KR101648106B1 - A형 간염 바이러스 항원 및 e형 간염 바이러스 항원 동시 생산방법 및 생산된 항원을 함유하는 간염 예방 백신 및 진단 키트 - Google Patents

A형 간염 바이러스 항원 및 e형 간염 바이러스 항원 동시 생산방법 및 생산된 항원을 함유하는 간염 예방 백신 및 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원 동시 생산방법 및 생산된 항원을 함유하는 간염 예방 백신 및 진단 키트에 관한 것으로, 구체적으로 A형 간염 바이러스 항원으로써 VP1 단백질의 일부와 E형 간염 바이러스 항원으로써 ORF2 단백질의 일부를 곤충세포에서 동시에 생산하는 방법, 이렇게 생산된 항원을 함유함으로써 두 가지 바이러스에 대한 항체생성을 유도하는 예방 백신, 및 상기 항원을 함유함으로써 피검체에 존재하는 두 가지 바이러스에 대한 항체를 검출할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원을 동시에 안정적으로 생산할 수 있다. 또한, 생산된 항원은 이들 두 가지 바이러스의 감염을 동시에 예방하기 위한 백신이나 감염 여부를 진단하기 위한 키트로 유용하게 사용할 수 있다. 상기 바이러스들이 가축으로부터 감염될 수 있는 만큼, 본 발명의 백신과 키트를 사용하여 가축을 관리하면 바이러스 보유 가능성을 차단할 수 있어 사람에게 전이되는 것을 사전에 방지할 수 있을 것으로 판단되며, 심각한 간염을 일으키는 동시 감염도 예방할 수 있어 질병관리에 큰 도움을 줄 것으로 기대된다.

Description

A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원 동시 생산방법 및 생산된 항원을 함유하는 간염 예방 백신 및 진단 키트{Dual expression of the structural proteins of hepatitis A virus and hepatitis E viurs and its applications as a vaccine or a diagnostic tool}
본 발명은 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원 동시 생산방법 및 생산된 항원을 함유하는 간염 예방 백신 및 진단 키트에 관한 것으로, 구체적으로 A형 간염 바이러스 항원으로써 구조단백질의 일부인 VP1 단백질과 E형 간염 바이러스 항원으로써 ORF2 단백질의 일부를 곤충세포에서 동시에 생산하는 방법, 이렇게 생산된 항원을 함유함으로써 두 가지 바이러스에 대한 항체생성을 유도하는 예방 백신, 및 상기 항원을 함유함으로써 피검체에 존재하는 두 가지 바이러스에 대한 항체를 검출할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다.
간염을 일으키는 바이러스는 총 5종으로 A, B, C, D 그리고 E가 있는데, 이중 A형(HAV, hepatitis A virus)과 E형(HEV, hepatitis E virus)은 사람에서 만성으로 진행되지 않고 급성간염만을 일으키는 것으로 알려져 있다.
A형 간염 바이러스(이하 'HAV'라 한다)는 Picornaviridae 과(family)의 Enterovirus 속에 속하며 직경이 27 ~ 32㎚인 외피 비보유(non-enveloped) 바이러스이다. 유전체(genome)는 약 7.5kb의 단일가닥(single-stranded) RNA로 이루어져 있다. 또한 E형 간염 바이러스(이하 'HEV'라 한다)는 Hepaviridae 과의 Hepavirus 속에 속하며 직경이 27 ~ 34㎚인 외피 비보유 바이러스이다. 유전체는 세 개의 ORF와 5'과 3' 말단 비암호화 영역(non-coding region, NCR)을 포함하는 약 7.2kb의 단일가닥 양성 센스 RNA(single-stranded positive-sense RNA)로 이루어져 있다.
현재 HEV는 돼지나 쥐 등을 통해 사람으로 감염될 우려가 있는 인수공통 질병으로 분류되고 있고, HAV의 경우 사람에만 질병을 일으키는 것으로 알려져 있으나, 환경오염 등을 통하여 동물의 분변 등에서 검출이 되는 것으로 조사되었다. 또한 이 두 바이러스에 동시 감염되는 경우가 발생하고 있는데, 한 종류의 바이러스에 감염된 경우 보다 심각한 간염을 일으킨다.
따라서 동물을 통해 감염될 우려가 있는 이 두 가지 간염 바이러스에 대한 대비가 필요하며, 특히 동물이 바이러스를 방어할 수 있도록 함으로써 전염원을 원천적으로 차단하기 위한 동물백신이 필요하다. 물론 이 동물백신을 개발한다면 사람에게도 사용할 수 있을 것이다.
또한, 보다 심각한 간염을 일으키는 동시 감염에 대비하고, 백신 사용을 용이하게 하기 위하여 이들 두 가지 간염 바이러스에 대한 면역력을 한 번에 얻을 수 있도록 하는 것이 필요하며, 보다 효율적으로 백신을 제조하기 위하여 두 바이러스의 항원기를 동시에 발현하는 시스템을 개발할 필요가 있다.
본 발명자는 이러한 목적을 달성하기 위하여 베큘로바이러스(Baculovirus) 발현 시스템을 이용하고자 하였다. 베큘로바이러스 발현 시스템은 베큘로바이러스 유전체에 표적 단백질의 유전자를 삽입하여 재조합 베큘로바이러스를 제작하고 곤충세포에 감염시킴으로써 표적 단백질 유전자를 곤충세포에 도입하여 관련 단백질이 발현되게 하는 시스템이다.
하지만 이 시스템을 사용하기 위해서는 표적 단백질의 크기를 조절해야 하고 표적 단백질이 곤충세포의 생존에 큰 영향을 미치지 않아야 하며, 곤충세포 내에서 표적 단백질이 원활하게 발현되어 본래의 3차 구조를 형성할 수 있어야 한다는 문제가 있다. 더욱이 2개의 표적 단백질을 동시에 발현시킬 경우에는 이러한 문제를 해결하는 것이 더욱 어려워지게 된다.
본 발명자는 이러한 베큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 HAV 항원 및 HEV 항원을 동시에 생산할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 노력하였다. 이의 결과 HAV의 구조단백질 중 주요 항원기로 알려진 VP1 단백질을 코딩하는 유전자와 HEV의 ORF2 단백질의 일부를 코딩하는 유전자를 베큘로바이러스 발현 시스템에 적용할 경우 각 간염 바이러스의 표적 항원 단백질을 동시에 안정적으로 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 등록특허 제10-0702086호
따라서 본 발명의 주된 목적은 HAV 항원 및 HEV 항원을 동시에 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항원을 이용한 HAV 및 HEV 동시 예방 백신을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항원을 이용한 HAV 및 HEV 동시 진단 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 위해 필요한 재조합 베큘로바이러스 전이벡터, 전이벡터 함유 대장균, 재조합 베큘로바이러스 유전체, 재조합 베큘로바이러스, 및 HAV 항원 및 HEV 항원을 동시에 생산하는 곤충세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 함께 곤충세포에서 발현시키는 것을 특징으로 하는 HAV 항원 및 HEV 항원 동시 생산방법을 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 HAV의 VP1 단백질의 아미노산 서열이고, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 HEV의 ORF2 단백질 아미노산 서열 중 일부(112 ~ 660번째 아미노산)이다. VP1과 ORF2는 각 바이러스의 구조단백질이다. ORF2 단백질의 전체 아미노산 서열은 서열번호 5와 같다.
본 발명의 HAV 항원 및 HEV 항원 동시 생산방법에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 갖고, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 서열번호 4의 염기서열은 본래 HEV ORF2의 아미노산 서열 및 유전자 염기서열을 바탕으로 곤충세포의 발현에 적합한 형태로 코돈 최적화(codon optimization)한 서열이다. 따라서 이 염기서열을 사용하는 것이 곤충세포에서 각 항원의 안정적이고 효율적인 발현을 위해 바람직하다.
본 발명의 HAV 항원 및 HEV 항원 동시 생산방법에 있어서, 상기 각 유전자의 발현이 p10 프로모터(promoter) 또는 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터에 의해 조절되도록 하는 것이 바람직하다. 이 두 프로모터는 베큘로바이러스 감염 사이클에서 비리온이 만들어진 후에 활성화되어 감염의 후기에 발현되게 하는 강력한 프로모터이며, 다중발현을 위해 적합한 프로모터로 다양한 조건에서 단백질 발현을 위해 사용되는 것으로 잘 알려져 있다. 본 발명에서는 이들 프로모터를 사용하는 것이 곤충세포에서 각 항원의 안정적이고 효율적인 발현을 위해 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 HAV 항원 및 HEV 항원을 함유하는 HAV 및 HEV 동시 예방 백신을 제공한다. 상기 항원은 각 바이러스의 구조단백질 또는 그 유사체로 바이러스 독성을 나타내지 않으며 체내에서 관련 면역반응을 유도할 수 있다. 따라서 이들 항원을 백신으로 사용하면 각 바이러스의 감염을 효과적으로 예방할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 HAV 항원 및 HEV 항원을 함유하는 HAV 및 HEV 동시 진단 키트를 제공한다. 동물이 상기 바이러스에 감염되면 면역반응에 의해 각 바이러스에 대한 항체가 생성되므로, 감염이 의심되는 동물의 혈액 등 생물학적 시료와 본 발명의 항원을 반응시켜 항원-항체 결합 생성 여부를 확인하면 각 바이러스의 감염 여부를 효과적으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고, 상기 각 유전자의 전사를 조절하는 프로모터를 포함하여 이루어지는 HAV 항원 및 HEV 항원 동시 생산용 재조합 베큘로바이러스 전이벡터를 제공한다.
이때 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 갖고, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 또한 상기 프로모터는 p10 프로모터 또는 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터인 것이 바람직하다. 본 발명에서는 상기 염기서열 및 프로모터를 사용하는 것이 곤충세포에서 각 항원의 안정적이고 효율적인 발현을 위해 바람직하다.
본 발명의 상기 재조합 베큘로바이러스 전이벡터는 도 1로 표시되는 것이 바람직하다. 도 1의 재조합 베큘로바이러스 전이벡터는 pFastBacTMDual 벡터를 모벡터로 사용하여 설계한 것이다. 베큘로바이러스 전이벡터는 베큘로바이러스에 표적 유전자를 도입하는데 사용되는 벡터로 유전자 도입 방식에 따라 다양한 종류의 벡터가 알려져 있는데, pFastBacTMDual 벡터도 이러한 벡터 중 하나이다. 이 벡터는 Bac-to-Bacㄾ 베큘로바이러스 발현 시스템을 적용할 수 있고 두 개의 유전자를 발현할 수 있도록 설계된 것으로 본 발명에 적합한 벡터이다. 이 벡터에 본 발명의 항원 유전자를 클로닝하되 도 1에서와 같이 HAV VP1 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH), HEV ORF2 유전자는 p10 프로모터(Pp10)에 의해 전사가 조절되도록 하는 것이 바람직하다. 이에 따르면 본 발명의 각 항원을 곤충세포에서 안정적이고 효율적으로 발현할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 베큘로바이러스 전이벡터를 함유하는 대장균을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고, 상기 각 유전자의 전사를 조절하는 프로모터를 포함하여 이루어지는 HAV 항원 및 HEV 항원 동시 생산용 재조합 베큘로바이러스 유전체(genome)를 제공한다. 이때 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 갖고, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 또한 상기 프로모터는 p10 프로모터 또는 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터인 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 베큘로바이러스 유전체는 곤충세포에 형질감염(transfection)시켜 재조합 베큘로바이러스를 제조하기 위해 사용될 수 있다. DH10BacTM E. coli 등과 같이 Bacmid를 함유하는 세포에 상기 본 발명의 재조합 베큘로바이러스 전이벡터를 도입하여 트랜스포존(transposon) 재조합, 상동재조합(homologous recombination) 등의 방법으로 재조합을 유도하면 본 발명의 재조합 베큘로바이러스 유전체를 제작할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 베큘로바이러스 유전체(genome)를 함유하는 재조합 베큘로바이러스를 제공한다. 본 발명의 재조합 베큘로바이러스는 곤충세포를 감염시켜 HAV 항원 및 HEV 항원을 동시에 안정적으로 생산할 수 있게 한다. 본 발명의 재조합 베큘로바이러스 유전체를 곤충세포에 형질감염시키면 본 발명의 재조합 베큘로바이러스를 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 베큘로바이러스에 감염되어 HAV 항원 및 HEV 항원을 동시 생산하는 곤충세포를 제공한다.
상기와 같은 재조합 베큘로바이러스 전이벡터, 재조합 베큘로바이러스 전이벡터 함유 대장균, 재조합 베큘로바이러스 유전체, 재조합 베큘로바이러스 및 곤충세포를 사용하면 본 발명의 HAV 항원 및 HEV 항원 동시 생산방법을 효율적으로 적용할 수 있다.
본 발명에 따르면 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원을 동시에 안정적으로 생산할 수 있다. 또한, 생산된 항원은 이들 두 가지 바이러스의 감염을 동시에 예방하기 위한 백신이나 감염 여부를 진단하기 위한 키트로 유용하게 사용할 수 있다. 상기 바이러스들이 가축으로부터 감염될 수 있는 만큼, 본 발명의 백신과 키트를 사용하여 가축을 관리하면 바이러스 보유 가능성을 차단할 수 있어 사람에게 전이되는 것을 사전에 방지할 수 있을 것으로 판단되며, 심각한 간염을 일으키는 동시 감염도 예방할 수 있어 질병관리에 큰 도움을 줄 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 베큘로바이러스 전이벡터(pFastBacTMDual HEV ORF2-HAV VP1)의 지도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 제작한 재조합 베큘로바이러스 전이벡터(pFastBacTMDual HEV ORF2-HAV VP1)에 각 표적항원 유전자가 클로닝되었는지 확인하기 위해 제한효소 처리하여 전기영동한 사진이다. (A)와 (B)의 1번 lane은 분자량 마커이고 (A)의 2번 lane은 KpnI과 NcoI으로 처리한 경우, (B)의 2번 lane은 SalI과 HindIII로 처리한 경우이다. HAV VP1 유전자에 NcoI 제한효소 인식부위가 존재하기 때문에 (A)의 2번 lane에서 2개가 아닌 3개의 밴드가 확인된다.
도 3은 본 발명의 생산방법으로 생산한 HAV 항원 및 HEV 항원의 진위여부를 확인하기 위해 HAV VP1 단백질에 대한 항체(B)와 HEV ORF2 단백질에 대한 항체(A)를 사용하여 웨스턴블롯(western blot)한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재조합 베큘로바이러스 전이벡터 제조
HAV의 표적항원 발현을 위한 유전자 설계
HAV의 표준 바이러스주인 HM175를 ATCC에서 구매하여 VP1 유전자 부분을 PCR을 통해 증폭하고, 염기서열을 확인하였다. 증폭 시 발현 개시 코돈(start codon)인 ATG와 종결 서열(stop sequence)인 TAG가 포함되도록 설계하였다. 또한 전이벡터 클로닝을 위해 PCR 프라이머에 SalI과 HindIII 인식 서열을 포함시켰다.
HEV의 표적항원 발현을 위한 유전자 설계
HEV ORF2(캡시드) 유전자를 곤충세포 발현체계에 적합하도록 코돈 최적화(codon optimization)하였다. HEV ORF2 단백질의 112 ~ 660번째 아미노산이 발현되도록 하고 발현 개시 코돈인 ATG와 종결 서열인 TAG를 포함(서열번호 4)하며, 클로닝을 위해 BamHI/XhoI 제한효소인식부위를 추가로 포함하도록 설계하여 DNA를 인공합성하였다.
HEV의 표적항원 유전자의 발현 확인
합성된 HEV 표적항원 유전자(ORF2의 일부를 코딩)는 BamHI/XhoI site를 이용하여 pFastBac_HT-B vector에 클로닝(HEV-ORF2/pFastBac_HT_B) 한 후 발현을 시도하여 단일 발현체계를 검증한 결과 정상적으로 표적항원이 발현되는 것을 확인하였다.
재조합 베큘로바이러스 전이벡터 제조
상기 HEV-ORF2/pFastBac_HT_B 재조합 벡터를 NcoI/KpnI으로 처리하여 표적항원 유전자(ORF2) DNA 단편을 얻었고 같은 제한효소부위를 이용하여 pFastBac Dual vector에 클로닝 하였다. PCR 증폭을 통해 수득한 HAV VP1 유전자 DNA 단편을 SalI/HindIII site를 이용하여 ORF2가 클로닝 된 pFastBac Dual vector에 클로닝 하였다(도 2 참조).
이의 결과, 도 1과 같은 재조합 베큘로바이러스 전이벡터(pFastBacTMDual HEV ORF2-HAV VP1)가 완성되었다.
클로닝은 대장균(DH5a)을 숙주세포로 사용하여 수행하였으며, 최종 선별된 클론 즉 상기 재조합 베큘로바이러스 전이벡터를 함유하는 대장균은 고체배지 계대배양 및 글리세롤 스탁(stock)의 형태로 보관하면서 사용하였다.
실시예 2. 재조합 베큘로바이러스 유전체 제조
상기 실시예 1에서 최종 클로닝된 재조합 전이벡터를 순수 대량 추출한 다음, 열충격(heat shock) 방법으로 DH10Bac E. coli(invitrogen)에 도입하여 형질전환(transformation)하였다. 형질전환된 DH10Bac을 3종의 항생제(Gentamycin, Kanamycin, tetracyclin) 및 염색제(IPTG, X-gal)가 함유된 배지에서 48시간 배양하여 흰색 콜로니를 대상으로 콜로니 PCR을 통해 재조합 Bacmid(베큘로바이러스 유전체 DNA)를 최종 선발하였다.
실시예 3. 재조합 베큘로바이러스 제조
상기 실시예 2에서 선발된 HEV-ORF2/HAV-VP1을 포함하는 Bacmid를 대량 순수 추출한 뒤, Sf-9 곤충세포를 형질감염(transfection)시켰다(Cellfectin 이용). 형질감염 72시간 후, P0 재조합 베큘로바이러스를 수거하였고, Sf9 세포에 계대하여 P1 바이러스를 수거하였으며, 향후 바이러스를 지속 계대하였다. 대량의 단백질을 생산하기 위하여 향후 계대에는 High-5 cell을 사용하였다.
실시예 4. HAV 표적항원 및 HEV 표적항원 생산 곤충세포 제조
상기 실시예 4에서 수거한 베큘로바이러스로 Sf9 세포를 감염시키고 4 ~ 6일 경과 후 90% 이상 CPE(세포변성효과)를 나타낼 때 -70℃에서 3회 freezing-thawing을 반복하고 배양 상층액을 수거하였다. 수거된 배양 상층액에서 면역블로팅을 한 결과 각각의 VP1(Abnova) 및 ORF2(LSBio 및 Millipore) 단클론항체에 대한 반응성을 확인하였다(도 3 참조).
<110> REPUBLIC OF KOREA (Management : Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Dual expression of the structural proteins of hepatitis A virus and hepatitis E viurs and its applications as a vaccine or a diagnostic tool <130> PA140402-C01 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 300 <212> PRT <213> hepatitis A virus <400> 1 Val Gly Asp Asp Ser Gly Gly Phe Ser Thr Thr Val Ser Thr Glu Gln 1 5 10 15 Asn Val Pro Asp Pro Gln Val Gly Ile Thr Thr Met Lys Asp Leu Lys 20 25 30 Gly Lys Ala Asn Arg Gly Lys Met Asp Val Ser Gly Val Gln Ala Pro 35 40 45 Val Gly Ala Ile Thr Thr Ile Glu Asp Pro Val Leu Ala Lys Lys Val 50 55 60 Pro Glu Thr Phe Pro Glu Leu Lys Pro Gly Glu Ser Arg His Thr Ser 65 70 75 80 Asp His Met Ser Ile Tyr Lys Phe Met Gly Arg Ser His Phe Leu Cys 85 90 95 Thr Phe Thr Phe Asn Ser Asn Asn Lys Glu Tyr Thr Phe Pro Ile Thr 100 105 110 Leu Ser Ser Thr Ser Asn Pro Pro His Gly Leu Pro Ser Thr Leu Arg 115 120 125 Trp Phe Phe Asn Leu Phe Gln Leu Tyr Arg Gly Pro Leu Asp Leu Thr 130 135 140 Ile Ile Ile Thr Gly Ala Thr Asp Val Asp Gly Met Ala Trp Phe Thr 145 150 155 160 Pro Val Gly Leu Ala Val Asp Thr Pro Trp Val Glu Lys Glu Ser Ala 165 170 175 Leu Ser Ile Asp Tyr Lys Thr Ala Leu Gly Ala Val Arg Phe Asn Thr 180 185 190 Arg Arg Thr Gly Asn Ile Gln Ile Arg Leu Pro Trp Tyr Ser Tyr Leu 195 200 205 Tyr Ala Val Ser Gly Ala Leu Asp Gly Leu Gly Asp Lys Thr Asp Ser 210 215 220 Thr Phe Gly Leu Val Ser Ile Gln Ile Ala Asn Tyr Asn His Ser Asp 225 230 235 240 Glu Tyr Leu Ser Phe Ser Cys Tyr Leu Ser Val Thr Glu Gln Ser Glu 245 250 255 Phe Tyr Phe Pro Arg Ala Pro Leu Asn Ser Asn Ala Met Leu Ser Thr 260 265 270 Glu Ser Met Met Ser Arg Ile Ala Ala Gly Asp Leu Glu Ser Ser Val 275 280 285 Asp Asp Pro Arg Ser Glu Glu Asp Lys Arg Phe Glu 290 295 300 <210> 2 <211> 550 <212> PRT <213> hepatitis E viurs <400> 2 Met Ala Val Ser Pro Ala Pro Asp Thr Ala Pro Val Pro Asp Val Asp 1 5 10 15 Ser Arg Gly Ala Ile Leu Arg Arg Gln Tyr Asn Leu Ser Thr Ser Pro 20 25 30 Leu Thr Ser Ser Val Ala Ala Gly Thr Asn Leu Val Leu Tyr Ala Ala 35 40 45 Pro Leu Asn Pro Leu Leu Pro Leu Gln Asp Gly Thr Asn Thr His Ile 50 55 60 Met Ala Thr Glu Ala Ser Asn Tyr Ala Gln Tyr Arg Val Val Arg Ala 65 70 75 80 Thr Ile Arg Tyr Arg Pro Leu Val Pro Asn Ala Val Gly Gly Tyr Ala 85 90 95 Ile Ser Ile Ser Phe Trp Pro Gln Thr Thr Thr Thr Pro Thr Ser Val 100 105 110 Asp Met Asn Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val Gln Pro 115 120 125 Gly Ile Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His Tyr Arg 130 135 140 Asn Gln Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr Thr Gly Val Ala Glu Glu Glu 145 150 155 160 Ala Thr Ser Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro Val Asn 165 170 175 Ser Tyr Thr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu Asp Phe 180 185 190 Ala Leu Glu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn Thr Asn Thr 195 200 205 Arg Val Ser Arg Tyr Thr Ser Thr Ala Arg His Arg Leu Arg Arg Gly 210 215 220 Ala Asp Gly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala Ala Thr Arg Phe Met 225 230 235 240 Lys Asp Leu His Phe Thr Gly Thr Asn Gly Val Gly Glu Val Gly Arg 245 250 255 Gly Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly 260 265 270 Leu Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser 275 280 285 Arg Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr 290 295 300 Ser Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Thr Ile Pro His Asp 305 310 315 320 Ile Asp Leu Gly Asp Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln 325 330 335 His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe 340 345 350 Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala 355 360 365 Glu Tyr Asp Gln Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Asn Pro Met Tyr Val 370 375 380 Ser Asp Thr Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val 385 390 395 400 Ala Arg Ser Leu Asp Trp Ser Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu 405 410 415 Thr Thr Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Tyr Val Leu Pro Leu Arg 420 425 430 Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro 435 440 445 Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Ile Leu Ile Glu Asn Ala 450 455 460 Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala 465 470 475 480 Gly Pro Thr Ser Ile Ser Ala Val Gly Val Leu Ala Pro His Ser Ala 485 490 495 Leu Ala Val Leu Glu Asp Thr Val Asp Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr 500 505 510 Phe Asp Asp Phe Cys Pro Glu Cys Arg Thr Leu Gly Leu Gln Gly Cys 515 520 525 Ala Phe Gln Ser Thr Ile Ala Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Val 530 535 540 Gly Lys Thr Arg Glu Ser 545 550 <210> 3 <211> 900 <212> DNA <213> hepatitis A virus <400> 3 gttggagatg attctggagg tttttcaaca acagtttcta cagaacagaa tgttccagat 60 ccccaagttg gtataacaac catgaaagat ttgaaaggaa aagctaacag agggaaaatg 120 gatgtttcag gagtacaagc acctgtggga gctatcacaa caattgagga tccagtttta 180 gcaaagaaag tacctgagac atttcctgaa ttgaaacctg gagaatccag acatacatca 240 gatcatatgt ccatctacaa gtttatggga aggtctcatt tcttgtgcac ttttacattc 300 aattcaaata ataaagagta cacatttcct ataaccttgt cttcaacctc taatcctcct 360 catggtttgc catcaacact gaggtggttt ttcaacttgt ttcagttgta tagagggcct 420 ttagatctga caattattat tacaggagca actgatgtag atggcatggc ctggttcact 480 ccagtaggtc ttgccgttga tactccttgg gtagagaagg agtcagcttt gtctattgac 540 tacaaaactg ctcttggagc tgtcagattt aacacaagga gaacagggaa cattcagatt 600 agattaccat ggtattctta tttatatgct gtgtctggag cactggatgg tttgggtgac 660 aagacagatt ctacatttgg attggtttct attcagattg caaattacaa tcattctgat 720 gaatacttgt cttttagttg ttatttgtct gtcacagaac aatcagagtt ttattttccc 780 agagctccat tgaactcaaa tgccatgtta tccactgaat caatgatgag cagaattgca 840 gctggagact tggagtcatc agtggatgat cctagatcag aggaagataa aagatttgag 900 900 <210> 4 <211> 1680 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized partial sequence of ORF2(hepatitis E viurs) <400> 4 atggcggttt caccggcccc cgacacagct cccgtaccag acgttgactc gcggggtgct 60 atcctgcgcc ggcagtacaa ccttagcacc agtccgctta cttcatctgt cgctgctggt 120 acgaacctgg ttctctatgc cgcccctctg aaccctctct tgcccctcca ggatggcacc 180 aacacgcata ttatggctac tgaggcgtct aattacgctc agtatcgggt tgtacgagcc 240 acgatccgct atcgaccact ggtgccaaac gctgttggtg gctatgcaat ctctatttct 300 ttctggcctc aaactacgac cacccccacc tcagttgaca tgaacagtat tacctccacc 360 gatgtccgca ttttggttca gcccggtatt gcctccgaat tggtgatccc tagtgagcgc 420 ctccattatc gcaatcaagg ctggagatct gtagaaacca caggggtggc cgaggaggaa 480 gctacatccg ggctggtcat gctttgtatt cacgggtctc ctgttaactc ctataccaac 540 acaccataca ccggtgccct ggggctctta gattttgcat tagagcttga attcagaaat 600 ttgacacccg ggaacacgaa cacccgggtt tcccggtaca ccagcacagc caggcataga 660 ctgcgcagag gtgctgatgg gactgcagag cttaccacca cagcagctac aaggttcatg 720 aaggacttgc acttcaccgg cacaaatggc gttggtgagg tgggtcgcgg catagctctg 780 acactgttta accttgctga cacccttctt ggtgggttac cgacagaatt gattagttcc 840 gccgggggac aactgtttta ctcccgccct gtcgtctctg ccaacggcga gccgacggtt 900 aagctctaca catctgttga aaatgcgcag caggacaagg gcataaccat cccacacgac 960 attgacctgg gcgactcacg tgtggttatt caggattacg acaatcagca cgagcaagac 1020 cgacctactc caagtccagc cccctctaga cctttctcag tcctacgcgc caatgacgtt 1080 ctgtggctct ccctcaccgc cgctgagtac gatcagacta catatgggtc gtccaccaac 1140 cccatgtacg tctccgacac ggtcactcta gtcaatgtgg ccactggcgc acaggctgtt 1200 gcacgctctc ttgattggag caaagtcact ctggacggcc gccccctgac taccattcag 1260 cagtatagca agacattcta cgtgctcccg ctcaggggga agctgtcctt ttgggaggct 1320 ggcaccacta aagccggcta cccatacaat tacaatacca ccgcttcgga tcagattctc 1380 attgagaacg cggctggcca cagggttgct atctctacct ataccaccag cttgggtgcc 1440 ggccctacca gcatatccgc cgttggtgtg ctagccccac acagtgcact cgccgtcctt 1500 gaggatacgg ttgactaccc cgcacgtgct cacactttcg atgatttctg ccctgaatgc 1560 agaacacttg gacttcaggg ttgtgcattc cagagcacta ttgctgaact gcagcggctt 1620 aaaatgaagg tagggaaaac ccgggagagc taactcatcc cctttgtgcc cccttcatga 1680 1680 <210> 5 <211> 1983 <212> DNA <213> hepatitis E viurs <400> 5 atgcgcccta gggctgttct gttgttgctc ttcgtgcttc tgcctatgct gcccgcgcca 60 ccggccggcc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca acggcggtgc cggcggtggt 120 ttctggggtg acagggttga ttctcagccc ttcgccctcc cctatattca tccaaccaac 180 cccttcgctg ccgatgtcgt ttcacaaccc ggggctggag ctcgccctcg acagccgccc 240 cgcccccttg gctccgcttg gcgtgaccag tcccagcgcc cctccactgc cccccgtcgt 300 cgatctgccc cagctggggc tgcgccgctg actgctgtat caccggcccc cgacacagct 360 cctgtacctg atgttgactc acgtggtgct atcctgcgcc ggcagtacaa tctgtctacg 420 tccccgctca cgtcatctgt cgctgctggt accaacctgg ttctctatgc cgccccgctg 480 aatcctctct tgcccctcca ggatggcacc aacactcata ttatggctac tgaggcgtcc 540 aattatgctc agtatcgggt tgttcgagct acgatccgtt atcgcccgct ggtgccaaat 600 gctgttggtg gctatgctat ctctatttct ttctggcctc aaactacaac cacccctact 660 tcagttgaca tgaactctat tacctccact gatgtcagga ttttggttca gcccggtatt 720 gcctccgagt tagtcatccc tagtgagcgc cttcattacc gcaatcaagg ctggcgctct 780 gtagagacca cgggcgtggc cgaggaggaa gctacctccg gtctggtaat gctttgcatt 840 cacggttctc ctgttaactc ctatactaac acaccttaca ctggtgcatt ggggctcctt 900 gattttgcat tagagcttga attcagaaat ttgacacccg ggaacactaa cacccgtgtt 960 tcccggtaca ccagcacagc ccgccatcgg ctgcgccgcg gtgctgatgg gaccgcagag 1020 cttaccacca cagcagccac acgtttcatg aaggacttgc atttcaccgg cacgaacggc 1080 gttggtgagg tgggtcgcgg tatagctcta acactgttta accttgctga tacgcttctt 1140 ggtggtttac cgacagaatt gatttcgtcg gccgggggcc aactgtttta ctcccgccct 1200 gtcgtctcgg ccaatggcga gccgacggtt aagttatata catctgttga gaatgcgcag 1260 caggacaagg gcattaccat cccacacgat atagatctgg gtgattcccg tgtggttatt 1320 caggattatg ataaccagca cgagcaagac cgacctactc cgtcaccagc cccctctcgc 1380 cctttctcag tccttcgcgc caatgatgtt ctgtggctct ccctcaccgc cgctgagtac 1440 gatcagacta catatgggtc gtccaccaac cctatgtatg tctccgatac ggtcacgcta 1500 gttaatgtgg ccactggtgc tcaggctgtt gcccgctctc ttgattggtc taaagtcact 1560 ctggatggcc gccccctcac taccattcag cagtattcaa agacattcta tgttctcccg 1620 ctccgcggga agctgtcctt ttgggaggct ggtaccacta aggccggcta cccgtataat 1680 tataatacca ctgctagtga tcaaattttg attgagaacg cggctggcca ccgtgttgct 1740 atctctacct ataccactag cttgggtgcc ggccctacct cgatttccgc cgttggtgtg 1800 ctagccccac actcggctct cgccgtcctt gaggatactg ttgattaccc tgctcgtgct 1860 catacttttg atgatttctg cccggagtgc cgcacccttg gtttgcaggg ttgtgcattc 1920 cagtctacta ttgctgagct tcagcgtctt aaaatgaagg taggtaaaac ccgggagtct 1980 taa 1983

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자를 함께 곤충세포에서 발현시키는 것을 특징으로 하는 A형 간염 바이러스(HAV, hepatitis A virus) 항원 및 E형 간염 바이러스(HEV, hepatitis E virus) 항원 동시 생산방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고,
    상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원 동시 생산방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 각 유전자의 발현이 p10 프로모터 또는 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터에 의해 조절되도록 하는 것을 특징으로 하는 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원 동시 생산방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원을 함유하는 A형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스 동시 예방 백신.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원을 함유하는 A형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스 동시 진단 키트.
  6. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고,
    상기 각 유전자의 전사를 조절하는 프로모터를 포함하여 이루어지는 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원 동시 생산용 재조합 베큘로바이러스 전이벡터.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고,
    상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원 동시 생산용 재조합 베큘로바이러스 전이벡터.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 프로모터는 p10 프로모터 또는 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터인 것을 특징으로 하는 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원 동시 생산용 재조합 베큘로바이러스 전이벡터.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 재조합 베큘로바이러스 전이벡터는 도 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원 동시 생산용 재조합 베큘로바이러스 전이벡터.
  10. 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 재조합 베큘로바이러스 전이벡터를 함유하는 대장균.
  11. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고,
    상기 각 유전자의 전사를 조절하는 프로모터를 포함하여 이루어지는 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원 동시 생산용 재조합 베큘로바이러스 유전체(genome).
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고,
    상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원 동시 생산용 재조합 베큘로바이러스 유전체(genome).
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 프로모터는 p10 프로모터 또는 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터인 것을 특징으로 하는 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원 동시 생산용 재조합 베큘로바이러스 유전체(genome).
  14. 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 재조합 베큘로바이러스 유전체(genome)를 함유하는 재조합 베큘로바이러스.
  15. 제 14항의 재조합 베큘로바이러스에 감염되어 A형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원을 동시 생산하는 곤충세포.
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