ES2336282T3 - Proteinas recombinantes de una cepa paquistani de hepatitis e y su utilizacion en metodos de diagnostico y vacunas. - Google Patents

Proteinas recombinantes de una cepa paquistani de hepatitis e y su utilizacion en metodos de diagnostico y vacunas. Download PDF

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Abstract

SE DESCUBRE UN LINAJE DEL VIRUS DE HEPATITIS E DE PAQUISTAN (SAR55) IMPLICADO EN LA HEPATITIS NO-A, NO-B TRANSMITIDA EPIDEMICA O ENTERICAMENTE, AHORA LLAMADO HEPATITIS E. EL INVENTO SE REFIERE A LA EXPRESION DE LA REGION ESTRUCTURAL TOTAL DE SAR-55, DESIGNADO ESTRUCTURA 2 DE LECTURA ABIERTA (ORF-2), EN UN SISTEMA DE EXPRESION EUCARIOTICA. LA PROTEINA EXPRESADA ES CAPAZ DE FORMAR PARTICULAS PARECIDAS AL VIRUS HEV QUE PUEDEN SERVIR COMO ANTIGENOS EN INMUNOENSAYOS DE DIAGNOSTICO Y COMO INMUNOGEN O VACUNA PARA PROTEGER CONTRA INFECCION POR HEPATITIS E.

Description

Proteínas recombinantes de una cepa paquistaní de hepatitis E y su utilización en métodos de diagnóstico y vacunas.
El invento es en el campo de la virología de la hepatitis. Más específicamente, este invento se refiere a un método para producir una proteína de hepatitis inmunogénica, a saber, la expresión de una secuencia que codifica el marco de lectura abierta 2 completo del virus de la hepatitis E en una célula hospedante de insecto transformada o transfectada con un vector de expresión de baculovirus que comprende dicha secuencia codificante, al vector de expresión de baculovirus y a la célula hospedante de insecto.
Las epidemias de hepatitis E, una hepatitis no-A/no-B entéricamente transmitida, ha sido documentada en Asia, África y América Central (Balayan, M. S, (1987), Soviet Medical Reviews, Section E, Virology Reviews, Zhdanov, V. M. (ed), Chur, Suiza: Harwood Academic Publishers, vol. 2, 235-261; Purcell, R. H. y otros (1988) en Zuckerman. A. J. (ed), "Viral Hepatitis and Liver Disease", Nueva York: Alan R. Liss, 131-137; Bradleay, D. W. (1990), British Medical Bulletin, 46; 442-461; Ticehurst, J. R. (1991) en Hollinger, F. B., Lemon, S. M., Margolis, H. S. (eds); "Viral Hepatitis and Liver disease", Williams and Wilkins, Baltimore, 501-513). Los casos de hepatitis esporádica, que se suponen son de hepatitis E, dan cuenta de hasta el 90% de las hepatitis documentadas en países donde el virus de la hepatitis E (HEV) es endémica. La necesidad para el desarrollo de un ensayo serológico para la detección de anticuerpos anti-HEV en el suero de individuos infectados es ampliamente reconocida en el campo, pero la concentración tan baja de HEV secretada por los humanos o animales infectados hizo imposible usar tal HEV como fuente de antígenos para ensayos serológicos y aunque el éxito limitado fue documentado en la propagación de HEV en cultivos celulares (Huang, R. T y otros (1992), J. Gen. Virol., 73: 1143-1148), el cultivo celular es actualmente demasiado ineficaz para producir las cantidades de antígeno requeridas para ensayos serológicos.
Recientemente, esfuerzos importantes en todo el mundo para identificar secuencias genómicas virales asociadas con la hepatitis E han resultado en el clonaje de los genomas de un número limitado de cepas de HEV (Tam, A. W. Y otros. (1991), Virology, 185: 120-131; Tsarev, S. A y otros (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 559-563; Fry, K. E. y otros (1992), Virus Genes, 6: 173-185). Los análisis de secuencias de ADN han llevado a los investigadores a hipotetizar que el genoma de HEV está organizado en tres marcos de lectura abiertos (ORFs) y a hipotetizar que estos ORFs codifican proteínas HEV intactas.
Una secuencia de ADN parcial del genoma de una cepa HEV de Burma (Myanmar) está descrita en Reyes y otros. 1990, Science, 247: 1335-1339. Tam y otros, 1991, y Reyes y otros, solicitud de patente PCT WO 91/15603 publicada el 17 de Octubre, 1991 describe la secuencia nucleotídica completa y una secuencia aminoacídica deducida de la cepa de Burma de HEV. Estos autores hipotetizaron que tres marcos de lectura abiertos (ORF) están contenidos dentro de las secuencias de esta cepa.
Ichikawa y otros, 1991, Microbiol. Immunol., 35: 535-543, describe el aislamiento de una serie de clones de 240-320 nucleótidos en longitud tras el cribado de una librería de expresión lgt11 con sueros de monos cynomolgus infectados con HEV. La proteína recombinante expresada por un clon fue expresada en E. Coli. Esta proteína de fusión está codificada por la región 3' de ORF-2 de la cepa de Myanmar de HEV.
La expresión de proteínas adicionales codificadas en la región 3' de ORF-2 de una cepa mejicana de HEV y de una cepa burmesa de HEV está descrita en Yarbough y otros, 1991 J: Virology, 65: 5790-5797. Este artículo describe el aislamiento de dos clones de cADN derivados de HEV. Estos clones codifican las proteínas en la región 3' de ORF-2. Los clones fueron expresados en E. Coli como proteínas de fusión.
Purdy y otros, 1992, Archives of Virology, 123: 335-349, y Favorov y otros, 1992. J. of Medical Virology, 36: 246-250, describe la expresión de un fragmento de proteína ORF-2 de la cepa de Burma en E. Coli. Estas referencias así como las previamente descritas, sólo describen la expresión de una porción del gen ORF-2 usando sistemas de expresión bacterianos. La expresión con éxito de la proteína ORF-2 de longitud completa no ha sido descrita hasta el presente invento.
La comparación de la organización del genoma y la estructura morfológica de HEV con la de los torovirus reveló que el HEV está mas íntimamente relacionado con los calicivirus. Es interesante que las proteínas estructurales de calicivirus están codificadas por la porción 3' de su genoma (Neil, J.D. y otros (1991) J. Virol., 65: 5440-5447; y Carter, M. J. y otros (1992), J. Arch. Virol., 122: 223-235) y aunque no hay evidencia directa de que la parte 3' terminal del genoma de HEV también codifique las proteínas estructurales, expresión de ciertas porciones pequeñas de la región 3' del genoma en las células de bacteria dio como resultado la producción de proteínas reactivas con suero anti-HEV en ELISA y transferencias Western (Yarborough, y otros, (1991); Ichikawa y otros, (1991), Vavorov y otros (1992) y Dwason, G. J y otros (1992) J. Virol. Meth; 38: 175-186). Sin embargo, la función de la proteína ORF-2 como una proteína estructural no se demostró hasta el presente invento.
Las proteínas pequeñas codificadas por una porción del gen ORF-2 han sido usadas en inmunoensayos para detectar anticuerpos frente a HEV en sueros de animales. El uso de proteínas pequeñas expresadas en bacterias como antígenos en inmunoensayos serológicos tiene varias desventajas posibles. Primero, la expresión de estas proteínas pequeñas en células de bacterias dan como resultado con frecuencia problemas de solubilidad y reactividad cruzada no específica de sueros de pacientes con proteínas de E. Coli cuando lisados de E. Coli en bruto son usados como antígenos en inmunoensayos (Purdy y otros (1992)). Segundo, el uso de transferencias Western como ensayos serológicos de elección para anticuerpos anti-HEV en epidemiología rutinaria es impráctico debido a las limitaciones de tiempo y de costes. Un ELISA que usa péptidos pequeños derivados de la parte 3' terminal del genoma HEV resultó en la detección de sólo 41% positivos de pacientes diagnosticados infectados por HEV. Tercero, se ha mostrado que para muchos virus, incluyendo Picornaviridae que es la familia más cercana a Caliciviridae, epítopos antigénicos e inmunogénicos importantes son altamente conformacionales (Lemon, S. M. y otros (1991), en Hollinger, F. B., Lemon, S.M., Margolis, H. S. (eds): "Viral Hepatitis and Liver Disease", Williams and Wilkins, Baltimore, 20-24). Por esta razón, se cree que la expresión en un sistema eucariótico de un ORF completo que codifica un gen HEV intacto daría como resultado la producción de una proteína que podría formar partículas de tipo HEV-virales. Tal proteína ORF completa tendría una estructura inmunológica más cercana a la de una proteína de cápside nativa que las proteínas más pequeñas anteriormente mencionadas que representan sólo porciones de las proteínas estructurales de HEV. Por lo tanto, estas proteínas ORF completas muy probablemente servirían como un antígeno más representativo y un inmunógeno más eficiente que las proteínas más pequeñas actualmente usadas.
El presente invento se refiere a:
Un método para producir una proteína de hepatitis inmunogénica que comprende:
Cultivar una célula hospedante de insecto transformada o transfectada con un vector de expresión de baculovirus, dicho vector de expresión comprende ADN, dicho ADN tiene una secuencia, dicha secuencia consiste en los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 a 660 de una proteína de marco de lectura abierta 2 del virus de la hepatitis E, en condiciones apropiadas para producir la proteína de hepatitis inmunogénica.
Preferiblemente, el presente invento se refiere al método anterior, en el que dicha secuencia de ADN consiste en:
a) nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID Nº: 4,
b) una secuencia de ADN que codifica la secuencia aminoácido de la SEQ ID Nº: 2 o
c) una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene más del 90% de homología con la secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº:2.
Por otro lado, el presente invento se refiere a un vector de expresión de baculovirus que comprende ADN, teniendo dicho ADN una secuencia, consistiendo dicha secuencia en los nucleótidos que codifica los aminoácidos 1 a 660 de la proteína del marco de lectura abierta 2 del virus de hepatitis E.
Preferiblemente el vector de expresión de baculovirus es un vector de expresión, en el que dicha secuencia de ADN consiste en:
a) nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID Nº: 4,
b) una secuencia de ADN que codifica las secuencias aminoacídicas de la SEQ ID Nº: 2, o
c) una secuencia que codifica una secuencia aminoacídica que tiene más del 90% de homología con la secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº: 2.
El presente invento también se refiere a una célula hospedante de insecto que comprende el vector de expresión anteriormente mencionado.
Este invento proporciona el uso de secuencias de ácidos nucleicos sintéticos capaces de dirigir la producción de proteínas de HEV recombinantes, así como secuencias de ácidos nucleicos naturales equivalente. Tales secuencias de ácidos nucleicos naturales pueden ser aisladas a partir de cADN o librerías genómicas a partir de las cuales los genes capaces de dirigir la síntesis de las proteínas HEV puede ser identificadas y aisladas. Para el propósito de esta aplicación, las secuencias de ácidos nucleidos se refieren al ARN, ADN, cADN o cualquier variante sintética de las mismas que codifican para proteínas.
El invento también se refiere a proteínas de HEV aisladas y parcialmente purificadas y variantes de las mismas codificadas por el genoma de HEV de SAR-55 o codificadas por secuencias de ácidos nucleicos sintéticas y en particular a proteínas recombinantes codificadas por al menos un marco de lectura abierta completa de HEV, como resultado del método del presente invento.
El invento también se refiere al método para preparar proteínas de HEV recombinantes derivadas de una secuencia de HEV genómica clonando el ácido nucleico e insertando el cADN en un vector de expresión y expresar la proteína recombinante en una célula hospedante dentro del ámbito al alcance del método del presente invento.
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La Figura 1 muestra el vector recombinante usado para expresar la proteína ORF-2 completa del genoma de la cepa HEV SAR-55.
Las Figuras 2A y 2B son geles de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) en los que los lisados celulares de células de insecto infectadas con baculovirus salvaje o baculovirus recombinante (que contiene el gen que codifica ORF-2) fueron o bien teñidos con Coomassie blue (A) o sometidos a transferencia Western con suero de un chimpancé infectado con HEV (B).
Las Figuras 3A y 3B muestran micrografías inmunoelectrónicas (IEM) de partículas de tipo viral de 30 y 20 nm respectivamente, que se forman como resultado de la expresión de la proteína ORF-2 en células de insecto infectadas recombinantes.
La Figura 4 muestra los resultados de un ELISA usando como antígeno, ORF-2 recombinante que fue expresado a partir de células de insecto que contienen el gen que codifican el ORF-2 completo. Los niveles de anticuerpo anti-HEV en suero fueron determinados a diversos tiempos tras la inoculación de monos cynomolgus con o bien la cepa Mejicana (Cyno-80A82, Cyno-9A97 y Cyno 83) o bien la cepa Paquistaní (Cyno-374) de HEV.
La Figura 5A-D muestra los resultados de un ELISA usando como antígeno, el ORF-2 recombinante que fue expresado a partir de células de insecto que contiene el gen que codifica el ORF-2 completo. Los niveles de IgG o IgM anti-HEV en suero fueron determinados a lo largo del tiempo tras la inoculación de dos chimpancés con HEV.
Las Figuras 6A-J muestran una comparación de los datos de ELISA obtenidos usando el antígeno de la proteína ORF-2 completa recombinante derivada de SAR-55 como el antígeno vs. una proteína ORF-2 parcial recombinante derivada de la cepa de Burma de HEV (Genelabs).
El presente invento se refiere a un método para producir una proteína de hepatitis inmunogénica que comprende:
el cultivo de una célula hospedante de insecto transformada o transfectada con un vector de expresión de baculovirus, dicho vector de expresión comprende ADN, dicho ADN tiene una secuencia, dicha secuencia consiste en nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 a 660 de una proteína de marco de lectura abierta 2 del virus de hepatitis E, en condiciones apropiadas para producir la proteína inmunogénica de hepatitis.
El presente invento describe una cepa aislada y sustancialmente purificada del virus de hepatitis E (HEV) de Paquistán, SAR-55. El presente invento también describe la clonación de los genes virales que codifican las proteínas de HEV y la expresión de las proteínas recombinantes usando un sistema de expresión. Más específicamente, el presente invento describe la clonación y expresión de las estructuras de lectura abierta (ORF) de HEV derivadas de SAR-55.
El presente invento describe las proteínas HEV aisladas. Preferiblemente, las proteínas HEV, como resultado del método del presente invento, son sustancialmente homólogas, y más preferiblemente biológicamente equivalentes, a las proteínas HEV nativas. Por "biológicamente equivalentes" como se usa a través de la especificación y las reivindicaciones, se refiere a que las composiciones son capaces de formar partículas virales semejantes y son inmunogénicas. Las proteínas HEV del presente invento pueden estimular también la producción de los anticuerpos protectores tras la inyección en un mamífero que serviría para proteger al mamífero tras el desafío con un tipo salvaje HEV. Por "sustancialmente homóloga" como se usa a través de la especificación consiguiente y las reivindicaciones, se refiere a un grado de homología en la secuencia aminoacídica con las proteínas HEV nativas. Preferiblemente, el grado de homología es mayor de un 70%, preferiblemente mayor del 90%, con un grupo particularmente preferido de proteínas que son más del 99% homólogas con las proteínas HEV nativas.
Las proteínas HEV preferidas producidas por el método del presente invento son aquellas proteínas que están codificadas por los genes ORF que incluyen el gen ORF-2. De interés particular son las proteínas codificadas por el gen ORF-2 del HEV y más particularmente de las proteínas codificadas por el gen ORF-2 de la cepa SAR-55 del HEV. Las proteínas producidas por el método del presente invento, codificadas por el gen ORF-2, forman partículas virales semejantes. Las secuencias aminoacídicas de las proteínas ORF-1, ORF-2 y ORF-3 se muestran a continuación como SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2, y SEQ ID NO.: 3, respectivamente;
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3
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6 
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Las abreviaturas de tres letras siguen la nomenclatura corta convencional para los veinte aminoácidos presentes de manera natural.
Las proteínas HEV recombinantes pueden consistir en al menos una proteína ORF pero incluyen siempre aminoácidos 1 a 660 de la proteína de marco de lectura abierta 2 del virus de la hepatitis E. Otras proteínas recombinantes hechas de más de una de las mismas proteínas ORF o diferentes puede ser hechas para alterar las propiedades biológicas de la proteína.
Se contempla que las adiciones, sustituciones o deleciones de los aminoácidos discretos o de secuencias discretas de aminoácidos pueden potenciar la actividad biológica de las proteínas de HEV.
El presente invento puede usar una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de dirigir la producción de la proteína HEV anteriormente tratada o proteínas sustancialmente homólogas a las proteínas HEV. Esta secuencia de ácidos nucleicos, designada SAR-55, está expuesta a continuación como SEQ ID Nº: 4 y fue depositada en la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) el 17 de Septiembre de 1992.
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Las abreviaturas usadas para los nucleótidos son las usadas normalmente en la técnica.
En una realización preferida, la secuencia de ácidos nucleicos usada en el método del presente invento consiste en los nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID NO:4.
La secuencia en una dirección ha sido designada por convención como la secuencia "plus" puesto que es la cepa que codifica la proteína de los virus ARN y ésta es la secuencia que se muestra anteriormente como la SEQ ID NO: 4.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de los marcos de lectura abierta del SAR-55 que tienen la SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 y la SEQ ID NO. 3 ORF-1 se inician en el nucleótido 28 de la SEQ ID NO. 4 y se extienden 5078 nucleótidos; el ORF-2 se inicia en el nucleótido 5147 de la SEQ ID NO. 4 y se extiende 1979 nucleótidos; y el ORF-3 se inicia en el nucleótido 5106 de la SEQ ID NO. 4 y se extiende 368 nucleótidos.
Las variaciones se contemplan en la secuencia de ADN que resultará en una secuencia de ADN que es capaz de dirigir la producción de los análogos de la proteína ORF-2. Se debe observar que la secuencia de ADN expuesta anteriormente puede representar una realización del presente invento. Debido a la degeneración del código genético, se debe comprender que varias elecciones de nucleótidos pueden ser hechas de modo que puedan conducir a una secuencia de ADN capaz de producir las proteínas ORF o sus análogas, incluyendo las proteínas ORF2. Como tales, las secuencias de ADN que son equivalentes funcionalmente a las secuencias expuestas anteriormente o que son equivalentes funcionalmente a las secuencias que podrían dirigir la producción de los análogos de las proteínas ORF producidas según la secuencia de aminoácidos expuesta anteriormente, se desea que sean abarcadas dentro del presente invento.
El presente invento describe un método para detectar el virus de la hepatitis E en las muestras biológicas basadas en la amplificación selectiva de los fragmentos génicos de hepatitis E. Preferiblemente, este método utiliza un par de cebadores de hebra simple derivados de regiones no homólogas de las hebras opuestas de un fragmento dúplex de ADN, que a su vez es derivado de un virus de hepatitis E cuyo genoma contiene una región homóloga a la secuencia SAR-55 mostrada en la SEQ ID NO.: 4. Estos cebadores pueden ser usados en un método que sigue el proceso para amplificar las secuencias de ácidos nucleicos como se define en el documento de patente norteamericana No. 4.683.202.
El presente invento también describe el uso de poli u oligonucleótidos antisentido de hebra simple derivados de las secuencias análogas al cADN SAR-55 para inhibir la expresión de los genes de la hepatitis E. Estos poli u oligonucleótidos antisentido pueden ser bien ADN o ARN. La secuencia diana es típicamente un ARN mensajero y mas preferentemente, una secuencia señal requerida para procesar o traducir el ARN. Los poli u oligonucleótidos antisentido pueden ser conjugados a un policatión tal como una polilisina como se describe en Lemaitre, M. y otros (1989) Proc Natl Acad Sci USA 84: 648-652; y este conjugado puede ser administrado a un mamífero en una cantidad suficiente para hibridar con, e inhibir la función, del ARN mensajero.
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El primer invento incluye un método recombinante de ADN para la fabricación de las proteínas HEV, preferiblemente una proteína compuesta de al menos una de las proteínas ORF, incluyendo la proteína ORF-2, más preferiblemente al menos una proteína ORF-2. La recombinación de la proteína ORF puede estar compuesta de una proteína ORF o de una combinación de la misma o de diferentes proteínas ORF, que incluyen la proteína ORF-2. Una secuencia de ácidos nucleicos natural o sintética puede ser usada para dirigir la producción de las proteínas HEV.
En una realización, dicho método comprende:
(a)
la preparación de una secuencia de ácidos nucleicos capaz de dirigir un organismo hospedante para producir una proteína de HEV; que incluye la proteína ORF-2
(b)
la clonación de la secuencia de ácidos nucleicos en un vector capaz de ser transferido en y replicado en un organismo hospedante, dicho vector contiene elementos operacionales para la secuencia de ácidos nucleicos;
(c)
la transferencia del vector que contiene ácidos nucleicos y los elementos operacionales en un organismo hospedante capaz de expresar la proteína;
(d)
el cultivo del organismo hospedante en las condiciones apropiadas para la amplificación del vector y la expresión de la proteína; y
(e)
el cultivo de la proteína.
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En otra realización del invento el método para la síntesis del ADN recombinante de una proteína que incluye la proteína ORF-2 codificada por los ácidos nucleicos del HEV, preferiblemente que codifican al menos un ORF del HEV o una combinación de la misma o de diferentes proteínas ORF que incluyen la proteína ORF-2, más preferiblemente que codifican al menos una proteína ORF-2, comprende:
(a)
el cultivo de un organismo transformado o transfectado que contiene una secuencia de ácidos nucleicos capaz de dirigir el organismo hospedante para producir una proteína, en condiciones tales que la proteína sea producida, dicha proteína exhibe una homología sustancial a una proteína HEV nativa aislada del HEV que tiene la secuencia del aminoácido según la SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3, o la combinación de las mismas, sin embargo, incluye siempre la secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO. 2.
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En una realización, la secuencia de ARN del genoma viral de la cepa HEV SAR-55 fue aislada y clonada en cADN como sigue. El ARN viral es extraído de una muestra biológica recogida de los monos cynomolgus infectados con el SAR-55 y el ARN viral es después transcrito inversamente y amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores complementarios a las hebras positivas o negativas del genoma de una cepa de HEV de Burma (Tam y otros) o del genoma SAR-55. Los fragmentos de PCR son subclonados en pBR322 o pGEM-3 y los fragmentos de PCR de doble hebra fueron secuenciados.
Los vectores contemplados para el uso en el presente invento incluyen un vector de expresión de baculovirus en el que una secuencia de ácidos nucleicos como se describe anteriormente, puede ser insertada, junto con cualquier elemento operacional requerido o preferido, y cuyo vector puede ser después transferido subsiguientemente en un organismo hospedante y replicado en dicho organismo. El vector usado es uno cuyos sitios de restricción han sido bien documentados y los cuales contienen los elementos operacionales preferidos o requeridos para la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos.
Los "elementos operacionales" como se describen aquí incluyen al menos un promotor, al menos un operador, al menos una secuencia líder, al menos un codón de terminación, y cualquier otra secuencia de ADN necesaria o preferida para la transcripción adecuada y la traducción subsiguiente del vector de ácidos nucleicos. En particular, se contempla que dichos vectores contendrán al menos un origen de replicación reconocido por el organismo hospedante junto con al menos un marcador seleccionable y al menos una secuencia promotora capaz de iniciar la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos.
En la construcción del vector de clonación del presente invento, se debe notar adicionalmente que múltiples copias de la secuencia de ácidos nucleicos y sus elementos operacionales esperados pueden ser insertados en cada vector. En dicha realización, el organismo hospedante produciría cantidades mayores por vector de la proteína HEV deseada. El número de múltiples copias de la secuencia de ADN que puede ser insertado en el vector está limitado sólo por la capacidad del vector resultante debido a su tamaño, para ser transferido en y replicado a y transcrito en un microorganismo hospedante apropiado.
En otra realización, los fragmentos de restricción tras la digestión que contienen una secuencia codificante para las proteínas HEV pueden ser insertados en un vector de expresión adecuado que funciona en las células procariotas o eucariotas. Por adecuado se refiere a que el vector es capaz de transportar y expresar una secuencia de ácidos nucleicos completa que codifica las proteínas HEV, preferiblemente en al menos una proteína ORF completa. En el caso de ORF-2, la proteína expresada debería formar partículas de tipo viral. El vector de expresión es un vector de expresión de baculovirus que funciona en una célula eucariota, especialmente en una célula de insecto. Se hace referencia al vector de transferencia de baculovirus, pBlueBac. Los vectores preferidos son p63-2, que contienen el gen ORF-2 completo, y el p59-4, que contiene los genes ORF-2 y ORF-3 completos. Estos vectores fueron depositados en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA el 10 de Septiembre de 1992. El Ejemplo 1 ilustra la clonación del gen ORF-2 en pBluebac para producir el p63-2. Este método incluye la digestión del genoma de la cepa HEV SAR-55 con las enzimas de restricción NruI y BglII, insertando un sitio de policlonaje que contiene los sitios BlnI y BglII en el sitio NheI único del vector e insertando el fragmento ORF-2 NruI-BglII en el pBluebac BlnI-BglII usando un adaptador.
En otra realización, el vector de expresión recombinante seleccionado puede ser luego transfectado en un sistema de células eucariotas adecuado con el propósito de expresar la proteína recombinante. Un sistema de células eucariotas preferidas es las células de insecto SF9. Un método preferido implica el uso del vector de expresión pBluebac donde la línea de célula del insecto SF9 está cotransfectada con el pBluebac recombinante y el ADN de baculovirus AcMNPV por el método de precipitación de Ca.
La proteína recombinante expresada puede ser detectada por métodos conocidos en la técnica que incluye tinción azul Coomassie y transferencia Western usando suero que contiene el anticuerpo anti HEV como se muestra en el Ejemplo 2. Otro método es la detección de partículas de tipo viral por microscopia inmunoelectrónica como se muestra en el Ejemplo 3.
La proteína recombinante expresada por las células SF9 puede ser obtenida como un lisado en bruto o puede ser purificada por los procedimientos de purificación de la proteína estándar conocidos en la técnica que pueden incluir precipitación diferencial, cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de intercambio iónico, enfoque isoeléctrico, electroforesis en gel, afinidad y cromatografía de inmunoafinidad y similares. En el caso de la cromatografía de inmunoafinidad, la proteína recombinante puede ser purificada por el paso a través de una columna que contiene una resina que ha unido a los mismos anticuerpos específicos para la proteína ORF.
Las proteínas recombinantes expresadas en este invento pueden ser usadas en los inmunoensayos para el diagnóstico o el pronóstico de hepatitis E en un mamífero que incluye, pero no se limita a humanos, chimpancés, monos del viejo mundo, monos del nuevo mundo, otros primates y similares. En una realización preferida, el inmunoensayo es útil en el diagnóstico de la infección de la hepatitis E en humanos. Los inmunoensayos que usan las proteínas HEV, particularmente las proteínas ORF, que incluyen la proteína ORF2 y especialmente las proteínas ORF2, proporcionan un método reproducible, sensible y altamente específico para el diagnóstico de las infecciones HEV, en contraste con los inmunoensayos que utilizan las proteínas ORF parciales.
Los inmunoensayos mencionados en el presente invento pueden ser radioinmunoensayos, ensayos de transferencia Western, ensayos inmunofluorescentes, inmunoensayos enzimáticos, ensayos quimioluminiscentes, ensayos inmunohistoquímicos y similares. Las técnicas estándar conocidas en la técnica para ELISA están descritas en los Methods in Immunodiagnosis, 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds., John Wiley and Sons, 1980 and Campbell y otros, Methods of Immunology, W.A. Benjamin, Inc., 1964, ambos de los cuales son incorporados aquí mediante referencia. Dichos ensayos pueden ser un inmunoensayos no competitivos, competitivos, indirectos o directos como se describe en la técnica. (Oellerich, M. 1984. J. Clin. Chem. Clin. BioChem. 22: 895-904). Las muestras biológicas apropiadas para dichos ensayos de detección incluyen, pero no están limitados a, extractos de biopsia de tejido, sangre entera, plasma, suero, fluido cerebroespinal, fluido pleural, orina y similares.
El suero de ensayo es reaccionado con un reactivo de fase sólida que tiene una proteína HEV recombinante unida a la superficie como un antígeno, preferiblemente la proteína ORF-2 o la combinación de las diferentes proteínas ORF tal como ORF-2 y ORF-3, sin embargo incluyen siempre ORF-2. Más preferiblemente, la proteína HEV es una proteína ORF-2 que forma partículas de tipo viral. El reactivo de superficie sólida puede ser preparado por las técnicas conocidas para unir la proteína al material de soporte sólido. Estos métodos de unión incluyen la adsorción no específica de la proteína para la unión covalente o de soporte de la proteína a un grupo reactivo en el soporte. Después de la reacción del antígeno con un anticuerpo anti HEV, los componentes de suero no adheridos son eliminados por lavado y el complejo anticuerpo-antígeno es reactivado con un anticuerpo secundario tal como el anticuerpo marcado antihumano. El marcaje puede ser una enzima que es detectada por incubación del soporte sólido en presencia de un reactivo colorimétrico o fluorimétrico adecuado. Otros marcajes detectables pueden ser también usados, tal como radiomarcaje u oro coloidal, y similares.
En una realización preferida, la proteína expresada por el vector recombinante pBluebac que contiene la secuencia ORF-2 entera de SAR-55 es usada como un agente de unión específico para detectar anticuerpos anti HEV, preferiblemente anticuerpos lgG o IgM. Los Ejemplos 4 y 5 muestran los resultados de un ELISA en el que el reactivo de fase sólida tiene un ORF-2 recombinante como el antígeno de superficie. Esta proteína, codificada por la secuencia de ácidos nucleicos ORF-2 entera, es superior a la proteína ORF-2 parcial, ya que es reactiva con más antisueros de las diferentes especies primates infectadas con HEV que son antígenos parciales de ORF-2. La proteína del presente invento es capaz también de detectar anticuerpos producidos en respuesta a las diferentes cepas del HEV pero no al virus de la Hepatitis A, B, C o D.
La proteína HEV y las análogas pueden ser preparadas en la forma de un kit, solo o en combinación con otros reactivos tal como anticuerpos secundarios, para el uso en inmunoensayos.
Las proteínas HEV recombinantes, que incluyen una proteína ORF-2, preferiblemente una proteína ORF-2 o la combinación de proteínas ORF, y proteínas sustancialmente homólogas y análogas a la del invento pueden ser usadas como una vacuna para proteger a los mamíferos frente a la exposición a la Hepatitis E. La vacuna, que actúa como un inmunógeno, puede ser una célula, un lisado celular de las células transfectadas con un vector de expresión recombinante o un cultivo de sobrenadante que contiene la proteína expresada. Alternativamente, el inmunógeno es una proteína recombinante sustancialmente o parcialmente purificada. Aunque es posible que el inmunógeno sea administrado en una forma sustancialmente pura o pura, es preferible presentarlo como una preparación, formulación o composición farmacéutica.
Las formulaciones descritas en el presente invento, ambas para uso humano y veterinario, comprenden un inmunógeno como se describe anteriormente, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. El/los excipiente(s) puede ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial con el recipiente del mismo. Las formulaciones pueden ser presentadas convenientemente en forma de dosis de unidad y pueden ser preparadas por cualquier método bien conocido en la técnica farmacéutica.
Todos los métodos incluyen la etapa de llevar en asociación el ingrediente activo con el excipiente que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones son preparadas por uniformidad y están íntimamente asociadas al ingrediente activo con los excipientes líquidos o los excipientes sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto en la formulación deseada.
Las formulaciones adecuadas para la administración intraperitoneal, subcutánea, intramuscular o intravenosa comprenden convenientemente disoluciones acuosas estériles del ingrediente activo con disoluciones que son isotónicas preferiblemente con la sangre del receptor. Dichas formulaciones pueden ser preparadas convenientemente por disolución del ingrediente activo sólido en agua, que contiene sustancias fisiológicamente compatibles tal como el cloruro de sodio (por ejemplo, 0,1-2, OM), glicina y similares y teniendo un pH tamponado compatible con las condiciones fisiológicas para producir una disolución acuosa y traduciendo dicha disolución estéril. Estos pueden estar presentes en unidades o contenedores multidosis, por ejemplo, ampollas selladas o viales.
Las formulaciones descritas en el presente invento pueden incorporar un estabilizador. Los estabilizadores ilustrativos son polietilenglicol, proteínas, sacáridos, aminoácidos, ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos que pueden ser usados bien solos o como mezclas. Estos estabilizadores son incorporados preferiblemente en una cantidad de 0,11-10.000 partes por peso per parte por peso del inmunógeno. Si dos o más estabilizadores deben ser usados, su cantidad total está preferiblemente dentro del intervalo especificado anteriormente. Estos estabilizadores son usados en disoluciones acuosas en la concentración apropiada y pH. La presión osmótica específica de dichas disoluciones acuosas está generalmente en el rango de 0,1-3,0 osmoles, preferiblemente en el intervalo de 0,8-1,2. El pH de la disolución acuosa es ajustado para estar dentro del intervalo de 5,0-9,0, preferiblemente dentro del intervalo de 6-8. En la formulación del inmunógeno descrita en el presente invento, se puede usar un agente anti adsorción.
Métodos farmacéuticos adicionales pueden ser empleados para controlar la duración de la acción. Las preparaciones de liberación controlada pueden ser conseguidas a través del uso del polímero para completar o adsorber las proteínas o sus derivados. El suministro controlado puede ser ejercitado por la selección de macromoléculas adecuadas (por ejemplo el poliéster, ácidos poliaminos, polivinilo, pirrolidon, etilénvinilacetato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o sulfato de protamina) y la concentración de macromoléculas así como los métodos de incorporación para controlar la liberación. Otro método posible para controlar la duración de la acción por las preparaciones de liberación controlada es para incorporar las proteínas, análogos de proteína o sus derivados funcionales, en partículas de un material polimérico tal como poliésteres, ácidos poliaminos, hidrogeles, poli (ácido láctico) o copolímeros etilénvinilacetato. Alternativamente, en lugar de incorporar estos agentes en las partículas poliméricas, es posible atrapar estos materiales en micro cápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, metilcelulosa hidroxi o micro cápsulas de gelatina y micro cápsulas poli (metilmetacrilato), respectivamente o en sistemas de suministro de fármacos coloidales, por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas o en macroemulsiones.
Cuando las preparaciones orales son deseadas, las composiciones pueden estar combinadas con los excipientes típicos, tal como la lactosa, sacarosa, almidón, estearato de magnesio de talco, celulosa cristalina, celulosa metilo, celulosa carboximetilo, glicerina, alginato de sodio o goma arábiga entre otros.
Las proteínas como resultado del método del presente invento pueden ser suministradas en forma de un kit, solas o en la forma de una composición farmacéutica como se describe anteriormente.
La vacunación puede ser conducida por los métodos convencionales. Por ejemplo, el inmunógeno puede ser usado en un diluyente adecuado tal como salino o agua, o en adyuvantes completos o incompletos. Además, el inmunógeno puede o no estar unido a un excipiente para hacer la proteína inmunogénica. Los ejemplos de dichas moléculas excipientes incluyen, pero no están limitados a, la albumina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa keyhole (KLH), el toxoide del tetano y similares. El inmunógeno puede ser administrado por cualquier ruta apropiada para la producción de anticuerpos tal como intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea y similares. El inmunógeno puede ser administrado una vez o en intervalos periódicos hasta que una concentración significante de anticuerpos anti HEV sea producida. El anticuerpo puede ser detectado en el suero usando un inmunoensayo.
La administración del inmunógeno como resultado del método del presente invento puede ser o bien para un propósito profiláctico o terapéutico. Cuando se proporciona profilácticamente, el inmunógeno es proporcionado antes de cualquier exposición al HEV o antes de cualquier síntoma debido a la infección HEV. La administración profiláctica del inmunógeno sirve para evitar o atenuar cualquier infección subsiguiente del HEV en un mamífero. Cuando se proporciona terapéuticamente, el inmunógeno es proporcionado durante (o poco después de) la aparición de la infección o durante la aparición de cualquier síntoma de la infección o de la enfermedad causada por el HEV. La administración terapéutica del inmunógeno sirve para atenuar la infección o la enfermedad.
Se menciona preferiblemente una vacuna preparada usando una proteína ORF-2 recombinante expresada por la secuencia ORF-2 de la cepa HEV SAR-55 y las equivalentes de la misma. Puesto que se ha demostrado que la proteína ORF-2 recombinante es reactiva con una variedad de sueros positivos para HEV, son indicadas sus utilidades en proteger frente a una variedad de las cepas de HEV.
Además de usarla como una vacuna, las composiciones pueden ser usadas para preparar anticuerpos frente a partículas de tipo virus HEV. Los anticuerpos pueden ser usados directamente como agentes antivirales. Para preparar los anticuerpos, un animal hospedante es inmunizado usando las partículas virales o, según sea apropiado, antígenos no particulados nativos de la partícula del virus son unidos a un excipiente como se describe anteriormente para las vacunas. El suero o el plasma del hospedante es recogido siguiendo un intervalo de tiempo apropiado para proporcionar una composición que comprende anticuerpos reactivos con la partícula del virus. La fracción de gama globulina o los anticuerpos lgG pueden ser obtenidos, por ejemplo, por el uso del sulfato amónico saturado o DEAE Sephadex, u otras técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. Los anticuerpos están sustancialmente libres de muchos de los efectos laterales adversos que pueden estar asociados con otros agentes anti virales tales como los fármacos.
Las composiciones del anticuerpo pueden ser hechas incluso más compatibles con el sistema hospedante minimizando potenciales respuestas del sistema inmune adversas. Esto se lleva acabo eliminando todo o una porción de la porción Fc de un anticuerpo de una especie diferente o usando un anticuerpo de la misma especie como animal hospedante, por ejemplo, el uso de los anticuerpos de los hibridomas humano/humano. Los anticuerpos humanizados (es decir, no inmunogénicos en un humano) pueden ser producidos, por ejemplo, por reemplazo de una porción inmunogénica de un anticuerpo con una correspondiente, pero no una porción inmunogénica (es decir, anticuerpos quiméricos). Tales anticuerpos quiméricos pueden contener la porción reactiva o de unión al antígeno de un anticuerpo de una especie y la porción Fc de un anticuerpo (no inmunogénico) de una especie diferente. Los ejemplos de los anticuerpos quiméricos, incluyen pero no están limitados a, quimeras mamífero no humano -humano, quimeras roedor-humano, quimeras murino-humano y rata-humano (Robinson y otros, solicitud de patente internacional 184, 187; Taniguchi M., solicitud de patente europea 171, 496; Morrison y otros, solicitud de patente europea 173, 494; Neuberger y otros, PCT Application WO 86/01533; Cabilly y otros, 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439; Nishimura y otros, 1987 Canc. Res. 47: 999; Wood y otros, 1985 Nature 314: 446; Shaw y otros, 1988 J. Natl. Cancer Inst. 80: 15553, todos incorporados aquí mediante referencia).
Revisiones generales de anticuerpos quiméricos "humanizados" son proporcionados por Morrison S. 1985 Science 229: 1202 y por Oi y otros, 1986 Bio Techniques 4: 214.
Los anticuerpos "humanizados" adecuados pueden ser producidos alternativamente mediante sustitución de CDR o CEA (Jones y otros, 1986 Nature 321: 552; Verhoeyan y otros, 1988 Science 239: 1534; Biedler y otros 1988 J. Immunol. 141: 4053, todos incorporados aquí por referencia).
Los anticuerpos o los antígenos que unen los fragmentos pueden ser producidos mediante ingeniería genética. La tecnología para la expresión de ambos genes de cadena ligera y pesada en E. coli es el sujeto de las solicitudes de patente PCT; el numero de publicación del documento de patente WO 901443, WO 901443, y el WO 9014424 y en Huse y otros, 1989 Science 246: 1275-1281.
Los anticuerpos pueden ser también usados como un medio para mejorar la respuesta inmune. Los anticuerpos pueden ser administrados en cantidades similares a aquellas usadas por otras administraciones terapéuticas del anticuerpo. Por ejemplo, la gama globulina concentrada es administrada a 0,02-0,1 ml/lb de peso corporal durante el período de incubación temprano de otras enfermedades virales como la rabia, el sarampión y la hepatitis B para interferir con la entrada viral en las células. Así pues, los anticuerpos reactivos con la partícula del virus HEV pueden ser administrados pasivamente solos o en conjunción con otro agente antiviral en un hospedante infectado con el HEV para mejorar la respuesta inmune y/o la efectividad de un fármaco antiviral.
Alternativamente, los anticuerpos anti HEV pueden ser inducidos por administración de anticuerpos anti idiotipo como inmunógenos. Convenientemente, una preparación de anticuerpos anti HEV purificado preparada como se describe anteriormente es usada para inducir el anticuerpo anti idiotipo en un hospedante animal. La composición es administrada en el hospedante animal en un diluyente adecuado. Tras la administración, habitualmente una administración repetida, el hospedante produce el anticuerpo anti idiotipo. Para eliminar una respuesta inmunogénica frente a la región Fc, los anticuerpos producidos por la misma especie del hospedante animal pueden ser usados o la región Fc de los anticuerpos administrados puede ser eliminada. Siguiendo la inducción del anticuerpo anti idiotipo en el hospedante animal, el suero o el plasma es retirado para proporcionar una composición de anticuerpos. La composición puede ser purificada como se describe anteriormente para los anticuerpos anti HEV, o por cromatografía de afinidad usando anticuerpos anti HEV unidos a la matriz de afinidad. Los anticuerpos anti idiotipo producidos son similares en conformación con el auténtico antígeno HEV y pueden ser usados para preparar una vacuna HEV en lugar de usar un antígeno de partículas de HEV.
Cuando se usa como un medio de inducir anticuerpos anti virus de HEV en un animal, la forma de inyectar el anticuerpo es la misma que para los propósitos de vacunación, especialmente intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o similar en una concentración eficaz en un diluyente fisiológicamente adecuado o sin adyuvante. Una o más inyecciones de refuerzo pueden ser deseadas.
Las proteínas derivadas del HEV como resultado del método del invento son pretendidas también para el uso en la producción del antisuero designado para la profilaxis de post o pre exposición. Aquí una proteína HEV, o la mezcla de las proteínas es formulada con un adyuvante adecuado y administrado por inyección a voluntarios humanos, según los métodos conocidos para la producción de antisuero humano. La respuesta del anticuerpo a las proteínas inyectadas es monitorizada, durante un período de varias semanas tras la inmunización, por muestreo de suero periódico para detectar la presencia de anticuerpos de suero anti HEV, usando un inmunoensayo como se describe aquí.
El antisuero de los individuos inmunizados puede ser administrado como una medida profiláctica de pre exposición para individuos que están en riesgo de contraer la infección. El antisuero es también útil en el tratamiento de un individuo post expuesto, análogo al uso del antisuero de concentración alta contra el virus de la hepatitis B para la profilaxis de post exposición.
Para ambos uso in vivo de los anticuerpos en las partículas semejantes al virus HEV y las proteínas y los anticuerpos anti idiotipo y el uso del diagnóstico, puede ser preferible usar los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales anti partículas virales o los anticuerpos antiidiotipo pueden ser producidos como sigue. El bazo o los linfocitos de un animal inmunizado son retirados e inmortalizados o usados para preparar los hibridomas por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica (Goding, J. W. 1983 Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Pladermic Press, Inc., NY, NY, pp. 56-97). Para producir un hibridoma humano-humano, un donante de linfocitos humanos es seleccionado. Un donante que se conoce que está infectado con HEV (donde la infección ha sido mostrada por ejemplo por la presencia de los anticuerpos antivirales en la sangre o por cultivo del virus) puede servir como un donante linfocito adecuado. Los linfocitos pueden ser aislados de una muestra de sangre periférica o las células del bazo pueden ser usadas si el donante está sujeto a esplenectomía. El virus Barr Epstein (EBV) puede ser usado para inmortalizar los linfocitos humanos o una pareja de fusión humana puede ser usada para producir los hibridomas humano-humano. La inmunización in vitro primaria con los péptidos puede ser también usada en la generación de los anticuerpos monoclonales humanos.
Los anticuerpos secretados por las células inmortalizadas son cribados para determinar los clones que secretan anticuerpos de la especificidad deseada. Para los anticuerpos monoclonal antipartículas virales, los anticuerpos deben unirse a las partículas del virus HEV. Para los anticuerpos monoclonales antiidiotipo, los anticuerpos deben unirse a los anticuerpos antipartículas virales. Las células que producen anticuerpos de la especificidad deseada son seleccionadas.
Los anticuerpos descritos anteriormente y los antígenos que unen fragmentos del mismo pueden ser suministrados en forma de kit solo o como una composición farmacéutica para el uso in vivo. Los anticuerpos pueden ser usados para usos terapéuticos, el uso de diagnostico en inmunoensayos o como un agente de inmunoafinidad para purificar las proteínas ORF como se describe aquí.
Los materiales usados en los siguientes Ejemplos fueron como sigue:
Primates. El chimpancé (Chimp) (Pan troglodytes). Monos del viejo mundo: monos cynomolgus (Cyno) (Macaca fascicularis), monos Rhesus (Rhesus) (M. mulatta), monos cerdo (PT) (M. nemestrina), y los monos verdes africanos (AGM) (Cercopithecus aethiops). Monos del nuevo mundo: tamarindos con bigote (Tam) (Saguinus mystax), monos ardilla (SQM) (Salmiri sciureus) y los monos búho (OWL) (Aotus trivigatus). Los primates fueron encerrados por separado en condiciones de contención de peligro biológico. El almacenamiento, el mantenimiento y el cuidado de los animales alcanzó o excedió todos los requerimientos para la cría de los primates.
La mayoría de los animales fueron inoculados de forma intravenosa con HEV, la cepa SAR-55 contenida en 0,5 ml de una suspensión fecal diluida en el suero de ternera fetal como se describe en Tsarev, S.A. y otros (1992), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 559-563; y Tsarev, S.A. y otros (1992), J. Infect. Dis. (Presentado). Los Chimpancés 1313 y 1310 fueron inoculados con una partida de deposiciones recogidas de los pacientes con hepatitis E Pakistani 7.
Las muestras de suero fueron recogidas aproximadamente dos veces por semana antes y después de la inoculación. Los niveles de la aminotransferasa de alanina del suero de las enzimas del hígado (ALT), de la isocitrato dehidrogenasa (ICD), y la gammaglutamil transferasa (GGT) fueron ensayadas con los ensayos disponibles comercialmente (Medpath Inc., Rockville, MD). Los ensayos serológicos fueron realizados como se describe anteriormente.
Ejemplo 1 Identificación de la secuencia de ADN del genoma de la cepa SAR-55 HEV
La preparación de la Plantilla del virus ARN para PCR. La bilis de un mono cynomolgus infectado con HEV (10 \mul), 20% de SDS (peso/vol) (a una concentración final del 1%), la proteinasa K (10 mg/ml; a una concentración final de 1 mg/ml), 1 \mul de tARN (10 mg/ml), y 3 \mul de EDTA 0,5 M fueron mezclados en un volumen final de 250 \mul e incubados durante 30 min. a 55ºC. Los ácidos nucleicos totales fueron extraídos de la bilis dos veces con cloroformo/fenol, 1:1 (vol/vol), a 65ºC y una vez con cloroformo, luego precipitados con etanol, lavados con 95% de etanol, y usado para el RT-PCR. La amplificación RT-PCR del ARN HEV de las heces y especialmente del suero fue más eficaz cuando el ARN fue purificado más extensamente. El suero (100 \mul) o el 10% de una suspensión fecal (200 \mul) fue tratado como se indica anteriormente con la proteinasa K. Después de 30 min de incubación, 300 \mul de tampón CHAOS (4,2 M guanidina tiocianato/0,5 N-lauroilsarcosina/0,025 M Tris-HCl, pH 8,0) fueron añadidos. Los ácidos nucleicos fueron extraídos dos veces con el fenol/cloroformo a 65ºC seguidos por la extracción del cloroformo a temperatura ambiente. Después se añadieron acetato de amonio 7,5 M (225 \mul) a la fase superior y los ácidos nucleicos fueron precipitados con 0,68 ml de 2-propanol. La precipitación fue disuelta en 300 \mul del tampón CHAOS y se añadieron 100 \mul de H_{2}O. Las extracciones de cloroformo y de la precipitación de 2-propanol fueron repetidas. Los ácidos nucleicos fueron disueltos en agua, precipitados con etanol, lavados con 95% de etanol, y usados para el RT-PCR.
Los cebadores. Noventa y cuatro cebadores, 21-40 nucleótidos (nt) largos, y complementarios a hebras positivas o negativas del genoma de una cepa de HEV de Burma (BUR-121) (Tam, A.W. y otros (1991), Virology, 185:120-131) o el genoma SAR-55 fueron sintetizados usando un sintetizador de ADN 391 modelo de Applied Biosystems.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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Las secuencias de estos 94 cebadores se muestran a continuación empezando con la SEQ. ID NO.5 y continuando con la SEQ. ID NO. 98:
Lista del cebador HEV
16
18
19
20
21
22 
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Las abreviaturas a la izquierda de las secuencias representan lo siguiente: R y D se refieren a los cebadores inverso (R) y directo (D), respectivamente; B y S se refieren a las secuencias derivadas de la cepa Burma-121 de la Hepatitis E y la cepa SAR-55 de la Hepatitis E, respectivamente; 5'NC y 3'NC se refiere a las regiones 5 prima y 3 prima no codificantes del genoma de HEV, respectivamente; y 1, 2 y 3 se refieren a las secuencias derivadas de los marcos de lectura abiertas 1, 2 o 3, respectivamente. El símbolo () hacia la derecha de algunas secuencias indican la inserción de un sitio de restricción artificial en estas secuencias.
Para el clonaje de los fragmentos de PCR, EcoRI, BamHI, o BglII precedidos por 3-7 nts fueron añadidos al extremo 5' de los cebadores.
RT-PCR. La mezcla normal de RT-PCR de 100 \mul contenía el molde, 10 mM Tris-HCL (pH 8.4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl_{2}, los cuatro cebadores dNTPs (cada uno a 0,2 mM), 50 pmoles del cebador directo, 50 pmoles del cebador inverso, 40 unidades de RNasin (Promega), 16 unidades de la transcriptasas inversa del virus de mieloblastosis aviar (Promega), 4 unidades de AmpliTaq (Cetus), en 100 \mul de aceite mineral ligero. La mezcla fue incubada 1 h a 42ºC y luego amplificada mediante 35 ciclos de PCR; 1 min a 94ºC, 1 min a 45ºC, y 1 min a 72ºC. Los productos de PCR fueron analizados en geles de agarosa al 1%.
Clonaje de los fragmentos de PCR. Los fragmentos de PCR que contienen sitios de restricción en los extremos fueron digeridos con enzimas de restricción EcoRI y BamHI o EcoRI y BglII y clonadas en pBR322 o pGEM-3Z (Promega) digeridas con EcoRI/BamHI. Alternativamente, los fragmentos de PCR fueron clonados en pCR1000 (Invitrogen) usando el kit de clonaje TA (Invitrogen).
Secuenciación de fragmentos de PCR y plásmidos. Los fragmentos de PCR fueron cortados a partir de geles de agarosa 1% purificados por Geneclean (Bio 101, La Jolla, CA). Los fragmentos de PCR de doble hebra fueron secuenciados usando Sequenasa (United States Biochemical) como se describe en Winship, P.R. (1984), Nucleic Acids Rev., 17: 1266. Los plásmidos de doble hebra purificados a través de gradientes de CsCl fueron secuenciados con un kit de Sequenasa (United States Biochemical).
Análisis computerizado de las secuencias. Las secuencias nucleotídicas de las cepas HEV fueron comparadas usando el paquete de software de Genetics Computer Group (Madison, WI) (Devereaux, J. Y otros (1984), Nucleic Acids Rev., 12:387-395, versión 7.5, en un ordenador VAX 8650 (en el Instituto Nacional del Cancer NCI, Frederick, MD)).
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Ejemplo 2 Construcción de un vector de expresión recombinante, p63-2
Un plásmido que contiene el ORF-2 completo del gen de la cepa SAR-55 de HEV, Tsarev, S.A y otros (1992). Proc. NatI. Acad.Sci. USA, 89:559-563), fue usado para obtener un fragmento de restricción NruI-BqlII. NruL corta el cADN de HEV cinco nucleótidos aguas arriba del codón de iniciación ATG de ORF-2. Un sitio Bgl II artificial había sido previamente colocado en el extremo 3' del genoma de HEV justo antes de la secuencia poliA (Tsarev, S.A. y otros (1992), Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89: 559-563). Para insertar este fragmento en el vector pBlue Bac Transfer (Invitrogen) un sitio de clonaje múltiple sintético fue introducido en el sitio NheI único en el vector. Este sitio de clonaje múltiple contenía sitios Bln I y Bgl II que están ausentes tanto en el cADN del HEV y las secuencias pBlueBac. El fragmento NruI-BglII fue insertado en Bln I-BglII pBlue Back usando un adaptador como se muestra en la Figura 1.
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Ejemplo 3 Expresión de p63-2 en células de insecto SF9
ADN de baculovirus p63-2 y AcMNPV (Invitrogen) fueron cotransfectados en células SF9 (Invitrogen) por el método de precipitación de Ca según el protocolo de Invitrogen. Siguiendo este protocolo: el ADN de baculovirus AcMNPV puede producir un baculovirus intacto vivo que puede empaquetar p63-2 para formar un baculovirus recombinante. Este baculovirus recombinante fue purificado en placa 4 veces. El baculovirus recombinante resultante 63-2-IV-2 fue usado para infectar células SF9.
SDS-PAGE y transferencia Western. Las células de insecto fueron resuspendidas en tampón de carga (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% bromophenol blue y 10% glicerol) y se realizó un gel en SDS-poliacrilamida como está descrito, Laemmli, U.K. (1970), Nature, 227:680. Los geles fueron teñidos con Coomassie blue o las proteínas fueron electrotransferidas en filtros de nitrocelulosa BA-85 (Schleicher & Schell). Tras la transferencia, las membranas de nitrocelulosa fueron bloqueadas en PBS que contenían 10% de suero de ternera fetal y 0,5% de gelatina. Como anticuerpo primario, un suero hiperinmune de chimpancé-1313 diluido 1:1000 fue usado. Como anticuerpo secundario, el anticuerpo de cabra purificado por afinidad marcado con fosfatasa frente a IgG humana (Kirkegaard y Perry Laboratories, Inc.) diluidos 1:2000 fue usado.
Los filtros fueron revelados en sustrato estabilizado Western blue para fosfatasa alcalina (Promega). Todas las incubaciones fueron realizadas en disolución de bloqueo, y los lavados fueron con PBS con 0,05% Tween-20 (Sigma).
Expresión de HEV ORF-2. La proteína principal sintetizada en células SF9 infectadas con baculovirus 63-2-IV-2 recombinante fue una proteína con un peso molecular aparente de 74KD (Fig. 2A). Este tamaño es un poco más grande que el predicho para el ORF-2 entero (71 KD). La diferencia en tamaño podría ser debida a la glicosilación de la proteína puesto que hay al menos un sitio potencial de glicosilación (Asn-Leu-Ser) en la parte N-terminal. Esta proteína no fue detectada en las células no infectadas o en células infectadas con baculovirus salvaje no recombinante. En el último caso, la proteína principal detectada fue una proteína poliédrica. Cuando los mismos lisados fueron analizados por transferencia Western con suero de chimpancé-1313 (hiperinmunizado con HEV), sólo las proteínas en el lisado celular recombinante hicieron reacción y la banda principal fue también representada por una proteína de 74 KD (Fig. 2B). Bandas más pequeñas estuvieron también presentes en la transferencia Western. Algunas de estas tuvieron pesos moleculares mayores de 74 KD, que podrían ser debidas a diferentes extensiones de glicosilación y algunas tuvieron pesos moleculares menores, que podrían reflejar procesamiento y/o degradación. Suero tomado de Chimpancé-1313 previamente a la inoculación con HEV no hizo reacción con ninguna de las proteínas por transferencia Western.
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Ejemplo 4 Microscopía inmunoelectrónica de células SF9 infectadas recombinantes
5x10^{6} células SF9 infectadas recombinantes fueron sonicadas en CsCl (1,30 g/ml) que contenía 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,3% sarcosil y centrifugadas 68 h, a 40.000 rpm (SW60Ti). 50 \mul de la fracción, que tenía la mayor respuesta por ELISA y una alta densidad de 1,30 g/ml fue diluida en 1 ml de PBS y 5 \mul de suero hiperinmune de chimpancé-1313 fueron añadidos. El suero hiperinmune fue preparado dándole otra dosis a una chimpancé previamente infectado con una segunda cepa de hepatitis E (HEV mejicana). Las muestras fueron incubadas 1 h a temperatura ambiente y dejadas toda la noche a 4ºC. Los complejos inmunes fueron precipitados usando un rotor SW60Ti a 30.000 rpm, 42ºC, 2 h. Los precipitados fueron resuspendidos en agua destilada, teñidos negativamente con 3% PTA, colocados en rejillas de carbono y examinados a una magnificación de 40.000 en un microscopio electrónico EM-10, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania.
Detección de VLPs: Los lisados celulares a partir de células de insecto infectadas con baculovirus 63-2-IV-2 salvaje o recombinante fueron fraccionados mediante centrifugación de densidad en CsCl. Cuando las fracciones del gradiente de CsCl a partir de las células de insecto infectadas recombinantes fueron incubadas con suero hiperinmune de chimp-1313, dos tipos de partículas de tipo viral (VLP) cubiertas con anticuerpo fueron observadas en la fracción con alta densidad de 1,30 g/ml: primero (Figs. 3A-3A''), partículas individuales cubiertas por anticuerpo que tenían el tamaño (30 nm) y estructura morfológica que sugiere HEV, segundo (Fig. 3B) agregados de partículas recubiertos por anticuerpo más pequeños que HEV (alrededor de 20 nm) pero que por lo demás se asemejan a HEV. EM directa mostró la presencia de una población muy heterogénea de objetos incluyendo algunos de 30 y 20 nm en diámetro respectivamente que parecen partículas virales pero que en ausencia de anticuerpo unido, no pueden confirmarse como HEV. Un número de experimentos IEM sugirieron que al menos alguna(s) de la(s) proteína(s) sintetizadas a partir de la región ORF-2 del genoma de HEV, se habían ensamblado en una estructura particulada. Se observó que las células de insecto en un estadio tardío de infección, cuando la proporción de proteínas más pequeñas fue mayor, dio consistentemente mejores resultados en ELISA. Por lo tanto, los lisados sin fraccionar de células de insecto recombinantes de un estadio tardío de infección fueron usadas con un antígeno en ELISA en ensayos subsecuentes.
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Ejemplo 5 Detección por un ensayo basado en ELISA de antígeno a partir de células de insecto que expresan el ORF-2 completo del anti-HEV tras la infección con diferentes cepas de HEV
5x10^{6} células de SF9 infectadas con virus 63-2-IV-2 fueron resuspendidas en 1 ml de 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl fueron entonces congeladas y descongeladas 3 veces. 10 \mul de esta suspensión fue disuelta en 10 ml de tampón carbonato (pH 9,6) y usadas para cubrir una placa de ensayo de microvaloración flexible (Falcon). Las muestras de suero fueron diluidas 1:20, 1:400 y 1:8000, ó 1:100, 1:1000 y 1:10000. Las mismas disoluciones de bloqueo y de lavado como las descritas para la transferencia Western fueron usadas en ELISA. Como anticuerpo secundario, una fracción IgG de cabra conjugada con peroxidasa frente a IgG humano o anticuerpo de cabra marcado con peroxidasa anti-inmunoglobulina de mono del viejo o del nuevo mundo fue usada. Los resultados fueron determinados midiendo la densidad óptica (D.O.) a 405 nM.
Para determinar si el antígeno derivado de células de insecto que representan una cepa Paquistaní de HEV podría detectar un anticuerpo anti-HEV en monos cynomolgus infectados con la cepa mejicana de HEV, 3 monos fueron examinados (Fig.4). Dos monos cyno-80A82 y cyno-9A97, fueron infectadas con heces que contenían la cepa HEV Mejico '86 (Ticehurst, J. y otros (1992), J. Infect. Dis., 165:835-845) y el tercer mono cyno-83 fue infectado con un segundo pase de la misma cepa. Como testigo, las muestras de suero de cyno-374, infectadas con la cepa SAR-55 de HEV paquistaní, fueron ensayadas en el mismo experimento. Los 3 monos infectados con la cepa mejicana sueroconvirtieron a anti-HEV. Los animales del primer pase sueroconvirtieron en la semana 15 y los del segundo pase en la semana 5. De modo interesante, la concentración más alta anti-HEV entre los 4 animales, se encontró en los cyno-83, inoculados con los del segundo pase de la cepa mejicana. Los cynos inoculados con los del primer pase de la cepa mejicana desarrollaron las concentraciones más bajas mientras que los inoculados con las del primer pase de la cepa paquistaní desarrollaron concentraciones intermedias.
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Ejemplo 6 Especificidad de ELISA anti-HEV basado en un antígeno a partir de células de insecto que expresan ORF-2 completo
Para estimar si el ELISA descrito aquí detectaba específicamente anti-HEV excluyendo cualquier otro tipo de anticuerpo relacionados con hepatitis, muestras de suero de chimpancés fueron analizadas, en grupos de 4, infectados con los otros virus de hepatitis conocidos (Garci, P. y otros (1992), J. Infect. Dis, 165:1006-1011; Farci, P. y otros (1992), Science (en prensa); Ponzetto, A. y otros (1987) J infect. Dis., 155:72-77; Rizzetto; m y otros (1981) Hepatology 1: 567-574: referencia para chimpancés- 1413,, 1373, 1442, 1551 (HAV); y para chimpancés-982, 1442, 1420, 1410 (HBV), son datos sin publicar de Purcel y otros (Tabla 1). Muestras de suero pre-inoculación y de 5 semanas y 15 semanas post-inoculación fueron analizadas en ELISA de HEV hechas reaccionar en el ELISA para anticuerpo HEV, pero los 4 chimpancés inoculados con HEV desarrollaron las clases IgM e IgG de anti-HEV.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Ensayo serológico de anticuerpo anti-HEV en chimpancés infectados con virus de diferentes hepatitis (Hepatitis A, B, C, D, E)
23
Ejemplo 7 Determinación del intervalo de hospedantes de la cepa SAR-55 de HEV en primates no humanos
Diferentes especies de primates fueron inoculadas con una suspensión de heces estándar de HEV y muestras de suero seriadas fueron recogidas para monitorizar la infección. Los niveles de ALT en suero fueron determinadas como indicador de hepatitis mientras que la sueroconversión fue definida mediante la detección de anti-HEV.
Ambos monos rhesus inoculados con HEV (Tabla 2) mostraron picos muy prominentes de actividad ALT así como sueroconversión. El primer signo de actividad ALT aumentada fue observada a día 14 para ambos animales, y una sueroconversión definitiva tuvo lugar a día 21. La concentración máxima de anti-HEV fue lograda a día 29.
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TABLA 2 Perfiles bioquímicos y serológicos de infección por HEV en 8 especies de primates
25
Ambos monos verdes africanos usados en este estudio (Tabla 2) desarrollaron una actividad ALT aumentada y anti-HEV. Aunque AGM-230 murió siete semanas post-inoculación, los signos de infección fueron observados previamente a ese tiempo. AGM-74 mostró un aumento bimodal en actividad ALT como se ha documentado para otras especies (Tsarev, SA y otros (1992), J. Infect. Dis. (en prensa)). La seroconversión para AGM-74 y AGM-230 fue primero observada en los días 27 y 21, respectivamente.
Aunque ambos macacos de cola de cerdo inoculados demostraron un ligero incremento en la actividad LAT estos aumentos no fueron tan prominentes como en el caso de los animales descritos previamente. Sin embargo, ambos monos seroconvirtieron a día 21 y las concentraciones anti-HEV fueron equivalente a los de los chimpancés y otros monos del viejo mundo.
Ningún mono tamarindo inoculado en este estudio mostró ningún aumento en la actividad ALT o seroconversión a anti-HEV (Tabla 2). Los monos ardilla respondieron con niveles significativamente menores de anti-HEV que los chimps o monos del viejo mundo (Tabla 2). El tiempo de seroconversión se retrasó también comparado con los de otros animales. SQM-868 seroconvirtió a día 41, y SQM-869 seroconviertió a día 35. La concentración anti-HEV no fue superior a 1:400 en ningún momento durante más de tres meses de monitorizar y disminuyeron claramente en ambos animales tras alcanzar un valor pico a días 47-54. Sin embargo, los aumentos en actividad ALT fue más bien prominente en ambos animales.
Los monos búho respondieron a la infección por HEV aproximadamente tan bien como las especies de monos del viejo mundo (Tabla 2). Ambos OWMs seroconvirtieron a día 21 y a día 28 las concentraciones anti-HEV alcanzaron un valor de 1:8000. La actividad ALT alcanzó su máximo a día 35 en OWM-924, pero no hasta el día 91 en OWM-925.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8 Detección de IgM e IgG anti HEV en Chimpancés
En ambos chimpancés, los niveles de ALT en suero aumentaron alrededor de 4 semanas post-inoculación (Tabla 2, Fig. 5). Ambos chimpancés seroconvirtieron al tiempo que se elevó la enzima ALT o antes (Fig. 5A, 5C). Los niveles de IgM anti-HEV fueron también determinados para los chimpancés. En chimp-1374, la concentración de IgM anti-HEV (Fig 5B) no fue tan alta como la de la concentración de IgG (Fig 5A) y disminuyó a lo largo de dos semanas. Aunque tanto los anticuerpos IgG como IgM fueron primero detectados para este animal a día 20, la concentración de IgM anti-HEV fue la mayor mientras que la concentración de IgG fue la menor ese día, pero luego aumentó y se mantuvo aproximadamente al mismo nivel durante más de tres meses. En Chimp-1375, sólo IgM anti-HEV fue detectado a día 20 (Fig. 5D). La concentración fue superior que en chimp-1374 e IgM anti-HEV fue detectada durante el período completo de la monitorización. IgG anti-HEV fue primero observada en este animal a día 27 (Fig. 5C) y permaneció a aproximada-mente el mismo nivel a través del experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9 Comparación de ELISA basado en la proteína ORF-2 completa expresada en células de insecto con el basado en los fragmentos de proteínas estructurales expresadas en E. coli
Para estimar si la expresión de la región ORF-2 completa del genoma HEV en células eucariotas tuvo cualquier ventaja sobre la expresión de fragmentos de proteínas estructurales en E. Coli, los autores usaron el antígeno anterior en ELISA para reensayar sueros de monos cynomolgus que habían sido analizados anteriormente (Tsarev, S.A. y otros (1992), Proc. Natl. Acad, Sci USA, 89: 559-563; y Tsarev, S.A y otros (1992) J. Infect. Dis (enviado)), usando los fragmentos de antígenos expresados en bacterias (Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Comparación de ELISA basado en el antígeno a partir de células de insecto que expresan ORF-2 completa con la basada en el antígeno de E. Coli que expresa fragmentos de proteínas estructurales
27 
\vskip1.000000\baselineskip
Para 3 de los 6 monos examinados por ELISA, el antígeno expresado en las células de insecto detectaron seroconversión más temprana que el antígeno expresado en E. Coli. Usando el antígeno derivado de células de insecto, los autores fueron capaces de detectar anticuerpos anti-HEV en sueros de los seis monos a la dilución más alta ensayada (1:8000). Con el antígeno derivado de células de E. coli (cepa Burma) no se obtuvo información acerca de las concentraciones anti HEV, puesto que todos los sueros fueron ensayados sólo a una dilución de 1:100 (Tsarev, SA y otros (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA; 89: 559-563; Tsarev y otros (1992) J. Infect. Dis (enviado)).
En otro estudio, el virus de la hepatitis E, cepa SAR-55 fue diluido en serie en aumentos de 10 y las diluciones 10-1 hasta 10-5 fueron inoculadas en pares de monos cynomolgus para valorar la concentración del virus. Los niveles de ALT en suero fueron medidos para determinar hepatitis y los anticuerpos en suero frente a HEV fueron determinados mediante el método ELISA del presente invento (datos en figuras) o por ELISA de Genelab (datos mostrados como ensayos positivo (+) o negativo (-) en la parte baja de la figura 6 a-g). Todas las muestras fueron ensayadas en código.
El método ELISA del presente invento detectó la seroconversión a IgG anti-HEV en todos los cynos inoculados y en todas las diluciones del virus.
Por el contrario, los resultados de Genelab fueron sorprendentemente variables, como se muestra a continuación
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4
28
Puesto que el Cyno 385 (10^{-5}) fue positivo en ensayos ELISA tanto de Genelabs como del presente invento, el 10^{-4} (diez veces más virus inoculado) y 10^{-3} (100 veces más virus inoculado) se habría esperado que fueran también positivos.
El presente invento los detectó como positivos a diferencia de ensayo ELISA de Genelab que no detectó a ninguno de los dos como positivos a 10^{-3} y 10^{-4} aún cuando los niveles de ALT de Cyno 383 y 393 sugirieron hepatitis activa. Por lo tanto, los datos apoyan las ventajas del presente método de ELISA sobre los métodos de la técnica anterior para detectar anticuerpos frente a HEV.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10 Uso de la proteína ORF-2 completa como vacuna
Como se describió previamente, la proteína ORF-2 recombinante es inmunoreactiva. Adicionalmente, se ha demostrado que reacciona con una variedad de sueros tomados a partir de diferentes especies de animales infectados con diferentes cepas de HEV. Esto viene a apoyar el uso de esta proteína recombinante como una vacuna para proteger frente a una variedad de cepas de HEV. Los mamíferos son inmunizados con la proteína ORF-2 recombinante purificada o parcialmente purificada en una cantidad suficiente para estimular la producción de anticuerpos protectores. Los animales inmunizados inoculados con la cepa salvaje de HEV están protegidos.
El contenido de todas las citas, es decir, artículos en revistas, patentes y similares, son incorporados aquí mediante referencia.
Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritas aquí son para propósitos ilustrativos y que las diversas modificaciones y cambios a la luz de los mismos a las personas con experiencia en la técnica son incluidos dentro del espíritu y ámbito de esta aplicación y alcance de las reivindicaciones anexas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTES: Tsarev, Sergei A., Emerson, Suzanne U., Purcell, Robert H.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas recombinantes de una cepa paquistaní de hepatitis E y su utilización en métodos de diagnóstico y vacunas
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 98
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: MORGAN & FINNEGAN
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 345 PARK AVENUE
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: NUEVA YORK
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: NUEVA YORK
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 10154
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco Flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Compatible con IBM PC
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: WORDPERFECT 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 07/947.263
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-SEP-1992
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Bork, Richard, W.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 36.459
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2026-4032
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
TELECOMMUNICATION INFORMATION:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (212) 758-4800
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (212) 751-6849
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1693 residuos de aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
29
30
31
32
33
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 660 residuos de aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
35
36
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 123 residuos de aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
38
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7168 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
40
41
42
43
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACATTTGAAT TCACAGACAT TGTGC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACACAGATCT GAGCTACATT CGTGAG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAGGGATCC ATGGTGTTTG AGAATG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTCACTGCA GAGCACTATC GAATC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGTAAACTG GTACTGCACA AC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGTCCCGCT CTATTACCCA AG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCCACGGGT GTTGGTTTTT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTCTTGGGGC AGGTAGAGAA G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTATTGAATT CATGTCAACG GACGTC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATAATTCAT GCCGTCGCTC C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGCTCAGGA AGGTACAACT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAATCGATGG CTGGGATCTG ATTC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGGCATTGT AGAGCTTTGT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATGTTGCAC GGACAGCAAA TC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCTCCGATG CAATCGTTAA TAAC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATCCATTC TGTGGCGAGA G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGTGTGACC TTGGTCCAGT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGCTCGTGC CACAATTCGC TAC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATTTCACTG AGTCAGTGAA G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATTATAAC ACCACTGCTA G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATTGCAATA CCCTTATCCT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTAAACCTG TATAGGGCAG AAC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGTTCGATA GCCAGATTTG C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCATGTTGGT TGTCATAATC C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATGACGCAC TTCTCAGTGT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAACAACGA ACGGAGAAC 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGATCCCAGC CATCGACTTT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGTAGTGTA GGTGGAAATA G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGTGGTTAT TCAGGATTAT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTCTGTGAC CTTGGTTAAT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACTCAAGTT CGAGGGCAAA G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCTTACCCT GTTTAACCTT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCCCCTATA TTCATCCAAC CAAC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCCTCATGT TTCTGCCTAT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCAGAACGA AATGGAGATA GC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCAGACATA AAACCTAAGT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCCCTATAC AGGTTTAATC G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 base pairs
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleic acid
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: single
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCGGCATAT ACCAGGTGC 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACATGGCTCA CTCGTAAATT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACATTAGAC GCGTTAACGA G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCTTTTGAT GCCAGTCAGA G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCTACCCGG ATGGCTCTAA GG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATGGGAATT CGTGCCGTCC TGAAG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTGGGAGCA GTATACCAGC G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCTATTGA GCAGGCTGCT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCCATTAG TCTCTAAAAC C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGGTTTTCT GGAATCATC 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCATAGGTGA GACTG 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTTACAGCC AGAAAACC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCATGGATCC TCGGCCTATT TTGCTGTTGC TCC 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGCAGACCA CATATGTG 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTGCACTCC TGACCAAGCC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTGGCTGCC ACTTTGTTC 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCCTCATAC GTCACCACAA C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGTGGACC ACATTAGGAT TATC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATGATATGT CACCATCTG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCATCCATA ACGAGCTGG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCGGAATTC GAGGGGCGGC ATAAAGAACC AGG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGCTGAATT CGGATCACAA GCTCAGAGGC TATGCC 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTATAACGGA TCCACATCTC CCCTTACCTC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAATTGGATC CTGTGTCGGG TGGAATGAAT AACATGTC 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCGGCAGAT CTGATAGAGC GGGGACTTGC CGGATCC 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TACCCTGCCC GCGCCCATAC TTTTGATG 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCTGAGATC TGGTTCGGGT CGCCAAGAAG GTG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TACAGATCTA TACAACTTAA CAGTCGG 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGTCGGATC CCAGGGGCTG CTGTCCTG 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:73:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAGGAATTC AAGACCAGAG GTAGCCTCCT C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTGATATGA ATTCAATAAC CTCGACGG 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:75:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA AATGAG 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:76:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCACTCGTGA ATTCCTATAC TAATAC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:77:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA AATG 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:78:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGATAGAGCG GGACTTGCCG GATCC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:79:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGCATTAGG TTAATGAGGA TCTC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:80:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCTGCTTCC TTCAGCCTGC AGAAG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:81:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGTGGATC CGCTCCCAGG CGTCAAAAC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:82:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCGGATCG AATTCGAGAC CCTTCTTGG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGATGGATC CATAAGTTAC CGATCAG 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 84:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:84:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCTGGAATT CCTCTGAGGA CGCCCTCAC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 85:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:85:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCGAAGATC TATCGGACAT AGACCTC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 86:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:86:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGACGACGG ATCCCCTTGG ATATAGCCTG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 87:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:87:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCCGAATTC AGGCAGACCA CATATGTGGT CGATGCCATG 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 88:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:88:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAGGTGTGC CTGGATCCGG CAAGT 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 89:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:89:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTAGAATTC CGGCCCAGCT GTGGTAGGTC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 90:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:90:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGTCCGATT GGTCTGTATG CAGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 91:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:91:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TACCAGTTTA CTGCAGGTGT GC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 92:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:92:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAAGCCGATG TGGACGTTGT CG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 93:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:93:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCGCTGGGC CTGGTCACGC CAAG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 94:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:94:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAGAAACTA GTGTTGACCC AG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 95:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:95:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGGTCTACG ACGTGAGGCA AC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 96:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:96:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TACAATCTTT CAGGAAGAAG G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 97:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:97:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCACACTCC TCCATAATAG C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 98:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:98:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATAGTGCTT TGCAGTGAGT ACCG 
\hfill
24

Claims (5)

1. Un método para producir una proteína de hepatitis inmunogénica que comprende:
cultivar una célula hospedante de insecto transformada o transfectada con un vector de expresión de baculovirus, comprendiendo dicho vector de expresión ADN, teniendo dicho ADN una secuencia, consistiendo dicha secuencia en los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 a 660 de la proteína de marco de lectura abierta 2 del virus de hepatitis E, en condiciones apropiadas para causar la producción de la proteína de hepatitis inmunogénica.
2. Un método de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN consiste en:
a) nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID Nº 4,
b) una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2, ó
c) la secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene más del 90% de homología con la secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº: 2.
3. Un vector de expresión de baculovirus que comprende ADN, teniendo dicho ADN una secuencia, consistiendo dicha secuencia en nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 a 660 de una proteína de marco de lectura abierta 2 del virus de la hepatitis E.
4. El vector de expresión de la reivindicación 3, en el que dicha secuencia de ADN consiste en:
a) nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID Nº: 4
b) una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2, ó
c) una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene más del 90% de homología con la secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº: 2
5. Una célula hospedante de insecto que comprende el vector de expresión de la reivindicación 3 ó 4.
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