JP5869885B2 - Ｅ型肝炎ウイルス様粒子を用いた多抗原送達系 - Google Patents

Ｅ型肝炎ウイルス様粒子を用いた多抗原送達系 Download PDF

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Description

本発明は、免疫防御系の経口／粘膜二元様式活性化のためのペプチド／核酸組成物に関する。
ＨＥＶは、ヒトに自己限定性肝炎を起こすｓｓ（＋）ＲＮＡウイルスである。これを昆虫Ｔｎ５細胞内に発現させると、残基１１２〜６０８を含む切断型カプシドタンパク質（ＣＰ）はウイルス様粒子（ＶＬＰ）へと自己集合することができる。ＶＬＰはＨＥＶ天然ウイルス粒子よりも小さく、ＨＥＶゲノムＲＮＡを含まない。ＶＬＰ自体は、チンパンジーに、アジュバントなしでＨＥＶウイルスに対する免疫を効率的に誘導する。最近本発明者らによりＨＥＶ ＶＬＰの構造について原子分解がなされ、ＨＥＶ ＣＰは３種の主要なドメイン、Ｓ１、Ｓ２、およびＰより構成されること、エピトープ提示およびカプシド集合は独立した様式でモジュール化されていることが説明された（Wang et al., 2008. Acta Crystallographica F, Acta Cryst. F 64, 318-322; Xing et al., 1999. Virology 265, 35-45）。ＨＥＶ ＶＬＰは、経口投与を通して抗原エピトープを提示する粘膜ワクチンのための有望な担体である。切断型ＣＰのＣ末端にＢ細胞エピトープタグの１１アミノ酸が挿入されたキメラＣＰは、なお正二十面体の粒子を形成する。経口投与後に、このＨＥＶキメラＶＬＰは液性免疫応答を刺激することができ、挿入されたエピトープおよびＨＥＶに対する多量のＩｇＭおよびＩｇＧ抗体が腸分泌物中に見出された（Niikura et al., 2002. Virology 293, 273-280）。重要なことに、ＨＥＶ ＶＬＰは、ＤＮＡプラスミドをカプシド内に含んでin vitroで解体および再集合することができる。この方法により、ＨＥＶ ＶＬＰは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐｌ２０をコードするＤＮＡプラスミドを腸粘膜へ送達することが示された。ＨＩＶ ｅｎｖに対する多量の特異的なＩｇＧおよびＩｇＡが、試験された実験動物の糞便抽出物および血清中に見出された。さらに、実験に使用したマウスは、脾臓、パイエル板、および腸間膜リンパ節においてｇｐｌ２０に特異的なＣＴＬ応答を示した（Takamura, S., et al., 2004. Gene Ther 11, 628-63.）。要約すると、これらのデータは、ＨＥＶ ＶＬＰが経口投与により粘膜組織へアミノ酸抗原および抗原をコードするＤＮＡの両方を送達できるか、または免疫を与えることを実証するものである。
Acta Crystallographica F, Acta Cryst. F 64, 318-322 (2008) Virology 265, 35-45 (1999) Virology 293, 273-280 (2002) Gene Ther 11, 628-63 (2004)
本発明は、改変Ｅ型肝炎ウイルス（hepatitis E virus：ＨＥＶ）カプシドタンパク質、および改変ＨＥＶカプシドタンパク質により形成されるキメラウイルス様粒子（virus-like particle：ＶＬＰ）内に被包された異種性核酸を含んでなる組成物を提供する。改変ＨＥＶカプシドは、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分、および異種性ペプチドを含んでなる。幾つかの実施形態によれば、異種性核酸および異種性ペプチドは同じ源由来である。幾つかの実施形態によれば、異種性核酸および異種性ペプチドは異なる源由来である。幾つかの実施形態によれば、改変ＨＥＶカプシドタンパク質は、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分、および２以上の異種性ペプチドを含んでなる。２以上の異種性ペプチドは、同じ源由来、または異なる源由来であってよい。
本発明の一実施形態によれば、本発明の組成物の改変ＨＥＶカプシドタンパク質は、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質残基の１１２〜６０８を含んでなる。例えば改変ＨＥＶカプシドは、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質残基の１１２〜６０８、および異種性ペプチドを含んでなる。本発明の別の実施形態によれば、改変ＨＥＶカプシドタンパク質は、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の残基１１２〜６０８のＮ末端に融合された、ＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質の残基９１〜１２３をさらに含んでなる。本発明のその他の実施形態によれば、改変ＨＥＶカプシドタンパク質は、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の残基１１２〜６０８のＮ末端に融合された、ＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質の残基７０〜１２３をさらに含んでなる。例えば改変ＨＥＶカプシドは、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の残基１１２〜６０８、およびＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質の残基７０〜１２３／９１〜１２３、および異種性ペプチドの融合タンパク質であってもよい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、異種性ペプチドは、改変ＨＥＶ カプシドタンパク質のＣ末端に位置する。本発明の幾つかの実施形態によれば、異種性ペプチドは、改変ＨＥＶ カプシドタンパク質のＮ末端に位置する。
本発明の幾つかの実施形態によれば、異種性ペプチドは、改変ＨＥＶカプシドタンパク質のＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の、残基４８３〜４９０、残基５３０〜５３５、残基５５４〜５６１、残基５７３〜５７７、残基５８２〜５９３、および残基６０１〜６１３からなる群より選択される、予め選択された領域内へ挿入される。本発明のその他の実施形態によれば、予め選択された領域の少なくとも１残基が欠失する。幾つかの場合には、予め選択された領域内の全ての残基が欠失する。
本発明の組成物は、薬剤的に許容される賦形剤をさらに含んでなり得る。賦形剤は、組成物の経口送達に適したものであってよい。あるいは賦形剤は、組成物の粘膜送達に適応させたものであってよい。本発明の幾つかの実施形態によれば、賦形剤はアジュバントである。
本発明はさらに、ホストへ本発明の組成物の有効量を投与する工程を含んでなる、ホストに免疫原性応答を誘導する方法を提供する。
本発明はまた、改変Ｅ型肝炎ウイルス（hepatitis E virus：ＨＥＶ）カプシドタンパク質およびこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。改変Ｅ型肝炎ウイルス（hepatitis E virus：ＨＥＶ）カプシドタンパク質は、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分、およびＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の残基４８３〜４９０、残基５３０〜５３５、残基５５４〜５６１、残基５７３〜５７７、残基５８２〜５９３、または残基６０１〜６１３から予め選択された領域内である、ＨＥＶ ＯＲＦ２の一部分に挿入された異種性ペプチドを含んでなる。
さらなる態様によれば、本発明は、特に様々な粘膜組織への治療方法送達のための手段を提供する。例えば本発明のＶＬＰは、治療目的の薬剤を被包し、かつ送達するために用いられてよい。ＶＬＰを形成するカプシドタンパク質は、ＨＥＶタンパク質の一部分のみまたは完全長、例えばＯＲＦ２もしくはＯＲＦ３を含んでなり得るか、または異種性タンパク質の一部分を含んでなり得る。治療薬は、小分子または高分子を含むいずれの化学的性質のものであってもよい。
本開示によれば、免疫原性応答系の刺激を期してアジュバントを伴うことなくホストへ投与することが可能でありかつ経口送達に適している組成物、および、当該組成物を用いてホストに免疫原性応答を誘導する方法を提供することができる。
ＶＬＰ／ＣタグおよびＶＬＰ／ＭＡｂ２２４の性質決定。（Ａ）Ｃ末端切断型ＯＲＦ２タンパク質の、ＭＡｂ２２４によるウェスタンブロット法。Ｍ、分子量マーカー；Ｗ、野生型バキュロウイルス感染細胞。（Ｂ）Ｃ末端マーカーの図示。凍結水和したＶＬＰ／Ｃタグ（Ｃ）およびＶＬＰ／ＭＡｂ２２４（Ｄ）の電子顕微鏡像。両粒子において、粒子中央に密度が見られないことが示される。ＶＬＰ／ＭＡｂ２２４の表面はＶＬＰ／Ｃタグに比較して、より長い棘状の密度を示すことに留意されたい。スケールバーは５０ｎｍを示す。 ＨＥＶ表面構造の描写。（Ａ）ＶＬＰ／Ｃタグおよび（Ｂ）ＶＬＰ／ＭＡｂ２２４の正二十面体２回軸方向の図。２回、３回、および５回軸の位置をそれぞれ楕円形、三角形、および五角形で示す。予想されるタンパク質量の１００％を占めるように密度のレベルを用いた。カプシドタンパク質、切断型ＯＲＦ２タンパク質両方の再構築において、それぞれの２回軸位置で３０の突起スパイクを有するＴ＝１表面格子に従って配置を確立した。（Ｂ）において、ＭＡｂ２２４は、可変ドメインがＶＬＰのＰドメイン側面の肩部分に結合し、かつ定常ドメインが粒子表面に対しわずかに傾いて垂直である、２ドメインの立体配置として観察される。スケールバーは１００Åである。（Ｃ）ＦＳＣにより概算された分解能。各マップの粒子は二つのデータセットへ均等に分配された。相関は、二つの独立した再構成の間における空間的頻度（１／分解能、Å）の関数として用いた。ＶＬＰ／Ｃタグの分解能（点線）は１７．５Åと計算され、ＶＬＰ／ＭＡｂ２２４の分解能（実線）は１８．５Åと計算された。 ２回軸におけるタグエピトープおよびＭＡｂ２２４の相違マップ。（Ａ）ＶＬＰＴｎ５からＶＬＰ／Ｃタグを差し引くことにより相違マップを算出し、得られたＣ末端挿入タグエピトープをＶＬＰＴｎ５の再構築の対応する領域へ重ね合わせ、密度レベルを、１．３６ｇ／ｃｍ３の平均タンパク質密度を用いて、予想されるタグ量の１００％の質量を占めるように選択した。（Ｂ）ＶＬＰＳｆ９からＶＬＰ／ＭＡｂ２２４を差し引くことにより相違マップを算出し、得られたＭＡｂ２２４断片をＶＬＰＳｆ９の再構築の対応する領域へ重ね合わせた。 Ｃ末端ペプチドの二次および三次構造予想。アルファヘリックスをＨ、ベータシートをＥの文字で表す。三次構造の立体像を右下に示す。タンパク質骨格は、二次構造を強調する「略画」様式で表した。 予想される３Ｄ原子モデルのクライオＥＭ密度マップへのフィッティング。ＶＬＰ／ＣタグならびにＶＬＰ／ＭＡｂ２２４の、上面図（ＡおよびＣ）および側面図（ＢおよびＤ）。クライオＥＭ密度マップ（メッシュで示す）を、略画で表す予想モデルへ適合させた。予想原子モデルを、クライオＥＭ密度マップのエピトープ領域およびＣ末端領域に従って、用手でクライオＥＭ密度に適合させた。エピトープの位置は表面に露出され、Ｐドメインの側面に位置した。 エピトープおよびＣ末端の表面マッピング。（Ａ）ＭＡｂ２２４とＶＬＰＳｆ９との相違マップに適合させ、Ｐドメインの側面から眺めた予想３Ｄモデル。エピトープ領域を表面に描写する。中和抗体の結合部位はＭＡｂ２２４の結合部位に重なり、ＭＡｂ２２４のフットプリントはエピトープ全体を覆うことに留意されたい。（Ｂ）Ｃ末端経路は、カルボキシル末端の抗原部位を認識する抗体と相互作用することが見出されたＰドメインの側面から始まり、Ｐドメインの上端表面で終わる。 Ｘ線結晶解析により決定されたＣ末端Ｐドメインの原子構造。構造は「略画」モードで表し、二次構造を強調した。アミノ酸５５５−５６０はカプシド内では不規則であり、電子密度からはよく解明できなかった。 キメラエピトープを被包ＤＮＡワクチンと共に有するＨＥＶ−ＶＬＰ。 ＨＥＶ−ＶＬＰの構造およびＨＥＶ−ＶＬＰのカプシドタンパク質二量体。 ＨＥＶ−ＬＰの結晶構造、およびＨＥＶ−ＬＰ、ｒＮＶ、ＳＭＳＶ、およびＣＡＲＭＶのカプシドタンパク質二量体の比較。ＨＥＶカプシドタンパク質のＳ、Ｍ、およびＰドメインを示す。（Ａ）ＨＥＶ−ＬＰは、正二十面体の２−、３−、および５回軸を形成する６０のカプシドサブユニットから構成され、Ｔ＝１の対称性を示す。（Ｂ）ＨＥＶ−ＬＰのカプシドサブユニットのリボン図（ＰＤＢ受入コード：２ＺＴＮ）であり、上、中、下がそれぞれＰ、Ｍ、およびＳドメインを示す。不規則な領域を点線で示す。Ｓドメインは、幾つかのウイルスにおいて保存されるゼリーロール様βバレル構造を示す。保存された逆平行β鎖を示す（ＢからＩ）。（Ｃ）ＨＥＶ−ＬＰ、ｒＮＶ（ＰＤＢ受入コード、１ＩＨＭ）、ＳＭＳＶｃ（ＰＤＢ受入コード、２ＧＨ８）、およびＣＡＲＭＶ（ＰＤＢ受入コード、ｌＯＰＯ）のカプシドタンパク質二量体の結晶構造のリボン図を示す。 ５回軸周囲における、ＨＥＶ−ＬＰのカプシドタンパク質サブユニットの相互作用。（Ａ）ＨＥＶ−ＬＰのカプシドタンパク質の五量体。ＨＥＶ−ＬＰの外側および内側から見た、５回軸の拡大表面図。アミノ酸残基、Ａｓｎ−２００およびＴｙｒ−２８８を示す。ｒＮＶ、ＳＭＳＶ、およびＣＡＲＭＶの外側から見た、５回軸の拡大表面図。芳香族アミノ酸として、ｒＮＶのＰｈｅ−１１８、ＳＭＳＶのＴｙｒ−３３０、およびＣＡＲＭＶのＰｈｅ−１４５を示す。相互作用が推定される原子を点線で連結し、距離を示す。（Ｂ）５回軸を構成するアミノ酸が置換されている野生型または変異型カプシドタンパク質（５３ｋＤａ）を用いたショ糖密度分画法。ＨＥＶ−ＬＰを構成するカプシドタンパク質は、上から５〜９１画分に見出されるが、粒子を形成できなかったものは上の画分に見出された。約６４ｋＤａの分子質量は、非特異的タンパク質であった。 モノクローナル抗体および変異型ＨＥＶ−ＬＰの性質決定。（Ａ）ＨＥＶ−ＬＰのＨｕｈ７細胞への結合の、ＨＥＶ−ＬＰに対するモノクローナル抗体による中和（Neutralization of binding：ＮＯＢ）。ＨＥＶ−ＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）を各モノクローナル抗体（２０μｇ／ｍＬ）と共に１時間３７℃にてプレインキュベートした後、混合物をＨｕｈ７細胞に接種して、１時間４℃にてインキュベートした。細胞へ結合したＨＥＶ−ＬＰ（線で示す範囲）を、フローサイトメトリーで検出した。塗りつぶされた範囲はモックによりインキュベートした細胞を示す。（Ｂ）ＨＥＶ−ＬＰ変異型の構築。Ｐドメインの表面アミノ酸残基が置換された、１６種のＨＥＶ−ＬＰ変異型を構築した。精製した野生型および変異型ＨＥＶ−ＬＰそれぞれ１００ｎｇのタンパク質バンドを、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ後にクマシーブリリアントブルー染色により可視化した。（Ｃ）変異型ＨＥＶ−ＬＰに対する、ＮＯＢ抗体の反応性。一連のＨＥＶ−ＬＰに対する、ＮＯＢ（ＭＡＢ１３２３およびＭＡＢ２７２）または非ＮＯＢ抗体（ＭＡＢ３５８およびＭＡＢ１６１）による免疫沈降分析。免疫沈降されたＨＥＶ−ＬＰを、抗ＨＥＶカプシドウサギポリクローナル抗体により検出した。（Ｄ）変異型ＨＥＶ−ＬＰのＨｕｈ７細胞への結合能。野生型または変異型ＨＥＶ−ＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）を、Ｈｕｈ７細胞と共に１時間４℃にてインキュベートし、次に細胞へ結合したＨＥＶ−ＬＰ（線で示す範囲）を、フローサイトメトリーで検出した。塗りつぶされた範囲はモックによりインキュベートした細胞を示す。各パネルにＭＦＩを示す。 ＮＯＢ抗体による認識およびＨｕｈ７細胞への結合に関与するアミノ酸残基。側面（上図）および上面（下図）から見たカプシドタンパク質二量体の表面図。（Ａ）ＭＡＢ１３２３およびＭＡＢ２７２における反応性の完全な喪失または減少に関与するＨＥＶ−ＬＰのアミノ酸を示す。（Ｂ）Ｈｕｈ７細胞への結合に関与するＨＥＶ−ＬＰのアミノ酸を示す。ＮＯＢ抗体の反応性またはＨｕｈ７細胞への結合に効果を示さない、ＨＥＶ−ＬＰのＰドメインにおける置換を示す。 Ｆａｂ断片と複合したＨＥＶ Ｔ＝１ ＶＬＰのクライオＥＭ構造。（Ａ）正二十面体２回軸のうちの一つの方向から見た、ＶＬＰ／Ｍａｂ２２４（左）およびＶＬＰ／Ｍａｂ４（右）の表面表示。５回軸のうちの一つ、および二つの隣接する３回軸を対応する数で示す。両方の再構築において、ＨＥＶ ＶＬＰの後方側に６０コピーのＦａｂ断片が付着しているが、Ｍａｂ４ Ｆａｂ断片の密度はＭａｂ２２４ Ｆａｂ断片の密度よりも薄く見える。（Ｂ）ウイルス表面を、正二十面体の非対称性単位を描く線に重なるステレオ投影として示す。５回軸、３回軸、および２回軸を対応する数で示す。Ｆａｂの密度を、ウイルス表面に白い円として投影する。 Ｍａｂ２２４抗体の結合部位。（Ａ）ＶＬＰ／Ｍａｂ２２４のクライオＥＭ密度マップをＰＯＲＦ２の結晶構造に適合させ、結合したＦａｂ分子の方向から眺めた。ＰＯＲＦ２二量体の一つを中実の表面として提示し、隣接する二量体をリボンモードで描く。（Ｂ）クライオＥＭ密度マップに適合させたＰＯＲＦ２二量体の側面図。（Ｃ）クライオＥＭ密度マップに重ねた２回軸方向から見たＰＯＲＦ２二量体。（Ｄ）２回軸方向から見たＰＯＲＦ２二量体の上面図。Ｍａｂ２２４への結合に関与するＰＯＲＦ２のアミノ酸を標識した。ＰＯＲＦ２二量体を中実の表面として示す。 Ｂ細胞タグを有するキメラＨＥＶ ＶＬＰの構造。（Ａ）正二十面体２回軸方向から見たＶＬＰ／Ｃタグの表面表示。（Ｂ）ＶＬＰ／ＣタグのクライオＥＭ密度マップ（網目）をＰＯＲＦ２十量体の結晶構造（リボン）に適合させた。（Ｃ）ＰＯＲＦ２二量体のリボン表示。選択された４の内部挿入部位を、エレメントを表示する球形モードにより標識した。（Ｄ）内部挿入部位の位置を示す、ＰＯＲＦ２の上面図。 Ｍａｂ２２４結合部位に関連するＣ末端挿入の位置。ＶＬＰ／ＣタグのクライオＥＭ密度マップ（網目）に重ねて適合させたＰＯＲＦ２二量体の側面図（Ａ）および上面図（Ｂ）（表面表示）。Ｃ末端残基Ａ６０６を標識する。リボン表示は隣接する二量体を示す。 ＨＥＶ ＶＬＰ（大）は、１８０コピーのＯＲＦ２タンパク質から構成される。（Ａ）ＨＥＶ−ＶＬＰのＳＴＥＭ顕微鏡写真。大および小両方のＴ＝１ ＨＥＶ−ＶＬＰを球状のイメージとして投影し、対応するそれらの粒子質量を算出した。長い直線状の杆体は、内部質量標準として加えたタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）である。（バー＝１０００Å）。（Ｂ）ＨＥＶ−ＶＬＰ（大）は、ＨＥＶ−ＶＬＰ（大）のクライオＥＭ表面に、点状のパターンを施された未変化の粒子として観察される（バー＝５００Å）。（Ｃ）ＯＲＦ２タンパク質の分子質量が６５．５ＫＤであることを示す、ＨＥＶ−ＶＬＰ（大）の質量スペクトル。（Ｄ）様々なイメージの条件に由来する、観察されたＨＥＶ−ＶＬＰ（大）の質量に対する、観察されたＴＭＶの質量／長さを示すプロット。既知のＴＭＶ質量／長さは１３．１ｋＤ／Åであり、ＨＥＶ ＶＬＰ（大）の質量は１１．８ＭＤａと算出された。 ＨＥＶ Ｔ＝３ ＶＬＰの三次元構造。（Ａ）ＯＲＦ２タンパク質のＴ＝３ 正二十面体格子を現す、ＨＥＶ ＶＬＰ（大）の全体構造。正二十面体の一面は、三つの隣接する５回軸内の三角形の範囲として定義される。（Ｂ）ＨＥＶ Ｔ＝３ ＶＬＰの表面には、二つの独特な二量体ＯＲＦ２のスパイクが存在する。ＡＢ二量体は５回軸の周囲に存在し、ＣＣ二量体は２回軸に存在する。（Ｃ）ＨＥＶ Ｔ＝３ ＶＬＰは半径２０５Åであり、粒子の中心に半径８５Åの低密度の空洞を有する。クライオＥＭ密度分布により、赤道部分から５０Åの位置に４個のＯＲＦ２ドメイン、Ｐ、Ｓ２、Ｓ１、およびＮの存在が明らかにされた。（Ｄ）Ｔ＝１ ＶＬＰ由来のＨＥＶサブユニットの結晶構造は、中心へ向かうＮ末端ループによって、ＨＥＶ Ｔ＝３ ＶＬＰの殻領域のクライオＥＭ密度によくドッキングしている。 遺伝子型１、ＰＯＲＦ２タンパク質の構造。（Ａ）Ｓ１、Ｓ２、およびＰのリボン表示。（Ｂ）二つの隣接するサブユニットの間の接触面に埋まった表面範囲を、ＰＯＲＦ２六量体（左）、およびＰＯＲＦ２二量体の接触面におけるＢＳＡ（右）に重ねた。 ＯＲＦ２十量体の構造は、Ｔ＝１およびＴ＝３ ＶＬＰの両方に一致する。（Ａ）ＨＥＶ Ｔ＝３ ＶＬＰのクライオＥＭ密度は、Ｔ＝１ ＶＬＰの座標に、５回軸周辺領域においてよく一致する。Ｐ、Ｓ２、Ｓ１、およびＮ＋ＲＮＡは、対応する密度層を示す。（Ｂ）ＨＥＶ Ｔ＝３とＴ＝１ ＶＬＰの十量体の間の一致した特色は、ＨＥＶ Ｔ＝３ ＶＬＰのクライオＥＭ密度マップ内へのＰＯＲＦ２二量体の結晶構造ドッキングにより明らかとなった。（Ｃ）in vitroにおけるＯＲＦ２タンパク質の再集合により、ＯＲＦ２の星型複合体の形成が導かれた（白い矢印）。この複合体のサイズは、内部標準としてのＴＭＶ（黒い矢印）による較正後に、ＯＲＦ２十量体のサイズによく一致する。ＯＲＦ２複合体の一つを２倍に拡大し、ＰＯＲＦ２五量体の結晶構造（リボン図）との比較の挿入図として表示する。（Ｄ）ＲＮＡ密度はＨＥＶ Ｔ＝３ ＶＬＰ（レーンＢ）から抽出されたが、Ｔ＝１ ＶＬＰ（レーンＡ）からは抽出されなかった。ＲＮＡのサイズラダーをレーンＭにロードした。 Ｃ−Ｃ二量体内でのＳ２およびＳ１ドメインに関連するＰドメインの方向性は、Ａ−Ｂ二量体内での方向性とは異なるように見える。（Ａ）ＨＥＶ Ａ−Ｂ二量体、ＨＥＶ Ｃ／Ｃ二量体、およびノーウォークウイルスＣ−Ｃ二量体における二量体の相互作用を、粒子の外側から観察したＣＰＫモデルにより示す。（Ｂ）Ｔ＝３クライオＥＭ密度マップにおいて、Ｐドメインの方向性を、Ｃ−Ｃ二量体におけるＳ２／Ｓ１ドメイン（二つの隣接する３回軸を通り抜ける白線）、またはＡ−Ｂ二量体におけるＳ２／Ｓ１ドメイン（５回軸および隣り合う３回軸を通り抜ける白線）に関連するスパイクのプラットフォーム間の角度として示す。（Ｃ）Ｓ２ドメインの間隙内におけるプロリンリッチなヒンジの位置を示す結晶密度マップ。（Ｄ）Ｓ２／Ｓ１ドメイン間の間隙は、Ａ−Ｂ二量体内にプロリンリッチなヒンジを収容するために十分な余地を提供し、ここで該ドメインは屈曲した構造を取る。Ｓ２／Ｓ１ドメイン間の平坦な構造のため、Ｃ−Ｃ二量体内では間隙が狭められ、これによりヒンジは間隙の外へ押し上げられる。 ＨＥＶ Ｔ＝１およびＴ＝３ ＶＬＰの推定される集合過程を示す図。ＯＲＦ２サブユニットは、十量体の集合を決定する情報をコードする。ＲＮＡ断片との相互作用によって平坦な二量体の接触およびＣ−Ｃ二量体の形成が誘導され、これにより完全な正二十面体カプシドの集合が導かれる。 ＨＥＶカプシドタンパク質の、遺伝子型１、３、および４の比較。（ａ）ＨＥＶ遺伝子型１、３、および４の配列アラインメント。ＣＬＵＳＴＡＬ−Ｘにより作成したアラインメントに従い、アミノ酸残基を四角で囲んだ。配列の上部に二次構造エレメントを標識した。（ｂ）ＨＥＶ−ＶＬＰ ＰＯＲＦ２タンパク質の遺伝子型１、遺伝子型３、および遺伝子型４の単量体構造のリボン表示。（ｃ）９０°回転させてＮ末端の位置を示す、ＨＥＶ ＰＯＲＦ２タンパク質の構造。 ＨＥＶ Ｓ２およびＰドメインの構造、ならびにそれらのカリシウイルスとの相違。（ａ）ＨＥＶにおけるＳ２ドメインおよびＳＭＳＶにおけるＰ１ドメインのリボン表示（左）、ならびに各々のトポロジー図（右）。β鎖をＡ’からＦ’で標識する。（ｂ）ＨＥＶ、ＳＭＳＶ、ならびにＮＶにおけるＰおよびＰ２ドメインのリボン表示（左）、ならびに各々のトポロジー図（右）。β鎖を、ＳＭＳＶの命名法に従いＡ”からＦ”で標識する。 ＨＥＶ−ＶＬＰ（大）のクライオＥＭ再構築についての技術データ。（ａ）０．７〜３．５μｍのデフォーカスレベルによるクライオＥＭの分布。（ｂ）最終密度マップが１０．６Å（カットオフ値０．５）の分解能であることを示すフーリエシェル相関。 Ｓ１ドメインにおける、モデル化されたアミノ酸残基によるＴ＝１ ＶＬＰ電子密度マップの立体像。 遺伝子型１ ＨＥＶ−ＶＬＰの全体構造。（ａ）正二十面体２回軸を見下ろす、カプシド構造のＣＰＫモデル。白い三角形は正二十面体の面を一周する。バー＝１００Å。（ｂ）ＨＥＶ−ＶＬＰカプシドタンパク質の二量体構造のリボン表示。（ｃ）Ｓ１ドメインのリボン表示。カリシウイルスの命名法に従い、β鎖をＢからＩで標識する。（ｄ）Ｓ２ドメインのリボン表示。β鎖をＡ’からＦ’で標識する。（ｅ）Ｐドメインのリボン表示。β鎖をＡ”からＦ”で標識する。 ＯＲＦ２サブユニット間の相互作用。（ａ）サブユニット間の接触面に埋もれた表面範囲を示す。白い三角形は正二十面体の面の範囲を一周する。（ｂ）正二十面体５回軸における、スティックモードで強調した５個のＹ２８８との接触を示すリボン表示。（ｃ）Ｐドメインの二量体接触面。Ｐドメインの一つにおける表面電子ポテンシャルを示す。相互作用している他のサブユニット由来の疎水性アミノ酸をスティックとして示す。（ｄ）３回軸位置における密度のないチャネル。３回軸に関連する二つのサブユニットの表面電子ポテンシャルを背景に示し、内部表面を現す。スティックは３回軸周囲の第３のサブユニットにおける、臨界の陰性に荷電したアミノ酸を示す。 ＨＥＶ−ＶＬＰの構造は、異種性エピトープ送達のためのカーゴ能を実証する。（ａ）ＨＥＶ遺伝子型（Ｇ１、Ｇ３、およびＧ４）のうちのＨＥＶ遺伝子型１（Ｇ１）について、特定の残基を殻の外側からの眺めとして示す、二量体および周囲の二量体の表面の表示。二量体のＳ２およびＰドメインにおける特定の残基を標識する。（ｂ）以前の挿入部位は、二量体の、または二量体−二量体の相互作用を妨げるために機能しなかった。二つの挿入部位は、Ｓ１ドメインおよびＳ２ドメインそれぞれに存在する。別の二つの部位は、Ｐドメインの二量体の接触面に位置する。（ｃ）キメラエピトープに対する液性応答。マウスに、以下：ＨＩＶ Ｐ１８エピトープを有するキメラＨＥＶ−ＶＬＰ（Ｐ−ＶＬＰ／Ｐ１８、四角）、キメラ合成したＨＩＶ Ｐ１８エピトープペプチド（三角）、またはＨＥＶ−ＶＬＰ（丸）のうちの１種を３回経口免疫した。無処置のコントロールを菱形で示す。血清および糞便懸濁液（２００ｍｇ／ｍｌ）を希釈し（それぞれ１：１００および１：２）、キメラエピトープに特異的な抗体を、合成ペプチドを抗原として用いるＥＬＩＳＡにより評価した。 ＨＥＶ−ＶＬＰは、遺伝子送達のためのＤＮＡプラスミドを有することができる。（ａ）Ｓ１ドメインにおける、モデル化されたアミノ酸残基を用いた試料電子密度マップ。（ｂ）カプシド殻の内側から見た、正二十面体２回軸における二量体表面上の電子ポテンシャル。２回軸周辺の陽性に荷電した残基を標識する。図はSwiss-PDB Viewerにより作成した。（ｃ）、（ｄ）キメラエピトープおよび被包ＤＮＡワクチンに対するＣＴＬ応答。マウスを、表面にＨＩＶ Ｐ１８エピトープを露出するキメラＨＥＶ−ＶＬＰ、および完全なＧａｇタンパク質を発現する被包ＤＮＡワクチン（Ｐ−Ｐ１８／Ｎ−Ｇａｇカプセル）により経口免疫した。Ｐ１８エピトープ（ｃ）またはＧａｇタンパク質（ｄ）のいずれかに応答したＣＴＬによる特異的な溶解を、免疫された動物からの脾臓、腸管膜リンパ節、およびパイエル板細胞を試験することにより評価した（黒丸）。コントロール組織（白丸）は、化学合成されたＰ１８エピトープペプチド（ｃ）またはＧａｇを発現するネイキッドＤＮＡワクチン（ｄ）を投与されたマウス由来のものである。エフェクター／ターゲット比（各パネルにおいて左から右へ、８０／１、４０／１、および２０／１を示す）を試験した。 ＤＮＡを負荷されたＨＥＶ−ＶＬＰの、空のＶＬＰからの密度勾配による分離。 血清（ａ、ｂ）および糞便抽出物（ｃ、ｄ）における、抗Ｐ１８特異的ＩｇＧ（ａ、ｃ）およびＩｇＡ（ｃ，ｄ）抗体の濃度。 プラスミド負荷ＶＬＰ（丸）を経口投与されたマウス由来の脾臓、ＭＬＮ、およびＰＰ細胞は特異的なＣＴＬ応答を誘導したが、ネイキッドプラスミド（三角）および非免疫コントロール（ばつ）によるものは誘導しなかった。
Ｉ．序論
本発明は、ＨＥＶ ＶＬＰに基づくペプチド／核酸（Ｐ／Ｎ）系に関する。ＨＥＶ ＶＬＰに基づくＰ／Ｎ系を使用するという考えにより、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ系を通した免疫応答の誘導に加えて、幾つかの独特な利点が提供される。１）Ｐ／Ｎ系によって経口ワクチン接種の可能性が提供される。実際、経口投与はストレスが少なく、かつ専門的な技術を必要としない。加えて、腸管を通してのワクチン送達は、全身性の注射よりも安全であるとみなされる。天然のＨＥＶ感染経路およびＨＥＶ ＶＬＰの構造は、胃内の低ｐＨ、タンパク質分解酵素の存在、ならびに粘膜表面に付随する物理的および化学的なバリアーの存在のような、消化管内における混乱した環境に抵抗するものである。２）ＨＥＶ ＶＬＰは標準的な培養プロトコルにより産生することができ、精製したＨＥＶ−ＶＬＰの収率は５０〜１００μｇ／ｍｌであり、これはその他のＶＬＰに比較して約１００倍大きい。３）ＨＥＶ ＶＬＰは、アミノ酸免疫源を正二十面体粒子の形で送達する。すなわち侵入に成功した全ての粒子は、同じホスト細胞に６０コピーの免疫源を送達する。４）ＨＥＶに対する免疫応答は、ＤＮＡ投与およびペプチド免疫源ワクチン接種の両方に効果を示さないことが証明されている。５）ＨＥＶは室温で安定である。これら全ての特色を総合することにより、Ｐ／Ｎ系は、本発明者らの目的である有効かつ広い反応性を持つワクチンの開発を達成するであろうと予想される。
ＩＩ．定義
「Ｅ型肝炎ウイルス」または「ＨＥＶ」は、ｉ）水媒介性であり、感染性肝炎の原因となる；ｉｉ）血清学的な特性の点から、Ａ型肝炎ウイルス（hepatitis A virus：ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（hepatitis B virus：ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus：ＨＣＶ）、またはＤ型肝炎ウイルス（hepatitis D virus：ＨＤＶ）とは区別される；ｉｉｉ）アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection：ＡＴＣＣ）に受入番号６７７１７により保管されているＥ．ｃｏｌｉ株に統合されるプラスミド、ｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に挿入されている、１．３３ｋｂのｃＤＮＡに相同なゲノム領域を含む、ウイルス、ウイルス型、またはウイルスのクラスを指す。
ＨＥＶに関する「カプシドタンパク質」または「改変カプシドタンパク質」の語は、成熟した、もしくは改変されたＯＲＦ２またはＯＲＦ３ポリペプチドを指す。本明細書における、このようなＯＲＦ２もしくはＯＲＦ３ポリペプチドまたはタンパク質への参照は、完全長ポリペプチドおよびその断片、ならびにＯＲＦ２またはＯＲＦ３タンパク質に施された置換、欠失、もしくは挿入、またはその他の改変のいずれも含むことが意図される。
本明細書で用いられる「ウイルス様粒子」（virus-like particle：ＶＬＰ）の語は、ウイルスに似た少なくとも１の性状にあるが、ウイルスゲノムを持たないために感染性ではない構造を指す。「ＶＬＰ」は、好ましくはＥ型肝炎ウイルスタンパク質、例えばカプシドタンパク質由来の、非複製性のウイルス殻を指す。ＶＬＰは一般に、Ｅ型肝炎カプシドタンパク質、または改変Ｅ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質と称されるタンパク質を含むがこれらに限定されない１以上のウイルス性タンパク質から構成される。ＶＬＰは、適切な発現系におけるタンパク質の組み換え発現により、自発的に形成される。
本明細書で用いられる「異種性核酸」の語は、Ｅ型肝炎ウイルスに内在性ではない、すなわちＨＥＶ以外の源に由来する核酸を指す。本明細書で用いられる「異種性ポリペプチド」の語は、Ｅ型肝炎ウイルスに内在性ではないペプチドもしくはポリペプチド、またはＥ型肝炎ウイルスの天然ゲノムに内在しないＤＮＡ配列によりコードされた、すなわちＨＥＶ以外の源もしくは生命体由来のタンパク質もしくはペプチドに対するペプチドもしくはポリペプチドを指す。
本明細書で用いられる「被包」または「被包された」との語は、異種性物質、例えば異種性核酸の、本明細書で定義されるウイルス様粒子内への包囲を指す。
「キメラタンパク質」の語は、一般にアミノ酸配列中に天然では共に見出されることのない２以上の部分を有するアミノ酸配列を指す。「キメラウイルス様粒子」の語は、ＨＥＶカプシドタンパク質および１以上の異種性ペプチドを含んでなるウイルス様粒子を指す。本明細書で定義される「キメラウイルス様粒子」の語は、さらに、１以上の異種性核酸を被包するＨＥＶカプシドタンパク質および異種性ペプチドを含んでなるウイルス様粒子を指す。
本明細書で定義される「源」の語は、病原体を指す。「源」の語はまた、患部組織、例えば癌、感染症、アレルギー反応、または自己免疫疾患の組織に由来する細胞を指してもよい。病原体には例えば、細菌、ウイルス、原生動物、真菌、寄生虫、またはプリオンのような感染性の粒子が含まれる。病原体の例にはさらに、アデノウイルス科；アレナウイルス科（例えば、イッピーウイルス（Ippy virus）およびラッサ熱ウイルス）；ビルナウイルス科；ブニヤウイルス科；カリシウイルス科；コロナウイルス科；フィロウイルス科；フラビウイルス科（例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルス）；ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；ヘルペスウイルス科（例えば、ヒト単純ヘルペスウイルス１）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ、およびＣ）；パラミクソウイルス科（例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、および呼吸器合胞体ウイルス）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス）；ポックスウイルス科；レオウイルス科；レトロウイルス科（例えば、ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ウシ免疫不全ウイルス、およびネコ免疫不全ウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、風疹ウイルス）が含まれる。一実施形態によれば産物は、主要なウイルス性病原体、例えば様々な肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus：ＨＩＶ）、様々なインフルエンザウイルス、ウエストナイルウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス（human papilloma virus：ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（Epstein Barr virus：ＥＢＶ）、ポリオーマウイルス、またはＳＡＲＳコロナウイルスに由来する抗原を１以上含んでなる。肝炎ウイルスの具体例には、例えば、Ａ型肝炎ウイルス（hepatitis A virus：ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（hepatitis B virus：ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus：ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（delta hepatitis virus：ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（hepatitis E virus：ＨＥＶ）、およびＧ型肝炎ウイルス（hepatitis G virus：ＨＧＶ）が含まれ；ヘルペスウイルスファミリーの具体例には単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus：ＨＳＶ）の１型および２型が含まれる。病原体には、ジフテリア（例えば、ジフテリア菌）、百日咳（例えば、百日咳菌）、破傷風（例えば、破傷風菌）、結核（例えば、結核菌）、細菌性または真菌性の肺炎、コレラ（例えば、コレラ菌）、腸チフス（例えば、チフス菌）、ペスト、細菌性赤痢（例えば、赤痢菌の血清型１（赤痢菌Ｉ））、サルモネラ症、レジオネラ症（例えば、レジオネラ菌）、ライム病、ハンセン病（例えば、らい菌）、マラリア（例えば、熱帯熱マラリア原虫）、鉤虫症、オンコセルカ症、住血吸虫症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ランブル鞭毛虫症（例えば、ランブル鞭毛虫）、アメーバ症（例えば、赤痢アメーバ）、フィラリア症、ボレリア症、旋毛虫症、インフルエンザ、ＢおよびＣ型肝炎、髄膜炎菌性髄膜炎、市中肺炎、水痘、風疹、流行性耳下腺炎、麻疹、ＡＩＤＳ、デング呼吸器感染症、下痢性疾患、熱帯性寄生虫病、性感染症、およびクラミジア感染症のような疾病の原因となる媒介物がさらに含まれる。抗原性物質もまた、ＳＡＲＳ感染症、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌感染症、ウエストナイルウイルス感染症、クリプトスポリジウム症、ハンタウイルス感染症、エプスタイン・バーウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、Ｈ５Ｎ１インフルエンザ、エンテロウイルス７１感染症、Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｏ１５７：Ｈ７感染症、ヒトサル痘、ライム病、シクロスポラ症、ヘンドラウイルス感染症、ニパーウイルス感染症、リフトバレー熱、マールブルグ出血熱、ホワイトウォーターアロヨウイルス感染症、および炭疽のような、新たに出現した、再出現した疾病、またはバイオテロリズムによる疾病に関与する原因媒介物に由来してもよい。
本明細書で定義される「同じ源」の語は、異種性核酸および異種性ペプチド（または２以上の異種性ペプチド）が、ウイルス、細菌などを含む疾病の原因病原体のような、同一の生命体に由来する事実を指す。「同じ源」は、ウイルスまたは細菌の異なる株のような、病原体の変異型または改変型を包含する。
「薬剤的に許容される」または「薬理学的に許容される」物質は、生物学的に有害であるかまたは望ましくないものではない物質、すなわち、改変Ｅ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質もしくはキメラウイルス様粒子、または望ましくない生物学的効果のいずれも引き起こさない本発明の組成物と共に固体へ投与されてもよい物質である。このいずれの物質も、それが含まれる組成物中のいずれの成分とも有害に相互作用しないと考えられる。
「賦形剤」の語は、本発明の組成物の完成した剤形中に存在し得るいずれの基本的な補助物質も指す。例えば「賦形剤」の語には、ビヒクル、結合剤、崩壊剤、増量剤（希釈剤）、潤滑剤、流動促進剤（フローエンハンサー）、圧縮助剤、着色料、甘味料、保存料、懸濁／分散剤、フィルム形成剤／被覆剤、香味料、および印刷インクが含まれる。
「アジュバント」の語は、抗原と共に投与した際に、抗原に対する免疫応答を増強するが、単独で投与した際には抗原に対する免疫応答を起こさない化合物を指す。アジュバントは、リンパ球の動員、Ｂおよび／またはＴ細胞の刺激、およびマクロファージの刺激を含む幾つかの機構によって免疫応答を増強することができる。
抗原または組成物に対する「免疫原性応答」は、関心のある組成物に提示される抗原に対する液性および／または細胞性免疫応答の、被験体における発生である。本開示の目的のために、「液性免疫応答」とは抗体分子により仲介される免疫応答を指すが、「細胞性免疫応答」とはＴリンパ球および／またはその他の白血球により仲介されるものを指す。細胞性免疫の重要な一態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的な応答に関与する。ＣＴＬは、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質と会合して提示され、細胞表面に発現するペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内の病原菌の破壊、またはこのような病原菌に感染した細胞の溶解の誘導および促進を助ける。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関与する。ヘルパーＴ細胞は、その表面にＭＨＣ分子と会合したペプチド抗原を提示する細胞に対して非特異的なエフェクター細胞の機能の刺激、および活性の集中を助けるために作用する。「細胞性免疫応答」はまた、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞由来の細胞を含む活性化Ｔ細胞および／またはその他の白血球から産生される、サイトカイン、ケモカイン、およびこれらのようなその他の分子の産生も指す。従って、免疫学的応答は以下の効果：Ｂ細胞による抗体の産生；および／または関心のある組成物もしくはワクチンに提示される単数または複数の抗原に特異的に方向付けられるサプレッサーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化、のうちの１以上を含み得る。これらの応答は、感染性の中和および／または抗体−補体の仲介、または免疫されたホストを防御するための抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に役立ち得る。このような応答は、当該技術分野において公知の標準的な免疫測定法および中和試験法を用いて判定することができる。
本明細書で用いられる「ホスト」の語は、ヒトおよびその他の動物を指す。
「粘膜送達」の語は、例えば消化管粘膜（例えば、頬または口唇の粘膜）または気道粘膜（例えば、鼻粘膜）のような粘膜への組成物の送達に関する。
ＩＩＩ．Ｅ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質
Ｅ型肝炎ウイルス（Hepatitis E virus：ＨＥＶ）は、重篤な急性肝不全の原因となることが知られている。ＨＥＶは、ヘペウイルス科ファミリーのヘペウイルス属に属する。ＨＥＶは、約７．２−ｋｂの一本鎖プラス鎖ＲＮＡ分子を含む。ＲＮＡは３’ポリアデニル化され、三つの翻訳領域（open reading frames：ＯＲＦ）を含む。ＯＲＦ１は、ゲノムの５’側の半分に位置する、ウイルス性の非構造タンパク質をコードする。０ＲＦ２は、ゲノムの３’側の半分に位置する、タンパク質形成性のウイルスカプシドをコードする。ＯＲＦ３は、ＯＲＦ１のＣ末端およびＯＲＦ２のＮ末端に重複する１３．５−ｋＤａのタンパク質をコードする。ＯＲＦ３は膜および細胞骨格分画に関連する。
ＩＩＩ．ウイルス様粒子（Virus-like particle：ＶＬＰ）
本発明の一態様は、ウイルス様粒子（virus-like particles：ＶＬＰ）への自己集合のためのＨＥＶカプシドタンパク質の構築に関する。カプシドタンパク質の様々なコンストラクトは、ＶＬＰ形成のために用いることができる（Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. Li TC, Yamakawa Y, Suzuki K, Tatsumi M, Razak MA, Uchida T, Takeda N, Miyamura T., J Virol. 1997 Oct;71(10):7207-13. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. Li TC, Takeda N, Miyamura T, Matsuura Y, Wang JC, Engvall H, Hammar L, Xing L, Cheng RH. J Virol. 2005 Oct;79(20): 12999-3006.）。ＨＥＶの主要なカプシドタンパク質がＯＲＦ２遺伝子によりコードされていることから、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質は、in vitroでのＶＬＰ形成のためのコンストラクトとして用いることができる。好ましくは、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質は、in vitroでのＶＬＰ形成のためのコンストラクトとして用いることができる。任意に、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分およびＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質の一部分を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質は、in vitroでのＶＬＰ形成のためのコンストラクトとして用いることができる。ＨＥＶ ＯＲＦ２は、以下のアミノ酸配列を有する６０８残基のタンパク質である：
MRPRP ILLLL LMFLP MLPAP PPGQP SGRRR GRRSG GSGGG FWGDR VDSQP FAIPYI HPTNP FAPDV TAAAG AGPRV RQPAR PLGSA WRDQA QRPAV ASRRR PTTAG AAPLT AVAPA HDTPP VPDVD SRGAI LRRQY NLSTS PLTSS VATGT NLVLY AAPLS PLLPL QDGTN THIMA TEASN YAQYR VARAT IRYRP LVPNA VGGYA ISISF WPQTT TTPTS VDMNS ITSTD VRILV QPGIA SELVI PSERL HYRNQ GWRSV ETSGV AEEEA TSGLV MLC1H GSLVN SYTNT PYTGA LGLLD FALEL EFRNL TPGNT NTRVS RYSST ARHRL RRGAD GTAEL TTTAA TRFMK DLYFT STNGV GEIGR GIALT LFNLA DTLLG GLPTE LISSA GGQLF YSRPV VSANG EPTVK LYTSV ENAQQ DKGIA IPHDI DLGES RWIQ DYDNQ HEQDR PTPSP APSRP FSVLR ANDVL WLSLT AAEYD QSTYG SSTGP VYVSD SVTLV NVATG AQAVA RSLDW TKVTL DGRPL STIQQ YSKTF FVLPL RGKLS FWEAG TTKAG YPYNY NTTAS DQLLV ENAAG HRVAI STYTT SLGAG PVSIS AVAVL APHSA LALLE DTLDY PARAH TFDDF CPECR PLGLQ GCAFQ STVAE LQRLK MKVGK TREL （配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ 受入Ｎｏ：ＡＡＡ４５７３６．１）
本発明の幾つかのコンストラクトは、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分と異種性ペプチドとの融合タンパク質である。本発明の幾つかのコンストラクトは、Ｎ末端領域に欠失のあるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の幾つかの新規なコンストラクトは、Ｎ末端領域に少なくとも１０の近接するアミノ酸の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の幾つかの新規なコンストラクトは、Ｎ末端領域に少なくとも２５の近接するアミノ酸の欠失があり、好ましくは少なくとも５０の近接するアミノ酸の欠失があり、特に好ましくは少なくとも１００の近接するアミノ酸の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の好ましいコンストラクトは、Ｎ末端領域に１１１ないし１２４残基の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の特に好ましいコンストラクトは、Ｎ末端領域に１〜１１１の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。
本発明の幾つかのコンストラクトは、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分と異種性ペプチドとの融合タンパク質である。本発明の幾つかのコンストラクトは、Ｃ末端領域に欠失のあるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の幾つかの新規なコンストラクトは、Ｃ末端領域に少なくとも１０の近接するアミノ酸の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の幾つかの新規なコンストラクトは、Ｃ末端領域に少なくとも２０の近接するアミノ酸の欠失があり、好ましくは少なくとも３０の近接するアミノ酸の欠失があり、特に好ましくは少なくとも５０の近接するアミノ酸の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の好ましいコンストラクトは、Ｃ末端領域に５２ないし６０残基の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の特に好ましいコンストラクトは、Ｃ末端領域に６０９〜６６０、６０１〜６６０、６０２〜６６０、６０３〜６６０、６０４〜６６０、６０５〜６６０、６０６〜６６０、６０７〜６６０、６０８〜６６０、または６０９〜６６０の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。
本発明の幾つかのコンストラクトは、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分と異種性ペプチドとの融合タンパク質である。本発明の幾つかのコンストラクトは、Ｎ末端領域およびＣ末端領域の両方に欠失のあるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の幾つかの新規なコンストラクトは、Ｎ末端領域に少なくとも１０の近接するアミノ酸の欠失があり、かつＣ末端領域に少なくとも１０の近接するアミノ酸の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の幾つかの新規なコンストラクトは、Ｎ末端領域に少なくとも２５の近接するアミノ酸の欠失があり、かつＣ末端領域に少なくとも２０の近接するアミノ酸の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の幾つかの新規なコンストラクトは、Ｎ末端領域に少なくとも５０の近接するアミノ酸の欠失があり、かつＣ末端領域に少なくとも３０の近接するアミノ酸の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の幾つかの新規なコンストラクトは、Ｎ末端領域に少なくとも１００の近接するアミノ酸の欠失があり、かつＣ末端領域に少なくとも５０の近接するアミノ酸の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の好ましいコンストラクトは、Ｎ末端領域に１１１ないし１２４残基の欠失があり、かつＣ末端領域に５２ないし６０残基の欠失があるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の特に好ましいコンストラクトは、ＨＥＶ ＯＲＦ２の残基１１２〜６０８を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。
本発明の別の態様は、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分のＮ末端に融合したＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質の一部分を用いる、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）への自己集合のためのＨＥＶカプシドタンパク質の構築に関する。ＨＥＶ ＯＲＦ３は、以下のアミノ酸配列を有する１２３残基のタンパク質である：
MNNMS FAAPM GSRPC ALGLF CCCSS CFCLC CPRHR PVSRL AAVVG GAAAV PAVVS GVTGL ILSPS QSPIF IQPTP SPPMS PLRPG LDLVF ANPPD HSAPL GVTRP SAPPL PHVVD LPQLG PRRZ （配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ 受入Ｎｏ：ＡＡＡ４５７２６．１）
本発明によれば、ＨＥＶ ＯＲＦ３の一部分は、上記いずれのＨＥＶ ＯＲＦ２コンストラクトのＮ末端にも融合できる。本発明に有用なＨＥＶ ＯＲＦ３の融合は、ＯＲＦ ３の残基８１〜１２３に位置する二量体化に必須の領域を含んだ、ＨＥＶ ＯＲＦ２のＣ末端領域を含んでなる。本発明の幾つかの新規なコンストラクトは、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分のＮ末端に融合したＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質のＣ末端の少なくとも６０残基を含んでなる。本発明の幾つかの新規なコンストラクトは、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分のＮ末端に融合したＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質のＣ末端の少なくとも７０残基を含んでなり、好ましくはＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分のＮ末端に融合したＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質のＣ末端の少なくとも８０残基を含んでなり、特に好ましくはＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分のＮ末端に融合したＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質のＣ末端の少なくとも９０残基を含んでなる。本発明の好ましいコンストラクトは、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分のＮ末端に融合したＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質の残基９１〜１２３を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。本発明の特に好ましいコンストラクトは、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分のＮ末端に融合したＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質の残基７０〜１２３を含んでなるＨＥＶカプシドタンパク質である。
ＩＶ．キメラ組み換えＨＥＶウイルス様粒子
本発明の一態様は、上記ＩＩＩ項に記載の異種性ペプチドに融合したカプシドタンパク質の様々なコンストラクトを用いる、ウイルス様粒子（virus-like particle：ＶＬＰ）への自己集合のための改変Ｅ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質に関する。
本発明の幾つかの実施形態によれば、異種性ペプチドは、改変ＨＥＶカプシドタンパク質のＣ末端に位置する。本発明の幾つかの実施形態によれば、異種性ペプチドは、改変ＨＥＶカプシドタンパク質のＮ末端に位置する。好ましくは、改変ＨＥＶカプシドタンパク質のＣ末端またはＮ末端における異種性ペプチドの挿入は、ＶＬＰの自己集合を妨げない。さらに好ましくは、挿入された異種性ペプチドは、異種性ペプチドを抗原性エピトープとして提示するためにＶＬＰの表面に露出される。異種性ペプチドの長さは、ＶＬＰの形成に適合するように好ましく選択される。一般に異種性ペプチドは、３または４アミノ酸の長さ、さらに典型的には５、６、または７アミノ酸の長さ、さらに典型的には８または９アミノ酸の長さ、およびさらになお典型的には１０以上のアミノ酸の長さであってよい。
本発明の別の実施形態によれば、本発明の異種性ペプチドは、改変ＨＥＶカプシドタンパク質のＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の、予め選択された領域内に挿入することもできる。改変ＨＥＶカプシドタンパク質のＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質内のいずれの領域も、異種性ペプチド挿入のために選択できる。好ましくは、改変ＨＥＶカプシドタンパク質の予め選択された領域における異種性ペプチドの挿入は、ＶＬＰの自己集合を妨げない。さらに好ましくは、挿入された異種性ペプチドは、異種性ペプチドを抗原性エピトープとして提示するためにＶＬＰの表面に露出される。特に好ましくは、予め選択された領域はＨＥＶ ＯＲＦ２のループ領域であり、このループ領域はＶＬＰの表面に露出される。最も好ましくは、予め選択された領域は以下のループ領域：残基４８３〜４９０、残基５３０〜５３５、残基５５４〜５６１、残基５７３〜５７７、残基５８２〜５９３、および残基６０１〜６１３のうちの１である。異種性ペプチドの長さは、ＶＬＰの形成に適合するように好ましく選択される。一般に異種性ペプチドは、３または４アミノ酸の長さ、さらに典型的には５、６、または７アミノ酸の長さ、さらに典型的には８または９アミノ酸の長さ、およびさらになお典型的には１０以上のアミノ酸の長さであってよい。
異種性ペプチドを、改変ＨＥＶ カプシドタンパク質のＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の予め選択された領域内に挿入する場合、挿入される異種性ペプチドを収容するため、予め選択された領域内に欠失を作ることができる。予め選択された領域に必要な欠失は、カプシドタンパク質のフォールディングを維持し、ＶＬＰの自己集合を促進し、かつＶＬＰの安定性を維持または増大するために作ることができる。必要な欠失はまた、特に立体構造的なエピトープを提示する場合に、より長い異種性の挿入を可能にするためにも作ることができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、予め選択された領域の少なくとも１の残基が欠失する。本発明の別の実施形態によれば、予め選択された領域の全ての残基が欠失する。本発明の好ましい実施形態によれば、予め選択された領域から欠失した残基の数は、挿入された異種性ペプチドの残基の数に同じかまたはほぼ同じである。
当業者は、改変ＨＥＶカプシドタンパク質内に異種性ペプチドの１以上を取り込むことにより、１以上の抗原を作ることができることを容易に認識するであろう。例えば、第１の異種性ペプチドは改変ＨＥＶカプシドタンパク質のＣ末端に挿入されてよく、第２の異種性ペプチドは予め選択された領域に挿入されてよい。
本発明はまた、本明細書に記載されるように、改変ＨＥＶカプシドタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。
Ｖ．ウイルス様粒子の産生および精製
本発明の一態様は、ウイルス様粒子の産生および精製のための方法に関する（Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. Li TC, Yamakawa Y, Suzuki K, Tatsumi M, Razak MA, Uchida T, Takeda N, Miyamura T., J Virol. 1997 Oct;71(10):7207-13. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. Li TC, Takeda N, Miyamura T, Matsuura Y, Wang JC, Engvall H, Hammar L, Xing L, Cheng RH. J Virol. 2005 Oct;79(20): 12999-3006. Niikura M et al, Chimeric recombinant hepatitis E virus-like particles as an oral vaccine vehicle presenting foreign epitopes. Virology 2002; 293: 273-280を参照）。様々な発現系が、本発明の改変Ｅ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質の発現のために用いられ得る。本発明のウイルス様粒子産生に有用な発現系の例には、細菌性発現系（例えば、大腸菌）、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳類細胞が含まれるがこれらに限定されない。本発明の好ましい発現系には、昆虫細胞を用いるバキュロウイルス発現系が含まれる。例えばバキュロウイルスベクターおよびバキュロウイルスＤＮＡの取り扱いおよび調製についての一般的方法、および昆虫細胞の培養手順については A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures に概説される。
本発明の改変Ｅ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質は、バキュロウイルスベクター内にクローン化することができ、適切なホスト細胞への感染に使用される（例えば、O'Reilly et al.,"Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual,"Freeman & Co. 1992. を参照）。昆虫細胞株（例えば、Ｓｆ９またはＴｎ５）は、本発明の改変ＨＥＶカプシドタンパク質をコードするポリ核酸を含む転移ベクターによって形質転換することができる。転移ベクターには、例えば、直線化したバキュロウイルスＤＮＡおよび望まれるポリヌクレオチドを含むプラスミドが含まれる。ホスト細胞株には、組み換えバキュロウイルスを作成するため、直線化したバキュロウイルスＤＮＡおよびプラスミドが共導入されてよい。
本発明のウイルス様粒子の精製は、当該技術分野における標準的な技術に従って実行できる（Li TC, et al, J Virol. 1997 Oct;71(10):7207-13. Li TC, et al., J Virol. 2005 Oct;79(20): 12999-3006. Niikura M et al, Virology 2002; 293: 273-280 を参照）。精製されたＶＬＰは、次に適切な緩衝液中に再懸濁される。
ＶＩ．異種性核酸の被包
本発明の別の態様は、ＨＥＶウイルス様粒子内の異種性核酸の被包に関する（DNA vaccine-encapsulated virus-like particles derived from an orally transmissible virus stimulate mucosal and systemic immune responses by oral administration, Gene Therapy 2004. 11, 628-635. S Takamura, M Niikura, T-C Li, N Takeda, S Kusagawa, Y Takebe, T Miyamura and Y Yasutomi を参照）。当該技術分野における標準的な技術のいずれも、異種性核酸を本発明のＶＬＰ内に被包するために使用できる。一般的な手順は、（１）本発明に従う改変ＨＥＶカプシドタンパク質によって形成されたＶＬＰを解体すること；および（２）ＶＬＰを異種性核酸の存在下で再構成することを含む。当業者は、被包手順の前に、精製されたＶＬＰを入手することが好ましいことを認識するであろう。被包手順の前に、いずれの不必要な核酸も除去されるか、または実質的に除去されたＶＬＰを入手することが特に好ましい。
ＶＬＰの解体は、当該技術分野におけるいずれの標準的な技術を用いても実行できる。再構成されたウイルス様粒子は、生理的な条件下で産生することができる（米国特許出願公開公報２００８０１３１９２８号を参照）。ウイルス様粒子の解体にはしばしば、ＶＬＰの集合を阻止する薬剤、例えば還元剤またはキレート剤が必要とされる（米国特許出願公開公報２００４０１５２１８１号を参照）。当業者は、集合および解体に影響を及ぼす因子ならびに条件には、特に：ｐＨ、イオン強度、翻訳後修飾、ウイルス性カプシドタンパク質の改変、ジスルフィド結合、および二価の陽イオン結合が含まれることを認識するであろう。例えば、ウイルス粒子の完全性を維持する上での陽イオン結合、具体的にはカルシウムの重要性が、ポリオーマウイルス（Brady et al., J. Virol, 23:717-724, 1977）、およびロタウイルス（Gajardo et al., J. Virol, 71 :2211-2216, 1997）について示されている。また、ポリオーマウイルス（Walter et al., Cold Spring Har Symp. Quant. Biol, 39:255-257, 1975; Brady et al., J. Virol, 23:717-724, 1977）；およびＳＶ４０ウイルス（Christansen et al., J. Virol, 21: 1079-1084, 1977）の安定化のためにはジスルフィド結合が重要であるように思われる。また、ｐＨおよびイオン強度のような因子が、おそらく静電気的な相互作用に影響することにより、ポリオーマウイルスカプシドの安定性に影響を与えることが知られている（Brady et al., J. Virol, 23:717-724, 1977; Salunke et al., Cell, 46:895-904, 1986; Salunke et al., Biophys. J, 56:887-900, 1980）。また、幾つかのウイルス性カプシドタンパク質の翻訳後修飾、例えばグリコシル化、リン酸化、およびアセチル化が、カプシドの安定性および集合に影響を与え得ることが知られている（Garcea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3613-3617, 1983; Xi et al., J. Gen. Virol, 72:2981-2988, 1991）。従って、カプシドの安定性、集合、および解体に影響し得る、多数の相互に関係する因子が存在する。
好ましくは、本発明のＶＬＰはカルシウムイオンの除去により解体する（Touze A, Coursaget P. In vitro gene transfer using human papillomavirus-like particles. Nucleic Acids Res 1998; 26: 1317-1323; Takamura et al, DNA vaccine-encapsulated virus-like particles derived from an orally transmissible virus stimulate mucosal and systemic immune responses by oral administration. Gene Therapy 2004; 11:628-635 を参照）。本発明によれば、還元剤もしくはキレート剤、または両方が、ＶＬＰの解体のために用いられる。様々な還元剤が用いられてよい。還元剤の好ましい実施形態にはジチオスレイトール（ＤＴＴ）が含まれるが、これに限定されない。様々なキレート剤、例えば、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が使用されてよい。ＶＬＰ解体条件の例には、以下が含まれるがこれに限定されない：精製されたＶＬＰを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および２０ｍＭ ジチオスレイトールを含む緩衝液中で３０分間インキュベートすることにより破壊した。
当業者はまた、異種性核酸を被包するためには、ＶＬＰの完全な解体が好ましくはあるが必要ではないことも認識するであろう。当業者はまた、別の場合には、ＶＬＰの部分的な解体が好ましいことも認識するであろう。本発明によれば、ＶＬＰの部分的な解体のための条件は、異種性核酸の効率的な被包がなお可能であるように制御できる。ＶＬＰの部分的な解体は、ＶＬＰを還元剤のみ（例えば、２０ｍＭ ＤＴＴ）で処理することにより達成され得る（Sapp et al, J. Gen. Virol, 76:2407-2412, 1995.）。本発明によれば、一旦ＶＬＰが完全または部分的に解体されると、異種性核酸の存在下でのＶＬＰの再集合によって、異種性核酸の被包が実行され得る。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＶＬＰの再集合は、破壊されたＶＬＰへのカルシウムイオンの再補充により達成される。あるいはＶＬＰの再集合は、還元剤またはキレート剤の除去により達成される。任意に、ｐＨおよびイオン強度のような因子、本発明に記載されるその他の因子は、ＶＬＰの効率的な再集合および異種性核酸の効率的な被包を達成するために調整されてよい。ＶＬＰの解体条件の例は以下を含むが、これに限定されない：
室温にて３０分間インキュベートした後、破壊されたＶＬＰ調製品に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中の異種性核酸および１５０ｍＭ ＮａＣｌを加えた。次に破壊されたＶＬＰ調製品を、最終濃度５ｍＭまでの、増加性の濃度のＣａＣｌ２と共に１時間インキュベートすることによりリフォールディングした。ＶＬＰを超遠心分離法によってペレットにして、１０ｍＭ カリウム−ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２）中に再懸濁した。各工程において、以前に記載したように、逆染色後にＶＬＰ構造の形成を電子顕微鏡により確認した。被包されたプラスミドＤＮＡの量を推定するため、リフォールディングして精製したＶＬＰを、ＶＬＰ表面のＤＮＡを除くために１０ ＩＵベンゾナーゼ（SIGMA-ALDRICH、アーバイン、英国）で１時間２０℃において処理し、ＥＧＴＡ（１ｍＭ）により破壊した。プラスミドＤＮＡの量を検出するため、上清の吸光度を測定した。
本発明の一態様は、改変ＨＥＶカプシドタンパク質による異種性核酸の被包に関し、ここで異種性核酸は、非ＨＥＶ源の抗原をコードするＤＮＡ発現カセットを含んでなる。本発明によれば、ＤＮＡ発現カセットはプロモーター配列および転写終結区配列を含んでなり得る。
本発明の組成物および方法の一利点は、本発明のＶＬＰがペプチド抗原および核酸抗原の両方を保有できることにある。ペプチド抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合して免疫系へ提示される。被包された核酸は、ＭＨＣクラスＩ系に関連して提示され得る。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の異種性（ペプチド抗原）および本発明の異種性核酸（核酸抗原）は異なる源由来である。本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の異種性（ペプチド抗原）および本発明の異種性核酸（核酸抗原）は異なる抗原性エピトープを提示する。特に好ましい実施形態によれば、本発明の異種性（ペプチド抗原）および本発明の異種性核酸（核酸抗原）は同じ源由来、例えば同じウイルス由来である。最も好ましい実施形態によれば、本発明の異種性（ペプチド抗原）および本発明の異種性核酸（核酸抗原）は同じ抗原性エピトープまたは単一の病原体由来のエピトープを提示する。このことにより、同じ病原体に対する免疫応答の刺激に相乗的な効果が得られるため、病原体により引き起こされる疾病に対する防御の増強がもたらされる。
異種性核酸のサイズおよび数は制御可能である。本発明によれば、提示される望ましい核酸抗原の数に応じて、異種性核酸の量および型は変動してよい。本発明の幾つかの実施形態によれば、被包された核酸を用いて１エピトープを提示することが望ましく、異種性核酸のコピー数はＶＬＰ内での被包を可能にし得るものである。本発明の別の実施形態によれば、被包された核酸を用いて２以上のエピトープを提示することが望ましく、より少ないコピーの異種性核酸がＶＬＰ内に被包され得る。
ＶＬＰのサイズは、改変Ｅ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質の異なるコンストラクトを用いる際に変動してよい。例えば、改変Ｅ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質のＮ末端の一部分は、ＶＬＰのサイズおよび被包用量を増大または減少させるために調整することができる。本発明の幾つかの実施形態によれば、改変Ｅ型肝炎ウイルスの構築において、ＶＬＰのサイズを調製するため、ＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質の一部分がＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分のＮ末端に融合される。
ＩＸ．医薬組成物、処方、および投与
本発明はまた、本発明の改変ＨＥＶカプシドタンパク質により形成されたキメラＶＬＰ内に被包された異種性核酸を含んでなる、医薬組成物または生理的組成物も提供する。このような医薬または生理的組成物は、１以上の薬剤的もしくは生理的に許容される賦形剤または担体も含む。本発明の医薬組成物は、様々な薬物送達系における使用に適する。本発明における使用に適した処方は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985) に見出される。薬物送達についての短い総説は、Langer, Science 249: 1527-1533 (1990) を参照されたい。
本発明の組成物は、賦形剤と共にホストへ投与されてよい。本発明に有用な賦形剤には、ビヒクル、結合剤、崩壊剤、増量剤（希釈剤）、潤滑剤、流動促進剤（フローエンハンサー）、圧縮助剤、着色料、甘味料、保存料、懸濁／分散剤、フィルム形成剤／被覆剤、香味料、および印刷インクが含まれるが、これらに限定されない。
免疫学的応答を増大させるため、様々なアジュバントがホストの種に依存して用いられてよく、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（Bacille Calmette Guerin：カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・バルバムのような潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。このようなアジュバントもまた、当該技術分野において公知である。本発明の組成物と共に投与されてよいさらなるアジュバントには、モノホスホリルリピド免疫調節物質、AdjuVax 100a、QS 21、QS 18、CRL1005、アルミニウム塩、MF 59、およびビロソームアジュバント技術が含まれるが、これらに限定されない。アジュバントはまた、これらの物質の混合物を含んでなってもよい。
本発明の組成物および方法の一利点は、本発明の組成物が免疫応答を刺激するためにアジュバントなしで投与できることである。従って、幾つかの場合には、本発明の組成物はアジュバントなしでホストへ投与される。
本発明の別の利点は、本発明の組成物が経口送達に適していることである。粘膜表面は相互に接続されていることから、粘膜表面の一つを抗原により刺激することで、直接に刺激された表面のみではなく、離れた表面にも粘膜免疫を誘導できる。例えば、本発明の組成物の経口送達により、呼吸器および生殖器−泌尿器感染に対して保護され得る。本発明の組成物はまた、頬もしくは口唇粘膜、または鼻粘膜を含む気道粘膜への送達のような、粘膜送達にも適する。
本発明の医薬組成物は、様々な経路により、例えば経口、皮下、経皮、筋肉内、静脈内、または腹腔内投与することができる。医薬組成物を投与する好ましい経路は、約０．０１〜５０００ｍｇ、好ましくは５〜５００ｍｇの一日用量による経口送達である。適切な用量は、単一の一日用量、または適切な間隔により提示される分割された用量、例えば一日あたり２、３、４、またはそれ以上の分割用量で投与され得る。
本発明の医薬組成物を調製するために、不活性で、かつ薬剤的に許容される担体が用いられる。医薬担体は固体または液体のいずれかであってよい。固体調製品には、例えば、散剤、錠剤、分散性顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤、および坐薬が含まれる。固体の担体は、希釈剤、香味料、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、結合剤、または錠剤崩壊剤としても作用することができ、また被包材料にもなり得る、１以上の物質であってよい。
散剤において、担体は一般に、微粉化された有効成分、例えば被包された核酸を有するキメラウイルス様粒子、と混合される微粉化固体である。錠剤において、有効成分（被包された核酸を有するキメラウイルス様粒子）は、必要な結合性を有する担体と適切な比率において混合され、望ましい形およびサイズに圧縮される。
坐薬の形態での医薬組成物の調製のためには、最初に脂肪酸グリセリドとココアバターの混合物のような低融点ワックスを融解し、その中へ、例えば撹拌することによって有効成分を分散させる。次に、融解した均一な混合物を使いやすいサイズの型へ注ぎ、冷却して凝固させる。
散剤および錠剤は、好ましくは約５重量％ないし約７０重量％の有効成分を含む。適切な担体には、例えば炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラクトース、糖類、ペクチン、デキストリン、デンプン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどが含まれる。
医薬組成物は、有効化合物の処方を担体としての被包材料と共に含んでよく、これによりカプセルが供給され、ここで有効成分（その他の担体と共にまたはその他の担体なしで）が担体により包囲されることで担体と化合物が会合する。カシェ剤もまた同じ様式に含むことができる。錠剤、散剤、カシェ剤、およびカプセル剤は、経口投与に適した固形剤形として使用することができる。
液体医薬組成物には、例えば、経口または非経口投与に適した溶液、懸濁液、および経口投与に適したエマルションが含まれる。有効成分（例えば、被包された核酸を含むキメラウイルス様粒子）の無菌水溶液、または有効成分の、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、エタノール、もしくはプロピレングリコールを含んでなる溶媒中の無菌溶液が、非経口投与に適した液体組成物の例である。組成物は、ｐＨを調整した緩衝剤、浸透圧を調整した薬剤、湿潤剤、界面活性剤などのような、生理的条件に近づけるために必要とされる、薬剤的に許容される補助物質を含み得る。
無菌溶液は、有効成分（例えば、被包された核酸を含むキメラウイルス様粒子）を望ましい溶媒系に懸濁し、次に得られた溶液を滅菌のためにメンブレンフィルターを通すことによるか、または代わりに、無菌化合物を予め滅菌された溶媒中に無菌的な条件で溶解することにより調製することができる。得られた水性溶液は、そのまま使用するためにパッケージされるか、または凍結乾燥されてよく、凍結乾燥調製品は、投与前に無菌の水性担体と組み合わされる。調製品のｐＨは、典型的には３ないし９、さらに好ましくは５ないし８、最も好ましくは６ないし７であり得る。
本発明の医薬組成物は、予防的な、および／または治療上の処置のために投与されてよい。治療上の応用において、組成物は、既に状態を経験している患者へ、阻止、治癒、改善のために十分であるか、または状態およびその合併症の症状を少なくとも部分的に遅延するかまたは抑止する量により投与される。これを達成するために十分な量は、「治療上有効な用量」と定義される。この使用のために有効な量は、患者の疾病または状態の重症度、ならびに体重および全身状態に依存し得るが、一般に７０ｋｇの患者では一日あたり組成物約０．１ｍｇないし約２，０００ｍｇの範囲であり、さらに一般的に使用される投薬量は、７０ｋｇの患者で一日あたり組成物約５ｍｇないし約５００ｍｇである。
予防的な応用において、本発明の医薬組成物は、疾病または状態に感受性であるか、またはそれらを発生する危険性のある患者へ、症状の開始を遅延または阻止するために十分な量により投与される。このような量は「予防的に有効な用量」と定義される。この使用における組成物の正確な量もまた、患者の健康状態および体重に依存するが、一般に７０ｋｇの患者では一日あたり阻害剤約０．１ｍｇないし約２，０００ｍｇの範囲であり、さらに一般的には、７０ｋｇの患者で一日あたり約５ｍｇないし約５００ｍｇである。
組成物の単回または複数回投与は、処置する医師により選択された用量レベルおよびパターンにより実行され得る。どのような現象においても、医薬処方は、治療的または予防的に、患者に免疫応答を効果的に刺激するために十分な量の本発明の組成物を提供しなければならない。
実施例１
Ｅ型肝炎ウイルス（HEPATITIS E VIRUS：ＨＥＶ）のカプシド構造
Ｅ型肝炎は、世界中で経腸感染非Ａ型、非Ｂ型肝炎の大多数を占める。衛生状態が悪く、高い人口密度を有する国において、Ｅ型肝炎は、妊婦に実質的な死亡率（２０％）を伴う水媒介性の流行病を引き起こす（Zhou et al., 2005. Vaccine 23:3157-65.）。原因媒介物は、ヘペウイルス科ファミリーのヘペウイルス属に属する、非エンベロープ型一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスの、Ｅ型肝炎ウイルス（hepatitis E virus：ＨＥＶ）である（Emerson et al., 2004. Hepevirus. Elsevier/ Academic Press, London.）。
ＨＥＶウイルス粒子の直径は約３２ないし３４ｎｍであり、カプシド内に７．２ｋｂのゲノムを含む。完全長のゲノムは三つの翻訳領域（open reading frames：ＯＲＦ）を含み、そのうちの一つであるＯＲＦ２は、３’末端に位置して、６６０アミノ酸のウイルス性カプシドタンパク質をコードする。その他の肝炎ウイルスと同じように、現在の細胞培養系ではＨＥＶを大量に増殖させることはできない。予防的戦略は、ＨＥＶカプシドタンパク質由来の組み換えタンパク質ワクチンに頼っている（Maloney et al., 2005. Vaccine 23:1870-4.）。
ＲＮＡ結合Ｎ末端１１１アミノ酸を欠損したＯＲＦ２タンパク質のコンストラクトをＴｎ５昆虫細胞株に発現させると、ＨＥＶ構造タンパク質由来の自己集合したウイルス様粒子（virus-like particles：ＶＬＰ）が観察された。直径２７ｎｍのこれらの粒子は、天然ウイルス粒子よりもかなり小さいが；それにもかかわらず抗ＨＥＶ血清によって認識され、カニクイザルに防御的免疫を誘導することができた（Li et al., 2004. Vaccine 22:370-7.）。従って、必須のエピトープはよく保存されており、これらの小粒子の表面になお露出されていることで、これらを潜在的に実行可能なワクチンとする。（Li et al., 2001. Vaccine 19:3476-84; Maloney et al., 2005. Vaccine 23: 1870-4.）。分析により、組み換えＨＥＶ ＶＬＰは、Ｔｎ５細胞のフューリン様活性によってＣ末端で切断されたＯＲＦ２タンパク質を集合させることが示された（Li et al., 2005. J Virol 79:12999-3006; Li et al., 1997. J Virol 71:7207-13.）。ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の他の細胞内での発現により、Ｃ末端の５２アミノ酸（amino acid：ａａ）残基の除去が、ＶＬＰ形成の必要条件であることが実証された。この知見により、数種の自己集合性組み換えＨＥＶ ＶＬＰが構築され、１２６ないし６０１の残基がＶＬＰ集合の開始に必須な要素であることが実証された（Li et al., 2005. J Virol 79:12999-3006.）。
Ｔｎ５およびＳｆ９細胞に発現させた組み換えＶＬＰ（ＶＬＰＴｎ５およびＶＬＰＳｆ９）の三次元構造を、電子低温顕微鏡（クライオＥＭ）によってそれぞれ２２および２３Ａの分解能で決定した。構造研究により、組み換えＨＥＶ ＶＬＰは、カプシド表面から伸びる３０のスパイク様突起を含む、空のＴ＝１正二十面体粒子であることが明らかになった（Li et al., 2005. J Virol 79: 12999-3006; Xing et al., 1999. Virology 265:35-45.）。密度解析により、切断型ＯＲＦ２タンパク質は、二つの異なるドメイン；すなわち、ウイルス性カプシドの連続的な表面を形成する殻（shell：Ｓ）ドメイン、および突出したスパイクを形成する突起（protrusion：Ｐ）ドメインを含むことが明らかになった。各正二十面体２回軸において、隣接するタンパク質サブユニットが、３０の突起を形成するために組み合わせられる。組み換えＨＥＶ ＶＬＰの内腔の直径は９．３ｎｍであり、これは完全長ＲＮＡゲノムをカプシド内に含むには不十分であることから、三次元再構築された粒子内には有意なＲＮＡ密度は見出されなかった（Xing et al., 1999. Virology 265:35-45.）。
Ｓｆ９細胞に発現させた、Ｓａｒ５５株由来の組み換え切断型ＯＲＦ２タンパク質（ａａ残基１１２〜６０７）を用いた同様の試験では、ＶＬＰ形成を検出できなかった。切断型ＯＲＦ２に対して産生されたか、またはチンパンジーｃＤＮＡライブラリーからファージディスプレイにより分離されたモノクローナル抗体（monoclonal antibodies：ＭＡｂｓ）は、ＨＥＶ ＳＡＲ−５５株をin vivoにおいて中和した（Schofield et al., 2000. J Virol 74:5548-55.）。放射性免疫沈降法によって、これらの抗体は、残基５７８〜６０７に位置するエピトープを認識すると位置づけられた。Ｓａｒ５５株の切断型ＯＲＦ２タンパク質（ａａ残基１１２〜６０７）の抗原部位のさらなる性質決定により、Ｃ末端領域に位置する抗原部位は、中和抗体により認識されるエピトープに重なり、このエピトープの提示を増強するためにはＣ末端が重要であることが示された（Schofield et al, 2003. Vaccine 22:257-67.）。
ＨＥＶ ＯＲＦ２のＣ末端の位置は、まだ実験的には同定されていない。しかしながら、配列解析により、この部位は溶媒に露出していることが示された。ＨＥＶ ＯＲＦ２のＶＬＰへの集合は、機能的な形での立体構造依存性エピトープの集合に対して鍵となる因子である（Maloney et al., 2005. Vaccine 23: 1870-4.）。ＨＥＶ中和性の抗原性エピトープは立体構造依存性であり、かつＯＲＦ２タンパク質のＣ末端に位置するという考察（Meng et al., 2001. Virology 288:203-11; Schofield et al., 2003. Vaccine 22:257-67.）を取り入れ、本発明者らは、クライオＥＭおよび三次元再構築技術を用い、切断型ＯＲＦ２タンパク質を集合させるＨＥＶ ＶＬＰに関して、Ｃ末端領域の構造解析を行った。研究の過程で、本発明者らは、残基６０８の後に挿入された１１アミノ酸のＢ細胞タグを含むキメラ組み換えＶＬＰ（Niikura et al., 2002. Virology 293:273-80.）および残基５９５〜６０１に対するマウスモノクローナル抗体由来のＦａｂ断片と結合する組み換えＶＬＰの構造を決定した。加えて、ＨＥＶ中和性エピトープに部分的に含まれる、位置５２５ないし６０８のＣ末端領域についての三次元構造が予想された（Meng et al., 2001. Virology 288:203-11.）。三次元構造予想からの結果がクライオＥＭからの結果と一致し、Ｃ末端領域における結合フットプリントが、ＯＲＦ２タンパク質の中和エピトープを含むＰドメインの側面を覆い、スパイク表面で終わることが明らかになったことへの留意が重要である。
材料および方法
ＩｇＧの産生および精製：８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＨＥＶ ＶＬＰ（１００μｇ／ｍｌ）の腹腔内接種によって０および４週目に免疫した。４週間後に同量の抗原を投与して最終の追加免疫を行った。最終の追加免疫から３日後、基本的にはAdlerおよびFaineによる記載に従い（Adler et al., 1983. Pathology 15:247-50）、ポリエチレングリコール１５００（５０％［重量／容量］）（Boehringer, Mannheim、独国）を用いて、マウスの脾臓細胞をＰ３Ｕ１マウスミエローマ細胞と融合させた。ハイブリドーマの増殖がみられたマイクロプレートウェルからの上清を、組み換えＨＥＶ ＶＬＰを抗原として用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングした。ＨＥＶに対する特異的な抗体を分泌するハイブリドーマを、それらがモノクローナルであるとみなされた後で、限界希釈法により３回サブクローン化した。上清中の抗体を、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Amersham、リトル・チャルフォント、バッキンガムシャー州、英国）を製造者のプロトコルに従って用いて、アイソタイプ決定した。ハイブリドーマを、１５％ＦＣＳを含んだＰＲＭＩ−１６４０を用いて、静止したフラスコ（Nunc、ロスキレ、デンマーク）内で大量増殖させた。上清を回収し、抗体をHiTrapプロテインＧアフィニティーカラム（Pharmacia Biotech AB、ウプサラ、スウェーデン）を用いて精製した後、−８０℃に保管した。マウスモノクローナル抗体ＭＡｂ２２４は免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）アイソタイプを有した。
Ｆａｂ断片の調製：精製したＭＡｂ２２４から分離したＦａｂ断片を得るため、パパイン切断を利用する方法を用いた。パパインの活性化のために還元Ｌ−システイン緩衝液を用い、ＭＡｂ２２４とパパインを１００：１のモル比で混合した。切断混合物を３０℃にて一晩インキュベートした。ヨードアセトアミドを加えて反応を消失させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。プロテインＡカラムを製造者の指示に従って用い、パパイン消化産物を精製した。結合緩衝液中でＦｃ断片および未切断のＭＡｂ２２４をカラムに固定化する一方、Ｆａｂ断片をフロースルー画分中に回収した。
ＶＬＰの精製：組み換えバキュロウイルスのコンストラクトを記載されたように（Li et al, 2005. J Virol 79:12999-3006; Li et al, 1997. J Virol 71:7207-13; Niikura et al., 2002. Virology 293:273-80.）ＶＬＰ／Ｃタグとして調製し、単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄ上のＢ細胞タグエピトープ「ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ」を、アミノ酸６０８の後に挿入した。ＨＥＶ ＶＬＰの産生および精製は、記載されたように行った（Li et al., 2005. J Virol 79: 12999-3006; Li et al., 1997. J Virol 71:7207-13; Niikura et al., 2002. Virology 293:273-80; Xing et al., 1999. Virology 265:35-45.）。簡単に述べると、Ｎ−切断型ＯＲＦ２タンパク質（ＶＬＰＴｎ５用）、Ｎ−および−Ｃ−切断型ＯＲＦ２タンパク質（ＶＬＰＳｆ９用）、ならびにＮ−切断型−および−Ｃ−挿入型ＯＲＦ２タンパク質（ＶＬＰ／Ｃタグを含む）を含むＤＮＡ断片を、バキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９３によりクローン化してｐＶＬＯＲＦ２を得た。組み換えバキュロウイルスを産生するため、昆虫Ｓｆ９細胞（理研細胞バンク、つくば市、日本）へ、ｐＶＬＯＲＦ２および直線化した野生型オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルスＤＮＡ（Pharmingen BaculoGold（商標）＃２１１００Ｄ）を、リポフェクチンを介する方法により共導入した。組み換えバキュロウイルスを３回プラーク精製した。Ｓｆ９およびＴｎ５細胞の両方、後者はイラクサギンウワバ由来のＢＴＬ−Ｔｎ ５Ｂ１−４（Ｔｎ５）（Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア州）（Wickham et al., 1993）、に組み換えバキュロウイルスをｍ．ｏ．ｉ．＞５にて感染させ、EX-CELL（商標）405培地（JRH Biosciences、レネクサ、カンザス州）中で６日間、２６．５℃にて培養した。上清を回収し、原型を保っている細胞、細胞片、および子孫バキュロウイルスを、１０，０００ｇ、９０分間の遠心分離によって除去した。次に上清を、Beckman SW32 Tiローターで、３０，０００ｒｐｍにて２時間遠心沈殿させた。得られたペレットを、４．５ｍｌのEX-CELL（商標）405に再懸濁し、４℃にて保管した。１．９６ｇのＣｓＣｌと混合した後、試料をBeckman SW55Tiローターで、３５，０００ｒｐｍにて２４時間、４℃にて遠心分離した。２２ゲージ針をチューブに穿刺して白いバンドを回収し、ＣｓＣｌを除去するため、EX-CELL（商標）405で４倍に希釈して、Beckman TLA 55ローターで４５，０００ｒｐｍにて２時間遠心分離した。ＶＬＰを１００〜５００μｌのEX-CELL（商標）405に再懸濁し、４℃にて保管した。材料は後に１０ｍＭ カリウム−ＭＥＳ緩衝液で希釈した。
クライオ電子顕微鏡用のＶＬＰ−Ｆａｂ複合体の調製：Ｆａｂ２２４断片と、Ｓｆ９細胞（ＶＬＰｓｆ９）から精製したＶＬＰとを、１：３００を超えるモル比にて、１０ｍＭ ｐＨ６．２ カリウム−ＭＥＳ緩衝液中で４℃にて一晩インキュベートすることにより、ＶＬＰ／Ｆａｂ２２４複合体を調製した。続く構造決定におけるバックグラウンド密度を減少させるため、Sephacryl-300を含む短カラムを用いて試料から未結合のＦａｂ断片を除去し、高純度ＶＬＰ／Ｆａｂ２２４複合体を得た。２８０ｎｍの吸光度（optical density：ＯＤ）におけるＵＶ分光光度計の読み取りに基づき、ＶＬＰ／Ｆａｂ２２４複合体を含む画分を回収した。精製ＶＬＰ／Ｆａｂ２２４複合体をアクリルアミドゲル（勾配８〜２５％）に負荷し、Phast（商標）システム（Pharmacia）にて定電圧条件下で電気泳動を行うＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、Ｆａｂ結合占有率を大まかに推定した。２％酢酸ウラニル（uranyl acetate：ＵＡ）を用いた逆染色の電子顕微鏡（electron microscopy：ＥＭ）により、粒子の完全性を調べた。
クライオ電子顕微鏡：試料調製およびクライオＥＭ操作は、以前に記載された、十分に確立されている手順に従った（Li et al., 2005. J Virol 79: 12999- 3006; Xing et al., 1999. Virology 265:35-45.）。簡単に述べると、３．５μｌの試料を含んだ液滴を、グロー放電した自家製穴あきカーボングリッドに載せ、余分な液体を濾紙片で３回吸収して除去し、自家製クライオコンテナー内の液体窒素で冷却した液体エタン内へ素早く入れた。試料をガラス状の氷の薄層内で凍結させた。次にグリッドを Gatan 626DH（Gatan Inc、カリフォルニア州）クライオホルダー内へ移し、続く処理のために低温環境（−１７８℃）に保持した。１２０ｋＶで操作するPhilips CM-120電子顕微鏡上で、拡大率４５，０００ｘにてKodak SO 163フィルムを用い、顕微鏡像を低線量条件下（＜１０ｅ−／Å２）で記録し、１０００ないし３０００ｎｍのデフォーカス範囲で撮影した。顕微鏡像を視覚的に点検し、適切な粒子濃度、至適な氷の厚さ、および最小の検体ドリフトという基準に基づいて選択した。これらの基準を満たした顕微鏡像のみを解析した。
イメージプロセシング：選択した顕微鏡像を、検体空間におけるピクセルあたり３．１１Åに対応する１４μｍの走査ステップサイズで、Heidelberg Primescan D8200（Heidelberg、独国）を用いてデジタル化した。粒子を、Robem（v2.14）を用いて用手で選別し、円形の平均イメージに対するそれら各々の相互関連によって集合させた。非点収差およびデフォーカス値を、単一顕微鏡像内の全ての粒子からのパワースペクトルの和の平均によって評価した。以下の構造決定に用いるデータの最初の零点は、約１７〜２０の範囲内にあった。ＶＬＰ／ＣタグおよびＶＬＰ／ＭＡｂ２２４それぞれの初期モデルを産出するため、セルフコモンラインアルゴリズムを用いた（Crowther, 1971. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 261 :221-30.）。以下の、各粒子についての起点および配向の探索は、AMD MP 1800 MHzデュアルプロセッサLinux（登録商標）ワークステーション（Baker & Cheng. 1996. J Struct Biol 116:120-30.）上で作動する極フーリエ変換（polar Fourier transformation：ＰＦＴ）アルゴリズムを繰り返し用いて実行した（ｐｆｔサーチプログラム）。三次元再構築は、正二十面体非対称性単位内に均一に広がった配向の粒子セットを、フーリエ−ベッセルアルゴリズムと組み合わせ、５−３−２正二十面体対称に重ね合わせて算出した（em3drプログラム）。最終の精密化工程において、三次元再構築の信頼性を試験するため、データセットを均等に二つの部分に分割し、それぞれ二つの三次元再構築を算出した。フーリエシェル相関（Fourier shell correlation：ＦＳＣ）を用い、フーリエ空間におけるこれら二つの再構築間の一致を評価することによって分解能を推定し；係数値０．５を基準として用いて、ＶＬＰ／ＣタグおよびＶＬＰ／Ｆａｂ２２４の三次元再構築の推定された分解能をそれぞれ１７．５Åおよび１８．５Åと算出した（図２Ｃ）。
RobemおよびPyMOL（DeLano, 2002. The PyMOL Molecular Graphics System. DeLano Scientific、パロアルト、カリフォルニア州、米国）を用いて三次元再構築を表し、可視化した。粒子容量の１００％質量に対応する値において輪郭レベルを選択した。特定の閾値についての密度を形成する表面バリアを構築する、イソ表面モードにおいて電子密度マップを点検することで、密度マップに簡潔な表面の詳細が提供された。
相違マップ解析:最初に二つの三次元モデルの間で倍率係数を探索し、cmpEMを用いてそれらの差が最小になるように調整することにより、相違マップを算出した。探索の結果、全てのモデルのサイズの相違は０．５％よりも少ないことが示され、倍率係数は１に設定した。次に、Ｓドメインに対応する全ての密度を、cmpEMを用いて固定した係数を掛け、定数を加えることにより放射状に基準化した。ＶＬＰ／ＣタグからＶＬＰＴｎ５を差し引き、かつＶＬＰ／Ｆａｂ２２４からＶＬＰＳｆ９を差し引くことにより、相違マップを得た。ＶＬＰＴｎ５およびＶＬＰＳｆ９のモデルは、以前の研究によるものを用いた（Li et al., 2005. J Virol 79: 12999-3006.）。得られた相違マップは、Ｓドメインの内部表面よりも小さな半径ならびにＶＬＰ／ＣタグおよびＶＬＰ／Ｆａｂ２２４の最大半径を超える半径において、溶媒密度をゼロに設定した。輪郭レベルは、１．３６ｇ／ｃｍ３の平均タンパク質密度、およびＦａｂ２２４の推定分子量４５ｋＤａを用いて、タグの質量に一致するように選択した。
部分的な切断型ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の構造予想：構造予想を２工程法、すなわち（Ａ）ドメイン解析および（Ｂ）De novo三次元構造予想により行った。
（Ａ）ドメイン解析：切断型ＯＲＦ２タンパク質のＣ末端領域（残基１１２〜６０８）の三次元モデルを予想するため、ドメイン予想法であるGinzu（Kim et al., 2005. Proteins 61 Suppl 7:193-200.）を、構造予想の第１工程として用いた。Ginzuは、推定されるドメインを検出する連続的な手順である。これは最初に、実験的に決定された三次元構造に相同なクエリー配列内で領域を検出する相同構造探索を行う。BLAST、PSIBLAST（Altschul et al., 1997. Nucleic Acids Res 25:3389-402.）、FFAS03（Jaroszewski et al., 2002. Protein Sci 11: 1702-13; Rychlewski et al., 2000. Protein Sci 9:232-41.）、および3D-Jury（Ginalski et al., 2003. Bioinformatics 19:1015-8; Ginalski & Rychlewski, 2003. Nucleic Acids Res 31:3291-2.）をこの工程で用いた。相同構造の無い領域の場合には、HMMER（Cheng et al., 1994. Structure 2:271-82.）を用いたPfam-Aに対する探索と共にGinzuを続け、次に推定されるドメインを予想するための方法に基づく複数配列アラインメント（multiple sequence alignment：ＭＳＡ）により解析した。切断型ＯＲＦ２タンパク質配列はいずれの相同構造とも一致しないことから、ドメイン間での切断点の選択は、NCBI非重複性（non-redundant：ＮＲ）タンパク質配列データベースに対するPSI-BLAST探索由来の完全長ＯＲＦ２タンパク質標的のＭＳＡを用いて行った。ＭＳＡにおいて最も多い配列の非重複クラスターをドメインとして指定し、最終的な切断点を、高頻度の配列末端、強力なループ予想（PSIPRED（Jones, 1999. J MoI Biol 292: 195-202.）により決定された）および整列させた残基による占有の減少、を有する位置に定めた。推定されるドメインが、Rosettaソフトウェアパッケージ（Bonneau et al., 2001. Proteins 43: 1-11; Bonneau et al., 2001. Proteins Suppl 5:119-26.）のde novo三次元構造予想プロトコルによる扱いが可能なサイズ制限（〜２００残基）内にとどまるように、境界を指定した。従って切断型ＯＲＦ２タンパク質は、推定される５個のドメイン、および８４アミノ酸（残基５２５〜６０８）を含むＣ末端領域に対応するドメインに分けられる。
（Ｂ）De novo三次元構造予想：このドメインの三次元構造を、Rosettaサーバー（Kim et al., 2004. Nucleic Acids Res 32:W526-31.）内で実行されるRosetta de novoプロトコルを用いてモデル化した。推定されるドメインの各々について、タンパク質データベース（protein database：ＰＤＢ）に提示される、局所構造を表す３から９の残基断片ライブラリーを生成し、次にタンパク質様の特色を示すスコアリング関数を用いた断片挿入により、モデルへ集合させた（Simons et al., 1997. J Mol Biol 268:209-25; Simons et al., 1999. Proteins 34:82-95.）。切断型ＨＥＶ ＯＲＦ２クエリータンパク質本来のＣ末端領域に対して１００００デコイ、および２種までの配列ホモログに対して５０００デコイを生成した。スコア、および局所的な接触または鎖トポロジーの数が好ましくないことにより除外されたデコイに基づき、このデコイセットより２０００クエリーデコイ、および配列ホモログより１０００デコイを選択した。選択されたデコイを次に、全てのギャップなしの位置にわたるＣａ二乗平均平方根偏差（root- mean-square deviation：ＲＭＳＤ）に基づいてクラスター化した。首位の９クラスターの中心をベストランクモデルとして選択し、上記の全てのフィルターを通過したベストスコアリングモデルを第１０モデルとして選択した。ベスト１０ランキングスコアを有するモデルを、次にクライオＥＭ密度マップへのフィッティングに用いた。
切断型ＯＲＦ２タンパク質のＸ線原子モデルの、キメラＨＥＶ ＶＬＰおよびＶＬＰ／Ｆａｂ２２４のクライオＥＭ密度マップへのフィッティング：プログラムＯ（Jones et al., 1991. Acta Crystallogr A 47 ( Pt 2): 110-9.）を用い、予想される三次元原子モデルの並進的および回転的な動きによるクライオＥＭ密度マップへの用手によるフィッティングを行った。クライオＥＭ密度マップの輪郭レベルは、タンパク質密度を１．３６ｇ／ｃｍ３と想定し、１００％質量を表す容量が確実となるように選択した。クライオＥＭ密度マップにおけるモデルの最もよい適合を達成するため、原子モデルの全体を剛体として扱い；フィッティング手順は、残基５９５〜６０１が表面に露出され、かつＭＡｂ２２４−Ｆａｂの密度に接近して位置する必要があり；一方で予想されるモデルのＣ末端もまた粒子表面へ向かわなければならないという基準を用いた。フィッティングの結果を最適化するため、対称関連分子を生成し、各分子間の衝突により判断した。最もよい１０モデルのうちの１個のみが、視覚的な点検によるフィッティング基準に適っていることが見出された。PyMOLプログラムを用い、図を作成した（DeLano, 2002. The PyMOL Molecular Graphics System. DeLano Scientific, Palo Alto, CA, USA.）。
結果
ＭＡｂ２２４はＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の残基５９５〜６０１を認識する：抗体ＭＡｂ２２４により認識されるエピトープを特徴付けるため、ウェスタンブロット法を行った。一連のＣ末端切断型ＯＲＦ２タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ＭＡｂ２２４によりブロットした（図１Ａ）。残基１１２〜６００、１１２〜５９６、および１１２〜５８９を含んでなる切断型ＯＲＦ２タンパク質は、ＭＡｂ２２４と相互作用できなかった。これらのデータにより、残基６０１がＭＡｂ２２４の結合に最も重要であることが示された。抗原性エピトープは通常３〜７ａａの長さの短い領域であることを考えると、Ｍａｂ２２４結合部位は、ＯＲＦ２タンパク質のａａ位置５９５〜６０１に位置するはずであり、かつSchofieldらにより報告された残基５７８〜６０７の中和エピトープ（Schofield et al, 2000. J Virol 74:5548-55.）内にある。ＭＡｂ２２４により検出された最も低分子量のタンパク質は、ＯＲＦ２タンパク質がＮ末端で分解した産物である。
Ｃ末端マーカー：本発明者らは、図１Ｂに示す三次元構造内のＣ末端領域の位置を同定するために２つのマーカーを用いた。第１に、ａａ６０８（ＶＬＰ／Ｃタグ）に挿入された１１ａａ Ｂ細胞タグエピトープを含む、キメラ組み換えＨＥＶ ＶＬＰを、ＶＬＰ内のこのエピトープをマップするために用いた。免疫沈降法および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）実験両方の結果から、タグエピトープは粒子表面に露出されていることが示唆された（Niikura et al., 2002. Virology 293:273-80.）。第２に、６０１〜６０８にマップされるＭＡｂ２２４エピトープを、ＶＬＰ粒子内のこの領域を検出するために用いた。ＭＡｂ２２４がＥＬＩＳＡ実験において未変化の組み換えＨＥＶ ＶＬＰと反応することが見出され、位置６０１〜６０９の領域はＢＬＰ表面に露出されていることが示唆された。ＶＬＰに結合するＭＡｂ２２４の密度を増大させるため、本発明者らはＩｇＧ型のＭＡｂ２２４の変わりにＦａｂ断片を用いた。この目的のため、ＭＡｂ２２４をパパインで処理し、Ｆａｂ断片を精製した。得られたＦａｂ断片をＶＬＰと共に一晩インキュベートして、続くデータ収集のためのＶＬＰ−Ｆａｂ複合体（ＶＬＰ／ＭＡｂ２２４）を得た。
二次元電子クライオ顕微鏡像：ＶＬＰ／ＣタグおよびＶＬＰ／ＭＡｂ２２４のクライオＥＭ検体を標準的な手順により調製した（Li et al., 2005. J Virol 79: 12999-3006; Li et al., 1997. J Virol 71:7207-13.）。試料を、１２０ｋＶで操作するPhilips CM-120ＥＭにより、拡大率４５，０００ｘにて撮像した。ガラス状の氷の薄層内に包埋された、凍結水和した試料のデジタル化クライオ電子顕微鏡像により、両方の粒子は、表面から伸びる尖った密度を持つ円形の輪郭を有することが示された（図１Ｃ）。両粒子の中心は空であるように見えることからＲＮＡ成分の欠如が示唆され、これは本発明者らの以前の観察と完全に一致する（Li et al, 2005. J Virol 79: 12999-3006; Xing et al, 1999. Virology 265:35-45.）。両粒子のサイズは、ＶＬＰ／ＭＡｂ２２４の表面からさらに伸びる余分な密度を考慮しないで、約２７ｎｍである（図１Ｃ、右）。
ＶＬＰ／ＣタグおよびＶＬＰ／ＭＡｂ２２４の三次元再構築：合計で、ＶＬＰ／Ｃタグに対し７８２粒子、およびＶＬＰ／ＭＡｂ２２４に対し６１５粒子が、最終的な三次元モデルを再構築するために用いられた。ＶＬＰ／ＣタグおよびＶＬＰ／ＭＡｂ２２４のクライオＥＭ構造の表面表示により、これらの両方が、各々の正二十面体２回軸に位置する、３０の突出した二量体スパイク内に配列された６０のタンパク質サブユニットを有するＴ＝１正二十面体対称を表示する、同様の特色が示された。以前に発表されたＶＬＰのクライオＥＭ構造（Li et al., 2005. J Virol 79:12999-3006.）に一致して、ＶＬＰ／ＣタグおよびＶＬＰ／ＭＡｂ２２４の表面もまた、表面（surface：Ｓ）ドメインおよび突起（protrusion：Ｐ）ドメインの二つの異なるドメインに分けることができる。Ｓドメインは、各正二十面体５回軸において、小さな中空のカプシドの、連続した基底殻を形成する。Ｐドメインは、二量体のアーチ様スパイクを形成する２回軸に位置する隣接タンパク質サブユニットと共に、表面から外部へ突出する。Ｐドメインの上端表面における各２回軸間の距離は〜７６Åであり、これもまたＶＬＰＴｎ５およびＶＬＰＳｆ９において測定された結果に一致する（Li et al., 2005. J Virol 79:12999-3006.）。両構造内に、有意なＲＮＡ密度は見出されなかった。
ＶＬＰ／Ｃタグにおける、三次元再構成から測定された粒子の直径は約２８０Åであった（図２Ａ）。Ｐドメインは、上端に二つの識別可能な突起を示し、これはＶＬＰ／ＭＡｂ２２４（図２Ｂ）または以前に発表されたその他のＶＬＰの構造（Li et al., 2005. J Virol 79: 12999-3006.）には観察されなかった。Ｐドメインの上端から測定したこの突起の高さは約６Åである。ＶＬＰ／Ｃタグの構造とは対照的に、ＶＬＰ／ＭＡｂ２２４では、Ｆａｂ断片の無い粒子自体の直径は約２７０Åであり；加えて、６０のＦａｂ断片が粒子の周囲に観察された。Ｐドメインの肩部分に結合したＭＡｂ２２４は、２回軸の平行方向から傾いて離れている。Ｆａｂ分子の高さは、Ｐドメインの表面に垂直な長軸として〜５７Åと測定され、２回軸の上面図に沿った、隣接するＭＡｂ２２４の距離は９５Åである。本明細書に提示されるＶＬＰ／ＣタグおよびＶＬＰ／ＭＡｂ２２４の両方は、１．３６ｇ／ｃｍ３の平均タンパク質密度を用いて推定された、１００％質量−容量の輪郭において作成された密度マップである。５回軸または３回軸いずれかの領域周囲の各Ｆａｂ分子間の３Ｄ再構成において、立体障害は観察されなかった。
組み換えＨＥＶ ＶＬＰのＣ末端部の決定：未改変ＶＬＰに比較したＶＬＰ／Ｃタグの著しい相違は、Ｐドメインの上端表面に観察された。この相違が挿入されたタグによるものであるか否かを解析するため、相補性解析を用い、ＶＬＰ／ＣタグからＶＬＰＴｎ５を差し引いて相違マップを算出した。タグが表面に露出されていることが見出されているため、Ｓドメインの半径が一致したことによって、Ｐドメインに対応する半径間での相違の解析が可能になった。平均タンパク質密度が１．３６ｇ／ｃｍ３であることを考慮すると、タグ容量は１．７０ｎｍ３と推定される。得られた相違マップをＶＬＰＴｎ５に重ね合わせ、突起が見出されたＰドメインの上端表面に位置するタグの密度が明らかになった（図３Ａ）。同様の解析をＶＬＰ／ＭＡｂ２２４に応用し；ＶＬＰ／ＭＡｂ２２４からＶＬＰＳｆ９を差し引いて算出した相違マップにより、Ｐドメインの側面に位置するＦａｂ密度が明らかになった（図３Ｂ）。ウェスタンブロット分析によると、ＭＡｂ２２４結合によるフットプリントは、Ｃ末端領域の残基６０１〜６０８を覆っていた。
Ｃ末端領域の構造予想：Rosettaプロトコルを用いて、位置５２５〜６０８におけるＣ末端領域の構造をモデル化した（Kim et al., 2004. Nucleic Acids Res 32:W526-31.）。トップ１０スコアのモデルを用い、それらの各々を、ソフトウェアＯ（Jones et al., 1991. Acta Crystallogr A 47 ( Pt 2): 110-9.）を用いて、ＶＬＰ／ＣタグおよびＶＬＰ／ＭＡｂ２２４密度マップへ用手でフィッティングさせることにより評価した。タグエピトープがＶＬＰ／Ｃタグの表面に露出されていることが示され（Niikura et al., 2002. Virology 293:273-80.）、領域６０１〜６０８はＭＡｂ２２４結合部位のフットプリントに近接して位置するはずであることから、タグがＶＬＰのＰドメインの中央またはＳドメインの下のいずれかに埋もれているモデルは廃棄した。上記の基準に合致したモデルは一つのみであった（図４）。このモデルは３個のアルファヘリックス（残基５４６〜５５０、５９１〜６０１、および６０４〜６０７）、および４個のベータ鎖（残基５２６〜５３０、５３５〜５４０、５６３〜５７３、および５７７〜５８５）を含む。構造フィッティング実験により、Ｃ末端はＶＬＰ／Ｃタグ密度マップの突出した密度の下に位置し（図５Ａおよび５Ｂ）、かつアルファヘリックス（残基６０４〜６０７）およびベータシート（残基５７７〜５８５）はＦａｂ２２４とＶＬＰの間の接触面に露出され、表面から下方に向かうベータシートはＵ型に曲がったループによって、再び上部表面へ向かうアルファヘリックスに結合することが示された。Schofieldら（Schofield et al., 2003. Vaccine 22:257-67.）により報告された中和抗体によって認識される残基５９１〜６０７もまた、ＭＡｂ２２４のフットプリントにより覆われる（図６Ａ）。図６Ｂに示すように、必須のエピトープは、カプシド突起の側面のみではなく、カプシドタンパク質のＣ末端により伸長する突出した表面の上端の近傍にも位置する。
考察
Ｔｎ５またはＳｆ９細胞のいずれかに切断型ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質を発現させることにより、同様の構造を持つＶＬＰの自己集合がもたらされる（Li et al, 2005. J Virol 79: 12999-3006.）。組み換えＶＬＰおよび天然ウイルス粒子の両方は、実験動物において全身性および粘膜性の免疫応答（Li et al., 2001. Vaccine 19:3476-84.）、およびＨＥＶ特異的な中和免疫応答（Li et al., 2004. Vaccine 22:370-7.）を誘導できることから、抗原特性を共有する。以前に同定されたクライオＥＭ三次元構造により、組み換えＨＥＶ ＶＬＰは、カプシド殻の上、〜４３Åに放射状に突出した３０の二量体の突起を持つ、Ｔ＝１正二十面体粒子を形成することが示された（Li et al., 2005. J Virol 79: 12999-3006; Xing et al., 1999. Virology 265:35-45.）。突起は粒子の最も露出された部分であることから、これらは抗原性を確定するものであると思われている。本発明者らの結果は、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質配列の、その空間的な立体配置への関連についての最初の証拠を提供するものである。
ＶＬＰに切断型ＯＲＦ２タンパク質のＣ末端を局在させるため、二つの戦略が独立して用いられた；すなわち、１１残基ペプチドのＣタグおよび位置６０１〜６０８のＣ末端を認識するＭＡｂ２２４である。Ｃタグの有無によるＶＬＰの比較解析により、２回軸周辺のＰドメインの上部表面における有意な密度の相違が明らかになった（図３Ａ）。殻ドメインおよび対称は同一であるように見えることから、挿入されたタグエピトープは、ＶＬＰ形成の間にタンパク質−タンパク質相互作用に直接関わっていないことが示唆される。相違マップを、タグを持たないＶＬＰに重ね合わせることにより、タグはＰドメインの上端表面に露出されていることが示された（図３Ａ）。この知見は、タグエピトープが、免疫沈降およびＥＬＩＳＡ実験において検出されるように、このタグエピトープに対する抗体によって認識されることから、ＶＬＰ表面に露出されているという報告に一致する（Niikura et al., 2002. Virology 293:273-80.）。加えて、この知見により、ＨＥＶ ＯＲＦ２ Ｃ末端領域は、ＨＥＶ中和エピトープを含むのみではなく、Ｃタグのような外来エピトープを免疫担当細胞へうまく提示することもできるため、多価ワクチンの構築のための組み換えＨＥＶ ＶＬＰの使用が示唆される。
モノクローナル抗体（ＭＡｂ２２４）は、ウェスタンブロット分析により示されるように、位置６０１〜６０８の末端領域を認識することができる（図１Ａ）。位置６００で切断されたＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質は、ＭＡｂ２２４に結合できなかった。この知見により、ＭＡｂ２２４によって認識される抗原部位は、少なくともＣ末端に位置する直鎖エピトープの一部であることが示唆される。しかしながら、Ｃ末端における立体構造的なエピトープは、ＯＲＦ２タンパク質が変性状態に耐える強固な二次構造を形成していた場合、この状態に維持され得ることが想像される。同様の結果はSchofieldらにより得られ（Schofield et al., 2000. J Virol 74:5548-55.）、彼らは最初に、遺伝子型１ ＨＥＶ由来であるＯＲＦ２タンパク質のＣ末端に位置する中和エピトープは直鎖であると仮定したが；後に、残基５８９〜６０７を含んでなるさらに短いペプチドを試験した後で、これが変性ＲＩＰＡ中で中和抗体と相互作用できなかったため、エピトープ（１個または複数）は立体構造的であることが示唆された（Schofield et al., 2003. Vaccine 22:257-67.）。ＭＡｂ２２４により認識される部位は中和エピトープに重なることから（Li et al., 2005. J Biol Chem 280:3400-6; Meng et al., 2001. Virology 288:203-11; Schofield et al., 2003. Vaccine 22:257-67.）、組み換えＶＬＰへのＭＡｂ２２４の結合は、中和相互作用のモデルとして考えられるであろう。本発明者らは、ＨＥＶ ＯＲＦ２のＣ末端領域への抗体結合を試験するため、Ｍａｂ２２４から産生されたＦａｂ断片（Ｆａｂ２２４）を用いた。この実験により、ＨＥＶの中和機構は、ウイルスの細胞への付着の抑止に関わることが示唆される。Ｃ末端に位置する抗原部位の詳細な解析においてSchofieldらは、５９７ないし６０７のアミノ酸を認識する抗体であるＨＥＶ＃４およびＨＥＶ＃３１がＨＥＶを中和することを示し（Schofield et al., 2003. Vaccine 22:257-67.）、これらの抗体により認識されるエピトープはＭＡｂ２２４により認識される部位に重複する。ＭＡｂ２２４の中和活性についてはまだ試験されていない。しかしながら、本発明者らのＶＬＰ／ＭＡｂ２２４の三次元再構成により、ＭＡｂ２２４の抗原部位は、Ｐドメインの側面に露出されていることが示唆される。ＭＡｂ２２４密度の長さは、Ｐドメインの表面から放射状に伸長する〜５３Åである（図３Ｂ）。このデータにより、Ｆａｂ２２４の結合は、細胞受容体の認識による立体干渉を引き起こし得ることが示唆される。ＭＡｂ２２４の結合フットプリントは、ＨＥＶ＃４およびＨＥＶ＃３１により認識されるエピトープもまた覆うことから（図６Ａ）、抗体ＨＥＶ＃４およびＨＥＶ＃３１の中和機構は、ウイルス付着経路の遮断を通したＦａｂ２２４と同様である可能性がある。
少なくとも１の免疫優性中和エピトープは、一般に、主要な４のＨＥＶ遺伝子型全てによって共有され、かつ位置４５８ないし６０７におけるＨＥＶ ＯＲＦ２領域を包囲するペプチドは、この立体構造的な中和エピトープを提示できることが示されてきた（Emerson et al., 2006. J Gen Virol 87:697-704; Zhou et al., 2005. Vaccine 23:3157-65.）。知られているＨＥＶの血清型は一つのみである。従って、この中和エピトープはＨＥＶに対する普遍的なワクチンの開発のための主要な成分であるとみなされなければならない。この研究で用いられるＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質は、その他３の遺伝子型由来のこのタンパク質と９３〜９４％の配列類似性を共有する。加えて、全てのＨＥＶ 遺伝子型に対し、組み換え ＶＬＰにおけるＰドメインの空間的な立体配置は保存されている（他で発表予定である）。Ｐドメインは中和エピトープを含むことから、このドメインの二量体の性質は、このエピトープの鍵となる構造的な性質を表している可能性がある。
本発明者らは以前に、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の領域１２５〜６０１ａａが、ＶＬＰ集合の必須エレメントであることを報告した。Ｃ末端領域の位置６００における切断によってＶＬＰ形成が阻止される（Li et al, 2005. J Biol Chem 280:3400-6.）ことにより、アミノ酸５９７〜６０２の疎水性領域は二量体の相互作用のための部位であると仮定されるが；本発明者らによるＣ末端領域のクライオＥＭ ３Ｄ構造または予想モデルのいずれも、この仮説を支持しない。本発明者らの結果により、隣接するＯＲＦ２タンパク質分子のペプチド領域（残基５９７〜６０２）は互いに離れていることが示された。従って、ＶＬＰ形成が抑止される理由は、二量体相互作用の破壊を導く、Ｃ末端領域の二次構造エレメントにおける安定性の低下による可能性がある。
結果として、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質のＣ末端は、中和エピトープの提示およびカプシド集合の両方に対して重要である。本研究において、本発明者らは、Ｃ末端領域がＰドメインの側面から上端表面まで伸長することを見出した。このドメインの著しい表面への露出は、このドメイン内に主要なＨＥＶ中和エピトープが位置することに一致する。ＶＬＰ／Ｃタグの構造解析により、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質のＣ末端領域は外来性抗原エピトープの挿入に使用されてよく、それ故に多価ワクチン設計のための新しいプラットフォームとして役立ち得ることが示唆された。ＶＬＰに抱合したＭＡｂ２２４の複雑な構造は、ＭＡｂ２２４の抗原部位がＰドメインの上部に位置することについての直接の証拠を提供する。このことは、組み換えＶＬＰから除去された領域６０９〜６６０が、天然ウイルス粒子によるこの中和エピトープの提示を妨げず、かつ組み換えＶＬＰに見られるＰドメインは天然ＨＥＶの表面に提示されることを意味する。
この出願に引用される全ての特許、特許出願、およびGenBank受入番号を含むその他の出版物は、全ての目的に対して、その全体が参照により取り込まれる。
実施例２
結晶構造に基づく、Ｅ型肝炎ウイルス様粒子の生物学的および免疫学的特性
Ｅ型肝炎ウイルス（Hepatitis E virus：ＨＥＶ）は、急性肝炎の原因媒介物である。カプシドタンパク質から成るＨＥＶ様粒子（HEV-like particles：ＨＥＶ−ＬＰ）の結晶構造を、３．５−Åの分解能にて決定した。カプシドタンパク質は、突起および中央ドメインにおいて、カリシウイルス科およびトンブスウイルス科のファミリーメンバーとは非常に異なるフォールディングをを示すが、殻ドメインにおいては共通のフォールディングを共有する。５回軸におけるＴｙｒ−２８８は、ＨＥＶ−ＬＰの集合において鍵となる役割を果たし、芳香族アミノ酸残基は、構造的に関連するウイルスの間でよく保存されている。変異解析により、突起ドメインは、ＨＥＶ感染に感受性である細胞への結合に関わり、幾つかの中和エピトープを有することが示された。これらの構造的および生物学的な知見は、ＨＥＶの集合および侵入の分子機構を理解するために重要であり、また、Ｅ型肝炎の防止的および予防的な方策の開発における手がかりも提供する。
Ｅ型肝炎は、主に糞口経路により伝染するＥ型肝炎ウイルス（hepatitis E virus：ＨＥＶ）の感染によって引き起こされる急性ウイルス性肝炎である（Panda SK, Thakral D, Rehman S, Rev Med Virol, 17: 151-180 (2007); Purcell RH, Emerson SU, J Hepatol, 48:494-503 (2008)）。衛生状態が十分に維持されていないアジア、中東、および北アフリカの発展途上国では、多数の流行病および散発例が起こっている。Ｅ型肝炎は主に若年成人に発症し、妊娠中のＨＥＶ感染は、重篤な疾病および死の危険因子の一つである（Navaneethan U, Al Mohajer M, Shata MT, Liver Int, 28: 1190-1199 (2008)）。最近の疫学研究により、世界的に、それが先進国であっても、ヒトならびに数種の動物においてＨＥＶの有意な有病率および抗ＨＥＶ抗体が見られることが示された（Meng XJ, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:9860-9865 (1997); Sonoda H, et al., J Clin Microbiol, 42:5371- 5374 (2004); Okamoto H, Virus Res, 127:216-228 (2007); Li TC, et al., Emerg Infect Dis, 11 :1958-1960 (2005); Yazaki Y, et al., J Gen Virol, 84:2351-2357 (2003)）。
ＨＥＶは、ヘペウイルス科ファミリー内のヘペウイルス属の唯一のメンバーであり、７．２−ｋｂのプラス鎖ＲＮＡゲノムを有する（Tarn AW, et al. Virology, 185:120-131 (1991)）。これまでに、５の主要な遺伝子型が同定されている（Purcell RH, Emerson SU, J Hepatol, 48:494-503 (2008)）。遺伝子型１および２のウイルスはヒトの間でのみ維持されるが、遺伝子型３および４のものはブタまたは野生動物に見出される（Meng XJ, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:9860-9865 (1997); Sonoda H, et al., J Clin Microbiol, 42:5371-5374 (2004); Okamoto H, Virus Res, 127:216-228 (2007)）。しかしながら、日本および米国のような先進国において、人畜共通の伝染または輸血を介した遺伝子型３および４によるヒトへの感染が報告されたことから（Li TC, et al, Emerg Infect Dis, 11 : 1958-1960 (2005); Yazaki Y, et al, J Gen Virol, 84:2351-2357 (2003); Matsubayashi K, et al., Transfusion, 44:934-940 (2004)）、ＨＥＶの遺伝子型３および４の感染によって引き起こされるＥ型肝炎は、重要な新興感染症であることが示唆される。遺伝子型５のウイルスは鳥類起源であり、ヒトには感染しないと考えられている（Huang FF, et al. J Gen Virol, 85: 1609-1618 (2004)）。ゲノムＲＮＡは、非構造タンパク質（ＯＲＦ１）、６６０アミノ酸により構成されるウイルスカプシドタンパク質（ＯＲＦ２）、および機能が同定されていない小リン酸化タンパク質（ＯＲＦ３）をコードする三つのＯＲＦを含む（Panda SK, Thakral D, Rehman S, Rev Med Virol, 17: 151-180 (2007); Tarn AW, et al. Virology, 185: 120-131 (1991)）。ウイルスカプシドタンパク質は、その免疫化により（Emerson SU, et al. J Gen Virol, 87:697-704 (2006); He S, et al., J Gen Virol, 89:245-249 (2008); Meng J, et al., Virology, 288:203-211 (2001); Takahashi M, et al., Arch Virol, 153:657-666 (2008)）、または感染の過程で（Schofield DJ et al., J Virol, 74:5548-5555 (2000); Schofield DJ et al., Vaccine, 22:257-267 (2003)）、中和抗体を誘導する。Ｎ末端の典型的なシグナル配列および三つの潜在的なＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）は、全ての哺乳類遺伝子型に由来するカプシドタンパク質においてよく保存されているが（Graff J, et al., J Virol, 82:1185-1194 (2008); Zafrullah M et al., J Virol, 73:4074-4082 (1999)）、このタンパク質のグリコシル化状態についてはなお議論の余地があり、かつウイルスの生活環における修飾の生物学的な重要性は不明なままである。以前の研究で報告された細胞培養系におけるＨＥＶの伝播は効率的ではなかったが（Huang R, et al., Clin Diagn Lab Immunol, 6:729-733 (1999); Kazachkov Yu A, et al., Arch Virol, 127:399-402 (1992); Meng J, Dubreuil P, Pillot J, J Clin Microbiol, 35: 1373-1377 (1997); Tarn AW, et al., Virology, 238:94-102 (1997)）、Tanakaらは、ヒト肝細胞腫（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）およびヒト癌性肺胞上皮（Ａ５４９）細胞株において、ＨＥＶ遺伝子型３の持続的な感染系の確立に成功した（Tanaka T et al., J Gen Virol, 88:903-911 (2007)）。しかしながら、ＨＥＶの構造、生活環、および病原性の研究に十分な量のウイルス粒子は得ることができなかった。
ヒト便検体の電子顕微鏡検査により、ＨＥＶは、直径約３２０Åの、エンベロープを持たない球状の粒子であることが示された（Bradley D, et al., J Gen Virol, 69:731-738 (1988)）。表面に突出したスパイクを有するＨＥＶ様粒子（ＨＥＶ−ＬＰ）は、遺伝子型１株のカプシドタンパク質を発現する組み換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞内で形成可能であることから、バキュロウイルス発現系は、ＨＥＶのin vitroでの伝播に代わるものとして、ＨＥＶカプシド集合の研究の見通しを開くものである（Li TC, et al, J Virol, 71:7207-7213 (1997); Li TC, et al, J Virol, 79: 12999-13006 (2005); Xing L, et al, Virology, 265:35-45 (1999)）。クライオ電子顕微鏡（クライオＥＭ）解析により、ＨＥＶ−ＬＰは６０コピーのＯＲＦ２の切断型産物から構成される、Ｔ＝１の正二十面体粒子であることが明らかになった（Li TC, et al., J Virol, 79: 12999-13006 (2005); Xing L, et al., Virology, 265:35-45 (1999)）。ＨＥＶ−ＬＰは、内部に含まれるＲＮＡの有意な密度が見られないことから空であるように見え、直径は２７０Åであり（Li TC, et al., J Virol, 71 :7207-7213 (1997); Li TC, et al., J Virol, 79:12999-13006 (2005); Xing L, et al., Virology, 265:35-45 (1999)）、これは天然ウイルス粒子の直径よりも小さい。しかしながら、ＨＥＶ−ＬＰは、天然ＨＥＶ粒子の抗原性およびカプシド形成を保持していた。
組み換えノーウォークウイルス（ｒＮＶ；ＰＤＢ受入コード、１ＩＨＭ）（Prasad BV, et al., Science, 286:287-290 (1999)）、カリシウイルス科ファミリーのメンバーであるサンミゲルアシカウイルス（ＳＭＳＶ；ＰＤＢ受入コード、２ＧＨ８）（Chen R et al., Proc Natl Acad Sd USA, 103:8048-8053 (2006)）、およびトンブスウイルス科ファミリーのメンバーであるカーネーション斑紋ウイルス（ＣＡＲＭＶ；ＰＤＢ受入コード、１ＯＰＯ）（Morgunova E, et al., FEBS Lett, 338:267-271 (1994)）、のような、構造的に関連する哺乳類および植物ウイルス由来の、組み換えまたは天然Ｔ＝３ウイルス粒子の結晶構造を、それぞれ３．４Å、３．２Å、および３．２Åの分解能において決定した。この研究で本発明者らは、ＨＥＶ構造の基礎を理解するために、遺伝子型３の株由来であるＨＥＶ−ＬＰの結晶構造を３．５−Åの分解能にて解析し、これらのウイルス間でのカプシドタンパク質のフォールディングの相違を見出した。一方で、本発明者らは殻形成に幾つかの構造的な類似性を見出した。特に、５回軸における芳香族アミノ酸（ＨＥＶ−ＬＰの場合Ｔｙｒ−２８８）が、粒子形成に必要とされる疎水性相互作用に決定的な役割を果たし、かつこれらのウイルス間でよく保存されていることが明らかになった。さらに、変異解析によって、ＨＥＶ−ＬＰの３Ｄ構造上の、推定される細胞受容体結合領域および結合中和（neutralizing of binding：ＮＯＢ）抗体のエピトープが示された。高分解能でのＨＥＶ−ＬＰの３Ｄ構造が利用できることにより、ＨＥＶの侵入および集合の解析のためのみではなく、Ｅ型肝炎ワクチン開発のための貴重な情報も提供されるであろう。
結果
遺伝子型３のＨＥＶ−ＬＰの調製。遺伝子型１株のＨＥＶ−ＬＰの場合について記載されたように（Li TC, et al, J Virol, 71 :7207-7213 (1997); Li TC, et al, J Virol, 79:12999-13006 (2005); Xing L, et al., Virology, 265:35-45 (1999)）、遺伝子型３株由来の切断型カプシドタンパク質（アミノ酸１１２〜６０８）のゲノムを有する組み換えバキュロウイルスをポリヘドリンプロモーターの制御下で感染させることによって、大量のＨＥＶ−ＬＰが培養上清中に分泌された。さらなる構造的、および生物学的解析のために、精製した遺伝子型３のＨＥＶ−ＬＰを使用した。
ＨＥＶ−ＬＰの全体構造。遺伝子型３株由来のＨＥＶ−ＬＰの結晶構造を、遺伝子型１株由来のＨＥＶ−ＬＰのクライオＥＭマップ（Li TC, et al., J Virol, 79:12999-13006 (2005); Xing L, et al., Virology, 265:35-45 (1999)）を最初の段階でのモデルとして用いる分子置換法により、３．５−Åの分解能において決定した（図１０Ａ）。以前の論文に示されるように（Li TC, et al., J Virol, 79:12999-13006 (2005); Xing L, et al., Virology, 265:35-45 (1999)）、ＨＥＶ−ＬＰは、外側の直径が２７０ÅのＴ＝１正二十面体対称性を示す。この粒子は、正二十面体２、３、および５回軸を形成する、切断型カプシドタンパク質の６０サブユニットから構成される。表面の２回軸には３０の突起があり、３および５回軸には大きな窪みがある。
ＨＥＶカプシドタンパク質の構造。切断型ＨＥＶカプシドタンパク質は、Ｓ（shell：殻）、Ｍ（middle：中央）、およびＰ（protruding：突起）と命名され、それぞれがアミノ酸残基、１２９〜３１９、３２０〜４５５、および４５６〜６０６から構成される、三つの明確なドメインを有する（図１０Ｂ）。ＮおよびＣ末端切断型のカプシドタンパク質を性質決定に用いたことから、この研究では、典型的なシグナル配列（アミノ酸１〜２２）およびそれに続くアルギニンリッチドメイン（アミノ酸２３〜１１１）、ならびに昆虫細胞内で切断により除去されたＣ末端ドメイン（アミノ酸６０９〜６６０）については決定しなかった。加えて、この研究では、アミノ酸残基１１２〜１２８、４８６〜４８７、５５５〜５６０、および６０７〜６０８は不規則であった。粒子内部の足場構造を形成するＳドメインは、多くのウイルス性カプシド間で保存される８のβ鎖（ＢないしＩと命名される）および４の短いα−ヘリックスを持つ古典的な逆平行ゼリーロール様βサンドイッチ構造へ折り畳まれる（図１０Ｂ）（Prasad BV, et al., Science, 286:287-290 (1999); Chen R et al., Proc Natl AcadSci USA, 103:8048-8053 (2006); Morgunova E, et al., FEBS Lett, 338:267-271 (1994); Hogle JM, Chow M, Filman DJ, Science, 229: 1358-1365 (1985); Tsao J, et al., Science, 251: 1456-1464 (1991)）。特徴的なドメインの一つであるＭドメインは、６のβ鎖および４の短いβヘリックスから構成される、ねじれた逆平行βバレル構造を持つ。このドメインはＳドメインと密接に会合し、正二十面体３回軸周辺の表面に位置する（図１０ＡおよびＢ）。ＭおよびＰドメインは、長いプロリンリッチなヒンジ（アミノ酸４４５〜４６７）により連結される。ｒＮＶ（Prasad BV, et al., Science, 286:287-290 (1999)）およびＳＭＳＶ（Chen R et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103:8048-8053 (2006)）の構造についての以前の研究により、ウイルスのＰドメインは、Ｐ１およびＰ２の二つのサブドメインにより構成され、Ｐ２サブドメインはＰ１サブドメインの大きな突起として位置することが明らかになった（図Ｓ１）。対称的に、ＨＥＶ−ＬＰのＰドメインは、ねじれた逆平行βシート構造を形成する単一個別のドメインから構成されることから（図１０Ｂ）、ＨＥＶ−ＬＰのカプシドタンパク質は、Ｓドメインを除いて、カリシウイルスのそれとは著しく異なるフォールディングを有することが実証された。本発明者らは昆虫細胞内で調製されたＨＥＶ−ＬＰのグリコシル化についての証拠を得ていないが、ＨＥＶカプシドタンパク質は、三つの潜在的なＮ−グリコシル化部位、Ａｓｎ−１３７−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−３１０−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ、およびＡｓｎ−５６２−Ｔｈｒ−Ｔｈｒを有する（Zafrullah M et al., J Virol, 73:4074-4082 (1999)）。図Ｓ２Ａに示すように、二量体構造において、前二者の部位はＳドメインの水平表面上にマップされる。しかしながら、Ａｓｎ−１３７およびＡｓｎ−３１０は、それぞれに五量体および三量体構造の接触面に位置することから（図Ｓ２ＢおよびＣ）、Ｎ−グリコシル化が少しでも起こった場合、これらの部位におけるＮ−グリコシル化はＨＥＶ−ＬＰの集合を阻害し得ることが示唆される。実際にGraffらは、Ａｓｎ−１３７またはＡｓｎ−３１０のＧｌｕへの変異を保有するＨＥＶが、ウイルス粒子集合の欠陥のために、細胞またはアカゲザルへの感染性を失うことを報告した（Graff J, et al., J Virol, 82: 1185-1194 (2008)）。一方で、Ａｓｎ−５６２はＰ二量体上端の中心領域にマップされ、ＨＥＶ−ＬＰの表面に露出する。
２回軸における二量体構造。注目すべきことには、正二十面体２回軸におけるＨＥＶ−ＬＰ二量体は、ＭおよびＳドメインに対するＰドメインの交差トポロジーを示すが、ｒＮＶ、ＳＭＳＶ、およびＣＡＲＭＶを含む、２回軸において突起を有するその他のウイルスでは、各ドメインの平行トポロジーを示す（図１０Ｃ）。ＭおよびＰドメイン間の長いプロリンリッチなヒンジ領域の柔軟性により、この独特なＨＥＶ−ＬＰのトポロジーが可能になる。ＨＥＶ−ＬＰのＰドメインは、二量体構造の安定性のために、対応物のＰドメインのみではなくＭドメインとも相互作用する。これらの形態的な相違にもかかわらず、２回軸における突起二量体構造の全体構造は、ｒＮＶおよびＳＭＳＶのそれに同様である。不規則な残基である４８６〜４８７および５５５〜５６０が突起の頂端領域に位置することから、この領域は、その他の分子との相互作用の利用に柔軟であることが示唆される。
５回軸パッケージング。正二十面体５回軸におけるカプシド五量体の分子間接触面はＳドメインのみから構成され、これらの相互作用領域は、２回軸および３回軸それぞれにおける二量体および三量体のそれよりも狭いことから（図１１Ａ）、五量体形成はＨＥＶ−ＬＰ集合の鍵となる工程であることが示唆される。五量体構造の中心周囲の、Ｓドメインのβシートの間には、ループＢ〜Ｃ（アミノ酸１３９〜１５２）、Ｄ〜Ｅ（アミノ酸１９６〜２０６）、Ｆ〜Ｇ（アミノ酸２３６〜２４１）、およびＨ〜Ｉ（アミノ酸２８１〜２９６）と命名される４のループがある。それらのうちのループＢ〜ＣおよびＦ〜Ｇは隣のサブユニットに近接していないことから、これらが分子間相互作用には関係していないことが示唆される。対照的に、ループＤ〜ＥおよびＨ〜Ｉは隣のサブユニットと相互作用している。特に、ループＤ〜ＥおよびＨ〜ＩそれぞれにおけるＡｓｎ−２００およびＴｙｒ−２８８の側鎖は、約３．２Åの距離で離れている隣のサブユニットのそれと相互作用して中央の穴を満たす（図１１Ａ）。これらの知見により、これらのアミノ酸残基が粒子の集合および安定性に重要であると仮説が立てられる。この仮説について検討するため、本発明者らは、Ａｓｎ−２００がアラニンにより置換されるか（Ｎ２００Ａ）またはＴｙｒ−２８８がアラニンにより置換される（Ｙ２８８Ａ）２種の変異カプシドタンパク質を構築し、粒子形成におけるこれらの変異の効果を密度分画法によって決定した（図１１Ｂ）。野生型カプシドに匹敵する量の変異タンパク質が発現し、組み換えバキュロウイルスを感染させた細胞上清中に放出された。Ｎ２００Ａは野生型のＶＬＰを形成したが、Ｙ２８８Ａは形成しなかったことから、Ｔｙｒ−２８８は粒子形成においてＡｓｎ−２００よりもさらに決定的な役割を果たしていることが示される。芳香族アミノ酸であるＰｈｅ−１１８、Ｔｙｒ−３３０、およびＰｈｅ−１４５は、ｒＮＶ、ＳＭＳＶ、およびＣＡＲＭＶそれぞれの正二十面体５回軸にも見出される（図１１Ａ）。粒子形成におけるＴｙｒ−２８８の芳香族側鎖の役割について検討するため、Ｔｙｒ−２８８がトリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、アスパラギン酸、ヒスチジン、またはアルギニンによって置換された一連の変異体（Ｙ２８８Ｗ、Ｙ２８８Ｆ、Ｙ２８８Ｌ、Ｙ２８８Ｄ、Ｙ２８８Ｈ、またはＹ２８８Ｒ）を作製した。それらは全て野生型と同様に発現し、培地中に放出された。芳香族アミノ酸による変異体、Ｙ２８８ＷおよびＹ２８８ＦはＨＥＶ−ＬＰを形成できたが、他の変異体は粒子を産生しないか、またはごくわずかしか産生しなかった（図１１Ｂ）。これらの結果により、Ｔｙｒ−２８８の芳香族側鎖は、五量体の中心の穴を閉じることによってＨＥＶ−ＬＰ形成に決定的な役割を果たし、かつＨＥＶのＴｙｒ−２８８に対応する位置の芳香族アミノ酸は、構造的に関連するウイルス間で機能的に保存されていることが示唆される。
ＨＥＶ−ＬＰの培養細胞への結合。ＨＥＶ侵入の初期工程は、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５およびＡ５４９細胞株内でのＨＥＶのin vitro伝播（Tanaka T et al, J Gen Virol, 88:903-911 (2007)）における最近の進歩にもかかわらず、ＨＥＶに対する強固な細胞培養系が欠如しているために不明なままである。ＨＥＶ−ＬＰは、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５およびＡ５４９細胞を含む数種の細胞に結合できるが、マウスミエローマＰ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．ｌ（Ｐ３Ｕ１）細胞には結合できなかったことから（図Ｓ３）、ＨＥＶ−ＬＰを用いる結合試験はＨＥＶの標的細胞への受容体結合の第１工程を試験するために有用であることが示唆される。試験した細胞株のうち、ヒト肝細胞腫細胞株Ｈｕｈ７が、細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５およびＡ５４９よりも高いＨＥＶ−ＬＰへの結合能を示した。従って、以下のＨＥＶ−ＬＰの結合実験にはＨｕｈ７細胞を用いた。
ＮＯＢ抗体に対するエピトープの三次元マッピング。新たに産生された１０種の抗ＨＥＶ−ＬＰモノクローナル抗体が、ＨＥＶ−ＬＰのＨｕｈ７細胞への結合を阻害する能力について試験した（図１２Ａ）。２種のモノクローナル抗体、ＭＡＢ１３２３およびＭＡＢ２７２が、Ｈｕｈ７細胞へのＨＥＶ−ＬＰのＮＯＢを示し、かつＧＳＴ（ＧＳＴ）融合ＨＥＶカプシドタンパク質を用いた免疫ブロットによってＰドメインを認識した。しかしながら、ＧＳＴ融合ＰドメインからのＣ末端２８またはＮ末端２４のアミノ酸のさらなる切断によって抗体は結合しなくなったことから、Ｐドメインの一連の切断型変異体を用いて抗体のエピトープをさらに詳細に決定することは困難であることが示される。競合的な酵素結合免疫吸着測定法（enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ）によって、結合試験における検出用として用いられたＭＡＢ３５８を除き、ＭＡＢ１３２３、ＭＡＢ２７２、およびＭＡＢ１６１は、同一であるかまたは隣接するエピトープを認識することが示唆された（図Ｓ５）。ｒＮＶおよびネコカリシウイルスのＰドメインは、受容体分子への結合に関わることが示唆されることから（Bhella D et al., J Virol, 82:8051-8058 (2008); Bu W, et al. J Virol, 82:5340-5347 (2008); Choi JM et al., Proc Natl Acad Sci USA, 105:9175-9180 (2008)）、本発明者らは、ＨＥＶ−ＬＰのＰドメインは細胞結合にも関わり得ると仮定した。この可能性について検討するため、Ｐドメイン表面の１または２アミノ酸残基が置換されている、１６のＨＥＶ−ＬＰ変異体を調製した（図１２Ｂ）。密度分画法により、全ての変異タンパク質が、野生型カプシドタンパク質の様式に従ってＨＥＶ−ＬＰを形成することが示された。Ｍドメインのエピトープを認識するＭＡＢ３５８により、全ての変異体を沈降させることが可能であった（図１２Ｃ）。ＭＡＢ１３２３は、ｍｔ３との相互作用を示さず、ｍｔ４およびｍｔｌ２を弱く沈降した。ＭＡＢ２７２およびＭＡＢ１６１の両方は、ｍｔ５およびｍｔｌ５を沈降しないか、または弱く沈降したが、一方でＭＡＢ２７２はＨｕｈ７細胞へのＨＥＶ−ＬＰのＮＯＢを示し、ＭＡＢ１６１はこれを示さなかった（図１２ＡおよびＣ）。これらの変異体の置換されたアミノ酸をカプシド二量体の３Ｄ構造内に図示する（図１３Ａ）。これらの結果により、ＮＯＢ抗体であるＭＡＢ１３２３およびＭＡＢ２７２はそれぞれ、３回軸におけるＭドメインの上のＰドメインの、頂端表面の周辺領域および平行領域を認識することが示唆される。
標的細胞への結合のために決定的な領域の三次元マッピング。細胞表面への結合に重要な領域を決定するため、Ｐドメインを置換した変異ＨＥＶ−ＬＰもまた、Ｈｕｈ７細胞への結合試験に用いた（図１２Ｄ）。野生型ＨＥＶ−ＬＰは、Ｈｕｈ７細胞へ８２．６５の幾何平均蛍光強度（mean fluorescence intensity：ＭＦＩ）で結合した。試験した変異体のうち、ｍｔ４、ｍｔ１１、ｍｔｌ２，およびｍｔｌ４は、２０未満の著しく低いＭＦＩ値を示した。Ａ５４９細胞を用いても、同様の結果が得られた。図１３Ｂに示すように、細胞結合に必要とされるアミノ酸残基は、頂端表面の中心の柔軟な領域に位置した。図Ｓ７に示すように、この領域は部分的に、ＭＡＢ１３２３（図１３Ａ）およびSchofieldらにより報告されたその他の中和抗体のエピトープに重なる（Schofield DJ et al., J Virol, 74:5548-5555 (2000)）。これらの結果により、Ｐドメインの頂端の中心領域は、まだ同定されていない単数または複数の細胞受容体との会合に関わることが示唆される。
考察
切断型ＨＥＶカプシドタンパク質（アミノ酸１１２〜６０８）の昆虫細胞内での発現により、天然ＨＥＶ粒子に同様の抗原性を保持したＨＥＶ−ＬＰの集合がもたらされた（Li TC, et al., J Virol, 71 :7207-7213 (1997); Li TC, et al., Virology, 349:222-229 (2004)）。Ｔ＝１対称性のこの粒子の直径は２７０Åであり、患者の糞便検体に検出された天然ウイルス粒子の直径である３２０Åよりも小さい（Bradley D, et al., J Gen Virol, 69:731-738 (1988)）。ＨＥＶ−ＬＰの内腔は、長さ７．８ｋｂのウイルス性ＲＮＡを収容するには非常に小さく（Xing L, et al., Virology, 265:35-45 (1999)）、粒子がヌクレオチドを含有しているという証拠はない（Li TC, et al., J Virol, 71 :7207-7213 (1997); Xing L, et al., Virology, 265:35-45 (1999)）ことが報告されてきた。従って天然ＨＥＶ粒子は、ＨＥＶ−ＬＰよりも多数の、および／または大きなサイズのカプシドタンパク質から構成されることが示唆される。Ｔ＝３対称性の植物ウイルスの幾つかの場合には、カプシドタンパク質は、Ｎ末端塩基性領域の欠失（Hsu C, et al., Virology, 349:222-229 (2006); Kakani K et al., J Virol, 82:1547-1557 (2008)）またはＮ末端領域もしくはＮ末端領域とＳドメインの間のリンカードメインのいずれかにおけるアミノ酸置換（Kakani K et al., J Virol, 82: 1547-1557 (2008)）によってＴ＝１対称性の粒子へ集合することから、Ｎ末端塩基性領域はＴ＝３からＴ＝１対称性への移行の切り替えに重要な役割を果たしていることが示唆される。加えて、ＮＶカプシドタンパク質の昆虫細胞内での発現により、Ｔ＝３大粒子のみではなく、Ｔ＝１対称性を持つと思われる小粒子の産生ももたらされた（White LJ, Hardy ME, Estes MK, J Virol, 71 :8066-8072 (1997)）。構造的に関連したウイルスの、カプシド構造およびそれらのパッケージングについての多くの類似性に基づき、天然ＨＥＶ粒子はＴ＝３表面格子を有することが示唆される。ＭおよびＰドメインに連結するプロリンリッチなヒンジの柔軟性により、カプシドタンパク質二量体の、Ｔ＝３ウイルスに見出されるＡ／ＢおよびＣ／Ｃサブユニットの間での立体構造の切り替えが可能になる。天然ＨＥＶの構造は、ＨＥＶ−ＬＰのそれとはわずかに異なる可能性があるが、この研究でＨＥＶ−ＬＰを用いて得られたデータは、ＨＥＶのウイルス粒子の構造、生活環、および病原性の理解に有用な情報を提供するはずである。Ｓドメインは、その他の幾つかの正二十面体ウイルスとゼリーロールフォールディングを共有する（Prasad BV, et al, Science, 286:287-290 (1999);Chen R et al, Proc Natl Acad Sci USA, 103:8048-8053 (2006); Morgunova E, et al., FEBS Lett, 338:267-271 (1994); Hogle JM, Chow M, Filman DJ, Science, 229:1358-1365 (1985); Tsao J, et al., Science, 251: 1456-1464 (1991)）。Ｓドメイン間の相互作用において構築された五量体構造の中心に位置するＴｙｒ−２８８が置換されたカプシドタンパク質は、ＨＥＶ−ＬＰへ集合できないことが見出された。GeneBankから入手可能なデータを用いたアミノ酸配列のアラインメント解析により、Ｔｙｒ−２８８はＨＥＶの５遺伝子型の間で完全に保存されていることが示された。さらに、ＨＥＶカプシドタンパク質のＴｙｒ−２８８に対応する残基は、ｒＮＶ（Ｐｈｅ−１１８）、ＳＭＳＶ（Ｔｙｒ−３３０）、およびＣＡＲＭＶ（Ｐｈｅ−１４５）の構造内に、これらの芳香族残基の位置は異なっていたものの、見出された。Ｈ−Ｉループに位置するＨＥＶのＴｙｒ−２８８およびＳＭＳＶのＴｙｒ−３３０、ならびにＤ−Ｅループに位置するｒＮＶのＰｈｅ−１１０は粒子表面の外側に露出し、一方でＤ−Ｅループに位置するＣＡＲＭＶのＰｈｅ−１４５は粒子内部に露出する。これらのデータにより、これらの残基の芳香族側鎖は、隣のサブユニットのそれとの疎水性相互作用に関与し、安定した粒子の集合を確実にすることが示唆される。細胞への侵入の間に、殻からのゲノム放出のため、ウイルス粒子構造の再構成が必要とされる。しかしながら、ＨＥＶの侵入および脱殻機構については不明なままである。五量体の中心は粒子の最も薄い領域であり、かつチャネル様の構造であるため（Xing L, et al., Virology, 265:35-45 (1999)）、この領域もまた脱殻およびウイルス性ＲＮＡの放出に重要であり得る。ポリオウイルスの５回軸は、受容体分子への結合により開始されるウイルス粒子の立体構造変化を通した、ゲノムＲＮＡの移行に関与することが提唱されてきた（Belnap DM, et al. J Virol, 74: 1342-1354 (2000); Bubeck D, Filman DJ, Hogle JM, Nat Struct Mol Biol, 12:615-618 (2005)）。
標的細胞内へのウイルス侵入の第１工程は、細胞受容体への結合である。持続性のＨＥＶ感染に対して高度に感受性であるヒトヘパトーマＰＬＣ／ＰＲＦ／５および肺上皮Ａ５４９細胞株（Tanaka T et al., J Gen Virol, 88:903-911 (2007)）は、細胞表面に機能的なＨＥＶ受容体を発現していると考えられる。しかしながら、試験した他の細胞株に比較して、これらの細胞へのＨＥＶ−ＬＰの結合は少なかった。従って、これもまたＨＥＶ感染に感受性を示し（He S, et al., J Gen Virol, 89:245-249 (2008); Graff J, et al., J Virol, 82: 1185-1194 (2008)）、かつＨＥＶ−ＬＰへ容易に結合するヒトヘパトーマ細胞株Ｈｕｈ７を、この研究では主に用いた。ノロウイルスおよびネコカリシウイルスのＰドメインはそれぞれ、推定される受容体である組織血液型抗原（Bu W, et al. J Virol, 82:5340-5347 (2008); Choi JM et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105:9175-9180 (2008)）およびネコの接合部接着分子（Bhella D et al., J Virol, 82:8051-8058 (2008)）への結合に関与していることが報告されてきた。Ｍドメインの一部およびＰドメインの全部から成るＨＥＶカプシドタンパク質のペプチド（アミノ酸３６８〜６０６）は数種の細胞株に結合できることが示されてきたことから（He S, et al., J Gen Virol, 89:245-249 (2008)）、ＨＥＶのＰドメインもまた細胞受容体への結合に関連することが示唆される。実際に、この研究における変異解析により、ＨＥＶ−ＬＰのＰドメイン上端の中心の柔軟な領域が、Ｈｕｈ７およびＡ５４９細胞への結合に決定的な役割を果たしていることが示された。このことは、ＨＥＶのＮ５６２Ｑ変異体が、ウイルス粒子の産生にもかかわらず、培養細胞およびアカゲザルへの感染性を失うというGraffらの最近の研究に一致する（Graff J, et al., J Virol, 82:1185-1194 (2008)）。興味深いことに、潜在的なＮ−グリコシル化部位であるＡｓｎ−５６２−Ｔｈｒ−Ｔｈｒが、この領域に位置する。Ｎ−グリコシル化は、ロタウイルスを除く、エンベロープを持たないウイルスに対する稀な翻訳後修飾である（Jayaram H, Estes MK, Prasad BV, Virus Res, 101 :67-81 (2004)）。Ａｓｎ−５６２およびＴｈｒ−５６４がアラニンへ置換された変異カプシドであるｍｔ１２は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにおいて野生型タンパク質と同じ泳動を示したことから、昆虫細胞から産生されたＨＥＶ−ＬＰはＡｓｎ−５６２においてグリコシル化されていないことが示唆される。カプシドタンパク質におけるＮ−グリコシル化の欠如はＨＥＶに感染した哺乳類細胞においても報告されたが（Graff J, et al., J Virol, 82: 1185-1194 (2008)）、カプシドタンパク質のある部分は哺乳類細胞での過剰発現によってグリコシル化され、細胞表面へ輸送された（Zafrullah M et al., J Virol, 73:4074-4082 (1999)）。Ａｓｎ−５６２におけるＨＥＶカプシドのＮ−グリコシル化もまた、受容体結合に対する負の効果を有する可能性があるが、病原性を含むその他の機能において正の役割を果たす可能性もある。ＨＥＶカプシドタンパク質のグリコシル化の生物学的な重要性についてはまだ研究されていない。
現在のところ、抗ＨＥＶ抗体の中和活性を判定するための鋭敏かつ信頼できる測定法は不足しているが、標的細胞へのＨＥＶ−ＬＰ結合のＮＯＢの測定法が、適切な代替法であると考えられている。変異ＨＥＶ−ＬＰのパネルへの反応性の測定により、ＭＡＢ１３２３およびＭＡＢ２７２抗体のエピトープはそれぞれ、Ｐドメイン二量体の頂端表面の周辺領域および水平領域に位置することが明らかになった。これらの結果はさらに、ＨＥＶ−ＬＰのＰドメインが細胞への結合に重要であるという考えを支持する。ＭＡＢ１３２３は、頂端表面への結合を通してＨＥＶ−ＬＰと細胞受容体との相互作用を直接阻害することが示唆されているが、ＭＡＢ２７２は、水平領域への結合を通してＰドメインの立体構造の変化を誘導するアロステリック効果を有し得る。幾つかのモノクローナル抗体は、in vitroおよびin vivoにおいてＨＥＶの感染を中和することができ（Emerson SU, et A. J Gen Virol, 87:697-704 (2006); He S, et al, J Gen Virol, 89:245-249 (2008); Meng J, et al., Virology, 288:203-211 (2001); Takahashi M, et al., Arch Virol, 153:657-666 (2008); Schofield DJ et al., J Virol, 74:5548-5555 (2000); Schofield DJ et al., Vaccine, 22:257-267 (2003)）、それらの多くは、この研究で調製されたＭＡＢ１３２３およびＭＡＢ２７２抗体に見られるように、カプシドタンパク質の立体構造的なエピトープを認識する。遺伝子型１のカプシドタンパク質のアミノ酸５７８〜６０７に位置する直鎖エピトープに対するモノクローナル抗体（Schofield DJ et al., J Virol, 74:5548-5555 (2000)）は、推定される受容体結合ドメインの一部およびＭＡＢ２７２のエピトープに重なることから、本研究のデータは支持される。一方で、遺伝子型１のカプシドタンパク質の、Ｍドメイン内のアミノ酸４２３〜４３８およびアミノ酸４２３〜４４３に位置する直鎖エピトープに対するモノクローナル抗体は、カプシドタンパク質に由来するペプチドの細胞への結合およびＨＥＶの感染を中和したことから（He S, et al., J Gen Virol, 89:245-249 (2008)）、結合工程におけるＭドメインの重要性が示唆される。
要約すると、本発明者らは昆虫細胞から産生されたＨＥＶ−ＬＰの結晶構造を決定し、その構造的特性を、構造的に関連する動物および植物ウイルスに比較して示した。この研究により、ＨＥＶの生活環の分子機構を解明するため、およびＥ型肝炎の予防的および治療的な方策を開発するための有用な情報が提供されるであろう。
材料および方法
ＨＥＶ−ＬＰの発現、精製、および結晶化。ＨＥＶ遺伝子型３のＯＲＦ２をコードする組み換えバキュロウイルスの２７１２株を昆虫細胞内に発現させた。ＨＥＶ−ＬＰを以前に記載されたように精製し（Xing L, et al., Virology, 265:35-45 (1999)）、ハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化した。詳細をＳＩ材料および方法に報告する。
データ収集および位相決定。Ｘ線回折データは、Photon Factory（ＫＥＫ）のビームラインＢＬ１７Ａにおいて、１００Ｋにて収集した。Ｘ線回折データ収集の統計を表１に要約する。解析したＨＥＶ−ＬＰの３Ｄ構造を、タンパク質データバンクへＰＤＢ受入コード２ＺＴＮにより提出した。詳細をＳＩ材料および方法に報告する。

角括弧内の値は、最も高い分解能の殻についてのものである。
*Rmerge *=ΣhklΣi|l(hkl)i-<l(hkl)>|lΣhkll(hkl)、ここでl(hkl)iは、反射hklの強度のｉ番目の測定値であり、<l(hkl)>は、反射hklの平均強度である。
実施例３
カプシド突起ドメインにおける主な抗原性領域の構造的な性質決定
Ｅ型肝炎ウイルス（Hepatitis E virus：ＨＥＶ）は、急性肝不全の原因となるヒトの病原体である。Ｃ末端から５２アミノ酸、およびＮ末端から１１１アミノ酸を欠失させて昆虫細胞に発現させた場合、カプシドタンパク質は天然ＨＥＶウイルス粒子の抗原性を保持したＴ＝１ウイルス様粒子（virus like particle：ＶＬＰ）へ自己集合することができる。ここではクライオ電子顕微鏡およびイメージ再構成を用いて、抗ＨＥＶモノクローナル抗体が、カプシドタンパク質の突起ドメインに、ＶＬＰあたり６０コピーのＦａｂ断片によって結合したことを特定した。ＨＥＶ結晶構造の分子ドッキングにより、抗体Ｍａｂ２２４の結合部位は、表面水平域の周縁における３個のＰＯＲＦ２表面ループを覆うことが明らかになった。この抗体結合部位は、キメラＨＥＶ ＶＬＰのクライオＥＭ構造により決定されたように、挿入されたＢ細胞タグ、ＰＯＲＦ２タンパク質のＣ末端に融合された１１アミノ酸のエピトープの潜在的な位置から離れている。従って、Ｔ＝１ＨＥＶ ＶＬＰは、ＨＥＶおよび外来エピトープの両方に対する抗体を効果的に誘導する、強固な送達候補である。
ヒトにおける急性肝不全の原因となるウイルス性媒介物であるＥ型肝炎ウイルス（Hepatitis E virus：ＨＥＶ）は、主に糞口経路を通して伝染されることから、胃ならびに消化管に付随する低ｐＨおよび消化酵素に対して抵抗性である。ＨＥＶの感染により、多くの熱帯および亜熱帯地方で流行病の激増がもたらされ得る。インドでの成年人口における、報告された急性ウイルス性肝炎の５０％を超える症例（Arankalle, V. A. et al, Proc Natl Acad Sci USA 91:3428-32 (1994)）、およびネパールのカトマンズ市における１９９６年の黄疸肝炎症例の９０％（Clayson, E. T. et al., Nepal. J Infect Dis 176:763-6 (1997)）がＨＥＶに起因することが見出された。インドでは、２００２〜２００７年の間にマハラシュトラ州において、血清学的分析により１０１の大流行が確認された（Deshmukh, T. M. et al., Vaccine 25:4350-4360 (2007)）。インドでのＨＥＶ感染による生命の危機は６０％を超える（Worm, H. C. Drugs 64: 1517-1531 (2004)）。ＨＥＶ流行地での大流行の間に、かつ非流行地で、散発例もまた報告されてきた。これらの症例の幾つかは流行地への移動に関連するものであったが、多くの症例において患者はこのような移動歴を持たなかった。証拠の集積により、散発性の感染は人畜共通経路を介して起こることが示唆され、Ｅ型肝炎の症例もまた、米国を含む十分な先進国に蔓延している（Purcell, R. H. et al., J Hepatol 48:494-503 (2008)）。大流行の間のＨＥＶによる全体的な死亡率は一般に１ないし１５％の範囲であり、最も高い死亡率は妊婦に見られ、その致死率は２０％に達する（Patra, S. et al., Ann Intern Med 147:28-33 (2007)）。さらに、ＨＥＶの重複感染は高確率で肝臓の代償不全を引き起こすことが記述されており（Kumar, A. S. et al., J Hepatol 46:387-394 (2007)）、臓器移植レシピエントにおける急性Ｅ型肝炎から慢性肝疾患への進行もまた報告されている（Kamar, N. et a\., NEnglJMed 358:811-817 (2008)）。
ＨＥＶウイルス粒子は、サイズが７．２ｋＢの一本鎖ＲＮＡ分子、および３２〜３４ｎｍと報告される正二十面体カプシドから構成される。６６０アミノ酸のＨＥＶカプシドタンパク質（ＯＲＦ２タンパク質）は、第２の翻訳領域によりコードされ、集合、ホストとの相互作用、および免疫原性のようなほとんどのカプシド関連機能に関与する。組み換えＯＲＦ２タンパク質は、非ヒト霊長類においてＨＥＶ感染を阻止する抗体を誘導することができる（Li, T. -C. et al., Vaccine 22:370-377 (2004); Purcell, R. H. et al., Vaccine 21:2607-15 (2003); Tsarev, S. A. et al., Vaccine 15:1834-1838 (1997)）。４個の主要な抗原性のドメインが、ＯＲＦ２タンパク質のＣ末端の２６８アミノ酸に位置することが予想されており（Meng, J. et al., Virology 288:203-211 (2001)）、それらのうちの一つはＯＲＦ２カプシドタンパク質のＳａｒ−５５上の中和エピトープとして実験的に同定された（Schofield, D. J. et al., J Virol 74:5548-5555 (2000)）。ＯＲＦ２タンパク質の残基４５９〜６０７を含む切断型ＯＲＦ２ペプチドは、抗ＨＥＶ中和抗体の誘導に必要な最小のペプチドを提示することから（Zhou, Y. H. et al., Vaccine 23:3157-3165 (2005)）、ＨＥＶ中和エピトープは立体構造依存性であることが示唆される。現在、国際的なヌクレオチド配列データベースの協働において入手可能なＨＥＶのゲノム配列は１，６００であり、これらは４の遺伝子型に分類される。特に、知られた単一の血清型のみが認識されており、４の遺伝子型のいずれの１に由来する抗体も、遺伝子型１のＨＥＶウイルスと広く交差反応することから、ＨＥＶの免疫優性ドメインは高度に保存されていることが示唆される（Emerson, S. et al., J Gen Virol 87:697-704 (2006)）。
その他の肝炎ウイルスと同じように、ＨＥＶは現在の細胞系で大量に増殖させることはできない。ＨＥＶの防止戦略の開発は、ＨＥＶカプシドタンパク質由来の組み換えタンパク質に頼っている。昆虫細胞内に発現させると、組み換えＯＲＦ２タンパク質は、Ｃ末端から５２残基、およびＮ末端から１１１残基を欠失させた後でウイルス様粒子（virus-like particles：（ＶＬＰｓ）に自己集合する（ＰＯＲＦ２）（Li, T. C. et al., J Virol 71:7207-7213 (1997)）。クライオ電子顕微鏡（クライオＥＭ）を用いた本発明者らの以前の組み換えＨＥＶ−ＶＬＰの構造解析によってＰＯＲＦ２の四次的な配置の基本的な理解が提供され、ここで、再構成されたＶＬＰは６０コピーの切断型ＰＯＲＦ２から構成されるＴ＝１正二十面体粒子を示し（Xing, L. et al., Virology 265:35-45 (1999)）、ＰＯＲＦ２タンパク質の必須集合エレメントにはアミノ酸１２５〜６００が含まれた（Li, T.-C. et al., J. Virol. 79:12999-13006 (2005)）。最近、遺伝子型３のＴ＝１ ＶＬＰ（Yamashita, T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 106: 12986-12991 (2009)）および遺伝子型４のＴ＝１ ＶＬＰ（Guu, T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 106:12992-12997 (2009)）の結晶構造が報告され、ＰＯＲＦ２は三つのドメインから構成されることが明らかになった。これらのＶＬＰ（直径２７０Å）は天然ＨＥＶウイルス粒子（３２０〜３４０Å）よりも小さいが、このＨＥＶ−ＶＬＰは、実験動物へ経口投与した場合に抗ＨＥＶ抗体を誘導することができる（Li, T. et al., Vaccine 19:3476-3484 (2001)）。
防止戦略の開発のため、ＨＥＶ抗原性エピトープの構造についての情報が必要とされている。本発明者らはここに、抗原性構造を同定するための、クライオＥＭおよび三次元再構成を用いた一連の実験を提示する。本発明者らの結果により、抗体結合フットプリントはＰドメインの側面部位を覆い、挿入されたＢ細胞タグの位置とは離れていることが示された。
材料および方法
抗HEVモノクローナル抗体の産生および精製
８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＨＥＶ ＶＬＰ（１００μｇ／ｍｌ）の腹腔内接種によって０および４週目に免疫した。４週間後に同量の抗原を投与して最終の追加免疫を行った。最終の追加免疫から３日後、以前の基本的な記載に従い（Adler, B. et al., Pathology 15:247-250 (1983)）、ポリエチレングリコール１５００（５０％［Ｗ／Ｖ］）（Boehringer, Mannheim、独国）を用いて、マウスの脾臓細胞をＰ３Ｕ１マウスミエローマ細胞と融合させた。ハイブリドーマの増殖がみられたマイクロプレートウェルからの上清を、組み換えＨＥＶ ＶＬＰを抗原として用いたＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＨＥＶに対する特異的な抗体を分泌するハイブリドーマを、それらがモノクローナルであるとみなされた後で、限界希釈法により３回サブクローン化した。上清中の抗体を、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Amersham、リトル・チャルフォント、バッキンガムシャー州、英国）を製造者のプロトコルに従って用いて、アイソタイプ決定した。ハイブリドーマを、１５％ＦＣＳを含んだＰＲＭＩ−１６４０を用いて、静止したフラスコ（Nunc、ロスキレ、デンマーク）内で大量増殖させた。上清を回収し、抗体をHiTrapプロテインＧアフィニティーカラム（Pharmacia Biotech AB、ウプサラ、スウェーデン）を用いて精製した後、−８０℃に保管した。全ての抗体のうち、本発明者らによる分析で用いたＭＡｂ２２４は免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）アイソタイプであった。
Ｆａｂ断片の調製
分離したＦａｂ断片を調製するため、パパイン切断を用いた。パパインの活性化のために還元Ｌ−システイン緩衝液を用い、ＭＡｂ２２４とパパインを１００：１のモル比で混合した。混合物を３０℃にて一晩インキュベートした。ヨードアセトアミドを加えて反応を消失させ、産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。プロテインＡカラムを製造者の指示に従って用い、Ｆａｂ断片を精製した。Ｆｃ断片および未切断のＭＡｂ２２４をプロテインＡに対する親和性によってカラム内に捕捉する一方、Ｆａｂ断片をフロースルー画分中に回収した。
ＨＥＶ ＶＬＰの調製および精製
ＨＥＶ ＶＬＰの産生および精製は、以前に記載されたプロトコルに従って行った（Li, T. C. et al., J Virol 71:7207-7213 (1997); Niikura, M. et al., Virology 293:273-280 (2002)）。簡単に述べると、Ｎ−切断型ＯＲＦ２タンパク質（野生型ＶＬＰ用）、およびキメラＯＲＦ２タンパク質（ＶＬＰ／Ｃタグ用）を含むＤＮＡ断片を、バキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９３によりクローン化してｐＶＬＯＲＦ２を得た。組み換えバキュロウイルスをＳｆ９昆虫細胞（理研細胞バンク、つくば市、日本）より産生し、次にＭ．Ｏ．Ｉ．＞５にてＴｎ５昆虫細胞に感染させた。感染した昆虫細胞を、EX-CELL（商標）405培地（JRH Biosciences、レネクサ、カンザス州）中で６日間、２６．５℃にて培養した。１０，０００ｇ、９０分間の遠心分離によって細胞片を除去した後、培地を回収した。上清をBeckman SW32 Tiローターで、３０，０００ｒｐｍにて２時間遠心沈殿させ、ペレットを４．５ｍｌのEX-CELL（商標）405に再懸濁した。ペレットはＨＥＶ ＶＬＰを含んでおり、これをＣｓＣｌ密度勾配内でさらに精製した。白いウイルスバンドを回収し、遠心分離（Beckman TLA 55ローターで４５，０００ｒｐｍ、２時間）によってＣｓＣｌを除去するため、EX-CELL（商標）405で４倍に希釈した。ＶＬＰを１００〜５００μｌの１０ｍＭ カリウム−ＭＥＳ緩衝液に再懸濁し、４℃にて保管した。キメラＶＬＰ／Ｃタグを構築するため、単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄ由来のＢ細胞タグエピトープ「ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ」を、アミノ酸６０８の後に挿入することにより、組み換えバキュロウイルスを調製した（Schofield, D. J. et al., Vaccine 22:257-267 (2003)）。ＶＬＰ／Ｃタグは、上記のプロトコルによって調製および精製した。
クライオ電子顕微鏡用のＶＬＰ−Ｆａｂ複合体の調製
Ｆａｂ断片とＶＬＰとを、１：３００を超えるモル比にて、４℃にて一晩インキュベートすることにより、ＶＬＰ／Ｆａｂ複合体を調製した。Sephacryl-300を含む短いゲル濾過カラムに試料を流すことによって、未結合のＦａｂ断片を除去した。ＯＤ２８０ｎｍの読み取りに基づき、ＶＬＰ／Ｆａｂ複合体を含む画分を同定した。精製ＶＬＰ／Ｆａｂ複合体をアクリルアミドゲル（勾配８〜２５％）に負荷し、Phast（商標）システム（Pharmacia）にて定電圧条件下で電気泳動を行うＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、Ｆａｂ結合占有率を大まかに推定した。２％酢酸ウラニル（uranyl acetate：ＵＡ）による逆染色の後、電子顕微鏡（electron microscopy：ＥＭ）によって粒子の完全性を調べた。
クライオ電子顕微鏡
試料調製およびクライオＥＭデータ収集は、以前に記載された、十分に確立されている手順に従った（Xing, L. et al., Virology 265:35-45 (1999)）。簡単に述べると、３．５μｌの試料を含んだ液滴を、グロー放電した自家製穴あきカーボングリッドに載せ、余分な液体を濾紙片で吸収して除去し、液体窒素で冷却した液体エタン内へ素早く入れた。次に凍結水和した検体グリッドを、続くデータ収集のために低温環境（−１７８℃）に検体を保持するGatan 626DHクライオホルダーと共にFEI CM-120電子顕微鏡へ移した。顕微鏡像を、デフォーカス範囲１０００ないし３０００ｎｍ、拡大率４５，０００ｘにて、低線量条件下（＜１０ｅ−／Å２）でKodak SO 163フィルムに記録した。顕微鏡像を、適切な粒子濃度、至適な氷の厚さ、および最小の検体ドリフトという基準に基づいて視覚的に選択した。これらの基準を満たした顕微鏡像のみを解析した。
イメージプロセシング
選択した顕微鏡像を、検体空間におけるピクセルあたり３．１１Åに対応する１４μｌの走査ステップサイズで、Heidelberg Primescanner D8200（Heidelberg、独国）を用いてデジタル化した。粒子を、Robem（v2.14）を用いて用手で選別し、円形の平均イメージに対するそれら各々の相互関連によって集合させた。各顕微鏡像の非点収差およびデフォーカス値を、顕微鏡像内の全ての選択された粒子からのパワースペクトルを重ねることによって評価した。構造決定に用いたイメージの最初の零点は、約１７〜２０Å−１の範囲内に位置した。ＶＬＰ／Ｃタグ、ＶＬＰ／ＭＡｂ２２４、およびＶＬＰ／ＭＡｂ４それぞれの初期モデルを産出するため、セルフコモンラインアルゴリズムを用いた（Crowther, R. A. Philos Trans R Soc LondB Biol Sci 261:221-230 (1971)）。粒子の起点および配向の精密化は、極フーリエ変換（polar Fourier transformation：ＰＦＴ）アルゴリズムを繰り返し用いて実行した（Baker, T. et al, J. Struct. Biol. 116:120-130 (1996)）。三次元再構築は、正二十面体非対称性単位内に均一に分布した配向を有する粒子のセットを、フーリエ−ベッセルアルゴリズムと組み合わせる一方で、５−３−２正二十面体対称に重ね合わせて算出した。三次元再構築の信頼性を試験するため、データセットを均等に二つの部分に分割し、二つの三次元再構築を算出した。フーリエシェル相関（Fourier shell correlation：ＦＳＣ）を用い、フーリエ空間におけるこれら二つの再構築間の一致を評価することによって分解能を推定し；係数値０．５を基準として用いて、ＶＬＰ／Ｃタグ、ＶＬＰ／Ｍａｂ２２４、およびＶＬＰ／Ｍａｂ４の有効な分解能をそれぞれ１７．５Å、１８．５Å、および２４Åと推定した。
密度マップ上に簡潔な表面の詳細を提供するため、特定の閾値についての密度を形成する表面バリアを構築するイソ表面モードにおいて、電子密度マップを表示した。粒子容量の１００％質量に対応する値において輪郭レベルを選択した。クライオＥＭ密度マップの表面表示を、Chimeraプログラムによって作成した（Pettersen, E. F. et al., J Comput Chem. 25:1605-1612 (2004)）。
クライオＥＭ密度マップへの結晶構造のフィッティング
プログラムＯ（Jones, T. A. et al., Acta crystallogr. Sect. A 47: 110-119 (1991)）を用い、ＰＯＲＦ２結晶構造の並進的および回転的な動きによって、クライオＥＭ密度マップへの用手によるフィッティングを行った。最もよい適合を得るため、ＰＯＲＦ２サブユニットの座標を剛体として扱った。フィッティングの結果を最適化するため、対称関連分子を生成し、サブユニット間の衝突により判断した。フィッティングを、クライオＥＭ密度と、適合したＰＯＲＦ２の座標から算出された密度との間の相関係数（ＣＣ値）に基づいて評価した。ｃｃ値が８０％に達したとき、フィッティングは安定であるとみなした。フィッティングにおける図はPyMOLプログラムを用いて作成し（DeLano, W. L. DeLano Scientific, Palo Alto, CA, USA (2002)）、ＨＥＶ ＶＬＰの表面ステレオ投影はRIVEMプログラムを用いて作成した（Xiao, C. et al., J Struct. Biol. 158:181-186 (2007)）。
結果
抗体Ｍａｂ２２４の結合は、残基６０１〜６０８のタンパク質の存在に依存する
現在、ＯＲＦ２エスケープ変異体を試験するための細胞培養系は利用できないため、モノクローナル抗体Ｍａｂ２２４のＰＯＲＦ２への結合を、ウェスタンブロット法によって性質決定した。一連のＣ末端切断型ＰＯＲＦ２タンパク質を、還元条件下で１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、Ｍａｂ２２４によってブロットした（図１Ａ）。Ｍａｂ２２４は、１１２〜６６０、１１２〜６０８、１１２〜６０２、および１１２〜６０１の領域を含むＰＯＲＦ２由来のペプチドを認識した。対照的に、残基１１２〜６００、１１２〜５９６、および１１２〜５８９を含んでなるペプチドは、Ｍａｂ２２４と反応しなかった。これらのデータにより、残基Ｌｅｕ６０１が、Ｍａｂ２２４のＰＯＲＦ２タンパク質への結合に決定的であることが示唆される。Ｍａｂ２２４により検出された、より小さな分子量のバンドは、Ｍａｂ２２４の結合配列を含む分解したＯＲＦ２タンパク質である。
二次元クライオ電子顕微鏡像
クライオ電子顕微鏡像において、キメラＨＥＶ粒子およびＦａｂ結合ＶＬＰ複合体の両方は、表面から伸びる尖った密度を持つ円形の輪郭を有していた（図１Ｃ）。これらは空の粒子に見え、本発明者らが以前にＨＥＶ天然ＶＬＰによって観察した形態に類似していることから（Li, T.-C. et al., J. Virol. 79:12999-13006 (2005); Xing, L. et al., Virology 265:35-45 (1999)）、これらのＶＬＰにＲＮＡ成分は欠如していることが示される。両ＶＬＰのサイズは、ＶＬＰ／ＭＡｂ２２４の表面からさらに伸びる余分な密度を考慮しないで、約２７ｎｍである（図１Ｃ、右）。
抗体の結合フットプリント
ＶＬＰ／Ｍａｂ２２４のクライオＥＭ構造は６１５のイメージから再構成され、粒子あたり６０サブユニットのＴ＝１正二十面体対称を示した。各正二十面体２回軸に位置する、３０の二量体突起スパイクが存在した（図１４Ａ）。各ＶＬＰ粒子の周囲に６０のＦａｂ断片が観察され、Ｐドメインの側面から突き出ていた。Ｆａｂ密度は、スパイク表面から〜５７Åの高さとして測定された。Ｆａｂ断片に対応する密度は、ＨＥＶ ＶＬＰのそれにほぼ等しい規模であったことから、６０の結合部位の大部分または全てはＦａｂ分子によって占有されていることが示される。ＨＥＶ ＶＬＰの密度マップ（Xing, L. et al, Virology 265:35-45 (1999)）を用いて、ＶＬＰカプシドに対応する密度をクライオＥＭマップから除くことにより、Ｍａｂ２２４抗体の結合部位を特定するために用いるＦａｂ相違密度マップを作成した（フットプリント）。
一方で本発明者らは、中和抗体であるＭａｂ４と複合したＨＥＶ ＶＬＰの構造を、２３４の個々のイメージを組み合わせることによって決定した。in vitroでの免疫沈降により、Ｍａｂ４は天然ＨＥＶウイルス粒子および組み換えＰＯＲＦ２ペプチドを沈降させるが、アミノ酸５９７〜６０７を欠除したペプチドとは反応しないことが見出された（Schofield, D. J. et al., Vaccine 22:257-267 (2003)）。ＶＬＰ／Ｍａｂ４複合体の三次元再構成はＨＥＶ ＶＬＰあたり６０コピーのＦａｂ断片を見せたことから、ＰＯＲＦ２サブユニット当たりでは１のＦａｂ断片が示される。Ｍａｂ２２４の複合体とは異なり、Ｍａｂ４に対応する密度はカプシドのそれの約３分の１の規模であったことから（図１４Ａ）、結合部位の３０〜４０％のみがＦａｂ断片によって占有されていることが示唆される。さらに、Ｆａｂ相違マップによって、Ｍａｂ４のＦａｂ断片はスパイクの基部領域でこれらの残基と接触しているように見えることが示された結果、スパイク表面の上の密度はＦｃドメインのみを表していた（図１４Ａ）。Ｍａｂ２２４のＦａｂ断片およびＭａｂ４のＦａｂ断片の両方は、突出したＰドメインの長軸に沿って伸長し、５回軸周辺の領域および３回軸周辺の領域における隣接するＦａｂ分子による立体障害は見られなかった。結合したＦａｂ断片の密度プロファイルは、スパイク表面に対応する半径（１３５Å）において、９０゜異なるように見えた。Ｍａｂ２２４の長軸は隣接するスパイクに向かって伸長するが、Ｍａｂ４の長軸は５回軸を指していた（図１４Ｂ）。
ＦａｂとＨＥＶ ＶＬＰとの結合接触面をさらに解析するため、遺伝子型１ ＰＯＲＦ２の結晶構造を、ＶＬＰ／Ｍａｂ２２４のクライオＥＭ密度マップへドッキングさせた。遺伝子型１ ＰＯＲＦ２の結晶構造は三つのドメインから構成され、遺伝子型３および遺伝子型４ ＰＯＲＦ２（それぞれのＰＤＢ受入番号は、２ＺＴＮおよび３ＨＡＧ）の結晶構造によく一致していた（Xingにより投稿準備中）。座標は、クライオＥＭ密度マップにいずれの調整もなしでよく適合した。Ｍａｂ２２４のＦａｂ断片は、ＯＲＦ２スパイクの水平表面の残基よりもむしろスパイクの側面の残基と相互作用した（図１５Ａ）。接触フットプリントは、ＰＯＲＦ２スパイクの二量体接触面には重ならなかった。本発明者らが期待したように、Ｍａｂ２２４は立体構造的な抗体であり、その結合部位は三つの表面ループ：ＡＢループ（４７０〜４９３）、ＣＤループ（５３９〜５６９）、およびＥＦループ（５８１〜５９５）を網羅する（図１５Ｂ）。ＡＢループ由来の残基Ｅ４７９、Ｄ４８１、Ｔ４８４、Ｙ４８５、Ｓ４８７、ならびにＣＤループ由来の残基Ｙ５３２、Ｓ５３３、およびＫ５３４は、Ｆａｂ分子と密接に接触している。
ＨＥＶキメラＶＬＰの構造
１１アミノ酸のＢ細胞タグをＰＯＲＦ２のＣ末端に組み入れてＰＯＲＦ２融合タンパク質を構築し、そこからキメラＨＥＶ ＶＬＰ（ＶＬＰ／Ｃタグ）が集合した（図１ｃ）。個々の粒子の全７８２イメージを、ＶＬＰ／Ｃタグの最終的な三次元構造モデルを再構成するために用いた。以前に発表されたＶＬＰのクライオＥＭ構造に一致して、ＶＬＰ／Ｃタグの表面もまた、二つの異なる層としての正二十面体殻および突起スパイクに分けることができた（図１６Ａ）。スパイク突起は正二十面体殻から外部へ向かい、ＰＯＲＦ２二量体から構成される。二つの隣接するＰドメインの上端表面間で測定した各２回軸間の距離は〜７６Åであり、Ｔｎ５昆虫細胞から得られたＶＬＰおよびＳｆ９昆虫細胞から得られたＶＬＰにおいて測定された結果に一致する。キメラＶＬＰ／Ｃタグ内に、有意なＲＮＡ密度は見出されなかった。
結晶構造はＶＬＰ／Ｃタグの密度マップと非常によく適合することから（図１６Ｂ）、１１アミノ酸のＣ末端への挿入によって、二量体−二量体相互作用またはＴ＝１ ＶＬＰ形成のいずれも阻害されないことが示される。１００％タンパク質質量を包含する輪郭において密度マップを重ねる際、本発明者らは、Ｓドメインの半径がＶＬＰ／ＣタグマップおよびＶＬＰ／Ｍａｂ２２４マップの両方においておおまかに同じであり、突起スパイクの高さは同様に見えることを見出した。ドッキングにより、水平なスパイク表面において有意な密度の相違が観察されなかったことから（図１７）、挿入されたＢ細胞タグは柔軟で、あまり秩序だっていないことが示唆される。しかしながら、スパイクの側面およびＭａｂ２２４結合部位の下には、挿入されたペプチドに対応する可能性のある余分の密度が観察された（図１７Ａ）。
考察
ＨＥＶ Ｔ＝１ ＶＬＰは、非ヒト霊長類に抗ＨＥＶ抗体を誘導する組み換えウイルス様粒子である（Li, T. -C. et al., Vaccine 22:370-377 (2004)）。これは、経口投与を通した外来エピトープ（Niikura, M. et al., Virology 293:273-280 (2002)）、およびＤＮＡワクチン（Takamura, S. et al., Gene Ther 11:628-635 (2004)）を送達するための抗原担体としても使用できる。従って、抗体認識部位における構造解析が、ＶＬＰに基づく抗ウイルス戦略の開発には必須である。この目的のため、本発明者らは、抗体Ｍａｂ２２４（ＶＬＰ／Ｍａｂ２２４）および抗体Ｍａｂ４（ＶＬＰ／Ｍａｂ４）と複合したＨＥＶ ＶＬＰの構造、ならびにＰＯＲＦ２ Ｃ末端にＢ細胞タグを有するキメラＨＥＶ ＶＬＰ（ＶＬＰ／Ｃタグ）の構造を決定した。ＰＯＲＦ２結晶構造のドッキングにより、ＨＥＶ抗原性ドメインについての空間的な情報、および外来エピトープ挿入をより良く設計するための構造ガイダンスが提供される。
中和エピトープの構造
ＨＥＶにおける抗原性の性質および中和機構を特徴付けることは、細胞培養における適切な複製系が不足しているという事実のために困難である。従って、ＨＥＶ免疫学に対する我々の理解は、主に大腸菌（Escherichia coli：E. coli）内で発現された組み換えタンパク質、および昆虫細胞内で発現された組み換えタンパク質またはＨＥＶ−ＶＬＰを用いた研究に基づいている。全ての証拠により、ＰＯＲＦ２のＣ末端領域がＨＥＶの免疫応答に関与していることが示され、ＨＥＶの中和エピトープは立体構造的であることが示唆された。後に、ＨＥＶ中和抗体の誘導に必要とされる最小ペプチドはＰＯＲＦ２の１４８残基、アミノ酸４５９〜６０７と同定された（Zhou, Y. H. et al., Vaccine 23:3157-3165 (2005)）。このペプチド領域はＰドメインに一致することが、ＰＯＲＦ２の結晶構造で明らかにされた。本発明者らのクライオＥＭ構造によって、Ｆａｂ断片の全体がスパイクに付着することが明らかになり、Ｐドメインが主にＨＥＶの抗原性を有することが実験的に示された。Ｍａｂ４は、チンパンジーのｃｏｄａライブラリーからファージディスプレイにより単離されたＯＲＦ２タンパク質に対するチンパンジー抗体である（Schofield, D. J. et al., J Virol 74:5548-5555 (2000)）。これは天然ＨＥＶウイルス粒子およびアミノ酸５９７〜６０７を含む組み換えＰＯＲＦ２ペプチドに結合する（Schofield, D. J. et al., Vaccine 22:257-267 (2003)）。本発明者らはＨＥＶ／Ｍａｂ４の構造のフィッティングを行ったが、Ｆａｂ断片に対応する密度はアミノ酸６０６の位置を網羅したものの、決定的なＭａｂ４の結合配向を提供するためにはＭａｂ４の密度は弱すぎた（データ未提示）。ウェスタンブロットにおいて、Ｍａｂ２２４がアミノ酸６０１〜６０８を欠如したペプチドと反応しないように見える理由は不明であるが、Ｍａｂ２２４の結合部位は、変異誘発によって以前に判定された決定的な抗原性残基に一致する。荷電した残基であるＥ４７９、Ｋ５３４のアラニンへの、同様に疎水性アミノ酸Ｙ４８５およびＩ５２９のアラニンへの点突然変異により、中和抗体による反応性が選択的に抑止され得ることが見出された（Li, S. et al, PLos Pathog. 5:el000537 (2009)）。変異体の別のセットにより、抗体が認識する残基と同じ領域が、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦにわたって広がることが示唆された（Yamashita, T. et al, Proc Natl Acad Sci USA 106:12986-12991 (2009)）。この中和部位は受容体結合部位と部分的に重複し、ここで結合した抗体がＨＥＶ ＶＬＰの細胞表面への付着を阻止する空間的な障害を作り出す（Yamashita, T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 106: 12986-12991 (2009)）。両実験で使用した抗体は中和活性を有し；それ故に、モノクローナル抗体Ｍａｂ２２４は、その結合部位がＨＥＶを優位に中和する表面の一部であることから、おそらく中和抗体である。
外来エピトープの挿入部位
ウイルス様粒子（Virus-like particles：VLPs）は、ウイルス粒子の全体構造を模倣した高度に組織化されたカプセルであることから、小分子、ペプチド抗原性エピトープ、およびその他の疾病を標的とする異種起源のＤＮＡワクチンを同時に輸送するための強固な積荷の一つである。このアプローチは、外来エピトープの結合における合理的な設計を可能にする、ＶＬＰについての優れた構造情報に依存する。以前に結晶構造が未知の状態で、ＰＯＲＦ２において６の挿入部位が選択された。それらはＮおよびＣ末端、ならびに４の内部部位である。内部部位は、残基Ａ１７９、Ｒ３６６、Ａ５０７、およびＲ５４２の後に位置する。Ａ１７９およびＲ３３６の部位に挿入を有する融合タンパク質は、ＶＬＰ産生に完全に失敗し、Ａ５０７およびＲ５４２に挿入を有するものは、ペプチド発現には影響することなく、ＶＬＰ産生を大きく減少させた（Niikura, M. et al., Virology 293:273-280 (2002)）。結晶構造により、これらの内部挿入は、不適切な空間的位置にあることが明らかになった。残基Ａ１７９はα−へリックスの中央のＳ１ドメインに位置し、一方でα１へリックスの完成度がＳ１ドメインの完全性に必要であることから、その２回軸に関連する隣接するサブユニットと相互作用する（図１６Ｃ）。Ｒ３６６はＳ２ドメイン内に位置し、その３回軸に関連する隣接するサブユニット由来の残基Ｅ３８６との静電気的な相互作用を促進する（図１６Ｄ）。Ｐドメインに位置するものの、Ｒ５４２の側鎖は二量体の接触面内にあり、二つの単量体の疎水性相互作用を導く（図１６Ｄ）。Ｒ５４２の後への挿入により、二つのＰドメインの配向が誤配列され、ＰＯＲＦ２タンパク質の二量体相互作用が弱くなる可能性がある。Ｐドメインにおける残基Ａ５０７の役割は、長いプロリンリッチなヒンジに対する角度を固定することにより、Ｐドメインの配向を維持することである（図１６Ｃ）。４残基のうちのいずれもＶＬＰの表面に露出していないが、それらの幾つかは個別のＰＯＲＦ２サブユニットの表面にある（図１６）。従って、これらの部位への外来配列の挿入により、個々のタンパク質の発現への干渉は誘導されないが、ＨＥＶ ＶＬＰの集合への障害は起こる。結晶構造により、Ｃ末端はＶＬＰの表面に露出し、Ｎ末端はＶＬＰの中心へ向かうことが明らかになった。従って、これらの二つの部位における挿入によりＶＬＰの集合は阻害されないが、Ｃ末端がＶＬＰの外表面に露出していることから、粗大な外来抗原配列を係留するためにはより適している（図１７）。
キメラＨＥＶ ＶＬＰ／ＣタグのクライオＥＭ構造により、スパイク側面のＢ細胞タグの位置は、残基Ａ６０６（Ｃ末端）からあまり離れていないことが示唆された（図１７Ａ）。この密度はＭａｂ２２４結合部位の真下で飽和していたが、Ｍａｂ４の潜在的な結合部位と重複していた。結果として、Ｂ細胞の１１アミノ酸の挿入により、ＨＥＶ抗原性部位がホストの免疫系に対して部分的に開かれ得る。このことは、感染したマウスが、キメラＶＬＰ／Ｃタグを経口投与された後で、ＨＥＶおよび外来エピトープの両方に対する抗体を産生できる理由を説明する。
結論として、ＰＯＲＦ２のＣ末端への外来エピトープの挿入は、ＨＥＶ抗原性ドメインへの到達性に介入しない。従ってキメラＨＥＶ ＶＬＰは、ＨＥＶおよび標的となる疾病の両方に対する抗体を誘導できる。現在、組み換えＯＲＦ２ ＶＬＰは第２相のワクチン臨床試験下にあることから（２６）Ｔ＝１ ＨＥＶ ＶＬＰは経口送達において重要な役割を果たすであろう。
実施例４
Ｅ型肝炎ウイルス粒子サイズ粒子の、ＲＮＡ依存性集合経路に対する構造的基礎
Ｅ型肝炎ウイルス（Hepatitis E virus：ＨＥＶ）はヒトに急性肝不全を誘導し、妊婦における致死率は高い。ＨＥＶ天然カプシドの集合過程を理解するための、抗ＨＥＶについての研究が必要とされている。ここで本発明者らは、比較構造解析のために、Ｎ末端の１１１残基を有するかまたは有さないＨＥＶカプシドタンパク質それぞれを昆虫細胞内に発現させることによって、大ウイルス粒子サイズ、および小Ｔ＝１のカプシドを産生した。ウイルス粒子サイズのカプシドはＴ＝３正二十面体格子を示し、ＲＮＡを含まないＴ＝１カプシドとは対照的にＲＮＡ断片を含む。しかしながら、両方のカプシドは共通の十量体構成を共有していた。in vitro集合により、ＨＥＶカプシドタンパク質は十量体の中間体を形成する内在的な能力を持つことがさらに示された。本発明者らのデータにより、ＲＮＡ結合は、ＨＥＶ天然カプシドの集合に必須の外的因子であることが示唆される。
ヒトにおける急性肝炎の原因媒介物であるＥ型肝炎ウイルス（Hepatitis E virus：ＨＥＶ）は、主に汚染水を通して伝染され、一般に多くの発展途上国において流行病の激増をもたらす。ＨＥＶ流行地での大流行の間に、かつ非流行地で、散発例もまた報告されており、これらの症例は人畜共通経路により伝染されていた。大流行の間のＨＥＶによる全体的な死亡率は一般に１ないし１５％の範囲であり、最も高い死亡率は妊婦に見られ、その致死率は３０％に達する（Naik, S. R. et al, Bull World Health Organ 70, 597-604 (1992)）。
ＨＥＶは、エンベロープを持たない正二十面体カプシド、および三つの翻訳領域（open reading frames：ＯＲＦｓ）をコードする〜７．２ｋｂの一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムから成る（Tarn, A. W. et al., Virology 185, 120-131 (1991)）。ＯＲＦ２によりコードされるカプシドタンパク質は６６０アミノ酸により構成され、ウイルス粒子の集合、ホストとの相互作用、および免疫原性のようなほとんどのカプシド関連機能に関与する。その他の肝炎ウイルスと同じように、ＨＥＶは現在利用できる細胞系で増殖させることはできず、ＨＥＶの研究の大部分は組み換えＨＥＶカプシドタンパク質に頼っている（Schofield, D. J. et al., Vaccine 22, 257-267 (2003); Li, T.-C. et al., Vaccine 22, 370-377 (2004); Purdy, M. A. et al., J Med Virol 41, 90-94 (1993); Riddell, M. A. et al., J Virol 74, 8011-8017 (2000)）。ウイルス様粒子（Virus-like particle：ＶＬＰ）は、Ｃ末端から５２残基およびＮ末端から１１１残基を欠失した切断型ＨＥＶカプシドタンパク質を昆虫Ｔｎ５細胞に発現させることで得られた（ＰＯＲＦ２）（Li, T. C. et al., J Virol 71, 7207-7213 (1997)）。本発明者らの以前の、クライオ電子顕微鏡（クライオＥＭ）を用いたこのＨＥＶ−ＶＬＰの構造解析によってＰＯＲＦ２の四次的な配置の基本的な理解が提供され、ここで、再構成されたＶＬＰは６０コピーのＰＯＲＦ２から構成されるＴ＝１正二十面体粒子を示した（Xing, L. et al., Virology 265, 35-45 (1999)）。ＰＯＲＦ２タンパク質のＴ＝１ ＶＬＰ集合に必須のエレメントには、アミノ酸１２５〜６００が含まれる（Li, T.-C. et al., J. Virol. 79, 12999-13006 (2005)）。最近、構造的な情報は遺伝子型３のＴ＝１ ＶＬＰ（Yamashita, T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 106, 12986-12991 (2009)）および遺伝子型４のＴ＝１ ＶＬＰ（Guu, T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 106, 12992-12997 (2009)）の結晶構造によりさらに改良され、ＰＯＲＦ２の三次構造がアミノ酸のレベルで明らかにされた。しかしながら、免疫ＥＭで判定されたように、これらの実験で用いられたＴ＝１ ＶＬＰは、直径３２０〜３４０Åである天然ウイルス粒子よりもはるかに小さかった（Balayan, M. et al., Intervirology 20, 23-31 (1983)）。ＨＥＶカプシドの集合経路についての研究は、なお必要とされている。
本発明者らは以前に、ＨＥＶウイルス粒子は１８０コピーのカプシドタンパク質から作られ得るという仮説を立てた（Xing, L. et al., Virology 265, 35-45 (1999)）。この仮説を検証するため、本発明者らはＨＥＶ遺伝子型の発現についてスクリーニングを行い、ＨＥＶ遺伝子型３ ＯＲＦ２タンパク質からＣ末端の５２残基を欠失させた後で、ウイルス粒子サイズのＶＬＰを産生することに成功した。このＶＬＰにより、ＨＥＶウイルス粒子の集合を決定する分子相互作用の研究が可能になった。
実験手順
ＨＥＶ−ＶＬＰの産生ならびにin vitroでの解体および再集合
以前に記載されたプロトコルに従い、ＨＥＶ−ＶＬＰを産生および精製した（Li, T. C. et al., J Virol 71, 7207-7213 (1997)）。簡単に述べると、遺伝子型３ ＨＥＶ−ＯＲＦ２タンパク質の残基１４ないし６６０をコードする組み換えバキュロウイルスを構築した（Liらにより投稿準備中）。Ｔｎ５細胞に組み換えバキュロウイルスを５のＭ．Ｏ．Ｉにて感染させ、６日間培養した。上清を回収し、複数回の超遠心分離法、およびそれに続くＣｓＣｌ密度勾配における分離によってＶＬＰを精製した。最終ペレットを、１０ｍＭ カリウム−［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］（ＭＥＳ）緩衝液、ｐＨ６．２、に再懸濁した。解体および再集合実験には、少量のサンプル（２０〜４０μｌ）の透析が可能であることから自家製の透析装置を用いた。精製したＶＬＰを、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）およびＤＴＴ（２０ｍＭ）を含む緩衝液に対する、様々なｐＨでの透析によって破壊した。ＶＬＰの解離後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中の１５０ｍＭ ＮａＣｌを加え、試料を二価イオンのＣａ２＋（２０ｍＭ）の存在下で１時間インキュベートした後、電子顕微鏡で観察した。
ＨＥＶ−ＶＬＰの走査透過型電子顕微鏡による解析
ブルックヘブン国立研究所ＳＴＥＭ施設（Brookhaven National Laboratory STEM facility）において、ＴＭＶを内部コントロールとして走査型ＴＥＭを行った。ＶＬＰとＴＭＶの混合物を液体窒素中で素早く凍結し、データ収集の間、汚染を排除し、かつ質量の減少を少なくするために、−１５０℃に維持した。検体を０．２５ｎｍのサイズで４０ｋｅｇの電子ビームにより走査し、大角および小角検出器の両方に対し、１０のプリアンプ増幅率によってイメージを収集した（Wall, J. S. et al., Methods Cell Biol. 53, 139-164 (1998)）。イメージを１０Åのピクセルサイズで記録し、PCMass29プログラム（Brookhaven National Lab http://www.biology.bnl.gov/stem）によって解析した。バックグラウンドを標準化した後、プログラムにより提供されるＭＳＶ殻モデルによってＶＬＰの質量を選択した。ＴＭＶおよびＨＥＶ−ＶＬＰの質量測定は、常に同じイメージから行った。ＨＥＶ−ＶＬＰの質量はＭＤａ（粒子あたりの質量）において測定し、ＴＭＶの質量はＫＤａ／Å（単位長さ当たりの質量）において測定した（Wall, J. S. and Simon, M. N., Methods MoI Biol. 148, 589-601 (2001)）。
ＨＥＶ Ｔ＝３ ＶＬＰのクライオ電子顕微鏡による構造決定
イメージ再構成のためのクライオＥＭデータの収集は、２００ｋＶにおいて、以前に詳述された手順に従って操作されるJEOL JEM-2100F TEMによって行った（Xing, L. et al., Virology 265, 35-45 (1999)）。簡単に述べると、Ｅ３３０Ｋカプシドまたは再集合したＯＲＦ２複合体を含む３μｌの溶液を、穴あきのカーボンフィルムコートされた銅グリッド上に置き、余分な液体を除去した後、液体エタン内へ素早く入れた。ＶＬＰをガラス状の氷の薄層内に包埋し、Gatan 636クライオトランスファーシステムを用いてＥＭ内に移した。検体を５０，０００ｘの倍率で観察し、関心のある範囲をTVIPS CCDカメラ（TemCam-F415）で記録した。顕微鏡像を、検体空間における２．０Åのピクセルサイズ、および０．７〜３．５Åのデフォーカスレベルによって記録した（図２６ａ）。無非点収差またはドリフトの無いデジタルイメージを、後のイメージプロセシングのために選択した。次に個々のＨＥＶ Ｔ＝３ ＶＬＰイメージを四角で囲み、正二十面体粒子のために確立されたソフトウェアパッケージを用いて処理した（Baker, T. S., and Cheng, R. H. (1996) J Struct Biol 116, 120- 130; Ji, Y. et al., J Struct Biol 154, 1-19 (2006)）。総数７７２０の個々のイメージが処理され、それらのデフォーカスレベルは主に１．０〜２．５Åに分布していた。
ＣＴＦ（contrast transfer function：コントラスト伝達関数）効果を補正するため、組織内でのプログラムにより、各イメージの位相を反転させた。密度マップは、最初に、１８１２の個々のイメージを１４Åの有効分解能に対して組み合わせることによって再構成した。次に、新しいデータを加える一方で、マップ再構成の間に振幅補正を適用した。最終的な密度マップは４３４８の個々の粒子のイメージを組み合わせることによって再構成され、最終的な分解能は、０．５のカットオフ値を用いるフーリエシェル相関によって１０．６Åと算定された（図２６ｂ）。
Ｔ＝１結晶構造のＴ＝３クライオＥＭ密度マップへのドッキングは、最初にプログラムＯを用いて用手により行い（Jones, T. A. et al., Acta crystallogr. Sect. A 47, 110-119 (1991)）、次にSitusソフトウェアパッケージを用いて改良した（Chacon, P. and Wriggers, W., J MoI Biol 317, 375-384 (2002)）。最初のフィッティング、および精密化過程の間に、ＰＯＲＦ２単量体を剛体として扱った。
Ｔ＝１ ＨＥＶ−ＶＬＰのＸ線結晶構造決定
以前に記載された方法に従い、ＶＬＰの結晶化を行った（Wang, C. Y. et ah, Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 318-322 (2008)）。結晶を液体窒素中で直接急速冷凍して、Ｘ線回折実験を行った。ＨＥＶ−ＶＬＰの結晶についての全てのｘ線実験は、兵庫県、日本のSPrin-8で行った。単位細胞内の粒子配向を、自己回転機能（Blow, D. M. et al., J MoI Biol 8, 65-78 (1964)）により決定し、粒子位置は、クライオＥＭ構造をモデルとする並進探索により決定した。非対称の結晶単位は一個の粒子を含むため、結果的に６０回非結晶学的対称（non-crystallographic symmetry：ＮＣＳ）の平均化を実行した。データＩの初期位相を得るため、クライオＥＭ構造（Xing, L. et al., Virology 265, 35-45 (1999)）を用い、ＮＣＳ平均化のために用いるエンベロープ（マスク）を作成した。位相は、正二十面体対称エレメントにより平均化した実空間電子密度および溶媒平滑化により改良した。分解能は次第に８．３Åに拡大した（Ｒ因子＝０．２１、相関係数［correlation coefficient：ＣＣ］＝０．９２）。この構造をデータＩＩの位相決定に用い、位相は改良されて３．８Åの分解能へ拡大した（全体的なＲ因子およびＣＣはそれぞれ０．１８と０．９７であった）。
６０の正二十面体関連Ｓサブユニットを同一のものとして扱い、精密化の間に厳格なＮＣＳの制約を適用した。分解能の範囲が２０〜３．８Åのデータを精密化に使用した（表２および図２７）。さらなる位置的な、およびＢ因子の精密化と、それに続くモードの用手による修正によって、０．２４２のＲ因子（ＲＦｒｅｅ＝０．２４５）が、合理的な立体化学（結合の長さおよび結合角における二乗平均平方根［root mean square：ｒｍｓ］偏差がそれぞれ０．０１０Åおよび１．６８°）と共に得られた。高いＮＣＳのため、Ｒ因子およびＲＦｒｅｅ因子はほとんど同一であった。精密化の後で、構造の立体化学をProcheck（Laskowski, R. A. et al., J Biomol NMR 8, 477-486 (1996)）により点検し：非グリシン残基の９８．１％が、ラマチャンドランプロットの最も好ましい領域およびさらなる許容領域内にあり、追加の領域に残基は見られなかった。原子構造表示は、MolScript（Kraulis, P., JAppl. Crystall. 24, 946-950 (1991)）およびRaser3D（Merritt, E. A. and Murphy, M. E. P., Acta Crystall. Sec D 50, 869-873 (1994)）を用いて作成した。
結果
走査透過型電子顕微鏡（Scanning transmission electron microscopy：ＳＴＥＭ）
遺伝子型３のＯＲＦ配列を昆虫細胞に発現させ、ウイルス粒子サイズのＨＥＶ−ＶＬＰを回収した。このＶＬＰは、直径〜４０ｎｍの球状のイメージとして投影され、Ｔ＝１ ＶＬＰ（直径２７ｎｍ）よりも大きかった（図１８ａ）。クライオ電子顕微鏡像では、ＨＥＶ−ＶＬＰのイメージはスパイク様の特色を施されており、対照的に均一であった（図１８ｂ）。
大ＨＥＶ−ＶＬＰの組成を決定するため、ＥＭグリッド上のＶＬＰのような対象から散乱する電子の量を測定する技術であるＳＴＥＭを用いて、質量測定を行った。ＳＴＥＭによる質量測定のため、精製した大および小ＨＥＶ−ＶＬＰの混合物をＥＭグリッド上へ凍結乾燥した。質量対長さの比が既知であるタバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus：ＴＭＶ）を内部標準として用いた。ＨＥＶ−ＶＬＰは、暗視野のＳＴＥＭイメージに対比する白い球状の投影を見せた（図１８ａ）。背景に白い雲様の物体が存在するが、これは試料保存の間に破損したＶＬＰである可能性がある。粒子あたりの平均ＶＬＰ質量に対する単位長さあたりの平均ＴＭＶ質量のプロットを作成するため、イメージ内の大ＶＬＰおよびＴＭＶの平均質量を測定した（図１８ａ）。一次適合を算出し、大ＨＥＶ−ＶＬＰの質量を１１．８ＭＤａと決定した（図１８ｄ）。大ＶＬＰから回収された遺伝子型３ ＯＲＦ２タンパク質の質量は、マススペクトロメトリーにより６５．５ＫＤａと測定された（図１８ｃ）。従って、ＨＥＶの大ＶＬＰは１８０コピーのＯＲＦ２タンパク質を含むことから、大ＨＥＶ−ＶＬＰはＴ＝３ 正二十面体粒子（Ｔ＝３ ＶＬＰ）であることが示唆される。
HEVウイルス粒子サイズである粒子の三次元再構成
大ＨＥＶ−ＶＬＰのクライオＥＭ構造により、完全な正二十面体殻上に９０の突起スパイクが明らかにされ（図１９ａ）、これはＴ＝３ 正二十面体対称およびＳＴＥＭ質量測定の結果に一致する。三次元密度マップから測定されたように、ＶＬＰの全体的な直径は４１０Åであり、中心腔の半径は１７０Åであった（図１９ｃ）。単層カプシドは１８０コピーのＯＲＦ２タンパク質を含み、これは幾何学的環境によって三つの独特な単量体にグループ化された。単量体ＡおよびＢは、各５回軸の周辺で二量体スパイクを形成したが（Ａ−Ｂ二量体）、２回軸関連の二つのＣ単量体は、各正二十面体２回軸においてスパイクを形成した（Ｃ−Ｃ二量体）（図１９ｂ）。大ＨＥＶ Ｔ＝３ ＶＬＰにおけるＯＲＦ２タンパク質の表面格子は、カリシウイルスのカプシド配置と同様であった。Ａ−Ｂ二量体に比較して、ＨＥＶＣ−Ｃ二量体の形態は、おそらく正二十面体殻に向かって突出するドメインの角度の柔軟性のために、よく定義されていない。
Ｔ＝３ ＶＬＰの密度マップにより、赤道面から５２Åの部分に、外側から内側へＰ、Ｓ２、Ｓ１、およびＮと命名された４個の別々のドメインが示された。（図１９ｃ）。Ｐ、Ｓ２、およびＳ１ドメインの密度プロファイルは、Ｔ＝１ ＨＥＶ−ＶＬＰに観察されたそれからの変動が少なく、かつＴ＝１ ＰＯＲＦ２タンパク質の結晶構造のＴ＝３ ＨＥＶ−ＶＬＰの密度マップへのドッキングは、二つの構造間の非常に良好な一致を示した（図１９ｄ）。カプシドの内部表面におけるＰＯＲＦ２タンパク質のＮ末端に位置するドッキングはＴ＝３ ＶＬＰにおける密度リンカーとよく揃っていた（図１９ｄ）。Ｎドメインと正二十面体カプシドとを結合するタグとなるリンカー密度により、Ｔ＝３ ＨＥＶ−ＶＬＰにおけるＯＲＦ２タンパク質のＮ末端１１１アミノ酸の位置が示される。
遺伝子型１ Ｔ＝１ ＨＥＶ−ＶＬＰの結晶構造
切断型の遺伝子型１カプシドタンパク質（残基１１２〜６０８を含むＰＯＲＦ２）の結晶構造は、三つのドメインＳ１、Ｓ２、およびＰに分けることができ、残基５５５〜５６０を網羅する領域についてはよく解明されていない。残基１１８〜３１７により形成されるＳ１ドメインは、多くのＴ＝３ウイルス性カプシドタンパク質に観察される、ゼリーロールモチーフを有する古典的な８本鎖βバレルへ折り畳まれる（図２０ａ）（Rossmann, M. G. and Johnson, J. E., Ann Rev Biochem 58, 533-573 (1989); Harrison, S. C, Curr Opin Struct Biol 11, 195-199 (2001)）。ユニークなことには、三つのさらなる短いαへリックスが、Ｓ１ドメインにおけるＥ鎖とＦ鎖の間およびＧ鎖とＨ鎖の間に観察された。カプシド殻は主に、Ｓ１ドメイン間でのサブユニット間相互作用によって安定化される。残基３１８〜４５１から成る折り畳まれたＳ２ドメインは、Ｂ’鎖とＣ’鎖の間のαへリックスを有するねじれた逆平行βシートであった（図２０ａ）。残基４５２〜６０６から構成されるＰドメインは、逆平行βシートのＦ”Ａ”Ｂｂ”およびＢａ”Ｅ”Ｄ”Ｃ”から構成されるβバレルへ折り畳まれ（図２０ａ）、長いプロリンリッチなヒンジ（残基４５２〜４６１のＰＴＰＳＰＡＰＳＲＰ）を通じてＳ２ドメインに結合した（図２０ａ）。Ｓ２およびＰドメインの両方はＳ１ドメインの上に存在するが、ＨＥＶクライオＥＭマップの突起スパイクはＰドメイン密度のみを含むことが、カリシウイルスとの明確な違いである（図２５）。ＰＯＲＦ２二量体は、主にＰドメイン間であるという理由から、単量体間に最も大きな埋没表面領域（buried surface area：ＢＳＡ）（５，９００Å２）を有する（図２０ｂ）。ＢＳＡは３回軸および５回軸周辺それぞれで、二つの隣接するＰＯＲＦ２サブユニットについて３，４００Å２および１６００Å２である（図２０ｂ）。さらに、３回軸周辺の第３の分子のＢＳＡ（９，５００Å２）は、５回軸周辺のもの（４，７００Å２）よりもかなり広い。
遺伝子型１のＰＯＲＦ２と、遺伝子型３（Yamashita, T. et al, Proc Natl Acad Sci USA 106, 12986-12991 (2009)）および遺伝子型４（Guu, T. et al, Proc Natl Acad Sci USA 106, 12992-12997 (2009)）のＰＯＲＦ２との配列アラインメントにより、Ｓ１ドメインは、Ｎ末端領域に大きな相違が見られたものの、ＨＥＶ遺伝子型の間で最も保存された領域であることが明らかになった（図２４ａ）。解析された構造のうち、遺伝子型３はＮ末端において柔軟に見え、かつ他よりも１１アミノ酸ほど短かった（図２４ｂ）。アミノ酸１１８〜１２９は、Ｔ＝３ ＶＬＰにおいてＮからＳ１ドメインへの橋渡しに重要な役割を果たしており、かつドッキングの整合（docking registers）に役立つことから、遺伝子型１の結晶構造をＴ＝３クライオＥＭ密度マップの解読のために用いた。
Ｔ＝３およびＴ＝１ ＨＥＶ−ＶＬＰ間の一貫した二量体間相互作用
Ｔ＝１とＴ＝３集合の間でのＯＲＦ２タンパク質移行の機構を理解するため、Ｔ＝１の十量体と六量体とをＴ＝３のクライオＥＭ密度マップへドッキングした。Ｔ＝１ ＶＬＰの十量体は、５回軸周辺の５の二量体に対応する、１０の隣接するＰＯＲＦ２単量体から成ったが、一方でＴ＝１六量体は、３回軸周辺の３の隣接する二量体に対応した。六量体とは異なり、ＰＯＲＦ２十量体の座標は、５回軸頂点におけるＴ＝３密度マップの屈曲（図２１ａ）およびドメイン分離（図２１ｂ）に非常によく適合した。３回軸におけるＴ＝３カプシドの屈曲は、二量体の一つがクライオＥＭ密度マップの外部に張り付いているように見えることから、ＰＯＲＦ２六量体の座標とは一致しなかった（データ未提示）。それに加えて、Ｓ２／Ｓ１ドメインに対する、Ｃ−Ｃ二量体のＰドメインの配向は、Ａ−Ｂ二量体のそれとは９０゜異なっていた（図２２）。このことにより、Ｔ＝３正二十面体におけるＡ−Ｂ二量体の間の分子相互作用は、Ｔ＝１正二十面体の集合における二量体−二量体相互作用に一致するが、Ａ−Ｂ二量体とＣ−Ｃ二量体の間の相互作用は、Ｔ＝３集合に対して独特であることが示唆される。
ＯＲＦ２タンパク質のin vitroでの再集合
Ｔ＝３ ＶＬＰ集合におけるＯＲＦ２十量体の役割を理解するため、ＨＥＶ−ＶＬＰの自己集合過程をin vitroで解析した。キレート剤（ＥＤＴＡ）および還元剤（ＤＴＴ）の組み合わせが、高アルカリ環境（ｐＨ１０）において、ＯＲＦ２タンパク質を変性させることなくＴ＝３ ＶＬＰを解体することが見出された（データ未提示）。解体溶液への２０ｍＭ ＣａＣｌ２の添加によってＯＲＦ２二量体の星型の複合体への会合が誘導され、リフォールディングされたＶＬＰは見出されなかった（図２１ｃ）。星型の複合体について調べたところ、二つの対立する頂点間の距離が、ＴＭＶの直径に近い〜１８ｎｍであることが見出された（図２１ｃ）。このサイズは、ＰＯＲＦ２十量体について測定したものと一致した。従って、星型の複合体は、外見のみではなくサイズもＯＲＦ２十量体に似ていた（二量体の五量体）。３回軸周辺の全体的なＢＳＡは５回軸周辺のものよりも大きかったが、ＰＯＲＦ２六量体に適合し得るいずれの複合体も見出せなかった。
in vitroでの解体および再集合により、Ｔ＝３ ＶＬＰ集合の一因となる、ＯＲＦ２タンパク質以外因子が示唆される。ＯＲＦ２のＮ末端の１１１アミノ酸が電気的に陽性であることを考慮して、Ｔ＝３およびＴ＝１ ＶＬＰ両方からの核酸抽出を行った。電気泳動の結果により、Ｔ＝３抽出物中に核酸の存在が示されたが、Ｔ＝１ ＶＬＰ抽出物中に核酸は見られなかった（図２１ｄ）。抽出された核酸はＲＮａｓｅ処理に感受性であり、かつＤＮａｓｅ処理に抵抗性であったことから、Ｔ＝３ ＶＬＰは集合の間にカプシド内にＲＮＡ断片を含んだことが確認されたが、Ｔ＝１ ＶＬＰにＲＮＡ断片は含まれなかった。この結果は、クライオ電子顕微鏡像で観察されたＶＬＰプロファイルに一致する。
考察
Ｅ型肝炎ウイルスは、急性肝不全の原因となるヒトの病原体である。その他の肝炎ウイルスと同じように、ＨＥＶは現在利用できる細胞技術によって増殖させることはできない。遺伝子型３ ＨＥＶのカプシドタンパク質は、Ｔ＝１ ＶＬＰへ自己集合するアミノ酸１１２〜６０８を含むＰＯＲＦ２タンパク質として、およびＴ＝３ ＶＬＰを形成するアミノ酸１〜６０８を含むＯＲＦ２タンパク質として、昆虫細胞内に発現させることができる。
ＰＯＲＦ２の結晶構造により、三つの機能的ドメインＳ１、Ｓ２、およびＰが明らかにされ、各ドメインの機能によってその配列柔軟性が限定された。Ｓ１ドメインはＳ２およびＰドメインを配置するための基礎となる正二十面体殻を形成したことから、サブユニット表面は遺伝子型の間で高度に保存される必要がある。Ｓ１ドメインはＨＥＶ遺伝子型の間で最も保存された領域であると同定され、配列アラインメントはこの機能に非常によく一致していた（Zhai, L. et al., Virus Res 120, 57-69 (2006)）。Ｐドメインは中和抗体および細胞受容体の両方に対する推定される結合部位であり（He, S. et al., J Gen Virol 89, 245-249 (2008)）、４の遺伝子型にわたって１９の異なるアミノ酸を含む（図２４ａ）。これらのアミノ酸のうちの９のみがＰドメインの表面に露出していた。クライオＥＭ密度マップにおける抗体の結合フットプリントの点検により、抗体が結合する接触面内には１個のアミノ酸のみが埋まっていたことが示された（Wangらにより投稿準備中）。このことにより、ＨＥＶ遺伝子型の間での配列変動にもかかわらず、ＨＥＶ血清型が多岐にわたっていない理由が説明される。配列の可変性とドメインの機能性の間の直接の相関関係が、ＨＥＶカプシドが複数の機能を有し、かつ間違いの無い集合を保障するために必要であろう。このことはまた、ＨＥＶ−ＶＬＰのＴ＝３からＴ＝１格子への移行によってその抗原性が妨害されない理由、およびＴ＝１ ＶＬＰが外来抗原性エピトープ（Niikura, M. et al., Virology 293, 273-280 (2002)）またはＤＮＡプラスミド（Takamura, S. et al., Gene Ther 11, 628-635 (2004)）を運搬するためにin vitroで解体および再集合できる理由も説明する。
Ｔ＝３ ＨＥＶ−ＶＬＰはカリシウイルスのそれと同様の形態を持ち、ＨＥＶ Ｓ２ドメインのフォールディングはカリシウイルスのＰ１ドメインのフォールディングと同様であるが、ＰＯＲＦ２の結晶構造によってＳ２ドメインの特徴的な配置が明らかになった（図２５）。ＨＥＶでは、ＰドメインはＳ２ドメインのＣ末端に位置するが、カリシウイルスのＰ２ドメインはＰ１ドメインのＡ’鎖とＢ’鎖の間の領域に挿入される（Chen, R. et al, Proc Natl Acad Sci USA 103, 8048-8053 (2006); Prasad, B. V. V. et al, Science 286, 287-290 (1999)）。さらに、ＨＥＶのＳ２ドメインはＳ１ドメインと強く相互作用し、長いプロリンリッチなヒンジを通じてＰドメインに結合するが、カリシウイルスのＰ１ドメインは突起スパイクのサブドメインである（図２５）。このことはＶＬＰの安定性に影響するようである：クライオＥＭ構造において、ＨＥＶ ＣサブユニットのスパイクはＡ−Ｂ二量体のそれに比較してあまり明確ではないように見えるが、ノーウォークウイルス（Norwalk virus：ＮＶ）のＣサブユニットは強固で、かつＡ−Ｂ二量体のそれと同様に見える（Prasad, B. V. V. et al., JMol Biol 240, 256-264 (1994)）。加えて、ＮＶカプシドタンパク質は２０アミノ酸の短いＮ末端のみを含むため、ＮＶカプシドタンパク質からＮ末端の陽性に荷電したアミノ酸を欠失させてもＴ＝１ ＶＬＰは誘導されない（Bertolotti-Ciarlet, A. et al., J. Virol. 76, 4044-4055 (2002)）。
Ｓ２／Ｓ１ドメインに対するＰドメインの配向において、ＨＥＶ Ｃ−Ｃ二量体はＨＥＶ Ａ−Ｂ二量体とは大きく異なっている。（図２２）。Ａ−Ｂ二量体とＣ−Ｃ二量体の間の立体構造的な相違は、以前にトマトブッシースタントウイルス（tomato bushy stunt virus：ＴＢＳＶ）およびその他のＴ＝３ウイルスについて報告されてきた。ＴＢＳＶでは、Ａ−Ｂ二量体からＣ−Ｃ二量体を区別するためにＲＮＡの結合が重要な役割を果たす。Ｃ−Ｃ二量体のＮ末端アームはよく秩序立っており、ＲＮＡゲノムと相互作用するが、Ａ−Ｂ二量体は無秩序で、ＲＮＡと相互作用しない（Timmins, P. A. et al., Structure 2, 1191-1201 (1994)）。フロックハウスウイルスでは、Ｃ−Ｃ二量体の接触によってＲＮＡ二本鎖を収容するための平坦な立体構造が得られるが、Ａ−Ｂ二量体は屈曲した立体構造であり、ＲＮＡを含まない（Fischer, A. and Johnson, J. E., Nature 361, 176-179 (1993)）。ＨＥＶ Ｃ−Ｃ二量体とＡ−Ｂ二量体の間で観察される配向の違いは、ＲＮＡ占有の違いに起因する可能性がある。Ａ−Ｂ二量体はＲＮＡと相互作用せず、屈曲した立体構造を持つ。結果として、Ｓ２／Ｓ１ドメインの曲がった接触によって、Ｔ＝１ ＶＬＰと同様に、プロリンリッチなヒンジがＶ型の間隙内に収容されることでＰドメインの配向が強化される（図２２ｃ）。対照的に、ＲＮＡとの接触によってＣ−Ｃ二量体は平坦な立体構造に導かれ、ヒンジは間隙の外に押し出される。従って、Ｃ−Ｃ二量体におけるＰドメインは柔軟で、かつＡ−Ｂ二量体の配向から９０°回転することができる（図２２ｄ）。
分子シミュレーションにより、Ｔ＝３正二十面体カプシド集合は、予め形成された中間体の凝集を組み合わせる機構を利用することが示唆され、これは主に単量体の添加を含むＴ＝１正二十面体カプシドの形成とは対照的である（Ngyyen, H. D. et al, JAm Chem Soc. 131, 2606-2614 (2009)）。それ故、ＯＲＦ２の十量体はＴ＝３ ＨＥＶカプシドの中間体が集合したものであり、各５回軸頂点に位置する。正二十面体の３回軸位置における六量体環の出現はＴ＝３カプシド集合における決定的な工程であり、Ｃ−Ｃ二量体に依存する。in vitroでの解体および再集合はまた、Ｔ＝３ ＶＬＰの集合においてＯＲＦ２タンパク質以外の外的な因子の関与も示し、Ｃ−Ｃ二量体はＲＮＡ結合に付随する平坦な立体構造を取る。Ｃ−Ｃ立体構造の誘導については、バクテリオファージＭＳ２を用いて報告されており、ここでカプシドの完全な集合には合成ＲＮＡ断片の存在が必要とされる（Stockley, P. G. et al., J MoI Biol 369, 541-552 (2007)）。従って、ＲＮＡとＯＲＦ２のＮ末端との相互作用は、Ｃ−Ｃ二量体を平坦な構造へ導き、最終的には３０コピーのＣ−Ｃ二量体と１２コピーのＡ−Ｂ十量体の統合を通じた完全なカプシド形成を導く駆動力である（図２３）。
Ｎ末端の１１１アミノ酸の存在は、ＯＲＦ２タンパク質によるＴ＝１ ＶＬＰの形成を阻止する。平均タンパク質密度を１．３０ｇ／ｍｌとみなした場合、Ｔ＝１ ＶＬＰのカプシドは、ＰＯＲＦ２タンパク質の各コピーにおいて、最大５５の付加残基を許容する容量を持つ中心腔を封入する。ＨＥＶ Ｔ＝３ ＶＬＰの中心腔の直径は約３４０Åであり、これはＨＥＶゲノムおよびＯＲＦ２のＮ末端ドメインの両方を収容するには十分である。カプシド内に含まれるＲＮＡのサイズおよびＮ末端配列を特徴付けることにより、本発明者らは、Ｔ＝３ ＨＥＶ ＶＬＰがＯＲＦ２タンパク質の配列をコードするＲＮＡ断片をカプシド内に選択的に含んだことを見出した（Liらにより、投稿準備中）。従って、天然ＨＥＶカプシドがＴ＝３正二十面体である可能性は非常に高い。そこで、被包されたゲノムＲＮＡはＨＥＶ感染性ウイルス粒子の集合に直接の役割を果たし得る。しかしながら、ここに本発明者らのデータは、ＨＥＶがその集合経路、タンパク質ドメインの配列、およびゲノム構成においてカリシウイルスとは異なっていることを示したが、両ウイルスは共に、二量体スパイクを有するＴ＝３正二十面体粒子である。Ｅ型肝炎ウイルスは、その集合経路およびその長く電気的に陽性であるＮ末端ドメインの利用において、幾つかの植物ウイルスに高い類似性を示した。このような類似性の進化的起源にはさらなる研究が必要であるが、本発明者らのデータによって、ＨＥＶの構造は、ヒトカリシウイルスの構造から逸脱してＴ＝３小植物ウイルスの構造へアプローチする、独特な位置に置かれる。

実施例５
急性Ｅ型肝炎ウイルスの改変されたヌクレオペプチドカプシドは、経口ワクチンとしての機能的なモジュール性を有する
Ｅ型肝炎ウイルス（Hepatitis E virus：ＨＥＶ）は水媒介性のウイルス性媒介物であり、主に糞口経路を通して伝染することから、低ｐＨならびに胃および消化管に付随する消化酵素に抵抗性である。ＨＥＶの感染はヒトに急性肝炎を引き起こし、妊婦における死亡率は３０％に達する（Naik, S.R. et al, Bull World Health Organ, 70 (5), 597-604 (1992)）。現在、国際的なヌクレオチド配列データベースの協働（Khuroo, M.S. & Khuroo, M.S., Curr Opin Infect Dis, 21, 539-543 (2008)）において入手可能なＨＥＶのゲノム配列は１，６００であり、これらは４の遺伝子型に分類される（Jameel, S., Expert Rev Mol Med, 1999, 1-16 (1999)）。特に、知られた単一の血清型のみが認識されていることから、ＨＥＶの免疫優性ドメインは高度に保存されていることが示唆される。第２の翻訳領域においてコードされる主要なカプシドタンパク質のＯＲＦ２は、最も免疫原性であり、かつ防御的な液性免疫応答の誘導に関与することが報告された（Li, T. et al., Vaccine, 22, 370-377 (2004); Purdy, M.A. et al., J Med Virol, 41 (1), 90-94 (1993); Riddell, M.A., Li, F., & Anderson, D.A., J Virol, 74 (17), 8011-8017 (2000)）。アミノ酸１１２〜６０８を網羅する組み換えＨＥＶカプシドタンパク質（Recombinant HEV capsid protein：ＰＯＲＦ２）は、昆虫細胞に発現させるとウイルス様粒子へ自己集合することができる（Li, T. C. et al., J Virol, 71 (10), 7207-7213 (1997)）。免疫電子顕微鏡によって示されるように、ＨＥＶウイルス粒子はエンベロープを持たない直径３２０〜３４０Åの正二十面体粒子であるが（Balayan, M., Andiaparidze, A., Savinskaya, S., & et. al., Intervirology, 20, 23-31 (1983)）、自己集合したウイルス様粒子の直径は２７０Åであることが、その三次元再構成から決定された。ＨＥＶ−ＶＬＰはＨＥＶの天然の免疫原性を有し、非ヒト霊長類への経口投与によって全身性および粘膜性の抗ＨＥＶ抗体を誘導することができる（Li, T. et al., Vaccine, 22, 370-377 (2004)）。ＨＥＶ−ＶＬＰは、６０コピーのＰＯＲＦ２タンパク質から構成されるＴ＝１正二十面体粒子であると判定されたが、ＨＥＶ ＶＬＰを、Ｅ型肝炎に対する直接の粘膜ワクチンまたは粘膜表面において免疫応答を活性化するための送達担体のいずれかとしてより良く利用するために、アミノ酸配列についての詳細な構造情報がなお必要とされる。
ＨＥＶカプシドの立体配置についての深い構造的な洞察を得るため、３０ÅのＥＭ密度マップを最初の段階とする分子置換法により、３．８Åの分解能で、遺伝子型１カプシドタンパク質由来のＨＥＶ−ＬＰの結晶構造を決定した（Xing, L. et al., Virology, 265 (1), 35-45 (1999)）（表Ｓ１）。クライオＥＭ構造に見られるように、ＨＥＶ−ＶＬＰは３０の大きな突起スパイクを各正二十面体２回軸に含む（図２８ａ）。カプシドタンパク質の構造は、Ｓ１ドメイン、Ｓ２ドメイン、およびＰドメインの三つのドメイン、および残基５５５〜５６０を網羅するよく決定されていない領域に分けられる（図２８ｂ）。残基１１８〜３１７により形成されるＳ１ドメインは、多くのＴ＝３ウイルス性カプシドタンパク質に見られる、ゼリーロールモチーフを有する古典的な８本鎖βバレルへ折り畳まれる（Rossmann, M. G. & Johnson, J.E., Ann Rev Biochem, 58, 533-573 (1989); Harrison, S.C., Curr Opin Struct Biol, 11, 195-199 (2001)）。Ｂ−Ｉで示されるこれらの８のβ鎖は、Ｃ鎖およびＤ鎖ならびにＥ鎖およびＦ鎖の間の二つのαヘリックスを有する、二つの逆平行βシートへ構築される（図２８ｃ）。ユニークなことには、三つのさらなる短いαへリックスが、Ｓ１ドメインにおけるＥ鎖とＦ鎖の間およびＧ鎖とＨ鎖の間に観察された。カプシド殻は主に、Ｓ１ドメイン間でのサブユニット間相互作用によって安定化されるように見える。残基３１８〜４５１から成るＳ２ドメインのフォールディングは、ねじれた逆平行βシートおよびＢ’鎖とＣ’鎖の間のαへリックスである（図２８ｃ）。Ｓ２ドメインは、主に３回軸周辺に生じ（図２８ｃ）、Ｓ１ドメインの下の、−３，２００Å２の埋没表面領域（buried surface area：ＢＳＡ）と強く相互作用する（図２９ａ）。Ｓ２およびＰドメインの両方はＳ１ドメインの上に存在するが、クライオＥＭマップの突起スパイクは単にＰドメイン密度を含む。残基４５２〜６０６から構成されるＰドメインは、逆平行βシートのＦ”Ａ”Ｂｂ”およびＢａ”Ｅ”Ｄ”Ｃ”から構成されるβバレルへ折り畳まれ（図２８ｃ）、長いプロリンリッチなヒンジ（残基４５２〜４６１のＰＴＰＳＰＡＰＳＲＰ）を通じてＳ２ドメインに結合する（図２８ｃ）。このＨＥＶカプシドタンパク質は、今日までに報告されているカリシウイルスのカプシドタンパク質に対し、空間的なドメイン構築および三つのドメインの配列における明らかな相違、および個々のドメインそれぞれのフォールディングにおける強い類似性を示す（Prasad, B.V.V. et al, Science, 286 (5438), 287-290 (1999); Chen, R. et al, Proc Natl Acad Sci USA, 103, 8048-8053 (2006)）。
各２回軸におけるサブユニット接触面は、主にＰドメインにおける接触のため、単量体における最も大きなＢＳＡ（５，９００Å２）を示す（図２９ａ）。この接触面には、強力な疎水性相互作用に関与する無極性アミノ酸基が埋まっている。１個のサブユニット由来の、Ｖａｌ４７０、Ｔｒｐ４７２、Ｖａｌ５０３、Ｖａｌ５９８、およびＶａｌ６００のアミノ酸の側鎖は、その二量体パートナー由来の疎水性表面パッチにより包囲される（図２９ｂ）。この疎水性の接触は、各部位における、１個のサブユニットの残基Ｔｒｐ５４８とその２回パートナー由来の残基Ａｒｇ５４２との間の水素結合を含む、極性の相互作用の縁によって保護される。従って、ＰＯＲＦ２二量体は溶液中で安定であり、二量体化はアミノ酸５８５〜６１０の存在に一致することが報告された（Li, X., Zafrullah et al., J Biomed Biotechnol, 1 (3), 122-128 (2001)）。さらなる変異誘発解析によって、二量体相互作用は、６の疎水性アミノ酸残基、Ａｌａ５９７、Ｖａｌ５９８、Ａｌａ５９９、Ｖａｌ６００、Ｌｕｅ６０１、およびＡｌａ６０２の存在に付随することが確認された（Li, S. et al., Vaccine, 23 (22), 2893-2901 (2005)）。結晶構造によると、これらの残基は、Ｐドメインの二量体接触面またはβバレルの疎水性中心内のいずれかに位置した。加えて、Ｓ１ドメインは、ＨＥＶ二量体を安定化させるさらなる力として、二量体接触面に疎水性残基、特にβＢ鎖およびα１へリックスを配置する。従って、カプシドタンパク質二量体は、ＨＥＶ−ＶＬＰの集合における構成要素である可能性が高く、これらの接触面領域における挿入によってＨＥＶ−ＶＬＰの形成は阻害され得る。
ＯＲＦ２二量体の正二十面体殻への集合のためには、厳密な５回および３回対称に従って３０コピーのＰＯＲＦ２二量体が置かれる必要があり、ここで集合の間に各二量体の大きな表面領域が埋め込まれる。結果として、Ｓ１ドメインの表面は５回軸周囲の領域においてのみ到達可能であることから、５回軸の結合は、単に４，７００Å２の埋め込まれた表面領域を持つＳ１ドメイン由来の残基を含む。５回軸の長短は５個のＴｒｙ２８８残基の環によって囲まれており、それらの芳香族側鎖は中心に向かっている（図２９ｃ）。３回軸周辺の結合は、９，５００Å２の埋め込まれた表面領域を持つＳ１およびＳ２ドメインの両方を含む（図２９ａ）。Ｓ２ドメイン由来の残基Ｇｌｎ４２１およびＳ１ドメイン由来の残基Ａｓｎ２５５がそれぞれ最外側および最内側のアミノ酸を占有することが観察された３回軸には、密度のない空洞が観察された。この中空の壁は高度に陰性に荷電しており、三つのアミノ酸、Ｇｌｕ２６９、Ｇｌｕ２７０、およびＧｌｕ４１７が含まれる（図２９ｄ）。現在の分解能では、構造内の金属イオンに対するいずれの電子密度も検出不可能である。しかしながら、ＨＥＶ−ＶＬＰは、ＥＤＴＡおよびＤＴＴの両方が含まれる環境で解体することができ、一方でカルシウムイオンの添加によって再集合する。カルシウムイオンに依存する安定性により、カプシド内に二価のイオンが存在することが示唆されるが、二価のイオンの正確な位置決定にはさらなる体系的な解析、例えばサマリウムによる結晶の誘導体化が必要とされる。高分子集合の「エネルギー地形」は段階的な過程を取ることが示唆されており、より大きな接触面は進化において大抵の場合保存されている（Levy, E.D. et al, Nature, 453, 1262-1265 (2008)）。二量体−二量体結合のＢＳＡにより、３回軸周辺での六量体（二量体の三量体）を通したＰＯＲＦ２二量体の集合経路の可能性が示唆されるが、その理由は、これが５回軸周辺での十量体（二量体の五量体）に比較して大きなＢＳＡを導くことにある。
ＨＥＶの４遺伝子型に由来するカプシドタンパク質の配列アラインメントにより、Ｓ１ドメインは最も保存された領域であるが、Ｓ２ドメインは遺伝子型の間で高度に可変性であることが明らかになった（Zhai, L., Dai, X., & Meng, J., Virus Res, 120, 57-69 (2006)）。低い溶媒到達性によるＶＬＰカプシドの封着におけるＳ１ドメインの重要な関与により、タンパク質配列のこのドメイン領域が遺伝子型の間でさらに保存され続けている可能性がある。Ｓ２ドメインには９の異なる残基があり、これらの全ては溶媒に露出する表面に位置しているが、知られているＨＥＶ抗原性エピトープでＳ２ドメインに位置しているものは無かった。
Ｐドメインは高度に露出されており、中和抗体の結合部位となる（He, S. et al, J Gen Virol, 89 (1), 245-249 (2008)）。ＨＥＶの中和エピトープは立体構造的であることが報告され（Schofield, DJ. et al., Vaccine, 22 (2), 257-267 (2003); Meng, J. et al., Virology, 288, 203-211 (2001)）、次に、カプシドタンパク質の残基４５９〜６０７を含むペプチドが抗ＨＥＶ中和抗体を誘導するための最小構造として同定された（Zhou, Y.H., Purcell, R., & Emerson, S., Vaccine, 23, 3157-3165. (2005)）。本発明者らの構造で、この領域はＰドメインと一致することが明らかになり、正二十面体殻の形成には関与しない。配列アラインメントの結果によって、Ｐドメインにおける１９の異なる残基が明らかになり、そのうちの９はＶＬＰ表面に存在した（図３０ａ）。それらのうちの一つのみが際立って抗体結合の接触面の内に位置しており、これは抗体が結合したＨＥＶ−ＶＬＰのクライオＥＭ構造によってさらに確認された（投稿準備中）。４の遺伝子型が存在するにもかかわらず、これまでに一つのＨＥＶ血清型のみが報告されてきた。４の遺伝子型で異なるアミノ酸は、抗原性ドメインの表面の外側に位置する。Ｓ１ドメインに集合機能を、Ｐドメインに免疫原性を割り当てるＰＯＲＦ２タンパク質のモジュール方式により、ＶＬＰが天然ウイルス粒子よりも小さいにもかかわらず、ＨＥＶ−ＶＬＰがその天然の抗原性立体構造を保つことを確実にする。あるいは、Ｐドメインに変異を導入するかまたは改変する事により、ＨＥＶ−ＶＬＰの集合は影響されないであろう。
４の挿入部位は、制限酵素の都合により、残基Ａ１７９、Ｒ３６６、Ａ５０７、およびＲ５４２の後に、予め選択した。これらの融合タンパク質は、これらの残基の不適切な空間的位置のためにＶＬＰを産生しなかった（Niikura, M. et al, Virology, 293 (2), 273-280 (2002)）。残基Ａ１７９は、Ｓ１ドメインのα１へリックスの中央に位置する。このへリックスは、Ｓ１ドメインの完全性およびその２回軸関連の隣接するサブユニットとの相互作用に必要である。Ｒ３６６はＳ２ドメイン内に位置し、その３回軸に関連する隣接するサブユニット由来の残基Ｅ３８６との静電気的な相互作用を促進する。Ｐドメインに位置するものの、Ｒ５４２の側鎖は二量体の接触面内にあり、二つの単量体の疎水性相互作用を導く。Ｒ５４２の欠失により、二つのＰドメインの配向が誤配列され、ＰＯＲＦ２タンパク質の二量体相互作用が弱くなる可能性がある。Ｐドメインにおける残基Ａ５０７は、長いプロリンリッチなヒンジに対する角度を固定することにより、Ｐドメインの配向を維持することに重要な役割を果たす。４残基のうちのいずれもＶＬＰの表面に露出していないが、それらの幾つかは個別のＰＯＲＦ２サブユニットの表面にある（図３０ｂ）。従って、これらの部位への外来配列の挿入により、個々のタンパク質の発現への干渉は誘導されないが、ＨＥＶ ＶＬＰの集合への障害は起こる。以前の報告に示されたように、Ｃ末端はＶＬＰの表面に露出し、かつ粗大な外来抗原配列を係留するために適していることが結晶構造によって明らかになった（Niikura, M. et al., Virology, 293 (2), 273-280 (2002)）。ＨＩＶ感染に対する粘膜ワクチンを作り出すため、ＨＩＶ免疫原性エピトープのＰ１８をＰＯＲＦ２タンパク質のＣ末端に挿入した。
ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus：ＨＩＶ）の感染は、２００７年に推定２，７００万人の新たな感染、および２００万人の死をもたらした、主要な健康問題である。大多数のＨＩＶの一次感染は粘膜部位で起こることから、粘膜ワクチンは、ＨＩＶの初感染および複製を標的とする上で特に頑強である（Miller, C.L., McGhee, J.R., & Gardner, M.B., Lab. Invest., 68, 129-145 (1993)）。ＨＩＶ Ｐ１８ペプチド（ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ）は、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質の第３の可変ドメインに位置する特異的なＨＩＶペプチドである。このドメインには、Ｔヘルパー（T helper：Ｔｈ）および主要なＨＩＶ−１中和エピトープが含まれる。Ｐ１８ペプチドは免疫優性で、ＨＩＶ特異的なＣＴＬ応答を刺激することができる（Achour, A. et al., J Virol, 70, 6741-6750 (1996)）。ＰＯＲＦ２タンパク質のＣ末端へのＰ１８ペプチドの融合は、ＨＥＶ−ＶＬＰの集合に影響を及ぼさなかった。結果として、挿入されたＰ１８エピトープはＨＥＶ免疫優性エピトープに隣接する位置にあり、ホストの免疫系に対して到達可能であることが予想される。各ＨＥＶ−ＶＬＰは、その正二十面体対称のために、６０コピーのＰ１８エピトープを５６Åのスペーシングと共に保有し得る。次にマウスを、５０ｍｇの精製キメラＰ１８−ＶＬＰにより、アジュバントなしで、１週間の間隔で３回経口的に免疫した。ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的なＩｇＧ抗体が、血清および腸液中に、合成Ｐ１８ペプチドを投与されたマウスよりも高い濃度で検出された（図３０ｃ）。さらに、ＨＩＶ ｅｎｖ−タンパク質に特異的なＩｇＡ抗体がマウス腸液中に検出されたが、血清中のＩｇＡ抗体の濃度は、ペプチドにより免疫されたマウスにおいて検出された濃度との違いを示さなかった（図３０ｃ）。野生型ＨＥＶ−ＶＬＰにより免疫したコントロールマウスは、合成Ｐ１８抗原に特異的な抗体を産生しなかった。このことにより、キメラＰ１８−ＶＬＰは、マウスに全身性および粘膜性の免疫の両方を誘導できることが示唆される。
キメラＰ１８−ＶＬＰは、ＨＥＶ−ＶＬＰのように、正二十面体２回軸周辺のカプシド内面に４個の陽性に荷電したアミノ酸のクラスターを含み（図３１ｂ）、ヌクレオチド相互作用に好ましい局所的な環境を形成する。ＤＮＡプラスミドを再集合緩衝液に加えると、再集合したキメラＶＬＰはＤＮＡプラスミドを取り込むことができた。それ故本発明者らは、表面にＨＩＶ Ｐ１８エピトープを有するキメラＶＬＰ、およびＧａｇタンパク質の全体を発現する被包ＤＮＡワクチン（Ｐ−Ｐ１８／ＮＧａｇカプセル）を産生し、マウスを用いてその免疫原性を実験的に評価した。Ｐ−Ｐ１８／Ｎ−Ｇａｇカプセルによって１週間の間隔で４回経口的に免疫した後、マウスは、ＨＩＶ特異的なＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の両方を、血清ならびに腸液中に、合成Ｐ１８ペプチドまたはネイキッドＤＮＡプラスミドのいずれかを投与されたマウスよりも高い濃度で産生した。細胞傷害性Ｔリンパ球（cytotoxic T lymphocyte：ＣＴＬ）の応答は、Ｐ−Ｐ１８／Ｎ−Ｇａｇカプセルを経口投与されたマウス由来の脾臓、腸間膜リンパ節、およびパイエル板細胞において、Ｐ１８エピトープ（図３１ｃ）およびＨＩＶ ｇａｇタンパク質（図３１ｄ）に応答して、際立って検出された。特異的なＣＴＬ応答は、合成Ｐ１８ペプチド、またはｇａｇタンパク質を発現する開発されたネイキッドＤＮＡワクチンのいずれかを投与されたコントロール動物に由来する、同じ組織細胞には観察されなかった。この結果により、ＤＮＡプラスミド上の遺伝子は、ＨＥＶ−ＶＬＰによる送達後に小腸の上皮細胞に発現可能であることが示された。
粘膜免疫応答誘導のためのＨＩＶ ＤＮＡワクチンの経口送達は、プラスミドＤＮＡを胃の環境から保護することが困難なために難問であるが、ポリ（ラクチド−コグリコリド）微粒子内にＤＮＡを被包することで有効性を改良することができる（Kaneko, H. et al, Virology, 267, 8-16 (2000)）。経口感染性のウイルスに由来するＨＥＶ−ＶＬＰは、抗原提示およびＶＬＰ集合のような異なる機能のための三つのドメインにモジュール化された、６０コピーのＰＯＲＦ２タンパク質から構成される。カプシドタンパク質のこのような構造的モジュール性により、ＨＥＶ−ＶＬＰは天然ＨＥＶウイルス粒子の伝染および免疫原性の性質を保持することができ、そのために小腸のＨＥＶを許容する上皮内に取り込まれる。さらに、これらの結果により、本発明者らのＨＥＶに基づいたＰ−Ｐ１８／ＮＧａｇカプセルは、抗原を粘膜表面に送達するのみではなく、特に液性および細胞粘膜性ならびに全身性の免疫応答を誘導することにより、粘膜系を通過するＨＥＶ−ＶＬＰを利用できることが示された。ＨＥＶ−ＶＬＰ自体がＨＥＶワクチンとしてヒトでの治験下にあることから（Shrestha, M.P. et al, N Engl J Med, 356 (9895-903) (2007)）、このＨＥＶ−ＶＬＰの送達系により、いずれのアジュバントもなしで粘膜免疫を誘導できる非複製実体としての、経口ワクチン送達の手軽で新規なツールが提供される。
実施例６
ＤＮＡワクチンを被包するＨＥＶ−ＶＬＰ
ワクチンプラットフォームに関する本発明は、単にカプシド内に含まれたプラスミドＤＮＡを送達するのみではなく、有効性を最大限にするためのアジュバントおよびブースターの両方としてのペプチドエピトープを、ウイルス様粒子（virus-like particles：ＶＬＰ）の表面に付着させ得る。このことにより、ヘルパーＴ細胞、および重要なことにはウイルス感染のためのＭＨＣクラスＩ限定の細胞傷害性Ｔリンパ球の両方による、細胞性免疫の誘導が実行可能となる。この試みは、ＶＬＰがペプチドまたはＤＮＡいずれかの一つの型の抗原を輸送するために用いられる際、付着された抗原が、ＤＮＡワクチンの有効性を増強するためのアジュバントおよびブースターの両方として機能するため、一般的なＶＬＰ送達系よりも強力であるとみなされる。全体的な産生には、潜在的に致命的なインフルエンザウイルスの扱いが必要とされず、産生時間が著しく短縮されることにより、進行中の大流行では最高に注目される。ＤＮＡワクチンのカプシド内への包含は、全てin vitroで行われることから、Ｍ２ｅを結合したＨＥＶ ＶＬＰは、逆遺伝学により産生された潜在的な大流行ウイルスのＲＮＡ部分を含むＤＮＡプラスミドを封入するためのエンベロープとして、前もって産生することができる。
ＨＥＶ感染の自然経路は糞口経路であり、ＨＥＶ−ＶＬＰの構造は、未変化のウイルスによる感染が通常起こる場である小腸へ通過するため、胃の低ｐＨでの生存を可能にする。従って、これはワクチン送達系として粘膜免疫を誘導することができ、かつ、例えば緩衝剤の前投与が必要とされる特定のコレラワクチンに比較して有利でもある。有効なワクチンは容易に製造可能でなければならない。ＨＥＶ−ＶＬＰは標準的な培養の方法論によって、精製されたＨＥＶ−ＶＬＰの収率が５０〜１００μｇ／ｍｌの範囲で産生することができ、これはその他のＶＬＰに比較しておおよそ１００倍多い。産生されたカプシドは室温で安定であり、冷却設備なしで輸送できることが、特に遠隔の、手段の少ない地域におけるその有効性のための決定的な特徴である。粘膜表面は、感染性微生物の侵入に対する、ヒトにおける防御の最前線を作り上げる。大多数のヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus：ＨＩＶ）の一次感染は粘膜で起こることから、このことはＨＩＶの感染について特に当てはまる。加えて、ワクチンの注射には鋭利なもの（針）または注射器の使用が必要であり、これらの両方は疼痛（このために多くの人々が接種を避ける）を引き起こし、バイオハザードを作り出すという不都合を有する。このようなワクチンの投与には訓練を受けた人々が必要とされることから、注射によるワクチン投与は、例えば経口的に投与されるワクチンよりもさらに費用がかかる。しかしながら、粘膜ワクチンの開発は抗原送達系の効率に大きく依存しており、これはヒトの消化管内のタンパク質分解酵素のような厳しい環境に対して抗原を保護するため十分に強く、かつ粘膜表面を標的としなければならない。
ＨＥＶ−ＶＬＰは粘膜免疫を活性化することができる：ヒトＥ型肝炎ウイルス（hepatitis E virus：ＨＥＶ）は、主に汚染水を通して伝染される、水媒介性のエンベロープを持たないウイルスである。Ｅ型肝炎ウイルス様粒子（ＨＥＶ−ＶＬＰ）は、カプシドタンパク質由来の切断型ＯＲＦ２タンパク質（ＰＯＲＤ２）から構成される。昆虫細胞に発現させると、ＰＯＲＦ２タンパク質は、Ｔ＝１正二十面体粒子へ高い収率（実験室規模で、ミリグラムの量）を伴って自己集合する。本発明者らは、次にその構造をクライオ電子顕微鏡およびイメージ再構成の両方、ならびに最近ではＸ線結晶学によって解析した。ＶＬＰは６０コピーのＰＯＲＦ２タンパク質から成り、ヌクレオチドを含まないことからホスト細胞内では複製できない。天然ウイルス粒子よりも小さいが（２７ｎｍ対３４ｎｍ）が、このＶＬＰは、天然ＨＥＶウイルス粒子と同様の形態的特色である、正二十面体殻の表面の突起スパイクを示した。加えて、これはＨＥＶの天然の抗原性も維持しており、実験動物に抗体を誘導して非ヒト霊長類を保護することができる。ＨＥＶの天然感染経路を利用して、経口によるワクチン接種の後にマウスとカニクイザルの両方にＩｇＡ抗体が検出されたことで、ＨＥＶ−ＶＬＰが粘膜免疫を誘導できることが示される。
ＨＥＶ−ＶＬＰは、in vitroおよびin vivoで遺伝子を転移することができる：ＨＥＶ−ＶＬＰの構造により、ＶＬＰの内表面は各正二十面体２回軸に優位に陽性荷電したパッチを含むことが明らかになったことから、ＶＬＰは核酸をカプシド内に包含する内在性の能力を保持することが示される。従ってこのＨＥＶ−ＶＬＰは、ＶＬＰのリフォールディングの間にin vitroでＤＮＡプラスミドを被包することができ、ＧＦＰ遺伝子をマウス、ウサギ、サル、およびヒト由来の培養細胞内へ転移する。ＥＧＴＡおよびＤＤＴの組み合わせによってＨＥＶ−ＶＬＰを遊離の二量体へ解体することができ、破壊されたＶＬＰは、カルシウムイオンが補充されると再集合できる。逆染色後に、著しい形態的な変化は観察されなかった。ＤＮＡワクチンを組み入れるため、再集合の前に、標的遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡを破壊されたＶＬＰと混合した。カプシド内にプラスミドを含んだＶＬＰを、次にＣｓＣｌ密度勾配によって空のＶＬＰから分離した（図３２）。蛍光顕微鏡下で、ＧＦＰを発現する細胞の蛍光を観察した。ＧＦＰが移入された細胞のパーセンテージはそれほど高くなかったが（ＮＩＨ３Ｔ３細胞で１１．２％、ＲＫ−１３細胞で１９．６％、ＣＯＳ−７細胞で２１．０％、およびＨｅｐＧ２細胞で２０．１％）、この研究で試験された全ての細胞は、プラスミドＤＮＡ単独またはプラスミドＤＮＡ存在下での未変化のＨＥＶ−ＶＬＰと共にインキュベートした細胞とは対照的に、陽性反応を示した。ＨＥＶ−ＶＬＰが遺伝子の形質導入をin vivoで誘導できるか否かを試験するため、ＮＬ４３２株のＨＩＶ ｅｎｖ ｇｐｌ２０を発現するプラスミドＤＮＡ（ｐＪＷＮＬ４３２）を被包するように、ＨＥＶ−ＶＬＰを再集合させた。このＶＬＰを経口投与されたマウスを免疫後２日目に屠殺すると、免疫組織化学によって、小腸の上皮細胞にＨＩＶ ｅｎｖタンパク質の発現が見出された。これらのデータにより、粘膜送達のための遺伝子担体としてのＨＥＶ−ＶＬＰの能力が示された。
ＨＥＶ−ＶＬＰ送達により、マウスに特異的な粘膜免疫応答が誘導される：マウスを、ｐＪＷＮＬ４３２を含むＨＥＶ−ＶＬＰまたはネイキッドｐＪＷＮＬ４３２プラスミドのいずれかにより、１週間の間隔で４回、経口および皮下免疫した。免疫後、マウスの血清および糞便から異なる時点で試料を回収し、ＨＥＶ−ＶＬＰ、合成ＨＩＶ Ｐ１８ペプチド、およびＮＬ４３２株のＨＩＶ ｇｐｌ２０タンパク質を発現する組み換えセンダイウイルスを感染させたＣＶ−１細胞に対する抗体誘導のレベルをＥＬＩＳＡによって調べた。皮下および経口免疫したマウス由来の血清中に検出された、ＨＩＶ ｅｎｖに特異的なＩｇＧ抗体の血清濃度は結局同じであり、一方でいずれの糞便試料にもＩｇＧは検出されなかった。しかしながら、ＤＮＡを負荷したＶＬＰを投与されたマウスの血清中のＩｇＧ濃度は、ネイキッドＤＮＡを投与されたものよりも有意に高かった（１２ｗｐｉにてＰ＜０．０５）（図３３）。ここでの統計解析は、マンホイットニーのＵ検定およびクラスカルウォリス検定を用いて行った。
重要なことに、ＨＩＶ ｅｎｖに対する特異的なＩｇＡは、ＤＮＡを負荷したＶＬＰにより経口的に免疫されたマウスの血清のみに高濃度で検出されたが、皮下免疫されたマウスの血清中には検出されなかった（１２ｗｐｉにてＰ＜０．０５）。このような特異的ＩｇＡは、ＤＮＡを負荷したＶＬＰを経口投与されたマウスの糞便抽出物のみに検出された（図３３）。これらのデータにより、ＨＥＶ−ＶＬＰは、ＤＮＡワクチンを粘膜表面へ効果的に送達することが示される。
HEV-VLP送達により、マウスに特異的なCTL応答が誘発される: DNAワクチンの重要な利点の一つは、抗体、および細胞傷害性またはキラーT細胞を介してウイルスを死滅させるために専門化された細胞を誘導する免疫系のT細胞アーム、の両方を刺激することである。ＨＥＶ−ＶＬＰ送達が細胞性の応答を誘導するか否かを調べるため、本発明者らは、初回免疫から５週間後に、脾臓、腸間膜リンパ節（mesenteric lymph nodes：ＭＬＮ）およびパイエル板（Peyer's patch：ＰＰ）細胞から回収したエフェクター細胞において、５１Ｃｒ−放出試験により細胞傷害性を調べた。Ｐ１８ペプチドは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける主要なＨＩＶ ｅｎｖ ＣＴＬおよびＴｈ細胞エピトープであり、Ｈ−２Ｄｄ対立遺伝子に限定される。抗ＣＤ８または抗Ｈ−２Ｄｄモノクローナル抗体のいずれかによる、これらのエフェクター細胞の阻害についてもまた調べた。この結果から、マウスは、プラスミドを負荷したＨＥＶ−ＶＬＰの投与後に、脾臓、ＭＬＮ、およびＰＰにおいてＨＩＶ−ｅｎｖエピトープ特異的なＣＴＬ応答を発生できることが明らかになったが、ネイキッドＤＮＡプラスミドを投与されたマウスは、このような特異的ＣＴＬ応答を発生しなかった（図３４）。これらのエフェクター細胞の機能は、抗ＣＤ８および抗Ｈ−２Ｄｄモノクローナル抗体によって阻害された。従って、ＨＩＶ ｅｎｖ ＤＮＡワクチンを被包したＨＥＶ−ＶＬＰをマウスに経口投与することにより、ＣＤ８＋およびＭＨＣクラスＩ限定ＣＴＬ応答が、局所性および全身性両方に誘発された。
ＨＩＶ抗原性エピトープＰ１８およびＤＮＡワクチンの両方を、ヒトＥ型肝炎ウイルスカプシド粒子を用いて送達した。Ｐ１８エピトープはＨＩＶエンベロープ糖タンパク質の第３の可変ドメイン（Ｖ３ループ）に位置し、Ｔヘルパーおよび主要なＨＩＶ中和エピトープを含んだ。Ｐ１８の投与により、感染細胞を死滅させることによってＨＩＶ感染の制御に重要な役割を果たすと考えられる、抗ＨＩＶ ＣＴＬ応答を誘導することができる。ＨＩＶ ＤＮＡワクチンは、ＨＩＶの可溶性糖タンパク質であるｇｐ１２０をコードするプラスミドである。発現したｇｐｌ２０タンパク質は、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（major histocompatibility complex class II：ＭＨＣＩＩ）分子との会合によって感染細胞表面における提示のために選択されることにより、ＣＴＬ応答を活性化する。ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答が、急性感染の間に、最初のウイルス血症の初期制御と同時に出現することから、ＨＩＶ特異的なＣＴＬ応答は、ＨＩＶ複製の制御において決定的な役割を有することが知られている。最近獲得された構造的な情報により、ＨＥＶカプシドタンパク質がＰ１８エピトープとｇｐｌ２０遺伝子の両方を、経口投与を通して粘膜表面へ同時に送達するように、このようなカプシドを改変する事ができる。従って提案するシステムでは、ＨＩＶ感染に対する全身性および粘膜性の抗体、ならびに細胞性ＣＴＬ応答の誘導を刺激することができる。高次の閉鎖カプシドであるが、ウイルス性のゲノム物質を含まないＨＥＶ−ＶＬＰは、ウイルス性カプシドの全体構造を保持しており、小分子、抗原性エピトープ、治療用遺伝子の送達における大きな利点を示した。特に、胃腸伝染性媒介物由来であるＨＥＶカプシドは、経口ワクチン接種を通して粘膜の抗原提示細胞を標的とするための天然の伝染経路を受け継いでいる。この技術は、抗体および細胞性免疫のみではなく、１）ウイルス接種を減少させるための抗ＨＩＶ抗体の誘導および２）ＨＩＶに感染したＣＤ４細胞の排除を促進するための細胞性応答の活性化において効果的な役割を果たすために、粘膜免疫（感染部位における）も誘導するはずである。
実施例７
様々なキメラＨＥＶ−ＶＬＰコンストラクト
様々な異種性ペプチドを、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の残基４８３〜４９０、残基５３０〜５３５、残基５５４〜５６１、残基５７３〜５７７、残基５８２〜５９３、または残基６０１〜６１３の予め選択された領域内のＨＥＶ ＯＲＦ２の一部分に挿入した。これらのコンストラクトに使用できる異種性エピトープには、ＨＩＶ−Ｖ３、ｆｌｕ−Ｍ２、ＨＳＶおよびレオ（下痢ウイルス）が含まれるが、これらに限定されない。（１）残基４８３〜４９０の領域内に挿入されたＨＩＶ Ｖ３ペプチドによるＨＥＶ−ＶＬＰ；（２）残基５３０〜５３５の領域内に挿入されたＨＩＶ Ｖ３によるＨＥＶ−ＶＬＰ；（３）残基５５４〜５６１の領域内に挿入されたＨＩＶ Ｖ３ペプチドによるＨＥＶ−ＶＬＰ；（４）残基５８２〜５９３の領域内に挿入されたＨＩＶ Ｖ３ペプチドによるＨＥＶ−ＶＬＰ；および（５）残基６０１〜６１３の領域内に挿入されたＨＩＶ Ｖ３ペプチド、またはｆｌｕ−Ｍ２ペプチド、または単純ヘルペスウイルスペプチドによるＨＥＶ−ＶＬＰを含む、様々なコンストラクトが作製された。
関連出願の相互参照
本出願は米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００９年２月２７日に提出された米国仮出願第６１／１５６，４４６号の利益を主張するものであり、その内容の全体は参照により本明細書に取り込まれる。

Claims (18)

  1. ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分および異種性ペプチドを含んでなる改変Ｅ型肝炎ウイルス（hepatitis E virus：ＨＥＶ）カプシドタンパク質；および
    改変ＨＥＶカプシドタンパク質により形成されるキメラウイルス様粒子（virus-like particle：ＶＬＰ）内に被包された異種性核酸
    を含み、
    前記ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分が、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の残基１１２〜６０８を含み、
    前記異種性ペプチドが、前記ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分のうちＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の残基４８３〜４９０の予め選択された領域内に挿入されている組成物。
  2. 前記異種性核酸および前記異種性ペプチドが同一の源由来である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記異種性核酸および前記異種性ペプチドが異なる源由来である、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記異種性ペプチドを２つ以上含んでなる、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記２つ以上の異種性ペプチドが異なる源由来である、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記２つ以上の異種性ペプチドが同一の源由来である、請求項４に記載の組成物。
  7. 前記改変ＨＥＶカプシドタンパク質が、前記ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の残基１１２〜６０８のＮ末端に融合された、ＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質の残基９１〜１２３をさらに含んでなる、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記改変ＨＥＶカプシドタンパク質が、前記ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の残基１１２〜６０８のＮ末端に融合された、ＨＥＶ ＯＲＦ３タンパク質の残基７０〜１２３をさらに含んでなる、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記予め選択された領域の少なくとも１残基が欠失する、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記予め選択された領域内の全ての残基が欠失する、請求項９に記載の組成物。
  11. 薬剤的に許容される賦形剤をさらに含んでなる、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記賦形剤がアジュバントである、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記賦形剤が経口送達に適応した、請求項１１または請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記賦形剤が粘膜送達に適応した、請求項１１または請求項１２に記載の組成物。
  15. ホストの免疫原性応答を誘導するための、請求項1〜請求項１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 請求項１〜請求項１５のいずれか一項に記載の組成物を含んでなるワクチン。
  17. ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の残基１１２〜６０８を含む、ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分、および
    前記ＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の一部分のうちＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の残基４８３〜４９０の予め選択された領域内に挿入された異種性ペプチド
    を含んでなる、改変Ｅ型肝炎ウイルス（hepatitis E virus：ＨＥＶ）カプシドタンパク質。
  18. 請求項１７に記載の改変ＨＥＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
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