ES2336282T3 - Proteinas recombinantes de una cepa paquistani de hepatitis e y su utilizacion en metodos de diagnostico y vacunas. - Google Patents
Proteinas recombinantes de una cepa paquistani de hepatitis e y su utilizacion en metodos de diagnostico y vacunas. Download PDFInfo
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Abstract
SE DESCUBRE UN LINAJE DEL VIRUS DE HEPATITIS E DE PAQUISTAN (SAR55) IMPLICADO EN LA HEPATITIS NO-A, NO-B TRANSMITIDA EPIDEMICA O ENTERICAMENTE, AHORA LLAMADO HEPATITIS E. EL INVENTO SE REFIERE A LA EXPRESION DE LA REGION ESTRUCTURAL TOTAL DE SAR-55, DESIGNADO ESTRUCTURA 2 DE LECTURA ABIERTA (ORF-2), EN UN SISTEMA DE EXPRESION EUCARIOTICA. LA PROTEINA EXPRESADA ES CAPAZ DE FORMAR PARTICULAS PARECIDAS AL VIRUS HEV QUE PUEDEN SERVIR COMO ANTIGENOS EN INMUNOENSAYOS DE DIAGNOSTICO Y COMO INMUNOGEN O VACUNA PARA PROTEGER CONTRA INFECCION POR HEPATITIS E.
Description
Proteínas recombinantes de una cepa paquistaní
de hepatitis E y su utilización en métodos de diagnóstico y
vacunas.
El invento es en el campo de la virología de la
hepatitis. Más específicamente, este invento se refiere a un método
para producir una proteína de hepatitis inmunogénica, a saber, la
expresión de una secuencia que codifica el marco de lectura abierta
2 completo del virus de la hepatitis E en una célula hospedante de
insecto transformada o transfectada con un vector de expresión de
baculovirus que comprende dicha secuencia codificante, al vector de
expresión de baculovirus y a la célula hospedante de insecto.
Las epidemias de hepatitis E, una hepatitis
no-A/no-B entéricamente transmitida,
ha sido documentada en Asia, África y América Central (Balayan, M.
S, (1987), Soviet Medical Reviews, Section E, Virology Reviews,
Zhdanov, V. M. (ed), Chur, Suiza: Harwood Academic Publishers, vol.
2, 235-261; Purcell, R. H. y otros (1988) en
Zuckerman. A. J. (ed), "Viral Hepatitis and Liver Disease",
Nueva York: Alan R. Liss, 131-137; Bradleay, D. W.
(1990), British Medical Bulletin, 46; 442-461;
Ticehurst, J. R. (1991) en Hollinger, F. B., Lemon, S. M., Margolis,
H. S. (eds); "Viral Hepatitis and Liver disease", Williams and
Wilkins, Baltimore, 501-513). Los casos de
hepatitis esporádica, que se suponen son de hepatitis E, dan cuenta
de hasta el 90% de las hepatitis documentadas en países donde el
virus de la hepatitis E (HEV) es endémica. La necesidad para el
desarrollo de un ensayo serológico para la detección de anticuerpos
anti-HEV en el suero de individuos infectados es
ampliamente reconocida en el campo, pero la concentración tan baja
de HEV secretada por los humanos o animales infectados hizo
imposible usar tal HEV como fuente de antígenos para ensayos
serológicos y aunque el éxito limitado fue documentado en la
propagación de HEV en cultivos celulares (Huang, R. T y otros
(1992), J. Gen. Virol., 73: 1143-1148), el cultivo
celular es actualmente demasiado ineficaz para producir las
cantidades de antígeno requeridas para ensayos serológicos.
Recientemente, esfuerzos importantes en todo el
mundo para identificar secuencias genómicas virales asociadas con
la hepatitis E han resultado en el clonaje de los genomas de un
número limitado de cepas de HEV (Tam, A. W. Y otros. (1991),
Virology, 185: 120-131; Tsarev, S. A y otros (1992),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 559-563; Fry, K. E.
y otros (1992), Virus Genes, 6: 173-185). Los
análisis de secuencias de ADN han llevado a los investigadores a
hipotetizar que el genoma de HEV está organizado en tres marcos de
lectura abiertos (ORFs) y a hipotetizar que estos ORFs codifican
proteínas HEV intactas.
Una secuencia de ADN parcial del genoma de una
cepa HEV de Burma (Myanmar) está descrita en Reyes y otros. 1990,
Science, 247: 1335-1339. Tam y otros, 1991, y Reyes
y otros, solicitud de patente PCT WO 91/15603 publicada el 17 de
Octubre, 1991 describe la secuencia nucleotídica completa y una
secuencia aminoacídica deducida de la cepa de Burma de HEV. Estos
autores hipotetizaron que tres marcos de lectura abiertos (ORF)
están contenidos dentro de las secuencias de esta cepa.
Ichikawa y otros, 1991, Microbiol. Immunol., 35:
535-543, describe el aislamiento de una serie de
clones de 240-320 nucleótidos en longitud tras el
cribado de una librería de expresión lgt11 con sueros de monos
cynomolgus infectados con HEV. La proteína recombinante expresada
por un clon fue expresada en E. Coli. Esta proteína de
fusión está codificada por la región 3' de ORF-2 de
la cepa de Myanmar de HEV.
La expresión de proteínas adicionales
codificadas en la región 3' de ORF-2 de una cepa
mejicana de HEV y de una cepa burmesa de HEV está descrita en
Yarbough y otros, 1991 J: Virology, 65: 5790-5797.
Este artículo describe el aislamiento de dos clones de cADN
derivados de HEV. Estos clones codifican las proteínas en la región
3' de ORF-2. Los clones fueron expresados en E.
Coli como proteínas de fusión.
Purdy y otros, 1992, Archives of Virology, 123:
335-349, y Favorov y otros, 1992. J. of Medical
Virology, 36: 246-250, describe la expresión de un
fragmento de proteína ORF-2 de la cepa de Burma en
E. Coli. Estas referencias así como las previamente
descritas, sólo describen la expresión de una porción del gen
ORF-2 usando sistemas de expresión bacterianos. La
expresión con éxito de la proteína ORF-2 de longitud
completa no ha sido descrita hasta el presente invento.
La comparación de la organización del genoma y
la estructura morfológica de HEV con la de los torovirus reveló que
el HEV está mas íntimamente relacionado con los calicivirus. Es
interesante que las proteínas estructurales de calicivirus están
codificadas por la porción 3' de su genoma (Neil, J.D. y otros
(1991) J. Virol., 65: 5440-5447; y Carter, M. J. y
otros (1992), J. Arch. Virol., 122: 223-235) y
aunque no hay evidencia directa de que la parte 3' terminal del
genoma de HEV también codifique las proteínas estructurales,
expresión de ciertas porciones pequeñas de la región 3' del genoma
en las células de bacteria dio como resultado la producción de
proteínas reactivas con suero anti-HEV en ELISA y
transferencias Western (Yarborough, y otros, (1991); Ichikawa y
otros, (1991), Vavorov y otros (1992) y Dwason, G. J y otros (1992)
J. Virol. Meth; 38: 175-186). Sin embargo, la
función de la proteína ORF-2 como una proteína
estructural no se demostró hasta el presente invento.
Las proteínas pequeñas codificadas por una
porción del gen ORF-2 han sido usadas en
inmunoensayos para detectar anticuerpos frente a HEV en sueros de
animales. El uso de proteínas pequeñas expresadas en bacterias como
antígenos en inmunoensayos serológicos tiene varias desventajas
posibles. Primero, la expresión de estas proteínas pequeñas en
células de bacterias dan como resultado con frecuencia problemas de
solubilidad y reactividad cruzada no específica de sueros de
pacientes con proteínas de E. Coli cuando lisados de E.
Coli en bruto son usados como antígenos en inmunoensayos
(Purdy y otros (1992)). Segundo, el uso de transferencias Western
como ensayos serológicos de elección para anticuerpos
anti-HEV en epidemiología rutinaria es impráctico
debido a las limitaciones de tiempo y de costes. Un ELISA que usa
péptidos pequeños derivados de la parte 3' terminal del genoma HEV
resultó en la detección de sólo 41% positivos de pacientes
diagnosticados infectados por HEV. Tercero, se ha mostrado que para
muchos virus, incluyendo Picornaviridae que es la familia más
cercana a Caliciviridae, epítopos antigénicos e inmunogénicos
importantes son altamente conformacionales (Lemon, S. M. y otros
(1991), en Hollinger, F. B., Lemon, S.M., Margolis, H. S. (eds):
"Viral Hepatitis and Liver Disease", Williams and Wilkins,
Baltimore, 20-24). Por esta razón, se cree que la
expresión en un sistema eucariótico de un ORF completo que codifica
un gen HEV intacto daría como resultado la producción de una
proteína que podría formar partículas de tipo
HEV-virales. Tal proteína ORF completa tendría una
estructura inmunológica más cercana a la de una proteína de cápside
nativa que las proteínas más pequeñas anteriormente mencionadas que
representan sólo porciones de las proteínas estructurales de HEV.
Por lo tanto, estas proteínas ORF completas muy probablemente
servirían como un antígeno más representativo y un inmunógeno más
eficiente que las proteínas más pequeñas actualmente usadas.
El presente invento se refiere a:
Un método para producir una proteína de
hepatitis inmunogénica que comprende:
- Cultivar una célula hospedante de insecto transformada o transfectada con un vector de expresión de baculovirus, dicho vector de expresión comprende ADN, dicho ADN tiene una secuencia, dicha secuencia consiste en los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 a 660 de una proteína de marco de lectura abierta 2 del virus de la hepatitis E, en condiciones apropiadas para producir la proteína de hepatitis inmunogénica.
Preferiblemente, el presente invento se refiere
al método anterior, en el que dicha secuencia de ADN consiste
en:
a) nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID Nº:
4,
b) una secuencia de ADN que codifica la
secuencia aminoácido de la SEQ ID Nº: 2 o
c) una secuencia de ADN que codifica una
secuencia de aminoácidos que tiene más del 90% de homología con la
secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº:2.
Por otro lado, el presente invento se refiere a
un vector de expresión de baculovirus que comprende ADN, teniendo
dicho ADN una secuencia, consistiendo dicha secuencia en los
nucleótidos que codifica los aminoácidos 1 a 660 de la proteína del
marco de lectura abierta 2 del virus de hepatitis E.
Preferiblemente el vector de expresión de
baculovirus es un vector de expresión, en el que dicha secuencia de
ADN consiste en:
a) nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID Nº:
4,
b) una secuencia de ADN que codifica las
secuencias aminoacídicas de la SEQ ID Nº: 2, o
c) una secuencia que codifica una secuencia
aminoacídica que tiene más del 90% de homología con la secuencia
aminoacídica de la SEQ ID Nº: 2.
El presente invento también se refiere a una
célula hospedante de insecto que comprende el vector de expresión
anteriormente mencionado.
Este invento proporciona el uso de secuencias de
ácidos nucleicos sintéticos capaces de dirigir la producción de
proteínas de HEV recombinantes, así como secuencias de ácidos
nucleicos naturales equivalente. Tales secuencias de ácidos
nucleicos naturales pueden ser aisladas a partir de cADN o librerías
genómicas a partir de las cuales los genes capaces de dirigir la
síntesis de las proteínas HEV puede ser identificadas y aisladas.
Para el propósito de esta aplicación, las secuencias de ácidos
nucleidos se refieren al ARN, ADN, cADN o cualquier variante
sintética de las mismas que codifican para proteínas.
El invento también se refiere a proteínas de HEV
aisladas y parcialmente purificadas y variantes de las mismas
codificadas por el genoma de HEV de SAR-55 o
codificadas por secuencias de ácidos nucleicos sintéticas y en
particular a proteínas recombinantes codificadas por al menos un
marco de lectura abierta completa de HEV, como resultado del método
del presente invento.
El invento también se refiere al método para
preparar proteínas de HEV recombinantes derivadas de una secuencia
de HEV genómica clonando el ácido nucleico e insertando el cADN en
un vector de expresión y expresar la proteína recombinante en una
célula hospedante dentro del ámbito al alcance del método del
presente invento.
\newpage
La Figura 1 muestra el vector recombinante usado
para expresar la proteína ORF-2 completa del genoma
de la cepa HEV SAR-55.
Las Figuras 2A y 2B son geles de
poliacrilamida-dodecilsulfato sódico
(SDS-PAGE) en los que los lisados celulares de
células de insecto infectadas con baculovirus salvaje o baculovirus
recombinante (que contiene el gen que codifica
ORF-2) fueron o bien teñidos con Coomassie blue (A)
o sometidos a transferencia Western con suero de un chimpancé
infectado con HEV (B).
Las Figuras 3A y 3B muestran micrografías
inmunoelectrónicas (IEM) de partículas de tipo viral de 30 y 20 nm
respectivamente, que se forman como resultado de la expresión de la
proteína ORF-2 en células de insecto infectadas
recombinantes.
La Figura 4 muestra los resultados de un ELISA
usando como antígeno, ORF-2 recombinante que fue
expresado a partir de células de insecto que contienen el gen que
codifican el ORF-2 completo. Los niveles de
anticuerpo anti-HEV en suero fueron determinados a
diversos tiempos tras la inoculación de monos cynomolgus con o bien
la cepa Mejicana (Cyno-80A82,
Cyno-9A97 y Cyno 83) o bien la cepa Paquistaní
(Cyno-374) de HEV.
La Figura 5A-D muestra los
resultados de un ELISA usando como antígeno, el
ORF-2 recombinante que fue expresado a partir de
células de insecto que contiene el gen que codifica el
ORF-2 completo. Los niveles de IgG o IgM
anti-HEV en suero fueron determinados a lo largo del
tiempo tras la inoculación de dos chimpancés con HEV.
Las Figuras 6A-J muestran una
comparación de los datos de ELISA obtenidos usando el antígeno de
la proteína ORF-2 completa recombinante derivada de
SAR-55 como el antígeno vs. una proteína
ORF-2 parcial recombinante derivada de la cepa de
Burma de HEV (Genelabs).
El presente invento se refiere a un método para
producir una proteína de hepatitis inmunogénica que comprende:
- el cultivo de una célula hospedante de insecto transformada o transfectada con un vector de expresión de baculovirus, dicho vector de expresión comprende ADN, dicho ADN tiene una secuencia, dicha secuencia consiste en nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 a 660 de una proteína de marco de lectura abierta 2 del virus de hepatitis E, en condiciones apropiadas para producir la proteína inmunogénica de hepatitis.
El presente invento describe una cepa aislada y
sustancialmente purificada del virus de hepatitis E (HEV) de
Paquistán, SAR-55. El presente invento también
describe la clonación de los genes virales que codifican las
proteínas de HEV y la expresión de las proteínas recombinantes
usando un sistema de expresión. Más específicamente, el presente
invento describe la clonación y expresión de las estructuras de
lectura abierta (ORF) de HEV derivadas de
SAR-55.
El presente invento describe las proteínas HEV
aisladas. Preferiblemente, las proteínas HEV, como resultado del
método del presente invento, son sustancialmente homólogas, y más
preferiblemente biológicamente equivalentes, a las proteínas HEV
nativas. Por "biológicamente equivalentes" como se usa a través
de la especificación y las reivindicaciones, se refiere a que las
composiciones son capaces de formar partículas virales semejantes y
son inmunogénicas. Las proteínas HEV del presente invento pueden
estimular también la producción de los anticuerpos protectores tras
la inyección en un mamífero que serviría para proteger al mamífero
tras el desafío con un tipo salvaje HEV. Por "sustancialmente
homóloga" como se usa a través de la especificación consiguiente
y las reivindicaciones, se refiere a un grado de homología en la
secuencia aminoacídica con las proteínas HEV nativas.
Preferiblemente, el grado de homología es mayor de un 70%,
preferiblemente mayor del 90%, con un grupo particularmente
preferido de proteínas que son más del 99% homólogas con las
proteínas HEV nativas.
Las proteínas HEV preferidas producidas por el
método del presente invento son aquellas proteínas que están
codificadas por los genes ORF que incluyen el gen
ORF-2. De interés particular son las proteínas
codificadas por el gen ORF-2 del HEV y más
particularmente de las proteínas codificadas por el gen
ORF-2 de la cepa SAR-55 del HEV.
Las proteínas producidas por el método del presente invento,
codificadas por el gen ORF-2, forman partículas
virales semejantes. Las secuencias aminoacídicas de las proteínas
ORF-1, ORF-2 y ORF-3
se muestran a continuación como SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2, y SEQ
ID NO.: 3, respectivamente;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas de tres letras siguen la
nomenclatura corta convencional para los veinte aminoácidos
presentes de manera natural.
Las proteínas HEV recombinantes pueden consistir
en al menos una proteína ORF pero incluyen siempre aminoácidos 1 a
660 de la proteína de marco de lectura abierta 2 del virus de la
hepatitis E. Otras proteínas recombinantes hechas de más de una de
las mismas proteínas ORF o diferentes puede ser hechas para alterar
las propiedades biológicas de la proteína.
Se contempla que las adiciones, sustituciones o
deleciones de los aminoácidos discretos o de secuencias discretas
de aminoácidos pueden potenciar la actividad biológica de las
proteínas de HEV.
El presente invento puede usar una secuencia de
ácidos nucleicos que es capaz de dirigir la producción de la
proteína HEV anteriormente tratada o proteínas sustancialmente
homólogas a las proteínas HEV. Esta secuencia de ácidos nucleicos,
designada SAR-55, está expuesta a continuación como
SEQ ID Nº: 4 y fue depositada en la Colección americana de cultivos
tipo (ATCC) el 17 de Septiembre de 1992.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas usadas para los nucleótidos son
las usadas normalmente en la técnica.
En una realización preferida, la secuencia de
ácidos nucleicos usada en el método del presente invento consiste
en los nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID NO:4.
La secuencia en una dirección ha sido designada
por convención como la secuencia "plus" puesto que es la cepa
que codifica la proteína de los virus ARN y ésta es la secuencia que
se muestra anteriormente como la SEQ ID NO: 4.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de los
marcos de lectura abierta del SAR-55 que tienen la
SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 y la SEQ ID NO. 3 ORF-1
se inician en el nucleótido 28 de la SEQ ID NO. 4 y se extienden
5078 nucleótidos; el ORF-2 se inicia en el
nucleótido 5147 de la SEQ ID NO. 4 y se extiende 1979 nucleótidos; y
el ORF-3 se inicia en el nucleótido 5106 de la SEQ
ID NO. 4 y se extiende 368 nucleótidos.
Las variaciones se contemplan en la secuencia de
ADN que resultará en una secuencia de ADN que es capaz de dirigir
la producción de los análogos de la proteína ORF-2.
Se debe observar que la secuencia de ADN expuesta anteriormente
puede representar una realización del presente invento. Debido a la
degeneración del código genético, se debe comprender que varias
elecciones de nucleótidos pueden ser hechas de modo que puedan
conducir a una secuencia de ADN capaz de producir las proteínas ORF
o sus análogas, incluyendo las proteínas ORF2. Como tales, las
secuencias de ADN que son equivalentes funcionalmente a las
secuencias expuestas anteriormente o que son equivalentes
funcionalmente a las secuencias que podrían dirigir la producción de
los análogos de las proteínas ORF producidas según la secuencia de
aminoácidos expuesta anteriormente, se desea que sean abarcadas
dentro del presente invento.
El presente invento describe un método para
detectar el virus de la hepatitis E en las muestras biológicas
basadas en la amplificación selectiva de los fragmentos génicos de
hepatitis E. Preferiblemente, este método utiliza un par de
cebadores de hebra simple derivados de regiones no homólogas de las
hebras opuestas de un fragmento dúplex de ADN, que a su vez es
derivado de un virus de hepatitis E cuyo genoma contiene una región
homóloga a la secuencia SAR-55 mostrada en la SEQ ID
NO.: 4. Estos cebadores pueden ser usados en un método que sigue el
proceso para amplificar las secuencias de ácidos nucleicos como se
define en el documento de patente norteamericana No. 4.683.202.
El presente invento también describe el uso de
poli u oligonucleótidos antisentido de hebra simple derivados de
las secuencias análogas al cADN SAR-55 para inhibir
la expresión de los genes de la hepatitis E. Estos poli u
oligonucleótidos antisentido pueden ser bien ADN o ARN. La secuencia
diana es típicamente un ARN mensajero y mas preferentemente, una
secuencia señal requerida para procesar o traducir el ARN. Los poli
u oligonucleótidos antisentido pueden ser conjugados a un
policatión tal como una polilisina como se describe en Lemaitre, M.
y otros (1989) Proc Natl Acad Sci USA 84:
648-652; y este conjugado puede ser administrado a
un mamífero en una cantidad suficiente para hibridar con, e inhibir
la función, del ARN mensajero.
\newpage
El primer invento incluye un método recombinante
de ADN para la fabricación de las proteínas HEV, preferiblemente
una proteína compuesta de al menos una de las proteínas ORF,
incluyendo la proteína ORF-2, más preferiblemente
al menos una proteína ORF-2. La recombinación de la
proteína ORF puede estar compuesta de una proteína ORF o de una
combinación de la misma o de diferentes proteínas ORF, que incluyen
la proteína ORF-2. Una secuencia de ácidos
nucleicos natural o sintética puede ser usada para dirigir la
producción de las proteínas HEV.
En una realización, dicho método comprende:
- (a)
- la preparación de una secuencia de ácidos nucleicos capaz de dirigir un organismo hospedante para producir una proteína de HEV; que incluye la proteína ORF-2
- (b)
- la clonación de la secuencia de ácidos nucleicos en un vector capaz de ser transferido en y replicado en un organismo hospedante, dicho vector contiene elementos operacionales para la secuencia de ácidos nucleicos;
- (c)
- la transferencia del vector que contiene ácidos nucleicos y los elementos operacionales en un organismo hospedante capaz de expresar la proteína;
- (d)
- el cultivo del organismo hospedante en las condiciones apropiadas para la amplificación del vector y la expresión de la proteína; y
- (e)
- el cultivo de la proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización del invento el método para
la síntesis del ADN recombinante de una proteína que incluye la
proteína ORF-2 codificada por los ácidos nucleicos
del HEV, preferiblemente que codifican al menos un ORF del HEV o
una combinación de la misma o de diferentes proteínas ORF que
incluyen la proteína ORF-2, más preferiblemente que
codifican al menos una proteína ORF-2,
comprende:
- (a)
- el cultivo de un organismo transformado o transfectado que contiene una secuencia de ácidos nucleicos capaz de dirigir el organismo hospedante para producir una proteína, en condiciones tales que la proteína sea producida, dicha proteína exhibe una homología sustancial a una proteína HEV nativa aislada del HEV que tiene la secuencia del aminoácido según la SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3, o la combinación de las mismas, sin embargo, incluye siempre la secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, la secuencia de ARN del
genoma viral de la cepa HEV SAR-55 fue aislada y
clonada en cADN como sigue. El ARN viral es extraído de una muestra
biológica recogida de los monos cynomolgus infectados con el
SAR-55 y el ARN viral es después transcrito
inversamente y amplificado por la reacción en cadena de la
polimerasa usando cebadores complementarios a las hebras positivas o
negativas del genoma de una cepa de HEV de Burma (Tam y
otros) o del genoma SAR-55. Los fragmentos de
PCR son subclonados en pBR322 o pGEM-3 y los
fragmentos de PCR de doble hebra fueron secuenciados.
Los vectores contemplados para el uso en el
presente invento incluyen un vector de expresión de baculovirus en
el que una secuencia de ácidos nucleicos como se describe
anteriormente, puede ser insertada, junto con cualquier elemento
operacional requerido o preferido, y cuyo vector puede ser después
transferido subsiguientemente en un organismo hospedante y
replicado en dicho organismo. El vector usado es uno cuyos sitios de
restricción han sido bien documentados y los cuales contienen los
elementos operacionales preferidos o requeridos para la
transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos.
Los "elementos operacionales" como se
describen aquí incluyen al menos un promotor, al menos un operador,
al menos una secuencia líder, al menos un codón de terminación, y
cualquier otra secuencia de ADN necesaria o preferida para la
transcripción adecuada y la traducción subsiguiente del vector de
ácidos nucleicos. En particular, se contempla que dichos vectores
contendrán al menos un origen de replicación reconocido por el
organismo hospedante junto con al menos un marcador seleccionable y
al menos una secuencia promotora capaz de iniciar la transcripción
de la secuencia de ácidos nucleicos.
En la construcción del vector de clonación del
presente invento, se debe notar adicionalmente que múltiples copias
de la secuencia de ácidos nucleicos y sus elementos operacionales
esperados pueden ser insertados en cada vector. En dicha
realización, el organismo hospedante produciría cantidades mayores
por vector de la proteína HEV deseada. El número de múltiples
copias de la secuencia de ADN que puede ser insertado en el vector
está limitado sólo por la capacidad del vector resultante debido a
su tamaño, para ser transferido en y replicado a y transcrito en un
microorganismo hospedante apropiado.
En otra realización, los fragmentos de
restricción tras la digestión que contienen una secuencia
codificante para las proteínas HEV pueden ser insertados en un
vector de expresión adecuado que funciona en las células
procariotas o eucariotas. Por adecuado se refiere a que el vector es
capaz de transportar y expresar una secuencia de ácidos nucleicos
completa que codifica las proteínas HEV, preferiblemente en al menos
una proteína ORF completa. En el caso de ORF-2, la
proteína expresada debería formar partículas de tipo viral. El
vector de expresión es un vector de expresión de baculovirus que
funciona en una célula eucariota, especialmente en una célula de
insecto. Se hace referencia al vector de transferencia de
baculovirus, pBlueBac. Los vectores preferidos son
p63-2, que contienen el gen ORF-2
completo, y el p59-4, que contiene los genes
ORF-2 y ORF-3 completos. Estos
vectores fueron depositados en la Colección Americana de Cultivos
Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA el 10 de
Septiembre de 1992. El Ejemplo 1 ilustra la clonación del gen
ORF-2 en pBluebac para producir el
p63-2. Este método incluye la digestión del genoma
de la cepa HEV SAR-55 con las enzimas de
restricción NruI y BglII, insertando un sitio de policlonaje que
contiene los sitios BlnI y BglII en el sitio NheI único del vector
e insertando el fragmento ORF-2
NruI-BglII en el pBluebac BlnI-BglII
usando un adaptador.
En otra realización, el vector de expresión
recombinante seleccionado puede ser luego transfectado en un sistema
de células eucariotas adecuado con el propósito de expresar la
proteína recombinante. Un sistema de células eucariotas preferidas
es las células de insecto SF9. Un método preferido implica el uso
del vector de expresión pBluebac donde la línea de célula del
insecto SF9 está cotransfectada con el pBluebac recombinante y el
ADN de baculovirus AcMNPV por el método de precipitación de Ca.
La proteína recombinante expresada puede ser
detectada por métodos conocidos en la técnica que incluye tinción
azul Coomassie y transferencia Western usando suero que contiene el
anticuerpo anti HEV como se muestra en el Ejemplo 2. Otro método es
la detección de partículas de tipo viral por microscopia
inmunoelectrónica como se muestra en el Ejemplo 3.
La proteína recombinante expresada por las
células SF9 puede ser obtenida como un lisado en bruto o puede ser
purificada por los procedimientos de purificación de la proteína
estándar conocidos en la técnica que pueden incluir precipitación
diferencial, cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de
intercambio iónico, enfoque isoeléctrico, electroforesis en gel,
afinidad y cromatografía de inmunoafinidad y similares. En el caso
de la cromatografía de inmunoafinidad, la proteína recombinante
puede ser purificada por el paso a través de una columna que
contiene una resina que ha unido a los mismos anticuerpos
específicos para la proteína ORF.
Las proteínas recombinantes expresadas en este
invento pueden ser usadas en los inmunoensayos para el diagnóstico
o el pronóstico de hepatitis E en un mamífero que incluye, pero no
se limita a humanos, chimpancés, monos del viejo mundo, monos del
nuevo mundo, otros primates y similares. En una realización
preferida, el inmunoensayo es útil en el diagnóstico de la
infección de la hepatitis E en humanos. Los inmunoensayos que usan
las proteínas HEV, particularmente las proteínas ORF, que incluyen
la proteína ORF2 y especialmente las proteínas ORF2, proporcionan
un método reproducible, sensible y altamente específico para el
diagnóstico de las infecciones HEV, en contraste con los
inmunoensayos que utilizan las proteínas ORF parciales.
Los inmunoensayos mencionados en el presente
invento pueden ser radioinmunoensayos, ensayos de transferencia
Western, ensayos inmunofluorescentes, inmunoensayos enzimáticos,
ensayos quimioluminiscentes, ensayos inmunohistoquímicos y
similares. Las técnicas estándar conocidas en la técnica para ELISA
están descritas en los Methods in Immunodiagnosis, 2nd Edition,
Rose and Bigazzi, eds., John Wiley and Sons, 1980 and Campbell y
otros, Methods of Immunology, W.A. Benjamin, Inc., 1964, ambos
de los cuales son incorporados aquí mediante referencia. Dichos
ensayos pueden ser un inmunoensayos no competitivos, competitivos,
indirectos o directos como se describe en la técnica. (Oellerich,
M. 1984. J. Clin. Chem. Clin. BioChem. 22: 895-904).
Las muestras biológicas apropiadas para dichos ensayos de detección
incluyen, pero no están limitados a, extractos de biopsia de tejido,
sangre entera, plasma, suero, fluido cerebroespinal, fluido
pleural, orina y similares.
El suero de ensayo es reaccionado con un
reactivo de fase sólida que tiene una proteína HEV recombinante
unida a la superficie como un antígeno, preferiblemente la proteína
ORF-2 o la combinación de las diferentes proteínas
ORF tal como ORF-2 y ORF-3, sin
embargo incluyen siempre ORF-2. Más preferiblemente,
la proteína HEV es una proteína ORF-2 que forma
partículas de tipo viral. El reactivo de superficie sólida puede ser
preparado por las técnicas conocidas para unir la proteína al
material de soporte sólido. Estos métodos de unión incluyen la
adsorción no específica de la proteína para la unión covalente o de
soporte de la proteína a un grupo reactivo en el soporte. Después
de la reacción del antígeno con un anticuerpo anti HEV, los
componentes de suero no adheridos son eliminados por lavado y el
complejo anticuerpo-antígeno es reactivado con un
anticuerpo secundario tal como el anticuerpo marcado antihumano. El
marcaje puede ser una enzima que es detectada por incubación del
soporte sólido en presencia de un reactivo colorimétrico o
fluorimétrico adecuado. Otros marcajes detectables pueden ser
también usados, tal como radiomarcaje u oro coloidal, y
similares.
En una realización preferida, la proteína
expresada por el vector recombinante pBluebac que contiene la
secuencia ORF-2 entera de SAR-55 es
usada como un agente de unión específico para detectar anticuerpos
anti HEV, preferiblemente anticuerpos lgG o IgM. Los Ejemplos 4 y 5
muestran los resultados de un ELISA en el que el reactivo de fase
sólida tiene un ORF-2 recombinante como el antígeno
de superficie. Esta proteína, codificada por la secuencia de ácidos
nucleicos ORF-2 entera, es superior a la proteína
ORF-2 parcial, ya que es reactiva con más antisueros
de las diferentes especies primates infectadas con HEV que son
antígenos parciales de ORF-2. La proteína del
presente invento es capaz también de detectar anticuerpos producidos
en respuesta a las diferentes cepas del HEV pero no al virus de la
Hepatitis A, B, C o D.
La proteína HEV y las análogas pueden ser
preparadas en la forma de un kit, solo o en combinación con otros
reactivos tal como anticuerpos secundarios, para el uso en
inmunoensayos.
Las proteínas HEV recombinantes, que incluyen
una proteína ORF-2, preferiblemente una proteína
ORF-2 o la combinación de proteínas ORF, y
proteínas sustancialmente homólogas y análogas a la del invento
pueden ser usadas como una vacuna para proteger a los mamíferos
frente a la exposición a la Hepatitis E. La vacuna, que actúa como
un inmunógeno, puede ser una célula, un lisado celular de las
células transfectadas con un vector de expresión recombinante o un
cultivo de sobrenadante que contiene la proteína expresada.
Alternativamente, el inmunógeno es una proteína recombinante
sustancialmente o parcialmente purificada. Aunque es posible que el
inmunógeno sea administrado en una forma sustancialmente pura o
pura, es preferible presentarlo como una preparación, formulación o
composición farmacéutica.
Las formulaciones descritas en el presente
invento, ambas para uso humano y veterinario, comprenden un
inmunógeno como se describe anteriormente, junto con uno o más
excipientes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente otros
ingredientes terapéuticos. El/los excipiente(s) puede ser
"aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros
ingredientes de la formulación y no perjudicial con el recipiente
del mismo. Las formulaciones pueden ser presentadas
convenientemente en forma de dosis de unidad y pueden ser preparadas
por cualquier método bien conocido en la técnica farmacéutica.
Todos los métodos incluyen la etapa de llevar en
asociación el ingrediente activo con el excipiente que constituye
uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones son
preparadas por uniformidad y están íntimamente asociadas al
ingrediente activo con los excipientes líquidos o los excipientes
sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario,
dando forma al producto en la formulación deseada.
Las formulaciones adecuadas para la
administración intraperitoneal, subcutánea, intramuscular o
intravenosa comprenden convenientemente disoluciones acuosas
estériles del ingrediente activo con disoluciones que son
isotónicas preferiblemente con la sangre del receptor. Dichas
formulaciones pueden ser preparadas convenientemente por disolución
del ingrediente activo sólido en agua, que contiene sustancias
fisiológicamente compatibles tal como el cloruro de sodio (por
ejemplo, 0,1-2, OM), glicina y similares y teniendo
un pH tamponado compatible con las condiciones fisiológicas para
producir una disolución acuosa y traduciendo dicha disolución
estéril. Estos pueden estar presentes en unidades o contenedores
multidosis, por ejemplo, ampollas selladas o viales.
Las formulaciones descritas en el presente
invento pueden incorporar un estabilizador. Los estabilizadores
ilustrativos son polietilenglicol, proteínas, sacáridos,
aminoácidos, ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos que pueden ser
usados bien solos o como mezclas. Estos estabilizadores son
incorporados preferiblemente en una cantidad de
0,11-10.000 partes por peso per parte por
peso del inmunógeno. Si dos o más estabilizadores deben ser usados,
su cantidad total está preferiblemente dentro del intervalo
especificado anteriormente. Estos estabilizadores son usados en
disoluciones acuosas en la concentración apropiada y pH. La presión
osmótica específica de dichas disoluciones acuosas está
generalmente en el rango de 0,1-3,0 osmoles,
preferiblemente en el intervalo de 0,8-1,2. El pH
de la disolución acuosa es ajustado para estar dentro del intervalo
de 5,0-9,0, preferiblemente dentro del intervalo de
6-8. En la formulación del inmunógeno descrita en el
presente invento, se puede usar un agente anti adsorción.
Métodos farmacéuticos adicionales pueden ser
empleados para controlar la duración de la acción. Las preparaciones
de liberación controlada pueden ser conseguidas a través del uso
del polímero para completar o adsorber las proteínas o sus
derivados. El suministro controlado puede ser ejercitado por la
selección de macromoléculas adecuadas (por ejemplo el poliéster,
ácidos poliaminos, polivinilo, pirrolidon, etilénvinilacetato,
metilcelulosa, carboximetilcelulosa o sulfato de protamina) y la
concentración de macromoléculas así como los métodos de
incorporación para controlar la liberación. Otro método posible
para controlar la duración de la acción por las preparaciones de
liberación controlada es para incorporar las proteínas, análogos de
proteína o sus derivados funcionales, en partículas de un material
polimérico tal como poliésteres, ácidos poliaminos, hidrogeles,
poli (ácido láctico) o copolímeros etilénvinilacetato.
Alternativamente, en lugar de incorporar estos agentes en las
partículas poliméricas, es posible atrapar estos materiales en micro
cápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o
por polimerización interfacial, por ejemplo, metilcelulosa hidroxi o
micro cápsulas de gelatina y micro cápsulas poli
(metilmetacrilato), respectivamente o en sistemas de suministro de
fármacos coloidales, por ejemplo, liposomas, microesferas de
albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas o en
macroemulsiones.
Cuando las preparaciones orales son deseadas,
las composiciones pueden estar combinadas con los excipientes
típicos, tal como la lactosa, sacarosa, almidón, estearato de
magnesio de talco, celulosa cristalina, celulosa metilo, celulosa
carboximetilo, glicerina, alginato de sodio o goma arábiga entre
otros.
Las proteínas como resultado del método del
presente invento pueden ser suministradas en forma de un kit, solas
o en la forma de una composición farmacéutica como se describe
anteriormente.
La vacunación puede ser conducida por los
métodos convencionales. Por ejemplo, el inmunógeno puede ser usado
en un diluyente adecuado tal como salino o agua, o en adyuvantes
completos o incompletos. Además, el inmunógeno puede o no estar
unido a un excipiente para hacer la proteína inmunogénica. Los
ejemplos de dichas moléculas excipientes incluyen, pero no están
limitados a, la albumina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa
keyhole (KLH), el toxoide del tetano y similares. El inmunógeno
puede ser administrado por cualquier ruta apropiada para la
producción de anticuerpos tal como intravenosa, intraperitoneal,
intramuscular, subcutánea y similares. El inmunógeno puede ser
administrado una vez o en intervalos periódicos hasta que una
concentración significante de anticuerpos anti HEV sea producida.
El anticuerpo puede ser detectado en el suero usando un
inmunoensayo.
La administración del inmunógeno como resultado
del método del presente invento puede ser o bien para un propósito
profiláctico o terapéutico. Cuando se proporciona profilácticamente,
el inmunógeno es proporcionado antes de cualquier exposición al HEV
o antes de cualquier síntoma debido a la infección HEV. La
administración profiláctica del inmunógeno sirve para evitar o
atenuar cualquier infección subsiguiente del HEV en un mamífero.
Cuando se proporciona terapéuticamente, el inmunógeno es
proporcionado durante (o poco después de) la aparición de la
infección o durante la aparición de cualquier síntoma de la
infección o de la enfermedad causada por el HEV. La administración
terapéutica del inmunógeno sirve para atenuar la infección o la
enfermedad.
Se menciona preferiblemente una vacuna preparada
usando una proteína ORF-2 recombinante expresada por
la secuencia ORF-2 de la cepa HEV
SAR-55 y las equivalentes de la misma. Puesto que se
ha demostrado que la proteína ORF-2 recombinante es
reactiva con una variedad de sueros positivos para HEV, son
indicadas sus utilidades en proteger frente a una variedad de las
cepas de HEV.
Además de usarla como una vacuna, las
composiciones pueden ser usadas para preparar anticuerpos frente a
partículas de tipo virus HEV. Los anticuerpos pueden ser usados
directamente como agentes antivirales. Para preparar los
anticuerpos, un animal hospedante es inmunizado usando las
partículas virales o, según sea apropiado, antígenos no
particulados nativos de la partícula del virus son unidos a un
excipiente como se describe anteriormente para las vacunas. El
suero o el plasma del hospedante es recogido siguiendo un intervalo
de tiempo apropiado para proporcionar una composición que comprende
anticuerpos reactivos con la partícula del virus. La fracción de
gama globulina o los anticuerpos lgG pueden ser obtenidos, por
ejemplo, por el uso del sulfato amónico saturado o DEAE Sephadex, u
otras técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. Los
anticuerpos están sustancialmente libres de muchos de los efectos
laterales adversos que pueden estar asociados con otros agentes
anti virales tales como los fármacos.
Las composiciones del anticuerpo pueden ser
hechas incluso más compatibles con el sistema hospedante minimizando
potenciales respuestas del sistema inmune adversas. Esto se lleva
acabo eliminando todo o una porción de la porción Fc de un
anticuerpo de una especie diferente o usando un anticuerpo de la
misma especie como animal hospedante, por ejemplo, el uso de los
anticuerpos de los hibridomas humano/humano. Los anticuerpos
humanizados (es decir, no inmunogénicos en un humano) pueden ser
producidos, por ejemplo, por reemplazo de una porción inmunogénica
de un anticuerpo con una correspondiente, pero no una porción
inmunogénica (es decir, anticuerpos quiméricos). Tales anticuerpos
quiméricos pueden contener la porción reactiva o de unión al
antígeno de un anticuerpo de una especie y la porción Fc de un
anticuerpo (no inmunogénico) de una especie diferente. Los
ejemplos de los anticuerpos quiméricos, incluyen pero no están
limitados a, quimeras mamífero no humano -humano, quimeras
roedor-humano, quimeras
murino-humano y rata-humano
(Robinson y otros, solicitud de patente internacional 184,
187; Taniguchi M., solicitud de patente europea 171, 496; Morrison
y otros, solicitud de patente europea 173, 494; Neuberger
y otros, PCT Application WO 86/01533; Cabilly y otros,
1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439; Nishimura y otros,
1987 Canc. Res. 47: 999; Wood y otros, 1985 Nature 314: 446;
Shaw y otros, 1988 J. Natl. Cancer Inst. 80: 15553, todos
incorporados aquí mediante referencia).
Revisiones generales de anticuerpos quiméricos
"humanizados" son proporcionados por Morrison S. 1985 Science
229: 1202 y por Oi y otros, 1986 Bio Techniques 4: 214.
Los anticuerpos "humanizados" adecuados
pueden ser producidos alternativamente mediante sustitución de CDR
o CEA (Jones y otros, 1986 Nature 321: 552; Verhoeyan y
otros, 1988 Science 239: 1534; Biedler y otros 1988 J.
Immunol. 141: 4053, todos incorporados aquí por referencia).
Los anticuerpos o los antígenos que unen los
fragmentos pueden ser producidos mediante ingeniería genética. La
tecnología para la expresión de ambos genes de cadena ligera y
pesada en E. coli es el sujeto de las solicitudes de patente
PCT; el numero de publicación del documento de patente WO 901443, WO
901443, y el WO 9014424 y en Huse y otros, 1989 Science 246:
1275-1281.
Los anticuerpos pueden ser también usados como
un medio para mejorar la respuesta inmune. Los anticuerpos pueden
ser administrados en cantidades similares a aquellas usadas por
otras administraciones terapéuticas del anticuerpo. Por ejemplo, la
gama globulina concentrada es administrada a
0,02-0,1 ml/lb de peso corporal durante el período
de incubación temprano de otras enfermedades virales como la rabia,
el sarampión y la hepatitis B para interferir con la entrada viral
en las células. Así pues, los anticuerpos reactivos con la partícula
del virus HEV pueden ser administrados pasivamente solos o en
conjunción con otro agente antiviral en un hospedante infectado con
el HEV para mejorar la respuesta inmune y/o la efectividad de un
fármaco antiviral.
Alternativamente, los anticuerpos anti HEV
pueden ser inducidos por administración de anticuerpos anti idiotipo
como inmunógenos. Convenientemente, una preparación de anticuerpos
anti HEV purificado preparada como se describe anteriormente es
usada para inducir el anticuerpo anti idiotipo en un hospedante
animal. La composición es administrada en el hospedante animal en
un diluyente adecuado. Tras la administración, habitualmente una
administración repetida, el hospedante produce el anticuerpo anti
idiotipo. Para eliminar una respuesta inmunogénica frente a la
región Fc, los anticuerpos producidos por la misma especie del
hospedante animal pueden ser usados o la región Fc de los
anticuerpos administrados puede ser eliminada. Siguiendo la
inducción del anticuerpo anti idiotipo en el hospedante animal, el
suero o el plasma es retirado para proporcionar una composición de
anticuerpos. La composición puede ser purificada como se describe
anteriormente para los anticuerpos anti HEV, o por cromatografía de
afinidad usando anticuerpos anti HEV unidos a la matriz de afinidad.
Los anticuerpos anti idiotipo producidos son similares en
conformación con el auténtico antígeno HEV y pueden ser usados para
preparar una vacuna HEV en lugar de usar un antígeno de partículas
de HEV.
Cuando se usa como un medio de inducir
anticuerpos anti virus de HEV en un animal, la forma de inyectar el
anticuerpo es la misma que para los propósitos de vacunación,
especialmente intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o similar
en una concentración eficaz en un diluyente fisiológicamente
adecuado o sin adyuvante. Una o más inyecciones de refuerzo pueden
ser deseadas.
Las proteínas derivadas del HEV como resultado
del método del invento son pretendidas también para el uso en la
producción del antisuero designado para la profilaxis de post o pre
exposición. Aquí una proteína HEV, o la mezcla de las proteínas es
formulada con un adyuvante adecuado y administrado por inyección a
voluntarios humanos, según los métodos conocidos para la producción
de antisuero humano. La respuesta del anticuerpo a las proteínas
inyectadas es monitorizada, durante un período de varias semanas
tras la inmunización, por muestreo de suero periódico para detectar
la presencia de anticuerpos de suero anti HEV, usando un
inmunoensayo como se describe aquí.
El antisuero de los individuos inmunizados puede
ser administrado como una medida profiláctica de pre exposición
para individuos que están en riesgo de contraer la infección. El
antisuero es también útil en el tratamiento de un individuo post
expuesto, análogo al uso del antisuero de concentración alta contra
el virus de la hepatitis B para la profilaxis de post
exposición.
Para ambos uso in vivo de los anticuerpos
en las partículas semejantes al virus HEV y las proteínas y los
anticuerpos anti idiotipo y el uso del diagnóstico, puede ser
preferible usar los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales anti partículas virales o los anticuerpos antiidiotipo
pueden ser producidos como sigue. El bazo o los linfocitos de un
animal inmunizado son retirados e inmortalizados o usados para
preparar los hibridomas por métodos conocidos por aquellos expertos
en la técnica (Goding, J. W. 1983 Monoclonal Antibodies: Principles
and Practice, Pladermic Press, Inc., NY, NY, pp.
56-97). Para producir un hibridoma
humano-humano, un donante de linfocitos humanos es
seleccionado. Un donante que se conoce que está infectado con HEV
(donde la infección ha sido mostrada por ejemplo por la presencia de
los anticuerpos antivirales en la sangre o por cultivo del virus)
puede servir como un donante linfocito adecuado. Los linfocitos
pueden ser aislados de una muestra de sangre periférica o las
células del bazo pueden ser usadas si el donante está sujeto a
esplenectomía. El virus Barr Epstein (EBV) puede ser usado para
inmortalizar los linfocitos humanos o una pareja de fusión humana
puede ser usada para producir los hibridomas
humano-humano. La inmunización in vitro
primaria con los péptidos puede ser también usada en la generación
de los anticuerpos monoclonales humanos.
Los anticuerpos secretados por las células
inmortalizadas son cribados para determinar los clones que secretan
anticuerpos de la especificidad deseada. Para los anticuerpos
monoclonal antipartículas virales, los anticuerpos deben unirse a
las partículas del virus HEV. Para los anticuerpos monoclonales
antiidiotipo, los anticuerpos deben unirse a los anticuerpos
antipartículas virales. Las células que producen anticuerpos de la
especificidad deseada son seleccionadas.
Los anticuerpos descritos anteriormente y los
antígenos que unen fragmentos del mismo pueden ser suministrados en
forma de kit solo o como una composición farmacéutica para el uso
in vivo. Los anticuerpos pueden ser usados para usos
terapéuticos, el uso de diagnostico en inmunoensayos o como un
agente de inmunoafinidad para purificar las proteínas ORF como se
describe aquí.
Los materiales usados en los siguientes Ejemplos
fueron como sigue:
- Primates. El chimpancé (Chimp) (Pan troglodytes). Monos del viejo mundo: monos cynomolgus (Cyno) (Macaca fascicularis), monos Rhesus (Rhesus) (M. mulatta), monos cerdo (PT) (M. nemestrina), y los monos verdes africanos (AGM) (Cercopithecus aethiops). Monos del nuevo mundo: tamarindos con bigote (Tam) (Saguinus mystax), monos ardilla (SQM) (Salmiri sciureus) y los monos búho (OWL) (Aotus trivigatus). Los primates fueron encerrados por separado en condiciones de contención de peligro biológico. El almacenamiento, el mantenimiento y el cuidado de los animales alcanzó o excedió todos los requerimientos para la cría de los primates.
La mayoría de los animales fueron inoculados de
forma intravenosa con HEV, la cepa SAR-55 contenida
en 0,5 ml de una suspensión fecal diluida en el suero de ternera
fetal como se describe en Tsarev, S.A. y otros (1992), Proc.
Natl. Acad. Sci USA, 89: 559-563; y Tsarev, S.A.
y otros (1992), J. Infect. Dis. (Presentado). Los Chimpancés
1313 y 1310 fueron inoculados con una partida de deposiciones
recogidas de los pacientes con hepatitis E Pakistani 7.
Las muestras de suero fueron recogidas
aproximadamente dos veces por semana antes y después de la
inoculación. Los niveles de la aminotransferasa de alanina del
suero de las enzimas del hígado (ALT), de la isocitrato
dehidrogenasa (ICD), y la gammaglutamil transferasa (GGT) fueron
ensayadas con los ensayos disponibles comercialmente (Medpath Inc.,
Rockville, MD). Los ensayos serológicos fueron realizados como se
describe anteriormente.
La preparación de la Plantilla del virus ARN
para PCR. La bilis de un mono cynomolgus infectado con HEV (10
\mul), 20% de SDS (peso/vol) (a una concentración final del 1%),
la proteinasa K (10 mg/ml; a una concentración final de 1 mg/ml), 1
\mul de tARN (10 mg/ml), y 3 \mul de EDTA 0,5 M fueron mezclados
en un volumen final de 250 \mul e incubados durante 30 min. a
55ºC. Los ácidos nucleicos totales fueron extraídos de la bilis dos
veces con cloroformo/fenol, 1:1 (vol/vol), a 65ºC y una vez con
cloroformo, luego precipitados con etanol, lavados con 95% de
etanol, y usado para el RT-PCR. La amplificación
RT-PCR del ARN HEV de las heces y especialmente del
suero fue más eficaz cuando el ARN fue purificado más extensamente.
El suero (100 \mul) o el 10% de una suspensión fecal (200 \mul)
fue tratado como se indica anteriormente con la proteinasa K.
Después de 30 min de incubación, 300 \mul de tampón CHAOS (4,2 M
guanidina tiocianato/0,5 N-lauroilsarcosina/0,025 M
Tris-HCl, pH 8,0) fueron añadidos. Los ácidos
nucleicos fueron extraídos dos veces con el fenol/cloroformo a 65ºC
seguidos por la extracción del cloroformo a temperatura ambiente.
Después se añadieron acetato de amonio 7,5 M (225 \mul) a la fase
superior y los ácidos nucleicos fueron precipitados con 0,68 ml de
2-propanol. La precipitación fue disuelta en 300
\mul del tampón CHAOS y se añadieron 100 \mul de H_{2}O. Las
extracciones de cloroformo y de la precipitación de
2-propanol fueron repetidas. Los ácidos nucleicos
fueron disueltos en agua, precipitados con etanol, lavados con 95%
de etanol, y usados para el RT-PCR.
Los cebadores. Noventa y cuatro
cebadores, 21-40 nucleótidos (nt) largos, y
complementarios a hebras positivas o negativas del genoma de una
cepa de HEV de Burma (BUR-121) (Tam, A.W. y
otros (1991), Virology, 185:120-131) o el
genoma SAR-55 fueron sintetizados usando un
sintetizador de ADN 391 modelo de Applied Biosystems.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Las secuencias de estos 94 cebadores se muestran
a continuación empezando con la SEQ. ID NO.5 y continuando con la
SEQ. ID NO. 98:
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas a la izquierda de las
secuencias representan lo siguiente: R y D se refieren a los
cebadores inverso (R) y directo (D), respectivamente; B y S se
refieren a las secuencias derivadas de la cepa
Burma-121 de la Hepatitis E y la cepa
SAR-55 de la Hepatitis E, respectivamente; 5'NC y
3'NC se refiere a las regiones 5 prima y 3 prima no codificantes
del genoma de HEV, respectivamente; y 1, 2 y 3 se refieren a las
secuencias derivadas de los marcos de lectura abiertas 1, 2 o 3,
respectivamente. El símbolo () hacia la derecha de algunas
secuencias indican la inserción de un sitio de restricción
artificial en estas secuencias.
Para el clonaje de los fragmentos de PCR, EcoRI,
BamHI, o BglII precedidos por 3-7 nts fueron
añadidos al extremo 5' de los cebadores.
RT-PCR. La mezcla normal
de RT-PCR de 100 \mul contenía el molde, 10 mM
Tris-HCL (pH 8.4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl_{2},
los cuatro cebadores dNTPs (cada uno a 0,2 mM), 50 pmoles del
cebador directo, 50 pmoles del cebador inverso, 40 unidades de
RNasin (Promega), 16 unidades de la transcriptasas inversa del virus
de mieloblastosis aviar (Promega), 4 unidades de AmpliTaq (Cetus),
en 100 \mul de aceite mineral ligero. La mezcla fue incubada 1 h
a 42ºC y luego amplificada mediante 35 ciclos de PCR; 1 min a 94ºC,
1 min a 45ºC, y 1 min a 72ºC. Los productos de PCR fueron
analizados en geles de agarosa al 1%.
Clonaje de los fragmentos de PCR. Los
fragmentos de PCR que contienen sitios de restricción en los
extremos fueron digeridos con enzimas de restricción EcoRI y
BamHI o EcoRI y BglII y clonadas en pBR322 o
pGEM-3Z (Promega) digeridas con
EcoRI/BamHI. Alternativamente, los fragmentos de PCR
fueron clonados en pCR1000 (Invitrogen) usando el kit de clonaje TA
(Invitrogen).
Secuenciación de fragmentos de PCR y
plásmidos. Los fragmentos de PCR fueron cortados a partir de
geles de agarosa 1% purificados por Geneclean (Bio 101, La Jolla,
CA). Los fragmentos de PCR de doble hebra fueron secuenciados
usando Sequenasa (United States Biochemical) como se describe en
Winship, P.R. (1984), Nucleic Acids Rev., 17: 1266. Los plásmidos
de doble hebra purificados a través de gradientes de CsCl fueron
secuenciados con un kit de Sequenasa (United States
Biochemical).
Análisis computerizado de las secuencias. Las
secuencias nucleotídicas de las cepas HEV fueron comparadas usando
el paquete de software de Genetics Computer Group (Madison, WI)
(Devereaux, J. Y otros (1984), Nucleic Acids Rev.,
12:387-395, versión 7.5, en un ordenador VAX 8650
(en el Instituto Nacional del Cancer NCI, Frederick, MD)).
\vskip1.000000\baselineskip
Un plásmido que contiene el
ORF-2 completo del gen de la cepa
SAR-55 de HEV, Tsarev, S.A y otros (1992). Proc.
NatI. Acad.Sci. USA, 89:559-563), fue usado para
obtener un fragmento de restricción NruI-BqlII. NruL
corta el cADN de HEV cinco nucleótidos aguas arriba del codón de
iniciación ATG de ORF-2. Un sitio Bgl II artificial
había sido previamente colocado en el extremo 3' del genoma de HEV
justo antes de la secuencia poliA (Tsarev, S.A. y otros (1992),
Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89: 559-563). Para
insertar este fragmento en el vector pBlue Bac Transfer
(Invitrogen) un sitio de clonaje múltiple sintético fue introducido
en el sitio NheI único en el vector. Este sitio de clonaje múltiple
contenía sitios Bln I y Bgl II que están ausentes tanto en el cADN
del HEV y las secuencias pBlueBac. El fragmento
NruI-BglII fue insertado en Bln
I-BglII pBlue Back usando un adaptador como se
muestra en la Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
ADN de baculovirus p63-2 y
AcMNPV (Invitrogen) fueron cotransfectados en células SF9
(Invitrogen) por el método de precipitación de Ca según el
protocolo de Invitrogen. Siguiendo este protocolo: el ADN de
baculovirus AcMNPV puede producir un baculovirus intacto vivo que
puede empaquetar p63-2 para formar un baculovirus
recombinante. Este baculovirus recombinante fue purificado en placa
4 veces. El baculovirus recombinante resultante
63-2-IV-2 fue usado
para infectar células SF9.
SDS-PAGE y transferencia
Western. Las células de insecto fueron resuspendidas en tampón
de carga (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM DTT, 2%
SDS, 0,1% bromophenol blue y 10% glicerol) y se realizó un gel en
SDS-poliacrilamida como está descrito, Laemmli,
U.K. (1970), Nature, 227:680. Los geles fueron teñidos con Coomassie
blue o las proteínas fueron electrotransferidas en filtros de
nitrocelulosa BA-85 (Schleicher & Schell). Tras
la transferencia, las membranas de nitrocelulosa fueron bloqueadas
en PBS que contenían 10% de suero de ternera fetal y 0,5% de
gelatina. Como anticuerpo primario, un suero hiperinmune de
chimpancé-1313 diluido 1:1000 fue usado. Como anticuerpo
secundario, el anticuerpo de cabra purificado por afinidad marcado
con fosfatasa frente a IgG humana (Kirkegaard y Perry Laboratories,
Inc.) diluidos 1:2000 fue usado.
Los filtros fueron revelados en sustrato
estabilizado Western blue para fosfatasa alcalina (Promega). Todas
las incubaciones fueron realizadas en disolución de bloqueo, y los
lavados fueron con PBS con 0,05% Tween-20
(Sigma).
Expresión de HEV ORF-2.
La proteína principal sintetizada en células SF9 infectadas con
baculovirus
63-2-IV-2
recombinante fue una proteína con un peso molecular aparente de 74KD
(Fig. 2A). Este tamaño es un poco más grande que el predicho para
el ORF-2 entero (71 KD). La diferencia en tamaño
podría ser debida a la glicosilación de la proteína puesto que hay
al menos un sitio potencial de glicosilación
(Asn-Leu-Ser) en la parte
N-terminal. Esta proteína no fue detectada en las
células no infectadas o en células infectadas con baculovirus
salvaje no recombinante. En el último caso, la proteína principal
detectada fue una proteína poliédrica. Cuando los mismos lisados
fueron analizados por transferencia Western con suero de
chimpancé-1313 (hiperinmunizado con HEV), sólo las proteínas en el
lisado celular recombinante hicieron reacción y la banda principal
fue también representada por una proteína de 74 KD (Fig. 2B).
Bandas más pequeñas estuvieron también presentes en la transferencia
Western. Algunas de estas tuvieron pesos moleculares mayores de 74
KD, que podrían ser debidas a diferentes extensiones de
glicosilación y algunas tuvieron pesos moleculares menores, que
podrían reflejar procesamiento y/o degradación. Suero tomado de
Chimpancé-1313 previamente a la inoculación con HEV no hizo reacción
con ninguna de las proteínas por transferencia Western.
\vskip1.000000\baselineskip
5x10^{6} células SF9 infectadas recombinantes
fueron sonicadas en CsCl (1,30 g/ml) que contenía 10 mM
Tris-HCl, pH 7,4, 0,3% sarcosil y centrifugadas 68
h, a 40.000 rpm (SW60Ti). 50 \mul de la fracción, que tenía la
mayor respuesta por ELISA y una alta densidad de 1,30 g/ml fue
diluida en 1 ml de PBS y 5 \mul de suero hiperinmune de
chimpancé-1313 fueron añadidos. El suero hiperinmune fue preparado
dándole otra dosis a una chimpancé previamente infectado con una
segunda cepa de hepatitis E (HEV mejicana). Las muestras fueron
incubadas 1 h a temperatura ambiente y dejadas toda la noche a 4ºC.
Los complejos inmunes fueron precipitados usando un rotor SW60Ti a
30.000 rpm, 42ºC, 2 h. Los precipitados fueron resuspendidos en agua
destilada, teñidos negativamente con 3% PTA, colocados en rejillas
de carbono y examinados a una magnificación de 40.000 en un
microscopio electrónico EM-10, Carl Zeiss,
Oberkochen, Alemania.
Detección de VLPs: Los lisados celulares
a partir de células de insecto infectadas con baculovirus
63-2-IV-2 salvaje o
recombinante fueron fraccionados mediante centrifugación de densidad
en CsCl. Cuando las fracciones del gradiente de CsCl a partir de
las células de insecto infectadas recombinantes fueron incubadas con
suero hiperinmune de chimp-1313, dos tipos de
partículas de tipo viral (VLP) cubiertas con anticuerpo fueron
observadas en la fracción con alta densidad de 1,30 g/ml: primero
(Figs. 3A-3A''), partículas individuales cubiertas
por anticuerpo que tenían el tamaño (30 nm) y estructura
morfológica que sugiere HEV, segundo (Fig. 3B) agregados de
partículas recubiertos por anticuerpo más pequeños que HEV
(alrededor de 20 nm) pero que por lo demás se asemejan a HEV. EM
directa mostró la presencia de una población muy heterogénea de
objetos incluyendo algunos de 30 y 20 nm en diámetro
respectivamente que parecen partículas virales pero que en ausencia
de anticuerpo unido, no pueden confirmarse como HEV. Un número de
experimentos IEM sugirieron que al menos alguna(s) de
la(s) proteína(s) sintetizadas a partir de la región
ORF-2 del genoma de HEV, se habían ensamblado en una
estructura particulada. Se observó que las células de insecto en un
estadio tardío de infección, cuando la proporción de proteínas más
pequeñas fue mayor, dio consistentemente mejores resultados en
ELISA. Por lo tanto, los lisados sin fraccionar de células de
insecto recombinantes de un estadio tardío de infección fueron
usadas con un antígeno en ELISA en ensayos subsecuentes.
\vskip1.000000\baselineskip
5x10^{6} células de SF9 infectadas con virus
63-2-IV-2 fueron
resuspendidas en 1 ml de 10 mM Tris-HCl, pH 7,5,
0,15 M NaCl fueron entonces congeladas y descongeladas 3 veces. 10
\mul de esta suspensión fue disuelta en 10 ml de tampón carbonato
(pH 9,6) y usadas para cubrir una placa de ensayo de microvaloración
flexible (Falcon). Las muestras de suero fueron diluidas 1:20,
1:400 y 1:8000, ó 1:100, 1:1000 y 1:10000. Las mismas disoluciones
de bloqueo y de lavado como las descritas para la transferencia
Western fueron usadas en ELISA. Como anticuerpo secundario, una
fracción IgG de cabra conjugada con peroxidasa frente a IgG humano o
anticuerpo de cabra marcado con peroxidasa
anti-inmunoglobulina de mono del viejo o del nuevo
mundo fue usada. Los resultados fueron determinados midiendo la
densidad óptica (D.O.) a 405 nM.
Para determinar si el antígeno derivado de
células de insecto que representan una cepa Paquistaní de HEV podría
detectar un anticuerpo anti-HEV en monos cynomolgus
infectados con la cepa mejicana de HEV, 3 monos fueron examinados
(Fig.4). Dos monos cyno-80A82 y
cyno-9A97, fueron infectadas con heces que contenían
la cepa HEV Mejico '86 (Ticehurst, J. y otros (1992), J. Infect.
Dis., 165:835-845) y el tercer mono
cyno-83 fue infectado con un segundo pase de la
misma cepa. Como testigo, las muestras de suero de
cyno-374, infectadas con la cepa
SAR-55 de HEV paquistaní, fueron ensayadas en el
mismo experimento. Los 3 monos infectados con la cepa mejicana
sueroconvirtieron a anti-HEV. Los animales del
primer pase sueroconvirtieron en la semana 15 y los del segundo
pase en la semana 5. De modo interesante, la concentración más alta
anti-HEV entre los 4 animales, se encontró en los
cyno-83, inoculados con los del segundo pase de la
cepa mejicana. Los cynos inoculados con los del primer pase de la
cepa mejicana desarrollaron las concentraciones más bajas mientras
que los inoculados con las del primer pase de la cepa paquistaní
desarrollaron concentraciones intermedias.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estimar si el ELISA descrito aquí detectaba
específicamente anti-HEV excluyendo cualquier otro
tipo de anticuerpo relacionados con hepatitis, muestras de suero de
chimpancés fueron analizadas, en grupos de 4, infectados con los
otros virus de hepatitis conocidos (Garci, P. y otros (1992), J.
Infect. Dis, 165:1006-1011; Farci, P. y otros
(1992), Science (en prensa); Ponzetto, A. y otros (1987) J infect.
Dis., 155:72-77; Rizzetto; m y otros (1981)
Hepatology 1: 567-574: referencia para chimpancés-
1413,, 1373, 1442, 1551 (HAV); y para
chimpancés-982, 1442, 1420, 1410 (HBV), son datos
sin publicar de Purcel y otros (Tabla 1). Muestras de suero
pre-inoculación y de 5 semanas y 15 semanas
post-inoculación fueron analizadas en ELISA de HEV
hechas reaccionar en el ELISA para anticuerpo HEV, pero los 4
chimpancés inoculados con HEV desarrollaron las clases IgM e IgG de
anti-HEV.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Diferentes especies de primates fueron
inoculadas con una suspensión de heces estándar de HEV y muestras de
suero seriadas fueron recogidas para monitorizar la infección. Los
niveles de ALT en suero fueron determinadas como indicador de
hepatitis mientras que la sueroconversión fue definida mediante la
detección de anti-HEV.
Ambos monos rhesus inoculados con HEV (Tabla 2)
mostraron picos muy prominentes de actividad ALT así como
sueroconversión. El primer signo de actividad ALT aumentada fue
observada a día 14 para ambos animales, y una sueroconversión
definitiva tuvo lugar a día 21. La concentración máxima de
anti-HEV fue lograda a día 29.
\vskip1.000000\baselineskip
Ambos monos verdes africanos usados en este
estudio (Tabla 2) desarrollaron una actividad ALT aumentada y
anti-HEV. Aunque AGM-230 murió siete
semanas post-inoculación, los signos de infección
fueron observados previamente a ese tiempo. AGM-74
mostró un aumento bimodal en actividad ALT como se ha documentado
para otras especies (Tsarev, SA y otros (1992), J. Infect. Dis. (en
prensa)). La seroconversión para AGM-74 y
AGM-230 fue primero observada en los días 27 y 21,
respectivamente.
Aunque ambos macacos de cola de cerdo inoculados
demostraron un ligero incremento en la actividad LAT estos aumentos
no fueron tan prominentes como en el caso de los animales descritos
previamente. Sin embargo, ambos monos seroconvirtieron a día 21 y
las concentraciones anti-HEV fueron equivalente a
los de los chimpancés y otros monos del viejo mundo.
Ningún mono tamarindo inoculado en este estudio
mostró ningún aumento en la actividad ALT o seroconversión a
anti-HEV (Tabla 2). Los monos ardilla respondieron
con niveles significativamente menores de anti-HEV
que los chimps o monos del viejo mundo (Tabla 2). El tiempo de
seroconversión se retrasó también comparado con los de otros
animales. SQM-868 seroconvirtió a día 41, y
SQM-869 seroconviertió a día 35. La concentración
anti-HEV no fue superior a 1:400 en ningún momento
durante más de tres meses de monitorizar y disminuyeron claramente
en ambos animales tras alcanzar un valor pico a días
47-54. Sin embargo, los aumentos en actividad ALT
fue más bien prominente en ambos animales.
Los monos búho respondieron a la infección por
HEV aproximadamente tan bien como las especies de monos del viejo
mundo (Tabla 2). Ambos OWMs seroconvirtieron a día 21 y a día 28 las
concentraciones anti-HEV alcanzaron un valor de
1:8000. La actividad ALT alcanzó su máximo a día 35 en
OWM-924, pero no hasta el día 91 en
OWM-925.
\vskip1.000000\baselineskip
En ambos chimpancés, los niveles de ALT en suero
aumentaron alrededor de 4 semanas post-inoculación
(Tabla 2, Fig. 5). Ambos chimpancés seroconvirtieron al tiempo que
se elevó la enzima ALT o antes (Fig. 5A, 5C). Los niveles de IgM
anti-HEV fueron también determinados para los
chimpancés. En chimp-1374, la concentración de IgM
anti-HEV (Fig 5B) no fue tan alta como la de la
concentración de IgG (Fig 5A) y disminuyó a lo largo de dos
semanas. Aunque tanto los anticuerpos IgG como IgM fueron primero
detectados para este animal a día 20, la concentración de IgM
anti-HEV fue la mayor mientras que la concentración
de IgG fue la menor ese día, pero luego aumentó y se mantuvo
aproximadamente al mismo nivel durante más de tres meses. En
Chimp-1375, sólo IgM anti-HEV fue
detectado a día 20 (Fig. 5D). La concentración fue superior que en
chimp-1374 e IgM anti-HEV fue
detectada durante el período completo de la monitorización. IgG
anti-HEV fue primero observada en este animal a día
27 (Fig. 5C) y permaneció a aproximada-mente el
mismo nivel a través del experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estimar si la expresión de la región
ORF-2 completa del genoma HEV en células eucariotas
tuvo cualquier ventaja sobre la expresión de fragmentos de
proteínas estructurales en E. Coli, los autores usaron el
antígeno anterior en ELISA para reensayar sueros de monos cynomolgus
que habían sido analizados anteriormente (Tsarev, S.A. y otros
(1992), Proc. Natl. Acad, Sci USA, 89: 559-563; y
Tsarev, S.A y otros (1992) J. Infect. Dis (enviado)), usando los
fragmentos de antígenos expresados en bacterias (Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para 3 de los 6 monos examinados por ELISA, el
antígeno expresado en las células de insecto detectaron
seroconversión más temprana que el antígeno expresado en E.
Coli. Usando el antígeno derivado de células de insecto, los
autores fueron capaces de detectar anticuerpos
anti-HEV en sueros de los seis monos a la dilución
más alta ensayada (1:8000). Con el antígeno derivado de células de
E. coli (cepa Burma) no se obtuvo información acerca de las
concentraciones anti HEV, puesto que todos los sueros fueron
ensayados sólo a una dilución de 1:100 (Tsarev, SA y otros (1992)
Proc. Nat. Acad. Sci. USA; 89: 559-563; Tsarev y
otros (1992) J. Infect. Dis (enviado)).
En otro estudio, el virus de la hepatitis E,
cepa SAR-55 fue diluido en serie en aumentos de 10 y
las diluciones 10-1 hasta 10-5
fueron inoculadas en pares de monos cynomolgus para valorar la
concentración del virus. Los niveles de ALT en suero fueron medidos
para determinar hepatitis y los anticuerpos en suero frente a HEV
fueron determinados mediante el método ELISA del presente invento
(datos en figuras) o por ELISA de Genelab (datos mostrados como
ensayos positivo (+) o negativo (-) en la parte baja de la figura 6
a-g). Todas las muestras fueron ensayadas en
código.
El método ELISA del presente invento detectó la
seroconversión a IgG anti-HEV en todos los cynos
inoculados y en todas las diluciones del virus.
Por el contrario, los resultados de Genelab
fueron sorprendentemente variables, como se muestra a
continuación
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que el Cyno 385 (10^{-5}) fue positivo
en ensayos ELISA tanto de Genelabs como del presente invento, el
10^{-4} (diez veces más virus inoculado) y 10^{-3} (100 veces
más virus inoculado) se habría esperado que fueran también
positivos.
El presente invento los detectó como positivos a
diferencia de ensayo ELISA de Genelab que no detectó a ninguno de
los dos como positivos a 10^{-3} y 10^{-4} aún cuando los
niveles de ALT de Cyno 383 y 393 sugirieron hepatitis activa. Por
lo tanto, los datos apoyan las ventajas del presente método de ELISA
sobre los métodos de la técnica anterior para detectar anticuerpos
frente a HEV.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se describió previamente, la proteína
ORF-2 recombinante es inmunoreactiva.
Adicionalmente, se ha demostrado que reacciona con una variedad de
sueros tomados a partir de diferentes especies de animales
infectados con diferentes cepas de HEV. Esto viene a apoyar el uso
de esta proteína recombinante como una vacuna para proteger frente
a una variedad de cepas de HEV. Los mamíferos son inmunizados con la
proteína ORF-2 recombinante purificada o
parcialmente purificada en una cantidad suficiente para estimular la
producción de anticuerpos protectores. Los animales inmunizados
inoculados con la cepa salvaje de HEV están protegidos.
El contenido de todas las citas, es decir,
artículos en revistas, patentes y similares, son incorporados aquí
mediante referencia.
Se entiende que los ejemplos y realizaciones
descritas aquí son para propósitos ilustrativos y que las diversas
modificaciones y cambios a la luz de los mismos a las personas con
experiencia en la técnica son incluidos dentro del espíritu y
ámbito de esta aplicación y alcance de las reivindicaciones
anexas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTES: Tsarev, Sergei A., Emerson, Suzanne U., Purcell, Robert H.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas recombinantes de una cepa paquistaní de hepatitis E y su utilización en métodos de diagnóstico y vacunas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 98
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: MORGAN & FINNEGAN
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 345 PARK AVENUE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: NUEVA YORK
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NUEVA YORK
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 10154
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco Flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con IBM PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: WORDPERFECT 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/947.263
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-SEP-1992
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Bork, Richard, W.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.459
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2026-4032
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- TELECOMMUNICATION INFORMATION:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (212) 758-4800
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (212) 751-6849
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1693 residuos de aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 660 residuos de aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 residuos de aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7168 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACATTTGAAT TCACAGACAT TGTGC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACACAGATCT GAGCTACATT CGTGAG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAGGGATCC ATGGTGTTTG AGAATG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTCACTGCA GAGCACTATC GAATC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGTAAACTG GTACTGCACA AC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGTCCCGCT CTATTACCCA AG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCCACGGGT GTTGGTTTTT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCTTGGGGC AGGTAGAGAA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTATTGAATT CATGTCAACG GACGTC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATAATTCAT GCCGTCGCTC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGCTCAGGA AGGTACAACT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAATCGATGG CTGGGATCTG ATTC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGGCATTGT AGAGCTTTGT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGTTGCAC GGACAGCAAA TC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTCCGATG CAATCGTTAA TAAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATCCATTC TGTGGCGAGA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGTGTGACC TTGGTCCAGT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGCTCGTGC CACAATTCGC TAC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATTTCACTG AGTCAGTGAA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATTATAAC ACCACTGCTA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATTGCAATA CCCTTATCCT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTAAACCTG TATAGGGCAG AAC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGTTCGATA GCCAGATTTG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCATGTTGGT TGTCATAATC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGACGCAC TTCTCAGTGT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAACAACGA ACGGAGAAC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGATCCCAGC CATCGACTTT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGTAGTGTA GGTGGAAATA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGTGGTTAT TCAGGATTAT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTCTGTGAC CTTGGTTAAT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACTCAAGTT CGAGGGCAAA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCTTACCCT GTTTAACCTT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCCCCTATA TTCATCCAAC CAAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCCTCATGT TTCTGCCTAT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCAGAACGA AATGGAGATA GC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCAGACATA AAACCTAAGT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCCCTATAC AGGTTTAATC G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 base pairs
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleic acid
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: single
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCGGCATAT ACCAGGTGC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACATGGCTCA CTCGTAAATT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACATTAGAC GCGTTAACGA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCTTTTGAT GCCAGTCAGA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCTACCCGG ATGGCTCTAA GG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATGGGAATT CGTGCCGTCC TGAAG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTGGGAGCA GTATACCAGC G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCTATTGA GCAGGCTGCT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGCCATTAG TCTCTAAAAC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGGTTTTCT GGAATCATC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCATAGGTGA GACTG
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTTACAGCC AGAAAACC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATGGATCC TCGGCCTATT TTGCTGTTGC TCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGCAGACCA CATATGTG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTGCACTCC TGACCAAGCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTGGCTGCC ACTTTGTTC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCCTCATAC GTCACCACAA C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGTGGACC ACATTAGGAT TATC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGATATGT CACCATCTG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCATCCATA ACGAGCTGG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCGGAATTC GAGGGGCGGC ATAAAGAACC AGG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCTGAATT CGGATCACAA GCTCAGAGGC TATGCC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTATAACGGA TCCACATCTC CCCTTACCTC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAATTGGATC CTGTGTCGGG TGGAATGAAT AACATGTC
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGGCAGAT CTGATAGAGC GGGGACTTGC CGGATCC
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACCCTGCCC GCGCCCATAC TTTTGATG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTGAGATC TGGTTCGGGT CGCCAAGAAG GTG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACAGATCTA TACAACTTAA CAGTCGG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGTCGGATC CCAGGGGCTG CTGTCCTG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:73:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAGGAATTC AAGACCAGAG GTAGCCTCCT C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTGATATGA ATTCAATAAC CTCGACGG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:75:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA AATGAG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:76:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCACTCGTGA ATTCCTATAC TAATAC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:77:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA AATG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:78:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGATAGAGCG GGACTTGCCG GATCC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:79:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGCATTAGG TTAATGAGGA TCTC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:80:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCTGCTTCC TTCAGCCTGC AGAAG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:81:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGTGGATC CGCTCCCAGG CGTCAAAAC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:82:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGCGGATCG AATTCGAGAC CCTTCTTGG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGATGGATC CATAAGTTAC CGATCAG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:84:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTGGAATT CCTCTGAGGA CGCCCTCAC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:85:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGAAGATC TATCGGACAT AGACCTC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:86:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGACGACGG ATCCCCTTGG ATATAGCCTG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 87:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:87:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCGAATTC AGGCAGACCA CATATGTGGT CGATGCCATG
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 88:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:88:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAGGTGTGC CTGGATCCGG CAAGT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 89:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:89:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTAGAATTC CGGCCCAGCT GTGGTAGGTC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 90:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:90:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGTCCGATT GGTCTGTATG CAGG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 91:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:91:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACCAGTTTA CTGCAGGTGT GC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 92:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:92:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAAGCCGATG TGGACGTTGT CG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 93:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:93:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGCTGGGC CTGGTCACGC CAAG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 94:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:94:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAGAAACTA GTGTTGACCC AG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 95:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:95:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGGTCTACG ACGTGAGGCA AC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 96:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:96:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACAATCTTT CAGGAAGAAG G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 97:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:97:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCACACTCC TCCATAATAG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 98:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:98:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATAGTGCTT TGCAGTGAGT ACCG
\hfill24
Claims (5)
1. Un método para producir una proteína de
hepatitis inmunogénica que comprende:
- cultivar una célula hospedante de insecto transformada o transfectada con un vector de expresión de baculovirus, comprendiendo dicho vector de expresión ADN, teniendo dicho ADN una secuencia, consistiendo dicha secuencia en los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 a 660 de la proteína de marco de lectura abierta 2 del virus de hepatitis E, en condiciones apropiadas para causar la producción de la proteína de hepatitis inmunogénica.
2. Un método de la reivindicación 1, en el que
dicha secuencia de ADN consiste en:
a) nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID Nº
4,
b) una secuencia de ADN que codifica la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2, ó
c) la secuencia de ADN que codifica una
secuencia de aminoácidos que tiene más del 90% de homología con la
secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº: 2.
3. Un vector de expresión de baculovirus que
comprende ADN, teniendo dicho ADN una secuencia, consistiendo dicha
secuencia en nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 a 660 de
una proteína de marco de lectura abierta 2 del virus de la
hepatitis E.
4. El vector de expresión de la reivindicación
3, en el que dicha secuencia de ADN consiste en:
a) nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID Nº:
4
b) una secuencia de ADN que codifica la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2, ó
c) una secuencia de ADN que codifica una
secuencia de aminoácidos que tiene más del 90% de homología con la
secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº: 2
5. Una célula hospedante de insecto que
comprende el vector de expresión de la reivindicación 3 ó 4.
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