PT901523E - Linhas de células aviárias imortalizadas - Google Patents

Description

ΡΕ0901523 1 DESCRIÇÃO "LINHAS DE CÉLULAS AVIÁRIAS IMORTALIZADAS" O presente invento está relacionado com uma linha de células aviárias e seus derivados. 0 estabelecimento de linhas celulares a partir de órgãos derivados de espécies aviárias não pode ser conseguido espontaneamente, como acontece com determinados órgãos provenientes de espécies de mamíferos.

As únicas linhas celulares até agora disponíveis foram obtidas usando as propriedades transformantes de determinados vírus aviários tendo características oncogé-nicas, tais como os retrovírus do grupo das leucoses aviárias ou o vírus da doença de Marek, ou determinadas moléculas químicas, como sejam metilcolantreno e dietil-nitrosamina.

Estas linhas celulares apresentam, na sua maioria, um carácter de transformação importante que as torna impróprias para a multiplicação de vírus vacinais.

Os autores empenharam-se numa nova via consistindo em introduzir nas células um vector sem carácter oncogénico mas capaz de integrar nestas células um gene escolhido pela sua capacidade para induzir imortalização. 2 ΡΕ0901523

Os primeiros ensaios foram realizados com a ajuda de vectores tendo inseridos genes de retrovirus aviários tais como erbA, erbB. 0 pedido de patente francesa FR-A-2 596 770 propõe um processo de imortalização no qual se infecta uma cultura de células aviárias ou de mamíferos com um vector ou sistema sem carácter oncogénico para as referidas células, mas capaz de integrar nestas células um gene escolhido entre v-myb, v-ets e v-erbA. Vectores adequados podem ser os vírus AMV, E26 e XJ12, este último sendo um vírus derivado do vírus AEV no qual o gene v-erB, oncogene, foi suprimido.

Na prática, estes ensaios permitiram obter linhas celulares estabelecidas a partir de células da linha hematopoiética, mas não deram resultados correspondentes para as células de embrião de galinha em cultura aderente, como sejam os fibroblastos ou as células epiteliais.

Linhas celulares aviárias do tipo mieloblastóide (células sanguíneas) não transformadas puderam ser obtidas com a ajuda do oncogene myb (pedido de patente internacional W091/18971) .

Paralelamente, os autores propuseram os genes precoces t e T do vírus símio SV40 para imortalizar células provenientes de diferentes tecidos de mamíferos (D.S. 3 ΡΕ0901523

Neufeld et al., Molecular and Cellular Biology, Agosto 1987, 2794-2802, 0. Kellermann e F. Kelly, Differentiation 1986, 32: 74-81 e pedido de patente francesa FR-A-2 649 721) . 0 pedido de patente francesa FR-A-2 649 721 propõe por seu lado um método de imortalização condicional que será utilizável para todos os tipos celulares e em todas as espécies, o objectivo sendo ultrapassar o inconveniente da grande especificidade das vias clássicas (limitação a espécies e/ou tipos celulares particulares): transformação das células por um virus transformante (adenovirus, vírus de Epstein-Barr, certos papovavírus como sejam o vírus SV40 ou o vírus do polioma; por exemplo, o vírus SV40 é indicado como só transformando células de roedores e células humanas); a transfecção com construções contendo um gene transformante ligado a um promotor virai; transfecção com um gene transformante ligado a um promotor celular. A escolha deste pedido de patente baseia-se numa construção que associa um fragmento de DNA da sequência reguladora da vimentina e um fragmento de DNA codificador de um gene imortalizante, que pode ser o antigénio T do vírus SV40 sob o controlo do promotor, induzível, da vimentina. As espécies aviárias nunca são referidas neste documento.

Na espécie aviária, a utilização real de tais oncogenes virais nunca foi descrita, exceptuando a utilização da forma 12S da proteína EIA do adenovirus humano 5 que permitiu imortalizar células epitelióides de codorniz (Guilhot et al. (1993), Oncogene 8: 619-624). 4 ΡΕ0901523

Contrariamente ao esperado, os inventores conseguiram produzir uma linha celular aviária, imortal e não transformada.

De forma mais geral, os inventores encontraram que é possível preparar linhas celulares aviárias imortais e não transformadas mesmo a partir de células de tecidos aviários, ou seja outras que não as células circulantes do sangue ou hematopoiéticas. 0 presente invento tem pois como objectivo células aviárias imortais não transformadas, em particular provenientes de tecidos aviários, ou seja outras que não as células circulantes do sangue ou hematopoiéticas, particularmente fibroblastos e células epiteliais, por exemplo de embriões. 0 presente invento tem, em particular, como objectivo células aviárias imortais, não transformadas, compreendendo, integrado no seu genoma, o gene SV40 τ+t sob a dependência do promotor MTI (metalotioneína I murina).

De preferência, integram igualmente o promotor SV40 funcionalmente ligado ao gene da resistência à neomicina.

De preferência, as células integram igualmente pelo menos uma sequência LTR. A sequência LTR pode ser deletada como descrito nos exemplos. 5 ΡΕ0901523

As células integram de preferência o vector pDAMT representado na Figura 1.

As células são de origem aviária mas podem ser, em particular, derivadas de pato da Barbarie. 0 invento tem, mais particularmente, como objec-tivo a linha celular aviária imortal, não transformada, TDF-2A depositada na CNCM (Colecção National de Culturas de Microrganismos do Instituto Pasteur) com a referência 1-1712.

Obviamente, o invento abrange as células derivadas destas linhas. Por isso, deve-se entender que estão incluídas não só as células depositadas na CNCM com as referências indicadas, mas também as células constituintes da descendência das anteriores, por um lado as obtidas por simples multiplicação e podendo sofrer mutações quando da multiplicação e por outro as células obtidas após modificação voluntária, o que se designa por células derivadas, e certamente também as células que sofrem os dois tipos de modificação. 0 invento abrange assim também as células derivadas obtidas por modificações das células referidas. Estas modificações podem compreender: 6 ΡΕ0901523

Inserção de uma ou mais cassetes de expressão compreendendo cada uma delas uma ou várias sequências nucleotidicas codificadoras de uma molécula com interesse industrial, estas cassetes de expressão estando aptas a produzir esta molécula após inserção nas células do invento. A técnica é perfeitamente conhecida dos familiarizados com a área. Como moléculas de interesse industrial, pode-se citar particularmente as subunidades virais do tipo peptideo, proteína, glico-proteína, principalmente para usar como vacina ou como reagente de diagnóstico, moléculas proteicas tais como hormonas, etc.

Infecção crónica por um vírus apto a multiplicar-se nestas células, com o objectivo de produzir vírus ou vacinas, com ou sem modificação prévia da sensibilidade a este vírus. A infecção pode também não ser crónica mas realizada num lote de células escolhido para a multiplicação virai. (As modificações que se seguem, são entendidas de preferência e vantajosamente na combinação dos dois tipos anteriores).

Introdução de genes de sobrevivência ou anti-apoptose para além de bcl-2, como sejam os genes codificadores das proteínas pl9EElB do adenovírus humano (Rao et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 7742-7746), LMP-1 (Gregory et al. (1991), Nature 349:612-614) e BHRFl (Pearson et al. (1987), Virology 960:151- 7 ΡΕ0901523 161) do vírus de Epstein Barr, ICP34.5 do vírus herpes simplex (Chou e Roizman (1992), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3266-3270) e p35 de baulovírus (Ciem et al. (1991), Science 254: 1388-1390), com o objectivo de tornar estas linhas mais resistentes às condições de cultura, principalmente manutenção na confluência.

Sobre-expressão de genes implicados no controlo do ciclo celular por vectores adequados para aumentar a velocidade de proliferação. Com efeito, foi demonstrado que, em determinados casos, a sobre-expressão do gene codificador das ciclinas inicia um encurtamento do ciclo celular e portanto um aumento da velocidade de proliferação (Rosenberg et al. (1995), Oncogéne 10:1501-1509; Quelle et al. (1933), Genes and Dev. 7: 1559-1571).

Modificação do espectro de sensibilidade virai das linhas, por integração de genes codificadores dos receptores do vírus com interesse, face à sua multiplicação. Pode-se referir a espécie de mamífero onde a expressão do receptor do vírus da rubéola (CD46) pelas células murinas, normalmente não permissivas ao vírus, apresenta uma sensibilidade destas células a este vírus e a capacidade de o replicar (Naniche et al. (1993), J. Virol. 67:6025-6032). O interesse principal é tornar as células sensíveis a um vírus com o fim de o produzir nestas. 8 ΡΕ0901523

Integração de oncogenes aptos a acelerar o crescimento celular. É evidente que as células derivadas de acordo com o invento podem compreender uma ou mais modificações apresentadas atrás. 0 invento tem ainda como objectivo um processo de produção de moléculas de interesse industrial ou de vírus, compreendendo a cultura das células descritas atrás.

No âmbito do presente invento, a orientação é particularmente no sentido da produção de moléculas ou de vírus para a obtenção de reagentes de diagnóstico ou de vacinas, ou ainda de moléculas com interesse terapêutico. 0 invento será agora descrito mais detalhadamente com a ajuda de uma forma de realização apresentada a título de exemplo e com referência à figura 1, a qual mostra a estrutura do vector pDAMT que serve para preparar a linha TDF-2A, sendo: LTR: sequência repetida directa (Repetição Termi nal Longa) LTR: LTR deletada MTI: promotor da metalotioneína I murina SV40 T+t: região precoce de SV40 SV40: promotor de SV40 9 ΡΕ0901523 EXEMPLO 1 = Produção da linha celular TDF-2A 1. Descrição da sua origem e das suas características

1.1 Descrição do vector utilizado: vector pDAMT

Inclui a região precoce do virus SV40 (codifica os antigénios T e t) (fragmento Hindlll/BamHl) (Fiers et al. (1978), Nature 273:113-120) sob o controlo do promotor da metalotioneina I de ratinho (fragmento EcoRI/BglII transformado em local HindIII) (Durnam et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:6511-6515; Brinster et ai., (1982), Nature 296:39-42). O fragmento EcoRl/EcoRl contendo esta subunidade de transcrição proveniente do vector pMTSVneo (Peden et al. (1989), Exp. Cell. Res. 185:60-72) foi inserido no local Xbal do vector pDAl (Aubert et al. (1991), J. Cell. Biol. 113:497-506). Este último deriva essencialmente do genoma do virus associado ao sarcoma de Rous-2 (RAV-2) após modificação da LTR situada em 3' . Com efeito, a região U3 da LTR 3' de RAV-2 foi deletada e ligada às regiões R e U5 isoladas da LTR do virus associado ao sarcoma de Rous-1 (RAV-1). Possui igualmente uma unidade de transcrição contendo o gene da resistência à neomicina sob o controlo do promotor SV40 que deriva do vector pSV2neo (Southern e Berg (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341). Ver Figura 1. 10 ΡΕ0901523 1.2. Estabelecimento da linha e demonstração do carácter imortalizado Células provenientes de embriões de pato da Barbarie com 14 dias de idade foram transfectadas com o vector pDAMT, pelo método que utiliza dimetilsulfóxido (DMSO) e descrito por Kawai e Nishizawa (1984), Mol. Cell. Bio. 4:1172-1174. As células transfectadas foram em seguida seleccionadas através da aplicação de geneticina G418 (150 pg/ml) durante 15 dias. Os clones resistentes foram então subcultivados regularmente na proporção de 1 a 2 passagens por semana. Após este periodo de proliferação activa de 3 meses, as células entraram num periodo de crise durante o qual a maior parte das células morreram. Após este periodo que durou cerca de 2 meses, vários clones retomaram uma proliferação activa sugerindo a sua imortalização. A linha celular TDF-2A derivou assim de 2 culturas e foi estudada de forma mais aprofundada.

As células TDF-2A atingiram 200 passagens ou seja cerca de 460 gerações e foram assim mantidas em cultura durante mais de 600 dias continuamente. Comparativamente, as células testemunha, não expressando a região precoce do virus SV40 não puderam ser mantidas em cultura mais de 20 passagens. ΡΕ0901523 1.3. Características de proliferação

As células imortalizadas foram cultivadas a 38°C, em frasco rolante, num meio contendo HAM F-10 10X a 6%, 199 Hanks 10X a 4%, Tryptose Broth Phosphate 2,95% a 4%, bicarbonato de sódio 5,6% a 2,5%, vitamina BME 100X a 0,1%, soro fetal de vitela a 3%, canamicina 5% a 1%, Vancomicina 0,5% a 1%.

Nestas condições, a sua velocidade de duplicação é de 1 em cada 24 horas. 1.4. Expressão do antigénio T.

Por imunofluorescência ou imunofosfatase indirec-ta usando um anticorpo especifico do antigénio T (Pab 101: Santa Cruz Biotechnology ref. scl47), verificou-se que todas as células expressavam o antigénio T no seu núcleo, indicando que todas integraram o vector.

Esta integração foi ainda demonstrada por transferência Southern. O DNA genómico dos fibroblastos imortalizados foi digerido com as enzimas de restrição Xbal, BstXI. A hibridação com uma sonda especifica do antigénio T (fragmento Ndel/Ndel de 1080 pb) permitiu verificar que a unidade de transcrição que dirige a expressão do gene imor-talizador, inserido nas células TDF-2A, não sofreu rearran-jos importantes. Com efeito, o tamanho dos fragmentos de hibridação obtidos está de acordo com o esperado. 12 ΡΕ0901523 1.5. Ausência de poder tumorigénico.

As células imortalizadas não apresentam poder tumorigénico. Elas são incapazes de formar colónias em meio semi-sólido ou de formar tumores em membrana corio-alantoi-deica de ovos de galinha ou de pata. Foram igualmente incapazes de formar tumores em ratinhos atimicos, pintos e patinhos SPF (isentos de organismos patogénicos) com 1 dia de idade. 1.6. Cariótipo. 0 cariótipo das células TDF-2A foi estudado nas 114a e 135a passagens. Permitiu verificar que as células eram de origem aviária com a presença de microcromossomas característicos desta espécie. Ainda, os cromossomas observados eram representativos dos cromossomas encontrados nas células primárias de embriões de pato, confirmando assim a origem da linha. II. Propriedades.

As células TDF-2A apresentam, particularmente, uma sensibilidade a virus específicos do pato, como sejam adenovírus, parvovirus e reovirus, que se replicam habitualmente em células primárias de embriões de pato. Pode-se portanto produzir estes virus nesta linha. 13 ΡΕ0901523 EXEMPLO 2: Caracterização da linha TDF-2A para a identificação dos locais de restrição. 0 DNA genómico das células TDF-2A, preparado a partir das células provenientes da 114a e 135a passagens, foi digerido com as enzimas de restrição BglII e Kpnl. 0 DNA assim tratado foi então submetido a uma electroforese em gel, seguido de transferência para membrana de nylon, depois hibridado com uma sonda específica do antigénio T (fragmento Ndel/Ndel de 1018 pb) . Assim, a digestão por BglII permite obter duas bandas de hibridação de tamanho elevado (cerca de 15 e 23 Kb) sugerindo a existência de dois locais de integração. A digestão por Kpnl permite a obtenção de uma banda principal de tamanho elevado (cerca de 20 Kb) e pelo menos uma banda pouco abundante confirmando a existência de pelo menos dois locais de integração. EXEMPLO 3: Multiplicação do adenovírus V127 em células TDF-2A.

As células TDF-2A foram semeadas em frascos rolantes. O adenovírus da doença dos ovos sem casca, estirpe V127, foi inoculado quando do início da cultura. Ao fim de 6 dias, foi efectuada a colheita por agitação, de forma a descolar a camada de células. Esta é composta por uma monocamada celular e sobrenadante de cultura. O conjunto foi homogeneizado por tratamento num triturador de 14 ΡΕ0901523 células ou homogeneizador, como o Ultraturrax, durante 1 min a 135000 rotações/min (aparelho ika tipo T25). A determinação do titulo infeccioso virai foi realizado pelo micrométodo em placa de 96 alvéolos. As diluições de virus foram inoculadas na monocamada estabelecida de células secundárias de embriões de pato da Barbarie SPF. Cada uma das diluições virais foi inoculada em seis alvéolos. As placas foram colocadas em incubação numa câmara de CO2 durante 8 dias. A presença de virus nos alvéolos foi controlada ao microscópio observando 0 efeito citopático (CPE) caracteristico. O titulo infeccioso foi calculado de acordo com o método de KARBER e foi expresso pelo logaritmo do inverso da diluição virai que dá 50% de CPE [Titulo = d+r/Nx(n+N/2)] com d igual à diluição expressa em log onde há 100% de alvéolos positivos, r igual à razão da diluição, N é igual ao número de alvéolos por diluição e n é igual ao número de alvéolos positivos entre 0 e 100%) . A presença de virus foi igualmente confirmada pela pesquisa da actividade hemaglutinante do sobrenadante virai com a ajuda de uma suspensão de glóbulos vermelhos de galinha. Neste caso, 50 μΐ de sobrenadante dos alvéolos anteriores foram depositados numa placa de microtitulação Dynatech e 25 μΐ de uma suspensão de eritrócitos de galinha a 15.106 células/ml foram adicionados por alvéolo. Após agitação e 45 min de incubação à temperatura ambiente, 15 ΡΕ0901523 foram considerados como positivos todos os alvéolos apresentando uma hemaglutinação francamente visível. 0 cálculo do titulo foi realizado igualmente de acordo com o método de KARBER.

Resultados: Os títulos virais obtidos foram equivalentes aos obtidos em células primárias de embriões de pato.

Lisboa, 9 de Maio de 2007

Claims (16)

1. ΡΕ0901523 ι REIVINDICAÇÕES 1. Processo de produção de vírus, compreendendo a cultura de células aviárias imortais mas não transformadas compreendendo, integrado no seu genoma, o gene SV40 T+t.
2. 2. Processo de produção de vírus de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a infecção de células aviárias imortais, mas não transformadas, com um vírus e a multiplicação deste vírus nestas células.
3. 3. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por as células aviárias imortais, mas não transformadas, serem obtidas a partir de células de tecido aviário.
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por as células aviárias imortais, mas não transformadas, serem provenientes de fibroblastos ou de células epiteliais.
5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o gene SV40 T+t estar sob a dependência do promotor da metalotioneina I. 2 ΡΕ0901523
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por as células aviárias imortais, mas não transformadas, integrarem igualmente o promotor de SV40 funcionalmente ligado ao gene de resistência à neomicina.
7. 7. Processo de acordo com uma das reivindicações 5 ou 6, caracterizado por as células aviárias imortais, mas não transformadas, integrarem pelo menos uma sequência de ltr.
8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por as células conterem pelo menos uma cassete de expressão compreendendo pelo menos uma sequência nucleotidica codificadora de uma subunidade virai do tipo peptideo, proteína, glicoproteína.
9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por as células estarem infectadas, de preferência cronicamente, por um vírus apto a multiplicar-se nestas células.
10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por as células aviárias imortais, mas não transformadas, conterem um gene anti-apoptose para além de bcl-2, de preferência escolhido entre o grupo consistindo em pl9ElB do adenovírus humano, LMP-1 do vírus Epstein Barr, BHRFl do vírus Epstein Barr, ICP34.5 do vírus herpes simplex e p35 de baculovírus. 3 ΡΕ0901523
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por as células aviárias imortais, mas não transformadas, integrarem vectores aptos a expressarem em excesso um ou mais genes implicados no controlo do ciclo celular para aumentar a velocidade de proliferação.
12. 12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por as células aviárias imortais, mas não transformadas, integrarem genes codificadores de receptores virais.
13. 13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por as células aviárias imortais, mas não transformadas, integrarem oncogenes aptos a acelerar o crescimento celular.
14. 14. Células aviárias imortais, mas não transformadas, compreendendo, integrado no seu genoma, o gene SV40 T+t sob a dependência do promotor da metalotioneina I.
15. 15. Linha celular aviária imortal, não transformada, TDF-2A depositada na CNCM, Colecção Nacional de Culturas de Microrganismos do Instituto Pasteur com a referência 1-1712. 4 ΡΕ0901523
16. 16. Processo de produção de vírus, caracterizado por um vírus específico de pato, como seja adenovírus, parvovírus e reovírus do pato, ser replicado na linha TDF-2A da reivindicação 15 ou em células aviárias imortais obtidas por multiplicação da linha TDF-2A. Lisboa, 9 de Maio de 2007