DE69629812T2

DE69629812T2 - Impfstoff gegen rotavirus infektionen enthaltend peptide des viralenterotoxines nsp4

Info

Publication number: DE69629812T2
Application number: DE69629812T
Authority: DE
Inventors: K. Mary ESTES; Judith Ball; Peng Tiang
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1995-06-14
Filing date: 1996-06-14
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2016-06-15
Also published as: CA2224697A1; WO1997000088A3; JPH11507831A; EP0833670B1; WO1997000088A2; DE69629812D1; EP0833670A2; ATE248601T1; US6210682B1; AU6387196A

Description

Allgemeiner Stand der Technik
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft virales Enterotoxin NSP4 und Vakzine bzw. Impfstoffefür die Immunisierung gegen eine Rotavirusinfektion oder -erkrankung, um das gehemmte Wachstum bei Tieren und Kindern zu verhindern, das durch eine Rotavirusinfektion hervorgerufen wird.
2. Zugehörige Technologie
Rotaviren führen bei Kindern und Tieren (1) zu einer schweren lebensbedrohlichen viralen Gastroenteritis und sind mit sporadischen Ausbrüchen von Diarrhoe bei älteren (2) und immunvermittelten Patienten (3) verbunden. Diese Viren weisen einen begrenzten Gewebetropismus auf, wobei die Infektion primär auf Zellen des Dünndarms begrenzt ist (4). Rotavirusinfektionen können auch bei vielen Tierspezies zur Morbidität und Mortalität führen. Der Ausbruch. Der Infektion hängt außerdem vom Alter ab; obwohl viele Rotaviren Personen und Tiere jeden Alters infizieren können, kommt es bei Jüngeren (6 Monate bis 2 Jahre bei Kindern und bis zu 14 Tagen bei Mäusen) und Älteren zu einer symptomatischen Infektion.
Es wurde vorgeschlagen, daß die mit dem Alter in Zusammenhang stehenden Wirtsfaktoren, die den Ausbruch der Infektion beeinflussen können, folgende einschließen: 1) Unterschiede beim Vorhandensein/der Menge von virusbindenden Rezeptoren auf reifen Epithelzellen des Villus, 2) Virusstämme mit einem bestimmten Protein eines Stachels (VP4), 3) die passive Immunität, die durch einen mütterlichen Antikörper oder im Kolostrum erzielt wird, und 4) geringere Werte von Proteasen bei den Jüngeren.
Die bei Mäusen durch eine Rotavirusinfektion ausgelöste Erkrankung wurde extensiver untersucht als bei anderen Spezies, und von der Altersbeschränkung der Krankheit haben verschiedene Forscher berichtet (5). Nur Mäuse mit einem Alter von weniger als 14 Tagen bilden nach der oralen Impfung mit einem reifen Rotavirus eine Diarrhoe aus, und der Höchstwert des Alters, bei dem es bei den Tieren höchstwahrscheinlich zu einer Diarrhoe kommt (6 bis 11 Tage) entspricht dem Alter, bei dem der Rotavirus Enterocyten der Maus binden kann (6). Die Behandlung von 8 Tage alten Mäusen mit Cortisonacetat, das die vorzeitige Reifung von intestinalen Epithelzellen fördert, führt zu einer geringeren Empfindlichkeit für die von einem Rotavirus ausgelöste Diarrhoe, obwohl die Mäuse noch infiziert sein können (7). Diese Daten wurden so interpretiert, daß sie nahelegen, daß die Fähigkeit von reifen Rotaviren, bei jungen jedoch nicht bei erwachsenen Mäusen, eine Diarrhoe auszulösen, auf der Menge der den Rotavirus bindenden Rezeptoren auf der Oberfläche von Epithelzellen des Villus im Darm von jungen Mäusen basiert.
Beim Vergleich mit Rotavirusinfektionen bei anderen Spezies zeigen Rotavirusinfektionen bei Mäusen minimale histologische Veränderungen. Das heißt, das Umempfindlichwerden des Villus ist begrenzt und vorübergehend, und eine Kryptazellhyperplasie liegt nicht vor. Außerdem ist der Verlust von Epithelzellen an der Spitze des Villus bei Mäusen begrenzter als bei anderen Tieren. Stattdessen ist die Vakuolenbildung von Enterocyten an den Villusspitzen ein vorherrschendes Merkmal bei einer symptomatischen Rotavirusinfektion bei Mäusen, und die Virusreplikation kann abortiv sein (8). Das Fehlen von extensiven pathologischen Veränderungen im Darm der Maus bei symptomatischen Infektionen ist ein Rätsel geblieben; eine Interpretation dieses Phänomens besteht darin, daß bisher nicht erkannte Mechanismen der Auslösung einer Diarrhoe bei einer symptomatischen Rotavirusinfektion bei Mäusen aktiv sein können.
Trotz der weiten Verbreitung von Rotavirusinfektionen und extensiver Untersuchungen bei verschiedenen Tiermodellen und vielen Fortschritten beim Verständnis der Rotavirus-Immunität, Epidemiologie, Replikation und Expression, insbesondere der Rotavirus-Pathogenese, ist der Mechanismus der Auslösung einer Diarrhoe weiterhin kaum bekannt. Vorgeschlagene pathophysiologische Mechanismen, nach denen Rotaviren nach der Virusreplikation und der Synthese des viralen Strukturproteins eine Diarrhoe auslösen, schließen eine mangelnde Absorption, die die Zerstörung der Enterocyten begleitet (9), eine Unterbrechung der transepithelialen Ionen-Homeostase, die zur Fluidausscheidung führt (10) und eine örtliche Villus-Ischämie, die zu einem Gefäßschaden und der Diarrhoe führt (11), ein. Diese vorgeschlagenen Mechanismen erklären jedoch die Fälle der von Rotaviren ausgelösten Diarrhoe nicht, die vor histopathologischen Veränderungen oder ohne diese beobachtet wurden (12).
Andererseits ist die Pathophysiologie der von Bakterien ausgelösten Diarrhoe, die auf Wechselwirkungen mit intestinalen Rezeptoren und bakteriellen Enterotoxinen basiert, allgemein bekannt (13). Das wärmebeständige Toxin A und das wärmeempfindliche Toxin von E. coli und Guanylin (ein endogener intestinaler Ligand mit 15 Aminosäuren, der ursprünglich aus dem Jejunum von Ratten isoliert worden ist) lösen eine Diarrhoe aus, indem sie einen bestimmten intestinalen Rezeptor binden, cAMP oder cGMP verstärken und den Weg für die cyclische Weiterleitung eines Nucleotidsignals aktivieren (14). Der reine Effekt dieser bakteriellen Toxine besteht darin, die Ausscheidung von Cl^– zu verstärken und Na⁺ und die Wasserabsorption zu verringern.
Frühere Untersuchungen bei Insektenzellen haben gezeigt, daß der vom Rezeptor vermittelte Phospholipase C-Weg mit Zunahmen bei [Ca²⁺]_i, gefolgt von einer exogenen Behandlung der Zellen mit dem Peptid NSP4 oder NSP4 114-135 verbunden ist (15). Es hat sich gezeigt, daß das nichtstrukturelle ER-Glycoprotein NSP4 des Rotavirus mehrere Funktionen aufweist, zu denen die Freisetzung von Calcium aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) bei SF9-Zellen von Insekten gehört, die mit dem rekombinanten Stäbchenvirus infiziert sind, der NSP4 cDNA enthält (15, 16). Außerdem bricht NSP4 ER-Membranen auf und kann beim Entfernen des Übergangs-Envelopes von knospenden Partikeln bei der viralen Morphogenese eine wichtige Rolle spielen (unveröffentlichte Daten). Es hat sich gezeigt, daß NSP4 114-135, ein 22aa Peptid des Proteins NSP4 in der Lage ist, die Eigenschaften nachzuahmen, die mit NSP4 verbunden sind, dazu gehört, daß es in der Lage ist, (i) die intrazellulären Calciumwerte bei Insektenzellen zu mobilisieren, wenn es endogen ausgeprägt worden ist oder den Zellen exogen zugesetzt worden ist (15, 16), und (ii) Liposome zu destabilisieren (unveröffentlichte Daten).
Die Expression von NSP4 in Insektenzellen verstärkt die [Ca²⁺]_i-Werte aus einem Teilsatz des für Thapsigargin empfindlichen Speichers (ER) (15). Das durch das Peptid NSP4 oder NSP4 114-135 immobilisierte [Ca2+]i wurde durch den Phospholipase-C-Inhibitor, die Verbindung U-73122, blockiert, was nahelegt, daß ein von einem Rezeptor vermittelter Weg für die Freisetzung von Calcium aus dem ER verantwortlich ist, die von NSP4 ausgelöst wird (15).
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung leitet sich aus der Entdeckung des ersten bekannten viralen Enterotoxins, Rotavirus NSP4, bisher als NS28 bezeichnet, ab, das ein virales Toxin codiert, das die intestinale Sekretion über einen bisher unbekannten Weg zur Weiterleitung eines Signals einleiten kann, so daß es zu einer Diarrhoeerkrankung kommt.
Dieses Dokument berichtet von der zufälligen Entdeckung, daß das nichtstrukturelle ER-Glycoprotein NSP4 eines Rotavirus bei zwei Nagetiermodellen eine altersabhängige Diarrhoe einleitet. Die Auslösung der Diarrhoe nach der Verabreichung dieses Proteins allein war völlig unerwartet, da keine Infektion mit einem Rotavirus beteiligt war. Die Kennzeichnung der Parameter dieser neuen Modelle einer von einem Rotavirus ausgelösten Diarrhoe zeigt, daß dieses von einem enterischen Virus codierte Protein ein Enterotoxin ist, das den bakteriellen Enterotoxinen ähnlich ist, von denen allgemein bekannt ist, daß sie eine Diarrhoe auslösen, indem nach der Wechselwirkung mit bestimmten intestinalen Rezeptoren die Wege für die Weiterleitung eines Signals stimuliert werden. Der Fachmann kann einschätzen, daß diese neuen Erkenntnisse über eine von NSP4 ausgelöste Diarrhoeerkrankung und die hier aufgeführten Daten verschiedene neue therapeutische und präventive Versuche zu einer von einem Rotavirus ausgelösten Erkrankung stützen.
Hier wird auch berichtet, daß ein synthetisches Peptid, das aa 114-135 von SA11 NSP4 entspricht, bei jungen Mäusen ebenfalls eine altersabhängige Diarrhoe ausgelöst, die NSP4 vergleichbar ist, wenn es über den i. p. und i. l. Weg verabreicht wird. Da das Peptid NSP4 114-135 in reiner Form in großen Mengen leicht erhältlich war, untersuchten wir die Reaktion auf dieses Peptid im Detail. Die Reaktion auf dieses Peptid zeigte sich insbesondere durch 1) das Fehlen einer Reaktion auf Kontrollpeptide, 2) das Blockieren mit einem für das Peptid spezifischen Antikörper und 3) dadurch, daß ein mutiertes Peptid (das sich nur in einem einzigen Rest unterscheidet) allein keine Reaktion auslöst. Die für die Auslösung der Erkrankung erforderliche Konzentration des Peptids war beträchtlich höher als die für eine Reaktion auf das Protein erforderliche. Da das ganze Protein eine stärkere Wirkung als das Peptid besitzt, sind in dieser Erfindung auch andere Peptide aus diesem Protein eingeschlossen, die den gleichen Effekt haben.
Wir haben eine analoge Altersabhängigkeit bei der Auslösung von Diarrhoe mit dem gereinigten Protein NSP4 und dem Peptid NSP4 114-135 aufgezeigt. Mäuse waren in einem Alter von 6 bis 7 Tagen für die Einflüsse des Proteins oder des Peptids am empfindlichsten. Die Auslösung einer Diarrhoe durch NSP4 oder NSP4 114-135 nahm unabhängig vom Verabreichungsweg mit zunehmendem Alter der Tiere ab. Die bei dieser Untersuchung beobachtete Diarrhoe imitiert folglich die Eigenschaften einer symptomatischen Infektion, die bei einer experimentellen und natürlichen Rotavirusinfektion beobachtet wurden.
Wir haben auch gezeigt, daß das Impfen mit einem für das Peptid NSP4 114-135 spezifischen Antiserum vor der i.p. Verabreichung des Peptids zu einer deutlichen Abschwächung der Erkrankung führt (90-prozentige Abschwächung der Erkrankung).
Wir haben auch gezeigt, daß die Diarrhoeerkrankung bei von Muttertieren geborenen Jungtieren, die mit dem Peptid NSP4 114-135 immunisiert worden sind, an Schwere und Dauer deutlich abgenommen hatte und daß die Anzahl von Jungtieren mit Diarrhoe deutlich abgenommen hatte.
Wir haben auch gezeigt, daß die Verabreichung eines für NSP4 spezifischen Antikörpers nach der Infektion die Diarrhoeerkrankung deutlich verringert.
Diese Werte, die zeigen, daß das Protein NSP4 oder ein für NSP4 114-135 spezifischer Antikörper ausreichen, um die Auslösung oder Schwere einer Diarrhoe zu blockieren, demonstrieren, daß NSP4 und/oder NSP4 114-135 und/oder dafür spezifische Antikörper als Vakzine und als therapeutische Mittel vorteilhaft sind. Außerdem können nun neue Wirkstoffe entwickelt werden, um die Einflüsse der Wechselwirkung von NSP4 auf seinen Rezeptor oder die Einflüsse der Unterbrechung der Calcium-Homeostase in angegriffenen Zellen zu blockieren oder zu minimieren.
Außerdem zeigten Tiere, denen das Peptid zweimal (in einem Abstand von zwei Tagen) gegeben worden war, einen schnellen Beginn einer schweren Diarrhoe, gefolgt von einem gehemmten Wachstum. Das Gewicht dieser Tiere war für drei Wochen nach der Verabreichung des Peptids 20 bis 30% geringer.
Auf der Basis unserer Ergebnisse in bezug auf eine von NSP4 ausgelöste Diarrhoe bei Mäusen und Ratten haben wir ein Modell vorgeschlagen, bei dem zwei intestinale Rezeptoren für eine symptomatische Rotavirusinfektion erforderlich sind. Ein Rezeptor bindet die Rotaviruspartikel, was zum Eintritt des Virus und zur Genexpression, jedoch nicht notwendigerweise zur Erkrankung führt, wie hingegen der zweite Rezeptor für NSP4 spezifisch ist. Obwohl der Rezeptor für eine Rotavirusinfektion mit dem Alter erhalten bleibt, womit eine erwachsene Maus (34 bis 35 Tage alt) den Virus replizieren und ausscheiden kann, bleibt der vollkommen funktionelle NSP4-Rezeptor im Verlauf der Alterung nicht erhalten, somit wird die Erkrankung nicht beobachtet. Außerdem ist die Krankheit bei heranwachsenden Mäusen (17 bis 18 Tage alt) nicht erkennbar, da der Kolon dieser Tiere im Dünndarm ausgeschiedenes Fluid absorbieren kann.
Wir haben gezeigt, daß NSP4 114-135 die von cAMP abhängige Ausscheidung von Cl^– in der Darmschleimhaut der Maus fördert und verstärkt und bei Nagetieren in einem Zeitrahmen Diarrhoe auslöst, der ST_B ähnlich ist (etwa 3 Stunden). Die elektrophysiologischen Daten zeigen, daß NSP4 die Zunahme von Calcium im Darm von Mäusen al-tersabhängig verstärkt und diese Zunahmen von Calcium zu einer Ausscheidung von Chlorid führen, die durch Kurzschlußströme gemessen wurde. Der direkte Zusatz von vernetztem NSP4 114-135 zu Schleimhautschichten des Ileums der Maus führte zu einem Anstieg des Stroms, der dem ähnlich ist, der vom Calcium-Agonisten Carbachol hervorgerufen wird. Neben der Altersabhängigkeit war die Auslösung der Ausscheidung von Chlorid aus den Schleimhautschichten des Darms ortsabhängig. Es wurden keine bis minimale Reaktionen beobachtet, wenn Jejunum-, Duodenum- oder Kolongewebe der Maus verwendet wurde, und maximale Reaktionen wurden ausgelöst, wenn das Ileum verwendet wurde. Diese Ergebnisse unterstützen unser Modell der von NSP4 ausgelösten Diarrhoe.
Unsere Werte zeigen, daß die Stimulierung des von Ca²⁺ abhängigen Weges für die Weiterleitung eines Signals durch NSP4, die zu einer Unterbrechung des normalen intestinalen Epitheltransports führt, der ähnlich ist, von der bei Guanylin und den wärmebeständigen Enterotoxinen berichtet wurde. Auf der Basis der enteropathogenen Ähnlichkeiten bei der intestinalen Ausscheidung mit den für Guanylin und den wärmebeständigen Enterotoxinen berichteten, kann NSP4 als virales Enterotoxin angesehen werden.
Für die Zwecke dieser Erfindung soll der Begriff "Verbindung, die Aminosäuren mit einer Sequenz umfaßt, die NSP4 114-135 entspricht" für eine Verbindung stehen, die eine Sequenz von Aminosäuren enthält, die der Sequenz von NSP4 114-135 entspricht, einschließlich dem Protein NSP4 114-135 und NSP4. Für die Zwecke dieser Erfindung soll der Begriff "Verbindung, die Aminosäuren mit einer Sequenz umfaßt, die NSP4 120-147 entspricht" für eine Verbindung stehen, die eine Sequenz von Aminosäuren enthält, die der Sequenz von NSP4 120-147 entspricht, einschließlich dem Protein NSP4 120-147 und NSP4. Für die Zwecke dieser Erfindung soll der Begriff "Derivat" für irgendwelche Moleküle stehen, deren Herstellung und Verwendung in der Erfahrung des Fachmanns liegt, die durch Derivatbildung der betreffenden Verbindung hergestellt werden und die die Aktivität der einer Derivatbildung unterzogenen Verbindung nicht zunichte machen. Verbindungen, die die vorstehend genannten Kriterien erfüllen, die die Aktivität der einer Derivatbildung unterzogenen Verbindung minimieren, jedoch nicht zerstören, liegen im Umfang des Begriffs "Derivat". Folglich muß gemäß der Erfindung ein Derivat einer Verbindung, die Aminosäuren mit einer Sequenz umfaßt, die der Sequenz von NSP4 114-135 oder NSP4 120-147 entspricht, keine Sequenz von Aminosäuren umfassen, die genau der Sequenz NSP4 114-135 oder NSP4 120-147 entspricht, sofern sie einen meßbaren Wert der Aktivität des Peptids NSP4 114-135 oder NSP4 120-147 beibehält.
Gemäß einer Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung, um verringerte Wachstumsraten zu verhindern, die durch eine Rotavirusinfektion verursacht werden, das die Verwendung der Peptide NSP4, NSP4 114-135 und/oder NSP4 120-147 als Vakzine gegen eine Rotavirusinfektion einschließt.
Gemäß einer weiteren Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung ein Vakzin bereit, das die Peptide NSP4, NSP4 114-135 oder NSP4 120-147 oder Derivate davon umfaßt, um die Bildung von schützenden aktiven oder passiven Antikörpern auszulösen.
Gemäß einer weiteren Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Immunisierung gegenüber einer Rotavirüsinfektion zur Verfügung, das die Verabreichung eines Vakzins an eine Person umfaßt, das die Peptide NSP4, NSP4 114-135 oder NSP4 120-147 einschließt.
Gemäß einer weiteren Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur passiven Immunisierung gegenüber einer Rotavirusinfektion zur Verfügung, das die Verabreichung eines Vakzins an eine Schwangere einschließt, das die Peptide NSP4, NSP4 114-135 oder NSP4 120-147 einschließt.
Beschreibung der Zeichnungen
1A Das Rotavirus-Protein NSP4 löst bei CD1-Mäusen eine Diarrhoe aus.
0,1 bis 5 nmol (2 bis 100 μM) gereinigtes NSP4 wurden auf dem i.p. oder i.l. Weg an 6 bis 7, 8 bis 9 und 17 bis 18 Tage alte CD1-Jungtiere verabreicht. Das Rotavirus-Protein VP6 diente bei 6 bis 7 Tage alten Tieren, den empfindlichsten, als Kontrolle. Die Dosis und der Weg der Proteine, das Alter der Tiere und das durchschnittliche Diarrhoe-Ergebnis (Durchschnittsergebnis) sind im unteren Teil der Figur angegeben. Die Y-Achse zeigt die Diarrhoe in %. Über jeder Säule steht die Anzahl der empfindlichen Tiere (Mäuse mit Diarrhoeerkrankung) gegenüber der Gesamtzahl der getesteten Tiere.
1B Die i.p. Verabreichung von NSP4 ruft bei 6 bis 7 Tage alten CD1-Jungtieren Diarrhoe hervor.
0,04 bis 1,0 nmol (1 bis 25 μg) gereinigtes Protein NSP4 wurde 6 bis 7 Tage alten CD 1-Jungtieren auf dem i.p. Weg verabreicht. Die verabreichte Dosis, in Nanomol und Mikrogramm, ist auf der X-Achse angegeben. Der Prozentsatz der Jungtiere, die als Reaktion auf die verabreichte Dosis Diarrhoe zeigte, ist auf der Y-Achse angegeben. Über jeder Säule ist die Anzahl der empfindlichen Tiere (Jungtiere mit Diarrhoe) gegenüber der Gesamtzahl der Tiere angegeben, die diese Behandlung erhalten haben.
2A Diarrhoereaktion bei CD 1-Mäusen nach der i.p. Verabreichung des Peptids NSP4 114-135.
Junge (6 bis 7 Tage) Mäuse erhielten eine Injektion unterschiedlicher Dosen des Peptids (x-Achse), und die Krankheit wurde überwacht. Die Anzahl der empfindlichen Tiere gegenüber der Gesamtzahl der getesteten Tiere ist über jeder Säule angegeben. Bei den CD1-Mäusen riefen 0,1 bis 50 nmol (2 μM bis 1 mM) des Peptids ähnliche Reaktionen hervor (Auslösung einer Diarrhoe 30 bis 40%); und 100 bis 400 nmol (2 bis 8 mM) des Peptids riefen vergleichbare Reaktionen hervor, wobei 60 bis 70% der Tiere krank waren. Eine leichte Verstärkung der Erkrankung wurde bei 500 nmol (20 mM) des Peptids festgestellt. Bei 0,001 nmol des Peptids wurde keine Diarrhoe ausgelöst (die Werte sind nicht gezeigt).
2B Diarrhoereaktion bei Balb/C-Mäusen nach der i.p. Verabreichung des Peptids NSP4 114-135.
Junge (6 bis 7 Tage) Mäuse erhielten eine Injektion mit unterschiedlichen Dosen des Peptids (x-Achse), und es wurde die Erkrankung überwacht. Die Anzahl der empfindlichen Tiere gegenüber der Gesamtzahl der getesteten Tiere ist über jeder Säule angegeben. Bei den Balb/C-Jungtieren wurde bei 50 nmol (1 mM) des Peptids die Auslösung einer Diarrhoe bei 100 % der Tiere festgestellt, was darauf hinweist, daß Inzuchttiere für den Einfluß des Peptids NSP4 empfindlicher sind.
3A Die i.p. Verabreichung des Peptids NSP4 114-135 löst bei CD 1-Mäusen und Sprague-Dawley-Ratten eine altersabhängige Diarrhoe aus.
Herausgezüchtete Mäuse und Ratten mit unterschiedlichem Alter wurden mit dem Peptid NSP4 114-135 geimpft (i.p.), und es wurde die Erkrankung ausgewertet. Das Alter und die Spezies der Jungtiere, die Dosis des synthetischen Peptids und der Hinweis darauf, ob die Peptide unvernetzt oder vernetzt waren, sind im unteren Teil der Figur angegeben. Die Dosis des i.p. zugeführten Peptids änderte sich mit dem Alter der Tiere, d.h. ältere Tiere erhielten eine höhere Dosis, damit eine Kontrolle der Unterschiede des Körpergewichts erfolgte. Die Y-Achse zeigt die Diarrhoe in %, und über jeder Säule ist die Anzahl der empfindlichen Tiere gegenüber der Gesamtzahl der geimpften Tiere angegeben. Das Peptid wurde mit steriler PBS verdünnt und es wurde die Sterilität ausgewertet. Es wurde ein Endvolumen von 50 μl pro Dosis verwendet. Analog den Effekten von gereinigtem NSP4 gehörten Lethargie und Unempfindlichkeit für eine Berührung zu den weiteren Symptomen.
3B Die i.l. Verabreichung des Peptids NSP4 114-135 löst bei CD1-Mäusen und Spraque-Dawley-Ratten eine altersabhängige Diarrhoe aus.
Herausgezüchtete Mäuse und Ratten mit unterschiedlichem Alter wurden (i.l.) mit dem Peptid NSP4 114-135 geimpft, und es wurde die Erkrankung ausgewertet. Das Alter und die Spezies der Jungtiere, die Dosis des synthetischen Peptids und der Hinweis darauf, ob die Peptide unvernetzt oder vernetzt waren, sind im unteren Teil der Figur angegeben. Die Y-Achse zeigt die Diarrhoe in %, und über jeder Säule ist die Anzahl der empfindlichen Tiere gegenüber der Gesamtzahl der geimpften Tiere angegeben. Das Peptid wurde mit steriler PBS verdünnt und es wurde die Sterilität ausgewertet. Es wurde ein Endvolumen von 50 μl pro Dosis verwendet. Analog den Effekten von gereinigtem NSP4 gehörten Lethargie und Unempfindlichkeit für eine Berührung zu den weiteren Symptomen.
4 Reaktion auf die Dosis bei einem vernetzten Peptid NSP4, das 6 bis 7 Tage alten CD1- und Balb/C-Mäusen i.p. verabreicht worden war.
Das Peptid NSP4 114-135 wurde mit Glutaraldehyd quervernetzt und gegen eine sterile PBS dialysiert, bevor es den CD1- und Balb/C-Mäusen i.p. zugeführt wurde. Die Anzahl der empfindlichen Tiere gegenüber der Gesamtzahl der geimpften Tiere ist über jeder Säule angegeben. Die Erkrankungsreaktion auf das vernetzte Peptid wurde im Vergleich mit dem Peptid allein bei geringeren Dosen festgestellt. Zu weiteren Symptomen gehörte eine Lethargie und die Unempfindlichkeit für eine Berührung.
5 zeigt die Versuchsgestaltungen, die für den Test der Fähigkeit von NSP4 114-135 angewendet wurden, um eine schützende Immunität vor einer infektiösen Erregung durch einen Rotavirus hervorzurufen und die Fähigkeit eines für NSP4 spezifischen Antikörpers zu testen, die Rotavirus-Diarrhoe nach der Infektion abzuschwächen. Die linke Seite der Figur zeigt, daß Muttertiere in Form von Mäusen mit dem Peptid NSP4 oder mit einem Kontrollpeptid immunisiert und dann herausgezüchtet wurden. Die von diesen Muttertieren geborenen Jungtiere wurden am 6. bis 7. Tag oral mit dem virulenten Rotavirus erregt. Die rechte Seite der Figur zeigt, wie Jungtiere, die von nicht immunisierten Muttertieren geboren worden waren, zuerst oral mit dem virulenten Rotavirus erregt wurden, worauf die orale Verabreichung eines für NSP4 spezifischen oder Kontroll-Antiserums mit einer Sonde folgte. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den Tabellen 5 und 6 gezeigt.
6 zeigt die Ergebnisse von einem Versuch, um die Unterschiede beim Gewicht und dem Wachstum zwischen normalen Tieren und Tieren zu untersuchen, die an einer von NSP4 114-135 ausgelösten Diarrhoe litten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Materialien und Verfahren
Beispiel 1: NSP4
NSP4 wurde aus dem rekombinanten Stäbchenvirus pAC461-G10, der mit Zellen von Spodoptera frugiperda (Sf9) infiziert war, die das Gen 10 ausprägen, durch FPLC auf einer QMA-Anionenaustauschsäule, wie bereits beschrieben (15, 16) und durch einen zusätzlichen Affinitäts-Reinigungsschritt auf einer Säule, die Antikörper für NSP4 enthält gereinigt. Unterschiedliche NSP4-Präparate mit einer Reinheit von ≤70 % und 90% erzielten die gleichen biologischen Ergebnisse. Auf der Basis einer bakteriologischen Züchtung in einer L-Nährbouillon, die 1 Woche bei 37°C inkubiert wurde, war das Protein steril, und auf der Basis eines Tests mit dem Limulus-Assay des Amöbocytenlysats (LAL) fehlte ihm Endotoxin (17). VP6 wurde aus dem rekombinanten Stäbchenvirus pAc461/SAll-G6, der mit Sf9-Zellen infiziert worden war, durch Gradienten-Zentrifugieren bis zu einer Reinheit von >95% gereinigt, wie es bereits beschrieben worden ist (18). Beide Proteine wurden gefriergetrocknet und unabhängig vom Verabreichungsweg bis zu einem Endvolumen von 50 μl pro Dosis in steriler PBS verdünnt.
Beispiel 2: Synthetische Peptide
Die in dieser Untersuchung verwendeten synthetischen, für NSP4 spezifischen und Kontrollpeptide wurden ursprünglich auf der Basis von Algorithmen ausgewählt, die das Oberflächenpotential (19), das Drehpotentioal (turn potential) (Pt) (20) und die amphipathische Struktur (21) vorhersagen. Es wurde eine Blocklänge von 11 verwendet, und ein amphipathisches Ergebnis (AS) von 4 wurde als signifikant angesehen. Wir haben Sequenzen mit einer ungewöhnlich starken vorhergesagten Neigung zum Falten zu amphipathischen Helices und Umkehrdrehungen ausgewählt, da sich kleine Peptide, denen in einer wäßrigen Umgebung typischerweise irgendein Faltungsmuster fehlt, zu einer geregelten Sekundärstruktur falten können, die dem naszierenden Protein ähnelt, wenn die strukturelle Neigung stark ist (22).
Die in dieser Untersuchung verwendeten Peptid-Sequenzen schließen die folgenden ein: NSP4 114-135 (23), (DKLTTREIEQ VELLKRIYDKLT, Sequenzidentifizierungsnr. 1), AS = 35; ein Peptid vom Amino-Terminus von NSP4, NSP4 2-22 (EKLTDLNYTLSVITLMNNTLH, Sequenzidentifizierungsnr. 2), AS = 14; ein verlängertes, stark amphipathisches Peptid, NSP4 90-123 (TKDEIEKQMDRVV KEMRRQLEMIDKLTTREIEQ, Sequenzidentifizierungsnr. 3) AS = 71; ein mutiertes Peptid NSP4 114-135, mNSP4 131K (DKLTTREIEQVELLKRIKDKLT, Sequenzidentifizierungsnr. 4) AS = 31; und ein Peptid vom COOH-Terminus des Kapselproteins des Norwalk-Virus mit einem zentral angeordneten Tyrosinrest (24), NV 464-483 (DTGRNLGEFKAYPDGFLTCV, Sequenzidentifizierungsnr. 5) AS = 41 (Tabelle 1) und NSP4 120-147 (EIEQVELLKRIYDKLTVQTTGEIDMTKE, Sequenzidentifizierungsnr. 6) AS = 35,0.
Alle Peptide waren von der University of Pittsburgh Peptide Core Facility synthetisiert worden, wobei die chemische Fmoc-Strategie und Standardprotokolle angewendet wurden (25). Die Wirksamkeit beim Koppeln und Deblockieren wurde durch eine Kolorimetriereaktion mit Ninhydrin überwacht (26). Die Peptide wurden von ihrem festen Harzträger abgespalten und durch mehrfache Extraktionen mit kaltem Ether und herkömmliche Gelfiltrationschromatographie (Sephadex G-25) von organischen Verunreinigungen getrennt. Das abschließende Peptidprodukt wurde durch Umkehrphasen-HPLC (Deltapak C4, Waters) und durch Plasmadesorptions-Massenspektroskopie gekennzeichnet (27). Bei diesen Untersuchungen wurden nur jene Peptide mit der exakten theoretischen Masse und 90% oder mehr der Gesamtlänge des Produktes verwendet. Vor der Verwendung wurden die Peptide entweder durch HPLC auf einer semipräparativen Umkehrphasen-C18-Säule (uBondapak, Waters) oder durch mehrfache Elutionen aus einer herkömmlichen Gelfiltrationssäule (1,5 mm × 40 mm) weiter gereinigt. Die Reinheit des Peptids wurde vor den Impfungen durch Gelfiltrationschromatographie (Säule Protein-Pak 60, 10 μm, Waters) auf einer HPLC-Einheit von Waters bestätigt. Die Elutionskurven wurden durch UV-Absorption (Lambda-Max LC-Spektrophotometer, Waters) bei 220 nm überwacht und mit einem 745 Data Module (Waters) erfaßt. Der Elutions-Puffer war PBS, pH = 7,2, und die Strömungsrate betrug 0,5 ml/min. Die Sterilität wurde wie für das Protein NSP4 beschrieben bestätigt:
Beispiel 3: Glutaraldehyd-Vernetzung von synthetischen Peptiden
In einigen Fällen wurden die Peptide nach einem Kopplungsprotokoll in einem einzigen Schritt durch Glutaraldehyd untereinander oder mit dem Trägerprotein, Hämocyanin der Keyhole-Napfschnecke (keyhole limpet) (KLH) vernetzt (28). Kurz zusammengefaßt wurde das Peptid-Immunogen in einem Verhältnis von 100 nmol Peptid : 1 nmol KLH mit KLH oder in einem Verhältnis von 1 : 1 untereinander gekoppelt, indem Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,4% zugesetzt wurde. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von 1 m Glycin (C f = 20 mM) gequencht. Die vernetzten Peptide wurden vor der Verwendung extensiv gegenüber steriler PBS dialysiert.
Beispiel 4: Antikörperproduktion
sDas für das Peptid NSP4 114-135 spezifische Antiserum wurde in CD 1-Mäusen und weißen New Zealand-Kaninchen erzeugt, indem eine Immunisierung mit Peptid erfolgte, das durch Glutaraldehyd mit dem Proteinträger KLH vernetzt worden war, wie es vorstehend beschrieben ist. Die erste Impfung wurde in kompletten Freundschem Adjuvans (Gibco) emulgiert, wohingegen alle anschließenden Impfungen in inkomplettem Freundschem Adjuvans präpariert wurden. Die Kaninchen erhielten eine intramuskuläre (i.m., einmal in jede Hüfte) und subkutane (s.c.) Injektion im Genick. Fördernde Dosen des emulgierten Antigens (100 nmol Peptid) erfolgten alle 4 Wochen für insgesamt 5 Immunisierungen. Die Mäuse wurden alle 3 Wochen auf i.m., s.c. und i.p. Weg immunisert. Die Seren für die Vorimmunisierung und die Nachimmunisierung wurden durch Peptid-ELISA (Titer 400-3200), wie es bereits beschrieben worden ist (29), und durch Western-Blotting-Analyse ausgewertet.
Beispiel 5: i.p. und i.l. Verabreichung von Protein und Peptiden
Das gereinigte Protein NSP4, das Peptid allein oder untereinander vernetzt wurde jungen (6 bis 10 Tage) und älteren (11 bis 25 Tage) herausgezüchteten CD1- oder durch Inzucht erhaltenen Balb/C-Mäusen und herausgezüchteten Sprague-Dawley-Ratten auf intraperitonealem (i.p.), intrailealem (i.l.), intramuskulärem (i.m.), subkutanem und oralem Weg verabreicht. Die Peptid- oder Proteinimpfung wurde unabhängig vom Verabreichungsweg oder der Impfung in steriler PBS bis zu einem Endvolumen von 50 μl pro Dosis verdünnt. Eine 30 G Nadel wurde für die i.p. und i.l. Verabreichung der Impfung verwendet. Das Peptid wurde jungen Mäusen mit einer künstlichen Sonde oral zugeführt, wobei ein flexibler Polyethylenschlauch PE-10 (Intramedic, Becton Dickinson) und die Färbung der Nahrung angewendet wurden. Für die chirurgische Einführung des Peptids oder des Proteins auf dem i.l. Weg wurden die Tiere mit Isofuran (Anaquest) anästhesiert, unter dem Magen wurde ein kleiner Schnitt vorgenommen, die Impfung wurde direkt in das obere Ileum injiziert, und der Schnitt wurde mit Polypropylennähten (PROLENE 6-0, Ethicon) verschlossen. Die Jungtiere wurden isoliert, warmgehalten und mindestens 2 Stunden vor der Rückkehr in ihren Käfig genau überwacht.
Beispiel 6: Überwachung der Auslösung von Diarrhoe
Die Auslösung von Diarrhoe durch das Protein NSP4 und Peptide wurde 24 Stunden nach den Impfungen sorgfältig überwacht. Jedes Jungtier wurde während der ersten 8 Stunden und 24 Stunden nach der Impfung alle 1 bis 2 Stunden überprüft, indem leicht auf den Bauch gedrückt wurde. Die Diarrhoe wurde notiert und mit 1 bis 4 bewertet, wobei die Bewertung 1 einen ungewöhnlich weichen, lockeren gelben Stuhl angibt und die Bewertung 4 ein vollkommen flüssiger Stuhl ist. Die Bewertung 2 (schleimig mit flüssigem Stuhl, etwas lockerer jedoch fester Stuhl) und darüber wurde als Diarrhoe angesehen. Die Bewertung 1 wurde notiert, jedoch nicht als Diarrhoe angesehen. Die Bewertung erfolgte von einer einzigen Person, und die Jungtiere wurden während der Analyse der Diarrhoe codiert. Es wurden weitere Symptome überwacht, einschließlich einer Lethargie, einer Unempfindlichkeit für eine Berührung und struppiges Fell bei älteren Tieren.
Beispiel 7: Analyse der Chloridausscheidungsreaktion auf NSP4 114-135 in der Darmschleimhaut von Mäusen
Nicht abgelöste Darmschleimhautschichten von 19 bis 22 und 35 Tage alten Mäusen wurden auf die Chloridausscheidungsreaktion gegenüber NSP4 114-135 analysiert. Es wurden die Kurzschlußströme (I_sc) entlang der nicht abgelösten Darmschleimhautschichten von 19 bis 22 und 35 Tage alten CD1-Mäusen gemessen, wobei eine automatische Spannungsklemme (Bioengineering, Univ. of Iowa) verwendet wurde, wie es bereits beschrieben worden ist (30). Es wurde das mittlere Ileum des Darms der Mäuse verwendet. Die nicht abgelösten Schleimhautschichten, die vom Darm entnommen worden waren, wurden in modifizierte Ussing-Kammern mit Öffnungen mit 0,12 cm² (Maschinenzuschnitt (machine shope) UTHSC) gegeben, und das Transepithel-Potential (V_t) wurde durch 3 m KCl-Agar-Brücken aufgezeichnet, die mit ausgeglichenen Calomel-Halbzellen verbunden waren. Der erforderliche Transepithel-Strom, um Vt bei 0 anzuklemmen, wurde durch Ag-AgCl-Elektroden geleitet, die mit den 3 m KCl-Brücken verbunden waren. Alle Versuche erfolgten bei 37°C in einer Ringer-Bicarbonatlösung, die durch Mischluftrührer mit 95% O₂ - 5% CO₂ begast wurde, wie es bereits beschrieben ist (wie oben). Das Schleimhaufbad enthielt natriumfreie (N-Methyl-D-Glutamin) substituierte Ringer-Lösung, um die Effekte des mit cAMP-stimulierten, elektrogenen Na⁺/Glucose-Cotransports durch den Dünndarm auf Isc zu minimieren (31). Nach dem Temperatur- und Ionenausgleich wurden die Grundmessungen von Isc vorgenommen, und die Darmschleimhautschichten wurden mit vernetztem Peptid (entweder NSP4 114-135, NSP4 2-22 oder mNSP4 131K), dem calciumerhöhenden Agonisten Carbachol (Cch) oder dem cAMP-Agonisten Forskolin (FSK) erregt. Es wurde die Bumetamid-Empfindlichkeit getestet und die Chloridausscheidungsreaktion bestätigt.
Ergebnisse
Beispiel 8: Das Protein NSP4 leitet bei Mäusen eine altersabhängige Diarrhoe ein.
Ob nun die Verabreichung i.p. oder intraileal (i.l.) erfolgte, eine Diarrhoe wurde innerhalb von 1 bis 4 Stunden nach der Impfung beobachtet, sie dauerte typischerweise bis zu 8 Stunden, dauerte jedoch gelegentlich 24 Stunden an. Gereinigtes NSP4 (0,1 bis 5 nmol) wurde auf dem i.p. Weg an 6 bis 7 und 8 bis 9 Tage alte CD 1-Jungtiere verabreicht. Bei 6 bis 7 Tage alten CD 1-Jungtieren löste die i.p. Verabreichung von 0,1 nmol NSP4 bei 60% der Mäuse eine Diarrhoe aus, wohingegen bei 8 bis 9 Tage alten Mäusen mit der gleichen Proteinkonzentration keine Erkrankung ausgelöst wurde (1A). Die i.p. Verabreichung von 1 nmol NSP4 führte bei 100% der 6 bis 7 Tage alten Jungtiere zur Diarrhoe und bei 60% der 8 bis 9 Tage alten Mäuse zu einer Erkrankung. Eine höhere Dosis von 5 nmol NSP4 löste bei 90% der älteren Mäuse (8 bis 9 Tage) eine Diarrhoe aus. Weitere klinische Symptome schlossen eine Lethargie und eine Unempfindlichkeit für eine Berührung ein, die beim größten Teil der behandelten Tiere mit Diarrhoe bei jedem Alter festgestellt wurde. Es zeigte sich, daß die Auslösung einer Diarrhoe durch NSP4 für dieses Protein spezifisch ist, da die Verabreichung des gleichen Volumens eines Puffers oder von VP6 keinen Effekt hatte.
Die i.l. Verabreichung von 0,5 nmol gereinigtem Protein NSP4 führte bei 100% der CD1-Jungtiere (8 bis 9 Tage alte Mäuse) in den ersten 2 Stunden nach der Impfung zu einer Erkrankung, wohingegen bei 17 bis 18 Tage alten Jungtieren keine Diarrhoe beobachtet wurde (Tabelle 2, 1).
Folglich war die Reaktion auf NSP4 bei CD1-Jungtieren alters- und dosisabhängig. Außerdem war die Auslösung einer Diarrhoe durch NSP4 spezifisch, da die Verabreichung der gleichen Konzentration des gereinigten Rotavirus VP6 oder des gleichen Volumens eines Puffers keinen Effekt hatte (1). Der Effekt der i.p. und i.l. Verabreichung des Proteins NSP4 bei Mäusen ist der gleiche. Die intramuskuläre (i.m.) Impfung von 1 nmol gereinigtem NSP4 erzeugte keine Krankheitseffekte (die Werte sind nicht gezeigt). Die subkutane und orale Verabreichung von NSP4 erzeugte ebenfalls keine Kranksheitseffekte (die Werte sind nicht gezeigt).
Weitere Werte, die die Reaktion auf die Dosis bei 6 bis 7 Tage alten CD1-Jungtieren zeigen, sind in 1B aufgeführt. Die Menge des verabreichten Peptids ist in Nanomol und Mikrogramm angegeben. 0,04 bis 1,0 nmol (1 bis 25 μg) des gereinigten NSP4 wurden 6 bis 7 Tage alten CD1-Jungtieren auf dem i.p. Weg verabreicht. Der Zusammenhang zwischen einem verstärkten Auftreten von Diarrhoe und der Erhöhung der Dosis war innerhalb des getesteten Bereichs zu erkennen (1B). Die höchste getestete Dosis (1,0 nmol = 25 μg) löste bei allen getesteten Mäusen eine Diarrhoe aus (10 von 10).
Beispiel 9: Das Peptid NSP4 114-135 löst bei Mäusen eine Diarrhoe aus.
Das Peptid NSP4 114-135 weist eine AS von 35 auf, ist in der Cytoplasma-Domäne von NSP4 lokalisiert und mobilisiert das intracelluläre Calcium in eukaryotischen Zellen (15, 16).
Nach der i.p. Verabreichung von 0,1 bis 50 nmol des Peptids NSP4 114–135 wurde bei 6 bis 7 Tage alten herausgezüchteten CD1-Jungtieren eine ähnliche Krankheitsreaktion mit der Auslösung einer Diarrhoe bei 30 bis 40% festgestellt (2A). Der Prozentsatz der CD1-Jungtiere mit Diarrhoe nahm nach der i.p. Verabreichung von 100 bis 400 nmol NSP4 114-135 auf 60 bis 70% zu, und 89% der Jungtiere hatten nach der Verabreichung einer Dosis von 500 nmol des Peptids eine Di arrhoe. Eine Auslösung der Erkrankung bei 100% der CD1-Jungtiere wurde nicht erreicht; Dosen von mehr als 500 nmol wurden nicht verabreicht, da das Volumen jeder Dosis auf 50 μl begrenzt war. Diese Werte zeigen, daß die Krankheitsreaktion bei CD 1-Mäusen auf der Basis der Dosis des Peptids NSP4 114-135 in drei Gruppen unterteilt werden kann: 1) weniger als und gleich 50 nmol (1 mM) führen bei 30 bis 40% der Tiere zur Erkrankung, 2) 100 bis 400 nmol (2 bis 8 mM) erzielen bei 60 bis 70% der Tiere eine Erkrankung, und 3) 500 nmol (10 mM) und darüber lösen bei mindestens 89% der jungen Mäuse eine Diarrhoe aus.
Eine Diarrhoe wurde bei 100% der 6 bis 7 Tage alten Balb/C-Jungtiere mit geringeren Konzentrationen (nur 50 nmol) des Peptids ausgelöst (2B), und die Diarrhoe wurde bei 80% der Balb/C-Mäuse beobachtet, denen 0,1 nmol (2 μM) NSP4 114-135 verabreicht worden war. Folglich erschienen Balb/C-Mäuse für die Effekte von NSP4 114-135 empfindlicher.
Zusammenfassend waren Dosen von mehr als 50 nmol (1 mM) des Peptids NSP4 114-135 ausreichend, um beim größten Teil der jungen Mäuse eine Diarrhoe auszulösen, wenn die Verabreichung auf dem i.p. Weg erfolgte. Die Diarrhoe wurde innerhalb von 1 bis 4 Stunden nach der Impfung beobachtet und dauerte typischerweise bis zu 8 Stunden, gelegentlich lag sie jedoch 24 Stunden lang vor. Die Schwere der Diarrhoe nahm typischerweise im Verlaufe der Zeit zu. Das heißt, eine Maus mit einer Diarrhoebewertung von 1 in der ersten Stunde nach der Impfung hat in der nächsten Stunde eine Diarrhoebewertung von 4. Nach der Verabreichung des Peptids wurden verschiedene Lethargiegrade festgestellt, und das war 3 bis 4 Stunden nach der Impfung am stärksten. Die Lethargie war von einer Unempfindlichkeit der Jungtiere für eine eine Berührung begleitet und war altersabhängig. Die Schwere der ausgelösten Diarrhoe war bei den Balb/C-Jungtieren stärker. Bei den Kontrollpeptiden (NSP4 2-22, NV C-Terminus) oder PBS, die Mäusen mit dem gleichen Alter und der gleichen Gattung verabreicht worden waren, wurden keine Symptome festgestellt.
Beispiel 10: Das Peptid NSP4 120-147 löst bei Mäusen Diarrhoe aus.
Ein den Aminosäureresten 120 bis 147 von NSP 4 entsprechendes Peptid wurde hergestellt und bei 5 bis 7 Tage alten Jungtieren getestet. Als eine Dosis von 100 nmol verabreicht wurde, zeigten alle Tiere (5 von 5) eine schwere Diarrhoe. Eine Dosis von 5 nmol löste bei 7 von 8 Tieren Diarrhoe aus (88%). Das zeigt, daß andere, von NSP4 abgeleitete Peptide hergestellt und überprüft werden können, um das Peptid mit der höchsten Aktivität herauszufinden. Es gehört zum Können eines Fachmanns, eine Bibliothek von sich überlappenden Peptiden zu synthetisieren und zu prüfen, die die gesamte Sequenz des Proteins NSP4 repräsentiert, um die Peptide mit biologischer Aktivität zu lokalisieren. Der Fachmann kann leicht einschätzen, daß sowohl die Länge der Peptide als auch die Anzahl der Reste, die bei benachbarten Peptiden überlappen, vom Praktiker frei geändert werden können, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Beispiel 11: Auslösen einer Diarrhoe bei CD1- und Balb/C-Mäusen durch vernetztes NSP4 114-135
Das Peptid NSP4 114-135 wurde durch Glutaraldehyd untereinander vernetzt und auf dem i.p. Weg jungen Mäusen verabreicht, um zu bestimmen, ob die Auslösung einer Diarrhoe von der Struktur oder Oligomerisation beeinflußt wurde. Beim größten Teil der CD 1-Jungtiere wurde die Diarrhoe bei einer geringeren Dosis von NSP4 114-135 ausgelöst, wenn das Peptid-untereinander vernetzt war - verglichen mit dem Peptid allein (4). 1 nmol des vernetzten Peptids löste bei 80 % von CD1-Jungtieren eine Diarrhoe aus, die bei 250 nmol vernetztem NSP4 114-135 auf 90% zunahm. Wie in 3 gezeigt, waren Dosen mit oder mehr als 1 nmol (20 μM) vernetztes Peptid ausreichend, um beim größten Teil der CD1-Jungtiere eine Reaktion auszulösen. Eine Erhöhung der Dosis über 1 nmol vernetztes NSP4 114-135 hatte nur einen geringen Einfluß, was darauf hinweist, daß die Diarrhoereaktion mit größeren Mengen des synthetischen Peptids nicht verstärkt werden kann, oder daß die Reaktion, wenn sie einmal stimuliert ist, gesättigt sein kann oder eine weitere Stimulierung keinen Einfluß hat.
Ähnlich der Reaktion bei CD1-Mäusen wurde bei 100 % der Balb/C-Jungtiere die Auslösung einer Diarrhoe bei einer geringeren Dosis (10 nmol, 200 μM) des vernetzten Peptids erreicht - verglichen mit dem Peptid allein (4). Außerdem waren die Lethargie und die Unempfindlichkeit für eine Berührung bei den Tieren deutlicher und dauerten länger, die das vernetzte Peptid erhalten hatten. Vernetztes NSP4 2–22 und NV-C-Terminus-Peptide wurden als Kontrolle verabreicht und lösten bei jungen Mäusen keine Symptome aus.
Die Auslösung der Krankheit bei einer geringeren Dosis und mit einer deutlicheren Schwere bei der i.p. Verabreichung von vernetztem NSP4 114-135 legt nahe, daß das Vernetzen entweder das Peptid stabilisiert, das Peptid oligomerisiert oder zu einer Konformation führt, die dem natürlichen Protein ähnlicher ist. Diese Werte legen nahe, daß die Struktur für die Auslösung der Erkrankung wichtig sein kann
Beispiel 12: Das vernetzte Peptid NSP4 114-135 löst bei jungen Ratten ebenfalls eine Diarrhoe aus.
Das Peptid NSP4 114-135 wurde bei einer zweiten Spezies, der Sprague-Dawley-Ratte, getestet, um zu bestimmen, ob die Krankheitsreaktion, die durch dieses Peptid ausgelöst wurde, nur bei jungen Mäusen wirksam war. Die i.p. Impfung von 100 bis 250 nmol vernetztem Peptid löste bei 78% junger Ratten (6 Tage) und bei keinem der älteren Jungtiere dieser Ratten (10 Tage) eine Diarrhoe aus (3A). Bei Nagetieren mit dem gleichen Alten, denen die Kontrollpeptide verab reicht worden waren, wurde keine Erkrankung beobachtet. Die Reaktion bei Ratten war schwächer, als sie bei Mäusen beobachtet wurde, es dauerte 6 bis 12 Stunden, bis der Beginn einer Diarrhoe festgestellt wurde – verglichen mit 2 bis 4 Stunden nach der Impfung bei Mäusen – und es war eine höhere Konzentration des Peptids erforderlich, um die Erkrankung zu beobachten. Die ausgelöste Diarrhoe und Lethargie bei jungen Ratten dauerte jedoch häufig bis zu 48 Stunden. Diese Unterschiede können die Unterschiede bei der Größe und der intestinalen Durchgangszeit bei Ratten und Mäusen oder eine Variation der Spezies (genetisch) reflektieren.
Beispiel 13: i.l. Verabreichung des Peptids NSP4
Die i.l. Verabreichung von 120 bis 240 nmol vernetztem NSP4 114-135 löst bei 90% der jungen Ratten (6 bis 7 Tage) eine Diarrhoe aus. Analog der Reaktion bei jungen Ratten nach der i.p. Verabreichung des vernetzten Peptids war der Beginn der Diarrhoe langsamer als bei Mäusen, es dauerte 6 bis 12 Stunden, sie dauerte jedoch länger (bis zu 48 Stunden). Die chirurgische Einführung von 10 nmol (200 μM) des vernetzten Peptids löste bei 100% der Balg/C-Jungtiere (8 bis 9 Tage) eine Diarrhoe aus, dies ist mit der Auslösung der Diarrhoe nach der i.p. Verabreichung identisch (Tabelle 2). Die Altersabhängigkeit der Diarrhoereaktion, die bei der i.p. Verabreichung von vernetztem NSP4 114–135 beobachtet wurde, blieb bei der i.l. Verabreichung des vernetzten Peptids bestehen. Nur ein Drittel der 11 bis 12 Tage alten Balb/C-Mäuse zeigte eine Diarrhoe, wenn ihnen 10 nmol vernetztes Peptid auf dem i.l. Weg verabreicht worden waren, und keines der 15 bis 17 Tage alten Tiere hatte Diarrhoe. Außerdem hatten ältere CD1-Mäuse (11 bis 12 und 25 Tage) keine Krankheitseffekte durch die i.l. Verabreichung von 50 bis 200 nmol (1 bis 4 mM) des vernetzten Peptids (3B, Tabelle 2). Die gleiche Konzentration des vernetzten Peptids NSP4 2-22 oder das gleiche Volumen von PBS hatte keine Krankheitseffekte, wenn sie sowohl bei jungen als auch älteren Jung tieren chirurgisch eingeführt wurden (Werte nicht gezeigt).
Folglich war der Einfluß der i.p. und der i.l. Verabreichung des Peptids NSP4 bei Nagetieren äugivalent.
Beispiel 14: Die Auslösung der Diarrhoe ist altersabhängig
Da die vom Rotavirus ausgelöste Diarrhoe altersabhängig ist, haben wir diesen Parameter bei dem Peptid getestet. Herausgezüchteten Mäusen und Ratten mit unterschiedlichem Alter wurden 100 bis 300 nmol des Peptids NSP4 114-135, allein oder vernetzt, auf dem i.p. Weg verabreicht. Die Diarrhoe wurde bei jungen Mäusen innerhalb von 2 bis 4 Stunden nach dem Impfen beobachtet, wohingegen bei den älteren Tieren (11 bis 12 oder 15 bis 17 Tage) schwächere oder keine Symptome zu erkennen waren (3). Bei der i.p. Verabreichung des Peptids allein wurde die Krankheit bei 60% der 6 bis 7 Tage alten CD 1-Jungtiere ausgelöst, wobei bei den 11 bis 12 und 15 bis 17 Tage alten Mäusen keine Symptome beobachtet wurden. Die i.p. Verabreichung des vernetzten Peptids führte zu einer 90%igen Auslösung einer Diarrhoe bei 6 bis 7 Tage alten CD 1-Jungtieren, bei 30% der 11 bis 12 Tage alten Jungtiere zu einer Erkrankung und nur bei 10% der 15 bis 17 Tage alten Mäuse zu einer Erkrankung.
Eine vergleichbare Altersabhängigkeit wurde bei Sprague-Dawley-Ratten beobachtet, wenn das vernetzte Peptid auf dem i.p. Weg verabreicht wurde. Eine Diarrhoe wurde 6 bis 12 Stunden nach der Impfung bei 78 % der jungen Ratten (5 bis 6 Tage) festgestellt, wohingegen bei 10 Tage alten Ratten, denen eine ähnliche Dosis des vernetzten Peptids gegeben worden war, keine Erkrankung festgestellt wurde (3). Somit ist bei dem Peptid NSP4 114-135 eine Altersabhängigkeit zu erkennen, die der ähnlich ist, die bei einer natürlichen Infektion festgestellt wird.
Beispiel 15: Die Auslösung der Diarrhoe ist dosisabhängig
Um festzustellen, ob die Reaktion auf das Peptid NSP4 114-135 dosisabhängig war, wurden 0,1 bis 500 nmol des Peptids 84 CD 1-Jungtieren (6 bis 7 Tage alt) i.p. verabreicht (2). Die Krankheitsreaktion auf das Peptid NSP4 114-135 war dosisabhängig (χ²trend = 9,98, p = 0,0016) bei einem DD₅₀-Wert (50% der diarrhoischen Dosis) von 79 nmol (10).
Beispiel 16: Spezifität der Diarrhoereaktion auf das Peptid NSP4 114-135
Die Spezifität der Auslösung einer Diarrhoe durch das Peptid NSP4 114-135 wurde durch die Verabreichung einer Gruppe von Kontrollpeptiden an Jungtiere von Mäusen bestätigt (Tabellen 1 und 3).
Das mutante Peptid mNSP4 131K, bei dem das Tyrosin in der Position 131 des NSP4 114-135 durch Lysin ersetzt ist, löst keine Diarrhoe aus (0/11), was auf die Bedeutung dieses Tyrosinrestes für die Auslösung der Diarrhoe hinweist. Weder NSP4 2-22 noch NV 464-483 lösten Diarrhoe aus, 0/11 bzw. 0/10. NSP4 90-123, das das Peptid 114-135 mit 9 Resten überlappt, löste nur bei 20% der getesteten Mäuse (2/10) Diarrhoe aus (Tabelle 3). Der Prozentsatz der Auslösung der Diarrhoe stieg auf 50%, wenn das Peptid NSP4 90-123 vernetzt war. Das vernetzte mutante Peptid (m)NSP4 131k löste bei 2 von 10 Mäusen Diarrhoe aus, wohingegen das vernetzte NV 464-483 keine Krankheit hervorrief. Somit scheint es, daß die Reaktion des Peptids allein auf eine Region des NSP4 gerichtet ist, die die Reste 114 bis 135 einschließt.
Beispiel 17: Die Verabreichung des Peptids NSP4 114-135 führt zu einem gehemmten Wachstum
Tiere, denen das Peptid dreimal täglich für zwei Tage verabreicht wurde, zeigten einen schnellen Beginn einer schweren Diarrhoe, gefolgt von einem gehemmten Wachstum. Das Gewicht dieser Tiere war für 3 Wochen nach Verabreichung des Peptids 20 bis 30% geringer (6). Diese Ergebnisse imitieren die Eigenschaften einer Rotaviruserkrankung bei Tieren und Kindern, einschließlich der Tatsache, daß beide nach mehreren Infektionen geringere Wachstumsraten zeigen können.
Beispiel 18: Das Antiserum für das Peptid NSP4 114-135 blockiert die Auslösung einer Diarrhoe
Wir haben auch ausgewertet, ob ein für das Peptid NSP4 114-135 hergestelltes Antiserum die Auslösung einer Diarrhoe blockieren kann (32). Ohne einen Antikörper löste die i.p. Verabreichung von 50 bis 100 nmol des Peptids NSP4 114-135 bei 67% der Mäuse eine Diarrhoe aus. Die i.p. Impfung des für das Peptid NSP4 114-135 spezifischen Antiserums 5 Minuten vor der i.p. Verabreichung des Peptids (50 bis 100 nmol) führte zu einer 90%igen Verringerung der Krankheit. Die i.p. Verabreichung von normalem Kaninchenserum vor dem Peptid blockierte die Diarrhoe nicht.
Beispiel 19: NSP4-Antikörper schützen vor einer vom Virus ausgelösten Erkrankung
Die Möglichkeit der NSP4-Antikörper, vor einer von einem Virus ausgelösten Erkrankung zu schützen, wurde getestet, indem Jungtiere, die von Muttertieren geboren worden waren, die mit dem Peptid NSP4 114-135 oder einem Kontrollpeptid immunisiert worden waren, mit einer hohen Dosis des infektiösen Virus SA11 erregt wurden (33), 5, linke Seite. Die Diarrhoeerkrankung bei Jungtieren, die von Muttertieren geboren worden waren, die mit dem Peptid NSP4 114-135 immunisiert worden waren, war in Bezug auf die Schwere, die Dauer und die Anzahl der Jungtiere mit Diarrhoe deutlich geringer (Fishers exakter Test) (Tabelle 5). Das Peptid NSP4 2-22 diente als Kontrollpeptid, da es bei Jungtieren keine Diarrhoe auslöst.
Bei einem anderen Versuch wurden Jungtiere von Mäusen mit dem Virus SA11 infiziert, und das NSP4-Antiserum oder ein Kontroll-Antiserum wurde alle 4 bis 6 Stunden 60 Stunden lang oral verabreicht, 5, rechte Seite. Die Jungtiere, denen der für NSP4 spezifische Antikörper verabreicht worden war, wiesen eine deutlich abgeschwächte Diarrhoeerkrankung auf - verglichen mit den Tieren, die keine Behandlung, Prä-Immunserum vom Kaninchen oder normales Kaninchenserum (NRS) erhalten hatten (33), (Tabelle 6). Diese Werte zeigen die Möglichkeit von NSP4-Antikörpern, eine von einem Rotavirus ausgelöste Erkrankung zu blockieren.
Beispiel 20: Elektrophysiologische Analysen
sDie vorstehend aufgeführten Werte legen nahe, daß NSP4 Diarrhoe hervorruft, indem es als Enterotoxin wirkt. Da Enterotoxine die reine Ausscheidung in ligierten intestinalen Segmenten ohne histologische Veränderungen stimulieren oder die Ausscheidung in Ussing-Kammern stimulieren, wurden die Effekte des Peptids und von bekannten Ca2+ und cAMP verstärkenden Agonisten bei nicht abgelösten Darmschleimhautschichten der Maus in modifizierten Ussing-Kammern getestet (14). Der Zusatz von Forskolin (FSK, cAMP-Agonist) und von Carbachol (Cch, cholinergischer Agonist, der Ca²⁺ mobilisiert) zur normalen Schleimhaut des Ileums der Maus führte zu meßbaren Erhöhungen des Kurzschlußstroms der C^–-Ausscheidung (Isc, Tabelle 4). Der Zusatz von entweder 5 μM des Peptids NSP4 114-135 (für eine bessere Stabilität untereinander vernetzt) oder von 5 μM Cch zu Schleimhautschichten von 19 bis 22 Tage alten CD1-Mäusen löste geringe (3 bzw. 9 μA/cm²) und vorübergehende (1 bis 2 min) Zunahmen des Isc aus. Wenn die Schleimhautschichten 5 μM des cAMP mobilisierenden Agonisten, FSK, ausgesetzt wurden, wurden stärkere Zunahmen des Isc (44 μA/cm2) hervorgerufen, die innerhalb von 2 bis 3 Minuten die Langzeitwerte erreichten. Nach der Vorbehandlung mit FSK führte die Erregung der Schleimhaut entweder mit dem Peptid oder mit Cch zu viel größeren Zunahmen des Isc der Schleimhaut (64 bzw. 63 μA/cm2), sowohl das Peptid als auch Cch verstärkten die Reaktion auf FSK. Alle Reaktionen auf die Agonisten waren für Bumetamid empfindlich, und die Behandlung der Schleimhautschichten des Ileums mit dem vernetzten Kontroll-Peptid NSP4 2-22 rief keine Reaktion hervor. Die Zugabe von Cch zu Schleimhautschichten von 19 bis 22 Tage alten Mäusen, die mit dem Peptid allein oder dem Peptid in Kombination mit FSK vorbehandelt worden waren, hatten nur einen minimalen oder keinen weiteren Effekt auf Isc. Dieser anschließende Verlust der Empfindlichkeit gegenüber dem Ca²⁺-verstärkten Agonisten (Cch) nach der Vorbehandlung mit dem Peptid legt nahe, daß das Peptid NSP4 den Isc durch Veränderungen des intracellulären Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) verändert. Die Zugabe von Cch zur Schleimhaut einer 35 Tage alten Maus rief wiederum eine geringe (14 μA/cm2) und vorübergehende (1 bis 2 min) Reaktion hervor, die den Effekt von FSK verstärkte (64 μA/cm2), wohingegen es keine oder nur eine minimale Zunahme des Isc gab, wenn das Peptid NSP4 114-135 allein oder mit FSK Schleimhautschichten von 35 Tage alten Mäusen zugesetzt wurde (Tabelle 4).
Die elektrophysiologischen Reaktionen von 19 Tage alten Mäusen erscheinen anfangs gegenüber den biologischen Daten paradox, da bei dem Tier mit diesem Alter keine als Diarrhoe meßbare Ausscheidung beobachtet wurde. Die Diarrhoe war wahrscheinlich bei diesen älteren Tieren aufgrund der erneuten Absorption des Fluids vom Kolon nicht erkennbar. Diese Hypothese wurde durch die i.l. Verabreichung von 200 nmol NSP4 114-135 oder des Kontrollpeptids an 19 Tage alte Jungtiere getestet. 4 Stunden nach der Impfung wurden die Mäuse getötet und die Gedärme wurden gelöst, entnommen, gewogen, und es wurde die Länge gemessen. Die Jungtiere, denen das Peptid NSP4 114-135 gegeben worden war, zeigten im Vergleich mit den Kontroll-Jungtieren eine signifikante Fluidansammlung, obwohl bei keinem der Tiere eine Diarrhoe erkennbar war.
Wir nehmen an, daß jüngere Mäuse eine deutlichere Zunahme des Isc als die zeigen würden, die bei der Schleimhaut von 19 Tage alten zu erkennen ist. Die Darmschleimhaut von jüngeren Mäusen (<19 Tage) konnte aufgrund ihrer geringen Größe jedoch nicht wirksam in Ussing-Kammern befestigt werden; solche Versuche bei sehr jungen Mäusen erfordern die Entwicklung neuer Verfahren, um die Ausscheidung von Cl^– in vitro zu messen. Trotzdem verstärkte das Peptid NSP4 114-135 die Ausscheidung bei 35 Tage alten Mäusen nicht, wenn sie mit der Altersabhängigkeit in Zusammenhang gebracht wird, die in vivo festgestellt worden ist.
Beispiel 21: Modell für eine vom Rotavirus ausgelöste diarrhoische Erkrankung
Auf der Basis unserer Ergebnisse bei der von NSP4 ausgelösten Diarrhoe bei Mäusen und Ratten schlagen wir ein Modell vor, bei dem zwei intestinale Rezeptoren für die symptomatische Rotavirusinfektion erforderlich sind. Ein Rezeptor bindet die Rotaviruspartikel, was zum Eintritt des Virus und einer Genexpression, jedoch nicht notwendigerweise zur Erkrankung führt, wohingegen der zweite Rezeptor für NSP4 spezifisch ist. NSP4, das in den, infizierten Zellen ausgeprägt worden ist, würde in das Lumen abgegeben und mit dem zweiten Rezeptor auf benachbarten Zellen in Wechselwirkung treten. Diese Wechselwirkung würde einen Weg für die Weiterleitung eines Signals auslösen, wodurch die [Ca2+]_i-Werte erhöht und die endogenen intestinalen Aus scheidungswege verstärkt würden. Mit einer neu erstellten ELISA, die ausreichend empfindlich ist, um 31,3 ng oder 0,02 nmol NSP4 nachzuweisen, haben wir NSP4 im diarrhoischen Stuhl von mit Rotavirus infizierten Mäusen in den Konzentrationen nachgewiesen, die für die Auslösung der Erkrankung erforderlich sind. NSP4 war im Stuhl von Tieren ohne Diarrhoe nicht vorhanden.
Dieses Modell paßt zu den verfügbaren Daten von einer vom Rotavirus ausgelösten Diarrhoe. Bei jungen Mäusen verursachen homologe und heterologe Rotaviren eine diarrhoische Erkrankung. Bei jungen Mäusen, die mit dem Affen-Virus SA11 infiziert sind, wird zum Beispiel kein infektiöser Virus produziert, das histopathologische Abstumpfen der Zotten wird nicht beobachtet, es wird jedoch eine Diarrhoe ausgelöst (34). Bei anderen Tieren wird die Diarrhoe vor den histologischen Veränderungen erkannt (12). Erwachsene Mäuse werden von murinen Rotaviren leicht infiziert, zeigen jedoch keine Diarrhoe oder andere Symptome (35). Der Virus kann jedoch aus fäkalen Proben isoliert werden, und die Virusreplikation kann in intestinalen Zellen von erwachsenen Tieren nachgewiesen werden (32).
Nach diesem Modell besitzen die Därme von jungen Mäusen einen für NSP4 spezifischen Rezeptor, dessen Anzahl oder Struktur oder Aktivität abnimmt bzw. sich verkleinert, wenn die Maus altert, und Wechselwirkungen mit diesem Rezeptor stimulieren die Ausscheidung von Cl^–, was zur beobachteten diarrhoischen Erkrankung führt. Unser Modell sagt vorher, daß die Bindungsaktivitäten oder die Konzentration der NSP4-Rezeptoren bei erwachsenen Tieren deutlich geringer ist, so daß der Kolon die Zunahme der Fluidausscheidung aufnehmen kann. Die erwachsene Maus kann einen Virus replizieren und ausscheiden, es wird jedoch keine Erkrankung beobachtet. Das heißt, obwohl der Rezeptor für die Rotavirusinfektion mit dem Alter erhalten bleibt, wodurch die erwachsene Maus den Virus replizieren und ausscheiden kann, bleibt der NSP4-Rezeptor mit der Alterung nicht erhalten, so daß keine Erkrankung beobachtet wird.
Eine weitere Unterstützung für unser Modell kommt von unserer Beobachtung, daß NSP4 bei jungen Ratten zu Diarrhoe führt. Es hat sich nicht gezeigt, daß ein Rotavirus der Gruppe A Ratten infiziert, was nahelegt, daß diesen Tieren der Rezeptor für die Virusinfektion fehlt. Die Auslösung der Diarrhoe mit NSP4 zeigt jedoch, daß der Rezeptor für dieses Protein vorliegt und mit NSP4 stimuliert werden kann, was zu einer Zunahme der intracellulären Calciumwerte und einer Verstärkung der Krankheit führt.
Diese Werte zeigen gemeinsam, daß NSP4 ein Enterotoxin ist: Die Peptide NSP4 und NSP4 114-135 und 120-147 lösen bei zwei Nagetiermodellen Diarrhoe aus; die Auslösung der Diarrhoe ist spezifisch, alters- und dosisabhängig; und die elektrophysiologischen Analysen in Ussing-Kammern zeigen, daß NSP4 die Ausscheidung von Cl^– über einen von Ca2+ abhängigen Weg in der Darmschleimhaut von jungen Mäusen stimuliert. NSP4 tritt mit einem altersabhängigen intestinalen Rezeptor in Wechselwirkung, regt den Weg für die Weiterleitung eines Signals an und verstärkt [Ca²⁺]_i, was zur Ausscheidung von Cl^– oder zur Diarrhoe führt.
Beispiel 26: Herstellung und Verwendung eines NSP4-Toxoids
Vakzine, die NSP4 in Form eines Toxoids umfassen, können aus dem gereinigten Protein NSP4 hergestellt werden. Das gereinigte Protein kann chemisch behandelt werden, wobei bekannte Verfahren angewendet werden, um die biologische Aktivität des Proteins NSP4 zu inaktivieren, wohingegen die Immunogenität erhalten bleibt. Das gereinigte Protein kann zum Beispiel etwa 1 Stunde bei etwa 37° mit einer 10%igen Formaldehydlösung behandelt werden. Dem Fachmall ist klar, daß andere äquivalente Protokolle zur Herstellung eines Toxoids an gewendet werden können, ohne vom Gedanken der Erfindung abzuweichen. Nach der chemischen Behandlung wird das Toxoid typischerweise mit einem Puffer, zum Beispiel mit Phosphat gepufferter Salzlösung oder dergleichen, gewaschen und zu einem Vakzin formuliert. Das Toxoid kann in einer festen Form, wie auf Alaun oder dergleichen adsorbiert, vorliegen. Alternativ kann das Toxoid in Lösung in irgendeiner pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeit vorliegen. Das Toxoid kann als Vakzin ohne irgendein Adjuvans verabreicht werden. Ein mit dem Toxoid formuliertes Vakzin kann Adjuvantien einschließen, zu denen Alaun, komplettes Freundsches Adjuvans und inkomplettes Freundsches Adjuvans, Ribis Adjuvans, bakterielle und mycobakterielle Zellwandkomponenten und Derivate davon, Liposome und irgendeine andere Adjuvans-Formulierung, die auf diesem Fachgebiet bekannt ist, gehören, sie sind jedoch nicht darauf begrenzt. So formulierte Vakzine können auf parenteralen oder Schleimhautwegen, wie durch intraperitoneale, intranasale, intragastrische, subkutane, intramuskuläre oder rektale Anwendung, verabreicht werden.
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Die hier offenbarte Erfindung soll nicht durch irgendwelche hier gemachten Feststellungen eingeschränkt werden. Tabelle 1
Tabelle 2 Intraileale Verabreichung von NSP4 und NSP4 114-135
Tabelle 3 Spezifität der Diarrhoereaktion: Auslösung einer Diarrhoe bei CD1-Mäusen nach der i.p. Verabreichung von 50 bis 100 nmol Peptid
Tabelle 4 Elektrophysiologische Analysen der Schleimhaut des Ileums von CD1-Mäusen
Tabelle 5 Die Immunisierung mit dem Peptid NSP4 114-135 löst eine schützende Immunität vor einer Erregung mit dem infektiösen Rotavirus aus
Tabelle 6 Schutz vor einer schweren Rotavirus-Diarrhoe (≥3+) nach der Verabreichung des für NSP4 spezifischen Antikörpers

Claims

Zusammensetzung zum Immunisieren einer Person gegenüber einer Rotavirusinfektion oder -erkrankung, die ein Peptid NSP4 114-135 oder ein Derivat davon umfaßt.
Zusammensetzung zum passiven Immunisieren einer Schwangeren gegenüber einer Rotavirusinfektion oder -erkrankung, die ein Peptid NSP4 114-135 oder ein Derivat davon umfaßt.
Zusammensetzung zum Immunisieren einer Person gegenüber einer Rotavirusinfektion oder -erkrankung, die ein Peptid NSP4 120-147 oder ein Derivat davon umfaßt.
Zusammensetzung zum passiven Immunisieren einer Schwangeren gegenüber einer Rotavirusinfektion oder -erkrankung, die ein Peptid NSP4 120-147 oder ein Derivat davon umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Peptid oder das Derivat davon nach einem Syntheseverfahren hergestellt worden ist.