JP2007515933A - ケラチノサイトの培養方法及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、MDV (マレック病ウイルス)及びFPV (鶏痘ウイルス)の場合がそうである。
文献EP-1 149 899は、鳥類のES細胞の培養方法を記載している。培養培地は、マイトマイシンでの処理又は照射により不活性化されたフィーダー細胞の層、例えばマウス胚繊維芽細胞であるSTO細胞を含むのが好ましい。
よって、いずれのケラチノサイト培養も、完全ウイルス複製、特にエンベロープDNAウイルス、例えばMDVをもたらす条件を提供できていない。
高度に分化した細胞(肝細胞、腸細胞、ニューロン細胞又はケラチノサイト)に感染するウイルスの複製サイクルは、一般に、その宿主細胞の分化プログラムに連結している(Calnekら, J. Natl. Cancer Inst., 45, 341〜351, 1970; Calnekら, Avian Dis., 14, 219〜233, 1970; Schmittら, J. Virol., 70, 1912〜1922, 1996)ので、完全に分化したケラチノサイトの培養が完全ウイルスの複製、よって細胞を含まないビリオンを産生することを可能にすると予想することができる。
(i) ニワトリ血清と、
(ii) 細胞分裂抑制処理により不活性化された繊維芽細胞を含む培養担体と
を含む表皮細胞、特に家禽の表皮細胞用の培養培地である。
(i) 表皮細胞又はケラチノサイトの懸濁物を作製し;
(ii) 上記の細胞を、上記のようなニワトリ血清を含む培養培地中の3T3細胞からなる細胞担体上に接種し;
(iii) 上記の表皮細胞をその細胞担体上でインキュベートする
各工程を含む。
(i) ウイルスの株をケラチノサイトに感染させ;
(ii) 感染したケラチノサイトを、上記の培養方法に従う培養に付し;
(iii) 工程(ii)で増殖したビリオンを抽出する
工程を含むことを特徴とする。
1.1 概要
ニワトリ繊維芽細胞の増殖は、3T3細胞の単層により効率的に解消されず、ニワトリの皮膚全層から作製した培養物は、繊維芽細胞により迅速に侵入される。よって、表皮を分散させる(disaggreagation)前に、サーモライシンでの処理により表皮を真皮から分離する。最初に、培地にウシ胎児血清を補うが、この血清はニワトリケラチノサイトの増殖を許容しない。ウシ血清をニワトリ血清に置き換えることにより、細胞コロニーが発生することが可能になる。
1.2.1 生物学的材料
新生の雛(Gallus gallus)を、高い湿度レベルで37.8℃において20〜21日間インキュベートした受精卵から得る。表皮細胞の初代培養物を得るために、トリブロモエタノールの腹腔内注射により新生の雛に麻酔をかける。
細胞培養(方法1):
足部又は体からの皮膚を回収する。リン酸緩衝食塩水(PBS)でこれを数回洗浄し、Hepes緩衝溶液(HBS)中の0.5 mg/mlのサーモライシン(Sigma)で、37℃で45分間又は4℃で一晩のいずれかでの酵素処理により、表皮を真皮から分離する。次いで表皮を回収し、薄い切片に切断し、トリプシン(0.25%)及びEDTA (0.02%)の存在下に37℃で30分間、2回、トリプシン処理フラスコ内で攪拌しながらインキュベーションすることにより分散させる。細胞懸濁物を800 gで5分間遠心分離する。細胞ペレットを培養培地に採取し、細胞を、マイトマイシンC (4μg/ml)で予め処理したマウス3T3細胞(2.3×104細胞/cm2)の単層で被覆したペトリディッシュに接種する。その後、ディッシュを37℃、7.5% CO2及び100%湿度のインキュベータに入れる。培養培地は、10%のニワトリ血清(Invitrogen)を補った1/1のDMEM/F12混合物(Invitrogen)からなる。次の添加物も培地中に存在する:0.4μg/mlのヒドロコルチゾン(Calbiochem)、5μg/mlのウシインシュリン(Sigma)、2×10-9 Mの3,3',5-トリヨード-L-チロニン(T3、Sigma)、10-10 Mのコレラトキシン(ICN)及び1.8×10-4 Mのアデニン(Calbiochem)。組換えヒト表皮成長因子(EGF)を、最初の培地交換のときに10 ng/mlの濃度で添加する。真皮の除去にもかかわらず繊維芽細胞コロニーが発生する場合があるが、これらは、培養物をCa++もMg++も含有しないPBS又は0.02% EDTAで短時間処理することにより除去できる。次いで、追加の3T3担体細胞を加え、培養を継続する。初代培養物を、接種密度に応じて接種の7〜19日後に移す。次いで、第2代培養物を得る。細胞を、第1継代の後に、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含有する培地中で凍結させる。凍結は、1〜3×106細胞/mlの割合で、上記の培養培地中で行う。凍結細胞は、液体窒素中に無期限に保存できる。
この方法は、文献J. Y. Yiら, Arch. Dermatol. Res., 2001, 293, 356〜362に基づく。この目的は、より完全な最終分化を得ることである。マイトマイシンで処理したか又はしていない3T3細胞を、供給業者(Nitta gelatin, Tokyo)の使用説明に従って、I型コラーゲンマトリックスと混合し(3×105細胞/ml)、この混合物の200μlを、ポリカーボネートフィルタ(Millicell-pc Millipore, Bedford, MA)上に接種する。ケラチノサイトをコラーゲンマトリックス上に接種し、通常の培養培地(DMEM/F12 +ニワトリ血清+添加物)中に5〜7日間浸しながら培養する。その後、フィルタを培地/空気界面に置き、培養を14日間継続する。
Nikon Coolpixデジタルカメラを備えたNikon顕微鏡を用いた。
カバーガラス上に接種された細胞を、3.7%ホルムアルデヒドを含有する冷PBS中に15分間、周囲温度で固定化し、次いで新鮮な固定化溶液で追加の1時間インキュベートする。蒸留水でカバーガラスを洗浄して空気乾燥する。脂質の小滴を0.3%のオイルレッドO (Sigma)及び60%のイソプロパノールを含有する溶液で1時間染色する。インキュベーションの最後に、カバーガラスを蒸留水中に洗浄し、Hoechst 33258試薬(1μg/ml)及びSigma社からIgepalの商品名で販売されている製品0.1%を含有するPBS中に5分間インキュベートする。カバーガラスをPBS/Igepal中に1回、及び水中に1回洗浄し、2.5%のDABCO (1,4-ジアゾビシクロ(2.2.2)オクタン)を含有する、Calbiochem社からMowiolの商品名で販売されている製品中のスライドに載せる。
3T3細胞に接着する円形細胞は接種の数時間後に目で見えるが、典型的な上皮単位を明らかに組織するコロニーは、細胞がプラスチックとの接触を確立するときである、接種の5〜6日後に目で見えるようになる。コロニーは、ヒトケラチノサイトにより形成されるコロニーと同様に、コロニーの周囲の3T3細胞の単層を置き換える。ほとんど全ての細胞が単一の大きい小滴と、ときにおそらく脂質で構成されるいくつかの小さい小滴とを含有することが、最も顕著であるように見られる(図1A及び1B)。その表皮の起源及び重層扁平上皮を形成し得るその能力により、また鳥類のケラチノサイトが脂質の小滴を含有することが知られていることからすると、コロニーがケラチノサイトで構成されていると結論付ける。
2.1 概要
ウシ胎児血清は、ウシ胎児血清が増殖阻害物質を含有していること又は増殖促進因子を欠いていることのいずれかの理由から、ニワトリケラチノサイトの増殖を許容しない。
これらの選択肢の間を区別するために、ニワトリケラチノサイトを、ニワトリ血清を増加する濃度で補った10%のウシ胎児血清の存在下、又はウシ胎児血清を増加する濃度で補った10%ニワトリ血清の存在下のいずれかに10日間培養する。実験の最後に、細胞を固定化してローダミンBで染色する。
2.2.1 材料
用いた生物学的材料は、実施例1に記載のものである。
細胞培養プロトコルは、実施例1に記載されたものに従って用いた。
培養物をPBSで2回洗浄し、10%グルタルアルデヒド含有PBSで、周囲温度で15分間固定化する。次いで、細胞を水中の1%ローダミンBで周囲温度で15分間、緩やかに攪拌しながら染色する。培養物を水で洗浄し、その後空気乾燥する。
図3において、ニワトリ血清がケラチノサイトの増殖を許容し、この能力は、10%ウシ胎児血清に加えられるときにニワトリ血清の用量に依存することが明確にわかる。10%ニワトリ血清の増殖促進活性は、ウシ胎児血清の添加量を増加しても影響されない。このことから、ニワトリ血清がニワトリケラチノサイトの増殖に必要な因子を含有しており、この因子はウシ胎児血清には存在しないと結論付ける。
3.1 概要
表皮細胞の特性の一つは、豊富にケラチノサイトを合成するその能力である。ニワトリケラチノサイトを、カバーガラス上での培養に付し、固定化する。次いで細胞を、抗α−パンケラチン抗体の存在下にインキュベートし、間接蛍光顕微鏡により調べる。
3.1.1 材料
生物学的材料は、実施例1に記載されたものである。
間接免疫蛍光染色
細胞をカバーガラス上に接種する。次の日に、細胞をPBS中に2回洗浄し、次いでアセトン:メタノールの1:1混液中に20分間、-20℃で固定化して空気乾燥させる。カバーガラスを、非特異的部位をブロックするために5%ウシ血清アルブミン(BSA)含有PBS中に10分間、周囲温度でインキュベートする。
集密な培養物をPBSで2回洗浄し、Dounceホモジナイザを用いて粉砕する。細胞は、10 mMのTris-HCl (pH 7.6)、1mM EDTA及びプロテアーゼ阻害剤の混合物(Roche)を含有するバッファー中に20回の回転後にホモジナイズされる。ホモジネートを8000 gで5分間、4℃で遠心分離し、ペレットをTris-EDTAバッファーで2回、2%のNonidet P40を含有するTris-EDTAバッファーで2回洗浄する。最終のペレット中のケラチンを、2%のSDS及び10mMのジチオトレイトールを含有する溶液中に37℃で15分間、超音波装置(2×15秒)を用いて懸濁させる。次いで、サンプルを100℃で2分間加熱し、不溶性の残渣を除去するために8000 gで5分間遠心分離する。
培養における全てのニワトリケラチノサイトは強く標識されるが、3T3細胞は標識されない(図5A)。特異的抗体を省いたときには標識は観察されない。
4.1 概要
哺乳動物の表皮ケラチノサイトの顕著な特性は、最終分化プロセスに従うその能力であり、該プロセスにおいてそれらの核は破壊され、その間に、ドデシル硫酸ナトリウム及び2-メルカプトエタノールの存在下で不溶性の角化細胞エンベロープを発生する。
本実施例において用いた生物学的材料及び方法は、実施例1に記載されたものである。
サイズが数百細胞を超えたニワトリケラチノサイトコロニーの中央が観察されるとき、それらが、それぞれがいくつかの基底細胞を覆う大きい細胞をほぼいつも含有することが注目される(図6A及びB)。これらの鱗屑は培地中に迅速に放出され、おそらく脂質で構成されている屈折小滴をいつも含有する。ニワトリの鱗屑は薄く、ヒトの鱗屑のおよそ2倍大きい(100μmに対して50μmの長軸(greater length)) (図6B)。ニワトリ表皮細胞コロニーを回収して2%のSDS及び2%の2-メルカプトエタノールを含有する溶液に入れ、100℃で加熱するとほとんどの細胞は溶解するが、角化エンベロープは不溶性のままであり、脂質小滴を未だ保持する(図6C)。ニワトリ表皮から直接得られるエンベロープのほとんども、SDS/2-メルカプトエタノール中での煮沸の後に脂質を保持する。これらの脂質は、メタノール/クロロホルムを用いて抽出し得る。
p53タンパク質をコードする遺伝子ファミリーの一部分であるp63タンパク質は、多くの上皮の基底層に豊富に存在する。ヒト表皮において、p63は高い増殖ポテンシャルを有する細胞でのみ見出される。p63をコードする遺伝子のノックアウトにより、全ての重層扁平上皮が存在しなくなり、p63はケラチノサイト幹細胞のマーカーであるとみなされる。
5.1.1 材料
生物学的材料は実施例1に記載される。
細胞培養及び間接免疫蛍光染色法は、それぞれ実施例1及び3に記載されたものである。
細胞を、1:500に希釈した抗ヒトp63モノクローナル抗体4A4の存在下に4℃で一晩インキュベートする。これ以外のプロトコルは、二次抗体を1:200の希釈で用いた以外はケラチン染色に用いた方法と同じである。細胞を、Nikonデジタル写真撮影装置を備えたNikon E600蛍光顕微鏡を用いて写真撮影する。
調べた全ての細胞は、p63について強い核染色を示す。逆に、3T3細胞は標識を示さないか又は時々弱い細胞質標識を示すかのいずれかである(図7)。
6.1 材料及び方法
ニワトリケラチノサイト単層培養物を得る。細胞が2/3の集密であるときに、3T3細胞をEDTAを用いて除去し、ケラチノサイトを3T3担体細胞を含まない小さいペトリディッシュに移す。次の日に、電子顕微鏡で観察されるように細胞を固定化して処理する。
細胞を、0.1MカコジレートpH 7.3で洗浄し、0.1Mカコジル酸ナトリウムpH 7.2中の5% パラホルムアルデヒド及び5% グルタルアルデヒドで90分間固定化し、通常の電子顕微鏡で観察する。酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した超薄切片を、80 kVでJeol JEM-1010電子顕微鏡(Jeol Ltd, Tokyo, Japan)を用いて調べる。
図8は、脂質小滴を含有する細胞の一連の顕微鏡写真を示す。2枚の顕微鏡写真(A及びB)は、核内に包埋された単一の核周囲脂質小滴を有する典型的な細胞を示す。よって、ほとんどの核が三日月形を示す。別の2枚の写真は、多数の小さい細胞質脂質小滴を有する細胞(C)及び核の内部に脂質小滴を有する別の細胞(D)を示す。これらの2つの特徴は、通常存在する。図9は、典型的な表皮細胞の特徴を示す。写真(A)は、デスモソームの存在を示す。写真(B)は、基底細胞と、細胞質がトノフィラメント(tonofilaments) (ケラチン)で充たされている超基底細胞(superbasal cell)とを示す。
7.1 概要
cDNAライブラリを、集密なニワトリケラチノサイト培養物から構築する。163のランダムなコロニーに由来する5'末端のヌクレオチド配列を、自動化シーケンサーを用いて決定する。次いで。cDNA配列との相同性探索のためにGenBank及びタンパク質データバンクを用いる。
cDNAライブラリの構築とヌクレオチド配列決定
Tripure Isolation Reagent (Roche)を用いて、培養でのニワトリケラチノサイトから全RNAを精製する。ポリ(A)+ RNAを、オリゴ(dT)セルロース上で、Micropoly(A) Purist (登録商標) (Ambion) mRNA精製キットを用いて単離する。cDNAライブラリを、1.7μgのポリ(A)+ RNAから、SuperScript (登録商標) Plasmid System (Life Technologies)を用いて作製する。第一の鎖の合成を、オリゴ(dT)配列の後ろにNotI部位を含有するプライマを用いて開始する。第二の鎖の合成の後に、SalIアダプタがcDNAの両端に付加される。NotIでの消化により、3'末端に付着末端が発生するが、SalI付着末端は5'末端に残る。cDNAを、SalI及びNotIで予め切断しておいたプラスミドpSport1に連結し、エレクトロポレーションによりエレクトロコンピテントな細菌E. Coli DH10B (Life Technologies)に導入する。
α−ケラチン5/6について:
配列番号1 5'-AGTGGATTCTATGGACCTGC-3'、
配列番号2 5'-AACTGAGCAGCTTGCTGGC-3'、
配列番号3 5'-CAGTCCAGGTACGAAGAGC-3'、
配列番号4 5'-TAGGATCGGGATATGGAAGC-3';
配列番号5 5'-GGCTTTGATGCTATCTGTGC-3'、
配列番号6 5'-GTGGAGTCTGACATCAACG-3'、
配列番号7 5'-AGAACTGAGACGCACGATGC-3';
β−ケラチンKについて:
配列番号8 5'-ACTAGGATGTTACTGCGTGG-3'。
50個のクローンは、データベースの配列と相同性を示さない。15個のクローンは、仮定的タンパク質と相同性を示す。86個のクローンは、既知の機能を有する遍在タンパク質をコードする。12個のクローンは、特定のケラチノサイトの機能に関係することが知られているタンパク質をコードする。これらのことから、ニワトリケラチノサイトにおいては、約40% (65/163)のmRNAが未知の機能のタンパク質をコードし、約12% (12/98)のmRNAがこの細胞種に特異的であると結論付ける。合計で、7個のケラチノサイト特異的クローンがケラチンをコードする(表III)。クローン6〜8は同じα−ケラチンをコードするが、クローン9〜11は種々のα−ケラチンをコードし、クローン12はβ−ケラチンをコードする。クローン6及び9〜12について、全ヌクレオチド配列を決定する。
8.1 材料及び方法
MDV-1に感染したニワトリの皮膚の初代細胞(本質的に繊維芽細胞)又は血液リンパ球に由来する感染細胞を、亜集密な培養のニワトリケラチノサイト上に接種し、37℃で1時間インキュベートする。吸着後に、接種物を吸引により除去し、ニワトリケラチノサイト単層を、リン酸緩衝食塩水(PBS)で3回洗浄する。細胞培養培地を加え、細胞を37℃で1週間インキュベートする。
Claims (22)
- ニワトリ血清と、ATCCコレクションに番号CCL92で登録された細胞系の不活性化された3T3細胞を含む培養担体とを含むことを特徴とする培養培地。
- 培養培地の全重量に対するニワトリ血清の重量での割合が0.5〜50%の間であることを特徴とする請求項1に記載の培養培地。
- 3T3細胞が、ATCCコレクションに番号CCL92で登録された細胞系の3T3細胞から、ウェルへの接種、培養、移送、培養、トリプシン処理による剥離、各サブクローンの半分の凍結、残りの半分のマイトマイシンC又はガンマ線での処理、処理された各サブクローンでのニワトリケラチノサイトのインキュベーション、培養、固定及びローダミンBでの染色、並びに最大のサイズのケラチノサイトコロニーが最大数存在するサブクローンの選択からなる各工程を含む方法により得られることを特徴とする請求項1又は2に記載の培養培地。
- 3T3細胞が、マイトマイシンCでの処理又はガンマ線の照射から選択される細胞分裂抑制処理により不活性化されたことを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の培養培地。
- 次の構成成分:無機塩、ビタミン、ホルモン及び成長因子の1又はそれより多くをも含有することを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の培養培地。
- 次の構成成分:無機塩、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、グルコース、バッファー、フェノールレッド、EGF (表皮成長因子)、T3、ヒドロコルチゾン、インシュリン、コレラトキシン、トランスフェリン及びアデニンの1又はそれより多くをも含有することを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の培養培地。
- ニワトリ血清と、不活性化された哺乳動物細胞、好ましくは不活性化された繊維芽細胞を含む培養担体とを含む培養培地を含有することを特徴とするケラチノサイト培養物。
- 請求項1〜6のいずれか1つに記載の培養培地を含有することを特徴とする請求項7に記載のケラチノサイト培養物。
- ケラチノサイトが、鳥類のケラチノサイトであることを特徴とする請求項8に記載のケラチノサイト培養物。
- ケラチノサイトが、ニワトリのケラチノサイトであることを特徴とする請求項9に記載のケラチノサイト培養物。
- (i) ケラチノサイトの懸濁物を製造し;
(ii) 前記細胞を、ニワトリ血清と不活性化された繊維芽細胞を含む培養担体とを含む培養培地に接種し;
(iii) 前記細胞をこの培養培地中でインキュベートする
工程を含む、表皮細胞又はケラチノサイトを培養する方法。 - 前記培養培地が、請求項1〜6のいずれか1つで規定されるものであることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 工程(iii)の最後に、培養由来の細胞が回収され、請求項11に記載の方法の工程(ii)及び(iii)に従って前記細胞にさらなる培養サイクルが適用されることを特徴とする請求項11又は12に記載の培養の方法。
- 最大で30回の細胞培養サイクルを含むことを特徴とする請求項13に記載の培養の方法。
- (i) ウイルス株をケラチノサイトに感染させ;
(ii) 感染したケラチノサイトを、請求項11〜14の方法に従う培養に付し;
(iii) 工程(ii)で得られるビリオンを抽出する
工程を含む、インビトロでウイルスを増殖させる方法。 - ビリオンの凍結乾燥工程をも含むことを特徴とする請求項15に記載の方法。
- ケラチノサイトが、ニワトリ表皮細胞であることを特徴とする請求項15又は16に記載の方法。
- 請求項15〜17のいずれか1つに記載の方法により得ることができることを特徴とする、MDV及びFPVから選択されるウイルスから得られる完全無細胞性弱毒化包膜生DNAビリオン。
- 請求項18に記載の少なくとも1のビリオンとワクチン担体とを含有することを特徴とする弱毒生ワクチン。
- 第一に凍結乾燥ビリオンと、第二に免疫化担体とを含み、それぞれが別々の区画に包装されているキットの形であることを特徴とする請求項19に記載のワクチン。
- 注射による投与、経口投与、インオボ経路を経由する投与、又は呼吸経路を経由する投与を意図することを特徴とする請求項19又は20に記載のワクチン。
- 請求項18に記載のビリオンの、マレック病の予防又は治療用の医薬品を製造するための使用。
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