DE69737388T2

DE69737388T2 - Immortalisierte geflügelzellinien

Info

Publication number: DE69737388T2
Application number: DE69737388T
Authority: DE
Inventors: Jean-Francois Bouquet; Miloud Benchaibi; Jacques Samarut; Philippe Desmettre
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Merial SAS; Ecole Normale Superieure de Lyon; Ecole Normale Superierure de Lyon
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Ecole Normale Superieure de Lyon; Ecole Normale Superierure de Lyon; Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
Priority date: 1996-05-23
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2017-05-23
Also published as: EP0901523B1; BR9703389A; DE69737388D1; FR2749021A1; AU732867B2; US20010036656A1; DK0901523T3; CA2256038A1; FR2749021B1; US20050118700A1; AU3036897A; PT901523E; JP2000509253A; ATE354643T1; EP0901523A1; NZ333006A; US6872561B2; WO1997044444A1; US6280970B1; ES2283016T3

Description

Immortalisierte Geflügelzelllinien
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vogelzelllinie und ihre Derivate.
Zelllinien ausgehend von aus Vogelarten entnommenen Organen können nicht spontan etabliert werden, wie es bei bestimmten Organen der Fall ist, die von Säugerarten stammen.
Die einzigen Zelllinien, die bisher zur Verfügung stehen, wurden unter Verwendung der transformierenden Eigenschaften von bestimmten Vogelviren erhalten, die onkogene Eigenschaften besitzen, wie die Retroviren der Gruppe aviärer Leukosen oder das Virus der Marek-Erkrankung, oder bestimmte chemische Moleküle, wie Methylcholantren und Diethylnitrosamin.
Diese Zelllinien zeigen größtenteils einen bedeutenden Transformationscharakter, der sie für die Vermehrung von Impstofffviren ungeeignet macht.
Autoren haben einen neuen Weg eingeschlagen, der darin besteht, in die Zellen einen Vektor einzuführen, der keinen onkogenen Charakter aufweist, aber in der Lage ist, in diese Zeilen ein Gen einzuführen, das aufgrund seiner Kapazität, die Immortalisierung zu induzieren, ausgewählt wurde.
Die ersten Versuche wurden mit Hilfe von Vektoren durchgeführt, die Vogel-Retrovirusgene wie erbA, erbB integrieren.
Die französische Patentanmeldung FR-A-2 596 770 schlägt ein Immortalisierungsverfahren vor, bei dem eine Kultur aus Vogelzellen oder Säugerzellen mit einem Vektor oder einem System infiziert wird, das für diese Zellen keinen onkogenen Charakter zeigt, aber in der Lage ist, in diese Zellen ein Gen zu integrieren, ausgewählt aus v-myb, v-ets und v-erbA. Geeignete Vektoren können die Viren AMV, E26 und XJ12 sein, wobei das Letzte ein Virus ist, das vom AEV-Virus stammt, in dem das Gen v-erB, das onkogen ist, supprimiert wurde.
In der Praxis konnten mit diesen Versuchen Zelllinien erhalten werden, die ausgehend von Zellen der hämatopoetischen Linien hergestellt wurden, aber sie erbrachten nicht die erhofften Ergebnisse für die Hühner-Embryonalzellen in adhärenter Kultur, wie Fibroblasten oder epitheliale Zellen.
Mit Hilfe des mybiale-Onkogens (internationale Patentanmeldung WO91/18971) konnten nicht transformierte Vogelzelllinien vom Typ Myeloblasten (Blutzellen) erhalten werden.
Gleichzeitig haben Autoren die frühen Gene t und T des Affen-SV40-Virus vorgeschlagen, um Zellen zu immortalisieren, die von verschiedenen Säugergeweben stammen (D.S. Neufeld et al., Molecular and Cellular Biology, August 1987, 2794-2802, O. Kellermann und F. Kelly, Differentiation 1986, 32, 74-81 und französische Patentanmeldung FR-A-2 649 721 ).
Die französische Patentanmeldung FR-A-2 649 721 schlägt ihrerseits ein Verfahren zur konditionellen Immortalisierung vor, das für alle Zelltypen und in allen Arten nützlich wäre, wobei hier das Ziel darin besteht, den Nachteil der großen Spezifität der klassischen Wege (Beschränkung auf bestimmte Arten und/oder Zelltypen) zu beseitigen: Transformation der Zellen durch ein transformierendes Virus (Adenovirus, Epstein-Barr-Virus, bestimmte Papovaviren wie das SV40-Virus oder Polyomavirus; beispielsweise wird angegeben, dass das SV40-Virus nur Nagerzellen und menschliche Zellen transformiert) Transfektion mit Konstrukten, die ein transformierendes Gen enthalten, das mit einem viralen Promotor verbunden ist; Transfektion mit einem transformierenden Gen, das mit einem zellulären Promotor verbunden ist. Die Wahl dieser Patentanmeldung stützt sich auf ein Konstrukt, das ein DNA-Fragment der regulatorischen Sequenz von Vimentin und ein DNA-Fragment assoziiert, das ein immortalisierendes Gen codiert, das das T-Antigen des SV40-Virus unter der Kontrolle des induzierbaren Vimentin-Promotors sein kann. Die Vogelarten werden in dieser Schrift niemals erwähnt.
Bei den Vogelarten wurde die tatsächliche Verwendung derartiger viraler Onkogene niemals beschrieben, mit Ausnahme der Verwendung der 12S-Form des E1A-Proteins des menschlichen Adenovirus 5, mit der Epithelzellen der Wachtel immortalisiert werden konnten (Guilhot et al. (1993), Oncogene 8: 619-624).
Entgegen aller Erwartungen ist es den Erfindern gelungen, eine immortale und nicht transformierte Vogel-Zelllinie herzustellen.
Darüber hinaus haben die Erfinder herausgefunden, dass es möglich war, immortale und nicht transformierte Vogel-Zelllinien sogar ausgehend von Vogelgewebezellen herzustellen, d.h. Zellen, die keine Zellen des Blutkreislaufes oder hämatopoetische Zellen sind.
Die vorliegende Erfindung hat daher immortale und nicht transformierte Vogelzellen zum Gegenstand, die insbesondere von Vogelgeweben stammen, d.h. Zellen, die keine Zellen des Blutkreislaufes oder hämatopoetische Zellen sind, insbesondere Fibroblasten und Epithelzellen, beispielsweise aus Embryonen.
Die vorliegende Erfindung hat insbesondere immortale und nicht transformierte Vogelzellen zum Gegenstand, die in ihrem Genom integriert das Gen SV40 T + t unter der Abhängigkeit des MTI (Maus-Methallothionein I)-Promotors enthalten.
Vorzugsweise integrieren sie auch den SV40-Promotor, der funktional mit dem Neomycinresistenzgen verbunden ist.
Vorzugsweise integrieren die Zellen auch mindestens eine LTR-Sequenz. Die LTR-Sequenz kann deletiert sein, wie in den Beispielen beschrieben.
Die Zellen integrieren vorzugsweise den Vektor pDAMT, der in 1 dargestellt ist.
Die Zellen sind aviären Ursprungs, können aber insbesondere von der Barbarie-Ente stammen.
Die Erfindung hat, genauer gesagt, die immortale und nicht transformierte Vogel-Zelllinie TDF-2A zum Gegenstand, die bei der CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes de Institut Pasteur) unter der Hinterlegungsnummer I-1712 hinterlegt ist.
Natürlich umfasst die Erfindung die Zellen, die von diesen Linien stammen. Daher sollte klar sein, dass nicht nur die Zellen umfasst werden, wie diejenigen, die bei der CNCM unter den angegebenen Hinterlegungsnummern hinterlegt sind, sondern auch die Zellen, die die Nachkommenschaft der Vorstehenden ausmachen, einerseits diejenigen, die durch einfache Vermehrung erhalten wurden und die bei der Vermehrung Mutationen erfahren können, und andererseits diejenigen, die nach beabsichtigten Modifikationen erhalten wurden, was man dann als abgeleitete Zellen („Derivate") bezeichnet, und natürlich auch Zellen, die beide Modifikationsarten erfahren haben.
Die Erfindung umfasst demnach auch die abgeleiteten Zellen („Derivate"), die durch Modifikationen der obigen Zellen erhalten werden. Diese Modifikationen können umfassen:

– Insertion einer oder mehrerer Expressionskassetten, wobei jede eine oder mehrere Nucleotidsequenzen umfasst, die ein Molekül von industriellem Interesse codieren, wobei diese Expressionskassetten geeignet sind, dieses Molekül nach der Insertion in die erfindungsgemäßen Zellen zu produzieren. Das Verfahren ist dem Fachmann gut bekannt. Als Moleküle von industriellem Interesse können insbesondere die Virusuntereinheiten vom Typ eines Peptids, Proteins, Glycoproteins, insbesondere zur Verwendung als Impfstoff oder diagnostisches Reagenz, und Proteinmoleküle wie Hormone etc. genannt werden.
– Chronische Infektion durch ein Virus, das geeignet ist, sich in diesen Zellen für die Zwecke der Virusproduktion oder der Impfstoffherstellung, mit oder ohne vorherige Modifikation der Sensibilität gegenüber diesem Virus, zu vermehren. Die Infektion kann auch nicht chronisch sein, wird jedoch auf einer Charge der Zellen durchgeführt, die für die Virusvermehrung ausgewählt wurde. (Die Modifikationen, die folgen, verstehen sich als Präferenz und sind vorteilhafterweise mit den beiden vorstehenden Arten kombiniert).
– Einführung von Überlebensgenen oder anti-Apoptose-Genen, die nicht bcl-2 sind, wie die Gene, die die Proteine p19E1B des menschlichen Adenovirus (Rao et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7742-7746), LMP-1 (Gregory et al. (1991), Nature 349: 612-614) und BHRF1 (Pearson et al. (1987), Virology 160: 151-161) des Epstein-Barr-Virus, ICP34.5 des Herpes simplex-Virus (Chou und Roizman (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3266-3270) und p35 des Baculovirus (Clem et al. (1991), Science 254: 1388-1390) codieren, um diese Linien gegenüber Kulturbedingungen, insbesondere der Aufrechterhaltung der Konfluenz, resistenter zu machen.
– Überexpression von Genen, die in die Kontrolle des Zellzyklus involviert sind, durch geeignete Vektoren, um die Proliferationsgeschwindigkeit zu erhöhen. Tatsächlich wurde gezeigt, dass in bestimmten Fällen die Überexpression von Genen, die Cycline codieren, eine Verkürzung des Zellzyklus und daher eine Erhöhung der Proliferationsgeschwindigkeit bedingt (Rosenberg et al. (1995), Oncogene 10: 1501-1509; Quelle et al. (1993), Genes and Dev. 7: 1559-1571).
– Modifikation des viralen Sensitivitätsspektrums der Linien durch Integration von Genen, die Rezeptoren der Viren von Interesse im Hinblick auf ihre Vermehrung codieren.

Man kann auf die Säugerart Bezug nehmen, in der die Expression des Masernvirusrezeptors (CD46) durch Mauszellen, die normalerweise nicht permissiv für das Virus sind, eine Sensitivität dieser Zellen gegenüber diesem Virus und die Fähigkeit, es zu replizieren, bedingt (Naniche et al. (1993), J. Virol. 67: 6025-6032). Das Interesse besteht insbesondere darin, die Zellen für ein Virus sensitiv zu machen, um es in diesen zu produzieren.

– Integration von Onkogenen, die geeignet sind, das zelluläre Wachstum zu beschleunigen.

Selbstverständlich können die erfindungsgemäßen abgeleiteten Zellen („Derivate") eine oder mehrere der vorstehend dargestellten Modifikationen umfassen.
Die Erfindung hat außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Molekülen von industriellem Interesse oder von Viren zum Gegenstand, umfassend die Kultur der vorstehend beschriebenen Zellen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung orientiert man sich insbesondere an der Herstellung von Molekülen oder von Viren zur Realisierung diagnostischer Reagenzien oder Impfstoffe, oder auch an Molekülen von therapeutischem Interesse.
Die Erfindung wird nun detaillierter mit Hilfe einer Ausführungsform beschrieben, die als nicht einschränkendes Beispiel dient und sich auf 1 bezieht, die die Struktur des Vektors pDAMT darstellt, der dazu dient, die Linie TDF-2a herzustellen mit:

LTR: direkte Wiederholungsequenz (Long Terminal Repeat)
LTR: LTR deletiert
MTI: Maus-Metallothionein-Promotor
SV40 T + t: frühe SV40-Region
SV40: SV40-Promotor

BEISPIEL 1 = Herstellung der Zelllinie TDF-2A
I. Beschreibung ihres Ursprungs und ihrer Merkmale
1.1 Beschreibung des verwendeten Vektors: Vektor pDAMT
Er weist die frühe Region des SV40-Virus (codiert die Antigene T und t) (HindIII/BamHI-Fragment) (Fiers et al. (1978), Nature 273: 113-120) unter der Kontrolle des Maus-Metallothionein-Promotors I auf (EcoRI/BgIII-Fragment, transformiert an der HindIII-Schnittstelle) (Durnam et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6511-6515; Brinster et al. (1982), Nature 296: 39-42).
Das EcoRI/EcoRI-Fragment, das diese Transkriptionseinheit enthält, die vom Vektor pMTSVneo stammt (Peden et al. (1989), Exp. Cell. Res. 185: 60-72), wurde in die XbaI-Schnittstelle des Vektors pDA1 eingebaut (Hubert et al. (1991); J. Cell. Biol. 113: 497-506). Der Letztere stammt im Wesentlichen vom Genom des Rous-Sarcoma-assoziierten Virus-2 (RAV-2) ab, nach Modifikation des LTR, das 3' lokalisiert ist. Tatsächlich wurde die U3-Region des LTR 3' von RAV-2 deletiert und mit den Regionen R und U5 verbunden, die aus dem LTR des Rous-Sarcoma-assoziierten Virus-1 (RAV-1) isoliert wurden. Er trägt auch eine Transkriptionseinheit, die das Neomycinresistenzgen unter der Kontrolle des SV40-Promotors enthält, die aus dem Vektor pSV2neo stammt (Southern und Berg (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341). Vgl. 1.
1.2. Etablieren der Linie und Zeigen des Unsterblichkeitscharakters
Zellen, die von 14 Tage alten Embryonen der Barbarie-Ente stammen, wurden mit dem Vektor pDAMT durch das Verfahren transfiziert, bei dem Dimethylsulfoxid (DMSO) verwendet wird und von Kawai und Nishizawa (1984), Mol. Cell. Biol. 4: 1172-1174 beschrieben wird. Die transfizierten Zellen werden dann durch Verwendung von Genetincin G418 (150 μg/ml) innerhalb von 15 Tagen selektiert. Die resistenten Clone werden dann regelmäßig für 1 bis 2 Passagen pro Woche subkultiviert. Nach diesem aktiven Proliferationszeitraum von 3 Monaten gelangen die Zellen in eine Krisenphase, in der die meisten Zellen absterben. Nach dieser Phase, die etwa 2 Monate dauerte, nahmen mehrere Clone eine aktive Proliferation wieder auf, die ihre Immortalisierung nahe legte.
Die Zelllinie TDF-2A stammt daher aus 2 Kulturen.
Sie wurde näher untersucht.
Die TDF-2A-Zellen erreichten 200 Passagen, d.h. etwa 460 Generationen, und wurden daher mehr als 600 Tage kontinuierlich in Kultur aufrechterhalten. Vergleichsweise können Kontrollzellen, die die frühe Region des SV40-Virus nicht exprimieren, nicht mehr als 20 Passagen in Kultur gehalten werden.
1.3. Proliferationsmerkmale
Die immortalisierten Zellen werden bei 38°C in einer Rollflasche, in einem Medium gezüchtet, das 6% 10X HAM F-10, 4% 10X HANKS-199, 2,95% bis 4% Tryptose-Phosphat-Bouillon, 5,6% bis 2,5% Natriumbicarbonat, 0,1% 100X Vitamin BME, 3% fötales Kälberserum, 5% bis 1% Kanamycin, 0,5% bis 1% Vancomycin enthält.
Unter diesen Bedingungen beträgt ihre Verdopplungsrate 1 pro 24 Stunden.
1.4. Expression des T-Antigens.
Durch indirekte Immunfluoreszenz oder Immunphosphatase unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers für das T-Antigens (Pab 101: Santa Cruz Biotechnology ref. sc147) wurde bestätigt, dass alle Zellen das T-Antigen in ihrem Kern exprimieren, was zeigt, dass sie alle den Vektor integriert haben.
Diese Integration wurde zudem durch Southern-Blot-Analyse gezeigt. Die genomische DNA der immortalisierten Fibroblasten wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI, BstXI geschnitten. Durch die Hybridisierung mit einer für das T-Antigen spezifischen Sonde (1018 bp-NdeI/NdeI-Fragment) konnte bestätigt werden, dass die Transkriptionseinheit, die die Expression des immortalisierenden Gens erlaubt und in die TDF-2A-Zellen inseriert war, keine größeren Umlagerungen erfahren hatte. Tatsächlich entspricht die Größe der erhaltenen Hybridisierungsfragmente denjenigen, die erwartet wird.
1.5. Fehlen des tumorigenen Potentials
Die immortalisierten Zellen zeigen kein tumorigenes Potential. Sie können keine Kolonien in halbfestem Medium bilden oder Tumore auf der Chorioallantoismembran von Hühnereiern oder Enteneiern bilden. Sie können auch keine Tumore auf nackten Mäusen ("Nackt"-Maus) oder auf 1 Tage alten SPF (frei von pathogenen Organismen) – Küken von Hühnern und Enten bilden.
1.6. Karyotyp
Der Karyotyp der TDF-2A-Zellen wurde in der 114. und 135. Passage untersucht. Es konnte durch das Vorliegen von für diese Art charakteristischen Mikrochromosomen bestätigt werden, dass die Zellen wohl aviären Ursprungs waren. Außerdem sind die beobachteten Chromosomen für die Chromosomen repräsentativ, die in den primären Embryonalzellen der Ente gefunden werden, die daher den Ursprung der Linie bestätigen.
II. Eigenschaften
Die TDF-2A-Zellen zeigen insbesondere eine Sensitivität gegenüber spezifischen Entenviren wie dem Adenovirus, dem Parvovirus und dem Reovirus, die gewöhnlich auf den primären Embryonalzellen der Ente repliziert werden. Man kann daher diese Viren auf dieser Linie produzieren.
BEISPIEL 2: Charakterisierung der Linie TDF-2A durch Identifizierung der Integrationsstellen
Die genomische DNA der TDF-2A-Zellen, die ausgehend von den Zellen hergestellt wurde, die von der 114. und 135. Passage stammen, wurde mit den Restriktionsenzymen BgIII und KpnI gespalten. Die so behandelte DNA wird dann einer Gelelektrophorese unterzogen, gefolgt von einem Transfer auf eine Nylonmembran, dann mit einer T-Antigen-spezifischen Sonde (1018 bp-NdeI/NdeI-Fragment) hybridisiert. Derart lassen sich nach Spaltung mit BgIII zwei Hybridisierungsbanden von großer Größe (etwa 15 und 23 kb) erhalten, die die Existenz von zwei Integrationsstellen nahe legen. Die Spaltung mit KpnI bedingt das Erhalten einer großen Hauptbande (etwa 20 kb) und mindestens einer kleinen Bande, was die Existenz von mindestens zwei Integrationsstellen bestätigt.
BEISPIEL 3: Vermehrung des V127-Adenovirus auf TDF-2A-Zellen
Die TDF-2A-Zellen werden in Rollenflaschen angesetzt. Das Adenovirus des Egg-Drop-Syndroms Stamm V127 wird beim Ansetzen der Zellen angeimpft. Am Ende von 6 Tagen erfolgt die Ernte durch Schütteln, so dass der Zellteppich abgelöst wird. Diese besteht daher aus dem Zellteppich und dem Kulturüberstand. Das Ganze wird durch eine Behandlung in der Zellmühle oder im Homogenisator wie Ultraturrax 1 min bei 13.500 UpM (Gerät IKA Typ T25) homogenisiert.
Die Bestimmung des infektiösen Virustiters wird mit einem Mikroverfahren auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Die Virusverdünnungen werden auf dem hergestellten Teppich aus sekundären Embryonalzellen der Barbarie-Ente SPF angeimpft. Jede Virusverdünnung wird auf 6 Vertiefungen angeimpft. Die Platten werden zur Inkubation 8 Tage in einen Inkubator mit CO₂ gelegt. Das Vorliegen des Virus in den Vertiefungen wird im Mikroskop durch Beobachtung des charakteristischen cytopathischen Effekts (CPE) kontrolliert. Der Infektionstiter wird nach dem KÄRBER-Verfahren berechnet und wird durch den inversen Logarithmus der Virusverdünnung ausgedrückt, die 50% CPE [(Titer = d + r/N ×(n + N/2)] ergibt mit d gleich der Verdünnung, die logarithmisch ausgedrückt wird, bei der es 100% positive Vertiefungen gibt, r ist der Verdünnungsgrad, N ist die Anzahl der Vertiefungen pro Verdünnung und n ist die Anzahl der positiven Vertiefungen zwischen 0 und 100%.
Das Vorliegen des Virus wird auch durch die Untersuchung der Hämagglutininaktivität des Virusüberstandes mit Hilfe einer Suspension aus roten Blutkörperchen des Huhns bestätigt. In diesem Fall werden 50 μl des Überstandes der vorstehenden Vertiefungen auf eine Dynatech-Mikrotiterplatte gegeben, und 25 μl einer Suspension aus roten Blutkörperchen des Huhns mit 15 × 10⁶ Zellen/ml werden pro Vertiefung zugegeben. Nach dem Schütteln und 45-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden alle Vertiefungen als positiv angesehen, die eine deutlich sichtbare Hämagglutination zeigen. Die Berechnung des Titers wird ebenfalls nach dem KÄRBER-Verfahren durchgeführt.
Ergebnisse: Die erhaltenen Virentiter entsprechen denjenigen, die auf den primären Embryonalzellen der Ente erhalten wurden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Virus, umfassend das Züchten immortaler aber nicht transformierter Vogelzellen, die in ihrem Genom integriert das Gen SV40 T + t enthalten.
Verfahren zur Herstellung eines Virus gemäß Anspruch 1, umfassend die Infektion immortaler aber nicht transformierter Vogelzellen mit einem Virus, und die Vermehrung dieses Virus auf dieser Zelle.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die immortalen aber nicht transformierten Vogelzellen ausgehend von Zeilen aviären Gewebes erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die immortalen aber nicht transformierten Vogelzellen von Fibroblasten oder epithelialen Zellen abstammen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen SV40 T + t vom Metaliothionein-I-Promotor abhängig ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die immortalen aber nicht transformierten Vogelzellen auch den Promotor SV40 einschließen, der funktionell mit dem Neomycinresistenz-Gen verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die immortalen aber nicht transformierten Vogelzellen auch mindestens eine LTR-Sequenz einschließen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen ferner mindestens eine Expressionskassette enthalten, umfassend mindestens eine Nucleotidsequenz, die eine virale Untereinheit vom Typ eines Peptids, Proteins oder Glykoproteins codiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen ferner mit einem Virus infiziert sind, vorzugsweise chronisch, der fähig ist, sich in diesen Zellen zu vermehren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die immortalen aber nicht transformierten Vogelzellen ferner ein Antiapoptose-Gen enthalten, das nicht bcI-2 ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus p19E1B des menschlichen Adenovirus, LMP-1 des Epstein-Barr-Virus, BHRF1 des Epstein-Barr-Virus, ICP34.5 des Herpes-simplex-Virus und p35 des Baculovirus.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die immortalen aber nicht transformierten Vogelzellen ferner Vektoren einschließen, die fähig sind, ein oder mehrere an der Kontrolle des Zellzyklus beteiligte Gene überzuexprimieren, um die Proliferation zu beschleunigen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die immortalen aber nicht transformierten Vogelzellen ferner Gene enthalten, die virale Rezeptoren codieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die immortalen aber nicht transformierten Vogelzellen ferner Onkogene enthalten, die fähig sind, das Zellwachstum zu beschleunigen.
Immortale aber nicht transformierte Vogelzellen, die, integriert in ihr Genom, das vom Metallothionein-I-Promotor abhängige Gen SV40 T + t umfassen.
Immortale, nicht transformierte aviäre Zelllinie TDF-2A, die bei der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen CNCM, Institut Pasteur, unter der Hinterlegungsnummer I-1712 hinterlegt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Virus, dadurch gekennzeichnet, dass ein für Ente spezifischer Virus, wie Adenovirus, Parvovirus und Reovirus der Ente, auf der Linie TDF-2A gemäß Anspruch 15 oder auf immortalen Vogelzellen, die durch Vermehrung aus der Linie TDF-2A gewonnen wurden, repliziert wird.