DE19943787A1 - Mittel zur Prävention und/oder Behandlung von Gewebeveränderungen mesenchymalen Ursprungs - Google Patents
Mittel zur Prävention und/oder Behandlung von Gewebeveränderungen mesenchymalen UrsprungsInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Prävention und/oder Behandlung einer Gewebeveränderung, wobei die Gewebeveränderung Gewebe mesenchymalen Ursprungs oder davon abgeleitete Gewebeveränderungen umfaßt und das Mittel ein antiviral wirksames Agens umfaßt.
Description
Die Erfindung betrifft Mittel zur Prävention und/oder Behandlung einer Gewebeveränderung,
wobei die Gewebeveränderung Gewebe mesenchymalen Ursprungs umfaßt, Verwendung der
Mittel, Verfahren zum Ermitteln von zur Herstellung eines Mittels zur Prävention und/oder
Behandlung von Gewebeveränderungen mesenchymalen Ursprungs und/oder zum Ermitteln
von Viren, gegen die das erfindungsgemäße Mittel gerichtet ist sowie Verwendungen des
Verfahrens, Vorrichtung zur Bestimmung eines an der Pathogenese von Gewebeveränderun
gen mesenchymalen Ursprungs beteiligten Viren sowie Verfahren zur Diagnose einer Gewe
beveränderung, wobei die Gewebeveränderung eine Gewebeveränderung mesenchymalen
Ursprungs ist.
Die Behandlung von Gewebeveränderungen wie Tumoren und Karzinomen ist trotz intensiv
ster Bemühungen der modernen Medizin noch immer vergleichsweise beschränkt auf Che
motherapie in ihren vielfältigsten Abwandlungen und chirurgische Eingriffe. Bei weitem pro
blematischer ist die Prävention derartiger Gewebeerkrankungen. In der Regel gilt es dabei, die
für die Gewebeveränderung verantwortlichen Faktoren für den individuellen Lebensbereich
auszuschließen, was jedoch nicht immer möglich ist.
Ein besonderer Problemkreis ist die Prävention und Behandlung von Gewebeveränderungen
mit mesenchymalen Ursprung. Bis zum heutigen Tage ist die der so verschiedenen Tumoren
wie Leiomyom, Endometrium-Polyp, Endometriose, Hamartom der Lunge und der Mamma,
Prostata-Adenom, Atherom und vieler mehr, zugrundeliegende Ätiologie nicht bekannt, was
dazu führt, daß für diese Art der Erkrankungen nur eine symptomatische Therapie bleibt. Un
ter diesen Umständen ist eine Prävention ganz besonders schwierig, weiß doch der Einzelne
nicht, wie er durch sein eigenes Verhalten das Risiko, an einer derartigen Gewebeveränderung
zu erkranken, verringern kann.
Beispielhaft sei hier auf die Leiomyome des Uterus hingewiesen. Diese sind, selbst wenn sie
gutartig ausgebildet sind, ein gesundheitspolitisches Problem. So haben Studien ergeben, daß
in den westeuropäischen Staaten jede dritte Frau Uterusleiomyome aufweist und bspw. in den
USA jeder fünfte Besuch beim Gynäkologen aufgrund von Myomen erfolgt (Morton, C. C.;
Am. J. Pathol. 1998; 153(4): 1050-20). Wenn diese Leiomyome sich symptomatisch äußern,
kann dies z. B. mit erheblichen Blutungen und damit gesundheitlichen Risiken, Schmerzen
und Harninkontinenz verbunden sein. Darüber hinaus können diese Leiomyome Infertilität bei
den betroffenen Frauen zur Folge haben.
Trotz vielfältiger Bemühungen war die Ätiologie/Pathogenese von Uterusleiomyomen bisher
unklar (Morton aaO.). Verschiedene mögliche Ursachen von Uterus-Leiomyomen werden
bspw. von Cramer, S.F. et al. (Cramer S. F.; J. Reprod. Med. 1995, 40(8): 595-600) diskutiert,
so bspw. Verletzung und Reparatur des Endometriums. Auch die Beteiligung von Östrogen
und/oder Progesteron und Östrogen- und/oder Progesteron-Rezeptoren bei der Entstehung von
Neoplasmen der glatten Muskulatur des Uterus wurde (=) in der Literatur diskutiert, so z. B.
von Tiltman A. J. (Tiltman A. J.; Curr. Opin. Obstet. Gynecol., 1997; 9(1): 48-51. Aufgrund
von verschiedenen Untersuchungen hat sich jedoch die Vorstellung entwickelt, daß Mutatio
nen der Gene der HMGI(Y)-Familie daran beteiligt sind (siehe Schoenmakers E. F. et al.; Nat.
Genet. 1995, 10(4): 436-44), wobei nach wie vor ungeklärt ist, ob es sich bei den besagten
Mutationen um primäre oder sekundäre Ereignisse handelt.
Trotz dieser Erkenntnis stehen für die Myome derzeit nur zwei Therapieansätze zur Verfü
gung, zum einen die operative Entfernung der Gebärmutter (Hysterektomie), so alleine in den
USA pro Jahr ca. 200.000 Hysterektomien (Morton, aaO), oder die Myomenukleation, d. h.
das "Herausschälen" der Tumoren, bei Uterus-Erhaltung. Im Falle der Myomenukleation
kann präoperativ eine medikamentöse Myomverkleinerung herbeigeführt werden unter Ver
wendung von Hormon-Antagonisten, die jedoch insoweit mit unerwünschten Nebenwirkun
gen verbunden sind, als daß dadurch menopausale Beschwerden ausgelöst werden.
Es besteht somit für Leiomyome, insbesondere solche des Uterus, sowie Endometriumpoly
pen und Endometriose ein dringender Bedarf an neuen Konzepten für Therapie und Präven
tionen und den hierfür geeigneten Mitteln.
Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel zur Prävention und Behandlung
von Gewebeveränderungen bereitzustellen, wobei die Gewebeveränderung Gewebe mesen
chymalen Ursprungs umfaßt.
Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit
dem jene wesentlichen Komponenten ermittelt werden können, die zur Herstellung der erfin
dungsgemäßen Mittel geeignet bzw. erforderlich sind.
Schließlich ist es noch eine Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Bestimmung eines
an der Pathogenese von Gewebeveränderungen beteiligten Agens bereitzustellen, wobei die
Gewebeveränderung Gewebe mesenchymalen Ursprungs umfaßt.
Des weiteren liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Diagnose einer
Gewebeveränderung bereitzustellen, wobei die Gewebeveränderung Gewebe mesenchymalen
Ursprungs umfaßt, und einen hierzu geeigneten Kit.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Mittel zur Prävention und/oder Behand
lung einer Gewebeveränderung, wobei die Gewebeveränderung Gewebe mesenchymalen Ur
sprungs oder davon abgeleitete Gewebeveränderungen umfaßt und das Mittel ein antiviral
wirksames Agens umfaßt.
Dabei kann vorgesehen sein, daß das Gewebe mesenchymalen Ursprungs zumindest teilweise
mit einem Virus aus der Gruppe der DNA-Viren, und insbesondere mit Adenovirus und/oder
Herpesvirus infiziert ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Mittel kann das Agens ausgewählt sein aus der Gruppe, die
Impfstoffe; Antikörper; Mittel, die die Replikation, Transkription oder Translation viraler
Gene, insbesondere Gene von Adenoviren und/oder Herpesviren, hemmen; Mittel, die mit
Viren, insbesondere Adenoviren und/oder Herpesviren, infizierte Zellen erkennen und/oder
zerstören; und Mittel, die durch ihre effektorzellenstimulierende Wirkung eine antivirale Wir
kung erzielen, umfaßt.
Bei einer Ausführungsform das erfindungsgemäßen Mittels ist dabei vorgesehen, daß die Ge
webeveränderung als ausschließlichen oder obligaten Bestandteil Gewebe umfaßt, wobei we
nigstens einige der das Gewebe aufbauenden Zellen mit Viren, insbesondere Adenoviren
und/oder Herpesviren infiziert sind.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Gewebeproliferation eine Profileration minde
stens einer mesenchymalen Zelle, die mit Viren, insbesondere Adenovirus und/oder Herpesvi
rus infiziert ist.
Dabei kann insbesondere vorgesehen sein, daß die Proliferation eine klonale Proliferation ist.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mittels ist vorgesehen, daß die Gewebe
proliferation eine epitheliale Komponente umfaßt.
Dabei ist insbesondere vorgesehen, daß die epitheliale Komponente mindestens eine Zelle
aufweist, die mit einem Virus aus der Gruppe der DNA-Viren, insbesondere mit Adenovirus
und/oder Herpesvirus, infiziert ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß die mit einem Virus aus
der Gruppe der DNA-Viren, insbesondere mit Adenovirus und/oder Herpesvirus infizierte
Zelle eine chromosomale Veränderung aufweist.
Dabei ist besonders bevorzugt, wenn die chromosomale Veränderung mindestens ein
HMGI(Y)-Gen der infizierten Zelle umfaßt.
Bei dem erfindungsgemäßen Mittel ist in einer Ausführungsform vorgesehen, daß die Gewe
beveränderung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Leiomyome, insbesondere Leiomyome des
Uterus; Endometriumpolypen; Endometriose; Fibroadenome, insbesondere Fibroadenome der
Mamma; Phyllodes-Tumoren, insbesondere der Mamma; Hamartome, insbesondere der
Mamma; Prostata-Adenome; Lipome; agressive Angiomyxome; Enchondrome; pleomorphe
Adenome, insbesondere der Kopfspeicheldrüsen; Kolon-Polypen, insbesondere Kolon-
Adenome; Hamartome, insbesondere der Lunge; Atherome und daraus entstandene Karzino
me umfaßt.
Dabei ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, daß die entstandenen
Karzinome aus der Gruppe ausgewählt sind, die Kolon-Karzinome und Prostata-Karzinome
umfaßt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Impfstoff gegen einen Virus aus der Gruppe
der DNA-Viren, insbesondere gegen Adenovirus und/oder Herpesvirus, gerichtet.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Impfstoff ein Viruspartikel
oder Teile davon.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Impfstoff einen Antikörper,
der gegen das Virus oder einen Teil davon gerichtet ist.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Impfstoff gegen ein Virus gerichtet, dessen Nu
kleinsäure mindestens eine Bindungsstelle für ein Genprodukt von Genen der HMGI(Y)-
Familien oder deren Derivate umfaßt.
In einer alternativen weiteren Ausführungsform ist der Impfstoff gegen ein Virus gerichtet,
dessen Nukleinsäure für mindestens ein Genprodukt codiert, wobei dieses Genprodukt minde
stens mit einem Genprodukt von Genen der HMGI(Y)-Familie oder deren Derivaten wech
selwirkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Bindungsstelle auf der Nukleinsäure des
Virus das Struktur- und Sequenzmerkmal einer ersten AT-reichen Sequenz.
Dabei kann vorgesehen sein, daß die Bindungsstelle auf der Nukleinsäure des Virus neben der
ersten Sequenz noch die Struktur- und Sequenzmerkmale umfaßt, daß
- - eine zweite AT-reiche Sequenz vorhanden ist, und
- - die erste und zweite Sequenz in einer räumlichen Distanz zueinander angeordnet sind.
Dabei kann weiterhin vorgesehen sein, daß die räumliche Distanz so ausgewählt ist, daß die
erste Sequenz und die zweite Sequenz relativ zueinander in einer Ebene auf der Nukleinsäure
angeordnet sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Mittel kann vorgesehen sein, daß die Gene der HMGI(Y)-
Familie MAG-Gene, HMGIC, HMGIY, aberrante Transkripte von Genen der HMGI(Y)-
Familie und Derivate davon umfassen.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mittels ist vorgesehen, daß der Antikörper
ausgewählt ist aus der Gruppe, die monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, polyva
lente Antikörper, Antikörperfragmente und Derivate davon umfaßt.
Weiterhin wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe gelöst durch die Verwendung
des erfindungsgemäßen Mittels zur Immunisierung gegen Viren, die mit der Pathogenese
und/oder Ätiologie der Gewebeveränderungen, wie sie hierin beschrieben sind, verbunden
sind.
Die Aufgabe wird auch gelöst durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels zur
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend das erfindungsgemäße
Mittel und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger zur Prävention und/oder Behandlung der
Gewebeveränderungen, wie sie hierin beschrieben sind, oder zur Immunisierung gegen die
Viren, die mit der Pathogenese und/oder Ätiologie der Gewebeveränderungen, wie sie hierin
beschrieben sind, verbunden sind.
Dabei kann vorgesehen sein, daß die Immunisierung eine aktive Immunisierung ist.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zum Ermitteln von zur Herstellung
eines - erfindungsgemäßen - Mittels zur Prävention und/oder Behandlung von Gewebeverän
derungen, wie hierin beschrieben, geeigneter Viren und/oder zum Ermitteln von Viren, gegen
die das Mittel nach einem der vorangehenden Ansprüche gerichtet ist, welches die Schritte
umfaßt:
- a) Transfektion einer Zellkultur mit normalem Karyotyp, die abgeleitet ist von einem Gewebe, das die Gewebeveränderung nach einem der vorangehenden Ansprüche um faßt, mit einem Expressionsvektor für ein Gen der HMGI(Y)-Familie oder dessen Deri vat,
- b) Vergleich des RNA-Musters der transfizierten Zellen mit demjenigen von Kontroll kulturen, und
- c) Überprüfen von in den transfizierten Kulturen gegenüber Kontrollkulturen expri mierten oder verstärkt exprimierten RNA(s) durch Sequenzhomologie auf das Vorhan densein viraler Elemente.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zum Ermitteln von zur Herstellung
eines - erfindungsgemäßen - Mittels zur Prävention und/oder Behandlung von Gewebeverän
derungen, wie hierin beschrieben, geeigneter Viren und/oder zum Ermitteln von Viren, gegen
die das Mittel nach einem der vorangehenden Ansprüche gerichtet ist, welches die Durchführung eines PCR-Tests umfaßt, wobei die für die PCR verwendeten Primer(paare) der Sequenz
viraler Nukleinsäure entsprechen.
Desweiteren wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zum Ermitteln von zur Herstellung
eines - erfindungsgemäßen - Mittels zur Prävention und/oder Behandlung von Gewebeverän
derungen, wie hierin beschrieben, geeigneter Viren und/oder zum Ermitteln von Viren, gegen
die das Mittel nach einem der vorangehenden Ansprüche gerichtet ist, welches die Schritte
umfaßt:
- a) Anlegen einer cDNA-Bibliothek von einem Gewebe, das die Gewebeveränderung nach einem der vorangehenden Ansprüche umfaßt, das eine Aktivierung eines Gens der HGMI(Y)-Familie oder eines Derivates aufweist, und
- b) Screenen der cDNA-Bibliothek mit einer virusspezifischen Sonde oder
- c) Analyse der cDNA-Klone auf virale Sequenzen oder
- d) Vergleich mit einer cDNA-Bibliothek aus normalem Myometrium.
Bei einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, daß das Gen
der HMGI(Y)-Familie ausgewählt ist aus der Gruppe, die HMGIC, HMGIY, MAG, aberrante
Transkripte der Gene der HMGI(Y)-Familie und Derivate davon umfaßt.
Weiterhin ist in einer Ausfiibrungsform vorgesehen, daß das Virus, das virale Element oder
die virusspezifische Sonde aus der Gruppe von Viren ausgewählt ist, die DNA-Viren, und
insbesondere Adenoviren und/oder Herpesviren umfaßt.
Schließlich wird die Aufgabe auch gelöst durch eine Verwendung eines erfindungsgemäßen
Verfahrens zum Ermitteln von Viren, gegen die zur Prävention und/oder Behandlung von
Gewebeveränderungen, wie hierin beschrieben, immunisiert werden kann.
Die Aufgabe wird auch gelöst durch eine Vorrichtung zur Bestimmung eines an der Pathoge
nese von Gewebeveränderungen, wie hierin beschrieben, beteiligten Virus, welche ein Gen
produkt von Genen der HGMI(Y)-Familie oder einen Teil davon oder dessen Derivate um
faßt, das/der an einen Träger gebunden ist.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist vorgesehen, daß die virale
Nukleinsäure neben der ersten Sequenz noch die Struktur- und Sequenzmerkmale umfaßt, daß
- - eine zweite AT-reiche Sequenz vorhanden ist und
- - die erste Sequenz und zweite Sequenz in einer räumlichen Distanz zueinander ange ordnet sind.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß die räumliche Distanz so ausgewählt
ist, daß die erste Sequenz und die zweite Sequenz relativ zueinander in einer Ebene auf der
Nukleinsäure angeordnet sind.
Die Aufgabe wird auch gelöst durch ein Verfahren zur Diagnose einer Gewebeveränderung,
wobei die Gewebeveränderung eine solche Gewebeveränderung umfaßt, wie hierin beschrie
ben, wobei eine Körperflüssigkeit auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen DNA-Viren,
und insbesondere gegen Adenoviren und/oder Herpesviren, untersucht wird.
Die Aufgabe wird desweiteren gelöst durch ein Verfahren zur Diagnose einer Gewebeverän
derung, wobei die Gewebeveränderung eine solche Gewebeveränderung umfaßt, wie hierin
beschrieben, wobei eine Körperflüssigkeit auf das Vorhandensein von Antigenen von DNA-
Viren und insbesondere von Adenoviren und/oder Herpesviren untersucht wird.
Schließlich wird die Aufgabe auch gelöst durch ein Verfahren zur Diagnose einer Gewebe
veränderung, wobei die Gewebeveränderung eine solche Gewebeveränderung umfaßt, wie
hierin beschrieben, wobei eine Gewebeprobe mit einem Mittel umgesetzt wird, das aus der
Gruppe ausgewählt ist, die Antikörper, die mit DNA-Viren und insbesondere Adenoviren
und/oder Herpesviren oder Teilen davon reagieren; Antigene, die von DNA-Viren und insbe
sondere Adenoviren und/oder Herpesviren oder Teilen davon stammen, und Nukleinsäure, die
mit Nukleinsäure von DNA-Viren und insbesondere von Adenoviren und/oder Herpesviren
wechselwirkt, umfaßt, im Falle der Anwesenheit von DNA-Viren und insbesondere Adenovi
ren und/oder Herpesviren sich ein Komplex aus dem Mittel und dem DNA-Virus und insbe
sondere Adenovirus und/oder Herpesvirus bildet und der Komplex nachgewiesen wird.
Bevor im folgenden die Erfindung näher erläutert wird, sollen die hierin verwendeten Be
grifflichkeiten in Ergänzung zu dem allgemeinen Verständnis des Fachmannes auf dem Ge
biet definiert werden.
Unter Leiomyomen sollen hierin insbesondere benigne Tumoren der glatten Muskulatur ver
standen werden (Definition nach Baltzer, J. et al.; Gynäkologie - Ein kurzgefaßtes Lehrbuch,
5. Aufl., 1994, Thieme Verlag).
Unter Endometriumpolypen sollen hierin insbesondere Hyperplasien und polypöse Wachs
tumsformen des Endometriums mit stromaler und Drüsen-(epithelialer) oder ausschließlich
stromaler Komponente verstanden werden.
Unter Endometriose soll hierin insbesondere Endometriumherde, die sich an anderer Stelle als
im Cavum uteri (Definition nach Baltzer aaO.) befinden, verstanden werden.
Unter Myomen sollen hierin insbesondere Leiomyome verstanden werden (Definition nach
Baltzer aaO.).
Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß Gewebeveränderungen, die
ein Gewebe umfassen, das mesenchymalen Ursprungs ist, ein gemeinsamer Pathogenitätsme
chanismus zugrunde liegt. Dieser Pathogenitätsmechanismus ist mit der Anwesenheit von
DNA-Viren in dem Gewebe mesenchymalen Ursprungs verbunden. Mit anderen Worten,
DNA-Viren sind ein Faktor bei der Auslösung von Gewebeveränderungen, die Gewebe um
fassen, das mesenchymalen Ursprungs ist.
Im Zusammenhang damit scheinen innerhalb der Gruppe der DNA-Viren insbesondere die
Adenoviren hierfür von besonderer Bedeutung zu sein. Eine weitere Gruppe von DNA-Viren,
die für die hierin beschriebenen Gewebeveränderungen, die ein Gewebe umfassen, das me
senchymalen Ursprungs ist von besonderer Bedeutung sind, sind Viren der Herpesgruppe, die
im folgenden vereinfacht als Herpesviren bezeichnet werden. Desweiteren gehören zur Grup
pe der DNA-Viren, die für die hierin beschriebenen Gewebeveränderungen von Bedeutung
sind, die Papova-Viren.
Der vorliegenden Erfindung liegt weiterhin die Erkenntnis zugrunde, daß für die hierin be
schriebenen Gewebeveränderungen verschiedene Viren, insbesondere DNA-Viren, synergi
stisch wirken können.
Die Gewebeveränderungen können dabei Tumore und/oder Karzinome umfassen. Hinsicht
lich des histologischen Aufbaus der besagten Gewebeveränderungen kann festgestellt werden,
daß diese vollständig aus solchem Gewebe bestehen können, das sich unter dem Einfluß von
DNA-Viren und insbesondere Adenoviren und/oder Herpesviren verändert hat, oder aber ein
Teil des die Gewebeveränderung aufweisenden Gewebes aus solchem Gewebe besteht, das
sich unter dem Einfluß der besagten Viren verändert hat, mithin dieser Teil des Gewebes le
diglich ein, aber ein obligater Bestandteil der Gewebeveränderung oder Tumors ist.
Die Gewebeveränderung kann des weiteren eine solche sein, bei der die Veränderung auf eine
Proliferation von mit den besagten Viren infizierten mesenchymalen Zellen zurückzuführen
ist. Gleichzeitig kann die Gewebeveränderung auch eine epitheliale Komponente aufweisen.
Unter epithelialer Komponente soll hierin ein Teil der Gewebeveränderung (bspw. des Tu
mors oder Karzinoms) verstanden werden, der hinsichtlich seines histologischen Ursprungs
dem Epithel zugewiesen werden kann. Diese histologische Zuweisung erfolgt dabei auf der
Basis allgemein akzeptierter Kriterien der Histopathologie.
Bei den Gewebeveränderungen kann dabei auch die Situation vorliegen, daß die Proliferation
eine klonale Proliferation ist, d. h. die Proliferation auf ein einzelnes Infektionsereignis zu
rückgeht, mithin eine einzelne Zellen infolge der Infektion mit den besagten Viren transfor
miert wird. Infolge der Transformation dieser einzelnen Zelle verändert sich das Verhalten der
Zelle, insbesondere ihr Differenzierungszustand und/oder ihr Wachstumsverhalten, was zu der
Gewebeveränderung führt. Geht die Gewebeveränderung auf eine einzelne, mit den besagten
Viren infizierte Zellen zurück, spricht man von einem monoklonalen Tumor, geht die Gewe
beveränderung auf mehrere, aber wenige mit den besagten Viren infizierte Zellen zurück,
spricht man von einem oligoklonalen Tumor. Beide Klonalitäten gehen auf den hierin offen
barten durch die besagten Viren vermittelten Pathogenitätsmechanismus zurück.
Mit der Infektion der mesenchymalen Zellkomponente von Gewebe durch die besagten Viren,
das schließlich die Gewebeveränderung zeigt bzw. diese ausbildet, als universellen Pathoge
nitätsmechanismus sind eine Reihe von verschiedenen Infektionsszenarien möglich. So kann,
z. B. in einem Fall die Primärinfektion in einem Gewebe mesenchymalen Ursprungs erfolgen
und auf dieses beschränkt sein. Dabei kann es zu weiteren Gewebeveränderungen kommen,
wobei eine Epithelproliferation auftritt, die mittelbar oder unmittelbar Folge der Virusinfekti
on der mesenchymalen Komponente ist. Beispiele hierfür stellen Hamartome und Endome
triose dar. Es ist jedoch auch möglich, daß sich die Primärinfektion auf andere Gewebeteile
ausweitet. Dabei kann bspw. auch epitheliales Gewebe infiziert werden, wobei es sich dabei
um eine Sekundärinfektion handelt und dieses sekundär infizierte epitheliale Gewebe eben
falls proliferieren kann. Es ist des weiteren denkbar, daß epitheliales Gewebe zuerst, d. h. pri
mär, durch die besagten Viren infiziert wird und sich ausgehend hiervon eine Sekundärinfek
tion des mesenchymalen Gewebes oder Gewebeanteils der - späteren - Gewebeveränderung
ergibt, die dann zu einer Proliferation des mesenchymalen Gewebes führen kann. Ein Beispiel
für das zuletzt beschriebene Szenario stellt das Kolonadenom dar.
Unter Adenovirus soll hierin ganz allgemein ein jegliches Mitglied der Gruppe der Adenovi
ren verstanden werden, wie sie bspw. beschrieben ist in Fields Virology, 3rd Edition, Raven
Publisher, Philadelphia, 1996 und die dort beschriebenen Eigenschaften aufweist. Gleiches
gilt für die Viren aus der Gruppe der Herpesviren, d. h. unter Herpesvirus soll hierin ganz
allgemein ein jegliches Virus aus der Gruppe der Herpesviren verstanden werden, z. B. auch
das Cytomegalovirus, wie in Fields Virology, aaO, beschrieben und das die dort beschrie
benen Eigenschaften aufweist. Des weiteren erstreckt sich der Begriff der Adenoviren
und/oder Herpesviren hierin insbesondere im Zusammenhang mit dem gegen Adenoviren
und/oder Herpesviren gerichteten Impfstoff, auch auf solche Viren, die wesentliche Elemente
und/oder Eigenschaften dieser Viren aufweisen. Hierzu zählen bspw. auch gentechnologisch
veränderte Viren.
Das DNA-Virus, insbesondere Adenovirus und/oder Herpesvirus, kann während oder nach
der Infektion in der Zelle in irgendeiner Form vorliegen. So kann das Virus in den infizierten
Zellen episomal oder in das Wirtsgenom integriert vorliegen. Es kann einen lytischen Zyklus
durchlaufen, in die Umgebung freigesetzt werden und weitere Zellen infizieren, wie auch
oben ausgeführt. Das Virus kann auch in epithelialen Zellen entweder episomal oder in das
Genom integriert vorliegen.
Zur Gruppe der DNA-Viren gehören auch die Polyoma-Viren, die wiederum zur Familie der
Papovaviridae, zu denen auch die Papilloma-Viren und Simian Vacuolating Virus 40 (SV 40)
gehören. Die Familie zeichnet sich durch extreme Hitzestabilität aus. Papovaviridae sind hül
lenlose kubische DNA-Viren mit einem Durchmesser von 45 bis 55 nm, umfassend 72 Kap
somere sowie eine zyklische doppelsträngige DNA. Das hierin insbesondere zu bzw. im Zu
sammenhang mit Adenoviren und Herpesviren Gesagte gilt sinngemäß auch für diese Gruppe
der DNA-Viren.
Infolge dieses insbesondere beim Menschen hinsichtlich Gewebeveränderungen, die Gewebe,
das mesenchymalen Ursprungs ist, umfassen, nach derzeitiger Auffassung des Erfinders, uni
versellen Pathogenitätsmechanismus, der auf der Beteiligung von DNA-Viren und insbeson
dere Adenoviren und/oder Herpesviren beruht, besteht damit die Möglichkeit, Mittel bzw.
Therapiekonzepte zur Behandlung von all jenen Gewebeveränderungen bereitzustellen, die
Gewebe mesenchymalen Ursprung umfassen. Gleiches gilt für die Diagnose derartiger Gewe
beveränderungen.
Darüberhinaus kann in Kenntnis dieses Pathogenitätsmechanismus nun auch eine Prävention
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mittel betrieben werden. Die Umsetzung dieser
fundamentalen Erkenntnis besteht darin, antivirale Mittel zur Behandlung derartiger Gewebe
veränderungen zu verwenden. Diese Mittel können insoweit auch bereits bekannte antiviral
wirksame Mittel umfassen, solange sie geeignet sind, die virale, insbesondere DNA-virale
Aktivität, noch spezieller die Aktivität von Adenoviren und Herpesviren, zu beeinflussen. Als
möglichen Angriffspunkt für eine derartige Beeinträchtigung der viralen Aktivität sind sämt
liche Teilschritte bzw. Teilaspekte denkbar, einschließlich des Absorptionsvorganges, Inter
nalisierungsvorganges, Integration der viralen DNA in das Wirtsgenom oder Stabilisierung im
Zytoplasma der Wirtszelle, Replikation, Transkription und Translation, Zusammenbau des
Viruskapsids und Freisetzung des Viruskapsids. Daneben eignen sich auch besonders Impf
stoffe gegen diese Viren sowohl zur Therapie, besonders jedoch zur Prävention derartiger
Gewebeveränderungen, wie im folgenden detaillierter ausgeführt werden wird.
Beispielhaft seien in der nachfolgenden Tabelle 1 Gewebeveränderungen angeführt, für die
die erfindungsgemäßen Mittel jeweils angewandt werden können bzw. für deren Therapie und
Prävention die bereits bekannten antiviralen Mittel, wie sie beispielsweise in Tabelle 2 gezeigt
sind, verwendet werden können.
Neben dem vorstehend geschilderten universellen Pathogenitätsmechanismus hat der Erfinder
weiterhin überraschend festgestellt, daß die Entstehung der Gewebeveränderungen, die Ge
webe mesenchymalen Ursprungs umfassen bzw. entsprechender Tumore, aufbauend auf der
oben beschriebenen Infektion mit den besagten Viren durch ein zusätzliches Ereignis in sy
nergistischer Weise gefördert wird. Bei diesem zusätzlichen Ereignis handelt es sich um
chromosomale Veränderungen, insbesondere um solche, die die HMGI(Y)-Gene betreffen,
d. h. Bruchpunkte struktureller Chromosomenaberrationen liegen entweder innerhalb der Gene
oder in einer Entfernung von diesen, so daß es durch die strukturellen Chromosomenaberra
tionen zu einer transkriptionellen De-Regulierung der HMGI(Y)-Gene kommt. Infolge dieser
chromosomalen Veränderung kommt es zur Expression nunmehr veränderter zellulärer Gen
produkte, die mit bestimmten viralen Sequenzen interagieren, wodurch der beobachtete sy
nergistische Effekt bei der Genese der Gewebeveränderungen bedingt wird. Der Begriff der
HMGI(Y)-Gene wird im folgenden im Zusammenhang mit den als erfindungsgemäße Mittel
offenbarten Impfstoffen noch weiter ausgeführt werden.
Beispiele von Gewebeveränderungen, die neben der Infektion des mesenchymalen Gewebe
anteils noch eine chromosomale Veränderung der HMGI(Y) aufweisen, ergeben sich aus der
obigen Tabelle 1, wobei beispielhaft auf Endometriumpolypen, Endometrioseherde, Hamarto
me der Lunge, Lipome, Fibroadenome der Mamma und pleomorphe Adenome der Speichel
drüsen verwiesen wird. Wie auch insbesondere aus Tabelle 1 ersichtlich, kann der Anteil der
jenigen Gewebeveränderungen, die neben der DNA-viralen Infektion, insbesondere einer In
fektion durch Adenoviren und/oder Herpesviren, noch eine chromosomale Veränderung der
HMGI(Y)-Gene tragen, schwanken. Der Nachweis der chromosomalen Veränderung ist bei
spielsweise beschrieben in Kazmierczak et. al., Oncogene 12: 515-521.
Wie bereits vorstehend erwähnt, setzt die Prävention und Therapie mesenchymaler Gewebe
veränderungen, die Gewebe mesenchymalen Ursprungs umfassen, bei einer antiviralen The
rapie an. Die Gewebeveränderungen können jedoch neben der viralen Infektion noch chromo
somale Veränderung betreffend die HMGI(Y)-Gene aufweisen. Auch derartige Gewebever
änderungen können, da auch sie letzten Endes auf einer viralen Aktivität beruhen, mit den
hierin vorgeschlagenen Mitteln behandelt bzw. verhindert werden. Damit werden auch die
eingangs beschriebenen Untersuchungen von Schoenmakers (a.a.O.) betreffend Mutationen
der Gene der HMGI(Y)-Familie an Uterus-Leiomyomen erklärlich, wenngleich aus dem darin
geschilderten Befund, die hierin offenbarte technische Lehre nicht abgeleitet werden konnte.
Die Pathogenese der Leiomyome beruht eben nicht nur auf Mutationen, insbesondere Chro
mosomenaberrationen im Bereich der Loci von Mitgliedern der HMGI(Y)-Genfamilie, son
dern es handelt sich bei diesen Fällen, d. h. Gewebeveränderung unter Beteiligung eines Ge
webes mesenchymalen Ursprungs mit einer Mutation im Bereich der Gene der HMGI(Y)-
Gene, um eine Folge aus dem Zusammenwirken von Mutationsereignissen der Mitglieder der
HMGI(Y)-Genfamilie und einem Virus, insbesondere eines transformierenden Virus, bzw.
Infektion mit einem solchen handelt, wobei die virale Infektion selbst bereits ausreicht, um
eine Myomentstehung auszulösen, dessen Wachstumspotential durch eine - ggf. nachfolgende
- Mutation von Genen der HMGI(Y)-Familie verstärkt wird.
Ohne im folgenden durch diese Annahmen beschränkt sein zu wollen, insbesondere nicht im
Detail, scheint es derzeit so zu sein, daß infolge der Infektion mit einem transformierenden
Virus sowie dessen folgende Persistenz, mutmaßlich nach Integration in das zelluläre Genom,
in Zellen ohne weitere Mutation von Genen der HMGI(Y)-Familie die transformierenden vi
ralen Proteine exprimiert, ggf. nur schwach, werden und die resultierenden Tumoren daher
sehr langsam wachsen und klein bleiben. Infolge einer mutationsbedingten Re-Aktivierung
von Genen der HMGI(Y)-Familie, z. B. durch Verlagerung von Enhancern in Juxta-Position
zu den Genen, kommt es zu einer verstärkten Aktivierung der Gene der transformierenden
Proteine und einer insgesamt erhöhten Expression derselben. Die in der Zelle vermehrt vor
handenen transformierenden Proteine führen zu einer deutlich höheren Wachstumsaktivität
der entsprechenden Tumoren und somit zu einem verstärkten Tumorwachstum.
Konkret hat man gefunden, daß die Genprodukte der Mitglieder der Gene der HMGI(Y)-
Familie, die typischerweise an Nukleinsäuren binden können, so bspw. beschrieben von
French, S. W. et al. (French, S. W. et al.; Mol. Cell. Biol., 1996; 16(10): 5393-99; Yie, J. et al.;
Mol. Cell. Biol., 1997, 17(7): 3649-62), auch an Nukleinsäure von transformierenden Viren
binden, wobei bei Bindung im Bereich der regulatorischen Regionen der Nukleinsäure (z. B.
Promotoren und Enhancer) die Genprodukte der Gene der HMGI(Y)-Familie auf die Tran
skriptionsrate der viralen transformierenden Proteine Einfluß nehmen.
Weiterhin hat man gefunden, daß die Genprodukte der Mitglieder der Gene der HMGI(Y)-
Familie auch mit einem Genprodukt einer viralen Nukleinsäure wechselwirken können.
Diese Wechselwirkung kann in einer direkten Wechselwirkung der beiden Genprodukte, d. h.
dem Genprodukt der viralen Nukleinsäure und demjenigen eines Gens der HMGI(Y)-Familie,
bestehen. Eine andere Form der Wechselwirkung kann darin bestehen, daß diese durch eine
weitere Komponente vermittelt wird, d. h. keine direkte Wechselwirkung der beiden Genpro
dukt-Spezies vorliegt. Diese vermittelnde weitere Komponente kann bspw. eine Nukleinsäure
sein, und insbesondere eine solche Nukleinsäure, die eine Bindungsstelle für ein Genprodukt
von Genen der HMGI(Y)-Familie aufweist, wie sie oben beschrieben wurde.
Infolge dieses Zusammenwirkens von Genprodukten der Gene der HMGI(Y)-Familie mit
Nukleinsäure von transformierenden Viren, insbesondere den regulatorischen Regionen der
Nukleinsäure (z. B. Promotoren und Enhancer) dieser Viren, kann der Entstehung von Gewe
beveränderungen mit Gewebe mesenchymalen Ursprungs, wie sie beispielhaft in Tabelle 1
oben angegeben sind, dadurch entgegengewirkt werden, daß ein antivirales Mittel gegen die
Viren verwendet wird. Wie vorstehend ausgeführt, sind allgemein derartige antivirale Mittel
zu diesem Zweck geeignet, die gegen die an der Gewebeveränderung kausal beteiligten Viren
gerichtet, d. h. aktiv sind. Die Viren sind bevorzugt DNA-Viren und ganz besonders bevor
zugt Adenoviren und/oder Herpesviren. Innerhalb einer jeder dieser Virengruppen sind, mit
Blick auf die hier speziell diskutierte Gruppe von Gewebeveränderungen, d. h. jene, bei denen
auch Gene der HMGI(Y)-Familie Mutationen aufweisen, solche Viren bevorzugt, deren Nu
kleinsäure zumindest eine Bindungsstelle für ein Genprodukt von Genen der HMGI(Y)-
Familie oder deren Derivaten umfaßt.
Die dagegen gerichteten antiviralen Mittel, zu denen auch gegen diese Viren gerichtete Impf
stoffe gehören, verhindern somit, daß die entsprechenden Gewebe, viral infiziert werden bzw.
es zu einer Vermehrung des viralen Materials kommt und somit die Ausbildung des Komple
xes aus viraler Nukleinsäure und Genprodukten der Gene der HMGI(Y)-Familie verhindert
wird, was in der Folge dazu führt, daß die Ausbildung der Gewebeveränderungen unterbleibt.
Bei der Pathogenese der hierin beschriebenen Gewebeveränderungen scheint weiterhin eine
Bindung von Genprodukten viraler Nukleinsäure mit Genprodukten von Genen der
HMGI(Y)-Familie und deren Derivaten zu erfolgen und infolge dessen sich der Einfluß der
viralen transformierenden Proteine zu erhöhen. Infolge der verschiedenen antiviralen Mittel
wird dieses Zusammenwirken letztendlich verhindert oder zumindest verringert.
Hierin soll Bindung eines Genprodukts von Genen der HMGI(Y)-Familie oder deren Deriva
ten an virale Nukleinsäure oder an das Genprodukt viraler Nukleinsäure, insbesondere eine
jegliche Wechselwirkung der daran beteiligten Molekülspezies umfassen, die dazu führt, daß
die den Komplex ausbildenden Komponenten nicht mehr als Einzelkomponenten wahrge
nommen werden, sondern der Komplex die einzig wahrnehmbare Komponente ist, was jedoch
nicht ausschließt, daß Einzelkomponenten noch in nicht-gebundener Form vorhanden sind.
Eine derartige Bindung schließt bspw. Wechselwirkung durch elektrostatische Anziehungs
kräfte, von der Wals-Kräfte, hydrophobe Wechselwirkung, Wasserstoffbrückenbindungen und
Disulfidbrücken und Kombinationen davon ein. Ein derartiger Komplex umfaßt zumindest die
beiden Genproduktespecies, d. h. ein Genprodukt der viralen Nukleinsäure und ein Genpro
dukt der Gene der HMGI(Y)-Familie, die direkt miteinander wechselwirken können, kann
aber auch zusätzlich eine Nukleinsäure umfassen, wobei auch in diesem Fall eine direkte
Wechselwirkung der beiden Genproduktspecies erfolgen kann, jedoch nicht notwendigerwei
se erfolgen muß.
Insoweit betrifft ein Aspekt der Erfindung auch einen Impfstoff gegen transformierende Vi
ren, der zur Prävention und/oder Behandlung der hierin beschriebenen Gewebever
änderungen geeignet ist.
Grundsätzlich sind alle der hierin offenbarten Mittel sowohl zur Therapie als auch zur Prä
vention von Gewebeveränderungen der hierin beschriebenen Art geeignet. Ganz besonders
vorteilhaft für die Prävention sind dabei solche Mittel, die einen Impfstoff gegen die Viren, d. h. DNA-Viren und insbesondere Adenoviren und/oder Herpesviren, umfassen, die somit die
bisherigen unbefriedigenden Therapie- und Präventionskonzepte mit ihren nicht unerhebli
chem Gefährdungspotential obsolet machen. Dabei ist besonders beachtlich, daß die Verwen
dung von Impfstoffen für den Körper besonders schonend, da mit in der Regel vergleichswei
se weniger Nebenwirkungen verbunden, ist.
Die Herstellung von Impfstoffen gegen Viren ist in der Technik allgemein bekannt und bspw.
beschrieben in Modrow, S.; Falke, D.; Molekulare Virologie, Spektrum, Akad. Verl., 1997.
Bei Impfstoffen sind grundsätzlich verschiedene Arten bekannt, nämlich Lebendimpfstoffe,
die vermehrungsfähiges Virus enthalten, Impfstoffe aus inaktiviertem Virus, wobei die Viren
in nicht mehr vermehrungsfähiger Form vorliegen, Spaltimpfstoffe, die nur aus den für die
Immunisierung wichtigen Komponenten des Virus bestehen, auch als Subunit-Vakzine oder
Antigenimpfstoffe bezeichnet, und sogenannte "synthetische Antigenimpfstoffe". Alle vorer
wähnten Impfstofformen können im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Lebendimpfstoffe enthalten vermehrungsfähige Virusstämme, die einen spezifischen Schutz
bewirken, aber bei gesunden Tieren zu keiner Erkrankung führen. Ein Lebendimpfstoff kann
entweder aus homologen (artgleichen) oder heterologen (artfremden) Virusstämmen herge
stellt werden. Als homologe Impfstoffe können natürlich gewonnene oder künstlich herge
stellte Stämme eines Virus verwendet werden.
Natürlich gewonnene Impfvirusstämme stammen von Feldstämme ab, die nur noch eine
schwache bzw. keine Virulenz mehr besitzen, also bei gesunden Tieren keine Erkrankung
mehr hervorrufen, sich aber im Wirt vermehren und die Ausbildung einer Immunität bewir
ken.
Eine Untergruppe der Lebendimpfstoffe betrifft die künstlich abgeschwächten, attenuierten
Stämme. Sie werden aus gut immunisierenden, vollvirulenten Feldviren dadurch gewonnen,
daß sie nach einer mehr oder weniger großen Anzahl von Passagen, bevorzugt in Zellkulturen,
künstlich kultiviert werden, wodurch sie ihre Virulenz für den natürlichen Wirt verlieren. Der
Virulenzverlust in einer derartigen passierten Viruspopulation tritt nicht gleichzeitig bei allen
Viruspartikeln ein. Durch bestimmte Selektionsverfahren kann man aber attenuierte Viru
spartikel isoliert gewinnen (z. B. Plaque-Methode, Endverdünnungsmethode usw.).
Unter Attenuierung versteht man eine gezielte Abschwächung oder Aufhebung der Virulenz
eines vermehrungsfähigen Virus für einen bestimmten Wirt unter Erhaltung der Vermeh
rungsfähigkeit, der Antigenität und der Immunogenität, die über eine bestimmte Generations
folge konstant bleibt.
Die Attenuierung kann eine Modifikation oder eine Mutation hinsichtlich Verlust der krank
machenden Eigenschafen, hier im vorliegenden Falle insbesondere hinsichtlich der transfor
mierenden Eigenschaften, sein. Sie ist entsprechend mehr oder weniger stabil. Während man
in früherer Zeit für eine künstliche Virulenzabschwächung vorwiegend Passagen in Tieren
oder Bruteiern durchführte, gewinnt man heute attenuierte Stämme hauptsächlich aus Zell
kulturen über Dauerpassagen.
Lebendvakzine aus heterologen Virusstämmen können dann einen Immunschutz bewirken,
wenn zwischen artverschiedenen Viren sehr enge immunologische Verwandtschaftsbeziehun
gen bestehen. Man kann dann als Impfstamm den verwandten heterologen und deshalb nicht
krankmachenden Virusstamm verwenden.
Lebendvakzine haben Vor- und Nachteile. Durchschnittlich wird mit ihnen eine bessere und
länger anhaltende Immunität erzielt. Ein gut attenuiertes Impfvirus kann den Immunitätsme
chanismus nur dann stimulieren, wenn es in ausreichender Konzentration verabreicht wird.
Die Bestimmung einer entsprechenden ausreichenden Konzentration kann durch einfache
routinemäßige Versuche erfolgen, die im Rahmen des Könnens des Durchschnittsfachmanns
liegen. Der Impfschutz setzt in der Regel schon nach wenigen Tagen nach der Impfung ein.
Verantwortlich sind hierfür mehrere Vorgänge: Interferenz, Interferon-Bildung, schnelle Ent
wicklung einer zellulären Immunität. Ein weiterer Vorteil von Lebendvakzinen besteht darin,
daß sie sehr leicht lokal appliziert werden können, z. B. oral oder per Aerosol. Dies ist beson
ders mit Blick auf die vergleichsweise leichte Zugänglichkeit der betroffenen Gewebe bzw.
Organe im Falle der hierin beschriebenen Gewebeveränderungen vorteilhaft, da in einem sol
chen Fall der Endverbraucher ein entsprechendes Mittel selbst anwenden kann.
Weiterhin können gemäß der vorliegenden Erfindung Impfstoffe aus inaktivierten Viren ver
wendet werden. Als Virusinaktivierung wird generell die Aufhebung der Infektiosität eines
Virusteilchens bezeichnet. In der Impfstoffherstellung speziell versteht man unter Inaktivie
rung, daß Viren künstlich, mit chemisch-physikalischen Verfahren, die Vermehrungsfähigkeit
genommen wird, ohne daß dabei die anderen Aktivitäten, insbesondere die antigenen und
immunogenen Fähigkeit negativ beeinflußt werden. Für Impfstoffe aus inaktivierten Viren
findet sich in der Literatur teilweise noch der Begriff "antigener Impfstoff".
Als Ausgangsmaterial für diese Impfstoffe dienen aus virushaltigen Organen oder Geweben,
heute jedoch in erster Linie aus Zellkulturen hergestellte, gereinigte und hochkonzentrierte
Virussuspensionen von vollvirulenten gut immunisierenden Virusstämmen. Diese konzen
trierten Virussuspensionen werden dann schonend durch geeignete Verfahren inaktiviert. Op
timal sind chemische oder physikalische Behandlungen, die die Virusnukleinsäure als Träger
der Vermehrungsfähigkeit und Infektiosität zerstören, jedoch die Proteinanteile des Virus, die
wirksame Komponenten für Antigenität und Immunogenität sind, möglichst wenig schädigen,
denaturieren oder verändern. Bewährte Mittel sind z. B. Formaldehyd und bestimmte Deter
genzien. Als physikalische Komponenten verwendet man Wärme und Strahlen.
Weiterhin können im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Spaltimpfstoffe ver
wendet werden, die durch Aufspaltung von Viren gewonnene antigene und immunisierende
Viruskomponenten in, in der Regel, gereinigter Form enthalten.
Bei den behüllten Viren sind dies die virusspezifischen Glycoproteide der lipidhaltigen Hül
len. Spezifische Antikörper gegen diese Antigene binden in vivo an die Glycoproteide des
Virus, blockieren dadurch deren Haftungsfunktion an die Zellen und damit die Infektiosität.
Die immunisierenden Glycoproteide behüllter Viren kann man durch die chemische Aufspal
tung der Virushülle (bestimmte lipidlösende Detergenzien) freisetzen. Das Virus verliert da
durch spontan und restlos seine infektiösen Eigenschaften und anschließend wird das ge
wünschte Glycoproteid von unerwünschten Komponenten wie Nukleoprotein, Kapsidenzym,
Lipide etc. des aufgespaltenen Virusmaterials durch physikalisch-chemische Verfahren gerei
nigt, konzentriert und zum Impfstoff verarbeitet.
Bei unbehüllten, nackten Viren sind Spaltimpfstoffe aus den für die Immunisierung maßgeb
lichen Kapsidproteinen von den Fachleuten auf dem Gebiet entwickelbar.
Schließlich können auch synthetische antigene Impfstoffe verwendet werden, die mittels
gentechnologischer Verfahren hergestellt werden. Über Isolierung und Identifizierung der
maßgeblichen Gene des Virusgenoms kann beispielsweise das Kapsidprotein der entspre
chenden Viren gentechnologisch produziert werden. Dabei ist es im Rahmen der Fähigkeiten
des Fachmannes die entsprechende Nukleinsäure bzw. daraus resultierenden Proteine soweit
zu verkürzen, daß lediglich die antigene Determinante bzw. das entsprechende Epitop als
Impfstoffkomponente verbleibt. In diesem Sinne ist auch die erfindungsgemäße Vorrichtung
zu verwenden. Die an das mit Genprodukt von Genen der HMGI(Y)-Familie versehene Trä
germaterial gebundene virale Nukleinsäure kann, in der Regel nach Elution, dazu verwendet
werden, zu bestimmen welches Virus, bzw. dessen Nukleinsäure, an der Ausbildung des für
die Entstehung der hierin beschriebenen Gewebeveränderungen verantwortlichen Komplexes
aus viraler Nukleinsäure und Genprodukt eines Gens der HMGI(Y)-Familie beteiligt ist.
Nach dieser Identifizierung kann die erfindungsgemäße Vorrichtung aber auch für die Bereit
stellung einer für die Herstellung eines erfindungsgemäßen Mittels zur Prävention und/oder
Behandlung der hierin beschriebenen Gewebeveränderungen wesentliche Komponente ver
wendet werden. Dabei wird eine virale Nukleinsäure oder ein Pool viraler Nukleinsäuren zu
der erfindungsgemäßen Vorrichtung gegeben, woraufhin diejenige virale Nukleinsäure an die
Vorrichtung bzw. an das in dieser an ein Trägermaterial gebundene Genprodukt eines Gens
der HMGI(Y)-Familie bindet, die mindestens eine Bindungsstelle für das Genprodukt eines
Gens der HMGI(Y)-Familie aufweist. Nicht gebundene oder unspezifisch gebundene virale
Nukleinsäure wird entfernt, beispielsweise durch Waschen des Trägermaterials mit einer ge
eigneten Waschlösung. Anschließend wird die spezifisch gebundene virale Nukleinsäure vom
Trägermaterial eluiert. Die solchermaßen erhaltene Nukleinsäure kann dann verwendet wer
den, um einen viralen Bestandteil zu bilden, der in den erfindungsgemäßen Mitteln verwendet
wird. Beispielsweise kann die virale Nukleinsäure in einen Expressionsvektor kloniert werden
und das exprimierte virale Peptid oder Protein als Impfstoff verwendet werden. Alternativ
kann beispielsweise das solchermaßen exprimierte virale Peptid oder Protein, möglicherweise
nach weiteren Zwischenschritten, die den Fachleuten bekannt sind, zur Herstellung von Anti
körpern verwendet werden, die dann ihrerseits als Impfstoff in den erfindungsgemäßen Mit
teln verwendet werden können. Im Zusammenhang damit ist das exprimierte virale Peptid
oder Protein bzw. der dagegen gerichtete Antikörper die für die Herstellung eines Mittels zur
Prävention und/oder Behandlung der hierin beschriebenen Gewebeveränderungen wesentliche
Komponente.
Gleiches gilt auch für den Fall der Bindung eines Genproduktes der viralen Nukleinsäure an
ein Genprodukt eines Gens der HMGI(Y)-Familie. In diesem Fall werden anstelle der viralen
Nukleinsäure die Genprodukte viraler Nukleinsäure, insbesondere Nukleinsäure von Kandi
datenviren, d. h. solchen Viren, die mutmaßlich an der - kausalen - Entstehung der hierin be
schriebenen Gewebeveränderungen beteiligt sind, hinzugegeben. Die nach spezifischer Bin
dung und anschließender Elution erhaltenen, von viraler Nukleinsäure codierten Genprodukte
können sodann direkt als Impfstoff verwendet werden oder weiteren Modifikation oder weite
ren Bearbeitungsschritten unterworfen werden. Dabei kann auch vorgesehen sein, daß die
Impfstoffe weiter gereinigt werden oder mit entsprechenden Adjuvanzien versetzt oder für die
angestrebte Verwendung in geeigneter Weise behandelt oder zubereitet werden.
Den Impfstoffen können Adjuvanzien hinzu gesetzt werden, wie bspw. vollständiges oder un
vollständiges Freundsches Adjuvans. Weitere Zusätze sind den Fachleuten auf diesem Gebiet
bekannt.
Allgemein können die erfindungsgemäßen Mittel als pharmazeutisches Präparat vorliegen,
das neben mindestens einem der verschiedenen erfindungsgemäßen Mittel auch einen geeig
neten pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt. Geeignete pharmazeutisch akzeptable
Träger sind den Fachleuten bekannt.
Die erfindungsgemäßen Mittel können weitere Zusätze, die bspw. der Stabilisierung des Mit
tels, der Konservierung, der Modifikation der Eigenschaften des Mittels selbst dienen, sowie
Stoffe, die die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Mittel modifizieren, umfassen.
Derartige Stoffe, die die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Mittels selbst modifizieren,
können bspw. im Falle von Impfstoffen Adjuvanzien, wie bspw. unvollständiges oder voll
ständiges Freundsches Adjuvans, sein.
Die erfindungsgemäßen Mittel können weiterhin Komponenten aufweisen, die sie in eine für
die jeweilige angestrebte Applikationsform bevorzugte Form überführen. So kann z. B. im
Falle der Ausbildung der erfindungsgemäßen Mittel als Aerosole neben dem eigentlichen
Mittel ein für die Aerosolbildung erforderliches Trägermaterial vorgesehen sein.
Das erfindungsgemäße Mittel kann bspw. in Form einer Lösung oder Emulsion zur intrader
malen, intravenösen oder subkutanen Injektion vorliegen. Flüssige Lösungen der erfindungs
gemäßen Mittel können auch in infundierbarer Form vorliegen.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Mittel in lyophilisierter Form vorliegen.
Darüberhinaus können die erfindungsgemäßen Mittel grundsätzlich in einer jeglichen phar
mazeutisch geeigneten Form vorliegen, einschließlich, bspw. Tabletten, Dragees, Supposito
rien, Gele, Pulver.
Für den Fall, daß das Mittel einen Impfstoff umfaßt, kann der Impfstoff selbst ein vollständi
ges Viruspartikel sein, lebend oder attenuiert, ebenso wie inaktiviert oder Teile davon, wobei
die Teile davon typischerweise die antigenen und immunologischen Eigenschaften des jewei
ligen Virus tragen. Es kann dabei vorgesehen sein, daß der Impfstoff eine Vielzahl verschie
dener Viruspartikel oder antigener bzw. immunogen wirksamer Teile umfaßt. Die Virusparti
kel sowie die Teile können selbst in modifizierter Form vorliegen. Derartige Modifikationen
können ausgebildet sein durch, wie dies allgemein für Peptide, Proteine, die ggf. glycosyliert
sind, bekannt ist.
Die Viruspartikel oder Teile davon können gentechnologisch hergestellt sein. Es ist nicht er
forderlich, daß die Viruspartikel oder Teile davon mit den für die Entstehung der hierin be
schriebenen Gewebeveränderungen verantwortlichen oder zumindest damit assoziierten Viren
identisch ist. Entscheidend ist, daß die im Impfstoff verwendeten oder zu dessen Herstellung
verwendeten Viren, einschließlich Teile davon, geeignet sind, eine gegen das für die Erkran
kung kausale Agens, d. h. Virus, gerichtete Immunantwort zu erzeugen und somit die trans
formierenden Eigenschaften des an der Pathogenese beteiligten Agens bzw. Virus zu verhin
dern.
Das vorstehend gesagte gilt sinngemäß auch für den Fall, daß der Impfstoff einen Antikörper
umfaßt.
Man hat gefunden, daß die Bindungsstelle für ein Genprodukt von Genen der HMGI(Y)-
Familie oder deren Derivate auf der Nukleinsäure des Virus eine Reihe von Struktur- und
Sequenzmerkmalen umfaßt. Grundsätzlich scheint für die Bindung von Genprodukten der
HMGI(Y)-Familie, Teilen davon und deren Derivaten, das Vorhandensein einer - ersten - AT-
reichen Sequenz von Bedeutung zu sein. Dabei ist AT-reiche Sequenz nicht so zu verstehen,
daß dies eine ausschließliche Abfolge bestehend aus AT-Dimeren ausbildet. Vielmehr kann
diese Sequenz eine beliebige Reihenfolge der beiden Basen umfassen, die durch einzelne oder
mehrere Nukleotide unterbrochen sein kann. Neben diesem ersten Struktur- und Sequenz
merkmal weisen die besagten Bindungsstellen der Genprodukte der HMGI-(Y) Familie noch
eine zweite AT-reiche Sequenz auf, die ähnlich ausgebildet sein kann wie die erste AT-reiche
Sequenz. Beide AT-reiche Sequenzen sind in einer räumlichen Distanz relativ zueinander
angeordnet. Diese räumliche Distanz ergibt sich aus den räumlichen Abmessungen und damit
aus der Sekundär- und Tertiärstruktur der HMGI(Y)-Proteine, d. h. der Genprodukte der Gene
der HMGI(Y)-Familie. Infolge dieser Sekundär- und Tertiärstruktur ist für ein Binden des
HMGI(Y)-Genproduktes erforderlich, daß die erste Sequenz und die zweite Sequenz relativ
zueinander in einer Ebene auf der viralen Nukleinsäure angeordnet sind. Betrachtet man die
DNA als dreidimensionales Modell, so liegen bei der vorgeschilderten Anordnung die als
Bindungsstellen wirkenden AT-reichen Sequenzen auf der dem Betrachter jeweils zuge
wandten Seite. Diese Anordnung wird auch als "same face" bezeichnet. Liegen diese drei
Struktur- bzw. Sequenzmerkmale der viralen Nukleinsäure vor, kommt es zu einem besonders
nachhaltigen Binden des Genprodukts an die virale Sequenz, insbesondere in regulatorischen
Regionen der Nukleinsäure (z. B. Promotoren und Enhancer), da bevorzugt diese die besagten
Struktur- und Sequenzmerkmale aufweist. Fehlt eines oder mehrere dieser Sequenz- bzw.
Strukturmerkmale, wird die Bindung eines Genproduktes der Gene der HMGI(Y)-Familie nur
schwach oder gar nicht erfolgen.
Betrachtet man umgekehrt die Sekundär- bzw. Tertiärstruktur der Genprodukte der Gene der
HMGI(Y)-Familie, so existieren dort drei Bereiche, oder Domänen, die in einer definierten
Entfernung voneinander angeordnet sind, die zu AT-reichen Sequenzen eine - hohe - Affini
tät aufweisen. Eine erfolgreiche Bindung an eine Nukleinsäure setzt somit voraus, daß die
AT-reichen Sequenzen in einer hierzu korrespondierenden Entfernung angeordnet sind. Diese
Entfernung resultiert aus der Ganghöhe der Nukleinsäure, die in der Regel ca. 10 Basenpaare
beträgt, woraus resultiert, daß der Abstand der AT-reichen Sequenzen in der Regel 10 Basen
paare sowie ganzzahlige Vielfache bis zu ≦ 3 davon beträgt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind neben Impfstoffen allgemein, besonders solche Impf
stoffe gegen DNA-Viren und ganz besonders solche Impfstoffe gegen Adenoviren und/oder
Herpesviren, solche Impfstoffe für die erfindungsgemäßen Mittel geeignet, die gegen ein vor
stehend genanntes Virus gerichtet sind, dessen Nukleinsäure mindestens eine Bindungsstelle
für mindestens ein Genprodukt von Genen der HMGI(Y)-Familie oder deren Derivate auf
weist. Gene der HMGI(Y)-Familie sind in der Technik gut bekannt. Die Gene der HMGI(Y)-
Familie stellen eine Familie von Genen dar, die, unter anderem, HMGIC, HMGIY und MAG-
Gene umfaßt. Beispielhaft sei hierzu auf die internationale Patentanmeldung
PCT/EP96/00716 und PCT/DE96/02494 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt hierin durch
Bezugnahme aufgenommen wird. Beachtlich ist, daß die Bindungsstelle auf der viralen Nu
kleinsäure für ein beliebiges der vorstehend genannten Gene bzw. dessen Genprodukt geeig
net ist. Hierin soll der Begriff Genprodukt auch Teile davon bezeichnen, solange diese Teile
noch geeignet sind, eine virale Nukleinsäure zu binden. Gleichfalls soll der Begriff Genpro
dukt die jeweiligen Derivate des Genproduktes umfassen, die eine Modifikation aufweisen,
wie sie üblicherweise für Peptide und Proteine vorgenommen werden kann, und bspw. Dele
tionen und Austausche der carboxyterminalen Abschnitte der Proteine umfaßt. Insbesondere
umfaßt der Begriff Derivate der Gene der HMGI(Y)-Familie auch die in PCT/DE96/02494
beschriebenen aberranten Transkripte sowie deren Translationsprodukte, solange diese nach
wie vor in der Lage sind, an die virale Nukleinsäure, insbesondere in regulatorischen Regio
nen der Nukleinsäure (z. B. Promotoren und Enhancer) derselben, zu binden. Die Charakteri
sierung derartiger aberranter Transkripte ist bspw. beschrieben von Kazmierczak, B. et al.;
Am. J. Pathol., 1998; 153 (2): 431-5 und deren Struktur bspw. von Schoenmakers, E. F. et al.
aaO.
In einer alternativen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Mittel kann vorgesehen sein,
daß der Impfstoff ein Antikörper ist, der gegen das Virus gerichtet ist. Es ist dabei ausrei
chend, wenn der Antikörper nicht primär gegen das Virus oder einen entsprechenden Teil
davon gerichtet ist, sondern vermittels einer entsprechenden Kreuzreaktivität seine Wirkung
erfüllt und entsprechend gewährleistet, daß es zu keiner Wechselwirkung zwischen der vira
len Nukleinsäure mit dem Genprodukt der Gene der HMGI(Y)-Familie kommt. Dabei kann
vorgesehen sein, daß der Antikörper gegen eine jede beliebige Komponente des Virus ge
richtet ist, d. h. er kann gerichtet sein gegen bzw. wechselwirken mit Proteinen oder Protein
fragmenten des Viruskapsids, des gegebenenfalls vorhanden Glycopeptids oder aber auch mit
der entsprechenden viralen Nukleinsäure bzw. Fragmenten davon.
Der Antikörper, wie er im Rahmen der Erfindung verwendet wird, kann sein ein monoklona
ler Antikörper oder polyklonaler Antikörper. Der Begriff Antikörper kann hierin eine Mi
schung verschiedener monoklonaler Antikörper umfassen. Weiterhin soll hierin der Begriff
Antikörper ein jegliches Peptid oder Protein umfassen, welches mindestens eine Antikör
pereigenschaft aufweist, insbesondere an ein geeignetes Epitop bindet und dafür sorgt, daß
der Komplex aus Antikörper plus Epitop bzw. Antigen in einer für die Pathogenese der hierin
beschriebenen Gewebeveränderungen nicht mehr zugängliche Form überführt wird bzw. aus
dem Pathogeneseprozeß entfernt wird. Dies kann bspw. dadurch erfolgen, daß eine Wechsel
wirkung eines Genproduktes eines Gens der HMGI(Y)-Familie mit der viralen Nukleinsäure
oder eine solche mit einem Genprodukt einer viralen Nukleinsäure (wobei das entsprechende
Virus - kausal - an der Entstehung der hierin beschriebenen Gewebeveränderungen beteiligt
ist) letztenendes vermieden wird, wobei diese Verhinderung sowohl direkt als auch indirekt
bedingt werden kann, indirekt bspw. durch Entfernen der entsprechenden Viren bzw. Viren
partikel. Der Begriff Antikörper schließt auch Antikörperfragmente und deren Derivate ein, so
insbesondere (Fab)'- oder F(ab)2-Fragmente sowie Einzelketten-Antikörper und dgl. Derivate
dieser Antikörper sind den Fachleuten ebenfalls bekannt und schließen insbesondere ein.
Das vorstehend Gesagte gilt sinngemäß auch für den Fall, daß ein Impfstoff gegen ein Virus
vorgesehen ist, dessen Nukleinsäure für ein Genprodukt codiert, wobei dieses Genprodukt
mindestens mit einem Genprodukt von Genen der HMGI(Y)-Familie oder deren Derivate
wechselwirkt.
Die Viren, gegen die ein Impfstoff bzw. ein Antikörper in den erfindungsgemäßen Mittel ent
halten ist, gehören zur Gruppe der DNA-Viren und bevorzugt zu den Adenoviren und/oder
Herpesviren mit ihren verschiedenen Typen.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels zur Immunisierung,
und insbesondere aktiven Immunisierung, gegen die Viren, die mit der Pathogenese und/oder
Ätiologie der hierin beschriebenen Gewebeveränderungen verbunden sind, sind bevorzugt die
Viren jene, die kausal mit der Pathogenese/Ätiologie der hierin beschriebenen Gewebeverän
derungen verbunden bzw. assoziiert sind.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden Zellkulturen verwendet, die abgeleitet sind
von einer Gewebeveränderung bzw. Teilen des/der sie aufbauenden Gewebes/Gewebe. Die
Herstellung derartiger Zellkulturen ist den Fachleuten bekannt und ist bspw. beschrieben in
Stern, C. et al.; Geburtsh. u. Frauenheilk. 52 (1992), 767-772.
Unter normalem Karyotyp soll hierin verstanden werden der Chromosomensatz, wie er nach
Anwendung routinemäßiger Techniken erhalten wird, sofern er bei einer Darstellung von
≧ 500 Banden pro haploidem Satz keine erkennbaren Anomalien insbesondere der Bereiche
12q14-15 und 6p21 aufweist.
Ein Expressionsvektor für ein Gen der HMGI(Y)-Familie zeichnet sich dadurch aus, daß er in
seiner Gesamtheit zur Expression eines Gens der HMGI(Y)-Familie führt und damit zur Her
stellung entsprechender Genprodukte. Typischerweise umfaßt ein derartiger Expressionsvek
tor einen Replikationsursprung, die für ein Genprodukt der HMGI(Y)-Genfamilie oder Frag
ment davon kodierende Nukleinsäure, und geeignete transkriptions- und translationsregulie
rende Sequenzen. Derartige Konstrukte sind in der Technik bekannt und bspw. beschrieben in
Winnacker, E.-L.; From Genes to Clones; Weinheim; New York: VCH, 1987.
Prinzipiell ist ein jegliches Transfektionsverfahren im Rahmen der vorliegenden Erfindung
anwendbar, welches zu einer Transfektion der entsprechenden Zellkulturen führt.
Die Herstellung von cDNA ist den Fachleuten bekannt. Für den Vergleich des RNA- bzw.
cDNA-Musters der transfizierten Zellen bzw. Kulturen mit demjenigen von nicht
transfizierten Zellen bzw. Kulturen wird typischerweise so vorgegangen, wie unter der Me
thode des sogenannten "differential display" verstanden (Diatchenko, L.; Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, Vol. 93, S. 6025-6030, 1996).
Bei der Überprüfung von in den transfizierten Kulturen gegenüber Kontrollkulturen expri
mierten oder verstärkt exprimierten RNA(s) durch Sequenzhomologie auf das Vorhandensein
viraler Elemente wird typischerweise so vorgegangen, daß die Sequenz unter Zuhilfenahme
von einschlägigen Datenbanken, z. B. BLAST, ein Datenbankservice des National Center for
Biotechnology Information (NCBI), überprüft bzw. gegebenenfalls identifiziert werden.
Es ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß auch von den primären Transkrip
tionsprodukten abgeleitete Nukleinsäuren für den Vergleich des RNA-Musters der transfi
zierten Kulturen mit demjenigen von Kontrollkulturen herangezogen werden können. Ent
sprechend ist es möglich, diesen Vergleich auf der Grundlage des cDNA-Musters anzustellen,
wobei die cDNA von den Transkriptionsprodukten, d. h. den RNA-Spezies, hergestellt wurde
unter Verwendung von bekannten Verfahren.
Die Kontrollkulturen sind in der Regel jene mit normalem Karyotyp, die abgeleitet sind von
einem Gewebe oder Teil eines Gewebes, welches in einer hierin beschriebenen Gewebever
änderung enthalten ist, und welche mit einem Expressionsvektor transfiziert sind, dem jedoch
das Gen der HMGI(Y)-Familie oder dessen Derivat, d. h. das für ein Genprodukt codierende
Insert, fehlt. Kontrollkulturen können aber auch solche sein, die mit keinerlei Expressions
vektor transfiziert sind.
Bei einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die Durchführung eines PCR-
Tests vorgesehen ist, wobei die für die PCR-verwendete Sonde eine virale Sonde ist, erfolgt
der PCR-Test nach den in der Technik bekannten Verfahren. Unter PCR-Test wird ein Poly
merase-Kettenreaktions-Test verstanden, bei dem mindestens ein sequenzspezifischer Primer
zur selektiven Amplifikation der gesuchten Nukleinsäure(fragmente) verwendet wird (siehe
Newton, C. R.; Graham, A.; "PCR"; 1994, Spektrum Akadem. Verlag, Heidelberg, Berlin,
Oxford).
Unter Primer oder viraler Sonde sollen hierin Oligonukleotide und/oder Nukleinsäurefrag
mente verstanden werden, die gerichtet sind auf eine Detektion von Nukleinsäuren, die eine
Homologie zu dem Primer/der Sonde aufweisen. Die Herstellung derartiger viraler Sonden
kann auf allen den Fachleuten bekannten Wegen erfolgen, so bspw. durch organische chemi
sche Synthese oder unter Verwendung von PCR oder Klonierungstechniken.
Wird im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens eine cDNA-Bibliothek von einer Ge
webeveränderung, wie sie hierin beschrieben ist, oder eines Teils davon angelegt, die/der eine
Aktivierung eines Gens der HMGI(Y)-Familie oder eines Derivates aufweist, so kann die Ak
tivierung durch eine entsprechende Chromosomenaberration kenntlich sein.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren wird das Screenen typischerweise unter Bedingungen
niedriger Stringenz vorgenommen. Unter Bedingungen niedriger Stringenz soll dabei verstan
den werden, daß durch Herabsetzen bspw. der Hybridisierungstemperatur oder Modifikation
der Waschbedingungen (z. B. Erhöhung der Salzkonzentration) auch eine Bindung an solche
Nukleinsäuren erfolgt, deren Homologie zu der Sequenz der Sonde deutlich reduziert ist, wo
bei zunächst auch eine Erfassung falsch-positiver Nukleinsäuresequenzen in Kauf genommen
wird, da eine letztendliche Klärung ob es sich um ein positives Signal bzw. Ergebnis handelt,
durch Sequenzierung und Sequenzanalyse der identifizierten Sequenzen erfolgt und somit
eine Ausscheidung der falsch-positiven Sequenzen zuläßt.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren kann, nachdem durch einen Vergleich des RNA- oder
cDNA-Musters von transfizierten Zellkulturen mit dem von Kontrollkulturen, oder durch
ein positives Signal in einem PCR-Test unter Verwendung von Primer(paaren), die Sequen
zen viraler Nukleinsäuren entsprechen, oder durch ein positives Signal beim Screenen einer
cDNA-Bibliothek mit einer virusspezifischen Sonde, oder durch Analyse der cDNA-Klone
auf virale Sequenzen oder Vergleich mit einer cDNA-Bibliothek aus normalem mesenchy
malen bzw. ggf. epithelialen Gewebe, festgestellt wurde, daß virale Elemente in den hierin
beschriebenen Gewebeveränderungen bzw. den davon abgeleiteten Zellkulturen vorhanden
sind, weiterhin vorgesehen sein, daß die viralen Elemente identifiziert und/oder klassifiziert
und ausschließlich für die Impfstoffherstellung verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Bestimmung eines an der Pathogenese beteiligten
Virus umfaßt ein Genprodukt von Genen der HMGI(Y)-Familie, das an einen Träger gebun
den ist. Im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie deren möglichen
Verwendungen umfaßt der Begriff Genprodukt auch Teile der Genprodukte oder Derivate der
Genprodukte. Dabei liegt der Definition von Genprodukten auch die oben gegebene Definiti
on von Genen der HMGI(Y)-Familie zugrunde.
Das Genprodukt ist dabei an ein Trägermaterial gekoppelt, das vom Fachmann auf dem Ge
biet entsprechend ausgewählt wird. Als Trägermaterialien eignen sich all jene Materialien, die
eine Bindung von Proteinen oder Derivaten, sei es direkt oder indirekt erlauben. Geeignete
Trägermaterialien finden sich typischerweise im Bereich der Chromatographiematerialien.
Eine derartige Bindung kann auch eine Adsorption sein bzw. eine reversible Bindung. Da es
sich bei den Genprodukten der HMGI(Y)-Familie um Proteine handelt, können die den Fach
leuten auf dem Gebiet bekannten Verfahren und Verbindungen zur Immobilisierung von Pro
teinen verwendet werden.
Hinsichtlich der Gestaltung des/der an das Trägermaterial gebundenen Genproduktes bzw.
Genprodukte ist im wesentlichen darauf zu achten, daß derjenige Bereich an das Trägermate
rial gebunden ist bzw. für Bindung viraler Nukleinsäure zur Verfügung steht, der für das Bin
den an die virale Nukleinsäure verantwortlich ist. Insoweit kann das entsprechende Genpro
dukt verkürzt sein oder bspw. als Fusionsprotein zur Verfügung gestellt werden. Ein jegliches
Konstrukt ist dabei denkbar, sofern der Nukleinsäure-bindende Teil des Genproduktes oder
derjenige Teil des Genproduktes der Gene der HMGI(Y)-Familie, der für das Binden des
Genproduktes der viralen Nukleinsäure verantwortlich ist, noch für eine Bindung einer Nu
kleinsäure zur Verfügung steht.
Im konkreten Fall kann eine derartige Vorrichtung so ausgebildet sein, daß es sich dabei um
eine affinitätschromatographische Säule handelt, wobei an das Säulenmaterial entsprechend
zumindest ein Genprodukt von Genen der HMGI(Y)-Familie, sei es nun von einem Genpro
dukt oder verschiedenen Genprodukten, immobilisiert ist und verschiedene Ansätze oder
auch Gemische von viraler Nukleinsäure oder von von viraler Nukleinsäure codiertem Gen
produkt zur Trägermatrix hinzugegeben werden. Infolge der Wechselwirkung zwischen dem
Genprodukt und der viralen Nukleinsäure bzw. dem Genprodukt der viralen Nukleinsäure
kommt es zur Ausbildung eines stabilen Komplexes. Nicht spezifisch gebundene virale Nu
kleinsäure oder ungebundene Nukleinsäure bzw. nicht spezifisch gebundenes oder ungebun
denes Genprodukt von viraler Nukleinsäure sowie weitere Bestandteile der aufgetragenen
Probe werden von der Säule gewaschen. Durch einen geeigneten Elutionspuffer werden so
dann - ggf. spezifisch - die Wechselwirkungen zwischen dem Genprodukt und der an das
Genprodukt gebundenen viralen Nukleinsäure bzw. dem gebundenen Genprodukt der viralen
Nukleinsäure verringert, so daß die entsprechenden viralen Nukleinsäuren oder die von diesen
codierten Genprodukte eluiert und weiter analysiert werden können.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, experimentellen Befunde und Figuren
weiter erläutert. Dabei zeigt
Fig. 1 die Größenverteilung der Myome mit normalem Karyotyp (graue Säulen) so
wie mit 12q14-15-Aberrationen (schwarze Säulen);
Fig. 2 eine Übersicht der in Beispiel 4 verwendeten Vektoren;
Fig. 3a-c einen Sequenzvergleich verschiedener Sequenzen aus Myomgewebe mit ade
noviralen Sequenzen;
Fig. 4a-b eine vergleichende Analyse verschiedener aus Myomgewebe erhaltener Se
quenzen;
Fig. 5 HMGI(Y)-Bindungsstellen in der Promotorsequenz des adenoviralen Proteins
E1A; und
Fig. 6 das Ergebnis einer PCR-Analyse, mit der die Anwesenheit eines adenoviralen
DNA-Fragmentes in verschiedenen Gewebeveränderungen untersucht wurde.
Die Ergebnisse bisheriger zytogenetischer Studien an Uterus-Myomen sind widersprüchlich
bezüglich möglicher Korrelationen zwischen der Tumorgröße und dem Auftreten klonaler
Chromosomenaberrationen. Das Problem dieser Studien ist allerdings, daß die untersuchten
Tumoren möglicherweise z. B. nach Größe selektiert sind. Da die Frage einer möglichen Kor
relation aber auch damit zusammen hängt, ob die Chromosomenaberrationen sekundär auf
treten und das Wachstumspotential der betroffenen Tumoren verstärken, wurde eine Studie an
unselektierten Myomen durchgeführt. Untersucht wurden dabei nur Myome nach Hysterek
tomie, wobei alle Tumoren untersucht wurden, die durch Tastuntersuchung des operativ ent
fernten Uterus nachweisbar waren.
Insgesamt wurden 155 Myome von 96 Patientinnen zytogenetisch untersucht. Dabei zeigten
28% der Myome klonale Karyotypänderungen. Auf die drei Hauptkaryotypengruppen mit
normalem Karyotyp, Aberrationen der Chromosomenregion 12q14-15 und Deletion des lan
gen Arms von Chromosom 7 entfielen 72%, 12% und 8%. Die durchschnittliche Tumorgröße
für die Gruppen ist Tabelle 3 zu entnehmen.
Karyotyp-Gruppe | |
durchschnittliche Größe [cm] ± Standardabweichung [cm] | |
normaler Karyotyp | 3,4 ± 2,1 |
12q14-15 Aberrationen | 8,9 ± 5, 6 |
Deletion des Chromosoms 7 | 3,5 ± 2,0 |
Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß das Auftreten von 12q14-15-Aberrationen, die moleku
largenetisch mit Mutationen im oder im Bereich des HMGIC-Gens korrelieren, mit einer
hochsignifikanten Größenzunahme der entsprechenden Myome einhergehen, wenn man sie
entweder mit Myomen mit normalem Karyotyp oder mit Deletionen am langen Arm von
Chromosom 7 vergleicht. Die Unterschiede werden nicht nur beim Vergleich der Mittelwerte,
sondern auch der Verteilungen der Tumorgrößen der einzelnen Tumorgruppen, wie dargestellt
in Fig. 1, deutlich.
Zusammengefaßt führt offenkundig das Auftreten von Chromosomenaberrationen der Chro
mosomenregion 12q14-15, das mit der verstärkten Expression von HMGIC-Gen oder der Ex
pression veränderter Transkripte dieses Gens einhergeht, zu einem verstärkten Tumorwachs
tum.
Mutationen im Bereich des HMGIC- oder HMGIY-Gens manifestieren sich zytogenetisch
durch Chromosomenaberrationen der Region 12q14-15 bzw. 6p21. Zumindest theoretisch ist
aber durchaus denkbar, daß die zytogenetisch erkennbaren Aberrationen nur "die Spitze des
Eisberges" darstellen und ein wesentlich größerer Teil der Mutationen der beiden genannten
Gene mit zytogenetisch nicht darstellbaren chromosomalen Umbauten einhergeht. Wäre dies
der Fall, könnte es für eine Schlüsselrolle der genannten Aberrationen bei der Tumorent
wicklung insgesamt im Sinne einer primären Mutation sprechen. Eine Methode zum Nach
weis der "versteckten" Umlagerungen ist die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Es
wurde an einer Serie von 40 Myomen mit anscheinend normalem Karyotyp FISH-
Experimente durchgeführt, für die Cosmid- und PAC-Sonden eingesetzt wurden, die den Lo
kalisierungsort von HMGIC- bzw. HMGIY-Gen abdecken. Die Sonden wurden dabei so ge
wählt, daß ein Bereich von ca. 150 kb 5' bis 40 kb 3' vom HMGIC-Gen und von 30 kb 5' bis
40 kb 3' vom HMGIY-Gen abgedeckt wurde. Alle Myome wurden mit den Sonden für beide
Gene untersucht; analysiert wurden jeweils mindestens 20 Metaphasen. In keinem Fall erga
ben sich Hinweise auf mit Mitteln der konventionellen Zytogenetik nicht erkennbare, ver
deckte chromosomale Umlagerungen der untersuchten Bereiche.
Berücksichtigt man die Häufigkeit der Myome ohne erkennbare zytogenetische Veränderun
gen (s. Beispiel 1) und die Ergebnisse der in diesem Beispiel dargestellten Untersuchungen,
ist es wahrscheinlich, daß die Mutationen der Gene der HMGI(Y)-Familie bei der Mehrzahl
der Uterus-Myome keine Schlüsselrolle spielt.
Unabhängig davon, ob diese Veränderungen primär oder sekundär sind, wird als molekular
genetische Basis der 12q14-15- und 6p21-Aberrationen bei Uterus-Myomen angenommen,
daß es durch die chromosomalen Umlagerungen zu einer Expression/verstärkten Expression
oder einer Expression aberranter Transkripte des HMGIC-Gens bzw. HGMIY-Gens kommt,
die in normalem Uterus-Gewebe fehlt. Für das HMGIC-Gen ist mittels einer RT-PCR in nor
malem Uterus-Gewebe im Regelfall keine HMGIC-Genexpression nachweisbar. Es wurden
mit dieser Methode 40 Myomgewebe mit anscheinend normalem Karyotyp untersucht. Ziel
der Untersuchung war wiederum festzustellen, ob bei diesen Myomen, wie bei solchen mit
12q14-15-Veränderungen, Hinweise auf eine HMGIC-Genexpression zu finden seien.
Bei keinem dieser Myome waren Hinweise auf eine Expression zu finden, so daß auch aus
diesen Ergebnissen darauf geschlossen werden kann, daß bei der Entstehung dieser Myome
HMGIC-Genexpression nicht das primäre Ereignis ist.
Für die Untersuchung der Wirkung von HMGIC auf den SV40-Promotor werden zwei Vek
torsysteme in eine Zelle transfektiert. Dies sind der Expressionsvektor H3Hx für HMGIC und
der "pGL3 Luciferase Reporter Vektor" der Firma Promega. Das komplette "pGL3 Luciferase
Reporter Vektor"-System von Promega umfaßt 4 verschiedene Vektoren, die es ermöglichen,
DNA-Abschnitte hinsichtlich Promotor- oder Enhancer-Regionen zu untersuchen. Diese
Vektoren sind in Fig. 2 dargestellt. Für die Untersuchung von Promotor-Abschnitten wird der
Vektor "pGL3-Enhancer" benötigt. Der Vektor "pGL3-Promotor" ist für die Untersuchung
von Enhancer-Elementen vorgesehen. Desweiteren wird der Vektor "pGL3-Promotor" bei
diesem Versuch verwendet, um die Wirkungsweise von HMGIC auf einen SV40-Promotor
bzw. Promotoren anderer Polyomaviren zu testen. Hierzu wird der Vektor H3Hx mit dem
Vektor "pGL3-Promotor" kotransfektiert.
Der Vektor "pGL3-Control" dient als Positivkontrolle für das System, eine Transfektion aus
schließlich mit dem Vektor "pGL3-Promotor" als Negativkontrolle.
Die einzelnen Vektoren haben abgesehen von Promotor- und Enhancer-Elementen die gleiche
Grundstruktur. Sie verfügen über eine modifizierte Kodierungsregion für Feuerfliegen-
Luciferase (Photinus pyralis) (luc+), welche für die Untersuchung der Transkriptionsaktivität
in transfektierten eukaryotischen Zellen gewählt wurde. Desweiteren enthalten sie einen pro
karyotischen Replikationsursprung zur Vermehrung in E.coli, ein Ampicillin-Resistenzgen für
die Selektion, einen Replikationsursprung von filamentösen Phagen (fl ori) für die Produkti
on einzelsträngiger DNA (ssDNA) und eine "multi cloning site" (MCS) 3' und 5' des Lucife
rase-Gens.
Der "pGL3-Promotor"-Vektor ist 5010 Basenpaare groß und enthält im Gegensatz zum
"pGL3-Enhancer" einen SV40-Promotor und keinen Enhancer. DNA-Fragmente, die ver
meintliche Enhancer-Sequenzen enthalten, können 3' oder 5' des Luciferase-Gens eingesetzt
werden und so zu einer Verstärkung führen. Desweiteren kann der SV40-Promotor durch an
dere Polyomavirus-Promotoren ersetzt werden.
Der Vektor "pGL3-Control" (5256 Basenpaare) enthält einen SV40 Promotor und eine En
hancer-Sequenz, was in den meisten Säugerzellen zu einer starken Expression von luc+ führt.
Dieser Vektor dient zur Kontrolle der Transfektionseffizienz und setzt den internen Standard
für die Promotor- und Enhancer-Aktivität der anderen Vektoren.
Für die Untersuchung haben sich HeLa-Zellen als geeignet erwiesen, da sie sehr leicht zu
handhaben sind, den Vorgang der Transfektion nahezu ohne Schaden überstehen und keine
Expression von HMGIC aufweisen (das Nichtvorhandensein der HMGIC Expression wurde
durch "Northern Blot" nachgewiesen). Die Zellen werden für die Transfektion in Platten mit 6
Näpfen herangezogen.
Für den Vorgang der Transfektion wurden 2 µg DNA mit Zellmedium (TC 199), ohne Kälber
serum und Antibiotika, gemischt (beides kann die Komplexbildung stören), Endvolumen
100 µl.
Zu dem DNA-Gemisch werden 10 µl "SuperFect" zugegeben. Nach dem Mischen inkubiert
man 10 min bei Raumtemperatur, wobei sich Komplexe aus der DNA und dem "SuperFect"
bilden.
Während der Inkubation wird von den Zellen das alte Medium abgesaugt und die Zellen mit
1x PBS gespült. Das Gemisch aus "SuperFect" und DNA wird mit 80 µl Zellmedium mit
20% Kälberserum gemischt, welches anschließend auf die Zellen gegeben wird. Nach einer
Inkubation (im Brutschrank bei 37°C und 6% CO2) von 16-18 Stunden wird frisches Medium
(20%) zugegeben und weitere 8-32 Stunden inkubiert.
Die Auswertung des Versuches erfolgt mit dem "Luciferase Assay Kit" von Stratagene (s.u.).
Nach der Inkubation der transfektierten Zellen wird das Medium abgesaugt und 500 µl 1x
Zelllysepuffer zugegeben. Nach 15-minütiger Inkubation, bei Raumtemperatur auf einem
Schüttler, lysieren die Zellen. Das Zelllysat wird in Eppendorf-Cups überführt. Dieses ist für
kurze Zeit bei 4°C lagerbar. Über längere Zeit kann es bei -80°C gelagert werden, hierbei
geht jedoch bis zu 50% der Luciferase-Aktivität verloren.
Für die Bestimmung der Luciferasekonzentration werden 20 µl Zelllysat mit 100 µl "Luciferase
assay reagent" (LSA) (beides sollte Raumtemperatur haben) gemischt. Das Luciferin im Re
aktionsgemisch wird unter ATP Verbrauch umgesetzt, wobei Lichtquanten entstehen.
Luciferase-Substrat (Luciferin) + ATP + O2 → Licht (560 nm) + Oxyluciferin + AMP + PPi.
Die emittierten Lichtquanten können mit einer Photozelle eines Luminometers gemessen
werden. Die ermittelten Werte werden in relativen Lichteinheiten (relative light units (RLU))
angegeben und vermitteln im Verhältnis zu anderen Werten Auskunft über die gebildete
Menge an Luciferase.
Bisher wurden zwei voneinander getrennte Meßreihen durchgeführt. Weitere Messungen, vor
allen Dingen mit Promotorregionen der BK- und JCV-Viren können leicht vorgenommen
werden, im vorliegenden Testsystem durch Klonierung der entsprechenden Promotorregionen
in die Testvektoren.
Die Ergebnisse der ersten 2 Meßreihen sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Die Meßergebnisse liegen über denen der Negativkontrolle und unter denen der Positivkon
trolle mit sehr starkem Promotor, was deutlich eine leichte Regulierung der virale Promotor
region durch HMGIC belegt.
Dies belegt die vorstehend beschriebene Beteiligung von Viren an der Entstehung von
Leiomyomen, Endometriumpolypen und Endometriose.
Die in der vorstehenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der
Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung
der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein. Der Offenba
rungsgehalt der Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
In diesem Beispiel werden die Ergebnisse eines PCR-Tests dargestellt, der durchgeführt wur
de, um nach Adenovirus-spezifischen DNA-Sequenzen in Myomgeweben zu suchen. Dabei
stehen für alle 6 Subgenera der Adenoviren spezifische Oligonukleotide zur Amplifikation
von viralen DNA-Sequenzen zur Verfügung.
Unter Anwendung des PureGene Kits (Fa. Gentra, deutscher Vertrieb Biozym) wurde DNA
aus 16 Myomen, 6 Zellkulturen von Myomen, 1 Myometrium und 2 Blutproben isoliert.
DNAs von 8 Myomen, allen 6 Zellkulturen, des Myometriums und der Blutproben wurden in
eine PCR eingesetzt. Verwendet wurden die Oligonukleotidpaare HsgA1 (SEQ: ID. No. 1:
aaggtgtcaatyatgtttg)/HsgA2 (SEQ ID. NO. 2: acggttacttkttt) und HsgB 1 (SEQ ID No. 3:
tctattccctacctggat)/HsgB2 (SEQ ID. No. 4: actcttaacggcagtag) aus der Sequenz des Hexon-
Gens, die jeweils Adenovirus-DNA der Gruppe A bzw. B amplifizieren (Pring-Akerbol et al.,
J. Med. Virol. 58, 87-92, 99). Das Oligonucleotidpaar HsgA amplifiziert ein Fragment von
299 bp, das Oligonucleotidpaar HsgB ein Fragment von 465 bp. Als Positivkontrollen wurden
Virus-DNA Proben der Adenovirus Subgenera A (Ad18) und B (Ad7) verwendet, die von
Frau Dr. Patricia Pring-Akerblom, Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Virologie
und Seuchenhygiene, 30623 Hannover zur Verfügung gestellt wurden. Folgender PCR-Ansatz
wurde verwendet:
500 ng DNA (Myome/Blut) bzw. 50 ng Virus-DNA
1.5 mM MgCl2
je 0.5 µM Primer
5 µl 10×PCR-Puffer ohne MgCl2 (Sigma)
200 µM dNTP
2.5 U Taq-Polymerase (Sigma)
500 ng DNA (Myome/Blut) bzw. 50 ng Virus-DNA
1.5 mM MgCl2
je 0.5 µM Primer
5 µl 10×PCR-Puffer ohne MgCl2 (Sigma)
200 µM dNTP
2.5 U Taq-Polymerase (Sigma)
Jeder Ansatz enthielt 50 µl Gesamtvolumen. Folgende Zyklen wurden durchgeführt:
Der gesamte Ansatz wurde in einem 1-%igen Agarosegel aufgetragen.
Fig. 6 zeigt das Ergebnis der PCR-Analyse zur Prüfung auf mögliche DNA-Sequenzen von
Adenoviren mit Konsensus-Primern der Gruppe B. Mit Ausnahme der Virus-Kontroll-DNA
konnte mit Primerpaar HsgA keine Amplifikation des 299 bp-Fragmentes nachgewiesen wer
den. Mit Primerpaar HsgB wurde bei vier DNA-Fragmenten von Uterus-Leiomyomen
(My178.1; My174.3; My174.4; My161.7) (Zellkultur und primäres Tumorgewebe) und der
viralen Kontroll-DNA (humanes Adenovirus 7) eine Amplifikation des 465 bp-Fragmentes
nachgewiesen. Weder aus Blut-DNA noch aus DNA aus normalem Myometrium aus einem
Uterus myomatosus (My187.6) oder den untersuchten Lungen-Hamartomen (H) wurde ein
entsprechendes Produkt amplifiziert. M5 bezeichnet einen Marker (DNA-Standard V, Roche,
Penzberg), Pfeil: Lage des spezifischen 465bp-Fragmentes. Damit konnte eindeutig der
Nachweis viraler DNA-Sequenzen des Adenovirus-Typ B in den Myomgeweben erbracht
werden.
Zur näheren Charakterisierung der PCR-Produkte wurden diese in einen geeigneten Vektor
kloniert und aus dem Vektor von beiden Seiten sequenziert. Hierzu wurde ausgehend von den
Ergebnissen der PCR-Analysen (siehe Beispiel 5) die dem 465bp-Amplifikat entsprechende
DNA (6 Fragmente aus 6 Myom-DNA-Proben und 1 Fragment aus der Virus-Kontroll-DNA
Ad7) mit Hilfe des QIAEX II-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben
(QIAX II Handbook Ausgabe August 1996, S. 12-13) aus dem Agarose-Gel eluiert. Ferner
wurde ein größeres Fragment, das aus der DNA My174.3 amplifiziert wurde (Vergl. Bsp. 5),
eluiert. Im folgenden Schritt wurde die gereinigte DNA in den Vektor pGEM-T Easy (Prome
ga, Madison, USA) nach Herstellerangaben (Technical Manual pGEM-T and pGEM-T Easy
Vector Systems, S. 11) ligiert und das Vektorkonstrukt in E.coli kloniert (Technical Manual
pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems, S. 12-13). Plasmid-DNA positiver Bakteri
enklone wurde mit Hilfe des QIAprep-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstelleran
gaben (QIAprep Miniprep Handbook Ausgabe April 1998, S. 18-19) isoliert. Die Sequenzie
rung der klonierten Inserts erfolgte unter Verwendung der Oligonukleotide M 13 universal
und M 13 revers und mit Hilfe einer automatischen Sequenziereinheit (373 Applied Biosy
stems, Weiterstadt, Deutschland). Die vergleichende Analyse der Sequenzen erfolgte mit Hil
fe der vom amerikanischen National Center for Biotechnology (NCBI) Information des Na
tional Institute of Health per Internet veröffentlichten Datenbanken (Zugang:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) und Suchmethoden (Advanced BLAST, Datenbank "nr" ohne
Angabe einer bestimmten Spezies).
Ergebnisse: Die amplifizierten Sequenzen aus allen Tumoren und Tumorzellkulturen entspre
chen (mit einigen Abweichungen, siehe Abb. 3, Abb. 4 und Tabelle 5) dem 465 bp langen
PCR-Fragment der Positivkontrolle. Die Sequenz, die bei der Analyse des größeren Fragment
des Amplifikats aus My174.4 erhalten wurde, ergab in der vergleichenden Analyse keinen
Match zu einer viralen Sequenz.
Damit wurde gezeigt, daß die viralen Sequenzen, die aus den einzelnen Myomen amplifiziert
wurden, der Sequenz des Adenovirus Typ 7 am ähnlichsten sind und untereinander an Hand
von Punktmutationen unterschieden werden können.
Die vergleichende Analyse der DNA- und Proteinsequenzen ergab den Nachweis, einer hohen
Homologie der aus den Myomengeweben amplifizierten Sequenzen zu veröffentlichten Se
quenzen aus der Hexonregion des Adenovirus Typ 7. Die einzelnen DNA-Sequenzen weisen
Punktmutationen auf und unterscheiden sich untereinander. Mit Ausnahme einer Punktmuta
tion, die zu einem Aminosäureaustausch in der Proteinsequenz von M 8-2 führt, erweisen sich
alle übrigen Mutationen als sogenannte stille Mutationen. Die Sequenzunterschiede sind je
weils in den Abbildungen Fig. 3a-c durch Kästchen markiert. Verwendete Nomenklatur:
X765551, AF 065068, AF 65065: veröffentlichte Sequenzen adenoviraler Hexongene, M 3-
3P: Positivkontrolle (siehe Beispiel 5), M 2-3, M 5-1, M 6-1, M 7-1, M 8-2, M 9-2: verschie
dene Sequenzen von Amplifikaten aus Myomgewebe.
Die Abbildung Fig. 4a-b zeigt eine vergleichende Analyse aller aus den verschiedenen
Myomgeweben erhaltenen DNA-Sequenzen. Die Unterscheidungen sind durch Kästchen
markiert. Die verwendete Nomenklatur entspricht derjenigen von Fig. 3 a-c.
HMGI(Y)-Proteine können durch die Bindung an virale Promotoren die Expression von vira
len Proteinen beeinflussen. Anhand der veröffentlichten Sequenz des Promotors des Gens E1a
(Zugangsnummer X03000 der NCBI-Datenbank; E1a ist ein adenovirales Gen, dessen Ge 09698 00070 552 001000280000000200012000285910958700040 0002019943787 00004 09579n
produkt eine transformierende Funktion zugeordnet wird) und mittels veröffentlichter Daten
zur Bindungsmodalität von HMGI(Y) an DNA-Sequenzen (vgl. Yic et al., Molecular and
Cellular Biology 17: 3649-3662, 1997) wurde überprüft, ob HMGI(Y) an die Promotorse
quenz binden kann. Proteine der HMGI-Y Gruppe enthalten drei Bindungsdomainen, von
denen jeweils 2 parallel an DNA-Sequenzen, die aus einer Reihung von mindestens 4 Adeni
nen und Thymidinen bestehen, binden können. Diese DNA-Sequenzen liegen idealerweise 10
oder 20 Basenpaare von einander entfernt, da die bindenden HMGI-Y Proteine auf Grund der
Lage der Bindungsdomainen 1-2 helikale Windungen der DNA umspannen können (Yie et
al., Molecular and Cellular Biology, 17: 3649-3662, 1997). Binden HMGI-Y Proteine auf die
beschriebene Weise an zelluläre oder virale Promotoren, so wird die Promoter-vermittelte
Wirkung im Sinne einer Aktivierung oder Hemmung modifiziert. Mittels Sequenzvergleich
unter Verwendung der über NCBI veröffentlichten Datenbanken (siehe Beispiel 6) wurde die
Promotersequenz des adenoviralen Proteins E1A identifiziert (Zugangsnummer X03000, Nu
kleotide 1-511, Quelle: AD7). An Hand der beschriebenen Kriterien wurden zahlreiche Bin
dungsstellen für HMGIY Proteine ermittelt (Vergl. Fig. 5). Exemplarisch sind zwei dieser
identifizierten Bindungsstellen, die parallel durch zwei Bindungsdomainen eines HMGI-Y
Proteins gebunden werden können, durch eine Klammer verbunden worden.
Hiermit wurde gezeigt, daß HMGI-Y Proteine an die Promotersequenz binden können.
Es wurden anhand der über NCBI publizierten Sequenz des linken Endes von AD7 (Zugangs
nummer X 03000) die Oligonucleotide ADE1Bgl2S: (SEQ ID. NO. 5): gaa gat ctt tat aga tgg
aat ggt gcc aac at und ADE1Hi3AS (SEQ. ID. NO. 6): ccc aag ctt aaa act ctt ctc gct ggc agt c
ausgewählt, die an die Promotorsequenz des E1A-Gens des Adenovirus 7 binden können. Das
Oligonucleotid ADE1Bgl2S enthält eine Bgl II-Schnittstelle und das Oligonucleotid ADE
Hi3AS enthält eine HindIII-Schnittstelle. Beide Schnittstellen sind in der oben angegebenen
Sequenz unterstrichen. Unter der Verwendung der Oligonukleotide wurde ein 521bp langes
Fragment aus der AD7-Promoter-Region amplifiziert und über die Schnittstellen BglI und
HindIII mittels Standardmethoden (Maniatis) in den Luciferase-Reportervektor pGL3-
Enhancer (Promega) kloniert (pAD7PROM). Als Template (Matrize) wurde die AD7-DNA,
die bereits im Beispiel 5 als Positivkontrolle gedient hat, verwendet. Das amplifizierte Frag
ment fungiert dann als Promoter für das im Vektor vorhandene Firefly-Luciferase-Gen, des
sen Aktivität durch ein Luciferase-Assay (Dual-Luciferase-Reporter-Assay-System, Promega)
meßbar ist. Die Co-Transfektion des o. g. Konstruktes mit einem HMGIC-Expressionsvektor
(H3HX) sowohl in Hela-Zellen als auch in primäre Myometrium-Zellen aus der 1. Passage
der Gewebekultur erbrachte den Nachweis einer Modifizierung der E1A-Promotorfunktion
durch HMGIC. Alle Transfektionen wurden mit dem Superfect nach dem Protokoll der Firma
Qiagen durchgeführt. In Abänderung zum Original-Protokoll wurde jeweils 1 µg der jeweili
gen Konstrukte verwendet und die Zellen wurden nicht mit PBS gewaschen. Die Inkubation
wurde von wenigen Stunden auf eine Über-Nacht-Inkubation verlängert und nach dieser wur
de das Superfect nicht abgenommen, sondern 3 mL Medium zu den Kulturen gegeben. Damit
wurde gezeigt, daß die Expression des transformierenden adenoviralen Proteins E1A durch
die Bindung von HMGIC-Proteinen in der viralen Promoter-Region beeinflußt wird. Als Ne
gativ-Kontrollen wurden zwei weitere Co-Transfektionen durchgeführt, wobei einmal der
Expressionsvektor keine klonierte HMGIC-Sequenz enthielt und zusätzlich wurde transfek
tiert ohne Zugabe des HMGIC-Expressionkonstrukts. Als Positiv-Kontrolle diente der pGL3-
Kontroll-Vektor, der einen SV40-Promoter und SV40-Enhancer enthält. Um Ungenauigkeiten
bei der Zellkultur auszuschließen, wie z. B. unterschiedliche Anzahl der Zellen pro Zellkultur
schale, unterschiedliche Effizienz bei Transfektion und Zell-Lysis, wird die Aktivität des ex
perimentellen Reporterkonstrukts (s.o.) durch Co-Transfektion mit einem internen pRL-
Kontroll-Vektor (pRL-TK, Renilla-Luciferase) normalisiert. Die Durchführung der Lucifera
se-Messungen erfolgte nach dem Protokoll des "Dual-Luciferase-Reporter-Assay-System"
von Promega.
Ein weiteres Beispiel für die Induktion von Gewebeveränderungen durch die Infektion der
Gewebezellen mit Adenoviren sind die Lungenhamartome. Dieses Beispiel beschreibt die
Strategie zur Überprüfung und zum Nachweis von adenoviralen Genomen in verschiedenen
Lungenhamartomgeweben.
Unter Anwendung des PureGene Kits (Fa. Gentra, deutscher Vertrieb Biozym) wurde DNA
aus 10 Zellkulturen von Hamartomen isoliert.
DNAs von 7 Zellkulturen wurden in eine PCR eingesetzt. Verwendet wurden die Oligonu
kleotidpaare HsgA1/HsgA2, HsgB1/HsgB2, HsgC1 [(SEQ. ID. NO. 7):
acctttgactcttctgt)]/HsgC2 [(SEQ. ID. NO. 8): tccttgtatttagtatc], HsgD1 [(SEQ. ID. NO. 9): ccat
catgttcgactcct]/HsgD2 [(SEQ: ID. No. 10): aggtagccggtgaagcc], HsgE1 [(SEQ: ID: NO.11):
gactcttccgtcagctgg]/HsgE2 [(SEQ: ID. NO. 12): gctggtaacggcgctct] und HsgF1 [(SEQ. ID.
No. 13): atttctattccttcgcg]/HsgF2 [(SEQ: ID. No.14): tcaggcttggtacggcc], aus der Sequenz des
Hexon-Gens, die jeweils Adenovirus-DNA der Gruppen A bis F amplifizieren (Pring-
Akerblom et al., J. Med. Virol. 58, 87-92, 99). Oligonukleotidpaar HsgA amplifiziert ein
Fragment von 299 bp, Oligonukleotidpaar HsgC von 269 bp, Oligonukleotidpaar HsgD von
331 bp, Oligonukleotidpaar HsgE von 399 bp und Oligonukleotidpaar HsgF von 586 bp. Die
als Kontrolle verwendeten Virus-DNA-Proben wurden ebenfalls von Frau Dr. Pring-
Akerbloom zur Verfügung gestellt (vergl. Beispiel 5. Subgenus A: Ad18, Subgenus B: Ad7,
Subgenus C: Ad1, Subgenus D: Ad17, Subgenus E: Ad4, Subgenus F: Ad41).
Folgender PCR-Ansatz wurde verwendet:
500 ng DNA (Gewebe, Zellkultur) bzw. 50 ng Virus-DNA
1.5 mM MgCl2
je 0.5 µM Primer
5 µl 10 × PCR-Puffer ohne MgCl2 (Sigma)
200 µM dNTP
2.5 U Taq-Polymerase (Sigma)
500 ng DNA (Gewebe, Zellkultur) bzw. 50 ng Virus-DNA
1.5 mM MgCl2
je 0.5 µM Primer
5 µl 10 × PCR-Puffer ohne MgCl2 (Sigma)
200 µM dNTP
2.5 U Taq-Polymerase (Sigma)
Jeder Ansatz enthielt 50 µl Gesamtvolumen. Folgende Zyklen wurden durchgeführt:
Der gesamte Ansatz wurde in einem 1,5%igen Agarosegel aufgetragen. Mit den Oligonukleo
tidpaaren HsgA1/HsgA2, HsgB1/HsgB2, HsgC1/HsgC2 und HsgF1/HsgF2 wurde kein Frag
ment der jeweils erwarteten Länge aus den verschiedenen Lungenharmartom-DNA-Proben
amplifiziert werden, wobei das entsprechende Fragment aus der viralen Kontroll-DNA ampli
fiziert wurde. Aus den DNA-Proben von 3 Lungenhamartomen wurde mit den Oligonucleoti
den HsgD1/HsgD2 ein 331 bp Fragment amplifiziert. Aus 4 weiteren Lungenhamartom-
DNA-Proben wurde mit dem Oligonucleotidpaar HsgF1/HsgF2 ein 399 bp langes Produkt
amplifiziert.
Damit wurde eindeutig gezeigt, daß eine Infektion der Ursprungszelle mit Adenoviren der
Gruppe D oder E zur Bildung von Lungenhamartomen führt.
Um zu prüfen, ob Zellen von Lungenhamartomen in vitro permissiv sein können, wurden
Hela-Zellen mit Zellen eines Lungenhamartoms kokultiviert. Hela-Zellen werden häufig für
die Vermehrung von Adenoviren benutzt und zeigen nach Infektion cytopathologische Ef
fekte.
Das verwendete Hamartomgewebe stammte von einem Tumor mit einer chromosomalen
Translokation t(6; 14)(p21; q24). Er wurde nach der Operation für 26 Stunden in Hank's Lö
sung bei Raumtemperatur gelagert und dann mit Schere und Skalpell in ca. 1 mm3 große Wür
fel zerkleinert. Nach Routinemethoden erfolgte dann enzymatisch die weitere Zerkleinerung
mit Kollagenase (Kazmierczak et al., Oncogene, 12: 515-521). Die resultierende Zellsus
pension wurde auf vier 25 cm2 Zellkulturflaschen verteilt, die jeweils mit 5 ml Zellkulturme
dium (Medium 199 mit 20% fetalem Kälberserum unter Zusatz von Antibiotika) vorgefüllt
waren. Nach dreitägiger Kultivierungsdauer bei 3°C, 5% CO2 hatte sich in den Flaschen ein
konfluenter Monolayer gebildet. Die Zellen wurden daraufhin nach Standardverfahren mit
Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst und jeweils auf zwei neue Kulturflaschen verteilt. Nach zwei
Stunden wurden zu den Kulturflaschen jeweils ca. 3 × 105 Hela-Zellen in 1 ml Kulturmedium
gegeben. Nach eintägiger Kulturdauer enthielten die Flaschen je etwa 50% von Hela-Zellen
und fibroblastenartigen Hamartom-Zellen. Die Serumkonzentration im Medium wurde auf 10%
reduziert. Nach zwei weiteren Tagen zeigten die Hela-Zellen an mehreren Stellen Verände
rungen der Zellmorphologie und begannen sich ellipsenartige Zellen vom Boden der Kulturge
fäße abzulösen. Nach vier Tagen waren nur noch einzelne Gruppen von Hela-Zellen nachzu
weisen, die allerdings proliferierten.
Der aufgetretene cytopathologische Effekt kann auf für Adenoviren permissive Hamartom
zellen zurückgeführt werden, die Hela-Zellen infiziert haben.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen sowie den Zeichnungen offenbarten
Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die
Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.
Claims (37)
1. Mittel zur Prävention und/oder Behandlung einer Gewebeveränderung, wobei die Gewebe
veränderung Gewebe mesenchymalen Ursprungs oder davon abgeleitete Gewebeveränderun
gen umfaßt und das Mittel ein antiviral wirksames Agens umfaßt.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe mesenchymalen Ur
sprungs zumindest teilweise mit einem Virus aus der Gruppe der DNA-Viren, und insbeson
dere mit Adenovirus und/oder Herpesvirus infiziert ist.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Agens ausgewählt ist aus
der Gruppe, die Impfstoffe; Antikörper; Mittel, die die Replikation, Transkription oder
Translation viraler Gene, insbesondere Gene von Adenoviren und/oder Herpesviren, hemmen;
Mittel, die mit Viren, insbesondere Adenoviren und/oder Herpesviren, infizierte Zellen erken
nen und/oder zerstören; und Mittel, die durch ihre effektorzellenstimulierende Wirkung eine
antivirale Wirkung erzielen, umfaßt.
4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeverän
derung als ausschließlichen oder obligaten Bestandteil Gewebe umfaßt, wobei wenigstens
einige der das Gewebe aufbauenden Zellen mit Viren, insbesondere Adenoviren und/oder
Herpesviren, infiziert sind.
5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeprolife
ration eine Profileration mindestens einer mesenchymalen Zelle, die mit Viren, insbesondere
Adenovirus und/oder Herpesvirus, infiziert ist, umfaßt.
6. Mittel nach Anspruch 5. dadurch gekennzeichnet, daß die Proliferation eine klonale Prolife
ration ist.
7. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeprolife
ration eine epitheliale Komponente umfaßt.
8. Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die epitheliale Komponente minde
stens eine Zelle aufweist, die mit einem Virus aus der Gruppe der DNA-Viren, insbesondere
mit Adenovirus und/oder Herpesvirus, infiziert ist.
9. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die mit einem Virus
aus der Gruppe der DNA-Viren, insbesondere mit Adenovirus und/oder Herpesvirus infizierte
Zelle eine chromosomale Veränderung aufweist.
10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die chromosomale Veränderung
mindestens ein HMGI(Y)-Gen der infizierten Zelle umfaßt.
11. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebever
änderung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Leiomyome, insbesondere Leiomyome des Ute
rus; Endometriumpolypen; Endometriose; Fibroadenome, insbesondere Fibroadenome der
Mamma; Phyllodes-Tumoren, insbesondere der Mamma; Hamartome, insbesondere der
Mamma; Prostata-Adenome; Lipome; agressive Angiomyxome; Enchondrome; pleomorphe
Adenome, insbesondere der Kopfspeicheldrüsen; Kolon-Polypen, insbesondere Kolon-
Adenome; Hamartome, insbesondere der Lunge; Atherome und daraus entstandene Karzino
me umfaßt.
12. Mittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die entstandenen Karzinome aus
der Gruppe ausgewählt sind, die Kolon-Karzinome und Prostata-Karzinome umfaßt.
13. Mittel nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstoff
gegen einen Virus aus der Gruppe der DNA-Viren, insbesondere gegen Adenovirus und/oder
Herpesvirus, gerichtet ist.
14. Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstoff ein Viruspartikel
oder Teile davon umfaßt.
15. Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstoff einen Antikörper
umfaßt, der gegen das Virus oder einen Teil davon gerichtet ist.
16. Mittel nach einem der Ansprüche 3 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstoff
gegen ein Virus gerichtet ist, dessen Nukleinsäure mindestens eine Bindungsstelle für ein
Genprodukt von Genen der HMGI(Y)-Familien oder deren Derivate umfaßt.
17. Mittel nach einem der Ansprüche 3 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstoff
gegen ein Virus gerichtet ist, dessen Nukleinsäure für mindestens ein Genprodukt codiert,
wobei dieses Genprodukt mindestens mit einem Genprodukt von Genen der HMGI(Y)-
Familie oder deren Derivaten wechselwirkt.
18. Mittel nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsstelle auf der Nu
kleinsäure des Virus das Struktur- und Sequenzmerkmal einer ersten AT-reichen Sequenz
umfaßt.
19. Mittel nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsstelle auf der Nu
kleinsäure des Virus neben der ersten Sequenz noch die Struktur- und Sequenzmerkmale um
faßt, daß
- - eine zweite AT-reiche Sequenz vorhanden ist, und
- - die erste und zweite Sequenz in einer räumlichen Distanz zueinander angeordnet sind.
20. Mittel nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die räumliche Distanz so ausge
wählt ist, daß die erste Sequenz und die zweite Sequenz relativ zueinander in einer Ebene auf
der Nukleinsäure angeordnet sind.
21. Mittel nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene der
HMGI(Y)-Familie MAG-Gene, HMGIC, HMGIY, aberrante Transkripte von Genen der
HMGI(Y)-Familie und Derivate davon umfassen.
22. Mittel nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper
ausgewählt ist aus der Gruppe, die monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, polyva
lente Antikörper, Antikörperfragmente und Derivate davon umfaßt.
23. Verwendung des Mittels nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Immunisierung gegen
Viren, die mit der Pathogenese und/oder Ätiologie der Gewebeveränderungen nach einem der
vorangehenden Ansprüche verbunden sind.
24. Verwendung des Mittels nach einem der Ansprüche 1-23 zur Herstellung einer pharma
zeutischen Zusammensetzung umfassend das Mittel nach einem der vorangehenden Ansprü
che und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger zur Prävention und/oder Behandlung der
Gewebeveränderungen nach einem der vorangehenden Ansprüche oder zur Immunisierung
gegen die Viren, die mit der Pathogenese und/oder Ätiologie der Gewebeveränderungen nach
einem der vorangehenden Ansprüche verbunden sind.
25. Verwendung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung
eine aktive Immunisierung ist.
26. Verfahren zum Ermitteln von zur Herstellung eines Mittels zur Prävention und/oder Be
handlung von Gewebeveränderungen nach einem der vorangehenden Ansprüche geeigneter
Viren und/oder zum Ermitteln von Viren, gegen die das Mittel nach einem der vorangehenden
Ansprüche gerichtet ist, welches die Schritte umfaßt:
- a) Transfektion einer Zellkultur mit normalem Karyotyp, die abgeleitet ist von einem Gewebe, das die Gewebeveränderung nach einem der vorangehenden Ansprüche um faßt, mit einem Expressionsvektor für ein Gen der HMGI(Y)-Familie oder dessen Deri vat,
- b) Vergleich des RNA-Musters der transfizierten Zellen mit demjenigen von Kontroll kulturen, und
- c) Überprüfen von in den transfizierten Kulturen gegenüber Kontrollkulturen expri mierten oder verstärkt exprimierten RNA(s) durch Sequenzhomologie auf das Vorhan densein viraler Elemente.
27. Verfahren zum Ermitteln von zur Herstellung eines Mittels zur Prävention und/oder Be
handlung von Gewebeveränderungen nach einem der vorangehenden Ansprüche geeigneter
Viren und/oder zum Ermitteln von Viren, gegen die das Mittel nach einem der vorangehenden
Ansprüche gerichtet ist, welches die Durchführung eines PCR-Tests umfaßt, wobei die für die
PCR verwendeten Primer(paare) der Sequenz viraler Nukleinsäure entsprechen.
28. Verfahren zum Ermitteln von zur Herstellung eines Mittels zur Prävention und/oder Be
handlung von Gewebeveränderungen nach einem der vorangehenden Ansprüche geeigneter
Viren und/oder zum Ermitteln von Viren, gegen die das Mittel nach einem der vorangehenden
Ansprüche gerichtet ist, welches die Schritte umfaßt:
- a) Anlegen einer cDNA-Bibliothek von einem Gewebe, das die Gewebeveränderung nach einem der vorangehenden Ansprüche umfaßt, das eine Aktivierung eines Gens der HGMI(Y)-Familie oder eines Derivates aufweist, und
- b) Screenen der cDNA-Bibliothek mit einer virusspezifischen Sonde oder
- c) Analyse der cDNA-Klone auf virale Sequenzen oder
- d) Vergleich mit einer cDNA-Bibliothek aus normalem Myometrium.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen der
HMGI(Y)-Fainilie ausgewählt ist aus der Gruppe, die HMGIC, HMGIY, MAG, aberrante
Transkripte der Gene der HMGI(Y)-Familie und Derivate davon umfaßt.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus,
das virale Element oder die virusspezifische Sonde aus der Gruppe von Viren ausgewählt ist,
die DNA-Viren, und insbesondere Adenoviren und/oder Herpesviren umfaßt.
31. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 26 bis 30 zum Ermitteln von
Viren, gegen die zur Prävention und/oder Behandlung von Gewebeveränderungen nach einem
der vorangehenden Ansprüche immunisiert werden kann.
32. Vorrichtung zur Bestimmung eines an der Pathogenese von Gewebeveränderungen nach
einem der vorangehenden Ansprüche beteiligten Virus, welche ein Genprodukt von Genen
der HGMI(Y)-Familie oder einen Teil davon oder dessen Derivate umfaßt, das/der an einen
Träger gebunden ist.
33. Vorrichtung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die virale Nukleinsäure ne
ben der ersten Sequenz noch die Struktur- und Sequenzmerkmale umfaßt, daß
- - eine zweite AT-reiche Sequenz vorhanden ist und
- - die erste Sequenz und zweite Sequenz in einer räumlichen Distanz zueinander ange ordnet sind.
34. Vorrichtung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die räumliche Distanz so
ausgewählt ist, daß die erste Sequenz und die zweite Sequenz relativ zueinander in einer Ebe
ne auf der Nukleinsäure angeordnet sind.
35. Verfahren zur Diagnose einer Gewebeveränderung, wobei die Gewebeveränderung eine
solche Gewebeveränderung nach einem der vorangehenden Ansprüche umfaßt, dadurch ge
kennzeichnet, daß eine Körperflüssigkeit auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen
DNA-Viren, und insbesondere Adenoviren und/oder Herpesviren, untersucht wird.
36. Verfahren zur Diagnose einer Gewebeveränderung, wobei die Gewebeveränderung eine
solche Gewebeveränderung nach einem der vorangehenden Ansprüche umfaßt, dadurch ge
kennzeichnet, daß eine Körperflüssigkeit auf das Vorhandensein von Antigenen von DNA-
Viren und insbesondere Adenoviren und/oder Herpesviren untersucht wird.
37. Verfahren zur Diagnose einer Gewebeveränderung, wobei die Gewebeveränderung eine
solche Gewebeveränderung nach einem der vorangehenden Ansprüche umfaßt, dadurch ge
kennzeichnet, daß eine Gewebeprobe mit einem Mittel umgesetzt wird, das aus der Gruppe
ausgewählt ist, die Antikörper, die mit DNA-Viren und insbesondere Adenoviren und/oder
Herpesviren oder Teilen davon reagieren; Antigene, die von DNA-Viren und insbesondere
Adenoviren und/oder Herpesviren oder Teilen davon stammen, und Nukleinsäure, die mit
Nukleinsäure von DNA-Viren und insbesondere Adenoviren und/oder Herpesviren wechsel
wirkt, umfaßt, im Falle der Anwesenheit von DNA-Viren und insbesondere Adenoviren
und/oder Herpesviren sich ein Komplex aus dem Mittel und dem DNA-Virus und insbesonde
re Adenovirus und/oder Herpesvirus bildet und der Komplex nachgewiesen wird.
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DE10080190T DE10080190D2 (de) | 1999-02-04 | 2000-02-04 | Mittel zur Prävention und/oder Behandlung einer Gewebeveränderung mesenchymalen Ursprungs |
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US12/404,292 US20090304708A1 (en) | 1999-02-04 | 2009-03-14 | Preparation for the Prevention and/or Treatment of a Tissue Change of Mesenchymal Origin |
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