب pJENII ويتم اقتطاع gene encoding neomycin اشارة متعدد غدد المستخدم بواسطة جينة ترميز مقاومة نيوميسين . resistance ويستخدم . PCR الدجاجي باستعمال metallothionein فلزي (ish ويتم الحصول على معزز للحصول على معزز الثيونين الفكلزي (PCR) البادئ التالي في تفاعلات سلسلة بوليمراز © : metallothionein
CGAAGATCTCTCAGCACGGCCCCACGCT 3' (SEQ ID NO:3) : البادئ الايسر : البادئ الايمن 5 CGAAGATCTTTATTCTCGAGATATCGAATTCT CGGGTGGGCTCGTA
GCAGT 3' (SEQ ID NO:4) ٠١ عباره عن بلازميد 0010111807 ويتم الحصول على PCR في هذه التجارب يكون قالب تفاعل ؛ دورية Fernando and Andres) الدجاجي الحافز metallothionein معزز الثيونين الفلزي في بلازميد 008301111867 من )١589 ؛ YAY الى ١77 ؛ صفحة AY بعنوان الجينة . المجلد وسوف يقدر ٠. Guelph, Guelf, Ontario, Canada (جامعة Ann Gibbins دكتونر المتخصصون في هذا المجال ان المعزز يمكن ان يتم تحديده ايضاً من مجموعات قدرة الملوثات ٠ الجينية للحصول على المعزز من أنواع اخرى ؛ بما في ذلك الدجاج ؛ ويتم شراء البادئ من وكل من البادئ الايسر والايمن مصممان بحيث يتضمنان مواقع .101 (Coralville, Iowa) متضمن في metallothionein ويولد التكبير باستخدام هذين البادئين معزز ثيونين فلزي . 1 .7 : جزء الحمض النووي المماثل لرقم تعريفالتسلسل
Y¢
وتسلسل معزز الثيونين الفلزي metallothionein الدجاجي المفضل (رقم تعريف التسلسل : ؟)
هو ؛ CTCAGCACGG CCCCACGCTG TGCGCACCGC CTGCAGCGC : 01 5 GGCCCGGGGG GGTGGCGGGG GTGGGAGCAG CAGTGGCGCA ATGACCCCTC CGGGTCACAT TCCCGCAACC GAGCGCAGAG TGCGTGGCCG ° GGAAATTCCC CCCCCCCCAAT TCGCCTTTCG GCAGCCCAAAG CGGGAGGGGG GGAGTGAGGA GGGTCAGGCA CGTTGGGGTC CGTGCCGTGT TCTGGCAAAG TGTCGTTT GGGGGGGGGG GGGAGCAAGG AAGGGAGGCG AGGGGTGAGG ACACAAA GCA AA'A GCGCCT AAATCTGTTG GCACACATGG CCATCCCACA GCTGTATCC CCTGCTTTGG Ve GGGAACCCCA ACACCAGGGC TGGCCCCGCG GTGAGGCTCC CCCCAGGCAG GGGGCACGGC CGTGACCCG CTGAGCACGG CACGGCGCTG و اذا م ان CCCCGCCCCG CTGAGCACGG CACGGCACGG CCCCCCGAGC ACGGCTCAGC ACGGCACGGC GCTCAGCACG GCACGGATCG GCACCGCCCC 0006100001 GCGCGAGCA ccAacceeaae Vo CCTATAAATA CAGGGCGGGGC AGCGGGACTC GGACTGCTA اذ CGAGCCCACC ويتضمن هذا المعزز ثلاثة عناصر تنظيمية فلزية رئيسية ؛ ومناطق صندوق - 00©وصندوق TATA . وتقوم العناصر التنظيمية All بربط الفقلز وحث جينة الثيونين الفكلزي metallothionein ٠١ الدجاجي الموضوعة في اتجاه التيار . ويتم ربط جزء الثيونين $a metallothionein المكبر الذي يتضمن أطراف Bll من البادئين الايسر والايمن في PIFNIL باستعمال BamHI . ويتم انتقاء مستنسخ الناقل المحدد من هذا الربط للكشف عن قدرته على اعطاء مقاومة نيوميسين ٠. وا )1 لمستنسخ معروف بمصطلح pJFNIIcMTD وكان مقداره حوالي bp AA . ويتضمن الناقل مواقع استنساخ متعددة EcoRI , ECORV (adi و Xbol . وتسمح
Yo
اشارة متعدد الغدد داخل البادئ الايمن بقدرة الملوثات الفعاله لتسلسلات NDA التي ينقصها هذه الاشارة .
ويتم دمج cDNA لبروتين 053 الدجاجي (رقم تعريف التسلسل : )١ المتوافر تحت مسمى إدخال EcoRI لدى تي. سوسي (برقم الحصول جين بانك (X13057 في 11101101110م عند موقع © حصر انزيم باطن نواه EcoRI في موقع الاستنساخ المتعدد . ويحتوي تسلسل CDNA (سوسي واخرون ؛ دورية ابحاث الاحماض النووية ؛ المجلد VT ؛ صفحة 11387 6 (YAAA على 84 من المنطقة غير المنسوخة للطرف *' (UTR) ؛ واطار قراءة مفتوح بمقدار bpd Vo) ترميز جزيء p53 حمض اميني 7776 ¢ UTR طرف ؟ بعدد YA وذيل م - متعدد صغير . ويحتوي p33 الدجاجي على نحو JW 7 EY مع مماثل بشري . ويتم الحصول على DNA ٠ 53م alas بمقدار 200 bp متضمناً اطراف EcoRI لاصقه ويتم هضم تركيب CMT (الثيونين الفلزي +SK/( metallothionein باستخدام EcoRI . يتم ربط ادخال cDNA 53م الدجاجي في موقع EcoRI . ويتم تحديد المستنسخات التي تتضمن ادخال p53 في اتجاه (الحس) الامامي . ويتم نقل التركيب في خلايا E.coli XL-1 Blue مختص (Stratagene) وذراعه في مرق LB زائد أمبيسيللين ampicillin طوال الليل . ويتم عزل البلازميد بواسطة Ve طريقة مستحضر البلازميد الاقصى ل Sambrook ؛ واخرون (الاستنساخ الجزئي : كتيب المعمل ¢ الطبعة الثانية ¢ ٠ ( ١854 ¢ Cold Spring Harbor, N.Y ويتم تنقية بلازميد DNA
مرتين بواسطة الطرد المركزي CsCl قبل النقل .
١ مثال
عزل الخلايا الاولية عن النسيج السليم
مصدر الخلايا لهذه التجارب هو dial دجاج SPAFAS الجنينية (مؤسسة (HyVac, Abel, JA .
ويتم التحقق من البيض وطبقاته بواسطة المزود بأعتبارها سالبة بالنسبة للنزلة الطيرية Avian
influenza © (النوع أ) ؛ والفيروس الريوي الطيري Avian reovirus ؛ والفيروسات الغدية
الطيرية Avian adenoviruses (المجموعات من ١ - *) ؛ وفيروس التهاب الدماغ والنخاع
الشوكي الطيري Avian encephalomyelitis virus ؛ والسرطان الظهاري Fowl pox ؛ وفيروس
Paramyxovirus )١ باراميكس فيروس (نوع (Newcastle disease virus مرض نيوكاسل
(Type 2) ¢ الفطريات المصورية <Mycoplasma سالمونيلا Salmonella والعوامل المعدية ٠ الاخرى المعروفة باصابتها لسلالة الدواجن . ويتم تحضين البيض المخصب في محضن معزول
معقم ويتم معالجة الاجنة ذات ٠١ أيام و ١9 يوماً لتأسيس المزارع الاولية .
ويتم استعمال أجنة SPAFAS عمرها ٠١ أيام للحصول على WDA من القلب والكبد ؛ والجلد ؛
والعضلة (الصدرية والفخذ) . ويتم استخدام الاجنة التي عمرها ١4 يوماً ايضاً لتأسيس مزرعات
جلدية أولية . ويتم فصل النسيج الجيني بأستعمال محلول trypsin/EDTA وتصفيحه في وسيط DMEM ٠ (جيبكو) DMEM media (Gibco) يحتوي على ٠١ 7 مصل عمل قاتل (Gibco) «
mM ١ يحتوي على (Gibco) antimycotic /مضاد الفطر antibiotic مضاد حيوي 7 ١
ml ٠ ويتم تجميع مستعلق الخلية المنفصلة في انبوب طرد مركزي . L-glutamine (Gibco).
يتضمن + 7 1 مصل بقري قاتل لإبطال مفعول التربسين trypsin وطرده مركزياً بمقدار
. دقائق ٠١ في معامل الجاذبية الارضية لمدة ٠
ف ويعاد تعليق الخلايا في ٠١ 01 من وسيط ايجلز دوبليكيى Dulbecco's modified Eagles's medium المعدل والمخصب ب ١ ؟ transferrin mg/m ١7 ١ insulin (Sigma), mg/ml /٠١ L-glutamine mM Y (Sigma, St.
Louis, Mo.) مصل ١ BB Jae 7 ؛ محلول مضاد حيوي/مضاد الفطر ونقله بالماصه الى ؛ - 0 أطباق mm2 ٠ بمقدار x 106 ١ خليه/طبق © وتحضينه في 40.5 م في © / ثاني اكسيد الكربون ؛ 790 هواء . وبعد YE ساعة من التحضين يتم تغيير الوسيط . ويتم السماح للخلايا بالنمو حتى الاحتشاء )© أيام) وتزال من الصفائح باستخدام محلول trypsin EDTA ( 05 % تربسين 0518( و 0507 7# حمض رباعي استيك ديامين ايثيلين ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) في (PBS واعادة تصفيحها للامرار الثاني . ٠ ويتم تجميد سلالات الخلايا في نيتروجين سائل liquid nitrogen . مثال ؟ نقل 053/تركيب معزز الثيونين الفلزي metallothionein الى الخلايا يتم تحويل خلايا skin cells ala دجاجة اولى من اجنة ELL-O عمرها Lag V4 أثناء الامرار الاول الى الثاني . ويتم تصفيح الخلايا بكثافة ٠١ ” خلية في أطباق mm2 ٠٠١ في DMEM ٠ جلوكوز Je زائد ٠١ 7 مصل عجل Jil محقق ومخصب ب ١ر١ transferrin mg/m insulin (Sigma) mg/m 1١ ١ (Sigma, St.
Louis, Mo), ومضادات حيوية . ويتم زراعة الخلايا ليلا لاستقرار المزارع واعادة تغذيتها في الصباح التالي ب 4 mm من وسيط ونقلها بأستعمال 1 lipofectamine Transit وذلك باستخدام توجيهات التجميع (مؤسسة PanVera (Corporation, Madison, Wis . وكل نقل يستخدم ٠١ ع« من تركيب 53م المنقى .
YA
ويتم نقل LAN لمدة © ساعات وتغيير الوسيط باستعمال مضاد حيوي 6418 المنتقى ) Sigma, (St. Louis, Mo . بمقدار mg/m ٠٠١ . ويتم امرار الخلايا المنقولة في وسيط منتقي حتى تنمو البؤر (عادة من ؛ الى ٠١ أيام) ؛ ويتم انتقاء البؤر وبالاستنساخ ونشرها . يتم زراعة الخلايا بمقدار ١ الى ¥ إمرار لتشكيل بؤّر mg/m 600) 6418) خلايا مقاومة oo (حوالي ٠١7 الى (Ved . ويتم Yo) تقسيم الخلايا عند الحاجة بمقدار © 105 x خلية/طبق <٠ لتجنب تأثيرات كثافة التصفيح على نتائج قدرة الملوثات p53 . ويتم نقل خلايا التحكم غير المنقولة صورياً باستخدام بلازميد تحكم . وتشيخ خلايا التحكم وتموت عند الامرار ١ . وتتم زراعة الخلايا في 50 205804 mM وسيط انتقائي لمدة أسبوعين حتى fas الخلايا المنقولة باستقرار في الانتشار . ولا تتلقى أطباق مزرعة التحكم العديدة سلفات زنك zine sulfate Ve (ولا حث لمعزز الثيونين الفلزي (metallothionein . وبعد أسبوعين من اعادة التغذية (لمدة ؛ أسابيع بعد النقل) تبداأً بؤر مميزة ظاهرياً من الخلايا في الظهور تنمو بصورة أسرع من الخلايا البادية الاكبر عمراً المحيطة . وبعد اعادة تغذية اضافية تظهر احدى بر خلايا الجلد المنقولة بسرعة خلايا متنامية . ويتم إزالة ما يقرب 10% Sitimes. خلية/يبؤر من صفيحة المزرعة بإستعمال حلقة استنساخ . وتنقل هذه الخلايا الى صفيحة سادسة . ويتم تقسيم طبقتين ٠ .من WIA محتشدة قريبة مزروعة في وجود زنك الى + أطباق بمقدار 7٠١ x ١ خلية/طبق مع اضافة 50 mM zine . ويتم نشر الخلايا الجلدية كل “ الى ؛ أيام في وجود زنك بمقدار ١ * ٠ خلية/سم؟ حتى الامرار ١7 . ويوجد انخفاض في مضاعفات التجمع عند الامرار Yo الى YY وبعد ذلك زيادة حتى ٠,7 الى ١ في اليوم . ويتم الحصول ايضاً على بؤر الخلايا من خلايا الجلد المنقولة المعزولة عن أجنة الدجاج التي عمرها ٠١ أيام . ونتائج هذه التجربة © مدهشة لان 53م معروف جيداً في الكتابات بأعتباره مانع لتولد الاورام وبأعتباره منظم نمو .
Y4 مضاد p53 ومزارع خلايا الجلد المزدوجة يتم نقلها بتركيب متطابق يحتوي على جزء جينة . للحس . ولا تخضع الخلايا المنقولة بهذا التركيب للتخليد وبالنسبة لخلايا العضلة القلبية والعضلة الصدرية الاولية ؛ يتم اذابة المزرعات المجمدة احتشاد) من كل نوع خلية باستخدام تركيب 7 Ve الى x 106 )40 A وإمرارها . ويتم نقل خلايا (مؤمسة lipofectamine Transit II و « polyamine الحسي مع مركب بولي امين 053 © عند الامرار 7 . ويتم الاحتفاظ بالخلايا غير المنقولة (PanVera Corporation, Madison, Wis . )6418 باعتبارها تحكم نحو ايجابي وبأعتبارها تحكم موت خلية سلبي (المزارع بأضافة وسط خالي من 1 ٠٠١ بالتقطير الى mi/mg DNA VY وبالنسبة للنقل ؛ يتم اضافة ؟ الى ويتم خلط الخليط برقة وتحضينه في درجة (Life Technologies « RPMI 1 640) المصل المتوافر Transit II في مفاعل mg DNA ١ الى ١ حرارة الغرفة لمدة © دقائق . ويتم تخفيف ٠ وبعد فقرة ٠. غسل الخلايا واعادة تغذيتها TS) . ساعات sad بواسطة الصناع وتحضينه x 7 ساعة ؛ يتم تقسيم كل من خلايا القلب والصدر في ؛ أطباق كل منها YE استعادة مدتها خلية ووضعها تحت انتقاء 6418 ؛ وحث الزنك . ويتم تحديد بؤر الخلايا في مزارع 5 . زنك مضنت mM © ٠ الاختبار . ولا يتم الحصول على بؤر من أطباق التحكم التي تتلقى مثال ؛ oe اختبار تركيب 53م المحتوي على الخلايا للكشف عن ملوثات الفيروسيتم خلية Limes. 10.5up.6 اختبار الخلايا للكشف عن فاعلية انزيم الانتساخ العكسي . ويتم عزل من المزارع النامية سريعاً في ؛ 81 من وسيط . ويؤخذ الوسيط من خلال إذابات تجميد عديدة مدرج 7 ٠١ في - 86م لحل الخلايا . ويتم جعل الوسيط مع الخلايا الحالة طبقات فوق
Yo دقيقة ؛ بمقدار 8٠ر50 دورة في الدقيقة ٠0 ويتم تدويم المدرج لمدة glycerol جليسيرول ويتم تكوير . (Beckman Instruments, Pal Alto, Calif (مؤسسة SWA0 باستخدام دوّار
Nonidet ml 7١0 جزيئات الفيروس ؛ ان وجدت ؛ ويتم استبعاد الوسيط ويعاد تعليق الكرية في . (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) P-40 كوكتيل aml © من العينة الى ml © م . ويضاف 4١ عند eppendorf ويتم تسخين أنبوب ©
MM 7 VA ؛ تركيز هيدروجين mM Tris £0 انزيم الانتساخ العكسي الذي يحتوي على
Triton X-100 , ل « manganous acetate اسيتات منجانوز b-2,2 mM مركبتو ايثانول
Boehringer Mannheim Biochemical, ) dATP , dCTP , dGTP من كل من 10 mM dT 12-19 بادئ ng ٠ « polyA (Sigma) متعدد أ (سيجما) mg Y,¢ ¢ (Indianapolis, Ind الى ٠5٠,000 3 H thymidine triphosphate تفاعل mCi/reaction 5 « (Pharmacia) ٠ . ( Amersham ؟ pmole دورة في الدقيقة/فاعلية YA, «oo £0 و ddH20 من ml © ويتم تحضين التفاعل لمدة ساعة في 1 م . ويستخدم التحكم السالب كوكتيل . ويتم تضمين اثنين من التحكمات الايجابية المعروفة مع المعايرة . ويتم ايقاف ml trichloroacetic acid حمض ثلاثي كلورو استيك 7 ٠١ ا« من ١ المعايرة بواسطة اضافة ويتم ترشيح الخليط من . (Columbus, Wis ¢ للصناعات الكياوية Columbus مؤسسة « TCA) ٠ ميكرون . ويتم اجراء عدة عمليات غسيل ١,40 Whatman GF/C glass خلال مرشح باستعمال © 108.7 . ويتم نقل المرشح الى قارورة الومضات التي تحتوي على © 015 من للآلات Beckman الومضات من مؤسسة dae سائل عد الومضات . ويتم عد العينات على الى 00869 موقع شباك . وتعتبر الزيادة بمقدار ثلاثة أضعاف العدد أكبر من ١5٠١ باستعمال . خلفية الكوكتيل (تحكم سلبي) ايجابية YS
١ وعند الاختبار أثبتت المزارع الاولية أنها سالبة كما فعلت الخلايا الاخرى المستخدمة في هذا «Crittenden) الاختراع . ولمعلومات اخرى عند معايرات انزيم الانتساخ العكسي راجع . ( YAVE YA الى YYA ؛ صفحة OV واخرون ؛ مبحث الفيروسات . المجلد o مثال immortalized تحديد الخلايا المخلدة © إمرار في مزرعة النسيج بعد ادخال YO تتميز الخلايا بأنها خالدة عندما تخضع لأكثر من - الذي يحتوي على تركيب في الخلايا وخضوعه ل metallothionein )/الثيونين الفلزي 3 الى 8ر١ مضاعفات تجمع في اليوم . ويتم مقارنة هذا المعدل بتحكمات المرحلة المتأخرة ٠ر1 ( metallothionein الخلايا التي لم تتلق تركيب 053/معزز الثيونين الفلزي ٠ غير المعالجة (اي . في اليوم ١7 الى ١.١ التي تحتوي على معدلات مضاعفة تجمع من ٠
Ve للإمرار metallothionein الجلد المتلقية ل 053/معزز ثيونين فلزي WIA وحالياً تخضع . بعد ادخال تركيب الجينة في الخلايا . ويثم تحديد اكثر من ه١٠ مستنسخ مخلد في اجراء النقل وتعد الخلايا طبيعية شكلاً ومانعة التلامس . وتخضع خلايا عضلة الصدر حالياً للإمرار ؟* ؛ ويتم انتقاء . VY وطبيعيه شكلاً . وتظهر نمو مانعاً للتلامس وتتضمن معدل مضاعفة تجمع »ومانعه Ss ؛ وطبيعيه ١ للامر ار Wa مستنسخ لعمل التحليل . وتخضع خلايا القلب VY Vo للتلامس وتتضمن معدل متوسط مضاعفة تجمع 7 . وهناك عديد من المستنسخات تتضمن . مستنسخات لدراسة اخرى ٠١ ويتم انتقاء YY و ٠,4 معدلات د تجمع بين
نضا مثال + معايرة تشكيلات مستعمرة أجاروز ناعم لتقييم فاعلية توليد الاورام للخلايا
Soft Agarose Colony Formations Assay to Assess Tumorigenic Potential of Cells لاجراء اختبار الكشف عن فاعلية توليد الاورام ؛ يتم اختبار [ps3 Wa معزز الثيونين الفلزي dial metallothionein © لكشف نموها في اجار ناعم . ويتم عمل acl اجاروز ناعم بواسطة خلط ml ١١ من Y 7 محلول اجاروز (المعقم بالضغط حتى 0% م ) في ml 7٠,3 من وسيط McCoy's SA المخصب ml VY + ([BRL/Gibco مصل Ji Jae (تم ابطال (21 mg/ml-L-serine ml} مخزيرن)ء ZY Na نيرو ات mio » مفعول حرارته ‘ ( مخزون mls Hepes (IM YY,© مخزون) و 200 mM-L-glutamine ml © « مخزون) من وسيط mls V ويتم سكب ٠ مخزون معقم مرشح) mg/ml £,¢ ) Asparagine mls رة 0 ٠ الدافئ/اجاروز 16 على طبق مزرعة نسيجية mm2 ٠٠١ والسماح له بالتصلب في day حر ارة الغرفه في غطاء مزرعة نسيجية لمدة ساعة . ويتم ازالة الخلايا من المزارع النامية بفاعلية (حوالي 560 الى EVs احتشاد) بواسطة استخدام تربسين لتحقيق مستعلق خلية و aa في وسيط DMEM جديد يحتوي على ٠ مصل عجل Bat Vo (مع جلوتاميد - L ومضادات حيوية/مضاد الفطر) ويثم اضافة x 106 ١ خلية الى OY £ ge ml وسيط DMEM يحتوي على ٠١ 7 مصل dae قاتل ؛ 8لا لن« من ١ 7 اجاروز agarose ¢ و ml ٠ ميركابتو ايثانول mercaptoethanol 57 والمطلوب العناية الاكيدة بان الوسيط الدافئ/اجاروز media/agarose عند درجة 47 م قبل اضافة الخلايا . وبسرعة يتم تحميل © ml من مستعلق الخلية المذكور عاليه على صفائح اجاروز agarose plates .
vy ويتم زراعة الخلايا عند 77م في © 87 اكسيد الكربون و 90 7 محضن هواء وملاحظتها 3 p-nitrophenyl-S-pheny! tetrazolium يوما . ويتم صبغ الصفائح المزدوجة ب VO لمدة وفحصها في أيام صفر » 6 106 158 70 70و 2# لكشف (INT (صبغة chlorite . ايجابية mm ٠١ تشكل ونمو المستعمرة . وتعتبر كل المستعمرات المصبوغة أكبر من
٠ والخلايا كلها سالبة عند الاختبار والمعلومات الأخرى المتعلقة بمعايرة اجار ناعم متوافره لدى (Hamburger واخرون ؛ دورية بعنوان ابحاث علم الاحياء السريري المتقدمة . المجلد EA ؛ الصفحات ؟؛ » YVR + ١0 سنة +148 . مثال VY تولد أورام الخلية المخلدة immortalized
Minnesota في ظل الخطوط الارشادية الموضحة في بروتوكول الاستخدام الحيواني لجامعة ٠ يتم حقن الخلايا )١4976 مارس 1890 ؛ حتى ديسمبر eV - 9502080 # (البروتوكول رقم في حيوانات اختبار وذلك لتحديد ما اذا كانت الخلايا مولدة للاورام ام لا ولاختبار فاعلية توليد metallothionein الاورام لبروتين 053 الدجاجي في ظل سيطرة معزز الثيونين الفلزي . في الدجاج immortalized الدجاجي » يتم حقن الخلايا المخلدة
Vo وتزال الخلايا النامية بفاعلية من صفائح مزرعة الخلية ؛ وتحقن في + دجاجات بالغة خط SPAFAS . وتوضع الحقن التي تستخدم تحت الجلد المكونة من 4.times.10.5up.6 خلية في جدائل جناح الدجاج . ويتم فحص مواقع الحقن اسبوعياً لمدة 0 ¥ شهراً . ولا يتم ملاحظة اورام عند موقع الحقن لاي من الخلايا المنقولة (الجلد ؛ القلبية ؛ والعضلة) المنتجة حتى تتاريخه وتبقى كل الحيوانات صحية .
نين
A مثال انتشار الفيروس في خطوط خلية 53م/ثيونين فلزي metallothionein يتم اختبار هذه الخلايا لكشف قدرتها على دعم انتاج الفيروس . ويتم اصابة 7,8 108 x خلية تحتوي على تركيب 3 /معزز الثيونين الفلزي metallothionein بسلالة1733 WSS - Re.o من الفيروس الريوي Reovirus having © الذي يحتوي على عيار 8,7 TCID50/mL وتصاب الخلايا بأعداد اصابة تبلغ 0,065 0 000 أو 0005 جزئيات فيروس معدي/خلية . ويتم زراعة الخلايا المصابة في زجاجات دوّارة واختبارها عند الساعات 48 ؛ TE و VY بعد الاصابة وتظهر نمو فيروسي منتج . وكذلك ايضاً يتم بذر الخلايا في زجاجات دوّارة بمقدار x 104 7,٠ خلية/«» . ويتم تحضين ٠ الزجاجات الدوّارة في FY م لمدة 8 أيام على مجموعة Jala دوّار بمقدار كر؛ الى درء 41 . ويتم اصابة الخلايا بفيروس الحلا الذي يصيب الديوك الرومية (فيروس HVT ؛ سلالة 3) . ويتم اصابة الخلايا بمقدار اعداد اصابة ١001 عندما يكون هناك 976 عند الساعة 90 الى WAN خلية في الزجاجات الدوّارة . ويتم حصر 1.33.times. 10.sup.7 عندما تعطي 40 7 من الطبقة دليلاً على باثولوجيا الخلية المصحوبة بالعدوى . وتزرع الخلايا ٠ ويحتفظ بها في DMEM مع EBS / V+ اشعاعي - ع ,2mM ٠.6 ¢ Hyclone 108 آ/ع ٠٠١ L-glutamine وحدة/ان بنسللين (Streptomycin mg/ml ٠٠١ (Penicillin فت mg/L ٠,١ insulin mg/L ٠١,١ Amphotericin 3 ml/ml صندصعدة1. وتظهر الدراسات . 1.4.times.10.sup.4 pfu/ml J sa الاولية ان الخلايا تنتج وتعد الخلايا قادرة ايضاً على دعم مضاعفة فيروس مرض ماريك Marek's .
Yo
مثال 9
استخدام خلايا الجلد المنقولة باعتبارها ركيزة خلية
تعد خلايا الاختراع مفيدة باعتبارها ركيزة لتدعيم مضاعفة الفيروس للخلايا الاولية. وفي هذه
التجارب يتم خلط خلية الجلد المخلدة immortalized 53م بالخلايا الاولية . وفي Gaal
© الدراسات يتم اصابة الخلايا الاولية وخلطها مع الخلايا المخلدة immortalized ووضعها في
مزرعة ؛ وفي دراسة اخرى تصاب الخلايا الاولية وتوضع على الخلايا المخلدة immortalized
حيث تكون الخلايا المخلدة immortalized موضوعة بالفعل كمخضرة في قارورة المزرعة
النسيجية . وفي احد الامثلة يكون الفيروس عباره عن فيروس متلازمة قطر البيض والخلايا
الاولية عباره عن خلايا كبد جنينية دجاجية اولية . وفي مثال اخر تكون خلال بطائية ؛ ويفضل ٠ خلايا بطانية لكلية ويكون الفيروس عباره عن فيروس الالتهاب الشعبي المعدي ؛ والنسبة
المفضلة للخلايا الاولية الى الخلايا المخلدة immortalized تتراوح من ١ : * الى Yor) ¢
ويفضل من ٠١ : ١ . وتعتبر عيارات الفيروس المأخوذة من الخلايا الاولية المزروعة في
تجمع الخلية المخلوطة أكبر من عيارات الفيروس المأخوذة من الخلايا الاولية في المزرعة
وحدها . والخلايا المخلدة immortalized تسمح باستعمال الخلايا الاولية بالنسبة لتكاثر الفيروس Ne تحت شروط تجارية .
وفي الوقت الذي يتم فيه وصف النماذج الخاصة من هذا الاختراع بالتفصيل + سوف يتضح
للمتخصصين في هذا المجال ان هذه النماذج هي على سبيل المثال وليس الحصر وان المدى
الحقيقي للاختراع هو ذلك المحدد في عناصر الحماية التالية .
Claims (1)
- عناصر الحماية -١ ١ طريقة لتحويل WA دجاج transforming chicken cells تشتمل على الخطوات: Y وضع حمض نووي nucleic acid يشفر 053 تحت تحكم معزز ميتالو ثيونين metallothionein ¢ في_ناقل جيني قادر على توجيه التعبير الوراثي ل p33 ° إدخال الناقل الجيني في خلايا دجاج رئيسية primary chicken cells © > واختيار بؤر من الخلايا لها Aa) مضاعفة مجموعة تتراوح بين 0.6 و 1,0 "> مضاعفة مجموعة لكل يوم تقريباً حيث تكون الخلايا سالبة بالنسبة لإنزيم النسخ A العكسي reverse-transcriptase وليست مكونة للأورام .non-tumorigenic ١ "- الطريقة وفقاً لعنصر الحماية (١)؛ حيث تكون WIAD عبارة عن خلايا جلد skin cells Y . ١ »- الطريقة وفقاً لعنصر الحماية )1( حيث تكون الخلايا عبارة عن خلايا Y عضلات الصدر breast muscle cells . ١ ؛- الطريقة وفقاً لعنصر الحماية (١)؛ حيث تكون الخلايا عبارة عن خلايا Y عضلة القلب .heart muscle cellsو -٠ \ الطريقة وفقاً لعنصر الحماية o)) حيث تكون الخلايا عبارة عن خلايا day Y ليفية fibroblasts ١ 7- طريقة لنشر جسيم فيروسي virus باستخدام خلية واحدة على الأقل من Y مزرعة DA دجاج حية Cua تحتوي خلايا المزرعة على Ji جيني gene 7 201 يعبر وراثياً عن pS3 تحت تحكم معزز ميتالو ثيونين «metallothionein ¢ وتجميع الفيروس virus المنتج بواسطة الخلايا . ١ "- الطريقة وفقا لعنصر الحماية )1( حيث يكون الفيروس عبارة عن فيروس Y نسخ عكسي is Reovirus 7/105 —A ١ الطريقة وفقا لعنصر الحماية )1 حيث يكون الفيروس عبارة عن فيروس HVT Y ١ - الطريقة وفقا لعنصر الحماية )1( حيث يكون الفيروس عبارة عن فيروس Y مرض SA) الدواجن Fowl pox virus -٠ ١ طريقة لنشر فيروس virus تشتمل على الخطوات: Y تلامس جسيم فيروس معدي infectious virus واحد على الأقل مع خلية رئيسية؛ 7 نمو الخلايا الرئيسية مع خلايا دجاج da تحتوي على ناقل جيني gene vectorYA في metallothionein تحت تحكم معزز ميتالو ثيونين p53 عن Ws يعبر ¢ المنتج من مزرعة الخلايا virus وتجميع الفيروس ¢cell culture مزرعة خلايا ° .cell culture 1 تحث تحكم معزز p33 خلايا الدجاج غير المحولة المحتوية على Jaa -١١ ١ واحد على الأقل vector والمحتوية على ناقل metallothionein ميتالو ثيونين عن البروتين ناتج عودة الارتباط الجيني expression قادرة على التعبير الوراثي 7 في خلايا حية. ¢ عن expression وفقاً لعنصر الحماية )11( التي تعبر وراثياً LAY VY \ . البروتين ناتج عودة الارتباط الجيني يشفر الناقل جزءاً على الأقل من Cua (VY) الخلايا وفقاً لعنصر الحماية -١# ١ ناتج عودة الارتباط الجيني. virus فيروس Y وفقاً لعنصر الحماية )0( حيث يكون الناقل عبارة عن ناقل LAY -4 ١ retroviral vector لفيروس النسخ العكسي Y
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/696,376 US5830723A (en) | 1996-08-13 | 1996-08-13 | Method for immortalizing chicken cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SA97180647B1 true SA97180647B1 (ar) | 2006-09-05 |
Family
ID=24796804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SA97180647A SA97180647B1 (ar) | 1996-08-13 | 1997-11-26 | طريقة لتخليد الخلايا cell immortalization |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5830723A (ar) |
| EP (1) | EP0956355B1 (ar) |
| JP (1) | JP3833714B2 (ar) |
| KR (1) | KR100375872B1 (ar) |
| CN (1) | CN1133745C (ar) |
| AR (1) | AR008295A1 (ar) |
| AT (1) | ATE280236T1 (ar) |
| AU (1) | AU717693B2 (ar) |
| BR (1) | BR9711165B1 (ar) |
| CA (1) | CA2263790C (ar) |
| CO (1) | CO4650227A1 (ar) |
| DE (1) | DE69731310T2 (ar) |
| DZ (1) | DZ2292A1 (ar) |
| ES (1) | ES2230619T3 (ar) |
| GT (1) | GT199700092A (ar) |
| HK (1) | HK1022497A1 (ar) |
| HU (1) | HUP9903946A3 (ar) |
| IL (1) | IL128512A (ar) |
| MA (1) | MA24592A1 (ar) |
| MY (1) | MY121698A (ar) |
| NZ (1) | NZ334146A (ar) |
| PE (1) | PE1899A1 (ar) |
| PT (1) | PT956355E (ar) |
| SA (1) | SA97180647B1 (ar) |
| UY (1) | UY24667A1 (ar) |
| WO (1) | WO1998006827A2 (ar) |
| ZA (1) | ZA977215B (ar) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1161689A1 (en) | 1999-03-16 | 2001-12-12 | Serex, Inc. | Method and device for detection of apo a, apo b and the ratio thereof in saliva |
| EP1048725B1 (en) * | 1999-04-27 | 2005-07-06 | Transgene S.A. | Process for production of mammalian cell lines |
| EP1048724A1 (en) * | 1999-04-27 | 2000-11-02 | Transgene S.A. | Human myoblast cell lines and their uses |
| EP1069187A1 (en) * | 1999-07-14 | 2001-01-17 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Mosaic Infectious Bursal Disease Virus vaccines |
| FR2836924B1 (fr) | 2002-03-08 | 2005-01-14 | Vivalis | Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet |
| EP1528101A1 (en) | 2003-11-03 | 2005-05-04 | ProBioGen AG | Immortalized avian cell lines for virus production |
| ATE444741T1 (de) | 2006-05-10 | 2009-10-15 | Biocompatibles Uk Ltd | Glp-1 peptide enthaltende kugelförmige mikrokapseln, deren produktion und deren verwendung |
| EP2163243A1 (en) | 2008-09-12 | 2010-03-17 | Biocompatibles UK Limited | Treatment of acute myocardial infarction (AMI) using encapsulated cells encoding and secreting GLP-1 peptides or analogs thereof |
| EP2251028A1 (en) | 2009-05-12 | 2010-11-17 | Biocompatibles Uk Ltd. | Treatment of eye diseases using encapsulated cells encoding and secreting an anti-angiogenic factor and/or a neuroprotective factor |
| US20140004201A1 (en) | 2010-09-15 | 2014-01-02 | Biocompatibles Uk Ltd. | Treatment of Vascular Diseases Using Encapsulated Cells Encoding and Secreting GLP-1, or a Fragment or Variant Thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2634784A1 (fr) * | 1988-08-01 | 1990-02-02 | Inst Nat Sante Rech Med | Lignees de cellules epitheliales intestinales immortalisees, leurs procedes de preparation et leurs applications en tant que systeme de production de facteurs de croissance et en tant que modele d'etude de la physiopathologie digestive fonctionnelle et cancereuse |
| DE4142452A1 (de) * | 1991-12-18 | 1993-06-24 | Max Planck Gesellschaft | Mittel zur stimulierung der teilungsaktivitaet tierischer zellen |
| EP0804553A4 (en) * | 1993-07-09 | 1999-07-07 | Jolla Cancer Res Found | CONDITIONAL IMMORTALIZATION OF GERM CELL LINES |
| AU2640595A (en) * | 1994-05-17 | 1995-12-05 | Rutgers University | Immortalized and transformed astrocyte-derived cells |
-
1996
- 1996-08-13 US US08/696,376 patent/US5830723A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-08-12 DZ DZ970142A patent/DZ2292A1/fr active
- 1997-08-12 ZA ZA9707215A patent/ZA977215B/xx unknown
- 1997-08-12 MA MA24764A patent/MA24592A1/fr unknown
- 1997-08-12 MY MYPI97003691A patent/MY121698A/en unknown
- 1997-08-12 GT GT199700092A patent/GT199700092A/es unknown
- 1997-08-13 PT PT97937274T patent/PT956355E/pt unknown
- 1997-08-13 KR KR10-1999-7001216A patent/KR100375872B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 ES ES97937274T patent/ES2230619T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-13 AT AT97937274T patent/ATE280236T1/de active
- 1997-08-13 AU AU39829/97A patent/AU717693B2/en not_active Expired
- 1997-08-13 CN CNB971973237A patent/CN1133745C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-13 IL IL12851297A patent/IL128512A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 EP EP97937274A patent/EP0956355B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-13 CA CA002263790A patent/CA2263790C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-13 WO PCT/US1997/014391 patent/WO1998006827A2/en active IP Right Grant
- 1997-08-13 UY UY24667A patent/UY24667A1/es not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 NZ NZ334146A patent/NZ334146A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 CO CO97046517A patent/CO4650227A1/es unknown
- 1997-08-13 AR ARP970103697A patent/AR008295A1/es active IP Right Grant
- 1997-08-13 PE PE1997000706A patent/PE1899A1/es not_active Application Discontinuation
- 1997-08-13 HU HU9903946A patent/HUP9903946A3/hu unknown
- 1997-08-13 DE DE69731310T patent/DE69731310T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-13 JP JP51005998A patent/JP3833714B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-13 BR BRPI9711165-1A patent/BR9711165B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-11-26 SA SA97180647A patent/SA97180647B1/ar unknown
-
2000
- 2000-03-07 HK HK00101428A patent/HK1022497A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU726820B2 (en) | Immortalized cell lines for virus growth | |
| EA004402B1 (ru) | Модуляторы регенерации тканей | |
| Lujvidin et al. | SV40 immortalizes myogenic cells: DNA synthesis and mitosis in differentiating myotubes | |
| SA97180647B1 (ar) | طريقة لتخليد الخلايا cell immortalization | |
| Calothy et al. | A transformation defective mutant of Rous sarcoma virus inducing chick embryo neuroretinal cell proliferation | |
| WO1998006827A9 (en) | Method for immortalizing cells | |
| CN108795982A (zh) | 一种鸡干扰素α生物学活性检测方法 | |
| Scholz et al. | An avian hepatoma cell line for the cultivation of infectious laryngotracheitis virus and for the expression of foreign genes with a mammalian promotor | |
| JP2003501014A (ja) | 増強タンパク質安定化の方法およびその安定化タンパク質の生産に有用な細胞株の製造方法 | |
| MXPA99001484A (es) | Metodo para inmortalizar celulas | |
| Shimada et al. | Lifespan extension of basal cell nevus syndrome fibroblasts by transfection with mouse pro or v‐myc genes | |
| CN108753917A (zh) | 一种羊干扰素τ生物学活性检测方法 | |
| MXPA99001485A (es) | Lineas de celulas inmortalizadas para crecimientode virus | |
| Thraves et al. | Radiation-Induced Transformation in Human Breast Cells. | |
| Culp et al. | Prostate Carcinoma Metastasis Tracked with Histochemical Marker Genes. |