KR100318516B1 - Ｅ형 간염 파키스탄형 균주의 재조합 단백질 및 이를이용한 진단방법과 백신 - Google Patents

Ｅ형 간염 파키스탄형 균주의 재조합 단백질 및 이를이용한 진단방법과 백신 Download PDF

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에머슨수잔유.
퍼셀로버트에이치.
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스피겔 잭
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Abstract

장내를 통해 전파되는, A형 간염도 아니고 B형 간염도 아닌, 현재 E형 간염으로 불리우는 간염과 관련된 파키스탄형 E형 간염 바이러스 균주 (SAR-55)가 개시되어 있다. 본 발명은 오픈 리딩프레임 2 (ORF-2)라고 명명된, SAR-55의 전체 구조 유전자 영역을 진핵성 발현 시스템에서 발현시키는 것에 관한 것이다. 이렇게 하여 발현되는 단백질은, 진단용 면역분석시 항원으로서 작용할 수 있고 면역원이나 백신으로 작용하여 E형 간염 바이러스의 감염을 예방할 수 있는 HEV 바이러스성 입자를 만들어낼 수 있다.

Description

Ｅ형 간염 파키스탄형 균주의 재조합 단백질 및 이를 이용한 진단방법과 백신{Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines}
본 출원은 1992년 9월 18일자로 출원되었지만 현재는 포기된 미국특허출원 제07/947,263호의 일부계속출원이다.
본 발명은 간염 바이러스학 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 파키스탄에서 분리된, E형 간염의 장내 전파 균주인 SAR-55로부터 유래된 재조합 단백질과 이 단백질을 이용한 진단방법 및 백신에 관한 것이다.
장내에서 전파되는, 비A형/비B형 간염인 E형 간염의 전염성에 대해서는 아시아, 아프리카 및 중앙 아메리카에서 보고된 바 있다 (Balayan, M.S. (1987), Soviet Medical Reviews, Section E, Virology Reviews, Zhdanov, 0-V.M. (ed), Chur, Switzerland:Harwood Academic Puclishers,vol. 2, 235-261; Purcell, R.G. 등 (1988), Zuckerman, A.J. (ed), 'Viral hepatitis and Liver Disease', 뉴욕: Alan R. Liss, 131-137; Bradley, D.W. (1990),British Medical Bulletin, 46-442-462; Ticehurst, J.R., Hollinger, F.B., Lemon, S.M., Margolis, H.S. (eds): 'Viral Hepatitis and Liver Disease', Williams and Wilkins, 볼티모어, 501-513). E형 간염으로 추측되는 간헐적인 간염의 경우가 E형 간염 바이러스가 유행하고 있는 국가에서 보고된 간염의 90%까지 이르고 있다. 감염된 개체의 혈정에 있는 항-HEV 항체를 검출하기 위한 혈청 테스트의 개발에 대한 필요성이 이 분야에서 널리 인식되고 있기는 하지만, 감염된 사람이나 동물로부터 분비되는 HEV의농고가 매우 낮아서 이러한 HEV를 혈청 테스트용 항원 소스로서 사용한다는 것은, 비록 세포배양에서 HEV의 증식에 성공한 예가 아주 제한적으로 있기는 하지만 (Huang, R.T. 등 (1992),J. Gen. Virol., 73;1143-1148), 불가능하다고 할 수 있으며, 현재로는 세포배양에 의해 혈청 테스트에 필요한 양만큼 항원을 제조하는 것은 너무나 효율적이다.
최근, E형 간염과 관련에 있는 바이러스의 유전자 씨퀀스를 확인하기 위한 연구가 세계적으로 이루어져 온 결과, 제한된 수의 HEV 균주의 유전자가 클로닝되었다 (Tam, A.W. 등, (1991), Virology, 185: 120-131; Tsarev, S.A. 등, (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:559-563; Fry, K.E. 등, (1992), Virus Genes, 6:173-185). 이 연구에 참여한 연구원들은 DNA 씨퀀스를 분석한 결과 HEV 유전자가 세 개의 오픈 리딩프레임(ORF)으로 구성되어 있으며, 이들 ORF가 완전한 HEV 단백질을 코딩한다는 가설을 세우게 되었다.
미얀마형 HEV 균주의 유전자에 대한 부분적인 DNA 씨퀀스가 싸이언스지(Rey 등, 1990,Science, 247:1335-1339)에 개시되어 있다. 탐 등과 리예스 등은 1991년 10월 17일자로 발생된 PCT 특허출원공개 WO91/15603호에 미얀마형 HEV 균주의 완전한 뉴클레오티드 씨퀀스와 이로부터 유도되는 아미노산 씨퀀스를 개시하였다. 이들 발명자들은 세 개의 정방향 오픈 리딩프레임이 이 균주의 씨퀀스내에 포함되어 있다는 가설을 세웠다.
이치가와 등은 HEV-감염된 사이노몰구스 원숭이 (cynomolgus monkey)의 혈청을 이용하여 λgtl1 발현 라이브러리를 조사하여 길이가 240-320개의 뉴클레오티드로 된 일련의 클론들을 분리하였다 (1991,Microbiol, lmmunol., 35:535-543). 하나의 클론에 의해 발현되는 재조합 단백질은 E. coli에서 발현되었다. 이러한 융합 단백질은 미얀마형 HEV 균주의 ORF-2의 3' 영역에 의해 코딩된다.
미얀마형 HEV 브루마 균주와 미얀마형 HEV 균주의 ORF-2의 3' 영역내에서 코딩되는 또 다른 단백질의 발현에 대해서는 야르보우 등에 의해 보고되었다 (Yarbough 등,1991,J. Virology, 65:5790-5797). 이 논문에는 HEV로부터 유래된 두 개의 cDNA 클론이 동정되어 있다. 이들 클론은 ORF-2의 3' 영역에 단백질을 코딩하고 있으며, 융합 단백질로서E. coli에서 발현되었다.
퍼디 등과 파보로브 등은 미얀마형 균주로부터 보다 큰 ORF-2 단백질 단편을E.coli」에서 발현시킨 것에 대해 보고하였다 (Purdy 등, Archives of Virology, 123:335-349, Favorov 등, 1992,J. of Medical Virology, 36:246-250). 이들 문헌에는 이전에 논의된 문헌과 마찬가지로 세균의 발현시스템을 이용하여 ORF-2 유전자의 일부를 발현시키는 것만이 보고되어 있다. 완전한 전체 ORF-2 단백길의 성공적인 발현에 대해서는 본 발명 이전까지는 전혀 보고된 바가 없다.
HEV의 유전자 기구와 형태학적인 구조를 다른 바이러스와 비교한 결과, HEV가 칼리시바이러스(calicivirus)에 가장 밀접한 관련을 가지고 있는 것으로 나타났다. 흥미로운 것은, 칼리시바이러스의 구조적 단백질이 이 바이러스의 유전자의 3' 영역에 의해 코딩된다는 것과(Neil, J.D. 등,(1991)J. Virol,65:5440-5447; Carter. M. J. 등, (1992),J. Arch Viro1.,122:223-235), HEV 유전자의 3' 말단영역이 구조적 단백질도 코딩한다는 직접적인 중거가 없다할지라도, 세균세포에서 3'유전자 영역의 어떤 작은 부분의 발현으로 인해 단백질이 제조되머, 이 단백질은 ELlSA와 웨스턴 블롯방법에서 항-HEV 혈청에 대해 반응성을 나타낸다는 것이다 (Yarborough 등, (1991): lchikawa 등, (1991); Favorov 등, (1992), Dawson, G.J.등,(1992),J. Virol. Meth.; 38:175-186). 그러나, 구조적 단백질로서의 ORF-2 단백질의 기능은 본 발명 이전까지는 입증되지 않았다.
ORF-2 유전자의 일부에 의해 코딩되는 작은 단백질들은 면역학적 분석법에서 동물 혈청에 있는 HEV에 대한 항체롤 검출하는데 이용되어 왔다. 면역학적 분석법에서의 항원으로서 세균에 의해 발현되는 작은 단백질들을 이용하는 경우에는 여러가지 문제가 발생한다. 첫째로는, 세균 세포에서의 이들 작은 단백질의 발현이 용해성 문제를 초래하며, 미정제된 대장균의 용혈체가 면역학적 분석방법에서 항원으로서 이용되는 경우에는 환자의 혈청과 대장균의 단백질간에 비특이적인 교차반응이 발생된다 (Purdy 등 (1992)). 두 번째로는, 루틴한 역학 데스트에서 항-HEV 항체에 대한 1차적인 혈청학적 테스트로서의 웨스턴 블롯방법은 시간과 비용면에서 비실용적이다. HEV 유전자의 3' 말단영역으로부터 유도된 작은 펩티드를 이용하여 ELISA 방법을 실시하는 경우에는 공지된 HEV 감염 환자의 단지 41%만이 양성으로 나타난다. 세 번째로는, 칼리시비리네와 가장 가까운 훼밀리(料)인 피코르나비리데를 포함하여 많은 바이러스의 경우에, 중요한 항원성 및 면역학적 에피토가 매우 입체적인 구조롤 가지고 있다는 것이다 (Lemon, S.M. 등,(1991), Hollinger., F.B., Lemon, S.M., Margolis, H.S. (eds): ''Viral Hepatitis and Liver Disease'', Williams and Wilkins, 볼티모어,20-24). 이러한 이유 때문에,진핵세포 시스템에서 완전한 HEV 유전자를 코딩하는 완전한 ORF의 발현은 HEV 바이러스와 같은 입자를 형성할 수 있는 단백질의 제조를 초래하는 것으로 추측된다. 이러한 완전한 ORF 단백질은, HEV의 구조적 단백질의 단지 일부만을 나타내는 전술한 보다 작은 단백질에 비해, 원래의 캡시드 단백질의 면역학적 구조에 보다 가까운 면역학적 구조를 가지고 있을 것이다. 그러므로, 이들 완전한 ORF 단백질은 현재까지 이용된 보다 작은 단백질에 비해 보다 전형적인 항원으로서 또한 보다 효과적인 면역원으로서 작용하기가 용이하다.
본 발명은 분리동정되어 실질적으로 순수한, 사람의 E형 간염 바이러스 균주인 SAR-55에 관한 것이다.
본 발명은 또한 분리동정되어 실질적으로 순수한, 사람의 E형 간염 바이러스균주인 SAR-55의 유전물질인 RNA에 관한 것이다.
본 발명은 또한 사람의 E형 간염 바이러스 균주인 SAR-55의 cDNA에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 재조합 HEV 단백질을 제조할 수 있는 인공 핵산 씨퀀스 뿐만 아니라 이와 균등한 천연 핵산 씨퀀스를 제공하는 것이다. 이러한 천연 핵산 씨퀀스는 HEV 단백질을 합성할 수 있는 유전자가 분리 동정할 수 있는 유전자 라이브러리 또는 cDNA로부터 분리될 수 있다. 본 발명에서는, 핵산 씨퀀스는 RNA, DNA, cDNA 또는 단백질을 코딩할 수 있는 것이라면 이들의 어떠한 인공 변형체라도 의미하는 것이다.
본 발명은 또한 SAR-55 cDNA로부터 유도된 프라이머를 이용하여 E형 간염 유전자 단편들을 선택적으로 증폭시키는 것을 기본으로 하여 생물학적 시료에서 E형간염 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 SAR-55 cDNA로부터 유도된 한가닥으로 된 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 E형 간염 유전자의 발현을 저해하는방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 SAR-55의 HEV 유전자 또는 인공 핵산 씨퀀스에 의해 코딩되는 단백질로서, 분리동정되어 실질적으로 순수한 HEV 단백질과 보다 상세하게는HEV의 적어도 하나의 완전한 오픈 리딩프레임에 의해 코딩되는 재조합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 또한 핵산을 클로닝하여 cDNA를 발현 벡터에 삽입한 다음 재조합 단백질을 숙주 세포에서 발현시킴으로써 HEV 유전자 씨퀀스로부터 유도된 재조합 HEV 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 전술한 방법에 의해 제조된 재조합 HEV 단백질을 진단용 시약 및 백신으로서 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 생물학적 시료에 있는 E형 간염 바이러스에 대해 특이적인 항체를 검출하는 방법을 포함한다. 이러한 방법들은 HEV에 의해 야기되는 감염과 질병의 진단에 유용하며 이러한 질병의 진전상황을 모니터링하는데도 유용하다. 이들 방법들은 또한 포유동물에 대해 HEV 감염과 이로 인한 질병을 치료하는 과정에서 치료제의 효능을 모니터링하는데도 유용하다.
본 발명은 또한 포유동물의 E형 간염을 예방 또는 치료하는데 이용되는 약학적 조성물에 관한 것이다.
도 1은 HEV 균주 SAR-55의 유전자로부터 완전한 ORF-2 단백질을 발현시키는데 이용되는 재조합 벡터를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 야생형 바쿨로바이러스(bacu1ovirus) 또는 재조합 바쿨로바이러스 (ORF-2를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 것)에 감염된 곤층 세포의 세포 용해물을 쿠마시 블루로 염색한 시료(도 2a) 또는 HEV-감염된 침팬지를 이용하여 웨스턴 블롯팅한 시료(도 2b)에 대한 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드겔(SDS-PAGE) 시험 결과를 나타낸다. 도 2a 및 도 2b에서, 레인 1은 감염되지 않은 SF-9 세포의 전체 세포 용해물을 함유하고 있고; 레인 2는 야생형 바쿨로바이러스에 감염된 세포의 용해물을 함유하고 있고; 레인 3은 재조합 바쿨로바이러스에 감염된 세포의 용해물을 함유하고 있고; 레인 4는 분자량 마커를 함유하고 있다.
도 3a-3d 및 도 3e는 각각 30nm 및 20nm 길이의 바이러스성 입자에 대한 면역전자현미경 사진을 나타내는데, 이들 입자들은 재조합체에 의해 감염된 곤충 세포에서 발현된 0RF-2 단백질들이다.
도 4는 완전한 0RF-2를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 곤충 세포로부터 발현된 재조합 ORF-2를 항원으로서 이용하여 실시된 ELlSA 의 결과를 나타낸다. 혈청의 항-HEV 항체 수준은 사이노몰구스 원숭이에 HEV의 맥시코형 균주 (Cyno-80A82, Cyno-9A97 및 Cyno 83) 또는 파키스탄형 균주 (CyIlo-374)를 접종한 다음 경과시간에 따라 측정되었다.
도 5a-d는 완전한 ORF-2를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 곤충 세포로부터 발현되는 재조합 ORF-2를 항원으로서 이용하여 실시된 ELISA의 결과를 나타낸다. 혈청의 IgG또는 IgM 항-HEV 항체의 수준은 두 마리의 침팬지에 HEV를 접종한 다음 경과시간에 따라 측정되었다.
도 6a-j는 SAR-55로부터 유도된 재조합체인 완전한 ORF-2 단백질을 항원으로서 이용한 경우와, 미얀마형 HEV 균주 (Genelabs)로부터 유도된 부분적인 재조합체인 ORF-2 단백질을 항원으로서 이용한 경우에 실시된 ELISA 결과들을 비교하여 보여주고 있다.
도 7a-j는 SAR-55 HEV 10% 분비물 현탁액 (fecal suspension)을 연속적으로 10배씩 희석한 희석액 (각각의 도면의 상단에 팔호 안에 희석으로 인한 희석농도가 표시되어 있음)으로 접종된 사이노몰구스 원숭이에 대한 항-HEV IgG ELISA와 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT) 값을 나타내는 그래프들이다. ELISA 테스트에 이용된 재조합 항원들은 다음과 같다: 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST); 3-2(M), 3-2 에피토프 (Yarbough 등, (1991),J. Virol., 65:5790-5797)와 GST의 융합체; SG3 (B), ORF-2의 C-말단 아미노산 327개와 GST의 융합체 (Yarbough 등, (1993):Assay Development of diagnostic tests for Hepatitis E in 'lnter1lational Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. Scientific program and Abstract Volume', 토쿄:VHFl p.87) 및 곤충 세포에서 직접적으로 발현된 55 kDa 0RF-2 생성물.
도 8a-e는 SAR-55 HEV 10% 분비물 현탁액 (fecal suspension)을 연속적으로 10배씩 회석한 희석액 (각각의 도면의 상단에 괄호 안에 희석으로 인한 회석농도가 표시되어 있음)으로 접종된 양성 사이노몰구스 원숭이에 대한 항-HEV IgM ELISA와ALT 값을 나타내는 그래프들이다. ELISA 테스트에 이용된 재조합 항원들은 다음과같다: 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST); 3-2(M), 3-2 에피토프 (Yarbough 등, (1991),J. Virol., 65:5790-5797)와 GST의 융합체; SG3 (B), 0RF-2의 C-말단 아미노산 327개와 GST의 융합체 (Yarbough 등, (1993)) 및 곤충 세포에서 직접적으로 발현된 55 kDa ORF-2 생성물.
도 9는 SAR-55 HEV 10% 분비물 현탁액 (fecal suspension)을 연속걱으로 10배씩 희석한 희석액 (각각의 도면의 상단에 괄호 안에 회석으로 인한 희석농도가 표시되어 있음)의 추출물로부터 제조된 PCR 생성물을 분리하기 위해 실시된 2% 아가로스 겔 테스트에서 겔을 브롬화 에티디움으로 염색한 것을 나타내고 있다. PCR생성물의 예상되는 길이는 약 640 염기쌍이었으며,(M)으로 표시된 칼럼은 DNA 크기에 대한 마커를 포함하고 있는 것이다.
도 10은 완전한 ORF-2 단백질 또는 이보다 분자량이 작은 단편을 이스트에서발현시키는데 이용되는 pPIC9 벡터를 나타낸다.
본 발명은 파기스탄으로부터 채취되어 분리동정되고 실질적으로 정제된 E형 간염 바이러스(HEV) 균주인 SAR-55에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HEV의 단백질을 코딩하는 바이러스의 유전자를 클로닝하는 것과, 발현 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 발현시키는 것에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명는 SAR-155로부터 유래된 HEV의 오픈 리딩프레임(ORF)의 클로닝과 발현에 관한 것이다.
본 발명은 분리동정된 HEV 단백질에 관한 것이다. 바람직하기로는, 본 발명의 HEV 단백질은 원래의 HEV 단백질에 대해 실질적으로 상동성을 나타내며 또한 보다 바람직하기로는 원래의 HEV 단백질과 생물학적으로 균등물이다. 본 명세서와 특허청구범위 전체를 통해 사용되고 있는 '생물학적 균등'이란, 그 조성물이 바이러스성 입자를 형성할 수 있으며, 면역원성을 나타내는 것을 의미한다. 본 발명의 HEV 단백질은 또한 포유동물에 투여되는 경우에 야생형 HEV에 대항하여 그 포유동물을 보호할 수 있는 방어용 항체의 생산을 자극 촉진할 수도 있다. 본 명세서와 특허청구범위 전체를 통해 사용되고 있는 '실질적으로 상동성을 나타낸다'는 의미는 아미노산 씨퀀스에 있어서의 원래의 HEV 단백질에 대한 상동성 정도를 말한다. 바람직하기로는, 상동성의 정도는 70%를 넘으며, 보다 바람직하기로는 90%를 넘는데, 특별히 바람직한 단백질군은 원래의 HEV 단백질과 99% 이상의 상동성을 나타내는 것이다.
바람직한 HEV 단백질은 ORF 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. 특히 중요한 것은, HEV의 ORF-2 유전자에 의해 코딩되는 단백질이며, 가장 바람직한 단백질 은 HEV의 SAR-55 균주의 ORF-2 유전자에 의해 코딩된다. ORF-2 유전자에 의해 코딩되는 본 발명의 바람직한 단백질은 바이러스성 입자를 형성한다. 0RF-1, ORF-2 및 ORF-3 단백질의 아미노산 씨퀀스는 각각 SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 및 SEQ lD NO.3로 나타나 있다:
영문자 3자로 된 약어체는 20개의 자연에서 발견되는 아미노산에 대한 일반적인 아미노산 속기체를 따르고 있다.
바람직한 재조합 HEV 단백질은 적어도 하나의 ORF 단백질로 구성되어 있다. 단백질의 생물학적 성질을 변화시키기 위해 동일하거나 또는 서로 다른 ORF 단백질 하나 이상으로 이루어진 다른 재조합 단백질도 만들어질 수 있다. 개별적인 아미노산들 또는 개별적인 아미노산 씨퀀스들의 첨가, 치환 또는 삭제에 의해 HEV 단백질의 생물학적 활성을 개선할 수 있다.
본 발명은 또한 HEV 단백질과 실질적으로 상동성을 나타내는 단백질 또는 전술한 HEV 단백질을 생산할 수 있는 핵산 씨퀀스에 관한 것이다. SAR-55라고 명명된 본 발명의 핵산은 하기 SEQ ID NO.4로 기재되어 있으며, 1992년 9월 17일자로미국균주기탁협회 (American Type Culture Collection (ATCC))에 기탁되었다 (ATCC 접수번호 75302).
뉴클레오티드에 대해 사용된 약자들은 이 기술분야에서 표준화된 약자들이다.
한쪽 방향의 씨퀀스롤 통상 '플러스' 씨퀀스라고 부르는네, 이는 이 씨퀀스가 RNA 바이러스의 단백질을 코딩하는 스트랜드이기 때문이며, 이 씨퀀스는 SEQ ID NO.4로서 위에 도시된 씨퀀스이다.
SAR-55의 오픈 리딩프레임으로부터 유도되는 아미노산 씨퀀스는 SEQ ID NO.1, SEQ lD NO.2 및 SEQ ID NO.3을 가지고 있다. ORF-1은 SEQ lD NO.4의 뉴클레오티드 28에서 시작하여 5078개의 뉴클레오티드까지 뻗어 있는 것이다; 0RF-2는 SEQ lD NO.4의 뉴클레오티드 5147에서 시작하여 1979개의 뉴클레오티드까지 뻗어 있는 것이다: ORF-3은 SEQ ID NO.4의 뉴클레오티드 5106에서 시작하여 368개의 뉴클레오티드까지 뻗어 있는 것이다.
ORF-2 단백질의 상사체를 제조할 수 있는 DNA 씨퀀스를 만들어낼 수 있는 DNA 씨퀀스에 대한 여러 가지 변형체를 생각해 볼 수 있다. 'ORF-2 단백질의 상사체(analog)'란, 본 명세서와 특허청구범위 전체를 통해, 여기에 특별히 도시된 씨퀀스와 실질적으로 동일한 아미노산 씨퀀스를 가지고 있는 단백질을 의미한다. 즉,여기에 제시된 씨퀀스를 이루는 잔기 중에서 하나 또는 그 이상의 잔기가 생물학적으로 균등한 잔기에 의해 치환되어, 이로 인해 생성되는 단백질 (즉, 상사체)이 바이러스성 입자를 생산할 수 있고 면역원으로 작용할 수 있을 때 그 단백질을 의미하는 것이다. 전술한 DNA 씨퀀스는 본 발명의 바람직한 일태양에 불과한 것임을 주목해야 한다. 유전자 코드의 퇴화성으로 인해, 뉴클레오티드를 다양하게 여러 가지로 선택하면 ORF 단백질 또는 그 상사체를 만들 수 있는 것으로 이해되어야한다. 전술한 씨퀀스와 기능적으로 균등한 DNA 씨퀀스 또는 전술한 아미노산 씨퀀스에 따라 제조되는 ORF 단백질의 상사체를 생산하는 씨퀀스와 기능적으로 균등한 DNA 씨퀀스는 그 자체로서 본 발명의 범위내에 포함된다.
본 발명은 E형 간염 유전자 단편의 선택적인 증식을 토대로 하여 섕물학적 시료에서 E형 간염 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다. 바람직하기로는, 이 방법은 2중가닥 DNA 단편에서 반대편 가닥의 비상동 영역으로부터 유래된 한쌍의 단일가닥 프라이머를 이용하는 것인데, 상기 2중가닥 DNA 단편은 SEQ lD NO.4에 도시된 SAR-55 씨퀀스에 대해 상동인 영역을 가지고 있는 유전자를 지닌 E형 간염 바이러스로부터 유래된 것이다. 이들 프라이머들은 미국 특허 제4,683,202호의 방법에 따라 선택된 아미노산 씨퀀스를 증폭시키는 방법으로 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 SAR-55 cDNA의 상동 씨퀀스로부터 유래된 단일가닥의 안티센스 폴리- 또는 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 E형 간염 유전자의 발현을 저해하는 방법에 관한 것이다. 이들 안티센스 폴리- 또는 올리고 뉴클레오티드는 DNA일수도 있고 RNA일 수도 있다. 타겟 씨퀀스는 일반적으로 전령 RNA이며, 보다 바람직하기로는 RNA의 후처리(processing) 또는 번역작업(translation)에 필요한 씨그날 씨퀀스이다. 안티센스 폴리 또는 을리고 뉴클레오티드는 폴리리신과 같은 폴리 양이온물질에 접합될 수 있으며 (Lemaitre, M. 등, (1989), Proc Natl Acad Sci USA 84:648-652), 이러한 접합체는 전령 RNA와 하이브리드를 형성하기에 충분한 양만큼 포유동물에 투여되어 전령 RNA의 기능을 저해할 수 있다.
본 발명은 HEV 단백질, 바람직하기로는 적어도 하나의 ORF 단백질, 가장 바람직하기로는 적어도 하나의 ORF-2 단백질로 구성된 단백질을 제조하기 위한 재조합 DNA 조작방법을 포함한다. 재조합 ORF 단백질은 하나의 ORF 단백질 또는 동일하거나 서로 다른 ORF 단백질의 조합체로 되어 있다. 천연 또는 인공 핵산 씨퀀스가 HEV 단백질의 제조에 이용될 수 있다. 본 발명의 일태양에 따르면, 이 방법은:
(a) 숙주로 하여금 HEV 단백질올 생산할 수 있도록 하는 핵산 씨퀀스를 준비하는 단계;
(b) 숙주에 감염되어 복제될 수 있으며 상기 핵산 씨퀀스에 대한 작동 요소(operational element)를 가지고 있는 벡터에 상기 핵산 씨퀀스롤 클로닝하는 단계;
(c) 상기 핵산 및 작동 요소를 가지고 있는 상기 벡터를 상기 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주에 감염시키는 단계;
(d) 상기 벡터의 증식과 상기 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 숙주를 배양하는 단계;및
(e) 상기 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, HEV의 핵산에 의해, 바람직하기로는 HEV의 적어도 하나의 ORF에 의해 또는 동일하거나 서로 다른 ORF 단백질의 조합체에 의해, 가장 바람직하기로는 적어도 하나의 ORF-2 핵산 씨퀀스에 의해 코딩되는 단백질에 대한 재조합 DNA를 합성하는 방법은:
(a) 숙주로 하여금, 상기 단백질이 제조될 수 있는 조건하에서, HEV 단백질을 생산할 수 있도록 하는 핵산 씨퀀스를 가지고 있는 감염 또는 형질전환된 숙주를 배앙하는 단계를 포함하며, 상기 단백질은 HEV로부터 분리된 원래의 HEV 단백질에 대해 실질적인 상동성을 나타내며, SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 또는 SEQ lD NO.3에 따른 아미노산 씨퀀스 또는 그것의 조합 씨퀀스롤 가지고 있다.
본 발명의 일태양에 있어서, HEV 균주 SAR-55의 바이러스 유전자의 RNA 씨퀀스를 분리한 다음 이를 다음과 같이 cDNA에 클로닝하였다. SAR-55에 감염된 사이노몰구스 원숭이로부터 채취된 생물학적 시료로부터 바이러스의 RNA를 추출한 다음 역전사시키고, 버마로부터의 HEV 균주 (Tam 등, (1991))의 유전자 또는 SAR-55 유전자의 플러스 또는 마이너스 가닥에 대해 상보적인 프라이머를 이용하여 폴리머라제 체인반응(PCR)에 의해 증폭시킨다. PCR 단편을 pBR322 또는 pGEM-32에 써브클로닝하여 이중가닥의 PCR 생성물을 씨퀀싱한다.
본 발명에서 이용될 수 있는 벡터는 전술한 바와 같이 핵산 씨퀀스가 바람직한 또는 필요한 작동 요소와 함께 삽입된 다음, 그 벡터가 숙주내로 감염되어 숙주내에서 복제될 수 있는 것이면 어느 것이어도 무방하다. 바람직한 벡터는 제한부위가 잘 알려져 있는 것으로서, 핵산 씨퀀스의 전사에 필요한 작동 요소를 가지고 있는 벡터들이다.
여기에서 '작동 요소'란 적어도 하나의 프로모터, 적어도 하나의 오퍼레이터, 적어도 하나의 리더 씨퀀스, 적어도 하나의 종결 코돈 및 그밖에 벡터 핵산의 전사와 번역에 필요한 DNA 씨퀀스롤 포함한다. 특히, 이러한 벡터는 하나 이상의 선택성 마커 및 핵산 씨퀀스의 전사를 개시할 수 있는 하나 이상의 프로모터 씨퀀스프와 함께 숙주에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 복제 출발점을 포함한 것으로 생각된다.
본 발명의 클로닝 벡터를 제조함에 있어서, 복수개의 핵산 씨퀀스와 이에 따른 작동 요소가 긱각의 벡터에 삽입될 수 있다는 것에 대해서도 주목해야 한다. 이러한 본 발명의 일태양에 있어서, 숙주는 벡터 하나당 원하는 HEV 단백질을 보다 많이 생산하게 될 것이다. 벡터에 삽입될 수 있는 DNA 씨퀀스의 갯수는, 그 크기로 인해 적절한 숙주 미생물에 감염되어 복제 및 전사되는 벡터의 능력에 의해서만 제한된다.
본 발명의 다른 태양에 있어서, HEV 단백질에 대한 코딩 씨퀀스를 가지고 있는, 제한효소에 의해 분리된 단편이, 원핵 또는 진핵 세포에서 작용할 수 있는 적절한 발현 벡터내로 삽입될 수 있다. 여기서 '적절한'이라는 표현은 벡터가 HEV 단백질, 바람직하기로는 하나 이상의 완전한 ORF 단백질을 코딩하는 완전한 핵산 씨퀀스를 운반 및 발현할 수 있는 것을 의미한다. 0RF-2의 경우에는, 발현되는 단백질이 바이러스성 입자를 형성하여야 한다. 바람직한 발현 벡터는 진핵 세포에서 작용할 수 있는 백터이다. 이러한 벡터의 예는 특별히 이스트에서의 발현에 유용한 벡터(예:pPIC9 벡터-lnvitrogen )로만 제한되지는 않으며, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노바이러스 또는 허피스바이러스, 바람직하기로는 바쿨로바이러스 트랜스퍼 벡터, pBlueBac가 있다. 바람직한 벡터는 완전한 0RF-2 유전자를 가지고 있는 p63-2, 완전한 ORF-3 및 ORF-2 유전자롤 가지고 있는 P59-4이다. 이들 벡터들은 미국군주기탁협회(미국 메릴랜드 20852, 록빌, 파크론 드라이브 12301)에 1992년 9월 10일자로 기탁되었다 (기탁번호 75299(P63-2), 75300(P59-4)). 실시예 1은ORF-2 유전자를 pBlueBac에 클로닝하여 p-63을 제조하는 것을 설명해주고 있다. 이 방법은 HEV 균주 SAR-55의 유전자를 제한효소인 NruI과 BgIII로 분해한 다음 BlnI과 BgIII 사이트를 가지고 있는 폴리링커를 벡터 중의 유일한 NheI 사이트에 삽입하고, 연결체(adpter)를 이용하여 NruI-BgIII ORF-2 단편을 BlnI-BgIII pBlueBad에 삽입한다.
본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 선택된 재조합 발현 벡터는 재조합 단백질의 발현을 위해 직절한 진핵 세포 시스템내로 형질전환될 수 있다. 이러한 진핵세포 시스템으로는 이스트로만 제한되는 것이 아니고, HeLa, MRC-5 또는 Cv-1과 같은 세포주도 이용된다. 바람직한 진핵 세포 시스템의 하나로는 SF9 곤층 세포가 있다. 또한, 이때, 곤충 세포주인 SF9가 Ca 침전법에 의해 재조합 pB1ueBac 및 AcMNPV 바쿨로바이러스 DNA와 함께 형질전환되어 있는 pBlueBac 발현 벡터를 이용하는 것이 바람직하다.
발현되는 재조합 단백질은 실시예 2에 나타나 있는 것과 같이 항-HEV 항체를 포함하고 있는 혈청을 이용한 웨스턴 블롯팅법과 쿠마시 블루 염색법을 포함하여 공지의 방법에 의해 검출될 수 있다. 다른 방법으로는, 실시예 3에 기재되어 있는 바와 같이, 면역전자현미경에 의해 바이러스성 입자를 검출하는 방법이 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 있어서. SF9 세포에 의해 발현되는 재조합 단백질은 정제되지 않은 용해물로서 얻어질 수 있고 또한, 미분침전법, 모레큘라 시이브 크로마토그라피, 이온-교환 크로마토그라피, 등전 포커싱, 겔 전기영동, 흡착 크로마토그라피 및 면역흡착 크로마토그라피 등올 포함하는 종래의 표준화된 단백질 정제기술을 이용하여 정제될 수도 있다. 면역흡착 크로마토그라피를 이용하는 경우에는 재조합 단백질을 ORF 단백질에 대해 특이적인 항체가 결합되어 있는 수지가 충전된 칼럼에 통과시킴으로써 정제할 수 있다. 재조합에 의해 발현되는 HEV 단백질의 정제를 위한 방법의 예가 실시예 10에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 발현되는 재조합 단백질은 사람을 포함하여 침팬지, 고시대 원숭이, 신시대 원숭이, 기타 영장류 등을 포함하는 포유동물에게서 E형 간염을 진단 또는 예측하기 위한 면역분석법에 이용될 수 있다. 바람직한 태양에 있어서, 이러한 면역분석법은 사람의 E형 간염을 진단하는데 유용하다. HEV 단백질, 특히 ORF 단백질, 보다 특별하게는 ORF-2 단백질을 이용한 면역분석법은 HEV 감염을 진단하는데 있어 종래의 부분적인 ORF 단백질을 이용하는 방법에 비해 매우 특이적이고 감도가 좋으며 재현성이 우수하다. 본 발명의 면역분석법에는 방사성 면역분석법, 웨스턴 블롯팅 분석법, 면역형광분석법, 효소 면역분석법, 화학발광분석법, 면역조직화학분석법 등이 있다. ELlSA에 대한 표준화된 방법은 이미 공지되어 있다 (Methods in Immunodiagnosis, 2판, Rose, Bigazzi, eds., John Wiley and Sons, 1980, Campbel1 등,Methods of lmmunology, W.A. Benjamin, lnc., 1964). 이들 문헌의 내용은 본 명세서에 참조되어 있다. 이러한 분석법은 공지되어 있는 바와 같이 직접적, 간접적, 경쟁적 또는 비경쟁적인 방법들이다(0ellerich, M. 1984,J Clin. Chem. Clin. BioChem. 22:895-904). 이러한 검출방법에 적합한 생물학적 시료는 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 조직 생체검사추출물, 완전 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 흉막액, 소변 등이 있다.
본 발명의 일태양에 있어서 테스트 혈청은 항원으로서, 표면-결합된 재조합 HEV 단백질, 바람직하기로는 ORF 단백질 또는 0RF-2와 ORF-3,ORF-1과 ORF-3 등과 같이 서로 다른 ORF 단백질간의 조합체를 가지고 있는 고체상의 시약과 반응한다. 보다 바람직하게는, HEV 단백질은 바이러스성 입자를 형성하는 OFR-2 단백질이다. 고체상 시약은 단백질을 고체 지지물질에 부착시키는 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 부착방법으로는 단백질을 지지체에 비특이적으로 흡착시키거나, 단백질을 지지체상의 반응성 기에 공유결합시키는 방법이 있다. 항원과 항-HEV 항체를 반응시킨 후, 결합되지 않은 혈청 성분들을 세척하여 제거하고 항원-항체 복합체를, 레이블링된 항-인간 항체와 같은 제2 항체와 반응시킨다. 여기서 레이블링에 이용되는 라벨은 적절한 형광시약 또는 칼라시약의 존재하에서 고체 지지체를 배양함으로써 검출되는 효소일 수 있다. 그외에 다른, 검출가능한 라벨도 이용될 수 있는데, 그 예로는 방사성 라벨 또는 콜로이드성 골드 등이 있다.
본 발명의 바람직한 태양에 있어서, SAR-55의 전체 ORF-2 씨퀀스를 포함하고 있는 재조합 벡터인 pBlueBac에 의해 발현되는 단백질이 항-HEV 항체, 바람직하기로는 IgG 또는 lgM 항체를 검출하기 위한 특이적인 결합제로서 이용된다. 실시예 4와 5는 고체상 시약이 표면항윈으로서 재조합 ORF-2를 가지고 있는 경우에 ELISA결과를 나타낸다. 이 단백질은, 완전한 ORF-2 핵산 씨퀀스에 의해 코팅되는데, ORF-의 부분항원에 비해 HEV에 감염된 다른 영장류로부터 유래된 항혈청에 대한 반응성이 보다 높으므로 부분적인 ORF-2 단백질에 비해 월등한 효과를 나타낸다. 본 발명의 단백질은 또한 다른 HEV 균주에 반응하여 생산된 항체를 검출할 수도 있지만, A형, B형, C형 또는 D형 간염 바이러스에 반응하여 생산된 항체롤 검출할 수는 없다.
HEV 단백질과 그 상사체는 킷트의 헝태로 단독으로 제조될 수 있으며, 또한 면역분석법에서 이용하기 위해 제2 항체와 같은 다른 시약과 조합된 형태로 제조될 수도 있다.
재조합 HEV 단백질, 바람직하기로는 ORF 단백질 또는 ORF 단백질의 조합체, 보다 바람직하기로는 0RF-2 단백질 및 본 발명의 단백질에 대해 실질적으로 상동 및 상사성을 나타내는 단백질이 백신으로 이용되어 E형 간염에 대항하여 포유동물을 보호하는 작용을 한다. 면역원으로 작용하는 백신은 세포, 재조합 발현 벡터에 감염된 세포의 용해물 또는 발현된 단백질을 함유하고 있는 배양액 상등액일 수 있다. 또한, 면역원은 부분적으로 정제되었거나 실질적으로 정제된 재조합 단백질이다. 면역원이 순수한 또는 실질적으로 순수한 형태로 투여될 수 있기는 하지만, 이것은 약학적 조성물, 약제 등의 형태로 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 조제물들은 사람이나 가축에게 모두 유용하며, 전술한 바와 같은 면역원을 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 전달매체 및 경우에 따라 다른 치료성분과 함께 포함한다. 전달매체는 조제물 중의 다른 성분과 혼화가능하고 수용체에 대해 해를 주지 않는다는 의미에서 '허용가능하여야' 한다. 본 발명의 조제물은 단위 투여 형태로 간편하게 제공될 수 있으며, 또한 약학 분야에서 공지된 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있다.
본 발명의 모든 방법은 활성 성분을 하나 이상의 보조 성분을 이루는 전달매체와 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이러한 조제물은 활성 성분을 액체전달매체 또는 미세하게 분쇄된 고체 전달매체 또는 이들 모두와 균일하게 혼합한 다음 필요한 경우에 그 생성물을 원하는 형태로 제형화함으로써 만들어진다.
정맥투여, 근육투여, 피하투여 또는 복강투여를 간편하게 실시하기에 적합한 제형물은 활성 성분과 수용체의 혈액과 바람직하기로는 등장인 용액이 혼합되어 있는 멸균 수용액을 포함한다. 이러한 제형물은, 고체 활성 성분을, 염화나트름(예:0.1-2.0M), 글리신 등과 같은 생리적 적합성을 지닌 물질을 포함하고 있고 생리조건과 조화를 이룰 수 있는 pH 완충효과를 지닌 물에 용해하여 수용액을 만든 다음 이 수용액을 멸균함으로써 간단하게 제조될 수 있다. 이러한 제형물은 단위 투여용기 또는 복수회 투여 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰플 또는 바이알에 포장된 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 제형물은 안정화제를 포함할 수 있다. 안정화제의 예로는, 폴리에틸렌글리콜, 단백질, 당류, 아미노산, 무기산 및 유기산을 들 수 있는데, 이들은 단독으로 또는 부가혼합물 형태로 이용될 수 있다. 이러한 안정화제는 면역원에 대해 0.11 내지 10,000 중량부의 양만큼 혼합되는 것이 바람직하다. 두 종류 이상의 안정화제가 이용되는 경우에도 이들의 합계량을 전술한 범위내로 하는 것이 바람직하다. 이러한 안정화제는 적절한 농도와 pH를 지닌 수용액 형태로 이용된다. 이러한 수용액의 비삼투압은 일반적으로 0.1-3.0osmole, 바람직하기로는 0.8-1.2osmole이다. 수용액의 pH는 5.0-9.0, 특히 6-8의 범위내로 조절하는 것이 바람직하다. 본 발명의 면역원을 제형화함에 있어서 흡착방지제가 이용될 수 있다.
활성 성분의 작용기간을 조절하기 위해 별도의 약 제조방법이 이용될 수 있다. 방출 조절형 조제물은 폴리머를 이용하여 단백질 또는 그 유도체와 복합체 또는 단백질을 흡착시킴으로써 제조될 수 있다. 방출 조절형 조제물은 적절한 거대분자 (예:폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐, 피롤리몬, 에틸렌비닐아세테이트, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 또는 프로타민 설페이트), 거대분자의 농도 및 방출속도롤 조절하기 위한 거대분자의 도입방법을 적절하게 선택함으로써 얻을 수 있다. 방출 조절형 조제물에 의해 활성 성분의 활성 지속기간을 조절할 수 있는 또 다른 방법으로서는, 단백질, 단백질 상사체 또는 이들의 기능적 유도체를, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 하이드로겔, 폴리(젖산) 또는 에틸렌 비닐아세테이트 공중합체와 같은 고분자 물질 입자에 도입시키는 방법이 있다. 또 다른 방법으로는, 이러한 물질을 고분자 입자에 도입시키는 대신 마이크로캡슐 안에 도입시키는 방법이 있는네, 이때 이용되는 방법의 예로는 코아세르베이션 방법, 계면 중합방법이 있고, 마이크로캡슐의 예로는 하이드록시 메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐이 있다. 또한, 마이크로캡슐 대신 예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스페어, 마이크로에멀션, 미세입자 (nanoparticle) 및 미세캡슐(nanocapsule)과 같은 클로이드성 약제 전달 시스템이나 마이크로에멀션이 이용될 수 있다. 경구용 제제를 제조하고자 하는 경우에는, 락토오스, 슈크로오스, 녹말, 탈크, 스테아린산 마그네슴, 결정형 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 글리세린 알긴산 나트륨 또는 아라비아검과 같은 일반적인 전달매체와 결합될 수 있다. 본 발명의 단백질은 킷트의 형태로, 단독으로 또는 전술한 바와 같은 약학적 조성물의 형태로 공급될 수 있다.
백신에 의한 면역화는 종래의 방법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 면역원이 생리식염수 또는 물과 같은 적절한 희석제 또는 완전 또는 불완전 보강제(adjuvant)에 용해된 채로 이용될 수 있다. 또한, 면역원은 단백질을 면역항원성으로 만들어 주는 전달매체에 결합 또는 비결합된 채로 이용될 수 있다. 이러한 전달매체 분자의 예로는 특별히 제한되지는 않으나, 소의 혈청 알부민 (BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 테타누스 톡소이드 등이 있다. 면역원은 항체 생산에 적합하기만 하다면 어떠한 경로를 통해서도 투여될 수 있는데, 예를 들면, 정맥투여, 복강투여, 근육투여, 피하투여 등의 방법이 있다. 면역원은 한번만, 또는 항-HEV 항체의 적정 수준에 도달될 때까지 주기적으로 투여될 수 있다. 항체는 면역분석법을 이용하여 혈청에서 검출될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 면역원은 숙주로 하여금 HEV ORF 단백질을 제조하도록 할 수 있는 핵산 씨퀀스일 수 있다. 이러한 핵산 씨퀀스는 당해 기술분야에서 통상인들에게 공지되어 있는 방법에 의해 적절한 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 생체내 조건(in vivo)에서, 높은 효율로 유전자 전달을 수헹하기에 적합한 발현 벡터로는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들명 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스로부터 유래된 벡터가 있다. 이러한 발현 벡터의 작동 요소들은 복 명세서의 앞부분에 기재되어 있는 것으로서 당해 기술분야에서 복강투여 또는 경구투여 방법에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 예를 들어 숙주로 하여금 HEV ORF 단백질을 제조하도록 할 수 있는 핵산 씨퀀스를 포함하고 있는, 플라스미드를 베이스로 하며 진핵세포에서 유래된 발현 벡터를 근육주사함으로써 직접적으로 유전자 전달이 이루어질 수 있다. 이러한 접근 방법은 이미 B형 간염 표면항원을 생체내 조건에서 생산하여 표면항원에 대한 항체 반응을 일으키는데 이용되어 왔다 (Davis, H.L. 등, (1993),Human Molecular Genetics, 2:1847-1851; Davis 등, (1993),H1lman Gene Therapy, 4:151-159, 733-740).
면역원이 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 재조합 HEV ORF 단백질인 경우에, HEV에 대항하여 방어적인 항체 반응을 일으키기에 효과적인 투여량은 약 2㎍ 내지 약 100㎍ 이다. 보다 바람직한 투여량 범위는 약 5 내지 7㎍이며, 가장 바람직한 범위는 약 10 내지 60㎍ 이다.
HEV에 대항하여 방어적인 항체 반응을 일므-키기에 효과적인 HEV-ORF 단백질을 코딩하는 핵산 씨퀀스의 투여량은 약 1 내지 약 5000㎍; 보다 바람직하기로는 약 300 내지 1000㎍ 이다.
숙주로 하여금 HEV ORF 단백질을 합성하도록 할 수 있는 핵산을 포함하는 발현 벡터는 깃트 형태로, 단독으로 또는 전술한 바와 같은 약학적 조성물 형태로 공급될 수 있다.
본 발명의 면역원의 투여는 예방을 위해 또는 치료를 위해 모두 이루어질 수있다. 예방학적으로 제공되는 경우에는, HEV에 노출되기 전 또는 HEV 간염으로 인한 증세가 나타나기 전에 면역원이 제공된다. 면역원의 예방적인 투여는 포유동물에 있어서 일어날 수 있는 HEV 감염을 방지하거나 또는 약화시키는 작용을 한다.치료학적으로 제공되는 경우에는, 감염의 개시와 함께 (또는 그 직후에) 또는 HEV에 의한 감염증상 또는 질병증상이 나타나기 시작할 때 면역원이 제공된다. 면역원의 치료적인 투여는 감염증상 또는 질병의 증상을 약화시키는 작용을 한다.
본 발명의 바람직한 태양에서는, HEV 균주 SAR-55의 ORF-2 씨퀀스에 의해 발현되는 재조합 ORF-2 단백질 또는 그 균등물을 이용하여 제조되는 백신이 이용된다. 재조합 ORF-2 단백질은 이미 다양한 HEV-양성 혈청에 대해 반응성을 나타내는 것으로 입증되었으므로 다양한 HEV 균주에 대항하여 방어작용을 나타낼 수 있다.
백신으로서의 이용성 외에도, 본 발명의 조성물은 HEV 바이러스성 입자에 대한 항체를 제조하는데도 이용될 수 있다. 이러한 항체는 항바이러스제로서 직접 이용될 수 있다. 항체를 제조하기 위해서 바이러스 입자를 이용하여 숙주 동물을 면역시키거나 또는 바이러스 입자 고유의 비입자성 항원을 백신과 관련하여 전술한바와 같은 방법으로 전달매체에 결합시킨다. 적절한 시간 간격으로 숙주의 혈청 또는 혈장을 수거하여, 바이러스 입자에 대해 반응하는 항체를 포함하고 있는 조성물을 만든다. 감마 글로블린 단편 또는 IgG 항체가, 예를 들어 황산암모늄 포화용액 또는 DEAE 세파덱스 또는 당해 기술분야에서 통상인에게 공지된 방법을 이용하여 얻어질 수 있다. 이러한 항체는 약과 같은 항바이러스제에서 나타나는 것과 같은 부작용을 실질적으로 나타내지 않는다.
항체 조성물은 면역 시스템 반응에 미치는 잠재적인 악영향을 최소화시킴으로써 숙주 시스템과의 화합성을 보다 높일 수 있도록 만들어 질 수 있다. 이는, 외래 종의 항체의 Fc 영역의 전부 또는 일부를 제거하거나, 또는 숙주 동물과 동일한종의 항체, 예를 들어 인간/인간 하이브리도마로부터의 항체를 이용함으로써 이루어질 수 있다. 인간화된 항체(humanized antibody)(즉, 사람에게서는 면역원으로 작용하지 않음)가 제조될 수 있는데, 예를 들어 항체의 면역원성 부분과 이에 상응하는 영역으로서 비면역원성 부분(즉, 키메릭 항체: chimeric antibody)을 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 키메릭 항체는 하나의 종으로부터 항체의 반응성 영역 또는 항원결합영역과, 다른 종으로부터 항체의 Fc 영역(비면역원성 영역)을 포함하고 있다. 키메릭 항체의 예로는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 인간이 아닌 포유동물-인간 키메라, 설치류-인간 키메라, 쥐과 동물-인간 키메라 및 랫트-인간 키메라가 있다 (Robinson 등, 국제특허출원 184,157호; Taniguchi M., 유럽특허출원 171,496호; Morrison 등, 유럽특허출원 173,494호; Neuberger 등, PCT 출원 WO86/01533; Cabilly 등, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439; Nishimura 등, 1987, Canc. Res. 47:999; Wood 등, 1985, Nature, 314:446; Shaw 등, 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:15553: 이들 참고문헌은 모두 본 출원에 참고자료로 이용됨).
'인간화된' 키메릭 항체에 대한 일반적인 지식은 모리슨과 오이 등에 의해 제공되었다 (Morrison S., 1985, Science, 229:1202; Oi 등,1986, BioTechniques 4:214).
적절한 '인간화된' 항체는 또한 CDR 또는 CEA 치환방법에 의해 제조될 수 있다 (Jones 등, 1986, Nature 321:552; Verhoeyan 등, 1988, Science, 239:1534; Biedlerst 등, 1988, J. Immuno1. 141:4053: 이들 참고문헌은 모두 본 츨원에 참고자료로 이용됨).
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 유전공학적으로도 제조될 수 있다. 대장균에서 헤비 체인 유전자와 라이트 체인 유전자를 모두 발현시키는 기술도 공지되어 있다 (PCT 출원 WO90/1433, WO90/14424; Huse 등, 1989, Science, 246:1275-1281).
본 발명의 항체는 면역반응를 증진시키는 수단으로서도 이용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 일반적으로 항체를 이용한 치료시 투여되는 다른 항체의 양과 비슷한 양만큼 투여될 수 있다. 예를 들어, 광견병, 흥역 및 B형 간염과 같은 다른 바이러스성 질병의 초기 잠복기간중에는 감마 글로블린을 체중 1파운드당 0.02 내지 O.lml 투여하면 바이러스가 세포내로 들어가는 것이 방해를 받게 된다. 그러므로, HEV 바이러스 입자와 반응하는 항체가 HEV에 감염된 숙주에 단독으로 또는 다른 항 바이러스제와 함께 수동적으로 투여되면 항바이러스 약제의 효능을 증진시키게 된다.
다른 방법으로는, 항-이디오타잎 항체를 면역왼으로서 투여함으로써 항-HEV 항체가 유도될 수 있다. 전술한 방법에 따라 제조되는 정제된 항-HEV 항체 조성물이 숙주 동물에게서 항-이디오타잎 항체를 유도하는데 이용될 수 있다. 이러한 소성물은 적절한 희석제에 용해된 상태로 숙주 동물에 투여된다. 투여 후, 통상 반복적인 투여 후, 숙주는 항-이디오타잎 항체를 만들어낸다. Fc 영역에 대한 면역반응을 제거하기 위하여, 숙주 동물과 동일한 종에 의해 생산된 항체가 사용되거나 투여된 항체의 Fc 영역이 제거될 수 있다. 숙주 동물에게서 항-이디오타잎 항체를유도한 다음, 혈청 또는 혈장을 채취하여 항체 조성물을 만든다. 이러한 조성물은 항-HEV 항체와 관련하여 전술한 방법에 따라, 또는 흡착 매트릭스에 결합된 항-HEV 항체를 이용한 흡착 크로마토그라피를 이용하여 정제될 수 있다. 이렇게 하여 제조된 항-이디오타잎 항체는 구조면에서 진정한 HEV-항원과 유사하므로, HEV 입자 항원에 비해 HEV 백신을 제조하는데 보다 효과적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 항체가 동물에게서 항-HEV 바이러스 항체를 유도하는 수단으로서 이용되는 경우에는, 항체를 투여하는 방식이 백신반응을 위해 행하고 있는 방식과 마찬가지인데, 즉 근육투여, 복강투여, 피하투여 등의 방법으로 보강제의 존재 또는 비존재하에서 생리학적으로 적절한 희석제에 유효량만큼 용해되어 있는 농도로 투여된다. 1회 또는 그 이상으로 부스팅을 위한 투여가 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라 HEV에서 유래된 단백질은 또한 노출전 또는 노출후의 예방을 위한 항혈청을 제조하는데 유용하다. 여기서, HEV 단백질 또는 단백질 혼합물은 적절한 보강제와 혼합된 형태로 제형화되며, 사람의 항혈청을 제조하는 공지의 방법에 따라 사람에게 투여된다. 면역화 후 수주일 동안 혈청 시료를 채취하여 전술한 면역분석법을 이용하여 투여된 단백질에 대한 항체 반응을 모니터링함으로써, 항-HEV 혈청 항체의 존재를 검출하게 된다.
면역된 개체로부터 얻은 항혈청은 감염의 우려가 있는 개체에게 노출전 예방수단으로서 투여될 수 있다. 이러한 항혈청은 또한 노출후 개체를 치료하는데도 유용한데, 이는 B형 간염 바이러스에 노출된 후에는 그 예방을 위해 보다 높은 농도로 항혈청을 투여하는 것과 유사한 방식으로 이루어지는 것이다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 지닌 사람이라면, 표준 방법을 이용하여 면역된 개체의 항혈청으로부터 정제된 면역 글로불린이 노출 전의 예방 수단으로서 또는 노출 후에 개체를 치료하는 수단으로서 이용될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
HEV 바이러스성 입자 및 단백질에 대한 항체 및 항-이디오타잎 항체를 생체내 조건하에서 및 진단용으로 이용하는 경우 모두, 모노클로날 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 모노클로날 항-바이러스 입자 항체 또는 항-이디오타잎 항체는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다. 면역된 동물로부터 비장 또는 림프구 세포를 분리하여 불멸화시키거나 또는 당해 기술분야에서 공지된 방법에 따라 하이브리도마를 제조하는 방법을 이용한다 (Goding, J.W., 1983, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Pladermic Press, lnc., NY, pp. 56-97). 인간-인간 하이브리도마를 제조하기 위해서는 사람의 림프구 세포 공여자를 선택한다. HEV에 감염된 것으로 확인된 공여자 (이때, 감염은 예를 들어 혈액 중에 항-바이러스 항체가 존재하는 것에 의해 또는 바이러스 배양에 의해 확인된다)가 림프구 세포의 적절한 공여자가 될 수 있다. 림프구 세포는 말초혈관 시료로부터 분리될 수 있으며, 또한 공여자가 비장절제술을 받는다면, 비장 세포가 이용될 수도 있다. 엡스타인-바 바이러스(EBS)는 인간의 림프구 세포를 불멸화시키는데 이용될 수 있고, 인간의 융합 파트너는 인간-인간 하이브리도마를 제조하는데 이용될 수 있다. 시험관 조건하에서의 펩티드를 이용한 1차 면역화는 또한 인간의 모노클로날 항체의 제조에 이용될 수 있다.
원하는 특이성을 지닌 항체를 분비하는 클론을 찾아내기 위해, 불멸화된 세포에 의해 분비되는 항체를 조사한다. 모노클로날 항-바이러스 입자 항체의 경우에는, 항체가 HEV 바이러스 입자에 결합되어야 한다. 모노클로날 항-이디오타잎 항체의 경우에는, 항체가 항-바이러스 입자 항체에 결합되어야 한다. 이어서, 원하는 특이성을 지닌 항체를 생산하는 세포를 선택한다.
전술한 바와 같은 항체와 항체 중의 항원 결합 단편은 킷트의 형태로 단독으로 또는 생체내 조건하에서의 이용을 위해 약학적 조성물 형태로 제공될 수 있다. 이러한 항체는 치료용, 면역분석을 이용한 진단용으로 이용될 수 있으며, 또한 전술한 바와 같이 ORP 단백질을 정제하기 위한 면역흡착제로서도 이용될 수 있다.
재료
실시예에서 사용된 재료는 다음과 같았다:
영장류. 침팬지(Chimp) (Pan troglodytes). 유럽 원숭이: 사이노몰구스 원숭이(Cyno) (Macaca fascicularis), 붉은털 원숭이(Rhesus) (M. mulatta), 돼지꼬리 원숭이(PT) (M.nemestrina), 및 아프리칸그린 원숭이(AGM) (Cercopithecus aethiops). 아메리카 원숭이 :콧수염이 있는 타마린(Tam) (Saguinus mystax), 다람쥐 원숭이(QM) (Saimiri sciureus) 및 올빼미 원숭이(OWL) (Aotus trivigatus). 영장류는 생물학적 잠재위험성을 배제시킨 조건하에서 개별적으로 가두어 놓았다. 동물에 대한 사육, 보관 및 주의관찰은 영장류 사육에 요구되는 수준 이상으로 하였다.
대부분의 동물에 대해, 종래의 방법 (Tsarev, S.A. 등,(1992),Proc. Nat1.Acad. Sci USA, 89:559-563; 및 Tsarev. S.A. 등, (1993),J. Infect. Dis.(167:1302-1306)을 이용하여 태중의 송아지 혈청으로 희석한 배설물 현탁액 0.5m1에 포함된 HEV 균주 SAR-55를 정맥주사법으로 접종하였다. Chimp-1313과 1310에 대해서는 파키스탄형 E형 간염 환자 7명으로부터 수거한 배설물을 이용하여 접종하였다.
접종 전과 접종 후에 1주일에 약 2회씩 혈청 시료를 수거하였다. 간 효소인 혈청 중의 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 이소시트레이트 디하이드로게나제(ICD) 및 감마 글루타밀 트랜스퍼라제(GGT)의 농도를 상업적으로 이용가능한 테스트(Medpath Inc., 록빌, 메릴랜드)를 이용하여 분석하였다. 혈청학적 테스트는 전술한 방법대로 실시하였다.
실시예 1
HEV 균주인 SAR-55 게놈의 DNA 씨퀀스 동정
PCR을 실시하기 위한 바이러스 RNA 주형 제조.
HEV에 감염된 사이노몰구스 원숭이의 담즙(10㎕), 20%(wt/vo1) SDS (최종 농도가 1%가 되도록 하는 양), 단백질 분해효소 K(1Omg/1㎖) 및 0.5M EDTA 3㎕를 혼합하여 최종부피가 250㎕가 되도록 한 후 55℃에서 30분간 배양하였다. 상기 배양된 담즙 용액에 65℃에서 페놀과 클로로포름이 1:1(vo1:vo1) 부피비로 혼합된 용액을 2회 처리하고, 클로로포름을 1회 처리하여 담즙으로부터 전체 핵산을 추출한 다음, 에탄올로 침전시킨 후, 95% 에탄올로 세척한 다음 RT-PCR에 사용하였다. 배설물 및 특히 혈청으로부터 얻어진 HEV RNA의 RT-PCR에 의한 증폭은 RNA가 매우 순수하게 정제되었을 때 훨씬 효율적이다. 혈청(100㎕) 또는 10% 배설물 현탁액(200㎕)을 상술한 방법과 같이 단백질 분해효소 K로 처리하였다. 30분간 배양한 후에, CHAOS 버퍼(4.2 구아니딘 티오시안산/ 0.5 N-라우로일살코신/pH 8.0의 0.025M 트리스-HCl)을 30㎕를 첨가하였다. 65℃에서 페놀/클로로포름용액을 2회 처리한 후, 상온에서 클로로포름을 처리하여 핵산을 추출하였다. 다음에 7.5M 암모늄 아세트산(225㎕)을 상층에 처리한 후, 2-프로판올 O.68㎖를 처리하여 침전시켰다. 침전물을 CHAOS 버퍼 3OO㎕와 H2O 100㎕에 용해시켰다. 클로로포름을 이용한 추출과 2-프로판올을 이용한 침전을 반복하었다. 핵산을 수용액에 용해시킨 후, 에탄올로 침전시킨 다음, 95% 에탄올로 세척하여 RT-PCR에 사용하였다.
프라이머의 제조.
미얀마형 HEV 균주(Tam, A.W. et al. (1991), Virology, 185:120-131) 또는 SAR-55 게놈의 + 또는 - 가닥에 상보적이고, 길이가 21-40 뉴클례오타이드(nt)인 94개의 프라이머를 어플라이드 바이오시스템 모델 391 DNA합성기를 이용하여 합성하였다.
상기 94개 프라이머의 씨퀀스를 하기와 같이 SEQ. ID N0.5 에서부터 시작하여 SEQ. ID NO. 98까지 나타내었다:
HEV 프라이머 리스트
씨퀀스의 왼쪽에 표시되어 있는 약자는 다음과 같다. R과 D는 각각 역 및 정방향 프라이머를, B와 S는 각각 B형 간염 균주인 미얀마형-121과 E형 간염 균주인 SAR-55로부터 얻어진 씨퀀스를, 5'NC 와 3'NC는 각각 HEV 게놈의 5 프라임과 3프라임 비-코딩영역을, 1, 2 및 3은 각각 오픈 리딩 프레임 1, 2 또는 3으로부터 얻어진 씨퀀스를 나타낸다. 몇몇 씨퀀스의 오른쪽에 있는 ( ) 부호는 인위적인 제한 효소 자리를 이 씨퀀스에 삽입하였음을 나타낸다.
PCR 절편을 클로닝하기 위해서, 5' 말단에서 3-7nt 떨어진 위치에EcoRI,BamHI 또는BglII 제한효소 위치를 첨가하였다.
RT-PCR
주형, 1OmM 트리스-HC1(pH 8.4), 5OmM KC1, 2.5 mM MgCl2, 네 종류의 dNTPs (각각 0.2 매), 순방향 프라이머 50pmol, 역방향 프라이머 50pmol, 조류의 골수 아구증 바이러스의 역방향 전사제(Promega) 16 유니트, 미네랄 경유 100㎕하의 앰플리태그(AmpliTaq) 4 유니트를 포함하는 RT-PCR 혼합물 100㎕를 준비하였다. 상기 혼합물을 42℃에서 1시간동안 배양한 다음, PCR 싸이클을 35회 실시하여 증폭하였다(94℃에서 1분, 45℃에서 1분, 72℃에서 1분). PCR 산물을 1% 한천 겔을 이용하여 분석하였다.
PCR 절편의 클로닝.
말단에 제한효소 위치를 가지고 있는 PCR 절편을EcoRI 및BamHI 또는EcoRI 및BglII 제한 효소로 분절한 다음EcoRI/BamHI으로 분절된 pBR322 또는 pGEM3Z(Prgomega)에 클로닝하였다. 또 다른 방법으로는, PCR 절편을 TA 클로닝 키트(Invitrogen)을 사용하여 pCR10O0(Invitrogen)에 클로닝하였다.
PCR 절편과 플라스미드의 씨퀀스결정.
PCR 절편을 1% 한천겔로부터 분리한 후 제데클린(Bio lO1, La Jolla, CA)를 이용하여 정제하였다. 윈십, 피.알(Winship, P.R. (1984),Nucleic Acids Rev.,17:1266)에 기술된 바와 같이 씨퀀나아제(United States Biochemical)를 이용하여이중-나선 PCR 절편의 씨퀀스를 결정하였다. CsC1 농도 구배를 이용하여 정제된 이중-나선 플라스미드를 씨퀀나아제 키트(United States Biochemical)을 사용하여 씨퀀스를 걸정하였다.
씨퀀스의 컴퓨터 분석.
HEV 균주의 뉴클레오타이드 서열을 제네틱스 컴퓨터 그룹(Madison, WI) 소프트웨어 패키지(Devereaux, J. et al. (1984),Nucleic Acids Rev., 12:387-395, version 7.5, on a VAX 8650 computer(at the National Cancer Institute, Frederick, MD))를 사용하여 비교하였다.
실시예 2
재조합 발현 벡터, P63-2의 구성
HEV 균주인 SAR-55 게놈의 완전한 ORF-2(Tsarev, S.A. et al. (1992),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:559-563)를 포함하는 플라스미드를 NruI-BglII 제한 효소에 의해 분절된 단편을 얻기 위해 사용하였다. NruI는 ORF-2의 개시코돈 ATG 상부에 있는 HEV cDNA의 5개의 뉴클레오타이드를 절단한다. 인위적인 BglII 위치는 HEV 게놈의 폴리 A 씨퀀스의 바로 옆에 있는 3' 말단(Tsarev, S.A. et al. (1992),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:559-563)에 미리 위치시켜 놓은 것이다. 이 단편을 pBlueBac-전이벡터(Invitrogen)에 삽입하기 위해서 합성 폴리링커(polylinker)를 벡터에 유일한 NheI 위치에 도입하였다. 이 폴리링커는 HEV cDNA와 pBlueBac 서열에 모두 존재하지 않는 것으로서 BlnI 과 BglII 위치에 포함되어 있다. NruI-BglII ORF-2 단편은 도 1에 도시되어 있는 어댑터를 사용하여 BlnI-BglII pBlueBac에 삽입되었다.
실시예 2
SF 9 곤충 세포내에서의 P63-2의 발현
p63-2와 AcMNPV 간상바이러스 DNA(Invitrogen)를 인비트로겐(Invitrogen) 프로토콜에 따라 Ca-침전 방법에 의해 SF9 세포(Invitrogen)에 함께 감염시켰다. 인비트로겐 프로토콜에 따르면, AcMNPV 바쿨로바이러스(baculovirus) DNA는 p63-2를 패키지하여 재조합 바쿨로바이러스를 형성할 수 있는, 살아있고 손상되지 않은 바쿨로바이러스를 생산할 수 있다. 이 재조합 바쿨로바이러스는 플라크로부터 4회 정제하였다. 얻어진 재조합 바쿨로바이러스 63-2-IV-2를 SF9 세포를 감염시키는데 사용하였다.
SDS-PACE 및 웨스턴 블랏.
곤충 세포를 로딩 버퍼(50mM 트리스-HC1, pH6.8 인 10OmM DTT, 2% SDS, 0.1 브롬페놀 블루 및 1O% 글리세롤)에 재현탁시킨 후, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 램리(Laemmli, U.K. (1970), Nature, 227:680)에 의해 기술된 대로 실시하였다. 겔은 쿠마시 블루로 염색한 후 단백질을 BA-85 니트로셀룰로오즈 필터 (Schleicher & Schuel1) 위로 전기블랏하였다. 전이 후에, 니트로셀룰로오즈 막을 10%의 송아지 혈청과 0.5% 젤라틴을 포함하는 PBS에 차단시켰다. 일차 항체로서, 1:1000으로 희석된 침팬지-1313의 과면역 혈청을 사용하였다. 이차 항체로서, 1:2000으로 희석되고 포스파타아제로 레이블링되고 인간 IgG에 대하여 친화력를 이용하여 정제된 염소 항체(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc)를 사용하였다. 알카리성 포스파타아제(Promega)에 적합하도록 안정화된 기질인 웨스턴 블루로 필터를 현상하였다. 모든 배양은 차단 용액내에서 행해졌으며, PBS와 0.05% 트윈-20(Sigma)로 세척하었다.
HEV ORF-2의 발현.
재조합 바쿨로바이러스 63-2-IV-2로 감염된 SF9 세포에서 합성된 주요 단백질은 분자량이 74KD(도 2a의 3레인)인 단백질이었다. 이 크기는 전체 ORF-2(71KD)에 대해 예측한 것보다는 다소 큰 것이다. 이러한 크기의 차이는, 적어도 하나의 잠재적인 글리코실화 위치(Asn-Leu-Ser)가 N-말단부위에 존재하는 것으로 보아, 단백질의 글리코실화에 기인한 것일 수 있다. 이 단백질은 비감염 세포(도 2a의 1 레인) 또는 야생형의 재조합되지 않은 바쿨로바이러스로 감염된 세포(도 2a의 2 레인)에서는 검출되지 않았다. 야생형의 재조합되지 않은 바쿨로바이러스로 감염된 세포의 경우, 검출된 주요 단백질은 다면체 단백질이었다. 동일 용균액을 침팬지-1313의 혈청(HEV로 과면역화됨)을 이용하여 웨스턴 블랏으로 분석하였을 때(도 2b), 재조합 세포의 용균액내에 있는 단백질만이 반응하였고(3 레인), 주요 밴드는 다시 74KD 단백질인 것으로 나타났다(도 2b). 쿠마시 블루로 염색된 겔내에 존재하는 약 25, 29, 35, 40-45 및 55-70kDa의 소수 밴드들 또한 웨스턴 블랏시 혈청과 반응하였다(도 2b, 3 레인). 74KD 이하의 분자량을 가지는 밴드들은 프로세싱 및/또는 분해 과정이 일어났음을 반영하는 것이고 74KD 이상의 분자량을 가지는 몇몇 밴드들은 글라이코실화의 정도차에 기인한 것이다. HEV로 접종하기 전의 침팬지-1313으로부터 얻어진 혈청은 웨스턴 블랏시 어떠한 단백질과도 반응하지 않았다.
실시예 4
재조합체에 의해 감염된 SF9 세포에 대한. 면역전자 현미경 측정
재조합체에 의해 감염된 SF9 세포 5×106개를 1OmM 트리스-HCl, pH7.4인0.3% 사르코실을 포함하는 CsC1(1.30 g/㎖)내에서 초음파 분해한 다음 40,000rpm(SW60Ti)으로 68시간동안 원심분리하였다. 가장 높은 ELISA 반응을 나타내고 부유 밀도가 1.30g/㎖인 분리된 물질 50㎕를 PBS 1㎖에 희석시킨 후, 침팬지-1313의 과면역 혈청 5㎕를 첨가하였다. 과면역 혈청은 E형 간염의 제2 균주(멕시코형 HEV)로 미리 감염된 침팬지로부터 준비하였다. 샘플을 상온에서 1시간동안 배양한 후, 4℃에서 밤새 배양하였다. SW60Ti 회전기를 30,000rpm으로 하여 4℃에서 2시간동안 원심분리하여 면역 복합체를 침전시켰다. 침전물을 증류수에 재현탁시기고,3%PTA로 음화가 되도록 염색시킨 후, 탄소 그리드 위에 위치시킨 다음, 전자 현미경 EM-10(Carl Zeiss,Oberkohen, Germany)으로 40,000배 확대하여 검사하였다.
VLPs의 검출
야생형 또는 재조합된 바쿨로바이러스 63-2-IV-2로 감염된 곤충세포로부터 얻어진 세포 용균액을 CsC1 밀도를 이용한 원심분리법으로 분리하였다. 재조합체에 의해 감염된 곤충 세포로부터 얻어진 용균액을 CsC1 농도구배에 의해 분리한 물질을 침팬지-1313 과면역 혈청을 처리하여 배양하였을 때, 부유 밀도 1.30g/㎖의 분리 물질내에 항체로 뒤덮인 두 종류의 바이러스-유사-입자(VLPs)가 관찰되었다. 항체로 덮인 제1 개별 입자는 HEV임을 암시하는 크기(30nm)와 형태학적 구조(도 3a-3d)를 지니고 있으며, 제2 입자(도 3e)는 항체가 결합한 입자의 응집물은 HEV보다 작기는 하나(약 20nm), 기타 다른 면에 있어서는 HEV와 유사하다. 직접적인 EM은 각각 30 및 20nm 직경을 가지는 물체로 이루어진 불균일한 군집이 존재하는 것을 나타내었는데, 이는 바이러스 입자처럼 보이기는 하나, 결합된 항체가 없는 경우 HEV라고 확신할 수가 없다. 다수의 IEM 실험은 HEV 게놈의 ORF-2 영역으로부터 합성된 적어도 몇몇의 단백질들이 특정 구조로 조립된다는 것을 암시하였다. 곤충 세포가 감염의 후기 단계에 있고, 작은 단백질의 비가 크면 클수록, 일관성있게 보다 나은 ELISA 결과를 나타내는 것이 관찰되었다. 따라서 감염의 후기 단계에서 얻어진 재조합 곤충세포의 파편화되지 않은 용균액을 후속 테스트 중 ELISA에서 항원으로 사용하였다.
실시예 5
서로 다른 HEV 균주로 감염된 후 항-HEV의 완전한 ORF-2를 발현하는 곤충세포로부터 얻어진 항원을 기초로한 ELISA에 의한 검출
63-2-IV-2 바이러스로 감염된 SF9 세포 5×106개를 1OmM 트리스-HCl과 pH7.5인 0.15M NaC1을 포함하는 용액 1m1에 재현탁시킨 후 냉동과 해동을 3회 실시하였다. 이 현탁액 10㎕를 탄산염 버퍼(pH 9.6) 1O㎖에 용해시킨 후 탄력적인 미세적정 분석 플레이트 하나를 피복하는데 사용하였다. 혈청 샘플을 1:20, 1:400 및 1;8000 또는 1:100, 1:1000 및 1:10000으로 회석하였다. 웨스턴 블랏에서 기술되었던 것과 같은 차단 용액 및 세척 용액을 ELISA에서도 사용하였다. 2차 항체로서, 인간의 IgG에 대한 과산화효소가 결합된 염소의 IgG 단편 또는 양고추냉이의 과산화효소가 레이블링된 염소의 항-유럽 원숭이 면역글로불린 또는 항-아메리카 원숭이 면역글로불린을 사용하였다. 그 결과는 450nm에서 광학 밀도(0.D.)를 측정함으로써 걸정하였다.
HEV 파기스탄형 균주임을 나타내는 곤충 세포에 의해 유도된 항원이 HEV 벡시코형 균주로 감염된 사이노몰구스 원숭이내의 항-HEV 항체를 검출할 수 있는지를 결정하기 위하여, 3 마리의 원숭이를 가지고 실험하였다(도 4). 두 마리의 원숭이 즉 사이노-80A82와 사이노-9A97를 HEV 멕시코형 '86 균주(Ticehurst, J. et al. (1992), J. Infect. Dis., 165:835-845)를 포함하는 분비물로 감염시키고 세 번째 원숭이 즉 사이노-83은 제2 계대 배양된 동일 균주로 감염시켰다. 대조군으로서, 파키스탄형 HEV 균주인 SAR-55로 감염시킨, 사이노-374의 혈청 샘플을 동일 실험에서 테스트하였다. 멕시코형 균주로 감염된 세 마리 원숭이 모두 항-HEV로 혈청이 전환되었다. 제1 계대 배양된 균주로 감염된 동물은 15주 정도돼야 혈칭이 전환되었고 제2 계대 배양된 균주로 감염된 동물은 5주 정도에 혈청이 전환되었다. 재미있는 것은, 네 마리 동물중에 가장 높은 항-HEV 적정 농도는, 멕시코형 균주중 제2 계대 배양 균주로 접종된, 사이노-83에서 발견되었다. 파키스탄 균주중 제1 계대 배양 균주로 접종된 다른 사이노몰구스는 중간 정도의 항-HEV 적정 농도를 나타내는 반면, 멕시코형 균주중 제1 계대 배양 균주로 접종된 사이노몰구스는 가장 낮은 항-HEV 적정 농도를 나타내었다.
실시예 6
완전한 ORF-2를 발현하는 곤충 세포로부터 얻어진 항원을 기초로한 항-HEV ELISA의 특이성
여기서 기술된 ELISA가, 관련된 항체를 가지고 있는 기타 다른 간염 바이러스와는 반응하지 않고, 항-HEV만을 특이적으로 검출하는지를 측정하기 위하여, 공지의 다른 간염 바이러스(Garci, P. et al. (1992),J. lnfect. Dis., 165:1006-1011; Farci, P. et al. (1992), Science (in press); Ponzetto, A. et al. (1987)J Infect. Dis., 155:72-77; Rizzetto, A. et al. (1981) Hepato1ogy 1:567-574; reference for chimps-1413, 1373, 1442, 1551(HAV); and for chimps-982, 1442, 1420, 1410(HEV); is unpublished data from Purcell et al)(표 1)로 감염된, 침팬지의 혈청 샘플 네 세트를 분석하였다. 접종 전 및 접종 후 5주 및 15주된 혈청 샘플을 1:1OO, 1:1OOO 및 1:1OOOO으로 희석하여 HEV ELISA로 분석하였다. HAV, HBV, HCV 및 HDV로 감염된 동물로부터 얻어진 어떠한 혈청도 HEV 항체를 이용한 ELISA에서 반응하지 않은 반면, HEV로 접종된 모든 4종류의 침팬지가 항-HEV IgM 및 IgG 클래스를 발현하였다.
실시예 7
인간을 제외한 영장류내에서 HEV 균주인 SAR-55의 숙주 범위의 결정
서로 다른 영장류 종에 HEV의 분비물 표준 현탁액을 정맥주사로 접종한 다음, 순차적인 혈청 샘플을 채취하여 감염 정도를 모니터하였다. 혈청 ALT의 수준을 간염 바이러스의 존재를 나타내는 지시자로 결정하고, 혈청 전환은 항-HEV의 증가로 정의하였다. 그 결과를 사이노몰구스 원숭이와 침팬지에서 얻어진 결과와 비교하였다.
HEV로 접종된 붉은털 원숭이(표 2) 모두 강한 항-HEV 반응을 나타낼 뿐만 아니라 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 활성의 현저한 피크도 나타내었다. 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 활성의 피크는 양 동물들 모두 접종후 35일 될 때 관찰되었고 혈청 전환은 접종 21일될 때 관찰되었다. 항-HEV의 최대치는 29일되는 날 나타났다. 이 실험에서 사용된 아프리카 그린 원숭이(표 2) 모두 증가된 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 활성과 항-HEV를 나타내었다. 비록 아프리카 그린 원숭이 230은 접종 후 7주 될 때 죽었지만, 감염에 대한 증거는 그 전에 이미 얻어졌다. 원숭이 74의 알라닌 아미노트랜스퍼라아제의 활성 피크는 접종전 혈청의 평균값의 3배이고 원숭이 230의 혈청 평균값의 5배를 초과하였다. 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 활성의 피크와 혈청전환은 원숭이 74의 경우에는 28일째에 원숭이 230의 경우에는 21일째에 동시에 나타났다.
돼지꼬리 원숭이 98에서는 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 활성이 증가하지 않은 반면, 돼지꼬리 원숭이 99에서는 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 활성이 접종전 혈청의 평균값을 넘는 3 SD 이상으로 증가하였다. 그러나 두 원숭이 모두 21일째에 혈청이 전환되었고 안티-HEV 값이 침팬지와 유럽 원숭이의 값과 동일하였다. 돼지꼬리 원숭이내에서의 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 피크의 낮은 값 때문에, HEV 감염 대신 면역화의 가능성을 완전히 배제할 수가 없다. 그러나, 면역화는 다음과 같은 몇 가지 이유로 불가능하다. 첫째, 돼지꼬리 원숭이의 1/4 크기밖에 안되는, 2 마리의 타마린에 동일양의 접종원이 주입되었지만 면역화가 관찰되지 않았다. 둘째, 분비물로 배설되는 HEV의 양이 일반적으로 매우 적다는 사실이 알려져 있는데, 본 연구에서 사용된 분비물의 10% 현탁액 0.5mL는 동물을 면역화시키기에 충분한 양의 항원을 포함하고 있지도 않으며, 특히 정맥으로 주사되었을 때는 더욱 더 그러하다.
본 실험에서 접종된 타마린은 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 활성의 현저한 증가도 없었을 뿐만 아니라 안티-HEV도 생성되기 않았다(표 2). 따라서, 상기 동물들은 감염되지 않은 것으로 보인다. 다람쥐 원숭이는 안티-HEV를 생성하기는 하였으나, 침팬지 또는 유럽 원숭이보다 현저하게 낮은 수준을 나타내었다(표 2). 게다가, 혈청전환은 다른 동물들보다 늦게 일어났다. 다람쥐 원숭이 868은 41일째에 혈청전환되었고 다람쥐 원숭이 869는 35일째에 혈청전환되었다. 안티-HEV의 적정농도는 모니터링을 3개월 또는 그 이상의 기간동안 언제나 1:20을 넘지 않았고 양 동물 모두에서 47-54에 최대 값에 도달한 이후에는 뚜렸하게 감소하였다. 그러나, 양 동물에 있어서, 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 활성의 증가는 다소 현저하였고 혈청 전환의 시간과주기적인 연관을 나타내었다.
유럽 원숭이 종 뿐만 아니라 왁배미 원숭이도 HEV 감염에 반응하였다(표 2).올빼미 원숭이 둘은 21과 28일에 안티-HEV 적정농도가 1:8000에 도달하였다. 올빼미 원숭이 924의 알라닌 아미노-트랜스퍼라아제의 활성은 35일에 최대치를 나타내었으나 925 원숭이는 49일이 되서야 최대치를 나타내었다.
실시예 8
침팬지에서의 안티-HEV IgM 와 IgG의 검출
두 마리 침팬지 모두, 혈청 ALT의 수준이 접종 후 4주쯤에 증가하였다(표 1, 도 5). 양 침팬지는 ALT 효소의 증가 시점 또는 그 보다 빨리 혈청 전환되었다(도 5a, 5c). 침팬지-1374에서 안티-HEV IgM의 적정농도는 IgG의 적정농도만큼 높지 않고 두 주 후에는 점차 약해졌다. 비록 이 동물들에서 IgG 와 IgM 항체가 20일째에 최초로 발견되기는 하였으나, 안티-HEV IgM의 적정농도는 최대치를 나타낸 반면 20일째에 IgG의 적정농도는 최소값을 나타내었으나, 일정량 정도 증가하여 3달 이상을 거의 동일한 수준을 유지하였다. 침팬지-1375에서는, 안티-HEV IgM만이 20일째에 검출되었다(도 5d). 적정량은 침팬지-1374보다 높았고 안티-HEV IgM은 모니터링의 전 기간동안 검출되었다. 침팬지-1375에서 안티-HEV IgG는 27일째에 최초로 관찰되었고(도 5c) 실험기간동안 거의 동일 수준을 유지하였다.
실시예 9
곤충 세포에서 발현되는 완전한 0RF-2 단백질에 기초한 ELlSA와 E. Coli에서 발현되는 구조 단백질 절편에 기초한 ELlSA의 비교
진핵세포에서 HEV 게놈의 완전한 ORF-2 영역의 발현이 E. Coli에서의 구조 단백질 절편의 발현보다 어떤 장점을 가지고 있는지 측정하기 위하여, ELISA에 앞의 항원을 사용하여, 박테리아에서 발현된 항원 절편을 사용하여 먼저 분석한 cynomolgus 원숭이 혈청을 재테스트하였다(Tsarev, S. A. et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:559-563; and Tsarev, S.A. et al. (1993) J. Infect. Dis. (167L1302-1306) (표 3).
완전한 ORF-2를 발현시키는 곤충 세포로부터의 항원에 대한 ELISA와 구조 단백질의단편을 발현시기는 E. Coli로부터의 항원에 대한 ELISA의 비교
사이노몰구스번호 박테리아 세포로부터 유래된 항원 (ORF-2의 일부)* 곤충 세포로부터 유래된 항원 (완전한 ORF-2)
항-HEV가 검출된 최초일 항-HEV
검출된최초일 적정농도 최대 적정농도
Cyno-376 28 21 1:400 1:8000
Cyno-369 54 40 1:100 1:8000
Cyno-374 19 19 1:400 1:8000
Cyno-375 26 26 1:400 1:8000
Cyno-379 21 19 1:100 1:8000
Cyno-381 28 28 1:400 1:8000
감도가 다소 떨어지는 ORF-3으로도 혈청을 테스트하였다 [Tsarev, S.A. 등, (1993), J. Infect. Dis. (167: 1302-1306) 참조]
6 마리의 원숭이중 3마리를, E. Coli에서 발현된 항원보다 먼저 혈청 전환이 발견된 곤충세포에서 발현된 항원을 이용하여, ELISA로 검사하였다. 곤충 세포에서 유도된 항원을 이용했을 때, 여섯 마리의 원숭이 모두의 혈청에 최대 적정농도(1:8000)로 테스트하였을 경우에도 안티-HEV 항체를 검출할 수 있었다. E-coli 세포에서 유도된 항원(미얀마 균주)을 사용했을 때에는, 안티-HEV 적정농도에 대한 어떠한 정보도 얻을 수 없었는데, 그 이유는 모든 혈청이 1:100 희석농도에서만 테스트되었기 때문이다(Tsarev, SA et al. (1992)Proc. Nat. Acad. Sci. USA; 89:559-563; Tsarev et al. (1993)J. Infect. Dis.(167:1302-1306)).
다른 실험에서는, E형 간염 바이러스 균주인 SAR-55을 연속적으로 10배씩 증가시켜가며 희석하여 1O-1내지 1O-5희석액을 cynomolgus의 쌍에 접종하여 바이러스를 적정하었다. 혈청 ALT의 수준을 측정하여 간염바이러스를 결정하였고 HEV에 대한 혈청 항체를 본 발명의 ELISA 방법(도면에 있는 데이터) 또는 제네랩의 ELISA(세 개의 ELISAs, 야브로흐 등(J. Virol., (1991) 65:5790-5797)에 언급되고 각각 4-2, 3-2 및 612로 표시되는 항원중 어느 하나에 기초한 방법)방법에 의해 결정되었다(도 6 a-g의 바닥에 (+) 또는 (-)로 표시된 데이터). 모든 시료는 코드하에 데스트되었다.
본 발명의 ELISA 방법은 접종된 모든 사이노몰구노 원숭이와 사용된 바이러스의 모든 희석액에 대해 안티-HEV IgG로의 혈청전환이 측정되었다.
이와는 대조적으로, 아래에 요약된 바와 같이, 제네랩의 결과는 매우 가변적이었다.
바이러스액의희석 농도 제네랩의 ELISA 본 발명의 ELISA
10-1 테스트하지 않음 양성
10-2 일정기간 동안은 모든 동물에 대하여 양성 양성
10 -3 모든 동물에 대하여 음성 양성
10-4 Cyno 289: IgM 및 IgG에 대하여 음성 양성
10-5 Cyno 383: 음성Cyno 386: 음성Cyno 385: 양성 양성
사이노 385(10-5)는 제네랩 및 본 발명의 ELISA 테스트에 대해 모두 양성을나타내었기 때문에, 1O-4(열배 이상의 바이러스로 접종한 경우) 및 1O-3(백배 이상의바이러스로 접종한 경우)에도 양성 반응을 나타내리라고 기대되었다. 본 발명에 따르면 양성을 나타낸 반면 이와는 대조적으로 제네랩의 ELISA 테스트에 따르면 비록 사이노 383 과 393의 ALT 수준이 활성화된 간염바이러스의 존재를 암시하고는 있으나 1O-3과 1O-4에서 모두 양성 반응을 나타내지 않았다. 따라서 상기 결과는 HEV에 대한 항체를 검출하는데 있어서 종래의 방법보다 본 발명의 ELISA방법이 장점을 지니고 있음을 지지한다.
실시예 10
HEV 파키스탄 균주의 SAR-55의 완전한 ORF-2 영역으로부터 발현된 55kDa 또는 박테리아내에서 융합 단백질로서 발현된 짧은 영역의 ORF-2를 포함하는 재조합 ORF-2 항원에 기초한 ELISAs의 비교
실시예 3에서 기술되고 도 2a 와 2b에 나타나 있는 바와 같이, 다양한 분자량의 다수의 단백질이 완전한 ORF-2를 포함하는 재조합 간상바이러스로 감염된 곤충세포에서 발현되었다. 약 55kDa의 분자량을 가지는 단백질을 접종 후 7일째에 수득한 5×102개의 SF-9 세프로부터 다음과 같이 일부 정제하였다. 감염세포를 원심분리한 후, 10mM 트리스-HC1(pH 8.0), 50mM NaC1,40㎍/l㎖의 페닐메틸술포닐 플루오르화물(시그마, 세인트. 루이스, 미조리)를 포함하는 용액 10㎖에 재현탁시킨 다음, 셀을 파괴하기 위해 초음파분해하고 용균액을 90,000×g 로 4℃에서 30분간 원심분리하였다. 상청액을 1OmM 트리스-HC1(매 8.0)과 50mM NaC1로 적정화시킨DET-세파로스 CL-6B(파마시아, 웁살라, 스웨덴) 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 로딩 버퍼로 세척하였고 55kDa 단백질을 1OmM 트리스-HCl(매 8.1)과 250mM NaCl로 추출하였다. 55kDa 단백질을 포함하는 분리된 물질들을 합쳐서 단백질 용액 10㎖에 대해 (NH4)2SO43g을 첨가하여 적정하였다. 단백질 침전물을 1OmM 트리스-HC1(pH 8.0), 50mM NaC1에 용해시켰다. 다음에 55kDa 단백질을 ELISA 방법에서 곤충 세포에 의해 발현된 HEV 항원으로서 사용하여 박테리아에서 발현된 두 개의 HEV 항원( 3-2 ((멕시코)(Goldsmith et al., (1992)Lancet, 339:328-331)) 또는 SG3((미얀마)(Yarbough et al., (1993) Assay development of diagnostics tests for hepatitis E. In 'International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disesae. Scientific program and abstract volume.' Tokyo : VHFL,p 87, Abstract # 687))중 어느 하나에 기초한 ELISAs 방법에 대한 비교 테스트로사용하였다. 상기 박데리아 항원은 분자량이 26kDa인 글루타치온-S-트랜스퍼라아제 (GST)와 ORF-2의 C-말단으로부터 6개의 아미노산만큼 상부에 위치한 42개의 아미노산(Yarbough et al., (1991)J. Virol., 5:5790-5797)을 포함하는 3-2(M) 항원 서열 또는 ORF-2의 C-말단의 327개의 아미노산(Yarbough et a1., (1993))중의 어느 하나의 융합 단백질이다. ELISAs는 다음과 같이 실시하였다.
(pH 9.6)의 탄산염 버퍼를 채운 폴리스티렌 미세적정 분석 플레이트 (Dynateck, S, Windham, ME)의 웰당 55kDa 단백질을 60ng씩 또는 융합단백질을 200ng씩 로딩'한 후 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 10% 송아지 혈청과 O.5% 젤라틴을 포함하는 PBS로 차단시졌다. 1O-1내지 1O-3범위가 되도록 HEV 균주 SAR-55를 포함하는 분비물의 희석액을 정맥주사로 접종한(참고: 사이노 387 및 392는 경구로 주입하였음) 사이노몰구스 원숭이로부터 얻은 혈청 시료를, 표 5 및 도7a-7j 및 8a-8d에 나타나있는 바와 같이, 차단 용액내에서 1:100으로 희석하였다. 1:1000 또는 1:2000으로 희석된 과산화효소가 결합된 염소의 안티-인간 IgM(Zymed, San Francisco, CA) 또는 1:1OOO으로 희석된 과산화효소로 레이블링된 염소의 안티-인간 면역글로불린을 탐지용 항체로 사용하였다.
경구로 접종된 두 원숭이, 즉 시아노-387 및 시아노-392의 경우를 제외한 모든 ELISA 테스트에서는, 55kDa 단백질 및 융합 항원을 동일 실험실에서 동세시에 테스트함으로써 사용된 항원만이 변수가 되도록 하였다. 55kDa 항원을 이용한 안티-HEV ELISA에서 광학 밀도가 O.2 이상이고 광학 밀도 값이 동일 동물에 대한 접종전 혈청의 광학 밀도 값의 두배가 되면 양성 반응으로 기록하는 기준으로 하였다. 게다가, 박테리아에서 발현된 두 개의 항원들은 GST와의 융합 단백질이기 때문에, 이 항원으로 테스트된 시료의 광학 밀도는 양성반응으로 간주되기 위해서는 GST와 융합되지 않은 항원으로부터 얻은 광학 밀도보다 3배 이상이 되어야 한다 (Goldsmith et a1.,(1992)).
결과
HEV 분비물의 현탁 표준액을 1O-1으로 희석한 용액으로 접종된 사이노몰구스 원숭이(377, 378)는 접종 후 4-5주에 ALT 활성의 증가를 나타내어 간염바이러스의존재를 암시하였다(표 5, 도 7a 및 7b).
접종전 혈청 내의 ALT의 평균값과 표준편차.
†15주후에 실험을 종료하였다.
*55kDa 항원을 이용한 ELISA에 의해 테스트하였을 때 Cyno-380의 접종전 혈청의 OD값이 사이노몰구스 원숭이의 접종전 혈청의 평균값의 두배였다.
§Cyno-387 및 Cyno-392를 제외한 다른 모든 ELISA.
- 미검출
ND 실험을 실시하지 않음
테스트된 모든 3종류의 항원들은 접종 후 3주가 된 사이노-377로부터 채취한 시료에서 항-HEV IgM을 검출하였으나 (표 5, 도 8a), 두 번째 동물 즉, 사이노-378로부터 채취한 어느 시료에서도 항-HEV IgM은 검출되지 않았다. 항-HEV IgG는 두 동물 모두에서 55kDA에 기초한 ELISA방법에 의하여 검출되었으나, 융합 항원에 기초한 ELISA방법에 의해서는 사이노-377에서만 항-HEV IgG가 검출되었다. 항-HEV IgG의 OD값은 항-HEV IgM의 값보다 현저하게 높았다. 55kDa 항원을 이용하여 얻은 ELISA 값 또한 두 개의 융합 항원으로부터 얻은 값보다도 현저하게 높았다(도 7a 및 7b). 두 개의 소오스로부터 얻어진 항원으로 실시한 ELISA에서 관찰된 두 OD값의 패턴 또한 매우 달랐다. 융합 항원에 기초한 ELISA의 경우, 혈청 전환 직후에 양성 신호가 최대치에 도달한 다음 실험이 진행된 15주 동안 점차 약해졌다. 55kDa 항원에 기초한 ELISA에서는, 양성 신호가 혈청 전환 직후 최대치에 도달하였고 실험 기간(15주) 동안 최대치와 거의 같은 정도의 높은 수준을 유지하였다.
HEV 분비물 표준 현탁액을 10-2배로 희석한 용액으로 접종한 원숭이(394 및 395) 모두에서 ALT 활성의 증가는 열배 높은 도우즈로 접종된 동물로부터 예측한 시간보다도 현저하게 늦게 일어났다(표 5, 도 7c 및 7d). 실제 사이노-395는 접종후 15주째 뿐만 아니라 접종 전에도 높은 ALT 활성을 지녔다. 접종 15주후에도 ALT활성을 나타내는 것은 아마도 HEV감염과는 관련이 없는 것으로 보인다. 항-HEV IgM의 약한 양성 반응이 사이노-394에서만 검출되었고(도 8b) 55kDa 항원을 기초로한 ELISA에서만 검출되었다. 그러나 양 동물 모두 감염되었기 때문에 항-HEV IgG의 혈청 전환은 두 동물 모두에서 검출되었다. 사이노-394에서, 항-HEV IgG는 3주째에 55kDa 항원에 의해 검출되었고 1주일 후에 3-2(M) 항원에 의해 검출되었다. SG3(B)항원은 사이노-395에서의 혈청전환을 검출하지 못했고 항-HEV IgG는 55kDa 항원으로만 검출되었다. 항-HEV는 이 동물에서 시간에 따라 적정농도를 감소시키는 경향이 있다.
사이노-380 및 사이노-383은 HEV 분비물의 표준 현탁액을 10-3배로 희석한 용액으로 접종하였다(표 5, 도 7e, 7f, 8c). 사이노-380은 접종 전과 후에 변동하는 ALT 활성을 지니고 있었다; 따라서 ALT 수준은 이 동물에 있어서 E형 간염바이러스에 대한 자료로서 사용될 수 없었다. 사이노-383에서는 ALT 활성이 약간 증가하는 것이 관찰되었고(도 7f), 이는 혈청 전환과 동시에 일어난 것으로 보아 미약한 간염 바이러스 E에 기인한 것으로 보인다. 항-HEV IgM은 세 종류의 항원중 어느 것에 의해서도 사이노-38O의 혈청에서 검출되지 않았다. 사이노-380은 SG3(B)틀 이용한 ELISA 테스트를 하였을 때 항-HEV로의 혈청전환을 나타내었으나 3-2(M) 항원의 경우에는 그러하지 않았다. 이 동물은 55kDa으로 테스트할 때 이미 존재하던 항-HEV IgG를 지니고 있으나 5주째부터 항-HEV IgG의 양이 상당히 증가하기 시작하였다(도 7e). 다른 사이노몰구스 원숭이의 혈청에서 이미 존재하는 항체를 동정방법이 이전에 보고되어 있다(Ticehurst et al., (1992)J. Infect Dis., ,165:835-845; Tsarev et al., (1993)J. Infect Dis., 168:369-378). 예측했던 시간에 혈청전환이 발생하였으나 사이노-383의 시료내의 항-HEV IgG의 값은 매우 낮은 수준을 유지하였고 55kDa 항원에 의해서만 검출이 가능하였다.
사이노-389 및 사이노-393을 HEV 분비물 표준 현탁액을 10-4배로 희석한 용액으로 접종하였다(도 7g, 7h, 8d, 표 5). 비록 사이노-393에서 5주째에 소량이기는 하나 특징적인 ALT 피크가 나타난 타이밍은 간염 바이러스의 존재를 나타낼 수 있는 경계점을 암시하기는 하나 어느 동물에서도 현저한 ALT 활성의 증가를 나타내지는 않았다. SG(3) 또는 3-2(M) 항원에 기초한 ELISA에 따르면 양 동물 모두 HEV 감염에 대해 음성반응을 나타내었다. 이와는 대조적으로,55kDa 항원은 접종 후 6-8주에 사이노-389의 혈청에서 항-HEV IgG을 검출하였고(표 8d) 양 동물 모두에서 6내지 15주에 항-HEV IgG를 검출하였다.
분비물 표준 현탁액을 1O-5으로 희석한 용액으로 접종한 어느 동물들에서도 특징적인 ALT 활성의 증가가 발생하지 않았으나(도 7i, 7j, 표 5), 사이노-386에서는 55kDa 항원에 의해 각각 8-13주, 8-15주에 항-HEV IgM과 항-HEV IgG가 검출되었다(도 7j, 8e). 사이노-385에서는 항-HEV IgG가 55kDa과 3-2(M)항원에 의해 검출되었으나 SG3(B) 항원에 의해서는 검출되지 않았다. 선행 패턴과는 대조적으로, 55kDa항원으로 검출한 경우보다도 융합 항원을 사용한 경우 항-HEV IgG가 4주나 빨리 검출되었고 그 값도 매우 높았다.
HEV 분비물 표준 현탁액을 1O-6-1O-8배로 희석한 용액으로 접종한 어느 동물에서도 세 종류의 HEV 항원중 어느 하나에 대해서라도 반응하는 항체를 발현하지 않았다. 이 동물들에서는 사이노-400에서 9주에 다소 현저한 ALT 활성 피크를 나타낸 것(표 5)을 제외하고는 증가된 ALT 활성을 관찰할 수 없었다. 그러나 사이노-400에서 혈청 전환이 발생하지 않은 것으로 보아 상기 피크는 HEV 감염과는 관련이 없는 것으로 보인다.
10% 분비물 현택액을 10-1배로 희석한 용액을 경구를 통하여 접종시킨 두 사이노몰구스 원숭이의 경우, ALT 값이 증가하지 않았고 3-2(M) 및 55kDa 항원을 이용하여 수행한 ELISA에 의해서 HEV에 대한 혈청 전환을 검출할 수 없었던 점으로 보아 어떠한 원숭이도 감염되지 않았음을 알 수 있다(표 5).
결론적으로, 분비물 현탁액을 1O-1내지 1O-3배로 희석한 용액으로 접종한 모든 동물들에서 HEV 감염에 대한 혈청학적인 증거가 발견되었고, 이보다 더 희석한 용액으로 접종한 동물들에서는 감염에 대한 증거가 발견되지 않았다. 증가된 ALT 값으로 정의되는, 현저한 양의 간염 바이러스의 존재는, 1O-1배로 희석한 용액으로 감염된 두 원숭이에서만 관찰되었다. 매우 낮은 수준의 ALT 활성 증가가 분비물 현탁액을 보다 더 높은 비율로 회석한 용액으로 접종된 몇몇 동물에서 관찰되었고 기타 다른 동물들에서는 ALT 활성 증가가 관찰되지 않았다. 이러한 사실만 따로 고려하면, 낮은 수준의 ALT 증가로는 간염 바이리스의 존재를 진단할 수 없다. 그러나 ALT의 증가와 동시에 혈청전환이 일어나고 이러한 ALT 피크의 형태는 이들 동물들내에 미약한 간염 바이러스가 존재하는 것을 암시한다. 항-HEV IgG로의 혈청전환은 분비물 현탁액을 1O-1-1O-5범위로 희석한 용액으로 접종한 모든 동물들에서 검출되었다. 항-HEV IgG의 값이 낮아지는 경향과 점차 지연된 혈청 전환이 스톡 용액을 좀 더 높은 비율로 희석한 용액으로 접종한 동물들에서 관찰되었다.
요약하면, HEV의 파키스탄형 균주에 의해 감염된 사이노몰구스 원숭이에서 항-HEV IgG 와 항-HEV IgM을 검출하는데 있어서, 55kDa 파키스탄 ORF-2 항원이 3-2(M) 또는 SG3(B)보다 효율적이었다. 예를 들면, 사이노-385의 혈청을 제외하고는 모든 동물들의 혈청들은, 3-2(M) 또는 SG3 항원을 사용한 ELISA보다 55kDa 항원을 사용한 ELISA에 의해서 항-HEV IgG 또는 항HEV IgNl를 검출하는 것이 보다 효율적이었다. 55kDa 항원을 사용한 ELISA가 일관되고 반복가능한 결과를 나타내었으며, 분비물을 10-5배 또는 그 이상으로 희석한 용액으로 접종한 열 마리 동물 모두에서 항-HEV IgG를 검출하였다. 접종원을 희석할수록 ELISA 신호의 크기 또한 감소하였다. 융합 항원은 각 동물의 쌍 들사이에 일관된 결과를 나타내지 못하였다. 단지 1O-1, 1O-2, 1O-3또는 1O-5배로 희석된 용액으로 접종된 각 동물의 쌍들중 하나만이항-HEV IgG로의 혈청 전환을 나타내었고, 이들 융합 항원들에 의해서는 항-HEV IgM로의 혈청 전환은 단지 하나만이 검출되었다. 비록 하나의 동물(사이노-393)의 혈청이 55kDa 항원으로 분석하였을 때 높은 수준의 항-HEV IgG 값을 유지하였으나 표준 접종원을 1O-4배로 희석한 용액으로 접종한 동물들 어느 것도 두 개의 융합 항원들에 의해서는 혈청 전환이 검출되지 않았다. 앞서 기술한 바와 같이, 비록 항-HEV IgM에 대한 ELISA가 사이몰구스 원숭이의 항-HEV IgG에 대한 ELISA보다 현저하게 덜 민감하지만, 55kDa 항원이 3-2(M) 또는 SG3(B) 항원보다 더 많은 동물들에서 항-HEV IgM을 검출할 수 있었다. 요약하면, 본 연구에서 사용된 파키스탄 바이러스 접종원의 감염 여부에 대한 적정농도는 3-2(M)과 SG3(B)를 기초로한 ELISA로부터 얻어진 데이터로는 결정할 수 없으나 파키스탄 55kDa 항원을 기초로한 ELISA로부터 얻어진 데이터만으로 결정하는 것이 가능하다.
사이노-385의 경우, 두 개의 테스트의 결과간에 항-HEV IgG가 검출되기 시작한 주들 사이의 차이는 4주이었다. 이러한 데이터는 3-2(M)항원보다 큰 55kDa 및 SG3(B) 항원에는 존재하지 않는 것으로서 이들 동물에 의해 인지되는 3-2(M) 항원내의 특징적인 에피토프의 존재를 암시한다. 완전한 ORF-2(75kDa) 및 55kDa 단백질을 포함하는 전체 곤충 세포의 용균액을 이들 샘플을 재테스트하기 위한 항원으로서 사용했을 때, 55kDa 단백질만을 사용했을 때의 결과와 같았다. 이러한 결과는 55kDa 단백질이 3-2 에피토프의 아미노산을 결여하고 있다기 보다는 본 연구에서 사용된 서로 다른 세 종류의 항원들 사이에 3-2 에피토프 서열과 다른 구조가 존재한다는 것을 암시한다. 결론적으로, ORF-2의 보다 긴 영역을 포함하고 에피토프 3-2의 전체 서열을 포함하고 있음에도 불구하고 SG3(B) 항원이 3-2(M) 항원보다 혈청의 양성반응을 더 감지하지 못한다는 사실은 주목할 만하다.
실시예 11
RT-PCR에 의해 HEV SAR-55 바이러스 스톡의 감염 적정 농도의 결정
접종윈의 감염 적정 농도에 대한 지식은 동물 모델에 대한 감염 실험으로부터 얻은 데이터를 분석하는데 있어서 매우 중요하다. 그러나 지금까지 HEV 바이러스 스톡에 대한 감염 적정 농도에 대해서는 보고된 바가 없다. HEV 균주인 SAR-55를 포함하는 분비물 현탁액을 열배씩 차례대로 희석한 용액을 추출한 후 RT-PCR을 다음과 같이 실시하여 HEV 게놈을 검출할 수 있는 희석의 최대 범위를 결정하였다. 분비물 현탁액 200㎕를 1.5M NaC1 0.4ml와 15% 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 8000과 혼합한 후, 4℃에서 하루 정도 놓아두었다. 침전물을 16,000g의 원심분리기(Beckman, Palo Alto, CA)에서 3분간 원심분리하어 수득한 후, 4.2M 구아니딘 티오시안산염, 0.5% N-라우로일살코신, 0.25M 트리스-HC1(pH 8.0), 0.15M 디티오트레이톨(DTT), 및 1.㎍ tRNA를 포함하는 용액 475㎕에 용해시켰다. lM 트리스-HC1(pH8.0) 50㎕, 10OmM EDTA 및 10% SDS를 첨가하였다. 65℃에서 페놀-클로로포름(1:1)을 2회 반복 처리하여 RNA를 추출한 후, 상온에서 클로로포름 추출을 실시하였다. 상층에 7.5M 암모늄 아세트산 250㎕를 첨가한 후, 2-프로판올 0.6㎖를 처리하여 핵산을 침전시킨 후, 침전물을 75& 에탄올과 100% 에탄올로 차례대로 세척하여 역전사(RT) PCR에 사용하였다.
HEV 게놈의 검출을 위해, SAR-55 게놈의 3' 영역(ORF-2)의 서열을 나타내는한 벌의 프라이머 두 세트를 사용하였다. 역전사용 프라이머와 제1 PCR은 각각 SEQ ID NO:99:GTATAACGGATCCACATCTCCCCTTACCTC와 SEQ ID:100:TACAGATCTATACAACTTAACA -GTCGG로 표시된다. 제2 PCR을 위한 프라이머와 제2 PCR은 각각 SEQ ID NO:101: GCGGCAGATCTCACCGACACCATTAGTAC와 SEQ ID NO:102:TAACCTGGATCCTTATGCCGCCCCTCTTAG이다. RNA 침전물을 O.05M 트리스-HC1(pH 7.6) 20㎕, O.06M KC1, O.0lM MgC12, 0.001M DTT, RNasin 40유니트(Promega Biotec, Madison, WI), 조류의 골수아구증 바이러스의 역전사 효소(Promega Biotec), 및 역 방향 프라이머 10pmol을 포함하는 용액에 용해시킨 후, 42℃에서 1시간동안 배양하였다. 역전사효소 혼합물 20㎕에 0.0lM 트리스-HC1(pH 8.4) 100㎕, 0.05M KC1,0.0025M MgC12, 각각 0.0002N1인 네 종류의 dNTP, 미네랄 경유 1OO㎕하의 앰플리태그(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)를 첨가하였다. PCR을 35회 실시(94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분간)함으로써 HEV cDNA를 증폭하였다. PCR 산물을 1% 한천겔위에서 분석하였다. 이어서 상기 역전사 효소 혼합물 5㎕를 연장 시간을 3분으로 증가시켰다는 점을 제외하고는 동일한 조건하에서 제2 차 증폭하였다.
HEV 분비물 표준액을 1O-1내지 1O-5배로 희석한 모든 희석액을 각각 이용하여 제조된 RT-PCR 산물을 2% 한천 겔위에서 분리한 후, 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하여 검출하였다. 희석 농도가 높을 수록 특정 PCR 산물의 양이 감소하는 것이 관찰되었고, 1O%의 분비물 현탁액을 가장 많이 희석한 용액내에서의 HEV 게놈은 1O-5으로 검출되었다. 따라서, 회석 요인을 고려하면, HEV 게놈의 적정 농도는 대략분비물 1g당 1O6.7이 된다.
게다가, HEV 게놈을 포함하는 RT-PCR에 의해 나타내어진 희석용액의 범위에 해당하는 용액만이 사이노몰구스 원숭이에 감염성이 있었다. 따라서 분비물의 표준 현탁액에 대한 감염도 측정의 적정 농도와 RT-PCR에 의해 검출된 게놈의 적정 농도는 거의 동일하였다. RT-PCR 적정농도와 감염도의 적정 농도간의 유사한 연관관계는 C형 간염 바이러스의 한 균주에서도 발견되었다(Cristiano et a1., (1991)Hepatology, 14:51-55; Farci et al., (1991)N. Engl. J. Med., 25:98-104; Bukh et al., (1992);Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 89:187-191).
실시예 12
ORF-2 단백질을 백신으로 이용한 능동 면역 및 항-HEV 양성 회복기 혈장을 이용한 수동면역.
55 kDa ORF-2 단백질에 대한 ELISA에서 HEV 항체 음성(<1:10)을 나타내 보인 사이노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis)를 생물학적 잠재적 위험성이 배제된 BL-2하에 개별적으로 가두어 둔 다음, 파기스탄형 HEV 균주 SAR-55를 포함하는 배설물 현탁액 (태중의 송아지 혈청에 현탁시킨 용액)을 1O,OOO 또는 1,OOO CID50수준으로 희석한 다음 동물에 대한 정맥 접종용으로 사용하였다.
능동 면역 실험을 위해, 실시예 10에 기개되어 있는 방법에 따라 접종한지 7일 후에 회수된 5×108SF-9 세포로부터 바쿨로바이러스 재조합체에 의해 발현된 55kDa ORF-2 단백질을 정제하였다. 정제된 55 kDa 단백질 3mg을 알루미늄을 이용하여 침전시킨 다음, 알루미늄에 의해 침전된 55kDa 단백질 50㎕을 함유하는 백신 0.5m1을 근육주사함으로써 8마리의 사이노몰구스 원숭이를 면역시켰다. 4마리의 원숭이에 대해서는 1회 투여하고, 나머지 4마리의 원숭이에 대해서는 2회 투여하였는데, 첫번째 투여한지 4주일 후에 두 번째 투여를 실시하였다. 마지막 면역화로부터 4주일 후에 1,O00-10,O0O CID50의 HEV를 정맥주사함으로써 영장동물에 대한 항원투여를 실시하였다.
능동 면역 실험에서는 4마리의 사이노몰구스 원숭이가 대조군으로서 이용되었다. Cyno-412와 413에 대해서는 위약 (0.5ml의 인산완충 생리식염수 용액)을 1회 투여하고, Cyno-397과 849에 대해서는 위약을 2회 투여하였다. 대조군의 동물에 대해서는 1,OOO-1O,OOO CID50의 HEV를 이용한 항원투여를 실시하였다.
수동 면역 실험을 위해서는 2 종류의 중국형 HEV 균주인 KS1-1987과 KS2-1987을 함유하는 10%의 배설물 현탁액 0.5m1을 Cyno-384에게 감염시킨 다음 회복기 동안 이 동물로부터 혈장을 반복적으로 수거하였다 (Yin 등,(1993), J. Med. Viro1., 41;230-241). Cyno-396과 Cyno-399의 혈액 약 1%와 Cyno-401과 Cyno-402의 혈액 약 10%를 1:10,O00의 HEV 항체 적정농도롤 가지고 있는 Cyno-384의 회복기 혈장으로 대체하였다. 이들 동물들에 대해 혈장 대체로부터 2일 후 10OO CID50의 HEV를 이용하여 항원투여를 실시하었다. 대조군에 대해서는 Cyno-405의 혈액 10%를 HEV에 감염되기 이전의 Cyno-384로부터 얻은 항-HEV 음성 혈장으로 대체하였다.
수동 및 능동 면역 실험 모두에 대해, 집종 전과 접종으로부터 15주일 동일매주 경피적으로 니들을 이용한 간의 샘플링, 혈청 및 배설물 샘플링을 실시하였다. 혈청에 대해서는 상업적으로 이용가능한 시험법 (Metpath Inc., 록빌, 메릴랜드)을 이용하여 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT)의 농도를 분석하였는데, 간염에 대한 생화학적인 증거는 ALT가 2배 또는 그 이상 증가된 것으로서 정하였다. 간의 생검시료는 정해진 규정에 따라 조사하였으며, 이용된 항-HEV ELISA에 대해서는 실시예 1O에 기재되어 있다. 제조회사의 프로토콜에 따라 TRIso1 시약 (Gibco BRL, 게티스버어그, 메릴랜드)을 이용하여 추출된 10% 배설물 현탁액 100㎕ 또는 혈청 1OO㎕로부터 RNA를 추출한 것을 제외하고는 실시예 11에 기재되어 있는 방법에 따라 RNA 추출과 RT-PCR을 실시하였다. 정량화를 위해, PCR 양성 계열의 혈청 또는 각각의 동물로부터의 배설물을 조합한 다음 소의 혈청을 이용하여 10배씩 연속적으로 회석하였다. 이러한 회석용액 1OO㎕를 이용하여 전술한 바와 같이 RNA 추출 및 RT-PCR을 실시하였다. 본 실험에서 이용된 PCR 프로토콜은 혈청 1ml당 1O CID50정도에 불과한 HEV와 배설물 1g당 1OO CID50정도를 검출할 수 있었다.
접종 전 5주일과 접종 후 15주일 동안 매주 채취된 혈청 시료의 ALT 피크 값에 대한 비값(접종후/접종전)을 개별적인 동물마다 나타내었다. 지메스 테스트(Simes, R.J., (1996),Biometrika, 73:751-754)를 이용하여, 대조군의 동물들로부터 얻은 비값의 평균값을 수동 또는 능동 면역된 동물로부터 얻은 비값과 비교하였다.
윌콕슨 테스트 (Voether, G.(1967), Elements nonparametric statistics,(John Wiley & Sons Inc., 뉴욕), pp.31-36)를 이용하여, 대조군 동물에 있어서의 비레미아와 배설물로의 바이러스 분비 지속기간 및 HEV 게놈 적정농도를 능동 또는 수동 면역된 동물에 대해 측정된 값과 비교하였다. 이와 동일한 테스트를 이용하여 수동 및 능동 면역된 동물에 대해서도 비교하였다.
통계적 분석을 위해 1m1의 혈청당 HEV 게놈 1O 미만인 혈청 시료를 적정농도 1:1로 하고, 배설물 1g당 HEV 게놈 1OO 미만인 배설물 시료를 적정농도 1:1O으로 하였다.
결과
면역되지 않은 동물에 있어서의 E형 간염의 감염 경과.
HEV 항원투여된, 면역되지 않은 동물 5마리 중 3마리에게서, 혈청 ATL 값이 2배 이상 증가함으로써 간염의 생화학적 증거가 나타났다. 나머지 2마리에게서는 ALT 값이 그다지 증가하지 않았다. 그러나, 조직병리학적 데이터는 표 6에 나타나있는 바와 같이 5마리 모두에게서 간염이 발생된 것으로 나타났다.
1+에서 4+까지 까지 등급을 정할 때 1+와 2+ 사이의 등급으로 평가되는 괴사성 염증의 변화는, ALT 활성의 상승을 보인 동물의 경우 ALT 활성의 상승과 일시적으로 관련을 가지고 있는 것으로 보였다.
대조군의 모든 동물은 항원투여 3-5주일 후 HEV에 대해 혈청전환현상을 나타내었으며, 1:1,000 내지 1:32,O00 범위의 최대 HEV 항체 적정농도를 나타냈다. 감염의 정도, 간염 및 항-HEV 반응의 정도간에는 상관관계가 양호하였다. 간염에 대해 가장 높은 등급 총계를 나타낸 Cyno-405는 비레미아 기간, 바이러스 분비기간이 가장 길었고 항-HEV 농도도 가장 높았다(표 6 참조). 배설물로 바이러스가 분비되는 기간은 비레미아의 지속기간과 동일하거나 그 이상이었다. 모든 대조군 동물의 경우에는 혈청의 HEV 게놈의 적정농도 (1O-3-1O-4.7)가 배설물의 HEV 게놈의 적정농도(1O-5.7-1O-7)보다 낮았다. 이러한 동물 5마리 모두에게서 비레미아와 배설물로의 바이러스 분비 현상이 4-11주일동안 관찰되었고, 혈청전환 후로부터는 평균 4.2주일(범위 2-9주)동안 관찰되었다.
수동 면역. 약 1%의 혈액이 항-HEv 양성 회복기 혈장으로 대체된 Cyno-396과 399는 대체한 지(항원투여시)로부터 2일 후 HEV 항체 적정농도가 1:40이었다(표 6 참조). HEV 항체 적정농도가 1/2로 떨어지는 현상은 접종 1주일 후 2 마리 동물 모두에게서 관찰되었고 혈장 대체 2주일 후까지는 HEV 항체가 검출가능한 농도 미만(<1:10)으로 떨어졌다. 항-HEV는 Cyno-396의 경우 혈장 대체 5주일 후, Cyno-399의 경우 혈장 대체 4주일 후에 다시 검출되었는데, 이는 HEV에 의한 감염이 이루어졌음을 의미하는 것이다. 최대 HEV 항체 적정농도 (1:8,000)는 접종 9-10주일 후에 도달되었다. 항원투여 후, ATL 활성의 상당한 증가가 2마리 동물 모두에게서발견되지 않았다. 그러나, 간염의 조직학적 증거가 Cyno-396에서 발견되었고, HEV 게놈이 2마리 동물 모두의 혈청과 배설물에서 검출되었다 (표 6 참조).
Cyno-401과 402는 혈액의 약 10%가 회복기 혈장으로 대체되었다. 혈장 대체2일 후 (항원투여시), 두 마리의 사이노몰구스 원숭이의 HEV 항체 적정농도는 1:200 이었다 (표 7 참조).
생물학적 및 조직학적 분석 결과는 어느 동물에서도 간염증상을 보여주지 않았다. 그러나 2마리 동물 모두에게서 HEV 비레미아와 바이러스가 배설물로 분비되는 현상이 관찰되었는데, 이것은 감염이 이루어졌음을 나타내는 것이다 (표 6 참조). 그러므로 보다 높은 항체 적정농도를 달성한 수동 면역학적 예방이 이루어진 경우에는, HEV를 이용한 항원투여 후에도 사이노몰구스 원숭이가 간염에 걸리지 않았다.
능동 면역 55kDa 단백질 50㎍ 1회 투여하여 면역된 4마리의 영장동물은 재조합 단백질에 대해 1:100 내지 1:10,000 범위의 적정농도로 항체를 만들었다 (표 7 참조). 1마리(Cyno 013)는 항원투여 9주 후에 마취사고로 사망하였으며, 분석에 포함되어 있다 (표 6 참조). 2회 항원투여받은 4마리의 동물은 1:10,000의 적정농도로 HEV 항체를 생산했다. 4마리의 원숭이 중 2마리는 HEV의 정맥주사 후 죽었다. 이는 마취사고로 인한 것으로 보이지만, 정확한 병인은 알아낼 수 없었다. 이들 2마리의 원숭이는 다음 단계의 분석시에는 누락되었다. 남아 있는 6마리의 동물 중의 어느 것도 비정상적인 ALT 수준을 나타내거나 항원투여 후 간염의 조직학적 증거를 나타내지 않았다 (표 6 참조). 55kDa 단백질을 1회 또는 2회 투여하여 면역된 사이노몰구스 원숭이는 비레미아를 일으키지 않았다. 그러나, 면역원을 1회 투여받은 4마리 중의 3마리는 배설물에 바이러스를 분비했다. 반면, 백신을 2회 투여받은 2마리의 동물에서는 배설물로의 바이러스 분비현상이 나타나지 않았다.
능동 면역된 동물의 대부분은 수동 면역된 동물에 비해 HEV 항체 적정농도가 높다. 그러나, Cyno-013은 감염시 HEV 항체 적정농도가 1:100 이었고, 반면 항-HEV 혈장에 의해 수동적으로 면역된 2마리의 동물의 경우에는 적정농도가 1:200이었다. 그러나 Cyno-013은 수동적으로 면역된 동물에 비해 HEV 감염에 대한 방어작용이 보다 큰 것으로 나타났다. 감염시 HEV 항체 적정농도가 1:100인 Cyno-013은 간염과 HEV 게놈에 대해 완전한 방어작용을 나타내었다 (표 6 참조). 반면, Cyno-003은 감염시 HEV 항체 적정농도가 1:1O,OOO 이지만 배설물로 HEV를 분비하는 현상을 나타냈다. 그러나, 이 동물 또는 면역원을 1회 투여받았고 HEV 항체 적정농도가 1:10,000 이상인 다른 사이노몰구스 원숭이의 경우에는 간염이나 비레미아가 나타나지 않았다.
대조군과 면역된 동물에 있어서의 HEV 감염 경과 비교.
조직병리학적으로 측정한 바에 따르면, 수동적으로 면역된 원숭이 중 1마리를 제외하고 모든 면역된 동물은 HEV의 정맥주사에 의해 간염에 대한 방어작용을 나타냈다. 간염 증상의 정도와 바이러스의 복제정도에 대한 평균값을 대조군과 수동적으로 면역된 동물 및 능동적으로 면역된 동물의 경우에 대해 비교해 보면, 일반적으로 감염 증상의 정도는 항원투여시의 HEV 항체 적정농도에 반비비례하며 다음과 같은 순서로 감소된다: 면역되지 않은 것> 수동 면역 (1%)> 수동 면역 (10%)>능동 면역 (1회 투여)> 능동 면역 (2회 투여) (표 6 및 8 참조). 그러나 수동적으로 면역된 써브그룹의 동물과 능동적으로 면역된 써브그룹의 동물의 숫자는 통계학적 분석을 실시하기에는 층분치 않았다. 그러므로, 수동적으로 면역된 그룹과 능동적으로 면역된 그룹을 조합하여, 조합된 대조군에 대해 통계학적 분석을 실시하였다. 이 분석 결과가 표 8에 나타나 있다.
그 결과, 대조군의 조직병리학적 등급과 조직학적 번화가 수동적으로 또는 능동적으로 면역된 동물의 경우와는 달랐다. 피크 ALT 값에 대한 접종후/접종전 비가 수동적으로 또는 능동적으로 면역된 동물에 비해 대조군이 높은 것은 통계학적으로 유의성이 있는데, 이는 두 그룹의 면역된 동물 모두에게서 간염의 생화학적증상에 대한 방어작용이 있음을 의미하는 것이다. 비레미아의 지속기간과 배설물중의 HEV 적정농도는 대조군의 경우보다 두 그룹의 면역된 동물의 경우가 훨씬 낮았다. 그러나 배설물로의 바이러스 분비현상이 지속되는 기간의 차이와 혈청의 HEV 적정농도의 차이는 대조군과 수동적으로 면역된 그룹간에는 통계학적으로 차이가 없었고, 대조군과 능동적으로 면역된 그룹간에는 상당한 차이가 있었다. 또한, 수동적으로 면역된 그룹의 동물과 능동적으로 면역된 그룹의 동물간에 비레미아의 지속기간과 배설물로의 바이러스 분비현상 뿐만 아니라 HEV 적정농도가 심각하게 차이가 났다.
요약하면, 표 6-8에 나타나 있는 결과는 수동적으로 및 능동적으로 획득된 HEV 항체는 병원성 HEV를 이용한 항원투여 후에는 사이노몰구스 원숭이가 간염에 걸리지 않았다는 것을 보여주고 있다. 5마리의 면역되지 않은 사이노몰구스 원숭이가 모두 SAR-55 1,OO0-10,OOO CID50를 이용한 항원투여를 받은 경우, 간염의 조직학적 증거가 나타나기는 하였지만 수동적으로 획득된 항체를 1:200의 적정농도로 가지고 있는 동물 2마리는 모두 간염에 걸리지 않았으며, 항체 적정농도가 1:40 정도로 낮은 2마리 중의 1마리도 또한 간염에 걸리지 않았다.
그러나, 능동적으로 면역된 동물은 수동적으로 면역된 동물에 비해 간염에 대해 완전한 방어작용을 나타냈으며 HEV 감염에 대해서도 보다 높은 내성을 가지고 있었다는 점에 주목하여야 한다. 예를 들어, 수동적으로 면역된 동물로부터 얻은 결과와는 대조적으로, 비레미아는 HEV 항원투여 후 능동적으로 면역된 동물에게서는 나타나지 않았다. 1:10,OOO 정도의 높은 HEV 항체 적정농도가 재조합 55kDa 단백질에 의해 1회 또는 2회 면역된 후 사이노몰구스 원숭이에서 얻어질 수 있었다. 1마리의 원숭이(013)가 능동 면역 후에 1:100의 적정농도를 나타내었지만, 이 정도의 수준으로도 간염 및 비레미아가 예방되었다.
능동 면역에 대한 연구에 의하면, 백신을 1회 투여한 경우에는 HEV 비레미아가 예방되기는 하지만 배설물로 바이러스가 분비되는 현상은 여전히 검출되었다. 그러나, 백신을 2회 투여한 경우에는 간염과 HEV 감염의 모든 증상을 예방하는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 결과는 예를 들어 외국 여행 전 백신을 1회 투여하는 경우에도, 감염 위험성이 큰 환경에서 여행자를 E형 간염으로부터 보호할 수 있다는 것을 의미한다.
마지막으로, 제시된 결과들은 A형 간염에 대해 비인간 영장동물의 수동 및 능동 면역학적 예방과 관련하여 이미 보고된 바 있는 결과들과 매우 유사하다: 수동 면역학적예방은 감염이 아니라 간염을 예방하는 반면, 백신 처리는 간염 뿐만 아니라 HAV에 의한 감염도 역시 예방하었다 (Purcel1, R.H. 등, (1992),Vaccine, 10:5148-5149). 흥미로운 것은 HEV에 대한 면역예방학적 연구는, 보호되는 항체의 적정농도 결정 (<1:100) 및 병원성 바이러스에 의한 항원투여 후 수반되는 현상면에서, HAV에 대한 면역학적예방 연구와 유사하다. 인간에게서 수동적으로 및 능동적으로 획득된 상당히 높은 정적정농도의 항-HAV 항체의 효능과, 간염 연구에 있어 영장동물 실험의 가치가 다른 연구들을 통해 확인되었으므로 (Stapleton, J., 등, (1985),Gastroenterology, 89:637-642; Innis, B.L., 등, (199),Vaccine, 10:8159), 사이노몰구스 원숭이에게서 얻은 이러한 결과는 인간에게 있어서의 예방에도 예기적으로 적용될 것이다.
실시예 13
이스트에 있어서, 완전한 ORF-2 단백질과 저분자량 단편의 직접 발현
다음과 같은,
1. 완전한 ORF-2 단백질 (aa 1-660, MW 70979), 단편 1778-1703(단편 번호는 하기에 주어진 프라이머 번호를 나타낸다)
2. 34번째 aa로부터 개시되는 ORF-2 단백질 (aa 34-660, MW 67206), 단편 1779-1703.
3. 96번째 aa로부터 개시되는 ORF-2 단백질 (aa 96-660, MW 60782), 단편 1780-1703.
4. 124번째 aa로부터 개시되는 ORF-2 단백질 (aa 124-660, MW 58050), 단편 1781-1703.
4종류의 단백질을 코딩하는 4종류의 cDNA ORF-2 단편을 플라스미드 p63-2를 주형으로 이용한 PCR을 이용하여 얻었으며, 합성된 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다:
SEQ ID NO.:103 (역 프라이머 #1703)
GCACAACCTAGGTTACTATAACTCCCGAGTTTTACC,
SEQ ID NO.:104 (정방향 프라이머 #1778)
GGGTTCCCTAGGATGCGCCCTCGGCCTATTTTG,
SEQ ID NO.:105 (정방향 프라이머 #1779)
CGTGGGCCTAGGAGCGGCGGTTCCGGCGGTGGT, 및
SEQ ID NO.:106 (정방향 프라이머 #1781)
CCGCCACCTAGGGATGTTGACTCCCGCGGCGCC.
SEQ ID NO.: 103-107로 기재된 모든 씨퀀스는 5' 말단에 4개의 뉴클레오티드에 이어서 합성 씨퀀스 CCTAGG를 포함한다. 이러한 합성 씨퀀스는 AvrII (BlnI) 제한효소에 대한 인식부위였다. 합성된 PCR 단편들을 BlnI으로 분리하여 pPIC9 벡터의 AvrII 부위에 클로닝시켰다 (도 1O 참조)(인비트로젠). 단편의 정확한 방향성은 ORF-2 씨퀀스와 벡터에 존재하는 비대칭 EcoRI 부위를 이용하여 제한효소 분석법에 의해 확인되었다. 정제된 재조합 플라스미드 pPIC9-1778 (단편 1778-1703 포함); pPIC9-1779 (단편 1779-1703 포함); pPIC9-1780 (단편 1780-1703 포함) 및 pPIC9-1781 (단편 1781-1730 포함)를 이용하여 인비트로젠의 프로토콜에 따라 이스트의 스페로플라스트(Picha 균주)를 형질전환시켰다. 동일한 프로토콜을 이용하여 재조합 클론을 조사하고 발현에 대해 분석하였다. 이렇게 발현된 단백질들은 본 발명에서 전술한 바와 같은 방법으로, 백신의 면역원으로서 및 면역분석시의 항원으로서 이용될 수 있다. 마지막으로, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들은 본 실시예에서 이용된 백터와 이스트 균주가 다른 벡터 (예를 들어 pHIL-Fl; 인비트로젠) 또는 다른 이스트 균주 (예를 들어 사카로마이세스 세레비지애)로 대치될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 14
재조합 바쿨로바이러스 63-2-IV-2에 감염된 SF-9 곤충세포에서 합성된 HEVORF-2 유전자 생성물의 정제 및 아미노 말단 씨퀀스에 대한 분석.
실시예 10에 기재되어 있는 방법에 따라, SF-9 세포를 재조합 바쿨로바이러스 63-2-IV-2에 감염시킨 다음 접종 한 지 7일 후 회수하였다. SDS-PAGE 상에 존재하는 곤충 세포 용해물 중 우성적으로 존재하는 단백질 밴드는 분자량이 약 55kDa이었다. 55kDa 밴드를, DEAE-세파로오스를 이용한 이온 교환 칼럼크로마토그라피 방법을 이용하되 NaC1 농도경사를 150-450mM로 걸어주고 추가적으로 정제하였다. 55kDa 밴드의 존재를 분석하기 위해 SDS-PAGE에 이어 DEAE 분획을 분석한 다음, 쿠마시 블루로 염색하였다. 그런 다음 피크 분획은 SDS의 부재하에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 조사하였는데, 세 개의 밴드인 55kDa, 61kDa 및 중간 분자량 밴드로 분리되었다. 폴리아크릴아미드 겔에서 분리된 각각의 단백질 밴드를 아미노-말단 마이크로프로테인 씨퀀싱한 결과 55kDa 단백질과 61kDa 단백질은 SEQ ID NO:2의 Ala-112에 독특한 N-말단을 공유하고 있었다. 2개의 ORF-2 분해 생성물의 크기 차이는 보다 큰 생성물의 글리코실화 패턴의 차이 또는 COOH-말단 분해성을 반영하는 것으로 추측된다.
폴리아크릴아미드 겔상에서의 제3의 중간체 단백질은 바쿨로바이러스 키티나제 단백질인 것으로 나타났다. 55kDa와 61kDa ORF-2 단백질은 피크 DEAE 분획을 NaCl과 아세토니트릴 용매와 마이크로포어 시스템을 이용한 역상 HPLC에 통과시킴으로써 키티나제가 없는 하나의 대칭성 피크 분핵으로 분리되었다.
실시예 15
55kDa 및 61kDa 분해 생성물의 직접 발현
112번째 아미노산으로부터 개시되는 ORF-2 단백질 (ORF-2의 아미노산 112-660)을 코딩하는 cDNA ORF-2 단편을 플라스미드 p63-2를 주형으로 이용한 PCR 방법으로 얻었다. 이 cDNA 단편을 벡터의 BamHI-PstI 부위에서 pBlueBac-3Transfer 벡터에 삽입하였다. SF-9 곤충 세포를 상기 벡터로부터 만들어진 재조합 바쿨로바이러스에 감염시킨 다음 곤충 세포의 용해물에 대해 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 실시한 다음 쿠마시 블루로 염색하여 55kDa 및 61kDa ORF-2 단백질이 존재하는지에 대해 분석하였다. 직접적으로 발현된 단백질은 전술한 바와 같이 백신의 면역원으로서 및 면역분석시의 항원으로서 이용될 수 있다.
본 발명의 단백질은, 진단용 면역분석시 항원으로서 작용할 수 있고 면역원이나 백신으로 작용하여 E형 간염 바이러스의 감염을 예방할 수 있는 HEV 바이러스성 입자를 만들어낼 수 있다.

Claims (16)

  1. 서열번호 2의 112 - 660 의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산분자로서, 상기 분자는 61 kDa 단백질을 코딩하는 핵산분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산분자가 서열번호 4의 뉴클레오티드 5480 이상 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  3. 제1항 또는 제2항의 핵산분자를 포함하는 발현벡터.
  4. 제3항의 발현벡터에 의해 형질전환 또는 감염된 숙주세포.
  5. 면역원성 간염 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 상기 단백질의 발현을 야기할 수 있도록 하는 조건하에서 제3항 기재의 발현벡터를 포함하고 있는 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항 따른 방법에 의해 제조되는 약 61 kd의 분자량을 가지고 서열번호 2의 아미노산 112를 아미노말단으로 하고 그로부터 서열번호 2의 상위서열을 포함하는 E형 간염 바이러스 단백질.
  7. 생물학적 시료에서 E형 간염 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법에 있어서, 제5항에 따른 방법에 의해 제조되는 서열번호 2의 아미노산 112를 아미노말단으로 하고 그로부터 서열번호 2의 상위서열을 포함하는 E형 간염 바이러스 단백질에 상기 생물학적 시료를 접촉시켜서 상기 항체와의 면역 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단백질은 약 61 kd의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 완전 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 조직, 소변 및 흉막액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, IgM 또는 IgG 항체가 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 단백질이 고체 지지체에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 면역 복합체가 레이블링된 항체를 사용하여 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제5항에 따른 방법에 의해 제조되는 약 61 kd의 분자량을 가지고 서열번호 2의 아미노산 112를 아미노말단으로 하고 그로부터 서열번호 2의 상위서열을 포함하는 면역원성 E형 간염 바이러스 단백질을 포함하는 키트.
  14. 제6항의 단백질과 적절한 부형제, 희석제 또는 전달매체를 포함하는 E형 간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. E형 간염의 감염에 대해 포유동물을 면역시키기 위한 백신으로서, 제6항에 따른 재조합 단백질을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 백신.
  16. 제6항에 따른 재조합 단백질을 이용하여 포유동물의 E형 간염을 예방하기 위한 약을 제조하는 방법에 있어서,
    방어용 항체의 생산을 자극하기에 효과적인 양만큼 상기 약을 인간을 제외한 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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