ES2283016T3 - Lineas de celulas aviarias inmortalizadas. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A CELULAS AVIARIAS INMORTALES NO TRANSFORMADAS, EN PARTICULAR PROCEDENTES DE TEJIDOS AVIARES, ES DECIR DISTINTAS DE LAS CELULAS SANGUINEAS O HEMATOPOIETICAS, PARTICULARMENTE FIBROBLASTOS Y CELULAS EPITELIALES, POR EJEMPLO DE EMBRIONES. LAS CELULAS AVIARIAS INMORTALIZADAS POR EL GEN VS40 T+T BAJO LA DEPENDENCIA DEL PROMOTOR MTI. ESTAS INTEGRAN PARTICULARMENTE EL VECTOR PDAMT.
Description
Líneas de células aviarias inmortalizadas.
La presente invención se refiere a una línea de
células aviarias y a sus derivadas.
El establecimiento de líneas celulares a partir
de órganos extraídos de especies aviarias no puede obtenerse
espontáneamente, tal y como es el caso con ciertos órganos que
provienen de especies mamíferas.
Las únicas líneas celulares disponibles hasta la
fecha se han obtenido utilizando las propiedades transformantes de
ciertos virus aviarios que tienen propiedades oncogénicas, tales
como los retrovirus del grupo de las leucosis aviarias o el virus
de la enfermedad de Marek, o de ciertas moléculas químicas tales
como el metilcolantreno y la dietilnitrosamina.
Estas líneas celulares presentan, en su mayor
parte, un carácter de transformación importante que las hace
inapropiadas para la multiplicación de virus de vacunas.
Los autores se han dedicado a una nueva vía
consistente en introducir en las células un vector que no presenta
un carácter oncogénico, pero que es capaz de integrar en las
células un gen escogido por su capacidad para inducir la
inmortalización.
Los primeros ensayos se han realizado con la
ayuda de vectores que integran genes de retrovirus aviarios tales
como el erbA, erbB.
La solicitud de patente francesa
FR-A-2.596.770 propone un
procedimiento de inmortalización en el cual se infecta un cultivo
de células aviarias o de mamífero con un vector o un sistema que no
presenta un carácter oncogénico para dichas células, pero que es
capaz de integrar en estas células un gen escogido de entre el v-
myb, v-ets y v-erbA. Pueden ser
vectores apropiados los virus AMV, E26 y XJ12, siendo éste último
un virus derivado del virus AEV en el cual se ha suprimido el gen
v-erB oncogénico.
En la práctica, estos ensayos han permitido
obtener líneas celulares establecidas a partir de células de la
línea hematopoyética, pero no han dado los resultados esperados
para las células embrionarias de pollo en cultivo adherente, tales
como los fibroblastos o las células epiteliales.
Se han obtenido líneas de células aviarias del
tipo mieloblastoide (células sanguíneas) no transformadas con la
ayuda del oncogén myb (solicitud de patente internacional
WO91/18971).
Paralelamente, ciertos autores han propuesto los
genes tempranos t y T del virus de simios SV40 para inmortalizar
células provenientes de diferentes tejidos de mamíferos (D.S.
Neufeld et al., Molecular and Cellular Biology, agosto de
1987, 2794-2802, O. Kellermann y F. Kelly,
Differentiation, 32:74-81 (1986) y solicitud
de patente francesa
FR-A-2.649.721).
La solicitud de patente francesa
FR-A-2.649.721 propone por su parte
un procedimiento de inmortalización condicional, que podrá
utilizarse con todos los tipos celulares y en todas las especies,
siendo aquí el objetivo remediar el inconveniente de la elevada
especificidad de las vías clásicas (limitación a especies y/o a
tipos celulares determinados): transformación de las células
mediante un virus transformante (adenovirus, virus de
Epstein-Barr, ciertos papovavirus tales como el
virus SV40 o el virus del polioma; por Ejemplo, está indicado que
el virus SV40 solamente transforma células de roedores y células
humanas); transfección con construcciones que contengan un gen
transformante unido a un promotor viral; transfección con un gen
transformante unido a un promotor celular. La elección de esa
solicitud de patente se apoya en una construcción que asocia un
fragmento de ADN de la secuencia reguladora de la vimentina y un
fragmento de ADN que codifica un gen inmortalizador, el cual puede
ser el antígeno T del virus SV40 bajo el control del promotor,
inducible, de la vimentina. Las especies aviarias no se mencionan
nunca en ese
documento.
documento.
En la especie aviaria, la utilización real de
tales oncogenes virales no se ha descrito jamás, excepto la
utilización de la forma 12S de la proteína E1A del Adenovirus 5
humano, la cual ha permitido inmortalizar células epitelioides de
codorniz (Guilhot et al., Oncogene,
8:619-624 (1993)).
Contra toda previsión, los autores han
conseguido producir una línea celular aviaria, inmortal y no
transformada.
De forma más general, los inventores han hallado
que era posible preparar líneas celulares aviarias inmortales y no
transformadas incluso a partir de células de tejidos aviarios, es
decir, distintos de las células circulantes de la sangre o
hematopoyéticas.
La presente invención tiene por tanto por objeto
las células aviarias inmortales no transformadas, en particular,
las provenientes de tejidos aviarios, es decir, distintas de las
células sanguíneas o hematopoyéticas, especialmente los
fibroblastos y las células epiteliales, por ejemplo, de
embriones.
La presente invención tiene en particular por
objeto las células aviarias inmortalizadas, no transformadas, que
comprenden, integrado en su genoma, el gen SV40 T+t bajo la
dependencia del promotor MTI (metalotioneína I múrida).
Preferiblemente, también integran el promotor
SV40 funcionalmente unido al gen de la resistencia a la
neomicina.
Preferiblemente, las células integran también al
menos una secuencia LTR. La secuencia LTR puede suprimirse tal y
como se describe en los ejemplos.
Las células integran preferiblemente el vector
pDAMT visible en la Figura 1.
Las células son de origen aviario, pero pueden
ser en particular procedentes de pato de Berbería.
La invención tiene además, de forma particular,
por objeto la línea celular aviaria inmortal, no transformada,
TDF-2A depositada en la CNCM ("Collection
Nationale de Cultures de Microoganismes" del Instituto Pasteur)
con la referencia I-1712.
Por supuesto, la invención abarca las células
obtenidas de estas líneas. Para eso, hace falta comprender que se
incluyen no solamente las células depositadas en la CNCM con las
referencias indicadas, sino también las células que constituyen la
descendencia de las precedentes, por una parte las obtenidas por
simple multiplicación y que pueden experimentar mutaciones durante
las multiplicaciones, y por otra parte las obtenidas después de su
modificación voluntaria, las que entonces se denominan células
derivadas, y, por supuesto, también las células que hayan
experimentado los dos tipos de modificación.
Por tanto, la invención abarca también las
células derivadas obtenidas mediante modificaciones de las células
de más arriba. Estas modificaciones pueden comprender:
- -
- La inserción de uno o múltiples casetes de expresión que comprenden cada uno una o múltiples secuencias nucleotídicas que codifican una molécula de interés industrial, siendo estos casetes de expresión capaces de producir esta molécula después de su inserción en las células de la invención. La técnica es perfectamente conocida por el especialista. Como moléculas de interés industrial se pueden citar especialmente las subunidades virales del tipo péptido, proteína, glicoproteína, especialmente para su uso como vacuna o como reactivo de diagnóstico, las moléculas proteicas tales como las hormonas, etc.
- -
- La infección crónica por un virus capaz de multiplicarse en las células, con fines de producción viral o de vacuna, con o sin modificación previa de la sensibilidad con respecto a estos virus. La infección puede ser también no crónica, sino realizada sobre un lote de células escogidas para la multiplicación vírica. (Se entiende que las modificaciones que siguen son preferentes y que se combinan ventajosamente con los dos tipos precedentes).
- -
- Introducción de genes de supervivencia o anti-apoptosis distintos de los bcl-2, tales como los genes que codifican las proteínas p19E1B del adenovirus humano (Rao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7742-7746 (1992)), LMP-1 (Gregory et al., Nature, 349:612-614 (1991)) y BHRF1 (Pearson et al., Virology, 960:151-161 (1987)) del virus Epstein Barr, ICP34.5 del virus Herpes simplex (Chou y Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3266-3270 (1992)) y p35 del baculovirus (Clem et al., Science, 254:1388-1390 (1991)), con objeto de hacer estas líneas más resistentes a las condiciones del cultivo, especialmente el mantenimiento en confluencia.
- -
- Sobreexpresión de genes implicados en el control del ciclo celular, mediante vectores apropiados, para aumentar la velocidad de proliferación. En efecto, se ha mostrado que, en ciertos casos, la sobreexpresión de genes que codifican las ciclinas acarreaba un acortamiento del ciclo celular y, por tanto, un aumento de la velocidad de proliferación (Rosenberg et al., Oncogene, 10:1501-1509 (1995); Quelle et al., Genes and Dev., 7:1559-1571 (1993)).
- -
- Modificación del espectro de sensibilidad vírica de las líneas mediante la integración de genes que codifican receptores del virus de interés, con vistas a su multiplicación.
- Se puede hacer referencia a la especie de mamífero en donde la expresión del receptor del virus de la rubéola (CD46) por parte de células múridas, normalmente no permisivas al virus, comporta una sensibilidad de estas células a estos virus y la capacidad de replicarlos (Naniche et al., J. Virol., 67:6025-6032 (1993)). El interés es principalmente hacer las células sensibles a un virus con objeto de producirlo en ellas.
- -
- Integración de oncogenes capaces de acelerar el crecimiento celular.
Ni que decir tiene que las células derivadas
según la invención pueden comprender una o múltiples de las
modificaciones presentadas más arriba.
\newpage
La invención tiene también por objeto un
procedimiento de producción de moléculas de interés industrial o de
virus, el cual comprende el cultivo de las células descritas más
arriba.
En el marco de la presente invención, nos
orientamos especialmente hacia la producción de moléculas o de
virus para la realización de reactivos de diagnóstico o de vacunas,
o incluso de moléculas de interés terapéutico.
A continuación se describirá la invención más
detalladamente con la ayuda de un modo de realización, tomado a
título de ejemplo no limitante, y que se refiere a la Figura 1, la
cual muestra la estructura del vector pDAMT que sirve para preparar
la línea TDF-2A, con:
- LTR:
- secuencia repetida directa ("Long Terminal Repeat")
- LTR:
- LTR suprimido
- MTI:
- promotor de la Metalotioneina I múrida
- SV40 T+t:
- región temprana del SV40
- SV40:
- promotor del SV40
\vskip1.000000\baselineskip
Incluye la región temprana del virus SV40
(codifica los antígenos T y t) (fragmento HindIII/BamHI) (Fiers
et al., Nature, 273:113-120 (1978)) bajo el
control del promotor de la metalotioneína I de ratón (fragmento
Eco-RI/BgIII transformado en sitio HindIII) (Durnam
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:6511-6515 (1980); Brinster et al., Nature,
296:39-42 (1982)).
El fragmento EcoRI/EcoRI que contiene esta
unidad de transcripción procedente del vector pMTSVneo (Peden et
al., Exp. Cell. Res., 185:60-72 (1989)) se ha
insertado en el sitio XbaI del vector pDA1 (Aubert et al., J.
Cell. Biol., 113:497-506 (1991)). Este último
deriva esencialmente del genoma del virus asociado al sarcoma de
Rous-2 (RAV-2) después de la
modificación de la LTR situada en 3'. En efecto, la región U3 de la
LTR 3' de RAV-2 se ha suprimido y ligado a las
regiones R y U5 aisladas de la LTR del virus asociado al sarcoma de
Rous-1 (RAV-1). Tiene igualmente
una unidad de transcripción que contiene el gen de la resistencia a
la neomicina, bajo el control del promotor del SV40 que deriva del
vector pSV2neo (Southern y Berg, J. Mol Appl. Genet.,
1:327-341 (1982)). Ver la Figura 1.
Se transfectaron células procedentes de
embriones de pato de la Berbería de 14 días con el vector pDAMT,
mediante el procedimiento que utiliza el dimetilsulfóxido (DMSO) y
descrito por Kawai y Nishizawa, Mol. Cell. Biol.,
4:1172-1174 (1984). Las células transfectadas se
seleccionaron a continuación mediante la aplicación de geneticina
G418 (150 \mug/ml) durante 15 días. Los clones resistentes se
subcultivaron entonces regularmente a razón de 1 a 2 pasajes por
semana. Después de este período de proliferación activa de 3 meses,
se sometieron las células a un período de crisis durante el cual
murieron la mayoría de las células. Después de este período, que
duró aproximadamente 2 meses, múltiples clones retomaron una
proliferación activa, lo que sugiere su inmortalización.
La línea celular TDF-2A procede,
así pues, de 2 cultivos. Se ha estudiado con más profundidad.
Las células TDF-2A alcanzaron
los 200 pasajes, o sea, aproximadamente 460 generaciones, y se han
mantenido de este modo en cultivo durante más de 600 días en
continuo. En comparación, las células control no expresaban la
región temprana del virus SV40 ni podían mantenerse en cultivo más
allá de los 20 pasajes.
Las células inmortalizadas se cultivaron a 38ºC,
en frascos rodantes, en un medio que contenía HAM
F-10 10\times al 6%, 199 HANKS 10\times al 4%,
"Tryptose Broth Phosphate" 2,95% al 4%, bicarbonato sódico
5,6% al 2,5%, vitamina BME 100\times al 0,1%, suero fetal de
ternera al 3%, kanamicina 5% al 1%, vancomicina 0,5% al 1%.
En estas condiciones, su tasa de duplicación es
de 1 vez cada 24 horas.
Se verificó que todas las células expresaban el
antígeno T en su núcleo, lo que indicó que todas habían integrado
el vector, mediante inmunofluorescencia o inmunofosfatasa
indirectas, utilizando un anticuerpo específico del antígeno T (Pab
101, Santa Cruz Biotechnology, ref. scl47).
Por otra parte, esta integración se mostró
mediante transferencia Southern. El ADN genómico de los
fibroblastos inmortalizados se digirió con los enzimas de
restricción XbaI, BstXI. La hibridación con una sonda específica
del antígeno T (fragmento NdeI/NdeI de 1018 p.b.) a permitido
verificar que la unidad de transcripción que permite la expresión
del gen inmortalizado, insertada en las células
TDF-2A, no había experimentado remodelaciones
importantes. En efecto, el tamaño de los fragmentos de hibridación
obtenidos es conforme a lo esperado.
Las células inmortalizadas no presentan poder
tumorigénico. Son incapaces de formar colonia en medio semisólido o
de formar tumores sobre la membrana corioalantoidea de huevos de
gallina o de pata. Son también incapaces de formar tumores sobre
ratones desnudos (ratones "nude"), y sobre polluelos y
anadones SPF (exentos de organismos patógenos) de 1 día.
El cariotipo de las células
TDF-2A se estudió en los pasajes 114º y 135º. Ha
permitido verificar que las células eran claramente de origen
aviario, con la presencia de los microcromosomas característicos de
esta especie. Además, los cromosomas observados son
representativos de los cromosomas encontrados en las células
primarias de embriones de pato, confirmándose de este modo el
origen de la línea.
Las células TDF-2A presentan
especialmente una sensibilidad a los virus específicos de los
patos, tales como los adenovirus, los parvovirus y los reovirus que
habitualmente se replican sobre células primarias de embriones de
pato. Por tanto, estos virus se pueden producir sobre esta
línea.
El ADN genómico de las células
TDF-2A, preparado a partir de células procedentes
de los pasajes 114º y 135º, se digirió con los enzimas de
restricción BgIII y KpnI. El ADN tratado de este modo se sometió a
continuación a una electroforesis en gel, seguida por una
transferencia sobre membrana de nailon, y seguidamente se hibridó
con una sonda específica para el antígeno T (fragmento NdeI/NdeI
de 1018 p.b.). De este modo, la digestión con BgIII permite obtener
dos bandas de hibridación de tamaño elevado (de aproximadamente 15
y 23 kb) sugiriendo la existencia de dos sitios de integración. La
digestión con KpnI comporta la obtención de una banda mayoritaria
de tamaño elevado (aproximadamente 20 kb) y de al menos una banda
minoritaria, lo que confirma la existencia de al menos dos sitios
de integración.
Las células TDF-2A se sembraron
en frascos rodantes. El adenovirus del síndrome de la baja postura
("enfermedad de los huevos sin cáscara") cepa V127 se inoculó
al poner las células en cultivo. Al cabo de 6 días, se efectúa la
recolección mediante agitación con objeto de desprender el tapiz
celular. Ésta está compuesta por tanto de tapiz celular y de
sobrenadante del cultivo. En conjunto se homogeneiza mediante un
tratamiento en un molino de células u homogeneizador tal como un
Ultraturrax, durante 1 minutos, a 13.500 revoluciones/minuto
(aparato IKA del tipo T25).
La determinación del título vírico infeccioso se
realiza en micrométodo sobre placa de 96 pocillos. Las diluciones
de virus se inoculan sobre el tapiz establecido de células
secundarias de embriones de pato de Berbería SPF. Cada dilución
vírica se inocula en 6 pocillos. Las placas se colocan dentro de un
incubador de CO_{2} durante 8 días. La presencia de virus en los
pocillos se controla al 1 microscopio observando el efecto
citopático (ECP) característico. El título infeccioso se calcula
según el procedimiento de KARBER y se expresa como el logaritmo de
la inversa de la dilución vírica que da un 50% de ECP [Título =
d+r/Nx(n+N/2)], siendo d igual a la dilución, expresada en
log, en donde hay un 100% de pocillos positivos, r es igual a la
proporción de la dilución, N es igual al número de pocillos por
dilución, y n es igual al número de pocillos positivos entre 0 y
100%.
La presencia de virus se confirma igualmente
mediante la detección de la actividad hemaglutinante del
sobrenadante vírico con la ayuda de una suspensión de glóbulos
rojos de polluelo. En este caso, se depositan 50 \mul del
sobrenadante de los pocillos precedentes sobre una placa de
microvaloración Dynatech, y se añaden 25 \mul de una suspensión
de hematíes de pollo a 15\times10^{6} células/ml por pocillo.
Después de una agitación de 45 minutos de incubación a temperatura
ambiente, se consideran como positivos todos los pocillos que
presentan una hemaglutinación netamente visible. El cálculo del
título se realizó igualmente según el procedimiento de KARBER.
Resultados: Los títulos víricos obtenidos son
equivalentes a los obtenidos con células primarias de embriones de
pato.
Claims (16)
1. Procedimiento de producción de virus, que
comprende el cultivo de células aviarias inmortales pero no
transformadas, que comprenden, integrado en su genoma, el gen SV40
T+t.
2. Procedimiento de producción de virus de la
reivindicación 1, que comprende la infección de células aviarias
inmortales pero no transformadas con un virus, y la multiplicación
de este virus sobre esta célula.
3. Procedimiento de una de las reivindicaciones
1 ó 2, caracterizado en que las células aviarias inmortales
pero no transformadas se obtienen a partir de células de tejidos
aviarios.
4. Procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado en que las células
aviarias inmortales pero no transformadas provienen de fibroblastos
o de células epiteliales.
5. Procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado en que el gen SV40 T+t
está bajo la dependencia de un promotor de metalotioneína I.
6. Procedimiento de la reivindicación 5,
caracterizado en que las células aviarias inmortales pero no
transformadas integran también el promotor SV40 funcionalmente
unido al gen de la resistencia a la neomicina.
7. Procedimiento de una de las reivindicaciones
5 6 6, caracterizado en que las células aviarias inmortales
pero no transformadas integran también al menos una secuencia
LTR.
8. Procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado en que las células
contienen además, al menos un casete de expresión que comprende al
menos una secuencia nucleotídica que codifica una subunidad vírica
del tipo péptido, proteína, glicoproteína.
9. Procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado en que las células
están infectadas además, preferiblemente de forma crónica, por un
virus capaz de multiplicarse en estas células.
10. Procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado en que las células
aviarias inmortales pero no transformadas contienen además un gen
anti-apoptosis distinto del bcl-2,
preferiblemente escogido de entre el grupo consistente en el p19E1B
del adenovirus humano, LMP-1 del virus Epstein
Barr, BHRF1 del virus Epstein Barr, ICP34.5 del virus Herpes
simplex, y p35 del baculovirus.
11. Procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado en que las células
aviarias inmortales pero no transformadas integran además vectores
capaces de sobreexpresar uno o varios genes implicados en el
control del ciclo celular con objeto de aumentar la velocidad de
proliferación.
12. Procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado en que las células
aviarias inmortales pero no transformadas integran además genes que
codifican receptores víricos.
13. Procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado en que las células
aviarias inmortales pero no transformadas integran además oncogenes
capaces de acelerar el crecimiento celular.
14. Células aviarias inmortalizadas pero no
transformadas, que comprenden, integrado en su genoma, el gen SV40
T+t bajo la dependencia del promotor de metalotioneína I.
15. Línea celular aviaria inmortal, no
transformada, TDF-2A, depositada en la CNCM
"Collection Nationale de Cultures de Microoganismes" del
Instituto Pasteur con la referencia I-1712.
16. Procedimiento de producción de virus,
caracterizado en que un virus específico de pato, tal como
un adenovirus, parvovirus y reovirus de pato, se replica sobre la
línea TDF-2A de la reivindicación 15, o sobre
células aviarias inmortales obtenidas por multiplicación de la
línea TDF-2A.
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