DE69836197T2

DE69836197T2 - Methylierte smd homologe peptide, die mit antikörpern aus sera von lebewesen mit systemischer lupus erythematodes reagieren

Info

Publication number: DE69836197T2
Application number: DE69836197T
Authority: DE
Inventors: Lydie Meheus; Georg Reinhard LÜHRMANN; Ann Union; Joseph Raymackers
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-31
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2018-09-01
Also published as: AU751784B2; AU9438798A; EP0944649B1; CA2270176A1; ATE342920T1; US20020165355A1; WO1999011667A1; EP0944649A1; US6362007B1; CA2270176C; JP2001505785A; ES2276474T3; DE69836197D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren des Produzierens bestimmter Peptide, die methylierte Arginine enthalten, welche von einem Glycinrest gefolgt sind, und die immunogene Determinanten von Antikörpern darstellen, die im Serum von Patienten mit systemischem Lupus erythematodes vorhanden sind, wobei die Methylierung eine Voraussetzung für das Reagieren mit den Antikörpern ist. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Peptide zur Diagnose eines systemischen Lupus erythematodes.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Systemischer Lupus erythematodes ist eine Autoimmunkrankheit, bei welcher der Patient Antikörper entwickelt, die mit vielen Geweben seines eigenen Körpers reagieren. Dominante Antikörper richten sich gegen Bestandteile des Zellkerns mit Epitopen, die in DNA gefunden werden können, sowie in Proteinen, die kleine Ribonukleoproteinpartikel (Small Ribonucleoprotein Particles, snRNP) darstellen.
Der erste Labortest, der je für diese Krankheit entwickelt wurde, war der LE (Lupus erythematodes)-Zelltest. Dieser Test muss viele Male wiederholt werden, bevor er bei etwa 90% der Menschen mit systemischem Lupus erythematodes zu einer positiven Reaktion führt. Auch ist der LE-Test nicht für Lupus spezifisch und kann bei bis zu 20% der Menschen mit rheumatoider Arthritis, bei manchen Patienten mit anderen Rheumaerkrankungen wie dem Sjögren-Syndrom oder Sklerodermie, bei Patienten mit Leberkrankheit und bei Personen, die Medikamente wie Hydralazin und Procainamid einnehmen, positiv sein. Der ANA-Test, der Antikörper gegen Kernantigene nachweist, ist spezifischer für Lupus als der LE-Test und ist bei vielen Patienten positiv, die an einem systemischen Lupus erythematodes leiden. Wie der LE-Test ist auch ein positiver ANA-Test nicht für Lupus diagnostisch, da der Test auch bei Menschen mit Sklerodermie, Dermatomyositis, rheumatoider Arthritis, Sjögren-Syndrom, bei Patienten unter Behandlung mit bestimmten Medikamenten oder bei Patienten, die an einer infektiösen Mononukleose, Leberkrankheit, Malaria, etc. leiden, positiv sein kann.
Aus diesen Gründen und da die resümierten Tests teuer sind, wurden neue Tests entwickelt, bei der Diagnose von SLE sehr hilfreich sind. Dazu gehören der Anti-DNA-Antikörpertest, der Anti-Sm-Antikörpertest, der Anti-RNP-Antikörpertest, der Anti-Ro-Antikörpertest und Tests, welche den Serumkomplementspiegel messen. Häufig hängt eine korrekte Diagnose von der Auswertung vieler separater Tests und Symptome ab.
Das Sm-Antigen ist eine komplexe makromolekulare Struktur, die aus 8 Proteinen besteht (B, B', D1, D2, D3, E, F, G) und mit der U-Serie kleiner RNA-Moleküle assoziiert ist. SmBB' und SmD gelten als wichtigste Antigenkomponenten des Komplexes (für einen Überblick siehe S. O. Hoch, 1989). SmBB' zeigt jedoch Kreuzreaktivität mit den Anti-RNP-Antikörpern, deshalb gilt SmD als spezifischstes Autoantigen für Sm (W. J. van Venrooij et al., 1991).
Die SmD-cDNA wurde mit synthetischen Oligonukleotidsonden, die auf Basis der N-terminalen Sequenz von SmD entworfen worden sind, aus einer humanen B-Lymphozytenbibliothek isoliert (Rokeach et al., 1988). Später wurde gezeigt, dass das In-vitro-Transkriptionsprodukt mit Anti-Sm-IgG immunpräzipitiert werden kann. Das D-Protein wurde inzwischen entweder als ein Dublett mit der Bezeichnung D und D' (Andersen et al., 1990) oder als drei Polypeptide mit der Bezeichnung D1 (16 kDa), D2 (16,5 kDa) und D3 (18 kDa) charakterisiert (Lehmeier et al., 1990), D1 ist identisch mit dem von Rokeach et al. (1988) klonierten SmD. Die Sequenz von D2 und D3 ist wesentlich anders als die von D1.
Im Lauf der Jahre haben mehrere Forschungsgruppen die Verwendung von rekombinanten SmD-Peptiden und von SmD abgeleiteten Peptiden berichtet und widersprüchliche Daten veröffentlicht. Rokeach et al. (1992a) exprimierten SmD1 in E. coli und in S. cerevisiae, aber gegenüber der Reaktivität von natürlichem SmD aus HeLa-Zellen banden die meisten Anti-SmD-Patientenseren rekombinanten SmD1 nicht wesentlich besser als normale humane Seren. Dieselbe Gruppe (Rokeach et al., 1992b) hat indessen eine Epitopkartierung ausgehend von mehreren Fusionen zwischen dem TrpE-Gen und Fragmenten der SmD-Codierungssequenz, exprimiert in E. coli, durchgeführt. Es ergaben sich zwei Muster einer Anti-Sm-Reaktivität: man stellte fest, dass über die gesamte Länge des Antigens diskontinuierliche Epitope verstreut waren und dass sich am C-Terminus, d. h. von Aminosäure 87 bis 119 ein dominantes Epitop befindet (Rokeach et al., 1992b). Hiepe et al. beschrieben SmD-Peptide, umfassend AA 35–45, welche Autoantikörper aufgrund der Bildung eines Konformationsepitops binden können ( EP 0776906 A ). Unter Verwendung synthetischer Peptide zeigten Barakat et al. (1990), dass der N-Terminus (Peptid 1–20) und Peptid 44–67 als wertvolle Sonde in der SLE-Diagnostik eingesetzt werden könnten, obwohl ihre Ergebnisse nicht der Anti-SmD-Reaktivität entsprachen, die im klassischen Test erhalten wird (Patent EP-B-0491014). Mit einer ähnlichen Strategie haben Sabbatini et al. (1993a) ein dominantes Epitop in der C-terminalen Region von SmD1 (aa95–aa119) identifiziert, was die Ergebnisse von Rokeach et al. (1992b) bestätigt, aber den von Barakat et al. (1990) erhaltenen Ergebnissen widerspricht. Die jüngste Arbeit bei der Epitopkartierung von SmD1 mittels synthetischer Peptide (James at al. 1994) zeigte, dass 8 von 9 SmD-positiven Seren (Präcipitin-positiv) mit der Sequenz reagieren, die Oktapeptide im Bereich 92–112 umspannen. Ein weiteres Epitop, das deutlich mit 7 von 9 SmD- positiven Seren reagiert, befindet sich in der Region von Aminosäure 82–90. Schließlich wurde kürzlich ein SmD-ähnliches Epitop von Rivkin et al. (1994) identifiziert, das aus einer (Gly-Arg)₉-Dipeptid-Wiederholungssequenz besteht (Homologie mit dem C-Terminus). Im Gegensatz zu der SLE-Spezifität von Anti-Sm-Antikörpern wird das definierte Epitop auch von Patienten mit anderen Autoimmunkrankheiten (rheumatoide Arthritis, Sklerodermie, Sjögren-Syndrom) erkannt. Das β-Galactosidase-Fusionsprotein in E. coli des oben erwähnten Epitops war mit 35% der SLE-Seren reaktiv, aber nur 6 von diesen 32 positiven Seren reagierten mit dem nativen SmD-Protein, was darauf hinweist, dass das Fusionsprotein weniger spezifisch ist als das native SmD-Protein. Umgekehrt reagierten nur vier der acht SmD-Seren mit dem Fusionsprotein. Allerdings ist zu beachten, dass SmD auch als β-Galactosidase-Fusionsprotein mit Volllänge in E. coli exprimiert wurde (Wagatsuma et al. 1993), aber dieses rekombinante SmD-Antigen wurde von Patientenseren nicht erkannt, obgleich alle Seren das natürliche 16-kDa-Sm-Antigen im Western Blot erkannten.
Schlussfolgernd bewirkt also keines der beschriebenen synthetischen Peptide noch das gesamte rekombinante Protein oder Teile des Moleküls eine Immunreaktivität, die mit der mit natürlichem SmD erhaltenen Reaktivität identisch ist.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Peptide mit hoher Reaktivität für Antikörper bereitzustellen, die im Serum von Patienten mit systemischem Lupus erythematodes vorhanden sind.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Erhalten der Peptide bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Erzeugen von Antikörpern bereitzustellen, die mit Peptiden der Peptide spezifisch reagieren, wodurch die Peptide imitiert werden.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Induzieren von Anti-Idiotyp-Antikörpern bereitzustellen, die mit den oben erwähnten Antikörpern spezifisch reagieren.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen diagnostischen Kit für systemischen Lupus erythematodes bereitzustellen.
Alle diese Ziele der vorliegenden Erfindung werden von den folgenden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erfüllt.
Nach ihrer Hauptausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Peptide mit weniger als 50 Aminosäuren, umfassend wenigstens ein Dimer vom Typ XG, wobei X für einen methylierten Argininrest steht, wobei das Peptid in der Lage ist, mit Antikörpern zu reagieren, wobei die Methylierung für die Reaktion zwischen dem Peptid und dem Antikörper entscheidend ist und wobei die Antikörper im Serum von Patienten mit systemischem Lupus erythematodes oder einer infektiösen, rezidivierenden oder chronischen Mononukleose oder bestimmten Krebserkrankungen, die mit einer Epstein-Barr-Virusinfektion in Zusammenhang stehen, wie beispielsweise Burkitt-Lymphom oder Nasopharyngealkarzinom, vorhanden sind.
Nach einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung außerdem ein Peptid und/oder eine chemische Struktur, umfassend eines der oben erwähnten Peptide, fusioniert an ein Linker-Molekül. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Peptide, umfassend und/oder bestehend aus Tandemwiederholungen von wenigstens zwei der beliebigen oben erwähnten Peptide oder verzweigte Peptide, die wenigstens eines der oben erwähnten Peptide aufweisen.
Nach einer spezifischeren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung außerdem ein Verfahren zum Herstellen eines beliebigen der oben erwähnten Peptide durch klassische chemische Synthese, wobei bei bestimmten Schritten während der chemischen Synthese methylierte Arginine durch nichtmethylierte Argininreste substituiert werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Herstellen eines beliebigen der oben erwähnten Peptide, wobei die primäre Aminosäuresequenz durch klassische chemische Synthese produziert wird und wobei die vor Glycinresten liegenden Argininreste anschließend methyliert werden, indem man Peptide mit einer Protein-Arginin-Methyltransferase in Kontakt gebracht werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Herstellen eines der oben erwähnten Peptide, welches folgende Schritte umfasst: (i) Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor, in dem eine die für das Peptid codierende Sequenz unter der Kontrolle der entsprechenden Regulationselemente umfassende Polynukleinsäure inseriert ist, so dass das Peptid oder ein das Peptid umfassendes Protein exprimiert und/oder sezerniert wird, (ii) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des Proteins oder Peptids sowie eine teilweise oder optimale Methylierung der in dem Peptid vorhandenen Arginine gestatten, und (iii) Ernten des Peptids. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Herstellen eines der oben erwähnten Peptide, welches folgende Schritte umfasst: (i) Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor, in dem eine die für das Peptid codierende Sequenz unter der Kontrolle der entsprechenden Regulationselemente umfassende Polynukleinsäure inseriert ist, so dass das Peptid oder ein das Peptid umfassendes Protein exprimiert und/oder sezerniert wird, (ii) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des Proteins oder Peptids sowie eine teilweise oder optimale Methylierung der in dem Peptid vorhandenen Arginine gestatten, und (iii) Ernten des Proteins oder des Peptids und (iv) Methylieren von Argininresten des Proteins oder des Peptids durch Inkontaktbringen mit einer Protein-Arginin-Methyltransferase. Nach einer spezifischeren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein beliebiges der oben erwähnten Verfahren, wobei es sich bei der Wirtszelle um einen bakteriellen Wirt oder Hefe oder eine beliebige andere eukaryontische Wirtszelle handelt, die vorzugsweise mit einem rekombinanten Baculovirus transformiert wird.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung außerdem einen Antikörper, der bei der Immunisierung mit einem beliebigen der oben erwähnten Peptide erzeugt wird, wobei der Antikörper spezifisch mit den methylierten Formen des Peptids reaktiv ist und wobei es sich bei dem Antikörper vorzugsweise um einen monoklonalen Antikörper handelt. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Anti-Idiotyp-Antikörper, der bei der Immunisierung mit einem beliebigen der oben definierten Antikörper erzeugt wird, wobei der Anti-Idiotyp-Antikörper spezifisch mit dem Antikörper reaktiv ist und dadurch die methylierte Form eines beliebigen der oben erwähnten Peptide imitiert und wobei es sich bei dem Antikörper vorzugsweise um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Nach einer spezifischeren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Immuntoxinmolekül, umfassend und/oder bestehend aus einem Zellerkennungsmolekül, bei dem es sich um ein Peptid wie oben definiert oder um einen Antikörper wie oben definiert handelt, kovalent gebunden an ein Toxinmolekül oder ein aktives Fragment davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Kit zur Verwendung zum Nachweis von systemischem Lupus erythematodes, wobei der Kit wenigstens eines der oben erwähnten Peptide oder einen der oben erwähnten Antikörper aufweist und wobei das Peptid oder der Antikörper gegebenenfalls an einen festen Träger gebunden sind. Mehr bevorzugt weist der Kit eine Reihe der Peptide oder der Antikörper auf, gegebenenfalls in Kombination mit nativem methyliertem SmD1 oder SmD3 oder Sm69 und rekombinantem nichtmethyliertem SmD2 oder SmD3 oder Sm69, wobei die Peptide an spezifischen Orten auf einem festen Substrat befestigt sind. Mehr bevorzugt ist der feste Träger ein Membranstreifen, und die Polypeptide sind in Form von parallelen Reihen an die Membran gekoppelt. Es versteht sich, dass bestimmte Peptide oder Antikörper wie oben definiert, alternativ nicht an einem festen Träger befestigt sind, sondern in der Bindungslösung bereitgestellt sind, um als Kompetitoren verwendet zu werden und/oder um andere Antikörper zu blockieren, die im Serum von Patienten mit Autoimmunkrankheiten außer SLE vorhanden sind, wodurch mögliche Kreuzreaktionen und/oder unspezifische Bindung vermindert oder beseitigt werden.
Wir haben erstmals gezeigt, dass gut definierte sekundäre Modifikationen (überwiegend N^G,N^G-Dimethylarginin) auf den Arg-Resten des C-terminalen Peptids vorhanden sind, auf die ein Glycinrest folgt. Darüber hinaus haben wir den Beweis erbracht, dass das C-terminale Peptid nur dann eine Immunreaktivität zeigen kann, die identisch mit der Immunreaktivität von natürlichem SmD ist, wenn diese Argininreste methyliert sind. Diese an den neun Arg-Positionen des C-Terminus vorhandenen Dimethylarginine sind im natürlichen SmD1-Molekül erstmals gezeigt worden. In SmD2 wurde kein Dimethylarginin erhalten, während sich im C-Terminus von SmD3 wiederum die vier RG-Motive im C-Terminus als dimethyliert erwiesen.
Die Aminosäure N^G,N^G-Dimethylarginin ist das Ergebnis einer posttranslationalen Modifikation, welche vorwiegend bei RNA-Bindungsproteinen stattzufinden scheint (Najbauer, 1993). Diese Kernproteine werden von einer nukleären Proteinmethylase I (S-Adenosyl-Methionin: Protein-Arginin-N-Methyltransferase, E.C.2.1.1.23; Rajpurohit, et al., 1994) enzymatisch modifiziert. Die Strukturspezifität dieses Enzyms scheint ein argininhaltiges Peptid mit Glycin in der C-flankierenden Position zu sein, wie durch Substratevaluierung mit synthetischen Peptiden gezeigt worden ist (Rawal, 1995). In derselben Studie wurde allerdings gezeigt, dass auch das gesamte Molekül eine wichtige, aber bislang unbekannte Rolle bei dem Methylierungsvorgang spielt. Interessanterweise kann dieser zelluläre Methylierungsprozess in vitro mit gereinigter Methylase I imitiert werden, wie mit rekombinantem heterogenem nukleärem RNP-Protein A1 gezeigt worden ist (Rajpurohit et al. 1994).
Aus unseren Ergebnissen ziehen wir daher den Schluss, dass mindestens 2 Epitope an der SmD-Immunreaktivität beteiligt sind. Eines der Epitope befindet sich offensichtlich in dem rekombinanten SmD1-Molekül und lässt sich keinem linearen Epitop zuordnen (Epitopkartierung von rekombinantem SmD1 von E. coli, Daten nicht gezeigt). Dies stimmt mit dem von Rokeach et al. (1992b) beschriebenen diskontinuierlichen Epitop überein. Das sowohl durch Epitopkartierung mit Fusionsfragmenten von E. coli (Rokeach et al., 1992b; Rivkin et al., 1994) als auch mit synthetischen Peptiden (Sabbatini et al., 1993a; James et al., 1994) am C-Terminus lokalisierte Epitop könnte durch die Arbeit von Rivkin et al. (1994) gut erklärt werden. Letztere Arbeitsgruppe hat gezeigt, dass eine Dipeptidwiederholung (Gly-Arg)₉ von 35% der Seren von SLE-Patienten, aber auch von 15% der Seren von Patienten mit anderen Autimmunkrankheiten erkannt wird. Dieses Ergebnis steht der hohen SLE-Spezifität der Anti-Sm-Antikörper gegenüber. In der Tat wurde die Spezifität des nichtmodifizierten C-terminalen SmD1-Peptids weder von Rokeach (1992b) noch von James et al. (1994) gründlich untersucht. Nur Sabbatini (1993a) beschrieb eine gewisse Krankheitsspezifität des C-terminalen synthetischen Peptids. Auf der anderen Seite hat Rivikin gezeigt, dass von 32 Seren, die für das (Gly-Arg)₉-Peptid positiv sind, nur 6 Seren mit nativem SmD positiv reagieren. Von den im Western Blot identifizierten positiven SmD-Seren wiederum ist nur die Hälfte mit dem nichtmodifizierten C-terminalen Peptid reaktiv (Rivkin: 4/8; Rokeach 9/19: Sabbatini: 5/9). Ausgehend von diesen Ergebnissen kann man folgern, dass Immunreaktivität des nichtmodifizierten C-terminalen Peptids mit natürlichem SmD nicht gut korreliert und weniger SLE-spezifisch ist als natürliches SmD. Im Gegensatz dazu zeigen unsere Ergebnisse, dass 15 von 17 SmD-positiven Seren mit dem dimethylierten C-terminalen Peptid immunreaktiv sind, während nur ein Serum mit dem nichtmodifizierten C-terminalen Peptid reagiert. Die 2 Seren, die das dimethylierte C-terminale Peptid nicht erkennen, sind mit dem vollständigen rekombinanten SmD reaktiv und offensichtlich monospezifisch für das diskontinuierliche Epitop.
Das natürliche SmD1 enthält also neun dimethylierte Arginine am C-Terminus, und diese Modifikation spielt eine entscheidende Rolle bei der SLE-spezifischen Immunreaktivität des SmD-Antigens.
Nach seiner Hauptausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Peptide, die Argininreste enthalten, denen unmittelbar ein Glycinrest folgt, und wobei mindestens ein Argininrest an einer terminalen Aminogruppe der Guanidinogruppe des Argininrestes methyliert oder dimethyliert ist und wobei diese Methylierung eine Vorraussetzung dafür ist, dass das Peptid von Antikörpern erkannt wird, die bestimmte Krankheiten kennzeichnen. Antikörper, die spezifisch mit dieser Art von Peptiden reagieren, lassen sich im Serum von Patienten mit systemischem Lupus erythematodes finden.
Es sind Peptide beschrieben, die immunologisch die immunogenen Determinanten von Selbstproteinen imitieren, die bei Patienten, die an Lupus erythematodes leiden, vom Immunsystem erkannt werden. Ein entscheidender Aspekt solcher Peptide ist die Tatsache, dass Arginine methyliert sind, denen ein Glycin folgt. Es wurde gezeigt, dass ein Peptid (SmD1) einen Bereich von 9 aufeinander folgenden Arginin-Glycin-Resten enthält, wobei jedes Arginin methyliert ist und wobei diese Methylierung für die spezifische Erkennung durch Antikörper notwendig ist, die im Serum von Patienten mit Lupus erythematodes vorhanden sind. Es wurde gezeigt, dass ein zweites Peptid (SmD3) isolierte Arginin-Glycin-Reste enthält, wobei das Arginin methyliert ist. Es wurde auch gezeigt, dass ein drittes Peptid (Sm69) mehrere Domänen enthält, die durch mehrere Arginin-Glycin-Reste gekennzeichnet sind, wobei das Arginin dimethyliert ist. Das Vorhandensein eines dimethylierten Arginins, gefolgt von einem Glycin, scheint also für die spezifische Erkennung seitens einiger im Serum von Patienten mit Lupus erythematodes vorhandener Antikörper ausreichend zu sein. Die Erfindung betrifft daher solche Peptide, bei denen mindestens ein Arginin einem Glycin vorausgeht, wobei der Argininrest methyliert ist und wobei diese Methylierung für die spezifische Erkennung durch Antikörper notwendig ist.
Der Begriff Peptid, wie er in dieser gesamten Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf ein Polymer aus Aminosäuren und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produktes; Oligopeptide, Polypeptide und Proteine sind daher in der Definition von „Peptid" enthalten. Dieser Begriff bezieht sich auch nicht auf Postexpressionsmodifikationen des Peptids bzw. schließt diese aus, beispielsweise Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen. In der Definition enthalten sind beispielsweise Peptide, die eines oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (einschließlich beispielsweise nicht-natürliche Aminosäuren, PNA, etc.), Polypeptide mit substituierten Verknüpfungen sowie anderen aus dem Stand der Technik bekannten Modifikationen, sowohl natürlich vorkommender als auch nicht natürlich vorkommender Art.
Immer dann, wenn der Ausdruck „Peptid, das weniger als 50 Aminosäuren enthält" verwendet wird, ist dies im weiten Sinne auszulegen, d. h. als Mittel zur Umschreibung einer im Wesentlichen trunkierten Version des gesamten immunreaktiven Proteins, das die hoch reaktive Domäne noch aufweist, welche durch das Vorhandenensein methylierter Argininreste gekennzeichnet ist. Diese Peptide haben eine Länge von vorzugsweise 40, 30, 25, 20 oder weniger Aminosäuren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Peptide mit einer Länge von 50, 60 oder mehr Aminosäuren, ohne die volle Länge des nativen Proteins zu umfassen. Aus praktischen Gründen in Verbindung mit der Peptidsynthese sind Peptide definiert, die weniger als 50 Aminosäuren enthalten.
Mit „immunogene Determinante" sind solche chemischen Gruppierungen gemeint, welche eine primäre Aminosäuresequenz und sekundäre Modifikationen der Aminosäurereste in einer bestimmten dreidimensionalen Anordnung aufweisen, die zusammen die spezifische Reaktivität des gesamten Antigens für einen erzeugten Antikörper festlegen. Solche Antikörper können auch verschiedene chemische Gruppierungen erkennen, welche dann die immunogene Determinante „immunologisch imitieren".
Wenn sekundäre Modifikationen eines Peptid als „notwendig" oder „entscheidend" beschrieben sind oder „eine Vorraussetzung" für das Reagieren mit einem Antikörper sind, führt das Nichtvorhandensein der sekundären Modifikationen zu einem Peptid, dessen Dissoziationskonstante der Wechselwirkung mit dem Antikörper um mindestens zwei Größenordnungen höher ist als die Dissoziationskonstante der Wechselwirkung zwischen dem Antikörper und dem Peptid, in dem die sekundären Modifikationen vorhanden sind, vorzugsweise drei Größenordnungen höher und, mehr bevorzugt, vier Größenordnungen höher.
Der Begriff „Kreuzreaktion" betrifft die Reaktion eines Antigens mit Antikörpern, die gegen ein anderes Antigen entwickelt worden sind, oder mit Antikörpern, die im Serum von Patienten mit anderen Krankheiten gefunden werden.
Der Begriff „methyliertes Arginin", wie er in der gesamten folgenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, wird im weiten Sinn verwendet und bezieht sich auf jede methylierte Form. Mehr bevorzugt bezieht sich der Begriff „methyliert" auf eine dimethylierte Form von Arginin, in der eine Aminogruppe der Guanidinogruppe des Argininrestes durch eine oder zwei Methylgruppen substituiert ist. Der Begriff „Methylierung" bezieht sich auf den Prozess, der zu den Formen von Arginin führt.
Nach einer spezifischeren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung solche Peptide, die methylierte Argininreste enthalten, die Glycinresten vorausgehen, wobei die Methylierung für die hoch affine Wechselwirkung mit Antikörpern entscheidend ist, die im Serum von Patienten mit Autoimmunkrankheiten wie beispielsweise systemischem Lupus erythematodes gefunden werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch solche Peptide, bei denen die Arginin-Glycin-Dubletts mindestens einmal und mehr bevorzugt 3 oder 4 oder 5 oder 6 oder 7 oder 8 Mal und noch mehr bevorzugt 9 Mal wiederholt werden, wie es bei dem natürlichen antinukleären Antigen SmD-1 der Fall ist, und wobei mindestens ein Argininrest, der einem Glycinrest vorausgeht, methyliert, vorzugsweise dimethyliert ist, wobei die Methylierung für eine spezifische Reaktion mit Antikörpern, beispielsweise mit Antikörpern, die im Serum von Patienten mit SLE gefunden werden, notwendig ist.
In einer spezifischeren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptid, das durch die Aminosäuresequenz GRGRGRGRGRGRGRGRGRG (SEQ ID Nr. 16) charakterisiert ist, wobei mindestens eines und vorzugsweise jedes Arginin methyliert, vorzugsweise dimethyliert und noch mehr bevorzugt auf asymmetrische weise dimethyliert ist, wodurch die wichtigste immunogene Determinante des C-terminalen Teils des antinukleären Antigens SmD1 imitiert wird.
In einer spezifischeren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptid, das durch die Aminosäuresequenz DVEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRR (SEQ ID Nr. 17) charakterisiert ist, wobei mindestens eines und vorzugsweise jedes Arginin, das einem Glycin vorausgeht, methyliert, vorzugsweise dimethyliert und noch mehr bevorzugt auf asymmetrische Weise dimethyliert ist, wodurch die wichtigste immunogene Determinante des C-terminalen Teils des antinukleären Antigens SmD1 imitiert wird.
In einer spezifischeren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptid, das durch die Aminosäuresequenz ARGRGRGMGRG (SEQ ID Nr. 18) charakterisiert ist, wobei mindestens eines und vorzugsweise jedes Arginin methyliert, vorzugsweise dimethyliert und noch mehr bevorzugt auf asymmetrische Weise dimethyliert ist, wodurch die wichtigste immunogene Determinante des C-terminalen Teils des antinukleären Antigens SmD3 imitiert wird.
In einer spezifischeren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Peptid, das durch die Aminosäuresequenz KAQVAARGRGRGMGRGNIFQKRR (SEQ ID Nr. 19) charakterisiert ist, wobei mindestens eines und vorzugsweise jedes Arginin, das einem Glycin vorausgeht, methyliert, vorzugsweise dimethyliert und noch mehr bevorzugt auf asymmetrische Weise dimethyliert ist, wodurch die wichtigste immunogene Determinante und deren Grenzen des C-terminalen Teils des antinukleären Antigens SmD3 imitiert wird.
Nach einer spezifischeren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Peptid, das die Aminosäuresequenz GGQQDRGGRGRGGGGGYNRSSGGYEPRGRGGGRGGRGGMGGSDRGG (SEQ ID Nr. 20) oder GGQQDRGGRGRGGGGGYN (SEQ ID Nr. 21) oder SGGYEPRGRGGGRGGRGGMGGSDRGG (SEQ ID Nr. 22) oder DFNRGGGNGRGGRGRGG (SEQ ID Nr. 23) oder DFNRGGGNGRGGRGRGGPMGRGGYGGGGS (SEQ ID Nr. 24) oder GDDRRGRGGYDRGGYRGRGGDRGGFRGGRGGGDRGGFG (SED ID Nr. 25) oder GDDRRGRGGYDRGG (SEQ ID Nr. 26) oder GGYRGRGGDRGGFRGGRGGGDRGGFG (SEQ ID Nr. 27) aufweist oder daraus besteht, wobei mindestens eines und vorzugsweise jede Arginin, das einem Glycin vorausgeht, methyliert, vorzugsweise dimethyliert und noch mehr bevorzugt auf asymmetrische Weise dimethyliert ist, wodurch die wichtigste immunogene Determinante und deren Grenzen des C-terminalen Teils des antinukleären Antigens Sm69 imitiert wird.
Nach einer spezifischeren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Peptid, das die Aminosäuresequenz DNHGRGRGRGRGRGGG (SEQ ID Nr. 28) oder GGRGRGGSGGRGRGG (SEQ ID Nr. 29) oder ERARGRGRGRGE (SEQ ID Nr. 30) aufweist oder daraus besteht, wobei mindestens eines und vorzugsweise jede Arginin, das einem Glycin vorausgeht, methyliert, vorzugsweise dimethyliert und noch mehr bevorzugt auf asymmetrische Weise dimethyliert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch molekulare Strukturen, in denen mindestens ein Teil ein Peptid oder einen Antikörper wie oben definiert darstellt. Solche molekularen Strukturen können aus der Fusion von Peptiden der vorliegenden Erfindung mit Peptiden und/oder Proteinen und/oder anderen Molekülen resultieren, die des Weiteren dadurch gekennzeichnet sind, dass sie spezifisch mit anderen Peptiden und/oder Proteinen und/oder molekularen Strukturen Wechselwirken, was ein Anheften und/oder Binden des fusionierten Polypeptids und/oder Proteins an spezifische Gewebe- oder Zelltypen ermöglicht oder was die Reinigung der molekularen Strukturen aufgrund des Vorhandenseins von beispielsweise 4 oder 5 oder 6 aufeinander folgenden Histidinresten ermöglicht, oder die zytotoxisch gegen T-Zellen und/oder B-Zellen sind, wie beispielsweise Choleratoxin, oder die eine Markierung mittels eines radioaktiven oder fluoreszierenden Markers oder einem Immunogoldmarker oder einem enzymatischen Marker ermöglichen.
In bestimmten Fällen kann es auch wünschenswert sein, zwei oder mehrere Peptide gemeinsam in einer Peptidstruktur zu verbinden oder verzweigte Peptide herzustellen. Ein Vorteil dieser Anordnung ist aus dem Stand der Technik gut bekannt und betrifft die Diagnose. Wenn in einem Test Antikörper verwendet werden, um die vorhandenen Antigene nachzuweisen, können Tandem-Wiederholungen oder verzweigte Peptide der Antigene die Menge an immobilisierten, den Antikörpern präsentierten Antigenen erhöhen und dadurch die Empfindlichkeit des Tests steigern. Die Empfindlichkeit lässt sich exponenziell erhöhen, wenn die immobilisierten Antigene zusammen mit einer spezifischen Konzentration solcher Antigene in einer löslichen Form verwendet werden, wodurch die Bildung vernetzter Antigen-Immunpräzipitate induziert wird. Ein zweiter Vorteil betrifft die Therapie. Die Ablagerung von Selbstantigen-Autoimmunkomplexen in verschiedenen Geweben ist ein wichtiger Schritt in Richtung auf den Erwerb eines pathologischen Zustandes. Es ist allgemein anerkannt, dass die Hauptursache einer solchen Ablagerung die unzureichende Blutclearance der Antigenimmunkomplexe durch die Leber aufgrund der kleinen Größe der Komplexe ist. Verabreichung von Tandem-Wiederholungen oder verzweigten Formen der Peptide könnte die Größe der gebildeten Antigenimmunkomplexe erhöhen und dadurch die Clearance erhöhen und somit die Ablagerung der Komplexe vermindern.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem zirkularisierte Formen der Peptide, wobei der Vorteil aus dem Stand der Technik gut bekannt ist und sich auf eine erhöhte Affinität eines von der Konformation her eingeschränkten Peptids gegenüber den eher zufällig geschlungenen Formen linearer Peptide bezieht.
Um eventuellen negativen Kennzeichen der beanspruchten Peptide Rechnung zu tragen, beispielsweise schnellem Abbau, Löslichkeit, zytotoxischen Effekten und so weiter, ist es einem Fachmann möglich, konservative sowie nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen oder Substitutionen mit nicht-natürlichen Aminosäuren, PNA, etc. zu entwerfen. Diese machen im Allgemeinen weniger als 35 Prozent einer spezifischen Sequenz aus. Solche Peptide umfassen auch Peptide mit substituierten Verknüpfungen sowie anderen aus dem Stand der Technik bekannten Modifikationen, sowohl natürlich vorkommender als auch nicht natürlich vorkommender Art. In Fällen, bei denen die SmD-Peptide oder andere Antigenpeptide der vorliegenden Erfindung hoch polymorph sind, kann es wünschenswert sein, eine oder mehrere der Aminosäuren zu variieren, um die verschiedenen Epitope mehrerer viraler Stämme, oder wie sie von Antikörpern im Serum von Patienten mit SLE oder anderen Autoimmunkrankheiten erkannt werden, besser zu imitieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem beliebige Analoga der Peptide der vorliegenden Erfindung.
Der Begriff „Analog", wie er in der gesamten Beschreibung oder den Ansprüchen zur Beschreibung der Proteine oder Peptide der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst jedes Protein oder Peptid mit einer Aminosäurerest-Sequenz, die im Wesentlichen mit einer spezifisch hierin gezeigten Sequenz identisch ist, in der einer oder mehrere Reste konservativ durch einen biologisch äquivalenten Rest substituiert ist bzw. sind. Beispiele konservativer Substitutionen umfassen die gegenseitige Substitution hydrophober Reste wie beispielsweise Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, die gegenseitige Substitution hydrophiler Reste wie beispielsweise Arginin und Lysine, zwischen Glutamin und Asparaginen, zwischen Glycin und Serin, die gegenseitige Substitution basischer Reste wie beispielsweise Lysin, Arginin oder Histidin oder die gegenseitige Substitution saurer Reste wie beispielsweise Asparaginsäure oder Glutaminsäure. Beispiele zulässiger Mutationen nach der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4
Überblick über die Aminosäuresubstitutionen, welche die Basis von Analoga (Muteinen) wie oben definiert bilden könnten.
Der Begriff „konservative Substitution" umfasst auch die Verwendung eines chemisch derivatisierten Restes anstelle eines nicht-derivatisierten Restes, vorausgesetzt, dass das resultierende Protein oder Peptid biologisch zu dem Protein oder Peptid der Erfindung äquivalent ist.
„Chemisches Derivat" bezieht sich auf ein Protein oder Peptid mit einem oder mehreren Resten, die chemisch durch Reaktion einer funktionellen Seitengruppe derivatisiert sind, oder auf Peptide mit substituierten Verknüpfungen sowie anderen aus dem Stand der Technik bekannten Modifikationen, sowohl natürlich vorkommender als auch nicht natürlich vorkommender Art. Beispiele solcher derivatisierter Moleküle umfassen, jedoch nicht ausschließlich, solche Moleküle, bei denen freie Aminogruppen derivatisiert werden, um Aminhydrochloride, p-Toluolsulfonylgruppen, Carbobenzoxygruppen, t-Butyloxycarbonylgruppen, Chloracetylgruppen oder Formylgruppen zu bilden. Freie Carboxylgruppen können derivatisiert werden, um Salze, Methyl- und Ethylester oder andere Arten von Estern oder Hydraziden zu bilden. Freie Hydroxylgruppen können derivatisiert werden, um O-Acyl- oder O-Alkylderivate zu bilden. Der Imidazolstickstoff des Histidins kann derivatisiert werden, um N-Imbenzylhistidin zu bilden. Als chemische Derivate gelten auch solche Proteine oder Peptide, die eines oder mehrere natürlich vorkommende Aminosäurederivate der zwanzig Standardaminosäuren enthalten. Beispielsweise: Prolin kann durch 4-Hydroxyprolin ersetzt werden; Lysin kann durch 5-Hydroxylysin ersetzt werden; Histidin kann durch 3-Methylhistidin ersetzt werden; Serin kann durch Homoserin ersetzt werden und Lysin kann durch Ornithin ersetzt werden. Die Peptide der vorliegenden Erfindung umfassen auch jedes Protein oder Peptid mit einer oder mehreren Additionen und/oder Deletionen oder Resten relativ zu der Sequenz eines Peptids, dessen Sequenz hierin gezeigt ist, so lange das Peptid zu den Proteinen oder Peptiden der Erfindung biologisch äquivalent ist.
Darüber hinaus können dem Amino- oder Carboxyterminus zusätzliche Aminosäuren oder chemische Gruppen zum Zweck des Herstellens eines „Linkerarms" hinzugefügt werden, durch den das Peptid praktisch an einem Träger befestigt werden kann. Der Linkerarm besteht aus mindestens einer Aminosäure und kann aus bis zu 60 Aminosäuren bestehen, am häufigsten besteht er jedoch aus 1 bis 10 Aminosäuren. Die Art der Befestigung an eine feste Phase oder einen festen Träger kann nicht-kovalent sowie kovalent sein. Mögliche Anordnungen dieser Art sind im Stand der Technik gut beschrieben. Dem Amino- oder Carboxyterminus können natürliche Aminosäuren wie beispielsweise Histidin, Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, um funktionelle Gruppen zum Koppeln an eine feste Phase oder einen Träger bereitzustellen. Den Enden können aber auch andere chemische Gruppen wie beispielsweise Biotin und Thioglycolsäure hinzugefügt werden, welche die Peptide mit gewünschten chemischen oder physikalischen Eigenschaften ausstatten. Die Enden der Peptide können auch beispielsweise durch N-terminale Acetylierung oder terminale Carboxyamidierung modifiziert werden. In jedem Fall ist das Peptid vorzugsweise so klein wie möglich, während es dennoch im Wesentlichen die gesamte Empfindlichkeit des größeren Peptids beibehält.
Die erfindungsgemäßen Peptide und insbesondere die Fragmente können durch klassische chemische Synthese hergestellt werden. Die Synthese kann in homogener Lösung oder in einer festen Phase durchgeführt werden. Beispielsweise ist die Synthesetechnik in homogener Lösung, die verwendet werden kann, die von Houbenweyl in dem Buch mit dem Titel „Methode der organischen Chemie", herausgegeben von E. Wunsh, Band 15-I und II. THIEME, Stuttgart 1974, beschriebene. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch in einer festen Phase nach den von Atherton und Shepard in deren Buch mit dem Titel „Solid phase peptide synthesis" (IRL Press, Oxford, 1989) Verfahren hergestellt werden. Die methylierten Formen der beanspruchten Peptide lassen sich erhalten, indem die normalen Argininderivate "während der klassischen chemischen Synthese gegen die methylierten Argininderivate ausgetauscht werden oder indem die nichtmethylierten Peptide nach der Synthese mit einem Protein-Arginin-Methyltransferaseenzym beliebiger eukaryontischer Herkunft in Kontakt gebracht werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch mittels DNA-Rekombinantionstechniken wie beschrieben von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 durch Insertion einer Polynukleinsäuresequenz hergestellt werden, welche die beanspruchten Peptide oder Teil der beanspruchten Peptide einem geeigneten Vektor codiert und ein geeigneter Wirt mit dem Vektor transformiert wird. Dieser rekombinante Expressionsvektor umfasst eine Polynukleinsäure oder einen Teil davon, wie oben definiert, in funktioneller Verknüpfung mit prokaryontischen, eukaryontischen oder viralen Transkriptions- und Translationssteuerelementen. Darüber hinaus kann diese Sequenz funktionell mit Sequenzen verknüpft sein, die eine Sekretion der beanspruchten Peptide zulassen. Der Begriff „Vektor" kann ein Plasmid, ein Cosmid, einen Phagen oder ein Virus oder einen transgenen Organismus umfassen. Besonders geeignet können BCG oder adenovirale Vektoren sowie rekombinante Avipox-Viren sein.
Die rekombinanten Peptide können in vitro methyliert werden, indem die exprimierten und/oder sezernierten Peptide mit einer Protein-Arginin-Methyltransferase beliebiger eukaryontischer Herkunft in Kontakt gebracht werden oder indem in vivo der geeignete Wirt gewählt wird, beispielsweise Hefe oder eine beliebige eukaryontische Zelle, und mehr bevorzugt, indem das Baculovirus-Transformationssystem verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung schließt die Option der Verwendung weiterer Proteine wie beispielsweise der Proteine BTG1 und TIS21, welche sich für eine Methylierung in vivo (als koexprimierte Proteine) als essenziell oder für eine optimale Methylierung in vitro als erforderlich erwiesen haben (Lin et al., 1996), oder beliebiger anderer Proteine, Peptide oder chemischer Substanzen, welche den Methylierungsgrad optimieren können, nicht aus.
Auch kann jedes beliebige der bekannten Reinigungsverfahren für rekombinante Peptide für die Herstellung der rekombinanten Peptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Expressionsvektor, welcher eine Polynukleinsäure oder einen Teil davon wie oben definiert aufweist, in funktioneller Verknüpfung mit prokaryontischen, eukaryontischen oder viralen Transkriptions- und Translationssteuerungselementen.
Im Allgemeinen umfasst der rekombinante Vektor eine Vektorsequenz, eine geeignete prokaryontische, eukaryontische oder virale Promotorsequenz, gefolgt von einer Nukleotidsequenz, die ein Peptid wie oben definiert codiert, wobei der rekombinante Vektor die Expression und/oder Sekretion eines beliebigen der Polypeptide wie oben definiert in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt oder in lebenden Säugern zulässt, wenn er als nackte DNA injiziert wird.
Auch kann jedes beliebige der bekannten Reinigungsverfahren für rekombinante Proteine für die Herstellung der rekombinanten Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Der Begriff „Vektor" kann ein Plasmid, ein Cosmid, einen Phagen oder ein Virus oder ein transgenes Tier umfassen. Für die Impfstoffentwicklung besonders geeignet können BCG- oder adenovirale Vektoren sowie rekombinante Avipox-Viren sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten Polypeptids wie oben definiert, umfassend:

– Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor, in dem eine Polynukleinsäure oder ein Teil davon in Übereinstimmung mit dem oben definierten unter der Kontrolle geeigneter Steuerungselemente inseriert ist,
– Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression und/oder Sekretion des Inserts erlauben, und
– Ernten des Polypeptids.

Der im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff „rekombinant exprimiert" bezieht sich auf die Tatsache, dass die Proteine der vorliegenden Erfindung durch rekombinante Expressionsverfahren sei es in Prokaryonten oder niedrigen oder höheren Eukaryonten hergestellt werden, wie ausführlich unten erläutert ist.
Der Begriff „niedriger Eukaryont" bezieht sich auf Wirtszellen wie Hefe, Pilze und dergleichen. Niedrige Eukaryonten sind im Allgemeinen (aber nicht zwingend) einzellig. Bevorzugte niedrige Eukaryonten sind Hefen, insbesondere Arten aus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia (z. B. Pichia castoris), Hansenula (z. B. Hansenula polymorpha), Yarowia, Schwaniomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces und dergleichen. Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis und K. lactis sind die am häufigsten verwendeten Hefewirte und geeignete Wirtspilze.
Der Begriff „Prokaryont" bezieht sich auf Wirte wie E.coli, Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis oder Streptomyces. Diese Wirte kommen auch für die vorliegende Erfindung infrage.
Der Begriff „höherer Eukaryont" bezieht sich auf Wirtszellen, die von höheren Tieren, wie beispielsweise Säugern, Reptilien, Insekten und dergleichen, abstammen. Derzeit bevorzugte höhere eukaryontische Wirtszellen stammen vom Chinesischen Hamster (z. B. CHO), vom Affen (z. B. COS und Vero-Zellen), der Niere von neugeborenen Hamstern (BHK), der Schweineniere (PK15), der Kaninchenniere (Rabbit Kidney 13-Zellen; RK13), der humanen Osteosarkomzelllinie 143 B, der humanen Zelllinie HeLa und von humanen Hepatomzelllinien wie Hep G2 und Insektenzelllinien (z. B. Spodoptera frugiperda). Die Wirtszellen können in Suspension oder Flaschenkulturen, Gewebekulturen, Organkulturen und dergleichen bereitgestellt sein. Alternativ können die Wirtszellen auch transgene Tiere sein.
Der Begriff „rekombinantes Polynukleotid" oder „Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Polynukleotid oder eine Nukleinsäure genomischer, cDNA-, halbsynthetischer oder synthetischer Herkunft, welche aufgrund ihrer Herkunft oder aufgrund von Manipulation: (1) nicht mit dem gesamten oder einem Anteil eines Polynukleotids assoziiert sind, mit dem sie in der Natur assoziiert sind, (2) mit einem Polynukleotid verknüpft sind, bei dem es sich nicht um das Polynukleotid handelt, mit dem sie in der Natur verknüpft sind, oder (3) in der Natur nicht vorkommen.
Der Begriff „rekombinante Wirtszellen", „Wirtszellen", „Zellen", „Zelllinien", „Zellkulturen" und andere solche Begriffe die Mikroorganismen oder höhere eukaryontische Zelllinien beschreiben, die als einzellige Einheiten kultiviert werden, bezieht sich auf Zellen, die als Empfänger eines rekombinanten Vektors oder eines anderen Transferpolynukleotids verwendet werden können bzw. verwendet worden sind, und die Nachkommen der ursprünglichen Zelle umfassen, die transfiziert worden ist. Es versteht sich, dass die Nachkommen einer einzelnen Elternzelle von ihrer Morphologie her oder in Bezug auf ihre genomische DNA oder ihre Gesamt-DNA aufgrund natürlicher, zufälliger oder absichtlicher Mutation nicht zwingend komplett identisch zu der ursprünglichen Elternzelle sein müssen.
Der Begriff „Replikon" bezeichnet jedes beliebige genetische Element, z. B. ein Plasmid, ein Chromosom, ein Virus, ein Cosmid, etc., die sich als autonome Einheit einer Polynukleotidreplikation in einer Zelle verhalten, d. h. zu Replikation unter eigener Kontrolle fähig sind.
Der Begriff „Vektor" ist ein Replikon, das des Weiteren Sequenzen umfasst, welche Replikation und/oder Expression eines gewünschten offenen Leserasters bereitstellen.
Der Begriff „Steuersequenzen" bezieht sich auf Polynukleotidsequenzen, die notwendig sind, um codierende Sequenzen zu exprimieren, mit denen sie ligiert sind. Die Art solcher Steuersequenzen unterscheidet sich je nach Wirtsorganismus; bei Prokaryonten umfassen solche Steuersequenzen in der Regel Promotor, ribosomale Bindungsstelle, Splicing-Stellen und Terminatoren; bei Eukaryonten umfassen solche Steuersequenzen in der Regel Promotoren, Splicing-Stellen, Terminatoren und in manchen Fällen Verstärker (Enhancer). Der Begriff „Steuersequenzen" soll mindestens alle Bestandteile umfassen, deren Vorhandensein für eine Expression erforderlich ist, und kann auch zusätzliche Bestandteile umfassen, deren Vorhandensein von Vorteil ist, beispielsweise Leader-Sequenzen, welche die Sekretion regulieren.
Der Begriff „Promotor" ist eine Nukleotidsequenz, welche aus Konsensussequenzen besteht, die derart eine Bindung der RNA-Polymerase an-die DNA-Vorlage erlauben, dass die mRNA-Produktion an der normalen Transkriptionsinitiationsstelle für das angrenzende Strukturgen beginnt.
Der Ausdruck „funktionell verknüpft" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, bei welcher die so beschriebenen Bestandteile in einer Beziehung stehen, die es ihnen erlaubt, in ihrer beabsichtigten Art und Weise zu arbeiten. Eine Steuersequenz, die „funktionell" mit einer codierenden Sequenz „verknüpft" ist, ist derart ligiert, dass unter Bedingungen, die mit den Steuersequenzen kompatibel sind, die Expression der codierenden Sequenz erreicht wird.
Die Polynukleinsäuren, welche die Peptide der vorliegenden Erfindung codieren und in die Vektorsequenz eingefügt werden, können an eine Signalsequenz angebracht werden. Eine solche Signalsequenz kann die einer beliebigen Herkunft sein, z. B. die Leader-Sequenz von IgG oder des Gewebe-Plasminogenaktivators (tpa) zur Expression in Säugerzellen oder die α-Mating-Faktor-Sequenz zur Expression in Hefezellen.
Es können verschiedene Vektoren verwendet werden, um die Peptide der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Niedrige Eukaryonten wie Hefen und Stämme mit Glykosylierungsmutationen werden typischerweise mit Plasmiden transformiert oder werden mit einem rekombinanten Virus transformiert. Die Vektoren können im Wirt unabhängig replizieren oder sich in das Wirtszellgenom einfügen.
Höhere Eukaryonten können mit Vektoren transformiert werden oder können mit einem rekombinanten Virus, beispielsweise einem rekombinanten Vakziniavirus infiziert werden. Techniken und Vektoren zum Einfügen von Fremd-DNA in Vakziniavirus sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und verwenden beispielsweise homologe Rekombination. Aus dem Stand der Technik ist eine breite Vielzahl viraler Promotorsequenzen, gegebenenfalls Terminatorsequenzen und Poly(A)-Adenylierungssequenzen, gegebenenfalls Enhancersequenzen und gegebenenfalls Amplifikationssequenzen verfügbar, die sämtlich für die Expression in Säugern erforderlich sind. Vakzinia ist besonders bevorzugt, da Vakzinia die Expression von Wirtszellproteinen unterbricht. Vakzinia ist außerdem sehr bevorzugt, da es die Expression von z. B. Peptiden der vorliegenden Erfindung in Zellen oder Individuen ermöglicht, die mit dem lebenden rekombinanten Vakziniavirus immunisiert sind. Besonders geeignete Vektoren zur Vakzinierung von Menschen sind das Avipoxvirus und das Ankara Modified Virus (AMV).
Bekannt sind außerdem Insektenexpressionstransfervektoren, die von dem Baculovirus AcNPV (Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus) abstammen, bei dem es sich um einen Helfer-unabhängigen viralen Expressionsvektor handelt. Aus diesem System abgeleitete Expressionsvektoren verwenden üblicherweise den starken viralen Polyhedringenpromotor, um die Expression heterologer Gene anzutreiben. Dem Fachmann stehen zur Expression in Baculovirus verschiedene Vektoren sowie Verfahren für die Einführung heterologer DNA in die gewünschte Stelle des Baculovirus zur Verfügung. Im Stand der Technik sind auch verschiedene Signale zur posttranslationalen Modifikation, die von Insektenzellen erkannt werden, bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Vektor, wie oben definiert, transformiert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Antikörper, die spezifisch gegen die Peptide der vorliegenden Erfindung erzeugt worden sind, vorzugsweise gegen solche Peptide, bei denen die Arginine, die einem Glycinrest vorausgehen, methyliert sind. Diese Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Zur Erzeugung von Antikörpern wird ein Wirtstier mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch zulässigen Träger immunisiert, wobei mindestens eines der Arginine der Peptide, die einem Glycinrest vorausgehen, methyliert ist. Pharmazeutisch zulässige Träger sind alle Träger, die selbst keine Produktion von Antikörpern induzieren, welche für das Individuum, das eine solche Zusammensetzung erhält, schädlich sind. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle wie beispielsweise Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere und inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind einem durchschnittlichen Fachmann gut bekannt.
Bevorzugte Adjuvanzien zur Verstärkung der Effektivität der Zusammensetzung umfassen, jedoch nicht ausschließlich: Aluminimhydroxid (Alum), N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), wie in US-Patent Nr. 4,606,918 beschrieben, N-Acetylnormuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoylsn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE) und RIBI, welches drei Bestandteile enthält, die aus Bakterien extrahiert sind, Monophosphoryl-Lipid A, Trehalosedimycolat und Zellwandskelett (MPL + TDM + CWS) in einer Emulsion mit 2% Squalen/Tween 80. Jeder beliebige der 3 Bestandteile MPL, TDM oder CWS kann auch allein oder 2 mal 2 kombiniert werden. Darüber hinaus können Adjuvanzien wie Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA) oder SAF-1 (Syntex) verwendet werden. Darüber hinaus können für nichthumane Anwendungen und Forschungszwecke komplettes Freund-Adjuvans (KFA) und inkomplettes Freund-Adjuvans (IFA) verwendet werden.
Die immunogenen Zusammensetzungen enthalten typischerweise pharmazeutisch zulässige Vehikel wie beispielsweise Wasser, Salzlösung, Glycerin, Ethanol, etc. In diesen Vehikeln können des Weiteren Hilfssubstanzen wie Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen, Konservierungsmittel und dergleichen enthalten sein.
Typischerweise werden die immunogenen Zusammensetzungen als injizierbare Mittel hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; es können auch feste Formen für das Auflösen oder die Suspension in flüssigen Vehikeln vor der Injektion hergestellt werden. Die Herstellung kann auch emulgiert oder in Liposomen verkapselt werden, um den adjuvierenden Effekt zu verstärken. Die Proteine können auch zusammen mit Saponinen in Immunstimulationskomplexe eingebaut werden, wie beispielsweise Quil A (ISCOMS).
Immunogene Zusammensetzungen, die zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, umfassen eine „ausreichende Menge" oder „eine immunologisch wirksame Menge" der Peptide der vorliegenden Erfindung sowie, je nach Bedarf, beliebige andere der oben erwähnten Bestandteile. „Immunologisch wirksame Menge" bedeutet, dass die Verabreichung der Menge an ein Individuum, entweder in einer Einzeldosis oder als Teil einer Serie, wirksam ist, um eine Immunreaktion auszulösen und Antikörper, wie oben definiert, zu erzeugen. Diese Menge variiert je nach der Gesundheit und dem körperlichen Zustand des Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z. B. nichtmenschlicher Primat, Primat, Kaninchen, etc.), der Kapazität des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern, der Immunogenität des Antigenpeptids und dessen Verabreichungsart und von anderen relevanten Faktoren. Es ist davon auszugehen, dass die Menge in einen relativ weit gefassten Bereich fällt, der sich in Routineuntersuchungen ermitteln lässt. Für gewöhnlich variiert die Menge von 0,01 bis 1000 μg/Dosis, insbesondere von 0,1 bis 100 μg/Dosis.
Die immunogenen Zusammensetzungen werden praktischerweise parenteral verabreicht, typischerweise durch Injektion, beispielsweise subkutan oder intramuskulär. Weitere Formulierungen, die für andere Verabreichungsverfahren geeignet sind, umfassen orale Formulierungen und Zäpfchen. Bei der Behandlungsdosis kann es sich um eine Behandlung mit einer einzelnen Dosis oder mit mehreren Dosen handeln. Der Impfstoff kann in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Mitteln gegeben werden.
Das Wirtsserum oder Plasma wird nach einem angemessenen Zeitintervall entnommen, um eine Zusammensetzung bereitzustellen, welche Antikörper aufweist, die mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung reaktiv sind. Die Gammaglobulinfraktion bzw. die IgG-Antikörper lassen sich beispielsweise durch Verwendung von gesättigtem Ammoniumsulfat oder DEAE-Sephadex oder durch andere, einem Fachmann bekannte Techniken erhalten. Die Antikörper sind im Wesentlichen frei von vielen der Nebenwirkungen, die mit anderen antiviralen Mitteln wie Medikamenten für die Behandlung einer infektiösen, chronischen oder rezidivierenden Mononukleose einhergehen. Solche Antikörper können auch verwendet werden, um bestimmte Krankheiten zu diagnostizieren, beispielsweise das Burkitt-Lymphom, an dem das Epstein-Barr-Virus beteiligt ist.
Der Begriff „immunogen" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Substanz, alleine oder in Verknüpfung mit einem Träger in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Adjuvans eine humorale und/oder zelluläre Reaktion auszulösen.
Die hergestellten Antikörper der beanspruchten Erfindung können auch monoklonale Antikörper sein, die mit einem beliebigen der Peptide spezifisch reaktiv sind und es sich bei dem Antikörper vorzugsweise um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können von jedem Hybridoma produziert werden, das nach klassischen Verfahren aus Milzzellen eines Tieres, insbesondere einer Maus oder Ratte, die gegen die beanspruchten Peptide der vorliegenden Erfindung immunisiert sind, einerseits und den Zellen einer Myelomzelllinie andererseits speziell gebildet und nach der Fähigkeit des Hybridomas ausgewählt wird, die monoklonalen Antikörper herzustellen, welche die methylierten Formen der Peptide erkennen, die ursprünglich für die Immunisierung der Tiere verwendet worden sind.
Die an der Erfindung beteiligten Antikörper können mit einem geeigneten Marker vom enzymatischen, fluoreszierenden oder radioaktiven Typ markiert werden.
Die monoklonalen Antikörper nach dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können humanisierte Versionen von monoklonalen Mausantikörpern sein, die mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellt sind, abweichend von Teilen von genomischen DNA-Sequenzen von Maus und/oder Mensch, welche für H- und L-Ketten codieren, oder von cDNA-Klonen, die für H- und L-Ketten codieren.
Alternativ können die monoklonalen Antikörper nach dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung humane monoklonale Antikörper sein. Diese Antikörper nach der vorliegenden Ausführungsform der Erfindung können auch von humanen peripheren Blutlymphozyten von Patienten mit SLE oder einer beliebigen anderen Autoimmunkrankheit oder mit einer infektiösen, chronischen oder rezidivierenden Mononukleose abgeleitet sein. Solche humanen monoklonalen Antikörper werden beispielsweise mittels Repopulation von Mäusen mit schwerem kombiniertem Immunschwächesyndrom (SCID) mit humanen peripheren Blutlymphozyten (PBL) (für einen aktuelleren Überblick vgl. Duchosal et al. 1992) oder durch Screening von Epstein-Barr-Virus-transformierten Lymphozyten infizierter oder geimpfter Individuen auf Vorhandensein reaktiver B-Zellen mittels der Antigene der vorliegenden Erfindung hergestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Anti-Idiotyp-Antikörper, die nach Immunisierung mit einem Antikörper wie oben definiert erzeugt werden und die mit den Antikörpern spezifisch reagieren, wodurch die Peptide der vorliegenden Erfindung imitiert werden. Die Verfahren zum Produzieren monoklonaler Anti-Idiotyp-Antikörper, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, wurden beispielsweise von Gheuens und MacFarlin (1982) beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem trunkierte Versionen oder einzelkettige Versionen der Antikörper und Anti-Idiotyp-Antikörper wie oben definiert, die ihre ursprüngliche Spezifität für die Reaktion mit den Antigenen bewahrt haben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Proteine oder Peptide, die die Antikörper wie oben definiert imitieren, wie beispielsweise Mikroproteine, wie sie durch Phagendisplay erhalten werden können, oder die hoch variablen Domänen eines rekombinanten Antikörpers, wie erhalten durch Screening nach Repertoire-Klonierung.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Erkennen von Antikörpern, die spezifisch mit den Peptiden oder Anti-Idiotyp-Antikörpern der vorliegenden Erfindung reagieren und welche in einer biologischen Probe vorhanden sind, umfassend:

(i) Inkontaktbringen der zu analysierenden biologischen Probe auf das Vorhandensein der Antikörper mit einem Peptid oder einem Anti-Idiotyp-Antikörper, wie oben definiert;
(ii) Feststellen des immunologischen Komplexes, der sich zwischen den Antikörpern und dem Peptid oder Anti-Idiotyp-Antikörper gebildet hat.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein umgekehrtes Verfahren zum Erkennen der Peptide und/oder der Anti-Idiotyp-Antikörper der vorliegenden Erfindung mit in einer biologischen Probe vorhandenen Antikörper, die mit methylierten Formen der Peptide und/oder Anti-Idiotyp-Antikörpern, die solche Peptide imitieren, spezifische reagieren, umfassend:

(i) Inkontaktbringen der zu analysierenden biologischen Probe auf das Vorhandensein der Peptide und/oder Anti-Idiotyp-Antikörper mit den Antikörpern, wie oben definiert;
(ii) Feststellen des immunologischen Komplexes, der sich zwischen den Antikörpern und dem Peptid oder Anti-Idiotyp-Antikörper gebildet hat.

Die oben definierten Verfahren können bei der Diagnose von Autoimmunkrankheiten wie beispielsweise einem systemischen Lupus erythematodes verwendet werden.
Nach einer spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Entwicklung einer diagnostischen Technik, welche die Differenzierung zwischen solchen Autoimmunkrankheiten ermöglicht, in denen die charakteristischen Antikörper häufig mit demselben Antigen reagieren, was zu einer erschwerten und langsamen Diagnose führt. Eine solche diagnostische Technik kann durch die simultane Verwendung mehrerer Antigene, methyliert und nichtmethyliert, und mindestens zwei Epitopen, einer methylierten und einer nichtmethylierten Form eines beliebigen der beanspruchten Peptide und/oder Anti-Idiotyp-Antikörpern der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Kit zur Verwendung bei der Erkennung des Vorhandenseins der Antikörper, wobei der Kit mindestens ein Peptid oder einen Anti-Idiotyp-Antikörper oder ein Mikroprotein wie oben definiert umfasst, wobei das Peptid oder der Anti-Idiotyp-Antikörper oder das Mikroprotein vorzugsweise an einen festen Träger gebunden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Kit zum Feststellen der Art von Autoimmunkrankheit, wobei der Kit mindestens ein Peptid oder einen Anti-Idiotyp-Antikörper oder ein Mikroprotein wie oben definiert umfasst, wobei das Peptid oder der Anti-Idiotyp-Antikörper oder das Mikroprotein vorzugsweise an einen festen Träger gebunden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Kit wie oben definiert, wobei der Kit eine Reihe der Peptide und/oder Anti-Idiotyp-Antikörper oder ein Mikroprotein aufweist, welche an spezifischen Orten auf einem festen Substrat gebunden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Kit wie oben definiert, wobei der feste Träger ein Membranstreifen ist und die Peptide und/oder Anti-Idiotyp-Antikörper oder Mikroproteine in Form paralleler Reihen an die Membran gekoppelt sind.
Die Immunassayverfahren nach der vorliegenden Erfindung können beispielsweise einzelne oder spezifische oligomere Antigene, dimere Antigene sowie Kombinationen einzelner oder spezifischer oligomerer Antigene verwenden. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können in praktisch jedem Assayformat eingesetzt werden, das ein bekanntes Antigen verwendet, um Antikörper festzustellen, die eine bestimmte Krankheit oder Infektion charakterisieren. Ein gemeinsames Merkmal all dieser Assays ist, dass das antigene Peptid bzw. der Anti-Idiotyp-Antikörper bzw. das Mikroprotein unter Bedingungen, die erlauben, dass das Antigen an einen solchen in dem Bestandteil vorhandenen Antikörper binden, in Kontakt mit dem Körperbestandteil gebracht werden, der vermutlich die Antikörper enthält. Solche Bedingungen sind typischerweise physiologische Temperatur, pH-Wert und Ionenstärke, unter Verwendung eines Antigenüberschusses. Auf die Inkubation des Antigens mit der Probe folgt der Nachweis von Immunkomplexen, die aus dem Antigen bestehen.
Das Design der Immunassays unterliegt beträchtlichen Variationen, und aus dem Stand der Technik sind viele Formate bekannt. Protokolle können beispielsweise feste Träger oder Immunpräzipitation verwenden. Die meisten Assays beinhalten die Anwendung markierter Antikörper oder Peptide; die Marker können beispielsweise enzymatische, fluoreszierende, chemilumineszente, radioaktive Moleküle oder Farbstoffmoleküle sein. Es sind auch Assays bekannt, welche die Signale des Immunkomplexes amplifizieren; Beispiele dafür sind Assays, die Biotin und Avidin oder Streptavidin nutzen, sowie enzymmarkierte und enzym-vermittelte Immunassays wie beispielsweise ELISA-Assays.
Der Immunassay kann ohne Einschränkung in einem heterogenen oder in einem homogenen Format vorliegen und von einem Standardtyp oder einem kompetitiven Typ sein. Bei einem heterogenen Format sind das Peptid oder der Anti-Idiotyp-Antikörper oder das Mikroprotein typischerweise an eine feste Matrix bzw. an einen festen Träger gebunden, um die Trennung der Probe von dem Peptid oder dem Anti-Idiotyp-Antikörper oder dem Mikroprotein nach der Inkubation zu vereinfachen. Beispiele geeigneter fester Träger sind Nitrocellulose (z. B. in Form einer Membran oder Mikrotitervertiefung), Polyvinylchlorid (z. B. in Blättern oder Mikrotitervertiefungen). Polystyrollatex (z. B. in Kügelchen oder Mikrotiterplatten), Polyvinylidenfluorid (bekannt als Immunolon^TM), diazotiertes Papier, Nylonmembranen, aktivierte Kügelchen und Protein-A-Kügelchen. Beispielsweise können Dynatech Immunolon^TM-1- oder Immunolon^TM-2-Mikrotiterplatten oder Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser von 0,25 Zoll (Precision Plastic Ball) im heterogenen Format verwendet werden. Der feste Träger, der die antigenen Peptide oder Anti-Idiotyp-Antikörper oder das Mikroprotein enthält, wird typischerweise gewaschen, nachdem er von der Testprobe getrennt wurde, sowie vor dem Nachweis gebundener Antikörper. Aus dem Stand der Technik sind sowohl Standardformate als auch kompetitive Formate bekannt.
In einem homogenen Format wird die Testprobe mit der Kombination von Antigenen in Lösung inkubiert. Beispielsweise kann dies unter Bedingungen ablaufen, unter denen etwaige gebildete Antigen-Antikörper- oder Anti-Idiotyp-Antikörper-Antikörper- oder Mikroprotein-Antikörper-Komplexe ausfallen. Aus dem Stand der Technik sind sowohl Standardformate als auch kompetitive Formate für diese Assays bekannt. Beispielsweise wird in einem Standardformat die Menge an SLE-Antikörpern in den Antikörper-Antigen-Komplexen zur Charakterisierung von SLE bzw. systemischem Lupus erythematodes direkt überwacht. Dies kann dadurch erreicht werden, indem bestimmt wird, ob ein zweiter Typ von markierten anti-xenogenen (z. B. anti-humanen) Antikörpern, welche ein Epitop auf dem ersten Typ von SLE-Antikörpern erkennen, aufgrund von Komplexbildung bindet. Bei einem kompetitiven Format wird die Menge an SLE-Antikörpern in der Probe abgeleitet, indem der kompetitive Effekt auf die Bindung einer bekannten Menge an markiertem Antikörper (oder einem anderen konkurrierenden Liganden) in dem Komplex überwacht wird. Die Feststellung von SLE-Antikörpern zur Diagnose von SLE wird als Veranschaulichung verwendet. Immer dann, wenn der Begriff „SLE-Antikörper" in dieser gesamten Beschreibung verwendet wird, ist dies nicht als Einschränkung zu verstehen. Entsprechend werden die anderen Autoimmunkrankheiten durch die Feststellung anderer Antikörper diagnostiziert, und Mononukleose wird durch die Feststellung von Anti-Epstein-Barr-Virus-Antikörpern diagnostiziert.
Gebildete Komplexe, die SLE-Antikörper aufweisen (oder im Fall von kompetitiven Assays die Menge an konkurrierendem Antikörper), werden, je nach dem Format, durch beliebige einer Reihe von bekannten Techniken festgestellt. Beispielsweise können unmarkierte SLE-Antikörper in dem Komplex mit einem Konjugat von anti-xenogenem Ig in Komplex mit einem Marker (z. B. einem Enzymmarker) festgestellt werden.
Bei einem Immunpräzipitations- oder Agglutinationsassayformat bildet die Reaktion zwischen den SLE-Antigenen und dem SLE-Antikörper ein Netzwerk, welches aus der Lösung oder Suspension ausfällt und eine sichtbare Schicht bzw. einen sichtbaren Film an Niederschlag bildet. Wenn in der Testprobe kein SLE-Antikörper vorhanden ist, bildet sich kein sichtbarer Niederschlag.
Derzeit gibt es drei spezifische Arten von Partikelagglutinations(PA)-Assays. Diese Assays werden zum Nachweis von Antikörpern gegen verschiedene Antigene verwendet, wenn diese an einen Träger beschichtet sind. Ein Typ dieses Assays ist der Hämagglutinationsassay unter Verwendung von roten Blutkörperchen (Erythrozyten), die sensibilisiert sind, indem Antigen (oder Antikörper) passiv an die Erythrozyten adsorbiert wird. Die Zugabe spezifischer Antigen-Antikörper, die ggf. in der Körperkomponente vorhanden sind, bewirkt, dass die mit dem gereinigten Antigen beschichteten Erythrozyten agglutinieren.
Zur Eliminierung möglicher unspezifischer Reaktionen in dem Hämagglutinationsassay können anstelle von Erythrozyten bei der PA zwei künstliche Träger verwendet werden. Die gängigsten davon sind Latexpartikel. Es können aber auch Gelatinepartikel verwendet werden. Die Assays, die einen dieser Träger verwenden, beruhen auf passiver Agglutination der mit gereinigten Antigenen beschichteten Partikel.
Die antigenen Peptide der vorliegenden Erfindung sind typischerweise in Form eines Kits zur Verwendung in diesen Immunassays verpackt. Der Kit enthält in der Regel in separaten Behältnissen das antigene Peptid bzw. den Anti-Idiotyp-Antikörper, Antikörperkontrollformulierungen (positiv und/oder negativ), markierten Antikörper, wenn das Testformat solche erfordert, sowie Signal erzeugende Reagenzien (z. B. Enzymsubstrat), wenn der Marker nicht direkt ein Signal erzeugt. Das antigene Peptid bzw. der Anti-Idiotyp-Antikörper können bereits an eine feste Matrix gebunden sein oder können separat mit Reagenzien vorliegen, um sie an die Matrix zu binden. Im Kit enthalten sind in der Regel Anleitungen (z. B. schriftlich, auf Band, CD-ROM, etc.) zur Durchführung des Assays.
Die ausgewählte Festphase kann Polymer- oder Glaskügelchen, Nitrozellulose, Mikropartikel, Mikrovertiefungen einer Reaktionsplatte, Teströhrchen und Magnetkügelchen aufweisen. Die Signal erzeugende Verbindung kann ein Enzym, eine lumineszente Verbindung, ein Chromogen, ein radioaktives Element und eine chemilumineszente Verbindung enthalten. Beispiele für Enzyme umfassen alkalische Peroxidase, Meerrettichperoxidase und Beta-Galaktosidase. Beispiele von Enhancer-Verbindungen umfassen Biotin, Anti-Biotin und Avidin. Beispiele von Bindungselementen von Enhancer-Verbindungen, umfassen Biotin, Anti-Biotin und Avidin. Zur Blockierung der Effekte von Rheumafaktorähnlichen Substanzen wird die Testprobe Bedingungen unterworfen, welche ausreichend sind, um den Effekt von Rheumafaktor-ähnlichen Substanzen zu blockieren. Diese Bedingungen umfassen das Inkontaktbringen der Testprobe mit einer Menge von beispielsweise Anti-Human-IgG zur Bildung eines Gemisches und Inkubieren des Gemisches eine Zeit lang und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um ein Reaktionsgemischprodukt zu bilden, das im Wesentlichen frei von Rheumafaktor-ähnlichen Substanzen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Immunassayformat, in dem mehrere Peptide der Erfindung in Form von parallelen reihen an eine Membran gekoppelt sind. Dieses Assayformat ist besonders vorteilhaft, um eine Unterscheidung zwischen den separaten Autoimmunkrankheiten zu ermöglichen. Die Antigene, die auf der Membran immobilisiert sind, sind vorzugsweise die methylierten und nichtmethylierten Formen von Poly(Arg-Gly), kombiniert mit nativem und daher methyliertem SmD1 und/oder SmD3 und/oder Sm69 und nichtmethylierten rekombinantem SmD1 und/oder SmD3 und/oder Sm69.
Legenden der Figuren
1: HPLC-Profil des Endo-Lys-Verdaus.
2: Immunodot von HPLC-Fraktionen mit 5 Patientenseren und 1 Kontrollserum.
3: Immunodot des C-terminalen Peptids (C-term mod) und ohne (C-term nicht mod) Dimethylarginin und des rekombinanten (Baculo SmD, coli SmD) und natürlichen Proteins (nativ). Die Streifen wurden mit einem Anti-SmDpositiven Serum (+) und einem Kontrollserum (–) inkubiert. Auf dem dritten Streifen wurde die Gesamtproteinfärbung (Aurodyne) durchgeführt.
4: LIA mit modifiziertem (Dimethylarginin) C-terminalem Peptid (Fraktion 15 des EndoLys-C-Verdaus, Reihe 1 auf dem Streifen) und nichtmodifiziertem C- terminalem Peptid (Fraktion 8 des EndoLys-C-Verdaus, Reihe 2 auf dem Streifen), beide in gleicher Menge aufgetragen (60 ng). Darüber hinaus wurden 7, 15 und 30 ng von rekombinantem SmD1 von Baculovirus- oder E. coli-infizierten Insektenzellen (respektive 4, 5, 6 und 7, 8, 9) sowie 15 und 30 ng eines Gemisches von gelgereinigtem SmD (nativ) auf die Streifen aufgetragen. Auf dem ersten Streifen wurde die Gesamtproteinfärbung (Aurodyne) durchgeführt. Die Streifen wurden mit (A) einer Reihe von Anti-SmDpositiven Seren, ausgewählt durch INNO-LIA ANA aus ANF-positiven Seren, (B) einer Reihe von Anti-SmD-positiven Seren, ausgewählt durch INNO-LIA ANA aus einer Kohorte von SLE-Patienten, die nach ACR-Kriterien diagnostiziert worden sind, (C) Seren, die aus MCTD-Patienten ausgewählt wurden (Kontrollseren), und (D) Seren, die aus ANF-negativen Seren ausgewählt worden sind (Kontrollseren) inkubiert. Mit den Kontrollseren wurde keine Reaktivität beobachtet.
BEISPIELE
Beispiel 1. Seren
Sm-positive Seren wurden aus der Rheumatologischen Abteilung der Universitätsklinik in Ghent, Belgien erhalten ((Dr. De Keyser und Dr. Veys). Diese Seren wurde durch Mikrogeldiffusionsblotting (MDB) mit Kaninchenthymusextrakt (Zeus, Bayer, Raritan, USA) als Substrat identifiziert (De Keyser et al., 1990). Sm-Positivität war definiert durch eine positive Immunreaktion an derselben Molekulargewichtsposition (etwa 14 kDa) wie mit dem α-SmD-Referenzserum.
Beispiel 2. Isolierung von nativem SmD
Die snRNP-Partikel werden aus HeLa-Kernextrakten durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt (R. Lührmann. Marburg, Deutschland).
Die snRNP-Partikel werden aufgenommen in 20 mM Hepes/KOH, pH 7,9–250 á 420 mM NaCl – 5 % Glycerin – 1,5M MgCl₂ – 0,2 mM EDTA – 0,5 mM DTE – 0,5 mM PMSF. SmD wird aus diesen Partikeln wie von Lehmeier at al. (1990) beschrieben mit einigen Modifikationen isoliert. In Kürze werden die snRNP in einem ersten Schritt in einem Centricon-Konzentrator (30K centripep, Amicon) auf ein Endvolumen von 5–10 mg/ml eingeengt. Anschließend werden die snRNPs in Laemmli-Probenpuffer aufgelöst, in einem präparativen 15%igen Laemmli-Gel (1 cm dick, 14-cm-Tasche; Proteinbeladung 3 mg) aufgetrennt und mit Coomassie-Brillantblau gefärbt.
Die 14-kDa-Bande von SmD (enthaltend SmD1, SmD2 und SmD3) wird aus dem Gel ausgeschnitten, in Wasser gespült und in 1-mm³-Würfel geschnitten. Die Proteine werden in dem BioRad-Apparat nach den Anweisungen des Herstellers aus dem Polyacrylamidgel eluiert. SDS- und Coomassie-BB-Reste werden aus den elektroeluierten Proteinen durch Ionenpaarextraktion (Präzipitation des getrockneten Proteins mit Aceton/Essigsäure/Triethylamin/Wasser im Verhältnis von 85/5/5/5) entfernt. Das Pellet wird in 6M Harnstoff, 0,1 M Essigsäure (Eisessig) gelöst und sofort mit 1,5 M Tris-HCl neutralisiert.
Die Proteinkonzentration wird mit dem MicroBCA-Verfahren (Pierce, USA) ermittelt, es wird eine durchschnittliche Ausbeute von 80 μg SmD/mg snRNP erhalten.
Beispiel 3. Expression von SmD1 als kurze mTNF-Fusion in E. coli und Reinigung des Fusionsproteins.
Die SmD1-Codierungssequenz (357 bp) wurde unter Verwendung von pfu-Polymerase aus einem cDNA-Klon isoliert, der von Organon Technika als 367-bp-PCR-Fragment erworben wurde (Tm: 55°C). Dieses PCR-Fragment wurde mir BamHI und XbaI geschnitten und in den mit BamHI/XbaI geschnittenen Expressionsvektor pIGFH111 eingesetzt. Dieser Expressionsvektor wurde in den E. coli-Expressionsstamm SG4044(pcI857) transformiert. Induktion dieser Vektor/Stamm-Kombination bei 37°C zeigte ein starkes Signal von ± 18 kDa auf CBB-gefärbten Gelen und im Western Blot. Bei der Lokalisierungsanalyse ergab sich, dass das Protein in der löslichen Fraktion vorhanden war. Es konnte kein wesentlicher proteolytischer Abbau beobachtet werden. Bakterienzellen aus einer Drei-Liter-Kultur wurden in Lysepuffer (10 mM Tris – 100 mM KCl pH 6,8) bis zum Dreifachen der Menge an Nasszellen suspendiert. Vor der Lyse mit einer French-Press wurden -Aminocapronsäure, DTT und PMSF bis zu einer Endkonzentration von respektive 25 mM, 1 mM und 2 mM zugegeben. Die Zellsuspension wurde zweimal durch die French-Press getrieben, und der Druck wurde bei 14.000 psi gehalten. Vor dem Zentrifugieren wurde das Lysat mit Lysepuffer verdünnt (auf das Fünffache des Zell-Feuchtgewichtes) und 20 Minuten bei 27.000 g bei 4°C zentrifugiert. Dem Überstand wurde Guanidin-HCl auf eine Endkonzentration von 4,5 M zugegeben. Das rekombinante Fusionsprotein, welches einen His-Marker enthält, wurde in einem Schritt durch Metallaffinitätschromatographie (Ni-IMAC-Sepharose) gereinigt. Die Chromatographie wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Säule wurde mit 1 Säulenvolumen NiCl₂ (5 mg/ml) beschickt, mit Wasser gewaschen und mit Puffer A äquilibriert (6 M Guanidin-HCl, 0,1 M Natriumphosphat, 0,05 TritonX100, pH 6,5). Die Proteine wurden auf Ni²⁺-Chelat-bildende Sepharose (Pharmacia, Schweden; etwa 18 mg Protein/ml Gel) geladen und die Säule wurde mit 4 Säulenbettvolumen Puffer A gewaschen. SmD1 wurde mit einem linearen Gradienten von Puffer B (6 M Guanidin-HCl, 0,1 M Natriumphosphat, 0,05 % TritonX100, pH 3,5) eluiert, und das Protein eluierte zwischen 70 % und 90 % Puffer B.
Beispiel 4. Expression von SmD1 als kurze mTNF-Fusion in dem Baculovirussystem und Reinigung des Fusionsproteins.
Das cDNA-Gen, das für das mTNF-His6-hSmD-Fusionsprotein codiert, wurde aus dem bakteriellen Expressionsplasmid pIGFH111hSmD (siehe Beispiel 3) als ein 520-bp-DraI-XbaI-Fragment isoliert und in das mit BamHI (aufgefüllt)-XbaI geöffnete Baculo-Transferplasmid pVL1393 eingesetzt, wodurch das rekombinante Transferplasmid pVLTNFH6hSmD entstand (siehe 2). Das Fusionsgen steht hier unter der transkriptionellen Kontrolle des starken Polyhedrinpromotors von Baculovirus. Der pVmTNFH6hSmD1-Baculo-Transfervektor wurde verwendet, um rekombinantes mTNF-His6-hSmD1-Baculovirus nach dem Baculogold-Transfektionsansatz (Pharmingen, San Diego, USA) zu erzeugen. Infektion von Spodoptera frugiperda-Zellen (Sf9) mit dem rekombinanten Virus führte zu der Expression eines 18-kDa-Proteins, das von einem für SmD spezifischen monoklonalen Antikörper (Progen, Heidelberg, Deutschland, Daten nicht gezeigt) im Western Blot erkannt wurde. Eine Verwendung des Zelllysats zum Testen der Spezifität verschiedener Humanseren war nicht möglich, da eine hohe Hintergrundreaktion der Humanseren mit Baculovirusproteinen eine mögliche spezifische SmD-Erkennung maskierte. Das SmD-Fusionsprotein wurde daher durch Ni-IMAC-Reinigung wie oben beschrieben gereinigt, wobei eine Anpassung durchgeführt wurde: Nach der French-Press wurde das Zelllysat ausgefällt und erneut in Puffer A gelöst (siehe Beispiel 3).
Beispiel 5. Sequenz und Massenanalyse von natürlichem SmD1 aus E. coli und von baculoviralem SmD1.
Aus HeLa-Kernextrakten eluiertes natürliches SmD, immobiliert auf einer PVDF-Membran in einer ProSpin-Vorrichtung (Perkin Elmer, Kalifornien, USA) wurde einem EndoLys-C-Verdau unterzogen, um ausführliche Sequenzdaten interner Peptide zu erhalten. Die Membran wurde mit 100 mM Tris pH 8,2, 1 % hydrogeniertem TritonX100, 1 mM K₃-EDTA, 10% Acetonitril und 0,5 μg Enzym inkubiert. Der Verdau wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt. Das Peptidgemisch wurde auf einer C4- Vydac-HPLC-Säule (mit einem Gradienten von 10–70 Lösungsmittel B: 70 % Acetonitril/0,1 % TFA) und einer Flussrate von 0,2 ml/Min. aufgetrennt. Die eluierten Peptidspitzen wurden manuell aufgefangen. Im C-terminalen 25-mer-Peptid von SmD1 wurden neun Dimethylargininreste sequenziert, nur die letzten beiden Arginine waren nicht modifiziert. Die Position von N^G,N^G-Dimethylarginin im Sequenzchromatogramm wurde bestätigt, indem die reine modifizierte Aminosäure (Sigma, St. Louis, USA) als Standard aufgetragen wurde. Diese Modifikation fehlte in rekombinantem SmD1 von E. coli (wie sich im Verlauf der Sequenzierung von Peptiden zeigte, die durch Endo-GluC erzeugt wurden), was den Schluss zulässt, dass die Modifikation als Resultat der Einwirkung der Methyltransferase in E. coli nicht stattfindet.
Diese Schlussfolgerung wurde durch Massenanalyse von rekombinantem SmD1 aus E. coli bestätigt. Dieses Protein, das bei Umkehrphasenchromatographie in einer einzelnen Spitze eluiert, wurde durch Elektrospray auf einem Bio-Q-Quadrupol-Massenspektrometer, ausgestattet mit einer Elektrospray-Ionenquelle (Fisons), analysiert. Es wurden zehn μl der Probenlösung, enthaltend 20 pmol in 50% Acetonitril – 1 % Essigsäure analysiert. Die Kalibrierung der Scans erfolgte mit 50 pmol Pferdeherzmyoglobin. Die Probe enthielt 3 Massen: 17.435 Da, 17.305 Da, und 16.992 Da, welche respektive dem Protein in gesamter Länge, dem Protein ohne dem N-terminalen Methionin und dem Protein ohne das N-terminale Met und das C-terminale Arg-Arg entsprachen. Aus diesen Ergebnissen kann der Schluss gezogen werden, dass es sich bei dem gereinigten rekombinanten SmD1 von E. coli um das intakte nicht modifizierte Molekül handelt und dass die fehlende spezifische Immunreaktivität des rekombinanten SmD1 nicht auf den Verlust des C-Terminus zurückzuführen ist.
Massenanalyse von rekombinanten Baculovirus-SmD1 zeigte ein heterogenes Ergebnis: eine der größten Massenspitzen (17.297 Da) konnte dem nicht modifizierten Protein ohne N-terminales Methionin zugewiesen werden, während in den kleineren Spitzenmassen 17.629 und 17.711 vorläufig dem Vorhandensein von 7 bzw. 10 Dimethylargininen zugeschrieben werden konnten.
Beispiel 6. Epitopkartierung von Baculo-SmD1
Baculo-SmD1-Fusionsprotein wurde wie folgt mit EndoGlu-C verdaut: 300 μg TCA-ausgefälltes Protein wurden in 50 μl 100 mM NH₄-Acetatpuffer pH 4,3 gelöst. Das EndoGlu-C-Enzym (Boehringer, Mannheim, Deutschland) wurde in einem Verhältnis von 1/100 zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 26°C inkubiert. Der Verdau wurde anschließend vakuumgetrocknet (SpeedVac), erneut in 0,1% TFA – 20% Essigsäure aufgelöst, und die Peptide wurde auf einer Umkehrphasen-HPLC-Säule (C₄-Vydac) aufgetrennt. Die Peptidspitzen wurden manuell aufgefangen. Ein ähnlicher Ansatz wurde für den EndoLys-C (Boehringer, Mannheim, Deutschland)-Verdau von Baculo-SmD1 mit den folgenden Modifikationen verfolgt: Das Protein wird in 50 μl 100 mM Tris-HCl, pH 8, 10 % Acetonitril, 10 mM K₃EDTA gelöst, und das Enzym wird in einem Verhältnis von 1/120 zugegeben.
Die HPLC-Fraktionen wurden vakuumgetrocknet und in 10 Acetonitril, 50 mM Carbonatpuffer pH 9,6 gelöst. Von jeder Fraktion wurden 2 μl auf eine ABC-Nylonmembran (Pall, NY, USA) aufgetupft. Nach dem Auftupfen wurde die Membran 1 Stunde in 0, 5 % Casein in PBS blockiert, dem 0,1 % 0,25 Glycin zugegeben wurde. Anschließend wurden die Membranen über Nacht mit Serum (1/100) in 0,5 % Casein in PBS ergänzt mit Triton X705 und 2,03 g/l MgCl₂·6H₂O inkubiert. Die Membranen wurden 3 Mal 3 Minuten lang in PBS, 0,05 % Tween20 gewaschen und mit Anti-Human-IgG (1/8000), konjugiert mit alkalischer Phosphatase, inkubiert. Die Immunreaktion wurde durch Zugabe von NBT/BCIP in einer Verdünnung von 1/500 sichtbar gemacht.
Die mit EndoGlu-C erhaltenen Fraktionen wurden mit einem positiven Serum und einem Kontrollserum inkubiert. Bei Fraktion 17 ergab sich eine starke Immunreaktion. Die Sequenzierung von Fraktion 15 ergab, dass diese Fraktion das C-terminale Peptid enthielt, in dem das RG-Motiv dimethyliert ist. Massenanalyse von Fraktion 8 zeigte, dass diese Fraktion das C-terminale Peptid ohne die modifizierten Arginine enthielt. Analyse der Fraktionen zwischen 8 und 17 zeigte an, dass diese Fraktionen das C-terminale Peptid enthielten, bei dem die 5 letzten RG-Motive dimethyliert sind und die ersten 4 RG-Motive partiell monomethyliert sind. Dies kann aus einem Masseunterschied von 14 zwischen den Fraktionen geschlossen werden.
Die mit EndoLys-C erhaltenen Fraktionen (1) wurden separat mit 6 positiven Seren und einem Kontrollserum inkubiert. In 5 von 6 positiven Seren war ein erheblich höheres Signal als im Kontrollserum auf Fraktion 15 beschränkt, welches sowohl durch Sequenzierung als auch durch Massenanalyse als das C-terminale Peptid mit Dimethylargininen identifiziert wurde. Auch hier wies die Massenanalyse darauf hin, dass die Fraktionen 8 bis 14 den nichtmethylierten und weniger methylierten Formen des C-terminalen Peptids entsprechen.
Diese Ergebnisse wurden bestätigt, indem das nichtmodifizierte und das modifizierte Peptid aus einem präparativen EndoLys-C-Verdau von Baculo-SmD1 selektiv isoliert wurden. In 1 ist ersichtlich, dass Fraktion 8 mit dem nichtmodifizierten SmD1-Peptid weniger Material als Fraktion 15 mit dem dimethylierten Peptid enthielt. Es ist daher möglich, dass die ausschließliche Reaktivität des modifizierten Peptids darauf zurückzuführen war, dass im Dot-Blot-Experiment (2) verschiedene Mengen an modifizierten und nichtmodifizierten Peptiden übertragen worden sind. Zum Ausschluss solcher quantitativen Schwankungen wurden die Peptide in einem Dot-Spot-Experiment wie beschrieben analysiert. In diesem Experiment wurden jedoch gleiche Mengen (ausgehend von der BCA-Proteinbestimmung) beider Peptide, modifizierte und nichtmodifizierte Peptide, aufgetragen. Zur Durchführung des Vergleichs wurden das vollständige natürliche SmD, das vollständige rekombinante E. coli- und Baculovirus-SmD1 in vergleichbaren Mengen auf den Immunodot aufgetragen (3). Schließlich wurden Peptide in einem Reihen-Immunassay-Experiment aufgetragen (Polet et al., Clinical Chemistry, 37, 1991) (4). Auch hier wurden auf eine Nylonmembran gleiche Mengen (60 ng) modifizierter und nichtmodifizierter SmD1-Peptide aufgetragen. Die Menge an gebundenem Peptid wurde durch Proteinkolloidalfärbung sichtbar gemacht (Aurodye, Amersham, Buckinghamshire, GB; 4). Darüber hinaus wurden auf die Streifen 30, 15 und 7 ng von rekombinantem SmD1 von E. coli- oder Baculovirusinfizierten Insektenzellen sowie eine Mischung aus gelgereinigtem SmD1, SmD2 und SmD3 aufgetragen. Diese wurden mit 12 Anti-Sm-Patientenseren getestet, die gegen eine Mischung aus HeLa-SmD1, -SmD2 und -SmD3 immunreaktiv waren. Sechs (29 %) dieser Anti-Sm-Patientenseren ergaben mit dem modifizierten Peptid D1 signifikante Signale, während die nichtmodifizierten Peptide mit keinem der 21 getesteten Seren reagierten. Ein unabhängiger Satz von brasilianischen Anti-Sm-Seren (n = 93) zeigte die gleiche Reaktivitätsrate mit dem modifizierten Peptid (4/14 Anti-Sm-Seren; 29 %). Diese Experimente untermauern unsere Hypothese, dass es mindestens 2 Epitope gibt, die an der Immunreaktivität von natürlichem SmD beteiligt sind: ein Epitop befindet sich in dem vollständigen rekombinanten E. coli-SmD-Molekül, während sich ein weiteres Epitop im C-Terminus (90–119) des SmD1-Moleküls befindet. Das Vorhandensein von Dimethylargininen in diesem Peptid ist entscheidend für die Erkennung durch Patientenseren.
Bezugsverweise

Andersen, J., Feeney, R.J, and Zieve, G.W. 1990. Identification and characterization of the small nuclear ribonucleoprotein particle D' core protein. Mol. Cell. Biol. 10, 4480–4485
Barakat, S., Briand, J.-P., Weber, J.-C., Van Regenmortel, M.H.V. and Muller, S. 1990. Recognition of synthetic peptides of Sm-D autoantigen by lupus sera. Clin. exp. Immunol. 81, 256–262
De Keyser, F.G., Verbruggen, G., Veys, E.M., Nimmegeers, J., Schatteman, L., Goethals, K., Vandenbossche, M. 1990. "Microgel Diffusionblotting" for sensitive detection of antibodies to extractable nuclear antigens. Clin. Chem. 36, 337–339
Gheuens, J., MacFarlin, D. 1982. Use of monoclonal anti-idiotypic antibody to P3X63Ag8 myeloma protein for analysis and purification of B lymphocyte hybridoma products. Eur. J. Immunol. 12, 701–703
Hoch, S.O. 1989. Application of protein blotting in the study of autoimmunedisease In Manual of Biological Markers of Disease B2.4:1-29, Kluwer Netherlands
Weiner, H.L. 1997. Oral tolerance for the treatment of autoimmune diseases. Annu. Rev. Med. 48, 341–351
James, J.A., Mamula, M.J. and Harley, J.B. 1994. Sequential autoantigenic determinants of the small nuclear ribonucleoprotein Sm D shared by human lupus autoantibodies and MRL Ipr/Ipr antibodies. Clin. Exp. Immunol. 98, 419–426
Lehmeier, T., Foulaki, K. And Lührman, R. 1990. Evidence for three distinct D proteins, which react differentially with anti-Sm autoantibodies, in the cores of the major snRNPs U1, U2, U4/U6 and U5. Nucleic Acids Res 18, 6475–6484
Najbauer, J., Johnson, B.A., Young, A.L. and Aswad, D.W. 1993. Peptides with sequences similar to glycine arginine rich motifs in proteins interacting with RNA are efficiently recognized by methyltransferases modifying arginine in numerous proteins. J. Biol. Chem. 268, 10501–10509
Rajpurohit, R., Lee, S.O., Paik, J.O., Paik, W.K. and Kim, S. 1994. Enzymatic methylation of recombinant heterogeneous nuclear RNP protein Al. J. Biol. Chem. 269, 1075–1082
Rawal, N., Rajpurohit, R., Lischwe, M.A., Williams, K.,R;, Paik, W., K., Kim, S. 1995. Structural specificity of substrate for S-Adenosylmethionine:protein arginine N-methyltransferases. Biochem. Biophys. Acta, 1248, 11–18
Rivkin. E., Vella, M.J. and Lahita, R.G. 1994. A heterogeneous immune response to an Sm-D-like epitope by SLE patients. J. Autoimmun. 7, 119–132
Rokeach, L.A., Haselby, J.A and Hoch, S.O. 1988. Molecular cloning of a cDNA encoding the human Sm-D autoantigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4832–4836
Rokeach, L.A., Haselby, J.A. and Hoch, S.O. 1992a. Overproduction of a human OsnRNP)-associated Sm-D autoantigen in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Gene 118, 247–253
Rokeach, L.A., Jannatipour, M., Haselby, J.A. and Hoch, S.O. 1992b. Mapping of the immunoreactive domains of a small nuclear ribonucleiprotein-associated Sm-D autoantigen. Clin. Immunol. Immunopath. 35, 315–324
Sabbatini, A., Dolcher, M.P., Marchini, B., Sombardieri, S. And Migliorini, P. 1993a. Mapping of epitopes an the SmD molecule: the use of multiple antigen poepotides to measure autoantibodies in systemlic lupus erythematosus. J. Rheumatol. 20, 1679–1683
Sabbatini, A., Bombardieri., S. And Migliorini, P. 1993b. Autoantibodies from patients with systemic lupus erythematosus bind a shared sequence of SmD and Epstein-Barr virus-encoded nuclear antigen EBNA t. Eur. J. Immunol. 23, 1146–1152
Van Venrooij, W.J., P. Charles and R.N. Maini 1991. The conscensus workshops for the detection of auto antibodies to intrzcellular antigens in rheumatic diseases. J. Immunol. Methods, 140, 181–189
Wagatsuma, M., Asami, N., Miyachi, J., Uchida, S., Watanabe, H. and Amann, E. 1993. Antibody recognition of the recombinant human nuclear antigens RNP 70 kD, Sm-A, Sm-B and Sm-D by autoimmune sera. Mol. Immunol. 30, 1491–1498 SEQUENZLISTE

Claims

Peptid mit weniger als 50 Aminosäuren, umfassend wenigstens ein Dimer vom Typ XG, wobei X für einen an der N-Guanidinogruppe der Seitenkette ein- oder zweifach methylierten Argininrest steht, wobei das Peptid in der Lage ist, spezifisch mit für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörpern zu reagieren, wobei die Methylierung für die Reaktion zwischen dem Peptid und dem Antikörper dahingehend entscheidend ist, daß ein Peptid, dem eine derartige Modifikation fehlt, eine Dissoziationskonstante für die Wechselwirkung mit einem für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörper aufweist, die wenigstens hundertmal höher als die eines methylierten Peptids mit der gleichen Primärsequenz ist, und das Peptid nicht ausgewählt ist aus der Gruppe: (i) GKGXLL, GXGXGXG, SSSQXG oder GNFGGGXGGGFGG und X N^G-monomethyliert oder N^G-N^G-dimethyliert ist; oder (ii) GXGL, GKGXGL, GKGXHL, GKGXFL, GDGXGL oder cyclisches CGKGXGLC und X N^G-monomethyliert ist.
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz GXGXGXGXGXGXGXGXGXG (SEQ ID NO 1) oder AXGXGXGMGXG (SEQ ID NO 2) oder KAQVAAXGXGXGMGXGN (SEQ ID NO 3) oder DVEPKVKSKKREAVAGXGXGXGXGXGXGXGXGXGGPRR (SEQ ID NO 4) oder DNHGXGXGXGXGXGGG (SEQ ID NO 5) oder GGXGXGGSGGXGXGG (SEQ ID NO 6) oder ERAXGXGXGXGE (SEQ ID NO 7) oder GGQQDXGGXGXGGGGGYNXSSGGYEPXGXGGGXGGXGGMGGSDXGG (SEQ ID NO 8) oder GGQQDXGGXGXGGGGGYN (SEQ ID NO 9) oder SGGYEPXGXGGGXGGXGGMGGSDXGG (SEQ ID NO 10) oder DFNXGGGNGXGGXGXGG (SEQ ID NO 11) oder DFNXGGGNGXGGXGXGGPMGXGGYGGGGS (SEQ ID NO 12) oder GDDXXGXGGYDXGGYXGXGGDXGGFXGGXGGGDXGGFG(SEQ ID NO 13) oder GDDXXGXGGYDXGG (SEQ ID NO 14) oder GGYXGXGGDXGGFXGGXGGGDXGGFG(SEQ ID NO 15).
Peptid und/oder chemische Struktur, umfassend eines der Peptide nach Anspruch 1 oder 2, fusioniert an ein Linker-Molekül.
Zirkularisiertes Peptid, das wenigstens eines der Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.
Peptid, umfassend und/oder bestehend aus Tandem-Wiederholungen von wenigstens zwei beliebigen Peptiden der Ansprüche 1 bis 4.
Verzweigtes Peptid, das wenigstens eines der Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansrüche 1 bis 6, wobei die primäre Aminosäuresequenz durch klassische chemische Synthese hergestellt wird und wobei die vor Glycinresten liegenden Argininreste anschließend methyliert werden, indem man das Peptid mit einer Protein-Arginin-Methyltransferase in Kontakt bringt.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids mit weniger als 50 Aminosäuren, umfassend wenigstens ein Dimer vom Typ XG, wobei X für einen an der N-Guanidinogruppe der Seitenkette ein- oder zweifach methylierten Argininrest steht, wobei das Peptid in der Lage ist, spezifisch mit für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörpern zu reagieren, wobei die Methylierung für die Reaktion zwischen dem Peptid und dem Antikörper dahingehend entscheidend ist, daß ein Peptid, dem eine derartige Modifikation fehlt, eine Dissoziationskonstante für die Wechselwirkung mit einem für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörper aufweist, die wenigstens hundertmal höher als die eines methylierten Peptids mit der gleichen Primärsequenz ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid durch klassische chemische Synthese hergestellt wird und ein nichtmethylierter Argininrest während der chemischen Synthese durch das methylierte Arginin ersetzt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids mit weniger als 50 Aminosäuren, umfassend wenigstens ein Dimer vom Typ XG, wobei X für einen an der N-Guanidinogruppe der Seitenkette ein- oder zweifach methylierten Argininrest steht, wobei das Peptid in der Lage ist, spezifisch mit für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörpern zu reagieren, wobei die Methylierung für die Reaktion zwischen dem Peptid und dem Antikörper dahingehend entscheidend ist, daß ein Peptid, dem eine derartige Modifikation fehlt, eine Dissoziationskonstante für die Wechselwirkung mit einem für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörper aufweist, die wenigstens hundertmal höher als die eines methylierten Peptids mit der gleichen Primärsequenz ist, wobei man in dem Verfahren die folgenden Schritte durchführt: – Transformieren einer eukaryontischen Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor, in dem eine die für das Peptid codierende Sequenz unter der Kontrolle der entsprechenden Regulationselemente umfassende Polynukleinsäure inseriert ist, so daß das Peptid oder ein das Peptid umfassendes Protein exprimiert und/oder sezerniert wird, – Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des Proteins oder Peptids sowie eine teilweise oder optimale Methylierung der in dem Peptid vorhandenen Arginine gestatten, – Ernten des Peptids.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids mit weniger als 50 Aminosäuren, umfassend wenigstens ein Dimer vom Typ XG, wobei X für einen an der N-Guanidinogruppe der Seitenkette ein- oder zweifach methylierten Argininrest steht, wobei das Peptid in der Lage ist, spezifisch mit für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörpern zu reagieren, wobei die Methylierung für die Reaktion zwischen dem Peptid und dem Antikörper dahingehend entscheidend ist, daß ein Peptid, dem eine derartige Modifikation fehlt, eine Dissoziationskonstante für die Wechselwirkung mit einem für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörper aufweist, die wenigstens hundertmal höher als die eines methylierten Peptids mit der gleichen Primärsequenz ist, wobei man in dem Verfahren die folgenden Schritte durchführt: – Transformieren einer eukaryontischen Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor, in dem eine die für das Peptid codierende Sequenz unter der Kontrolle der entsprechenden Regulationselemente umfassende Polynukleinsäure inseriert ist, so daß das Peptid oder ein das Peptid umfassendes Protein exprimiert und/oder sezerniert wird, – Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des Proteins oder des Peptids gestatten, – Ernten des Proteins oder des Peptids, – Methylieren von Argininresten des Proteins oder des Peptids durch Inkontaktbringen mit einer Protein-Arginin-Methyltransferase.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, wobei es sich bei der Wirtszelle um Hefe oder eine beliebige andere eukaryontische Wirtszelle handelt, die vorzugsweise mit einem rekombinanten Baculovirus transformiert wird.
Antikörper, erzeugt bei der Immunisierung mit einem Peptid mit weniger als 50 Aminosäuren, umfassend wenigstens ein Dimer vom Typ XG, wobei X für einen an der N-Guanidinogruppe der Seitenkette ein- oder zweifach methylierten Argininrest steht, wobei das Peptid in der Lage ist, spezifisch mit für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörpern zu reagieren, wobei die Methylierung für die Reaktion zwischen dem Peptid und dem Antikörper dahingehend entscheidend ist, daß ein Peptid, dem eine derartige Modifikation fehlt, eine Dissoziationskonstante für die Wechselwirkung mit einem für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörper aufweist, die wenigstens hundertmal höher als die eines methylierten Peptids mit der gleichen Primärsequenz ist, wobei der Antikörper spezifisch mit den methylierten Formen des Peptids reaktiv ist.
Antikörper nach Anspruch 12, wobei es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Anti-Idiotyp-Antikörper, erzeugt bei der Immunisierung mit einem Antikörper nach Anspruch 12, wobei der Anti-Idiotyp-Antikörper spezifisch mit dem Antikörper nach Anspruch 12 reaktiv ist und dadurch das methylierte Peptid imitiert.
Anti-Idiotyp-Antikörper nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Immuntoxinmolekül, umfassend ein und/oder bestehend aus einem Zellerkennungsmolekül, bei dem es sich um – ein Peptid mit weniger als 50 Aminosäuren, umfassend wenigstens ein Dimer vom Typ XG, wobei X für einen an der N-Guanidinogruppe der Seitenkette ein- oder zweifach methylierten Argininrest steht, wobei das Peptid in der Lage ist, spezifisch mit für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörpern zu reagieren, wobei die Methylierung für die Reaktion zwischen dem Peptid und dem Antikörper dahingehend entscheidend ist, daß ein Peptid, dem eine derartige Modifikation fehlt, eine Dissoziationskonstante für die Wechselwirkung mit einem für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörper aufweist, die wenigstens hundertmal höher als die eines methylierten Peptids mit der gleichen Primärsequenz ist, oder um – einen Antikörper nach einem der Ansprüche 12 oder 13 oder um – einen Anti-Idiotyp-Antikörper nach Anspruch 14 oder 15 handelt, wobei das Zellerkennungsmolekül kovalent an ein Toxinmolekül oder ein aktives Fragment davon gebunden ist.
Verwendung – eines Peptids mit weniger als 50 Aminosäuren, umfassend wenigstens ein Dimer vom Typ XG, wobei X für einen an der N-Guanidinogruppe der Seitenkette ein- oder zweifach methylierten Argininrest steht, wobei das Peptid in der Lage ist, spezifisch mit für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörpern zu reagieren, wobei die Methylierung für die Reaktion zwischen dem Peptid und dem Antikörper dahingehend entscheidend ist, daß ein Peptid, dem eine derartige Modifikation fehlt, eine Dissoziationskonstante für die Wechselwirkung mit einem für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörper aufweist, die wenigstens hundertmal höher als die eines methylierten Peptids mit der gleichen Primärsequenz ist, oder – eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 12 oder 13 oder – eines Anti-Idiotyp-Antikörpers nach Anspruch 14 oder 15, oder einer Zusammensetzung davon zur Herstellung eines diagnostischen Kits zum Nachweis von systemischem Lupus erythematodes.
Diagnostischer Kit zum Nachweis von systemischem Lupus erythematodes, wobei der Kit – wenigstens ein Peptid mit weniger als 50 Aminosäuren, umfassend wenigstens ein Dimer vom Typ XG, wobei X für einen an der N-Guanidinogruppe der Seitenkette ein- oder zweifach methylierten Argininrest steht, wobei das Peptid in der Lage ist, spezifisch mit für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörpern zu reagieren, wobei die Methylierung für die Reaktion zwischen dem Peptid und dem Antikörper dahingehend entscheidend ist, daß ein Peptid, dem eine derartige Modifikation fehlt, eine Dissoziationskonstante für die Wechselwirkung mit einem für systemischen Lupus erythematodes spezifischen Antikörper aufweist, die wenigstens hundertmal höher als die eines methylierten Peptids mit der gleichen Primärsequenz ist, oder – einen Antikörper nach einem der Ansprüche 12 oder 13 oder – einen Anti-Idiotyp-Antikörper nach Anspruch 14 oder 15 umfaßt.
Diagnostischer Kit nach Anspruch 18, wobei das Peptid oder der Antikörper an einem festen Träger gebunden ist.
Diagnostischer Kit nach Anspruch 19, wobei der Kit eine Bandbreite der Peptide oder der Antikörper, gegebenenfalls in Kombination mit nativem methyliertem SmD1 oder SmD3 und rekombinantem nichtmethyliertem SmD1 oder SmD3, umfaßt, wobei die Peptide an spezifischen Orten auf einem festen Substrat gebunden sind.
Diagnostischer Kit nach Anspruch 20, wobei es sich bei dem festen Träger um einen Membranstreifen handelt und die Polypeptide oder Antikörper an die Membran in Form paralleler Reihen gekoppelt sind.
Diagnostischer Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei bestimmte Peptide nicht an einem festen Träger gebunden sind, sondern in der Bindungslösung zur Verwendung als Kompetitoren und/oder zur Blockierung anderer Antikörper, die in Seren aus Patienten mit einer von SLE verschiedenen Autoimmunkrankheit vorhanden sind, bereitgestellt werden, wodurch eine mögliche Kreuzreaktion und/oder aspezifische Bindung reduziert oder beseitigt wird.